DE69630583T2

DE69630583T2 - Peptide, bronchodilator und den blutstrom verbesserndes mittel

Info

Publication number: DE69630583T2
Application number: DE69630583T
Authority: DE
Inventors: Kazuhisa Kitasoma-gun KASHIMOTO; Yumiko Kitasoma-gun NAGANO
Original assignee: Itoham Foods Inc
Current assignee: ILS Inc
Priority date: 1995-06-09
Filing date: 1996-06-06
Publication date: 2004-09-30
Anticipated expiration: 2016-06-07
Also published as: DE69630583D1; AU682638B2; ATE253590T1; EP0796867B1; AU5911296A; CA2196308C; EP0796867A4; CA2196308A1; US5856303A; CN1124283C; EP0796867A1; CN1161043A; WO1996041814A1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein neues Peptid, ein Bronchus-erweiterndes Mittel (Bronchodilatator) und ein den Blutstrom verbesserndes Mittel.
VIP (vasoaktives intestinales Peptid) ist eine An eines physiologisch aktiven Peptids, Hirn-Darm-Peptid genannt, dessen Wirkung darin besteht, den Blutstrom zu verstärken und den Blutdruck zu senken. VIP wurde im Jahr 1970 aus dem Verdauungstrakt eines Schweins extrahiert, und es besteht aus 28 Aminosäureresten (S. I. Said, V. Mutt, Science, 169, 1217(1970)).
PACAP (Hypophysen-stämmiges, Adenylat-Cyclase aktivierendes Polypeptid) wurde im Jahr 1989 aus dem Hypothalamus eines Schafes mit Hilfe eines Bioassay-Systems isoliert, das die Aktivierung der Adenylat-Cyclase kultivierter Hypophysenzellen als einen Indikator verwendete, und es ist ein Peptid mit bekannter Struktur, das aus 38 Aminosäureresten besteht (A. Miyata, A. Arimura et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 164, 567 (1989)). 27 Aminosäurereste vom N-terminalen Ende von PACAP stellen die PACAP-Aktivität dar, und die Aminosäuresequenz dieser 27 Aminosäuren hat eine beachtlich ähnliche Struktur wie die von VIP.
VIP und PACAP haben eine ähnliche Aminosäuresequenz wie Sekretin, Glucagon etc. und werden daher als Peptide klassifiziert, die zur Glucagon-Familie gehören. Aufgrund ihrer starken Wirkung bei Gefäßerweiterung und Verstärkung des Blutstroms wird von VIP und PACAP Verwendung bei der Behandlung eines Geschwürs, einer Erfrierung, von Wundliegen, Impotenz etc. und bei der Wiederherstellung und dem Wachstum von Haar erwartet. Zusätzlich haben VIP und PACAP eine vergleichsweise starke Entspannungswirkung auf die glatte Bronchialmuskulatur im Atemsystem, wodurch sie die Kontraktion der glatten Muskulatur mindern, die durch Stimulatoren wie Acetylcholin, Histamin, Serotonin etc. ausgelöst werden. Solche Entspannungswirkung von VIP und PACAP unterscheidet sich von der Entspannungswirkung, die über Adrenalin β ausgelöst wird, dem Rezeptor für allgemeine Bronchialentspannung, so dass von VIP und PACAP erwartet wird, eine Behandlungswirkung bei asthmatischem Krampf zu haben, der schwer mit einem nicht wirksam reagierenden Stimulator des β-Rezeptors zu behandeln ist.
Neben VIP und PACAP ist ein aus 28 bis 31 Aminosäureresten bestehendes Peptid bekannt, das Bronchus-erweiternde Wirkung, Blutdruck senkende Wirkung und Haar wiederherstellende Wirkung hat (vgl. japanische Patentanmeldung, Offenlegungs-Nr. 246,595/87, 83,012/89 und 297,498/92).
Der Stand der Technik lieferte auch VIP-Analoga mit einem Met-Rest an Position 17, die starke, den Blutstrom verstärkende Wirkung, geringe Blutdruck-senkende Nebenwirkungen aufwiesen und wirksam bei Geschwüren, Frostbeulen, Impotenz und Haarwachstum waren (JP4-297 498; WPI-Datenbank: Derwent Publications LTD-AN: 1992-401811). VIP-Analoga, die eine Hypertension-reduzierende oder eine Bronchienverengung-reduzierende Wirkung haben, sind auch in WO 88/06598 offenbart.
Es ist jedoch wünschenswert, ein Bronchus-erweiterndes Mittel und ein Blutstrom verbesserndes Mittel zu entwickeln, das VIP, PACAP und andere Peptide in der Nachhaltigkeit der Bronchus-erweiternden Wirkung und Blutstrom verstärkenden Wirkung übertrifft.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist es, ein neues Peptid herzustellen, das hervorragend in der Nachhaltigkeit der Bronchus-erweiternden Wirkung und weiterhin hervorragend in der Blutstrom verstärkenden Wirkung ist, ein Bronchus-erweiterndes Mittel und ein Blutstrom verbesserndes Mittel, das das genannte Peptid als einen aktiven Bestandteil enthält.
Die vorliegende Erfindung stellt ein Peptid bereit, das durch die nachstehende chemische Formel wiedergegeben wird:

oder die allgemeine chemische Formel 1:
worin gilt: A ist Ala oder Gly; B ist Ile oder Val; C ist Asn oder Ser; D ist Thr oder Ser; E ist Leu oder Tyr; jeder F, I und J ist Lys oder Arg, und mindestens einer von F, I und J ist Arg; G ist Met, Leu oder nLeu; K ist Asn oder Ala; L ist Ser oder Ala; M ist Ile oder Val; bei dem mindestens einer von F, I und J Arg ist; P ist Asn oder eine chemische Bindung; Q ist Lys, Arg, Lys-Arg, Arg-Arg oder eine chemische Bindung; und R ist -OH oder -NH₂, oder pharmazeutisch verträgliche Salze hiervon.
Darüber hinaus stellt die vorliegende Erfindung ein Bronchus-erweiterndes Mittel bereit, das das genannte Peptid oder ein pharmazeutisch verträgliches Salz hiervon als einen aktiven Bestandteil umfasst.
Darüber hinaus stellt die vorliegende Erfindung ein Blutstrom verbesserndes Mittel bereit, das das genannte Peptid oder ein pharmazeutisch verträgliches Salz hiervon als einen aktiven Bestandteil umfasst.
Darüber hinaus stellt die vorliegende Erfindung ein Arzneimittel bereit, das das genannte Peptid oder ein pharmazeutisch verträgliches Salz hiervon und einen pharmazeutisch verträglichen Trägerstoff umfasst.
Darüber hinaus stellt die vorliegende Erfindung die Verwendung des genannten Peptids oder eines pharmazeutisch verträglichen Salzes hiervon zur Herstellung eines Arzneimittels zur Erweiterung eines Bronchus bereit.
Darüber hinaus stellt die vorliegende Erfindung die Verwendung des genannten Peptids oder eines pharmazeutisch verträglichen Salzes hiervon zur Herstellung eines Arzneimittels zur Verbesserung eines Blutstroms bereit.
Das Peptid der Erfindung oder ein Salz hiervon ist hervorragend in der Nachhaltigkeit der Bronchus-erweiternden Wirkung, die auf die Entspannungswirkung auf die glatte Muskulatur zurück geht. Das Peptid der Erfindung und ein Salz hiervon ist daher nützlich als ein Bronchus-erweiterndes Mittel.
Zusätzlich ist das Peptid der Erfindung oder ein Salz hiervon hervorragend in der den Blutstrom verstärkenden Wirkung und in seiner Nachhaltigkeit. Daher ist das Peptid der Erfindung oder ein Salz hiervon ebenfalls nützlich als ein Blutstrom verstärkendes Mittel, und es kann eine verbessernde Wirkung auf einen Blutstrom bei niedriger Dosierung hervorrufen.
Die Abkürzungen für die Aminosäuren, Peptide, schützenden Gruppen, Lösungsmittel etc. in der nachstehenden Beschreibung entsprechen jenen der International Union of Pure and Applied Chemistry (IUPAC) oder der International Union of Biochemystry (IUB) oder gebräuchlichen Abkürzungen dieses Fachgebietes. Beispiele werden nachstehend angeführt. Falls optische Isomere bei Aminosäuren etc. bestehen können, sind L-Isomere gemeint, soweit nicht anders angegeben.
Die durch die vorstehenden chemischen Formeln wiedergegebenen Peptide können mit herkömmlichen Mitteln zur Synthese bekannter Peptide hergestellt werden. Zum Beispiel können diese Peptide mit einem Azid-Verfahren, Acid-Chlorid-Verfahren, Acid-Anhydrid-Verfahren, gemischtem Acid-Anhydrid-Verfahren, DCC-Verfahren, aktivem Ester-Verfahren (p-Nitrophenylester-Verfahren, N-Hydroxysuccininsäure-imidester-Verfahren etc.), einem Verfahren, das Woodward-Reagent K verwendet, Carboimidazol-Verfahren, Oxidation-Reduktionsverfahren, DCC-Additiv (HONB, HOBt, HOSu) -Verfahren etc. nach den Verfahren hergestellt werden, die z. B. in "The Peptides" Bd. 1 (1966) [Schreder und Luhke: Academic Press, New York., USA oder "Peputido Gosei" (Peptidsynthese) [Izumiya et al., Maruzen K.K. (1975), Japan] beschrieben werden. Diese Verfahren können sowohl bei der Festphasen-Synthese als auch bei der Flüssigphasen-Synthese angewendet werden. Den vorstehend beschriebenen Verfahren zur Synthese herkömmlicher Polypeptide kann ein Zielpeptid durch ein Verfahren der schrittweisen Verlängerung hergestellt werden, wobei jede einzelne der Aminosäuren im genannten Peptid sequenziell an die C-terminale Aminosäure gebunden wird oder durch ein Fragment-Kondensationsverfahren, bei dem Teilabschnitte des genannten Peptids synthetisiert und dann aneinander gebunden werden.
Zum Beispiel kann die Festphasen-Synthese mit dem Verfahren der schrittweisen Verlängerung gemäß dem Verfahren von Merrifield, R. B. (Solid Phase Peptide Synthesis, J. Amer. Chem. Soc., 85, 2149–2159 (1963)) wie nachstehend beschrieben durchgeführt werden: Die C-terminale Aminosäure eines Zielpeptids (das ist in der vorliegenden Erfindung die Aminosäuresequenz der vorstehend genannten chemischen Formeln) wird an ihrer Aminogruppe geschützt und dann an unlösliches Harz gebunden, das funktionelle Gruppen besitzt, die in der Lage sind, Carboxyl-Gruppen zu binden. Der Schutz der Aminogruppe wird dann entfernt, und an diese freie Aminogruppe wird die nächste Aminosäure gebunden, wobei ihre Aminogruppe geschützt ist. Diese Schritte werden viele Male wiederholt, wodurch sich die Aminosäurekette bis zum Histidin-Rest an der Position 1 der vorstehend genannten chemischen Formeln verlängert. Das auf diese Weise erhaltene Peptid wird daraufhin vom Harz abgespalten.
Das vorstehend genannte Verfahren erfordert den Schutz (das heißt, Bindung einer schützenden Gruppe an die Aminogruppe) und die Entfernung des Schutzes (das heißt, Abspaltung der schützenden Gruppe von der Aminogruppe) der Aminogruppe, die sowohl an der Peptidbindung zwischen Aminosäuren beteiligt ist, als auch an der Aktivierung der Carboxylgruppe, die an der Peptidbindung zwischen Aminosäuren beteiligt ist. Bei Bedarf kann eine schützende Gruppe auch an eine funktionelle Gruppe in einer Seitenkette der Aminosäure gebunden werden.
Die schützende Gruppe, die verwendet wird, um die Aminogruppe zu schützen, umschließt diejenigen, die normalerweise verwendet werden. Beispiele sind Benzyloxycarbonyl- (Z), t-Butyloxycarbonyl- (BOC), t-Amyloxycarbonyl- (AOC), Isobornyl-oxycarbonyl-, p-Methoxybenzyl-oxycarbonyl-, 2-Chlorobenzyl-oxycarbonyl-, Amadantyl-oxycarbonyl-, Trifluoroacetyl-, Phthaloyl-, Formyl-, o-Nitrophenyl-sulphenyl- und Diphenylphosphinothioyl-Gruppen.
Die schützende Gruppe, die zum Schutz der Carboxylgruppe eingesetzt wird, umschließt die normalerweise verwendeten. Beispiele sind Alkylester wie etwa Methylester, Ethylester, Propylester, Butylester und tertiäre Butylester, Benzylester, p-Nitrobenzylester, Methylbenzylester, p-Chlorobenzylester, Benzhydrylester, Benzyloxycarbonyl-hydrazide, tertiäre Butyloxycarbonyl-hydrazide und Tritylhydrazide.
Die Aktivierung der Carboxylgruppe, die an der Peptidbindung beteiligt ist, kann mit jedem der allgemein bekannten, vorstehend angeführten Verfahren durchgeführt werden, und die Reagenzien etc., die für die Aktivierung verwendet werden, können aus der Gruppe der bekannten ausgewählt werden. Die Aktivierung der Carboxylgruppe beinhaltet die Reaktion verschiedener Reagenzien mit der genannten Carboxylgruppe, um z. B. ihre entsprechenden Säurechloride, Säureanhydride oder gemischten Säure-Anhydride, Azide und aktiven Ester (zum Beispiel Ester wie etwa Pentachlorophenol, p-Nitrophenol, N-Hydroxysuccinimid, N-Hydroxybenztriazol, N-Hydroy-5-norbornen-2,3-dicarboxyimid etc.) zu bilden.
Bei einer Aminosäure mit einer funktionellen Gruppe in seiner Seitenkette wird die funktionelle Gruppe bevorzugt während der Reaktion der Bildung einer Peptidbindung geschützt. Besonders bei His, Tyr, Thr, Lys, Asp, Arg und Ser wird die funktionelle Gruppe in ihren Seitenketten bevorzugt geschützt. Der Schutz der funktionellen Gruppe wird durch Anbindung der schützenden Gruppe durch ein herkömmliches Verfahren durchgeführt. Nachdem die Peptidsynthese abgeschlossen ist, wird die schützende Gruppe freigesetzt. Die schützende Gruppe, die zum Schutz der Imino-Gruppe in His verwendet wird, umschließt z. B. Benzyloxymethyl- (Bom), Tosyl- (Tos), Benzyl- (Bzl), Benzyloxycarbonyl- (Z) und Trityl-Gruppen.
Die Hydroxylgruppe in Ser and Thr kann durch Esterbildung oder Etherbildung geschützt werden, ihr Schutz ist allerdings nicht notwendigerweise erforderlich. Die durch Esterbildung einzuführende schützende Gruppe umschließt z. B. niedere Alkanoyl-Reste wie etwa einen Acetyl-Rest etc., Aroyl-Gruppen wie etwa ein Benzoyl-Rest etc. und von Carbonsäure abgeleitete Gruppen wie etwa Benzoyloxycarbonyl-, Ethyloxycarbonyl-Reste etc. Bevorzugte Beispiele für schützende Gruppen, die durch Etherbildung eingeführt werden, sind Benzyl- (Bzl), Tetrahydropyranyl- and tertiär-Butyl-Reste.
Die schützende Gruppe, die zum Schutz der Hydroxylgruppe in Tyr verwendet wird, umschließt z. B. einen Benzyl- (Bzl), Bromobenzyl-oxycarbonyl- (BrZ), Dichlorobenzyl- (Cl₂-Bzl), Benzyloxycarbonyl- (Z), Acetyl- und Tosyl-Rest (Tos).
Die schützende Gruppe, die zum Schutz der Aminogruppe in Lys verwendet wird, umschließt z. B. einen Benzyloxycarbonyl- (Z), Chlorobenzyloxycarbonyl- (Cl-z), Dichlorobenzyl- (Cl₂-Bzl), t-Butyloxycarbonyl- (Boc) und Tosyl-Rest (Tos).
Die schützende Gruppe, die zum Schutz der Guanidin-Gruppe in Arg verwendet wird, umschließt z. B. einen Tosyl- (Tos), Nitro-, Benzyloxycarbonyl- (Z) und t-Amyloxycarbonyl-Rest (Aoc).
Der Schutz der Carbonylgruppe in Asp wird durch Esterbildung z. B. mit Benzylalkohol, Methanol, Ethanol oder tertiärem Butanol durchgeführt.
Die Reaktion zur Bildung einer Peptidbindung kann manchmal unter Anwesenheit eines Kondensationsreagenz, z. B. eines Carbodiimid-Reagenz wie etwa Dicyclohexylcarbodiimid (DCC), Carbodiimidazol etc. oder Tetraethyl-pyrophosphat, Benzotriazol-N-Hydroxytrisdimethyl-aminophosphonium-hexafluorophosphat (Bop-Reagenz) durchgeführt werden.
Das unlösliche Harz, das in der vorstehend genannten Festphasen-Synthese verwendet wird, kann jedes beliebige Harz sein, das über funktionelle Gruppen verfügt, die in der Lage sind, an Carboxylgruppen zu binden. Beispiele sind Benzhydrylamin-Harz (BHA-Harz), Chloromethyl-Harz, Oxymethyl-Harz, Aminomethyl-Harz, p-Methylbenzhydrylamin-Harz (MBHA-Harz), 4-Aminomethyl-phenoxymethyl-Harz, 4-Hydroxymethyl-phenoxymethyl-Harz, 4-Oxymethyl-phenylacetamidemethyl-Harz (PAM-Harz) etc. Die Bindung der Aminosäure an das Harz und die Abspaltung des synthetisierten Peptids vom Harz kann durch jedes beliebige der allgemein bekannten Verfahren erfolgen.
Das in der vorstehend genannten Festphasen-Synthese verwendete Lösungsmittel kann jedes beliebige Lösungsmittel sein, welches bekanntermaßen bei der Bildung einer Peptidbindung verwendet werden kann, und Beispiele sind wasserfreies oder Wasser enthaltendes Dimethylformamid (DMF), Dimethylsulfoxid (DMSO), Pyridin, Chloroform, Dioxan, Dichlormethan (DCM), Tetrahydrofuran (THF), Ethylacetat, N-Methylpyrrolidon und Hexamethylphosphat-triamid (HMPA). Diese Lösungsmittel können allein oder miteinander kombiniert verwendet werden.
Das auf diese Weise hergestellte Peptid kann auf herkömmlichem Weg entsalzt und gereinigt werden. Zum Beispiel kann es durch Ionenaustausch-Chromatographie auf DEAE-Zellulose etc., Verteilungschromatographie auf Sephadex LH-20, Sephadex G-25 etc., normaler Phasen-Chromatographie auf Silicagel etc., Umkehrphasen-Chromatographie auf ODS-Silicagel etc. oder mit hochauflösender Flüssig-Chromatographie (HPLC) etc. entsalzt und gereinigt werden.
Die pharmazeutisch verträglichen Salze der Peptide, die durch die vorstehend genannten chemischen Formeln wiedergegeben werden, umschließen z. B. Acetat, Hydrochlorid, Phosphat etc.
Das Peptid der Erfindung und Salze hiervon sind durch ihre Brochus-erweiternde Wirkung nützlich als ein Bronchus-erweiterndes Mittel. Auf diese Weise ist das Bronchus-erweiternde Mittel, das das Peptid der Erfindung oder ein Salz hiervon als aktiven Inhaltstoff enthält, nützlich zur Unterdrückung und Verbesserung von Asthma etc.
Als Bronchus-erweiterndes Mittel kann das Peptid der Erfindung oder ein Salz hiervon als solches verabreicht werden, wird aber normalerweise auf eine herkömmliche Weise mit verschiedenen pharmazeutisch verträglichen Trägerstoffen vermischt, so dass Präparate in Form von Flüssigkeit, Gel oder Feststoff zur oralen oder parenteralen Verabreichung gebildet werden können. Die Verabreichungsart umschließt Inhalation (z. B. mit einem Aerosol), Injektion, Applikation etc.
Die Dosierung des vorliegenden Peptids oder eines Salzes hiervon liegt, wenn es als Bronchus-erweiterndes Mittel eingesetzt wird, bevorzugt in dem Bereich von etwa 1 ng/kg bis 1 mg/kg (Körpergewicht)/Tag/Person, wobei die Dosierung auch abhängig von dem Verwendungszweck, Symptom, dem Alter und Körpergewicht etc. eines Patienten, der Art der Verabreichung etc. festgesetzt wird.
Darüber hinaus ist das Peptid der Erfindung oder ein Salz hiervon hervorragend in seiner Blutstrom verstärkenden Wirkung, die in ihrer Nachhaltigkeit überragend ist. Auf diese Weise ist ein den Blutstrom verbesserndes Mittel, das das Peptid der Erfindung oder ein Salz hiervon umfasst, bei der Behandlung von einem Geschwür, Erfrierung, Wundliegen, Impotenz etc., wie auch bei Wiederherstellung und Wachstum von Haar wirksam.
Das Peptid der Erfindung oder ein Salz hiervon wird, wenn es als den Blutstrom verbesserndes Mittel eingesetzt wird, mit einem herkömmlichen pharmazeutisch verträglichen Trägerstoff vermischt, um pharmazeutische Präparate, bevorzugt in Form einer Injektionslösung, zu bilden.
Zur Herstellung einer solchen Injektionslösung ist das entstandene Präparat bevorzugt sterilisiert und isotonisch zum Blut. Alle herkömmlich verwendeten Lösungsmittel können zur Herstellung eines Präparates in Form einer Injektionslösung eingesetzt werden. Beispiele für Lösungsmittel sind Wasser, physiologische Kochsalzlösung etc. In diesem Fall kann eine ausreichende Menge an gewöhnlichem Salz oder Glycerin zur Herstellung einer isotonischen Lösung in einem Präparat in Form einer Injektionslösung enthalten sein. Dieses Präparat kann eine herkömmliche Pufferlösung, ein Schmerz linderndes Mittel, Konservierungsstoffe etc. und bei Bedarf sowohl einen Farbstoff, ein Konservierungsmittel, einen Geschmackstoff, ein Süßungsmittel etc. als auch andere Arzneimittel enthalten. Der vorstehend genannte aktive Inhaltstoff für eine Injektionslösung kann vor Gebrauch in destilliertem Wasser gelöst werden. Die Anwendungsart des entstandenen pharmazeutischen Präparates ist, abhängig von der Form des Präparates, unterschiedlich. Zum Beispiel kann das Präparat in der Form einer Injektionslösung allein intravenös verabreicht werden, oder nachdem es mit herkömmlichen Zusätzen wie etwa Aminosäuren etc. vermischt worden ist.
Das vorliegende Peptid oder ein Salz hiervon wird, wenn es als den Blutstrom verstärkendes Mittel eingesetzt wird, bevorzugt in 2 bis 4 Portionen pro Tag im Bereich von etwa 1 ng/kg bis 1 mg/kg (Körpergewicht)/Tag/Person verabreicht, wobei die Dosierung auch abhängig von dem Verwendungszweck, den Symptombedingungen etc. festgesetzt wird.
1 ist eine grafische Darstellung, die eine Änderung im Grad der Entspannung der glatten Bronchialmuskulatur über die Zeit im Fall der Verabreichung von PACAP zeigt.
2 ist eine grafische Darstellung, die eine Änderung im Grad der Entspannung der glatten Bronchialmuskulatur über die Zeit im Fall der Verabreichung von Peptid 5, dargestellt in SEQ ID NR: 5, zeigt.
3 ist eine grafische Darstellung, die eine Änderung im Grad der Entspannung der glatten Bronchialmuskulatur über die Zeit im Fall der Verabreichung von VIP zeigt.
4 ist eine grafische Darstellung, die eine Änderung im Grad der Entspannung der glatten Bronchialmuskulatur über die Zeit im Fall der Verabreichung von Peptid 11, dargestellt in SEQ ID NR: 11, zeigt.
Nachstehend wird die vorliegende Erfindung im Einzelnen durch Bezugnahme auf Beispiele beschrieben, die jedoch den Rahmen der vorliegenden Erfindung nicht begrenzen sollen.
In den nachstehenden Beispielen wurde die Identifizierung der entstandenen gereinigten Peptide durch die Messung der Retentionszeit in der hoch auflösenden Flüssigchromatographie (HPLC), der Messung des optischen Drehwinkels und der Analyse der Aminosäuren, wie nachstehend dargestellt, durchgeführt.
Hoch auflösende Flüssigkeitschromatographie (HPLC)
Zur Analyse durch hoch auflösende Flüssigkeitschromatographie wurde ein LC-Modul-1 (Waters Ltd., Japan) verwendet.
Analysebedingungen für die HPLC

Säule: TSK-Gel ODS-120T (4,6 × 250 mm)
Lösungsmittel: 0,1% TFA-Acetonitril (Lineargradient von 20% bis 50% Acetonitril über 30 min.).
Fließgeschwindigkeit: 1 ml/min
Wellenlänge zur Detektion: 220 nm

optischer Drehwinkel
Zur Messung des optischen Drehwinkels wurde DIC-370 (Nippon Bunko Kogyo K.K., Japan) verwendet.
Bedingungen zur Messung des optischen Drehwinkels

Lichtquelle: Na-Lampe, 589 nm
Temperatur: 20°C.
Schichtlänge: 100 mm.
Konzentration: 1% (0,1 M in Essigsäure).

Analyse der Aminosäuren
Die Analyse der Aminosäuren wurde durchgeführt, indem ein Peptid bei 110°C über 20 Stunden in 6 N HCl, die 0.1% Phenol enthielt, hydrolysiert wurde, und das Hydrolysat in einem Hitachi Aminosäuren-Analysator L-8500 (Hitachi, Ltd., Japan) analysiert wurde.
Beispiel 1
Herstellung von Peptid 1
Der verwendete Festphasen-Synthesizer war der Peptide-Synthesizer 9600 (Milligen Bioresearch). Peptid 1, dargestellt in SEQ ID NR: 1, dessen C-terminale Gruppe amidiert wurde, wurde durch die nachstehend beschriebene Festphasen-Synthese und Reinigung hergestellt.
Zunächst wurden 694 mg MBHA-Harz (0,72 mmol/g Amino-Gruppe, hergestellt von Peptide-Kenkyuzyo K.K., Japan) in einen Reaktor zur Festphasen-Synthese für Peptide eingebracht und mit 8 ml DCM (4 mal, je 1 Minute), 8 ml DCM mit 60% TFA (20 Minuten), 4 ml DCM (3 mal, je 15 Sekunden), 3 ml DMF-Lösung mit 1 ml DIEA (2 mal, je 1 Minute) und 8 ml DMF (6 mal, je 40 Sekunden) in dieser Reihenfolge unter Rühren in einem Argon-Strom behandelt. Nach jedem Behandlungsschritt wurde eine Filtration durchgeführt.
Getrennt davon wurden 2 mmol der Aminogruppen-geschützten Aminosäure Boc-Leu-OH, die dem Aminosäure-Rest an Position 27 der SEQ ID NR: 1 entspricht, in 4 ml DCM gelöst. Diese Lösung wurde in ein Reaktionsgefäß zur Aktivierung von Aminosäuren überführt, darauf wurden 3 ml DCC (0,5 M in DCM) und 4 ml HOBt (0,5 M in DCM) dazu gegeben, und die Reaktionszeit betrug 30 Minuten. Danach wurde die Reaktionslösung abgefiltert und das Filtrat wurde in einen Konzentrationskolben überführt. 3 ml DMF wurden dazu gegeben, und das DCM wurde in einem Argon-Strom herausdestilliert. Dann wurden 3 ml DMF zum Konzentrat zugegeben, und es wurde in das vorstehend genannte Reaktionsgefäß zur Festphasen-Synthese von Peptiden überführt, die Reaktionszeit betrug 30 Minuten. Dann wurde das Reaktionsgemisch mit 8 ml DCM gewaschen (6 mal, je 20 Sekunden). Getrennt davon wurden 2 mmol Boc-Leu-OH in 4 ml DCM gelöst, und die Lösung wurde in das Reaktionsgefäß zur Aktivierung von Aminosäuren überführt, und die gleiche Vorgehensweise wie vorstehend beschrieben wurde wiederholt (Doppel-Koppelung) und filtriert. Auf diese Weise wurde Boc-Leu-MBHA-Harz erhalten.
Darauf wurde das Boc-Leu-MBHA-Harz mit 8 ml DCM gewaschen (4 mal, je 1 Minute) und gefiltert. Dieses Harz wurde mit 8 ml DCM das 60% TFA enthielt (20 Minuten), 4 ml DCM (3 mal, je 15 Sekunden), 3 ml DMF-Lösung, die 1 ml DIEA enthielt, (2 mal, je 1 Minute) und 8 ml DMF (6 mal, je 40 Sekunden) in dieser Reihenfolge unter Rühren in einem Argon-Strom behandelt. Nach jedem Behandlungsschritt wurde eine Filtration durchgeführt.
Davon getrennt wurden 2 mmol der Aminogruppen-geschützten Aminosäure Boc-Val-OH, die dem Aminosäure-Rest an Position 26 der SEQ ID NR: 1 entspricht, in 4 ml DCM gelöst und in ein Gefäß zur Aktivierung von Aminosäuren überführt, und darauf wurden 1,5 ml DCC (0,5 M in DCM) dazu gegeben, und die Reaktionszeit betrug 7 Minuten. Darauf wurde die Reaktionslösung abgefiltert, und das Filtrat wurde in ein Konzentrationsgefäß überführt. 3 ml DMF wurden dazu gegeben, und das DCM wurde in einem Argonstrom abdestilliert. Dann wurden 3 ml DMF zum Konzentrat zugegeben, und es wurde in den vorstehend genannten Reaktor zur Festphasen-Synthese von Peptiden überführt, und die Reaktion wurde über 30 Minuten durchgeführt. Dann wurde das Reaktionsgemisch mit 8 ml DCM gewaschen (6 mal, je 20 Sekunden) und filtriert. Auf diese Weise wurde Boc-Val-Leu-MBHA-Harz erhalten.
Dann wurden die nachstehenden Aminogruppen-geschützten Aminosäuren, den 25. bis 1. Aminosäuren in SEQ ID NR: 1 entsprechend, Schritt für Schritt daran gebunden.
In der vorstehend genannten Festphasen-Synthese wurde im Fall von Asn, Arg, Gln und His eine Doppel-Koppelung durchgeführt.
2,76 g des nachstehenden geschützten Peptid-HBHA-Harzes wurden auf diese Weise erhalten: BOC-His(Bom)-Ser(Bzl)-Asp(OBz)-Gly-Ile-Phe-Thr(Bzl)-Asp(OBz)-Ser(Bzl)-Tyr(Bzl)-Ser(Bzl)-Arg(Tos)-Tyr(Bzl)-Arg(Tos)-Arg(Tos)-Gln-Leu-Ala-Val-Arg(Tos)-Arg(Tos)-Tyr(Bzl)-Leu-Ala-Ala-Val-Leu-MBHA-Harz.
5 ml Anisol wurden zu den 2,76 g des vorstehend genannten geschützten Peptid-MBHA-Harz zugegeben, und 25 ml anhydriertes Hydrogenfluorid wurde dazu gegeben, und man ließ das Gemisch unter Rühren bei 0C° über eine Stunde reagieren. Darauf wurde das anhydrierte Hydrogenfluorid unter vermindertem Druck abdestilliert. Der Rest wurde mit Ether gewaschen, und dann wurde das Peptid daraus mit 100 ml 0,1 M Essigsäure extrahiert.
Der Extrakt wurde über 15 Minuten zusammen mit 20 ml des Anionen-Austauschharzes Amberlite IR-410 gerührt, und das unlösliche Harz wurde durch Filtration entfernt. Die auf diese Weise erhaltene Suspension wurde durch 0,22 μ Millipore-Filter filtriert, und das Filtrat wurde lyophilisiert. Auf diese Weise wurden 823 mg weißes Pulver erhalten. Diese Probe wurde dann auf eine CM-Cellulose-Säule (2.5 × 30 cm) aufgetragen und mit einem linearen Gradienten von 0,05 M bis 0.5 M AcONH₄ (pH-Wert 7.0) eluiert, und die Fraktionen Nr. 69 bis 82 (10 ml/Fraktion) wurden vereint und ergaben 382 mg des gewünschten Peptids in teilgereinigter Form. Dieses Peptid wurde mit Hilfe der präparativen hoch auflösenden Flüssigchromatographie weiter gereinigt.
Säule: TSK-Gel ODS-120T (21.5 × 300 mm).
Lösungsmittel: 0,1% TFA-Acetonitril (linearer Gradient von 20% bis 40% Acetonitril).
Fließgeschwindigkeit: 10 ml/min.
Das zu einem Maximum („Peak") von Peptid 1 als gewünschter Substanz gehörende Eluat wurde lyophilisiert. Das Peptid in gereinigter Form wurde aus der genannten HPLC in einer Menge von 63 mg pro 100 mg des teilgereinigten Peptids erhalten. Das gereinigte Peptid wurde auf Retentionszeit in der HPLC und seinen optischen Drehwinkel untersucht, und seine Aminosäuren wurden analysiert. Die Ergebnisse werden nachstehend dargestellt:

– Retentionszeit in der HPLC: 27,2 min.
– [α]_D: –55,8°
– Analyse der Aminosäuren: Asp(2) 2,17, Thr(1) 0,98, Ser(3) 2,45, Glu(1) 1,09, Gly(1) 1,03, Ala(3) 3,18, Val(2) 2,14, Ile(1) 0,96, Leu(3) 3,07, Tyr(3) 2,73, Phe(1) 0,92, His(1) 1,12, Arg(5) 5,16.

Beispiel 2
Peptid 2, in SEQ ID NR: 2 dargestellt, dessen C-terminale Carboxylgruppe amidiert war, wurde in gereinigter Form auf die gleiche Weise wie in Beispiel 1 erhalten. Die Ausbeute für dieses gereinigte Peptid ist nachstehend dargestellt. Seine Retentionszeit in der HPLC und sein optischer Drehwinkel wurden bestimmt, und seine Aminosäuren wurden analysiert. Die Ergebnisse werden nachstehend dargestellt:

– Erhalt: 73 mg
– Retentionszeit in der HPLC: 27.6 min.
– [α]_D: –53.2°
– Analyse der Aminosäuren: Asp(2) 2,10, Thr(1) 0,97, Ser(3) 2,46, Glu(1) 0,97, Gly(2) 1,97, Ala(3) 3,15, Val(2) 2,13, Ile(1) 1,00, Leu(3) 3,08, Tyr(3) 2,75, Phe(1) 0,98, His(1) 0,99, Arg(5) 4,54.

Beispiel 3
Peptid 3, in SEQ ID NR: 3 dargestellt, dessen C-terminale Carboxylgruppe amidiert war, wurde in gereinigter Form auf die gleiche Weise wie in Beispiel 1 erhalten. Die Ausbeute für dieses gereinigte Peptid ist nachstehend dargestellt. Seine Retentionszeit in der HPLC und sein optischer Drehwinkel wurden bestimmt, und seine Aminosäuren wurden analysiert. Die Ergebnisse werden nachstehend dargestellt:

– Erhalt: 88 mg
– Retentionszeit in der HPLC: 27,0 min.
– [α]_D: –52.8°
– Analyse der Aminosäuren: Asp(2) 2,11, Thr(1) 0,95, Ser(3) 2,56, Glu(1) 0,97, Gly(2) 2,00, Ala(3) 3,15, Val(2) 2,10, Ile(1) 1,00, Leu(3) 3,08, Tyr(3) 2,75, Phe(1) 0,98, His(1) 1,03, Arg(5) 5,14, Lys(1) 1,01.

Beispiel 4
Peptid 4, in SEQ ID NR: 4 dargestellt, dessen C-terminale Carboxylgruppe amidiert war, wurde in gereinigter Form auf die gleiche Weise wie in Beispiel 1 erhalten. Die Ausbeute für dieses gereinigte Peptid ist nachstehend dargestellt. Seine Retentionszeit in der HPLC und sein optischer Drehwinkel wurden bestimmt, und seine Aminosäuren wurden analysiert. Die Ergebnisse werden nachstehend dargestellt:

– Erhalt: 84 mg
– Retentionszeit in der HPLC: 25,1 min.
– [α]_D: –54,3°
– Analyse der Aminosäuren: Asp(2) 2,09, Thr(1) 0,96, Ser(3) 2,44, Glu(1) 0,97, Gly(2) 2,01, Ala(3) 3,11, Val(2) 2,03, Ile(1) 1,02, Leu(3) 3,08, Tyr(3) 2,74, Phe(1) 0,97, His(1) 1,05 Arg(6) 6,10.

Beispiel 5
Peptid 5, in SEQ ID NR: 5 dargestellt, dessen C-terminale Carboxylgruppe amidiert war, wurde in gereinigter Form auf die gleiche Weise wie in Beispiel 1 erhalten. Die Ausbeute für dieses gereinigte Peptid ist nachstehend dargestellt. Seine Retentionszeit in der HPLC und sein optischer Drehwinkel wurden bestimmt, und seine Aminosäuren wurden analysiert. Die Ergebnisse werden nachstehend dargestellt:

– Erhalt: 76 mg
– Retentionszeit in der HPLC: 24,4 min.
– [α]_D: –52,2°
– Analyse der Aminosäuren: Asp(2) 2,11, Thr(1) 0,96, Ser(3) 2,47, Glu(1) 1,01, Gly(2) 2,00, Ala(3) 3,03, Val(2) 2,03, Ile(1) 1,02, Leu(3) 3,03, Tyr(3) 2,70, Phe(1) 0,97, His(1) 1,07, Arg(6) 6,15, Lys(1) 1,02

Beispiel 6
Peptid 6, in SEQ ID NR: 6 dargestellt, dessen C-terminale Carboxylgruppe amidiert war, wurde in gereinigter Form auf die gleiche Weise wie in Beispiel 1 erhalten. Die Ausbeute für dieses gereinigte Peptid ist nachstehend dargestellt. Seine Retentionszeit in der HPLC und sein optischer Drehwinkel wurden bestimmt, und seine Aminosäuren wurden analysiert. Die Ergebnisse werden nachstehend dargestellt:

– Erhalt: 85 mg
– Retentionszeit in der HPLC: 23,6 min.
– [α]_D: –53,7°
– Analyse der Aminosäuren: Asp(2) 2,09, Thr(1) 0,94, Ser(3) 2,51, Glu(1) 1,05, Gly(2) 2,00, Ala(3) 3,03, Val(2) 2,01, Ile(1) 1,02, Leu(3) 3,03, Tyr(3) 2,77, Phe(1) 0,97, His(1) 1,07, Arg(7) 7,11.

Beispiel 7
Peptid 7, in SEQ ID NR: 7 dargestellt, dessen C-terminale Carboxylgruppe amidiert war, wurde in gereinigter Form auf die gleiche Weise wie in Beispiel 1 erhalten, mit dem Unterschied, dass 704 mg Boc-Arg(Tos)-PAM-Harz verwendet wurden (0,68 mmol/g Aminogruppe, hergestellt von Peptide-Kenkyuzyo K.K.), d. h. ein Harz wurde verwendet, das den C-terminalen Aminosäurerest des Zielpeptids aufweist. Die Ausbeute für dieses gereinigte Peptid ist nachstehend dargestellt. Seine Retentionszeit in der HPLC und sein optischer Drehwinkel wurden bestimmt, und seine Aminosäuren wurden analysiert. Die Ergebnisse werden nachstehend dargestellt:

– Erhalt: 84 mg
– Retentionszeit in der HPLC: 23,8 min.
– [α]_D: –56,7°
– Analyse der Aminosäuren: Asp(2) 2,12, Thr(1) 0,96, Ser(3) 2,47, Glu(1) 1,01, Gly(2) 2,00, Ala(3) 3,03, Val(2) 2,03, Ile(1) 1,02, Leu(3) 3,03, Tyr(3) 2,70, Phe(1) 0,97, His(1) 1,03, Arg(6) 6,10, Lys(1) 1,02.

Beispiel 8
Peptid 8, in SEQ ID NR: 8 dargestellt, dessen C-terminale Carboxylgruppe amidiert war, wurde in gereinigter Form auf die gleiche Weise wie in Beispiel 1 erhalten. Die Ausbeute für dieses gereinigte Peptid ist nachstehend dargestellt. Seine Retentionszeit in der HPLC und sein optischer Drehwinkel wurden bestimmt, und seine Aminosäuren wurden analysiert. Die Ergebnisse werden nachstehend dargestellt:

– Erhalt: 68 mg
– Retentionszeit in der HPLC: 26,9 min.
– [α]_D: –58,7°
– Analyse der Aminosäuren: Asp(5) 5,11, Thr(2) 1,72, Ser(2) 1,61, Glu(1) 1,10, Ala(2) 2,00, Val(2) 2,00, Ile(1) 1,02, Leu(4) 4,15, Tyr(2) 1,86, Phe(1) 0,99, His(1) 0,95, Arg(5) 4,75.

Beispiel 9
Peptid 9, in SEQ ID NR: 9 dargestellt, dessen C-terminale Carboxylgruppe amidiert war, wurde in gereinigter Form auf die gleiche Weise wie in Beispiel 1 erhalten. Die Ausbeute für dieses gereinigte Peptid ist nachstehend dargestellt. Seine Retentionszeit in der HPLC und sein optischer Drehwinkel wurden bestimmt, und seine Aminosäuren wurden analysiert. Die Ergebnisse werden nachstehend dargestellt:

– Erhalt: 76 mg
– Retentionszeit in der HPLC: 25,4 min.
– [α]_D: –52,9°
– Analyse der Aminosäuren: Asp(5) 5,11, Thr(2) 1,83, Ser(2) 1,49, Glu(1) 1,09, Gly(1) 1,04, Ala(2) 2,01, Val(2) 2,01, Ile(1) 0,96, Leu(4) 4,19, Tyr(2) 2,03, Phe(1) 1,01, His(1) 1,07, Arg(6) 6,10, Lys(1) 1,05.

Beispiel 10
Peptid 10, in SEQ ID NR: 10 dargestellt, dessen C-terminale Carboxylgruppe amidiert war, wurde in gereinigter Form auf die gleiche Weise wie in Beispiel 1 erhalten. Die Ausbeute für dieses gereinigte Peptid ist nachstehend dargestellt. Seine Retentionszeit in der HPLC und sein optischer Drehwinkel wurden bestimmt, und seine Aminosäuren wurden analysiert. Die Ergebnisse werden nachstehend dargestellt:

– Erhalt: 77 mg
– Retentionszeit in der HPLC: 24,9 min.
– [α]_D: –52,5°
– Analyse der Aminosäuren: Asp(5) 5,12, Thr(2) 1,83, Ser(2) 1,55, Glu(1) 1,08, Gly(1) 1,03, Ala(2) 2,01, Val(2) 2,01, Ile(1) 0,96, Leu(4) 4,17, Tyr(2) 2,03, Phe(1) 1,01, His(1) 1,03, Arg(6) 6,15

Beispiel 11
Peptid 11, in SEQ ID NR: 11 dargestellt, dessen C-terminale Carboxylgruppe amidiert war, wurde in gereinigter Form auf die gleiche Weise wie in Beispiel 1 erhalten. Die Ausbeute für dieses gereinigte Peptid ist nachstehend dargestellt. Seine Retentionszeit in der HPLC und sein optischer Drehwinkel wurden bestimmt, und seine Aminosäuren wurden analysiert. Die Ergebnisse werden nachstehend dargestellt:

– Erhalt: 87 mg
– Retentionszeit in der HPLC: 23,5 min.
– [α]_D: –55,5°
– Analyse der Aminosäuren: Asp(5) 5,11, Thr(2) 1,83, Ser(2) 1,49, Glu(1) 1,09, Gly(1) 1,04, Ala(2) 2,01, Val(2) 2,01, Ile(1) 0,96, Leu(4) 4,19, Tyr(2) 2,03, phe(1) 1,01, His(1) 1,07, Arg(6) 6,10, Lys(1) 1,05.

Beispiel 12
Peptid 12, in SEQ ID NR: 12 dargestellt, dessen C-terminale Carboxylgruppe amidiert war, wurde in gereinigter Form auf die gleiche Weise wie in Beispiel 1 erhalten. Die Ausbeute für dieses gereinigte Peptid ist nachstehend dargestellt. Seine Retentionszeit in der HPLC und sein optischer Drehwinkel wurden bestimmt, und seine Aminosäuren wurden analysiert. Die Ergebnisse werden nachstehend dargestellt:

– Erhalt: 78 mg
– Retentionszeit in der HPLC: 23,0 min.
– [α]_D: –56,2°
– Analyse der Aminosäuren: Asp(5) 5,13, Thr(2) 1,84, Ser(2) 1,49, Glu(1) 1,08, Gly(1) 1,03, Ala(2) 2,01, Val(2) 2,01, Ile(1) 0,96, Leu(4) 4,19, Tyr(2) 2,03, Phe(1) 1,01, His(1) 1,02, Arg(7) 7,11.

Beispiel 13
Peptid 13, in SEQ ID NR: 13 dargestellt, dessen C-terminale Carboxylgruppe amidiert war, wurde in gereinigter Form auf die gleiche Weise wie in Beispiel 1 erhalten, mit dem Unterschied, dass 704 mg Boc-Arg(Tos)-PAM-Harz verwendet wurde, d. h. ein Harz, das den C-terminalen Aminosäurerest des Zielpeptids aufweist, wurde verwendet. Die Ausbeute für dieses gereinigte Peptid ist nachstehend dargestellt. Seine Retentionszeit in der HPLC und sein optischer Drehwinkel wurden bestimmt, und seine Aminosäuren wurden analysiert. Die Ergebnisse werden nachstehend dargestellt:

– Erhalt: 83 mg
– Retentionszeit in der HPLC: 23,8 min.
– [α]_D: –58,6°
– Analyse der Aminosäuren: Asp(5) 5,15, Thr(2) 1,83, Ser(2) 1,53, Glu(1) 1,09, Gly(1) 1,01, Ala(2) 2,01, Val(2) 2,01, Ile(1) 1,02, Leu(4) 4,10, Tyr(2) 1,86, Phe(1) 1,00, His(1) 0,95, Arg(6) 6,15.

Beispiel 14
Peptid 14, in SEQ ID NR: 14 dargestellt, dessen C-terminale Carboxylgruppe amidiert war, wurde in gereinigter Form auf die gleiche Weise wie in Beispiel 1 erhalten. Die Ausbeute für dieses gereinigte Peptid ist nachstehend dargestellt. Seine Retentionszeit in der HPLC und sein optischer Drehwinkel wurden bestimmt, und seine Aminosäuren wurden analysiert. Die Ergebnisse werden nachstehend dargestellt:

– Erhalt: 62 mg
– Retentionszeit in der HPLC: 26,2 min.
– [α]_D: –52,5°
– Analyse der Aminosäuren: Asp(2) 2,11, Thr(1) 0,95, Ser(3) 2,45, Glu(1) 1,04, Gly(1) 1,03, Ala(3) 3,18, Val(2) 2,14, Ile(1) 0,96, Leu(2) 2,0, Tyr(3) 2,73, Phe(1) 0,96, His(1) 1,02, Arg(5) 5,16, nLeu(1) 1,02.

Beispiel 15
Die gereinigten Peptide 1 bis 14, die in den Beispielen 1 bis 14 erhalten wurden, wurden auf ihre Bronchus-erweiternde Wirkung auf folgende Weise untersucht und mit denen von VIP und PACAP verglichen.
Männliche Meerschweinchen, jedes mit einem Gewicht von 450 bis 500 g, wurden an den Jugularvenen aufgeschnitten, um ihre Brusträume zu öffnen, und die Luftröhren wurden sofort entfernt. Ihre Luftröhren wurden sofort in eine Krebs-Lösung gelegt und in Ringe geschnitten. Daraus wurde dann eine Kette gebildet, indem die Knorpelabschnitte mit Hilfe eines Stahldrahtes verbunden wurden. Dann wurden die Knorpelabschnitte, die den Abschnitten glatter Muskulatur gegenüber lagen, eingeschnitten, so dass die Abschnitte der glatten Muskulatur einander berührten. Die erhaltene Probe wurde in einem etwa 10 ml umfassenden isothermischen Organbad platziert und senkrecht suspendiert. Der untere Abschnitt wurde fixiert, und der obere Abschnitt wurde mit einem Grass-force-Umwandler mit einer Ladung von 1,4 g verbunden. Diese Probe wurde mit einem Gas aus 94% Sauerstoff und 6% Kohlendioxid ausreichend belüftet, während eine Krebs-Lösung, die 0,1 μmol/l Carbachol enthielt, mit einer Tropfrate von 0,33 ml/min zugegeben wurde, um die Entspannungswirkung zu bestimmen. Weil die Entspannungsreaktion in Abhängigkeit von dem Gehalt einer Testprobe in dieser Tropfenlösung auftritt, kann diese verwendet werden, um die Entspannungswirkung von VIP und PACAP und derjenigen der Peptide der Erfindung auf die glatte Bronchialmuskulatur zu vergleichen.
Je eine Lösung mit VIP, PACAP und den Peptiden der Erfindung wurde in bis zu 100facher Konzentration der Endkonzentration hergestellt, so dass ihre Konzentration im Organbad angepasst werden konnte. 30 Minuten nachdem die Carbachol enthaltende Krebs-Lösung zugelaufen war, wurden 100 μl der Probenlösung tropfenweise dazu gegeben.
Es wurde angenommen, dass der Kontraktionsgrad der glatten Muskulatur bei Abwesenheit von Carbachol 0 ist, und dass der Grad bei Anwesenheit von Carbachol 100 ist. Der minimale Kontraktionsgrad A (d. h. maximaler Entspannungswert) in Anwesenheit der Probe wurde bestimmt, und der maximale Entspannungsgrad B wurde wie folgt berechnet: Maximaler Entspannungsgrad B (%) = 100 – A
Die Zeit, die benötigt wurde, um nach der Zugabe der Probe die Hälfte des maximalen Wertes (nachstehend als „Halbwertszeit T" bezeichnet) zu erreichen, wurde bestimmt.
Eine Änderung im Entspannungsgrad der glatten Bronchialmuskulatur über die Zeit wurde bestimmt, wobei jedes Peptid jeweils in 3 Dosierungen von 0,3 μM, 1 μM beziehungsweise 3 μM verwendet wurde. Die Ergebnisse werden in den Abbildungen dargestellt: PACAP in 1; Peptid 5, erhalten aus Beispiel 5, in 2; VIP in 3; und Peptid 11, erhalten aus Beispiel 11, in 4. Der maximale Entspannungsgrad B bei einer Dosierung von 3 μM beträgt 75% für Peptid 5 und 80% für Peptid 11, und die Halbwertszeit T beträgt 360 Minuten oder mehr in beiden Fällen. Mit diesen Ergebnissen zeigen die Peptide der Erfindung eine außerordentliche Nachhaltigkeit, d. h. eine länger andauernde Wirksamkeit im Vergleich zu VIP und PACAP, wobei sie eine ähnliche Entspannungswirkung aufweisen wie VIP und PACAP.
Tabelle 1 stellt den maximalen Entspannungsgrad B und die Halbwertszeit T für jedes Peptid bei jeder Dosierung dar.
Tabelle 1
Beispiel 16
Die gereinigten Peptide 1 bis 14, erhalten nach den Beispielen 1 bis 14, wurden auf ihre Wirkung zur Verstärkung des Blutstroms im Vergleich mit denen von VIP und PACAP untersucht.
Männliche Wistar-Ratten, jede mit einem Gewicht von 220 bis 250 g, wurden durch intraperitoneale Verabreichung von Pentobarbital (25 mg/kg) betäubt und auf dem Rücken liegend fixiert. Eine Arterienkanüle wurde in die Carotisarterie geschoben und dann mit einem Blutdruck-Transducer (DX-300, Nippon Koden, Japan) über ein „Doom-Kit" (SCK-512, Nippon Koden) verbunden, das mit Heparin enthaltender physiologischer Kochsalzlösung (10 U/ml) gefüllt war, um den Blutdruck mit einem Stamm-Blutdruck-Amplifizierer (AP-601G, Nippon Koden) zu messen. Darüber hinaus wurde eine Sonde zur Messung des Blutstroms (FR-030T, Nippon Koden) an der rechten Femurarterie angebracht und dann mit einem elektromagnetischen Blutstrom-Messgerät (MFV-3200, Nippon Koden) verbunden, um den Blutstrom zu messen. Die Dosierung von jedem Peptid, das intraarteriell verabreicht wurde, betrug 100 pmol/kg.
Tabelle 2 stellt ein Anwachsen des Blutstroms bei Ratten dar, denen jedes der Peptide verabreicht worden war.
Tabelle 2
Es wurde keine besondere Änderung des Blutdrucks bei Ratten beobachtet, denen 100 pmol/kg von jedem der Peptide 1 bis 14 verabreicht worden war.
Beispiel 17
Test zur akuten Toxizität
Die Peptide 1 bis 14, die aus den Beispielen 1 bis 14 erhalten worden waren, wurden in physiologischer Kochsalzlösung gelöst und Mäusen in einer Dosierung von 10 mg/kg intravenös verabreicht. Das Ergebnis zeigt an, dass alle Mäuse überlebten.
SEQUENZ-PROTOKOLL

Claims

Peptid, dargestellt durch die Formel:
oder die allgemeine Formel (1):
wobei A Ala oder Gly ist; B Ile oder Val ist; C Asn oder Ser ist; D Thr oder Ser ist; E Leu oder Tyr ist; F, I und J jeweils Lys oder Arg sind und mindestens eines von F, I und J Arg ist; G Met, Leu oder nLeu ist; K Asn oder Ala ist; L Ser oder Ala ist; M Ile oder Val ist; P Asn oder eine chemische Bindung ist; Q Lys, Arg, Lys-Arg, Arg-Arg oder eine chemische Bindung ist; und R eine -OH- oder -NH₂-Gruppe ist, oder pharmazeutisch verträgliche Salze davon.
Peptide nach Anspruch 1, dargestellt durch die Formel:

oder pharmazeutisch verträgliche Salze davon.
Bronchus-erweiterndes Mittel, umfassend ein Peptid nach Anspruch 1 oder 2 oder ein pharmazeutisch verträgliches Salz davon als Wirkstoff.
Blutströmung-verbesserndes Mittel, umfassend ein Peptid nach Anspruch 1 oder 2 oder ein pharmazeutisch verträgliches Salz davon als Wirkstoff.
Arzneimittel, umfassend ein Peptid nach Anspruch 1 oder 2 oder ein pharmazeutisch verträglichen Salzes davon und einen pharmazeutisch verträglichen Träger.
Verwendung eines Peptids nach Anspruch 1 oder 2 oder eines pharmazeutisch verträglichen Salzes davon zur Herstellung eines Arzneimittels für die Behandlung von Asthma.
Verwendung eines Peptids nach Anspruch 1 oder 2 oder eines pharmazeutisch verträglichen Salzes davon zur Herstellung eines Arzneimittels für die Behandlung eines Geschwürs, Erfrierung, Wundliegens, Impotenz und in der Wiederherstellung und dem Wachstum von Haaren.