JPS58501121A - ヒト カルシトニン前駆体ポリ蛋白質構造遺伝子 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は組換えＤＮＡバイオテクノロジー領域に関する。特にヒトカルシトニン 前駆体構造遺伝子の生産、該遺伝子のベクター系への挿入、そのクローニング及 びこれに続くヒトカルシトニンの生産におげろ組換えＤＮＡバイオテクノロジー の使用に関する。

カルシトニンは甲状腺のＣ−細胞により合成及び分泌される６２個のアミノ酸残 基（分子量３５００）より成る小さいポリペプチドホルモンである。

カルシトニンの主たる生理機能は、カルシウムト燐の要求時、例えば成長、姶娠 及び哺乳期間に骨格の崩壊を制限するものである。従って例えば、思春期におけ る急速な成長時のカルシトニンの欠乏は骨の損失をもたらす。カルシトニンの分 泌がなければ同様な骨の損失が娼娠中にもおこる。男性のカルシトニンレベルは 女性より高く、そして両性とも年令に伴いそのレベルは低下する。このことは月 経閉止後の女性に特に顕著で、カルシトニンのレベルの低いことが閉経後の骨の 損失と骨粗鬆症における重要な要素と入られている。

もしヒトカルシトニンが商品として充分な量入手出来れば、このペプチドを単独 又は他の薬と組入合わせて閉経後の骨粗鬆症の予防と治療に用いることが可能で ある。カルシトニンは又骨中の悪性の沈着物による上昇したプラズマカルシウム の治療にも役立つ。これの最も普通の原因は骨格中の二次的沈着を伴う乳癌であ る。こ＼での作用は多分部分的には骨芽細胞中のカルシトニンの抑制作用を反映 している。後者は部分的には上昇したプラズマカルシウムレベルを導く骨の破壊 の増加の原因となる。カルシトニンは骨中の癌細胞に対する直接作用を持ち、従 って骨中の悪性沈着物による上昇したプラズマカルシウムレベルの低下に役割を 演するものであろう。

現在、カルシトニン（鮭から精製したもの）がぺ−ジェット病の治療に代替量よ りもむしろ薬理的投与量で使用されている。これは主として４０才以後の人に影 響のある普通の状態である。人口の４％をしめるこのダルーゾが影響を受けてい る。この様に、例えば英国では、この病気は無症候性ではあるけれども何万人と いう人々が治療を必要としている。不幸にして鮭カルシトニンを用いる長期間の 治療は、症例の約２５％が魚の異種カルシトニンの免疫拒否反応により実行出来 ないことが証明されている。従って既にヒトカルシトニンが大量に必要となって いるのである。

本発明者は、ヒトカルシトニン構造遺伝子の微細構造を明らかした、これは既知 の組換えＤＮＡ技術により原核又は真核生物の細胞系に挿入され、構造遺伝子中 で暗号づげられる他のペプチドに加えて、ヒトカルシトニンが大量に合成され、 精製され引き続いて薬理的目的に使用され得る。

甲状軟骨骨髄癌腫から分離した全ヒトポ’）　（Ａ）−含有ｍＲＮＡは推定分子 量２１．００’０の主要ポリペプチドの無細胞蛋白合成系における合成を方向づ ける。これ及び更に量が少い一連の主要でないポリペプチドは合成ヒトカルシト ニンに対してあげた抗血清により沈澱し得る。このことを示すために行われた実 験は後述するが結果（第１図に示す）は正常なヒト血清中を循環するカルシトニ ンの既知の分子量（３５００）とは著しく対照的である。

此等高分子量の想像されるカルシトニンの前駆体の合成を方向づけるｎｆｔＮＡ 種の分析を組換えＤＮＡ技術、ＤＮＡ配列分析及びカルシトニンｍＲＮＡのサイ ズ決定の組み合せにより行なった。この様にしてヒトカルシトニンの高分子免役 沈澱形の合成を方向づけるとして知られる全ポ１７　（Ａｌ−含有ＲＮＡを二本 鎖ｃ　ＤＮＡ群を合成するための鋳型として使用した。これを確立されている方 法でシラスミドＤＮＡに挿入し、適当なに、　ｃｏ１ｉホスト中に形質転換させ た。最も豊富な甲状腺ポ！Ｊ　（Ａ）−含有ＲＮＡ群を代表するｃＤＮＡ配列を 含むコロニーを原位置（ｉｎ　５ｉｔｕ　）　／％イブリダイゼーション法を用 いて選択し、カルシトニンｃＤＮＡ配列を含むものを次に雑種形成翻訳（ｈｙｂ ｒｉｄｓａｔｉｏｎ　ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ　）により同定した。本発明者は 更にこ＼にこれ等ｐｈＴ　−Ｂ３及びｐｈＴ　−Ｂ６と指定された２つのシラス ミドの詳細な分析、及びそれ等のサイズ、配列、及びカルシトニン構造遺伝子（ 複数）により暗号づけられる此等ｍＲＮＡ（複数）の暗号づげの可能性の決定へ の利用につき詳細に記述する。

第２図にか＼れている結果は次のことを示している。

（Ａ）　エンドヌクレアー（！’　Ｐｓｔ’ｉを用いる制限分析により決定され る様に、組換えシラスミドは親プラスミドＤＮＡと比較すると、それ以外のＤＮ Ａ配列（ｐｈＴ−Ｂ６．４９０ｂｌ）８；　ｐｈＴ　−Ｂ３．５９０−ｂ、ｐｓ 　’ｂｐｓ二塩基対）を含んでいる。

（Ｂｌ　組換えシラスミド両者は無細胞蛋白質合成系において推定されるヒトカ ルシトニン前駆体ポリ蛋白の合成を方向づける甲状腺ｍＲＮＡ　＠を雑種形成（ 〕・イブリダイジング）させ得る配列を己んでいる。

（Ｃ）　その両者の組換えプラスミドは°制限エンドヌクレアーゼ遺伝地図作成 により判定されるように共通なｃＤＮＡを含んでいるが、ｐｈ’ｒ−Ｂ３．は共 通断片の一方の端に附加的な配列を含入、ｐｈＴ　−Ｂ６はもう一方の端に附加 的な配列を含んでいる。

第６図は３２ｐをラベルしたｐｈＴ−Ｂ５雑種形成プローブ（探査子）を用いた ＲＮＡゾロツテイング実験の結果を示す。これから、問題のｍＲＮＡ種が多量に 甲状腺組織中に存在しこれ等が１０００±１００ヌクレオチドの長さであること が明らかである。上記のデータはカルシトニンの起源とｍＲＮＡのサイズを明確 にし又カルシトニンは生体中において分泌の前に広汎な翻訳後の加工過程を必要 とする高分子前駆体ポリ蛋白として合成されることを示している。

クローンされたｃＤＮＡ配列のＤＮＡ配列分析は（１）此の前駆体ポリ蛋白内部 のカルシトニンペプチドの相対位置を明確にし、 （１１）側面のＮＨ２−末端及びｃｏｏａ末端ペゾチドのアミノ酸配列を明らか にする。

第４図はｐｈＴ−Ｂ３及びｐｈＴ−Ｂ（５プラスミドに挿入されたｃＤＮＡのヌ クレオチド配列を示し又第５図は此の配列を決定するために使用するＤＮＡの配 列策を示している。

１つの（ｐｈＴ−Ｂ６）はｍＲＮＡの３′非翻訳部の全体とカルシトニンペプチ ドを暗号づける配列の部分を含み、相中で停止コードンが遭遇する前にカルシト ニンのＣ００Ｈ−末端プロリンの後の更に２５個のアミノ酸をｍＲＮＡが暗号づ けることを明らかにしている。もう１つの（ｐｈＴ−Ｂ３）はカルシトニンペプ チドの全体、側面の０００Ｈ−末端（隠性の）ペプチドの附加的２５個のアミノ 酸、側面のＮＨ２−末端（隠性の）ペプチドの３６個のアミノ酸及びｍＲＮＡの ３′非翻訳部の大部分を指定する配列を含んでいる。全体として、本発明者は２ つの重複するｃＤＮＡクローンを用いて５８０の塩基又はヒトカルシトニンｍＲ ＮＡの６０％を配列した。

ヒトカルシトニン構造遺伝子（複数）は１０００±１００塩基の長さのｍＲＮＡ 種を暗号づける。此等のｍＲＮＡの翻訳は分子量２１，０００の前駆体ポリ蛋白 を作る。カルシトニンペプチドは此のポリ蛋白のＣ００Ｈ−末端に向って存在し 、附加的な２５個のアミノ酸によりＣ００Ｈ−末端と側面を接し、３６アミノ酸 より長いが未だ決定はされていないアミノ酸配列によりＮＨ２−末端と側面を接 する。

この様にして、−面においては、本発明はヒトカルシトニン前駆体ポリ蛋白の構 造遺伝子より成る。本発明は又、以下のアミノ酸配列を含む挿入されたポリペプ チド断片を持つＤＮＡ転換ベクター、特にシラスミド、より成っているニー −Ｃ７１１ｉ−ｇｌｙ−ａｓｎ−１ｅｕ−Ｅｌｅｒ−ｔｈｒ−ｃ７Ｂ−ｍｅｔ− １ｅｕ−ｇｌ、７−ｔｈｒ−−ｔｙｒ−ｔｈｒ−ｇ　Ｉｎ−ａ　ｓ　ｐ−ｐｈｅ 　−ａ　ｓ　ｎ−１ｙｓ−ｐｈｅ−ｈｉ　ｓ−ｔｈｒ−ｐｈｅ−−ｐｒｏ−ｇ　 Ｉｎ−ｔｈｒ−ａ　１ａ−１ｌｅ−ｇ’１ｙ−ｖａ　ｌ−ｇ　１ｙ−ａ　１ａ− ｐｒ□　。

本発明は更に以下のアミノ酸配列を含む挿入されたポリペプチド断片を持つＤＮ Ａ転換ベクター、特にプラスミドを含んでいる二 ７ 特表昭５８−’ａＵ１１？、１（４） 更に本発明てよるヒトカルシトニンのアミノ酸配列より成るポリペプチドを暗号 づけるヌクレオチド配列を持つＤＮＡ転換ベクターの生成法は、（１）　ヒトカ ルシトニンのアミノ酸配列より成るポリペプチドを暗号づけるｍＲＮＡを提供す ること、（１１）二本鎖ｃＤＮＡの合成、そのうち１つはｍＲＮＡのヌクレオチ ド配列と相補的なヌクレオチド配列を持つ、及び ｌｉｐ　ＤＮＡ転移ベクター中に該二本鎖ｃＤＮＡを挿入することより成る。

ｍＲＮＡはカルシトニン生産生物の甲状腺に起源するｍＲＮＡを含む細胞により 好適に提供される。その様な細胞の他の起源は肺と脳である。

ＤＮＡ転換ベクターは微生物菌株、例えばＥｓｃｈｅｒｉ−（！ｈｉａ　ｃｏｌ ｉの様な細菌中に好適に転移され複製される。

本発明は又ヒトカルシトニンを作るため加工（好適には切断による）され得るヒ トカルシトニンのアミノ酸配列を含むポリペプチドを提供する。その様なポリペ プチドは好適にはヒトカルシトニンのアミノ酸配列より成るペゾチドと組入合わ せたホスト蛋白より成る融合蛋白質である。

本発明は更に又ヒトカルシトニンを生産するためにポリペプチドを加工すること より成るヒトカルシトニンの生産法を提供し、そこで該ポリペプチドはヒトカル シトニンのアミノ酸配列より成るポリペプチドを暗号づける挿入された遺伝子よ り成る遺伝子含有ＤＮＡ転移ベクターにより形質転換されたホスト生物により表 現される。

・・・はヒトカルシトニン前駆体ポリ蛋白に相補的なりＮＡ配列を含むシラスミ ドを構築し、特徴づけそしてそれに引き続（ｔｒｐＥ−カルシトニン融合蛋白か らヒトカルシトニンの生産を行うものである。

■　材料と方法 Ｉｌｌ　限ｅ素ＰｓｔＩはベーリンガー社より又ウシ胸腺末端デゾキシヌクレオ チジル転移酵素はＰ、Ｌバイオケミカルス（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｅ　）より 得た。すべてのその他の酵素は前に記載した起源（（！ｒａｉｇ　Ｒ９に、Ｈａ ：Ｌｌ、Ｌ。

Ｐａｒｋｅｒ、　Ｄ、　＆　Ｃａｍｐｂｅｌｌ　Ｐ、Ｎ、（１９８１）　Ｂｉｏ ｃｈｅｍ、Ｊ。

１９４、９８９−９９８　）より得た。Ｌ（３３Ｓ）−メチオニン（７００−１ ３０００ｉ／ｍＭ　）　、デシキシＣ５−”Ｈ〕シｆシフ５’−ｔｒｉ−燐酸塩 ＜　１８．４０ｉ／ｍＭ　）　、デシキシ〔８−”Ｈ）り７／　シン５’−三燐 酸塩（１１，７０ｉ／ｍＭ）、アデノシン５′−〔γ−３２ｐ〕三燐酸塩（２０ ００−ろＱ　Ｑ　Ｑ　Ｃｉ／ｍＭ　）及びデシキシグアノシン５′−〔α−３２ Ｐ〕三燐酸塩（≧４０００ｉ／ｍＭ　）はアマ−ジャムイア　ターｆ　’／　ヨ ナ／ｌ／　、（Ａｍｅｒｓｈａｍ工ｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａ上）より得た。ＡＭ Ｖ逆転写酵素（ロットナンバーＧ−９１１８０）はアメリカフロリダ州３３７０ ７セントピータースバーグにあるライフサイエンス社（Ｌｉｆｅ　５ｃｉｅｎｃ ｅ工ｎｃ、）のＪＪ、Ｂｅａｒｄ博士により提供された。その他すべての化学薬 品及び溶剤は前に記載した起源（Ｃｒａｉｇ。

Ｒｏに、Ｂｒ０Ｗｎ、　Ｐ、ＡｌＨａｒｒｉｓｏｎ、Ｏ，Ｓ、　ＭＣ工１ｒｅａ Ｖｇ、Ｄ、　＆Ｃａｍｐｂｅｌｌ、　Ｐ、Ｗ、　（１９７６）　Ｂｉｏｃｈｅｍ 、　Ｊ、　１６Ｑ、　５７−７４Ｃ！ｒａｉｇ、　Ｒ，に、Ｂｏｎｅｔｏｎ、　 Ａ、Ｐ＋Ｈａｒｒｉｓｏｎ、　Ｏ，Ｓ、Ｐａｒｋｅｒ。

Ｄ、　＆Ｃ！ａｍｂｅｌｌ、　Ｐ、Ｎ　（１９７９）　Ｂｉｏｃｈｅｒｎ、　Ｊ 、　１８１．７３７−７５６　）　；　（Ｐａ５ａａｌｌ、Ｊ、００Ｂｏｕｌｔ Ｑｎ、　Ａ、Ｐ、　Ｐａｒｋｅｒ、　Ｄ。

Ｈａｌｌ、　Ｌ、　＆　Ｃｒａｉｇ、　ＲｏＫ　（１９８１）　Ｂｉｏｃｈｅｍ 、Ｊ、　１９６゜５６７−５７４　）より得た。

ｂ　ヒト骨髄癌腫からのポＩＪ　（Ａ）−含有ＲＮＡの分離二組換えシラスミド の構築、形質転換及び選択全ＲＮＡは（Ｈａｌｌ、　Ｌ、　Ｃ！ｒａ４．、Ｒｏ に、＆　Ｃａｍｐｂｅｌｌ、　Ｐ、Ｎ（１９７９）　Ｎａｔｕｒｅ（ｏ　ｙトン ）２７７．５４−５６）に記載の通り、冷凍したヒト甲状軟骨骨髄癌腫組織より 分離され、残ったＤＮＡ　Ｇ′ｉＺｉｍｍｅｒｍａｎ、　Ｓ、Ｂ及び５ａｎｄｅ ｅｎ　Ｇ、Ａｎａｌ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　１４．２６９−２７７　（１９６６ ）に記載の通りデシキシリボヌクレアーゼによる消化で除いた。ポＩＪ　（Ａｌ −含有ＲＮＡは次いでオリゴ（ｄＴ）−セルローズ上のアフイニテイークロマト ダラフイーにより分離し、次いでサイズ選別した二本鎖ＣＤＮＡ群を前に記載し た（　Ｏｒａｉｇ等、１９８１　Ｈａｌｌ、　Ｌ、Ｄａｖｉｅｓ、　Ｍ、Ｓ。

＆　０ｒａＱ　、、Ｒ，に、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、９．６５− ８４　。

１９８１　）通り生じたポ！ｊ　（Ａ）−含有ＲＮＡ群より合成した。

このサイズ選別した二本鎖ｃ　ＤＮＡを次いで次の方法でｄＣ残基で６′ヒドロ キシ末端において伸張した。二水銀ｃＤＮＡ　（１μｇ　／　ｍｌ　）を２　ｍ Ｍ　−０，ｏＣｔ２．０．ｌｍｍ−ジチオスレイトール、５ｃｋｇのヌクレアー ゼを含まなイウシ血清７／ｌ／プミン／ｍｌ及び０．１　ｍｍ　−（”Ｈ）ｄ　 ＣＴＰ（４Ｃｈｉ／ミリモル）を含む６０龍のトリス／　１００　ｍｍ−カコジ ール酸（１０ｍ−ＫＯＨでＰＨを７．５ニ調整）に溶かした。次いで末端デゾキ シヌクレオチゾル転移酵素（６００単位／　ｍｌ）を加え、混合物を６０℃にイ ンキュベートした。３０−５０残基の長さのポリ（ｄＯ）尾部を添加した時（５ 分間隔で１μ量のトリクロール酢酸による沈澱により決定され、約１５分）反応 をフェノ」ル／クロロホルムによる抽出により停止し、核酸をエタノール沈澱で 回収した。この沈澱をエタノールで２回洗い、二回蒸溜水に溶かし一７０°Ｃで 貯蔵した。

前に記載した様に（Ｃｒａｉｇ等、１９８１　）　して調製した高純度に精製し た多重コイルｐＡＴ１５３ＤＮＡを制限エンドヌクレアーゼＰｅｔ　Ｉで消化し 次いで、５０μｇ／ｍｌ！ＤＮＡが存在すること以外本質的に上述した様にして ポリ（ｄＧ）１．と尾部づけした。（３Ｈ″］ｄＧＴＰ　（１，７Ｃｉ／ｍＭ） を放射能ラベルしたデシキシヌクレオチド燐乍塩としてｄＣＴＰと置換し、末端 デゾキシヌクレオチジル転移酵素が最終濃度として８００単位／　ｍｌ存在した 。ポリ（ａａ）−尾部づげしたｃＤＮＡとボＩＪ　（ｄＧ）−尾部づけしたｐＡ Ｔ　ｉ　５３ＤＮＡは次いで夫々最終濃度として０．４μｇ　／ｍｌ及び４μｇ 　／　ｍになるようにＱ、４ｍＡのポリプロピレン製の特衣昭５Ｌ５０１１２１ （５） スナップキャツノチューブの中で２　Ｑ　Ｑ　ｍＭ−ＮａＣｌ及び１ｍｍＥＤＴ Ａを含むｐＨ７，６の１０　ｍＭ　−トリス／ＨＣｔ中テアニールした。混合物 を７０°Ｃで６０分間水浴中で加熱し、水浴のスイッチを切り、この雑種形成（ バイブリド）した混合物を一夜室温迄冷却した。形質転換に使用したポ！Ｊ　（ （ＩＣ）−尾部づけしたｃ　ＤＮＡの量は１０から２０　ｎｇの間で変化した。

生じたキメラプラスミドＤＮＡを次いで、他に記載した方法（Ｃｌｒａｉｇ等、 １９８１　）を用い英国遺伝子操作諮問グループ（ｔｈｅ　Ｂｒ１ｔｉｓｈ　Ｇ ｅｎｅｔｉｃ　ＭａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎＡｄｖｉｓｏｒｙ　Ｇｒｏｕｐ　）が 決定したガイドラインに従って最適微生物基準によりＫｓｃｈ６ｒｉｃｈｉａ　 ｃｏｌｉ　ＨＢｌＱｌＨＢｌｏｌｒｓｃＡ　（Ｂｏｙｅｒ、　ＨｏＷ、＆　Ｒｏ ｕｌｌａｎｄ　−Ｄｕｓｓｏｉｘ。

Ｄ、Ｊ、Ｍｏｌ、Ｂｉｏｌ　４１．４５９〜４７２．１９６９　）を形質転換さ せるのに用いた。形質転換した細胞は１２．５μμのテトラサイクリンを含むＬ −ブロス中の１．５％（Ｗ／Ｖ）寒天上で選別した。個々のコロニーを次いで１ ２．５μｇのテトラサイクリン／　ｍｌのみ又は１００μｇｏ）アンピシリン／ 　ｍｌの入を含む新しい寒天平板培地上でレノリカ平板培養した。アンピシリン 感受性と入られるコロニーを選択し以下の実験に供した。

コロニー許過原位置（ｉｎ　５ｉｔｕ　Ｊハイブリダイゼーション、プラスミド の成長と精製、正のハイブリダイゼーション−翻訳、個々のｃＤＮＡ配列の精製 及び「ノーずン（Ｎｏｒｔｈｅｒｎ　）　Ｊ転移技法を用いる個々のｍＲＮＡ配 列のサイズ推定は他の文献に記載されている。

（Ｃｒａｉｇ等、１９８１　；　Ｂｕｒｄｉｔｔ、　Ｌ、Ｊ、Ｐａｒｋｅｒ、　 Ｄ、Ｃｌｒａｉｇ。

Ｒ，Ｋ、、　Ｇｅｔｏｖａ、　Ｔ、及びＣａｍｐｂｅｌｌ、　Ｐ、Ｎ、Ｂｉｏｃ ｈｅｍ、　Ｊ。

１９４９９９−１００６．１９８１．　Ｈａｌｌ等、１９８１参照）。シラスミ ドのニック（Ｎ１ｃｋ　）　）ランスレージョンはＲｉｇｂｙ。

Ｐ、Ｗ、Ｊ、、　Ｄｉｅｃｋｍａｎ　、Ｍ、、　Ｒｈｏｄｅｓ、　Ｃ及びＢｅｒ ｇ、　”、＋Ｊ、　Ｍｏｌ、　Ｂ１１１−、１１３．２３７−２５１．１９７７ に記載されている通りである。特に断わらない限り、すべての制限酵素分析は製 造メーカーの推せんするイオン条件を用いて行った。制限酵素処理プラスミドＤ ＮＡのサイズ分析は他の文献（Ｃｒａｉｇ等、１９８１　）に記載されている平 床アガローズデル電気泳動により行った。

小麦胚芽無細胞蛋白合成系におけるｍＲＮＡ一方向づけ無細胞蛋白合成及び抗体 沈澱法はＯｒａｉｇ等（１９７６）により記載されている。ＳＤＳ／ポリアクリ ルアミドーケ８ル電気泳動分析はＰａ５ｃａｌ１等（１９８１）により記載され ている平板デルを用いて行なった。フロログラフィーは、ジメチルスルフォキサ イドを氷酢酸で置換えた。

（Ｂｕｒｃｋｈａｒｄｔ、　Ｊ、　Ｔｅ１ｆｏｒｄ、　Ｊ、＆　Ｂ１ｎ５ｔｉｃ ｌ、　ＨｏＬ、。

Ｎｕｃ：ｈｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　６．２９６３　２９７１．１９７９ 　）以外は（Ｂｏｎｎｅｒ、　Ｗ、Ｍ、＆　Ｌａ５ｋｅｙ、　Ｒ９Ａ、、　Ｆｕ ｒ、Ｊ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、。

４６、８３−８８．１９７４　）の方法に従った。

甲状軟骨の骨髄癌腫から分離した全ヒトポリ（Ａ）含有ＲＮＡを小麦胚芽無細胞 蛋白合成系に加え、生じた（３５Ｓ）メチオニンラベルした蛋白質をＳＤＳ／ポ リアクリルアミドデル電気泳動と７０ログラフイーにより分析した。その結果（ 第１図ａ）は分子量６００００迄の蛋白質スペクトラムが合成されたことを示し ている。

最も顕著なことは、推定分子量２１００の蛋白質がヒトカルシトニンに対してた てられた抗血清で沈澱し得ることが証明されたことである。此の蛋白質に加えて 、推定分子量１９５００．１８０００及び１５０００の量の少いペゾチドも又カ ルシトニン特異性抗血清で沈澱された。此等は小麦胚芽無細胞抽出物（Ｐａ５ｃ ａｌ１等１９８１参照）中に存在する翻訳後の加工活性により部分的に加工され たカルシトニン前駆体ポリ蛋白であると信じられる。別法として、此等は、それ ぞれカルシトニンのアミノ酸配列を含む異なったポＩＪ　ｉｎを暗号づける多重 ポ’）　（Ａ）−含有種の翻訳から生ずるであろう。

此等の相違は蛋白合成にとって次善であるＭｇ２＋の濃度において特に明らかで ある。この様にして１．５ｍＭ−Ｍｇ　２＋においては、主要なポリペプチドは 分子量ｉ　ａｏｏｏのカルシトニン前駆体ポリ蛋白の形のものであり、一方蛋白 合成の最適条件である２、５　ｍｍ　−Ｍｇ２＋においては、分子量２１０００ のカルシトニン前駆体ポリ蛋白の形のものが主要であった（第１図す参照）。

重要でないＭｇ　２＋の濃度でも主要なポリペプチドはヒトカルシトニンに対し てあげられた抗血清で沈澱し得る状態にとどまっていた。（第１図Ｃ）。

全体として、組織の起源及びｍＲＮＡ一方向づけの無細胞蛋白合成の主要生産物 としてヒトカルシトニン抗血清で免役沈澱し得るポリペプチドの同定に基づいて 、本発明者はヒト甲状軟骨骨髄癌腫組織に存在する豊富なポー！Ｊ　（Ａ）−含 有ＲＮＡ種がカルシトニン前、躯体ポリ蛋白（複数）の合成を方向づけると結論 する。

甲状軟骨のヒト骨髄癌腫から分離した全ボＩＪ　（Ａ）　−含有ＲＮＡを用いる 組み換えｃＤＮＡプラスミドの構築すべての操作は第６図に概説した全体の方策 を用いる方法の部に特に述べられているものを除いて、ヒト及びモルモットミル ク蛋白ｃＤＮＡ配列を含む組み換えプラスミドの構築のため概説された方法（Ｃ ｒａｉｇ等、１９８１；Ｈａ］１等１９８１参照）Ｋ従った。

簡単に云えば、甲状軟骨のヒト骨髄癌腫から分離された全ポリ（ロ）−含有ＲＮ Ａ群を代表するｃ　ＤＮＡ　をＡＭＶ逆転写酵素を用いて合成した。アガローズ ゲル電気泳動を用いるサイズ分析によれば、合成されたｃＤＮＡの大きさは５０ ０から１５００ヌクレオチドの長さの範囲のサイズであることを示している。こ れを、虹ハ逆転写酵素を用い、次いで生じたヘアーピノループのＳ、ヌクレアー ゼによる切断により二本鎖型に変換した。この群を次いで調製アガロ−ズブルミ 気泳動によりサイズ分けし、６００から２５００ヌクレオチドの長さの範囲の此 等の配列をゲルから溶出させ、それ等の３′−ヒドロキシル末端ｔウシ胸腺末端 デゾキンヌクレオチジル転移酵素を用いてボ！Ｊ　（ｄＣ）５０　で伸張した。

此の群を次いであらかじめろ′−ヒドロキシル末端をポ、す（ｄＧ）、２で伸張 したＰｓｔＩ−制限酵素処理ｐＡＴ　１５３　ＤＮＡでアニールした。

生じたキメラ状分子を最適微生物実験基準の条件下でｒｅｃＡ−株のＬｃｏｌｉ 　ＨＢ　１０１の形質転換に使用した。形質転換物をテトラサイクリ／を含むし 一寒天平板上で選別し、次いで組み換えシラスミドを含むコロニーをアノピンリ ンのみ又はテトラサイクリンのみを含むＬ−寒天上にレプリカ（複製）平板培養 した。全体で、２０　ｎｇ　の二本鎖の尾部づけしたｃ　ＤＮＡを用いた単独形 質転換はアノピシリン感受性を失った１０７のコロニーを生じた、従ってこれ等 はｐＡ、Ｔ　１５ろのＰｓｔＩ部位に挿入されたｃ　ＤＮＡ配列を含むものと推 定した。

無細胞蛋白合成の研究から、甲状軟骨のヒト骨髄癌腫のポリ囚−含有ＲＮＡ群は 、カルシトニン前駆体ポリ蛋白（複数）の合成を方向づける豊富なｍ　ＲＮＡ群 を含んでいることが明らかになった。従って、ヒト骨髄癌腫からの全塩基切断３ ２ｐ−ラペルボＩＪ　（Ａ）　−含有ＲＮＡは原位置ハイブリダイゼーション法 を用いる。前記の方法で此等のコロニーがカルシトニン前躯体ポリ蛋白ｃＤＮＡ 配列ｃ　ＤＮＡ配列（方法の部参照）を最もたしかに含むであろうことを確認す るために使用された。すべてのアノピシリン感受１コロニーはこの方法で選別し 、１７（１６％）が基準に対して顕著なハイブリダイゼーションを示した。此等 のうち、１１を選択し液体培養中で生育させ、プラス８ ミドＤＮＡを分離した、そして附加的ＤＮＡ配列の存在は制限エンドヌクレアー ゼＰｓｔ　Ｉによる分解、次いでアガローズケ９ル電気泳動により決定した。こ のことは１つを除いてすべて親プラスミドｐＡ　１５ろと比較して附加的なりＮ Ａを含んでいることを確認した。

２つのシラスミドｐｈ’ｒ　−Ｂ　３とｐｈ’Ｉ’　−８６の詳細な特徴づけを 記載する。

制限エンドヌクレアーゼＰｓｔＩでの消化によるｃ　ＤＮＡ　の切断の後でアガ ローズケゞル電気泳動による挿入ｃＤＮＡ配列のサイズ分析によりｐｈ’Ｉ’− Ｂ３　とｐｈ’ｒ−Ｂ６は５９０及び４９０塩基対の挿入配列を含むことが分っ た（第２図Ａ）。

それぞれのシラスミドに存在する暗号づけ配列の同定はＤＢＭ−ペーパーフィル ター上に固定化した部分的に制限酵素処理により変性したプラスミドＤＮＡへの 、きひしい条件下でハイブリダイゼーションにより分離したｍＲＮＡの小麦胚芽 無細胞翻訳のＳＤＳ　／ポリアクリルアミドゲル電気泳動により行った（　Ｃｒ ａｉｇ等１９８等径９８１参照は両シラスミドが豊富なガルシトニン前駆体蛋白 の合成を方向づける骨髄甲状軟骨癌腫ｍ　ＲＮＡ種に対して相補的ＤＮＡ配列を 含むことを示した（第２８図）。それぞれの例において、無細胞蛋白合成は２． ５　ｍ、Ｍ　−Ｍｇ　”＋の存在下で行われたけれども、分子量２１０００及び １８０００のカルシトニン前駆体ポリ蛋白型は両者とも存在し１９ た。これに続（種々の制限エンドヌクレアーゼを用いる此等の配列のマンピッグ （第２図Ｃ）は両者の組み換えプラスミド共共通のｃＤＮＡ配列を含んでいるが ｐｈＴ　−Ｂ　３ば共通断片の一端に附加的な配列を含み、ｐｈＴ　−Ｂ　６は 他の端に附加的配列を含んでいることを示した。特徴づけられた組み換え体中の カルノトニ／前駆体ポリ蛋白ｍ　ＲＮＡ配列の割合をめるため、ｍＴ（ＮＡＯサ イズを、水平アガロ−ズブルミ気泳動によるグリオキサ゛−ル処理ボＩＪ　（Ａ ）−含有ＲＮＡの分離後（ＭｃＭａｓｔａ、　Ｇ、に、＆Ｕａ、ｍ１ｃｈａｅｌ 、　（）、Ｇ、ＰＴｏｃ、Ｎａｔｌ　ＡＣａｄ。

Ｓｃｉ、ＵＳＡ、７４．４８３５−４８３８．１９７７　）ＲＮＡブロンティン グ技法（Ａｌｗｉｎｅ、　Ｊ　、Ｃ，Ｋｅｍｐ、　Ｄ、Ｊ　、＆５ｔａｒｋ、、 Ｇ、Ｒ，Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ　７４　、５３５０− ５３５４．１９７７）を用いて推定した（第６図）。

これはヒトカルシトニン前、躯体ポリ蛋白ｍ　ＲＮ　Ａは１０００土１００ヌク レオチドの長さであることを示した。この様にしてｐｈ’ｒ　−Ｂろ及びｐｈ’ ｒ　−Ｂ　６に挿入されたｃ　ＤＮＡ配列は全体としてｍ　ＲＮＡ配列の６０〜 ６５％を代表した。非ポリアデニル化ヒト甲状軟骨骨髄癌腫ＲＮＡの並行した分 析は同一の長さのカルシトニン前駆体ポリ蛋白ｍＲＮＡの存在をも明らかにした が又低分子量のかげ離れたバンドを明らかにした、これは部分的に分解したｍ　 ＲＮＡか又ははっきりしたカルシトニ／配列と共通の配列を含むかけ離れた低分 子量のｍＲＮＡ種かのいずれかである（第２０　特表昭５８−５０１１２１（７ ）４図）。カルシトニン前駆体ポリ蛋白ｍ　ＲＮＡは実施した条件下では臨月胎 盤組織、Ｔ−４７Ｄ細胞又は乳房起源のヒト細胞系から分離した全ボＩＪ　（Ａ ）−含有ＲＮＡ中には検出出来る量存在しなかった（第６図参第１図　免疫沈澱 及びＳＤＳ　／ポリアクリルアミドゲル電気泳動により判定したヒトカルシトニ ン前駆体ポリ蛋白の無細胞蛋白合成を方向づけるｍＲＮＡ。

冷凍したヒト甲状軟骨骨髄癌腫組織（４ｇ）から分離した全ポリ（ロ）−含有Ｒ ＮＡ　（０，２μｇ　／分析）　（Ｈａｌ、１等、Ｎａｔｕｒｅ　（Ｌｏｎｄｏ ｎ）　２７７　、５４−５６　、１９７９参照）を小麦胚芽無細胞蛋白合成系に 加え、生じたＣ　３５　ｓ　〕メチオニンをラベルした蛋白質をＳＤＳ　／ポリ アクリルアミドケゞル電気泳動で分離しついでフロログラフィーを用いて視覚化 した（前記材料と方法参照）。

（５）レー／（１）添力［１ｍＲＮＡなし；レーン（ｉｉ）、ヒト甲状軟骨骨髄 癌腫ポリ（Ａ）−含有ＲＮＡ　；レーア（ｉｉｉ）、レーア　（ｉｉ）と同様で あるが蛋白質を合成ヒトカル／トニノに対してあげられた抗血清を用いて沈・澱 させた。（Ｂ）レーン（１）（ロ）、（Ｖ）及び（ｖｌ、それぞれ１．５．２． ０．２．２５及び２．５ｍＭのＭｇ　２＋　濃度で翻訳されたヒト甲状軟骨骨髄 癌腫ポリ（４）−含有ＲＮＡ、ｖ　−ｙ　（ｉｉ）、（１ｖ）、（ｖｉ）、（ｖ ｌ）及び（ｖｉｉｉ）、それぞれ１，５．２０口、２．２５及び２．５ｍＭのＭ ｇ２＋　濃度におけるＲＮＡ添力■なし。（Ｃ）レーン（１）及び（ロ）、それ ぞれ１．５及び２．５　ｍＭのＭｇ２＋濃度で翻訳されたヒト甲状軟骨骨髄癌腫 ポリ（Ａ）含有ＲＮＡ　；レーン（ｉｉ）及びＯＶ）、それぞれレーン（１）及 び（ｉｉｉ）と同様であるが合成セトカル／トニンに対してあげられた抗血清を 用いて蛋白を沈澱させた。矢印は次の既知分子量のクーマツノーブルーで染めた マーカー蛋白の比移動度を示す（Ｗｅｂｅｒ等１９７等径９７２参照セルアルデ ヒド−６−燐酸塩デヒドロゲナーゼ（ろ６０００）；　トリプンン（２ろ３００ ）；及びリゾチーム（１４ろ０９）。

第２図　ヒトカルシトニン前駆体ポリ蛋白ｃ　ＤＮＡ配列を含むプラスミドの特 徴づけ。

（ト）挿入ｃ　ＤＮＡ配列のサイズ分析。プラスミドＤＮＡす／プル（０，２５ μｇ）を制限エンドヌクレアーゼで分解し、次いで前記（Ｈａ１１等１９８１参 照）の通り１．６％（Ｖ■）のアガローズデル上で電気泳動した。既知サイズの ＤＮＡ断片（５ｕｔｃｌｉｆｆｅ、Ｊ、（）、　（１９７８ａ　）　ＣｏｌｄＳ ｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂ　Ｓｙｍｐ　Ｑｕａ−ｎｔ　Ｂｉｒｌ、４ろ、７７−９０ ；５ｕｔｃ１．１ｆｆｅ、Ｊ　、Ｇ、　（１９７８ｂ　）　ＮｕｃＬｅｉｃ　Ａ ｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ。

５．２７２１−２７２８）はｐＢＲろ２２　ＤＮＡσ）　ＡＩＵＩ分解及びｐＡ Ｔ　１５３　ＤＮＡ　０）Ｈａｅ　ｍ分解により作られた。

レーン（Ａ）、　９１０、６５９、６５５、５２１　、４０　ろ、２８１．２５ ７及び２２６塩基対のＡｌｕ　Ｉ　マーカー；レーン（ｂ）、Ｐｓｔ　１により 分解されたｐＡＴ　ｉ　５　り　ＤＮＡ　；レー／（Ｃ）、Ｐｓｔ　Ｉにより分 解されたｐｈＴ　−Ｂ　３　ＤＮＡ　；レーン（ｄ、）、Ｐｓｔｌにより分解さ れたｐｔｉＴ　−Ｂ　６　ＤＮＡ　；レーン（ｅ）　５８７．４５８．４ろ４、 ろろ９．２６ノ、２３４及び２１６塩基対のＨａ−ｅ　ｍ　７−カー。（Ｂ）正 の／％イブリダイゼー７ヨン翻訳。ＤＢＭ−ペーパー上に固定化された部分的に 制限され、変性した組み換えＤＮＡへのハイプリダイゼ−７ヨンにより分離され た配列特異的なボＩＪ　（Ａ）含有ＦｔＮＡを小麦胚芽無細胞系に加え［””Ｓ ：］メチオニンでラベルした無細胞翻訳生産物をＳＤＳ　／ポリアクリルアミド ゲル電気泳動で分離し次いでフロログラフィーで視覚化した。レーン（ａ）、添 ｍ　ＲＮＡなし；レーン（ｂ）全ヒト甲状軟骨骨髄癌腫ポ１，１　（Ａ）含有Ｒ ＮＡ；レーン（ｃ）、（ｄ）及び（ｅ）、それぞれシラスミドＩ）ＡＴ　１５３ 　。

ｐｈＴ　−Ｂ　３及びｐｈＴ−Ｂ　６へのノ・イブリダイゼーションにより分離 されたポリ（〜含有ＲＮＡｏ矢印は第１図に関して記載したマーカー蛋白の相対 位置を表す、然しそれに加えてチトクローム−Ｃ（１１７００）を含んでいる。

（Ｃ）組み換えプラスミドｐｈＴ　−Ｂ　５とｐｈ、Ｔ−Ｂ６中の挿入ｃＤＮＡ 配列の制限エツトヌクレアーゼの比較マツプ。

第６図　ヒトカルシトニン前駆体ポリ蛋白ｍＲＮＡのサイズ推定。ＲＮＡサンプ ルをグリオキサールで処理し、次いで１・５％（ｗ／ｖ）アガローズケゞル上の 別々σ）みぞに装填し、電気泳動を行い前記の通り（Ｃｒａｉｇ等、１９８１　 ）　ＤＢＭ−ペーパー上にプロットした。ヒトカルシトニン前駆体ポリ蛋白ｍＲ ＮＡ配列（矢印）σ）位置は３２ｐでラベルした、ニック（Ｎｉｃｋ））ランス レーノヨンしだｐｈＴ　−８３プラスミドＤＮＡハイブリダイゼ−７ヨ／プロー ブ（探査子）　（５，６ｘ　１０７ｃ、ｐ、ｍ、／ｄｇ）にハイブリダイゼーシ ョンすることにより決定した。レーア（ｉ）Ｔ　−４７Ｄポリ囚含有ＲＮＡ（１ μｇ）ｔレーン（１１）ヒト胎盤ポリ囚含有ＲＮＡ（１μｇ）、レーン（ｉｉｉ ）全ヒト甲状軟骨骨髄癌腫ＲＮＡ（４ｏμｇＬレーノ（１ｖ）、非ポリアデニル 化ヒト甲状軟骨骨髄癌＠ＲＮＡ（４ｏμｇＬ　レーア（Ｖ）ヒト甲状軟骨骨髄癌 腫全ボＩＪ　（Ａ）含有ＲＮＡ（ｉμｇ）。

サイズ推定はグリオキず−ル処理直線１）ＢＲ３２２ＤＮＡ（４３６２塩基）、 先細赤血球１８５　ＲＮＡ　（２０６０塩基）、ｐＢＲ３，２２ＤＮＡのＢａｍ ＨＩ／Ｐｓ　ｔ　Ｉ分解物（３２３７及び１１２５塩基）及びＥ、ｃｏｌｉ　ｔ ＲＩＪＡ　（８０塩基）の移動度との直接比較により決定した。

上記した通り、第４図はヒトカル／トニン前駆体ポリ蛋白の構造遺伝子のヌクレ オチド配列及びそれが暗号づけるアミノ酸を示している。１−３２と標識されて いるアミノ酸はヒトカルシトニンの既知アミノ酸配列に相当する。

ｍ−１から一６６迄のアミノ酸配列は既知の陽性のＮｌ２−末端側面ペゾチドを 弄し、＋１から＋２５迄のアミノ酸配列は陽性のカルホキフル末端側面ペプチド を表している。矢印は隣接するＤＮＡ配列はしごから推論されるヌクレオチド配 列の領域を明確にしている。

箱に囲んだアミノ酸（−２及び−１；＋１から＋４迄）は生体内蛋白分解過程の ために予期される部位を示している。（５ｅｉｎｅｒ　Ｄ、Ｆ、、　Ｑｕｉｎｎ 、　Ｐ、Ｓ、Ｃｈａ−ｎ、ｓ、Ｊ　、ＭａｒｓｈＪ、ａｎｄ　Ｔａｊｅｒ　Ｈ， ｓ、、Ａｎｎ、Ｎ、Ｙ、Ａｃａｄ、Ｓｃ＋、３４　ろ、　１−１６．１９８０） 。グリシン残基（＋１）、（以下に記載する表現ベクターの構築において重要な 考慮が払われる）は生体内で隣接するカルボキシル末端アミノ酸のアミデージョ ンのだめの加工中に要求される（　Ｋｒｅｉｌ、　Ｇ、５ｕｃｈａｎｅｋ、　Ｇ 、ａｎｄ　Ｋｉｎｄｅｓ　−Ｍｎｇｇｅ、　Ｉ　、、　Ｆｅｄｎ　。

Ｐｒｏｃ、６６．２０８１−２０’８６．１９７７　＞。この様にしてヒトカル シトニン中でグリシン＋１はカルボキシル末端ゾロリ／残基（３２）（これは生 物学的活性に要求される特性である）のアミデーショ／のために必要とされる。

第５図は、Ｍａｘａｍ　Ａ、Ｍ、ａｎｄ　Ｇ１１ｂｅｒｔ　Ｗ、、　Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｎ。

化学的切断法を用いて行ったヌクレオチドの配列方策を明確にしたものである。

第６図は全体としてのクロー二／グ方策を描いたものである。そこで次にｐｃ’ ｒろ７と指示された表現ベクターを用いる生産法を、融合蛋白の生産のためのプ ラスミドｐｈＴ　−Ｂろから誘導されたヒトカルシトニン配列と組み合せて、又 ヒトカルシトニン又はカルボキシ末端に附加的グリシン残基金持つヒトカルシト ニンのそえ等からの生産の記述を以下に行う。

トリプトファンプロモータ及びＴＲＰＥ遺伝子の分離近年トリプトノア／オペロ ンは高い関心のある主題５ である。その結果、５つの構造遺伝子の完全なヌクレオチド配列及びそのコント ロール領域の解明が行われた（　ＣｏＹａｎｏｆｓｋｙ等Ｎｕｃｌｅ１ｃ　Ａｃ １ｄｓ　Ｒｅｓ　９＋　６６４７−６６６８．１９８１　）。コントロール領域 と構造遺伝子の部分は外来遺伝子の表現のためのベクターを構築するため（（も 使用される（　Ｂ、Ｅ、Ｅｎｇｅｒ−Ｖａｌｋ等、Ｇｅｎｅ９　＋　６９−８５ 　＋　１９８０　；　Ｗ、Ｔａｃｏｎ、Ｎ、Ｃａ５ｅｙ　ａｎｄＪ、Ｓ、Ｅｍｔ ａｇｅ、Ｍｏ１ｅｃ、Ｏｅｎ、Ｇｅｎｅｔ、　１７７　４２７−４３８＋１９８ ０　；　Ｒ，Ａ、Ｈａｌｌｅｗｅｌｌ　ａｎｄ　Ｊ、Ｓ、Ｅｍｔａｇｅ、Ｇｅｎ ｅ　９　＋２７−４７．１９８０　）。初期の研究は又コントロール領域と完全 なｔｒｐ　Ｅ遺伝子が三５７００塩基対のＨｉｎｄ■断片上のＥ、ｃｏｌｊ　染 色体から分離し得ることを明らかにした（　Ａ、Ｓ、Ｈｏｐ　ｋｌｎｓ、Ｎ、Ｅ 、Ｍｕｒｒａｙ　ａｎｄ　Ｗ、Ｊ。

Ｂｒａｍｍａｒ　Ｊ、Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、　１０７　、５４９−５６９　。

１９７６　）　Ｅ、ｃｏｌｉ　オペロンも又ファージφ８０及びλのｔｒｐ形質 導入株のＤＮＡから分離されている（　Ｂ、Ｅ。

Ｅｎｇｅｒ−Ｖａｌｋ　等上記引用文中）。

他の方法として、コントロール領域とｔｒｐ　Ｅ遺伝子はコスミド（ｃｏｓｍｉ ｄ　）　ベクターと生体外パンケージノブを用いても分離出来る。（Ｂ、　Ｈｏ ｈｎ　ａｎｄ　Ｋ、Ｍｕｒｒａｙ。

Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ　７４　、３２５９−３２６２ ゜１９７７　；　Ｃｏ１１ｉｎｓ、Ｊ、ａｎｄ　Ｈｏｈｎ、Ｂ、、　Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ。

ＳＣ１，ＵＳＡ　７５　、−４２４２−４２４６　、１９７８　）この様にして 、Ｅ　ｃｏｌｌ　染色体ＤＮＡ　ｆ　Ｓａｕ　３　Ａで部分的に分解し、生じた 断片をあらかじめＢａｍ　ＨＩ　で完全になる部分解しである１　０．５ｋｂ　 のコスミド３０３０とりガーゼでつないだ。コスミド６０ろ０はＢａｍ　ＨＩの だめの特異な部位を含み、アノビアリンに対する耐性を与える。リガーゼ処理の 後で、混合物を生体外でパッケージし、Ｅ、ｃｏｌｉ　Ｋ　１２のｔｒｐ　Ｅ株 を感染させるために使用した。組換え体をアノビアリンを含むＬ−寒天平板上で 選別し、これから、それ等をアンピシリンを補給したＭｇ塩、グルコーズ、力ず ミノ酸ミニマル寒天平板上にレプリカ培養した。組み換え体はこの様に選択され そのトリプトファン欠落中でも生育する能力によりｔｒｐＥ−株を補う。数種の 組み換え体が同定され、プラスミドＤＮＡが分離され、そして制限酵素分析によ り特徴づけられた。３０ろＱ　／　ｔｒｐと指示され、Ｈｘｎｄｍによる分解で の５７００塩基対断片を生産する１つのコスミドを将来の使用のため選別した。

コスミド６０ろ０／　ｔｒｐをＨｉｎｄ　ＩＩＩ　で分解し、断片をアガローズ ゲル電気泳動で分離し、５７００塩基対の断片をゲル状ソリ力から回収した。最 後に、この５７００塩基対の断片を、プラスミドｐｔ、ｒｐ　Ｅ５７００　ｋ生 産するためＫ　Ｉ）ＡＴ　１５ろのＨｉｎｄ　Ｉｌｌ　部位にクロー／トリシト ファンプロモーター含有断片の部分の図示を第７図にあげる。この図から、完全 な：　ｌ；　、。

ンプロモーターーオペレーター複合体が、もしＤＮＡか可能な部位の約５０％が 切断されている様な条件下で分解されるならば、２６４塩基対（ｂｐ）のＴａｑ 　（制限断片上に分離できることがみられる。

この様にして１０μｇのｐｔｒｐ　Ｅ５７０．ＯをＰＨ８，４の１０ＩＩ！Ｍ） リス−ＨＣ１，１Ｑ　ＱｍＭＮａＣＪ、６　ｍＭ　Ｍｇ（Ｊ２及び６β−メルカ ７’トエタノール中でＴａｑ　Ｉ　４単位と共に６５°Ｃで２０分間インキュベ ートした。インキュベートヨ／の後、反応混液を７エノールで抽出し、エタノー ルで沈澱させ、水に溶解させ、そして５％ポリアクリルアミドｒル上で電気泳動 した。電気泳動後、デルを臭化エチジウムで染色し、２３４　ｂｐのＤＮＡバン ドをケゝルから切り取りＤＮＡを回収した（　Ａ、Ｍ、Ｍａｘａｎｎ　ａｎｄＷ 、Ｇ１１ｂｅｒｔ、　Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ　７４　 、５６０−５６４．１９７７）。

このＤＮＡ断片を次いでシラスミドＩ）ＡＴ　１５３のＣｌａｌ部位に挿入した （　Ｔｗｉｇｇ　ａｎｄ　５ｈｅｒｒａｔｔ、　Ｎａｔｕｒｅ２８３．２１６． １９８０＞。１０μｇ＆）ｐＡＴ　１５３をＣ１ａ　Ｉで完全に分解し、５′− 燐酸基を、ＰＨ８の１０ｍＭ　）リスーＨＣ１中で０．５単位のウシ腸アルカリ フォスファターゼと６７°Ｃ１時間インキュベートして除いた。

この過程は挿入したＤＮＡ断片の不在下でプラスミｙ７５ｓ再環状化することを 防ぐものである。ＩＧＯｎｇ　の上記処理Ｉ）ＡＴ　１５　！ｌ　ｆ：、ｐ［（ ７，６の５　ＱｍＭ　）リス−Ｈ（Ｊ、１０ｍ＊のＭｇ（Ｊ２．２０＋ｎＭのジ チオスレイトール１−のＡＴｐ及び２０単位のＴ４ＤＮＡＩＪガーゼを含む反応 系中で５　ｎｇの２３４　ｂｐ　ＤＮＡと１５℃で４時間でリガーゼでつないた 。リガーゼでつないだＤＮＡを次いで標準的な技法（、Ｈｅｒｓｈｆｉｅｌｄ、 　Ｖ、等Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ’、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ。

ＵＳＡ７１．３４５５−３４５９．１９７４）Ｋより受容能力あるＥ　ｃｏｌｉ 　Ｋ　−１２ＨＢ　１０１株（Ｂｏｙｅｒ。

Ｈ，Ｗ、ａｎｄ　Ｆｔｏｕｌｌａｒｄ−Ｄｕｓｓｏｉｘ、Ｄ、、　Ｊ、Ｍｏ１． Ｂｉｏｌ−４１゜４５９−４７２．１９６９）を形質転換させるために使用し、 そのバクテリアを１００μｇ７威アンピンリ／を含有するＬ−寒天平板上に平板 培養した。数種のアン−シリ／抵抗性コロニーを選別し、シラスミドＤＮＡを調 製し、２３４　ｂｐ　断片の存在を制限分析により確認した。

生じたプラスミド、指定されたＩ）ＣＴ　１２　、は第８図に示す構造を持って いる。Ｔｒｑ断片のＣｌａ部位への挿入はｔｒｐプロモーターから下流の末端に おけるＣ１ａ　Ｉ部位を改善することが指摘された。

ｐｃ’ｒ　１２の改変 ｐｃ’ｒ　１２は更に下記の様にしてＩ）ＣＴ　２８とＩ）ＣＴ　２９を生産す るため改変された。２μｇのＩ）ＣＴ　１２をＨｉｎｄｍで完全に分解し、次い で突き出たＨｉｎｃｉ　ｍ末端を除くため２５　ｍＭ　酢酸ソーダを含む−４， ５の緩衝液、０、５　Ｍ　Ｎａ（Ｊ及び１ｍＭ酢酸亜鉛中で６０単位の３Ｉヌク レアーゼと共に２０℃で６０分イ、ンキュペー卜した。

この反応をｐ［（７，６Ｋ上けて停止させ、混合物をフェノール／クロロホルム （１：ｊ）で抽出した。ＤＮＡ　ヲエタノール沈澱により濃縮し、す７ゾルを上 記の通りＴ４ＤＮＡリガーゼと共にインキュベートし、次いでＥｃｏｌｉ　Ｋ　 １２　ＨＢ、１．０１株の形質転換のために使用した。

数種のアンビンリン耐性コロニーを選別し、プラスミドＤＮＡを調製し、制限分 析によりＨｉｎｄ　ｍ　部位のないことを確認した。生じたプラスミド、１）Ｃ Ｔ　２８と指定された、は第８図に示す構造を有する。ｐＣＴ　２８は更に改変 された。２μｇ　のＥｃｏＲＩで分解したｐｃ’ｒ　２８をｐＨ７，６，０５［ ］ｍＭ）リスＨＣ１，１０ｍＭ　ＭｇＣｆ２．１０ｍＭβ’　ｌ　”　カフ’　 ）　エタ／　−＃、０．２　ｍＭ　ｄＡＴＰ　及び０．２ｍＭＴＴＰを含む反応 系中で４単位のＥ、ｃｏｌｉ　ＤＮＡポリメラーゼと共にインキュベートした。

インキュベーション後、混合物をフェノール、クロロフォルムで抽出し次いでエ タノール沈澱させた。

この処理は、Ｂｃ　ｏＲ工部位の５′突出末端に相補的な４つのヌクレオチドを 入れこむ；□ ０．６μｇ　の上記処理ｐＣＴ　２８を６０ピコモルの５′−フオスフオリル化 合成オリゴヌクレオチドｐｃｃＡＡＧｃＴＴＧＩ）の存在下で１０μ１Ｔ４ＤＮ ＡＩＪガーゼ緩衝液中で２５００で１６時間処理した。

混合物を次いで反応を停止するために７０’Ｃで１０分間加熱しリンカ−をＨｉ ｎｄｍで分解して切断した。そして今Ｈｉｎｄｍ末端を持つ直線上ＤＮＡをアガ ローズデル上の電気泳動によりリンカ−から分離し、これから引ぎ続いて電気溶 出により回収しエタノール沈澱により濃縮した。リガーゼ処理のあとＥｃｏｌｉ 　Ｋ−１２ＨＢ　１０１株の形質転換、プラスミドＤＮＡの分離、Ｈｌｎｄ　ｍ 及びＥＣＯＲ工部位によるプラスミドの同定、ｐｃ’ｒ　２９と指定されたプラ スミドの生産が引き続いた。

ＴＲＰＦＩ遺伝子をクローンするＩ）ＣＴ　２９の調製ｐＣＴ　２９　（第９図 ）はＥ、ｃｏｌｉ　のトリプトファンプロモーターオペレーター領域及びプロモ ーター領域θ）下流の酵素Ｃ１ａ　ｌ　、Ｈｉｎｄ　ｍ及びＥｃ　ｏ　ＲＩの特 異な制限部位も含んでいる。

此等部位の２つ、Ｃ１ａ　Ｉ及びＨｉｎｄ　ｍ部位はｔｒｐ　Ｅ遺伝子を挿入す るために使用された。

５　μｇのｐＣＴ　２９をＣ１ａ　ｌで切断し、５′−突出末端を上記の通りｄ ｃＴＰ及びｄＧＴＰの存在下でＥ　ｃｏｌｉ　ＤＮＡポリメラーゼを用いて挿入 した。ポリメラーゼ反応混合物をフェノール次いでクロロホルムで抽出し、ＤＮ Ａを最終的にエタノールで沈澱させた。挿入したＤＮＡを次いでＨｉｎｄ　ｍで 分解し、生じた断片をアガローズｒル電気泳動で分離した。最大の断片を最初に 臭化エチジウムで染色し、紫外線でＤＮＡの位置を決め、関ノＢの部分をゲルか ら切りとることにより分離した。ＤＮＡを、電気溶出とエタノール沈澱による濃 縮（（より回収した。

ＴＲＰ　Ｆｉ遺伝子の分離 ｔｒｐ　Ｅ遺伝子はシラスミドｐｔｒｐＥ５．。。上に存在する、その１部は第 １０図に示されてし・る。然しなから、上記の通りｐｔｒｐＥ５７００はｔｒｐ 減衰部（ａｔｔｅｎｕａｔｏｒ　）も含んでいるｔｒｐ減衰部からの転写のコン トロールに関係する領域は以下の通りである。

この減衰部の領域を除くため５μｇのｐｔｒｐ　Ｅ５７００をＨｐａで分解し次 いでヌクレアーゼＢＡＬ　３１で処理した。

このヌクレアーゼは非常に特異的ヌクレアーゼで末端からＤＮＡ断片を短縮する ために使用出来る。更に、その作用は平滑末端分子を作り出す。５μｇのＨｐａ 　１分解ｐｔｒｐ　［５７００を０．６ＭのＮａＣｆ、１２ｍＭＭｇＣ１２、ｐ Ｈ８の２０ｍＭのトリス−Ｈ（４，１ｍＭのＥＤＴＡ中で１．５単位のＢＡＬ　 ３　ｉヌクレアーゼと共に６０°Ｃで１．５分処理した。次いで混合物をフェノ ール抽出、クロロホルム抽出及エタノール沈澱した。この処理によりＤＮＡ断片 のそれぞれの末端から１５０−２５０ｂｐを除去し、それによりほとんどの分子 から減衰部領域（、これはＨｐａ　１部位から１５０　ｂｐであるから）を除去 することになる。上記の処理を行ったＤＮＡ断片をＨｉｎｄ　ｌｌで完全に分解 し、次いでアガローズゲル電気泳動で分離した。

ｔｒｐ　Ｋ遺伝子を含むＤＮＡを最初に臭化エチジウムで染色、紫“外線でＤＮ Ａの位置をきめ、１８００−１８５０ｂｐ範囲のサイズのＤＮＡをゲルから切り 取ることにより分離した。このＤＮＡは電気溶出及びエタノール沈澱による濃縮 によりゲル断片から回収した。

ＴＲＰ　Ｅ遺伝子のｐｃＴ　２９への挿入上記の様にして分離したｔｒｐ　Ｅ断 片は上記の様にして改変したｐＣＴ　２９に挿入し得る。第１０図はりガーゼ処 理反応を図示している。０．２μｇの改変ｐｃＴ　２９と８０　ｎｇのｔｒｐ　 Ｅ断片をｐＨ７，６の５　ｍＭ　トリス、１０ｍＭのＭｇ（Ｊ２．１ｍＭのＡＴ Ｐ及び２０　ｕＭのジチオスレイトール中で１００単位のＴ　４　ＤＮＡリガー ゼと共に２０″ｃで１６時間インキュベートした。この混合物を次いで上記のＥ ｉ　ｃｏｌｉ　Ｋ１２　ＨＢ１０１株を形質転換させるのに使用し、形質転換物 をアンピシリン含有り一寒天平板上で選別した。数種のアンピシリン耐性コロニ ーヲ選別し、プラスミドＤＮＡを分離し、制限分析により検査した。此の分析に よりｔｒｐ　Ｅ遺伝子の存在と又代（ａｌｔｅｒｎａｔｏｒ　）領域の損失を確 認した。此等の特徴をもつプラスミドの１つ、ｐＯＴ　３７と指定されているも のをヒトカルシトニン遺伝子に関する其の後の仕事のために選択した。

カルシトニン及びカルシトニン−ＧＬＹのＴＲＰ　Ｅとの融合第１１図に概説し た図はシラスミドｐｈＴ　−’Ｂ　３がら誘導したヒトカルシトニン配列を融合 蛋白を作るために上記の表現ベクターｐＯＴ　３７と組み合せるために行う操作 段階を示している。最初の段階はカルシトニン配列の改変を含みそれにより、融 合蛋白中の最終的なアミノ酸がカルシトニン中の真正の末端アミノ酸に相当する プロニンであるか又は更にグリシンが翻訳される。

此の構築の目的はカルシトニン生産にみられる最終的な加工に関係があり下記に 全体を記載する。

２０μどのｐｈＴ−Ｂ　３をｐＨ７，５の６ｍＭのトリス−ＨＣｆ、＜５　ｍＭ のＭｇＣｌ２．７５　ｍＭのβ−メルカプトエタノール及び２Ｑ　ｍＭ　Ｋ（Ｊ ！中で１０単位のＢｓｔ　ＮＩと６０分間６０°Ｃでインキュベートスる。イン キュベーションの後、反応物をｐＨ６，０のＮａ−アセテート中で０．６Ｍとし 、フェノールで、次いでクロロホルムで抽出しエタノール沈澱で濃縮する。沈澱 したＤＮＡを７０％エタノールで洗い、真空中で乾燥し、２０μｍの水に再溶％ する（第１１図段階Ｉ）。Ｂｓｔ　ＮＩはカルシトニン配列を３２位置のゾロリ ンにおいてのみ切りその様にして非−暗号つけ鎖中のＴ残基は除去される。この Ｔ残基は次の段階（１１）でまた添加される。１０μｇのＢｓｔ　Ｎ工切断ｐｈ Ｔ　−Ｂ　３をｐｉ（７，６の５０　ｍＭ　トリス−ＨＣＪ、１０ｍＭＭｇＣ４ ゜１ＱｍＭβ−メルカゾトエタノール、０．２　ｍＭ　ｄｃＴＰ　。

０．２　ｍＭ　ｄＴＴＰ及び６単位のクレナ・つ（Ｋｌｅｎｏｗ　）酵素（ＤＮ Ａ−ポリメラーゼ大断片）’　（ＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ 　、　（Ｌｏｎｄｏｎ　）　Ｌｔｄにより供給）中でインキュベートした。イン キュベーション後、　ＤＮＡを７７０％エタノール中で洗い、１０μｍの水に再 溶解した。

得られたＤＮＡはこ＼で平滑末端で他の平滑末端ＤＮＡ分子とりガーゼでつなぐ ことが出来る。このＤＮＡ　’ｇ第１１図のＡ又はＢと指定された別々の２つの 合成オリゴヌクレオチドとりガーゼでつないだ（共有結合） Ａ　：　ＴＡＧＧＡＴＣＩＣＴＡ ＡＴＣＣＴＡＧＧＡＴ Ｂ　：　ＧＧＴＴＧＡＴＣＡＡＣＩＣ Ｃ！０ＡＡＯＴＡＧＴＴＧＧ この様にして、２．５μｇのｐｈＴ　−Ｂ　３由来のＤＮＡ断片を別別に４０　 ｎｇのオリゴヌクレオチドＡ又はＢと共に、ｐＨ７，５の　６　０　ｍＭ　）　 リ　ス　−　ＨＣｌ、　、８　ｍＭ　Ｈｇ（Ｊ２　、ｉ　Ｑ　ｍＭβ−メルカプ トエタノール、１ｍＭ　ＡＴＰ及び１．５μＩＴ４ＤＮＡリガーゼ（Ｎｅｗ　Ｅ ｎｇｌａｎａ　Ｂｉｏｌａｂｓ　ｏット１７）中で２４時間１６℃でインキュベ ートした。リガーゼ活性は温度を５分間７０℃に上げることにより破壊し、ＤＮ Ａをエタノール沈澱させ、７０％エタノール中で洗い、真空中で乾燥し、１０μ ｍの水に再溶解した。

１μｍ０両ＤＮＡサンプル（即ちオリゴヌクレオチドＡ又はＢにリガーゼでつな いだ）は、連結重合Ｃｏｎｃａｔθｍｅｒｉｇａｔｉｏｎによるサイズの増力口 の証明と臭化エチジウムによるアガローズデルの染色による視覚化これに次ぐ電 気泳動によるサイズ分別によりリガーゼ処理の効率を分析した。この２つのりガ ーゼ反応サンルート（即ちＡ又はＢ）のスタートを表わすことを注意。

以下の実験の記述は両方のシリーズの構築（Ｃ適用される。

残ったプラスミドＤＮＡ　（９μｌ）をセファデックスＧ−５０クロマトグラフ イーにより未反応のオリゴヌクレオチドから分離し、エタノール沈澱により濃縮 した。

ＤＮＡ　を　５０　μｌ　の　６　ｍＭ　）　リ　ス　−　ＨＣ，ρ１、　５　 ０　ｍＭ　Ｎａ（Ｊ　、６　ｍＭ　Ｍｇｃ、ｉ：２、ｔ５　ｍＭβ−メルカプト エタノール中に再溶解し、６７°Ｃで１時間放置後すべてのＳａｕ　３部位が完 全に切断されることを保障するため過剰のＳａｕ　３　Ａを加えた。リンカ−オ リゴヌクレオチドはＳａｕ　３　Ａ認識配列５’　ＧＡＴＣ！　３’を含み、Ｂ ｇｌ　１部位５’　ＡＧＡＴＣＴ　３’は又Ｓａｕ　３　Ａ部位である従ってＳ ａｕ　５　Ａ＋解の後で、カルシトニン配列は約１１０塩基対の長さく正確な長 さはオリゴヌクレオチドＡ又はＢを使用することにより１つのヌクレオチドだけ 異なっている）のＤＮＡ断片中に存在する。此等の断片を上記（第１１図段階ｔ ｖ　）の通りポリアクリルアミドケ゛ル電気泳動（ＰＡＧＥ　）により分離し、 次いでエタノール沈澱し、水（１０μｍ）に溶解した。ベクター表現プラスミド Ｉ）ＣＴ　３７　（上に詳述）を以下の通りＢｇｌ　１部位へのすＦ？−ジョン のために調製した。１０μｇのｐＯＴ　３７を６−ドリスーＨ（Ｊ、５　Ｑ　ｍ Ｍ　Ｎａ（Ｊ、６ｍＭ　ＭｇＣ４，６ｍＭβ−メルカプトエタノール及び１０単 位のＢｇｌ　ｌ中に３７℃で６０分間インキュ、ベートした。直線化したＤＮＡ を３．５ｍｌに稀釈し、ｐＨ６，０の酢酸ソーダ中に０．３　Ｍ濃度とする。５ ′燐酸基を６単位のウシ腸アルカリフォスファターゼ（ＣＩＡＰ　）の添加で６ ０°０１６０分のインキュベーションで除き、その後頁に６単位のＣＩＡＰを加 えて更に６０分間インキュベートした。

フオスファターセ活性は１フエノール、２フェノール−クロロホルム、６クロロ ホルム抽出で破壊し、その後ＤＮＡをエタノール沈澱し、水（１０μｍ）に再溶 解した。段階ｖ１で、カルシトニン含有断片を以下の通りｐｃ’ｒ　３　’７０ Ｂｇ１１部位にリガーゼでつないだ。０．１μｇの３ｇ１…で直線化しＣ工ＡＰ 処理したｐｃＴｊ７を約２ｎｇのカルシトニン含有断片とｐＨ７，５の６０　ｍ Ｍ　）リス−ＨＣｆ、８ｍＭ　ＭｇＣｆ２．１０ｍＭβ−メルカプトエタノール 、ｉ　ｍＭ　ＡＴＰ及び０．２μ１Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄ 　Ｂｉｏ１ａｂｓｉット１７）と共に１６時間１６°Ｇでインキュベートした。

ＤＮＡは次いで標準的な方法（Ｍｅｔｈｏｄ　ｉｎ　Ｆｉｎｚｙｍｏｌｏｇｙ　 、　Ｖｉｌ　６８、ｐｐ　３２６−６６１参照〕を用いて冷凍した受容力のある Ｅ　ｃｏｌｉＨＢＩＯＩ株を形質転換するのに使用し、アンピシリン耐性の形質 転換物を１００μｇ／ｍｌアンピシリン含有り一寒天平板上で選別した。Ｂｇｌ 　■部位に正しい方向にカルシトニン配列を持つプラスミドを含むクローンを同 定し、Ｍａｘａｍ、　Ａ及びＧ１１ｂｅｒｔ、Ｗ　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ。

Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　７４．５６０（１９７７）の方法を用いてＤＮＡ配列法 により構造を確認した。この段階において、カルシトニンＤＮＡ翻訳読みとり枠 はｔｒｐ　Ｆｉ遺遺伝耽読取り枠を持つ相の相外であり、もしこの読みとり枠が リポソームにより使われるならば、停止コードン（ＴＡＡ　）　＆Ｚ　ｔｒｐ　 Ｅ遺伝子の３２２のアミノ酸の後に遭遇する。この様に、ｔｒｐ　Ｅ遺伝子生産 物の過剰生産を指向する親表現ベクターｐＯＴ　３７と対照的に、これ等の構造 は６２６アミノ酸の長さの（即ち約３５にダルトン分子量）新規な切断された蛋 白質の過剰生産を指向するものと期待される。

この様な新規な蛋白質は此等のプラスミドを抱いているＦ；、Ｃ０１ｉにより実 際に生産され、そしてこれは適当な誘導条件下でのみおこり、第１２図に図示さ れている（下記参照）。この様に望！しいｔｒｐ　Ｂ−カルシトニン（又はカル シトニン−ｇｌｙ　）融合蛋白の過剰生産を指向するシラスミドの構築の最終段 階はｔｒｐ　Ｅ遺伝子と同じ翻訳読み取り枠の中えのカルシトニン配列が取りこ １れることを要求する。これは６ｎ＋２ヌクレオチドをｔｒｐ　Ｂ配列とカルシ トニン配列（即ち改造した特異なりｇｌ　１１部位において）の融合接点に加え ることによって達成される。

合成８倍体 ５’ＧＡＴ（！０ＯＧＧ ＧＧＣＯＯＴＡＧ　は正しい長さ く８＝３Ｘ２＋２）であり、Ｂｇｌ　１部位えのりｒ−シヨにとって適当な５′ 張出しを持って居り、加えて融合接点において酵素Ｓｍａのため新しいユニーク な制限部位（５’　ｃｃｃＧＧＧ　３’　）を造り出すので、適当である。この 様にしてプラスミド（１０μｇ）を６ｍＭトリス−ＨＣｌ、５０　ｍＭ　ＮａＣ ｆ、６ｍＭβ−メルカプトエタノール、６ＤＩＭ　ＭｇＣｆ２中で１０単位のＢ ｇｌ　ｌとインキュベートし、上記の通り、ＣＩＡＰを用いて直線上分子から燐 酸基を除去した。フェノール抽出とエタノール沈澱に続い℃、０．１μｇの直＃ ！　ＤＮＡを１０倍モル過剰の合成オリゴヌクレオチド、 ＧＡＴＯＣＣＧＧ ＧＧＣＣＴＡＧ　とｐＨ７，５の６０ＩＮＩＭトリスーＨ（Ｊ、１３　ｍＭ　Ｍ ｇ（Ｊ２．１［１ｍＭβ−メルカプトエタノール、ｉ　ｍＭ　ＡＴＰ及び０．２ 　μｍのＴ４ＤＮＡリガーゼ中で１６時間１６℃でインキュベートした（第１１ 図の段階ｉｘ　）。このリガーゼ処理した生産物を］ｌＣ，ＱＯｌｉ　ＨＢ１０ １細胞の形質転換に使用し、アンピシリン耐性の形質転換されたクローンを１０ ０μｇ／ｍｌのアンピシリン含有り一寒天平板上で分離した。これ等クローンの プラスミドの大部分は融合接点に１コピ一以上の合成オリゴヌクレオチドを含ん でいることが分った。２つの挿入されたリンカ−を持つプラスミド１μｇを６吐 トリス−ＨＣｌ、６　ｍＭ　ＭｇＣ２２，６ｍＭβ−メルカプトエタノール及び ２０ｒｎＭＫＣＪｌ中で１０単位のＳｍａ　Ｉ　（ペーリンガ社（Ｌｏｎｄｏｎ 　）　Ｌｔｄより供給）とインキュベートすることにより直線化し、次いで非直 線化プラスミドからの直線上分子を精製し、ＤＮＡを再びＴ４ＤＮＡリガーゼで つなぎ、更に第１１図の下に示されている構造を持つＨＢ１０１プラスミドえの 形質転換の手順に続いて分離した。図示した様に、ＤＮＡ接点は今、カルシトニ ン配列がｔｒｐ　Ｅ配列を持つ相中にあるようなものであり、又その様なプラス ミドは従って期待されるサイズ（約３８にダルトン分子量、第１２図参照）の新 規な融合蛋白の生産を示す。此等の構造の証明は次の方法で示きれる。この様に して、プラスミドを抱かないＥ　ｃｏ１ｉ細胞（即ち上記ＨＢ１０１細胞第１２ 図レーｙａ）、ｐＯＴ　３７を抱くもの（レーンｂ及びＣ）又はその中に停止コ ードンが６２６アミノ酸の後にみもれる上記構造を抱くもの（レーンｄ及びθ） を６７°Ｃで、その中でｔｒｐプロモーターが誘導されないＬ−ブロス（レーン ａ及びｂ）中、又は七の中で誘導されるＭ９−塩中（レーンｃ、ｅＬ、ｅ、ｆ、 ｇ−Ｒ，Ａ。

Ｈａｌｌｅｗｅｌｌ　ａｎｄ　Ｊ、Ｓ、　Ｆｍｔａｇｅ　１Ｇｅｎｅ　９．２７ −４７．１９８０も参照）で生育させ、遠心分離器で収穫した。

細胞をＳＤＳサンプル緩衝液（Ｌａｅｍｍｌｉ　、Ｕ、に、　Ｎａｔｕｒｅ２２ ７．６８０．１９７０）に溶解した。もとの培養５０μｌに相当する蛋白質を１ ２．５％（Ｗ／Ｖ　）ポリアクリルアシドグ９ル上で電気泳動し、分離された蛋 白をクマシーブルーで染色して視覚化した。第１２図からｐｃＴ　３７はＴｒｐ プロモーター誘導の条件下ではＴｒｐ　Ｂ遺伝子を過剰生産する（矢印で示した レーンＣ１−生育が非誘導条件であるレーンｂと比較）ことが明らかである。こ れと対比して、相外カルシトニン含有誘導体（レーンｄは第１１図に明確にした Ａタイプ末端を持ち、レーンｅはＢタイプ末端を持っている）では適当なサイズ の新規な蛋白質が示されたように存在する。２つの構造がカルシトニン配列を相 中に含むところでは（レーンｆはＡ−タイプ、レーンｇはＢ−タイプ構造）期待 されたサイズの新規な蛋白質がみもれる。

カル７トニンペプチドの存在の細菌細胞ライゼート（溶解物）による同定は放射 線免疫分析により行った。

この分析は本質的にはＳ　Ｉ　Ｇｉｒｇｉｓ等が記載した（Ｊ。

Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ　７３．３７２−３８２）様に行った。第１６図に見られ る様に、相外に挿入されたカルシトニン遺伝子を持つＬｃｏｌｉのライゼートか らの稀釈は１２５　Ｉ−３ラベルしたヒトカルシトニンに匹敵することが出来な かった。これに反し、相中に挿入されたカルシトニン遺伝子（Ａ及びＢとも）の 構造を持つＥ。

Ｃ０１ｉから得られたライゼートは期待された方法（カルシトニン標準と比較す る）で１２５ニー６ラベルヒトカルシトニンに匹敵した。このことは構築がヒト カルシトニンの期待された抗原決定群を含む融合蛋白の合成をもたらしたことを 確認するものである。

ヒトカルシトニン配列をＥ、ｃｏｌｉのｔｒｐ　Ｅ遺伝子に相当量のｔｒｐ　Ｅ カルシトニン融合蛋白が生産される様に導入することの究極の目的はカルシトニ ンペプチドを商業的に成り立つ方法で遊離させることにある。これは数個の可能 なルートにより達成されるであろう。

最初のステップとして、カルシトニンペプチドは融合蛋白から切り離されなけれ ばならない。これは最初のシスティン残基がアルギニンにより先行されているの で正しく融合接点を切断するトリジシン酵素の使用により達成きれる。カルシト ニンはアルギニンを含１ないが１８位置に１つのりシン残基を持ち、これも又ト リジシン切断を受けやすい。このリジンは然しなから、シトラコニン無水物によ り保護される。（５ｈｉｎｅ　Ｓ　。

Ｆｅｔｔｅｓ　Ｉ　、Ｎａｎｃｙ　Ｃ，Ｙ、Ｌａｎ　、Ｒｏｂｅｒｔｓ、Ｊ、Ｌ 　ａｎｄＢｏｘｔｅｒ、Ｊ、Ｄ　Ｎａｔｕｒｅ　２８５．４５６−４６１）この 方法で遊離したペプチドは真のカルシトニンと次の点だけで異なるだけである。

即ち真のカルシトニンにおいてはＣ−末端のアミノ酸はプロリン（あるいはプロ リン−グリシン）であるよりむしろプロリンアミドである。遊離したペプチドを 真のカルシトニンに転換するのは酵母カルボキシペプチダーゼＹ　（Ｂｒｅｄｄ ａｍ　、　ＴＫ、ｚＷｉｄ−ｍａｒ、Ｆ　ａｎｄ　Ｊｏｈａｎｓｏｎ、Ｊ、Ｔ、 　ＣａｒｌｓｂｅｒｇＲｅｓ、　Ｃｏｍｍｕｎ。

４５．２３７−２４７及び３６１−３６７．１９８０）のＣ−末端修飾活性を使 用することにより可能である。

本発明に従い生産されたカルシトニンの生物学的使用から全く離れて、本発明に よって可能となる、クローンしたヒトカルシトニンＣＤＮＡゾローブの入手出来 ることはヒトカルシトニン遺伝子構造と正常な甲状腺組織の表現の間、又家族性 及び散発性甲状軟骨骨髄癌腫の比較を可能にする。ゾローブは又カルシトニンの 正規外の合成（特に肺癌腫による）に関する分子機作の決定的な研究に使用出来 るし、一方ＣＤＮＡプローブはリンクしたＤＮＡ多型性の研究に使用出来それに より甲状腺の家族性及び散発性骨髄癌腫を区別する迅速で信頼出来る手段を提供 し、患者とその家族を不快で広汎でしばしば害のある調査から救う可能性が出て くるのである。

浄膚　（Ｉ′二′９′″：二−プ２゛゛遣１・−゛日Ｇ、」 △　■Ｉ　ｉｌｌ 旦、　ｉ　ｉｉ　ｉｉｉ　Ｉｖ　ｖ　ｖｉ　ｖｉｉｖｉｉｉＱｉ　ｉｉ　ｉＮ　 ｉνψｍ　１．５　ｉ、口０２．ｏ　：２費丁２５　ユニ５　１：う１：５２ニ ラ　２ニラＦＩＧ、２゜ ＲＧ、　３ ３ｆｆ　ｌｔｌ”’　Ｌ　Ｐ”　豐１し’ＩＳ％　轡゛°１手続補正書（方式） 詔・１１うｄ　工　４　〕２８　日 特許庁長官殿 １、′ド件の表示 ２、発明の名称 じト（１１シントニ゛）＠五裳トボリｉ口ｖｅｘし１云ｙ３、補正をする者 −ＪＸ件との関係　持４．′「出頭人 工　名　（６，６６９）　浅　村　皓（１、・−≧−為。

５、補正命令の日付 昭和　５８住　４　月　１２日 ８、補正の内容　別紙のとおり 国際調査報告 易？Ｉ・１ｎｌｌｌ＋１ｌｌｌａｌ＾＋＋ｏｌ喝ｃａａｏｎ＋ｉｏ、ｐＣＴ／Ｇ Ｂ８２１００２０９２第１頁の続き Ｃ１２Ｒ１／１９　）　６７６０−４Ｂ優先権主張　＠１９８１年１１月２６日 ■イギリス（ＧＢ）［有］８１３５７３８ ＠発　明　者　マツフィンタイヤ−・イアインイギリス国ロンドン・ダブツユ１ ２オーエツチエス（番地なし）ハンマースミス・ホスピタル・ザ・ロイヤル・ポ ストグラブユニイト・メディカル・スクール内 ■出　願　人　マツフィンタイヤ−・イアインイギリス国ロンドン・ダブリユニ ２オーエツチエス（番地なし）ハンマースミス・ホスピタル・ザ・ロイヤル・ポ ストグラブユニイト・メディカル・スクール内

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １．　ヒトカルシトニンのアミノ酸配列より成るペプチドを暗号づける構造遺伝 子であって、このポリペプチドがヒトカルシトニンを生産するように加工出来る ことを特徴とする、上記構造遺伝子。 ２、　ポリペプチドがホスト蛋白質と、ヒトカルシトニンのアミノ酸配列より成 るペプチドより成る融合蛋白質である、請求の範囲第１項記載の構造遺伝子。 ６、　ポリペプチドがヒトカルシトニン前駆体ポリ蛋白より成る、請求の範囲第 １項記載の構造遺伝子。 ４、請求の範囲第１項から第６項のいずれか１項に記載の構造遺伝子を含むＤＮ Ａ転移ベクター。 ５、以下のアミノ酸配列含むポリペプチドを暗号づケル挿入（ポリ）ヌクレオチ ド断片を持つ、請求の範囲第４項記載のＤＮＡ転移ベクターニー−ｃｙ　５−ｇ ｌｙ−ａｓ　ｎ−１ｅｕ−ｓ　ｅ　ｒ　−ｔｈｒ−ｃｙｓ−ｍｅ　ｔ−１ｅ　ｕ −ｇｌｙ−ｔｈｒ−−ｔｙｒ−ｔｈｒ　−ｇＩｎ−ａ　５ｐ−ｐｈｅ　−ａ　Ｃ ｎ−１ｙｓ　−ｐｈｅ−ｈｉ　５−ｔｈｒ−ｐｈｅ　−−ｐｒｏ　−６１ｎ−ｔ ｈｒ−ａｌａ−ｉｌｅ−ｇｌｙ−ｖａｌ−ｇ、１ｙ−ａｌａ−ｐｒｏ　−。 ６、　以下のアミノ酸配列を６含むポリペプチドを暗号づける挿入（ポリ）ヌク レオチド断片を持つ、請求の範囲第４項記載のＤＮＡ転移ベクター：７　ヒトカ ルシトニンを生産する様に加工し得るヒトカルシトニンのアミノ酸配列を含むポ リペプチド。 ８、　ヒトカルシトニンのアミノ酸配列より成るペプチドと組み合せたホスト蛋 白？含む融合蛋白より成る、請求の範囲第７項記載のポリペプチド。 ９　ヒトカルシトニン前駆体のアミノ酸配列より成る、請求の範囲第７項記載の ポリペプチド。 １０、　（ｉ）　ヒトカルシトニンのアミノ酸配列より成るポリペプチドを暗号 づける遺伝子をＤＮＡ転移ベクターに挿入し、 （ｉｉ）　ＤＮＡ転移ベクターを含む遺伝子でホスト生物を形質転換させ、 （ｉｉｉ）　形質転換された生物により表現されたポリペプチドを回収し、この ポリペプチドをヒトカルシトニンを生産するために加工することを特徴とする、 ヒトカルシトニンの製造法。 １１、０）　ヒトカルシトニンのアミノ酸配列より成るポリペプチドを暗号づけ るｍＲＮＡを調製し、（１１）二本鎖のｃＤＮＡ、そのうち１本はｍＲＮＡのヌ クレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列を有する、を合成し、 ０１１）該二本鎖ｃＤＮＡをＤＮＡ転換ベクターに挿入することを特徴とする、 ヒトカルシトニンのアミノ酸配列より成るポリペプチドを暗号づけるヌクレオチ ド配列を持つＤＮＡ転換ベクターの調製法。 １２、　ｍＲＮＡがカルシトニン生産生物の甲状腺に起源するｍＲＮＡを含む細 胞により提供はれる、請求の範囲第１１項記載の方法。 １３、請求の範囲第１１項又は第１２項記載の方法で生産されたＤＮＡ転移ベク ター。 １４、微生物菌株中に転移し複製された、請求の範囲第４．５．６又は１６項記 載のＤＮＡ転移ベクター。 １５、微生物がバクテリアであり、転移ベクターがプラスミドである、請求の範 囲第１４項記載のＤＮＡ転移ベクター。 １６、微生物かＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ−ｃｏｌｉの菌株である、請求の範囲第 １５項記載のＤＮＡ転移ベクター。 １Ｚ　ヒトカルシトニンのアミノ酸配列より成るポリペプチドを暗号づける挿入 遺伝子より成る遺伝子−含有ＤＮＡ転移ベクターで形質転換されたホスト生物に よりポリペプチドが表現されている、ヒトカルシトニンを生産するための該ポリ ペプチドを加工することを特徴とする、ヒトカルシトニンの製造法。