JPH0659230B2 - ＴＧＦ‐βをコードしている核酸およびその用途 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明はＴＧＦ−βをコードしている核酸、およびその
用途に関するものである。

従来技術 哺乳類細胞の培養中で可逆的な表現型形質転換を誘導す
ることのできるペプチドは形質転換成長因子（TGF）
（１，２）と呼ばれている。α型TGFは表皮成長因子
（ＥＧＦ）と競合的に、同一の細胞表面受容体（３）と
結合する。アミノ酸数５０のTGF−α種が精製され、そ
れはEGF（４）と相同（ホモロジイ）な配列を有してい
ることが示された。TGF−αは種々の形質転換されたセ
ルラインによつて合成されているが、非胚起源の正常な
組織での合成は示されていない（３，５，６）。この５
０アミノ酸TGF−αは最初１６０アミノ酸前駆体分子の
一部として合成され、このものはＮ末端およびＣ−末端
のタンパク分解的プロセツシングを受けて成熟ペプチド
になる（７，８）。明らかにもつと分子量の大きいTGF
−α種が検出されるのは（１，２，９）、１６０アミノ
酸前駆体のプロセツシングが異なるからであろう。

β型（タイプβ）ＴＧＦ活性は、多くの性状組織（10，
11）、例えば腎臓（12）、胎盤（13）および血小板（1
4，15）から、並びに、腫瘍細胞から単離されている。T
GF−βは血小板中に存在しているが、この血小板中に
は、血小板誘導性成長因子（PDGF）およびＥＧＦ様ペプ
チド（16）も含有されている。ウシTGF−βはラツトに
おける傷の治癒を促進することが示された（17）。しか
しながら、TGF−βでＮＲＫ線維芽細胞を処理すると、
ＥＧＦに対する膜受容体の数が増加したという報告もあ
る（20）。この観察結果は、TGF−βが、これらの細胞
上でのＥＧＦおよびTGF−αの活性に対して大きい増強
作用を有するというTGF−βの既知の能力と一致してい
る（10，11）。さらに、TGF−βは単独で軟寒天中で、A
KR−２Ｂ線維芽細胞のコロニー形成を誘導する作用も有
する（21）。ある種の形質転換された細胞が高レベルで
TGF−βを分泌するということ（22）は、この成長調節
因子が悪性の形質転換において何らかの役割を演じてい
ることを示唆している。

TGF−βは、その細胞増殖刺激作用の外に、種々のヒト
がん細胞セルラインの固定依存性増殖を阻害することが
最近示された（13）。今日では、TGF−βは、アフリカ
ミドリザル（BSC−１）細胞から単離された増殖阻害因
子と同一、もしくは極めて近いと考えられている（2
4）。特定の細胞型のセルラインの増殖に対してTGF−α
が刺激的に作用するか、阻害的に作用するかは、細胞の
生理学的条件、および他の成長因子の存在等を含む多く
の変動因子（variables）に依存すると思われる。

ウシTGF−βは、配列決定可能な程度にまで精製され
た。成熟タンパク質の最初の１５アミノ末端残基は、以
下の式であらわれさるものであることがわかつた： Ala-Leu-Asp-Thr-Asn-Tyr-CMC-Phe-Ser-Ser-Thr-Gly-Ly
s-Asn-CMC- （式中、ＣＭＣは、システイン残基または半−システイ
ン残基であるＳ−カルボキシメチルシステインを表わ
す）。

ヒト胎盤またはヒト血小板由来のヒトTGF−βも同程度
にまで精製された。胎盤性TGF−βのアミノ末端配列
は、式： Ala-Leu-Asp-Thr-Asn-Tyr-CMC-Phe-(Ser-Ser)-Thr-Glu-
Lys-Asn-CMC-Val-X-Gln-Leu-Tyr-Ile-Asp-Phe-X-(Lys)-
Asp-Leu-Gly- （式中、Ｘは未定であることを表わし、ＣＭＣは上記と
同意義である） で示されることが報告されている。血小板性TGF−βの
アミノ末端配列は、式： Ala-Leu-Asp-Thr-Asn-Tyr-X-Phe-Ser- （式中、ＣＭＣおよびＸは上記の定義に従う） で示されることが報告されている。

TGF−βは、ジスルフイド結合を介して共有結合的に結
合している、分子量が極めて近い（Mr−12,500）２本の
ポリペプチド鎖からなつているとの報告がある。このジ
スルフイド結合は、TGF−β分子の構造を定める上で重
要な役割を果している様に思われる。

ヒト由来の生物学的物質を出発物質に用いないでTGF−
βを製造する方法の開発が期待されている。この様な方
法は、感染性の汚染物質、例えば、HTLV−IIIまたは肝
炎ウイルスが、生産物の製造過程で入り込み得ないこと
を確実にするのに大きく寄与するであろう。上記の目的
は、組換え合成法によつて達成される。しかしながら、
そうするためには、その様なTGF−βの組換え合成に用
いるためのベクターを調製する上で、TGF−βをコード
している核酸が必要である。その様な核酸はまた、組織
試料中のTGF−βメッセンジャー（ｍＲＮＡ）と、ゲノ
ムＤＮＡの診断的な分析においても必要とされる。

要約 本発明は、(a)式： Ala Leu Asp Thr Asn Tyr Cys Phe Ser Ser Thr Glu Ly
s Asn Cys Cys Val Arg Gln Leu Tyr Ile Asp Phe Arg
Lys Asp Leu Gly Trp Lys Trp Ile His Glu Pro Lys Gl
y Tyr His Ala Asn Phe Cys Leu Gly Pro Cys Pro Tyr
Ile Trp Ser Leu Asp Thr Gln Tyr Ser Lys Val Leu Al
a Leu Tyr Asn Gln His Asn Pro Gly Ala Ser Ala Ala
Pro Cys Cys Val Pro Gln Ala Leu Glu Pro Leu Pro Il
e Val Tyr Tyr Val Gly Arg Lys Pro Lys Val Glu Gln
Leu Ser Asn Met Ile Val Arg Ser Cys Lys Cys Ser で示されるアミノ酸配列からなり、ＴＧＦ−β活性を有
するポリペプチドをコードしているＤＮＡを含んでいる
ベクターを組立て、(b)該ベクターで哺乳類宿主細胞を
形質転換し、(c)形質転換された細胞を培養し、(d)培養
物から上記ポリペプチドを含有する生成物を回収する、
ことからなる方法により、上記の目的を達成したもので
ある。

本発明方法では、ＴＧＦ−βをコードしているＤＮＡを
用いる。このＤＮＡは、上記のベクターを組立てるのに
有用である。このＤＮＡまたは、このＤＮＡとハイブリ
ダイズし得る核酸を標識し、TGF−βまたはその近縁タ
ンパク質をコードしているＤＮＡまたはmRNAの診断的分
析に用いることもできる。

組換え法によるTGF−β誘導体の製造は、本明細書で開
示したTGF−β暗号配列に関する知見を得たことにより
可能となつた。これら誘導体は、TGF−βをコードして
いる核酸中にサイレント突然変異および発現突然変異を
含んでいる。

サイレント突然変異は、１つの同義性コドンが別のコド
ンで置き換えられることであつて、この場合、これら両
コドンは同じアミノ酸をコードしているが、この置換は
組換え培養中でのTGF−βの収率に幾分かの影響を及ぼ
し得る（例えば、TGF−βmRNAの二次構造を修飾するこ
とによる）。その様な置換は、形質転換体からのTGF−
βの収率をスクリーニングすることにより同定され得
る。

発現されたTGF−β突然変異は３つのクラスの内の１ま
たはそれ以上に分類される。これらは、欠失、置換また
は挿入である。欠失は、アミノ酸残基が除去されるが、
そこに代替アミノ酸が挿入されないことを特徴とする。
欠失突然変異TGF−βＤＮＡは、例えば、免疫エピトー
プが欠失されたTGF−βフラグメントが必要な場合、そ
れを調製するのに有用である。

置換突然変異は、１つのアミノ酸残基が別のアミノ酸残
基で置換されることである。その様な突然変異を組換え
合成法以外の方法で行うことは非常に困難であり、とり
わけ、一次アミノ酸配列の内部での置換を目指す場合に
は困難である。この様な置換はTGF−βの生物学的活性
を改良するのに有用である。

挿入突然変異は、１またはそれ以上の残基がTGF−β核
酸の内部、またはいずれかの端に配置されることであ
る。融合物は、通常、挿入突然変異の１種であり、TGF
−βのカルボキシ末端またはアミノ末端で挿入が起きた
場合に相当する。

TGF−βと細菌性または他の免疫原性タンパク質との融
合は、TGF−βまたは、その予め定められたフラグメン
トに対する抗体を惹起するのに有用である。

図面についての簡単な説明 第１ａ図はTGF−βmRNAを模式的に示した図であり、四
角い箱の中は、暗号配列を表わす。１１２アミノ酸TGF
−β（斜線で示されている）は、暗号配列の３′末端に
コードされている。この図の上方に、配列決定のなされ
た、λβC1，3.19，3.32，4.10，4.33，4.37および5.7b
のcDNA挿入体（後述）と３′非翻訳領域のためのゲノム
DNA配列とが並べられている。

第１ｂ図は、数個の重複するcDNAと、３′領域のゲノム
ＤＮＡとで配列決定されたプレ−TGF−βcDNAのヌクレ
オチド配列並びに推定のアミノ酸配列とを示す図であ
る。折りたたまれて安定なヘアーピン。ループを形成し
得る５′末端領域には下線を付した。プレTGF−βcDNA
は３５４個または３９０個のアミノ酸のタンパク質をコ
ードしており、そのＣ末端の１１２アミノ酸（四角い箱
の中）は成熟TGF−βをコードしている。上線を施され
たArg-ArgジペプチドはTGF−βを放出するためのタンパ
ク分解的な開裂部位の上流に位置する。プレTGF−β内
のＮ−グリコシル化され得る３箇所には、オーバーライ
ンが施されている。終止コドンの下流には、Ｇ−Ｃに富
む下線を施された配列とその下流のTA TA様配列とが続
いている。ＡＡＴＡＡＡポリアデニル化シグナルと、推
定のポリアデニル化部位上流のＴＴＣＡＧＧＣＣ配列に
も下線が施されている。

第２図はTGF−βエクソンをコードしているゲノムフラ
グメントとその推定のアミノ酸配列を示す図である。mR
NAプロセツシング部位（イントロン−エクソン結合部
位）は矢印で示されている。残基の番号は第１ｂ図のそ
れと対応している。

詳しい説明 TGF−βを、その成長促進作用を保持したままの状態
で、組換え細胞培養によつて合成することは極めて困難
であることがわかつた。第１図から分る様に、成熟TGF
−βアミノ酸配列は多数のシステイン残基を含有してお
り（９）、少くともその内のいくつかは、天然起源から
回収されるホモ二量体TGF−βを形成するための鎖間交
差結合に関与しているらしい。さらに、TGF−βは、あ
る程度は細胞外媒質（培地）に本来の姿で見出される
が、大多数の分泌タンパク質にとつては一般的である認
識し得るNH₂−末端シグナルペプチド配列を含んでいな
い大きいアミノ末端領域を持つた前駆体分子として発現
される。本明細書で開示する発明はいかなる特定の理論
にも限定されないが、このアミノ末端領域は複数の膜透
過領域を含んでいるのかもしれない。本発明者らは、組
換え培養内で、一次転写産物を適切にプロセツシングす
ることが困難であると予測されたにも拘らず、真核性細
胞を形質転換してヘテロロ−ガスTGF−βを発現させる
ことに成功した。

本発明は、TGF−βの組換え合成を目的とするものであ
る。本明細書では、TGF−βとは、生物学的に活性な、
第１ｂ図の配列を有するプレTGF−β、成熟TGF−β、そ
のポリペプチドフラグメント、並びにそれらプレTGF−
β、成熟TGF−βまたはポリペプチドフラグメントの挿
入、置換および／または欠失突然変異体を包含するもの
と定義する。

生物学的に活性なTGF−βとは、標的セルラインのEGF−
増強固定非依存性増殖（81）を誘導する能力および／ま
たは新生物セルラインの増殖阻害能力（23）を指すもの
と定義する。固定非依存性増殖とは、TGF−βおよびEGF
で処理された非−新生物性標的細胞が軟寒天中でコロニ
ーを形成し得る能力を指し、これは細胞の形質転換によ
つて付与された特性である（従つて、形質転換成長因子
と命名されている）。今日では多くの正常細胞がTGF−
βを発現するということが知られているので、このこと
は、TGF−βが、がんを誘発するという意味ではない。
逆に、TGF−βがＡ５４９の如きある種の新生物細胞の
増殖を阻害することも知られている。

本明細書において、生物学的に活性な、という意味に
は、天然のTGF−βに対して惹起された抗血清と交差反
応を行う得る能力も総括的に包含されるものとする。天
然のTGF−βとは、血小板その他の天然起源から得られ
たTGF−βを指す。免疫学的な交差反応は１個の活性な
エピトープを知る目安であつて必ずしも固定非依存性増
殖の誘導または標的細胞に関連するTGF−βの活性領域
の目安ではない。しかしながら、免疫学的に交差反応し
得るタンパク質自体は、それが増殖に影響し得る能力を
持つていなければ、本明細書で定義した意味に於いて生
物学的に活性であるとは言えない。勿論、固定非依存性
増殖を誘導し得るTGF−βは、適当な立体配置を維持す
るという自然の結果として、天然分子に対して惹起され
た抗血清との免疫学的な交差反応性を示すことが多い。

第１ｂ図のヌクレオトヂ配列は、数個の重復しているcD
NAと遺伝子フラグメントとを分析し、それからTGF−β
前駆体mRNAに相当する連続した２５３７塩基対配列を決
定することにより得られた。第１ｂ図によると、開始配
列（イニシエーター）ＡＴＧは５′末端から第８４１番
目のヌクレオチド部分にあり、それは１，６９６ヌクレ
オチドの暗号配列（これは、３９０アミノ酸長さのポリ
ペプチドをコードしている）を確立するものである。cD
NA配列中の数箇所は、Ｇ−Ｃ含有量が異常に多くなつて
いる。イニシエーターＡＴＧは、いずれも約２００bpか
らなる。Ｇ−Ｃに富む２領域と両側面を接している。そ
の上、cDNAの数領域、殊に５′−末端領域は、Ｇ−Ｃ含
高率が８０％以上である。これらＧ−Ｃに富む領域の位
置は、多くのｃＤＮＡクローニングに係るアーチフアク
ト（人工産物）が得られた場所、並びに、cDNAの部分が
得られた箇所と一致している。

第１ｂ図に示されるように、幾つかの構造上の特徴か
ら、プレＴＧＦ−β（preＴＧＦ−β）の開始コドンは
８４２位でなく９５３位のＡＴＧに帰属される。第１
に、この位置の前後に含まれる配列は、指摘されている
開始コドンのコンセンサス配列、Ｇ／ACCATGG（35）と
かなり一致している。第２に、このＡＴＧの上流には約
８５０bpのオープンリーデイングフレームが存在してい
るが、同一の解読相内にはこれ以外のＡＧＴは唯一つし
か見出されない。第３に、シエフアード（Shepherd）
（36）が述べている様に、プリン−ピリミジン分布に基
づいて最も使用され易いリーデイング・フレームを算出
すると、このＡＴＧの上流の暗号配列も別のリーデイン
グ・フレームとして選ばれる可能性もあるが、該イニシ
エーターＡＴＧから始まる暗号配列が、実際、リーデイ
ングフレームとして最も可能性のある配列であることが
分る。第４に、このＡＴＧは、Ｇ−Ｃ含有率の比較的低
い（〜５０％）４０ヌクレオチド領域内に存在している
ので、このことがリボソームへの接近に好都合である。
特に、それがより大きなＧ−Ｃに富む領域内にあるため
に、そう思われる。５′非翻訳領域内には、開始コドン
となり得る別のコドンは唯１個しか存在していない（84
2位）。しかるに、このＡＴＧは非常にＧ−Ｃに富む領
域内に位置している。

TGF−βmRNAの５′非翻訳領域は、（ヌクレオチド９５
３にＡＴＧが位置すると仮定したとき）少なくとも９５
２個のヌクレオチドの長さを有し、殆んどプリンのみか
らなる６１個のヌクレオチド長さの配列（192〜252）を
含んでいる。このＧ−Ｃ含有率の高い、異常に長い５′
非翻訳領域の生物学的な関連性は不明であるが、c-myc
mRNAの構造上の組立てと似ている。しかしながら、これ
らの２個の配列間には著しい配列上のホモロジイは存在
していない。c-mycの長い５′非翻訳領域は機能的な意
義を持つと言われている（37）。ヒトc-myc mRNAの５′
非翻訳領域のＧ−Ｃに富む５′−近位部分には、安定な
ヘアピン・ループ構造を形成し得る領域が幾つか含まれ
ている。同様に、非翻訳−プレTGFβcDNAの最初の１２
０bpも、理論上は、安定性についての計算値が−９１kc
alである、ヘアピン・ループ構造をとり得る。長い５′
非翻訳領域と、潜在的に安定なヘアピン・ループ構造と
は、mRNAの安定性、あるいは転写の制御において何らか
の役割を演じているかもしれない。従つて、組換え細胞
培養からのTGF−βの収率が改善された構造を同定する
ために、この領域を欠失させ、例えばウイルス性タンパ
ク質由来の、他の５′非翻訳配列で置き換えることがで
きる。

残基２０１５上流における終止コドンの直ぐ下流には、
７５ヌクレオチドからなる著しくＧ−Ｃに富む配列があ
る。（第１ｂ図）。この配列はＣＣＧＣＣの複数回に及
ぶ繰返しを含み、ＧＧＧＧＧＣで終つている。この配列
の特異な性質は、おそらく、mRNAの３′非翻訳末端がcD
NA配列としてクローンされないという事実（これは、多
分、大腸菌（Ｅ．coli）のＤＮＡポリメラーゼＩがこの
配列を二次鎖cDNA合成の鋳型として利用し得ないことに
起因している）と、関係していると思われる。同様の性
質の繰返し配列は、ヒト−ジヒドロ葉酸還元酵素、ヒト
−トランスフエリン受容体、ヒト−アデノシンデアミナ
ーゼ、およびヘルペスウイルス−チミジンキナーゼ等の
遺伝子のプロモーター領域にも見い出されている（4
0）。後者の場合、マツクナイト（McKnight）ら（40）
は、これらの構造要素が、転写効率において主たる重要
な要素であることを示した。さらに、このプロモーター
特異的転写因子Ｓｐ１は、SV40早期プロモーター領域、
および近縁のサル−プロモーター内に含まれるその様な
結合と結合することが示された（41，42）。これら全て
の場合、Ｇ−Ｃに富む反復配列の下流に密接してコール
ドバーグ−ホツグネス（Goldberg-Hogness）のＴＡＴＡ
配列が存在している。ところがプレTGF−βの場合、こ
れらの配列は遺伝子の３′非翻訳領域に位置している
が、これらの配列もまたＴＡＴＡ様配列を従えている点
は興味深い。これらの領域がプロモーターとして機能し
得る、ということを示す事実は得られていない。プレTG
F−β遺伝子配列の、終止コドンから約５００ヌクレオ
チド下流には、ヘキサヌクレオチドＡＡＴＡＡＡが存在
している。通常はポリアデニル化部位の１１〜３０塩基
上流に存在している（32）この配列は、それが、ノーザ
ン・ハイブリダイゼーシヨンに基づいて見積られたプレ
TGF−βmRNAの大きさと一致していること、並びに、
３′非翻訳領域に介在配列が存在することは稀有であ
る、という理由から、おそらくプレTGF−βmRNAのポリ
アデニル化シグナルとして機能すると思われる。ベノイ
スト（Benoist）ら（43）はＡＡＴＡＡＡと接近し、そ
の下流であつて、ポリＡ−テイル（tail）の直ぐ上流に
コンセンサス配列TTCA CTGCが存在することを提示し
た。プレTGF−βmRNAの３′非翻訳領域内にあるAATAAA
配列の下流に、これと同様の配列、TTCA GGCCが存在し
ていることは、2530位がポリアデニル化部位であるとす
る前述の帰属をさらに支持するものである（または第１
ｂ図記載の３９０アミノ酸）。

プレTGF−βは３５４アミノ酸からなるポリペプチドで
ある（第１ｂ図）。この配列と既に配列決定されている
成熟TGF−βのHN₂−末端とを比較すると、TGF−βがプ
レTGF−βのＣ末端の１１２アミノ酸から成つているこ
とが分る。成熟TGF−βモノマーは、前駆体の、成熟TGF
−βNH₂−末端の直ぐ上流にあるArg-Argジペプトヂの位
置で、前駆体から切り離される。同様のタンパク分解的
開裂部位は、プロプレエンケフアリン（44，45）、カル
シトニン前駆体（46）およびコルチコトロピン−β−リ
ポトロピン前駆体（47）等の幾つかの他のポリペプチド
前駆体配列にも見い出されている。カイト（Kyte）およ
びドウーリトル（Doolittle）の疎水性決定法（48）に
よると、このArg-Arg配列は親水性領域に存在している
ので、トリプシン様ペプチダーゼら近付き易いと予測さ
れる。この前駆体の翻訳後開裂により、成熟TGF−βモ
ノマーが得られる。プレ配列の処理は不明であるが、別
の生物鍔的に活性なペプチドを生成させるのかもしれな
い。TGF−β前駆体は、それらもまた翻訳後開裂を受け
て別々のポリペプチド物質を生成させ得る、数個の塩基
性残基対を含有している（第１ｂ図）。しかしながら、
成熟TGF−βは、開裂されないと思われる２個のArg-Lys
ジペプチドを含有している。第１ｂ図に示されている様
に、プレTGF−β前駆体は、３箇所のＮ−グリコシル化
され得る部位、Asn-X-SerまたはThrを含有している（第
１ｂ図）。これらの内のどれも、成熟TGF−β内に位置
していない。従つて、糖タンパク質を固定化したレクチ
ンに吸着させ、TGF−βを吸着されないフラクシヨンと
して溶出させることにより、糖タンパク質を含まない状
態に、成熟TGF−βを精製する方法が得られる。

ヒトTGF−βの配列は、直接的なアミノ酸配列決定と、T
GF−βcDNAからの演繹により、決定された。クロストリ
パン（clostripain）消化で得られた異なるTGF−βペプ
チドの配列は、僅かな残基を除いてcDNA配列と一致して
いた。これは、多分、配列決定時におけるアミノ酸の帰
属が間違つていたことによると思われる。１１２アミノ
酸TGF−β配列は９個のシステインを含有しているが、
前駆体の残余部分は、２個しか含有していない（第１ｂ
図）。

以前の研究によると、２５kdのTGF−β二量体を還元す
ると１２．５kdの２本のポリペプチド鎖が生成すること
が示された（15）。TGF−βアミノ末端とクロストリパ
ン消化の後に得られたTGF−βペプチドとの配列決定の
結果は、TGF−β二量体が２本の同一のポリペプチドか
らなつていることを強く示唆している。このホモ二量体
性は、ヒトゲノムＤＮＡをTGF−βエクソンプローブを
用いたサザーン・ハイブリダイゼーシヨンに付した時、
ハイブリダイズするcDNAフラグメントは一本であるとい
うことによつても支持される。二次構造のチヨウ−フア
スマン（Chou-Fasman）分析（50）により、TGF−βポリ
ペプチドは、広範なβ−シート構造を有しており、α−
ヘリツクス構造は、あつても極く僅かであることが分つ
た。塩基性のジペプチド開裂部位の直ぐ上流の領域は、
α−ヘリツクス立体配座をとつている様に思われる。

TGF−β前駆体の著しい特徴は、普通、大多数の分泌タ
ンパク質が含有しているNH₂−末端シグナルペプチド配
列が認められないことである。

TGF−βが細胞外媒質に現れる機構は不明であるが、成
熟TGF−βはまた、通常、げつ歯類細胞またはヒト細胞
に伴なつて見い出されているのでその機構は、比較的非
効率的なものと思われる。

TGF−βが血小板の内部に貯えられる機構も理解されて
いない。最近、インターロイキン−１をコードしている
cDNA（51，52）および腫瘍壊死因子をコードしているcD
NA（53）が決定された。これらはいずれも細胞外媒質に
現われるが、これらはいずれも典型的なNH₂−末端シグ
ナルペプチドを含有していない。

TGF−βの細胞外媒質への放出において可能な機構は、
細胞質内にNH₂−末端を、TGF−β配列を外側に出して膜
に固定され、そこから前駆体が開裂されることである。
唯１回だけ膜を横切るタンパク質の多くは、電荷を持た
ない、大部分が疎水性の２０〜２３残基から成る膜透過
領域を有する。唯一の例外はＴ−細胞受容体のＴ３サブ
ユニツトであり（54）、これは、膜透過領域内にAsp残
基を有している。TGF−β前駆体の推定のアミノ酸配列
から、同じ様な疎水性領域を予測することができないこ
とから、このタンパク質が唯１個しか膜透過領域を持つ
ていないとは考えられない。

他方、TGF−β前駆体が数個の膜透過領域を有するタン
パク質であるということは納得できることである。その
様なタンパク質として、例えば、ロドプシン（rhodopsi
n）（55）、電気ウナギのナトリウム・チヤンネル・タ
ンパク質（56）およびレンズ・ギヤツプ結合部位の主要
内因性タンパク質（57）がある。これらは、そのNH₂−
末端を細胞質内に置くと共に、数個の電荷を帯びた残基
を含んだ、複数の膜透過領域を含有している。これらの
電荷の内、いくらかは、膜透過領域の近辺に存在してい
る反対の電荷を帯びた残基と物理的に近接しているため
に、中和されている可能性がある。大多数の場合、膜透
過領域は電荷を帯びた残基で両側を囲まれており、正の
電荷が細胞質内に、負の電荷が細胞外に存在しているこ
とが多い。これらの特徴をTGF−β配列と比べると、該
配列は、幾つかの可能な膜透過領域を有する上、数個の
電荷を持つた残基群を含んでいるので、TGF−β前駆体
はこのクラスの膜透過タンパク質に属する可能性があ
る。正電荷を帯びた残基に富むNH₂末端の２１アミノ酸
は、第１番目の膜透過領域（おそらく残基５９〜８０）
の間に存在するであろう）の、細胞質内側に配される領
域であろう。この領域の直ぐ下流に、細胞外に配される
２個のArg残基と、５個のまとまつた、負電荷を帯びた
グルタミン酸残基（アミノ酸９１〜１００）が続いてい
る。第２の膜透過領域は、残基１２７〜１５１の間に存
在し、細胞質内側に位置する塩基性残基群（アミノ酸１
５６〜１６５）の上流にある。第３の膜透過に係る領域
は、第２４５位のArg-Argジペプチドの下流に位置する
残基２４８〜２７０の間に存在している。後者の領域は
２個の正電荷を帯びた残基を含有しており、これらは、
第１または第２の膜透過領域に存在している２個の負電
荷を帯びた残基を中和するかもしれない。この様な立体
配置をとつているので、TGF−βポリペプチドおよびそ
の上流のArg-Arg残基は膜の外側に位置することにな
る。このために、細胞膜の外側の位置で二塩基性ペプチ
ダーゼによつて開裂される（58，59）ことが可能とな
り、細胞外環境にTGF−βが分泌されることになる。こ
のTGF−β前駆体の仮定的な構造は、ヒトロドプシン（5
5）およびレンズ線維（フアイバー）膜の主要内因性タ
ンパク質（57）と同様に、そのグリコシル化され得る部
位の全てに炭水化物部分が存在している訳ではないこと
を暗示している。前記のモデルは仮説であることを認識
し、本発明の範囲を制限するものと解釈すべきでない。

本明細書では、プレTGF−βとは、第１図に示したTGF−
β前駆体と同様に、通常、TGF−βに伴なつていないプ
レ配列を有する、別のTGF−β前駆体形をも包含するも
のとする。後者の形は、成熟TGF−βをコードしている
ＤＮＡの挿入形突然偏位体と考えられる。これらの突然
変異体は、成熟TGF−βとの融合物の形で、TGF−βにと
つてヘテロロ−ガスなプレ配列を含有している。ヘテロ
ロ−ガスなプレ配列は、例えば、プレ成長ホルモン、プ
レプロインシユリン、ウイルス性エンベロープタンパク
質、インターフエロン、および哺乳類宿主細胞によつて
認識され得る酵母または細菌性プレ配列等の他の分泌タ
ンパク質から得ることができる。これらの分泌リーダー
の配列は知られており、該ＤＮＡのインビトロでの合成
を目的としない場合には、それをコードしているＤＮＡ
の好適な供給源である。所望のシグナルを含むＤＮＡと
プレTGF−βＤＮＡとを制限酵素消化に付すことによ
り、上記の配列を、成熟TGF−βをコードしているＤＮ
Ａに結合させる。単一の制限部位を導入する目的で合成
オリゴヌクレオチド（リンカー類）を合成し、さらに、
プレ配列および成熟TGF−β暗号領域を完成させる上で
必要ならば、制限酵素消化の間にＤＮＡフラグメントを
除去する。次いで合成リンカーおよび／またはフラグメ
ントを、代替のシグナルとTGF−βの暗号領域とを含有
する制限酵素消化フラグメントにライゲートし、これを
クローニングベクターに挿入し、得られたベクターを用
いて宿主細胞を形質転換する。その後、発現ベクターに
突然変異プレ配列をクローンし、これを用いて宿主細胞
を形質転換する。以後の実施例ではウイルス性エンベロ
ープタンパク質プレ配列に関して例示的に述べる。

ヘテロロ−ガスプレ配列は、その完全なものをＴＧＦ−
βＤＮＡの最初のコドンに結合させることが好ましい
が、成熟TGF−βの暗号配列と、ヘテロロ−ガスなプレ
配列そのものに短い部分、例えばヘテロロ−ガスな成熟
タンパク質をコードしているＤＮＡ起源の２１〜４５塩
基対部分とが結合したものも本発明の範囲内に含まれ
る。この組立ての目的は、プレTGF−βの仮定の分泌系
を高い効率の分泌系で置き換えることにある。しかしな
がらそれは、必ずしもTGF−βを組換え培養内に生産さ
せる様に分泌させることを意味しない。

その他の欠失−挿入突然変異体には、TGF−β種と、細
胞内的に大量に発現されるウイルス性タンパク質（例え
ばレトロウイルス・コアタンパク質、ＳＶ４０からのラ
ージＴ抗原等）、あるいは免疫原性の細菌性タンパク質
またはポリペプチド（例えば化学走性ポリペプチド、と
りわけ潜在的化学走性トリペプチド、Met-Leu-Phe）が
含まれる。

発現された突然変異プレTGF−β、成熟ＴＧＦ−βまた
はそのフラグメントは、挿入、欠失および置換の数およ
び範囲の増加に伴なつて、第１図の配列から次第にかけ
離れたアミノ酸配列をとる。この離脱（ずれ）は、プレ
TGF−βと突然変異体との間のホモロジイ（同質性）の
減少で測ることができる。TGF−βの、固定依存性増殖
−促進作用に係る生物活性を示すタンパク質またはポリ
ペプチドはすべて、それらと第１図のタンパク質との配
列上のホモロジイの程度に関係なく、本発明の範囲内に
包含される。これは、プレTGF−βのある領域（例えば
プレ配列）は突然変異され易く、あるいは成熟TGF−β
の場合の如く完全に欠失さえされてしまうが、上記の生
物活性は保持される、ということが理由である。他方、
成熟TGF−β分子内の９個のシステイン残基（およびそ
れに付随したジスルフイド結合）の欠失は、上記の生物
活性に対して実質上、逆効果を及ぼし、あらゆる生物活
性を失なわせてしまうようである。また、置換突然変異
体は、機能が類似しているアミノ酸側鎖を含む残基によ
り置換されている場合には、完全なTGF−β成長促進作
用を現わすが、左程ホモローガス性を持たない。機能が
類似しているということは、側鎖の主な性質、例えば疎
水性、塩基性、中性または酸性等の性質、あるいは立体
障害の有無に関する性質に関している。即ち、特定のポ
リペプチドが有するプレTGF−βとのホモロジイの程度
は、それをTGF−βと同定する上での基本的な目安では
ない。しかしながら、一般的な指針としては、天然起源
のTGF−βの生物学的活性を幾らかを共有しているタン
パク質またはポリペプチドであつて、第１ｂ図の配列と
実質上ホモローガスである（例えばプレTGF−βまた
は、そのフラグメントであつて約２０残基以上のフラグ
メントと約４０〜１００％以上のホモローガス性を示す
こと）ものはTGF−βという名称で表わされる。新生細
胞の増殖阻害作用に関して、TGF−βは、これまでその
様な増殖阻害作用を表すことが知られているポリペプチ
ド、例えばインターフエロン、腫瘍壊死因子およびリン
ホトキシンを除外したポリペプチドであるが、それ以外
であれば、必ずしも第１ｂ図の配列とホモローガスな領
域を持つていることを要求されない。

あるポリペプチドがTGF−βであると同定する上で、よ
り細かく詳しいフアクターは、(a)成熟TGF−βの増殖阻
害活性あるいは固定依存性増殖促進活性を中和する抗血
清によつて、問題のポリペプチドの活性も中和される、
(b)候補ポリペプチドがTGF−β細胞表面受容体を、TGF
−βと競合し得る、という点にある。しかしながら、免
疫学的な同一性と増殖促進活性に関する同一性とは、必
ずしも同じ範囲内であることを必要としない。第１ｂ図
の成熟TGF−βの中和抗体は、それが成熟TGF−βの増殖
促進活性にとつて臨界的な部位に特異的に結合すること
を目的として生じたものでないので、候補タンパク質と
結合しないかもしれない。むしろ、この抗体は無害な領
域に結合し、その中和効果を立体障害によつて表してい
るのかもしれない。従つて、その無害な領域で突然変異
を生じた候補タンパク質は中和抗体と結合しないが、そ
れにもかかわらず、このタンパク質は実質的なホモロジ
ーおよび生物学的活性の意味においてTGF−βの定義範
囲内に含まれることになる。

胎盤または血小板から得られた第１ｂ図記載の天然また
は野性型成熟TGF−β特性、例えば分子量等は、天然種
のTGF−βに関してのみ記載されているということを認
識しておく必要がある。本明細書に示した天然変異体の
性質は天然のTGF−βとかなり異なつていることが予測
され、このことが、実際、本発明の突然変異誘発の目的
であることは、以下に詳しく述べている通りである。本
明細書の定義に従えばTGF−βは天然のTGF−βをも包含
するが、他の関連する、生物学的に活性なポリペプチド
も定義内に含まれる。挿入突然変異体、欠失突然変異
体、または融合タンパク質等の上記のTGF−β種は天然
のTGF−βについて求められた分子量と異る分子量を有
することになろう。例えば、成熟TGF−βまたはプレＴ
ＧＦ−βそのものとの融合物の分子量は天然の成熟TGF
−αの分子量より大きく、成熟TGF−βの欠失突然変異
体の分子量はより小さくなる。同様に、TGF−βを処理
してグリコシル化部位を導入してグリコシル化されたTG
F−βを得るか、あるいは、生物学的な活性に臨界的で
ない部位のシステインをセリンで置換する。最後に、霊
長類以外の哺乳類から得たセルライン中のヒトプレTGF
−βの翻訳後プロセツシングによつて成熟TGF−βのア
ミノ末端領域中に微少の異質性を導入し、アミノ末端ア
ミノ酸をアラニンでない様にする。

生物学的な活性に関して固定依存性増殖を誘導すること
が“可能（capable）”という語句は、プレTGF−βまた
はフラグメントであつて、所望の生物学的活性を表すポ
リペプチドフラグメント酵素的に変換され得るポリペプ
チドを含むものであることを意味する。通常、不活性な
前駆体は、成熟TGF−βのカルボキシ末端に不溶性また
はゼラチン様タンパク質がペプチド結合を介して結合し
ている融合タンパク質である。このペプチド結合領域内
の配列は、インビトロでの製造工程の一部としてインビ
ボで、またはそのままでタンパク分解的加水分解に対し
て感受性を有する様、選択する。

TGF−βは、通常ヒトTGF−βを意味するが、上記の生物
学的活性に関する基準と合致する限り、ネズミ、ブタ、
ウマまたはウシの如き供給源から得られたTGF−βもPRT
GF−βの定義範囲内に含まれるものである。TGF−βは
種特異的でなく、例えば、ネズミTGF−βとヒトTGF−β
は、いずれも同じセルラインにおける固定依存性増殖を
有効に誘導する。従つて、１つの種に由来するTGF−β
を他の種の治療に用いることができる。他の種のTGF−
βをコードしているＤＮＡは、その様な種から得たcDNA
またはゲノムライブラリイを標識したヒトプレTGF−βc
DNAでプローブすることにより、得られる。

TGF−βの誘導体も本発明の範囲内に含まれる。誘導体
には、グリコシル化されたTGF−β分子、並びに他のTGF
−β分子との共有結合または会合による複合物（コンシ
ユゲート）、二量体または非関連の化学部分が含まれ
る。共有結合性誘導体は、TGF−βのアミノ酸側鎖に見
出される基、またはＮ−あるいはＣ−末端と、機械的な
成分とを当業者既知の方法で結合させることによつて調
製される。これらの誘導体には、例えば以下のものが含
まれる：カルボキシ末端、アルキルアミンまたはカルボ
キシ側鎖を含む残基の脂肪族エステルまたはアシルエス
テル（例えばアスパラギン酸残基におけるアルキルアミ
ンのコンジユゲート）：ヒドロキシ基−含有残基のＯ−
アシル誘導体およびアミノ末端アミノ酸またはアミノ基
含有基のＮ−アシル誘導体（例えば、ｆＭｅｔ−Ｌｅｕ
−Ｐｈｅまたは免疫原性タンパク質とのコンジユゲー
ト）。アシル基の誘導体は、アシル基を、アルキル類
（Ｃ３〜Ｃ１０の直鎖アルキルを含む）の基から選択す
ることにより、アルカノイル種が生成され、炭素環式ま
たは異項環式化合物を選択することにより、アロイル
（aroyl）種が生成される。反応性の基は、それ自体が
反応性の側鎖を介して不溶性のマトリツクスを形成し、
交差結合タンパク質として用い得る様な二機能性の化合
物であることが好ましい。

共有結合または会合性の誘導体はイムノアツセイまたは
アフイニテイ精製法における試薬として有用である。例
えば、TGF−βは、自体周知の方法で、臭化シアン−活
性化セフアロースに共有結合させて不溶化することによ
り、またはポリオレフインの表面に（グルタルアルデヒ
ド交差結合の存在または非存在下で）吸着させることに
より、抗−TGF−β抗体または細胞表面の受容体を分析
または精製するのに用いることができる。また、TGF−
βを検出可能な基でラベル（例えば、クロラミンＴ法に
よる放射性ヨウ素化、希土類キレートとの共有結合、ま
たは他の螢光物質との共役）し、診断的な分析法、特に
競合法イムノアツセイによる生物学的試料中のTGF−β
レベルの診断に用いることができる。

TGF−β突然変異体は、一般に、予め定められた、即ち
部位特異的な方法で調製される。突然変異誘発の目的は
上記の如きTGF−β、即ち、生物学的活性を有するTGF−
βをコードしているＤＮＡを組立てることにある。

突然変異部位は予め定めておくが、突然変異そのものを
予め定めておく必要はない。例えば特定の位置の残基で
の突然変異を適切に行うためには、標的コドンに無作為
な変異誘発を行い、発現されたTGF−β突然変異体を、
所望の活性についてスクリーニングする。既知の配列を
有するＤＮＡの特定の部位で置換突然変異を誘発する方
法はよく知られている（例、Ｍ１３プライマー突然変異
誘発法）。

TGF−βの突然変異誘発には、通常、アミノ酸残基約１
〜５程度の挿入、または約１〜１０残基の欠失が含まれ
る。置換、欠失、挿入、またはそれらの併用、等を組合
わせて最終的な組立てを行う。前述の如く、挿入には、
アミノ末端またはカルボキシ末端の融合（例えば、疎水
性タンパク質や免疫原タンパク質との融合）も含まれ
る。その様な突然変異をコードしているＤＮＡ内におけ
る突然変異は、暗号配列を発現ベクター内のリーデイン
グフレームの外に位置せしめ、生物学的活性を持たない
TGF−βを与えるようなものであつてはならない。ま
た、その突然変異は、転写−抑制性のmRNAの二次構造を
形成させる可能性のある相補領域を作らないことが好ま
しい。

TGF−βをコードしているＤＮＡは、化学合成、胎盤細
胞または他の細胞から得たmRNAの逆転写物のスクリーニ
ング、あるいは真核細胞から得たゲノムライブラリイの
スクリーニングによつて得ることができる。このＤＮＡ
は、それに用いられているコドンを宿主細胞が認識し得
る限り、第１ｂ図に示したコドンを用いていなくとも良
い。この様なＤＮＡ類は、第１ｂ図のＤＮＡとして、イ
ンビトロで容易に製造される。本発明においては、核
酸、ＲＮＡまたはＤＮＡのいずれかであつて、それらは
本明細書で定義したTGF−βをコードしていないが、そ
の様なＤＮＡまたはＲＮＡとハイブリダイズし得る核酸
もまた有用である。コードしてはいないが、ハイブリダ
イズし得る核酸は、TGF−βの組換え合成に用いられる
ことはないが、被験細胞中のTGF−βmRNAまたはゲノム
ＤＮＡの診断分析に用いられる標識プローブの調製のた
めの中間体として有用である。

診断用核酸は、螢光性の基、放射活性原子、または化学
発光性の基等の検出可能な物質により、自体既知の方法
で共有結合的に標識される。次いで、このものを、通常
のサザーンまたノーザンハイブリダイゼーシヨン分析
（アツセイ）に用いる。その様な分析法は、以下の実施
例に述べる如く、TGF−βベクターや形質転換体を同定
するために、または、ミトゲン活性の測定による組織試
料中のTGF−βmRNAの検出の如く、インビトロでの診断
に利用される。

本明細書では、TGF−βは、TGF−βをコードしているＤ
ＮＡを含むベクターで形質転換された宿主細胞内で合成
される。ベクターは複製可能な核酸組立て物である。TG
F−βをコードしているＤＮＡの増幅および／または発
現のため、あるいはTGF−βをコードしているＤＮＡま
たはＲＮＡとハイブリダイズするＤＮＡの増幅のため
に、ベクターを利用する。

発現ベクターは、TGF−βをコードしているＤＮＡと、
そのTGF−βの適当な宿主内での発現に影響を及ぼし得
る適当なコントロール配列とが機能的に（操作可能に）
結合した複製可能なＤＮＡ組立て物である。その様なコ
ントロール配列には、転写プロモーター、転写をコント
ロールするための任意のオペレーター配列、適切なmRNA
のリボゾーム結合部位をコードしている配列、および転
写および翻訳の終止をコントロールするための配列が含
まれる。真核細胞内でのTGF−βの発現のためのベクタ
ーは、選択遺伝子をコードしているＤＮＡをも含有して
いなければならない。しかしながら、この選択遺伝子は
同時形質転換において、結合していないプラスミドから
供給されるものであつても良い。

ベクターにはプラスミド、ウイルス（フアージを含
む）、および組込み可能なＤＮＡフラグメント（即ち、
組換えによつて宿主のゲノム内に組込まれ得るもの）が
含まれる。しかしながら本明細書中では、それが細菌細
胞にクローンされるが、同時形質転換に際しては宿主細
胞ゲノムに組込まれるという意味において、ベクターを
プラスミドとして用いる。しかしながら、同等の機能を
有し、当該技術分野で知られており、またはいずれ知ら
れるであろう、その他の形のベクターも全て、本発明方
法に用いるのに好適である。好適なベクターは、発現さ
せようとする宿主と適合し得る種から導かれたレプリコ
ンおよびコントロール配列を含んでいる。

ＤＮＡ領域は、それらが、互いに機能的に関連している
場合は、機能的に（操作可能に）結合している。例え
ば、プレ配列または分泌リーダーのためのＤＮＡは、そ
れがポリペプチドの分泌に与るプレタンパク質として発
現されるならば、該ポリペプチドに関するＤＮＡと機能
的に結合している；プロモーターは、それが結合してい
る暗号配列の転写をコントロールするものであるなら
ば、該配列と機能的に結合している；リボゾーム結合部
位は、それが結合している暗号配列の翻訳を可能にする
様な位置に存在しているならば、該暗号配列と機能的に
結合している。一般に、機能的に結合している、という
ことは近接（コンテイギユアス）していることを意味
し、分泌リーダー配列の場合には、近接し、かつ解読相
内にあることを意味する。

多核生物からの細胞培養は、本発明における好ましい宿
主細胞である。原則として、脊椎動物であるか無脊椎動
物であるかに拘らず、あらゆる高等な真核細胞培養を使
用し得る。しかしながら、最近では脊椎動物細胞に大き
い関心が寄せられており、培養（組織培養）で脊椎動物
細胞を増殖させることは日常的な操作となつている〔テ
イツシユ・カルチヤー（Tissue Culture）アカデミツク
・プレス、クルスおよびパターソン（Krus and Patters
on）編（1973）〕。有用な宿主セルラインの例には、Ｖ
ＥＬＯおよびHeLa細胞、チヤイニーズハムスターの卵巣
（ＣＨＯ）セルライン、並びにＷ１３８、ＢＨＫ、ＣＯ
Ｓ−７およびＭＤＣＫセルライン等が含まれる。

多くの真核細胞が内因性TGF−βを合成することが知ら
れている。即ち、多くの宿主細胞として用いられる細胞
は、宿主種のTGF−βを合成する。従つて、形質転換に
用いたＤＮＡの転写、翻訳の結果、生産されたTGF−β
中には上記の様なTGF−βも含まれていることになる。
例えば、ＴＧＦ−βで形質転換されたハムスターのＣＨ
Ｏ細胞の場合、この様な細胞から得られたTGF−βを含
有している抽出物中には、上記の如き物質が存在してい
る。TGF−βは、動物とヒトとの間に交差活性を示すの
で、この様なことは必ずしも不都合ではないが、動物性
の物質の含有量が可能な限り少量であるヒトTGF−βを
生産することが望ましい。この目的は、(a)動物性TGF−
βの合成量ができるだけ少い、宿主動物細胞を選択し、
(b)この動物宿主セルラインを、TGF−β分泌効率の高い
ベクター（前述）で形質転換し、培養培地からヒトTGF
−βを回収する、あるいは(c)ヒトセルラインを形質転
換する（こうすれば、どの様な内容性のｋTGF−βも、
汚染物質でなく、有用なものとなる）ことにより、達成
される。

その様な細胞のための発現ベクターには、通常複製起源
（染色体外での増幅のために）およびＴＧＦ−βの暗号
配列の上流に位置しているプロモーターが、リボゾーム
結合部位、ＲＮＡスプライス部位（イントロン含有ＴＧ
Ｆ−β−暗号化ゲノムＤＮＡを用いる場合）、ポリアデ
ニル化部位および転写終止配列と共に含有されている。

脊椎動物細胞の形質転換に使用される発現ベクターのた
めの転写および翻訳コントロール配列は、ウイルス起源
から供給されることが好ましい。例えば、普通用いられ
ているプロモーターはポリオーマ、アデノウイルス２、
および最も好ましくはシミアンウイルス４０（ＳＶ４
０）から導かれる。ＳＶ４０の初期および後期プロモー
ターは、いずれもＳＶ４０ウイルスの複製起源含有フラ
グメントとして該ウイルスから容易に得られるので特に
有用である〔フアイヤーズ（Fiers）ら、１９７８、
“ネイチヤー”273：133〕。ＳＶ４０のより小さい、ま
たはより大きいフラグメントも、それらがウイルス性複
製起源内に位置するHindIII部位からBeIＩ部位に至る約
250bpの配列を含有している限り用いることができる。
更に、正常な状態でＴＧＦ−βに伴なつているヒトＴＧ
Ｆ−βゲノムプロモーター、コントロールおよび／また
はシグナル配列も、その様なコントロール配列が宿主細
胞系に適合し得ると共に、認識され得ることを条件とし
て用いることができる。

複製起源は、例えばＳＶ４０その他のウイルス性起源
（例えばポリオーマ、アデノウイルス、ＶＳＶ、ＢＰＶ
等）から導かれる複製起源等の外来性起源を含む様にベ
クターを組立てることにより、あるいは宿主細胞の染色
体性複製機構により、与えられる。もしもベクターが宿
主細胞染色体に組込まれるのなら、しばしば、後者の機
構でも十分である。

ウイルス性複製起源を有するベクターを用いずに、選択
マーカーとＴＧＦ−βＤＮＡとで同時形質転換する方法
で哺乳類細胞を形質転換することもできる。適当な選択
マーカーとしては、例えばジヒドロ葉酸還元酵素やチミ
ジンキナーゼがある。その様なマーカーはタンパク質、
一般に酵素であつて、形質転換細胞、即ち、外因性ＤＮ
Ａを取り込むことのできた（コンピテントな）細胞の同
定を可能にするものである。通常、同定は、マーカータ
ンパク質を取り込んでいなければ、毒性であるか、ある
いはそこから必須栄養物を得ることができない様な培地
中で、形質転換体が生き残るということに基づいて行わ
れる。ＴＧＦ−βとＤＨＥＲの両者をコードしているＤ
ＮＡ配列を含むベクターでトランスフエクトするのに好
適な哺乳類宿主細胞を選択するに際しては、用いるＤＨ
ＦＲタンパク質のタイプに従つて宿主を選択するのが適
当である。野性型ＤＨＦＲタンパク質を用いる場合に
は、ＤＨＦＲ欠損宿主細胞を選択するのが好ましく、そ
うすることにより、ヒポキサンチン、グリシンおよびチ
ミジンを欠く選択用培地内で、満足のいくトランスフエ
クシヨンを選択するためのマーカーとしてＤＨＦＲ暗号
配列を用いることができる。この場合、好ましい宿主細
胞はＤＨＦＲ活性を欠くチヤイニーズハムスターの卵巣
（ＣＨＯ）セルラインであり、これは、ウーラウブおよ
びチヤツシン（Urlaub and Chasin）（1980、“プロシ
ーデイングス・オブ・ザ・ナシヨナル・アカデミー・オ
ブ・サイエンスイズ”（ＵＳＡ）77：4216）の述べた如
くにして調製し、増殖させることができる。

他方、メトトレキセート（ＭＴＸ）に対する結合親和性
の低いＤＨＦＲタンパク質をコードしているＤＮＡをコ
ントロール配列に用いる場合には、ＤＨＦＲ耐性細胞を
用いる必要はない。何故ならば突然変異ＤＨＦＲはＭＴ
Ｘ耐性であるので、宿主細胞自身がＭＴＸ感受性である
ならば、ＭＴＸ含有培地を選択の手段として用いること
ができるからである。ＭＴＸを吸収することのできる真
核細胞の大多数は、メトトレキセート感受性であると思
われる。その様な、有用なセルラインの１つはＣＨＯ
系、ＣＨＯＫ１（ATCCNo.CCL61）である。

その他、組換え脊椎動物の細胞培養内でのＴＧＦ−βの
合成に適用し得る適当な方法は、Ｍ−Ｊ．ゲツシング
（Ｍ−Ｊ．Gething）ら“ネイチヤー”293：620−625
（1981）、Ｎ．マンテイ（Ｎ．Mantei）ら“ネイチヤ
ー”281：40−46およびＡ．レビンソン（Ａ．Levinso
n）ら、ＥＰ177，060Aおよび117,058Aに記載されてい
る。

ＴＧＦ−βは、溶解した形質転換細胞から、遠心して不
溶性の細胞断片を分離することにより、回収される。あ
るいは、ＴＧＦ−βを分泌する形質転換細胞の場合は、
培養物を遠心するだけで細胞から分離することができ
る。次いで、一般に、ＴＧＦ−βを当業者既知の方法
（15、16、17）に従い、酸の存在下でゲル過した後、
ＨＰＬＣにかけ、アセトニトリルグラデイエントで溶離
する方法により、精製する。その様な精製法を治療様物
質の精製にも同様に用いる必要はない。

その後の、あるいは、それに代る精製法として、細胞リ
ゼイトまたは上清を、汚染性タンパク質を変性させ、沈
降させるのには充分であるが、ＴＧＦ−βを変性、沈降
させない程度の温度で、ある時間加熱する。ＴＧＦ−β
は非常に熱に安定であるが、これは、広範なジスルフイ
ド結合の形成によると思われる。従つて、ジチオトレイ
トールの如きジスルフイド試薬を少量含有している培地
で加熱するべきである。ＴＧＦ−βは１Ｍ酢酸に対して
安定であることが分つているので、加熱と酸性化とを併
用することもできる。

天然の成熟ＴＧＦ−βはグリコシル化されていない。従
つて、熱および酸に安定な糖タンパク質は、レンチル・
レクチン−結合セフアロースの如きレクチンカラムに糖
タンパクを吸着させることにより、分離することができ
る。この工程は、余り好ましくないが、熱および酸で処
理する前に行うこともできる。ＴＧＦ−βは吸着されな
かつたフラクシヨン（画分）に伴なつて溶出する。

純度の高い生産物を必要とする場合には、粗混合物また
は部分的に精製された混合物を、次いでクロマトフオー
カスする。

ＴＧＦ−βは、所望の純度のＴＧＦ−βと、生理学的に
許容し得る担体、即ち、使用される用量および濃度にお
いては、被投与者にとつて無毒な担体を混合することに
より、投与のために製剤化される。通常、この様な製剤
化には、ＴＧＦ−βと緩衝液、アスコルビン酸等の抗酸
化剤、低分子量（約１０残基以下）ポリペプチド、タン
パク質、アミノ酸、グルコースまたはデキストリンを含
む炭水化物、ＥＤＴＡの如きキレート剤、並びにその他
の賦形剤とを混合する必要がある。治療のために投与さ
れるＴＧＦ−βは滅菌されねばならない。滅菌処理は、
滅菌過膜（0.2ミクロン）を通すことにより、用意に
行うことができる。通常、ＴＧＦ−βは、熱変性および
酸化による変性に極めて安定であるため、水溶液の形で
保存する。

ＴＧＦ−β組成物の投与法として、２つの方法が考えら
れる。

第１番目の方法は、好ましい方法であるが、創傷表面の
治癒を促進するための、局所適用である。治療し得る傷
のタイプや外傷には何ら制限なく、それらには以下の創
傷が含まれる（ただし、これらに限定されない）。１
度、２度または３度の火傷（特に２度または３度の火
傷）；表皮または内部の手術による切開、美容上の手術
をも含む；外傷、裂傷、切開、貫通を含む；および表面
壊瘍、床ずれ、糖尿病性壊瘍、歯肉壊瘍、血友病性壊
瘍、および静脈瘤を含む。

ＴＧＦ−β組成物を火傷に用いる場合、潅流液（irriga
nt）として生理食塩水と一緒に用いるのが好ましく、あ
るいは、軟膏または懸濁剤として、好ましくは精製コラ
ーゲンと併用する。ＴＧＦ−β組成物はまた、パツチ類
や硬膏、並びに包帯に浸み込ませても良く、この場合
は、液状または半流動体の形であることが望ましい。そ
の様な品、あるいは組成物には、サルフアダイアジンの
如き、抗生物質を加える必要がある。創傷清浄化剤に
は、タンパク分解酵素を加えても良い。ただし、これ
は、その様な酵素がＴＧＦ−βを加水分解しないか、あ
るいは加水分解に抵抗性のＴＧＦ−β突然変異体を用い
ている場合である。

第２番目の投与方法は、内部創傷、および内部の傷を治
療するために全身投与する方法である。その様な投与方
法は、がん患者における新生物細胞の増殖刺激作用の如
き望ましくない副作用が無いか、あるいは、限られてい
ることを条件として、利用することができる。全身投与
用のＴＧＦ−β組成物は、滅菌した等張性の注射薬、ま
たは注入液として製剤化することが好ましい。

ＴＧＦ−βは、ＴＧＦ−α、ＥＧＦまたはその他の成長
因子等の活性化剤と適宜併用される。活性化剤の含有量
は患者に投与される活性化された組成物中のＴＧＦ−β
の量に直接、左右される。

活性化された組成物の用量は、選択された成長因子、並
びに患者の臨床面での症状に応じて変化する。

しかしながら、一般にＴＧＦ−βは、調合された組成物
中に少くとも約1.0nｇ／mlの割合で存在していることが
好ましく、約1.0mg／ml存在していれば、一層好ましい
と言われている。ＴＧＦ−β組成物は細胞の再生を誘発
し、維持するので、この組成物は継続使用するか、ある
いは周期的に再投与を繰り返すことが望ましい。

実施例の記載を簡単にするため、頻繁に用いられる方法
を短い熟語に略して示す。

プラスミドは小文字のｐを先頭にし、そして／または大
文字および／または数字を続けることによつて表わされ
る。本発明の出発物質であるプラスミドは市販されてい
るか、または非制限的な施設から一般に入手可能であ
り、あるいはこの様にして入手し得るプラスミドから、
公知の方法に従つて組立てることができる。更に、その
他の同等なプラスミドも当業者には知られており、通常
の技術者にとつて自明であろう。

ＤＮＡの“消化”とは、ＤＮＡを、該ＤＮＡのある位置
に対してのみ作用する酵素で触媒的に開裂することを指
す。その様な酵素を制限酵素と称し、該酵素にとつて特
異的な部位を制限部位（サイト）と称する。本発明にお
いて用いる様々な制限酵素は市販されており、その反応
条件、コフアクター、およびその他必要なものは、酵素
の供給業者の指示に従つて使用した。制限酵素類は、各
制限酵素が最初に得られた微生物を表示する大文字、次
いで他の文字、更に、通常、数字からなる略号で表わさ
れる。一般に、約１μｇのプラスミドまたはＤＮＡフラ
グメントを、約20μの緩衝液中の約２単位の酵素と共
に使用する。特定の酵素について適当な緩衝液および基
質の量は、製造業者によつて明示されている。通常、イ
ンキユベーシヨン時間は３７℃で１時間とするが、供給
者の指示に従つてかえてもよい。インキユベーシヨンし
た後、フエノールおよびクロロホルムでタンパク質を抽
出して除き、水性フラクシヨンからエタノール沈殿によ
つて消化された核酸を回収する。時たま、制限酵素によ
る消化の後、５′末端のホスフエートを細菌性アルカリ
ホスフアターゼで加水分解することがある。これは、Ｄ
ＮＡフラグメントの２つの制限的開裂末端が“閉環（サ
ーキユライデイング）”したり、閉じたループを形成す
ることにより、該制限部位に他のＤＮＡフラグメントが
挿入されにくくなるのを防止するためである。明示しな
い限り、プラスミドの消化には、５′末端の脱りん反応
は伴なわないものとする。脱リン酸の方法および試薬は
常法に従う〔Ｔ．マニアテイス（Ｔ．Maniatis）ら、19
82、モレキユラー・クローニング（Molecular Clonin
g）pp．１３３−１３４〕。

制限酵素による消化によつて得られた特定のＤＮＡフラ
グメントの“回収”または“単離”とは、この消化物を
ポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけて分離し、フラ
グメントの移動度を分子量既知のマーカーＤＮＡフラグ
メントのそれと比較して所望のフラグメントを同定し、
該フラグメントを含むゲルの部分を取り除き、該ゲルか
らＤＮＡを分離することを意味する。この方法は一般的
に知られている。例、Ｒ．ローン（Ｒ．Lawn）ら、198
1、“ヌクレイツク・アシツズ・リサーチ”９：6103−6
114およびＤ．ゲツデル（Ｄ．Goeddel）ら、1980“ヌク
レイツク・アシツズ・リサーチ”８：4057参照。

“サザーン分析”とは、消化物またはＤＮＡ含有組成物
中のＤＮＡ配列の存在を、既知の、標識したオリゴヌク
レオチドまたはＤＮＡフラグメントとのハイブリダイゼ
ーシヨンによつて確認する方法である。本明細書中で
は、特に断らない限り、サザーン分析という時は、Ｅ．
サザーン（Ｅ．Southern）、1975“ジヤーナル・オブ・
モレキユラー・バイオロジイ（Ｊ．Mol．Biol．）”9
8：503−517、の方法に従つて、消化物を１％アガロー
ス上で分離し、変性し、そしてニトロセルロース上に移
し、Ｔ．マニアテイスらの方法〔1978、“セル”15：68
7−701〕に従つてハイブリダイゼーシヨンを行なうこと
を意味する。

“形質転換”とは、ＤＮＡを生物内に導入することを意
味し、その結果ＤＮＡが染色体外成分として、あるいは
染色体内に組込まれて複製されることを意味する。特に
明示しない限り、本発明における大腸菌の形質転換法に
はマンデル（Mandel）らのCaCl₂法（1970、“ジヤーナ
ル・オブ・モレキユラー・バイオロジイ”53：154）を
採用する。

“ライゲーシヨン（結合）”とは、２個の二本鎖核酸フ
ラグメントの間にホスホジエステル結合を形成する工程
を言う（Ｔ．マニアテイスら、前掲Ｐ１４６）。特に明
示しない限り、ライゲーシヨンは既知の緩衝液と条件を
使用し、略等モル量のライゲートすべきＤＮＡフラグメ
ント0.5μｇ当たりＴ４ＤＮＡリガーゼ（“リガー
ゼ”）１０単位を用いて行う。

形質転換体からＤＮＡを“調製する”とは、プラスミド
ＤＮＡを微生物培養物中から単離することを意味する。
明示しない限り、マニテテイスらのアルカリ性／ＳＤＳ
法（同上ｐ．90）を採用する。

“オリゴヌクレオチド”とは、短かい一本鎖または二本
鎖ポリデオキシヌクレオチドであつて、既知の方法によ
つて化学的に合成され、次いでポリアクリルアミドゲル
上で精製されたものである。

引用した文献は全て参考例として示した。

実施例１ ヒトTGF-βの純化および配列分析 アミノ酸配列を決定するための、十分に均質で純粋なヒ
トＴＧＦ−βを得る為に、アソイアン（Assoian）らの
既知の精製法(15)をスケールアツプし、改良した。２５
０単位のヒト血小板を、ワーリング（Waring）の混合機
中、酸−エタノール１で抽出した。エーテル４を加
えると沈殿が生じたので、これをワツトマン紙（NO.
１）を用いて減圧過して集めた。沈殿を１Ｍ酢酸５０
mlに一夜溶解し、１Ｍ酢酸で平衡化したバイオゲールＰ
−６０カラム（１０×１００cm）でゲル過して精製し
た。ＴＧＦ−βを含有しているフラクシヨンを分析用Ｓ
ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動およびバイオア
ツセイにより同定した。ピークフラクシヨンを集め、凍
結乾燥し、２０mlの１Ｍ酢酸、８Ｍ尿素に再溶解した。
１Ｍ酢酸、８Ｍ尿素中、バイオゲルＰ−６０カラム（５
×９０cm）でゲル過することにより約５０％純度のTG
F−βが得られた。これらのピークフラクシヨンを１容
量の水で希釈し、0.1％トリフロオロ酢酸の半プレパラ
テイブRPP C18（シンクロパツク）HPLCに入れ、２０〜
５０％のアセトニトリルグラジエントで溶出した。この
様にして得たTGF−βをアミノ酸分析で定量したとこ
ろ、標本当たり約0.5mgであることがわかつた。次いで
文献(60)記載の方法により変性ＳＤＳ−ポリアクリルア
ミドゲル電気泳動を行なつた。先の実験と一致して、Ｓ
ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル中、非還元ＴＧＦ−βは
２５ＫＤタンパクとして移動したが、β−メルカプトエ
タノールで還元すると、１２．５ＫＤのものに変つた。
このことは、ＴＧＦ−βは分子間ジスルフイド結合によ
り連結されている２個の１２．５kdポリペプチド鎖で構
成されていることを示唆している。（15）。

タンパクの配列に関する情報を得るために、精製したＴ
ＧＦ−βを還元し、アルキル化し、アミノ末端配列分析
にかけた。ＴＧＦ−β1.2ナノモルを８Ｍ尿素中へ透析
し、0.1Ｍトリス−HCl（pH8.5）10mMジチオトレイトー
ル、８Ｍ尿素中でインキユベートして還元した。次いで
暗所、室温で、５ｍＮ沃化アセテートの存在下でアルキ
ル化を行なつた。過剰のβ−メルカプトエタノールを加
えた透析することにより、３０分後に反応を停止した。
このＴＧＦ−β0.7ナノモルを使つて直接NH₂−末端配列
分析を行なつた。還元しアルキル化したTGF−β1.2ナノ
モルを、０．７５Ｍ尿素、５０mM NH₄HCO₃、5mMジチオ
トレイトール中、１％クロストリパインで２４時間消化
した(15)。１２時間後に、更に１％クロストリパインを
追加した。反応生成物を、0.1％トリフルオロ酢酸中の
０〜７０％アセトニトリルグラジエントを使つて、シン
クロパツクRPPC18逆相カラム（4.6×２５０nm）で分離
した。配列決定は、大改良したベツクマン８９０ｃスピ
ニングカツプシークエンサー(61)またはヘビツク（Hewi
ck）らの記載している気相シークエンサー(62)（アプラ
イド・バイオシステムズ、モデル４７０Ａ）のいずれか
を用いて行ない、アミノ酸誘導体の同定はライニン・マ
イクロソルブＣ−８カラムの逆相HPLCにより行なつた。
数種のペプチドのアミノ酸配列を決定した。これらのフ
ラグメントの１つはNH₂−末端セグメントであり、もう
１つの大きいペプチドから３７アミノ酸配列が得られ
た。これはNH₂−末端配列と重複しており、隣接する配
列の６０残基が確立された。

非修飾TGF−βもCNBrで処理した。メチオニン残基で開
裂すると生物活性が完全に消失したので、生物活性に
は、少なくとも１部のこのＣ−末端オクタペプチドが必
要であることが証明された（データは示されていな
い）。

実施例２ TGF−βエクソンの分離 TGF−２について行なつた方法(7)と類似の方法で、TGF
−βをコードしているヌクレオチド配列を同定した。ヒ
トのゲノムＤＮＡライブラリー中のTGF−βエクソンを
同定する為のハイブリダイゼーシヨンプローブとして、
部分的タンパク配列に基いてデザインした長いオリゴヌ
クレオチドを使用した。次いでTGF−βエクソンを、Ｔ
ＧＦ−βcDNAの分離用プローブとして使用した。

それぞれアミノ酸３〜１７および３０〜４４をコードし
ている配列に相補的な２個の４４−塩基のデオキシオリ
ゴヌクレオチド、βＬＰ１およびβＬＰ２は、化学的に
合成した。ヌクレオチド配列の選択は、ヒトmRNAに見ら
れるコドン傾向（バイアス）に基いて行なつた(26)。脊
椎動物のＤＮＡには比較的まれであるＣｐＧジヌクレオ
チドは(27)、できる限り避けた。更に、アミノ酸１３〜
１７の為の全ての可能なコドンに相補的な１６個の１４
量体を合成した。これらのデオキシリボヌクレオチドお
よび相当するアミノ酸配列を以下に示す： 点を付したヌクレオチドは、コドンに多義性のない残基
である。

32P標識βＬＰ−１をプローブとして使用し、低ストリ
ンジエントのハイブリダイゼーシヨン条件下でヒトゲノ
ムＤＮＡライブラリー(28)をスクリーニングした。ヒト
胎児のゲノム肝臓ライブラリー(28)からの約7.5×10⁵組
換えフアージを、ニトロセルロースフイルターにレプリ
カ平板法(66)にかけた後、低ストリンジエント条件下(6
5)で、³²p−標識４４量体βＬＰ−１とハイブリダイズ
した。ハイブリダイズフアージの５８からＤＮＡを調製
し、ドツト・プロツト分析法(67)およびBamHI消化混合
物のサザーン。ハイブリダイゼーシヨン(68)を使つて、
³²Ｐ−標識βＬＰ−１およびβＬＰ−２オリゴヌクレオ
チドとハイブリダイズさせた。両方のオリゴヌクレオチ
ドとハイブリダイズした２個のフアージＤＮＡを消化
し、再びサザーン・ハイブリダイゼーシヨンにより³²Ｐ
−標識１４量体のプールでプローブした。１４量体のハ
イブリダイゼーシヨンは、６×ＳＳＣ、0.5％NP40、６
ｍＭEDTA、１×デンハート溶液および５０μｇ／mlサケ
精子ＤＮＡ中、３７℃で行なつた。オートラジオグラフ
イーにかける前に、６×ＳＳＣ中、室温で数回洗浄し
た。フアージβλ５８からのＤＮＡをオリゴヌクレオチ
ドβLP−１、βLP−２および１４量体プールとハイブリ
ダイズした。βLP−２および１４量体とハイブリダイズ
する配列は、同じ4.2KbpＢａｍＨＩフラグメント内に存
在し、一方、プローブβLP−１は２０KbpＢａｍＨＩフ
ラグメントとハイブリダイズした。ハイブリダイジング
ＢａｍＨＩフラグメントをpBR３２２にサブクローンし
た。小さいハイブリダイジングフラグメントのヌクレオ
チド配列は、Ｍ１３誘導体にサブクローンした後(70)、
ジデオキシヌクレオチド鎖末端法(69)で決定した。

ゲノムＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることに
より、ＴＧＦ−β暗号配列の部分のみコードしているエ
クソンを分離した（残渣１０〜６０、第３図）。全ＴＧ
Ｆ−β暗号配列を得るために、このエクソンをプローブ
として使用し、ヒトの満期胎盤のｍＲＮＡから誘導した
λgt10ベイスのｃＤＮＡライブラリーをスクリーニング
した。

実施例３ ＴＧＦ−βｃＤＮＡの分離 種々の細胞起源から全ＲＮＡを抽出し(71)、ポリアデニ
ル化ｍＲＮＡフラクシヨンをオリゴ(dT)−セルロース・
クロマトグラフイー(72)により分離したdT_12-18または
デオキシリボヌクレオチドACACGGGTTCAGGTAC（ヌクレオ
チド１２７０〜１２８６に相補的）でプライムすること
により、ＣＤＮＡを調製した(73)。この２本鎖ｃＤＮＡ
をヌクレアーゼＳ１（マイルズ・ラボラトリー）で処理
し、次いで大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩクレノウフラグ
メントで処理し、非対象Ｅ_ｃｏＲＩリンカー(75)を使用
する以外は文献記載の方法(74)でEcoRIで開裂したλgt1
0にサブクローンし、ＥｃｏＲＩメチラーゼ処理の必要
性を回避した。この組換えフアージを大腸菌Ｃ６００Ｈ
ｆ(74)に植え、ニトロセルロース・フイルターにレプ
リカ移植した(66)。５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ、
５０ｍＭリン酸ナトリウム（pH6.8）、0.1％ピロリン酸
ナトリウム、５×デンハルト溶液、５０μｇ／mlサケ精
子ＤＮＡ中でこれらを₃₂Ｐ−標識(76)特異的制限フラグ
メントと４２℃でハイブリダイズし、同じ温度で0.2×
ＳＳＣ、0.1％ＳＤＳ中で洗浄した。₃₂Ｐ−標識デオキ
シリボヌクレオチドの場合は、低いストリンジエントの
ハイブリダイジエーシヨン条件(65)で行なつた。ＴＧＦ
−βＣＤＮＡ制限フラグメントのヌクレオチド配列は、
Ｍ１３フアージ誘導体にサブクローンした後、(70)、ジ
デオキシオリゴヌクレオチド鎖末端法(69)によつて決定
した。得られたｃＤＮＡを第１ａ図に模式的に示した。
λβＣ１はゲノムエクソン（第３図）をプローブとして
用い、ヒトの胎盤ｃＤＮＡライブラリーから分離した。
約７５０，０００オリゴ−ｄＴプライム化胎盤ｃＤＮＡ
クローンをスクリーニングし、１個の約１，０５０ｂｐ
のＴＧＦ−βｃＤＮＡ（λβＣ１）を分離した。先に決
定した部分的ＴＧＦ−β配列からリーデイングフレーム
が確立され、完全なＴＧＦ−βポリペプチドをコードし
ている配列が明らかになつた。この配列はNH₂末端のア
ラニン残基から始まり、その後停止コドンまで１１２コ
ドンが続き、３′末端からは僅かに２０塩基対がある。
こんどはλβＣ１ ＥｃｏＲＩ ｃＤＮＡ挿入体を使つ
てＡ１７２膠芽腫（グリオブラストマ）ｃＤＮＡライブ
ナリーをスクリーニングし、λβＣ３．１９を分離し
た。特異的にプライムしたＨＴ１０８０線維肉腫ｃＤＮ
Ａライブラリーを₃₂Ｐ−標識、Ｋ_ｐｎＩ−Ｋ_ｐｎＩでス
クリーニングし、λβＣ３．１９ｃＤＮＡ挿入体の上流
のＥ_ｃｏＲＩ−Ｋ_ｐｎＩフラグメントからλβＣ４．１
０、４．３３および４．３７を得た。別の同様のライブ
ラリーをλβＣ４．３３挿入体およびヌクレオチド１−
４０に相当する合成４０量体でスクリーニングし、λβ
Ｃ５．７ｂを分離した。

種々のオリゴ（ｄＴ）−プライム化ｃＤＮＡライブラリ
ーから分離した７０以上のＴＧＦ−β ｃＤＮＡは、い
ずれも３′非翻訳領域の２、３のヌクレオチド以上のも
のを含んでおらず、この３′非翻訳配列は、クローンし
たゲノムＤＮＡを使つて決定した。ハイブリダイゼーシ
ヨン分析の結果、λβＣ１ＤＮＡ挿入体の３′末端は、
ゲノムＤＮＡフアージβλ５８中に存在していることが
わかつた。ＤＮＡ配列分析により、ＴＧＦ−βのカルボ
キシ末端部分をコードしているエクソンが存在してお
り、これに停止コドンおよび３′非翻訳末端が続いてい
ることがわかつた（第１ｂ図）。AATAAAヘキサヌクレオ
チド配列(32)は終止コドンから５００ｂｐ下流にあるの
で、推定のポリアデニル化部位を決めることができた。
これが事実ポリアデニル化シグナルだとすると、ＴＧＦ
−βｍＲＮＡの計算した寸法は、ノーザンハイブリダイ
ゼーシヨン実験（実施例４）で決定した2.3〜2.5Ｋｂと
いう長さに一致する。ゲノムＤＮＡプローブを使つて、
３′非翻訳末端についてオリゴ（ｄＴ）−プライム化胎
盤およびＨＴ１０８０ｃＤＮＡライブラリーを更にスク
リーニングしたところ、単一のハイブリダイズするｃＤ
ＮＡを同定しなかつた。

実施例４ ＴＧＦ−βｃＤＮＡプローブを使つた診断法 肝癌ＨＥＰ−Ｇ２、Wilms腫瘍TuWi、膠芽腫Ａ１７２、
膀胱癌Ｔ２４、鱗性表皮癌Ａ４３１、乳房癌ＭＣＦ−
７、鼻咽腔ＫＢ、線維肉腫ＨＴ１０８０、Burkittリン
パ腫−リンパ芽球DaudiおよびRaji、Ｔ−リンパ芽球モ
ルト４から、ポリアデニル化ＲＮＡを回収した。末梢血
液リンパ球を調製し、文献記載(53)のスタフイロコツカ
ル・エンテロトキシンＢおよびホルボールミリステート
を用いてミトゲン誘導を行なつた。この場合、ＲＮＡは
２４時間後に回収した。ポリアデニル化ｍＲＮＡ４μｇ
を、ホルムアルデヒド−1.2％アガロースゲル(29)中で
電気泳動し、ニトロセルロースフイルターにプロツトし
た(30)。上に記載した高いストリンジエント条件下で、
λβＣ１の₃₂Ｐ−標識(76)ＥｃｏＲＩｃＤＮＡ挿入体を
プローブとして使用した。ゲル上で２８Ｓおよび１８Ｓ
のｒＲＮＡの位置を比較することにより、ＴＧＦ−βｍ
ＲＮＡの長さは2.3〜2.5であることが示唆された。ｍＲ
ＮＡの部分分解は除外することはできないが、ある場合
には、小さいｍＲＮＡ種が存在するかもしれない。

ＴＧＦ−βｍＲＮＡは、神経外胚葉起源の腫瘍細胞を含
む全てのヒトの腫瘍セルライン、例えばTuWi（Wilms腫
瘍）およびＡ１７２（膠芽腫）、および癌セルラインＴ
２４膀胱癌、Ａ４３１（鱗性表皮癌）、ＭＣＦ−７（乳
房癌）およびＫＢ（鼻咽喉癌）中で検出可能であつた。
ＨＴ１０８０、ｃＤＮＡをクローニングするためのｍＲ
ＮＡ源として発明者らが選択した、セルライン誘導の線
維肉腫は、比較的高レベルのＴＧＦ−βｍＲＮＡを含ん
でいた。ＴＧＦ−βｍＲＮＡは、中胚葉、内胚葉および
外胚葉起源の固状腫瘍から誘導されたセルラインに存在
しなかつたばかりでなく、造血起源の腫瘍セルライン、
例えばDaudi（Burkittリンパ腫Ｂ−リンパ芽球）、Raji
（Burkittリンパ腫Ｂ−リンパ芽球）およびMolt−４
（Ｔ−細胞白血病）中で検出できた。ＴＧＦ−βｍＲＮ
Ａは、胎盤および末梢血液リンパ球（PBL）ｍＲＮＡに
も検出されることは明らかであるので、ＴＧＦ−βｍＲ
ＮＡが存在するのは腫瘍細胞に限られる訳ではない。Ｐ
ＢＬをミトゲン刺激すると、ＴＧＦ−βｍＲＮＡのレベ
ルは有意に上昇する。ＴＧＦ−βｍＲＮＡはヒトの肝臓
では検出できないが、ＨＥＰ−Ｇ２肝癌セルラインには
存在していた。全ゆる場合に於いて、ＴＧＦ−βｍＲＮ
Ａは2.3〜2.5Ｋ塩基の長さのものとして泳動する。ある
場合には、より小さな約1.8〜1.9KbのｍＲＮＡが存在す
ることがあるが、これはこのｍＲＮＡの部分的分解によ
るものであろう。

実施例５ ＴＧＦ−βの組換え合成 ＴＧＦ−βの組換え合成に使用されたプラスミドはｐＭ
ＢＴＥ６であつた。以下に述べるプラスミドの調製法
は、その組立に実際に使用されるもつと複雑な方法より
も好ましい先見の明ある変法である。

ｐ３４２Ｅ(79)をＥｃｏＲＩで消化し、大腸菌ＤＮＡポ
リメラーゼＩ（クレナウフラグメント）と４個のｄＮＴ
Ｐを用いて平滑化し、SalＩで消化してフラグメントＩ
（ｐＢＲ３２２のＡｍｐ^ｒ遺伝子を含んでいる）を回収
した。

ｐ３４２Ｅを同時にSalＩおよびHindIIIで消化し、ＨＢ
ｓＡｇをコードしているフラグメントをフラグメント２
として回収した。

最後にＳＶ４０ゲノムをHindIIIおよびHincIIで消化
し、ＳＶ４０起源と初期プロモーターを含んでいる５９
６bpフラグメントをフラグメント３として回収した。

フラグメント１、２および３をスリー・ウエイ・ライゲ
ーシヨン法で連結し、このライゲーシヨン混合物を大腸
菌株２９４（ATCC31446）に導入した。形質転換した培
養物をアンピシリン媒質プレートに植え、耐性コロニー
を選択した。形質転換コロニーから、ｐ３４２Ｅ−平滑
を回収した。

ｐ３４２Ｅ−平滑を、HindIIIおよびＥｃｏＲＩで同時
に消化し、大きいベクターフラグメントを回収した。こ
のフラグメントを、以下の配列を持つポリリンカーに連
結した。

ついで、このライゲーシヨン混合物を用い、上記の方法
で大腸菌ATCC31446を形質転換した。pCVSV−HBsをアン
ピシリン−耐性形質転換体から回収した。

pCVSV−HBsをHindIIIおよびＥｃｏＲＩで同時に消化
し、ベクターフラグメントを分離した（１８bp HindIII
−ＥｃｏＲＩフラグメントは、そのサイズが小さいので
ゲルには現れていないであろう）。

pgD−DHFR−Trunc（ヨーロツパ特許出願８４．305909．
８）、単純性疱疹ｇＤタンパクをコードしているＤＮＡ
を含んでいるプラスミドをStuＩおよびHindIIIで同時に
消化、単純性疱疹シグナルペプチドをコードしているＤ
ＮＡおよび成熟ＨＳＶ−１ｇＤタンパクのＮ−末端部分
の暗号領域を含んでいる約７６０bpフラグメントを回収
した。ヨーロツパ特許出願番号８４．305909.8からのプ
ラスミドｐＪ2.9も、同様の方法で使用できる。

ｐβＣ１（第１ａ図）をSmaＩおよびBamHIで消化し、４
８０bpフラグメントを回収した。このフラグメントは、
成熟ＴＧＦ−βのＮ−末端から残基３１４に至るまでを
コードしている配列を含む、preＴＧＦ−βをコードし
ている配列の大部分を含んでいる。

ｐβＣ１をBamHIおよびＥｃｏＲＩで消化し、２７０bp
フラグメントを回収した。BamHI−ＥｃｏＲＩｐβＣ１
フラグメントはSamＩ部位を持つているので、ｐβＣ１
液の消化は別々に行なつた。２７０bpフラグメントはＴ
ＧＦ−β分子の残りをコードしている配列を含んでお
り、停止コドンから２０bp延びている。

ｐＣＶＳＶ−ＨＢｓベクターフラグメントを、先の７６
０、２７０および４８０bpフラグメントと、フオー・ウ
エイ。ライゲーシヨンによつて連結する。得られた組立
て物（pCVSVgD）は、ＳＶ４０初期プロモーターの支配
下にあるハイブリツド暗号領域（単純性疱疹gD−１シグ
ナルペプチドおよびプレＴＧＦ−βプリカーサーフラグ
メントにフレーム中で連結したgD−１エンベロープタン
パクの一部）を含んでいる。このハイブリツド暗号領域
には、３′−非翻訳配列および肝炎表面抗原のポリアデ
ニル化シグナルが続いている。

pCVSVgDをＥｃｏＲＩで消化し、クレノウと４種のｄＮ
ＴＰで平滑化し、次いでpstＩで消化する。この様にし
て２つのフラグメントが得られ、ハイブリツド暗号配列
とＳＶ４０プロモーターを含んでいるフラグメント（フ
ラグメントＡ）を回収する。

pCVSVgDをBamHIで消化し、クレノウおよび４種のｄＮＴ
Ｐで平滑化し、次いでPstＩで消化する。これらの消化
あと、４種のフラグメントが得られる。pBR322起源およ
びAmp^r遺伝子を含んでいるフラグメント（約1900bp）を
フラグメントＢと同様にして回収する。

フラグメントＡおよびＢを連結し、このライゲーシヨン
混合物を使つて大腸菌ATCC31.446を形質転換した。Amp^r
コロニーからプラスミドpMBTE6を回収する。

プラスミドpMBTE6を、プラスミドpFD11〔シモンセン（S
imonsen）およびレビンソン（Levinson）、1983、Ｐ．
Ｎ．Ａ．Ｓ．80、2495−2499〕と共にDHFR欠失ＣＨＯ細
胞〔ウルラウブ（Urlaub）およびチヤシン（Chasin）、
1980、Ｐ．Ｎ．Ａ．Ｓ．77．4216−4220〕にトランスフ
エクスした。プラスミドpFD11はDHFRをコードしてお
り、従つてトランスフエクトされた細胞にメトトレキセ
ート耐性を与えるので、ＴＧＦ−βを発現する形質転換
体を選択することができる。あらゆるDHFR^-哺乳動物宿
主細胞を使用することができる。別法として、ネオマイ
シン耐性をコードしているプラスミドを用いて宿主細胞
を同時形質転換し、ネオマイシン含有培地で増殖する能
力によつて形質転換体を同定すれば、あらゆる哺乳動物
宿主細胞を使用することができる。

形質転換したＣＨＯ細胞をHGT^-培地で培養することによ
り選択した。細胞を直径１５cmの平板中、全面生長する
まで増殖させた。次いで血清不含の培地中、４８時間培
養した後収穫した。培養培地を平板からデカントして取
り出し、記載された方法(78)を用い軟寒天分析によりＴ
ＧＦ−βの存在を調べた。

上清の培地５０mlを凍結乾燥し、７００μの4mMHCl−
0.1％牛血清アルブミンに溶解した。この溶液および連
続的３倍稀釈液２００μを分析した。軟寒天中の直結
が＞８９μｍであるコロニーの数をカウントした。飽和
レベルのＴＧＦ−βの存在下で得た最大応答値（プラト
ー値）は平板当たり約１５００であつた。ＴＧＦ−βの
非存在下では、５０コロニー以下であつた。半最大応答
値は、ネガテイブコントロールプラスミドで形質転換し
た細胞由来の試料の９倍稀釈液において得られた。MBTE
6上清の連続稀釈によつて得られた値から計算したとこ
ろ、半最大値は７０倍稀釈において得られることがわか
つた。

連続稀釈液の分析の結果、サブクローンおよびMTX−含
有培地中での選択の前ですら、ｐＥＤ１１単独で、ある
いはｐＦＤ１１と対照プラスミド（疱疹（ヘルペス）暗
号配列が細菌のＳＴIIシグナルペプチドをコードしてい
る配列で置き換える外はpMBTE6と類似しているもの）で
トランスフエクトしたＣＨＯ細胞より約８〜１０倍以上
のＴＧＦ−β／ml（培地）を合成することがわかつた。
この追加量のＴＧＦ−βはヒトＴＧＦ−βである。

生物学的に活性なＴＧＦ−βが培養培地中に存在するの
で、ヒトの細胞がインビボに於いて成熟ＴＧＦ−βを分
泌するのと同様に、ＣＨＯ細胞がプレＴＧＦ−βを開裂
すると結論された。この結論は、軟寒天中のＴＧＦ−β
濃度稀釈曲線の傾斜が、内因性の天然ＴＧＦ−βと組換
えＴＧＦ−βの両者に於いて同じであることから強く支
持されるのであり、このことは、ＴＧＦ−βリセプター
に対する親水性が同一でないにしても、類似しているこ
とを表わしている。

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tsuo，Ｈ．），ラフテリー（Raftery，Ｍ．Ａ．），ヒ
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76．テイラー（Taylor，Ｊ．Ｍ．），イルメンセ（Illm
ensee，Ｒ．）およびサマーズ（Summers，Ｓ．）、バイ
オシミカ・エ・バイオフイジカ・アクタ（Biochim.Biop
hys.Acta）442，324−330（1976）。

77．クローリー（Crowley）等，モレキユラー・アンド
・セルラー・バイオロジー（Molec.Cell.Biol.）３，44
−55（1983）。

78．アンザノ（Anzano）等，モレキユラー・アンド・セ
ルラー・バイオロジー（Mol.Cell,Biol.）５，242−247
（1985）。

79．ヨーロツパ特許出願第73，656A号

【図面の簡単な説明】

第１ａ図はＴＧＦ−βｍＲＮＡの模式図、第１ｂ図はプ
レ−ＴＧＦ−βｃＤＮＡのヌクレオチド配列および推定
のアミノ酸配列を示す模式図、第２図はＴＧＦ−βエク
ソンをコードしているゲノムフラグメントとその推定の
アミノ酸配列を示す模式図である。

フロントページの続き (51)Int.Cl.⁵ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91）

Claims (5)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】(a)式： Ala Leu Asp Thr Asn Tyr Cys Phe Ser Ser Thr Glu Ly
   s Asn Cys Cys Val Arg Gln Leu Tyr Ile Asp Phe Arg
   Lys Asp Leu Gly Trp Lys Trp Ile His Glu Pro Lys Gl
   y Tyr His Ala Asn Phe Cys Leu Gly Pro Cys Pro Tyr
   Ile Trp Ser Leu Asp Thr Gln Tyr Ser Lys Val Leu Al
   a Leu Tyr Asn Gln His Asn Pro Gly Ala Ser Ala Ala
   Pro Cys Cys Val Pro Gln Ala Leu Glu Pro Leu Pro Il
   e Val Tyr Tyr Val Gly Arg Lys Pro Lys Val Glu Gln
   Leu Ser Asn Met Ile Val Arg Ser Cys Lys Cys Ser で示されるアミノ酸配列からなり、ＴＧＦ−β活性を有
   するポリペプチドをコードしているＤＮＡを含んでいる
   ベクターを組立て、(b)該ベクターで哺乳類宿主細胞を
   形質転換し、(c)形質転換された細胞を培養し、(d)培養
   物から上記ポリペプチドを含有する生成物を回収する方
   法。
2. 【請求項２】哺乳類細胞がチャイニーズ・ハムスターの
   卵巣セルラインである第(1)項に記載の方法。
3. 【請求項３】該アミノ酸配列をコードしているＤＮＡが
   ウイルス性プロモーターと機能的に結合している第(1)
   項に記載の方法。
4. 【請求項４】プロモーターがＳＶ４０プロモーターであ
   る第(3)項に記載の方法。
5. 【請求項５】生成物が培養培地から回収される第(1)項
   に記載の方法。