JPH0763378B2 - ＴＧＦ−βをコードしているＤＮＡ - Google Patents
ＴＧＦ−βをコードしているＤＮＡInfo
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- JPH0763378B2 JPH0763378B2 JP5227016A JP22701693A JPH0763378B2 JP H0763378 B2 JPH0763378 B2 JP H0763378B2 JP 5227016 A JP5227016 A JP 5227016A JP 22701693 A JP22701693 A JP 22701693A JP H0763378 B2 JPH0763378 B2 JP H0763378B2
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- Japan
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- tgf
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- dna
- cell
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- Expired - Lifetime
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Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
- C07K14/495—Transforming growth factor [TGF]
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明はＴＧＦ−βをコードして
いるＤＮＡ、それを含有するベクター並びに該ベクター
で形質転換された形質転換体に関する。
いるＤＮＡ、それを含有するベクター並びに該ベクター
で形質転換された形質転換体に関する。
【０００２】哺乳類細胞の培養中で可逆的な表現型形質
転換を誘導することのできるペプチドは形質転換成長因
子(ＴＧＦ)(１,２)と呼ばれている。α型ＴＧＦは表皮
成長因子(ＥＧＦ)と競合的に、同一の細胞表面受容体
(３)と結合する。アミノ酸数５０のＴＧＦ−α種が精製
され、それはＥＧＦ(４)と相同(ホモロジイ)な配列を有
していることが示された。ＴＧＦ−αは種々の形質転換
されたセルラインによって合成されているが、非胚起源
の正常な組織での合成は示されていない(３,５,６)。こ
の５０アミノ酸ＴＧＦ−αは、最初１６０アミノ酸前駆
体分子の一部として合成され、このものはＮ−末端およ
びＣ−末端のタンパク分解的プロセッシングを受けて成
熟ペプチドになる(７,８)。明らかにもっと分子量の大
きいＴＧＦ−α種が検出されるのは(１,２,９)、１６０
アミノ酸前駆体のプロセッシングが異なるからであろ
う。
転換を誘導することのできるペプチドは形質転換成長因
子(ＴＧＦ)(１,２)と呼ばれている。α型ＴＧＦは表皮
成長因子(ＥＧＦ)と競合的に、同一の細胞表面受容体
(３)と結合する。アミノ酸数５０のＴＧＦ−α種が精製
され、それはＥＧＦ(４)と相同(ホモロジイ)な配列を有
していることが示された。ＴＧＦ−αは種々の形質転換
されたセルラインによって合成されているが、非胚起源
の正常な組織での合成は示されていない(３,５,６)。こ
の５０アミノ酸ＴＧＦ−αは、最初１６０アミノ酸前駆
体分子の一部として合成され、このものはＮ−末端およ
びＣ−末端のタンパク分解的プロセッシングを受けて成
熟ペプチドになる(７,８)。明らかにもっと分子量の大
きいＴＧＦ−α種が検出されるのは(１,２,９)、１６０
アミノ酸前駆体のプロセッシングが異なるからであろ
う。
【０００３】β型(タイプβ)ＴＧＦ活性は、多くの正常
組織(１０,１１)、例えば腎臓(１２)、胎盤(１３)およ
び血小板(１４,１５)から、並びに、腫瘍細胞から単離
されている。ＴＧＦ−βは血小板中に存在しているが、
この血小板中には、血小板誘導性成長因子(ＰＤＧＦ)お
よびＥＧＦ様ペプチド(１６)も含有されている。ウシＴ
ＧＦ−βはラットにおける傷の治癒を促進することが示
された(１７)。しかしながら、ＴＧＦ−βでＮＲＫ線維
芽細胞を処理すると、ＥＧＦに対する膜受容体の数が増
加したという報告もある(２０)。この観察結果は、ＴＧ
Ｆ−βが、これらの細胞上でのＥＧＦおよびＴＧＦ−α
の活性に対して大きい増強作用を有するというＴＧＦ−
βの既知の能力と一致している(１０,１１)。さらに、
ＴＧＦ−βは単独で軟寒天中で、ＡＫＲ−２Ｂ線維芽細
胞のコロニー形成を誘導する作用も有する(２１)。ある
種の形質転換された細胞が高レベルでＴＧＦ−βを分泌
するということ(２２)は、この成長調節因子が悪性の形
質転換において何らかの役割を演じていることを示唆し
ている。
組織(１０,１１)、例えば腎臓(１２)、胎盤(１３)およ
び血小板(１４,１５)から、並びに、腫瘍細胞から単離
されている。ＴＧＦ−βは血小板中に存在しているが、
この血小板中には、血小板誘導性成長因子(ＰＤＧＦ)お
よびＥＧＦ様ペプチド(１６)も含有されている。ウシＴ
ＧＦ−βはラットにおける傷の治癒を促進することが示
された(１７)。しかしながら、ＴＧＦ−βでＮＲＫ線維
芽細胞を処理すると、ＥＧＦに対する膜受容体の数が増
加したという報告もある(２０)。この観察結果は、ＴＧ
Ｆ−βが、これらの細胞上でのＥＧＦおよびＴＧＦ−α
の活性に対して大きい増強作用を有するというＴＧＦ−
βの既知の能力と一致している(１０,１１)。さらに、
ＴＧＦ−βは単独で軟寒天中で、ＡＫＲ−２Ｂ線維芽細
胞のコロニー形成を誘導する作用も有する(２１)。ある
種の形質転換された細胞が高レベルでＴＧＦ−βを分泌
するということ(２２)は、この成長調節因子が悪性の形
質転換において何らかの役割を演じていることを示唆し
ている。
【０００４】ＴＧＦ−βは、その細胞増殖刺激作用の外
に、種々のヒトがん細胞セルラインの固定依存性増殖を
阻害することが最近示された(１３)。今日では、ＴＧＦ
−βは、アフリカミドリザル(ＢＳＣ−１)細胞から単離
された増殖阻害因子と同一、もしくは極めて近いと考え
られている(２４)。特定の細胞型のセルラインの増殖に
対してＴＧＦ−αが刺激的に作用するか、阻害的に作用
するかは、細胞の生理学的条件、および他の成長因子の
存在等を含む多くの変動因子(variables)に依存すると
思われる。ウシＴＧＦ−βは、配列決定可能な程度にま
で精製された。成熟タンパク質の最初の１５アミノ末端
残基は、以下の式であらわされるものであることがわか
った: Ａla−Ｌeu−Ａsp−Ｔhr−Ａsn−Ｔyr−ＣＭＣ−Ｐhe−
Ｓer−Ｓer−Ｔhr−Ｇly−Ｌys−Ａsn−ＣＭＣ− (式中、ＣＭＣはシステイン残基または半−システイン
残基であるＳ−カルボキシメチルシステインを表わ
す)。ヒト胎盤またはヒト血小板由来のヒトＴＧＦ−β
も同程度にまで精製された。胎盤性ＴＧＦ−βのアミノ
末端配列は、式: Ａla−Ｌeu−Ａsp−Ｔhr−Ａsn−Ｔyr−ＣＭＣ−Ｐhe−
(Ｓer−Ｓer)−Ｔhr−Ｇlu−Ｌys−Ａsn−ＣＭＣ−Ｖal
−Ｘ−Ｇln−Ｌeu−Ｔyr−Ｉle−Ａsp−Ｐhe−Ｘ−(Ｌy
s)−Ａsp−Ｌeu−Ｇly− (式中、Ｘは未定であることを表わし、ＣＭＣは上記と
同意義である)で示されることが報告されている。血小
板性ＴＧＦ−βのアミノ末端配列は、式: Ａla−Ｌeu−Ａsp−Ｔhr−Ａsn−Ｔyr−Ｘ−Ｐhe−Ｓer
− (式中、ＣＭＣおよびＸは上記の定義に従う)で示される
ことが報告されている。ＴＧＦ−βは、ジスルフィド結
合を介して共有結合的に結合している、分子量が極めて
近い(Ｍr＝１２,５００)２本のポリペプチド鎖からなっ
ているとの報告がある。このジスルフィド結合は、ＴＧ
Ｆ−β分子の構造を定める上で重要な役割を果している
様に思われる。
に、種々のヒトがん細胞セルラインの固定依存性増殖を
阻害することが最近示された(１３)。今日では、ＴＧＦ
−βは、アフリカミドリザル(ＢＳＣ−１)細胞から単離
された増殖阻害因子と同一、もしくは極めて近いと考え
られている(２４)。特定の細胞型のセルラインの増殖に
対してＴＧＦ−αが刺激的に作用するか、阻害的に作用
するかは、細胞の生理学的条件、および他の成長因子の
存在等を含む多くの変動因子(variables)に依存すると
思われる。ウシＴＧＦ−βは、配列決定可能な程度にま
で精製された。成熟タンパク質の最初の１５アミノ末端
残基は、以下の式であらわされるものであることがわか
った: Ａla−Ｌeu−Ａsp−Ｔhr−Ａsn−Ｔyr−ＣＭＣ−Ｐhe−
Ｓer−Ｓer−Ｔhr−Ｇly−Ｌys−Ａsn−ＣＭＣ− (式中、ＣＭＣはシステイン残基または半−システイン
残基であるＳ−カルボキシメチルシステインを表わ
す)。ヒト胎盤またはヒト血小板由来のヒトＴＧＦ−β
も同程度にまで精製された。胎盤性ＴＧＦ−βのアミノ
末端配列は、式: Ａla−Ｌeu−Ａsp−Ｔhr−Ａsn−Ｔyr−ＣＭＣ−Ｐhe−
(Ｓer−Ｓer)−Ｔhr−Ｇlu−Ｌys−Ａsn−ＣＭＣ−Ｖal
−Ｘ−Ｇln−Ｌeu−Ｔyr−Ｉle−Ａsp−Ｐhe−Ｘ−(Ｌy
s)−Ａsp−Ｌeu−Ｇly− (式中、Ｘは未定であることを表わし、ＣＭＣは上記と
同意義である)で示されることが報告されている。血小
板性ＴＧＦ−βのアミノ末端配列は、式: Ａla−Ｌeu−Ａsp−Ｔhr−Ａsn−Ｔyr−Ｘ−Ｐhe−Ｓer
− (式中、ＣＭＣおよびＸは上記の定義に従う)で示される
ことが報告されている。ＴＧＦ−βは、ジスルフィド結
合を介して共有結合的に結合している、分子量が極めて
近い(Ｍr＝１２,５００)２本のポリペプチド鎖からなっ
ているとの報告がある。このジスルフィド結合は、ＴＧ
Ｆ−β分子の構造を定める上で重要な役割を果している
様に思われる。
【０００５】
【発明が解決すべき課題】ヒト由来の生物学的物質を出
発物質に用いないでＴＧＦ−βを製造する方法の開発が
期待されている。この様な方法は、感染性の汚染物質、
例えば、ＨＴＬＶ−ＩＩＩまたは肝炎ウイルスが、生産
物の製造過程で入り込み得ないことを確実にするのに大
きく寄与するであろう。上記の目的は、組換え合成法に
よって達成される。しかしながら、そうするためには、
その様なＴＧＦ−βの組換え合成に用いるためのベクタ
ーを調製する上で、ＴＧＦ−βをコードしている核酸
（ＤＮＡ、ＲＮＡ等）が必要である。その様な核酸はま
た、組織試料中のＴＧＦ−βメッセンジャーmＲＮＡ
と、ゲノムＤＮＡの診断的な分析においても必要とされ
る。
発物質に用いないでＴＧＦ−βを製造する方法の開発が
期待されている。この様な方法は、感染性の汚染物質、
例えば、ＨＴＬＶ−ＩＩＩまたは肝炎ウイルスが、生産
物の製造過程で入り込み得ないことを確実にするのに大
きく寄与するであろう。上記の目的は、組換え合成法に
よって達成される。しかしながら、そうするためには、
その様なＴＧＦ−βの組換え合成に用いるためのベクタ
ーを調製する上で、ＴＧＦ−βをコードしている核酸
（ＤＮＡ、ＲＮＡ等）が必要である。その様な核酸はま
た、組織試料中のＴＧＦ−βメッセンジャーmＲＮＡ
と、ゲノムＤＮＡの診断的な分析においても必要とされ
る。
【０００６】
【課題を解決するための手段】本発明は、(a)ＴＧＦ−
βをコードしているＤＮＡを含んでいるベクターを組立
て、(b) 該ベクターで異種の真核性細胞を形質転換し、
(c) 形質転換された細胞を培養し、(d) 培養物からＴＧ
Ｆ−βを回収することからなる方法により、上記の目的
を達成したものである。本発明は、ＴＧＦ−βをコード
するＤＮＡを提供するものであり、該ＤＮＡは配列番号
１に記載のアミノ酸配列を有する成熟ＴＧＦ−βをコー
ドするＤＮＡを含む。本発明のＤＮＡは、上記のベクタ
ーの組立てに有用であるのみならず、該ＤＮＡまたはそ
れとハイブリダイゼーションし得る核酸を標識し、ＴＧ
Ｆ−βまたはその近縁タンパク質をコードしているＤＮ
ＡまたはmＲＮＡの診断的分析に用いることもできる。
βをコードしているＤＮＡを含んでいるベクターを組立
て、(b) 該ベクターで異種の真核性細胞を形質転換し、
(c) 形質転換された細胞を培養し、(d) 培養物からＴＧ
Ｆ−βを回収することからなる方法により、上記の目的
を達成したものである。本発明は、ＴＧＦ−βをコード
するＤＮＡを提供するものであり、該ＤＮＡは配列番号
１に記載のアミノ酸配列を有する成熟ＴＧＦ−βをコー
ドするＤＮＡを含む。本発明のＤＮＡは、上記のベクタ
ーの組立てに有用であるのみならず、該ＤＮＡまたはそ
れとハイブリダイゼーションし得る核酸を標識し、ＴＧ
Ｆ−βまたはその近縁タンパク質をコードしているＤＮ
ＡまたはmＲＮＡの診断的分析に用いることもできる。
【０００７】組換え法によるＴＧＦ−β誘導体の製造
は、本明細書で開示したＴＧＦ−β暗号配列に関する知
見を得たことにより可能となった。これら誘導体は、Ｔ
ＧＦ−βをコードしている核酸中にサイレント突然変異
および発現突然変異を含んでいる。サイレント突然変異
は、１つの同義性コドンが別のコドンで置き換えられる
ことであって、この場合、これら両コドンは同じアミノ
酸をコードしているが、この置換は組換え培養中のＴＧ
Ｆ−βの収率に幾分かの影響を及ぼし得る(例えば、Ｔ
ＧＦ−β mＲＮＡの二次構造を修飾することによる)。
その様な置換は、形質転換体からのＴＧＦ−βの収率を
スクリーニングすることにより同定され得る。
は、本明細書で開示したＴＧＦ−β暗号配列に関する知
見を得たことにより可能となった。これら誘導体は、Ｔ
ＧＦ−βをコードしている核酸中にサイレント突然変異
および発現突然変異を含んでいる。サイレント突然変異
は、１つの同義性コドンが別のコドンで置き換えられる
ことであって、この場合、これら両コドンは同じアミノ
酸をコードしているが、この置換は組換え培養中のＴＧ
Ｆ−βの収率に幾分かの影響を及ぼし得る(例えば、Ｔ
ＧＦ−β mＲＮＡの二次構造を修飾することによる)。
その様な置換は、形質転換体からのＴＧＦ−βの収率を
スクリーニングすることにより同定され得る。
【０００８】発現されたＴＧＦ−β突然変異体は３つの
クラスの内の１またはそれ以上に分類される。これら
は、欠失、置換または挿入である。欠失は、アミノ酸残
基が除去されるが、そこに代替アミノ酸が挿入されない
ことを特徴とする。欠失突然変異ＴＧＦ−β ＤＮＡ
は、例えば、免疫エピトープが欠失されたＴＧＦ−βフ
ラグメントが必要な場合、それを調製するのに有用であ
る。置換突然変異は、１つのアミノ酸残基が別のアミノ
酸残基で置換されることである。その様な突然変異を組
換え合成法以外の方法で行うことは非常に困難であり、
とりわけ、一次アミノ酸配列の内部での置換を目指す場
合には困難である。この様な置換はＴＧＦ−βの生物学
的活性を改良するのに有用である。挿入突然変異は、１
またはそれ以上の残基がＴＧＦ−β核酸の内部、または
いずれかの端に配置されることである。融合物は、通
常、挿入突然変異の１種であり、ＴＧＦ−βのカルボキ
シ末端またはアミノ末端で挿入が起きた場合に相当す
る。ＴＧＦ−βと細菌性または他の免疫原性タンパク質
との融合は、ＴＧＦ−βまたは、その予め定められたフ
ラグメントに対する抗体を惹起するのに有用である。
クラスの内の１またはそれ以上に分類される。これら
は、欠失、置換または挿入である。欠失は、アミノ酸残
基が除去されるが、そこに代替アミノ酸が挿入されない
ことを特徴とする。欠失突然変異ＴＧＦ−β ＤＮＡ
は、例えば、免疫エピトープが欠失されたＴＧＦ−βフ
ラグメントが必要な場合、それを調製するのに有用であ
る。置換突然変異は、１つのアミノ酸残基が別のアミノ
酸残基で置換されることである。その様な突然変異を組
換え合成法以外の方法で行うことは非常に困難であり、
とりわけ、一次アミノ酸配列の内部での置換を目指す場
合には困難である。この様な置換はＴＧＦ−βの生物学
的活性を改良するのに有用である。挿入突然変異は、１
またはそれ以上の残基がＴＧＦ−β核酸の内部、または
いずれかの端に配置されることである。融合物は、通
常、挿入突然変異の１種であり、ＴＧＦ−βのカルボキ
シ末端またはアミノ末端で挿入が起きた場合に相当す
る。ＴＧＦ−βと細菌性または他の免疫原性タンパク質
との融合は、ＴＧＦ−βまたは、その予め定められたフ
ラグメントに対する抗体を惹起するのに有用である。
【０００９】以下に、添付の図面について説明する。図
１はＴＧＦ−β mＲＮＡを模式的に示した図であり、
四角い箱の中は、暗号配列を表わす。１１２アミノ酸Ｔ
ＧＦ−β(斜線で示されている)は、暗号配列の３'末端
にコードされている。この図の上方に、配列決定のなさ
れた、λβＣ１,３.１９,３.３２,４.１０,４.３３,４.
３７および５.７bのcＤＮＡ挿入体(後述)と３'非翻訳領
域のためのゲノムＤＮＡ配列とが並べられている。
１はＴＧＦ−β mＲＮＡを模式的に示した図であり、
四角い箱の中は、暗号配列を表わす。１１２アミノ酸Ｔ
ＧＦ−β(斜線で示されている)は、暗号配列の３'末端
にコードされている。この図の上方に、配列決定のなさ
れた、λβＣ１,３.１９,３.３２,４.１０,４.３３,４.
３７および５.７bのcＤＮＡ挿入体(後述)と３'非翻訳領
域のためのゲノムＤＮＡ配列とが並べられている。
【００１０】図２、３、４は数個の重複するcＤＮＡ
と、３'領域のゲノムＤＮＡとで配列決定されたプレー
ＴＧＦ−β cＤＮＡのフクレオチド配列並びに推定の
アミノ酸配列とを示す図である。折りたたまれて安定な
ヘアーピン・ループを形成し得る５'末端領域には下線
を付した。プレＴＧＦ−β cＤＮＡは３５４または３
９０個のアミノ酸のタンパク質をコードしており、その
Ｃ末端の１１２アミノ酸(四角い箱の中)は成熟ＴＧＦ−
βをコードしている。なお、該成熟ＴＧＦ−βのアミノ
酸配列は配列表の配列番号１に記載されている。上線を
施されたＡrg−ＡrgジペプチドはＴＧＦ−βを放出する
ためのタンパク分解的な開裂部位の上流に位置する。プ
レＴＧＦ−β内のＮ−グリコシル化され得る３箇所に
は、オーバーラインが施されている。終止コドンの下流
には、Ｇ−Ｃに富む下線を施された配列とその下流のＴ
Ａ ＴＡ様配列とが続いている。ＡＡＴＡＡＡポリアデ
ニル化シグナルと、推定のポリアデニル化部位上流のＴ
ＴＣＡＧＧＣＣ配列にも下線が施されている。
と、３'領域のゲノムＤＮＡとで配列決定されたプレー
ＴＧＦ−β cＤＮＡのフクレオチド配列並びに推定の
アミノ酸配列とを示す図である。折りたたまれて安定な
ヘアーピン・ループを形成し得る５'末端領域には下線
を付した。プレＴＧＦ−β cＤＮＡは３５４または３
９０個のアミノ酸のタンパク質をコードしており、その
Ｃ末端の１１２アミノ酸(四角い箱の中)は成熟ＴＧＦ−
βをコードしている。なお、該成熟ＴＧＦ−βのアミノ
酸配列は配列表の配列番号１に記載されている。上線を
施されたＡrg−ＡrgジペプチドはＴＧＦ−βを放出する
ためのタンパク分解的な開裂部位の上流に位置する。プ
レＴＧＦ−β内のＮ−グリコシル化され得る３箇所に
は、オーバーラインが施されている。終止コドンの下流
には、Ｇ−Ｃに富む下線を施された配列とその下流のＴ
Ａ ＴＡ様配列とが続いている。ＡＡＴＡＡＡポリアデ
ニル化シグナルと、推定のポリアデニル化部位上流のＴ
ＴＣＡＧＧＣＣ配列にも下線が施されている。
【００１１】図５はＴＧＦ−βエクソンをコードしてい
るゲノムフラグメントとその推定のアミノ酸配列を示す
図である。mＲＮＡプロセッシング部位(イントロン−エ
クソン結合部位)は矢印で示されている。残基の番号
は、図２、３、４のそれと対応している。
るゲノムフラグメントとその推定のアミノ酸配列を示す
図である。mＲＮＡプロセッシング部位(イントロン−エ
クソン結合部位)は矢印で示されている。残基の番号
は、図２、３、４のそれと対応している。
【００１２】ＴＧＦ−βを、その成長促進作用を保持し
たままの状態で、組換え細胞培養によって合成すること
は極めて困難であることがわかった。図１から分る様
に、成熟ＴＧＦ−βアミノ酸配列は多数のシステイン残
基を含有しており(９)、少くともその内のいくつかは、
天然起源から回収されるホモ二量体ＴＧＦ−βを形成す
るための鎖間交差結合に関与しているらしい。さらに、
ＴＧＦ−βは、ある程度は細胞外媒質(媒地)に本来の姿
で見出されるが、大多数の分泌タンパク質にとって一般
的である、認識し得るＮＨ2−末端シグナルペプチド配
列を含んでいない大きいアミノ末端領域を持った前駆体
分子として発現される。本明細書で開示する発明はいか
なる特定の理論にも限定されないが、このアミノ末端領
域は複数の膜透過領域を含んいるのかもしれない。本発
明者らは、組換え培養内で、一次転写産物を適切にプロ
セッシングすることが困難であると予測されたにも拘ら
ず、真核性細胞を形質転換してヘテロローガスＴＧＦ−
βを発現させることに成功した。
たままの状態で、組換え細胞培養によって合成すること
は極めて困難であることがわかった。図１から分る様
に、成熟ＴＧＦ−βアミノ酸配列は多数のシステイン残
基を含有しており(９)、少くともその内のいくつかは、
天然起源から回収されるホモ二量体ＴＧＦ−βを形成す
るための鎖間交差結合に関与しているらしい。さらに、
ＴＧＦ−βは、ある程度は細胞外媒質(媒地)に本来の姿
で見出されるが、大多数の分泌タンパク質にとって一般
的である、認識し得るＮＨ2−末端シグナルペプチド配
列を含んでいない大きいアミノ末端領域を持った前駆体
分子として発現される。本明細書で開示する発明はいか
なる特定の理論にも限定されないが、このアミノ末端領
域は複数の膜透過領域を含んいるのかもしれない。本発
明者らは、組換え培養内で、一次転写産物を適切にプロ
セッシングすることが困難であると予測されたにも拘ら
ず、真核性細胞を形質転換してヘテロローガスＴＧＦ−
βを発現させることに成功した。
【００１３】本発明は、ＴＧＦ−βの組換え合成を目的
とするものである。本明細書では、ＴＧＦ−βとは、生
物学的に活性な、図２−４の配列を有するプレＴＧＦ−
β、成熟ＴＧＦ−β、そのポリペプチドフラグメント、
並びにそれらプレＴＧＦ−β、成熟ＴＧＦ−βまたはポ
リペプチドフラグメントの挿入、置換および／または欠
失突然変異体を包含するものと定義する。生物学的に活
性なＴＧＦ−βとは、標的セルラインのＥＧＦ−増強固
定非依存性（ＥＧＦ−potentiated anchorage independ
ent）増殖(８１)を誘導する能力および／または新生物
セルラインの増殖阻害能力(２３)を指すものと定義す
る。固定非依存性増殖とは、ＴＧＦ−βおよびＥＧＦで
処理された非−新生物性標的細胞が軟寒天中でコロニー
を形成し得る能力を指し、これは細胞の形質転換によっ
て付与された特性である(従って、形質転換成長因子と
命名されている)。今日では多くの正常細胞がＴＧＦ−
βを発現するということが知られているので、このこと
は、ＴＧＦ−βが、がんを誘発するという意味ではな
い。逆に、ＴＧＦ−βがＡ５４９の如きある種の新生物
細胞の増殖を阻害することも知られている。
とするものである。本明細書では、ＴＧＦ−βとは、生
物学的に活性な、図２−４の配列を有するプレＴＧＦ−
β、成熟ＴＧＦ−β、そのポリペプチドフラグメント、
並びにそれらプレＴＧＦ−β、成熟ＴＧＦ−βまたはポ
リペプチドフラグメントの挿入、置換および／または欠
失突然変異体を包含するものと定義する。生物学的に活
性なＴＧＦ−βとは、標的セルラインのＥＧＦ−増強固
定非依存性（ＥＧＦ−potentiated anchorage independ
ent）増殖(８１)を誘導する能力および／または新生物
セルラインの増殖阻害能力(２３)を指すものと定義す
る。固定非依存性増殖とは、ＴＧＦ−βおよびＥＧＦで
処理された非−新生物性標的細胞が軟寒天中でコロニー
を形成し得る能力を指し、これは細胞の形質転換によっ
て付与された特性である(従って、形質転換成長因子と
命名されている)。今日では多くの正常細胞がＴＧＦ−
βを発現するということが知られているので、このこと
は、ＴＧＦ−βが、がんを誘発するという意味ではな
い。逆に、ＴＧＦ−βがＡ５４９の如きある種の新生物
細胞の増殖を阻害することも知られている。
【００１４】本明細書において、生物学的に活性な、と
いう意味には、天然のＴＧＦ−βに対して惹起された抗
血清と交差反応を行い得る能力も総括的に包含されるも
のとする。天然のＴＧＦ−βとは、血小板その他の天然
起源から得られたＴＧＦ−βを指す。免疫学的な交差反
応性は１個の活性なエピトープを知る目安であって必ず
しも固定非依存性増殖の誘導または標的細胞に関連する
ＴＧＦ−βの活性領域の目安ではない。しかしながら、
免疫学的に交差反応し得るタンパク質自体は、それらが
増殖に影響し得る能力を持っていなければ、本明細書で
定義した意味に於いて生物学的に活性であるとは言えな
い。勿論、固定非依存性増殖を誘導し得るＴＧＦ−β
は、適当な立体配置を維持するという自然の結果とし
て、天然分子に対して惹起された抗血清との免疫学的な
交差反応性を示すことが多い。
いう意味には、天然のＴＧＦ−βに対して惹起された抗
血清と交差反応を行い得る能力も総括的に包含されるも
のとする。天然のＴＧＦ−βとは、血小板その他の天然
起源から得られたＴＧＦ−βを指す。免疫学的な交差反
応性は１個の活性なエピトープを知る目安であって必ず
しも固定非依存性増殖の誘導または標的細胞に関連する
ＴＧＦ−βの活性領域の目安ではない。しかしながら、
免疫学的に交差反応し得るタンパク質自体は、それらが
増殖に影響し得る能力を持っていなければ、本明細書で
定義した意味に於いて生物学的に活性であるとは言えな
い。勿論、固定非依存性増殖を誘導し得るＴＧＦ−β
は、適当な立体配置を維持するという自然の結果とし
て、天然分子に対して惹起された抗血清との免疫学的な
交差反応性を示すことが多い。
【００１５】図２ー４のヌクレオチド配列は、数個の重
複しているcＤＮＡと遺伝子フラグメントとを分析し、
それからＴＧＦ−β前駆体mＲＮＡに相当する連続した
２５３７塩基対配列を決定することにより得られた。図
２−４によると、開始配列(イニシエーター)ＡＴＧは
５'末端から第８４１番目のヌクレオチド部分にあり、
それは１,６９６ヌクレオチドの暗号配列(これは、３９
０アミノ酸長さのポリペプチドをコードしている)を確
立するものである。cＤＮＡ配列中の数箇所は、Ｇ−Ｃ
含有量が異常に多くなっている。イニシエーターＡＴＧ
は、いずれも約２００bpからなる、Ｇ−Ｃに富む２領域
と両側面を接している。その上、cＤＮＡの数領域、殊
に５'−末端領域は、Ｇ−Ｃ含高率が８０％以上であ
る。これらＧ−Ｃに富む領域の位置は、多くのcＤＮＡ
クローニングに係るアーチファクト(人工産物)が得られ
た場所、並びに、cＤＮＡの部分が得られた箇所と一致
している。
複しているcＤＮＡと遺伝子フラグメントとを分析し、
それからＴＧＦ−β前駆体mＲＮＡに相当する連続した
２５３７塩基対配列を決定することにより得られた。図
２−４によると、開始配列(イニシエーター)ＡＴＧは
５'末端から第８４１番目のヌクレオチド部分にあり、
それは１,６９６ヌクレオチドの暗号配列(これは、３９
０アミノ酸長さのポリペプチドをコードしている)を確
立するものである。cＤＮＡ配列中の数箇所は、Ｇ−Ｃ
含有量が異常に多くなっている。イニシエーターＡＴＧ
は、いずれも約２００bpからなる、Ｇ−Ｃに富む２領域
と両側面を接している。その上、cＤＮＡの数領域、殊
に５'−末端領域は、Ｇ−Ｃ含高率が８０％以上であ
る。これらＧ−Ｃに富む領域の位置は、多くのcＤＮＡ
クローニングに係るアーチファクト(人工産物)が得られ
た場所、並びに、cＤＮＡの部分が得られた箇所と一致
している。
【００１６】幾つかの構造上の特徴が、図２−４に示さ
れる様に、８４２位ではなく、９５３位のＡＴＧをプレ
ＴＧＦ−βの開始コドンに帰属することを支持してい
る。第１に、この位置の前後に含まれる配列は、指摘さ
れている開始コドンのコンセンサス配列、Ｇ／ＡＣＣＡ
ＴＧＧ(３５)とかなり一致している。第２に、このＡＴ
Ｇの上流には約８５０bpのオープンリーディングフレー
ムが存在しているが、同一の解読相内にはこれ以外のＡ
ＴＧは唯一つしか見出されない。第３に、シェファード
(Ｓhepherd)(３６)が述べている様に、プリン−ピリミ
ジン分布に基づいて最も使用され易いリーディング・フ
レームを算出すると、このＡＴＧの上流の暗号配列も別
のリーディング・フレームとして選ばれる可能性もある
が、該イニシエーターＡＴＧから始まる暗号配列が、実
際、リーディングフレームとして最も可能性のある配列
であることが分る。第４に、このＡＴＧは、Ｇ−Ｃ含有
率の比較的低い(〜５０％)４０ヌクレオチド領域内に存
在しているので、このことがリボソームへの接近に好都
合である。特に、それがより大きなＧ−Ｃに富む領域内
にあるために、そう思われる。５'非翻訳領域内には、
開始コドンとなり得る別のコドンは唯１個しか存在して
いない(８４２位)。しかるに、このＡＴＧは非常にＧ−
Ｃに富む領域内に位置している。
れる様に、８４２位ではなく、９５３位のＡＴＧをプレ
ＴＧＦ−βの開始コドンに帰属することを支持してい
る。第１に、この位置の前後に含まれる配列は、指摘さ
れている開始コドンのコンセンサス配列、Ｇ／ＡＣＣＡ
ＴＧＧ(３５)とかなり一致している。第２に、このＡＴ
Ｇの上流には約８５０bpのオープンリーディングフレー
ムが存在しているが、同一の解読相内にはこれ以外のＡ
ＴＧは唯一つしか見出されない。第３に、シェファード
(Ｓhepherd)(３６)が述べている様に、プリン−ピリミ
ジン分布に基づいて最も使用され易いリーディング・フ
レームを算出すると、このＡＴＧの上流の暗号配列も別
のリーディング・フレームとして選ばれる可能性もある
が、該イニシエーターＡＴＧから始まる暗号配列が、実
際、リーディングフレームとして最も可能性のある配列
であることが分る。第４に、このＡＴＧは、Ｇ−Ｃ含有
率の比較的低い(〜５０％)４０ヌクレオチド領域内に存
在しているので、このことがリボソームへの接近に好都
合である。特に、それがより大きなＧ−Ｃに富む領域内
にあるために、そう思われる。５'非翻訳領域内には、
開始コドンとなり得る別のコドンは唯１個しか存在して
いない(８４２位)。しかるに、このＡＴＧは非常にＧ−
Ｃに富む領域内に位置している。
【００１７】ＴＧＦ−β mＲＮＡの５'非翻訳領域は
(ヌクレオチド９５３にＡＴＧが位置すると仮定したと
き)、少くとも９５２個のヌクレオチドの長さを有し、
殆んどプリンのみからなる６１個のヌクレオチド長さの
配列(１９２〜２５２)を含んでいる。このＧ−Ｃ含有率
の高い、異常に長い５'非翻訳領域の生物学的な関連性
は不明であるが、c−myc mＲＮＡの構造上の組立てと
似ている。しかしながら、これらの２個の配列間には著
しい配列上のホモロジィは存在していない。c−mycの長
い５'非翻訳領域は機能的な意義を持つと言われている
(３７)。ヒトc−myc mＲＮＡの５'非翻訳領域のＧ−Ｃ
に富む５'−近位部分には、安定なヘアピン・ループ構
造を形成し得る領域が幾つか含まれている。同様に、非
翻訳−プレＴＧＦ−β cＤＮＡの最初の１２０bpも、
理論上は、安定性についての計算値が−９１kcalであ
る、ヘアピン・ループ構造をとり得る。長い５'非翻訳
領域と、潜在的に安定なヘアピン・ループ構造とは、m
ＲＮＡの安定性、あるいは転写の制御において何らかの
役割を演じているかもしれない。従って、組換え細胞培
養からのＴＧＦ−βの収率が改善された構造を同定する
ために、この領域を欠失させ、例えばウイルス性タンパ
ク質由来の、他の５'非翻訳配列で置き換えることがで
きる。
(ヌクレオチド９５３にＡＴＧが位置すると仮定したと
き)、少くとも９５２個のヌクレオチドの長さを有し、
殆んどプリンのみからなる６１個のヌクレオチド長さの
配列(１９２〜２５２)を含んでいる。このＧ−Ｃ含有率
の高い、異常に長い５'非翻訳領域の生物学的な関連性
は不明であるが、c−myc mＲＮＡの構造上の組立てと
似ている。しかしながら、これらの２個の配列間には著
しい配列上のホモロジィは存在していない。c−mycの長
い５'非翻訳領域は機能的な意義を持つと言われている
(３７)。ヒトc−myc mＲＮＡの５'非翻訳領域のＧ−Ｃ
に富む５'−近位部分には、安定なヘアピン・ループ構
造を形成し得る領域が幾つか含まれている。同様に、非
翻訳−プレＴＧＦ−β cＤＮＡの最初の１２０bpも、
理論上は、安定性についての計算値が−９１kcalであ
る、ヘアピン・ループ構造をとり得る。長い５'非翻訳
領域と、潜在的に安定なヘアピン・ループ構造とは、m
ＲＮＡの安定性、あるいは転写の制御において何らかの
役割を演じているかもしれない。従って、組換え細胞培
養からのＴＧＦ−βの収率が改善された構造を同定する
ために、この領域を欠失させ、例えばウイルス性タンパ
ク質由来の、他の５'非翻訳配列で置き換えることがで
きる。
【００１８】残基２０１５の上流における終止コドンの
直ぐ下流には、７５ヌクレオチドからなる著しくＧ−Ｃ
に富む配列がある(図２ー４)。この配列はＣＣＧＣＣの
複数回に及ぶ繰返しを含み、ＧＧＧＧＧＣで終ってい
る。この配列の特異な性質は、おそらく、mＲＮＡの３'
非翻訳末端がcＤＮＡ配列としてクローンされないとい
う事実(これは多分、大腸菌(Ｅ.coli)のＤＮＡポリメラ
ーゼＩがこの配列を二次鎖cＤＮＡ合成の鋳型として利
用し得ないことに起因している)と、関係していると思
われる。同様の性質の繰返し配列は、ヒト−ジヒドロ葉
酸還元酵素、ヒト−トランスフェリン受容体、ヒト−ア
デノシンデアミナーゼ、およびヘルペスウイルス−チミ
ジンキナーゼ等の遺伝子のプロモーター領域にも見い出
されている(４０)。後者の場合、マックナイト(ＭcＫni
ght)ら(４０)は、これらの構造要素が、転写効率におい
て主たる重要な要素であることを示した。さらに、この
プロモーター特異的転写因子Ｓp１は、ＳＶ４０早期プ
ロモーター領域、および近縁のサル−プロモーター内に
含まれるその様な結合と結合することが示された(４１,
４２)。これら全ての場合、Ｇ−Ｃに富む反復配列の下
流に密接してコールドバーグ−ホッグネス(Ｇoldberg−
Ｈogness)のＴＡＴＡ配列が存在している。ところがプ
レＴＧＦ−βの場合、これらの配列は遺伝子の３'非翻
訳領域に位置しているが、これらの配列もまたＴＡＴＡ
様配列を従えている点は興味深い。これらの領域がプロ
モーターとして機能し得る、ということを示す事実は得
られていない。プレＴＧＦ−β遺伝子配列の、終止コド
ンから約５００ヌクレオチド下流には、ヘキサヌクレオ
チドＡＡＴＡＡＡが存在している。通常はポリアデニル
化部位の１１〜３０塩基上流に存在している(３２)この
配列は、それが、ノーザン・ハイブリダイゼーションに
基づいて見積られたプレＴＧＦ−β mＲＮＡの大きさ
と一致していること、並びに、３'非翻訳領域に介在配
列が存在することは稀有である、という理由から、おそ
らくプレＴＧＦ−β mＲＮＡのポリアデニル化シグナ
ルとして機能すると思われる。ベノイスト(Ｂenoist)ら
(４３)は、ＡＡＴＡＡＡと接近し、その下流であって、
ポリＡ−テイル(tail)の直ぐ上流にコンセンサス配列Ｔ
ＴＣＡＣＴＧＣが存在することを提示した。プレＴＧＦ
−βmＲＮＡの３'非翻訳領域内にあるＡＡＴＡＡＡ配列
の下流に、これと同様の配列、ＴＴＣＡＧＧＣＣが存在
していることは、２５３０位がポリアデニル化部位であ
るとする前述の帰属をさらに支持するものである(また
は図２ー４記載の３９０アミノ酸)。
直ぐ下流には、７５ヌクレオチドからなる著しくＧ−Ｃ
に富む配列がある(図２ー４)。この配列はＣＣＧＣＣの
複数回に及ぶ繰返しを含み、ＧＧＧＧＧＣで終ってい
る。この配列の特異な性質は、おそらく、mＲＮＡの３'
非翻訳末端がcＤＮＡ配列としてクローンされないとい
う事実(これは多分、大腸菌(Ｅ.coli)のＤＮＡポリメラ
ーゼＩがこの配列を二次鎖cＤＮＡ合成の鋳型として利
用し得ないことに起因している)と、関係していると思
われる。同様の性質の繰返し配列は、ヒト−ジヒドロ葉
酸還元酵素、ヒト−トランスフェリン受容体、ヒト−ア
デノシンデアミナーゼ、およびヘルペスウイルス−チミ
ジンキナーゼ等の遺伝子のプロモーター領域にも見い出
されている(４０)。後者の場合、マックナイト(ＭcＫni
ght)ら(４０)は、これらの構造要素が、転写効率におい
て主たる重要な要素であることを示した。さらに、この
プロモーター特異的転写因子Ｓp１は、ＳＶ４０早期プ
ロモーター領域、および近縁のサル−プロモーター内に
含まれるその様な結合と結合することが示された(４１,
４２)。これら全ての場合、Ｇ−Ｃに富む反復配列の下
流に密接してコールドバーグ−ホッグネス(Ｇoldberg−
Ｈogness)のＴＡＴＡ配列が存在している。ところがプ
レＴＧＦ−βの場合、これらの配列は遺伝子の３'非翻
訳領域に位置しているが、これらの配列もまたＴＡＴＡ
様配列を従えている点は興味深い。これらの領域がプロ
モーターとして機能し得る、ということを示す事実は得
られていない。プレＴＧＦ−β遺伝子配列の、終止コド
ンから約５００ヌクレオチド下流には、ヘキサヌクレオ
チドＡＡＴＡＡＡが存在している。通常はポリアデニル
化部位の１１〜３０塩基上流に存在している(３２)この
配列は、それが、ノーザン・ハイブリダイゼーションに
基づいて見積られたプレＴＧＦ−β mＲＮＡの大きさ
と一致していること、並びに、３'非翻訳領域に介在配
列が存在することは稀有である、という理由から、おそ
らくプレＴＧＦ−β mＲＮＡのポリアデニル化シグナ
ルとして機能すると思われる。ベノイスト(Ｂenoist)ら
(４３)は、ＡＡＴＡＡＡと接近し、その下流であって、
ポリＡ−テイル(tail)の直ぐ上流にコンセンサス配列Ｔ
ＴＣＡＣＴＧＣが存在することを提示した。プレＴＧＦ
−βmＲＮＡの３'非翻訳領域内にあるＡＡＴＡＡＡ配列
の下流に、これと同様の配列、ＴＴＣＡＧＧＣＣが存在
していることは、２５３０位がポリアデニル化部位であ
るとする前述の帰属をさらに支持するものである(また
は図２ー４記載の３９０アミノ酸)。
【００１９】プレＴＧＦ−βは３５４アミノ酸からなる
ポリペプチドである(図２ー４)。この配列と既に配列決
定されている成熟ＴＧＦ−βのＮＨ2−末端とを比較す
ると、ＴＧＦ−βがプレＴＧＦ−βのＣ末端の１１２ア
ミノ酸から成っていることが分る。成熟ＴＧＦ−βモノ
マーは、前駆体の、成熟ＴＧＦ−β ＮＨ2−末端の直
ぐ上流にあるＡrg−Ａrgジペプチドの位置で、前駆体か
ら切り離される。同様のタンパク分解的開裂部位は、プ
ロプレエンケファリン(４４,４５)、カルシトニン前駆
体(４６)およびコルチコトロピン−β−リポトロピン前
駆体(４７)等の幾つかの他のポリペプチド前駆体配列に
も見い出されている。カイト(Ｋyte)およびドウーリト
ル(Ｄoolittle)の疎水性決定法(４８)によると、このＡ
rg−Ａrg配列は親水性領域に存在しているので、トリプ
シン様ペプチダーゼに近付き易いと予測される。この前
駆体の翻訳後開裂により、成熟ＴＧＦ−βモノマーが得
られる。プレ配列の処理は不明であるが、別の生物学的
に活性なペプチドを生成させるかもしれない。ＴＧＦ−
β前駆体は、それらもまた翻訳後開裂を受けて別々のポ
リペプチド物質を生成させ得る、数個の塩基性残基対を
含有している(図２ー４)。しかしながら、成熟ＴＧＦ−
βは、開裂されないと思われる２個のＡrg−Ｌysジペプ
チドを含有している。図２ー４に示されている様に、プ
レＴＧＦ−β前駆体は、３箇所のＮ−グリコシル化され
得る部位、Ａsn−Ｘ−ＳerまたはＴhrを含有している
(図２ー４)。これらの内のどれも、成熟ＴＧＦ−β内に
位置していない。従って、糖タンパク質を固定化したレ
クチンに吸着させ、ＴＧＦ−βを吸着されないフラクシ
ョンとして溶出させることにより、糖タンパク質を含ま
ない状態に、成熟ＴＧＦ−βを精製する方法が得られ
る。
ポリペプチドである(図２ー４)。この配列と既に配列決
定されている成熟ＴＧＦ−βのＮＨ2−末端とを比較す
ると、ＴＧＦ−βがプレＴＧＦ−βのＣ末端の１１２ア
ミノ酸から成っていることが分る。成熟ＴＧＦ−βモノ
マーは、前駆体の、成熟ＴＧＦ−β ＮＨ2−末端の直
ぐ上流にあるＡrg−Ａrgジペプチドの位置で、前駆体か
ら切り離される。同様のタンパク分解的開裂部位は、プ
ロプレエンケファリン(４４,４５)、カルシトニン前駆
体(４６)およびコルチコトロピン−β−リポトロピン前
駆体(４７)等の幾つかの他のポリペプチド前駆体配列に
も見い出されている。カイト(Ｋyte)およびドウーリト
ル(Ｄoolittle)の疎水性決定法(４８)によると、このＡ
rg−Ａrg配列は親水性領域に存在しているので、トリプ
シン様ペプチダーゼに近付き易いと予測される。この前
駆体の翻訳後開裂により、成熟ＴＧＦ−βモノマーが得
られる。プレ配列の処理は不明であるが、別の生物学的
に活性なペプチドを生成させるかもしれない。ＴＧＦ−
β前駆体は、それらもまた翻訳後開裂を受けて別々のポ
リペプチド物質を生成させ得る、数個の塩基性残基対を
含有している(図２ー４)。しかしながら、成熟ＴＧＦ−
βは、開裂されないと思われる２個のＡrg−Ｌysジペプ
チドを含有している。図２ー４に示されている様に、プ
レＴＧＦ−β前駆体は、３箇所のＮ−グリコシル化され
得る部位、Ａsn−Ｘ−ＳerまたはＴhrを含有している
(図２ー４)。これらの内のどれも、成熟ＴＧＦ−β内に
位置していない。従って、糖タンパク質を固定化したレ
クチンに吸着させ、ＴＧＦ−βを吸着されないフラクシ
ョンとして溶出させることにより、糖タンパク質を含ま
ない状態に、成熟ＴＧＦ−βを精製する方法が得られ
る。
【００２０】ヒトＴＧＦ−βの配列は、直接的なアミノ
酸配列決定と、ＴＧＦ−β cＤＮＡからの演繹によ
り、決定された。クロストリパン(clostripain)消化で
得られた異なるＴＧＦ−βペプチドの配列は、僅かな残
基を除いてcＤＮＡ配列と一致していた。これは、多
分、配列決定時におけるアミノ酸の帰属が間違っていた
ことによると思われる。１１２アミノ酸ＴＧＦ−β配列
は９個のシステインを含有しているが、前駆体の残余部
分は、２個しか含有していない(図２ー４)。以前の研究
によると、２５kdのＴＧＦ−β二量体を還元すると１
２.５kdの２本のポリペプチド鎖が生成することが示さ
れた(１５)。ＴＧＦ−βアミノ末端とクロストリパン消
化の後に得られたＴＧＦ−βペプチドとの配列決定の結
果は、ＴＧＦ−β二量体が２本の同一のポリペプチドか
らなっていることを強く示唆している。このホモ二量体
性は、ヒトゲノムＤＮＡをＴＧＦ−βエクソンプローブ
を用いたサザーン・ハイブリダイゼーションに付した
時、ハイブリダイズするcＤＮＡフラグメントは一本で
あるということによっても支持される。二次構造のチョ
ウ−ファスマン(Ｃhou−Ｆasman)分析(５０)により、Ｔ
ＧＦ−βポリペプチドは、広範なβ−シート構造を有し
ており、α−ヘリックス構造は、あっても極く僅かであ
ることが分った。塩基性のジペプチド開裂部位の直ぐ上
流の領域は、α−ヘリックス立体配座をとっている様に
思われる。
酸配列決定と、ＴＧＦ−β cＤＮＡからの演繹によ
り、決定された。クロストリパン(clostripain)消化で
得られた異なるＴＧＦ−βペプチドの配列は、僅かな残
基を除いてcＤＮＡ配列と一致していた。これは、多
分、配列決定時におけるアミノ酸の帰属が間違っていた
ことによると思われる。１１２アミノ酸ＴＧＦ−β配列
は９個のシステインを含有しているが、前駆体の残余部
分は、２個しか含有していない(図２ー４)。以前の研究
によると、２５kdのＴＧＦ−β二量体を還元すると１
２.５kdの２本のポリペプチド鎖が生成することが示さ
れた(１５)。ＴＧＦ−βアミノ末端とクロストリパン消
化の後に得られたＴＧＦ−βペプチドとの配列決定の結
果は、ＴＧＦ−β二量体が２本の同一のポリペプチドか
らなっていることを強く示唆している。このホモ二量体
性は、ヒトゲノムＤＮＡをＴＧＦ−βエクソンプローブ
を用いたサザーン・ハイブリダイゼーションに付した
時、ハイブリダイズするcＤＮＡフラグメントは一本で
あるということによっても支持される。二次構造のチョ
ウ−ファスマン(Ｃhou−Ｆasman)分析(５０)により、Ｔ
ＧＦ−βポリペプチドは、広範なβ−シート構造を有し
ており、α−ヘリックス構造は、あっても極く僅かであ
ることが分った。塩基性のジペプチド開裂部位の直ぐ上
流の領域は、α−ヘリックス立体配座をとっている様に
思われる。
【００２１】ＴＧＦ−β前駆体の著しい特徴は、普通、
大多数の分泌タンパク質が含有しているＮＨ2−末端シ
グナルペプチド配列が認められないことである。ＴＧＦ
−βが細胞外媒質に現れる機構は不明であるが、成熟Ｔ
ＧＦ−βはまた、通常、げつ歯類細胞またはヒト細胞に
伴なって見い出されているのでその機構は、比較的非効
率的なものと思われる。ＴＧＦ−βが血小板の内部に貯
えられる機構も理解されていない。最近、インターロイ
キン−１をコードしているcＤＮＡ(５１,５２)および腫
瘍壊死因子をコードしているcＤＮＡ(５３)が決定され
た。これらはいずれも細胞外媒質に現われるが、これら
はいずれも典型的なＮＨ2−末端シグナルペプチドを含
有していない。ＴＧＦ−βの細胞外媒質への放出におい
て可能な機構は、細胞質内にＮＨ2−末端を、ＴＧＦ−
β配列を外側に出して膜に固定され、そこから前駆体が
開裂されることである。唯１回だけ膜を横切るタンパク
質の多くは、電荷を持たない、大部分が疎水性の２０〜
２３残基から成る膜透過領域を有する。唯一の例外はＴ
−細胞受容体のＴ３サブユニットであり(５４)、これ
は、膜透過領域内にＡsp残基を有している。ＴＧＦ−β
前駆体の推定のアミノ酸配列から、同じ様な疎水性領域
を予測することができないことから、このタンパク質が
唯１個しか膜透過領域を持っていないとは考えられな
い。
大多数の分泌タンパク質が含有しているＮＨ2−末端シ
グナルペプチド配列が認められないことである。ＴＧＦ
−βが細胞外媒質に現れる機構は不明であるが、成熟Ｔ
ＧＦ−βはまた、通常、げつ歯類細胞またはヒト細胞に
伴なって見い出されているのでその機構は、比較的非効
率的なものと思われる。ＴＧＦ−βが血小板の内部に貯
えられる機構も理解されていない。最近、インターロイ
キン−１をコードしているcＤＮＡ(５１,５２)および腫
瘍壊死因子をコードしているcＤＮＡ(５３)が決定され
た。これらはいずれも細胞外媒質に現われるが、これら
はいずれも典型的なＮＨ2−末端シグナルペプチドを含
有していない。ＴＧＦ−βの細胞外媒質への放出におい
て可能な機構は、細胞質内にＮＨ2−末端を、ＴＧＦ−
β配列を外側に出して膜に固定され、そこから前駆体が
開裂されることである。唯１回だけ膜を横切るタンパク
質の多くは、電荷を持たない、大部分が疎水性の２０〜
２３残基から成る膜透過領域を有する。唯一の例外はＴ
−細胞受容体のＴ３サブユニットであり(５４)、これ
は、膜透過領域内にＡsp残基を有している。ＴＧＦ−β
前駆体の推定のアミノ酸配列から、同じ様な疎水性領域
を予測することができないことから、このタンパク質が
唯１個しか膜透過領域を持っていないとは考えられな
い。
【００２２】他方、ＴＧＦ−β前駆体が数個の膜透過領
域を有するタンパク質であるということは納得できるこ
とである。その様なタンパク質として、例えば、ロドプ
シン(rhodopsin)(５５)、電気ウナギのナトリウム・チ
ャンネル・タンパク質(５６)およびレンズ・キャップ結
合部位の主要内因性タンパク質(５７)がある。これら
は、そのＮＨ2−末端を細胞質内に置くと共に、数個の
電荷を帯びた残基を含んだ、複数の膜透過領域を含有し
ている。これらの電荷の内、いくらかは、膜透過領域の
近辺に存在している反対の電荷を帯びた残基と物理的に
近接しているために、中和されている可能性がある。大
多数の場合、膜透過領域は電荷を帯びた残基で両側を囲
まれており、正の電荷が細胞質内に、負の電荷が細胞外
に存在していることが多い。これらの特徴をＴＧＦ−β
配列と比べると、該配列は、幾つかの可能な膜透過領域
を有する上、数個の電荷を持った残基群を含んでいるの
で、ＴＧＦ−β前駆体はこのクラスの膜透過タンパク質
に属する可能性がある。正電荷を帯びた残基に富むＮＨ
2末端の２１アミノ酸は、第１番目の膜透過領域(おそら
く残基５９〜８０の間に存在するであろう)の、細胞質
内側に配される領域であろう。この領域の直ぐ下流に、
細胞外に配される２個のＡrg残基と、５個のまとまっ
た、負電荷を帯びたグルタミン酸残基(アミノ酸９１〜
１００)が続いている。第２の膜透過領域は、残基１２
７〜１５１の間に存在し、細胞質内側に位置する塩基性
残基群(アミノ酸１５６〜１６５)の上流にある。第３の
膜透過に係る領域は、第２４５位のＡrg−Ａrgジペプチ
ドの下流に位置する残基２４８〜２７０の間に存在して
いる。後者の領域は２個の正電荷を帯びた残基を含有し
ており、これらは、第１または第２の膜透過領域存在し
ている２個の負電荷を帯びた残基を中和するかもしれな
い。この様な立体配置をとっているので、ＴＧＦ−βポ
リペプチドおよびその上流のＡrg−Ａrg残基は膜の外側
に位置することになる。このために、細胞膜の外側の位
置で二塩基性ペプチダーゼによって開裂される(５８,５
９)ことが可能となり、細胞外環境にＴＧＦ−βが分泌
されることになる。このＴＧＦ−β前駆体の仮定的な構
造は、ヒトロドブシン(５５)およびレンズ線維(ファイ
バー)膜の主要内因性タンパク質(５７)と同様に、その
グリコシル化され得る部位の全てに炭水化物部分が存在
している訳ではないことを暗示している。前記のモデル
は仮説であることを認識し、本発明の範囲を制限するも
のと解釈すべきでない。
域を有するタンパク質であるということは納得できるこ
とである。その様なタンパク質として、例えば、ロドプ
シン(rhodopsin)(５５)、電気ウナギのナトリウム・チ
ャンネル・タンパク質(５６)およびレンズ・キャップ結
合部位の主要内因性タンパク質(５７)がある。これら
は、そのＮＨ2−末端を細胞質内に置くと共に、数個の
電荷を帯びた残基を含んだ、複数の膜透過領域を含有し
ている。これらの電荷の内、いくらかは、膜透過領域の
近辺に存在している反対の電荷を帯びた残基と物理的に
近接しているために、中和されている可能性がある。大
多数の場合、膜透過領域は電荷を帯びた残基で両側を囲
まれており、正の電荷が細胞質内に、負の電荷が細胞外
に存在していることが多い。これらの特徴をＴＧＦ−β
配列と比べると、該配列は、幾つかの可能な膜透過領域
を有する上、数個の電荷を持った残基群を含んでいるの
で、ＴＧＦ−β前駆体はこのクラスの膜透過タンパク質
に属する可能性がある。正電荷を帯びた残基に富むＮＨ
2末端の２１アミノ酸は、第１番目の膜透過領域(おそら
く残基５９〜８０の間に存在するであろう)の、細胞質
内側に配される領域であろう。この領域の直ぐ下流に、
細胞外に配される２個のＡrg残基と、５個のまとまっ
た、負電荷を帯びたグルタミン酸残基(アミノ酸９１〜
１００)が続いている。第２の膜透過領域は、残基１２
７〜１５１の間に存在し、細胞質内側に位置する塩基性
残基群(アミノ酸１５６〜１６５)の上流にある。第３の
膜透過に係る領域は、第２４５位のＡrg−Ａrgジペプチ
ドの下流に位置する残基２４８〜２７０の間に存在して
いる。後者の領域は２個の正電荷を帯びた残基を含有し
ており、これらは、第１または第２の膜透過領域存在し
ている２個の負電荷を帯びた残基を中和するかもしれな
い。この様な立体配置をとっているので、ＴＧＦ−βポ
リペプチドおよびその上流のＡrg−Ａrg残基は膜の外側
に位置することになる。このために、細胞膜の外側の位
置で二塩基性ペプチダーゼによって開裂される(５８,５
９)ことが可能となり、細胞外環境にＴＧＦ−βが分泌
されることになる。このＴＧＦ−β前駆体の仮定的な構
造は、ヒトロドブシン(５５)およびレンズ線維(ファイ
バー)膜の主要内因性タンパク質(５７)と同様に、その
グリコシル化され得る部位の全てに炭水化物部分が存在
している訳ではないことを暗示している。前記のモデル
は仮説であることを認識し、本発明の範囲を制限するも
のと解釈すべきでない。
【００２３】本明細書では、プレＴＧＦ−βとは、図１
−４に示したＴＧＦ−β前駆体と同様に、通常、ＴＧＦ
−βに伴なっていないプレ配列を有する、別のＴＧＦ−
β前駆体をも包含するものとする。後者の形は、成熟Ｔ
ＧＦ−βをコードしているＤＮＡの挿入形突然変異体と
考えられる。これらの突然変異体は、成熟ＴＧＦ−βと
の融合物の形で、ＴＧＦ−βにとってヘテロローガスな
プレ配列を含有している。ヘテロローガスなプレ配列
は、例えば、プレ成長ホルモン、プレプロインシュリ
ン、ウイルス性エンベロープタンパク質、インターフエ
ロン、および哺乳類宿主細胞によって認識され得る酵母
または細菌性プレ配列等の他の分泌タンパク質から得る
ことができる。これらの分泌リーダーの配列は知られて
おり、該ＤＮＡのインビトロでの合成を目的としない場
合には、それをコードしているＤＮＡの好適な供給源で
ある。所望のシグナルを含むＤＮＡとプレＴＧＦ−βＤ
ＮＡとを制限酵素消化に付すことにより、上記の配列
を、成熟ＴＧＦ−βをコードしているＤＮＡに結合させ
る。単一の制限部位を導入する目的で合成オリゴヌクレ
オチド(リンカー類)を合成し、さらに、プレ配列および
成熟ＴＧＦ−β暗号領域を完成させる上で必要ならば、
制限酵素消化の間にＤＮＡフラグメントを除去する。次
いで合成リンカーおよび／またはフラグメントを代替の
シグナルとＴＧＦ−βの暗号領域とを含有する制限酵素
消化フラグメントにライゲート（結合）し、これをクロ
ーニングベクターに挿入し、得られたベクターを用いて
宿主細胞を形成転換する。その後、発現ベクターに突然
変異プレ配列をクローンし、これを用いて宿主細胞を形
質転換する。以後の実施例ではウイルス性エンベロープ
タンパク質プレ配列に関して例示的に述べる。ヘテロロ
ーガスプレ配列は、その完全なものをＴＧＦ−β ＤＮ
Ａの最初のコドンに結合させることが好ましいが、成熟
ＴＧＦ−βの暗号配列と、ヘテロローガスなプレ配列そ
のものに短い部分、例えばヘテロローガスな成熟タンパ
ク質をコードしているＤＮＡ起源の２１〜４５塩基対部
分とが結合したものも本発明の範囲内に含まれる。この
組立ての目的は、プレＴＧＦ−βの仮定の分泌系を高い
効率の分泌系で置き換えることにある。しかしながらそ
れは、必ずしもＴＧＦ−βを組換え培養内に生産させる
様に分泌させることを意味しない。その他の欠失−挿入
突然変異体には、ＴＧＦ−β種と、細胞内的に大量に発
現されるウイルス性タンパク質(例えばレトロウイルス
・コアタンパク質、ＳＶ４０からのラージＴ抗原等)、
あるいは免疫原性の細菌性タンパク質またはポリペプチ
ド(例えば化学走性ポリペプチド、とりわけ潜在的化学
走性トリペプチド、Ｍet−Ｌeu−Ｐhe)が含まれる。
−４に示したＴＧＦ−β前駆体と同様に、通常、ＴＧＦ
−βに伴なっていないプレ配列を有する、別のＴＧＦ−
β前駆体をも包含するものとする。後者の形は、成熟Ｔ
ＧＦ−βをコードしているＤＮＡの挿入形突然変異体と
考えられる。これらの突然変異体は、成熟ＴＧＦ−βと
の融合物の形で、ＴＧＦ−βにとってヘテロローガスな
プレ配列を含有している。ヘテロローガスなプレ配列
は、例えば、プレ成長ホルモン、プレプロインシュリ
ン、ウイルス性エンベロープタンパク質、インターフエ
ロン、および哺乳類宿主細胞によって認識され得る酵母
または細菌性プレ配列等の他の分泌タンパク質から得る
ことができる。これらの分泌リーダーの配列は知られて
おり、該ＤＮＡのインビトロでの合成を目的としない場
合には、それをコードしているＤＮＡの好適な供給源で
ある。所望のシグナルを含むＤＮＡとプレＴＧＦ−βＤ
ＮＡとを制限酵素消化に付すことにより、上記の配列
を、成熟ＴＧＦ−βをコードしているＤＮＡに結合させ
る。単一の制限部位を導入する目的で合成オリゴヌクレ
オチド(リンカー類)を合成し、さらに、プレ配列および
成熟ＴＧＦ−β暗号領域を完成させる上で必要ならば、
制限酵素消化の間にＤＮＡフラグメントを除去する。次
いで合成リンカーおよび／またはフラグメントを代替の
シグナルとＴＧＦ−βの暗号領域とを含有する制限酵素
消化フラグメントにライゲート（結合）し、これをクロ
ーニングベクターに挿入し、得られたベクターを用いて
宿主細胞を形成転換する。その後、発現ベクターに突然
変異プレ配列をクローンし、これを用いて宿主細胞を形
質転換する。以後の実施例ではウイルス性エンベロープ
タンパク質プレ配列に関して例示的に述べる。ヘテロロ
ーガスプレ配列は、その完全なものをＴＧＦ−β ＤＮ
Ａの最初のコドンに結合させることが好ましいが、成熟
ＴＧＦ−βの暗号配列と、ヘテロローガスなプレ配列そ
のものに短い部分、例えばヘテロローガスな成熟タンパ
ク質をコードしているＤＮＡ起源の２１〜４５塩基対部
分とが結合したものも本発明の範囲内に含まれる。この
組立ての目的は、プレＴＧＦ−βの仮定の分泌系を高い
効率の分泌系で置き換えることにある。しかしながらそ
れは、必ずしもＴＧＦ−βを組換え培養内に生産させる
様に分泌させることを意味しない。その他の欠失−挿入
突然変異体には、ＴＧＦ−β種と、細胞内的に大量に発
現されるウイルス性タンパク質(例えばレトロウイルス
・コアタンパク質、ＳＶ４０からのラージＴ抗原等)、
あるいは免疫原性の細菌性タンパク質またはポリペプチ
ド(例えば化学走性ポリペプチド、とりわけ潜在的化学
走性トリペプチド、Ｍet−Ｌeu−Ｐhe)が含まれる。
【００２４】発現された突然変異プレＴＧＦ−β、成熟
ＴＧＦ−βまたはそのフラグメントは、挿入、欠失およ
び置換の数および範囲の増加に伴なって、図２ー４の配
列から次第にかけ離れたアミノ酸配列をとる。この離脱
(ずれ)は、プレＴＧＦ−βと突然変異体との間のホモロ
ジイ(同質性)の減少で測ることができる。ＴＧＦ−β
の、固定依存性増殖−促進作用に係る生物活性を示すタ
ンパク質またはポリペプチドはすべて、それらと図２ー
４のタンパク質との配列上のホモロジイの程度に関係な
く、本発明の範囲内に包含される。これは、プレＴＧＦ
−βのある領域(例えばプレ配列)は突然変異され易く、
あるいは成熟ＴＧＦ−βの場合の如く完全に欠失さえさ
れてしまうが、上記の生物活性は保持される、というこ
とが理由である。他方、成熟ＴＧＦ−β分子内の９個の
システイン残基(およびそれに付随したジスルフィド結
合)の欠失は、上記の生物活性に対して実質上、逆効果
を及ぼし、あらゆる生物活性を失なわせてしまうようで
ある。また、置換突然変異体は、機能が類似しているア
ミノ酸側鎖を含む残基により置換されている場合には、
完全なＴＧＦ−β成長促進作用を現わすが、左程ホモロ
ーガス性を持たない。機能が類似しているということ
は、側鎖の主な性質、例えば疎水性、塩基性、中性また
は酸性等の性質、あるいは立体障害の有無に関する性質
に関している。即ち、特定のポリペプチドが有するプレ
ＴＧＦ−βとのホモロジイの程度は、それをＴＧＦ−β
と同定する上での基本的な目安ではない。しかしなが
ら、一般的な指針としては、天然起源のＴＧＦ−βの生
物学的活性を幾らかを共有しているタンパク質またはポ
リペプチドであって、図２−４の配列と実質上ホモロー
ガスである(例えばプレＴＧＦ−βまたは、そのフラグ
メントであって約２０残基以上のフラグメントと約４０
〜１００％以上のホモローガス性を示すこと)ものはＴ
ＧＦ−βという名称で表わされる。新生細胞の増殖阻害
作用に関して、ＴＧＦ−βは、これまでその様な増殖阻
害作用を表すことが知られているポリペプチド、例えば
インターフェロン、腫瘍壊死因子およびリンホトキシン
を除外したポリペプチドであるが、それ以外であれば、
必ずしも図２−４の配列とホモローガスな領域を持って
いることを要求されない。
ＴＧＦ−βまたはそのフラグメントは、挿入、欠失およ
び置換の数および範囲の増加に伴なって、図２ー４の配
列から次第にかけ離れたアミノ酸配列をとる。この離脱
(ずれ)は、プレＴＧＦ−βと突然変異体との間のホモロ
ジイ(同質性)の減少で測ることができる。ＴＧＦ−β
の、固定依存性増殖−促進作用に係る生物活性を示すタ
ンパク質またはポリペプチドはすべて、それらと図２ー
４のタンパク質との配列上のホモロジイの程度に関係な
く、本発明の範囲内に包含される。これは、プレＴＧＦ
−βのある領域(例えばプレ配列)は突然変異され易く、
あるいは成熟ＴＧＦ−βの場合の如く完全に欠失さえさ
れてしまうが、上記の生物活性は保持される、というこ
とが理由である。他方、成熟ＴＧＦ−β分子内の９個の
システイン残基(およびそれに付随したジスルフィド結
合)の欠失は、上記の生物活性に対して実質上、逆効果
を及ぼし、あらゆる生物活性を失なわせてしまうようで
ある。また、置換突然変異体は、機能が類似しているア
ミノ酸側鎖を含む残基により置換されている場合には、
完全なＴＧＦ−β成長促進作用を現わすが、左程ホモロ
ーガス性を持たない。機能が類似しているということ
は、側鎖の主な性質、例えば疎水性、塩基性、中性また
は酸性等の性質、あるいは立体障害の有無に関する性質
に関している。即ち、特定のポリペプチドが有するプレ
ＴＧＦ−βとのホモロジイの程度は、それをＴＧＦ−β
と同定する上での基本的な目安ではない。しかしなが
ら、一般的な指針としては、天然起源のＴＧＦ−βの生
物学的活性を幾らかを共有しているタンパク質またはポ
リペプチドであって、図２−４の配列と実質上ホモロー
ガスである(例えばプレＴＧＦ−βまたは、そのフラグ
メントであって約２０残基以上のフラグメントと約４０
〜１００％以上のホモローガス性を示すこと)ものはＴ
ＧＦ−βという名称で表わされる。新生細胞の増殖阻害
作用に関して、ＴＧＦ−βは、これまでその様な増殖阻
害作用を表すことが知られているポリペプチド、例えば
インターフェロン、腫瘍壊死因子およびリンホトキシン
を除外したポリペプチドであるが、それ以外であれば、
必ずしも図２−４の配列とホモローガスな領域を持って
いることを要求されない。
【００２５】あるポリペプチドがＴＧＦ−βであると同
定する上で、より細かく詳しいファクターは、(a)成熟
ＴＧＦ−βの増殖阻害活性あるいは固定依存性増殖促進
活性を中和する抗血清によって、問題のポリペプチドの
活性も中和される、(b)候補ポリペプチドがＴＧＦ−β
細胞表面受容体を、ＴＧＦ−βと競合し得る、という点
にある。しかしながら、免疫学的な同一性と増殖促進活
性に関する同一性とは、必ずしも同じ範囲内であること
を必要としない。図２−４の成熟ＴＧＦ−βの中和抗体
は、それが成熟ＴＧＦ−βの増殖促進活性にとって臨界
的な部位に特異的に結合することを目的として生じたも
のでないので、候補タンパク質と結合しないかもしれな
い。むしろ、この抗体は無害な領域に結合し、その中和
効果を立体障害によって表しているのかもしれない。従
って、その無害な領域で突然変異を生じた候補タンパク
質は中和抗体と結合しないが、それにもかかわらず、こ
のタンパク質は実質的なホモロジーおよび生物学的活性
の意味においてＴＧＦ−βの定義範囲内に含まれること
になる。
定する上で、より細かく詳しいファクターは、(a)成熟
ＴＧＦ−βの増殖阻害活性あるいは固定依存性増殖促進
活性を中和する抗血清によって、問題のポリペプチドの
活性も中和される、(b)候補ポリペプチドがＴＧＦ−β
細胞表面受容体を、ＴＧＦ−βと競合し得る、という点
にある。しかしながら、免疫学的な同一性と増殖促進活
性に関する同一性とは、必ずしも同じ範囲内であること
を必要としない。図２−４の成熟ＴＧＦ−βの中和抗体
は、それが成熟ＴＧＦ−βの増殖促進活性にとって臨界
的な部位に特異的に結合することを目的として生じたも
のでないので、候補タンパク質と結合しないかもしれな
い。むしろ、この抗体は無害な領域に結合し、その中和
効果を立体障害によって表しているのかもしれない。従
って、その無害な領域で突然変異を生じた候補タンパク
質は中和抗体と結合しないが、それにもかかわらず、こ
のタンパク質は実質的なホモロジーおよび生物学的活性
の意味においてＴＧＦ−βの定義範囲内に含まれること
になる。
【００２６】胎盤または血小板から得られた第２−４図
記載の天然または野生型成熟ＴＧＦ−βの特性、例えば
分子量等は、天然種のＴＧＦ−βに関してのみ記載され
ているということを認識しておく必要がある。本明細書
に示した突然変異体の性質は天然のＴＧＦ−βとかなり
異なっていることが予測され、このことが、実際、本発
明の突然変異誘発の目的であることは、以下に詳しく述
べている通りである。本明細書の定義に従えばＴＧＦ−
βは天然のＴＧＦ−βをも包含するが、他の関連する、
生物学的に活性なポリペプチドも定義内に含まれる。挿
入突然変異体、欠失突然変異体、または融合タンパク質
等の上記のＴＧＦ−β種は天然のＴＧＦ−βについて求
められた分子量と異る分子量を有することになろう。例
えば、成熟ＴＧＦ−βまたはプレＴＧＦ−βそのものと
の融合物の分子量は天然の成熟ＴＧＦ−αの分子量より
大きく、成熟ＴＧＦ−βの欠失突然変異体の分子量はよ
り小さくなる。同様に、ＴＧＦ−βを処理してグリコシ
ル化部位を導入してグリコシル化されたＴＧＦ−βを得
るか、あるいは、生物学的に活性に臨界的でない部位の
システインをセリンで置換する。最後に、霊長類以外の
哺乳類から得たセルライン中のヒトプレＴＧＦ−βの翻
訳後プロセッシングによって成熟ＴＧＦ−βのアミノ末
端領域中に微小の異質性を導入し、アミノ末端アミノ酸
をアラニンでない様にする。
記載の天然または野生型成熟ＴＧＦ−βの特性、例えば
分子量等は、天然種のＴＧＦ−βに関してのみ記載され
ているということを認識しておく必要がある。本明細書
に示した突然変異体の性質は天然のＴＧＦ−βとかなり
異なっていることが予測され、このことが、実際、本発
明の突然変異誘発の目的であることは、以下に詳しく述
べている通りである。本明細書の定義に従えばＴＧＦ−
βは天然のＴＧＦ−βをも包含するが、他の関連する、
生物学的に活性なポリペプチドも定義内に含まれる。挿
入突然変異体、欠失突然変異体、または融合タンパク質
等の上記のＴＧＦ−β種は天然のＴＧＦ−βについて求
められた分子量と異る分子量を有することになろう。例
えば、成熟ＴＧＦ−βまたはプレＴＧＦ−βそのものと
の融合物の分子量は天然の成熟ＴＧＦ−αの分子量より
大きく、成熟ＴＧＦ−βの欠失突然変異体の分子量はよ
り小さくなる。同様に、ＴＧＦ−βを処理してグリコシ
ル化部位を導入してグリコシル化されたＴＧＦ−βを得
るか、あるいは、生物学的に活性に臨界的でない部位の
システインをセリンで置換する。最後に、霊長類以外の
哺乳類から得たセルライン中のヒトプレＴＧＦ−βの翻
訳後プロセッシングによって成熟ＴＧＦ−βのアミノ末
端領域中に微小の異質性を導入し、アミノ末端アミノ酸
をアラニンでない様にする。
【００２７】生物学的な活性に関して固定依存性増殖を
誘導することが“可能(capable)"という語句は、プレＴ
ＧＦ−βまたはフラグメントであって、所望の生物学的
活性を表すポリペプチドフラグメント酵素的に変換され
得るポリペプチドを含むものであることを意味する。通
常、不活性な前駆体は、成熟ＴＧＦ−βのカルボキシ末
端に不溶性またはゼラチン様タンパク質がペプチド結合
を介して結合している融合タンパク質である。このペプ
チド結合領域内の配列は、インビトロでの製造工程の一
部としてインビボで、またはそのままでタンパク分解的
加水分解に対して感受性を有する様、選択する。ＴＧＦ
−βは、通常ヒトＴＧＦ−βを意味するが、上記の生物
学的活性に関する基準と合致する限り、ネズミ、ブタ、
ウマまたはウシの如き供給源から得られたＴＧＦ−βも
ＰＲＴＧＦ−βの定義範囲内に含まれるものである。Ｔ
ＧＦ−βは種特異的でなく、例えば、ネズミＴＧＦ−β
とヒトＴＧＦ−βは、いずれも同じセルラインにおける
固定依存性増殖を有効に誘導する。従って、１つの種に
由来するＴＧＦ−βを他の種の治療に用いることができ
る。他の種のＴＧＦ−βをコードしているＤＮＡは、そ
の様な種から得たcＤＮＡまたはゲノムライブラリイを
標識したヒトプレＴＧＦ−βcＤＮＡでプローブするこ
とにより、得られる。
誘導することが“可能(capable)"という語句は、プレＴ
ＧＦ−βまたはフラグメントであって、所望の生物学的
活性を表すポリペプチドフラグメント酵素的に変換され
得るポリペプチドを含むものであることを意味する。通
常、不活性な前駆体は、成熟ＴＧＦ−βのカルボキシ末
端に不溶性またはゼラチン様タンパク質がペプチド結合
を介して結合している融合タンパク質である。このペプ
チド結合領域内の配列は、インビトロでの製造工程の一
部としてインビボで、またはそのままでタンパク分解的
加水分解に対して感受性を有する様、選択する。ＴＧＦ
−βは、通常ヒトＴＧＦ−βを意味するが、上記の生物
学的活性に関する基準と合致する限り、ネズミ、ブタ、
ウマまたはウシの如き供給源から得られたＴＧＦ−βも
ＰＲＴＧＦ−βの定義範囲内に含まれるものである。Ｔ
ＧＦ−βは種特異的でなく、例えば、ネズミＴＧＦ−β
とヒトＴＧＦ−βは、いずれも同じセルラインにおける
固定依存性増殖を有効に誘導する。従って、１つの種に
由来するＴＧＦ−βを他の種の治療に用いることができ
る。他の種のＴＧＦ−βをコードしているＤＮＡは、そ
の様な種から得たcＤＮＡまたはゲノムライブラリイを
標識したヒトプレＴＧＦ−βcＤＮＡでプローブするこ
とにより、得られる。
【００２８】ＴＧＦ−βの誘導体も本発明の範囲内に含
まれる。誘導体には、グリコシル化されたＴＧＦ−β分
子、並びに他のＴＧＦ−β分子と共有結合または会合に
よる複合物(コンジュゲート)、二量体または非関連の化
学部分が含まれる。共有結合性誘導体は、ＴＧＦ−βの
アミノ酸側鎖に見出される基、またはＮ−あるいはＣ−
末端と、機能的な成分とを当業者既知の方法で結合させ
ることによって調製される。これらの誘導体には、例え
ば以下のものが含まれる:カルボキシ末端、アルキルア
ミンまたはカルボキシ側鎖を含む残基の脂肪族エステル
またはアシルエステル(例えばアスパラギン酸残基にお
けるアルキルアミンのコンジュゲート):ヒドロキシ基−
含有残基のＯ−アシル誘導体およびアミノ末端アミノ酸
またはアミノ基含有残基のＮ−アシル誘導体[例えば、f
Ｍet−Ｌeu−Ｐheまたは免疫原性タンパク質とのコンジ
ュゲート。アシル基誘導体を、アルキル類(Ｃ３〜Ｃ１
０の直鎖アルキルを含む)の基から選択することによ
り、アルカノイル種が生成され、炭素環式または異項環
式化合物を選択することにより、アロイル(aroyl)種が
生成される]。反応性の基は、それ自体が反応性の側鎖
を介して不溶性のマトリックスを形成し、交差結合タン
パク質として用い得る様な二機能性の化合物であること
が好ましい。
まれる。誘導体には、グリコシル化されたＴＧＦ−β分
子、並びに他のＴＧＦ−β分子と共有結合または会合に
よる複合物(コンジュゲート)、二量体または非関連の化
学部分が含まれる。共有結合性誘導体は、ＴＧＦ−βの
アミノ酸側鎖に見出される基、またはＮ−あるいはＣ−
末端と、機能的な成分とを当業者既知の方法で結合させ
ることによって調製される。これらの誘導体には、例え
ば以下のものが含まれる:カルボキシ末端、アルキルア
ミンまたはカルボキシ側鎖を含む残基の脂肪族エステル
またはアシルエステル(例えばアスパラギン酸残基にお
けるアルキルアミンのコンジュゲート):ヒドロキシ基−
含有残基のＯ−アシル誘導体およびアミノ末端アミノ酸
またはアミノ基含有残基のＮ−アシル誘導体[例えば、f
Ｍet−Ｌeu−Ｐheまたは免疫原性タンパク質とのコンジ
ュゲート。アシル基誘導体を、アルキル類(Ｃ３〜Ｃ１
０の直鎖アルキルを含む)の基から選択することによ
り、アルカノイル種が生成され、炭素環式または異項環
式化合物を選択することにより、アロイル(aroyl)種が
生成される]。反応性の基は、それ自体が反応性の側鎖
を介して不溶性のマトリックスを形成し、交差結合タン
パク質として用い得る様な二機能性の化合物であること
が好ましい。
【００２９】共有結合または会合性の誘導体はイムノア
ッセイまたはアフイニテイ精製法における試薬として有
用である。例えば、ＴＧＦ−βは、自体周知の方法で、
臭化シアン−活性化セファロースに共有結合させて不溶
化することにより、またはポレオレフィンの表面に(グ
ルタルアルデヒド交差結合の存在または非存在下で)吸
着させることにより、抗−ＴＧＦ−β抗体または細胞表
面の受容体を分析または精製するのに用いることができ
る。また、ＴＧＦ−βを検出可能な基でラベル(例え
ば、クロラミンＴ法による放射性ヨウ素化、希土類キレ
ートとの共有結合、または他の蛍光物質との共役)し、
診断的な分析法、特に競合型イムノアッセイによる生物
学的試料中のＴＧＦ−βレベルの診断に用いることがで
きる。ＴＧＦ−β突然変異体は、一般に、予め定められ
た、即ち部位特異的な方法で調製される。突然変異誘発
の目的は上記の如きＴＧＦ−β、即ち、生物学的活性を
有するＴＧＦ−βをコードしているＤＮＡを組立てるこ
とにある。突然変異部位は予め定めておくが、突然変異
そのものを予め定めておく必要はない。例えば特定の位
置の残基での突然変異を適切に行うためには、標的コド
ンに無作為な変異誘発を行い、発現されたＴＧＦ−β突
然変異体を、所望の活性についてスクリーニングする。
既知の配列を有するＤＮＡの特定の部位で置換突然変異
を誘発する方法はよく知られている(例、Ｍ１３プライ
マー突然変異誘発法)。
ッセイまたはアフイニテイ精製法における試薬として有
用である。例えば、ＴＧＦ−βは、自体周知の方法で、
臭化シアン−活性化セファロースに共有結合させて不溶
化することにより、またはポレオレフィンの表面に(グ
ルタルアルデヒド交差結合の存在または非存在下で)吸
着させることにより、抗−ＴＧＦ−β抗体または細胞表
面の受容体を分析または精製するのに用いることができ
る。また、ＴＧＦ−βを検出可能な基でラベル(例え
ば、クロラミンＴ法による放射性ヨウ素化、希土類キレ
ートとの共有結合、または他の蛍光物質との共役)し、
診断的な分析法、特に競合型イムノアッセイによる生物
学的試料中のＴＧＦ−βレベルの診断に用いることがで
きる。ＴＧＦ−β突然変異体は、一般に、予め定められ
た、即ち部位特異的な方法で調製される。突然変異誘発
の目的は上記の如きＴＧＦ−β、即ち、生物学的活性を
有するＴＧＦ−βをコードしているＤＮＡを組立てるこ
とにある。突然変異部位は予め定めておくが、突然変異
そのものを予め定めておく必要はない。例えば特定の位
置の残基での突然変異を適切に行うためには、標的コド
ンに無作為な変異誘発を行い、発現されたＴＧＦ−β突
然変異体を、所望の活性についてスクリーニングする。
既知の配列を有するＤＮＡの特定の部位で置換突然変異
を誘発する方法はよく知られている(例、Ｍ１３プライ
マー突然変異誘発法)。
【００３０】ＴＧＦ−βの突然変異誘発には、通常、ア
ミノ酸残基約１〜５程度の挿入、または約１〜１０残基
の欠失が含まれる。置換、欠失、挿入、またはそれらの
併用、等を組合わせて最終的な組立てを行う。前述の如
く、挿入には、アミノ末端またはカルボキシ末端の融合
(例えば、疎水性タンパク質や免疫原タンパク質との融
合)も含まれる。その様な突然変異をコードしているＤ
ＮＡ内における突然変異は、暗号配列を発現ベクター内
のリーデイングフレームの外に位置せしめ、生物学的活
性を持たないＴＧＦ−βを与えるようなものであっては
ならない。また、その突然変異は、転写−抑制性のmＲ
ＮＡの二次構造を形成させる可能性のある相補領域を作
らないことが好ましい。ＴＧＦ−βをコードしているＤ
ＮＡは、化学合成、胎盤細胞または他の細胞から得たm
ＲＮＡの逆転写物のスクリーニング、あるいは真核細胞
から得たゲリムライブラリイのスクリーニングによって
得ることができる。このＤＮＡは、それに用いられてい
るコドンを宿主細胞が認識し得る限り、第２−４図に示
したコドンを用いていなくとも良い。この様なＤＮＡ類
は、第２−４図のＤＮＡとして、インビトロで容易に製
造される。本発明においては、核酸、ＲＮＡまたはＤＮ
Ａのいずれかであって、それらは本明細書で定義したＴ
ＧＦ−βをコードしていないが、その様なＤＮＡまたは
ＲＮＡとハイブリダイズし得る核酸もまた有用である。
コードしてはいないが、ハイブリダイズし得る核酸は、
ＴＧＦ−βの組換え合成に用いられることはないが、被
験細胞中のＴＧＦ−βmＲＮＡまたはゲノムＤＮＡの診
断分析に用いられる標識プローブの調製のための中間体
として有用である。
ミノ酸残基約１〜５程度の挿入、または約１〜１０残基
の欠失が含まれる。置換、欠失、挿入、またはそれらの
併用、等を組合わせて最終的な組立てを行う。前述の如
く、挿入には、アミノ末端またはカルボキシ末端の融合
(例えば、疎水性タンパク質や免疫原タンパク質との融
合)も含まれる。その様な突然変異をコードしているＤ
ＮＡ内における突然変異は、暗号配列を発現ベクター内
のリーデイングフレームの外に位置せしめ、生物学的活
性を持たないＴＧＦ−βを与えるようなものであっては
ならない。また、その突然変異は、転写−抑制性のmＲ
ＮＡの二次構造を形成させる可能性のある相補領域を作
らないことが好ましい。ＴＧＦ−βをコードしているＤ
ＮＡは、化学合成、胎盤細胞または他の細胞から得たm
ＲＮＡの逆転写物のスクリーニング、あるいは真核細胞
から得たゲリムライブラリイのスクリーニングによって
得ることができる。このＤＮＡは、それに用いられてい
るコドンを宿主細胞が認識し得る限り、第２−４図に示
したコドンを用いていなくとも良い。この様なＤＮＡ類
は、第２−４図のＤＮＡとして、インビトロで容易に製
造される。本発明においては、核酸、ＲＮＡまたはＤＮ
Ａのいずれかであって、それらは本明細書で定義したＴ
ＧＦ−βをコードしていないが、その様なＤＮＡまたは
ＲＮＡとハイブリダイズし得る核酸もまた有用である。
コードしてはいないが、ハイブリダイズし得る核酸は、
ＴＧＦ−βの組換え合成に用いられることはないが、被
験細胞中のＴＧＦ−βmＲＮＡまたはゲノムＤＮＡの診
断分析に用いられる標識プローブの調製のための中間体
として有用である。
【００３１】診断用核酸は、蛍光性の基、放射活性原
子、または化学発光性の基等の検出可能な物質により、
自体既知の方法で共有結合的に標識される。次いで、こ
のものを、通常のサザーンまたノーザンハイブリダイゼ
ーション分析(アッセイ)に用いる。その様な分析法は、
以下の実施例に述べる如く、ＴＧＦ−βベクターや形質
転換体を同定するために、または、ミトゲン活性の測定
による組織試料中のＴＧＦ−βmＲＮＡの検出の如く、
インビトロでの診断に利用される。本明細書では、ＴＧ
Ｆ−βは、ＴＧＦ−βをコードしているＤＮＡを含むベ
クターで形質転換された宿主細胞内で合成される。ベク
ターは複製可能な核酸組立て物である。ＴＧＦ−βをコ
ードしているＤＮＡの増幅および／または発現のため、
あるいはＴＧＦ−βをコードしているＤＮＡまたはＲＮ
ＡとハイブリダイズするＤＮＡの増幅のために、ベクタ
ーを利用する。発現ベクターは、ＴＧＦ−βをコードし
ているＤＮＡと、そのＴＧＦ−βの適当な宿主内での発
現に影響を及ぼし得る適当なコントロール配列とが機能
的に(操作可能に)結合した複製可能なＤＮＡ組立て物で
ある。その様なコントロール配列には、転写プロモータ
ー、転写をコントロールするための任意のオペレーター
配列、適切なmＲＮＡリボゾーム結合部位をコードして
いる配列、および転写および翻訳の終止をコントロール
するための配列が含まれる。真核細胞内でのＴＧＦ−β
の発現のためのベクターは、選択遺伝子をコードしてい
るＤＮＡをも含有していなければならない。しかしなが
ら、この選択遺伝子は同時形質転換において、結合して
いないプラスミドから供給されるものであっても良い。
子、または化学発光性の基等の検出可能な物質により、
自体既知の方法で共有結合的に標識される。次いで、こ
のものを、通常のサザーンまたノーザンハイブリダイゼ
ーション分析(アッセイ)に用いる。その様な分析法は、
以下の実施例に述べる如く、ＴＧＦ−βベクターや形質
転換体を同定するために、または、ミトゲン活性の測定
による組織試料中のＴＧＦ−βmＲＮＡの検出の如く、
インビトロでの診断に利用される。本明細書では、ＴＧ
Ｆ−βは、ＴＧＦ−βをコードしているＤＮＡを含むベ
クターで形質転換された宿主細胞内で合成される。ベク
ターは複製可能な核酸組立て物である。ＴＧＦ−βをコ
ードしているＤＮＡの増幅および／または発現のため、
あるいはＴＧＦ−βをコードしているＤＮＡまたはＲＮ
ＡとハイブリダイズするＤＮＡの増幅のために、ベクタ
ーを利用する。発現ベクターは、ＴＧＦ−βをコードし
ているＤＮＡと、そのＴＧＦ−βの適当な宿主内での発
現に影響を及ぼし得る適当なコントロール配列とが機能
的に(操作可能に)結合した複製可能なＤＮＡ組立て物で
ある。その様なコントロール配列には、転写プロモータ
ー、転写をコントロールするための任意のオペレーター
配列、適切なmＲＮＡリボゾーム結合部位をコードして
いる配列、および転写および翻訳の終止をコントロール
するための配列が含まれる。真核細胞内でのＴＧＦ−β
の発現のためのベクターは、選択遺伝子をコードしてい
るＤＮＡをも含有していなければならない。しかしなが
ら、この選択遺伝子は同時形質転換において、結合して
いないプラスミドから供給されるものであっても良い。
【００３２】ベクターにはプラスミド、ウィルス(ファ
ージを含む)、および組込み可能なＤＮＡフラグメント
(即ち、組換えによって宿主のゲノム内に組込まれ得る
もの)が含まれる。しかしながら本明細書中では、それ
が細菌細胞にクローンされるが、同時形質転換に際して
は宿主細胞ゲノムに組込まれるという意味において、ベ
クターをプラスミドとして用いる。しかしながら、同等
の機能を有し、当該技術分野で知られており、またはい
ずれ知られるであろう、その他の形のベクターも全て、
本発明方法に用いるのに好適である。好適なベクター
は、発現させようとする宿主と適合し得る種から導かれ
たレプリコンおよびコントロール配列を含んでいる。
ージを含む)、および組込み可能なＤＮＡフラグメント
(即ち、組換えによって宿主のゲノム内に組込まれ得る
もの)が含まれる。しかしながら本明細書中では、それ
が細菌細胞にクローンされるが、同時形質転換に際して
は宿主細胞ゲノムに組込まれるという意味において、ベ
クターをプラスミドとして用いる。しかしながら、同等
の機能を有し、当該技術分野で知られており、またはい
ずれ知られるであろう、その他の形のベクターも全て、
本発明方法に用いるのに好適である。好適なベクター
は、発現させようとする宿主と適合し得る種から導かれ
たレプリコンおよびコントロール配列を含んでいる。
【００３３】ＤＮＡ領域は、それらが、互いに機能的に
関連している場合は、機能的に(操作可能に)結合してい
る。例えば、プレ配列または分泌リーダーのためのＤＮ
Ａは、それがポリペプチドの分泌に与えるプレタンパク
質として発現されるならば、該ポリペプチドに関するＤ
ＮＡと機能的に結合している;プロモーターは、それが
結合している暗号配列の転写をコントロールするもので
あるならば、該配列と機能的に結合している;リボゾー
ム結合部位は、それが結合している暗号配列の翻訳を可
能にする様な位置に存在しているならば、該暗号配列と
機能的に結合している。一般に、機能的に結合してい
る、ということは近接(コンテイギュアス)していること
を意味し、分泌リーダー配列の場合には、近接し、かつ
解読相内にあることを意味する。多核生物からの細胞培
養は、本発明における好ましい宿主細胞である。原則と
して、脊椎動物であるか無脊椎動物であるかに拘らず、
あらゆる高等な真核細胞培養を使用し得る。しかしなが
ら、最近では脊椎動物細胞に大きい関心が寄せられてお
り、培養(組織培養)で脊椎動物細胞を増殖させることは
日常的な操作となっている[テイッシュ・カルチャー(Ｔ
issue Ｃulture)アカデミック・プレス、クルスおよび
パターソン(Ｋrus and Ｐatterson)編(１９７３)]。
有用な宿主セルラインの例には、ＶＥＬＯおよびＨeＬa
細胞、チャイニーズハムスターの卵巣(ＣＨＯ)セルライ
ン、並びにＷ１３８、ＢＨＫ、ＣＯＳ−７およびＭＤＣ
Ｋセルライン等が含まれる。
関連している場合は、機能的に(操作可能に)結合してい
る。例えば、プレ配列または分泌リーダーのためのＤＮ
Ａは、それがポリペプチドの分泌に与えるプレタンパク
質として発現されるならば、該ポリペプチドに関するＤ
ＮＡと機能的に結合している;プロモーターは、それが
結合している暗号配列の転写をコントロールするもので
あるならば、該配列と機能的に結合している;リボゾー
ム結合部位は、それが結合している暗号配列の翻訳を可
能にする様な位置に存在しているならば、該暗号配列と
機能的に結合している。一般に、機能的に結合してい
る、ということは近接(コンテイギュアス)していること
を意味し、分泌リーダー配列の場合には、近接し、かつ
解読相内にあることを意味する。多核生物からの細胞培
養は、本発明における好ましい宿主細胞である。原則と
して、脊椎動物であるか無脊椎動物であるかに拘らず、
あらゆる高等な真核細胞培養を使用し得る。しかしなが
ら、最近では脊椎動物細胞に大きい関心が寄せられてお
り、培養(組織培養)で脊椎動物細胞を増殖させることは
日常的な操作となっている[テイッシュ・カルチャー(Ｔ
issue Ｃulture)アカデミック・プレス、クルスおよび
パターソン(Ｋrus and Ｐatterson)編(１９７３)]。
有用な宿主セルラインの例には、ＶＥＬＯおよびＨeＬa
細胞、チャイニーズハムスターの卵巣(ＣＨＯ)セルライ
ン、並びにＷ１３８、ＢＨＫ、ＣＯＳ−７およびＭＤＣ
Ｋセルライン等が含まれる。
【００３４】多くの真核細胞が内因性ＴＧＦ−βを合成
することが知られている。即ち、多くの宿主細胞として
用いられる細胞は、宿主種のＴＧＦ−βを合成する。従
って、形質転換に用いたＤＮＡの転写、翻訳の結果、生
産されたＴＧＦ−β中には上記の様なＴＧＦ−βも含ま
れることになる。例えば、ＴＧＦ−βで形質転換された
ハムスターのＣＨＯ細胞の場合、この様な細胞から得ら
れたＴＧＦ−βを含有している抽出物中には、上記の如
き物質が存在している。ＴＧＦ−βは、動物とヒトとの
間に交差活性を示すので、この様なことは必ずしも不都
合ではないが、動物性の物質の含有量が可能な限り少量
であるヒトＴＧＦ−βを生産することが望ましい。この
目的は、(a)動物性ＴＧＦ−βの合成量ができるだけ少
い、宿主細胞細胞を選択し、(b)この動物宿主セルライ
ンを、ＴＧＦ−β分泌効率の高いベクター(前述)で形質
転換し、培養培地からヒトＴＧＦ−βを回収する、ある
いは(c)ヒトセルラインを形質転換する(こうすれば、ど
の様な内容性のkＴＧＦ−βも、汚染物質でなく、有用
なものとなる)ことにより、達成される。その様な細胞
のための発現ベクターには、通常複製起点(染色体外で
の増幅のために)およびＴＧＦ−βの暗号配列の上流に
位置しているプロモーターが、リボゾーム結合部位、Ｒ
ＮＡスプライス部位(イントロン含有ＴＧＦ−β−暗号
化ゲノムＤＮＡを用いる場合)、ポリアデニル化部位お
よび転写終止配列と共に含有されている。
することが知られている。即ち、多くの宿主細胞として
用いられる細胞は、宿主種のＴＧＦ−βを合成する。従
って、形質転換に用いたＤＮＡの転写、翻訳の結果、生
産されたＴＧＦ−β中には上記の様なＴＧＦ−βも含ま
れることになる。例えば、ＴＧＦ−βで形質転換された
ハムスターのＣＨＯ細胞の場合、この様な細胞から得ら
れたＴＧＦ−βを含有している抽出物中には、上記の如
き物質が存在している。ＴＧＦ−βは、動物とヒトとの
間に交差活性を示すので、この様なことは必ずしも不都
合ではないが、動物性の物質の含有量が可能な限り少量
であるヒトＴＧＦ−βを生産することが望ましい。この
目的は、(a)動物性ＴＧＦ−βの合成量ができるだけ少
い、宿主細胞細胞を選択し、(b)この動物宿主セルライ
ンを、ＴＧＦ−β分泌効率の高いベクター(前述)で形質
転換し、培養培地からヒトＴＧＦ−βを回収する、ある
いは(c)ヒトセルラインを形質転換する(こうすれば、ど
の様な内容性のkＴＧＦ−βも、汚染物質でなく、有用
なものとなる)ことにより、達成される。その様な細胞
のための発現ベクターには、通常複製起点(染色体外で
の増幅のために)およびＴＧＦ−βの暗号配列の上流に
位置しているプロモーターが、リボゾーム結合部位、Ｒ
ＮＡスプライス部位(イントロン含有ＴＧＦ−β−暗号
化ゲノムＤＮＡを用いる場合)、ポリアデニル化部位お
よび転写終止配列と共に含有されている。
【００３５】脊椎動物細胞の形質転換に使用される発現
ベクターのための転写および翻訳コントロール配列は、
ウィルス起点から供給されることが好ましい。例えば、
普通用いられているプロモーターはポリオーマ、アデノ
ウィルス２、および最も好ましくはシミアンウィルス４
０(ＳＶ４０)から導かれる。ＳＶ４０の初期および後期
プロモーターは、いずれもＳＶ４０ウィルスの複製起点
含有フラグメントとして該ウィルスから容易に得られる
ので特に有用である[ファイヤーズ(Ｆiers)ら、１９７
８、“ネイチャー"２７３:１１３]。ＳＶ４０のより小
さい、またはより大きいフラグメントも、それらがウィ
ルス性複製起点内に位置するＨindＩＩＩ部位からＢgＩ
Ｉ部位に至る約２５０bpの配列を含有している限り用い
ることができる。更に、正常な状態でＴＧＦ−βに伴っ
ているヒトＴＧＦ−βゲノムプロモーター、コントロー
ルおよび／またはシグナル配列も、その様なコントロー
ル配列が宿主細胞系に適合し得ると共に、認識され得る
ことを条件として用いることができる。複製起点は、例
えばＳＶ４０その他のウィルス性起点(例えばポリオー
マ、アデノウィルス、ＶＳＶ、ＢＰＶ等)から導かれる
複製起点等の外来性起点を含む様にベクターを組立てる
ことにより、あるいは宿主細胞の染色体性複製機構によ
り、与えられる。もしもベクターが宿主細胞染色体に組
込まれるのなら、しばしば、後者の機構でも十分であ
る。
ベクターのための転写および翻訳コントロール配列は、
ウィルス起点から供給されることが好ましい。例えば、
普通用いられているプロモーターはポリオーマ、アデノ
ウィルス２、および最も好ましくはシミアンウィルス４
０(ＳＶ４０)から導かれる。ＳＶ４０の初期および後期
プロモーターは、いずれもＳＶ４０ウィルスの複製起点
含有フラグメントとして該ウィルスから容易に得られる
ので特に有用である[ファイヤーズ(Ｆiers)ら、１９７
８、“ネイチャー"２７３:１１３]。ＳＶ４０のより小
さい、またはより大きいフラグメントも、それらがウィ
ルス性複製起点内に位置するＨindＩＩＩ部位からＢgＩ
Ｉ部位に至る約２５０bpの配列を含有している限り用い
ることができる。更に、正常な状態でＴＧＦ−βに伴っ
ているヒトＴＧＦ−βゲノムプロモーター、コントロー
ルおよび／またはシグナル配列も、その様なコントロー
ル配列が宿主細胞系に適合し得ると共に、認識され得る
ことを条件として用いることができる。複製起点は、例
えばＳＶ４０その他のウィルス性起点(例えばポリオー
マ、アデノウィルス、ＶＳＶ、ＢＰＶ等)から導かれる
複製起点等の外来性起点を含む様にベクターを組立てる
ことにより、あるいは宿主細胞の染色体性複製機構によ
り、与えられる。もしもベクターが宿主細胞染色体に組
込まれるのなら、しばしば、後者の機構でも十分であ
る。
【００３６】ウィルス性複製起点を有するベクターを用
いずに、選択マーカーとＴＧＦ−βＤＮＡとで同時形質
転換する方法で哺乳類細胞を形質転換することもでき
る。適当な選択マーカーとしては、例えばジヒドロ葉酸
還元酵素やチミジンキナーゼがある。その様なマーカー
はタンパク質、一般に酵素であって、形質転換細胞、即
ち、外因性ＤＮＡを取り込むことのできた(コンピテン
トな)細胞の同定を可能にするものである。通常、同定
は、マーカータンパク質を取り込んでいなければ、毒性
であるか、あるいはそこから必須栄養物を得ることがで
きない様な培地中で、形質転換体が生き残るということ
に基づいて行われる。ＴＧＦ−βとＤＨＦＲの両者をコ
ードしているＤＮＡ配列を含むベクターでトランスフェ
クトするのに好適な哺乳類宿主細胞を選択するに際して
は、用いるＤＨＦＲタンパク質のタイプに従って宿主を
選択するのが適当である。野性型ＤＨＦＲタンパク質を
用いる場合には、ＤＨＦＲ欠損宿主細胞を選択するのが
好ましく、そうすることにより、ヒポキサンチン、グリ
シンおよびチミジンを欠く選択用培地内で、満足のいく
トランスフェクションを選択するためのマーカーとして
ＤＨＦＲ暗号配列を用いることができる。この場合、好
ましい宿主細胞はＤＨＦＲ活性を欠くチャイニーズハム
スターの卵巣(ＣＨＯ)セルラインであり、これは、ウー
ラウブおよびチャツシン(Ｕrlaub and Ｃhasin)(１９
８０、“プロシーデイングス・オブ・ザ・ナショナル・
アカデミー・オブ・サイエンスイズ"(ＵＳＡ)７７:４２
１６)の述べた如くにして調製し、増殖させることがで
きる。
いずに、選択マーカーとＴＧＦ−βＤＮＡとで同時形質
転換する方法で哺乳類細胞を形質転換することもでき
る。適当な選択マーカーとしては、例えばジヒドロ葉酸
還元酵素やチミジンキナーゼがある。その様なマーカー
はタンパク質、一般に酵素であって、形質転換細胞、即
ち、外因性ＤＮＡを取り込むことのできた(コンピテン
トな)細胞の同定を可能にするものである。通常、同定
は、マーカータンパク質を取り込んでいなければ、毒性
であるか、あるいはそこから必須栄養物を得ることがで
きない様な培地中で、形質転換体が生き残るということ
に基づいて行われる。ＴＧＦ−βとＤＨＦＲの両者をコ
ードしているＤＮＡ配列を含むベクターでトランスフェ
クトするのに好適な哺乳類宿主細胞を選択するに際して
は、用いるＤＨＦＲタンパク質のタイプに従って宿主を
選択するのが適当である。野性型ＤＨＦＲタンパク質を
用いる場合には、ＤＨＦＲ欠損宿主細胞を選択するのが
好ましく、そうすることにより、ヒポキサンチン、グリ
シンおよびチミジンを欠く選択用培地内で、満足のいく
トランスフェクションを選択するためのマーカーとして
ＤＨＦＲ暗号配列を用いることができる。この場合、好
ましい宿主細胞はＤＨＦＲ活性を欠くチャイニーズハム
スターの卵巣(ＣＨＯ)セルラインであり、これは、ウー
ラウブおよびチャツシン(Ｕrlaub and Ｃhasin)(１９
８０、“プロシーデイングス・オブ・ザ・ナショナル・
アカデミー・オブ・サイエンスイズ"(ＵＳＡ)７７:４２
１６)の述べた如くにして調製し、増殖させることがで
きる。
【００３７】他方、メトトレキセート(ＭＴＸ)に対する
結合親和性の低いＤＨＦＲタンパク質をコードしている
ＤＮＡをコントロール配列に用いる場合には、ＤＨＦＲ
耐性細胞を用いる必要はない。何故ならば突然変異ＤＨ
ＦＲはＭＴＸ耐性であるので、宿主細胞自身がＭＴＸ感
受性であるならば、ＭＴＸ含有培地を選択の手段として
用いることができるからである。ＭＴＸを吸収すること
のできる真核細胞の大多数は、メトトレキセート感受性
であると思われる。その様な、有用なセルラインの１つ
はＣＨＯ系、ＣＨＯＫ１(ＡＴＣＣ ＮＯ．ＣＣＬ６１)
である。その他、組換え脊椎動物の細胞培養内でのＴＧ
Ｆ−βの合成に適用し得る適当な方法は、Ｍ−Ｊ,ゲツ
シング(Ｍ−Ｊ,Ｇething)ら“ネイチャー"２９３:６２
０−６２５(１９８１)、Ｎ．マンテイ(Ｎ．Ｍantei)ら
“ネイチャー"２８１:４０−４６およびＡ．レビンソン
(Ａ．Ｌevinson)ら、ＥＰ１１７、０６０Ａおよび１１
７,０５８Ａに記載されている。
結合親和性の低いＤＨＦＲタンパク質をコードしている
ＤＮＡをコントロール配列に用いる場合には、ＤＨＦＲ
耐性細胞を用いる必要はない。何故ならば突然変異ＤＨ
ＦＲはＭＴＸ耐性であるので、宿主細胞自身がＭＴＸ感
受性であるならば、ＭＴＸ含有培地を選択の手段として
用いることができるからである。ＭＴＸを吸収すること
のできる真核細胞の大多数は、メトトレキセート感受性
であると思われる。その様な、有用なセルラインの１つ
はＣＨＯ系、ＣＨＯＫ１(ＡＴＣＣ ＮＯ．ＣＣＬ６１)
である。その他、組換え脊椎動物の細胞培養内でのＴＧ
Ｆ−βの合成に適用し得る適当な方法は、Ｍ−Ｊ,ゲツ
シング(Ｍ−Ｊ,Ｇething)ら“ネイチャー"２９３:６２
０−６２５(１９８１)、Ｎ．マンテイ(Ｎ．Ｍantei)ら
“ネイチャー"２８１:４０−４６およびＡ．レビンソン
(Ａ．Ｌevinson)ら、ＥＰ１１７、０６０Ａおよび１１
７,０５８Ａに記載されている。
【００３８】ＴＧＦ−βは、溶解した形質転換細胞か
ら、遠心して不溶性の細胞断片を分離することにより、
回収される。あるいは、ＴＧＦ−βを分泌する形質転換
細胞の場合は、培養物を遠心するだけで細胞から分離す
ることができる。次いで、一般に、ＴＧＦ−βを当業者
既知の方法(１５、１６、１７)に従い、酸の存在下でゲ
ル濾過した後、ＨＰＬＣにかけ、アセトニトリルグラデ
イエントで溶離する方法により、精製する。その様な精
製法を治療用物質の精製にも同様に用いる必要はない。
その後の、あるいは、それに代る精製法として、細胞リ
ゼイトまたは上清を、汚染性タンパク質を変性させ、沈
降させるのには充分であるが、ＴＧＦ−βを変性、沈降
させない程度の温度で、ある時間加熱する。ＴＧＦ−β
は非常に熱に安定であるが、これは、広範なジスルフィ
ド結合の形成によると思われる。従って、ジチオトレイ
トールの如きジスルフィド試薬を少量含有している培地
で加熱するべきである。ＴＧＦ−βは１Ｍ酢酸に対して
安定であることが分かっているので、加熱と酸性化とを
併用することもできる。
ら、遠心して不溶性の細胞断片を分離することにより、
回収される。あるいは、ＴＧＦ−βを分泌する形質転換
細胞の場合は、培養物を遠心するだけで細胞から分離す
ることができる。次いで、一般に、ＴＧＦ−βを当業者
既知の方法(１５、１６、１７)に従い、酸の存在下でゲ
ル濾過した後、ＨＰＬＣにかけ、アセトニトリルグラデ
イエントで溶離する方法により、精製する。その様な精
製法を治療用物質の精製にも同様に用いる必要はない。
その後の、あるいは、それに代る精製法として、細胞リ
ゼイトまたは上清を、汚染性タンパク質を変性させ、沈
降させるのには充分であるが、ＴＧＦ−βを変性、沈降
させない程度の温度で、ある時間加熱する。ＴＧＦ−β
は非常に熱に安定であるが、これは、広範なジスルフィ
ド結合の形成によると思われる。従って、ジチオトレイ
トールの如きジスルフィド試薬を少量含有している培地
で加熱するべきである。ＴＧＦ−βは１Ｍ酢酸に対して
安定であることが分かっているので、加熱と酸性化とを
併用することもできる。
【００３９】天然の成熟ＴＧＦ−βはグリコシル化され
ていない。従って、熱および酸に安定な糖タンパク質
は、レンチル・レクチン−結合セファロースの如きレク
チンカラムに糖タンパクを吸着させることにより、分離
することができる。この工程は、余り好ましくないが、
熱および酸で処理する前に行うこともできる。ＴＧＦ−
βは吸着されなかったフラクション(画分)に伴なって溶
出する。純度の高い生産物を必要とする場合には、粗混
合物または部分的に精製された混合物を、次いでクロマ
トフォーカスする。ＴＧＦ−βは、所望の純度のＴＧＦ
−βと、生理学的に許容し得る担体、即ち、使用される
用量および濃度においては、被投与者にとって無毒な担
体を混合することにより、投与のために製剤化される。
通常、この様な製剤化には、ＴＧＦ−βと緩衝液、アス
コルビン酸等の抗酸化剤、低分子量(約１０残基以下)ポ
リペプチド、タンパク質、アミノ酸、グルコースまたは
デキストリンを含む炭水化物、ＥＤＴＡの如きキレート
剤、並びにその他の賦形剤とを混合する必要がある。治
療のために投与されるＴＧＦ−βは滅菌されねばならな
い。滅菌処理は、滅菌濾過膜(０．２ミクロン)を通すこ
とにより、容易に行うことができる。通常、ＴＧＦ−β
は、熱変性および酸化による変性に極めて安定であるた
め、水溶液の形で保存する。
ていない。従って、熱および酸に安定な糖タンパク質
は、レンチル・レクチン−結合セファロースの如きレク
チンカラムに糖タンパクを吸着させることにより、分離
することができる。この工程は、余り好ましくないが、
熱および酸で処理する前に行うこともできる。ＴＧＦ−
βは吸着されなかったフラクション(画分)に伴なって溶
出する。純度の高い生産物を必要とする場合には、粗混
合物または部分的に精製された混合物を、次いでクロマ
トフォーカスする。ＴＧＦ−βは、所望の純度のＴＧＦ
−βと、生理学的に許容し得る担体、即ち、使用される
用量および濃度においては、被投与者にとって無毒な担
体を混合することにより、投与のために製剤化される。
通常、この様な製剤化には、ＴＧＦ−βと緩衝液、アス
コルビン酸等の抗酸化剤、低分子量(約１０残基以下)ポ
リペプチド、タンパク質、アミノ酸、グルコースまたは
デキストリンを含む炭水化物、ＥＤＴＡの如きキレート
剤、並びにその他の賦形剤とを混合する必要がある。治
療のために投与されるＴＧＦ−βは滅菌されねばならな
い。滅菌処理は、滅菌濾過膜(０．２ミクロン)を通すこ
とにより、容易に行うことができる。通常、ＴＧＦ−β
は、熱変性および酸化による変性に極めて安定であるた
め、水溶液の形で保存する。
【００４０】ＴＧＦ−β組成物の投与法として、２つの
方法が考えられる。第１番目の方法は、好ましい方法で
あるが、創傷表面の治癒を促進するための、局所適用で
ある。治療し得る傷のタイプや外傷には何ら制限なく、
それらには以下の創傷が含まれる(ただし、これらに限
定されない)。１度、２度または３度の火傷(特に２度ま
たは３度の火傷);表皮または内部の手術による切開、美
容上の手術をも含む;外傷、裂傷、切開、貫通を含む;お
よび表面壊瘍、床ずれ、糖尿病性壊瘍、歯肉壊瘍、血友
病性壊瘍、および静脈瘤を含む。ＴＧＦ−β組成物を火
傷に用いる場合、灌流液(irrigant)として生理食塩水と
一緒に用いるのが好ましく、あるいは、軟膏または懸濁
剤として、好ましくは精製コラーゲンと併用する。ＴＧ
Ｆ−β組成物はまた、パッチ類や硬膏、並びに包帯に浸
み込ませても良く、この場合は、液状または半流動体の
形であることが望ましい。その様な品、あるいは組成物
には、サルファダイアジンの如き、抗生物質を加える必
要がある。創傷清浄化剤には、タンパク分解酵素を加え
ても良い。ただし、これは、その様な酵素がＴＧＦ−β
を加水分解しないか、あるいは加水分解に抵抗性のＴＧ
Ｆ−β突然変異体を用いている場合である。
方法が考えられる。第１番目の方法は、好ましい方法で
あるが、創傷表面の治癒を促進するための、局所適用で
ある。治療し得る傷のタイプや外傷には何ら制限なく、
それらには以下の創傷が含まれる(ただし、これらに限
定されない)。１度、２度または３度の火傷(特に２度ま
たは３度の火傷);表皮または内部の手術による切開、美
容上の手術をも含む;外傷、裂傷、切開、貫通を含む;お
よび表面壊瘍、床ずれ、糖尿病性壊瘍、歯肉壊瘍、血友
病性壊瘍、および静脈瘤を含む。ＴＧＦ−β組成物を火
傷に用いる場合、灌流液(irrigant)として生理食塩水と
一緒に用いるのが好ましく、あるいは、軟膏または懸濁
剤として、好ましくは精製コラーゲンと併用する。ＴＧ
Ｆ−β組成物はまた、パッチ類や硬膏、並びに包帯に浸
み込ませても良く、この場合は、液状または半流動体の
形であることが望ましい。その様な品、あるいは組成物
には、サルファダイアジンの如き、抗生物質を加える必
要がある。創傷清浄化剤には、タンパク分解酵素を加え
ても良い。ただし、これは、その様な酵素がＴＧＦ−β
を加水分解しないか、あるいは加水分解に抵抗性のＴＧ
Ｆ−β突然変異体を用いている場合である。
【００４１】第２番目の投与方法は、内部創傷、および
内部の傷を治療するために全身投与する方法である。そ
の様な投与方法は、がん患者における新生物細胞の増殖
刺激作用の如き望ましくない副作用が無いか、あるい
は、限られていることを条件として、利用することがで
きる。全身投与用のＴＧＦ−β組成物は、滅菌した等張
性の注射薬、または注入液として製剤化することが好ま
しい。ＴＧＦ−βは、ＴＧＦ−α、ＥＧＦまたはその他
の成長因子等の活性化剤と適宜併用される。活性化剤の
含有量は患者に投与される活性化された組成物中のＴＧ
Ｆ−βの量に直接、左右される。活性化された組成物の
用量は、選択された成長因子、並びに患者の臨床面での
症状に応じて変化する。しかしながら、一般にＴＧＦ−
βは、調合された組成物中に少くとも約１．０ng／mlの
割合で存在していることが好ましく、約１．０mg／ml存
在していれば、一層好ましいと言われている。ＴＧＦ−
β組成物は細胞の再生を誘発し、維持するので、この組
成物は継続使用するか、あるいは周期的に再投与を繰り
返すことが望ましい。
内部の傷を治療するために全身投与する方法である。そ
の様な投与方法は、がん患者における新生物細胞の増殖
刺激作用の如き望ましくない副作用が無いか、あるい
は、限られていることを条件として、利用することがで
きる。全身投与用のＴＧＦ−β組成物は、滅菌した等張
性の注射薬、または注入液として製剤化することが好ま
しい。ＴＧＦ−βは、ＴＧＦ−α、ＥＧＦまたはその他
の成長因子等の活性化剤と適宜併用される。活性化剤の
含有量は患者に投与される活性化された組成物中のＴＧ
Ｆ−βの量に直接、左右される。活性化された組成物の
用量は、選択された成長因子、並びに患者の臨床面での
症状に応じて変化する。しかしながら、一般にＴＧＦ−
βは、調合された組成物中に少くとも約１．０ng／mlの
割合で存在していることが好ましく、約１．０mg／ml存
在していれば、一層好ましいと言われている。ＴＧＦ−
β組成物は細胞の再生を誘発し、維持するので、この組
成物は継続使用するか、あるいは周期的に再投与を繰り
返すことが望ましい。
【００４２】実施例の記載を簡単にするため、頻繁に用
いられる方法を短い熟語に略して示す。プラスミドは小
文字のpを先頭にし、そして／または大文字および／ま
たは数字を続けることによって表わされる。本発明の出
発物質であるプラスミドは市販されているか、または非
制限的な施設から一般に入手可能であり、あるいはこの
様にして入手し得るプラスミドから、公知の方法に従っ
て組立てることができる。更に、その他の同等なプラス
ミドも当業者には知られており、通常の技術者にとって
自明であろう。
いられる方法を短い熟語に略して示す。プラスミドは小
文字のpを先頭にし、そして／または大文字および／ま
たは数字を続けることによって表わされる。本発明の出
発物質であるプラスミドは市販されているか、または非
制限的な施設から一般に入手可能であり、あるいはこの
様にして入手し得るプラスミドから、公知の方法に従っ
て組立てることができる。更に、その他の同等なプラス
ミドも当業者には知られており、通常の技術者にとって
自明であろう。
【００４３】ＤＮＡの“消化"とは、ＤＮＡを、該ＤＮ
Ａのある位置に対してのみ作用する酵素で触媒的に開裂
することを指す。その様な酵素を制限酵素と称し、該酵
素にとって特異的な部位を制限部位(サイト)と称する。
本発明において用いる様々な制限酵素は市販されてお
り、その反応条件、コフアクター、およびその他必要な
ものは、酵素の供給業者の指示に従って使用した。制限
酵素類は、各制限酵素が最初に得られた微生物を表示す
る大文字、次いで他の文字、更に、通常、数字からなる
略号で表わされる。一般に、約１μgのプラスミドまた
はＤＮＡフラグメントを、約２０μlの緩衝液中の約２
単位の酵素と共に使用する。特定の酵素について適当な
緩衝液および基質の量は、製造業者によって明示されて
いる。通常、インキュベーション時間は３７℃で１時間
とするが、供給者の指示に従ってかえてもよい。インキ
ュベーションした後、フェノールおよびクロロホルムで
タンパク質を抽出して除き、水性フラクションからエタ
ノール沈澱によって消化された核酸を回収する。時た
ま、制限酵素による消化の後、５'末端のホスフェート
を細菌性アルカリホスファターゼで加水分解することが
ある。これは、ＤＮＡフラグメントの２つの制限的開裂
末端が“閉環(サーキュライディング)"したり、閉じた
ループを形成することにより、該制限部位に他のＤＮＡ
フラグメントが挿入されにくくなるのを防止するためで
ある。明示しない限り、プラスミドの消化には、５'末
端の脱りん反応は伴わないものとする。脱りん酸の方法
および試薬は常法に従う[Ｔ．マニアテイス(Ｔ．Ｍania
tis)ら、１９８２、モレキュラー・クローニング(Ｍole
cular Ｃloning)pp．１３３−１３４]。
Ａのある位置に対してのみ作用する酵素で触媒的に開裂
することを指す。その様な酵素を制限酵素と称し、該酵
素にとって特異的な部位を制限部位(サイト)と称する。
本発明において用いる様々な制限酵素は市販されてお
り、その反応条件、コフアクター、およびその他必要な
ものは、酵素の供給業者の指示に従って使用した。制限
酵素類は、各制限酵素が最初に得られた微生物を表示す
る大文字、次いで他の文字、更に、通常、数字からなる
略号で表わされる。一般に、約１μgのプラスミドまた
はＤＮＡフラグメントを、約２０μlの緩衝液中の約２
単位の酵素と共に使用する。特定の酵素について適当な
緩衝液および基質の量は、製造業者によって明示されて
いる。通常、インキュベーション時間は３７℃で１時間
とするが、供給者の指示に従ってかえてもよい。インキ
ュベーションした後、フェノールおよびクロロホルムで
タンパク質を抽出して除き、水性フラクションからエタ
ノール沈澱によって消化された核酸を回収する。時た
ま、制限酵素による消化の後、５'末端のホスフェート
を細菌性アルカリホスファターゼで加水分解することが
ある。これは、ＤＮＡフラグメントの２つの制限的開裂
末端が“閉環(サーキュライディング)"したり、閉じた
ループを形成することにより、該制限部位に他のＤＮＡ
フラグメントが挿入されにくくなるのを防止するためで
ある。明示しない限り、プラスミドの消化には、５'末
端の脱りん反応は伴わないものとする。脱りん酸の方法
および試薬は常法に従う[Ｔ．マニアテイス(Ｔ．Ｍania
tis)ら、１９８２、モレキュラー・クローニング(Ｍole
cular Ｃloning)pp．１３３−１３４]。
【００４４】制限酵素による消化によって得られた特定
のＤＮＡフラグメントの“回収"または“単離"とは、こ
の消化物をポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけて分
離し、フラグメントの移動度を分子量既知のマーカーＤ
ＮＡフラグメントのそれと比較して所望のフラグメント
を同定し、該フラグメントを含むゲルの部分を取り除
き、該ゲルからＤＮＡを分離することを意味する。この
方法は一般的に知られている。例、Ｒ．ローン(Ｒ．Ｌa
wn)ら、１９８１、“ヌクレイック・アシッズ・リサー
チ"９:６１０３−６１１４およびＤ．ゲツデル(Ｄ．Ｇo
eddel)ら、１９８０“ヌクレイック・アシッズ・リサー
チ"８:４０５７参照。“サザーン分析"とは、消化物ま
たはＤＮＡ含有組成物中のＤＮＡ配列の存在を、既知
の、標識したオリゴヌクレオチドまたはＤＮＡフラグメ
ントとのハイブリダイゼーションによって確認する方法
である。本明細書中では、特に断らない限り、サザーン
分析という時は、Ｅ．サザーン(Ｅ．Ｓouthern)、１９
７５“ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジイ
(Ｊ．Ｍol．Ｂiol．)"９８:５０３−５１７、の方法に
従って、消化物を１％アガロース上で分離し、変性し、
そしてニトロセルロース上に移し、Ｔ．マニアテイスら
の方法[１９７８、“セル"１５:６８７−７０１]に従っ
てハイブリダイゼーションを行なうことを意味する。
のＤＮＡフラグメントの“回収"または“単離"とは、こ
の消化物をポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけて分
離し、フラグメントの移動度を分子量既知のマーカーＤ
ＮＡフラグメントのそれと比較して所望のフラグメント
を同定し、該フラグメントを含むゲルの部分を取り除
き、該ゲルからＤＮＡを分離することを意味する。この
方法は一般的に知られている。例、Ｒ．ローン(Ｒ．Ｌa
wn)ら、１９８１、“ヌクレイック・アシッズ・リサー
チ"９:６１０３−６１１４およびＤ．ゲツデル(Ｄ．Ｇo
eddel)ら、１９８０“ヌクレイック・アシッズ・リサー
チ"８:４０５７参照。“サザーン分析"とは、消化物ま
たはＤＮＡ含有組成物中のＤＮＡ配列の存在を、既知
の、標識したオリゴヌクレオチドまたはＤＮＡフラグメ
ントとのハイブリダイゼーションによって確認する方法
である。本明細書中では、特に断らない限り、サザーン
分析という時は、Ｅ．サザーン(Ｅ．Ｓouthern)、１９
７５“ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジイ
(Ｊ．Ｍol．Ｂiol．)"９８:５０３−５１７、の方法に
従って、消化物を１％アガロース上で分離し、変性し、
そしてニトロセルロース上に移し、Ｔ．マニアテイスら
の方法[１９７８、“セル"１５:６８７−７０１]に従っ
てハイブリダイゼーションを行なうことを意味する。
【００４５】“形質転換"とは、ＤＮＡを生物内に導入
することを意味し、その結果ＤＮＡが染色体外成分とし
て、あるいは染色体内に組込まれて複製されることを意
味する。特に明示しない限り、本発明における大腸菌の
形質転換法にはマンデル(Ｍandel)らのＣaＣl2法(１９
７０、“ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジ
イ"５３:１５４)を採用する。“ライゲーション(結合)"
とは、２個の二本鎖核酸フラグメントの間にホスホジエ
ステル結合を形成する工程を言う(Ｔ．マニアテイス
ら、前掲p１４６)。特に明示しない限り、ライゲーショ
ンは既知の緩衝液と条件を使用し、略等モル量のライゲ
ートすべきＤＮＡフラグメント０．５μg当たりＴ4ＤＮ
Ａリガーゼ(“リガーゼ")１０単位を用いて行う。形質
転換体からＤＮＡを“調製する"とは、プラスミドＤＮ
Ａを微生物培養物中から単離することを意味する。明示
しない限り、マニアテイスらのアルカリ性／ＳＤＳ法
(同上p．９０)を採用する。“オリゴヌクレオチド"と
は、短かい一本鎖または二本鎖ポリデオキシヌクレオチ
ドであって、既知の方法によって化学的に合成され、次
いでポリアクリルアミドゲル上で精製されたものであ
る。引用した文献は全て参照例として示した。
することを意味し、その結果ＤＮＡが染色体外成分とし
て、あるいは染色体内に組込まれて複製されることを意
味する。特に明示しない限り、本発明における大腸菌の
形質転換法にはマンデル(Ｍandel)らのＣaＣl2法(１９
７０、“ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジ
イ"５３:１５４)を採用する。“ライゲーション(結合)"
とは、２個の二本鎖核酸フラグメントの間にホスホジエ
ステル結合を形成する工程を言う(Ｔ．マニアテイス
ら、前掲p１４６)。特に明示しない限り、ライゲーショ
ンは既知の緩衝液と条件を使用し、略等モル量のライゲ
ートすべきＤＮＡフラグメント０．５μg当たりＴ4ＤＮ
Ａリガーゼ(“リガーゼ")１０単位を用いて行う。形質
転換体からＤＮＡを“調製する"とは、プラスミドＤＮ
Ａを微生物培養物中から単離することを意味する。明示
しない限り、マニアテイスらのアルカリ性／ＳＤＳ法
(同上p．９０)を採用する。“オリゴヌクレオチド"と
は、短かい一本鎖または二本鎖ポリデオキシヌクレオチ
ドであって、既知の方法によって化学的に合成され、次
いでポリアクリルアミドゲル上で精製されたものであ
る。引用した文献は全て参照例として示した。
【００４６】
【実施例】実施例１ ヒトＴＧＦ−βの純化および配列分析 アミノ酸配列を決定するための、十分に均質で純粋なヒ
トＴＧＦ−βを得る為に、アソイアン（Ａｓｓｏｉａ
ｎ）らの既知の精製法（１５）をスケールアップし、改
良した。２５０単位のヒト血小板を、ワーリング（Ｗａ
ｒｉｎｇ）の混合機中、酸−エタノール１ｌで抽出し
た。エーテル４ｌを加えると沈澱が生じたので、これを
ワットマン濾紙（ＮＯ．１）を用いて減圧濾過して集め
た。沈澱を１Ｍ酢酸５０ｍｌに一夜溶解し、１Ｍ酢酸で
平衡化したバイオゲルＰ−６０カラム（１０×１００ｃ
ｍ）でゲル濾過して精製した。ＴＧＦ−βを含有してい
るフラクションを分析用ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲ
ル電気泳動およびバイオアッセイにより同定した。ピー
クフラクションを集め、凍結乾燥し、２０ｍｌの１Ｍ酢
酸、８Ｍ尿素に再溶解した。１Ｍ酢酸、８Ｍ尿素中、バ
イオゲルＰ−６０カラム（５×９０ｃｍ）でゲル濾過す
ることにより約５０％純度のＴＧＦ−βが得られた。こ
れらのピークフラクションを１容量の水で希釈し、０.
１％トリフルオロ酢酸の半プレパラティブＲＰＰ Ｃ１
８（シンクロパック）ＨＰＬＣに入れ、２０〜５０％の
アセトニトリルグラジエントで溶出した。この様にして
得たＴＧＦ−βをアミノ酸分析で定量したところ、標本
当たり約０.５ｍｇであることがわかった。次いで文献
（６０）記載の方法により変性ＳＤＳ−ポリアクリルア
ミドゲル電気泳動を行なった。先の実験と一致して、Ｓ
ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル中、非還元ＴＧＦ−βは
２５ＫＤタンパクとして移動したが、β−メルカプトエ
タノールで還元すると、１２.５ＫＤのものに変わっ
た。このことは、ＴＧＦ−βは分子間ジスルフィド結合
により連結されている２個の１２.５ｋｄポリペプチド
鎖で構成されていることを示唆している（１５）。
トＴＧＦ−βを得る為に、アソイアン（Ａｓｓｏｉａ
ｎ）らの既知の精製法（１５）をスケールアップし、改
良した。２５０単位のヒト血小板を、ワーリング（Ｗａ
ｒｉｎｇ）の混合機中、酸−エタノール１ｌで抽出し
た。エーテル４ｌを加えると沈澱が生じたので、これを
ワットマン濾紙（ＮＯ．１）を用いて減圧濾過して集め
た。沈澱を１Ｍ酢酸５０ｍｌに一夜溶解し、１Ｍ酢酸で
平衡化したバイオゲルＰ−６０カラム（１０×１００ｃ
ｍ）でゲル濾過して精製した。ＴＧＦ−βを含有してい
るフラクションを分析用ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲ
ル電気泳動およびバイオアッセイにより同定した。ピー
クフラクションを集め、凍結乾燥し、２０ｍｌの１Ｍ酢
酸、８Ｍ尿素に再溶解した。１Ｍ酢酸、８Ｍ尿素中、バ
イオゲルＰ−６０カラム（５×９０ｃｍ）でゲル濾過す
ることにより約５０％純度のＴＧＦ−βが得られた。こ
れらのピークフラクションを１容量の水で希釈し、０.
１％トリフルオロ酢酸の半プレパラティブＲＰＰ Ｃ１
８（シンクロパック）ＨＰＬＣに入れ、２０〜５０％の
アセトニトリルグラジエントで溶出した。この様にして
得たＴＧＦ−βをアミノ酸分析で定量したところ、標本
当たり約０.５ｍｇであることがわかった。次いで文献
（６０）記載の方法により変性ＳＤＳ−ポリアクリルア
ミドゲル電気泳動を行なった。先の実験と一致して、Ｓ
ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル中、非還元ＴＧＦ−βは
２５ＫＤタンパクとして移動したが、β−メルカプトエ
タノールで還元すると、１２.５ＫＤのものに変わっ
た。このことは、ＴＧＦ−βは分子間ジスルフィド結合
により連結されている２個の１２.５ｋｄポリペプチド
鎖で構成されていることを示唆している（１５）。
【００４７】タンパクの配列に関する情報を得るため
に、精製したＴＧＦ−βを還元し、アルキル化し、アミ
ノ末端配列分析にかけた。ＴＧＦ−β１.２ナノモルを
８Ｍ尿素中へ透析し、０.１Ｍトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８.
５）、１０ｍＭジチオトレイトール、８Ｍ尿素中でイン
キュベートして還元した。次いで暗所、室温で、５０ｍ
Ｍ沃化アセテートの存在下でアルキル化を行なった。過
剰のβ−メルカプトエタノールを加えて透析することに
より、３０分後に反応を停止した。このＴＧＦ−β０.
７ナノモルを使って直接ＮＨ2−末端配列分析を行なっ
た。還元してアルキル化したＴＧＦ−β１.２ナノモル
を、０.７５Ｍ尿素、５０ｍＭ ＮＨ4ＨＣＯ3、５ｍＭ
ジチオトレイトール中、１％クロストリパインで２４時
間消化した（１５）。１２時間後に、更に１％クロスト
リパインを追加した。反応生成物を、０.１％トリフル
オロ酢酸中の０〜７０％アセトニトリルグラジエントを
使って、シンクロパックＲＰＰ Ｃ１８逆相カラム
（４.６×２５０ｎｍ）で分離した。配列決定は、大改
良したベックマン８９０ｃスピニングカップシークエン
サー（６１）またはヘビック（Ｈｅｗｉｃｋ）らの記載
している気相シークエンサー（６２）（アプライド・バ
イオシステムズ、モデル４７０Ａ）のいずれかを用いて
行ない、アミノ酸誘導体の同定はライニン・マイクロソ
ルブＣ−８カラムの逆相ＨＰＬＣにより行なった。数種
のペプチドのアミノ酸配列を決定した。これらのフラグ
メントの１つはＮＨ2−末端セグメントであり、もう１
つの大きいペプチドから３７アミノ酸配列が得られた。
これはＮＨ2−末端配列と重複しており、隣接する配列
の６０残基が確立された。非修飾ＴＧＦ−βもＣＮＢｒ
で処理した。メチオニン残基で開裂すると生物活性が完
全に消失したので、生物活性には、少なくとも１部のこ
のＣ−末端オクタペプチドが必要であることが証明され
た（データは示されていない）。
に、精製したＴＧＦ−βを還元し、アルキル化し、アミ
ノ末端配列分析にかけた。ＴＧＦ−β１.２ナノモルを
８Ｍ尿素中へ透析し、０.１Ｍトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８.
５）、１０ｍＭジチオトレイトール、８Ｍ尿素中でイン
キュベートして還元した。次いで暗所、室温で、５０ｍ
Ｍ沃化アセテートの存在下でアルキル化を行なった。過
剰のβ−メルカプトエタノールを加えて透析することに
より、３０分後に反応を停止した。このＴＧＦ−β０.
７ナノモルを使って直接ＮＨ2−末端配列分析を行なっ
た。還元してアルキル化したＴＧＦ−β１.２ナノモル
を、０.７５Ｍ尿素、５０ｍＭ ＮＨ4ＨＣＯ3、５ｍＭ
ジチオトレイトール中、１％クロストリパインで２４時
間消化した（１５）。１２時間後に、更に１％クロスト
リパインを追加した。反応生成物を、０.１％トリフル
オロ酢酸中の０〜７０％アセトニトリルグラジエントを
使って、シンクロパックＲＰＰ Ｃ１８逆相カラム
（４.６×２５０ｎｍ）で分離した。配列決定は、大改
良したベックマン８９０ｃスピニングカップシークエン
サー（６１）またはヘビック（Ｈｅｗｉｃｋ）らの記載
している気相シークエンサー（６２）（アプライド・バ
イオシステムズ、モデル４７０Ａ）のいずれかを用いて
行ない、アミノ酸誘導体の同定はライニン・マイクロソ
ルブＣ−８カラムの逆相ＨＰＬＣにより行なった。数種
のペプチドのアミノ酸配列を決定した。これらのフラグ
メントの１つはＮＨ2−末端セグメントであり、もう１
つの大きいペプチドから３７アミノ酸配列が得られた。
これはＮＨ2−末端配列と重複しており、隣接する配列
の６０残基が確立された。非修飾ＴＧＦ−βもＣＮＢｒ
で処理した。メチオニン残基で開裂すると生物活性が完
全に消失したので、生物活性には、少なくとも１部のこ
のＣ−末端オクタペプチドが必要であることが証明され
た（データは示されていない）。
【００４８】実施例２ ＴＧＦ−βエクソンの分離 ＴＧＦ−２について行なった方法（７）と類似の方法
で、ＴＧＦ−βをコードしているヌクレオチド配列を同
定した。ヒトのゲノムＤＮＡライブラリー中のＴＧＦ−
βエクソンを同定する為のハイブリダイゼーションプロ
ーブとして、部分的タンパク配列に基いてデザインした
長いオリゴヌクレオチドを使用した。次いでＴＧＦ−β
エクソンを、ＴＧＦ−βｃＤＮＡの分離用プローブとし
て使用した。それぞれアミノ酸３〜１７および３０〜４
４をコードしている配列に相補的な２個の４４−塩基の
デオキシオリゴヌクレオチド、βＬＰ１およびβＬＰ２
は、化学的に合成した。ヌクレオチド配列の選択は、ヒ
トｍＲＮＡに見られるコドン傾向（バイアス）に基いて
行なった（２６）。脊椎動物のＤＮＡには比較的まれで
あるＣｐＧジヌクレオチドは（２７）、できる限り避け
た。更に、アミノ酸１３〜１７の為の全ての可能なコド
ンに相補的な１６個の１４量体を合成した。これらのデ
オキシリボヌクレオチドおよび相当するアミノ酸配列を
以下に示す：
で、ＴＧＦ−βをコードしているヌクレオチド配列を同
定した。ヒトのゲノムＤＮＡライブラリー中のＴＧＦ−
βエクソンを同定する為のハイブリダイゼーションプロ
ーブとして、部分的タンパク配列に基いてデザインした
長いオリゴヌクレオチドを使用した。次いでＴＧＦ−β
エクソンを、ＴＧＦ−βｃＤＮＡの分離用プローブとし
て使用した。それぞれアミノ酸３〜１７および３０〜４
４をコードしている配列に相補的な２個の４４−塩基の
デオキシオリゴヌクレオチド、βＬＰ１およびβＬＰ２
は、化学的に合成した。ヌクレオチド配列の選択は、ヒ
トｍＲＮＡに見られるコドン傾向（バイアス）に基いて
行なった（２６）。脊椎動物のＤＮＡには比較的まれで
あるＣｐＧジヌクレオチドは（２７）、できる限り避け
た。更に、アミノ酸１３〜１７の為の全ての可能なコド
ンに相補的な１６個の１４量体を合成した。これらのデ
オキシリボヌクレオチドおよび相当するアミノ酸配列を
以下に示す：
【００４９】
【化１】 点を付したヌクレオチドは、コドンに縮重（多義性）の
ない残基である。
ない残基である。
【００５０】32Ｐ標識βＬＰ−１をプローブとして使用
し、低ストリンジエントのハイブリダイゼーション条件
下でヒトゲノムＤＮＡライブラリー（２８）をスクリー
ニングした。ヒト胎児のゲノム肝臓ライブラリー（２
８）からの約７.５×１０5組換えファージを、ニトロセ
ルロースフイルターにレプリカ平板法（６６）にかけた
後、低ストリンジエント条件下（６５）で、32Ｐ−標識
４４量体βＬＰ−１とハイブリダイズした。ハイブリダ
イズファージの５８からＤＮＡを調製し、ドット・ブロ
ット分析法（６７）およびＢａｍＨＩ消化混合物のサザ
ーン・ハイブリダイゼーション（６８）を使って、32Ｐ
−標識βＬＰ−１およびβＬＰ−２オリゴヌクレオチド
とハイブリダイズさせた。両方のオリゴヌクレオチドと
ハイブリダイズした２個のファージＤＮＡを消化し、再
びサザーン・ハイブリダイセーションにより32Ｐ−標識
１４量体のプールでプローブした。１４量体のハイブリ
ダイセーションは、６×ＳＳＣ、０.５％ＮＰ４０、６
ｍＭ ＥＤＴＡ、１×デンハート溶液および５０μｇ／
ｍｌサケ精子ＤＮＡ中、３７℃で行なった。オートラジ
オグラフィーにかける前に、６×ＳＳＣ中、室温で数回
洗浄した。ファージβλ５８からのＤＮＡをオリゴヌク
レオチドβＬＰ−１、βＬＰ−２および１４量体プール
とハイブリダイズした。βＬＰ−２および１４量体とハ
イブリダイズする配列は、同じ４.２Ｋｂｐ ＢａｍＨ
Ｉフラグメント内に存在し、一方、プローブβＬＰ−１
は２０Ｋｂｐ ＢａｍＨＩフラグメントとハイブリダイ
ズした。ハイブリダイジングＢａｍＨＩフラグメントを
ｐＢＲ３２２にサブクローンした。小さいハイブリダイ
ジングフラグメントのヌクレオチド配列は、Ｍ１３誘導
体にサブクローンした後（７０）、ジデオキシヌクレオ
チド鎖末端法（６９）で決定した。ゲノムＤＮＡライブ
ラリーをスクリーニングすることにより、ＴＧＦ−β暗
号配列の部分のみコードしているエクソンを分離した
（残渣１０〜６０、第５図）。全ＴＧＦ−β暗号配列を
得るために、このエクソンをプローブとして使用し、ヒ
トの満期胎盤のｍＲＮＡから誘導したλｇｔ１０ベイス
のｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングした。
し、低ストリンジエントのハイブリダイゼーション条件
下でヒトゲノムＤＮＡライブラリー（２８）をスクリー
ニングした。ヒト胎児のゲノム肝臓ライブラリー（２
８）からの約７.５×１０5組換えファージを、ニトロセ
ルロースフイルターにレプリカ平板法（６６）にかけた
後、低ストリンジエント条件下（６５）で、32Ｐ−標識
４４量体βＬＰ−１とハイブリダイズした。ハイブリダ
イズファージの５８からＤＮＡを調製し、ドット・ブロ
ット分析法（６７）およびＢａｍＨＩ消化混合物のサザ
ーン・ハイブリダイゼーション（６８）を使って、32Ｐ
−標識βＬＰ−１およびβＬＰ−２オリゴヌクレオチド
とハイブリダイズさせた。両方のオリゴヌクレオチドと
ハイブリダイズした２個のファージＤＮＡを消化し、再
びサザーン・ハイブリダイセーションにより32Ｐ−標識
１４量体のプールでプローブした。１４量体のハイブリ
ダイセーションは、６×ＳＳＣ、０.５％ＮＰ４０、６
ｍＭ ＥＤＴＡ、１×デンハート溶液および５０μｇ／
ｍｌサケ精子ＤＮＡ中、３７℃で行なった。オートラジ
オグラフィーにかける前に、６×ＳＳＣ中、室温で数回
洗浄した。ファージβλ５８からのＤＮＡをオリゴヌク
レオチドβＬＰ−１、βＬＰ−２および１４量体プール
とハイブリダイズした。βＬＰ−２および１４量体とハ
イブリダイズする配列は、同じ４.２Ｋｂｐ ＢａｍＨ
Ｉフラグメント内に存在し、一方、プローブβＬＰ−１
は２０Ｋｂｐ ＢａｍＨＩフラグメントとハイブリダイ
ズした。ハイブリダイジングＢａｍＨＩフラグメントを
ｐＢＲ３２２にサブクローンした。小さいハイブリダイ
ジングフラグメントのヌクレオチド配列は、Ｍ１３誘導
体にサブクローンした後（７０）、ジデオキシヌクレオ
チド鎖末端法（６９）で決定した。ゲノムＤＮＡライブ
ラリーをスクリーニングすることにより、ＴＧＦ−β暗
号配列の部分のみコードしているエクソンを分離した
（残渣１０〜６０、第５図）。全ＴＧＦ−β暗号配列を
得るために、このエクソンをプローブとして使用し、ヒ
トの満期胎盤のｍＲＮＡから誘導したλｇｔ１０ベイス
のｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングした。
【００５１】実施例３ ＴＧＦ−β ｃＤＮＡの分離 種々の細胞起源から全ＲＮＡを抽出し（７１）、ポリア
デニル化ｍＲＮＡフラクションをオリゴ（ｄＴ）−セル
ロース・クロマトグラフィー（７２）により分離した。
ｄＴ12-18またはデオキシリボヌクレオチドＡＣＡＣＧ
ＧＧＴＴＣＡＧＧＴＡＣ（ヌクレオチド１２７０〜１２
８６に相補的）でプライムすることにより、ｃＤＮＡを
調製した（７３）。この２本鎖ｃＤＮＡをヌクレアーゼ
Ｓ１（マイルズ・ラボラトリー）で処理し、次いで大腸
菌ＤＮＡポリメラーゼＩクレノウフラグメントで処理
し、非対象ＥｃｏＲＩリンカー（７５）を使用する以外
は文献記載の方法（７４）でＥｃｏＲＩで開裂したλｇ
ｔ１０にサブクローンし、ＥｃｏＲＩメチラーゼ処理の
必要性を回避した。この組換えファージを大腸菌Ｃ６０
０Ｈｆｌ（７４）に植え、ニトロセルロース・フイルタ
ーにレプリカ移植した（６６）。５０％ホルムアミド、
５×ＳＳＣ、５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ６.
８）、０.１％ピロリン酸ナトリウム、５×デンハルト
溶液、５０μｇ／ｍｌサケ精子ＤＮＡ中でこれらを32Ｐ
−標識（７６）特異的制限フラグメントと４２℃でハイ
ブリダイズし、同じ温度で０.２×ＳＳＣ、０.１％ＳＤ
Ｓ中で洗浄した。32Ｐ−標識デオキシリボヌクレオチド
の場合は、低いストリンジエントのハイブリダイジェー
ション条件（６５）で行なった。ＴＧＦ−βｃＤＮＡ制
限フラグメントのヌクレオチド配列は、Ｍ１３ファージ
誘導体にサブクローンした後（７０）、ジデオキシオリ
ゴヌクレオチド鎖末端法（６９）によって決定した。得
られたｃＤＮＡを図１に模式的に示した。λβＣ１はゲ
ノムエクソン（図５）をプローブとして用い、ヒトの胎
盤ｃＤＮＡライブラリーから分離した。約７５０,００
０オリゴ−ｄＴプライム化胎盤ｃＤＮＡクローンをスク
リーニングし、１個の約１,０５０ｂｐのＴＧＦ−βｃ
ＤＮＡ（λβＣ１）を分離した。先に決定した部分的Ｔ
ＧＦ−β配列からリーディングフレームが確立され、完
全なＴＧＦ−βポリペプチドをコードしている配列が明
らかになった。この配列はＮＨ2末端のアラニン残基か
ら始まり、その後停止コドンまで１１２コドンが続き、
３’末端からは僅かに２０塩基対がある。こんどはλβ
Ｃ１ ＥｃｏＲＩ ｃＤＮＡ挿入体を使ってＡ１７２膠
芽腫（グリオブラストマ）ｃＤＮＡライブラリーをスク
リーニングし、λβＣ３.１９を分離した。特異的にプ
ライムしたＨＴ１０８０線維肉腫ｃＤＮＡライブラリー
を32Ｐ−標識、ＫｐｎＩ−ＫｐｎＩでスクリーニング
し、λβＣ３.１９ｃＤＮＡ挿入体の上流のＥｃｏＲＩ
−ＫｐｎＩフラグメントからλβＣ４.１０、４.３３お
よび４.３７を得た。別の同様のライブラリーをλβＣ
４.３３挿入体およびヌクレオチド１−４０に相当する
合成４０量体でスクリーニングし、λβＣ５.７ｂを分
離した。
デニル化ｍＲＮＡフラクションをオリゴ（ｄＴ）−セル
ロース・クロマトグラフィー（７２）により分離した。
ｄＴ12-18またはデオキシリボヌクレオチドＡＣＡＣＧ
ＧＧＴＴＣＡＧＧＴＡＣ（ヌクレオチド１２７０〜１２
８６に相補的）でプライムすることにより、ｃＤＮＡを
調製した（７３）。この２本鎖ｃＤＮＡをヌクレアーゼ
Ｓ１（マイルズ・ラボラトリー）で処理し、次いで大腸
菌ＤＮＡポリメラーゼＩクレノウフラグメントで処理
し、非対象ＥｃｏＲＩリンカー（７５）を使用する以外
は文献記載の方法（７４）でＥｃｏＲＩで開裂したλｇ
ｔ１０にサブクローンし、ＥｃｏＲＩメチラーゼ処理の
必要性を回避した。この組換えファージを大腸菌Ｃ６０
０Ｈｆｌ（７４）に植え、ニトロセルロース・フイルタ
ーにレプリカ移植した（６６）。５０％ホルムアミド、
５×ＳＳＣ、５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ６.
８）、０.１％ピロリン酸ナトリウム、５×デンハルト
溶液、５０μｇ／ｍｌサケ精子ＤＮＡ中でこれらを32Ｐ
−標識（７６）特異的制限フラグメントと４２℃でハイ
ブリダイズし、同じ温度で０.２×ＳＳＣ、０.１％ＳＤ
Ｓ中で洗浄した。32Ｐ−標識デオキシリボヌクレオチド
の場合は、低いストリンジエントのハイブリダイジェー
ション条件（６５）で行なった。ＴＧＦ−βｃＤＮＡ制
限フラグメントのヌクレオチド配列は、Ｍ１３ファージ
誘導体にサブクローンした後（７０）、ジデオキシオリ
ゴヌクレオチド鎖末端法（６９）によって決定した。得
られたｃＤＮＡを図１に模式的に示した。λβＣ１はゲ
ノムエクソン（図５）をプローブとして用い、ヒトの胎
盤ｃＤＮＡライブラリーから分離した。約７５０,００
０オリゴ−ｄＴプライム化胎盤ｃＤＮＡクローンをスク
リーニングし、１個の約１,０５０ｂｐのＴＧＦ−βｃ
ＤＮＡ（λβＣ１）を分離した。先に決定した部分的Ｔ
ＧＦ−β配列からリーディングフレームが確立され、完
全なＴＧＦ−βポリペプチドをコードしている配列が明
らかになった。この配列はＮＨ2末端のアラニン残基か
ら始まり、その後停止コドンまで１１２コドンが続き、
３’末端からは僅かに２０塩基対がある。こんどはλβ
Ｃ１ ＥｃｏＲＩ ｃＤＮＡ挿入体を使ってＡ１７２膠
芽腫（グリオブラストマ）ｃＤＮＡライブラリーをスク
リーニングし、λβＣ３.１９を分離した。特異的にプ
ライムしたＨＴ１０８０線維肉腫ｃＤＮＡライブラリー
を32Ｐ−標識、ＫｐｎＩ−ＫｐｎＩでスクリーニング
し、λβＣ３.１９ｃＤＮＡ挿入体の上流のＥｃｏＲＩ
−ＫｐｎＩフラグメントからλβＣ４.１０、４.３３お
よび４.３７を得た。別の同様のライブラリーをλβＣ
４.３３挿入体およびヌクレオチド１−４０に相当する
合成４０量体でスクリーニングし、λβＣ５.７ｂを分
離した。
【００５２】種々のオリゴ（ｄＴ）−プライム化ｃＤＮ
Ａライブラリーから分離した７０以上のＴＧＦ−βｃＤ
ＮＡは、いずれも３’非翻訳領域の２、３のヌクレオチ
ド以上のものを含んでおらず、この３’非翻訳配列は、
クローンしたゲノムＤＮＡを使って決定した。ハイブリ
ダイゼーション分析の結果、λβＣ１ＤＮＡ挿入体の
３’末端は、ゲノムＤＮＡファージβλ５８中に存在し
ていることがわかった。ＤＮＡ配列分析により、ＴＧＦ
−βのカルボキシ末端部分をコードしているエクソンが
存在しており、これに停止コドンおよび３’非翻訳末端
が続いていることがわかった（図２−４）。ＡＡＴＡＡ
Ａヘキサヌクレオチド配列（３２）は終止コドンから５
００ｂｐ下流にあるので、推定のポリアデニル化部位を
決めることができた。これが事実ポリアデニル化シグナ
ルだとすると、ＴＧＦ−βｍＲＮＡの計算した寸法は、
ノーザンハイブリダイゼーション実験（実施例４）で決
定した２.３〜２.５Ｋｂという長さに一致する。ゲノム
ＤＮＡプローブを使って、３’非翻訳末端についてオリ
ゴ（ｄＴ）−プライム化胎盤およびＨＴ１０８０ ｃＤ
ＮＡライブラリーを更にスクリーニングしたところ、単
一のハイブリダイズするｃＤＮＡを同定しなかった。
Ａライブラリーから分離した７０以上のＴＧＦ−βｃＤ
ＮＡは、いずれも３’非翻訳領域の２、３のヌクレオチ
ド以上のものを含んでおらず、この３’非翻訳配列は、
クローンしたゲノムＤＮＡを使って決定した。ハイブリ
ダイゼーション分析の結果、λβＣ１ＤＮＡ挿入体の
３’末端は、ゲノムＤＮＡファージβλ５８中に存在し
ていることがわかった。ＤＮＡ配列分析により、ＴＧＦ
−βのカルボキシ末端部分をコードしているエクソンが
存在しており、これに停止コドンおよび３’非翻訳末端
が続いていることがわかった（図２−４）。ＡＡＴＡＡ
Ａヘキサヌクレオチド配列（３２）は終止コドンから５
００ｂｐ下流にあるので、推定のポリアデニル化部位を
決めることができた。これが事実ポリアデニル化シグナ
ルだとすると、ＴＧＦ−βｍＲＮＡの計算した寸法は、
ノーザンハイブリダイゼーション実験（実施例４）で決
定した２.３〜２.５Ｋｂという長さに一致する。ゲノム
ＤＮＡプローブを使って、３’非翻訳末端についてオリ
ゴ（ｄＴ）−プライム化胎盤およびＨＴ１０８０ ｃＤ
ＮＡライブラリーを更にスクリーニングしたところ、単
一のハイブリダイズするｃＤＮＡを同定しなかった。
【００５３】実施例４ ＴＧＦ−βｃＤＮＡプローブを
使った診断法 肝癌ＨＥＰ−Ｇ２、Ｗｉｌｍｓ腫瘍ＴｕＷｉ、膠芽腫Ａ
１７２、膀胱癌Ｔ２４、鱗性表皮癌Ａ４３１、乳房癌Ｍ
ＣＦ−７、鼻咽腔ＫＢ、線維肉腫ＨＴ１０８０、Ｂｕｒ
ｋｉｔｔリンパ腫−リンパ芽球ＤａｕｄｉおよびＲａｊ
ｉ、Ｔ−リンパ芽球モルト４から、ポリアデニル化ＲＮ
Ａを回収した。末梢血液リンパ球を調製し、文献記載
（５３）のスタフィロコッカル・エンテロトキシンＢお
よびホルボールミリステートを用いてミトゲン誘導を行
なった。この場合、ＲＮＡは２４時間後に回収した。ポ
リアデニル化ｍＲＮＡ４μｇを、ホルムアルデヒド−
１.２％アガロースゲル（２９）中で電気泳動し、ニト
ロセルロースフイルターにブロットした（３０）。上に
記載した高いストリンジエント条件下で、λβＣ１の32
Ｐ−標識（７６）ＥｃｏＲＩｃＤＮＡ挿入体をプローブ
として使用した。ゲル上で２８Ｓおよび１８ＳのｒＲＮ
Ａの位置を比較することにより、ＴＧＦ−βｍＲＮＡの
長さは２.３〜２.５であることが示唆された。ｍＲＮＡ
の部分分解は除外することはできないが、ある場合に
は、小さいｍＲＮＡ種が存在するかもしれない。
使った診断法 肝癌ＨＥＰ−Ｇ２、Ｗｉｌｍｓ腫瘍ＴｕＷｉ、膠芽腫Ａ
１７２、膀胱癌Ｔ２４、鱗性表皮癌Ａ４３１、乳房癌Ｍ
ＣＦ−７、鼻咽腔ＫＢ、線維肉腫ＨＴ１０８０、Ｂｕｒ
ｋｉｔｔリンパ腫−リンパ芽球ＤａｕｄｉおよびＲａｊ
ｉ、Ｔ−リンパ芽球モルト４から、ポリアデニル化ＲＮ
Ａを回収した。末梢血液リンパ球を調製し、文献記載
（５３）のスタフィロコッカル・エンテロトキシンＢお
よびホルボールミリステートを用いてミトゲン誘導を行
なった。この場合、ＲＮＡは２４時間後に回収した。ポ
リアデニル化ｍＲＮＡ４μｇを、ホルムアルデヒド−
１.２％アガロースゲル（２９）中で電気泳動し、ニト
ロセルロースフイルターにブロットした（３０）。上に
記載した高いストリンジエント条件下で、λβＣ１の32
Ｐ−標識（７６）ＥｃｏＲＩｃＤＮＡ挿入体をプローブ
として使用した。ゲル上で２８Ｓおよび１８ＳのｒＲＮ
Ａの位置を比較することにより、ＴＧＦ−βｍＲＮＡの
長さは２.３〜２.５であることが示唆された。ｍＲＮＡ
の部分分解は除外することはできないが、ある場合に
は、小さいｍＲＮＡ種が存在するかもしれない。
【００５４】ＴＧＦ−βｍＲＮＡは、神経外胚葉起源の
腫瘍細胞を含む全てのヒトの腫瘍セルライン、例えばＴ
ｕＷｉ（Ｗｉｌｍｓ腫瘍）およびＡ１７２（膠芽腫）、
および癌セルラインＴ２４膀胱癌、Ａ４３１（鱗性表皮
癌）、ＭＣＦ−７（乳房癌）およびＫＢ（鼻咽腔癌）中
で検出可能であった。ＨＴ１０８０、ｃＤＮＡをクロー
ニングするためのｍＲＮＡ源として発明者らが選択し
た、セルライン誘導の線維肉腫は、比較的高レベルのＴ
ＧＦ−βｍＲＮＡを含んでいた。ＴＧＦ−βｍＲＮＡ
は、中胚葉、内胚葉および外胚葉起源の固状腫瘍から誘
導されたセルラインに存在しなかったばかりでなく、造
血起源の腫瘍セルライン、例えばＤａｕｄｉ（Ｂｕｒｋ
ｉｔｔリンパ腫Ｂ−リンパ芽球）、Ｒａｊｉ（Ｂｕｒｋ
ｉｔｔリンパ腫Ｂ−リンパ芽球）およびＭｏｌｔ−４
（Ｔ−細胞白血病）中で検出できた。ＴＧＦ−βｍＲＮ
Ａは、胎盤および末梢血液リンパ球（ＰＢＬ）ｍＲＮＡ
にも検出されることは明らかであるので、ＴＧＦ−βｍ
ＲＮＡが存在するのは腫瘍細胞に限られる訳ではない。
ＰＢＬをミトゲン刺激すると、ＴＧＦ−βｍＲＮＡのレ
ベルは有意に上昇する。ＴＧＦ−βｍＲＮＡはヒトの肝
臓では検出できないが、ＨＥＰ−Ｇ２肝癌セルラインに
は存在していた。全ゆる場合に於いて、ＴＧＦ−βｍＲ
ＮＡは２.３〜２.５Ｋ塩基の長さのものとして泳動す
る。ある場合には、より小さな約１.８〜１.９Ｋｂのｍ
ＲＮＡが存在することがあるが、これはこのｍＲＮＡの
部分的分解によるものであろう。
腫瘍細胞を含む全てのヒトの腫瘍セルライン、例えばＴ
ｕＷｉ（Ｗｉｌｍｓ腫瘍）およびＡ１７２（膠芽腫）、
および癌セルラインＴ２４膀胱癌、Ａ４３１（鱗性表皮
癌）、ＭＣＦ−７（乳房癌）およびＫＢ（鼻咽腔癌）中
で検出可能であった。ＨＴ１０８０、ｃＤＮＡをクロー
ニングするためのｍＲＮＡ源として発明者らが選択し
た、セルライン誘導の線維肉腫は、比較的高レベルのＴ
ＧＦ−βｍＲＮＡを含んでいた。ＴＧＦ−βｍＲＮＡ
は、中胚葉、内胚葉および外胚葉起源の固状腫瘍から誘
導されたセルラインに存在しなかったばかりでなく、造
血起源の腫瘍セルライン、例えばＤａｕｄｉ（Ｂｕｒｋ
ｉｔｔリンパ腫Ｂ−リンパ芽球）、Ｒａｊｉ（Ｂｕｒｋ
ｉｔｔリンパ腫Ｂ−リンパ芽球）およびＭｏｌｔ−４
（Ｔ−細胞白血病）中で検出できた。ＴＧＦ−βｍＲＮ
Ａは、胎盤および末梢血液リンパ球（ＰＢＬ）ｍＲＮＡ
にも検出されることは明らかであるので、ＴＧＦ−βｍ
ＲＮＡが存在するのは腫瘍細胞に限られる訳ではない。
ＰＢＬをミトゲン刺激すると、ＴＧＦ−βｍＲＮＡのレ
ベルは有意に上昇する。ＴＧＦ−βｍＲＮＡはヒトの肝
臓では検出できないが、ＨＥＰ−Ｇ２肝癌セルラインに
は存在していた。全ゆる場合に於いて、ＴＧＦ−βｍＲ
ＮＡは２.３〜２.５Ｋ塩基の長さのものとして泳動す
る。ある場合には、より小さな約１.８〜１.９Ｋｂのｍ
ＲＮＡが存在することがあるが、これはこのｍＲＮＡの
部分的分解によるものであろう。
【００５５】実施例５ ＴＧＦ−βの組換え合成 ＴＧＦ−βの組換え合成に使用されたプラスミドはｐＭ
ＢＴＥ６であった。以下に述べるプラスミドの調製法
は、その組立に実際に使用されるもっと複雑な方法より
も好ましい先見の明ある変法である。ｐ３４２Ｅ（７
９）をＥｃｏＲＩで消化し、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼ
Ｉ（クレナウフラグメント）と４個のｄＮＴＰを用いて
平滑化し、ＳａｌＩで消化してフラグメントＩ（ｐＢＲ
３２２のＡｍｐr遺伝子を含んでいる）を回収した。ｐ
３４２Ｅを同時にＳａｌＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化
し、ＨＢｓＡｇをコードしているフラグメントをフラグ
メント２として回収した。最後にＳＶ４０ゲノムをＨｉ
ｎｄＩＩＩおよびＨｉｎｃＩＩで消化し、ＳＶ４０起源
と初期プロモーターを含んでいる５９６ｂｐフラグメン
トをフラグメント３として回収した。フラグメント１、
２および３を３方向ライゲーション法で連結し、このラ
イゲーション混合物を大腸菌株２９４（ＡＴＣＣ３１４
４６）に導入した。形質転換した培養物をアンピシリン
媒質プレートに植え、耐性コロニーを選択した。形質転
換コロニーから、ｐ３４２Ｅ−平滑を回収した。ｐ３４
２Ｅ−平滑を、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＥｃｏＲＩで同時
に消化し、大きいベクターフラグメントを回収した。こ
のフラグメントを、以下の配列を持つポリリンカーに連
結した。 ついで、このライゲーション混合物を用い、上記の方法
で大腸菌ＡＴＣＣ３１４４６を形質転換した。ｐＣＶＳ
Ｖ−ＨＢｓをアンピシリン−耐性形質転換体から回収し
た。
ＢＴＥ６であった。以下に述べるプラスミドの調製法
は、その組立に実際に使用されるもっと複雑な方法より
も好ましい先見の明ある変法である。ｐ３４２Ｅ（７
９）をＥｃｏＲＩで消化し、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼ
Ｉ（クレナウフラグメント）と４個のｄＮＴＰを用いて
平滑化し、ＳａｌＩで消化してフラグメントＩ（ｐＢＲ
３２２のＡｍｐr遺伝子を含んでいる）を回収した。ｐ
３４２Ｅを同時にＳａｌＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化
し、ＨＢｓＡｇをコードしているフラグメントをフラグ
メント２として回収した。最後にＳＶ４０ゲノムをＨｉ
ｎｄＩＩＩおよびＨｉｎｃＩＩで消化し、ＳＶ４０起源
と初期プロモーターを含んでいる５９６ｂｐフラグメン
トをフラグメント３として回収した。フラグメント１、
２および３を３方向ライゲーション法で連結し、このラ
イゲーション混合物を大腸菌株２９４（ＡＴＣＣ３１４
４６）に導入した。形質転換した培養物をアンピシリン
媒質プレートに植え、耐性コロニーを選択した。形質転
換コロニーから、ｐ３４２Ｅ−平滑を回収した。ｐ３４
２Ｅ−平滑を、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＥｃｏＲＩで同時
に消化し、大きいベクターフラグメントを回収した。こ
のフラグメントを、以下の配列を持つポリリンカーに連
結した。 ついで、このライゲーション混合物を用い、上記の方法
で大腸菌ＡＴＣＣ３１４４６を形質転換した。ｐＣＶＳ
Ｖ−ＨＢｓをアンピシリン−耐性形質転換体から回収し
た。
【００５６】ｐＣＶＳＶ−ＨＢｓをＨｉｎｄＩＩＩおよ
びＥｃｏＲＩで同時に消化し、ベクターフラグメントを
分離した（１８ｂｐＨｉｎｄＩＩＩ−ＥｃｏＲＩフラグ
メントは、そのサイズが小さいのでゲルには現れていな
いであろう）。ｐｇＤ−ＤＨＦＲ−Ｔｒｕｎｃ（ヨーロ
ッパ特許出願８４.３０５９０９.８）、単純性疱疹ｇＤ
タンパクをコードしているＤＮＡを含んでいるプラスミ
ドをＳｔｕＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで同時に消化、単純
性疱疹シグナルペプチドをコードしているＤＮＡおよび
成熟ＨＳＶ−１ｇＤタンパクのＮ−末端部分の暗号領域
を含んでいる約７６０ｂｐフラグメントを回収した。ヨ
ーロッパ特許出願番号８４.３０５９０９.８からのプラ
スミドｐＪ２.９も、同様の方法で使用できる。ｐβＣ
１（図１）をＳｍａＩおよびＢａｍＨＩで消化し、４８
０ｂｐフラグメントを回収した。このフラグメントは、
成熟ＴＧＦ−βのＮ−末端から残基３１４に至るまでを
コードしている配列を含む、プレＴＧＦ−βをコードし
ている配列の大部分を含んでいる。
びＥｃｏＲＩで同時に消化し、ベクターフラグメントを
分離した（１８ｂｐＨｉｎｄＩＩＩ−ＥｃｏＲＩフラグ
メントは、そのサイズが小さいのでゲルには現れていな
いであろう）。ｐｇＤ−ＤＨＦＲ−Ｔｒｕｎｃ（ヨーロ
ッパ特許出願８４.３０５９０９.８）、単純性疱疹ｇＤ
タンパクをコードしているＤＮＡを含んでいるプラスミ
ドをＳｔｕＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで同時に消化、単純
性疱疹シグナルペプチドをコードしているＤＮＡおよび
成熟ＨＳＶ−１ｇＤタンパクのＮ−末端部分の暗号領域
を含んでいる約７６０ｂｐフラグメントを回収した。ヨ
ーロッパ特許出願番号８４.３０５９０９.８からのプラ
スミドｐＪ２.９も、同様の方法で使用できる。ｐβＣ
１（図１）をＳｍａＩおよびＢａｍＨＩで消化し、４８
０ｂｐフラグメントを回収した。このフラグメントは、
成熟ＴＧＦ−βのＮ−末端から残基３１４に至るまでを
コードしている配列を含む、プレＴＧＦ−βをコードし
ている配列の大部分を含んでいる。
【００５７】ｐβＣ１をＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩで
消化し、２７０ｂｐフラグメントを回収した。ＢａｍＨ
Ｉ−ＥｃｏＲＩｐβＣ１フラグメントはＳｍａＩ部位を
持っているので、ｐβＣ１液の消化は別々に行なった。
２７０ｂｐフラグメントはＴＧＦ−β分子の残りをコー
ドしている配列を含んでおり、停止コドンから２０ｂｐ
延びている。ｐＣＶＳＶ−ＨＢｓベクターフラグメント
を、先の７６０、２７０および４８０ｂｐフラグメント
と、フォー・ウエイ・ライゲーションによって連結す
る。得られた組立て物（ｐＣＶＳＶｇＤ）は、ＳＶ４０
初期プロモーターの支配下にあるハイブリッド暗号領域
（単純性疱疹ｇＤ−１シグナルペプチドおよびプレＴＧ
Ｆ−βプリカーサーフラグメントにフレーム中で連結し
たｇＤ−１エンベロープタンパクの一部）を含んでい
る。このハイブリッド暗号領域には、３’−非翻訳配列
および肝炎表面抗原のポリアデニル化シグナルが続いて
いる。ｐＣＶＳＶｇＤをＥｃｏＲＩで消化し、クレノウ
と４種のｄＮＴＰで平滑化し、次いでＰｓｔＩで消化す
る。この様にして２つのフラグメントが得られ、ハイブ
リッド暗号配列とＳＶ４０プロモーターを含んでいるフ
ラグメント（フラグメントＡ）を回収する。
消化し、２７０ｂｐフラグメントを回収した。ＢａｍＨ
Ｉ−ＥｃｏＲＩｐβＣ１フラグメントはＳｍａＩ部位を
持っているので、ｐβＣ１液の消化は別々に行なった。
２７０ｂｐフラグメントはＴＧＦ−β分子の残りをコー
ドしている配列を含んでおり、停止コドンから２０ｂｐ
延びている。ｐＣＶＳＶ−ＨＢｓベクターフラグメント
を、先の７６０、２７０および４８０ｂｐフラグメント
と、フォー・ウエイ・ライゲーションによって連結す
る。得られた組立て物（ｐＣＶＳＶｇＤ）は、ＳＶ４０
初期プロモーターの支配下にあるハイブリッド暗号領域
（単純性疱疹ｇＤ−１シグナルペプチドおよびプレＴＧ
Ｆ−βプリカーサーフラグメントにフレーム中で連結し
たｇＤ−１エンベロープタンパクの一部）を含んでい
る。このハイブリッド暗号領域には、３’−非翻訳配列
および肝炎表面抗原のポリアデニル化シグナルが続いて
いる。ｐＣＶＳＶｇＤをＥｃｏＲＩで消化し、クレノウ
と４種のｄＮＴＰで平滑化し、次いでＰｓｔＩで消化す
る。この様にして２つのフラグメントが得られ、ハイブ
リッド暗号配列とＳＶ４０プロモーターを含んでいるフ
ラグメント（フラグメントＡ）を回収する。
【００５８】ｐＣＶＳＶｇＤをＢａｍＨＩで消化し、ク
レノウおよび４種のｄＮＴＰで平滑化し、次いでＰｓｔ
Ｉで消化する。これらの消化後、４種のフラグメントが
得られる。ｐＢＲ３２２起源およびＡｍｐr遺伝子を含
んでいるフラグメント（約１９００ｂｐ）をフラグメン
トＢと同様にして回収する。フラグメントＡおよびＢを
連結し、このライゲーション混合物を使って大腸菌ＡＴ
ＣＣ３１,４４６を形質転換した。Ａｍｐrコロニーから
プラスミドｐＭＢＴＥ６を回収する。プラスミドｐＭＢ
ＴＥ６を、プラスミドｐＦＤ１１［シモンセン（Ｓｉｍ
ｏｎｓｅｎ）およびレビンソン（Ｌｅｖｉｎｓｏｎ）、
１９８３、Ｐ．Ｎ．Ａ．Ｓ．８０、２４９５−２４９
９］と共にＤＨＦＲ欠失ＣＨＯ細胞［ウルラウブ（Ｕｒ
ｌａｕｂ）およびチャシン（Ｃｈａｓｉｎ）、１９８
０、Ｐ．Ｎ．Ａ．Ｓ．７７．４２１６−４２２０］にト
ランスフェクスした。プラスミドｐＦＤ１１はＤＨＦＲ
をコードしており、従ってトランスフェクトされた細胞
にメトトレキセート耐性を与えるので、ＴＧＦ−βを発
現する形質転換体を選択することができる。あらゆるＤ
ＨＦＲ-哺乳動物宿主細胞を使用することができる。別
法として、ネオマイシン耐性をコードしているプラスミ
ドを用いて宿主細胞を同時形質転換し、ネオマイシン含
有培地で増殖する能力によって形質転換体を同定すれ
ば、あらゆる哺乳動物宿主細胞を使用することができ
る。
レノウおよび４種のｄＮＴＰで平滑化し、次いでＰｓｔ
Ｉで消化する。これらの消化後、４種のフラグメントが
得られる。ｐＢＲ３２２起源およびＡｍｐr遺伝子を含
んでいるフラグメント（約１９００ｂｐ）をフラグメン
トＢと同様にして回収する。フラグメントＡおよびＢを
連結し、このライゲーション混合物を使って大腸菌ＡＴ
ＣＣ３１,４４６を形質転換した。Ａｍｐrコロニーから
プラスミドｐＭＢＴＥ６を回収する。プラスミドｐＭＢ
ＴＥ６を、プラスミドｐＦＤ１１［シモンセン（Ｓｉｍ
ｏｎｓｅｎ）およびレビンソン（Ｌｅｖｉｎｓｏｎ）、
１９８３、Ｐ．Ｎ．Ａ．Ｓ．８０、２４９５−２４９
９］と共にＤＨＦＲ欠失ＣＨＯ細胞［ウルラウブ（Ｕｒ
ｌａｕｂ）およびチャシン（Ｃｈａｓｉｎ）、１９８
０、Ｐ．Ｎ．Ａ．Ｓ．７７．４２１６−４２２０］にト
ランスフェクスした。プラスミドｐＦＤ１１はＤＨＦＲ
をコードしており、従ってトランスフェクトされた細胞
にメトトレキセート耐性を与えるので、ＴＧＦ−βを発
現する形質転換体を選択することができる。あらゆるＤ
ＨＦＲ-哺乳動物宿主細胞を使用することができる。別
法として、ネオマイシン耐性をコードしているプラスミ
ドを用いて宿主細胞を同時形質転換し、ネオマイシン含
有培地で増殖する能力によって形質転換体を同定すれ
ば、あらゆる哺乳動物宿主細胞を使用することができ
る。
【００５９】形質転換したＣＨＯ細胞をＨＧＴ-培地で
培養することにより選択した。細胞を直径１５ｃｍの平
板中、全面生長するまで増殖させた。次いで血清不含の
培地中、４８時間培養した後収穫した。培養培地を平板
からデカントして取り出し、記載された方法（７８）を
用いて軟寒天分析によりＴＧＦ−βの存在を調べた。上
清の培地５０ｍｌを凍結乾燥し、７００μｌの４ｍＭＨ
Ｃｌ−０.１％牛血清アルブミンに溶解した。この溶液
および連続的３倍希釈液２００μｌを分析した。軟寒天
中の直径が＞８９μｍであるコロニーの数をカウントし
た。飽和レベルのＴＧＦ−βの存在下で得た最大応答値
（プラトー値）は平板当たり約１５００であった。ＴＧ
Ｆ−βの非存在下では、５０コロニー以下であった。半
最大応答値は、ネガティブコントロールプラスミドで形
質転換した細胞由来の試料の９倍希釈液において得られ
た。ＭＢＴＥ６上清の連続希釈によって得られた値から
計算したところ、半最大値は７０倍希釈において得られ
ることがわかった。
培養することにより選択した。細胞を直径１５ｃｍの平
板中、全面生長するまで増殖させた。次いで血清不含の
培地中、４８時間培養した後収穫した。培養培地を平板
からデカントして取り出し、記載された方法（７８）を
用いて軟寒天分析によりＴＧＦ−βの存在を調べた。上
清の培地５０ｍｌを凍結乾燥し、７００μｌの４ｍＭＨ
Ｃｌ−０.１％牛血清アルブミンに溶解した。この溶液
および連続的３倍希釈液２００μｌを分析した。軟寒天
中の直径が＞８９μｍであるコロニーの数をカウントし
た。飽和レベルのＴＧＦ−βの存在下で得た最大応答値
（プラトー値）は平板当たり約１５００であった。ＴＧ
Ｆ−βの非存在下では、５０コロニー以下であった。半
最大応答値は、ネガティブコントロールプラスミドで形
質転換した細胞由来の試料の９倍希釈液において得られ
た。ＭＢＴＥ６上清の連続希釈によって得られた値から
計算したところ、半最大値は７０倍希釈において得られ
ることがわかった。
【００６０】連続希釈液の分析の結果、サブクローンお
よびＭＴＸ−含有培地中での選択の前ですら、ｐＥＤ１
１単独で、あるいはｐＦＤ１１と対照プラスミド（疱疹
（ヘルペス）暗号配列が細菌のＳＴＩＩシグナルペプチ
ドをコードしている配列で置き換える外はｐＭＢＴＥ６
と類似しているもの）でトランスフェクトしたＣＨＯ細
胞より約８〜１０倍以上のＴＧＦ−β／ｍｌ（培地）を
合成することがわかった。この追加量のＴＧＦ−βはヒ
トＴＧＦ−βである。生物学的に活性なＴＧＦ−βが培
養培地中に存在するので、ヒトの細胞がインビボに於い
て成熟ＴＧＦ−βを分泌するのと同様に、ＣＨＯ細胞が
プレＴＧＦ−βを開裂すると結論された。この結論は、
軟寒天中のＴＧＦ−β濃度希釈曲線の傾斜が、内因性の
天然ＴＧＦ−βと組換えＴＧＦ−βの両者に於いて同じ
であることから強く支持されるのであり、このことは、
ＴＧＦ−βリセプターに対する親和性が同一でないにし
ても、類似していることを表わしている。
よびＭＴＸ−含有培地中での選択の前ですら、ｐＥＤ１
１単独で、あるいはｐＦＤ１１と対照プラスミド（疱疹
（ヘルペス）暗号配列が細菌のＳＴＩＩシグナルペプチ
ドをコードしている配列で置き換える外はｐＭＢＴＥ６
と類似しているもの）でトランスフェクトしたＣＨＯ細
胞より約８〜１０倍以上のＴＧＦ−β／ｍｌ（培地）を
合成することがわかった。この追加量のＴＧＦ−βはヒ
トＴＧＦ−βである。生物学的に活性なＴＧＦ−βが培
養培地中に存在するので、ヒトの細胞がインビボに於い
て成熟ＴＧＦ−βを分泌するのと同様に、ＣＨＯ細胞が
プレＴＧＦ−βを開裂すると結論された。この結論は、
軟寒天中のＴＧＦ−β濃度希釈曲線の傾斜が、内因性の
天然ＴＧＦ−βと組換えＴＧＦ−βの両者に於いて同じ
であることから強く支持されるのであり、このことは、
ＴＧＦ−βリセプターに対する親和性が同一でないにし
ても、類似していることを表わしている。
【００６１】以下に本明細書で引用した文献を記載す
る。 １．デ・ラルコ（Ｄｅ Ｌａｒｃｏ，Ｊ．Ｅ．）および
トダロー（Ｔｏｄａｒｏ，Ｇ．Ｊ．）、プロシーディン
グ・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス
（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．）、ＵＳＡ
７５，４００１−４００５（１９７８）。 ２．ロバーツ（Ｒｏｂｅｒｔｓ，Ａ．Ｂ．），フローリ
ック（Ｆｒｏｌｉｋ，Ｃ．Ａ．），アンザノ（Ａｎｚａ
ｎｏ，Ｍ．Ａ．）およびスポーン（Ｓｐｏｒｎ，Ｍ．
Ｂ．）、フェデレイション・プロシーディングス（Ｆｅ
ｄ．Ｐｒｏｃ．）４２，２６２１−２６２５（１９８
３）。 ３．トダロー（Ｔｏｄａｒｏ，Ｇ．Ｊ．）、フライリン
グ（Ｆｒｙｌｉｎｇ，Ｃ．）およびデ・ラルコ（Ｄｅ
Ｌａｒｃｏ，Ｊ．Ｅ．）、プロシーディング・オブ・ナ
ショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ．
Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．）、ＵＳＡ ７７，５２
５８−５２６２（１９８０）。 ４．マルカート（Ｍａｒｑｕａｒｄｔ，Ｈ．），ハンカ
ピラー（Ｈｕｎｋａｐｉｌｌｅｒ，Ｍ．Ｗ．），フッド
（Ｈｏｏｄ，Ｌ．Ｅ．）およびトダロー（Ｔｏｄａｒ
ｏ，Ｇ．Ｊ．）、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）２２
３，１０７９−１０８２（１９８４）。 ５．ロバーツ（Ｒｏｂｅｒｔｓ，Ａ．Ｂ．），ラム（Ｌ
ａｍｂ，Ｌ．Ｃ．），ニュートン（Ｎｅｗｔｏｎ，Ｄ．
Ｌ．），スポーン（Ｓｐｏｒｎ，Ｍ．Ｂ．），デ・ラル
コ（Ｄｅ Ｌａｒｃｏ，Ｊ．Ｅ．）およびトダロー（Ｔ
ｏｄａｒｏ，Ｇ．Ｊ．）、プロシーディング・オブ・ナ
ショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ．
Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．）ＵＳＡ ７７，３４９
４−３４９８（１９８０）。
る。 １．デ・ラルコ（Ｄｅ Ｌａｒｃｏ，Ｊ．Ｅ．）および
トダロー（Ｔｏｄａｒｏ，Ｇ．Ｊ．）、プロシーディン
グ・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス
（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．）、ＵＳＡ
７５，４００１−４００５（１９７８）。 ２．ロバーツ（Ｒｏｂｅｒｔｓ，Ａ．Ｂ．），フローリ
ック（Ｆｒｏｌｉｋ，Ｃ．Ａ．），アンザノ（Ａｎｚａ
ｎｏ，Ｍ．Ａ．）およびスポーン（Ｓｐｏｒｎ，Ｍ．
Ｂ．）、フェデレイション・プロシーディングス（Ｆｅ
ｄ．Ｐｒｏｃ．）４２，２６２１−２６２５（１９８
３）。 ３．トダロー（Ｔｏｄａｒｏ，Ｇ．Ｊ．）、フライリン
グ（Ｆｒｙｌｉｎｇ，Ｃ．）およびデ・ラルコ（Ｄｅ
Ｌａｒｃｏ，Ｊ．Ｅ．）、プロシーディング・オブ・ナ
ショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ．
Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．）、ＵＳＡ ７７，５２
５８−５２６２（１９８０）。 ４．マルカート（Ｍａｒｑｕａｒｄｔ，Ｈ．），ハンカ
ピラー（Ｈｕｎｋａｐｉｌｌｅｒ，Ｍ．Ｗ．），フッド
（Ｈｏｏｄ，Ｌ．Ｅ．）およびトダロー（Ｔｏｄａｒ
ｏ，Ｇ．Ｊ．）、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）２２
３，１０７９−１０８２（１９８４）。 ５．ロバーツ（Ｒｏｂｅｒｔｓ，Ａ．Ｂ．），ラム（Ｌ
ａｍｂ，Ｌ．Ｃ．），ニュートン（Ｎｅｗｔｏｎ，Ｄ．
Ｌ．），スポーン（Ｓｐｏｒｎ，Ｍ．Ｂ．），デ・ラル
コ（Ｄｅ Ｌａｒｃｏ，Ｊ．Ｅ．）およびトダロー（Ｔ
ｏｄａｒｏ，Ｇ．Ｊ．）、プロシーディング・オブ・ナ
ショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ．
Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．）ＵＳＡ ７７，３４９
４−３４９８（１９８０）。
【００６２】６．オザンヌ（Ｏｚａｎｎｅ，Ｂ．），フ
ルトン（Ｆｕｌｔｏｎ，Ｒ．Ｊ．）およびカプラン（Ｋ
ａｐｌａｎ，Ｐ．Ｌ．）、ジャーナル・オブ・セルラー
・フィジオロジー（Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ．）
１０５，１６３−１８０（１９８０）。 ７．デリンク（Ｄｅｒｙｎｃｋ，Ｒ．），ロバーツ（Ｒ
ｏｂｅｒｔｓ，Ａ．Ｂ．），ウインクラー（Ｗｉｎｋｌ
ｅｒ，Ｍ．Ｅ．）チェン（Ｃｈｅｎ，Ｅ．Ｙ．）および
ゲツデル（Ｇｏｅｄｄｅｌ，Ｄ．Ｖ．）、セル（Ｃｅｌ
ｌ）３８，２８７−２９７（１９８４）。 ８．リー（Ｌｅｅ，Ｄ．Ｃ．），ローズ（Ｒｏｓｅ，
Ｒ．Ｍ．），ウエブ（Ｗｅｂｂ，Ｎ．Ｒ．）およびトダ
ロー（Ｔｏｄａｒｏ，Ｇ．Ｊ．）、ネイチャー（Ｎａｔ
ｕｒｅ）３１３，４８９−４９１（１９８５）。 ９．リンズレー（Ｌｉｎｓｌｅｙ，Ｐ．Ｓ．），ハーグ
リーブス（Ｈａｒｇｒｅａｖｅｓ，Ｗ．Ｒ．），ツワル
ジク（Ｔｗａｒｄｚｉｋ，Ｄ．Ｒ．）およびトダロー
（Ｔｏｄａｒｏ，Ｇ．Ｊ．）、プロシーディング・オブ
・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Ｐｒｏ
ｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．）ＵＳＡ ８２，３
５６−３６０（１９８５）。 １０．ロバーツ（Ｒｏｂｅｒｔｓ，Ａ．Ｂ．），アンザ
ノ（Ａｎｚａｎｏ，Ｍ．Ａ．），ラム（Ｌａｍｂ，Ｌ．
Ｃ．），スミス（Ｓｍｉｔｈ，Ｊ．Ｍ．）およびスポー
ン（Ｓｐｏｒｎ，Ｍ．Ｂ．）、プロシーディング・オブ
・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Ｐｒｏ
ｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．）ＵＳＡ ７８，５
３３９−５３４３（１９８１）。 １１．ロバーツ（Ｒｏｂｅｒｔｓ，Ａ．Ｂ．），アンザ
ノ（Ａｎｚａｎｏ，Ｍ．Ａ．），ラム（Ｌａｍｂ，Ｌ．
Ｃ．），スミス（Ｓｍｉｔｈ，Ｊ．Ｍ．），フローリッ
ク（Ｆｒｏｌｉｋ，Ｃ．Ａ．），マルカート（Ｍａｒｑ
ｕａｒｄｔ，Ｈ．），トダロー（Ｔｏｄａｒｏ，Ｇ．
Ｊ．）およびスポーン（Ｓｐｏｒｎ，Ｍ．Ｂ．）、ネイ
チャー（Ｎａｔｕｒｅ）２９５，４１７−４１９（１９
８２）。
ルトン（Ｆｕｌｔｏｎ，Ｒ．Ｊ．）およびカプラン（Ｋ
ａｐｌａｎ，Ｐ．Ｌ．）、ジャーナル・オブ・セルラー
・フィジオロジー（Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ．）
１０５，１６３−１８０（１９８０）。 ７．デリンク（Ｄｅｒｙｎｃｋ，Ｒ．），ロバーツ（Ｒ
ｏｂｅｒｔｓ，Ａ．Ｂ．），ウインクラー（Ｗｉｎｋｌ
ｅｒ，Ｍ．Ｅ．）チェン（Ｃｈｅｎ，Ｅ．Ｙ．）および
ゲツデル（Ｇｏｅｄｄｅｌ，Ｄ．Ｖ．）、セル（Ｃｅｌ
ｌ）３８，２８７−２９７（１９８４）。 ８．リー（Ｌｅｅ，Ｄ．Ｃ．），ローズ（Ｒｏｓｅ，
Ｒ．Ｍ．），ウエブ（Ｗｅｂｂ，Ｎ．Ｒ．）およびトダ
ロー（Ｔｏｄａｒｏ，Ｇ．Ｊ．）、ネイチャー（Ｎａｔ
ｕｒｅ）３１３，４８９−４９１（１９８５）。 ９．リンズレー（Ｌｉｎｓｌｅｙ，Ｐ．Ｓ．），ハーグ
リーブス（Ｈａｒｇｒｅａｖｅｓ，Ｗ．Ｒ．），ツワル
ジク（Ｔｗａｒｄｚｉｋ，Ｄ．Ｒ．）およびトダロー
（Ｔｏｄａｒｏ，Ｇ．Ｊ．）、プロシーディング・オブ
・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Ｐｒｏ
ｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．）ＵＳＡ ８２，３
５６−３６０（１９８５）。 １０．ロバーツ（Ｒｏｂｅｒｔｓ，Ａ．Ｂ．），アンザ
ノ（Ａｎｚａｎｏ，Ｍ．Ａ．），ラム（Ｌａｍｂ，Ｌ．
Ｃ．），スミス（Ｓｍｉｔｈ，Ｊ．Ｍ．）およびスポー
ン（Ｓｐｏｒｎ，Ｍ．Ｂ．）、プロシーディング・オブ
・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Ｐｒｏ
ｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．）ＵＳＡ ７８，５
３３９−５３４３（１９８１）。 １１．ロバーツ（Ｒｏｂｅｒｔｓ，Ａ．Ｂ．），アンザ
ノ（Ａｎｚａｎｏ，Ｍ．Ａ．），ラム（Ｌａｍｂ，Ｌ．
Ｃ．），スミス（Ｓｍｉｔｈ，Ｊ．Ｍ．），フローリッ
ク（Ｆｒｏｌｉｋ，Ｃ．Ａ．），マルカート（Ｍａｒｑ
ｕａｒｄｔ，Ｈ．），トダロー（Ｔｏｄａｒｏ，Ｇ．
Ｊ．）およびスポーン（Ｓｐｏｒｎ，Ｍ．Ｂ．）、ネイ
チャー（Ｎａｔｕｒｅ）２９５，４１７−４１９（１９
８２）。
【００６３】１２．ロバーツ（Ｒｏｂｅｒｔｓ，Ａ．
Ｂ．），アンザノ（Ａｎｚａｎｏ，Ｍ．Ａ．），メイヤ
ース（Ｍｅｙｅｒｓ，Ｃ．Ａ．），ワイドマン（Ｗｉｄ
ｅｍａｎ，Ｊ．），ブラッシャー（Ｂｌａｃｈｅｒ，
Ｒ．），パン（Ｐａｎ，Ｙ．Ｃ．），シュタイン（Ｓｔ
ｅｉｎ，Ｓ．），レールマン（Ｌｅｈｒｍａｎ，Ｓ．
Ｒ．），スミス（Ｓｍｉｔｈ，Ｊ．Ｍ．），ラム（Ｌａ
ｍｂ，Ｌ．Ｃ．），およびスポーン（Ｓｐｏｒｎ，Ｍ．
Ｂ．）、バイオケミストリー（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒ
ｙ）２２，５６９２−５６９８（１９８３）。 １３．フローリック（Ｆｒｏｌｉｋ，Ｃ．Ａ．），ダー
ト（Ｄａｒｔ，Ｌ．Ｌ．），メイヤース（Ｍｅｙｅｒ
ｓ，Ｃ．Ａ．），スミス（Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｍ．）およ
びスポーン（Ｓｐｏｒｎ，Ｍ．Ｂ．）、プロシーディン
グ・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス
（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．）、ＵＳＡ
８０，３６７６−３６８０（１９８３）。 １４．チャイルズ（Ｃｈｉｌｄｓ，Ｃ．Ｂ．），プロパ
ー（Ｐｒｏｐｅｒ，Ｊ．Ａ．），タッカー（Ｔｕｃｋｅ
ｒ，Ｒ．Ｆ．）およびモーゼス（Ｍｏｓｅｓ，Ｈ．
Ｌ．）、プロシーディング・オブ・ナショナル・アカデ
ミー・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａ
ｄ．Ｓｃｉ．）、ＵＳＡ ７９，５３１２−５３１６
（１９８２）。 １５．アソイアン（Ａｓｓｏｉａｎ，Ｒ．Ｋ．），コモ
リヤ（Ｋｏｍｏｒｉｙａ，Ａ．），メイヤース（Ｍｅｙ
ｅｒｓ，Ｃ．Ａ．），ミラー（Ｍｉｌｌｅｒ，Ｄ．
Ｍ．）およびスポーン（Ｓｐｏｒｎ，Ｍ．Ｂ．）、ジャ
ーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊ．Ｂ
ｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．）２５８，７１５５−７１６０（１
９８３）。
Ｂ．），アンザノ（Ａｎｚａｎｏ，Ｍ．Ａ．），メイヤ
ース（Ｍｅｙｅｒｓ，Ｃ．Ａ．），ワイドマン（Ｗｉｄ
ｅｍａｎ，Ｊ．），ブラッシャー（Ｂｌａｃｈｅｒ，
Ｒ．），パン（Ｐａｎ，Ｙ．Ｃ．），シュタイン（Ｓｔ
ｅｉｎ，Ｓ．），レールマン（Ｌｅｈｒｍａｎ，Ｓ．
Ｒ．），スミス（Ｓｍｉｔｈ，Ｊ．Ｍ．），ラム（Ｌａ
ｍｂ，Ｌ．Ｃ．），およびスポーン（Ｓｐｏｒｎ，Ｍ．
Ｂ．）、バイオケミストリー（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒ
ｙ）２２，５６９２−５６９８（１９８３）。 １３．フローリック（Ｆｒｏｌｉｋ，Ｃ．Ａ．），ダー
ト（Ｄａｒｔ，Ｌ．Ｌ．），メイヤース（Ｍｅｙｅｒ
ｓ，Ｃ．Ａ．），スミス（Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｍ．）およ
びスポーン（Ｓｐｏｒｎ，Ｍ．Ｂ．）、プロシーディン
グ・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス
（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．）、ＵＳＡ
８０，３６７６−３６８０（１９８３）。 １４．チャイルズ（Ｃｈｉｌｄｓ，Ｃ．Ｂ．），プロパ
ー（Ｐｒｏｐｅｒ，Ｊ．Ａ．），タッカー（Ｔｕｃｋｅ
ｒ，Ｒ．Ｆ．）およびモーゼス（Ｍｏｓｅｓ，Ｈ．
Ｌ．）、プロシーディング・オブ・ナショナル・アカデ
ミー・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａ
ｄ．Ｓｃｉ．）、ＵＳＡ ７９，５３１２−５３１６
（１９８２）。 １５．アソイアン（Ａｓｓｏｉａｎ，Ｒ．Ｋ．），コモ
リヤ（Ｋｏｍｏｒｉｙａ，Ａ．），メイヤース（Ｍｅｙ
ｅｒｓ，Ｃ．Ａ．），ミラー（Ｍｉｌｌｅｒ，Ｄ．
Ｍ．）およびスポーン（Ｓｐｏｒｎ，Ｍ．Ｂ．）、ジャ
ーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊ．Ｂ
ｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．）２５８，７１５５−７１６０（１
９８３）。
【００６４】１６．アソイアン（Ａｓｓｏｉａｎ，Ｒ．
Ｋ．），グローテンドースト（Ｇｒｏｔｅｎｄｏｒｓ
ｔ，Ｇ．Ｒ．），ミラー（Ｍｉｌｌｅｒ，Ｄ．Ｍ．）お
よびスポーン（Ｓｐｏｒｎ，Ｍ．Ｂ．）、ネイチャー
（Ｎａｔｕｒｅ）３０９，８０４−８０６（１９８
４）。 １７．スポーン（Ｓｐｏｒｎ，Ｍ．Ｂ．），ロバーツ
（Ｒｏｂｅｒｔｓ，Ａ．Ｂ．），シャル（Ｓｈｕｌｌ，
Ｊ．Ｈ．），スミス（Ｓｍｉｔｈ，Ｊ．Ｍ．），ワード
（Ｗａｒｄ，Ｊ．Ｍ．）およびソデック（Ｓｏｄｅｋ，
Ｊ．）、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）２１９，１３２
９−１３３１（１９８３）。 １８．フローリック（Ｆｒｏｌｉｋ，Ｃ．Ａ．），ウエ
イクフィールド（Ｗａｋｅｆｉｅｌｄ，Ｌ．Ｍ．），ス
ミス（Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｍ．）およびスポーン（Ｓｐｏ
ｒｎ，Ｍ．Ｂ．）、ジャーナル・オブ・バイオロジカル
・ケミストリー（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．）２５９，
１０９９５−１１０００（１９８４）。 １９．タッカー（Ｔｕｃｋｅｒ，Ｒ．Ｆ．），ブラナム
（Ｂｒａｎｕｍ，Ｅ．Ｌ．），シップレー（Ｓｈｉｐｌ
ｅｙ，Ｇ．Ｄ．），ライアン（Ｒｙａｎ，Ｒ．Ｊ．）お
よびモーゼス（Ｍｏｓｅｓ，Ｈ．Ｌ．）、プロシーディ
ング・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエン
ス（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．）、ＵＳ
Ａ ８１，６７５７−６７６１（１９８４）。 ２０．アソイアン（Ａｓｓｏｉａｎ，Ｒ．Ｋ．），フロ
ーリック（Ｆｒｏｌｉｋ，Ｃ．Ａ．），ロバーツ（Ｒｏ
ｂｅｒｔｓ，Ａ．Ｂ．），ミラー（Ｍｉｌｌｅｒ，Ｄ．
Ｍ．）およびスポーン（Ｓｐｏｒｎ，Ｍ．Ｂ．）、セル
（Ｃｅｌｌ）３６，３５−４１（１９８４）。
Ｋ．），グローテンドースト（Ｇｒｏｔｅｎｄｏｒｓ
ｔ，Ｇ．Ｒ．），ミラー（Ｍｉｌｌｅｒ，Ｄ．Ｍ．）お
よびスポーン（Ｓｐｏｒｎ，Ｍ．Ｂ．）、ネイチャー
（Ｎａｔｕｒｅ）３０９，８０４−８０６（１９８
４）。 １７．スポーン（Ｓｐｏｒｎ，Ｍ．Ｂ．），ロバーツ
（Ｒｏｂｅｒｔｓ，Ａ．Ｂ．），シャル（Ｓｈｕｌｌ，
Ｊ．Ｈ．），スミス（Ｓｍｉｔｈ，Ｊ．Ｍ．），ワード
（Ｗａｒｄ，Ｊ．Ｍ．）およびソデック（Ｓｏｄｅｋ，
Ｊ．）、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）２１９，１３２
９−１３３１（１９８３）。 １８．フローリック（Ｆｒｏｌｉｋ，Ｃ．Ａ．），ウエ
イクフィールド（Ｗａｋｅｆｉｅｌｄ，Ｌ．Ｍ．），ス
ミス（Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｍ．）およびスポーン（Ｓｐｏ
ｒｎ，Ｍ．Ｂ．）、ジャーナル・オブ・バイオロジカル
・ケミストリー（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．）２５９，
１０９９５−１１０００（１９８４）。 １９．タッカー（Ｔｕｃｋｅｒ，Ｒ．Ｆ．），ブラナム
（Ｂｒａｎｕｍ，Ｅ．Ｌ．），シップレー（Ｓｈｉｐｌ
ｅｙ，Ｇ．Ｄ．），ライアン（Ｒｙａｎ，Ｒ．Ｊ．）お
よびモーゼス（Ｍｏｓｅｓ，Ｈ．Ｌ．）、プロシーディ
ング・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエン
ス（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．）、ＵＳ
Ａ ８１，６７５７−６７６１（１９８４）。 ２０．アソイアン（Ａｓｓｏｉａｎ，Ｒ．Ｋ．），フロ
ーリック（Ｆｒｏｌｉｋ，Ｃ．Ａ．），ロバーツ（Ｒｏ
ｂｅｒｔｓ，Ａ．Ｂ．），ミラー（Ｍｉｌｌｅｒ，Ｄ．
Ｍ．）およびスポーン（Ｓｐｏｒｎ，Ｍ．Ｂ．）、セル
（Ｃｅｌｌ）３６，３５−４１（１９８４）。
【００６５】２１．タッカー（Ｔｕｃｋｅｒ，Ｒ．
Ｆ．），フォルケナント（Ｖｏｌｋｅｎａｎｔ，Ｍ．
Ｅ．），ブラナム（Ｂｒａｎｕｍ，Ｅ．Ｌ．）およびモ
ーゼス（Ｍｏｓｅｓ，Ｈ．Ｌ．）、カンサー・リサーチ
（Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．）４３，１５８１−１５８６
（１９８３）。 ２２．アンザノ（Ａｎｚａｎｏ，Ｍ．Ａ．），ロバーツ
（Ｒｏｂｅｒｔｓ，Ａ．Ｂ．），デ・ラルコ（Ｄｅ Ｌ
ａｒｃｏ，Ｊ．Ｅ．），ウエイクフィールド（Ｗａｋｅ
ｆｉｅｌｄ，Ｌ．Ｍ．），アソイアン（Ａｓｓｏｉａ
ｎ，Ｒ．Ｋ．），ロシュ（Ｒｏｃｈｅ，Ｎ．Ｓ．），ス
ミス（Ｓｍｉｔｈ，Ｊ．Ｅ．），ラザルス（Ｌａｚａｒ
ｕｓ，Ｊ．Ｅ．）およびスポーン（Ｓｐｏｒｎ，Ｍ．
Ｂ．）、モレキュラー・アンド・セルラー・バイオロジ
ー（Ｍｏｌｅｃ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌｏｇｙ）５，２４
２−２４７（１９８５）。 ２３．ロバーツ（Ｒｏｂｅｒｔｓ，Ａ．Ｂ．），アンザ
ノ（Ａｎｚａｎｏ，Ｍ．Ａ．），ウエイクフィールド
（Ｗａｋｅｆｉｅｌｄ，Ｌ．Ａ．），ロシュ（Ｒｏｃｈ
ｅ，Ｎ．Ｓ．），スターン（Ｓｔｅｒｎ，Ｄ．Ｆ．）お
よびスポーン（Ｓｐｏｒｎ，Ｍ．Ｄ．）、プロシーディ
ング・オブ・ナショナル・アカザミー・オブ・サイエン
ス（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．）、ＵＳ
Ａ ８２，１１９−１２３（１９８５）。 ２４．タッカー（Ｔｕｃｋｅｒ,Ｒ.Ｆ.），シップレー
（Ｓｈｉｐｌｅｙ，Ｇ．Ｄ．），モーゼス（Ｍｏｓｅ
ｓ，Ｈ．Ｌ．）およびホリー（Ｈｏｌｌｅｙ，Ｒ．
Ｗ．）、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）２２６,７０５
−７０７（１９８４）。 ２５．ミッチェル（Ｍｉｔｃｈｅｌｌ，Ｗ．Ｍ．）メソ
ッズ・オブ・エンザイモロジー（Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍ
ｏｌ．）ＸＬＶＩＩ，ｐ．１６５−１７０（１９７
７）。 ２６．グランサム（Ｇｒａｎｔｈａｍ，Ｒ．），ゴーテ
ィエ（Ｇａｕｔｉｅｒ，Ｃ．），ゴウイ（Ｇｏｕｙ，
Ｍ．），ジャコブゾン（Ｊａｃｏｂｚｏｎｅ，Ｍ．）お
よびマーシャー（Ｍｅｒｃｉｅｒ，Ｒ．）、ニュークレ
イック・アシッズ・リサーチ（Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ
Ｒｅｓ．）９，４３−７３（１９８１）。 ２７．バード（Ｂｉｒｄ，Ａ．Ｐ．）、ニュクレイック
・アシッズ・リサーチ（Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅ
ｓ．）８，１４９９−１５０４（１９８０）。
Ｆ．），フォルケナント（Ｖｏｌｋｅｎａｎｔ，Ｍ．
Ｅ．），ブラナム（Ｂｒａｎｕｍ，Ｅ．Ｌ．）およびモ
ーゼス（Ｍｏｓｅｓ，Ｈ．Ｌ．）、カンサー・リサーチ
（Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．）４３，１５８１−１５８６
（１９８３）。 ２２．アンザノ（Ａｎｚａｎｏ，Ｍ．Ａ．），ロバーツ
（Ｒｏｂｅｒｔｓ，Ａ．Ｂ．），デ・ラルコ（Ｄｅ Ｌ
ａｒｃｏ，Ｊ．Ｅ．），ウエイクフィールド（Ｗａｋｅ
ｆｉｅｌｄ，Ｌ．Ｍ．），アソイアン（Ａｓｓｏｉａ
ｎ，Ｒ．Ｋ．），ロシュ（Ｒｏｃｈｅ，Ｎ．Ｓ．），ス
ミス（Ｓｍｉｔｈ，Ｊ．Ｅ．），ラザルス（Ｌａｚａｒ
ｕｓ，Ｊ．Ｅ．）およびスポーン（Ｓｐｏｒｎ，Ｍ．
Ｂ．）、モレキュラー・アンド・セルラー・バイオロジ
ー（Ｍｏｌｅｃ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌｏｇｙ）５，２４
２−２４７（１９８５）。 ２３．ロバーツ（Ｒｏｂｅｒｔｓ，Ａ．Ｂ．），アンザ
ノ（Ａｎｚａｎｏ，Ｍ．Ａ．），ウエイクフィールド
（Ｗａｋｅｆｉｅｌｄ，Ｌ．Ａ．），ロシュ（Ｒｏｃｈ
ｅ，Ｎ．Ｓ．），スターン（Ｓｔｅｒｎ，Ｄ．Ｆ．）お
よびスポーン（Ｓｐｏｒｎ，Ｍ．Ｄ．）、プロシーディ
ング・オブ・ナショナル・アカザミー・オブ・サイエン
ス（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．）、ＵＳ
Ａ ８２，１１９−１２３（１９８５）。 ２４．タッカー（Ｔｕｃｋｅｒ,Ｒ.Ｆ.），シップレー
（Ｓｈｉｐｌｅｙ，Ｇ．Ｄ．），モーゼス（Ｍｏｓｅ
ｓ，Ｈ．Ｌ．）およびホリー（Ｈｏｌｌｅｙ，Ｒ．
Ｗ．）、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）２２６,７０５
−７０７（１９８４）。 ２５．ミッチェル（Ｍｉｔｃｈｅｌｌ，Ｗ．Ｍ．）メソ
ッズ・オブ・エンザイモロジー（Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍ
ｏｌ．）ＸＬＶＩＩ，ｐ．１６５−１７０（１９７
７）。 ２６．グランサム（Ｇｒａｎｔｈａｍ，Ｒ．），ゴーテ
ィエ（Ｇａｕｔｉｅｒ，Ｃ．），ゴウイ（Ｇｏｕｙ，
Ｍ．），ジャコブゾン（Ｊａｃｏｂｚｏｎｅ，Ｍ．）お
よびマーシャー（Ｍｅｒｃｉｅｒ，Ｒ．）、ニュークレ
イック・アシッズ・リサーチ（Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ
Ｒｅｓ．）９，４３−７３（１９８１）。 ２７．バード（Ｂｉｒｄ，Ａ．Ｐ．）、ニュクレイック
・アシッズ・リサーチ（Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅ
ｓ．）８，１４９９−１５０４（１９８０）。
【００６６】２８．ローン（Ｌａｗｎ，Ｒ．Ｍ．），フ
リッチュ（Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．），パーカー（Ｐ
ａｒｋｅｒ，Ｒ．Ｃ．），ブレイク（Ｂｌａｋｅ，
Ｇ．）およびマニアティス（Ｍａｎｉａｔｉｓ，
Ｔ．）、セル（Ｃｅｌｌ）１５，１１５７−１１７４
（１９７８）。 ２９．ドブナー（Ｄｏｂｎｅｒ，Ｐ．Ｒ．），カワサキ
（Ｋａｗａｓａｋｉ，Ｅ．Ｓ．），ユー（Ｙｕ，Ｌ．
Ｙ．）およびバンクロフト（Ｂａｎｃｒｏｆｔ，Ｆ．
Ｃ．）、プロシーディング・オブ・ナショナル・アカデ
ミー・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａ
ｄ．Ｓｃｉ．）ＵＳＡ ７８，２２３０−２２３４（１
９８１）。 ３０．トーマス（Ｔｈｏｍａｓ，Ｐ．Ｓ．）、プロシー
ディング・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイ
エンス（ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．）Ｕ
ＳＡ ７７，５２０１−５２０５（１９８０）。 ３１．ヴォルケール（Ｖｏｌｃｋａｅｒｔ，Ｇ．），ダ
ヴェルニエ（Ｔａｖｅｒｎｉｅｒ，Ｊ．），デリンク
（Ｄｅｒｙｎｃｋ，Ｒ．），デヴォ（Ｄｅｖｏｓ，
Ｒ．）およびフィエール（Ｆｉｅｒｓ，Ｗ．）、ジーン
（Ｇｅｎｅ）１５，２１５−２２３（１９８１）。 ３２．プラウドフット（ｐｒｏｕｄｆｏｏｔ，Ｎ．
Ｊ．）およびブラウンリー（Ｂｒｏｗｎｌｅｅ，Ｇ．
Ｇ．）ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）２５３，２１１−２
１４（１９７６）。 ３３．レヴィ（Ｌｅｖｙ，Ｗ．Ｐ．），ルビンシュタイ
ン（Ｒｕｂｉｎｓｔｅｉｎ，Ｍ．），シヴリー（Ｓｈｉ
ｖｅｌｙ，Ｊ．），デル・バル（Ｄｅｌ Ｖａｌｌｅ，
Ｕ．），レイ（Ｌａｉ，Ｃ．−Ｙ．），モシェラ（Ｍｏ
ｓｃｈｅｒａ，Ｊ．），ブリンク（Ｂｒｉｎｋ，
Ｌ．），ガーバー（Ｇｅｒｂｅｒ，Ｌ．），シュタイン
（Ｓｔｅｉｎ，Ｓ．）およびペスカ（Ｐｅｓｔｋａ，
Ｓ．）、プロシーディング・オブ・ナショナル・アカデ
ミー・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａ
ｄ．Ｓｃｉ．）ＵＳＡ ７８，６１８６−６１９０（１
９８１）。 ３４．リンダーネヒト（Ｒｉｎｄｅｒｋｎｅｃｈｔ，
Ｅ．），オコナー（Ｏ’Ｃｏｎｎｏｒ，Ｂ．Ｈ．）およ
びロドリゲッツ（Ｒｏｄｒｉｑｕｅｚ，Ｈ．）、ジャー
ナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊ．Ｂｉ
ｏｌ．Ｃｈｅｍ．）２５９，６７９０−６７９７（１９
８４）。
リッチュ（Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．），パーカー（Ｐ
ａｒｋｅｒ，Ｒ．Ｃ．），ブレイク（Ｂｌａｋｅ，
Ｇ．）およびマニアティス（Ｍａｎｉａｔｉｓ，
Ｔ．）、セル（Ｃｅｌｌ）１５，１１５７−１１７４
（１９７８）。 ２９．ドブナー（Ｄｏｂｎｅｒ，Ｐ．Ｒ．），カワサキ
（Ｋａｗａｓａｋｉ，Ｅ．Ｓ．），ユー（Ｙｕ，Ｌ．
Ｙ．）およびバンクロフト（Ｂａｎｃｒｏｆｔ，Ｆ．
Ｃ．）、プロシーディング・オブ・ナショナル・アカデ
ミー・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａ
ｄ．Ｓｃｉ．）ＵＳＡ ７８，２２３０−２２３４（１
９８１）。 ３０．トーマス（Ｔｈｏｍａｓ，Ｐ．Ｓ．）、プロシー
ディング・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイ
エンス（ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．）Ｕ
ＳＡ ７７，５２０１−５２０５（１９８０）。 ３１．ヴォルケール（Ｖｏｌｃｋａｅｒｔ，Ｇ．），ダ
ヴェルニエ（Ｔａｖｅｒｎｉｅｒ，Ｊ．），デリンク
（Ｄｅｒｙｎｃｋ，Ｒ．），デヴォ（Ｄｅｖｏｓ，
Ｒ．）およびフィエール（Ｆｉｅｒｓ，Ｗ．）、ジーン
（Ｇｅｎｅ）１５，２１５−２２３（１９８１）。 ３２．プラウドフット（ｐｒｏｕｄｆｏｏｔ，Ｎ．
Ｊ．）およびブラウンリー（Ｂｒｏｗｎｌｅｅ，Ｇ．
Ｇ．）ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）２５３，２１１−２
１４（１９７６）。 ３３．レヴィ（Ｌｅｖｙ，Ｗ．Ｐ．），ルビンシュタイ
ン（Ｒｕｂｉｎｓｔｅｉｎ，Ｍ．），シヴリー（Ｓｈｉ
ｖｅｌｙ，Ｊ．），デル・バル（Ｄｅｌ Ｖａｌｌｅ，
Ｕ．），レイ（Ｌａｉ，Ｃ．−Ｙ．），モシェラ（Ｍｏ
ｓｃｈｅｒａ，Ｊ．），ブリンク（Ｂｒｉｎｋ，
Ｌ．），ガーバー（Ｇｅｒｂｅｒ，Ｌ．），シュタイン
（Ｓｔｅｉｎ，Ｓ．）およびペスカ（Ｐｅｓｔｋａ，
Ｓ．）、プロシーディング・オブ・ナショナル・アカデ
ミー・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａ
ｄ．Ｓｃｉ．）ＵＳＡ ７８，６１８６−６１９０（１
９８１）。 ３４．リンダーネヒト（Ｒｉｎｄｅｒｋｎｅｃｈｔ，
Ｅ．），オコナー（Ｏ’Ｃｏｎｎｏｒ，Ｂ．Ｈ．）およ
びロドリゲッツ（Ｒｏｄｒｉｑｕｅｚ，Ｈ．）、ジャー
ナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊ．Ｂｉ
ｏｌ．Ｃｈｅｍ．）２５９，６７９０−６７９７（１９
８４）。
【００６７】３５．コザック（Ｋｏｚａｋ，Ｍ．）、ニ
ュークレイック・アシッズ・リサーチ（Ｎｕｃｌ．Ａｃ
ｉｄｓ Ｒｅｓ．）１２，８５７−８７２（１９８
４）。 ３６．シェファード（Ｓｈｅｐｈｅｒｄ，Ｊ．Ｃ．
Ｗ．）、プロシーディング・オブ・ナショナル・アカデ
ミー・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａ
ｄ．Ｓｃｉ．）ＵＳＡ ７８，１５９６，１６００（１
９８１）。 ３７．バッティ（Ｂａｔｔｅｙ，Ｊ．），ムールディン
グ（Ｍｏｕｌｄｉｎｇ，Ｃ．），タウブ（Ｔａｕｂ，
Ｒ．），ムルフィー（Ｍｕｒｐｈｙ，Ｗ．），スチュワ
ート（Ｓｔｅｗａｒｔ，Ｔ．），ポッター（Ｐｏｔｔｅ
ｒ，Ｈ．），レノアー（Ｌｅｎｏｉｒ，Ｇ．）およびレ
ダー（Ｌｅｄｅｒ，Ｐ．）、セル（Ｃｅｌｌ）３４，７
７９−７８７（１９８３）。 ３８．引用文献なし ３９．引用文献なし ４０．マックナイト（ＭｃＫｎｉｇｈｔ，Ｓ．Ｌ．），
キングスベリー（Ｋｉｎｇｓｂｕｒｙ，Ｒ．Ｃ．），ス
ペンス（Ｓｐｅｎｃｅ，Ａ．）およびスミス（Ｓｍｉｔ
ｈ，Ｍ．）、セル（Ｃｅｌｌ）３７，２５３−２６２
（１９８４）。 ４１．ダイナン（Ｄｙｎａｎ，Ｗ．Ｓ．）およびテイア
ン（Ｔｊｉａｎ，Ｒ．）、セル（Ｃｅｌｌ）３５，７９
−８７（１９８３）。 ４２．ギドニ（Ｇｉｄｏｎｉ，Ｄ．），ダイナン（Ｄｙ
ｎａｎ，Ｗ．Ｓ．）およびテイアン（Ｔｊｉａｎ，
Ｒ．）、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）３１２，４０９−
４１３（１９８４）。 ４３．ベノイスト（Ｂｅｎｏｉｓｔ，Ｃ．），オーヘイ
ル（Ｏ’Ｈａｒｅ，Ｋ．），ブラットナック（Ｂｒａｅ
ｔｎａｃｈ，Ｒ．）およびチャンボン（Ｃｈａｍｂｏ
ｎ，ｐ．）、ニュークレイック・アシッズ・リサーチ
（Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．）１２７−１４２
（１９８０）。 ４４．ノダ（Ｎｏｄａ，Ｍ．），フルタニ（Ｆｕｒｕｔ
ａｎｉ，Ｙ．）タカハシ（Ｔａｋａｈａｓｈｉ，
Ｈ．），トイサト（Ｔｏｙｓａｔｏ，Ｍ．），ヒロセ
（Ｈｉｒｏｓｅ，Ｔ．），イマヤマ（Ｉｍａｙａｍａ，
Ｓ．），ナカニシ（Ｎａｋａｎｉｓｈｉ，Ｓ．）および
ヌマ（Ｎｕｍａ，Ｓ．）、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）
２９５，２０２−２０６（１９８２）。
ュークレイック・アシッズ・リサーチ（Ｎｕｃｌ．Ａｃ
ｉｄｓ Ｒｅｓ．）１２，８５７−８７２（１９８
４）。 ３６．シェファード（Ｓｈｅｐｈｅｒｄ，Ｊ．Ｃ．
Ｗ．）、プロシーディング・オブ・ナショナル・アカデ
ミー・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａ
ｄ．Ｓｃｉ．）ＵＳＡ ７８，１５９６，１６００（１
９８１）。 ３７．バッティ（Ｂａｔｔｅｙ，Ｊ．），ムールディン
グ（Ｍｏｕｌｄｉｎｇ，Ｃ．），タウブ（Ｔａｕｂ，
Ｒ．），ムルフィー（Ｍｕｒｐｈｙ，Ｗ．），スチュワ
ート（Ｓｔｅｗａｒｔ，Ｔ．），ポッター（Ｐｏｔｔｅ
ｒ，Ｈ．），レノアー（Ｌｅｎｏｉｒ，Ｇ．）およびレ
ダー（Ｌｅｄｅｒ，Ｐ．）、セル（Ｃｅｌｌ）３４，７
７９−７８７（１９８３）。 ３８．引用文献なし ３９．引用文献なし ４０．マックナイト（ＭｃＫｎｉｇｈｔ，Ｓ．Ｌ．），
キングスベリー（Ｋｉｎｇｓｂｕｒｙ，Ｒ．Ｃ．），ス
ペンス（Ｓｐｅｎｃｅ，Ａ．）およびスミス（Ｓｍｉｔ
ｈ，Ｍ．）、セル（Ｃｅｌｌ）３７，２５３−２６２
（１９８４）。 ４１．ダイナン（Ｄｙｎａｎ，Ｗ．Ｓ．）およびテイア
ン（Ｔｊｉａｎ，Ｒ．）、セル（Ｃｅｌｌ）３５，７９
−８７（１９８３）。 ４２．ギドニ（Ｇｉｄｏｎｉ，Ｄ．），ダイナン（Ｄｙ
ｎａｎ，Ｗ．Ｓ．）およびテイアン（Ｔｊｉａｎ，
Ｒ．）、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）３１２，４０９−
４１３（１９８４）。 ４３．ベノイスト（Ｂｅｎｏｉｓｔ，Ｃ．），オーヘイ
ル（Ｏ’Ｈａｒｅ，Ｋ．），ブラットナック（Ｂｒａｅ
ｔｎａｃｈ，Ｒ．）およびチャンボン（Ｃｈａｍｂｏ
ｎ，ｐ．）、ニュークレイック・アシッズ・リサーチ
（Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．）１２７−１４２
（１９８０）。 ４４．ノダ（Ｎｏｄａ，Ｍ．），フルタニ（Ｆｕｒｕｔ
ａｎｉ，Ｙ．）タカハシ（Ｔａｋａｈａｓｈｉ，
Ｈ．），トイサト（Ｔｏｙｓａｔｏ，Ｍ．），ヒロセ
（Ｈｉｒｏｓｅ，Ｔ．），イマヤマ（Ｉｍａｙａｍａ，
Ｓ．），ナカニシ（Ｎａｋａｎｉｓｈｉ，Ｓ．）および
ヌマ（Ｎｕｍａ，Ｓ．）、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）
２９５，２０２−２０６（１９８２）。
【００６８】４５．グブラー（Ｇｕｂｌｅｒ，Ｕ．），
シーブルグ（Ｓｅｅｂｕｒｇ，Ｐ．），ホフマン（Ｈｏ
ｆｆｍａｎ，Ｂ．Ｊ．），ゲージ（Ｇａｇｅ，Ｌ．
Ｐ．）およびユーデンフレンド（Ｕｄｅｎｆｒｉｅｎ
ｄ，Ｓ．）、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）２９５，２０
６−２０８（１９８２）。 ４６．アマラ（Ａｍａｒａ，Ｓ．Ｇ．），ジョナス（Ｊ
ｏｎａｓ，Ｖ．），ローゼンフェルド（Ｒｏｓｅｎｆｅ
ｌｄ，Ｍ．），オング（Ｏｎｇ．Ｅ．Ｓ．）およびエバ
ンス（Ｅｖａｎｓ，Ｒ．Ｍ．）、ネイチャー（Ｎａｔｕ
ｒｅ）２９８，２４０−２４４（１９８２）。 ４７．ナカニシ（Ｎａｋａｎｉｓｈｉ，Ｓ．），イノウ
エ（Ｉｎｏｕｅ，Ａ．），ナカムラ（Ｎａｋａｍｕｒ
ａ，Ｍ．），チャン（Ｃｈａｎｇ，Ａ．Ｃ．Ｙ．），コ
ーエン（Ｃｏｈｅｎ，Ｓ．Ｎ．）およびヌマ（Ｎｕｍ
ａ，Ｓ．）ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）２７８，４２３
−４２７（１９７９）。 ４８．カイト（Ｋｙｔｅ，Ｊ．）およびドリトル（Ｄｏ
ｏｌｉｔｔｌｅ，Ｒ．Ｆ．）、ジャーナル・オブ・モレ
キュラー・バイオロジー（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．）１
５７，１０５−１３２（１９８２）。 ４９．ウインツラー（Ｗｉｎｚｌｅｒ，Ｒ．Ｊ．）、ホ
ルモナル・プロテインズ・アンド・ペプタイズ１（Ｈｏ
ｒｍｏｎａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ａｎｄ Ｐｅｐｔｉ
ｄｅｓ１）、［リ（Ｌｉ，Ｃ．Ｉ．）編］、（ニューヨ
ーク、アカデミック・プレス）ｐ．１−１５（１９７
３）。 ５０．ガーニエ（Ｇａｒｎｉｅｒ，Ｊ．），オスグソル
プ（Ｏｓｇｕｔｈｏｒｐｅ，Ｄ．Ｊ．）およびロブソン
（Ｒｏｂｓｏｎ，Ｂ．）ジャーナル・オブ・モレキュラ
ー・バイオロジー（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．）１２０，
９７−１２０（１９７８）。 ５１．アーノン（Ａｒｎｏｎ，ｐ．Ｅ．），ウエブ（Ｗ
ｅｂｂ，Ａ．Ｃ．），ローゼンバッセル（Ｒｏｓｅｎｗ
ａｓｓｅｒ，Ｌ．Ｊ．），ムッチ（Ｍｕｃｃｉ，Ｓ．
Ｆ．），リッチ（Ｒｉｃｈ，Ａ．），ウォルフ（Ｗｏｌ
ｆｆ，Ｓ．Ｍ．）およびディナレロ（Ｄｉｎａｒｅｌｌ
ｏ，Ｃ．Ａ．）、プロシーディング・オブ・ナショナル
・アカデミー・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ
ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．）ＵＳＡ ８１，７９０７−７
９１１（１９８４）。
シーブルグ（Ｓｅｅｂｕｒｇ，Ｐ．），ホフマン（Ｈｏ
ｆｆｍａｎ，Ｂ．Ｊ．），ゲージ（Ｇａｇｅ，Ｌ．
Ｐ．）およびユーデンフレンド（Ｕｄｅｎｆｒｉｅｎ
ｄ，Ｓ．）、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）２９５，２０
６−２０８（１９８２）。 ４６．アマラ（Ａｍａｒａ，Ｓ．Ｇ．），ジョナス（Ｊ
ｏｎａｓ，Ｖ．），ローゼンフェルド（Ｒｏｓｅｎｆｅ
ｌｄ，Ｍ．），オング（Ｏｎｇ．Ｅ．Ｓ．）およびエバ
ンス（Ｅｖａｎｓ，Ｒ．Ｍ．）、ネイチャー（Ｎａｔｕ
ｒｅ）２９８，２４０−２４４（１９８２）。 ４７．ナカニシ（Ｎａｋａｎｉｓｈｉ，Ｓ．），イノウ
エ（Ｉｎｏｕｅ，Ａ．），ナカムラ（Ｎａｋａｍｕｒ
ａ，Ｍ．），チャン（Ｃｈａｎｇ，Ａ．Ｃ．Ｙ．），コ
ーエン（Ｃｏｈｅｎ，Ｓ．Ｎ．）およびヌマ（Ｎｕｍ
ａ，Ｓ．）ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）２７８，４２３
−４２７（１９７９）。 ４８．カイト（Ｋｙｔｅ，Ｊ．）およびドリトル（Ｄｏ
ｏｌｉｔｔｌｅ，Ｒ．Ｆ．）、ジャーナル・オブ・モレ
キュラー・バイオロジー（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．）１
５７，１０５−１３２（１９８２）。 ４９．ウインツラー（Ｗｉｎｚｌｅｒ，Ｒ．Ｊ．）、ホ
ルモナル・プロテインズ・アンド・ペプタイズ１（Ｈｏ
ｒｍｏｎａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ａｎｄ Ｐｅｐｔｉ
ｄｅｓ１）、［リ（Ｌｉ，Ｃ．Ｉ．）編］、（ニューヨ
ーク、アカデミック・プレス）ｐ．１−１５（１９７
３）。 ５０．ガーニエ（Ｇａｒｎｉｅｒ，Ｊ．），オスグソル
プ（Ｏｓｇｕｔｈｏｒｐｅ，Ｄ．Ｊ．）およびロブソン
（Ｒｏｂｓｏｎ，Ｂ．）ジャーナル・オブ・モレキュラ
ー・バイオロジー（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．）１２０，
９７−１２０（１９７８）。 ５１．アーノン（Ａｒｎｏｎ，ｐ．Ｅ．），ウエブ（Ｗ
ｅｂｂ，Ａ．Ｃ．），ローゼンバッセル（Ｒｏｓｅｎｗ
ａｓｓｅｒ，Ｌ．Ｊ．），ムッチ（Ｍｕｃｃｉ，Ｓ．
Ｆ．），リッチ（Ｒｉｃｈ，Ａ．），ウォルフ（Ｗｏｌ
ｆｆ，Ｓ．Ｍ．）およびディナレロ（Ｄｉｎａｒｅｌｌ
ｏ，Ｃ．Ａ．）、プロシーディング・オブ・ナショナル
・アカデミー・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ
ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．）ＵＳＡ ８１，７９０７−７
９１１（１９８４）。
【００６９】５２．ロメディコ（Ｌｏｍｅｄｉｃｏ．
ｐ．），ゲブラー（Ｇｕｅｂｌｅｒ，Ｕ．），ヘルマン
（Ｈｅｌｌｍａｎｎ，ｐ．），ドウコビッチ（Ｄｕｋｏ
ｖｉｃｈ，Ｍ．），ギリ（Ｇｉｒｉ，Ｊ．Ｇ．），パン
（Ｐａｎ，Ｙ．−Ｃ．），コリエル（Ｃｏｌｌｉｅｒ，
Ｋ．），セミオノウ（Ｓｅｍｉｏｎｏｗ，Ｒ．），チュ
ア（Ｃｈｕａ，Ａ．Ｄ．）およびミゼル（Ｍｉｚｅｌ，
Ｓ．Ｂ．）、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）３１２，４５
８−４６２（１９８４）。 ５３．ペニカ（Ｐｅｎｎｉｃａ，Ｄ．），ネドウイン
（Ｎｅｄｗｉｎ，Ｇ．），ヘイフリック（Ｈａｙｆｌｉ
ｃｋ，Ｊ．Ｓ．），シーブルグ（Ｓｅｅｂｕｒｇ，ｐ．
Ｈ．），デリンク（Ｄｅｒｙｎｃｋ，Ｒ．），パラディ
ノ（Ｐａｌｌａｄｉｎｏ，Ｍ．Ａ．），コール（Ｋｏｈ
ｒ，Ｗ．Ｊ．），アガーワル（Ａｇｇａｒｗａｌ，Ｂ．
Ｂ．）およびゲツデル（Ｇｏｅｄｄｅｌ，Ｄ．Ｖ．）、
ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）３１２，７２４−７２９
（１９８４）。 ５４．ヴァン・デン・エルゼン（Ｖａｎ ｄｅｎ Ｅｌ
ｓｅｎ），シェプレー（Ｓｈｅｐｌｅｙ，Ｂ．−
Ａ．），ボースト（Ｂｏｒｓｔ，Ｊ．），コリガン（Ｃ
ｏｌｉｇａｎ，Ｊ．Ｅ．），マーカム（Ｍａｒｋｈａ
ｍ，Ａ．），オルキン（Ｏｒｋｉｎ，Ｓ．）およびテル
ホルスト（Ｔｅｒｈｏｒｓｔ，Ｃ．）、ネイチャー（Ｎ
ａｔｕｒｅ）３１２，４１３−４１８（１９８４）。 ５５．ナサンス（Ｎａｔｈａｎｓ，Ｊ．）およびホグネ
ス（Ｈｏｇｎｅｓｓ，Ｄ．）、プロシーディング・オブ
・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Ｐｒｏ
ｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．）ＵＳＡ ４８５１
−４８５５（１９８４）。
ｐ．），ゲブラー（Ｇｕｅｂｌｅｒ，Ｕ．），ヘルマン
（Ｈｅｌｌｍａｎｎ，ｐ．），ドウコビッチ（Ｄｕｋｏ
ｖｉｃｈ，Ｍ．），ギリ（Ｇｉｒｉ，Ｊ．Ｇ．），パン
（Ｐａｎ，Ｙ．−Ｃ．），コリエル（Ｃｏｌｌｉｅｒ，
Ｋ．），セミオノウ（Ｓｅｍｉｏｎｏｗ，Ｒ．），チュ
ア（Ｃｈｕａ，Ａ．Ｄ．）およびミゼル（Ｍｉｚｅｌ，
Ｓ．Ｂ．）、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）３１２，４５
８−４６２（１９８４）。 ５３．ペニカ（Ｐｅｎｎｉｃａ，Ｄ．），ネドウイン
（Ｎｅｄｗｉｎ，Ｇ．），ヘイフリック（Ｈａｙｆｌｉ
ｃｋ，Ｊ．Ｓ．），シーブルグ（Ｓｅｅｂｕｒｇ，ｐ．
Ｈ．），デリンク（Ｄｅｒｙｎｃｋ，Ｒ．），パラディ
ノ（Ｐａｌｌａｄｉｎｏ，Ｍ．Ａ．），コール（Ｋｏｈ
ｒ，Ｗ．Ｊ．），アガーワル（Ａｇｇａｒｗａｌ，Ｂ．
Ｂ．）およびゲツデル（Ｇｏｅｄｄｅｌ，Ｄ．Ｖ．）、
ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）３１２，７２４−７２９
（１９８４）。 ５４．ヴァン・デン・エルゼン（Ｖａｎ ｄｅｎ Ｅｌ
ｓｅｎ），シェプレー（Ｓｈｅｐｌｅｙ，Ｂ．−
Ａ．），ボースト（Ｂｏｒｓｔ，Ｊ．），コリガン（Ｃ
ｏｌｉｇａｎ，Ｊ．Ｅ．），マーカム（Ｍａｒｋｈａ
ｍ，Ａ．），オルキン（Ｏｒｋｉｎ，Ｓ．）およびテル
ホルスト（Ｔｅｒｈｏｒｓｔ，Ｃ．）、ネイチャー（Ｎ
ａｔｕｒｅ）３１２，４１３−４１８（１９８４）。 ５５．ナサンス（Ｎａｔｈａｎｓ，Ｊ．）およびホグネ
ス（Ｈｏｇｎｅｓｓ，Ｄ．）、プロシーディング・オブ
・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Ｐｒｏ
ｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．）ＵＳＡ ４８５１
−４８５５（１９８４）。
【００７０】５６．ノダ（Ｎｏｄａ，Ｍ．），シミズ
（Ｓｈｉｍｉｚｕ，Ｓ．），タナベ（Ｔａｎａｂｅ，
Ｔ．），タカイ（Ｔａｋａｉ，Ｔ．），カヤノ（Ｋａｙ
ａｎｏ，Ｔ．），イケダ（Ｉｋｅｄａ，Ｔ．），タカハ
シ（Ｔａｋａｈａｓｈｉ，Ｈ．），ナカヤマ（Ｎａｋａ
ｙａｍａ，Ｈ．），カナオカ（Ｋａｎａｏｋａ，
Ｙ．），ミナミノ（Ｍｉｎａｍｉｎｏ，Ｎ．），カンガ
ワ（Ｋａｎｇａｗａ，Ｋ．），マツオ（Ｍａｔｓｕｏ，
Ｈ．），ラフテリー（Ｒａｆｔｅｒｙ，Ｍ．Ａ．），ヒ
ロセ（Ｈｉｒｏｓｅ，Ｔ．），イナヤマ（Ｉｎａｙａｍ
ａ，Ｓ．），ハヤシダ（Ｈａｙａｓｈｉｄａ，Ｈ．），
ミヤタ（Ｍｉｙａｔａ，Ｔ．）およびヌマ（Ｎｕｍａ，
Ｓ．）、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）３１２，１２１−
１２７（１９８４）。 ５７．ゴーリン（Ｇｏｒｉｎ，Ｍ．Ｂ．），ヤンセイ
（Ｙａｎｃｅｙ，Ｂ．），クライン（Ｃｌｉｎｅ，
Ｊ．），レベル（Ｒｅｖｅｌ，Ｊ．−ｐ．）およびホル
ウイッツ（Ｈｏｒｗｉｔｚ，Ｊ．）、セル（Ｃｅｌｌ）
３９，４９−５９（１９８４）。 ５８．ノー（Ｎｏｅ，Ｂ．Ｄ．），モラン（Ｍｏｒａ
ｎ，Ｍ．Ｎ．）およびシュピース（Ｓｐｉｅｓｓ，
Ｊ．）、ペプチド：ストラクチャー・アンド・ファンク
ション（Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎ
ｄ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ）、［ピエルス・ケミカル・カン
パニー（Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａ
ｎｙ）；ハービー（Ｈｕｒｂｙ，Ｖ．）およびリッチ
（Ｒｉｃｈ，Ｄ．Ｈ．），編］、ｐ．２１９−２２８
（１９８３）。 ５９．デボウルト（Ｄｅｖａｕｌｔ，Ａ．），ゾリンガ
ー（Ｚｏｌｌｉｎｇｅｒ，Ｍ．）およびクライン（Ｃｒ
ｉｎｅ，Ｐ．）、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・
ケミストリー（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｅｍ．）２５９，５１
４６−５１５１（１９８４）。 ６０．ラエムリ（Ｌａｅｍｍｌｉ，Ｕ．Ｋ．）、ネイチ
ャー（Ｎａｔｕｒｅ）２２７，６８０−６８５（１９７
０）。
（Ｓｈｉｍｉｚｕ，Ｓ．），タナベ（Ｔａｎａｂｅ，
Ｔ．），タカイ（Ｔａｋａｉ，Ｔ．），カヤノ（Ｋａｙ
ａｎｏ，Ｔ．），イケダ（Ｉｋｅｄａ，Ｔ．），タカハ
シ（Ｔａｋａｈａｓｈｉ，Ｈ．），ナカヤマ（Ｎａｋａ
ｙａｍａ，Ｈ．），カナオカ（Ｋａｎａｏｋａ，
Ｙ．），ミナミノ（Ｍｉｎａｍｉｎｏ，Ｎ．），カンガ
ワ（Ｋａｎｇａｗａ，Ｋ．），マツオ（Ｍａｔｓｕｏ，
Ｈ．），ラフテリー（Ｒａｆｔｅｒｙ，Ｍ．Ａ．），ヒ
ロセ（Ｈｉｒｏｓｅ，Ｔ．），イナヤマ（Ｉｎａｙａｍ
ａ，Ｓ．），ハヤシダ（Ｈａｙａｓｈｉｄａ，Ｈ．），
ミヤタ（Ｍｉｙａｔａ，Ｔ．）およびヌマ（Ｎｕｍａ，
Ｓ．）、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）３１２，１２１−
１２７（１９８４）。 ５７．ゴーリン（Ｇｏｒｉｎ，Ｍ．Ｂ．），ヤンセイ
（Ｙａｎｃｅｙ，Ｂ．），クライン（Ｃｌｉｎｅ，
Ｊ．），レベル（Ｒｅｖｅｌ，Ｊ．−ｐ．）およびホル
ウイッツ（Ｈｏｒｗｉｔｚ，Ｊ．）、セル（Ｃｅｌｌ）
３９，４９−５９（１９８４）。 ５８．ノー（Ｎｏｅ，Ｂ．Ｄ．），モラン（Ｍｏｒａ
ｎ，Ｍ．Ｎ．）およびシュピース（Ｓｐｉｅｓｓ，
Ｊ．）、ペプチド：ストラクチャー・アンド・ファンク
ション（Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎ
ｄ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ）、［ピエルス・ケミカル・カン
パニー（Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａ
ｎｙ）；ハービー（Ｈｕｒｂｙ，Ｖ．）およびリッチ
（Ｒｉｃｈ，Ｄ．Ｈ．），編］、ｐ．２１９−２２８
（１９８３）。 ５９．デボウルト（Ｄｅｖａｕｌｔ，Ａ．），ゾリンガ
ー（Ｚｏｌｌｉｎｇｅｒ，Ｍ．）およびクライン（Ｃｒ
ｉｎｅ，Ｐ．）、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・
ケミストリー（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｅｍ．）２５９，５１
４６−５１５１（１９８４）。 ６０．ラエムリ（Ｌａｅｍｍｌｉ，Ｕ．Ｋ．）、ネイチ
ャー（Ｎａｔｕｒｅ）２２７，６８０−６８５（１９７
０）。
【００７１】６１．ロドリゲッツ（Ｒｏｄｒｉｇｕｅ
ｚ，Ｈ．），コール（Ｋｏｈｒ，ｗ．Ｊ．）およびハー
キンス（Ｈａｒｋｉｎｓ，Ｒ．Ｎ．）、アナリティカル
・バイオケミストリー（Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．）
１４０，５３８−５４７（１９８４）。 ６２．ヘウイック（Ｈｅｗｉｃｋ，Ｒ．Ｍ．），ハンカ
ピラー（Ｈｕｎｋａｐｉｌｌｅｒ，Ｍ．Ｗ．），フッド
（Ｈｏｏｄ，Ｌ．Ｅ．）およびドレイヤー（Ｄｒｅｙｅ
ｒ，Ｗ．Ｊ．）、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・
ケミストリー（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．）２５６，７
９９０−７９９７（１９８１）。 ６３．クレア（Ｃｒｅａ，Ｒ．）およびホーン（Ｈｏｒ
ｎ，Ｔ．）、ニュークレイック・アシッズ・リサーチ
（Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．）８，２３３１−２
３４８（１９８０）。 ６４．ビューケージ（Ｂｅａｕｃａｇｅ，Ｓ．Ｌ．）お
よびカルサーズ（Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ，Ｍ．）、テトラ
ヘドロン・レターズ（ＴｅｔｒａｈｅｄｒｏｎＬｅｔ
ｔ．）２２，１８５９（１９８１）。 ６５．ウルリッチ（Ｕｌｌｒｉｃｈ，Ａ．），バーマン
（Ｂｅｒｍａｎ，Ｃ．Ｈ．），ダル（Ｄｕｌｌ，Ｔ．
Ｊ．），グレイ（Ｇｒａｙ，Ａ．）およびリー（Ｌｅ
ｅ，Ｊ．Ｍ．）エンボ・ジャーナル（ＥＭＢＯ Ｊ．）
３，３６１−３６４（１９８４）。 ６６．ベントン（Ｂｅｎｔｏｎ,Ｗ．Ｄ.）およびデイビ
ィス（Ｄａｖｉｓ,Ｒ．Ｗ．）、サイエンス（Ｓｃｉｅ
ｎｃｅ）１９６,１８０−１８２（１９７７）。 ６７．カファトス（Ｋａｆａｔｏｓ，Ｆ．Ｃ．），ジョ
ーンズ（Ｊｏｎｅｓ，Ｃ．Ｗ．）およびエフストラティ
アディス（Ｅｆｓｔｒａｔｉａｄｉｓ，Ａ．）、ニュー
クレイック・アシッズ・リサーチ（Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ
ｓ Ｒｅｓ．）７，１５４１−１５５２（１９７９）。 ６８．サザーン（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ，Ｅ．Ｍ．）、ジャ
ーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー（Ｊ．Ｍｏ
ｌ．Ｂｉｏｌ．）９８，５０３−５１７（１９７５）。 ６９．サンガー（Ｓａｎｇｅｒ，Ｆ．），ニックレン
（Ｎｉｃｋｌｅｎ，Ｓ．）およびコウルソン（Ｃｏｕｌ
ｓｏｎ，Ａ．Ｒ．）、プロシーディング・オブ・ナショ
ナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ．Ｎａ
ｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．）ＵＳＡ ７４，５４６３−
５４６７（１９７７）。
ｚ，Ｈ．），コール（Ｋｏｈｒ，ｗ．Ｊ．）およびハー
キンス（Ｈａｒｋｉｎｓ，Ｒ．Ｎ．）、アナリティカル
・バイオケミストリー（Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．）
１４０，５３８−５４７（１９８４）。 ６２．ヘウイック（Ｈｅｗｉｃｋ，Ｒ．Ｍ．），ハンカ
ピラー（Ｈｕｎｋａｐｉｌｌｅｒ，Ｍ．Ｗ．），フッド
（Ｈｏｏｄ，Ｌ．Ｅ．）およびドレイヤー（Ｄｒｅｙｅ
ｒ，Ｗ．Ｊ．）、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・
ケミストリー（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．）２５６，７
９９０−７９９７（１９８１）。 ６３．クレア（Ｃｒｅａ，Ｒ．）およびホーン（Ｈｏｒ
ｎ，Ｔ．）、ニュークレイック・アシッズ・リサーチ
（Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．）８，２３３１−２
３４８（１９８０）。 ６４．ビューケージ（Ｂｅａｕｃａｇｅ，Ｓ．Ｌ．）お
よびカルサーズ（Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ，Ｍ．）、テトラ
ヘドロン・レターズ（ＴｅｔｒａｈｅｄｒｏｎＬｅｔ
ｔ．）２２，１８５９（１９８１）。 ６５．ウルリッチ（Ｕｌｌｒｉｃｈ，Ａ．），バーマン
（Ｂｅｒｍａｎ，Ｃ．Ｈ．），ダル（Ｄｕｌｌ，Ｔ．
Ｊ．），グレイ（Ｇｒａｙ，Ａ．）およびリー（Ｌｅ
ｅ，Ｊ．Ｍ．）エンボ・ジャーナル（ＥＭＢＯ Ｊ．）
３，３６１−３６４（１９８４）。 ６６．ベントン（Ｂｅｎｔｏｎ,Ｗ．Ｄ.）およびデイビ
ィス（Ｄａｖｉｓ,Ｒ．Ｗ．）、サイエンス（Ｓｃｉｅ
ｎｃｅ）１９６,１８０−１８２（１９７７）。 ６７．カファトス（Ｋａｆａｔｏｓ，Ｆ．Ｃ．），ジョ
ーンズ（Ｊｏｎｅｓ，Ｃ．Ｗ．）およびエフストラティ
アディス（Ｅｆｓｔｒａｔｉａｄｉｓ，Ａ．）、ニュー
クレイック・アシッズ・リサーチ（Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ
ｓ Ｒｅｓ．）７，１５４１−１５５２（１９７９）。 ６８．サザーン（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ，Ｅ．Ｍ．）、ジャ
ーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー（Ｊ．Ｍｏ
ｌ．Ｂｉｏｌ．）９８，５０３−５１７（１９７５）。 ６９．サンガー（Ｓａｎｇｅｒ，Ｆ．），ニックレン
（Ｎｉｃｋｌｅｎ，Ｓ．）およびコウルソン（Ｃｏｕｌ
ｓｏｎ，Ａ．Ｒ．）、プロシーディング・オブ・ナショ
ナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ．Ｎａ
ｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．）ＵＳＡ ７４，５４６３−
５４６７（１９７７）。
【００７２】７０．メッシング（Ｍｅｓｓｉｎｇ,
Ｊ.），クレア（Ｃｒｅａ,Ｒ.）およびシーブルグ（Ｓ
ｅｅｂｕｒｇ，Ｐ．Ｈ．）、ニュークレイック・アシッ
ズ・リサーチ（Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．）９，
３０９−３２１（１９８１）。 ７１．ウルリッチ（Ｕｌｌｒｉｃｈ，Ａ．），シャイン
（Ｓｈｉｎｅ，Ｊ．），チャーグウイン（Ｃｈｉｒｇｗ
ｉｎ，Ｊ．），ピクテット（Ｐｉｃｔｅｔ，Ｒ．），テ
ィッシャー（Ｔｉｓｃｈｅｒ，Ｅ．），ラッター（Ｒｕ
ｔｔｅｒ，Ｗ．Ｊ．）およびグッドマン（Ｇｏｏｄｍａ
ｎ，Ｈ．Ｍ．）、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）１９
６，１３１３−１３１７（１９７７）。 ７２．アヴィヴ（Ａｖｉｖ，Ｈ．）およびレダー（Ｌｅ
ｄｅｒ，ｐ．）、プロシーディング・オブ・ナショナル
・アカデミー・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ
ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．）ＵＳＡ 69,1408-1412（１９
７２）。 ７３．ウイッケンズ（Ｗｉｃｋｅｎｓ，Ｍ．Ｐ．），ビ
ュエル（Ｂｕｅｌｌ，Ｇ．Ｎ．）およびシムケ（Ｓｃｈ
ｉｍｋｅ，Ｒ．Ｔ．）、ジャーナル・オブ・バイオロジ
カル・ケミストリー（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．）２５
３，２４８３−２４９５（１９７８）。 ７４．ヒューイン（Ｈｕｙｎｈ,Ｔ.Ｖ.），ヤング（Ｙ
ｏｕｎｇ,Ｒ.Ａ.）およびデイビス（Ｄａｖｉｓ,Ｒ．
Ｗ．）、ＤＮＡクローニング・テクニックス（ＤＮＡ
Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ），ア・プラク
ティカル・アプローチ（Ａ ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐ
ｐｒｏａｃｈ）、［グローバー（Ｇｌｏｖｅｒ，Ｄ．),
編］、（ＩＲＬ,Ｏｘｆｏｒｄ）ｐｐ４９−７８（１９
８５）。 ７５．ノーリス（Ｎｏｒｒｉｓ，Ｋ．Ｅ．）,イセレン
タント（Ｉｓｅｒｅｎｔａｎｔ，Ｄ．）,コントレラス
（Ｃｏｎｔｒｅｒａｓ,Ｒ．）およびフィアース（Ｆｉ
ｅｒｓ,Ｗ.）、ジーン（Ｇｅｎｅ）７,３５５−３６２
（１９７９）。 ７６．テイラー（Ｔａｙｌｏｒ，Ｊ．Ｍ．），イルメン
セ（Ｉｌｌｍｅｎｓｅｅ，Ｒ．）およびサマーズ（Ｓｕ
ｍｍｅｒｓ，Ｓ．）、バイオシミカ・エ・バイオフィジ
カ・アクタ（Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔ
ａ）４４２，３２４−３３０（１９７６）。 ７７．グローリー（Ｇｒｏｗｌｅｙ）等,モレキュラー
・アンド・セルラー・バイオロジー（Molec.Cell.Bio
l.）３,４４−５５（１９８３）。 ７８．アンザノ（Ａｎｚａｎｏ）等，モレキュラー・ア
ンド・セルラー・バイオロジー（Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂ
ｉｏｌ．）５，２４２−２４７（１９８５）。 ７９．ヨーロッパ特許出願第７３，６５６Ａ号
Ｊ.），クレア（Ｃｒｅａ,Ｒ.）およびシーブルグ（Ｓ
ｅｅｂｕｒｇ，Ｐ．Ｈ．）、ニュークレイック・アシッ
ズ・リサーチ（Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．）９，
３０９−３２１（１９８１）。 ７１．ウルリッチ（Ｕｌｌｒｉｃｈ，Ａ．），シャイン
（Ｓｈｉｎｅ，Ｊ．），チャーグウイン（Ｃｈｉｒｇｗ
ｉｎ，Ｊ．），ピクテット（Ｐｉｃｔｅｔ，Ｒ．），テ
ィッシャー（Ｔｉｓｃｈｅｒ，Ｅ．），ラッター（Ｒｕ
ｔｔｅｒ，Ｗ．Ｊ．）およびグッドマン（Ｇｏｏｄｍａ
ｎ，Ｈ．Ｍ．）、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）１９
６，１３１３−１３１７（１９７７）。 ７２．アヴィヴ（Ａｖｉｖ，Ｈ．）およびレダー（Ｌｅ
ｄｅｒ，ｐ．）、プロシーディング・オブ・ナショナル
・アカデミー・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ
ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．）ＵＳＡ 69,1408-1412（１９
７２）。 ７３．ウイッケンズ（Ｗｉｃｋｅｎｓ，Ｍ．Ｐ．），ビ
ュエル（Ｂｕｅｌｌ，Ｇ．Ｎ．）およびシムケ（Ｓｃｈ
ｉｍｋｅ，Ｒ．Ｔ．）、ジャーナル・オブ・バイオロジ
カル・ケミストリー（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．）２５
３，２４８３−２４９５（１９７８）。 ７４．ヒューイン（Ｈｕｙｎｈ,Ｔ.Ｖ.），ヤング（Ｙ
ｏｕｎｇ,Ｒ.Ａ.）およびデイビス（Ｄａｖｉｓ,Ｒ．
Ｗ．）、ＤＮＡクローニング・テクニックス（ＤＮＡ
Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ），ア・プラク
ティカル・アプローチ（Ａ ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐ
ｐｒｏａｃｈ）、［グローバー（Ｇｌｏｖｅｒ，Ｄ．),
編］、（ＩＲＬ,Ｏｘｆｏｒｄ）ｐｐ４９−７８（１９
８５）。 ７５．ノーリス（Ｎｏｒｒｉｓ，Ｋ．Ｅ．）,イセレン
タント（Ｉｓｅｒｅｎｔａｎｔ，Ｄ．）,コントレラス
（Ｃｏｎｔｒｅｒａｓ,Ｒ．）およびフィアース（Ｆｉ
ｅｒｓ,Ｗ.）、ジーン（Ｇｅｎｅ）７,３５５−３６２
（１９７９）。 ７６．テイラー（Ｔａｙｌｏｒ，Ｊ．Ｍ．），イルメン
セ（Ｉｌｌｍｅｎｓｅｅ，Ｒ．）およびサマーズ（Ｓｕ
ｍｍｅｒｓ，Ｓ．）、バイオシミカ・エ・バイオフィジ
カ・アクタ（Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔ
ａ）４４２，３２４−３３０（１９７６）。 ７７．グローリー（Ｇｒｏｗｌｅｙ）等,モレキュラー
・アンド・セルラー・バイオロジー（Molec.Cell.Bio
l.）３,４４−５５（１９８３）。 ７８．アンザノ（Ａｎｚａｎｏ）等，モレキュラー・ア
ンド・セルラー・バイオロジー（Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂ
ｉｏｌ．）５，２４２−２４７（１９８５）。 ７９．ヨーロッパ特許出願第７３，６５６Ａ号
【００７３】
配列番号：１ 配列の長さ：１１２ 配列の型：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 起源 生物名：Homo sapiens (ヒト) 組織の種類：胎盤または血小板 配列 Ａｌａ Ｌｅｕ Ａｓｐ Ｔｈｒ Ａｓｎ Ｔｙｒ Ｃｙｓ Ｐｈｅ Ｓｅｒ
Ｓｅｒ Ｔｈｒ Ｇｌｕ Ｌｙｓ Ａｓｎ Ｃｙｓ Ｃｙｓ １ ５
１０ １５ Ｖａｌ Ａｒｇ Ｇｌｎ Ｌｅｕ Ｔｙｒ Ｉｌｅ Ａｓｐ Ｐｈｅ Ａｒｇ
Ｌｙｓ Ａｓｐ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ｔｒｐ Ｌｙｓ Ｔｒｐ ２０ ２５
３０ Ｉｌｅ Ｈｉｓ Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ｌｙｓ Ｇｌｙ Ｔｙｒ Ｈｉｓ Ａｌａ
Ａｓｎ Ｐｈｅ Ｃｙｓ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ｐｒｏ Ｃｙｓ ３５ ４０
４５ Ｐｒｏ Ｔｙｒ Ｉｌｅ Ｔｒｐ Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ａｓｐ Ｔｈｒ Ｇｌｎ
Ｔｙｒ Ｓｅｒ Ｌｙｓ Ｖａｌ Ｌｅｕ Ａｌａ Ｌｅｕ ５０ ５５
６０ Ｔｙｒ Ａｓｎ Ｇｌｎ Ｈｉｓ Ａｓｎ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｓｅｒ
Ａｌａ Ａｌａ Ｐｒｏ Ｃｙｓ Ｃｙｓ Ｖａｌ Ｐｒｏ ６５ ７０
７５ ８０ Ｇｌｎ Ａｌａ Ｌｅｕ Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ｌｅｕ Ｐｒｏ Ｉｌｅ Ｖａｌ
Ｔｙｒ Ｔｙｒ Ｖａｌ Ｇｌｙ Ａｒｇ Ｌｙｓ Ｐｒｏ ８５
９０ ９５ Ｌｙｓ Ｖａｌ Ｇｌｕ Ｇｌｎ Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ａｓｎ Ｍｅｔ Ｉｌｅ
Ｖａｌ Ａｒｇ Ｓｅｒ Ｃｙｓ Ｌｙｓ Ｃｙｓ Ｓｅｒ １００ １０５
１１０ １１２
Ｓｅｒ Ｔｈｒ Ｇｌｕ Ｌｙｓ Ａｓｎ Ｃｙｓ Ｃｙｓ １ ５
１０ １５ Ｖａｌ Ａｒｇ Ｇｌｎ Ｌｅｕ Ｔｙｒ Ｉｌｅ Ａｓｐ Ｐｈｅ Ａｒｇ
Ｌｙｓ Ａｓｐ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ｔｒｐ Ｌｙｓ Ｔｒｐ ２０ ２５
３０ Ｉｌｅ Ｈｉｓ Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ｌｙｓ Ｇｌｙ Ｔｙｒ Ｈｉｓ Ａｌａ
Ａｓｎ Ｐｈｅ Ｃｙｓ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ｐｒｏ Ｃｙｓ ３５ ４０
４５ Ｐｒｏ Ｔｙｒ Ｉｌｅ Ｔｒｐ Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ａｓｐ Ｔｈｒ Ｇｌｎ
Ｔｙｒ Ｓｅｒ Ｌｙｓ Ｖａｌ Ｌｅｕ Ａｌａ Ｌｅｕ ５０ ５５
６０ Ｔｙｒ Ａｓｎ Ｇｌｎ Ｈｉｓ Ａｓｎ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｓｅｒ
Ａｌａ Ａｌａ Ｐｒｏ Ｃｙｓ Ｃｙｓ Ｖａｌ Ｐｒｏ ６５ ７０
７５ ８０ Ｇｌｎ Ａｌａ Ｌｅｕ Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ｌｅｕ Ｐｒｏ Ｉｌｅ Ｖａｌ
Ｔｙｒ Ｔｙｒ Ｖａｌ Ｇｌｙ Ａｒｇ Ｌｙｓ Ｐｒｏ ８５
９０ ９５ Ｌｙｓ Ｖａｌ Ｇｌｕ Ｇｌｎ Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ａｓｎ Ｍｅｔ Ｉｌｅ
Ｖａｌ Ａｒｇ Ｓｅｒ Ｃｙｓ Ｌｙｓ Ｃｙｓ Ｓｅｒ １００ １０５
１１０ １１２
【図１】 ＴＧＦ−βｍＲＮＡの模式図である。
【図２】 プレ−ＴＧＦ−βｃＤＮＡのヌクレオチド配
列および推定のアミノ酸配列を示す模式図である。
列および推定のアミノ酸配列を示す模式図である。
【図３】 プレ−ＴＧＦ−βｃＤＮＡのヌクレオチド配
列および推定のアミノ酸配列を示す模式図である。
列および推定のアミノ酸配列を示す模式図である。
【図４】 プレ−ＴＧＦ−βｃＤＮＡのヌクレオチド配
列および推定のアミノ酸配列を示す模式図である。
列および推定のアミノ酸配列を示す模式図である。
【図５】 ＴＧＦ−βエクソンをコードしているゲノム
フラグメントとその推定のアミノ酸配列を示す模式図で
ある。
フラグメントとその推定のアミノ酸配列を示す模式図で
ある。
フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 // Ａ６１Ｋ 38/22 Ｃ０７Ｋ 14/495 8318−4Ｈ Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｈ 9282−4Ｂ (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91） Ａ６１Ｋ 37/24
Claims (6)
- 【請求項１】 配列番号１で示されるアミノ酸配列をコ
ードしている、ヒト形質転換成長因子−β（ＴＧＦ−
β）をコードするＤＮＡ。 - 【請求項２】 検出可能な部分で標識されている請求項
１のＤＮＡ。 - 【請求項３】 配列番号１で示されるアミノ酸配列をコ
ードしている、ヒト形質転換成長因子−β（ＴＧＦ−
β）をコードするＤＮＡを含んでいる複製可能なベクタ
ー。 - 【請求項４】 配列番号１で示されるアミノ酸配列をコ
ードしている、ヒト形質転換成長因子をコードするＤＮ
Ａを含んでいるベクターを含有する哺乳類または細菌宿
主細胞。 - 【請求項５】 哺乳類細胞である請求項４の細胞。
- 【請求項６】 細菌細胞である請求項４の細胞。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US71514285A | 1985-03-22 | 1985-03-22 | |
| US715142 | 1985-03-22 |
Related Parent Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP61064661A Division JPH0659230B2 (ja) | 1985-03-22 | 1986-03-20 | ＴＧＦ‐βをコードしている核酸およびその用途 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH06169777A JPH06169777A (ja) | 1994-06-21 |
| JPH0763378B2 true JPH0763378B2 (ja) | 1995-07-12 |
Family
ID=24872822
Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP61064661A Expired - Lifetime JPH0659230B2 (ja) | 1985-03-22 | 1986-03-20 | ＴＧＦ‐βをコードしている核酸およびその用途 |
| JP5227016A Expired - Lifetime JPH0763378B2 (ja) | 1985-03-22 | 1993-09-13 | ＴＧＦ−βをコードしているＤＮＡ |
Family Applications Before (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP61064661A Expired - Lifetime JPH0659230B2 (ja) | 1985-03-22 | 1986-03-20 | ＴＧＦ‐βをコードしている核酸およびその用途 |
Country Status (7)
| Country | Link |
|---|---|
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| JP (2) | JPH0659230B2 (ja) |
| AT (1) | ATE99737T1 (ja) |
| DE (1) | DE3689495T2 (ja) |
| DK (1) | DK175412B1 (ja) |
| IE (1) | IE61119B1 (ja) |
| IL (1) | IL78197A (ja) |
Families Citing this family (26)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
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