DE3783257T2

DE3783257T2 - Peptid, dessen verfahren zur herstellung, sie enthaltende pharmazeutische zusammensetzung und benutzung.

Info

Publication number: DE3783257T2
Application number: DE8787105570T
Authority: DE
Inventors: Osamu Ito; Shinro Tachibana
Original assignee: Eisai Co Ltd
Current assignee: Eisai Co Ltd
Priority date: 1986-04-17
Filing date: 1987-04-15
Publication date: 1993-05-13
Anticipated expiration: 2007-04-16
Also published as: DK193887A; EP0241926A3; CA1288894C; EP0241926A2; EP0241926B1; NO871574L; JPS62246595A; DE3783257D1; ATE84048T1; NO871574D0; GR3006718T3; ES2052507T3; DK193887D0; US4822774A; US4757133A

Description

Diese Erfindung betrifft ein neues physiologisch aktives Peptid mit bronchienerweiternden und blutdrucksenkenden Aktivitäten. Somit wird diese Erfindung auf einem Gebiet von Arzneimitteln für die medizinische Behandlung angewandt.
VIP (vasoaktives intestinales Polypeptid), das von S. Said et al., isoliert warden ist, weist eine Aminosäuresequenz, die denen von Secretin, Glucagon und dergleichen analog ist, und wird daher als ein Peptid klassifiziert, das zu der Glucagon-Familie gehört. Dessen physiologische Aktivitäten zu decken einen solchen weiten Bereich ab, daß sie auf vielen Gebieten, beispielsweise bei dem kardiovaskulären System, dem Atmungssystem, dem metabolischen System und dem endokrinen System beobachtet werden. Kürzlich erregte die Funktion von VIP als ein Neurotransmitter ebenfalls Aufmerksamkeit. Die Funktion von VIP in dem Atmungssystem sollte insbesondere beachtet werden. Spezifisch weist VIP eine sehr starke Funktion für die Entspannung der glatten Muskeln eines Bronchus auf, so daß es die glatten Muskeln sehr gut entspannen kann, die durch eine anregende Substanz wie Acetylcolin, Histamin oder Serotonin kontrolliert werden. Diese Entspannungsfunktion ist deutlich verschieden von solchen von üblichen Bronchienerweiterungsmitteln, die durch den beta&sub2;-Rezeptor von Adrenalin dadurch reagieren, daß durch den beta-Blocker keine Inhibition erfolgt. Dieses legt eine Möglichkeit sehr nahe, daß VIP und dessen Derivat eine beachtliche Wirkung bei einem Anfall von hartnäckigem Asthma entfaltet, bei dem ein beta&sub2;-Rezeptor-Stimulanz nicht wirksam reagiert. Die folgenden Artikel werden als Dokumente erwähnt, die die oben genannten Feststellungen beschreiben.
(a) S. Said, V. Mutt, Nature 225, 863 (1970).
(b) N. Hara, A. Guemei, S. Said et al., Clin. Res. 23, 347A (1975).
(c) Kudo, Sogo Rinsho, 34 (11), 2497 (1985).
VIP ist ein Peptid mit einem amidierten C-Ende, das aus 28 Aminosäuren besteht, wie es durch die primäre strukturelle Formel repräsentiert wird, die nachfolgend erwähnt wird. Da der Gehalt an VIP in vivo gering ist, kann eine große Menge an VIP nicht durch Extraktion eines natürlichen Stoffes erhalten werden. Die Synthese des Peptides durch das Flüssigphasen- oder Festphasenverfahren ist so teuer, daß es schwierig sein kann, es in die Praxis umzusetzen. Da das C-Ende amidert ist, ist die Produktion von VIP durch Genrekombination technisch schwierig und teuer.
His-Ser-Asp-Ala-Val-Phe-Thr-Asp- Asn-Tyr-Thr-Arg-Leu-Arg-Lys-Gln- Met-Ala-Val-Lys-Lys-Tyr-Leu-Asn- Ser-Ile-Leu-Asn-NH&sub2;
Unter derartigen Umständen ist es gewünscht, ein VIP Derivat mit höheren VIP-Aktivitäten als von VIP selbst zur Verfügung zu stellen. Spezifisch, wenn ein solches VIP-Derivat doppelte Aktivitäten aufweist, kann die Zahlbarkeit ausreichend gesichert werden, selbst wenn es durch das Flüssigphasen- oder Festphasenverfahren hergestellt wird. In einigen Fällen kann eine Möglichkeit der nicht teuren Herstellung eines derartigen VIP-Derivates durch Genrekombinatioan erwartet werden. Angesichts dessen liegt bei dieser Erfindung das Problem, das durch die Erfindung gelöst werden soll, darin, ein neu entworfenes VIP-Derivat zur Verfügung zu stellen. VIP weist einen Vorläufer von sich selbst auf, dessen Struktur in dem unten erwähnten Artikel (d) angegeben ist. Es ist bekannt, daß -Asn-Gly-Lys-Arg- in dieser Struktur mehrere Schritte von enzymatischen Reaktionen eingeht, um schließlich eine C-terminale Amidgruppe von VIP, nämlich Asn-NH&sub2;, zur Verfügung zu stellen. Jedoch sind keine Zwischenprodukte in den Zwischenschritten bekannt. Somit gibt es keine Substanzen, die VIP-Derivate betrachtet werden. Wenn die Substanz mit einer Amidgruppe an dem C-Terminus in eine Substanz umgewandelt wird, die eine Carboxylgruppe an dem C-Terminus aufweist, werden die Aktivitäten im allgemeinen beachtlich erniedrigt. Jedoch ist nicht geklärt, was in dem Fall eines VIP-Derivates passiert. Unter solchen Bedingungen haben die Erfinder dieser Erfindung versucht, eine neue Substanz unter dem Gesichtspunkt zu finden, ein VIP-Derivat mit höheren Aktivitäten als jenen von VIP selbst zu finden.
(d) N. Itoh, H. Okamoto et al,; Nature 304, 547 (1983).
Als ein Untersuchungsergebnis wurde die Möglichkeit bei mehreren neu entworfenen Substanzen festgestellt. Einige entworfene Substanzen weisen höhere Aktivitäten als die von natürlichem VIP auf, selbst wenn es eine Caboxylgruppe an dem C-Terminus aufweist. Es wurde festgestellt, daß alle Substanzen eine höhere Aktivität bei der Entspannung der glatten Muskeln eines Bronchus und/oder eine höhere hypertonische Aktivität als die bei natürlichem VIP aufweisen.
Auf der Grundlage dieser Feststellungen wurde diese Erfindung vollendet.
Diese Erfindung wird nachfolgend detailliert beschrieben.
Die Substanz dieser Erfindung ist ein neues Peptid, dargestellt durch eine primäre strukturelle Formel:
His-Ser-Asp-Ala-Val-Phe-Thr-Asp- Asn-Tyr-Thr-Arg-Leu-Arg-Lys-Gln- X-Ala-Val-Lys-Lys-Tyr-Leu-Asn- Ser-Ile-Leu-Asn-Gly-Y
(worin X Met oder Leu ist; und worin Y OH, Lys-OH, Arg-OH, Lys-Arg-OH oder Lys-NH&sub2; ist, wenn X Met ist oder worin Y Lys-NH&sub2;, Lys-OH oder Lys-Arg-OH ist, wenn X Leu ist). Hier steht -NH&sub2; für eine Amidgruppe an dem C-Terminus, während -OH für eine Carboxylgruppe an dem C-Terminus steht.
Die Erfindung schlägt ein Verfahren zur Synthetisierung eines Peptides mit der oben definierten Primärstruktur vor, umfassend die folgendne Schritte: Binden einer C-terminalen Aminosäure, die mit einer tert-Butoxycarbonylgruppe an dem N-Terminus geschützt worden ist, an einen Träger durch eine Amidgruppe oder eine Estergruppe, Eliminieren der tert-Butoxycarbonylgruppe, Kondensieren einer zweiten Aminosäure mit einer Schutzgruppe an dem N-Terminus mit der resultierenden C-terminalen Aminosäure, anschließendes Bewirken der Kondensationen nacheinander in der Folge der Struktur des beabsichtigten Peptides mit den folgenden Aminosäuren, Eliminieren der Schutzgruppen von dem Peptid und Herausnehmen des erhaltenen Peptides von dem Träger.
An das Verfahren kann sich die Reinigung des erhaltenen Peptides durch die Ionenaustauschchromatographie anschließen. Es ist bevorzugt, daß die Ausgangsaminosäure eine Schutzgruppe an einer reaktiven Gruppe der Seitenkette davon aufweist.
Verschiedene neue Entwürfe in dieser Erfindung wurden aus den folgenden Gründen gemacht. Da VIP von dem bekannten Vorläufer durch mehrere Schritte von enzymatischen Reaktionen erzeugt ist, wurde eine Substanz, worin X Met und Y OH, Lys-OH oder Lys-Arg-OH ist, als eine Verbindung entworfen, von der angenommen wird, daß sie in dem Zwischenschritt hergestellt wird. Eine Substanz, worin X Met und Y Arg-OH ist, wurde als eine Substanz entworfen, bei der Arg direkt an Gly gebunden ist, worin Arg eine basische Aminosäure wie Lys ist, und eine Substanz, worin X Met und Y Lys-NH&sub2; ist, wurde als eine Substanz entworfen, die den C-Terminus einer basischen Aminosäure aufweist, die in eine Amidgruppe zur weiteren Erhöhung der Basizität umgewandelt worden ist, obwohl diese nicht in der Natur auftreten.
Da Met an der 17. Position von VIP für eine Oxidation anfällig ist, so daß eine Inaktivierung aufgrund der Oxidation befürchtet wird, wurde die Substitution von Met an der 17. Position mit Leu entworfen, das gegen eine Oxidation resistent ist. Obwohl eine solche Sequenz in der natürlichen Substanz nicht gefunden wird, wurde eine Substanz entworfen, worin X Leu und Y Lys-OH, Lys-Arg-OH oder Lys-NH&sub2; ist, wobei in diesem Fall die Route von mehreren Schritten von enzymatischen Reaktionen von dem oben erwähnten bekannten Vorläufer berücksichtigt worden ist.
Die erfindungsgemäße Substanz wird durch eine Peptidkarte nach der enzymatischen Zersetzung und durch Aminosäureanalysewerte nach der Hydrolyse bestätigt. Zum Sicherstellen der weiteren Identifizierung sind (alpha)D und die Retentionszeit bei der HPLC als physikalische Konstanten in Tabelle 1 gezeigt. Die Anlage und die Bedingungen zum Messen von (alpha)D sind wie folgt:
Anlage: JASCO DIP-140 Digitalpolarimeter hergestellt von Nippon Bunko Co.
Bedingungen: Na Lampe 589 nm, Temperatur: 22ºC, Zell: 100 nm
Integrationszeit: 5 Sekunden
Konzentration 0,2% (in 0,1 N Essigsäure)
Die Säule, das Lösungsmittel, die Detektion, etc. bei der HPLC sind wie folgt:
Säule: YMC ODS 5 u, Durchmesser 4,6 mm X L 250 mm
Lösungsmittel: 0,1 % TFA-26,4% CH&sub3;CN&sub3;-73,5% H&sub2;O
Detektion: 215 nm
Bedingungen: 1,0 ml/min, isokratisch/Elution Tabelle 1 Retentionszeit (min)
Die erfindungsgemäße Substanz kann durch das bekannte Festphasen- oader Flüssigphasenverfahren synthetisiert werden. Beispielsweise kann sie unter Verwendung eines Peptidsynthetisators Modell 990B, hergestellt von Beckman, durch das Festphasenverfahren hergestellt werden, das im allgemeinen als das "Merrifield Verfahren" bezeichnet wird.
Eine C-terminale Aminosäure, die in der erfindungsgemäßen Substanz involviert ist, die mit einer tert-Butoxycarbonylgruppe (nachfolgend kurz mit "Boc" bezeichnet) an dem N-Terminus geschützt ist, die an ein Styrolharz gebunden ist, wird durch eine Amid- oder Esterbindung getragen. Spezifisch wird Boc-Gly, Boc-Lys (Cl-Z) oder Boc-Arg (Tos) beispielsweise an ein Benzhydrylaminharz, ein p-Methylbenzhydrylaminharz oder ein Chloromethylharz gebunden. Anschließend wird Boc mit einer Säure eliminiert. Eine Aminosäure an der zweiten Stelle von dem C-Terminus, die zuvor an dem N-Terminus und, falls erforderlich, an einer funktionellen Gruppe in der Seitenkette geschützt worden ist, wird mit der oben erwähnten Aminosäure zur Bildung einer Peptidbindung kondensiert. In diesem Fall wird die geschützte Aminosäure in einer 3 bis 5-fachen Menge der theoretischen Menge verwendet. Dicyclohexylcarbodiimid (nachfolgend kurz mit "DCC" bezeichnet) oder eine Mischung aus DCC und 1-Hydroxybenzotriazol (nachfolgend kurz mit "HOBt" bezeichnet) wird als das Kondensationsmittel verwendet. Die Vollendung der Reaktion wird durch einem Punkt bestätigt, bei dem die Reaktion einer Aminogruppe mit Ninhydrin negativ wird. Auf diese Weise werden Aminosäuren, die an dem N-Terminus und, falls erforderlich, an einer funktionellen Gruppe in der Seitenkette geschützt sind, der Reihe nach entsprechend der Aminosäurefrequenz in der primären strukturellen Formel der Substanz dieser Erfindung kondensiert, um schließlich die Substanz dieser Erfindung zu erhalten, bei der sowohl die funktionelle Gruppe als auch das N-Ende geschützt sind. Schließlich wird eine Behandlung mit Fluorwasserstoff durchgeführt, um die Schutzgruppe und das Harz von der erfindungsgemäßen Substanz zu eliminieren. Bei dieser Behandlung werden Anisol und Dimethylsulfid zugegeben, um die Nebenreaktion zu verhindern. Ein rohes Produkt, erhalten durch Entfernen von Fluorwasserstoff, kann durch Ionenaustauschchromatographie unter Verwendung von CM-Cellulose oder dergleichen gereinigt werden. Die Reinheit wird durch Hochleistungsflüssigchromatographie bestätigt. Falls erforderlich, kann eine weitere Reinigung durch präparative Hochleistungsflüssigchromatographie durchgeführt werden, unter Erhalt der erfindungsgemäßen Substanz in gereinigter Form. Die Bestätigung der Reinheit und die Struktur kann durch Hochleistungsflüssigchromatographie, Peptidkarte, Aminosäurenanalyse etc. durchgeführt werden.
Die erfindungsgemäßen Substanzen, die VIP Derivate sind, weisen eine höhere Aktivität für die Entspannung der glatten Muskeln eines Bronchus und/oder eine höhere hypertonische Aktivität als die von VIP selbst auf. Somit weisen die erfindungsgemäßen Substanzen bronchienerweiternde und hypotonische Aktivitäten auf und es wird von ihnen daher erwartet, daß sie als ein Asthmabehandlungsmittel und ein Hypotoniemittel in der Zukunft Nützlichkeit aufweisen. Da einige der Derivate eine Carboxylgruppe an dem C-Ende aufweisen, schaffen sie die Möglichkeit der Massenproduktion durch Genrekombination. Somit können sie anstelle des teuren VIP selbst verwendet werden.

Beispiel 1

1,25 g Boc-Lys(Cl-Z)-O-Harz (Boc-Lys(Cl-Z) Gehalt: 0,4 mmol/g, hergestellt von Peninsula Labs.) wurden in einem Reaktionskessel eines Peptidsynthetisators Modell 990 B, hergestellt von Beckman, angeordnet und zwei Stunden lang zum quellen in CH&sub2;Cl&sub2; gerührt. Anschließend wird Boc-Gly entsprechend dem Verfahren zur Reaktion gebracht, das aus den folgenden Schritten besteht:
(1) Dreimaliges Waschen mit 20 ml CH&sub2;Cl&sub2;;
(2) vorbereitendes Waschen mit 20 ml einer CH&sub2;Cl&sub2; Lösung aus 40% TFA und 0,05% Indol;
(3) Entblocken mit 20 ml einer CH&sub2;Cl&sub2; Lösung von 40% TFA und 0,05% Indol;
(4) Dreimaliges Waschen mit 20 ml CH&sub2;Cl&sub2;;
(5) Waschen mit 20 ml MeOH;
(6) Dreimaliges Waschen mit 20 ml CH&sub2;Cl&sub2;;
(7) Vorbereitendes Waschen mit 20 ml einer CH&sub2;Cl&sub2; Lösung aus 10% TEA;
(8) Neutralisieren mit 20 ml einer CH&sub2;Cl&sub2; Lösung aus 10% TEA;
(9) Dreimaliges Waschen mit 20 ml CH&sub2;Cl&sub2;;
(10) Auflösen von 2,5 mmol einer Boc-geschützten Aminosäure und 2,5 mmol an HOBt in einer gemischten Fljjssigkeit aus 7,5 ml DMF und 7,5 ml CH&sub2;Cl&sub2; und Zugabe der resultierenden Lösung; und
(11) Zugabe von 5 ml einer 0,5M CH&sub2;Cl&sub2; Lösung aus DCC und Durchführung einer Reaktion für 2 Stunden.
Die Einführung von Boc-Gly wird durch das oben erwähnte Verfahren vollendet.
Die Schritte (1) bis (11) werden wiederholt, zur Bildung einer Peptidkette, beginnend mit der Sequenz Gly in Richtung auf ein N-Ende.
Die geschützten Aminosäuren werden in der folgenden Reihenfolge zugegeben. Jede Aminosäure wurde in einer Menge von 2,5 mmol zugegeben, die 5mal soviel ist wie die von Lys, das an das Harz gebunden ist.
Boc-Asn 0,58 g/HOBt 0,34 g (die Gegenwart von HOBt verbessert die Kondensationsausbeute und verhindert die Razemisierung. Wenn jedoch His vorhanden ist, wird HOBt nicht verwendet, da Imidazol einer Änderung unterliegt. In diesem Fall werden 2,5 mmol HOBt zu jeder Aminosäure mit Ausnahme von His, die ein schließliches N-Ende ist, bei der Kupplung zugegeben). Boc-Leu . H&sub2;O 0,62g, Boc-Ile . 1/2 H&sub2;O 0,60 g, BOC-ser(Bzl) 0,74 g, Boc-Asn 0,58g, Boc-Leu . H&sub2;O 0,62 g, Boc-Tyr (Br-Z) 1,24 g; Boc-Lys (Cl-Z) 1,00 g, Boc-Lys (Cl-Z) 1,00 g Boc-Val 0,54 g, Boc-Ala 0,47 g, Boc-Leu . H&sub2;O 0,62g, Boc-Gln 0,62 , Boc-Lys (Cl-Z) 1,00 g, Aoc-Arg (Tos) . 1/4 EtoAc . 1/2 H&sub2;O 1,18g, Boc-Leu. H&sub2;O 0,62g, Aoc-Arg (Tos) . 1/4 EtoAc . 1/2 H&sub2;O 1,18 g, Boc-Thr (Bzl) 0,77g, Boc-Tyr (Br-Z) 1,24, Boc-Asn 0,58g, Boc-Asp (OcHex) 0,79 g, Boc-Thr (Bzl) 0,77 g, Boc-Phe 0,66 g, Boc-Val 0,54 g, Boc-Ala 0,47 g, Boc-Asp (OcHex) 0,79%, Boc-Ser (Bzl) 0,74g, Boc-His (Tos) 1,03g (Hoßt wird in diesem Fall nicht zugegeben).
Wenn die oben erwähnte Vorgehensweise vollendet ist, wird das folgende geschützte Peptid auf dem Harz synthetisiert.
Boc-His(Tos)-ser(Bzl)-Asp(OcHex)-Ala- Val-Phe-Thr(Bzl)-Asp(OcHex)-Asn-Tyr(Br -Z)-Thr(Bzl)-Arg(Tos)-Leu-Arg(Tos)-Lys (Cl-Z)-Gln-Leu-Ala-Val-Lys(Cl-Z)-Lys (Cl-Z)-Tyr(Br-Z) Leu-Asn-Ser(Bzl)-Ile-Leu-Asn-Gly-Lys(Cl-Z)-Harz.
Dieses geschützte Peptid, das an dem Harz haftet, wird den oben erwähnten Schritten (1) bis (9) unterworfen, filtriert und in einem Exsikkator über Nacht getrocknet. 3,25g eines getrockneten geschützten Peptides, das an dem Harz gebunden ist, wird erhalten. 1,3g davon werden mit 30 ml Fluorwasserstoff in der Gegenwart von 2 ml Anisol und 0,5 ml DM5 bei 0ºC für eine Stunde behandelt. Der Fluorwasserstoff wird abdestilliert. Der Rest wird mit einer gemischten Flüssigkeit aus wasserfreiem Ether und n-Hexan (1:1) gewaschen, nur mit wasserfreiem Ether gewaschen und ausreichend getrocknet. Das Peptid wird in 50 ml 10%iger Essigsäure aufgelöst uand das nicht gelöste Harz wird abfiltriert. Die erhaltene Lösung wird durch ein 0.22 um Millipore Filter filtriert, mit anschließendem Gefriertrocknen. 628 mg eines rohen Peptides werden erhalten. Anschließend wird das rohe Peptid einer CM-Cellulosesäule (2,5 Durchmesser 30 h cm) - Chromatographie unterworfen und mit AcONH&sub4; (pH: 7,0) eluiert (6,5 ml/fr), das eine geradlinige Neigung in dem Bereich von 0,05 M bis 0,5 M aufweist, zur Elution des gewünschten Peptides in der Fraktion Nr. 112 bis 119. Somit werden 104 mg eines teilweise gereinigten Peptides erhalten. Es wird dann einer Hochleistungsflüssigchromatographie unter den folgenden Bedingungen unterworfen:
Säule: YMC ODS u Durchmesser 10 mm X L 250 mm
Lösungsmittel: R und S, die unten erwähnt sind, werden hergestellt, ein Lösungsmittel mit einer geradlinigen Neigung im Bereich von einer gemischten Flüssigkeit aus 65% R und 35% S zu einer gemischten Flüssigkeit aus 40% R und 60% S wird verwendet:
R: CH&sub3;CN-H&sub2;O (1:99, enthaltend 0,1% TFA)
S: CH&sub3;CN-H&sub2;O (6:4, enthaltend 0,1% TFA)
Flußrate: 3 ml/min
10,0 mg eines reinen Peptides werden aus 17,4 mg des teilweise gereinigten Peptides durch die Chromatographie erhalten. In diesem Fall ist die Ausbeute 8,5%, wenn von einer Kupplung mit Asn berechnet wird. Die Peptidkarte und die Aminosäurenanalysenwerte werden bestimmt, um zu bestätigen, daß das Produkt eine Substanz entsprechend der Erfindung ist. Weiterhin werden der (alpha)22/D sowie die Retentionszeit als Werte der physikalischen Eigenschaften bestimmt. Bei diesem Beispiel wird die Substanz entspechend dieser Erfindung erhalten, worin X Leu und Y Lys-OH ist. Die in der Beschreibung verwendeten Abkürzungen entsprechen der Nomenklatur der IUPAC-IUB Kommission (Eur. J. Biochem. 138, 9 (1984), und sind wie folgt:
Bzl: Benzyl
Cl-Z: 2-Chlorobenzyloxycarbonyl
Tos: 4-Toluolsulfonyl
Br-Z: 2-Bromobenzyloxycarbonyl
OcHex: Cyclohexylester.
Die Ergebnisse der Aminosäurenanalyse der Substanz, die bei diesem Beispiel erhalten ist, durchgeführt durch die Erfinder dieser Erfindung, sind zum Vergleich unten gezeigt.
Die Hydrolysereaktion wird in 6N HCl (enthaltend 0,1% Phenol) bei 110ºC 20 Stunden lang durchgeführt mit anschließender Analyse mit einem Hitachi Aminosäureanalysator Modell 835. Wie unten beschrieben stimmen die beobachteten Werte gut mit den theoretischen Werten überein, was erhärtet, daß die Verbindung entsprechend dieser Erfindung eine gewünschte ist. Aminosäure Theoretischer Wert Erhaltener Wert

Beispiel 2

Es wird im wesentlichen das gleiche Verfahren wie bei Beispiel 1 wiederholt, bis die Vollendung der Einfügung der geschützten Aminosäuren nacheinander erreicht ist, mit der Ausnahme, daß 1,25 g Boc-Met anstelle der 0,62 g Boc-Leu.H&sub2;O-Einfügung der 17. Aminosäure von dem N-Terminal verwendet wird.
Wenn die Vorgehensweise vollständig vollendet ist, ist das folgende geschützte Peptid auf dem Harz synthetisiert.
Boc-His(Tos)-Ser(Bzl)-Asp(OcHex)-Ala- Val-Phe-Thr(Bzl)-Asp(OcHex)-Asn-Tyr(Br -Z)-Thr(Bzl)-Arg(Tos)-Leu-Arg(Tos)-Lys (Cl-Z)-Gln-Met-Ala-Val-Lys(Cl-Z)-Lys (Cl-Z)-Tyr(Br-Z)-Leu-Asn-Ser(Bzl)-Ile- Leu-Asn-Gly-Lys(Cl-Z)-Harz.
Nachdem die oben genannten Schritte (1) bis (9) durchgeführt sind, wird das geschützte Peptid, das an dem Harz gebunden ist, filtriert und in einem Exsikkator über Nacht getrocknet. 3.4 g des getrockenten, geschützten Peptides werden erhalten. 1,7 g des getrockneten, geschützten Peptides werden mit 30 ml Fluorwasserstoff in der Gegenwart von 2 ml Anisol und 0,5 ml DMS bei 0ºC für eine Stunde behandelt. Der Fluorwasserstoff wird abdestilliert, und der Rest wird mit einer gemischten Flüssigkeit aus wasserfreiem Ether und n-Hexan (1:1) gewaschen, nur mit wasserfreiem Ether gewaschen und ausreichend getrocknet. Das Peptid wird in 50 ml einer 10%igen Essigsäure aufgelöst und das nicht gelöste Harz wird abfiltriert. Die erhaltene Lösung wird durch ein 0,22 um Millipore Filter filtriert, mit anschließendem Gefriertrocknen. 834 mg eines rohen Peptides werden erhalten. Anschleißend wird mit dem rohen Peptid eine CM-Cellulosesäule (2,5 Durchmesser x 30 h cm) - Chromatographie durchgeführt und es wird mit AcONH&sub4; (pH: 7.0) mit einer geraden Neigung in dem Bereich von 0,05 M bis 0,5 M eluiert (6,5 ml/fr), zur Elution des gewünschten Peptides in den Fraktionen Nr. 109 bis 121. Somit werden 303 mg eines teilweise gereinigten Peptides erhalten. Mit ihm wird dann eine Hochleistungsflüssigchromatographie unter den folgenden Bedingungen durchgeführt.
Säule: YMC ODS 5 um Durchmesser 10 mm X L 250 mm,
Lösungsmittel: R und S, die unten erwähnten sind, werden hergestellt; ein Lösungsmittel mit einer geraden Neigung in dem Bereich von einer gemischten Flüssigkeit aus 65% R und 35% S zu einer gemischten Flüssigkeit aus 40% R und 60% S wird verwendet:
R: CH&sub3;CN-H&sub2;O (1:99, umfassend 0,1% TFA)
S: CH&sub3;CN-H&sub2;O (6:4, umfassend 0,1% TFA).
Flußrate: 3 ml/min.
11.5 mg eines reinen Peptides werden aus 16,3 mg des teilweise gewaschenen Peptides durch die Chromatographie erhalten. In diesem Fall ist die Ausbeute 24,3%, wenn von der Kuplung mit Asn berechnet wird. Die Peptidkarte und die Aminosäurenanalysenwerte werden bestimmt, um zu bestätigen, daß das Produkt eine Substanz entsprechend dieser Erfindung ist. Weiterhin werden der (alpha)D Wert und die Retentionszeit als Werte von physikalischen Eigenschaften bestimmt. Bei diesem Beispiel wird die Substanz entsprechend dieser Erfindung erhalten, worin X Met und Y Lys-OH ist. Die Abkürzungen in der Beschreibung sind die gleichen wie bei Beispiel 1.
Die Ergebnisse der Aminosäureanalyse der Substanz, die gemäß diesem Beipsiel erhalten wird, durchgeführt durch die Erfinder dieser Erfindung, sind unten zum Vergleich gezeigt.
Die Hydrolysereaktion wird in 6N HCl (umfassend 0,1% Phenol) bei 110ºC für 20 Stunden durchgeführt, mit anschließender Analyse mit einem Hitachi Aminosäureanalysator Modell 835. Wie unten beschrieben, stimmen die beobachteten Werte gut mit den theoretischen Werten überein, was bestärkt, daß die Verbindung eine gewünschte entsprechend dieser Erfindung ist. Aminosäure Theoretischer Wert Erhaltener Wert
Die Wirkungen dieser Erfindung werden nun durch das folgende experimentelle Beispiel gezeigt.

Experimentelles Beispiel

Proben:

Die erfindungsgemäße Substanz wird als eine Probe verwendet. Ein natürliches VIP (nachfolgend kurz mit "VIP-NH&sub2;" bezeichnet) und ein synthetisches VIP Derivat (nachfolgend kurz mit "VIP-HO" bezeichnet), bei dem die C-terminale Amidgruppe von VIP mit einer Carboxyl-OH-Gruppe substituiert worden ist, werden als Kontrollproben hergestellt und verwendet.

Verfahren:

Die folgenden beiden Bestimmungen A und B werden durchgeführt.

A: Bestimmung bei der Relaxation des Muskels von Bronchus, entfernt von Meerschweinchen:

Die Jugularvene eines männlichen Meerschweinchens mit einem Gewicht von 300g oder mehr wird geschnitten, was verursacht, daß das Meerschweinchen ausblutet. Mit dem Meerschweinchen wird eine Brustwanderöffnung durchgeführt. Unmittelbar nach der Brustwanderöffnung werden 3 cm der Trachea herausgenommen. Die Trachea wird unmittelbar in eine Krebslösung gegeben. Sie wird dann in 7 gleiche Ringe geschnitten und die Knorpel werden mit einem Baumwollgarn zur Bildung einer Kette miteinander verbunden. Anschließend werden die glatten Muskelteile und die Knorpel gegenüberliegend von diesen geschnitten, so daß die glatten Muskelteile miteinander verbunden werden können. Die Herstellung, die somit erzeugt ist, wird in einer isothermen Glaszelle mit einer inneren Kapazität von etwa 7 ml angeordnet und von oben suspendiert. Der untere Teil des Präparates wird fixiert, während der obere Teil mit einem isometrischen Transducer verbunden wird, auf den eine Beladung von 0,5g auferlegt worden ist, um die Relaxationsreaktion zu bestimmen. Ausreichende Mengen an 95% Sauerstoff und 5% Kohlendioxidgas werden in das Präparat eingeblasen. Weiterhin wird eine Krebslösung mit 37ºC, die 6,5 x 10&supmin;&sup6; M Histamin enthält, auf das Präparat von oben mit einer Flußrate von 3,3 ml/min. getropft. Die Relaxationsreaktion findet bis zu einem Ausmaß statt, der der Menge einer Probe proportional ist, die zu der zugetropften Lösung zugegeben ist. Unter Anwendung dieser Beziehung wird die Relaxationsaktivität gegen den bronchialen glatten Muskel im Hinblick auf die Substanz dieser Erfindung mit der von VIP-NH&sub2; verglichen. VIP-NH&sub2; wird bei einer Konzentration von 10&supmin;&sup5; M verwendet und in Mengen von 40 ul und 80 ul getropft. Die erfindungsgemäße Substanz wird ebenfalls bei einer Konzentration von 10&supmin;&sup5; M verwendet und in Mengen von 10 ul und 20 ul getropft. Der Wert der Fläche (Höhe x Zeit) bei der Relaxation in jedem Fall wird bestimmt. Die spezifischen Aktivitäten werden erhalten, indem der Flächenwert von VIP-NH&sub2; als 100% genommen wird, und indem das relative Verhältnis des Flächenwertes eines jeden Falles bestimmt wird. Somit werden die Relaxionsreaktionen durch das Vierpunkt-Untersuchungsverfahren im Hinblick auf das oben erwähnte Bestimmungsverfahren verglichen, wobei auf die folgenden Artikel (e) und (f) Bezug genommen werden kann:
(e) W.L.M. Perry, Pharmacological Experiments on Isolated Preparations: E & S Livingstone LTD. 1968; und
(f) Castillo, De Beer, J. Phamac. Exp. Ther. 90, 104 (1947).

B. Bestimmung des Halsschlagaderdruckes bei Ratten:

Eine SD-männliche Ratte mit einem Körpergewicht von 200 g wird durch intraperitoneale Verabreichung von 48% Urethan bei einer Dosis von 2,7 ml/kg anästhetisiert. Um die Ratte zu injizieren wird eine Kanüle in die Halsschlagarterie gelegt. Die Kanüle eines Transducers für die Bestimmung des Blutdruckes wird ebenfalls bei der Halsschlagarterie vorgenommen. Eine Probe von 12,5 pmol/kg bis 400 pmol/kg wird in die Halsschlagarterie verabreicht und die Änderung des Blutdruckes wird mit einem Polygraph aufgezeichnet, unter Erhalt einer Dosis-Antwortkurve. Die Menge der Probe, die erforderlich ist, um eine Senkung des Blutdruckes um 15 mmHg zu erzeugen, wird von der Kurve bestimmt. Die erforderliche Menge an VIP-NH&sub2; wird als 100% genommen und die spezifische Aktivität einer jeden Probe wird durch Berechnen der relativen Verhältnisse erhalten.
Im Hinblick auf das oben erwähnte Bestimmungsverfahren kann auf den folgenden Artikel (g) verwiesen werden:
(g) Suzuki, Araki und Tachibana, Yakugaku Zasshi, 99 (2), 172 (1979).

Ergebnisse:

Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 gezeigt. In der Tabelle ist der Wert in der Spalte A die spezifische Aktivität (%), erhalten durch das oben erwähnte Verfahren A, während der Wert in Spalte B die spezifische Aktivität (%) ist, die durch das oben erwähnte Verfahren B erhalten wird. Wie aus der Tabelle 2 ersichtlich ist, weist die erfindungsgemäße Substanz eine höhere Aktivität für die Relaxation des glatten Muskels eines Bronchius und/oder eine höhere hypertonische Aktivität als die von dem natürlichen VIP auf. Tabelle 2 Probe Spezies Kontrolle

Claims

1. Ein Peptid mit der primären strukturellen Formel:

His-Ser-Asp-Ala-Val-Phe-Thr-Asp- Asn-Tyr-Thr-Arg-Leu-Arg-Lys-Gln- X-Ala-Val-Lys-Lys-Tyr-Leu-Asn- Ser-Ile-Leu-Asn-Gly-Y

worin X Met und Y OH, Lys-OH, Arg-OH, Lys-Arg-OH oder Lys-NH&sub2; ist oder worin X Leu und Y Lys-NH&sub2;, Lys-OH oder Lys-Arg-OH ist.

2. Peptid nach Anspruch 1, worin X Met ist und worin Y OH, Lys-OH, Arg-OH, Lys-Arg-OH oder Lys-NH&sub2; ist.

3. Peptid nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß X Leu ist und daß Y Lys-NH&sub2;, Lys-OH oder Lys-Arg-OH ist.

4. Verfahren zum Synthetisieren eines Analogons eines vasoaktiven intestinalen Polypeptides, umfassend die folgenden Schritte: Binden einer C-terminalen Aminosäure, die mit einer tert-Butoxycarbonylgruppe an dem N-Ende geschützt worden ist, an einen Träger durch eine Amidgruppe oder eine Estergruppe, Eliminieren der tert-Butoxycarbonylgruppe, Kondensieren einer zweiten Aminosäure mit einer Schutzgruppe an dem N-Ende mit der resultierten C-terminalen Aminosäure, anschließendes Bewirken der aufeinander folgenden Kondensationen in der Folge der Struktur des beabsichtigten Peptides mit den folgenden Amnosäuren, Eliminieren der Schutzgruppen von dem Peptid und Herausnehmen des erhaltenen Peptides aus dem Träger;

dadurch gekennzeichnet, daß das Analogon die primäre strukturelle Formel aufweist:

worin X Met ist und Y OH, Lys-OH, Arg-OH, Lys-Arg-OH oder Lys-NH&sub2; ist, oder worin X Leu und Y Lys-NH&sub2;, Lys-OH oder Lys-Arg-OH ist.

5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß es weiterhin die Reinigung des erhaltenen Peptides durch die Ionenaustauschchromatographie umfaßt.

6. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Ausgangsaminosäure eine Schutzgruppe an einer reaktiven Gruppe der Seitenkette davon aufweist.

7. Pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend eine Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 3 und einen pharmazeutisch akzeptablen Träger.

8. Verwendung der Verbindungen nach einem der Ansprüche 1 bis 3 bei der Herstellung eines Medikamentes mit bronchienerweiternder und hypotonischer Aktivität.