DE2647843A1 - Neue peptide, ihre herstellung sowie verfahren zur herstellung cyclischer peptide - Google Patents

Description

Die Erfindung bezieht sich auf die Cyclisierung von Peptiden, insbesondere auf Verfahren zur Behandlung von Peptiden, die einen Cysteinrest in der Aminosäuresequenz und einen Cystinrest am Aminoende aufweisen, zur Erzeugung von Disulfidbindungen zwischen diesen Resten und Bildung einer Ringstruktur. Derartige Verfahren werden bei der Synthese von Peptiden mit biologischer Aktivität gebraucht, die sich zur Behandlung bestimmter Erkrankungen bei Menschen und Tieren eignen.

Die Erfindung bezieht sich ferner auf Peptid-Zwischenprodukte als Vorläufer cyclischer Disulfid-Peptide sowie auf die Herstellung dieser Peptid-Zwischenprodukte,

Es sind zahlreiche Peptide mit biologischer Aktivität bekannt, die sich zur Behandlung von bestimmten

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— ^^ —

Erkrankungen eignen und einen Disulfidring enthalten. Calcitonine, die sich zur Behandlung der Paget-Krankheit eignen, enthalten eine Ringstruktur, an der die Cysteingruppen in den Positionen 1 und 7 ihrer Aminosäureketten beteiligt sind. Oxytocin eignet sich z.B. zur therapeutischen Induktion oder Stimulation von Beanspruchungen bzw. Streß bei Menschen und Tieren sowie zur Kontrolle von Gebärmutterblutungen nach der Geburt. Es enthält eine Disulfid-Ringstruktur zwischen den Cysteingruppen in den Positionen 1 und 6 der Aminosäurekette. Vasopressin und sein Analogon Lypressin werden als antidiuretische Mittel in der Humanmedizin eingesetzt und enthalten Disulfid-Ringstrukturen zwischen den Cysteingruppen in den Positionen 1 und 6 ihrer Aminosäuresequenz (vgl. das Handbook of Biochemistry, S. C-164 bis c-188).

Obgleich Art und Sequenz der Aminosäuregruppen bei den Calcitoninen, Oxytocin, Vasopressin und anderen natürlich vorkommenden Peptiden je nach der Spezies, von der sie gewonnen sind, variieren können, enthalten doch alle derartigen Peptide, die ausgehend von natürlichen Quellen wie etwa durch Extraktion von Drüsen von Menschen, Haustieren, Fischen, Fröschen oder Reptilien erhalten wurden, die oben genannte Ringstruktur.

Die Aminosäuresequenzen einiger bekannter biologisch aktiver Peptide, die durch Disulfidbrücken in einer Ringstruktur verknüpfte Cysteingruppen enthalten, sind in der Tabelle I aufgeführt.

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Tabelle I

Typische Peptide mit Cystein-Ringstrukturen

Oxytocin: H-CYS-TYR-ILE-GLN-ASN-CYS-PRo-LEU-GLY-NH₉

1 I

Vasopressin: H-CYS-TYR-PHE-GLN-ASN-CYS-PRO-ARG-GLY-Nh₂

I I

Lachs- _H-CYS-SER-ASN-LEU-SER-THR-CYS-VAl-LEU-GLY₁ Calci tonin: Γ

t-LYS-LEU-SER-GLN-GLU-LEU-HIS-LYS-LEU-GLN-THR-i

LTYR-PRO-ARG-THR-ASN-THR-GLY-SER-GLY-THR-PrO-NH₂

menschliches H-CYS-GLY-ASN-LEU-SER-THR-CYS-MET-LEU-GLY-THR-f

Calcitonin: j *

^LTYR-THR-GLN-ASP-PHE-ASN-LYS-PHE-HIS-THR-PHEn

PRO-GLN-THR-ALA-ILE-GLY-VAL-GLY-ALA-PRO-Nh₂

Schweine- H-CYS-SER-ASN-LEU-SER-THR-CYS-VAL-LEU-SER

Calcitonin:

ALA-TYR-TRP-ARG-ASN-LEU-ASN-ASN-PHE-HIS-ARG-

Rinder- H-CYS-SER-ASN-LEU-SER-THR-CYS-VAL-LEU-SER-ALAn

Calci toni η: l :

J-TYR-TRP-LYS-ASP-LIiU-ASN -ASN-TYR-M IS -ARG-LMIE

'III·.-ι

LSER-GLY-MET-GLY-PHE-GLY-PRO-GLU-THr-PRO-NH₂

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Bei früher unternommenen Versuchen zur Herstellung synthetischer Peptide wie etwa der in Tabelle I angegebenen bestand das einzige verfügbare Verfahren zur Herstellung einer geschlossenen Disulfid-Ringstruktur darin, die Herstellung eines Peptid-Zwischenprodukts mit der erwünschten Aminosäurekette zu versuchen und dieses Peptid anschließend unter Verwendung von Oxidationsmitteln einem Oxidationsprozeß zur Erzeugung von Disulfidbrücken zwischen den beiden Cysteinresten zu unterziehen. Derartige Oxidationsverfahren sind in der Literatur beschrieben (vgl. etwa P.G. Katsoyannis, The Chemistry of Polypeptides, Plenum Press 1974, S. 60 - 85).

Einer der Hauptnachteile dieser Verfahren besteht darin, daß die hoch labilen Peptidmoleküle Oxidationsmitteln ausgesetzt werden. Diese Behandlung kann zu einer Inaktivierung des Peptids führen, was entsprechend zu einer niedrigeren Ausbeute an biologisch aktiven Produkten führt.

Es bestand daher auf diesem Gebiet bereits seit langem ein großes Bedürfnis nach zufriedenstellenderen Verfahren zur Erzeugung von Disulfidbindungen zwischen den Cysteingruppen von Peptiden, bei denen keine Oxidationsmittel verwendet werden müssen.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, praktisch durchführbare und zugleich wirksame Verfahren zur Bildung cyclischer Disulfidbindungen zwischen den Cysteinresten von Peptiden zu entwickeln sowie entsprechende Peptid-Zwischenprodukte und deren Herstellung anzugeben.

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AO

Von den Erfindern wurde bereits ein Verfahren zur Herstellung derartiger Bindungen zwischen Cysteinresten angegeben, das in der US-Patentanmeldung 505 344 vom 12. September 1974 beschrieben ist.

Der Erfindung liegt die Auffindung eines weiteren Verfahrens zur Herstellung derartiger Bindungen zwischen einem Cysteinrest innerhalb der Aminosäuresequenz und einem Cysteinrest am N-terminalen Ende der Aminosäurekette zugrunde. Das erfindungsgemäße Verfahren vermeidet ferner die Anwendung oxidativer Reaktionsbedingungen. Es führt zu Peptiden, deren Thiölfunktion der Cysteinreste am N-terminalen Ende des Peptids durch Bindung über eine Disulfidbrücke an eine zweite Cysteingruppe geschützt ist. Die Kombination zweier mit einer Disulfidbindung verknüpfter Cysteingruppen stellt die Aminosäure Cystin dar. Die Disulfidbindung des Cystins ist gegenüber den nachgeschalteten sauren Spaltungsbedingungen stabil, die bei der Peptidsynthese üblicherweise verwendet werden, beispielsweise gegen flüssigen Fluorwasserstoff oder Bromwasserstoff in Essigsäure. Der zweite Cysteinrest des Peptids, der sich in irgendeiner anderen Position befindet, die zur Erzielung der erwünschten Sequenz erforderlich ist, ist an seiner Thiolfunktion mit einer gegen Säurespaltung labilen Gruppe wie etwa einer t-Butylthiogruppe oder einer Benzylgruppe oder deren sowie ähnlichen Derivaten geschützt. Das nach dem nachfolgenden Spaltungsschritt erhaltene resultierende Peptid-Zwischenprodukt enthält einen Cystinrest am Aminoende der Kette und eine freie Thiolfunktion am zweiten Cysteinrest, der sich in irgendeiner anderen Position befindet, die zur erwünschten Aminosäuresequenz führt. Dieses Peptidzwischenprodukt kann in sauerstofffreier Lösung gehalten werden, bis eine spontane Umlagerung eintritt, bei der der erwünschte Disulfidring zwischen den beiden

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Cysteinresten unter Verdrängung einer Hälfte des Cystinrests oder der Cystein-Schutzgruppe vom Cysteinrest am Aminoende des Zwischenpeptids vervollständigt wird. Das Gesamtverfahren liefert so das erwünschte cyclische Disulfidpeptid durch ein einfaches, unter milden Bedingungen ablaufendes Umlagerungsverfahren, bei dem keinerlei Oxidationsmittel oder oxidative Reaktionsbedingungen angewandt werden.

Das erfindungsgemäße Verfahren eignet sich zur Synthese aller cyclischen Disulfid-Peptide, bei denen die Disulfidbindung zwischen zwei Cysteinresten in der Aminosäurekette erfolgt, von denen sich ein Cysteinrest am N-terminalen Ende der Peptidkette befindet. Das Verfahren ist insbesondere bei der Synthese labiler biologisch aktiver Peptide von besonderem Vorteil, da die Bildung der Disulfidbindung unter Bedingungen erfolgt, bei denen eine Oxidation vermieden ist und zugleich auch keine anderen störenden Einflüsse auf die Peptidstruktur gegeben sind.

Man beginnt mit der Herstellung eines entsprechenden intermediären Peptids und baut die Aminosäurekette beispielsweise von Oxytocin, Calcitonin oder anderer derartiger Peptide mit zwei Cysteinresten auf. Die Aminosäurekette kann dabei unter Anwendung herkömmlicher Syntheseverfahren oder neuer Syntheseverfahren an festen Trägern erfolgen; hierzu vgl. etwa R.B. Merrifield, 'Advances in Enzymology', Interscience, New York, 1969, Kapitel 32, S. 221 - 96,sowie etwa J. Stewart und J. Young, 'Solid Phase Peptide Synthesis', W.H. Preemann & Co., San. Francisco, 1969).

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Erfindungsgemäß wird die trägergebundene Peptidsynthese an fester Phase bevorzugt. Bei dieser Synthese werden die Aminosäuren jeweils einzeln schrittweise an das Harz angekuppelt, bis die gesamte Peptidsequenz am Harz aufgebaut ist. Die funktioneilen Gruppen der Aminosäuren werden dabei durch Schutzgruppen geschützt.

Die Ql/_Aminogruppe der Aminosäuren wird z.B. durch die t-Butyloxycarbonyl-Gruppe (als BOC abgekürzt) geschützt.

Die Hydroxylfunktionen von Serin und Threonin werden mit Benzylgruppen oder Derivaten von Benzylgruppen wie beispielsweise 4-Methoxybenzyl, 4-Methylbenzyl, 3.4-Dimethylbenzyl, 4-Chlorbenzyl, 2.6-Dichlorbenzyl, 4-Nitrobenzyl, Benzhydryl oder damit äquivalenten Gruppen geschützt. Die Benzylgruppen bzw. Gruppen aus Benzylderivaten werden mit BZ abgekürzt.

Die Hydroxylfunktion des Tyrosins kann ungeschützt bleiben, jedoch auch mit Benzylgruppen oder Gruppen von Benzylderivaten wie oben (BZ-Gruppen) oder durch Benzyloxycarbonylgruppen oder Benzyloxycarbonylderivate wie 2-Chlorbenzyloxycarbonyl oder 2-Brombenzyloxycarbonylgruppen oder ihnen äquivalente Gruppen geschützt werden. Die Abkürzung V/ bezeichnet dabei entweder keine Schutzgruppe oder eine BZ-Gruppe, eine Benzyloxycarbonylgruppe oder ein Derivat einer Benzyloxycarbonylgruppe.

Die Guanidinofunktion des Arginins kann durch eine Nitrogruppe, eine Tosylgruppe oder eine ihnen äquivalente Gruppierung geschützt werden. Zur Bezeichnung einer

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Nitrogruppe oder einer Tosylgruppe wird die Abkürzung T verwendet.

Die ζ-Aminofunktion des Lysins kann durch eine Benzyloxycarbonylgruppe oder ein Benzyloxycarbonylderivat wie etwa 2-Chlorbenzyloxycarbonyl, 2-Brombenzyloxycarbonyl, 3.4-Dimethylbenzyloxycarbonyl oder eine ihnen äquivalente Gruppierung geschützt werden. Zur Bezeichnung einer Benzyloxycarbonylgruppe oder eines Derivats einer Benzyloxycarbonylgruppe wird die Abkürzung V verwendet.

Als Schutzgruppen für den Imidazolstickstoff des Histidins werden Benzyloxycarbonylgruppen und Derivate von Benzyloxycarbonylgruppen wie oben für Lysin beschrieben verwendet, die mit V bezeichnet sind.

Die (^-Carboxylgruppen von Glutaminsäure und Asparaginsäure werden mit einer Benzylgruppe oder einem Derivat einer Benzylgruppe wie zum Schutz der Hydroxylfunktionen von Serin und Threonin beschrieben geschützt. Diese Schutzgruppen werden mit BZ bezeichnet.

Die säureempfindliche Schutzgruppe für die Thiolfunktion des Cysteins ist mit P abgekürzt. Unter säureempfindlichen Schutzgruppen werden hierbei solche Gruppen verstanden, die durch starke Säuren wie flüssigen Fluorwasserstoff oder andere Halogenwasserstoffsäuren in Essigsäure oder Trifluoressigsäure abgespalten v/erden. Die Bezeichnung P wird entsprechend zur Bezeichnung säureempfindlicher Gruppen wie der t-Butylthiogruppe, der Isopropylthiogruppe,

der Benzylgruppe oder Benzylderivat-Gruppen wie etwa

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4-Methoxybenzyl, 4-Methylbenzyl, 3.4-Dimethylbenzyl, 4-Chlorbenzyl, 2.6-Dichlorbenzyl, 4-Nitrobenzyl, Benzhydryl oder ihnen äquivalenter Gruppen verwendet.

Die Disulfid-Peptide, auf die das erfindungsgemäße Verfahren anwendbar ist, besitzen mindestens zwei Cysteinreste, von denen sich einer am Aminoende der Aminosäuresequenz befindet.

Die cyclischen Disulfid-Peptide werden in drei Stufen erhalten; schematisch:

Peptid-Synthese-

BOC-CYS

Schritt 1

BOC-CYS-A_n-CYS-A_m-X

H-CYS

Schritt 2

H-CYS-A_n-CYS-A_m-X'

1 Schritt 3

I 1 *

H-CYS-A_n-CYS-A_1n-X' + CYS

Dabei bedeuten:

BOC = oc_t-Butyloxycarbonyl A = Aminosäurekette X = NH₂, OH oder feste

Phase des Trägerharzes

OH oder NH,

P = säureempfindliche Schutzgruppe

η und m = 0 oder eine

der erwünschten Peptidsequenz entsprechende ganze Zahl

In Schritt 1 wird ein Peptid-Zwischenprodukt hergestellt, dessen funktioneile Gruppen außer der Thiolgruppe des Cysteinrests am Aminoende der Peptidkette mit säureempfindlichen Gruppen geschützt sind. Pur diesen Rest wird eine Cystingruppe verwendet, die einem Cysteinrest entspricht, dessen Thiolfunktion durch Bildung von Disulfidbindungen mit einer anderen

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Cysteingruppe geschützt ist. Der andere Cysteinrest in der Aminosäuresequenz des erwünschten Peptids weist eine mit einer säureenpfLndüchenSchutzgruppe wie einer Benzylgruppe oder einem entsprechenden Derivat geschützte Thiolfunktion auf.

Schritt 2 des Verfahrens besteht in der Säurebehandlung des Peptid-Zwischenprodukts zur Entfernung aller Schutzgruppen vom Peptid außer der säurebeständigen Disulfid-Schutzgruppe, die im Cystinrest am Aminoende des Peptids enthalten ist. Der andere Cysteinrest in der erwünschten Peptidsequenz besitzt damit eine freie Thiolgruppe. Seine säureempfindliche Schutzgruppe wurde durch den Säurespaltungsschritt entfernt.

Schritt 3 des erfindungsgemäßen Verfahrens besteht in der Erzeugung der erwünschten Disulfidbindung zwischen den beiden Cysteinresten der Sequenz. Dieser Schritt erfolgt durch spontane Umlagerung in einem sauerstofffreien Medium unter Verdrängung des Cysteins vom aminoterminalen Cystinrest.

Nach der Verfahrensweise der Peptidsynthese an festen Trägern wird die Aminosäure der höchstindizierten Position der zu synthetisierenden Peptidkette unter Verwendung der oben genannten Schutzgruppen an das Trägerharz gekuppelt, worauf die BOC-Schutzgruppen der ^-Aminogruppen entfernt werden; darauf wird die nächste Aminosäure der nächstfolgenden Position an die zuletzt hinzugefügte Aminosäuregruppe unter Verwendung geeigneter Schutzgruppen angekuppelt; in dieser Weise wird weiter verfahren, bis die erwünschte Aminosäurekette vollständig aufgebaut ist.

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Dabei können geeignete Kombinationen von Aminosäuregruppen und Schutzgruppen hergestellt und diese Kombination mit dem zuvor hergestellten Peptid zur Verknüpfung der nachfolgenden Aminosäuregruppen zur Reaktion gebracht werden. Derartige geschützte Aminosäuren sind auch im Chemikalienhandel erhältlich.

Zur Erläuterung der Synthese von Aminosäureketten, die in typischen Peptiden, auf die das erfindungsgemäße Verfahren anwendbar ist, vorkommen, sind in den Tabellen II bis VII einige typische Reaktanten (die die Aminosäuregruppe und Schutzgruppen enthalten) angegeben, die sich zur Verwendung.bei der Synthese typischer Aminosäuresequenzen eignen.

Tabelle II

Typische Reaktanten zur Verwendung bei der Oxytocin-

Synthese

Position Aminosäure-

Nr. Reaktant

9 BOC-Glycin

8 BOC-L-Leucin

7 BOC-L-Prolin

6 BOC-S-p-Methoxybenzyl-L-cystein,

BOC-S-Benzyl-L-cystein, BOC-S-3.4-Dimethylbenzyl-L-cystein, BOC-S-Isopropylthio-L-cystein oder BOC-S-t-Butylthio-L-cystein

5 BOC-L-Asparagin-p-nitrophenylester

4· BOC-L-Glutamin-p-nitrophenylester

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3 BOC-L-Isoleucin

2 BOC-O-Benzyl-L-tyrosin, BOC-L-

Tyrosin Oder B0C-0-2~Brombenzyloxycarbonyl-L-tyrosin

1 Bis-BOC-L-Cystin

Tabelle III

Typische Reaktanten zur Verwendung bei der Synthese von Lachs-Calcitonin

Position Aminosäure-

Nr. Reaktant

32 BOC-L-Prolin

31 BOC-0-Benzyl-L-threonin

30 BOC-Glycin

29 BOC-0-Benzyl-L-serin

28 BOC-Glycin

27 BOC-0-Benzyl-L-threonin

26 BOC-L-Asparagin-p-nitrophenylester'

25 BOC-0-Benzyl-L-threonin

24 BOC-t-tf-Nitro-L-arginin oder

BOC-co-Tosyl-L-arginin

23 BOC-L-Prolin

22 BOC-0-Benzyl-L-tyrosin, BOC-L-

Tyrosin oder B0C-0-2-Brombenzyloxycarbonyl-L-tyrosin

21 BOC-0-Benzyl-L-threonin

20 BOC-L-Glutamin-p-nitrophenylester

19 BOC-L-Leucin

18 BOC- ε-CBZ-L-Lysin oder BOC-fc-2-

Chlorbenzyloxycarbonyl-L-lysin

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(Fortsetzung von Tabelle III«)

17 BOC-N(im)-CBZ-L-Histidin

16 BOC-L-Leucin

15 BOC-L-Glutaminsäure-^f-benzylester

14- BOC-L-Glutamin-p-nitrophenylester

13 BOC-L-Benzyl-L-serin

12 BOC-L-Leucin

11 BOC-e -CBZ-L-Lysin oder BOC- £-2-

Chlorbenzyloxycarbonyl-L-lysin

10 BOC-Glycin

9 BOC-L-Leucin

8 BOC-L-Valin

7 BOC-S-p-Methoxybenzyl-L-cystein,

BOC-S-Benzyl-L-cystein, BOC-S-J)A-Dimethylbenzyl-L-cystein, BOC-S-Isopropylthio-L-cystein oder BOC-S-t-Butylthio-L-cystein

6 BOC-O-Benzyl-L-threonin

5 BOC-0-Benzyl-L-serin

4 BOC-L-Leucin

3 BOC-L-Asparagin-p-nitrophenylester

2 BOC-0-Benzyl-L-serin

1 Bis-BOC-L-cystin

Tabelle IV

Typische Reaktanten zur Verwendung bei der Synthese von menschlichem Calcitonin

Position Nr.	Aminosäure- Reaktant
32	BOC-L-Prolin
31	BOC-L-Alanin
30	BOC-Glycin

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/a'

(Fortsetzung von Tabelle IV:)

29 BOC-L-Valin

28 BOC-Glycin

27 BOC-L-Isoleucin

26 BOC-L-Alanin

25 BOC-0-Benzyl-L-threonin

24 BOC-L-Glutamin-p-nitrophenylester

23 ' BOC-L-Prolin

22 BOC-L-Phenylalanin

21 BOC-0-Benzyl-L-threonin

20 BOC-N(im)-CBZ-L-Histidin

19 BOC-L-Phenylalanin

18 BOC- a-CBZ-L-Lysin oder BOC- £-2-

Chlorbenzyloxycarbonyl-L-lysin

17 BOC-L-Asparagin-p-nitrophenylester

16 BOC-L-Phenylalanin

15 BOC-L-Asparaginsäure-^-benzylester

14 BOC-L-Glutamin-p-nitrophenylester

13 ' BOC-0-Benzyl-L-threonin

12 BOC-0-Benzyl-L-tyrosin, BOC-L-

Tyrosin oder B0C-0-2-Brombenzyloxycarbonyl-L-tyrosin

11 BOC-0-Benzyl-L-threonin

10 BOC-Glycin

9 BOC-L-Leucin

8 BOC-L-Methionin

7 BOC-S-p-Methoxybenzyl-L-cystein, BOC-

S-Benzyl-L-cystein, BOC-S-3.4-Dimethylbenzyl-L-cystein, BOC-S-Isopropylthio-L-cystin oder BOC-S-t-Butylthio-L-cystein

6 BOC-0-Benzyl-L-threonin

5 BOC-0-Benzyl-L-serin

4 BOC-L-Leucin

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(Fortsetzung von Tabelle IV;)

3 BOC-L-Asparagin-p-nitrophenylester

2 BOC-Glycin

1 Bis-BOC-L-Cystin

Tabelle V

Typische Reaktanten zur Verwendung bei der Vaso-

pre s s in-Synthe s e

Position Aminosäure-

Nr. Reaktant

9 BOC-Glycin

8 BOC-co-Tosyl-L-arginin oder BOC-oj -

Nitro-L-arginin

7 BOC-L-Prolin

β BOC-S-p-Methoxybenzyl-L-cystein, BOC-

S-Benzyl-L-cystein, B0C-S-5.4-Dimethylbenzyl-L-cystein, BOC-S-Isopropylthio-L-cystein oder BOC-S-t-Butylthio-L-cystein

5 BOC-L-Asparagin-p-nitrophenylester

4 BOC-L-Glutamin-p-nitrophenylester

3 BOC-L-Phenylalanin

2 BOC-O-Benzyl-L-tyrosin, BOC-L-Tyrosin,.

oder BOC-O-2-Brombenzyloxycarbonyl-L-tyrosin

1 Bis-BOC-L-Cystin

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(4

Tabelle VI

Typische Reaktanten zur Verwendung bei der Synthese

von Schweine-Calcitonin

Position Aminosäure-

Nr. ' reaktant

32 BOC-L-Prolin

31 BOC-O-Benzyl-L-threonin

30 BOC-L-Glutaminsäure-f -Benzylester

29 BOC-L-Prolin

28 BOC-Glycin

27 BOC-L-Phenylalanin

26 BOC-Glycin

25 BOC-L-Methionin

24 BOC-Glycin

23 BOC-0-Benzyl-L-serin

22 BOC-L-Phenylalanin

21 BOC-^J-Tosyl-L-arginin oder BOC-cu-

Nitro-L-arginin

20 BOC-N(im)-CBZ-L-Histidin

19 BOC-L-Phenylalanin

l8 BOC-L-Asparagin-p-nitrophenylester

17 BOC-L-Asparagin-p-nitrophenylester

l6 BOC-L-Leucin

15 BOC-L-Asparagin-p-nitrophenylester

14 BOC-fO-Tosyl-L-arginin oder BOC-cc-

ni tro-L-arginin

13 BOC-L-Tryptophan

12 BOC-0-Benzyl-L-tyrosin, BOC-L-Tyrosin

oder BOC-2-Brotnbenzyloxycarbonyl-L-tyrosin

11 BOC-L-Alanin

10 BOC-0-Benzyl-L-serin

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- w-

(Fortsetzung von Tabelle VI;)

9 BOC-L-Leucin

8 BOC-L-Valin

7 BOC-S-p-Methoxybenzyl-L-cystein,

BOC-S-Benzyl-L-cystein, BOC-S-3.4-Dimethylbenzyl-L-cystein, BOC-S-Isopropylthio-L-cystein oder BOC-t-Butylthio-L-cystein

6 BOC-0-Benzyl-L-threonin

5 BOC-0-Benzyl-L-serin

4 BOC-L-Leucin

3 BOC-L-Asparagin-p-nitrophenylester

2 BOC-0-Benzyl-L-serin

1 Bis-BOC-L-Cystin

Tabelle VII

Typische Reaktanten zur Verwendung bei der Synthese von Rinder-Calcitonin

Position Aminosäure-

Nr. Reaktant

32 BOC-L-Prolin

31 BOC-0-Benzyl-L-threonin

30 BOC-L-Glutaminsäure- 7f-benzylester

29 BOC-L-Prolin

28 BOC-Glycin

27 BOC-L-Phenylalanin

26 BOC-Glycin

25 BOC-L-Methionin

24 BOC-Glycin

23 BOC-0-Benzyl-L-serin

22 BOC-L-Phenylalanin

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_ 26A78A3

(Fortsetzung von Tabelle VII:)

21 BOC-co-Tosyl-L-arginin oder BOC-LD-

Ni tro-L-arginin

20 BOC-N(im)-CBZ-L-Histidin

19 BOC-O-Benzyl-L-tyrosin, BOC-L-Tyrosin

oder B0C-0-2-Brombenzyloxycarbonyl-L-tyrosin

18 BOC-L-Asparagin-p-nitrophenylester

17 BOC-L-Asparagin-p-nitrophenylester

16 . ' BOC-L-Leucin
15 BOC-L-Asparaginsäure-T-benzylester

14 BOC- ε-CBZ-L-Lysin oder BOC- £ -2-Chlor-

benzyloxycarbonyl-L-lysin

13 BOC-L-Tryptophan

12 BOC-O-Benzyl-L-tyrosin, BOC-L-Tyrosin

oder BOC-O-2-Brorabenzyloxycarbonyl-L-tyrosin

11 BOC-L-Alanin

10 BOC-0-Benzyl-L-serin

9 BOC-L-Leucin

8 BOC-L-Valin

7 BOC-S-p-Methoxybenzyl-L-cystein, BOC-S-

benzyl-L-cystein, BOC-S-3.4-Dimethylbenzyl-L-cystein, BOC-S-Isopropylthio-L-cystein oder BOC-t-Butylthio-L-cystein

6 BOC-O-Benzyl-L-threonin

5 BOC-0-Benzyl-L-serin

4 BOC-L-Leucin

3 BOC-L-Asparagin-p-nitrophenylester

2 BOC-0-Benzyl-L-serin

1 Bis-BOC-L-Cystin

Die einen aminoterminalen Cysteinrest und einen freien Cysteinrest in einer anderen Position innerhalb

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der Sequenz enthaltenden Peptide, die beim erfindungsgemäßen Verfahren als Zwischenprodukte hergestellt werden, weisen vor der Säurespaltung folgende struktur auf:

BOC-CYS P

ι ι

BOC-CYS-(A) -CYS- j

■Λ-

sie haben nach der Säurebehandlung zur Abspaltung der äureempfindlichen Schutzgruppen folgende Struktur:

H-CYS

H-CYS-(A)-CYS- ,

in der Formel bedeuten:

A einen Aminosäurerest

χ 0 oder eine ganze Zahl

CYS einen Cysteinrest und

P eine tertiäre oder sekundäre Alkylthiogruppe oder eine Benzylgruppe oder eine Gruppe aus einem Benzylderivat.

Das gespaltene Peptid weist so einen Cysteinrest mit einer freien Sulfhydrylfunktion auf, wobei die Sulfhydrylfunktion des anderen Cysteinrests an einer Disulfidbindung mit einem anderen Cysteinrest teilnimmt. Diese Kombination von zwei über eine Disulfidbindung verknüpften Cysteinresten wird als Cystinrest bezeichnet. Aus dem folgenden geht hervor, daß die als Resultat der Reaktionen in den Tabellen II VII hergestellten Peptide jeweils in dieser Weise charakte-

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«Γ

risierb sind.

Jedes wie oben angegeben charakterisierte peptid kann im erfindungsgemäßen Verfahren als Zwischenprodukt eingesetzt und dem erfindungsgemäßen Ringschlußverfahren unterzogen werden. Derartige peptide, die eine Struktur mit einem Cysteinrest mit einer freien Sulfhydrylfunktion und einem Cystinrest am Aminoende enthalten, können bei pH-Werten von etwa 5 - 10 in Lösung gehalten werden, wobei alle diejenigen Lösungen in Frage kommen, in denen das Produkt löslich ist, und wäßrige oder alkoholische Lösungen bevorzugt sind, bis spontane Umlagerung zum erwünschten cyclischen disulfidischen Cysteinpeptid unter Verdrängung eines Moleküls Cystein eintritt.

Die Umlagerungsreaktion wird durch Einstellung des pH-Werts der Lösung auf einen Wert von 5/-O - 8,0, vorzugsweise 6,0 - 8,5> erleichtert, wobei am günstigsten bei etwa pH 7*5 gearbeitet wird und Ammonium- oder Alkalihydroxide zugesetzt werden. pH-Werte unter 6,0 können angewandt werden, jedoch verläuft die Umlagerung langsamer als wünschenswert; auch pH-Werte über etwa 10,0 bzw. 10,5 können angewandt werden; bei der Verwendung von pH-Werten über etwa 8,5 können allerdings gewisse Ausbeuteverluste eintreten.

Es ist erfindungsgemäß ferner bevorzugt, die Lösung während der Umlagerungsreaktion, die etwa 1 - 18 h dauern kann und üblicherweise in etwa 24 h beendet ist, zu bewegen oder zu rühren. Die Reaktion wird dabei durch Rühren oder andere Arten von Bewegung erleichtert. Die Behandlung kann allerdings auch ohne nachteilige Wirkungen auf

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das Produkt auch über längere Zeiten durchgeführt werden.

Die Anwesenheit von Sauerstoff oder oxidierenden Substanzen ist ferner zu vermeiden, auch die Lösung ist im wesentlichen sauerstofffrei zu halten. Erfindungsgemäß ist bevorzugt, die peptidhaltige Lösung unter einem Strom eines Inertgases wie etwa Stickstoff zu halten. Das intermediäre Peptid, das die Struktur

H-CYS

I
H-CYS-(A) -CYS-

enthält, in der die innere CYS-Gruppe· eine freie Sulfhydrylfunktion und das Aminoende einen Cystinrest aufweisen, wird durch das erfindungsgemäße Ringschlußverfahren in ein Peptid folgender Struktur umgewandelt:

H-CYS-(A)_x-CYS-,

wobei CYS einen Cysteinrest,

A einen Aminosäurerest und

χ 0 oder eine ganze Zahl bedeuten.

Wenn das Verfahren im Sinne der oben angegebenen Verfahrenweise unter Beachtung der genannten Vorsichtsmaßnahmen sorgfältig durchgeführt wurde, führt der Ringschluß zu keiner anderen Veränderung des Peptids als der Umlagerung unter Bildung einer Disulfidbindung zwischen zwei Cysteinen und der Abspaltung eines Moleküls Cystein.

Die nach dem erfindungsgemäßen Ringschlußverfahren erhaltene Peptidlösung kann nach bekannten Verfahren gereinigt werden. Die Lösung kann so beispielsweise einer Kombination von Gelfiltrationsverfahren und ionenaustauschchromato-

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.as-.

graphischen Verfahren unterzogen werden. Das gereinigte Endprodukt kann aus der Lösung beispielsweise durch Gefriertrocknung erhalten werden, Das resultierende Peptid ist chemisch wie biologisch entsprechenden Peptiden gleichwertig, die aus natürlichen Quellen gewonnen wurden.

Eine Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens besteht beispielsweise in der Synthese von Lachs-Calcitonin. Wie aus Beispiel I hervorgeht, kann Prolin unter Verwendung des Reaktanten BOC-L-Prolin in Position J52 an das Harz gekuppelt werden, anschließend Threonin unter Verwendung des Reaktanten BOC-0-Benzyl-L-threonin in Position Jl, worauf die Kupplung unter Verwendung der in der Tabelle III aufgeführten Reaktanten in der angegebenen Reihenfolge fortgesetzt wird. Bei Erreichen der Position 7 kann ein Cysteinderivat mit einer säureempfindlichen Schwefel-Schutzgruppe verwendet werden; bei Erreichen der Position 1 kann Bis-BOC-L-cystin als Cysteinderivat eingesetzt werden. Nach der Vervollständigung der jeweils erwünschten Aminosäurekette kann das trägergebundene Peptid (im folgenden kurz als Peptidharz bezeichnet) zur Abspaltung des Trägerharzes sowie aller verbleibenden säureempfindlichen Schutzgruppen mit Fluorwasserstoff behandelt werden. Die nach dem Säurespaltungsschritt resultierende Lösung kann mit Wasser verdünnt und durch Zusatz von Ammoniumhydroxid auf einen pH-Wert von etwa 7,5 eingestellt werden. Die Lösung kann dabei unter einem Stickstoffgasstrom 5 - fö h bewegt werden. Das resultierende Produkt ist nach der Reinigung chemisch wie biologisch natürlichem Lachs-Calcitonin äquivalent.

Nach den in Tabelle III aufgeführten Reaktionsschritten und vor der Abspaltung des Trägerharzes weist das Peptid

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folgende Struktur auf:

H-CYS BZ BZ BZ P V BZ

/I J(I I I

H-CYS-SER-ASN-LEU-SER-THR-CYS-VAL-LEU-GLY-LYS-LEU-SER-GLN η

BZ V V BZ W T BZ BZ BZ

/ Il Il Il I /

GLU-LEU-HIS-LYS-LEU-GLN-THR-TYR PRO-ARG-THR-ASN-THR-GLY-SERn

BZ
GLY-THR-PRO-NHCH—

Nach der Spaltung mit wasserfreier Halogenwasserstoffsäure weist das Peptid folgende Struktur auf:

H-CYS

H-CYS-SER-ASN-LEU-SER-THR-CYS-VAL-LEU-GLY-LYS-LEU-SER-GLN

-SER-GLNn

G-TlIR-ASN-TIlRCI₁Y ι ^LSER-GLY-THR-PRO NH

und stellt einen Vorläufer von Laohs-Calcitonin dar.

Nach der erfindungsgemäß durchgeführten Cyclisierung dieses Peptids in der oben beschriebenen Weise liegt folgendes Peptid vor:

H-CYS-SER-ASN-LEU-SER-THR-CYS-VAL-LEU-GLY-LYS-LEU-SER-GLNq Lglu-leu-his-lys-leu-gln-thr-tyr-pro-arg-thr-asn-thr-glyη LSER-GLY-THR-PRo-NH₂'

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die dem Lachs-Caloitonin entspricht.

Das nachfolgende Beispiel I bezieht sich im einzelnen auf die Synthese von Lachs-Calcitonin unter Verwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens.

Beispiel I Aktivierung des Trägers

Benzylhydrylamin- (BHA-)

Harz (5 g) mit einem Amintiter von 0,61 mäq/g

(mäq = Milliäquivalent) wurde in den Reaktionsbehälter einer Peptidsyntheseapparatur (Vertrieb durch Schwartz-Mann, Inc., Orangeburg, New York). Das Harz wurde mit 25 ml folgender Lösungsmittel behandelt, wobei nach jeder Behandlung filtriert wurde:

Methylenchlorid, 2 min,

zweimal Chloroform, je 2 min, zweimal 10 % Triäthylamin in Chloroform, je 5 min, Chloroform, 2 min und

dreimal Methylenchlorid, je 2 min.

Zyklus 32

Kupplung:

Das BHA-Harz, 25 ml Methylenchlorid und 1,29 g (Ο,ΟΟβ mol) BOC-L-Prolin wurden 10 min gerührt. Anschließend wurden 6,0 ml einer Methylenchloridlösung von Dicyclohexylcarbodiimid (DCCI) (1 mäq DCCl/ml Lösung) in das Reaktionsgefäß gegeben und das Gemisch 6 h gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde anschließend durch Filtration aus dem Reaktionsge-

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faß entnommen und BOC-Prolyl-BHA-Harz folgenden hintereinander vorgenommenen, jeweils 2 min dauernden Waschvorgängen mit einem Volumen von jeweils 25 ml unterzogen, wobei die Waschflüssigkeit jeweils durch Filtration entfernt wurde:

zweimal Methylenchlorid,
zweimal Methanol und
dreimal Methylenchlorid.

Acetylierung:

Das Harz wurde anschließend mit einem Gemisch von 1,5 ml Triäthylamin (TEA), 1 ml Acetanhydrid und 25 ml Chloroform 2 h bewegt. Das Reaktionsgemisch wurde darauf durch Filtration abgetrennt und das Harz folgenden jeweils 2 min lang durchgeführten Waschvorgängen mit einer Menge von jeweils 25 ml unterzogen:

zweimal Chloroform,
zweimal Methanol und
dreimal Methylenchlorid.

Schutzgruppenabspaltung:

Das BOC-geschützte Harz wurde 5 min mit einem Gemisch von 15 ml Trifluoressigsaure (TFA) und 15 ml Methylenchlorid bewegt. Das Gemisch wurde durch Filtration abgetrennt und das Harz mit einem zweiten Gemisch von 15 ml TFA und 15 ml Methylenchlorid J>0 min bewegt. Anschließend wurde das Reaktionsgemisch durch Filtration abgetrennt und das Harz folgenden Waschvorgängen mit jeweils 25 ml unterzogen:

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zweimal Methylenchlorid, jeweils 2 min, zweimal Methanol, jeweils 2 min, zweimal Chloroform, jeweils 2 min, zweimal 10 % TFA in Chloroform, jeweils 10 min, zweimal Chloroform, jeweils 2 min und zweimal Methylenchlorid, jeweils 2 min.

Das L-Prolin-BHA-Harz wurde zur Ermittlung seines Amin- oder Prolintiters titriert. Die Werte betrugen 0,55 mäq Amin oder Prolin pro g Harz.

Zyklus

Kupplung;

Das L-Prolyl-Harz, 25 ml Methylenchlorid und 1,7 g (0,0055 mol} BOC-O-Benzyl-L-threonin wurden 10 min bewegt. Anschließend wurden 5*5 ml einer Methylenchloridlösung von Dicyclohexylcarbo.diimid (1 mäq DCCl/ml Lösung, insgesamt 0,0055 mol DCCI) in das Reaktionsgefäß gegeben und das Gemisch 2 h bewegt. Das Reaktionsgemisch wurde darauf aus dem Reaktor entfernt und das Harz folgenden jeweils 2 min dauernden Waschvorgängen mit jeweils 25 ml unterzogen, wobei die Waschflüssigkeit jeweils durch Filtration abgetrennt wurde:

zweimal Methylenchlorid,
zweimal Methanol und
dreimal Methylenchlorid.

Der Ninhydrintest verlief negativ.

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Schutzgruppenabspaltung;

Zur Abspaltung der Schutzgruppen wurde das Verfahren von Zyklus 32 wiederholt.

Zyklen 30 - 27

Die Schritte der Kupplung und der Schutζgruppenabspaltung waren dieselben wie im Zyklus 31 mit dem Unterschied, daß folgende Aminosäurederivate anstelle des Threoninderivats eingesetzt wurden:

Zyklus 30: 0,97 g (0,0055 mol) BOC-Glycin,

Zyklus 29: 1,62 g (0,0055 mol) BOC-0-Benzyl-L-serin,

Zyklus 28: gleiches Material wie in Zyklus 30 und

Zyklus 27: gleiches Material wie in Zyklus 31.

Zyklus 26

Kupplung:

Das in Zyklus 27 erhaltene Peptidharz wurde zweimal mit je 25 ml Dimethylformamid (DMP) gewaschen. Das Harz wurde anschließend 24 h mit einer Lösung von 2,9 S (Ο,ΟΟδ mol) BOC-L-Asparagin-p-nitrophenylester in 35 ml DMF bewegt. Das Reaktionsgemisch wurde anschließend filtriert und das Peptidharz aufeinanderfolgend zwei je 2 min langen Waschvorgängen mit je 25 ml folgender Lösungsmittel unterzogen:

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DMF, Methylenchlorid, Methanol und Methylenchlorid.

Die einzelnen Lösungsmittel wurden jeweils durch Filtration abgetrennt.

Der Ninhydrintest verlief negativ. Schutzgruppenabspaltung:

Zur Abspaltung der Schutzgruppen wurde das Verfahren von Zyklus J52 wiederholt.

Zyklus 25

Kupplung und Schutzgruppenabspaltung erfolgten in derselben Weise wie in Zyklus 31 unter Verwendung der derselben Materialien und Mengen.

Zyklus 24

Kupplung:

Das von Zyklus 25 erhaltene peptidharz wurde aufeinanderfolgend zweimal mit je 25 ml DMF gewaschen. Das Peptidharz wurde anschließend 10 min mit einem Gemisch von J>,k~5 g (0,008 mol) BOC-N-Tosyl-L-arginin und 25 ml DMF bewegt. Anschließend wurden 8 ml (entsprechend 0,008 mol) DCCI in Methylenchlorid zugesetzt und das-Gemisch 6 h bewegt.

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Das Reaktionsgemisch wurde anschließend durch Filtration abgetrennt. _#Das Peptidharz wurde darauf je 2 min langen Waschvorgängen mit zwei aufeinanderfolgenden Mengen von 25 ml folgender Lösungsmittel unterzogen:

DMF,

Methylenchlorid,
Methanol und
Methylenchlorid.

Der Ninhydrintest verlief negativ. Schutzgruppenabspaltung:

Zur Abspaltung der Schutzgruppen wurde das Verfahren von Zyklus 32 wiederholt.

Zyklus 23

Kupplung;

Das von Zyklus 24 erhaltene peptidharz wurde 10 min mit 1,77 g (0,008 mol) BOC-L-Prolin und 25 ml Methylenchlorid bewegt. Darauf wurden 8 ml DCCI in Methylenchlorid (entsprechend 0,008 mol DCCI) zugesetzt und das Gemisch 6 h bewegt. Das Reaktionsgemisch wurde durch Filtration entfernt und das Peptidharz je 2 min langen Waschvorgängen mit zwei aufeinanderfolgenden Mengen von 25 ml folgender Lösungsmittel unterzogen:

Methylenchlorid,
Methanol und
Methylenchlorid.

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Die einzelnen Lösungsmittel wurden dabei jeweils durch Filtration abgetrennt.

Der Ninhydrintest verlief negativ. Schutzgruppenabspaltung:

Zur Abspaltung der Schutzgruppen wurde das Verfahren von Zyklus 32 wiederholt.

Zyklen 22 und 21

Kupplung und Schutzgruppenabspaltung wurden in derselben Weise wie in Zyklus 24 vorgenommen mit dem Unterschied, daß bei der Kupplungsreaktion folgende Aminosäurederivate anstelle von BOC-L-Prolin eingesetzt wurden:

Zyklus 22: 2,97 g (0,008 mol) BOC-0-Benzyl-L-tyrosin

• und
Zyklus 21: 2,4γ g (0,008 mol) BOC-O-Benzyl-L-threonin.

Zyklus 20

Es wurde wie in Zyklus 26 verfahren mit dem Unterschied, daß 3,0 g (0,008 mol) BOC-L-Glutamin-p-nitrophenylester anstelle des Asparaginderivats verwendet wurden.

Zyklen 19 - 15

Es wurde wie in Zyklus 31 verfahren mit dem Unterschied, daß folgende Aminosäurederivate anstelle des

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V*

Threoninderivats eingesetzt wurden:

Zyklus 19: 1,57 g (0,0055 mol) BOC-L-Leucin, Zyklus 18: 2,09 S (0,0055 mol) BOC-S -Carbobenzyloxy-

L-lysin,

Zyklus 17: 2,58 g (0,0055 mol) BOC-N(im)-Carbobenzyl·

oxy-L-histidin,

Zyklus l6: vgl. Zyklus I9 und

Zyklus 15: 1,85 g (0,0055 mol) BOC-L-Glutaminsäure- -

benzylester.

Zyklus 14

Es wurde wie in Zyklus 20 verfahren,

Zyklus 13

Es wurde wie in Zyklus 2j5 verfahren mit dem Unterschied, daß bei der Kupplungsreaktion 2,^6 g (0,008 mol) BOC-0-Benzyl-L-serin anstelle des Prolinderivats eingesetzt wurden.

Zyklen 12-9

Es wurde wie in Zyklus 31 verfahren mit dem Unterschied, daß bei den Kupplungsreaktionen folgende Aminosaurederivate anstelle des Threoninderivats eingesetzt wurden:

Zyklus 12: gleiches Material verwendet wie in Zyklus 19,

Zyklus 11: gleiches Material verwendet wie in Zyklus l8,

Zyklus 10: gleiches Material verwendet wie in Zyklus 50 und

Zyklus 9: gleiches Material verwendet wie in Zyklus Ϊ9.

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Zyklus 8

Kupplung;

Das Peptidharz von Zyklus 9 wurde 10 min mit 1,79 g (0,008 mol) BOC-L-Valin und 25 ml Methylenchlorid bewegt.. Anschließend wurden 8 ml DCCI in Methylenchlorid (entsprechend 0,008 mol DCCI) zugesetzt und das Gemisch 16 h bewegt. Das Reaktionsgemisch wurde durch Filtration abgetrennt. Das Peptidharz wurde anschließend je 2 min langen Waschvorgängen mit zwei aufeinanderfolgenden Mengen von 25 ml folgender Lösungsmittel unterzogen:

Methylenchlorid,
Methanol und
Methylenchlorid.

Schutzgruppenabspaltung:
Vgl. Zyklus 22.
Zyklus 7

Es wurde wie in Zyklus 31 verfahren mit dem Unterschied, daß bei der Kupplungsreaktion 1,88 g (0,0055 mol) BOC-S-p-Methoxybenzyl-L-cystein anstelle des Threoninderivats eingesetzt wurden.

Zyklus 6

Verfahrensweise und Materialien waren dieselben wie

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in Zyklus 31.

Zyklus 5

Verfahrensweise und Materialien waren dieselben wie in Zyklus 29.

Zyklus 4

Verfahrensweise und Materialien waren dieselben wie in Zyklus 19.

Zyklus 3

Verfahrensweise und Materialien waren dieselben wie in Zyklus 26.

Zyklus 2

Verfahrensweise und Materialien waren dieselben wie in Zyklus 29.

Zyklus

Das von Zyklus 2 erhaltene Peptidharz wurde aufeinanderfolgend wie je 20 ml DMF gewaschen. Das Peptidharz wurde anschließend 10 min mit einem Gemisch von 2,4 g (0,0055 mol) Bis-BOC-L-cystin und 20 ml DMF bewegt. Darauf wurden 11,0 ml einer Methylenchloridlösung von Dicyclohexylcarbodiimid (1 mäq DCCl/ml Lösung bzw. insgesamt 0,011 mol DCCI) in den Reaktor gegeben und das Gemisch 2 h bewegt. Das Reaktionsgemisch wurde anschließend

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aus dem Reaktor entnommen und das Peptidharz folgenden 2 min dauernden Waschvorgängen mit je 20 ml unterzogen, wobei die Waschflüssigkeit jeweils durch Filtration abgetrennt wurde.

zweimal DMF,

zweimal Methylenchlorid,
zweimal Methanol und
zweimal Methylenchlorid.

Der Ninhydrintest verlief negativ. Schutzgruppenabspaltung:

Zur Abspaltung der Schutzgruppen wurde das Verfahren von Zyklus Jl wiederholt.

Nach Vervollständigung des Zyklus 1 wurde das Peptidharz aufeinanderfolgend zweimal mit je 25 ml η-Hexan gewaschen. Das Peptidmaterial wurde aus dem Reaktor entnommen und in einem elektrisch beheizten Vakuumtrockenschrank bei 40 ⁰C und 0,1 Torr 24 h getrocknet.

Spaltung mit Fluorwasserstoff:

Das getrocknete Peptidharz (16 g) und 16 ml Anisol wurden in ein Reaktionsgefäß aus Tetrafluoräthylen gebracht. Das mit einem tetrafluoräthylenbeschichteten Magnetrührer ausgerüstete Reaktionsgefäß wurde in ein Trockeneis-Aceton-Bad gesetzt, worauf 100 ml Fluorwasserstoffgas in das Gefäß einkondensiert wurden. Das Gemisch wurde anschließend in einem Eisbad 1 h bei 0 ⁰C gerührt. Der Fluorwasserstoff wurde unter vermindertem Druck durch Verdampfen entfernt. Der Rückstand wurde

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mit sechs 100-ml-Portionen Äthylacetat verrieben. Das Peptid wurde mit 800 ml einer wäßrigen 0,1m Essigsäurelösung von den Harzkügelchen abgetrennt.

Cyclisierung des Peptids zu Lachs-Calcitonin

Der von der Spaltung mit Fluorwasserstoff erhaltene wäßrige Essigsäureextrakt wurde durch Zusatz von 700 ml destilliertem Wasser auf 1,5 1 verdünnt. Der pH-Wert der Lösung wurde durch Zusatz von konzentriertem Ammoniumhydroxid auf 7*5 eingestellt. Die Lösung wurde in einem geschlossenen Gefäß unter einem Stickstoffstrom 12 h gerührt. Der pH-Wert des Reaktionsgemische wurde durch Zusatz von Eisessig auf 5,0 eingestellt.

Reinigung des rohen Lachs-Calcitonins

Die von der obigen Synthese mit einem pH-Wert von 5,0 vorliegenden 1,5 1 Lösung wurden unter Verwendung einer SP-Sephadex-C-25-Ionenaustauschersäule aufkonzentriert, Die von der Säule mit 0,5 ^M Natriumchloridlösung abgenommenen 75 ml Konzentrat wurden durch Hindurchleiten durch eine Sephadex-G-25 (fein)-Gelfiltrationssäule unter Elution mit 0,03 m wäßriger Essigsäurelösung gereinigt.

Die Lachs-Calcitonin-Eraktion von dieser Säure wurde durch

Zusatz von Ammoniumhydroxidlösung auf pH 6,0 eingestellt. Diese Lösung wurde durch Ionenaustauschohromatographie unter Verwendung einer Whatman-CM52-Säule unter Elution mit Ammoniumacetatpuffer weiter gereinigt. Die Lachs-Calci- · tonln-Praktion von dieser Säule wurde durch Zusatz von Eisessig auf pH 5*0 eingestellt. Die Lösung wurde mit einer

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SP-Sephadex-C-25-Ionenaustauschersäule konzentriert. Die von der Säule mit 0,5 M Natriunichloridlösung erhaltenen 30 ml Konzentrat wurden mit einer Sephadex-G-25 (fein)-Gelfiltrationssäure entsalzt. Die gereinigte Lachs-CaIeitonin-Fraktion wurde gesammelt und gefriergetrocknet. Das Produkt fiel als flaumig-weißer Feststoff an. Das Material erwies sich als chemisch und biologisch dem in der Literatur beschriebenen Produkt (S. Guttman et al., HeIv. Chim. Acta 52 (1969) I789-95) äquivalent.

Die Herstellung der oben oder in Beispiel I beschriebenen Verbindungen kann in vielerlei Hinsicht variiert werden; wenn allerdings mehr als ein Parameter variiert wird, ist; es schwierig,,
/einen der veränderten Parameter zu ermitteln. Aus diesem Grund wurde eine Reihe von Tests durchgeführt, bei denen lediglich ein Parameter variiert wurde und deren Resultate miteinander verglichen sind.

Eine weitere Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens besteht in der Synthese von Oxytocin. Oxytocin enthält neun Aminosäuren, und die Aminosäurekette des Oxytocins kann beginnend mit Glycin in Position 9 aufgebaut werden. Das Glycin kann unter Verwendung von BOC-Glycin als Reaktant an das BHA-Harz gekuppelt werden; anschließend kann Leucin unter Verwendung von BOC-L-Leucin

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als Reaktant angekuppelt werden; anschließend werden die Zyklen der Kupplung und der Schutzgruppenabspaltung nach der Verfahrensweise am festen Träger unter Verwendung der in der Tabelle II angeführten Aminosäuregruppen und Schutzgruppen in der angegebenen Reihenfolge durchgeführt, Wenn Position 6 erreicht ist, wird ein säureempfindliches geschütztes Cysteinderivat verwendet; wenn Position 1 erreicht ist, wird Bis-BOC-cystin an das Aminoende der Peptidkette angekuppelt.

Nach der Vervollständigung der Aminosäurekette weist das Peptid folgende Struktur auf:

H-CYS W P

h-cys-tyr-ile-gln-asn-cys-pro-leu-gly-nhch-

^C6^H5

mit (x) = Polystyrolteil des Harzes, W = keine Schutzgruppe, eine BZ-Gruppe oder

eine Benzyloxycarbonylgruppe bzw. ein

Derivat einer Benzyloxycarbonylgruppe

und
P = eine tertiäre oder sekundäre Alkylthio-

gruppe oder eine Benzylgruppe bzw. ein

Derivat einer Benzylgruppe.

Nach der Säurebehandlung zur Abspaltung des Harzes liegt folgende Struktur vor:

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H-CYS

H-CYS-TYR-ILE-GLN-ASN-CYs-PRO-LEU-GLY-NH₂.

Das den Cystinrest am Aminoende der Kette tragende abgespaltene Peptid unterliegt in einem Lösungsmittel, vorzugsweise bei pH 6, 0 - 8,5, einer Umlagerung der Disulfidbindung zwischen dem freien Cystein und dem Cystinrest am Aminoende zu einem Peptid folgender Struktur:

H-CYS-TYR-ILE-GLN-ASN-CYS-PRO-LEU-GLY-Nh₂ , die Oxytocin darstellt.

Ein detailliertes Beispiel der Oxytocinsynthese unter Verwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens ist im folgenden Beispiel II gegeben.

Beispiel II Synthese von Oxytocin

Aktivierung des Trägers

Ein Benzhydrylamin- (BHA-) Harz (5 g) mit einem Amintiter von 0,43 mäq/g wurde in das Reaktionsgefäß einer Peptidsyntheseapparatur (Vertrieb Schwärtz-Mann, Inc.,Orangeburg, New York) gegeben. Das Harz wurde mit 20 ml folgender Lösungsmittel behandelt, wobei nach jeder Behandlung filtriert wurde:

Methylenchlorid, 2 min,
zweimal Chloroform, je 2 min,

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zweimal 10 $ Triäthylamin in Chloroform, je 5 min, Chloroform, 2 min und

dreimal Methylenchlorid, je 2 min.

Zyklus 9

Kupplung:

Das BHA-Harz, 20 ml Methylenchlorid und 0,75 g (0,0043 mol) BOC-Glycin wurden 10 min bewegt. 4,3 ml einer Methylenchloridlösung von Dicyclohexylcarbodiimid (1 mäq DCCI/ml Lösung) wurden in das Reaktionsgefäß gegeben und das Gemisch 6 h bewegt. Das Reaktionsgemisch wurde aus dem Reaktionsgefäß durch Filtration entnommen und das BOC-Glycyl-BHA-Harz nachstehenden aufeinanderfolgenden 2-minütigen Waschvorgangen mit je 20 ml unterzogen, wobei die Waschflüssigkeit jeweils durch Filtration abgetrennt wurde:

zweimal Methylenchlorid,
zweimal Methanol und
zweimal Methylenchlorid.

Acetylierung;

Das Harz wurde anschließend mit einem Gemisch von 1,6 ml Acetanhydrid, 2,4 ml Triäthylamin (TEA) und 20 ml Chloroform 30 min bewegt. Das Reaktionsgemisch wurde anschließend durch Filtration abgetrennt und das Harz folgenden 2 min dauernden Waschvorgangen mit je 20 ml Waschflüs-

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sigkeit unterzogen:

zweimal Chloroform,
zweimal Methanol und
dreimal Methylenchlorid.

Der Ninhydrintest verlief negativ. Schutzgruppenabspaltung:

Das BOC-geschützte Harz wurde 5 min mit einem Gemisch von 12 ml Trifluoressigsäure (TFA) und 12 ml Methylenchlorid bewegt. Das Gemisch wurde anschließend durch Filtration abgetrennt und das Harz mit einem zweiten Gemisch von ml TFA und 12 ml Methylenchlorid JO min bewegt. Anschließend wurde das Reaktionsgemisch durch Filtration abgetrennt und das Harz folgenden Waschvorgängen mit je 20 ml unterzogen:

zweimal Methylenchlorid, jeweils 2 min, zweimal Methanol, jeweils 2 min,

zweimal Chloroform, jeweils 2 min, zweimal 10 % TEA in Chloroform, 5 und 10 min, zweimal Chloroform, jeweils 2 min und zweimal Methylenchlorid, jeweils 2 min.

Das L-Glycin-BHA-Harz wurde zur Bestimmung des Amin- bzw. Glycintiters titriert (vgl. hierzu L. Dortnan, Tetrahedron Letters, I969, 2319-21). Der ermittelte Wert betrug 0,384 mäq Amin bzw. Glycin pro g Harz.

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Zyklus 8

Kupplung;

Das L-Glycinharz, 20 ml Methylenchlorid und 2,95 g (0,00^8 mol) BOC-L-Leucin·H₂O wurden 10 min bewegt. Anschließend wurden 3,8 ml einer Methylenchloridlösung von Dicyclohexylcarbodiimid (1 mäq DCCI/ml Lösung bzw. insgesamt 0,038 mol DCCI) in das Reaktionsgefäß gegeben und das Gemisch 2 h bewegt. Das Reaktionsgemisch wurde anschließend aus dem Reaktionsgefäß entnommen und das Harz den nachstehenden aufeinanderfolgenden, jeweils 2 min dauernden Waschvorgängen mit je 20 ml unterzogen, wobei die Waschflüssigkeit jeweils durch Filtration entfernt wurde:

zweimal Methylenchlorid,
zweimal Methanol und
zweimal Methylenchlorid.

Der Ninhydrintest verlief negativ. Schutzgruppenabspaltung:

Zur Abspaltung der Schutzgruppen wurde das Verfahren von Zyklus 9 wiederholt.

Zyklus 7

Kupplung und Abspaltung der Schutzgruppen wurden in derselben V/eise wie in Zyklus 8 vorgenommen mit dem Unter-

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schied, daß folgendes Aminosäurederivat anstelle des Leucinderivats verwendet wurde:

0,82 g (0,0038 tnol) BOC-L-Prolin.

Zyklus 6

Kupplung und Schutzgruppenabspaltung wurden in derselben Weise wie in Zyklus 8 vorgenommen. Die Acetylierung geschah in diesem Zyklus unter Verwendung desselben Verfahrens wie in Zyklus 9· Bei der Kupplung wurde folgendes Aminosäurederivat eingesetzt:

1,3 g (0,0038 mol) B0C-S-3.4-Dimethylbenzyl-L-cystein.

Zyklus 5

Kupplung; .

Das von Zyklus 6 erhaltene Peptidharz wurde zweimal mit je 20 ml Dimethylformamid (DMF) gewaschen. Das Harz wurde anschließend 24 h mit einer Lösung von 2,01 g (0,0057 mol) BOC-L-Asparagin-p-nitrophenylester in 25 ml DMF bewegt. Das Reaktionsgemisch wurde anschließend filtriert

zwei und das Peptidharz aufeinanderfolgend/jeweils 2 min dauernden Waschvorgängen mit je 20 ml folgender Lösungsmittel unterzogen:

DMF,

Methylenchlorid,
Methanol und
Methylenchlorid.

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Die jeweiligen Waschlösungen wurden durch Filtration abgetrennt.

Der Ninhydrintest verlief negativ. Schutzgruppenabspaltung:

Zur Abspaltung der Schutzgruppen wurde das Verfahren von Zyklus 8 wiederholt.

Zyklus 4

Die Kupplung wurde in derselben Weise wie in Zyklus vorgenommen. Die Acetylierung geschah in diesem Zyklus unter Verwendung desselben Verfahrens wie in Zyklus 9. Die Abspaltung der Schutzgruppen erfolgte hierbei in derselben Weise wie in Zyklus 8. Es wurde folgendes Aminosäurederivat eingesetzt:

2,09 g (0,0057 mol) BOC-L-Glutamin-p-nitrophenyl-

ester.

Zyklus 3

Zur Kupplung wurde dasselbe Verfahren wie in Zyklus angewandt. Die Kupplung wurde unter Verwendung eines Lösungsmittelsystems von 10 ml DMP und 10 ml Methylenchlorid und derselben Mengen von Aminosäure und DCCI wiederholt. Die Acetylierung erfolgte in diesem Zyklus in derselben Weise wie in Zyklus 9. Zur Abspaltung der Schutzgruppen wurde das Verfahren von Zyklus 8 herangezogen. Es wurde folgendes Aminosäurederivat für die jeweilige Kupplungsreaktion eingesetzt:

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0,88 g (0,0058 mol) BOC-L-Isoleucin.

Zyklus 2

Kupplung:

Das von Zyklus 3 erhaltene Peptidharz wurde aufeinanderfolgend zweimal mit je 20 ml DMF gewaschen. Das Peptidharz wurde anschließend 10 min mit einem Gemisch von 2,11 g (0,0057 mol) BOC-0-Benzyl-L-tyrosin und 20 ml DMF bewegt. Anschließend wurden 5,7 ml DCCI in Methylenchlorid (entsprechend 0,0057 mol DCCI) zugesetzt und das Gemisch ΐβ h bewegt. Das Reaktionsgemisch wurde anschließend durch Filtration abgetrennt. Das Peptidharz wurde aufeinanderfolgend zweimal je 2 min mit jeweils 20 ml folgender Lösungsmittel gewaschen:

DMF,

Methylenchlorid,
Methanol und
Methylenchlorid.

Die Kupplung wurde unter Verwendung der halben Mengen von Aminosäurederivat und DCCI in Methylenchlorid bei einer Bewegungsdauer von 6 h wiederholt.

Acetylierung;

Es wurde das Acetylierungsverfahren von Zyklus 9 wiederholt.

Schutzgruppenabspaltung:

Es wurde das Schutzgruppenabspaltungs-Verfahren von

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Zyklus 9 wiederholt.

Zyklus 1

Das von Zyklus 2 erhaltene Peptidharz wurde aufeinanderfolgend zweimal mit je 20 ml DMF gewaschen. Das Peptidharz wurde anschließend 10 min mit einem Gemisch von 1,7 g (0,0038 mol) Bis-BOC-L-cystin und 20 ml DMF bewegt. Darauf wurden 7*6 ml einer Methylenchloridlösung von Dicyclohexylcarbodiimid (1 mäq DCCl/ml Lösung bzw. insgesamt 0,0076 mol DCCI) in den Reaktor gegeben und das Gemisch 2 h bewegt. Das Reaktionsgemisch wurde aus dem Reaktor entfernt und das Peptidharz aufeinanderfolgend nachstehenden 2 min dauernden Waschvorgängen mit je 20 ml unterzogen, wobei jeweils filtriert wurde:

zweimal DMF,

zweimal Methylenchlorid,
zweimal Methanol und
zweimal Methylenchlorid.

Der Ninhydrintest verlief negativ. Schutzgruppenabspaltung:

Zur Abspaltung der Schutsgruppen wurde das Verfahren von Zyklus 9 wiederholt.

Das Peptidmaterial wurde durch Spülen mit Hexan aus dem Reaktionsgefäß entfernt und in einem elektrisch beheizten Vakuumtrockenschrank bei 40 ⁰C und 0,1 Torr 24 h ge-

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trocknet. Das blockierte Oxytocin-Peptidharz wog 6,8 g. Spaltung mit Fluorwasserstoff

Das getrocknete Peptidharz (2 g) und 2 ml Anisol wurden in ein Reaktionsgefäß aus Tetrafluoräthylen gebracht. Das mit einem mit Tetrafluoräthylen beschichteten Magnetrührer versehene Gefäß wurde in ein Trockeneis-Aceton-Bad gebracht, worauf 15 ml Fluorwasserstoffgas in das Gefäß einkondensiert wurden. Das Gemisch wurde anschließend 1 h in einem Eisbad bei 0 ⁰C gerührt. Der Rückstand wurde viermal mit jeweils 25 ml Ä'thylacetat verrieben. Das Peptid wurde von den Harzkügelchen mit zweimal 50 ml Eisessig abgetrennt. Der Extrakt wurde zur Gewinnung des abgespaltenen Peptids lyophilisiert.

Cyclisierung des Peptids zu Oxytocln

Das rohe Peptid (200 mg) wurde in 50 mg sauerstofffreiem destilliertem Wasser unter Zusatz von 1 ml Eisessig teilweise gelöst. Der pH-Wert der Lösung wurde durch Zusatz von konzentriertem Ammoniumhydroxid auf 7,5 eingestellt. Das Gemisch wurde anschließend in einem geschlossenen Gefäß unter einem Stickstoffstrom 24 h gerührt. Der pH-Wert der Gemischs wurde darauf durch Zusatz von Eisessig auf J>₃2 eingestellt. Zur Gewinnung eines festen Rückstands wurde gefriergetrocknet.

Reinigung des rohen Oxytocins

Der feste Rückstand wurde in einer 0,5 ^N Essigsäurelösung gelöst und über eine Sephadex-G-25 (fein)-Gel-

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filtrationssäule unter Elution mit 0,5 N Essigsäure gereinigt. Die Oxytocin-Fraktion von dieser Säule wurde gesammelt und zu einem weißen Peststoff gefriergetrocknet.

Der Peststoff wurde nochmals in 0,5 N Essigsäure gelöst und über eine Sephadex-G-25 (fein)-Gelfiltrationssäule unter Elution mit 0,5 N Essigsäurelösung gereinigt. Die Oxytocin-Praktion von dieser Säule wurde gesammelt und zu einem flockigen weißen Pulver lyophilisiert.

Die Analyse dieses Produkts ergab folgende Aminosäureverhältnisse: GLY 1,0, LEU 0,98, PRO 0,97, ASP 0,89, GLU 0,84, ILE 0,74 und TYR 0,72. Die theoretische Menge sollte 1,0 betragen. Ein Wert für CYS ist nicht angegeben, da diese Aminosäure bei der Analyse zerstört wird. Die biologische Aktivität dieses Produkts betrug 505,4 Einheiten/mg.

Das erfindungsgemaße Verfahren kann ferner auch beispielsweise zur Synthese von menschlichem Calcitonin in ähnlicher Weise wie bei der Synthese von Lachs-Calcitonin herangezogen werden. Humancalcitonin enthält 32 Aminosäuren in seiner Aminosäurekette. Ausgehend von Prolin wird diese Aminosäure in Position 32 mit einem BHA-Harz gekuppelt, worauf Alanin in Position 31 und Glycin in Position 30 entsprechend dem zuvor erläuterten System des Aufbringens von Schutzgruppen, der Kupplung sowie der Abspaltung von Schutzgruppen unter Verwendung der

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in Tabelle IV angegebenen Aminosäuregruppen und Schutzgruppen in der angegebenen Reihenfolge angehängt werden.

Wenn die Cysteingruppe in Position 7 erreicht ist, wird ein säureempfindliches geschütztes Cysteinderivat eingesetzt. Wenn Position 1 erreicht wird, wird Bis-BOC-L-oystin als Cysteinderivat verwendet.

Wenn die Aminosäurekette vervollständigt ist, weist das Peptid folgende Struktur auf:

H-CYS BZ BZ P BZ W

I III I I

H-CYS-GLY-ASN-LEU-SER-THR-CYS-MET-LEU-GLY-THR-TYR-,

BZ BZ VV BZ

Il III

^u THR-GLN-ASP-PHE-ASN-LYS-PHE-HIS-THR-PHE-PRO-GLN

BZ

thr-ala-ile-gly-val-gly-ala-pro-nhch-(x

cIh_c

Nach der Säurebehandlung zur Entfernung des Harzes und der säureempfindlichen Gruppen liegt folgende Struktur vor:

H-CYS

H-CYS-GLY-ASN-LEU-SER-THR-.CYS-MET-LEU-GLY-THR-TYRη

THR-GLN-ASP-PHE-ASN-LYS-PHE-HIS-THR-PHE-PRO-GLN

LTHR-ALA-ILE-GLY-VAl-GLY-ALA-PRO-NH₂ .

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Nach der vorgenommenen Umlagerung des Peptids unter den beschriebenen Bedingungen zur Vervollständxgung des Disulfidrings weist das Produkt folgende Struktur auf:

I I

H-CYS-GLY-ASN-LEU-SER-THR-CYS-MET-LEU-GLY-THR-TYR-THRi

- GLN-ASP-PHE-ASN-LYS-PHE-HIS-THR- PHE-PRO-GLN-THR-ALA-i ILE-GLY-VAl-GLY-ALA-PRO-NH₂ ,

die menschliches Calcitonin darstellt.

Die Synthese von Humancalcitonin unter Verwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens wird im folgenden Beispiel III im einzelnen erläutert.

Beispiel III Synthese von menschlichem Calcitonin

Aktivierung des Trägers

4 g Benzhydrylamin- (BHA-) Harz mit einem Amintiter von 0,55 mäq/g wurden in das Reaktionsgefäß einer Peptidsyntheseapparatur (Vertrieb Schwartz-Mann, Inc., Orangeburg, New York) eingebracht. Das Harz wurde mit jeweils 20 ml folgender Lösungsmittel behandelt, wobei nach jeder Behandiung filtriert wurde:

Methylenchlorid, 2 min,

zweimal Chloroform, jeweils 2 min, zweimal 10. % Triäthylamin in Chloroform, jeweils 5 min,

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— SrQ —

Chloroform, 2 min, und

dreimal Methylenchlorid, jeweils 2 min.

Zyklus 32

Kupplung:

Das BHA-Harz, 20 ml Methylenchlorid und 0,95 g (0,0044 mol) BOC-L-Prolin wurden 10 min bewegt. Anschließend wurden 4,4 ml einer Methylenchloridlösung von Dicyclohexylcarbodiimid (1 mäq DCCI/ml Lösung) in den Reaktor gegeben und das Gemisch 6 h bewegt. Das Reaktionsgemisch wurde darauf durch Filtration aus dem Reaktionsgefäß entfernt und das BOC-Prolyl-BHA-Harz aufeinanderfolgend nachstehenden 2 min dauernden Waschvorgängen mit jeweils 20 ml unterzogen, wobei die Waschflüssigkeit jeweils durch Filtration abgetrennt wurde:

zweimal Methylenchlorid,
zweimal Methanol und
zweimal Methylenchlorid.

Acetylierung:

Das Harz wurde anschließend mit einem Gemisch von 1,5 ml Triäthylamin (TEA), 1 ml Acetanhydrid und 20 ml Chloroform 2 h bewegt. Das Reaktionsgemisch wurde durch Filtration abgetrennt und das Harz folgenden 2 min dauernden Waschvorgängen mit jeweils 20 ml unterzogen:

zweimal Chloroform,
zweimal Methanol und

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dreimal Methylenchlorid.

Der Ninhydrintest (vgl. E. Kaiser et al., Anal. Biochem. ]J4 (!97°) 595-8) verlief negativ.

Schutzgruppenabspaltung:

Das. BOC-geschützte Harz wurde 5 min mit einem Gemisch von 12,5 ml Trifluoressigsaure (TPA) und 12,5 ml Methylenchlorid bewegt. Das Gemisch wurde durch Filtration abgetrennt und das Harz mit einem zweiten Gemisch von 12,5 ml TFA und 12,5 ml Methylenchlorid JO min bewegt. Das Reaktionsgemisch wurde anschließend durch Filtration abgetrennt und das Harz folgenden Waschvorgängen mit jeweils 20 ml unterzogen:

zweimal Methylenchlorid, jeweils 2 min, zweimal Methanol, jeweils 2 min, zweimal Chloroform, jeweils 2 min, zweimal 10 % TEA in Chloroform, jeweils 10 min, zweimal Chloroform, jeweils 2 min,und zweimal Methylenchlorid, jeweils 2 min.

Das L-Prolin-BHA-Harz wurde zur Mischung des Amin- bzw. Prolintiters titriert. Es ergab sich ein Wert von 0,494 mäq Amin bzw. Prolin pro g Harz.

Zyklus 31

Kupplung:

Das L-Prolyl-Harz, 20 ml Methylenchlorid und 0,83 g

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(0,0044 mol)B00-L<-Alanin wurden 10 min bewegt. Darauf wurden 4,4 ml einer Methylenchloridlösung von Dicyclohexylcarbodiimid (1 mäq DCCI/ml Lösung bzw. insgesamt 0,0044 mol DCCI) in das Reaktionsgefäß gegeben und das Gemisch 2 h bewegt. Das Reaktionsgemisch wurde anschließend aus dem Reaktionsgefäß durch Filtration entfernt und das BOC-L-Alanyl-L-prolyl-BHA-Harz aufeinanderfolgend nachstehenden 2 min dauernden Waschvorgängen mit jeweils 20 ml unterzogen, wobei die Waschflüssigkeit jeweils durch Filtration entfernt wurde;

zweimal Methylenchlorid,
zweimal Methanol und
dreimal Methylenchlorid.

Der Ninhydrintest verlief negativ.

Zyklen 30 - 26

Kupplung und Schutzgruppenabspaltung wurden in derselben Weise wie in Zyklus 31 vorgenommen mit dem Unterschied, daß folgende Aminosäurederivate anstelle des Alaninderivats eingesetzt wurden:

Zyklus 30: 0,77 g (0,0044 mol) BOC-Glycin, Zyklus 29: 0,95 g (0,0044 mol) BOC-L-Valin,

Zyklus 28: Es wurde das gleiche Material verwendet wie in Zyklus 30,

Zyklus 27: 1,02 g (0,0044 mol) BOC-L-Isoleucin und

Zyklus 26: Es wurde dasselbe Material wie in Zyklus verwendet.

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Zyklus 25

Kupplung:

Das von Zyklus 26 erhaltene Peptidharz wurde zweimal mit je 20 ml Dimethylformamid (DMF) gewaschen. Das Peptidharz wurde anschließend 10 min mit einem Gemisch von 2,04 g (0,OO66 mol) BOC-O-Benzyl-L-threonin und 20 ml DMF bewegt. Darauf wurden 6,6 ml DCCI in Methylenchlorid (entsprechend Ο,ΟΟββ mol DCCI) zugegeben und das Gemisch 6 h bewegt. Das Reaktionsgemisch wurde anschließend durch Filtration abgetrennt. Das Peptidharz wurde anschließend je 2 min langen Waschvorgängen mit zwei aufeinanderfolgenden Mengen von je 20 ml folgender Lösungsmittel unterzogen:

DMF,

Methylenchlorid,
Methanol und
Methylenchlorid.

Der Ninhydrintest verlief negativ. Schutzgruppenabspaltung:

Zur Abspaltung der Schutzgruppen wurde das Verfahren von Zyklus 32 wiederholt.

Zyklus 24

Kupplung:

Das von Zyklus 25 erhaltene Peptidharz wurde zweimal mit jeweils 20 ml DMF gewaschen. Das Harz wurde anschließend

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24 h mit einer Lösung von 2,42 g (Ο,ΟΟββ mol) BOC-L-Glutamin-p-nitrophenylester in 25 ml DMF bewegt. Das Reaktionsgemisch wurde anschließend filtriert und das Peptidharz darauf je 2 min langen Waschvorgängen mit zwei aufeinanderfolgenden Mengen von 20 ml folgender Lösungsmittel unterzogen:

DMP,

Methylenchlorid,
Methanol und
Methylenchlorid.

Jedes einzelne Lösungsmittel wurde dabei durch Filtration entfernt.

Der Ninhydrintest verlief negativ. Schutzgruppenabspaltung:

Zur Abspaltung der Schutzgruppen wurde das Verfahren von Zyklus 32 wiederholt.

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(oO

Zyklus 23

Kupplung;

Das von Zyklus 24 erhaltene Peptidharz wurde IO min mit 1,42 g (0*0066 mol) BOC-L-Prolin und 20 ml Methylenchlorid bewegt. Darauf wurden 6,6 ml DCCI in Methylenchlorid (entsprechend 0,0066 mol DCCI) zugesetzt und das Gemisch 16 h bewegt. Darauf wurde das Reaktionsgemisch durch Filtration entfernt und das Peptidharz je 2 min langen Waschvorgängen mit zwei aufeinanderfolgenden Mengen von 20 ml folgender Lösungsmittel unterzogen:

Methylenchlorid,
Methanol und
Methylenchlorid.

jede der Waschflüssigkeiten wurde dabei durch Filtration entfernt.

Der Ninhydrintest verlief negativ.

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Schutzgruppenabspaltung;

Zur Abspaltung der Schutzgruppen wurde das Verfahren von Zyklus 32 wiederholt.

Zyklus 22

Kupplung und Schutzgruppenabspaltung wurden wie in Zyklus 23 vorgenommen mit dem Unterschied, daß bei der
Kupplungsreaktion 1,75 g (0,0066 mol) BOC-L-Phenylalanin anstelle von BOC-L-Prolin eingesetzt wurden.

Zyklen 21 - l8

Kupplung und Schutzgruppenabspaltung wurden in derselben Weise wie in Zyklus 31 vorgenommen mit dem Unterschied, daß folgende Aminosäurederivate anstelle des AIaninderivats eingesetzt wurden:

Zyklus 21: 1,36 g (0,0044 mol) BOC-O-Benzyl-L-threonin, Zyklus 20: 1,71 g (0,0044 mol) BOC-N(im)-Carbobenzyl-

oxy-L-histidin,

Zyklus 19: 1,17 S (0,0044 mol) BOC-L-Phenylalanin und Zyklus 18: 1,67 g (0,0044 mol) BOC-6 -Carbobenzyl-

oxy-L-lysin.

Zyklus 17

Kupplung und Schutzgruppenabspaltung erfolgten in

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derselben Weise wie in Zyklus 24 mit dem Unterschied, daß 2,33 g (O,0066 mol) BOC-L-Asparagin-p-nitrophenylester anstelle des Glutaminderivats verwendet wurden.

Zyklen l6 und 15

Kupplung und Schutzgruppenabspaltung erfolgten in derselben Weise wie in Zyklus 31 mit dem Unterschied, daß folgende Aminosäurederivate anstelle des Alaninderivats eingesetzt wurden:

Zyklus 16: 1,17 g (0,0044 mol) BOC-L-Phenylalanin und

Zyklus 15: 1,42 g (0,0044 mol) BOC-L-Asparaginsäure-

ß-benzylester.

Zyklus 14

Es wurde wie in Zyklus 24 verfahren.

Zyklus 13

Es wurde wie in Zyklus 21 verfahren.

Zyklus 12

Kupplung und Schutzgruppenabspaltung wurden wie in Zyklus 25 vorgenommen mit dem Unterschied, daß 2,45 g (0,0066 mol) BOC-0-Benzyl-L-tyrosin anstelle des Threoninderivats eingesetzt wurden und die Rühr- bzw. Bewegungs-

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zeit auf 16 h ausgedehnt wurde.

Zyklus 11

Es wurde wie in Zyklus 25 verfahren.

Zyklen 10-7

Kupplung und Schutzgruppenabspaltung erfolgten
in Zyklus 31 mit dem Unterschied, daß bei der Kupplungsreaktion folgende Aminosäurederivate anstelle des BOC-L-Alanins eingesetzt wurden:

Zyklus 10: 0,77 g (0,0044 raol) BOC-Glycin,
Zyklus 9: 1,02 g (0,0044- mol) BOC-L-Leucin,
Zyklus 8: 1,1 g (0,0044 mol) BOC-L-Methionin und Zyklus 7: 1,5 g (0,0044 mol) BOC-S-J.4-Dimethyl-

benzyl-L-cystein.

Zyklus 6

Es wurde wie in Zyklus 25 verfahren.
Zyklen 5 und 4

Kupplung und Schutzgruppenabspaltung erfolgten wie in Zyklus 31 mit dem Unterschied, daß bei der Kupplungsreaktion folgende Aminosäurederivate anstelle des BOC-L-Alanins eingesetzt wurden:

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Zyklus 5: 1*3 g (0,0044 mol) BOC-0-Benzyl-L-serin und Zyklus 4: 1,02 g (O,0044 mol) BOC-L-Leucin.

Zyklus 3

Es wurde wie in Zyklus YJ 'verfahren.

Zyklus 2

Kupplung und Schutzgruppenabspaltung wurden wie in Zyklus 31 vorgenommen mit dem Unterschied, daß bei der Kupplungsreaktion folgendes Aminosäurederivat anstelle des BOC-L-Alanins eingesetzt wurde:

0,77 g (0,0044 mol) BOC-Glycin. Zyklus 1

Kupplung:

Das Peptidharz von Zyklus 2 wurde aufeinanderfolgend zweimal mit jeweils 20 ml DMF gewaschen. Das Peptidharz wurde anschließend 10 min mit einem Gemisch von 1,9 S (0,0044 mol)'Bis-BOC-L-cystin und 20 ml DMF bewegt. Darauf wurden 8,8 ml einer Methylenchloridlösung von Dicyclohexylcarbodiimid (1 mäq DCCI/ml Lösung bzw. insgesamt 0,0088 mol DCCI) in den Reaktor gegeben und das Gemisch 2 h bewegt. Das Reaktionsgemisch wurde anschließend aus dem Reaktionsgefäß entfernt und das Peptidharz folgenden 2 min langen Waschvorgängen mit jeweils 20 ml unterzogen, wobei die Waschflüssigkeit jeweils durch Filtration abge-

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fcS" 26478A3

trennt wurde:

zweimal DMP,

zweimal Methylenchlorid,
zweimal Methanol und
zweimal Methylenchlorid.

Der Ninhydrintest verlief negativ. Schutzgruppenabspaltung:

Zur Abspaltung der Schutzgruppen wurde das Verfahren von Zyklus 31 wiederholt.

Nach Vervollständigung von Zyklus 1 wurde das Peptidharz aufeinanderfolgend zweimal mit jeweils 20 ml n-Hexan gewaschen. Das Peptidmaterial wurde aus dem Reaktionsgefäß entnommen und in einem elektrisch beheizten Vakuumtrockenschrank bei 40 ⁰C und 0,1 Torr 24 h getrocknet. Das blockierte Humancalcitonin-Peptidharz wog 10,3 g.

Spaltung mit Fluorwasserstoff

Das getrocknete Peptidharz (2 g) und 2 ml Anisol wurden in ein Reaktionsgefäß aus Tetrafluoräthylen eingebracht. Das mit einem mit Tetrafluoräthylen beschichteten Magnetrührer versehene Gefäß wurde in ein Trockeneis-Aceton-Bad eingebracht, worauf 15 ml Fluorwasserstoffgas in das Gefäß einkondensiert wurden. Das Gemisch wurde anschließend bei 0 ⁰C in einem Eisbad 1 h gerührt. Der Fluorwasserstoff wurde durch Verdampfen unter vermindertem Druck entfernt. Der Rückstand wurde zweimal mit je 25 ml Äthylacetat verrieben. Das Peptid wurde von den Harzkügelchen durch zweimalige Behandlung mit je 50 ml

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Eisessig abgespalten. Der Extrakt wurde zur Gewinnung des abgespaltenen Peptids gefriergetrocknet.

Cyclisierung des Peptids zu Humanealeitonin

Das rohe Peptid (1000 mg) wurde in 250 ml sauerstofffreiem destilliertem Wasser unter Zusatz von 1 ml Eisessig gelöst. .Der pH-Wert der Lösung wurde durch Zusatz von konzentriertem. Ammoniumhydroxid auf 7,5 eingestellt. Das Gemisch wurde in einem geschlossenen Gefäß unter einem Stickstoffstrom 24 h gerührt. Der pH-Wert des Reaktionsgemischs wurde durch Zusatz von Eisessig auf 3*2 eingestellt. Durch Gefriertrocknung wurde das feste Produkt erhalten.

Reinigung des rohen Humancalcitonins

Das feste Produkt wurde in 0,5 N Essigsäure gelöst und über eine Sephadex-G-25 (fein)-Gelfiltrationssäule unter Elution mit 0,5 N Essigsäure gereinigt. Die Humancalcitonin-Fraktion von dieser Säule wurde gesammelt und zu einem flockigen, weißen Feststoff gefriergetrocknet.

Der weiße flockige Feststoff wurde in wäßrigem, 0,05 M Ammoniumacetat (pH 5) gelöst. Die Lösung wurde auf pH 5 eingestellt und durch Ionenaustauschchromatographie unter Verwendung einer SP-Sephadex-C-25-Säule unter Elution mit Ammoniumacetatpuffer gereinigt. Die Humancalcitonin-Fraktion wurde gesammelt und zweimal gefriergetrocknet, worauf ein flockiger weißer Feststoff erhalten wurde. Das Material erwies sich chemisch wie biologisch ^al^s &^em ^ⁿ der Literatur beschriebenen Produkt (vgl. P. Sieber et al., Helv. Chim. Acta. 53 (1970) 2135-50) äquivalent. Die Amino-

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säureanalyse (Säurehydrolyse) lieferte folgende Mengenverhältnisse der Aminosäuren (die theoretischen Werte sind in Klammern angegeben):

LYS 1,03 (1), HIS 0,99 (1), ASP 3, l8 0),

THR 5,11 (5), SER 0,84 (1), GLU 1,95 (2),

GLY 4,31 (²O, ALA 2,03 (2), VAL 0,95 (1),

MET 0,90 (1), ILE 1,04 (l), LEU 2,24 (2), TYR 0,8 (1) und PHE 3,0 (3).

Die Werte für PRO und CYS wurden nicht bestimmt.

Die biologische Aktivität wurde zu 110 MRD-Einheiten/mg ermittelt.

Das erfindungsgemaße Verfahren kann ferner auch bei der Synthese von Vasopressin eingesetzt werden, wobei als Reaktanten in der Aminosäurekette die in der Tabelle V angeführten Gruppen oder damit äquivalente Gruppen eingesetzt werden. Das nach den in Tabelle V angegebenen Reaktionen resultierende Peptid weist vor der Abspaltung des Harzes folgende Struktur auf:

H-CYS BZ PT

ι ι ι ι ^

H-CYS-THR-PHE-GLN-ASN-CYS-PRO-Ar 3-GLY-NHCHτ- (χ)

^C6^H5

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Nach der Säurebehandlung dieses Peptids zur Abspaltung des Harzes und der meisten Schutzgruppen liegt folgende Struktur vor:

H-CYS H-CYS-THR-PHE-GLN-ASN-CYS-PRO-ARG-GLY-Nh₂ ,

die einen Vorläufer des Vasopressins darstellt.

Nach der erfindungsgemäßen Cyclisierung dieses Peptids weist das entstandene Produkt die struktur des Vasopressins auf:

_H_CYS-THR-PHE-GLN-ASN₇ CYS- PRO-ARG-GLY-NH₂-

Bei der Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Synthese von Schweine-Calcitonin kann die zugehörige Aminosäurekette unter Verwendung der in Tabelle VI angeführten Reaktanten oder ihnen äquivalenter Reaktanten aufgebaut werden. Das Peptid weist nach den in Tabelle VI aufgeführten Reaktionen und vor der Abspaltung des Harzes folgende Struktur auf:

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H-CYS BZ BZ BZ P BZ W

Il III ι I

H-CYS-SER-ASN-LEU-SER-THR-CYS-VAL-LEU-SER-ALA-TYR -1

T V-T-BZ

I II!

trp-arg-asn-leu-asn-asn-phe-his-arg-phe-ser-gly *—"Τ

L-MET-GLY-PHE-GLY-PRO

BZ BZ -GLU-

THR- PRO-NHCH— (X,

Nach der Säurebehandlung zur Abspaltung aller säureempfindlichen Schutzgruppen liegt folgende Struktur vor:

H-CYS
I

H-CYS-SER-ASN-LEU-SER-THR-CYS-VAL-LEU-SER-ALA-TYR-TRP-ARG

ASN-LEU-ASN-ASN-PHE-HIS-ARG-PHE-SER-GLY-MET-GLY-PHE-GLY

LPRO-GLU-THR-PRO-NH,

die einen Vorläufer von Schweine-Calcitonin darstellt.

Nach der erfindungsgemäßen Cyclisierung des Peptids weist das Produkt die Struktur von Schweine-Calcitonin auf:

H-CYS-SER-ASN-LEU-SER-THR-CYS-VAL-LEU-SER-ALA-TYR-TRP-ARG-ASN-LEU-ASN-ASN-PHE-HIS-ARG-PHE-SER-GLY-MET-GLY-

PHE-GLY-PRO-GLU-THR PRO-NH_{2 t}

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Bei der Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Synthese von Rinder-Calcitonin kann die zugehörige Aminosäurekette unter Verwendung der in Tabelle VII angeführten Reaktanten oder ihnen äquivalenter Reaktanten aufgebaut werden. Nach den in Tabelle VII angeführten Reaktionen und vor der Abspaltung des Harzes weist das Peptid folgende Struktur auf:

H-CYS BZ BZ BZ ρ BZ W

Ii" Jii J f

H-CYS-SER-ASN-LEU-SER-THR-CYS-VAL-LEU-SER-ALA-TYR

V BZ WVT BZ

* ί I ι I J

-TRP-LYS-ASP-LEU-ASN-ASN-TYR-HIS-ARG-PHE-SER-GLY-MET-I

BZ BZ
I I

-GLY-PHE-GLY-PRO-GLU-THR-PRO-NHCH—

^C6^H5

Nach der Säurebehandlung dieses Peptids zur Abspaltung des Harzes und der meisten Schutzgruppen liegt folgende Struktur vor:

H-CYS
I

H-CYS-SER-ASN-LEU-SER-THR-CYS-VAL-LEU-SER-ALA-TYR-TRP-LYS

ASP-LEU-ASN-ASN-TYR.-HIS-ARG-PHE-SER-GLY-MET-GLY-PHE-GLY-1-PRo-GLU-THR-PRO-NH₂,

die einen Vorläufer von Rinder-Calcitonin darstellt.

Nach der erfindungsgemäßen Cyclisierung des Peptids liegt die Struktur des Rinder-Calcitonins vor:

7 0 j 3 2 1 / 1 0 3 6

H-CYS-SER-ASN-LEU-SER-THR-CYS-VAL-LEU-SER-ALA-TYR-TRP-i l-LYS-ASP-LEU-ASN-ASN-TYR-HIS-ARG-PHE- SER-GLY-MET-GLY-j 1-PHE-GLY-PRO-GLU-THR-PRO-Nh₂ .

Das erfindungsgemäße Verfahren wurde an bestimmten Peptiden im einzelnen beschrieben; die Erfindung ist jedoch nicht auf die beschriebenen Anwendungsbeispiele beschränkt, sondern kann auch auf zahlreiche andere Peptidstrukturen bzw. Peptidsynthesen gleichermaßen angewandt werden.

Zusammengefaßt betrifft die Erfindung die Synthese cyclischer Disulfidpeptide durch Herstellung von Peptid-Zwischenprodukten mit einem Cystinrest am Aminoende und einem Cysteinrest in einer Position innerhalb der Aminosäuresequenz, die dem erwünschten Peptid entspricht, und Einbringen des Peptid-Zwischenprodukts in eine im wesentlichen sauerstofffreie Lösung bei einem pH von etwa 5 - 10, bis durch Umlagerung ein cyclisches Disulfidpeptid erhalten und ein Molekül Cystein vom am Aminoende befindlichen Cysteinrest abgespalten wird.

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Die Erfindung gibt ferner die entsprechenden Peptid-Zwischenprodukte als neue Verbindungen sowie deren Herstellungsverfahren an.

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Claims (21)

1. Ansprüche

   eptide, deren Aminosäuresequenz einen Cystinrest am Aminoende und einen Cysteinrest mit einer freien Sulfhydrylfunktion innerhalb der Aminosäuresequenz aufweist.
2. 2. Peptid nach Anspruch 1, gekennzeichnet durch dieselbe Aminosäuresequenz wie in Lachs-Calcitonin mit dem Unterschied, daß der Rest am Aminoende der Sequenz ein Cystinrest ist.
3. 3. Peptid nach Anspruch 1, gekennzeichnet durch dieselbe Aminosäuresequenz wie in Oxytocin mit dem Unterschied, daß der Rest am Aminoende der Sequenz ein Cystinrest ist.
4. 4. Peptid nach Anspruch 1, gekennzeichnet durch dieselbe Aminosäuresequenz wie in Vasopressin mit dem Unterschied, daß der Rest am Aminoende der Sequenz ein Cystinrest ist.
5. 5. Peptid nach Anspruch 1, gekennzeichnet durch dieselbe Aminosäuresequenz wie in menschlichem Calcitonin mit dem Unterschied, daß der Rest am Aminoende der Sequenz ein Cystinrest ist.
6. 6. Peptid nach Anspruch 1, gekennzeichnet durch dieselbe Aminosäuresequenz wie in Schweine-Caleitonin mit dem Unterschied, daß der Rest am Aminoende der Sequenz ein Cystinrest ist.
7. 7. Peptid nach Anspruch 1, gekennzeichnet durch dieselbe

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   η L· ι υ η J

   Aminosäuresequenz wie in Rinder-Calcitonin mit dem Unterschied, daß der Rest am Aminoende der Sequenz ein Cystinrest ist.
8. 8. Peptide, deren Aminosäuresequenz einen Cystinrest am Aminoende und einen innerhalb der Sequenz liegenden Cysteinrest aufweist, dessen Sulfhydrylfunktion geschützt ist durch Benzyl, 4-Methoxybenzyl, k— Methylbenzyl, 3.4-Dimethylbenzyl, 4-Chlorbenzyl, 2.6-Dichlorbenzyl, 4-Nitrobenzyl, Benzhydryl, t-Butylthio oder Isopropylthio.
9. 9. Verfahren zur Herstellung cyclischer Peptide mit Disulfid-Ringstruktur,

   dadurch gekennzeichnet, daß ein Peptid mit einem Cystinrest am Aminoende und einem Cysteinrest innerhalb der Aminosäuresequenz zur Umlagerung zum cyclischen Disulfidpeptid in einer im wesentlichen sauerstofffreien Lösung gehalten wird.
10. 10. Verfahren nach Anspruch 9* dadurch gekennzeichnet, daß eine wäßrige Lösung verwendet wird.
11. 11. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß eine wäßrig-alkoholische Lösung verwendet wird.
12. 12. Verfahren nach Anspruch 9 oder 10, dadurch gekennzeichnet, daß die Lösung während der Umlagerung bewegt bzw. gerührt wird.
13. 13. Verfahren nach Anspruch 9* dadurch gekennzeichnet, daß die Umlagerung unter einer Inertgasatmosphäre vorgenommen wird.

    709821/103S

    36
14. 14. Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß als Inertgas Stickstoff verwendet wird.
15. 15. Verfahren nach Anspruch 9 oder 13, dadurch gekennzeichnet, daß das Verfahren über mindestens 1 h durchgeführt wird.
16. 16. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß folgendes Peptid verwendet wird:

    H-CYS* H-CYS-THR-ILE-GLN-ASN-CYS-PRO-LEu-GLY-NH₂.
17. 17. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß folgendes Peptid verwendet wird:

    H-CYS I

    h-cys-gly-asn-leu-ser-thr-cys-met-leu-glyn Lthr-tyr-thr-gln-asp-phe-asn-lys-phe-his-j

    L-PHE-PRO-GLN-THR-ALA-ILE-GLY-VAL-GLY-1
18. 18. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß folgendes Peptid verwendet wird:

    H-CYS

    I
    H-CYS-TYR-PHE-GLN-ASN-CYS-PRO-ARG-GLY-Nh₂.

    V^rfahr^n Hcich Anspruch Q

    ,fladuroh gekennzeichnet,

    709821/1038

    •OIPL-ING. R. BEETZSEN.- DIPL-ING. K. WMPRECHT DR.-ING. R. BEETZ JR.- RA DIPL.-PHYS. U. UElDU""! DR.-ING. W. TIMPE- DIPL-INQ. J. SIEGFRIED " Steinsdorfstraße 10 - 8000 München 22

    542-26.171P-FSBk

    P 26 47

    NACHQEREICHTI

    Neuer Anspruch 19
19. 19. l. 1977

    19. Verfahren nach Anspruch 9,

    dadurch gekennzeichnet,

    daß das Peptid hergestellt wird durch

    Einkuppeln des Cysteinrests in eine Aminosaurekette unter Schutz seiner Sulfhydrylfunktion mit Benzyl, 4-Methoxybenzyl, 4-Methylbenzyl, 3.4-Dimethylbenzyl, 4-Chlorbenzyl, 2.6-Dichlorbenzyl, 4-Nitrobenzyl, Benzhydryl, t-Butylthio und Isopropylthio,

    Ankuppeln des Cystinrests am Aminoende der Aminosäurekette und

    Abspaltung der jeweiligen Schutzgruppe vom Cysteinrest durch Behandlung des erhaltenen Peptids mit einer wasserfreien Säure.

    709621/1038

    Einkuppeln des Cysteinrests in eine Aminosäureke^e unter Schutz seiner Sulfhydrylfunktion mit Benzyl^T-Methoxybenzyl, 4-Methylbenzyl, 5.4-Dimethylben^yi, 4-Chlorbenzyl, 2.6-Dichlorbenzyl, 4-Nitrobenzyl, Befizhydryl, t-Butylthio und Isopropylthio,

    Ankuppein des Cystinre^&tfs am Aminoende der Aminosäurekette und

    Abspaltung der jeweiligen Schutzgruppe vom Cysteinrest

    Behandlung des erhaltenen Peptids mit wasserfreier
20. 20. Verfahren nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, daß ein Peptid folgender Aminosäuresequenz verwendet wird.

    CYS

    CYS-TYR-ILE-GLN-ASN-CYS-PRO-LEU-GLY.
21. 21. Verfahren nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, daß daß ein Peptid folgender Aminosäuresequenz verwendet wird.

    CYS

    CYS-GLY-ASN-LEU-SER-THR-CYS-MET-LEU-GLY-THR-

    [tyr-

    THR-GLN-ASP-PHE-ASN-LYS-PHE-HIS-THR-PHE-

    ■PRO- GLN-THR-ALA- ILE- GLY-VAL- GLY-ALA-PRO.

    709821/1036