NO179453B - Fremgangsmåte for fremstilling av terapeutisk aktivt amphiregulin, vertscelle som produserer proteinet, rekombinant vektor inneholdt i vertscellen, samt nukleotidsekvens som koder for proteiner med amphiregulinaktivitet - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse angår en fremgangsmåte for fremstilling av terapeutisk aktivt amphiregulin, vertscelle som produserer proteinet, rekombinant vektor inneholdt i vertscellen, samt nukleotidsekvens som koder for proteiner med amphiregulinaktivitet. Proteinene fremstilt ifølge oppfinnelsen inhiberer sterkt veksten av flere tumoravledede cellelinjer, mens de fremmer cellevekst i flere andre cellelinjer. Et bredt område av terapeutiske anvendelser av denne bifunksjonelle vekstregulator er beskrevet, omfattende, men ikke begrenset til, behandling av sår og diagnose og behandling av cancer.

Cellevekst og -differensiering synes å bli innledet, fremmet, opprettholdt og regulert av en mangfoldighet av stimulerende, inhiberende og synergistiske faktorer og hormoner. Endringen og/eller nedbrytningen av den cellulære homøostase-mekanisme synes å være en grunnleggende årsak til vekstbeslektede sykdommer, innbefattet neoplasi. Vekstmodulerende faktorer er innblandet i mange forskjellige patologiske og fysiologiske prosesser, innbefattet signal-transduksjon, cellekommunikasjon, vekst og utvikling, embryogenese, immunrespons, hematopoiese, celleoverlevelse og -differensiering, betennelse, vevsgjenoppbygging og gjendannelse, aterosklerose og kreft. Det er en begrunnet stor interesse for isolering, karakterisering og definering av de funksjonelle mekanismer hos vekstmodulerende faktorer på grunn av disse faktorers potensielle anvendelse ved diagnose, prognose og behandling av kreft. Enn videre vil ervervelse av kunnskap om disse faktorer hjelpe ved for-ståelsen av de grunnleggende mekanismer bak normal vekstkontroll og tapet av denne kontroll i kreftceller.

Epidermal vekstfaktor (EGF), transformerende vekstfaktor-a (TGFa), blodplateavledet vekstfaktor (PDGF), fibroblast vekstfaktor (FGF), nervevekstfaktor (NGF), transformerende vekstfaktor-6 (TGF8), insulin-vekstfaktor I og

II (IGF I, IGF II), hematopoietiske vekstfaktorer som erythropoietin, kolonistimulerende faktorer (CSF 1 og 2), interleukiner (IL-1 til IL-6), interferoner (IFN a, 6, Y), tumornekrosefaktor a og 6(TNF a, 8), leukoregulin,

oncostatin M og andre mindre definerte faktorer, er vekst-og differensieringsmodulerende proteiner fremstilt av forskjellige celletyper, enten under normale fysiologiske forhold, eller som reaksjon på eksogene stimuleringer. De fleste av disse faktorer synes å virke på autokrin og parakrin måte. (Se f.eks. Goustin et al., 1986, Cancer Res. 46: 1015-1029, Rozengurt, 1986, Science 234: 161-166, Pardee, 1987, Cancer Res. 47: 1488-1491, Sachs, 1986, Sei. Amer. 254: 40-47, Marshall, 1987, Cell 50: 5-6, Melcher og Anderson, 1987, Cell 30: 715-720, Clemens og McNurlan, 1985, Biochem. J. 226: 345-360, Nathan, 1987, J. Clin. Invest.

79: 319-326, Sporn og Roberts, 1986, J. Clin. Invest.

78: 329-332, Old, 1987, Nature, 326: 330-331, Beutler og Cerami, 1987, New Eng. J. Med. 316: 379-385, Weinstein,

J. Cell. Biochem., 33: 213-224, Zarling et al., 1987, Proe. Nati. Acad. Sei. USA 83: 9739-9744, Sporn og Todaro, 1985, N. Eng. J. Med. 303: 878-880, Sporn og Roberts, 1985, Nature 313: 745-747).

Biologisk aktive forbolestere som 12-0-tetra-decanoyl-forbol-13-acetat (TPA), er kraftige tumor-promotorer in vivo og frembringer og modulerer et bredt område av biologiske og biokjemiske reaksjoner, både in vivo og in vitro (Blumberg, 1981, Crit. Rev. Toxicol., 9: 153-197, Slaga, 1983, Cancer Surv. 2: 595-612). Det har i en tid vært kjent at TPA inhiberer veksten av den humane bryst-adenocarcinomacellelinje MCF-7. I tillegg endrer TPA også morfologien av MCF-7-celler ettersom TPA-behandlede celler utviser de morfologiske karakteristika for sekresjonsceller (Osborne et al., 1981, J. Clin. Invest. 67: 943-951, Valette et al., 1987, Cancer Res. 47: 1615-1620).

Foreliggende oppfinnelse angår en fremgangsmåte for fremstilling av terapeutisk aktivt amphiregulin med følgende aminosyresekvens

1 10 20

Rj VKPPQNKTE SENTSDKPKR KKKGGKNGK

30 40 50

NR R NRKKKNPC NAEFQNFCIH GECKYI

60 70 78

EHLE AVTCKCQQEY FGERCGEK

hvori

Rx er V eller sekvensen SVRVEQV,

eller et strukturelt nærliggende fragment derav med tilsvarende biologisk aktivitet, kjennetegnet ved at

(a) en Escherlchia coil-verteelle inneholdende en rekombinant vektor omfattende en nucleotidsekvens som koder for nevnte protein, dyrkes under kontroll av en annen nucleotidsekvens som regulerer genekspresjonen på en slik måte at et peptid eller protein med amphiregulinaktivitet frembringes av Escherlchia coli-cellen, eller (b) MCF-7-celler dyrkes i nærvær av 12-O-tetra-decanoyl-phorbol-13-acetat (TPA), og (c) amphiregulinet utvinnes fra kulturen i trinn (a) eller (b).

Amphiregulin er en hittil ukjent cellevekstregulerende faktor som utviser usedvanlig bifunksjonell cellevekstregulerende aktivitet. Amphiregulin inhiberer veksten av neoplastiske celler, men forøker veksten av visse normale celler. Amphiregulin er et ekstremt hydrofilt glycoprotein med en gjennomsnittlig molekylvekt på 22500 dalton som forekommer i to adskilte, men funksjonelt ekvivalente former, en avstumpet form og en større form. Bortsett fra de ytterligere seks N-terminale rester som finnes i den større form, er de to former fullstendig homologe på aminosyrenivået (fig. 12). Den foreliggende oppfinnelse er delvis basert på iakttagelsen at TPA-behandlede MCF-7-celler frigjør et glycoprotein som inhiberer veksten av den A431 epidermoide carcinomacellelinje og andre tumorcellelinjer, men forøker veksten av normale, humane fibroblaster og noen andre cellelinjer.

Foreliggende oppfinnelse beskrives ved hjelp av eksempler hvori amphiregulin er identifisert, renset til homogenitet og grundig karakterisert strukturelt og funksjonelt. I andre eksempler beskrives isoleringen og sekven-seringen av både cDNA og genome kloner som koder for amphiregulin-forstadier. Disse kloner anvendes for fremstilling av ekspresjonsvektorer som er i stand til å styre høynivåsyntesen av biologisk aktivt amphiregulin i trans-formerte bakterielle, og transfekterte eukaryotiske vertceller. Forskjellige anvendelsesområder for denne enestående faktor er beskrevet.

Foreliggende oppfinnelse angår således også en vertscelle, kjennetegnet ved at den inneholder en rekombinant vektor omfattende en nucleotidsekvens som koder for en aminosyresekvens omfattende følgende aminosyresekvens for et amphiregulinprotein

1 10 20

RjVKPPQNKTE SENTSDKPKR KKKGGKNGK

30 40 50

NR R NRKKKNPC NAEFQNFCIH GECKYI

60 70 78

EHLE AVTCKCQQEY FGERCGEK

hvori

Rx er V eller sekvensen SVRVEQV,

eller et strukturelt nærliggende fragment derav med tilsvarende biologiske aktivitet, under kontroll av en annen nucleotidsekvens som regulerer genekspresjon slik at cellen produserer et peptid eller protein med amphiregulinaktivitet.

Ved foreliggende oppfinnelse tilveiebringes også en rekombinant vektor for anvendelse i den egnede vertscelle, kjennetegnet ved at den er plasmid pARl, pARH12, pARH6, pTacAPARl eller pTacAPHILE, som er inneholdt i en Escherlchia coil cellelinje deponert ved NRRL og henholdsvis tildelt aksesjonsnr. B-18438, B-18439, B-18440, B-18441 eller B-18442; en "Isolert og renset genomsekvens som koder for amphiregulin-proteinet fremstilt ifølge krav 1, kjennetegnet ved at nucleotidsekvensen er som avbildet i fig.17."; samt en nucleotidsekvens som koder for en amphiregulin-forløper, kjennetegnet ved at den omfatter nucleotidkodingssekvensen som i alt vesentlig er som avbildet i fig. 16 fra ca. nucleotidrest nr. 1 til 1243. Figur 1 viser preparativ revers-fase HPLC av "flow-through"- og vaskeløsning.

Figur 2 viser semi-preparativ revers-fase HPLC av

de sammenblandede fraksjoner 47-62 fra figur 1.

Figur 3A viser analytisk revers-fase HPLC av sammenblandede II-fraksjoner fra det foregående forsøk. Figur 3B viser analytisk revers-fase HPLC av sammenblandede II-fraksjoner fra det foregående forsøk. Figur 4 viser gelgjennomtrengningskromatografi av fraksjoner fra figur 3A og 3B på "Bio-Sil TSK 250"-søyler. Kromatografering ble utført som beskrevet nedenfor i

avsnitt 6.3.2. (A) HPLC av konsentrert fraksjon 35

(fig. 3A); (B) HPLC av konsentrert fraksjon 36 (fig. 3A); (C) HPLC av konsentrert fraksjon 37 (fig. 3A); (D) HPLC av konsentrerte fraksjoner 41 og 42 sammen (fig. 3B).

Figur 5 viser analyse av renset AR og S-pyridylethylert-AR (SPE-AR) ved gelgjennomtrengnings-HPLC på "Bio-Sil TSK 250"-søyler. Kromatografering ble utført som beskrevet nedenfor i avsnitt 6.3.2. De anvendte molekyl-vektmarkører var ovalbumin, 43kD; chymotrypsinogen A, 25kD;

ribonuclease, 14kD; og insulin, 6kD; (A) AR; (B) SPE-AR.

Figur 6 viser analyse av AR og SPE-AR på en revers-fase "ultrapore RPSC C3"-søyle (4,6 x 75 mm). Det ble anvendt en gradient fra det primære oppløsningsmiddel 0,1% TFA til det sekundære oppløsningsmiddel acetonitril med

0,1% TRA og en gjennomstrømningshastighet på 1 ml/minutt ved romtemperatur. 1 ml's fraksjoner ble oppsamlet. (A) Ar,

(B) SPE-AR.

Figur 7 viser SDS-PAGE-analyse av AR-proteiner.

(A) En analyse ble utført på en 15% SDS-PAGE-gel (0,75 mm x 18 cm x 15 cm, Bio-Rad) med et diskontinuerlig buffersystem

ved en strømstyrke på 30 milliampere. De anvendte molekyl-

vektsmarkører var fosforylase B, 92,5kD; BSA, 66,2kD, ovalbumin, 43kD, carbonsyreanhydrase, 31kD; chymotrypsino-

gen A, 25,7kD, soyabønne-trypsininhibitor, 21,5kD; lactoglobulin, 18,4kD; lysozym, 14,4kD; aprotonin, 6,2kD og insulin-underenhet, 3kD. Felt 1: AR; felt 2: NG-AR,

felt 3: SPE-AR; felt 4: NG-SPE-AR. (B) En analyse ble ut-ført på en 20% SDS-PAGE-minigel (0,75 mm x 10 cm x 7 cm)

ved en konstant spenning på 200 volt. De ovennevnte molekyl-vektsmarkører ble anvendt. Felt 1: AR; felt 2: NG-AR;

felt 3: fosfolipasebehandlet NG-AR adskilt på revers-fase

HPLC.

125

Figur 8 viser IEF-analyse av I-merket AR.

De følgende standarder, med Pj-verdier mellom 4,65 og 9,6,

ble anvendt: fycocyanin, 4,65; 8-lactoglobulin B, 5,1; kveg-carbonsyreanhydrase, 6,1; human carbonsyreanhydrase,

6,5; heste-myoglobin, 7,0; hval-myoglobin, 8,05; a-chymotrypsin, 8,8; og cytokrom C, 9,6.

Figur 9 viser (A) dosereaksjonskurve for AR ved

125 inhibering av I-deoxyuridin-inkorporering i DNA av A431-celler; (B) virkning av AR på stimulering av <125>I-deox<y>-uridin-inkorporering i DNA av humane forhuds-fibroblaster (Sadamoto).

Figur 10 viser konkurransen om binding til fikserte 125

A431-celler eller A4 31-plasmamembraner mellom <125>I-EGF og murint EGF og AR. Bindingsforsøk ble utført som beskrevet nedenfor i avsnitt 6.1.5. Prøver på 100 uliter eller 50 uliter pr. brønn ble anvendt til forsøk med hhv. fikserte celler eller membraner.

Figur 11 viser hydropatianalyse av AR og humant EGF (Kyte og Doolittle). (A) AR (rester 1-84); (B) AR (rester 44-84); (C) EGF (rester 1-53); (D) AR-forstadium (rester 1-252); (E) sammenligning av humant AR (rester 1-84) og EGF

(rester 1-53) (oppstilling er i overensstemmelse med fig. 13 slik at cystein, rest 46 i utviklet AR, svarer til cystein, rest 6 av utviklet EGF).

Figur 12 viser aminosyresekvensen av utviklet AR og avstumpet AR. Den anvendte standard-énbokstavskode for aminosyrer er som følger: alanin (A); arginin (R); asparagin (N); asparaginsyre (D); cystein (C), glutamin (Q); glutaminsyre (E); glycin (G); histidin (H); isoleucin (I); leucin (L);

lysin (K); methionin (M); fenylalanin (F); prolin (P),

serin (S); threonin (T); tryptofan (W); tyrosin (Y); og valin (V).

Figur 13 viser en sammenligning av aminosyresekvenser

hos amphiregulin (AR) og medlemmer av EGF-overfamilien.

Figur 14 viser (A) 12 5I-binding tii cellulose (o-o), denaturert DNA-cellulose ( - ), og nativt DNA-cellulose-(& - A). (B) 12<5>I-AR-binding til cellulose (o-0) og til

125

DNA-cellulose ( - ) ble sammenlignet med I-EGF-bindmg til cellulose (a - &) og til DNA-cellulose . ( v - *7) . Figur 15 viser syntetiske amphiregulinpeptider fremstilt ved fast-faseteknikk. Fem peptider svarende til restene 166-184 (nr. 259), 108-130 (nr. 264), 31-50 (nr. 279), 71-90 (nr. 280) og 221-240 (nr. 281), ble fremstilt ved fast-fase-syntese og deretter renset ved revers-fase HPLC. Figur 16 viser nucleotidsekvens og avledet aminosyresekvens av cDNA-klon pARl som koder for humant amphiregulin. Figur 17 viser den humane amphiregulin-genomsekvens. Figur 18 viser skjematisk diagram av exon-strukturen og proteinområdene i AR-molekylet som angår genom-sekvensen. Figur 19 viser nucleotidsekvens av ekspresjonsvektoren pDCHBARl.

Figur 20 viser nucleotidsekvens av pTacAPARl.

Figur 21 viser nucleotidsekvens av pTacAPHILE.

Foreliggende oppfinnelse angår fremstilling av amphiregulin (AR) ved konvensjonelle fremgangsmåter eller rekombinant DNA-fremgangsmåter, samt nucleotidsekvenser som koder for AR og AR-forstadiet.

Den foreliggende oppfinnelse angår amphiregulin (AR), nucleotidsekvenser som koder for AR og AR-forstadiet, samt fremstillingen av AR ved konvensjonelle fremgangsmåter eller rekombinant DNA-fremgangsmåter.

AR, en hittil ukjent cellevekstregulerende faktor, uttrykkes ved ekspresjon og utskilles av TPA-behandlede MCF-7-celler som to forskjellige og likevel funksjonelt ekvivalente former. De to former er strukturelt identiske bortsett fra ytterligere seks amino-terminale rester i den større form. AR utviser sterk inhibitorisk aktivitet på DNA-syntesen i neoplastiske celler og har derfor potensial som en virkningsfull anti-tumorforbindelse. Av særlig interesse er evnen hos AR til å fremme vekst i fibroblaster og andre normale celler, noe som antyder at AR kan være nyttig ved behandling av tilstander som krever økning av cellevekst, f.eks. ved forbrenninger og sår.

AR eller fragmenter og derivater av denne, har utstrakt potensiell terapeutisk anvendelse ved behandling og overvåkning av neoplasi samt ved behandling av sår. AR kan også anvendes ved modulering av ben-resorpsjon og immunrespons, samt ved stimulering av arachidonsyre-strømmen. Amphiregulingenet og -genproduktene, fremgangsmåter for deres fremstilling og anvendelse av produktene, er beskrevet nedenfor i detalj.

5. 1. Fremstilling og rensing av amphiregulin

Amphiregulin utskilles fra den humane bryst-carcinome cellelinje MCF-7 ved behandling med det tumorfremmende middel 12-0-tetradecanoyl-forbol-13-acetat (TPA). Amphiregulin kan isoleres fra det tilpassede middel av slike dyrkede TPA-behandlede MCF-7-celler og deretter renses til høy, spesifikk aktivitet. Amphiregulin kan også isoleres fra andre cellelinjer med eller uten induksjon ved behandling med TPA eller andre tumorfremmende midler. Alternativt kan amphiregulin fremstilles ved rekombinant DNA-fremgangsmåte, eller ved fast-fase peptidsyntese.

Amphiregulin kan renses ved anvendelse av forskjellige fremgangsmåter kjent i teknikken, innbefattet, men ikke begrenset til, kromatografi (f.eks. revers-fase-væskekromatografi, gelgjennomtrengingskromatografi, væskebytterkromato-grafi, ionebytterkromatograf i, størrelsesutelukkelseskromato-grafi og affinitetskromatografi), sentrifugering, elektro-foretiske fremgangsmåter, differensiell oppløselighet, eller ved hjelp av andre standardfremgangsmåter for rensing av proteiner.

I en spesifikk utførelsesform av den foreliggende oppfinnelse ble MCF-7-celler behandlet med TPA i 48 timer og dyrket i friskt serumfritt medium i 4 dager. Det dannede, tilpassede medium ble innsamlet og anvendt for fremstilling av rått AR som beskrevet i avsnitt 6.2. nedenfor. En blanding av revers-fase-væskekromatografi og gelgjennomtrengingskromatografi kan anvendes for rensing av AR til tilsynelatende homogenitet som beskrevet nedenfor i avsnitt 6.3., og resulterte i AR renset mellom 1842 ganger og 2270 ganger i forhold til det rå utgangsmateriale. Fremgangsmåten er reproduserbar og gir rensede AR-preparater med spesifikke aktiviteter mellom 2,7 og 3,4 x IO<6> enheter/mg protein.

5. 2. Amphiregulingenet

5. 2. 1. Isolering og kloning av amphiregulingenet

Ved utførelse av fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen kan nucleotidkodingssekvensen for humant amphiregulin eller et funksjonelt derivat derav, anvendes for å frembringe rekombinante molekyler som vil styre ekspresjonen av det humane amphiregulinprodukt. Nucleotidkodingssekvensen for AR kan erholdes fra cellekilder som danner AR-lignende aktivitet. I en spesifikk utførelsesform anvendes f.eks. den humane bryst-carcinomcellelinje MCF-7 som kilde for AR-nucleotidkodingssekvensen. Kodingssekvensen kan erholdes ved cDNA-kloning av RNA som er isolert og renset fra slike cellekilder eller ved genom kloning. Enten cDNA-biblioteker eller genom-biblioteker av kloner kan fremstilles ut fra de DNA-fragmenter som er fremstilt ved anvendelse av fremgangsmåter kjent i teknikken, innbefattet anvendelsen av restriksjonsenzymer.

Fragmentene som inneholder genet for AR, kan identifiseres på forskjellige måter kjent i teknikken. En del av AR-aminosyresekvensen kan f.eks. anvendes til å utlede DNA-sekvensen, og deretter kan denne DNA-sekvens syntetiseres kjemisk, merkes radioaktivt og anvendes som hybridiserings-probe.

Andre fremgangsmåter som kan anvendes for isolering av AR-genet, omfatter kjemisk syntetisering av gensekvensen fra en kjent sekvens som f.eks. kan være avledet fra aminosyresekvensen av AR. Alternativt kan anvendes in vitro translasjon av utvalgt mRNA, etterfulgt av funksjonelle eller immunologiske forsøk med de translaterte produkter. Det identifiserte og isolerte gen kan deretter innføyes i en passende kloningsvektor. Et stort antall vektor-vertsystemer som er kjent i teknikken, kan anvendes. Mulige vektorer kan f.eks. omfatte plasmider eller modifisert virus hvor vektor-systemet er forenlig med vertcellen. Slike vektorer omfatter f.eks. bakteriofager som A-derivater, eller plasmider som PBR322 eller pUC-plasmidderivater. Rekombinante molekyler kan innføres i vertceller via transformasjon, transfeksjon, infeksjon, elektroporasjon, etc.

I en spesiell utførelsesform klones AR-genet som uttrykkes av MCF-7-celler, ved utvelgelse av mRNA som dannes som reaksjon på behandling av MCF-7-celler med TPA, og oppbygging av et cDNA-bibliotek i bakteriofag XgtlO. Siden ubehandlede MCF-7-celler tilsynelatende ikke syntetiseres og utskiller AR-protein, ble det antatt at induksjonen av AR med TPA også kunne ses på transkripsjonsnivået, og at et slikt cDNA-bibliotek ville være betraktelig beriket med AR-holdige sekvenser. Probeundersøkelse av cDNA-biblioteket med degenererte og beste skjønn oligonucleotider basert på anvendelse av humant kodon (Lathe, 1985, J. Mol. Biol. 183:1-12 og som beskrevet nedenfor i avsnitt 8.1.), førte til isolasjon av AR cDNA-kloner. Disse cDNA-kloner ble deretter anvendt for å karakterisere AR mRNA og AR-genet. Nucleotidsekvensen av AR cDNA (avsnitt 8.2. nedenfor og figur 16) kan videre anvendes for å utlede en primær AR-aminosyresekvens.

Som følge av naturlig degenerasjon i nucleotidkodingssekvensen kan andre DNA-sekvenser som koder for i det vesentlige samme aminosyresekvens eller en funksjonell ekvivalent aminosyresekvens, anvendes ved utøvelsen av fremgangsmåten ifølge foreliggende oppfinnelse. Slike endringer av AR-nucleotidsekvensen omfatter utslettelser, tilføyelser eller substitusjoner av forskjellige nucleotider, noe som fører til en sekvens som koder for samme genprodukt eller et funksjonelt ekvivalent produkt. Genproduktet kan inneholde utslettelser, tilføyelser eller substitusjoner av aminosyrerester i sekvensen, som fører til stumme endringer og således danner et bioaktivt produkt. Slike aminosyre-substitusjoner kan foretas på basis av likhet i polaritet, ladning, oppløselighet, hydrofobisitet, hydrofilisitet og/eller den amfipatiske natur av de involverte rester. Negativt ladede aminosyrer omfatter f.eks. asparaginsyre og glutaminsyre; positivt ladede aminosyrer omfatter f.eks. lysin og arginin; aminosyrer med uladede, polare hovedgrupper eller ikke-polare hovedgrupper med lignende hydrofilisitetsverdier omfatter følgende: leucin, isoleucin, valin, glycin, alanin, asparagin, glutamin, serin, threonin, fenylalanin og tyrosin.

AR cDNA kan anvendes som en probe for påvisning av

AR mRNA i TPA-induserte MCF-7-celler. AR mRNA har en lengde på tilnærmet 1400 bp.

Som beskrevet nedenfor i avsnitt 9, kan AR cDNA anvendes for karakterisering av AR-genet. Kromosomfastsett-elsen av det humane AR-gen ble bestemt ved in situ-hybridiser-mg av <3>H-merket AR cDNA til normale metafasekromosomer, noe som avslørte at humant AR-gen sitter i kromosom 4 område 4ql3-21, et område som ble antatt å være involvert i lymfo-cyttdifferensiering (se avsnitt 9.2. nedenfor). cDNA ble også anvendt til isolering av genomt DNA som spenner over hele AR-genet, innbefattet det regulatoriske 5'-område. AR-genet har en lengde på tilnærmet 10 kb og er delt i 6 exoner. Det regulatoriske 5'-område ble inkorporert i en ekspresjonsvektor inneholdende et promotorløst kloramfenicol-acetyl-transferasegen (CAT-gen). Denne oppbygning var i stand til å stimulere transkripsjon av CAT-genet ved forbigående inn-føring i MCF-7-celler, og aktiviteten ble stimulert 6-7 ganger ved tilsetning av TPA (se avsnitt 9.4. nedenfor). Ved spesifikke utførelsesformer ifølge oppfinnelsen kan dette regulatoriske 5'-område anvendes i ekspresjonsvektorer for kontroll av transkripsjon av AR-genet eller andre strukturelle gener. Den kimære AR-CAT-oppbygning kan også anvendes til å lete etter faktorer som regulerer ekspresjonen av AR som beskrevet i avsnitt 9, og etterfølgende avsnitt.

5. 2. 2. Oppbygning av ekspresjonsvektorer inneholdende amphiregulin- kodingssekvensen

For å uttrykke en biologisk aktiv utviklet form av AR var det nødvendig å velge et ekspresjonsvektor/vertsystem som ikke bare kunne tilveiebringe høye transkripsjons-og translasjonsnivåer, men også korrekt bearbeidelse av genproduktet. Dette er særlig viktig ved anvendelse av hele kodingssekvensen for amphiregulin-forstadiet ved ekspresjons-oppbygninger, fordi den utviklede form av amphiregulin synes å stamme fra forstadium-produktet via cellulære be-arbeidningstrinn. Et mammalt vertcellesystem kan f.eks. velges på grunn av dets evne til korrekt bearbeidelse og utskillelse av amphiregulin i det ekstracellulære miljø.

Spesielt fremgår det at to former av utviklet amphiregulin syntetiseres som den midterste del av et vanlig 252-aminosyre-forstadium, fra hvilket de to utviklede former frigjøres via forskjellige proteolytiske bearbeidingstrinn.

Videre glycosyleres amphiregulin og kan undergå tyrosin-sulfatisering, noe som ytterligere understreker betydningen av å utvelge et ekspresjonssystem som er i stand til å utføre disse modifikasjoner etter translasjon hvis de ønskes i sluttproduktet.

Forskjellige animalske vertekspresjonsvektorsystemer (dvs. vektorer som inneholder de nødvendige bestanddeler for styring av replikasjon, transkripsjon og translasjon av AR-kodingssekvensen i en egnet vertcelle) kan anvendes like godt av fagmannen. Disse systemer omfatter, men er ikke begrenset til, virusekspresjonsvektor/mammale vertcellesystemer (f.eks. cytomegalovirus, vacciniavirus, adenovirus og lignende), insektvirus-ekspresjonsvektor/insekteeliesysterner (f.eks. baculovirus) eller ikke-virale promotor ekspresjonssystemer som stammer fra genomene av mammale celler (f.eks. musemetallothioninpromotor).

Ekspresjonsbestanddelene hos disse vektorer kan variere med hensyn til styrke og spesifisitet. Avhengig av det anvendte vert/vektorsystem vil enhver egnet transkripsjons- og translasjonsbestanddel blant et antall slike bestanddeler kunne anvendes. Ved kloning i mammale celle-systemer vil f.eks. promotorer isolert fra genomet av mammale celler (f.eks. musemetallothioninpromotor) eller fra virus som vokser i disse celler, (f.eks. vacciniavirus 7,5K-promotoren eller den lange terminale gjentagelse i Moloney-murint sarcomavirus) kunne anvendes. Promotorer fremstilt ved rekombinant DNA-teknikk eller ved syntetiske fremgangsmåter, vil også kunne anvendes for å tilveiebringe transkripsjon av de innføyde sekvenser.

Spesifikke startsignaler er også nødvendige for tilstrekkelig translasjon av innføyde proteinkodingssekvenser. Disse signaler omfatter ATG-startkodonet og nabosekvenser.

I slike tilfeller hvor hele AR-genet omfattende dets eget startkodon og nabosekvenser, er innføyd i egnede ekspresjonsvektorer, er ikke ytterligere translasjonskontrollsignaler påkrevet. I tilfeller hvor kun en del av kodingssekvensen er innføyd, må det imidlertid tilveiebringes exogene translasjonskontrollsignaler innbefattet ATG-startkodo.net. Videre skal startkodonet være i fase med AR-kodingssekvensenes leseramme for å sikre translasjon av hele innføyelsen. Disse exogene translasjonskontrollsignaler og startkodoner kan ha forskjellige både naturlige og syntetiske opprinnelser. Ekspresjonens effektivitet kan forsterkes ved inkorporering av transkripsjonsdempingssekvenser, forsterkningsbestanddeler, etc.

Enhver av de tidligere beskrevne fremgangsmåter for innføyelse av DNA-fragmenter i en vektor kan anvendes til oppbygging av ekspresjonsvektorer inneholdende AR-genet og egnede transkripsjons-/translasjonskontrollsignaler. Disse fremgangsmåter kan omfatte in vitro rekombinant DNA-teknikk, syntesefremgangsmåter og in vivo rekombinasjoner (genetisk rekombinasjon).

I tilfeller hvor et adenovirus anvendes som ekspresjonsvektor, kan AR-kodingssekvensen f.eks. ligeres med et adenovirus-transkripsjons-/translasjonskontrollkompleks, f.eks. den sene promotorsekvens og den tredelte ledersekvens. Dette kimære gen kan deretter innføyes i adenovirusgenomet ved in vitro eller in vivo rekombinasjon. Innføyelse i et ikke-essensielt område av det virale genom (f.eks. område El eller E3) vil føre til et rekombinant virus som er leve-dyktig og i stand til å uttrykke AR i infiserte verter. På lignende måte kan vaccinia 7,5 K-promotoren anvendes.

Et alternativt ekspresjonssystem som vil kunne anvendes for å uttrykke AR, er et insektsystem. I et slikt system kan Autographa californica nukleært polyhedrosis-virus (AcNPV) anvendes som vektor til ekspresjon av fremmede gener. Dette virus vokser i Spodoptera frugiperda-celler. AR-kodingssekvensen kan klones i ikke-vesentlige områder (f.eks. polyhedringenet) i dette virus og anbringes under kontroll av en AcNPV-promotor (f.eks. polyhedrinpromotoren). Vellykket innføyelse av AR-kodingssekvensen vil resultere i inaktivering av polyhedringenet og dannelse av ikke-okkludert rekombinant virus (dvs. virus som mangler den protein-holdige kappe som polyhedringenet koder for). Disse rekombinante vira anvendes deretter til infeksjon av Spodoptera frugiperda-celler hvori det innføyde gen uttrykkes.

Retrovirale vektorer fremstilt i amfotrope paknings-cellelinjer, tillater høyeffektiv ekspresjon i tallrike celletyper. Denne fremgangsmåte tillater vurdering av celle-type-spesifikk bearbeiding, regulering eller funksjon av den innføyde proteinkodingssekvens.

I tillegg kan det velges en vertcellestamme som modulerer ekspresjonen av de innføyde sekvenser, eller modi-fiserer og bearbeider genproduktet på den spesifikt ønskede måte. Ekspresjon fra visse promotorer kan heves i nærvær av visse induktorer (f.eks. sink- og kadmiumioner til metallo-thioneinpromotorer). Ekspresjon av det genteknisk fremstilte AR kan derfor kontrolleres. Dette er viktig hvis proteinproduktet fra det klonede fremmede gen er letalt overfor vertcellene. Modifikasjoner (f.eks. glycosylering) og bearbeidelse (f.eks. spaltning) av proteinprodukter er videre viktige for proteinets funksjon. Forskjellige vertceller har karakteristiske og spesifikke mekanismer for bearbeidelse og modifikasjon av proteiner etter translasjon. Egnede cellelinjer eller vertsystemer kan velges for å sikre korrekt modifikasjon og bearbeidelse av det uttrykte, fremmede

protein.

Ekspresjonsvektorer som kan anvendes i overenstemm-else med den foreliggende oppfinnelse, omfatter de følgende:

Plasmid pSV2Neo

Plasmid pSV2Neo er beskrevet av Southern et al.,

(1982), i J. Mol. Applied Genetics 1, 327-341.

Plasmid pSV2dhfr

Plasmid pSV2dhfr (Subramani et al., 1981, Mol. Cell.

Biol. 1, 854-864) inneholder muse-dihydrofolat-reduktasegenet (dhfr-genet) under kontroll av SV40-promotoren.

Plasmid pH3M

Plasmid pH3M (Aruffo et al., 1987, Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 84, 3365-3369) inneholder en kimær promotor bestående av den umiddelbare tidligere humane cytomegalovirus (CMV) AD169-forsterkersekvens forbundet med KIV LTR-still-ingene -67 til +80. LTR etterfølges av en polylinker med 5'-til 3'-ende-seter: Hindlll, Xbal, Xhol, BstXI, Xhol, Pstl og Xbal. De små t-antigen-spleise/polyadenyleringssignaler fra pSV2 og et SV40-replikasjonsopprinnelsessted er beliggende nedstrøms fra polylinkeren. Sistnevnte tillater forsterkning i celler som inneholder det store T SV40-antigen, som COS-

og WOP-celler. Et supressor tRNA-gen understøtter vekst i pVX-baserte vektorer og bakterier som bærer P3-plasmidet,

som MC1061/P3.

Plasmid pH3M/ b0ncM

Plasmid pH3M/b0ncM ble erholdt fra Najma Malik, Oncogen. Det inneholder den utranslaterte simiane TGF-8 5'-ledersekvens som er forbundet med Oncostatin M-kodingssekvensen som er innføyd i pH3M ved (utfylte) Hindlll/Xhol-seter. TGF-8-sekvensen består av et utranslatert 85 bp 5'-område som begynner ved Hindlll (som stammer fra pSP65 polylinker) og et tilstøtende Pstl-sete fra TGF-8 cDNA, etterfulgt av 87 bp som koder for 29 aminosyresignalsekvensen som normalt spaltes mellom en glycin-leucin-dipeptidsekvens.

Plasmid pH3ARP

Plasmid pH3ARP er en pH3M-basert vektor utviklet til forbigående ekspresjon av AR-forstadiet i COS-celler. Den inneholder 13 bp av det utranslaterte AR 5'-område, og hele kodingsområdet og utranslaterte 3<1->sekvenser. Dette plasmid ble fremstilt ved ligering av 4 kb-fragmentet av pH3M-vektoren nedbrutt ved Hindlll og Xbal, oligonucleotider EVSAL3 og EVSAL4, og det gelrensede 1,1 kb Hgal/Xbal cDNA-fragment fra pARl. EVSAL3 og EVSAL4 er komplementære med Hindlll-,

EcoRV-, Sali- og HgaI-5<1->seter. Oppbygningen beholder også EcoRI til Xbal-polylinker-setene fra pEMBL18 umiddelbart etter det utranslaterte 3'-område.

EcoRV Hgal

Hindlll Sali

EVSAL3 5' AGCTTGATATCGTCGA

EVSAL4 3' ACTATAGCAGCTGACGC

Plasmid pSVDR/ bOM

Plasmid pSVDR/bOM ble erholdt fra Jeff Kallestad, Oncogen. Det er en fusjon mellom pSV2dhfr og pH3M/b0M og tilveiebringer en vektor med et cDNA styrt av en CMV/HIV-promotor av pH3M, omgitt av TGF-8-signalsekvens og SV40-polyadenyleringssignaler i tillegg til muse-dhfr-genet kon-trollert av tidlig-SV40-promotor. Det er utviklet ved ligering av BamHI/NruI (utfylt)-nedbrutt pH3M/bOM med BamHI nedbrutt-pSV2dhfr.

Plasmid pHras

Plasmid pHras er en mammal ekspresjonsvektor utviklet av Stan McKnight, Univ. of Washington, Dept. of Pharmacology. Det er en pML-basert vektor som inneholder et 754 bp EcoRI til Tthllll-fragment av Harvey Ras LTR, en polylinker med Smal, BamHI, Sali, Pstl, Hindlll og Clal, etterfulgt av muse-DHFR cDNA og utranslatert hepatitt B-virus 3'-polyadenyleringssignal. Avstanden mellom BamHI i polylinkeren og ATG i DHFR er 54 bp.

Plasmid pHLARGE

Plasmid pHLARGE er en mammal ekspresjonsoppbygning som inneholder 10 kb AR-genomsekvensene (Smal til Hindlll) styrt av Harvey Ras LTR og etterfulgt av et ikke-funksjonelt, promotorløst DHFR-gen. Det ble dannet ved en treveis-ligering av følgende fragmenter: 4,6 kb pHras Smal/Hindlll-fragment; 6,0 kb Smal/Hindlll Ar-genomfragment fra pARHl2;

og 6,4 kb Hindlll Ar-genomfragment fra pARH6.

Plasmid pHLARGlpcD

Plasmid pHLARGlpcD er en polycistron mammal eks-pres jonsoppbygning. Det inneholder AR-forstadium-cDNA-sekvensen etterfulgt av muse-dhfr-genet styrt av et enkelt Harvey Ras LTR. Den primære transkripsjon er en polycistron meddelelse med 74 bp mellom stoppkodonet for AR og ATG-startkodonet for dhfr, noe som tillater ribosomet å starte på nytt og fortsette translasjon. pH3ARP ble nedbrutt med EcoRV, og 700 bp-fragmentet ble isolert. Dette fragment inneholdt et 13 bp utranslatert AR 5'-område, det komplette AR-forstadium-kodingsområde og en 21 bp utranslatert 5'-sekvens. Dette fragment ble ligert med BamHI-avkutningen, utfylt og ligert med fosfatasebehandlet pHras-vektor.

Plasmid pLOSNL

Plasmid pLOSNL ble erholdt fra Dusty Miller,

Fred Hutchinson Cancer Research Center, Seattle, WA. Denne retrovirale ekspresjonsvektor ble utviklet til i høy titer å fremstille amfotrope, hjelperfrie, virale materialer som er i stand til å infisere, men ikke replikere i, en lang rekke verter. Vektoren inneholder et mutert Moloney-murint leukemivirus LTR uten pakningssignaler; psi+ sekvenser; ornithin-transcarbamylasegenet (OTC-genet) som inneholder to Xhol-seter for innføyelse av en cDNA og etterfølgende inaktivering av OTC-genet; SV2Neo, en utvelgbar markør; 3'-LTR; og et pBR322 Amp-resistent skjelett.

Plasmid pLARSNL

Plasmid pLARSNL er en amfotrop, retroviral eks-pres jonsoppbygning som inneholder AR-forstadium-cDNA-kodingsområdet som mangler en poly(A)-hale og styres av det virale LTR. SV2Neo tillater utvelgelse for ekspresjon av transfektanter. pLARSNL ble frembrakt ved ligering av 800 bp Sall-fragmentet fra pHLARGlpcD med det 7,7 kb Xhol-nedbrutte og fosfatasebehandlede pLOSNL-vektorfragment. 5. 2. 3. Identifikasjon av transfektanter eller transformanter som uttrykker amphiregulin- genproduktet

Vertceller som inneholder den rekombinante AR-kodingssekvens og som uttrykker det biologisk aktive, utviklede produkt, kan identifiseres ved minst fire generelle fremgangsmåter: (a) DNA-DNA-, DNA-RNA- eller RNA-antisens-RNA-hybridisering; (b) nærvær eller fravær av "markør"-genfunk-sjoner; (c) vurdering av transkripsjonsnivået som målt ved ekspresjonen av AR mRNA-transskripter i vertcellen; og (d) påvisning av det utviklede genprodukt som målt ved immunanalyse og i siste instans ved hjelp av dets biologiske aktivitet.

Ved den første fremgangsmåte kan tilstedeværelsen av den humane AR-kodingssekvens innføyd i ekspresjonsvektoren, påvises ved DNA-DNA-hybridisering ved anvendelse av prober som inneholder nucleotidsekvenser som er homologe med den humane AR-kodingssekvens.

Ved den andre fremgangsmåten kan det rekombinante ekspresjonsvektor-/vertsystem identifiseres og utvelges på grunnlag av tilstedeværelse eller fravær av visse "markør"-genfunksjoner (f.eks. thymidinkinaseaktivitet, resistens overfor antibiotika, resistens overfor methotrexat, trans-formasjons fenotype , okklusjonslegemedannelse i baculovirus, etc.). Dersom AR-kodingssekvensen f.eks. innføyes i en markørgensekvens i vektoren, kan rekombinanter som inneholder AR-kodingssekvensen, identifiseres ved fravær av markørgen-funksjonen. Alternativt kan et markørgen anbringes i for-lengelse av AR-sekvensen under kontroll av samme promotor som anvendes til kontroll av ekspresjonen av AR-kodingssekvensen eller en avvikende promotor. Ekspresjon av markøren som reaksjon på induksjon eller seleksjon, tyder på ekspresjon av AR-kodingssekvensen.

Ved den tredje fremgangsmåte kan transkripsjons-aktivitet for AR-kodingsområdet vurderes ved hybridiserings-prøver. Polyadenylert RNA kan f.eks. isoleres og analyseres ved Northern blotting under anvendelse av en probe som er homolog med AR-kodingssekvensen eller med spesielle deler av denne. Alternativt kan samtlige nucleinsyrer i vertcellen ekstraheres og analyseres for hybridisering med slike prober.

Ved den fjerde fremgangsmåte kan ekspresjonen av

det utviklede proteinprodukt vurderes immunologisk, f.eks. ved Western blotting, immunanalyse som radioimmunutfelling, enzymbindingsimmunanalyser og lignende. Den endelige test for ekspresjonssystemets anvendelighet omfatter imidlertid påvisning av det biologisk aktive AR-genprodukt. Der hvor vertcellen utskiller genproduktet, kan det cellefrie medium erholdt fra de dyrkede, transfektantvertceller, analyseres for AR-aktivitet. Der hvor genproduktet ikke utskilles, kan cellelysater analyseres for en slik aktivitet. I hvert tilfelle kan biologiske undersøkelser anvendes, som i de foreliggende beskrevne vekstinhiberingsanalyser og stimulerings-analyser.

5. 3. Amphiregulinstruktur

Aminosyresekvensanalyse av renset AR avslører at det erholdte produkt består av en ulik blanding av to nesten identiske former av AR (se fig. 12). En form, den største av de to, omfatter tilnærmet 16% av preparatet. Den andre form, et avstumpet AR, omfatter den resterende del, dvs. størstedelen av det erholdte produkt, og avviker kun fra den lengre motpart ved at den mangler det amino-terminale hexa-peptid, SVRVEQ. Bortsett fra dette er de to former perfekt homologe på aminosyrenivået.

AR er et ytterst hydrofilt glycoprotein med en gjennomsnittlig relativ molekylvekt på 22500 dalton. N-glycanasebehandling som fjerner N-bundet-carbohydrat, for-årsaker at AR beveger seg som et enkelt bånd med en relativ molekylvekt på 14000, i god overensstemmelse med molekyl-vektsberegninger ut fra AR-gelgjennomtrengingskromatografi. Under ikke-reduserende forhold beveget AR seg på lignende måte. AR er derfor et enkeltkjedet glycoprotein.

Den primære struktur av AR ole sammenlignet mect

mange proteinsekvenser. Disse sammenligninger viser at AR

er et unikt protein uten vesentlig strukturell homologi med noen av de sammenlignede proteiner. Den primære AR-struktur er imidlertid beslektet med flere andre vekstfaktorer hvorav de fleste hører til EGF-overfamilien. Det er rimelig å klassifisere AR som et medlem av denne gruppe proteiner fordi flere av dets strukturelle trekk er nært beslektet med de godt bevarte strukturelle trekk som finnes blant proteiner av EGF-familien. Den N-terminale AR-sekvens ligner f.eks. de N-terminale sekvenser av TGFa, VGF og MGF ved at dette område er meget rikt på prolin-, serin- og threoninrester. AR inneholder også seter for N-bundet glycosylering på samme måte som de N-terminale forstadium-områder i TGFa og VGF. AR utviser videre sekvenshomologi med andre EGF-lignende proteiner, med bevaring av 6 cysteinrester som inngår i tre disulfidbindinger, som definerer den sekundære struktur i de utviklede former av disse vekstfaktorer. Hydropatianalyser avslører imidlertid vesentlige forskjeller mellom homologe AR- og EGF-sekvenser. For ytterligere sammenligning mellom AR og andre medlemmer av EGF-overfamilien henvises til tabell I, fig. 13 og avsnitt 9.7 og 9.8.

Kombinerte homologiresultater for område nr. 1 og 2.

Amphiregulin-aminosyresekvensene vist i fig. 12 samt strukturelt nærliggende fragmenter derav med tilsvarende biologisk aktivitet faller innenfor rammene av den foreliggende oppfinnelse. Amphiregulinproduktet kan f.eks. inneholde utslettelser, tilføyelser eller substitusjoner av aminosyrerester i sekvensen, noe som fører til stumme endringer som således tilveiebringer et bioaktivt produkt. Slike aminosyre-substitusjoner kan foretas på grunnlag av likhet i polaritet, ladning, oppløselighet, hydrofobisitet, hydrofilisitet og/eller den amfipatiske natur av de involverte rester. Negativt ladede aminosyrer omfatter f.eks. asparaginsyre og glutaminsyre; positivt ladede aminosyrer omfatter lysin og arginin; aminosyrer med uladede, polare hovedgrupper med lignende hydrofilisitetsverdier omfatter følgende: leucin, isoleucin, valin, glycin, alanin, asparagin, glutamin, serin, threonin, fenylalanin og tyrosin.

5. 4. Egenskaper til amphiregulin

AR er et enkeltkjedet glycoprotein med en gjennomsnittlig molekylvekt på tilnærmet 22500 dalton som utviser bifunksjonelle vekstmodulerende aktiviteter på forskjellige celler ved dyrkning. Strukturelt er AR beslektet med EGF-familien av vekstfaktorer og kan dessuten dele funksjonelle likheter med andre medlemmer av denne familie, noe som vises ved AR's evne til effektivt å konkurrere med EGF med hensyn til reseptorbinding.

AR er et monomert protein som med hensyn til aktivitet krever intrakjede-disulfidbindinger som ikke krever glycosylering med hensyn til den biologiske aktivitet, som er stabilt under moderate syre- og basebehandlinger og som er stabilt ved varmebehandling ved 56°C i 30 minutter. AR mister fullstendig biologisk aktivitet ved reduksjon, ved oppvarming til 100°C i 5 minutter og ved nedbrytning med trypsin, endo-

peptidase Lys-C, endopeptidase Arg og endopeptidase Glu.

Proteolytisk spaltning med fosfolipase D synes å omdanne AR til et aktivt fragment eller fragmenter med en relativ molekylvekt på tilnærmet 5600 ifølge SDS-PAGE-analyse. Aktive fragmenter av AR er omfattet av den foreliggende oppfinnelse og diskuteres nærmere i avsnitt 5.5. nedenfor.

AR har kraftige anti-proliferative virkninger in vitro på flere humane kreftcellelinjer av epitelial opprinnelse. AR inhiberer f.eks. effektivt DNA-syntese av epidermal carcinoma av vulva A431-, bryst-adenocarcinoma HTB 132-, cervical epidermoid carcinoma CRL 1550-, ovarie-papillært adenoma HTB 75-, ovarie-teratocarcinoma HTB 1572- og bryst-adenocarcinoma HTB 26-celler. En 50% inhibering av DNA-syntese iakttas i A431-celler behandlet med 0,13 nM AR.

Normale rottenyre NRK-SA6-celler danner vanligvis ikke kolonier i bløt agar. Tilsetning av blandingen av exogent EGF og TGF-6 til disse cellers dyrkningsmedium fremkaller imidlertid forankringsuavhengig vekst, noe som indikerer en transformert fenotype. En blanding av exogent AR og TGF-8 fremkaller også den forankringsuavhengige vekst av NRK-SA6-celler, om enn på et lavere nivå (se tabell V), noe som gir direkte bevis for at AR og EGF er funksjonelt beslektet.

Den synergistiske virkning av AR med TGF-8 impliserer sterkt at AR er en viktig faktor ved regulering av cellevekst. Den foreliggende oppfinnelse tilveiebringer således hittil utilgjengelig forskningsmessig verktøy for undersøkelse av den komplekse og fremkommende historie angående normal celle-vekstkontroll og det karakteristiske tap av vekstkontroll i neoplastiske celler.

AR fremkaller også proliferasjon av humane forhuds-fibroblaster (tabell IV). En fordobling av DNA-syntesen i disse celler ble observert ved tilnærmet 50 pM konsentrasjon av AR. En maksimal stimulering til det tilnærmet 6-dobbelte forekom ved tilnærmet 5 nM.

Mekanismen hvorved AR signalerer celleproliferasjon eller vekstinhibering, er ukjent. Foreløpige undersøkelser med hensyn til karakterisering av AR-reseptorbinding antyder imidlertid at AR kan ha en spesifikk reseptor. AR konkurrerer med EGF med hensyn til binding til EGF-reseptoren og kan også konkurrere med EGF med hensyn til binding til andre vanlige reseptorer, mulig innbefattet den AR-spesifikke reseptor selv. Det er kjent at ligandbinding til EGF-reseptoren initierer et vekststimulerende signal, delvis ved aktivering av tyrosin-kinaseaktivitet. Binding av AR til EGF-reseptoren kan like-ledes initiere en proliferativ reaksjon eller, omvendt, kan blokkere initiering av et proliferativt signal ved begrensning av det antall EGF-reseptorer som er tilgjengelige for binding av EGF eller andre signal-frembringende ligander.

Alternativt er en annen mekanisme mulig hvor AR inhiberer cellevekst, og denne mekanisme antydes av data ifølge tabell I. Fire kloner av A431-cellelinjen med vari-able EGF-bindingsseter for hver celle, ble testet med hensyn til følsomhet overfor AR-inhibitorisk aktivitet. Den observerte mangel på sammenheng mellom AR-følsomhet og antall EGF-bindingsseter pr. celle antyder at det vekstinhiberende signal utviklet av AR, initieres ved et reseptorbindings-trinn som ikke omfatter EGF-reseptoren. Et slikt trinn kan antagonisere vekstproliferative signaler utviklet av andre vekstfaktorer som f.eks. TGF-ct. AR kan således utøve sin anti-proliferative virkning ved spesifikt å blokkere en celles mitogene reaksjon på TGF-a eller andre autokrine vekstfaktorer.

AR er et ekstremt hydrofilt protein hvis aminosyresekvens utvikler en enestående hydropatiprofil som har liten likhet med profilene for andre proteiner av EGF-familien

(fig. 11). AR er et basisk protein med en PI på 7,6-8,0.

5. 4. 1. Karaktisering av AR- induksjon med TPA

TPA fremkaller en pleiotrop reaksjon på celler, innbefattet endringer i cellemorfologi, celleproliferasjon og

-differensiering, membrantransport, reseptor-ligand-vekselvirkninger, protein-fosforylering og fosfolipid-

2+

metabolisme. Proteinkinase C (PKC) er en Ca - og fosfolipid-avhengig protein-kinase som fungerer som en reseptor for TPA.

Binding av TPA til PKC fører til fosforyleringen av tallrike substrater innbefattet vekstfaktorreseptorer, celleskjelett-proteiner og trans-aktiverende, regulatoriske proteiner.

c-AMP er et annet regulerende molekyl som utviser forskjellige innvirkninger på celler, primært gjennom cAMP-avhengig protein-kinase A. Intracellulære nivåer av cAMP reguleres ved en blanding av reseptor-formidlet aktivering og adenylat-cyclaseinhibering. Noen undersøkelser viser at TPA- og cAMP-indusert genekspresjon kan forløpe den samme

vei. For å undersøke reguleringen av AR-genekspresjon ble virkningen av forskjellige aktivatorer eller inhibitorer undersøkt på dannelsen av AR-spesifikt RNA i MCF-7-celler.

Forskolin er et legemiddel som aktiverer adenylat-cyclase, noe som fører til forhøyet intracellulært cAMP. Ved administrering av 25 uM i 4 timer til MCF-7-celler ble det observert en markert stimulering av AR mRNA, noe som antyder at cAMP-veiene også spiller en rolle ved regulering av AR-ekspresjon. 5. 5. Strukturelt nærliggende amphiregulin- fragmenter. analoger og peptider med tilsvarende biologisk aktivitet

Fremstilling og anvendelse av fragmenter, analoger og peptider som er strukturelt nærliggende AR, er også omfattet av foreliggende oppfinnelse. Slike fragmenter, analoger og peptider som utviser vekstmodulerende aktivitet, kan finne anvendelse ved diagnose, prognose og behandling av forskjellige former for neoplasi. Slike fragmenter, analoger eller peptider kan ha forhøyet eller forminsket biologisk aktivitet i sammenligning med nativt AR og/eller kan utvide eller begrense det AR GIA-mottagelige celleområde og ennå falle innenfor rammene av den foreliggende oppfinnelse. På lignende måte kan fremstillingen og anvendelsen av fragmenter, analoger og peptider som er strukturelt nærliggende AR og som utviser forhøyet eller forminsket vekststimulerende aktivitet og/eller som utvider eller begrenser det område av celler som reagerer på AR's vekststimulerende aktivitet, også ha nyttige anvendelsesområder, innbefattet, men ikke begrenset til behandling av sår og forbrenninger.

Strukturelt nærliggende AR-fragmenter, analoger og peptider ifølge foreliggende oppfinnelse kan fremstilles ved forskjellige fremgangsmåter kjent i teknikken. Fremgangsmåter og manipulasjoner på gen- og proteinnivåene er omfattet av den foreliggende oppfinnelse.

På proteinnivået kan tallrike kjemiske modifikasjoner anvendes til fremstilling av AR-nærliggende fragmenter, analoger eller peptider ved fremgangsmåter kjent i teknikken, innbefattet, men ikke begrenset til, spesifikk kjemisk spaltning med endopeptidaser (f.eks. cyanogenbromider, trypsin, chymotrypsin, V8-protease og lignende), eller exopeptidaser, ved acetylering, formylering eller oxydering, etc.

5.- 6. Anvendelse av amphiregulin

Den bifunksjonelle natur av AR tilveiebringer forskjellige anvendelser in vitro og in vivo. En hvilken som helst forbindelse som omfatter AR eller strukturelt nærliggende fragmenter av denne, og som utviser vekstinhiberende og/eller vekststimulerende aktivitet, enten alene eller sammen med andre biologisk aktive vekstfaktorer, inhibitorer eller immunmodulerende midler, kan anvendes.

Lokaliseringen av AR-genet til et område som er involvert i lymfocytt-differensiering, antyder at AR kan spille en rolle ved hematopoietisk celleutvikling,

aktivering eller immunundertrykkelse. Denne funksjon under-støtte også av homologien mellom det AR3-utranslaterte område og lignende områder fra andre cytokiner.

Forbindelsene fremstilt ifølge oppfinnelsen kan anvendes ved modulasjon av angiogenese, benresorpsjon, immunrespons og synaptiske og neuronale effektorfunksjoner. AR kan også anvendes ved modulering av arachidonsyre-strømmen. Enzymatisk oxydasjon av arachidonsyren fører til mange viktige produkter, som prostaglandiner, thromboxaner, prostacycliner og leukotriener. Slike produkter er ekstremt kraftige, ubikvitære midler med tallrike fysiologiske virkninger, innbefattet muskelkontraksjon, blodplateaggregering, leuko-cyttmigrasjon og gastrisk sekresjon. AR, AR-beslektede molekyler og blandinger av disse, kan være spesielt nyttige ved behandling av sår og ved diagnose og behandling av kreft.

5. 6. 1. Behandling av sår

AR kan anvendes ved behandling av sår, som kutane sår, hornhinnesår og forskjellige andre epiteliale og stromale sprengninger, som kronisk ulcus, forbrenninger, kirurgiske inngrep, traumatiske sår og beskadigelser på hule, epitelbekledte organer, som spiserør, mave, tykktarm og tynntarm, munn og kjønnsdeler samt urinveiene. Ved fremgangsmåten anvendes topisk påføring av et behandlingspreparat inneholdende AR i en fysiologisk akseptabel bærer.

Preparatene fremstilt ifølge foreliggende oppfinnelse kan anvendes til behandling av mange forskjellige typer sår, innbefattet praktisk talt alle kutane sår, hornhinnesår og beskadigelser på de epitelbekledte, hule organer i kroppen. Sår som er egnet for behandling, omfatter slike sår som følger fra lesjoner, som forbrenninger, avskrapninger og snittsår, samt fra kirurgiske inngrep, som kirurgiske inn-snitt og hudtransplantering. Andre tilstander som er egnet for behandling med de omhandlede preparater, omfatter kron-iske tilstander, som kronisk mavesår, diabetisk ulcus og andre ikke-helende (trope) tilstander.

AR kan inkorporeres i fysiologisk akseptable bærere for administrering til det angrepne område. Arten av bærere kan variere i vidt omfang og avhenger av det tilsiktede område for administrering. For administrering til huden foretrekkes vanligvis en krembase eller salvebase hvor egnede baser omfatter lanolin, "Silvadene" (Marion) (særlig til behandling av brannsår), "Aquaphor" (Duke Laboratories, South Norwalk, CT) og lignende. Om ønsket er det mulig å inkor-porere AR-holdige preparater i bandasjer og andre sårbekled-ninger slik at såret konstant kan utsettes for peptidet. Aerosolpåføringer kan også anvendes.

Konsentrasjonen av AR i behandlingspreparatet er ikke kritisk, men bør være tilstrekkelig for å fremkalle epitelial celleproliferasjon. Preparatene kan administreres topisk til det angrepne område, typisk som øyendråper til øyet eller som kremer, salver eller lotions til huden. I tilfelle av skader på øynene foretrekkes hyppig behandling, vanligvis ved administrering i intervaller på 4 timer eller mindre. På huden er det ønskelig å holde behandlingspreparatet konstant på det angrepne område under helingen med påføring av behandlingspreparatet 2-4 ganger daglig eller oftere.

Den anvendte mengde av det fremstilte polypeptid kan variere avhengig av administreringsmåten og anvendelsen av andre aktive forbindelser, men ligger i alminnelighet i området fra tilnærmet 1 ug til 100 ug. Det fremstilte polypeptid kan anvendes sammen med en fysiologisk akseptabel bærer, som saltvann, fosfatbufret saltvann eller lignende. Den anvendte mengde forbindelse bestemmes empirisk på grunnlag av reaksjonen av cellene in vitro og reaksjonen hos for-søksdyrene på de foreliggende polypeptider eller formuleringer som inneholder de foreliggende polypeptider.

AR-forbindelser kan anvendes alene eller i blanding med andre vekstfaktorer, -inhibitorer eller immunmodulatorer.

5. 6. 2. Diagnose og behandling av neoplasi

Preparatene fremstilt ifølge foreliggende oppfinnelse kan være anvendelige ved diagnose, prognose og behandling av mange forskjellige former for neoplasi.

Det beskrives et antall diagnostiske anvendelser av AR og beslektede molekyler. Ved utøvelsen av den foreliggende oppfinnelse kan de foreliggende polypeptider bindes til en markør, som en radioisotop, et enzym, et fluorescerende materiale, et chemiluminescerende materiale, et enzymfrag-ment, en partikkel, etc. Slike forbindelser kan anvendes

for titrering av antallet reseptorer for AR på en celle. Identifisering av reseptorer for AR gir en indikasjon på cellens potensielle responsivitet overfor de biologiske virkninger av AR og beslektede molekyler. AR, AR-beslektede molekyler og/eller antistoffer mot disse kan anvendes ved sammenligningsforsøk for påvisning av AR i medier, spesielt i fysiologiske medier. Forskjellige diagnostiske analyse-fremgangsmåter kjent i teknikken, kan anvendes.

Tilstedeværelsen og nivået av AR i kroppsvæsker og -vev kan direkte eller omvendt angå tilstedeværelsen og ut-bredelsen av visse krefttyper. Analyser som kan påvise og/eller kvantifisere AR, kan anvendes ved diagnose og prognose av kreft (se avsnitt 5.6. ovenfor).

Amphiregulinet fremstilt ifølge foreliggende oppfinnelse kan også anvendes til påvisning av AR mRNA. Analyse som anvender nucleinsyreprober til påvisning av sekvenser som inneholder alle eller en del kjente gensekvenser, er kjente i teknikken og kan anvendes. AR mRNA-mengder kan indikere ut-brytende eller eksisterende neoplasi, og analyser som kan kvantifisere AR mRNA-mengder, er derfor et verdifullt redskap ved diagnostisering.

I tillegg kan maligne celler som uttrykker AR-reseptoren, påvises ved anvendelse av merkede AR- eller AR-beslektede molekyler i et reseptor-bindingsforsøk, eller ved anvendelse av antistoffer mot AR-reseptoren selv. Celler

kan skjelnes i overensstemmelse med tilstedeværelsen av tett-heten av reseptorer for AR, og derved tilveiebringes en fremgangsmåte for å forutsi slike cellers mottakelighet for de biologiske aktiviteter av AR.

AR kan anvendes som en anti-neoplastisk forbindelse. For anvendelse in vivo kan de fremstilte preparater administreres på forskjellige måter, innbefattet ved injek-sjon, ved infusjon, topisk, parenteralt, etc. Administrering kan skje i en hvilken som helst fysiologisk akseptabel bærer, innbefattet fosfatbufret saltvann, saltvann og sterilt vann. AR og beslektede molekyler kan også være innkapslet i liposomer og kan være konjugert til antistoffer som gjenkjenner og bindes til tumor- eller cellespesifikke antigener, og derved tilveiebringes en fremgangsmåte for "målretting" av AR-preparatene.

AR kan være anvendelig in vivo for å indusere terminal differensiering i tumorceller. Slike celler avviker

fra det alminnelige forløp av celledifferensiering som er karakteristisk for normale celler, og er i stand til å fortsette proliferasjon. I motsetning til dette differensierer normale celler til celler som i de fleste tilfeller er ute

av stand til å utføre ytterligere celledeling. Evnen hos AR til å reaktivere normal celledifferensiering i tumorer og i siste instans å stanse fortsatt cellevekst, kan således finne verdifull anvendelse ved tumorterapi.

AR og strukturelt nærliggende fragmenter, analoger og peptider derav, kan anvendes alene eller med minst én annen antiproliferativ forbindelse, innbefattet f.eks. interferon. TGF-61, TGF-82, tumornekrosefaktor-6, tumornekrosefaktor-a, etc, ved behandling av hormonalt påviselige carcinomer som kan påvirke mange forskjellige organer, som lunger, bryst, prostata, tykktarm, etc. Hormonalt påviselige carcinomer kan også behandles ved å fremkalle produksjon av AR i carcinomcellene. Induktorer omfatter østrogener som 17-B-østradiol, forbindelser med østrogen aktivitet, og forbindelser med anti-østrogen aktivitet, som "Tamoxifen". En hvilken som helst blanding av disse forbindelser kan også anvendes som induktor.

Forbindelsene fremstilt ifølge foreliggende oppfinnelse kan anvendes in vitro til inhibering av veksten av celler eller cellelinjer som er følsomme overfor AR, til forskjell fra celler som ikke er følsomme. På denne måte kan heterogene blandinger eller cellelinjer frigjøres fra uønskede celler hvor de uønskede celler er følsomme overfor den vekstinhiberende aktivitet av AR. Forbindelsene kan f.eks. anvendes in vitro til eliminering av maligne celler fra marg til autologe margtransplantasjoner, og til eliminering eller inhibering av proliferasjon av maligne celler i blod forut for reinfusjon.

Den mest virksomme konsentrasjon av AR for inhibering av proliferasjon av en gitt celle kan bestemmes ved tilsetning av forskjellige konsentrasjoner av AR til tumorcellen og overvåkning av graden av inhibering av celleproliferasjon.

Den mest virksomme konsentrasjon av individuelle induktorer og/eller blandinger av induktorer kan bestemmes ved overvåkning av dannelsen av AR i carcinomacellene.

6. Eksempel; Fremstilling, rensing og karakterisering av humant amphiregulin

I de følgende underavsnitt beskrives rensing og karakterisering av amphiregulin dannet av MCF-7-celler behandlet med TPA.

6. 1. Materialer og fremgangsmåter

De følgende fremgangsmåter anvendes for å fremkalle AR-syntese i MCF-7-celler og til fremstilling og karakterisering av i det vesentlige rent AR.

6. 1. 1. SDS- polyacrylamidgel- elektroforese

Proteiner ble analysert på SDS-PAGE "plate"-geler (normalt eller mini "Bio-Rad"-system) som beskrevet (Laemmli, 1970, Nature 227: 680-685) og ble påvist ved farving med sølv (Merril et al., 1981, Science 211: 1437-1439).

6. 1. 2. Isoelektrofokusering

Isoelektrofokusering ble utført i det vesentlige

som beskrevet i Isolab Technical datablad for "Resolve IEF"-geler. Prøver ble anbrakt på ferdigstøpte agarosegeler (85 x 100 mm, pH 3-10) og fokusert på et "Resolve-model FR-2500"-isoelektrofokuseringsapparat under anvendelse av en "Bio-Rad model 3000 Xi"-datakontrollert elektroforese-spenningsforsyning. "Bio-Rad IEF"-standarder ble fokusert sammen med prøven, farvet, og den tørre gel ble anvendt til eksponering av en Kodak "X-Omat AR"-film ved hjelp av en "DuPont Cronex Lightening plus"-forsterkningsskjerm.

6. 1. 3. Jodbehandling av protein

125

Proteiner ble merket med I ved anvendelse av kloramin T-fremgangsmåten (Barridge, 1978, Methods Enzymol. 50:54-65).

6. 1. 4. Proteinbestemmelse

Proteinkonsentrasjoner ble bestemt ved absorpsjon ved forskjellige bølgelengder (210 til 280 nm). Fremgangs-måtene ifølge Lowry (Lowry et al., 1951, J. Biol. Chem. 193:265-275) og Bradford (1976, Anal. Biochem. 72: 248-252) ble anvendt med bovint serumalbumin som standard.

125

6. 1. 5. I- EGF- bindinqsf or søk

Bindingsforsøkene ble utført enten i vevskultur-plater med 48 brønner, dersom de var nydyrkede, og/eller det ble anvendt formalinfikserte A431-celler som beskrevet (Carpenter et al., 1979, J. Biol. Chem. 254, 4484-4891; Shoyab et al., 1979, Nature 279: 387-391; DeLarco et al., 1980, J. Biol. Chem. 255:3685-3690), eller ved å immo-bilisere plasmamembraner på polyvinylkloridplater med 96 brønner som beskrevet (Kimball og Warren, 1984, Biochem. Biophys. Acta 771: 82-88) .

6. 2. Fremstilling av amphiregulin

6. 2. 1. Innsamling av tilpasset medium fra TPA- behandlede MFC- 7- celler

MFC-7-celler ble dyrket i Corning "T 150"-vevskultur-kolber i et samlet volum på 25 ml av 50% IMDM (Iscoves modifiserte Dulbeccos medium) + 50% DMEM inneholdende 0,6 ug/ml insulin og 15% varmeinaktivert, bovint fosterserum (komplett MCF-7-medium). Tilnærmet 1 x 10<6> celler ble podet i hver kolbe og inkubert ved 37°C under 5% C02. På den 6. dag ble alt medium fjernet, og 20 ml friskt, komplett MCF-7-medium inneholdende 100 ng/ml TPA, ble tilsatt til hver.kolbe. 48 timer senere ble mediet fjernet, og hver kolbe ble skyllet med 15 ml bestående av 50% IDMM + 50% DMEM (serumfritt medium), og 25 ml friskt, serumfritt medium

ble tilsatt til hver kolbe som ble inkubert ved 37°C under 5% CO2. 4 dager senere ble det tilpassede serumfrie medium innsamlet, sentrifugert for å fjerne urenheter og oppbevart ved -20°C. Kolbene ble på nytt tilsatt 25 ml serumfritt medium, og tilpasset, serumfritt medium ble innsamlet hver 3. eller 4. dag. En aliquot av det tilpassede medium fra hver innsamling ble undersøkt med henblikk på vekstinhiberende aktivitet (GIA) på humane, epidermoide A431-carcinomaceller. Vanligvis ble det innsamlet 3-4 prøver av tilpasset medium fra hver porsjon TPA-behandlede MCF-7-celler.

6. 2. 2. Isolering av " rått" AR

Tilnærmet 4 500 ml tilpasset medium ble tint og sentrifugert ved 4°C i 15 minutter ved 3 500 omdr./minutt. Supernatanten ble konsentrert i en 2-liters "Amicon"-konsentrator under anvendelse av en "YM10"-membran (Amicon) ved 4°C. Når volumet av det tilbakeholdte nådde tilnærmet 200 ml, ble det tilsatt 1000 ml kaldt "Mili-E-Q"-vann, og blandingen ble rekonsentrert til 200 ml.

Konsentratet ble fjernet og overført til en på for-hånd avkjølt 250 ml Corning-sentrifugekolbe. Konsentrert eddiksyre ble tilsatt langsomt under omrøring til en slutt-konsentrasjon på 1 M eddiksyre. Blandingen fikk stå i 1 time ved 4°C og ble sentrifugert i 20 minutter ved 40.000 x g ved 4°C i en "Sorval RC-5B"-sentrifuge. Supernatanten ble fjernet og oppbevart ved 4°C. Pelleten ble suspendert i 30 ml 1 M eddiksyre og resentrifugert som beskrevet ovenfor. Supernatanten ble på nytt fjernet forsiktig og blandet med den første supernatant og deretter dialysert mot 17 liter 0,1 M eddiksyre i "No. 3 spektrapore"-dialyserør (molekylvektavskjæring tilnærmet 3000). Dialysebufferen ble endret 3 ganger i løpet av 2 dager. Det tilbakeholdte ble lyofilisert. Det tørre materiale ble fjernet, blandet, veiet og oppbevart ved -20°C for videre anvendelse. Dette materiale benevnes som rått pulver.

6. 3. Rensing av amphiregulin

6. 3. 1. Revers- fase- væskekromatografi

950 mg rått pulver (fra tilnærmet 9 liter serumfritt-tilpasset medium) ble suspendert i 300 ml 0,1% TFA (tri-fluoreddiksyre) og sentrifugert i 20 minutter ved 7000 x g. Supernatanten ble forsiktig fjernet og overført til en preparativ C18-søyle (2,54 cm x 27 cm, 55-105 u, Waters) ekvilibrert med 0,1% TFA i vann. Det kromatografiske kolonne-materiale ble suspendert i acetonitril (MeCN) med 0,1% TFA, oppslemningen ble overført på en søyle med en diameter på 2,54 cm, og søylen ble vasket med 400 ml MeCN med 0,1% TFA

og deretter ekvilibrert med 600 ml 0,1% TFA i vann. Gjennom-strømningshastigheten var 4 ml/minutt, og kromatografien ble utført ved romtemperatur. Søylen ble vasket med 6 50 ml 0,1% TFA i vann. "Flow-through" og vaskeløsning ble oppsamlet sammen.

Deretter ble trinnvis eluering utført som følger: (1) 650 ml 20% MeCN/H20 med 0,1% TFA, (2) 650 ml 40% MeCN/H20 med 0,1% TFA, (3) 650 ml 60% MeCN/H20 med 0,1% TFA og (4) 650 ml 100% MeCN med 0,1% TFA. En aliquot ble tatt fra hver fraksjon

og testet for GIA. En samlet GIA-aktivitet på tilnærmet 77% forekom i gjennombruddet og i vaskefraksjonene.

"Flow-through" og væskefraksjoner ble injisert isokratisk på en preparativ "Partisil 10 0DS-3"-søyle (10 p,

2,2 x 50 cm, Whatman) forbundet med et HPLC-system (Waters). Gjennomstrømningshastigheten ble innstilt til 4 ml/minutt. Når prøven var overført til søylen, ble denne vasket med

250 ml 0,1% TFA i vann. Den lineære gradient ble utviklet

iucj.j-wiLi piniKsie uppi^saingsmiQaei, u,j.? iia i vann, og det sekundære oppløsningsmiddel, acetonitril inneholdende 0,1% TFA. Gradientforholdene var: 0-15% i 10 minutter, 15-15% i 30 minutter, 15-25% i 150 minutter, 25-65% i 100 minutter og 65-100% i 10 minutter. Samtlige oppløs-ningsmidler hadde HPLC-kvalitet. Fraksjoner på 14 ml ble innsamlet, og aliquoter av hver fraksjon ble analysert med hensyn til GIA. To brede aktivitetstopper kunne iakttas (fig. 1), Toppen som eluerte tidlig (eluert mellom 20-23% acetonitril) ble videre renset og karakterisert.

Fraksjonene 47-62 ble blandet. 224 ml 0,1% TFA i vann ble tilsatt den blandede fraksjon. Blandingen ble injisert isokratisk på en semipreparativ "u-Bondapak C18"-søyle (7,8 x 300 mm, Waters) ved en gjennomstrømningshastig-het på 2 ml/minutt ved romtemperatur. De lineære gradient-forhold var 0-17% i 10 minutter, 17-17% i 30 minutter, 17-25% i 320 minutter og 25-100% i 40 minutter. Gjennom-strømningshastigheten var 1 ml/minutt under gradientforholdene, og 4 ml fraksjoner ble innsamlet. Aliquoter ble tatt ut og analysert med hensyn til GIA. Det ble iakttatt at to hovedaktivitetstopper eluerte ved acetonitrilkonsentra-sjoner på hhv. tilnærmet 20% og 21% (fig. 2).

Fraksjonene 49-53 ble blandet. 20 ml 0,1% TFA ble tilsatt til den blandede fraksjon. Blandingen ble påført isokratisk på en "u-Bondapak-C18"-søyle (3,9 x 300 mm, Waters) ved en gjennomstrømningshastighet på 1 ml/minutt

ved romtemperatur. Gradientforholdene var 0-18% i 10 minutter, 18-18% i 30 minutter, 18-25% i 280 minutter og 25-100% i 20 minutter. Gjennomstrømningshastigheten var 0,4 ml/minutt, og 2 ml fraksjoner ble innsamlet. Det meste av aktiviteten fremkom fra søylen ved en acetonitrilkonsentrasjon på tilnærmet 21,5% (fig. 3A). Fraksjonene 54-59 (fig. 2) ble blandet og kromatografert på nøyaktig samme måte som beskrevet ovenfor i fig. 3A. Det meste av aktiviteten ble eluert fra søylen ved en acetonitrilkonsentrasjon på tilnærmet 22,2% (fig. 3B).

6. 3. 2. Gelgjennomtrengingskromatografi

Fraksjoner 35-38 (fig. 3A) ble konsentrert individuelt til tilnærmet 70 uliter med en "Speed-Vac"-konsentrator (Savant), og til dette ble tilsatt et tilsvarende volum acetonitril inneholdende 0,1% TFA. Denne 140 uliter prøve ble injisert på to "Bio-Sil TSK-250"-søyler (7,5 x 300 mm hver, Bio-Rad) som var anbrakt etter hverandre. Elueringen ble utført isokratisk med en mobil fase av 50% acetonitril/H20 med 0,1% TFA ved romtemperatur. Gjennomstrøm-ningshastigheten var 0,4 ml/minutt, og papirhastigheten i skriveren var 0,25 cm/minutt; 0,4 ml fraksjoner ble innsamlet, og aliquoter ble analysert med hensyn til GIA. Kromatografiske profiler av fraksjonene 35, 36 og 37 (fig. 3A) er vist i hhv. figur 4A, 4B og 4C.

Fraksjonene 41 og 42 (fig. 3B) ble blandet og konsentrert til 70 uliter og ble deretter underkastet gelgjennomtrengingskromatografi som beskrevet ovenfor. Den kromatografiske profil er vist i figur 4D.

6. 4. Cellevekstforsøk

6. 4. 1. Cellevekstmodulerende forsøk ved anvendelse av <1>25I-deoxyuridin- inkorporering i DNA

Forsøkene ble utført på plater med 96 flate brønner ("Falcon 3072"). Humane epidermoide carcinomer av vulva-celler (A431) ble anvendt som testceller for vekstinhiberende aktivitet (GIA), og humane forhuds-fibroblaster (Sadamoto) ble anvendt som indikatorceller for vekststimulerende aktivitet (GSA). 3,5 x 10 4 celler i 50 uliter DMEM supplert med 5% varmeinaktivert, bovint fosterserum (FBS), peni-cillin/streptomycin (PS) og glutamin (forsøksmedium) ble anbrakt i alle brønner med unntagelse av de perifere brønner. De perifere brønner ble tilført 50 uliter PBS. Tre timer senere ble det tilsatt 50 uliter forsøksprøve i testmedium til hver brønn, mens kontrollbrønnene kun ble tilsatt 50 uliter forsøksmedium. Tre brønner ble anvendt til hver konsentrasjon av testprøven. Plater ble inkubert ved 37°C i 2-3 dager. Deretter ble det tilsatt 100 uliter av en oppløs-ning av <125>I-jod-2'-<125>I-deoxyuridin [4 Ci/mg - 0,5 mCi/ml

(2 uliter/ml i testmedium)] til hver brønn, og platene ble inkubert ved 3 7°C. Etter 4-6 timer ble mediet oppsugd fra brønnene som ble vasket én gang med 200 uliter PBS. Der-

etter ble det tilsatt 200 uliter methanol til hver brønn, platene ble inkubert i 10 minutter ved romtemperatur, og methanol ble fjernet ved oppsuging. 200 uliter 1 M natriumhydroxyd ble tilsatt til hver brønn, og platene ble inkubert i 30 minutter ved 37°C. Natriumhydroxyd ble fjernet med "titertek"-propper (Flow Labs). Proppene ble overført til 12 x 75 mm plastrør og ble tellet i en y-teller for

125

mengdebestemmelse av I-IUdR-inkorporering.

6. 4. 2. Koloni- analysebestemmelse i bløt agar

Et 0,5 ml basislag av 0,5% agar ("Agar Noble", Difco Laboratories, Detroit, MI) i DMEM inneholdende 10% varmeinaktivert FBS, ble tilsatt til "Costar"-vevskulturplater med 24 brønner. 0,5 ml 0,3% agar inneholdende samme medium-FBS-blandmg, 5-10 x 10 3 testceller og forskjellige konsentrasjoner av de faktorer som skulle analyseres, ble anbrakt ovenpå basislaget av agar. Platene ble inkubert ved 37°C i en fuktig atmosfære med 5% C02 i luft, og etter 7 dager ble det tilsatt 0,5 ml 0,3% agar inneholdende samme medium og samme konsentrasjoner av testmateriale. Kolonier ble tellet ufiksert og ufarvet, og antall kolonier på fler enn 20 celler ble bestemt mellom 7. og 14. dag.

6. 4. 3. Cellevekstinhiberende analysebestemmelse

4 A431-celler ble anbrakt på plater med 2,1 x 10 celler pr. brønn i 0,3 ml medium (DMEM med 10% FBS, P/S, glutamin) på "Costar"-plater med 24 brønner (tilnærmet 2 cm 2/brønn) og inkubert i 2 timer ved 37°C. Deretter ble det tilsatt, som

dobbeltfortynning, forsøksprøver ved forskjellige konsentrasjoner i 0,3 ml medium til hver brønn. Til kontrollbrønnene ble det tilsatt medium uten prøve. Platene ble inkubert ved 37°C i 72 timer. Mediet ble deretter oppsugd, cellene vasket med 1 ml PBS/brønn, frigjort med 0,5 ml trypsin (0,5%)-EDTA (0,5 mM) og tellet under anvendelse av en "Coulter"-teller.

6. 5. Analyse av primær struktur for AR

6. 5. 1. Reduksjon og S- pyridylethylerinq

AR (20-30 ug) ble tørket i et 1,5 ml "mikrofuge" polypropylenrør og suspendert i 100 uliter 3 M urea i 0,05M Tris-HCl, pH 7,5. 4 yliter 2-mercaptoethanol ble tilsatt blandingen, innholdet ble blandet, skyllet med nitrogen og inkubert ved 25°C. Etter 2,5 timer ble det tilsatt 4,5 yliter friskt destillert 4-vinylpyridin til blandingen, røret ble på nytt skyllet med nitrogen og inkubert i 2 timer ved 25°C. Reaksjonsblandingen ble surgjort til pH 2,0 med 10% TFA. S-pyridylethylert AR ble renset ved revers-fase HPLC på en "y-Bondapak-C18"-søyle (3,9 x 300 mm, Waters). Acetonilkonsentrasjonen ble lineært øket (1%/minutt) i 55 minutter ved en gjennomstrømningshastighet på 1 ml/minutt. Det primære oppløsningsmiddel var 0,1% TFA. S-pyridylethylert AR (SPE-AR) ble eluert ved en acetonitrilkonsentrasjon på tilnærmet 26,5%, noe som er en tilnærmet 4% høyere acetonitrilkonsentrasjon enn for ubehandlet AR.

6. 5. 2. N- glycanasebehandling

AR eller S-pyridylethylert AR (10-20 ug) ble tørket

i et 1,5 ml "mikrofuge" polypropylenrør, suspendert i 80 uliter 0,1 M fosfatbuffer med pH 5,5, 10-20 uliter N-glycanase (0,25 enheter/uliter, Genzyme) ble tilsatt, blandingen ble inkubert i 16 timer ved 37°C, og 0,9 ml 0,2% TFA ble tilsatt reaksjonsblandingen, og prøven ble injisert på en "ultrapore RPSC C3"-revers-fase HPLC-søyle (4,6 x 74 mm, Altex) ved en gjennomstrømningshastighet på 1 ml/minutt, hvor denne søyle tidligere var ekvilibrert med det primære oppløsningsmiddel 0,1% TFA. Acetonitril med 0,1% TFA ble anvendt som det sekundære oppløsningsmiddel. Konsentrasjonen av acetonitril ble lineært øket (0,4%/minutt) i 85 minutter ved romtemperatur. N-deglycosylert AR og N-deglycosylert S-pyridylethylert AR, ble eluert ved en konsentrasjon på hhv. tilnærmet 16,5% og 20,5% acetonitril.

6. 5. 3. Enzymatisk spaltning av N- glycanasebehandlet S- pyridylethylert AR

Spaltning med endopeptidase Lys-C ble foretatt i

60 uliter 0,1 M Tris-eddiksyrebuffer, pH 8,0, ved 25°C i

16 timer. Enzym:substratforholdet var 1:5 (på vektbasis). Endopeptidase-Arg- og S-aureus V8-protease-nedbrytning ble foretatt i 80 uliter 0,05 M Tris-HCl, pH 8,0, og 0,1 M ammoniumbicarbonat ved 37°C i 16 timer. Enzym:substrat-forholdet var igjen 1:5.

6. 5. 4. Kjemisk spaltning

For CNBr-spaltning ved en methioninrest ble 5 ug N-glycanasebehandlet S-pyridylethylert AR tørket i et 1,5 ml "mikrofuge"-polypropylenrør, suspendert i 75 uliter 70% maursyre, deretter tilsatt 25 uliter CNBr-oppløsning (25 mg/ml i 70% HCOOH) og blandet, og deretter ble røret skyllet med nitrogen. Reaksjonen ble utført i 22 timer ved 25°C i mørke. Reaksjonsblandingen ble fortynnet til 1,1 ml med vann og tørket i en "Speed-Vac"-konsentrator. Den tørkede prøve ble suspendert i 20 uliter 2-aminoethanol, hen-sto i 10 minutter ved 22°C og ble tørket i vakuum. Blandingen ble suspendert i 0,9 ml 0,2% TFA.

6. 5. 5. Peptidisolering

Peptider ble adskilt på en revers-fase HPLC C8-søyle (4,6 x 100 mm, Whatman) forbundet med et HPLC-system (Waters). Surgjorte prøver (pH 2,0) ble påsatt søylen som var ekvilibrert med 0,1% TFA (primært oppløsningsmiddel) ved en gjennomstrømningshastighet på 1 ml/minutt, og søylen ble ytterligere vasket med tilnærmet 15 ml 0,1% TFA. Lineære gradienter ble anvendt mellom det primære oppløsningsmiddel og det sekundære oppløsningsmiddel acetonitril med 0,1% TFA. Gradientforholdene var 0-50% i 125 minutter ved en gjennom-strømningshastighet på 0,5 ml/minutt.

6. 5. 6. Aminosyreanalyse

Tørkede prøver ble hydrolysert med konstant kokende HC1 (5,7 M, Pierce) inneholdende 1% (på volumbasis) fenol under redusert trykk i en Teflon-forseglet glasshydrolyse-kolbe (Pierce) ved 105°C i 16 timer. Hydrolysatene ble tørket i en "Speed-Vac"-konsentrator (Savant Instruments) og derivatisert med fenylisothiocyanat i 20 minutter ved romtemperatur. Fenylthiocarbamyl-aminosyrederivater ble analysert ved revers-fase HPLC på en octadecyl-søyle (4,5 x 250 mm, IBM). Den lineære gradient ble utført mellom det primære oppløsningsmiddel, 0,15 M natriumacetat, pH 6,4, 0,05% triethylamin titrert til pH 6,4 med eddiksyre, og det sekundære oppløsningsmiddel, 60% acetonitril ved en gjennom-strømningshastighet på 1 ml/minutt ved 38°C.

6. 5. 7. Bestemmelse av aminosyresekvens

Peptidsekvenser ble bestemt ved hjelp av et "Applied Biosystem model 475"-gassfasesekvensbestemmelsesapparat som beskrevet (Hewick et al., 1981, J. Biol. Chem. 256:7990-7997). Tre precykler av Edman-degradering ble utført forut for prøvepåføring i hvert forsøk. 25% TFA ble anvendt for å omdanne triazolinderivatene til fenylthiohydantoin-aminosyrer. Identifikasjon av fenylthiohydantoin-aminosyrer ble utført, on-line, på et "Model 120A PTH"-analyseapparat (Applied Biosystem) som beskrevet (Hunkapiller og Hood, 1983, Science 219: 650-659).

6. 5. 8. Forskjellige behandlinger

50-100 enheter av enten semirent (semi-preparativt revers-fase C18-trinn) eller tilsynelatende rent AR ble anvendt til disse forsøk (tabell 1). N-glycanase og 0-glycanase stammet fra Genzyme Corp., Boston, og alle andre enzymer stammet fra Boehringer Mannheim Biochemicals eller Worthington Biochemicals. Behandlinger ble utført i

50-200 yliter av en egnet buffer. Det ble anvendt en over-skytende mengde enzym, vanligvis 5-20% (på vektbasis) av substratkonsentrasjon. Etter behandling ble prøven analysert med hensyn til GIA ved å fjerne forstyrrende materialer ved forskjellige analytiske fremgangsmåter. I de fleste tilfeller ble pH-verdien av prøven innstilt til tilnærmet 2 med 10% TFA. Prøvene ble påsatt på en revers-

fase "ultrapore RPSC C3"-søyle (4,6 x 75 mm, Altex) ekvilibrert med 0,1% TFA. Søylen ble ytterligere vasket med primært oppløsningsmiddel 0,1% TFA. Deretter ble eluer-

ingen innledet under anvendelse av acetonitril med 0,1% TFA som et sekundært oppløsningsmiddel. Gradientforholdene var 0-50% i 0,2 minutter og 50-50% i 19,8 minutter. Gjennom-strømningshastigheten var 0,5 ml/minutt, og 2 ml fraksjoner ble oppsamlet. Aliquoter ble uttatt og analysert med hensyn til GIA. AR-aktivitet eluerte vanligvis i fraksjon 4.

6. 6. Undersøkelser av DNA- bindinq

Bindingen av AR til nativt kalvethymus DNA-cellulose, denaturert kalvethymus DNA og cellulose ble utført som beskrevet (Herick og Alberts, 1971, Methods in Enzymology 21:198). Celluloser (10 mg) ble rehydrert i 500 uliter ladningsbuffer (20 mM Tris pH 7,4, 10% glycerol, 1 mM EDTA, 1 mM 8-mercaptoethanol, 100 ug/ml BSA og 50 mM NaCl). Reak-sjonene ble utført som dobbeltforsøk i 1,5 ml Eppendorf-rør med 300 uliter hydrerte (pakket volum) celluloseprøver vasket 5 ganger med ladningsbuffer. Deretter ble det tilsatt 0,2 ng <125>I-AR (spesifikk aktivitet på 425 uCi/ug) eller et

125

annet I-merket protein i 250 uliter ladningsbuffer til hvert rør. Prøvene ble blandet og inkubert ved 4°C i 20 minutter under periodevis omrøring og ble deretter vasket 5 ganger med 200 uliter ladningsbuffer pr. vask. Eluering ble utført trinnvis med 0,1 M, 0,15 M, 0,25 M, 0,6 M, IM og

2 M NaCl i ladningsbuffer (5 ganger med 200 uliter ved hver konsentrasjon). Spesifikt bundet materiale ble definert som det materiale som eluerte ved en konsentrasjon på 0,25 M

NaCl eller mer. Materiale som eluerte ved en konsentrasjon på 0,15 M NaCl eller mindre, ble betraktet som ikke-spesifikt bundet.

6. 7. Resultater

6. 7. 1. Fremstilling av AR med TPA- behandlede MCF- 7- celler

MCF-7-celler dyrket på et plastsubstrat, utviste typiske epiteloide trekk: celler er små og har polygonal form. TPA fremkaller dramatiske morfologiske endringer på en doseavhengig måte. Etter TPA-behandling mister MCF-7-celler sin veldefinerte morfologi, de blir avrundet og utbredt. TPA frembringer en doseavhengig reduksjon i antall celler og en stigning i cellevolumet sammenlignet med ubehandlede celler.

Serumfritt, tilpasset medium fra MCF-7-celler utviste ingen påviselig vekstinhiberende aktivitet overfor A431-celler. Serumfrie supernatanter innsamlet fra MCF-7-celler behandlet med TPA i 2-3 dager, viste seg imidlertid å inhibere proliferasjonen av A431 epidermoide carcinomaceller. Den optimale induksjon av inhibitorisk aktivitet ble observert ved 25-100 ng/ml TPA. Selv etter fjernelse av TPA utviste TPA-behandlede MCF-7-celler denne aktivitet i serumfritt medium i minst 8 dager. Selv om en reduksjon i vekstinhibitorisk aktivitet kunne observeres med tiden etter fjernelse av TPA, viser disse resultater induksjon eller økning av amphiregulin ved ekspresjon i MCF-7-celler som er behandlet med TPA.

6. 7. 2. Innledende karakterisering

Tabell I oppsummerer virkningen av forskjellige fysiske, kjemiske og enzymatiske behandlinger på den anti-proliferative aktivitet av amphiregulin. GIA (vekstinhiberende aktivitet) av amphiregulin var motstandsdyktig overfor behandling med 1 M eddiksyre, 1 M ammoniumhydroxyd, 6 M

urea, 0,01 M natrium-metaperjodat, oppvarming ved 5 6°C i 30 minutter og behandling med neuraminidase, N-glycanase, O-glycanase, lipase, fosfolipase A2, C eller D. Aktiviteten var imidlertid følsom overfor oppvarming ved 100°C i 10 minutter, reduksjon, reduksjon og behandling med 4-vinylpyridin samt overfor nedbrytning med proteinaser som trypsin, endopeptidase Lys-C, endopeptidase-Arg og endopeptidase-Glu (V-8). Disse resultater antyder at amphiregulin er et protein som inneholder cysteiner i disulfidbinding(er) som er vesentlige for dets biologiske aktivitet. Dette protein kan inneholde oligosaccharid- og/eller lipo-deler som ikke er obligatoriske for den biologiske aktivitet.

6. 7. 3. Rensing av amphiregulin

En oppsummering av amphiregulin-rensing er gitt i tabell III. En rensing på 1.842 ganger med 5,1% utbytte er oppnådd for "TSK-250-I"-fraksjonen, og en rensing på 2.270 ganger med 1,7% utbytte er oppnådd for "TSK 250 II"-fraksjonen. Fremgangsmåten er reproduserbar. Amphiregulin ble renset ved fire forskjellige tilfeller med lignende resultater. Den spesifikke aktivitet av renset amphiregulin ligger i området fra 2,7 til 3,4 x 10 enheter/mg protein. Renset amphiregulin fra "TSK-250-I"-søylen med en spesifikk aktivitet på tilnærmet 3,0 x 10 ble anvendt for strukturelle bestemmelser og andre biokjemiske undersøkelser.

<*> Detaljene er anført ovenfor i avsnitt 6.1.3. og dets underavsnitt. En enhet av GIA defineres som den mengde faktor som er nødvendig for å inhibere <125> I-deoxyuridin-inkorporering i A431-celler med 50%.

6. 7. 4. Analyse av amphiregulin ( AR) og S- pyridylethylert amphiregulin ( SPE- AR) ved HPLC

Gelgjennomtrengingskromatografi av AR og SPE-AR på

en "TSK 250"-søyle (7,5 x 600 mm, Bio-Rad) er vist i hhv. fig. 5A og 5B. Aktiviteten eluerte sammen med proteintoppen (5A). Molekylvekten av AR og SPE-AR ble bestemt ut fra data i fig. 5 og viste seg å være hhv. tilnærmet 14000 og 17000. Beregnede molekylvekter for strukturene av avstumpet AR og AR vist i fig. 12, er hhv. tilnærmet 8500 og 9100 dalton.

AR og SPE-AR eluerte som symmetriske enkelttopper fra en "ultrapore RPSC C3" revers-fase HPLC-søyle (4,6 x 75 mm, Altex) (fig. 6A og 6B). GIA eluerte sammen med proteintoppen (fig. 6A). SPE-AR eluerte ved en acetonitrilkonsentrasjon på tilnærmet 21% som er en 4% høyere acetonitrilkonsentrasjon enn for det ubehandlede protein. Disse resultater antyder at AR er rik på cysteinrester som er modifisert med 4-vinylpyridin, hvorved AR blir mer hydrofobt samtidig med at det eluerer ved en høyere acetonitrilkonsentrasjon.

6. 7. 5. SDS- PAGE- analyse av AR

Fig. 7A viser en analyse av AR, N-glycanasebehandlet AR (NG-AR), SPE-AR og N-glycanasebehandlet SPE-AR (NG-SPE-AR) i 15% acrylamid under reduksjonsbetingelser (fig. 7A). AR og SPE-AR beveget seg i gelen som et bredt, diffust, enkelt bånd med en gjennomsnittlig relativ molekylvekt på 22500 innenfor et område på tilnærmet 20000 til 25000 (felt 1 og 3). Behandlingen av AR og SPE-AR med N-glycanase førte til en hurtigere bevegelse av disse proteiner. NG-AR og NG-SPE-AR beveget seg som et enkelt bånd med en gjennomsnittlig molekylvekt på hhv. 14000 og 14500 dalton. Lignende resultater kunne iakttas ved forsøk med proteiner i 15% gel under ikke-reduserende forhold (data er ikke vist). Behandlignen av AR med neuraminidase, O-glycanase eller neuraminidase og O-glycanase sammen, endret ikke den elektro-foretiske mobilitet i gel, hverken under reduserende eller ikke-reduserende forhold. AR er således et enkeltkjedet glycoprotein med N-bundne oligosaccharidkjeder som ikke er

nødvendige for GIA hos AR in vitro.

Behandlingen av NG-AR eller AR med fosfolipase D (PLD)

(kål) førte til en reduksjon av GIA til 80% av kontroll-gruppen. PLD-behandlet NG-AR ble underkastet revers-fase-HPLC på en C3-søyle, og rensede, aktive topper ble analysert på 20% SDS-PAGE (fig. 7B). Et enkelt bånd med Mr 5600

kunne iakttas. Disse resultater indikerer at PLD eller noen forurensende proteaser i PLD-preparatet omdanner AR til aktive fragmenter.

6. 7. 6. Isoelektrofokuseringsanalyse ( IEF- analyse) av AR

125

IEF-analyse av I-merket AR ble utført som beskrevet ovenfor i avsnitt 6.1.1.2. AR fokuserte som et enkelt, bredt bånd med PI mellom 7,6 og 8 (fig. 8). NG-AR fokuserte som et enkelt bånd med PI på tilnærmet 8,05. AR er således et basisk enkeltkjedet N-bundet glycoprotein.

6. 7. 7. Biologiske egenskaper 125 Inhiberingen av I-deoxyuridin-xnkorporenng x DNA hos A431-celler ved forskjellig konsentrasjon av renset AR er vist i fig. 9A. En 50% inhibering av DNA-syntese kunne observeres ved tilnærmet 0,2 ng/brønn. En 50% DNA-syntese-inhibering i A431 humane epidermale carcinomaceller kunne således observeres ved en konsentrasjon av det rene protein på tilnærmet 0,13 nM. Det bør imidlertid bemerkes at GIA

av AR avhenger av forsøksforhold, som f.eks. antall celler/brønn (celletetthet), tidspunktet for faktortilførsel, varighet av behandling, serumkonsentrasjon og andre vari-abler .

Ved dyrking av A4 31-celler i fravær og nærvær av forskjellige konsentrasjoner av AR, og ved overvåkning av cellevekst ved en direkte celle-telling, har det vist seg at AR inhiberer A431-proliferasjon på en doseavhengig måte (data

125

er ikke vist) . Utstrekningen av I-deoxyuridm-mkorporering i DNA er således en god målestokk for cellevekst.

125 . • Stimuleringen av I-deoxyuridm-mkorporering i DNA av humane forhuds-fibroblaster (Sadamoto) ved forskjellige

konsentrasjoner av det rensede AR er vist i fig. 9B. En

125

dobbeltstimulermg av I-deoxyuridin-inkorporering kunne ses ved tilnærmet 0,7 ng/ml eller tilnærmet 0,05 nM Ar.

Den maksimale reaksjon var en tilnærmet 6 ganger stimulering

125

av I-deoxyuridm-mkorporering i disse fibroblaster. AR virker således som en vekstfaktor for humane fibroblaster selv i nærvær av 5% FBS.

Virkningen av AR på inkorporeringen av <125> I-deox<y>-uridin i DNA hos forskjellige humane tumor- og ikke-tumorcellelinjer og noen ikke-humane cellelinjer, ble undersøkt. Data er angitt i tabell IV. AR inhiberte veksten av forskjellige kloner av A431-celler, humane brystcarcinomaceller HTB 132, humane ovarie-teratocarcinoma-celler HTB 15 75, humane epidermale carcinomer av cervix-celler CRL 155, humane papillære adenomer av ovarie-celler HTB 75 og humane adenocarcinomer av brystceller HTB 26. AR utviste ikke noen signifikant virkning på forskjellige celler (tabell 3).

125

AR stimulerte inkorporeringen av I-deoxyuridin til flere humane fibroblast-cellelinjer, humane hypofyse-tumorceller CRL 7386, humane ovarie-adenocarcinomaceller HTB77, nyreceller BSC 1 fra grønn afrikansk ape, og nyreceller SA6 fra rotter. AR påvirket ikke signifikant proliferasjon av T-, B- eller endotelceller. AR undertrykte ikke human proliferativ eller cytotoksisk T-cellerespons ved reaksjoner med blandede leukocyttkulturer (MLC).

AR er et monomert protein som krever intrakjede-disulfidbindinger av hensyn til aktiviteten, ikke krever glycosylering av hensyn til aktiviteten, er stabilt under moderate syre- og basebehandlinger og er stabilt ved varmebehandling ved 56°C i 30 minutter. AR mister fullstendig biologisk aktivitet ved reduksjon, ved oppvarming til 100°C i 5 minutter, ved nedbrytning med trypsin, endopeptidase Lys-C, endopeptidase ARG eller endopeptidase GLU.

a 125 enheter (GIA på A431-celler) av AR ble suspendert i 250 yliter forsøksmedium, seriefortynnet 5 ganger med forsøksmedium. 6 fortynninger ble anvendt for hver celle. Fraksjonene ble analysert med hensyn til vekstmodulerende aktivitet, og GIA- og GSA-enheter ble beregnet.

fø En GIA-enhet ble definert som den mengde faktor som var påkrevet for 50% inhibering av <125>I-deoxyuridin-inkorporering i celler.

c En GSA-enhet ble definert som den mengde faktor som var påkrevet for 100% økning av <125>I-deoxyuridin-inkorporering i celler.

N.D. = ikke påviselig

Virkningen av AR og EGF på kolonidannelse av NRK-SA6-celler i bløt agar i nærvær og fravær av TGF-8, ble utført, og resultatene er vist i tabell V. EGF induserte forankringsuavhengig vekst av SA6-celler på en doseavhengig måte i nærvær av TGF-8, mens derimot AR viste seg å være en meget svak induktor for SA-G-kolonidannelse i bløt agar (tabell V).

Forsøkene ble utført som beskrevet i avsnittet.

Kolonier defineres som en klynge av minst 6 celler.

6. 7. 8. Virkning av AR på bindingen av EGF til dets spesifikke reseptorer

125

AR viste seg å inhibere bindingen av I-EGF til

A431-celler samt til A431-plasmamembraner (fig. 10). En

125

50% inhibering av I-EGF-binding til fikserte celler og membraner kunne observeres ved hhv. tilnærmet 1,1 nM og 1,8 nM EGF, mens en 50% reduksjon i EGF-binding til celler og membraner kunne observeres ved hhv. 1,8 nM og 5,7 nM AR.

125

Umerket EGF inhiberte fullstendig I-EGF-reseptor-interaksjonen i begge systemer ved høyere konsentrasjoner. Den maksimale konkurranse med AR var imidlertid hhv. tilnærmet 75% og 50% for binding til celler hhv. membraner. Konkurransekurvene for AR var heller ikke parallelle med kurvene for EGF. Disse resultater antyder at AR utviser lavere affinitet for EGF-reseptorer enn EGF. Den spesifikke reseptor for AR kan også være nært beslektet med EGF-reseptoren .

Flere kloner av A431-cellelinjen med forskjellig føl-somhet overfor AR-inhibering ble utvalgt, og en mangel på sammenheng mellom AR-følsomhet og antallet EGF-reseptorer pr. celle eller KD, kunne iakttas (tabell VI).

Tabell VI

Mangel på sammenheng mellom amphiregulin-følsomhet hos forskjellige A431-kloner og antallet KQ av EGF-reseptorer

Forskjellige kloner av A431 ble utvalgt ved vekst i bløt agar. EGF-binding ble utført som beskrevet ovenfor i avsnitt 6.1.5. KD og antall bindingsseter ble beregnet ut fra Scatchard-plots (Scatchard et al., 1949, Ann. N.Y. Acad. Sei. 51:660-672).

6. 7. 9. Kjemisk struktur av amphiregulin

Aminosyresekvensen av AR ble utledet ved mikrosekvens-analyse av S-pyridylethylert protein (SPE-AR) og fragmenter ble frembrakt ved bruk av endoproteinase Lys-C, Staphylococcus aureus V8 og endopeptidase Arg. Sekvensene av avstumpet protein og protein inneholdende 6 ytterligere aminosyrer, er som følger:

Avstumpet AR

1 10 20

VVKPPQNKTE SENTSDKPKR KKKGGKNGK

30 40 50

NRRNRKKKNPC NAEFQNFCIH GECKYI

60 70 78

EHLE AVTCKCQQEY FGERCGEK

Større AR

1 10 20

SVRVEQVVKP PQNKTESENT SDKPKRKKK

30 40 50

GGKNGKNRRNR KKKNPCNAEF QNFCI

60 70 80 84

HGECKYIEHLEAVTC KCQQEYFGER CGEK

I sekvensen ovenfor anvendes standard-énbokstavs-aminosyreforkortelse for hver aminosyre. Aminosyrerester som det hersker tvil om identiteten til, er angitt i parentes. Bokstaven "X" betegner aminosyre med ukjent identitet. Mengden av større AR viste seg å være tilnærmet 16% i forhold til avstumpet AR.

Proteinsekvensen av AR ble sammenlignet med alle proteiner i databasen hos National Biomedical Research Foundation (PIR 13), Genetic Sequence Data Bank (Bolt Beranek og Newman, Inc., Los Alamos National Laboratories, meddelelse nr. 50) og DNA-sekvensbibliotek hos European Molecular Biology Laboratory .(meddelelse y nr. 12). Disse undersøkelser avslørte at AR er et hittil ukjent protein og er medlem av EGF-overfamilien av vekstfaktorer. Denne familie omfatter EGF (mus, menneske, rotte, kveg, etc), TGF-a, virale vekstfaktorer (vaccinia, myxo og Shope-fibroma), human plasminogenaktivator, bovin faktor IX,

human faktor X, LDL-reseptor, bovint protein C, humant proteoglycan-kjerneprotein, produktet av Drosophila Notch-gen, produktet av C. elegans lin 12-gen og produktet av cellelinje-spesifikt gen av sjøpinnsvin S. purpuratus.

Etter at AR-strukturen var rettet inn på strukturene av proteiner av EGF-overfamilien, ble det avslørt at AR, på samme måte som andre medlemmer av EGF-overfamilien, inneholder de kjennetegnende seks essensielle cysteinrester, opprettholder konservering av cysteinrestavstand og inneholder noen av de karakteristiske og velbevarte aminosyrer. Det er åpenbart at AR ligger mellom de medlemmer av vekst-faktorfamilien som ligner EGF, TGF, og de medlemmer som ligner MGF og SFGF, spesielt med hensyn til anvendelse av asparagin. I stilling 2 (første cystein = 1) inneholder f.eks. samtlige TGF-medlemmer og EGF-medlemmer prolin, VGF inneholder glycin og MGF, SFGF og AR inneholder asparagin.

I samme løkke, i stilling 7, inneholder EGF-medlemmer og VGF-medlemmer glycin, TGF-medlemmer inneholder glutamin,

og MGF, SFGF og AR inneholder asparagin. I tredje løkke inneholder AR imidlertid ikke den velbevarte 6-dreining i

stilling 34 (enten asparagin i MGF og SFGF eller glycin hos samtlige andre medlemmer), men inneholder glutaminsyre (lavt 6-dreiningspotensial). AR har en avvikende struktur for den velbevarte tredje løkke, noe som kan påvirke reseptorbinding. AR inneholder ikke de asparaginrester som mulig anvendes i MGF og SFGF som glycosyleringsseter i selve vekstfaktorstrukturen.

Den N-terminale sekvens av AR har noe analogi med de N-terminale sekvenser hos TGF-medlemmer, VGF og MGF, ved at den er rik på prolin-, serin- og threonin-rester og har,

på samme måte som TGF-medlemmer og VGF, potensielle N-bundne glycosyleringsseter (inneholder faktisk ett slikt sete)

samt muligheten for O-bundet glycosylering i dette område som er rikt på serin, threonin og prolin. Dette område er vel-bevart mellom den N-terminale del av TGF-forstadier og den N-terminale del av FGF og synes å være et sterkt glycosylert område.

AR er et ekstremt hydrofilt protein, spesielt i området som inneholder aminosyrene 8 til 45 (fig. 2). Den hydropatiske profil av AR har liten likhet med de hydropatiske profiler for de andre medlemmer av EGF-familien.

Den hydropatiske profil av den C-terminale del av AR, selv om den er strukturelt beslektet med andre medlemmer av EGF-familien, er ulik profilene av andre medlemmer av denne familie (fig. 11B og C).

6. 7. 10. Spesifikk binding av DNA til AR

125 I-AT ble testet for dets evne til a binde cellulose, denaturert DNA-cellulose og nativt DNA-cellulose under anvendelse av det ovenfor beskrevne forsøk i avsnitt 6.6. Resultatene angitt i fig. 14A, indikerer at AR spesifikt binder både denaturert og nativt DNA-cellulose, men ikke binder til cellulose. Binding av nativt DNA var 3-4 ganger større enn binding til denaturert DNA.

AR's evne til spesifikt å binde DNA adskiller AR fra alle andre medlemmer av EGF-overfamilien. EGF er f.eks. ikke i stand til å binde DNA-cellulose (fig. 14B). Resul-tåtene antyder sterkt at det hydrofile N-terminale 45-aminosyreområde av AR som ikke finnes i EGF eller andre medlemmer av EGF-familien, kan være en kjerne-lokaliserings-sekvens som inngår ved målretting av AR til kjernen hvor faktorer virker sammen med DNA.

8. Eksempel: cDNA- kloning av amphiregulin- forstadiet

Det følgende eksempel beskriver kloning og analyse

av cDNA som koder for amphiregulin-forstadiet fra TPA-behandlede MCF-7-humane brystcarcinomaceller.

8. 1. Materialer og fremgangsmåter

8. 1. 1. Fremstilling av RNA

RNA ble isolert fra subkonfluente celler dyrket i "T150"-vevskulturkolber eller fra nyfrosne vevsprøver ved guanidiniumfremgangsmåten beskrevet av Chirgwin (1979, Biochemistry, 18, 5294). Celler fra fire "T150"-kulturer ble vasket i PBS, trypsinbehandlet, vasket på nytt i PBS, og pelleten ble resuspendert i 8 ml 4 M guanidinium-isothio-cyanatoppløsning. DNA ble klippet ved å lede oppløsningen gjennom en nål med dimensjon 18. Prøven ble anbrakt oppå 2,4 ml 5,7 M CsCl i et "Beckman SW41Ti"-rør og sentrifugert ved 32000 omdr./minutt i 20 timer ved 20°C. Pelletene ble resuspendert i 300 uliter 2,5 M CsCl og utfelt med 2 volumer EtOH ved romtemperatur. Pelletene ble resuspendert i

300 uliter H20, deretter ble det tilsatt 25 uliter 3 M natriumacetat (pH 5,2) og 800 uliter EtOH, og RNA presipi-terte ved -70°C. Presipitering ble gjentatt, og RNA ble kort tørket, resuspendert i 100 uliter H.,0, kvantifisert ved 0D2gQ og oppbevart ved -70°C.

32

8. 1. 2. Vilkårlig endemerking med P- TTP

Spesifikke fragmenter fra AR-kodingsområdet ble utskåret fra lavtemperatur agarosegel (BioRad) og merket med 3 2P-TTP (NEN, 3000 Ci/mmol) ved fremgangsmåten med vilkårlig endemerking utviklet av Feinberg (1983, Anal. Biochem., 137, 266). Ikke-inkorporerte deoxyribonucleosider ble fjernet ved kromatografi på en 1,5 ml "Sephadex 50"-søyle. Spesifikke aktiviteter var 0,5-2,5 x 10 9 cpm/ug.

8. 1. 3. RNA- geler og Northern blot- analyse

10 eller 20 ug samlet RNA ble underkastet elektroforese på 1,2% agarose/formaldehydgeler til Northern-analyse. Agarose/formaldehydgelene ble fremstilt i 40 mM N-morfolinpropansulfonsyre (MOPS), pH 7,0/1 mM EDTA/10 mM natriumacetat/2/2 M deionisert formaldehyd (pH 5,6) i et "IBI VCV"-gelapparat med matte plater. RNA ble denaturert i samme buffer med 50% formamid ved 65°C og behandlet i 1 x MOPS ved 20-30 mA i 3-5 timer. Gelen ble renset i 10 x SSC i 30 minutter og overført til "Hybond-N"-membraner (Amersham), UV-kryssbundet (1200 uJoules), prehybridisert og hybridisert i 5 x SSPE (1 x SSPE er 0,18 M NaCl/20 mM natriumfosfat, pH 7,7, 0,1 mM EDTA), 5 x Denhardts medium, 0,5% SDS og 20 ug/ml denaturert laksesperma-DNA som bærer. Hybridiseringer ble utført ved 42°C i 16 timer med 2 x 10^

32

cpm/ml P-ARBPl. Blottene ble vasket flere ganger i 2 x SSC med 0,1% SDS ved romtemperatur etterfulgt av 1 x SSC/0,1% SDS ved 65°C og eksponert på Kodak "X-OMAT" med

to DuPont "Lightening Plus"-forsterkningsskjermer ved -70°C. Bånd angis som (+) hvis de er tydelig synlige etter eksponering natten over, (+/-), hvis de er synlige etter eksponering i 3 dager og (++) hvis de er påviselige etter 6 timer.

8. 1. 4. cDNA- kloning

MCF-7-celler ble høstet for RNA etter behandling med 100 ug/ml 12-0-tetradecanoyl-forbol-13-acetat (TPA) i 24, 40 og 72 timer. Poly(A)<+>RNA ble isolert fra kombinerte aliquoter av disse prøver og anvendt som templat for den dobbelttrådede cDNA-syntese som beskrevet (Gubler og Hoffman, 1983, Gene 25:263). cDNA med G-hale ble ligert på EcoRI-setet hos ^gtlO ved anvendelse av BRl-oligonucleotid-adaptorer (Rose et al., 1986, Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 83:1261-1265).

5 ug TBA-behandlet MCF-7 poly(A)<+>RNA ble varmedenaturert spesifikt og preparert med 5 ug oligo(dT) ved anvendelse av 100 U revers-fase-transkriptase i et reaksjonsvolum på 45 uliter. Syntese av den andre tråd ble ut-ført med 4 U RNase og 115 U E. coli DNA pool I. 10 yg

T4-DNA-polymerase ble anvendt til å fjerne 3'-fremspring

som frembrakte stumpe ender. Samtlige 6,8 ug dobbeltstrenget cDNA ble anbrakt på en "Sephadex G50"-søyle for utvelgelse av cDNA med mer enn 500 bp, og deretter ble 150 ng cDNA forsynt med dG-hale under anvendelse av terminal deoxy-nucleotidyl-transferase. cDNA forsynt med dG-hale, ble ligert med EcoRI-setet i ÅgtlO under anvendelse av BRl-adaptorer (AATTCCCCCCCCCCCC). Ligert DNA ble pakket in vitro (Grosveld et al., 1981, Gene, 13:227-237) og anbrakt på E. coli C600 rK mK hfl-plater med en virkning i form av IO<6> rekombinanter/ug cDNA. Dobbelte nitrocelluloseprøver ble tatt på 2,5 x 10^ rekombinanter, og filtre ble sorteringsanalysert med [ 3 2P]-merkede, degenererte oligonucleotid-prober og prober etter beste skjønn (tabell VIII nedenfor), avledet fra den primære AR-sekvens ifølge bestemmelse ved automatisk Edman-nedbrytning av N-glycanasebehandlet, redusert og S-pyridylethylert AR (avsnitt 6 ovenfor).

Restriksjonsanalyse avslørte et fåtall seter i cDNA-innføyelsen av pARl, med enkle seter for Bsml, EcoRV, Hgal, Nael, PvuII, Smal og Sstl og to seter for Sspl. Det forekom ingen nedbrytning i innføyelsen med BamHI, Clal, EcoRI, Hindlll, Kpnl, Pstl, Pvul, SphI, Stul og Xbal. Et 170 bp Bsml til PvuIII-fragment ble isolert og anvendt som probe

på et annet cDNA-bibliotek med 100000 rekombinanter som i det vesentlige ble fremstilt som beskrevet ovenfor. Det ble identifisert 13 positive kloner med innføyelser fra 300 bp til 1,3 kb, idet 6 inneholdt mer enn 1 kb og 5 inneholdt et enkelt Sstl-sete som er kjent for å befinne seg innenfor 100 bp fra 5'-enden av pARl. Fire av de sistnevnte fem inn-føyelser ble subklonet (pAR3, pAR5, pAR9, pARl3) for ytterligere restriksjons- og sekvensanalyse. Alle disse kloner hadde identiske restriksjonskart basert på Bsml, EcoRV, PvuII, Sstl og Smal, bortsett fra pAR9 som hadde en avstumping ved 3<1->enden på 100 bp og som senere viste seg å stamme fra et A^-spor som antagelig er tilstrekkelig for priming med oligo(dT).

8. 2. Nucleotidsekvensanalyse av AR cDNA- kloner

Nøyaktige oligonucleotid-primere ble anvendt for sekvensanalyse av begge tråder av 1.230 bp pARl-klonen under anvendelse av dideoxykjedeavslutningsfremgangsmåten (Sanger et al., 1977, Proe. Nati. Acad. Sei. USA 74:5463-5467).

Den komplette nucleotidsekvens og den utledede aminosyresekvens av klon pARl er vist i fig. 16. En åpen leseramme på 965 bp starter ved nucleotid nr. 1. Første AUG ligger i stilling 210, men er ikke tilpasset den optimale anerkjente oppfatning ifølge Kozak for translasjonene startseter (Kozak, 1984, Nucleic Acids Research 12:857-872, Kozak, 1986, Cell 44:283-292) på grunn av fraværet av et purin i 3-stillingen. Slike AUG-tripletter kan imidlertid tjene som startkodon som observert av Kozak i tilnærmet 3% av de undersøkte budskaper, og tilstedeværelsen av et adenosin i 1-stillingen i alle disse "mindre gunstige" AUG-tripletter og i mRNA for AR, har en mulig betydning.

Selv om et annet methionin er lokalisert ved nucleotid 378 som stemmer overens med den alminnelig anerkjente startsekvens, antas den første AUG å være det sanne trans-las jonssete, ettersom den etterfølges av en forutsagt 19-aminosyrestrekning av overveiende hydrofobe rester avbrutt av 3 proliner, noe som er typisk for en signalpeptidsekvens (Heijne, 1983, J. Biochem. 133:17-21).

Den lengste, åpne leseramme som starter med et methionin, koder for et 252 aminosyre polypeptid som omfatter signalpeptidet med 19-resten. Forut for kodingssekvensen ligger 209 nucleotider av en utranslatert sekvens ved 5'-enden, og den etterfølges av et translasjons-avsluttende signal, TAA, og 262 nucleotider av en utranslatert sekvens ved 3'-enden. En potensiell poly(A) tilføyelsessignal-sekvens, AATAA, er lokalisert 64 nucleotider oppstrøms fra en strekning av 15 adenylatrester, noe som antas å være poly(A)-halen. Det utranslaterte AR-område ved 3'-enden inneholder 4 kopier med sekvensen ATTTTA som også er til stede i visse lymfokiner, cytokiner og proto-oncogener. Hos GM-CSF formidler denne sekvens RNA-destabilisering og nedbrytning (Shaw, 1986, Cll 46:659-667). Bevaring av dette tema i funksjonelt tilsvarende molekyler antyder at AR også kan være beslektet med denne klasse lymfokiner.

cDNA-sekvensen bekrefter den utviklede AR-peptid-sekvens (avsnitt 6 ovenfor) bortsett fra aminosyrestilling 113 (fig. 15) som ble sekvensbestemt som asparaginsyre (D) ved proteinanalyse og utledet som asparagin (AAT = N) fra cDNA-klonene. Av 5 undersøkte cDNA hadde alle 5'-endene innenfor de første 25 bp av pARl-sekvensen.

Sammenligning av cDNA-sekvensen med "beste skjønn"-probene viste en samlet homologi på 74% (ARK41) og 77%

(ARK31). Ingen probe hadde mer enn ett motstykke ; med

åtte fortløpende basepar, men i alt 50 av 67 nucleotider plassert som i ARK41, dannet et påviselig signal under be-tingelser med meget lav stringens. Kodonanvendelsen ved AR mRNA-sekvensen avviker betraktelig fra anvendelseshyppig-hetene beskrevet av Lathe (Lathe, 1985, J. Mol. Biol.

183:1-12), noe som forklarer hvorfor de degenererte oligonucleotider i dette tilfelle tilveiebrakte kraftigere signaler. Fra cDNA- og proteinsekvensene forutsies to proteiner med en molekyvlekt på 9772 og 9173 for de to former av utviklet AR basert på cDNA- (fig. 16) og proteinsekvensene (avsnitt 6.7.9. ovenfor). Hydropatiprofilen av AR-forstadiet er avbildet i fig. 11D.

AR-forstadiet har 3 potensielle N-glycosyleringsseter, ett i det N-terminale område (stilling 30 i fig. 16) og to i det hydrofile område av utviklet AR (stilling 113 og 119). Glycosylering bidrar med 10-12 kd til molekylvekten av utviklet AR, og glycosyleringen skjer sannsynligvis ved carbo-hydrattilføyelse på ett eller begge av disse seter i det hydrofile område.

Det N-terminale og serinberikede område av AR-forstadiet (fig. 15) inneholder 3 potensielle tyrosinsulfat-eringsseter ved Y^, , Y^, basert på tilstedeværelsen av syrerester, dreiningsfremkallende aminosyrer, og fraværet av rester som kunne bidra til sterisk hindring (Huttner, 1987, TIBS 12:301-303). De fleste tyrosinsulfaterte proteiner er sekretoriske proteiner. Tyrosinsulfateringsmodifikasjoner antas å være involvert i aktivering, transport eller proteolytisk bearbeidelse av forstadium-proteiner. Det serinberikede område av AR kan også inneholde 0-bundne carbohydrat-kjeder i betraktning av overfloden av serin/threoninrester

(23 av 81) i dette molekylområde, hvori disse rester er

seter for slike bindinger. I dette henseende er 0-glycosyl-erte former av et annet medlem av EGF-familien, TGF-a, identifisert (Ignotz et al., 1986, PNAS, 83, 6307-6311).

Ingen av serinrestene i AR-forstadiet passer til den samstemmende sekvens for cAMP-avhengige kinase-fosforyler-ingsseter (Grima et al., 1985, Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 82:617-621), og heller ingen andre tyrosinrester utviser flankerende sekvenslikhet med kjente fosfotyrosinrester.

Det hydrofile område av det utviklede AR-protein er sammensatt av tallrike positivt ladede aminosyrer (16 av 37 rester er lysin eller arginin), innbefattet to etter-følgende strekninger av 4-5 basiske, ladede rester. Det nucleære målsignal hos SV40 T-antigen svarer til dette område av AR og inneholder en karakteristisk KKKRK-sekvens forut for små aminosyrer (glycin, alanin, prolin), som kan tillate dannelse av den ct-spiralformede struktur (Burglin et al., 1987, EMBO 6:2617-2625, Dingwall et al., 1987, EMBO 6:69-74). Ved mutasjonsanalyse ble fire i rekke-følge basiske rester definert som det dominerende trekk ved SV40 kjernelokaliseringssekvensen (Lanford, 1984, Cell, 37, 801-813). Andre kjerneproteiner med lignende strekninger av basiske aminosyrer som ble antatt å være involvert i kjernemålretting, omfatter nucleoplasmin, polyom virus T, histoner og c-myc. Fusjon av forskjellige kjernesignal-sekvenser til genene for kylling-pyruvatkinase, albumin, immunglobulin, ferritin og 6-galactosidase, fører til lokaliseringen av disse ellers cytoplasmatiske proteiner til kjernen (Moreland, 1987, Mol. Cell. Biol. 7:4048-4057). Det er ikke fastlagt om de hydrofile sekvenser i AR er involvert i målretting av denne vekstmodulator til kjernen, men AR's evne til spesifikt å binde DNA antyder imidlertid at AR har en funksjonell rolle i kjernen. Med hensyn til dette kan AR regulere DNA-syntese, cellesyklusen eller forskjellige andre forhold som skjer i kjernen.

TGF-a-forstadiet inneholder flere cysteiner i det C-terminale cytoplasmatiske område, hvorav noen gjennomgår covalent palmitatbinding (Bringman, 1987, Cell, 48, 429-440). I motsetning til dette mangler AR-forstadiet cysteiner i dets cytoplasmatiske område og forventes derfor ikke å inneholde palmitatrester. Selv om den biologiske funksjon av palmitatbinding er ukjent, utgjør dette en ytterligere forskjell mellom AR og andre medlemmer av EGF-overf amilien .

8. 3. Cellulære kilder for amphiregulinsyntese

Northern blot-analyse (Thomas, 1980, PNAS, 77, 5201) under anvendelse av a 32P-merkede AR cDNA-fragmenter viste hybridisering til en enkelt 1,4 kb RNA-form fra forskjellige normale, humane vev og tumorcellelinjer. Et enkelt bånd kunne ses ved Northern blotting under anvendelse av enten AREBl (et 480 bp BstEII - PvuII-fragment av pARl inneholdende hele kodingsområdet for utviklet AR og en del av det N-terminale forstadium- og transmembranområde) eller AR170 (et 170 bp Bsml - PvuIII-fragment av pARl som kun inneholder den C-terminale halvdel av utviklet AR) som merkede prober. Resultatene anført i tabell IX nedenfor, viser at ekspresjon (+) av AR RNA på lavt nivå kunne iakttas i normalt lunge- og bukspyttkjertelvev fra voksne mennesker. Lavere, men allikevel påviselig ekspresjon (+/-), kunne iakttas i normalt nyre-, lever- og hjernevev.

Fordi AR opprinnelig ble isolert fra TPA-behandlede MCF-7-celler, var bestemmelse av tidsforløpet for TPA-induksjon av AR RNA i disse celler interessant. MCF-7-celler ble behandlet med TPA i 0, 1, 3, 6, 18, 24 og 48 timer, alt RNA ble isolert, og 10 ug ble analysert på hver bane av en 1,2% formaldehyd agarosegel, overført til nylonmembraner og sorteringsanalysert med en komplementær ARBPl-probe til hele kodingsområdet for utviklet AR. En imponerende økning av 1,4 kb AR RNA-formen kunne ses allerede 1 time etter behandling med TPA, og maksimale nivåer ble nådd mellom 18 og 24 timer. Etterfølgende Northern

32

blots, undersøkt med P-ARBP1, viste TPA-stimulering av AR RNA-syntese i andre brystcancercellelinjer selv om maksimale nivåer aldri ble så høye som for de TPA-induserte MCF-7-celler.

Et panel av tumorcellelinjer ble testet for AR RNA-nivåer både før og etter 24 timers induksjon med TPA. Resultatene er vist nedenfor i tabell X. Bortsett fra få unntagelser forelå de eneste kilder til påviselig AR RNA i humane brystcancercellelinjer behandlet med TPA. En slik unntagelse er Caki-1, en human nyre-clearcelle carcinoma-linje som grunnleggende uttrykker høyere nivåer av AR RNA enn de mengder som kan ses i de TPA-induserte MCF-7-celler. Samtlige undersøkte TPA-behandlede brystcancercellelinjer viste AR-spesifikk hybridisering.

AR spiller tilsynelatende en funksjonell rolle i lunge, pancreas, nyrer, lever og hjerne hos voksne mennesker og er mulig involvert i mange forskjellige prosesser, herunder sårheling, vevsregenerering og opprettholdelse av neuronale celler. 9. Eksempel: Genom kloning og analyse av amphiregulingenet

Det følgende eksempel beskriver den genome kloning av det humane amphiregulingen, strukturen av denne samt intron/exoninnretning. Funksjonelle og utviklingsmessige implikasjoner med hensyn til EGF-overfamilien av vekstfaktorer beskrives også.

9. 1. Materialer og fremgangsmåter

9. 1. 1. Southern blot- hybridiseringer

Totalt genomt DNA ble isolert (Maniatis, 1982, In Molecular Cloning: A Laboratory Manual) fra subkonfluente celler i "T150"-vevskulturkolber. 20 ug DNA ble nedbrutt med restriksjonsenzymer som vist, elektroforesebehandlet på 0,8% agarosegel, blottet på "Hybond-N" (Amersham) med 20 x SSC bunnbuffer (Southern, 1975, M. Mol. Bio., 98, 503-517), hvoretter DNA ble bundet ved å eksponeres for 1200 uJoules kortbølget UV. Filtrene ble hybridisert ved 65°C natten over i hybridiseringsbuf f er (6 x SSC, 5 x Denhardfs oppløs-ning, 0,5% SDS og 20 ug/ml klippet, denaturert laksesperma-DNA) inneholdende 2 x 10 6 cpm 3 2P-merket AR-spesifikt fragment pr. ml. Prober ble prime-merket vilkårlig til en spesifikk aktivitet på 5-25 x 10 p cpm/ug. Filtre ble vasket grundig i 1 x SSC, 65°C og ble autoradiografert natten over ved -70°C.

9. 1. 2. Oppbygging av genom- bibliotek

Bakteriofag AL47.1 ble utvalgt som kloningsvektor, og fosfatasebehandlede armer ble fremstilt etter nedbrytning med BamHI, EcoRI og Hindlll. DNA med høy molekylvekt fra MCF-7-celler ble nedbrutt med Hindlll, behandlet med elektroforese på 0,8% lavtemperatur-agarosegel (BioRad) og fraksjonert etter størrelse. Agarosefraksjonen som var maksimalt beriket med det ønskede restriksjonsfragment, ble smeltet ved 6 5°C, DNA ble ekstrahert med fenol og NaOAc, deretter ble DNA ethanolutfelt og resuspendert ved 25-100 ug/ml. Biblioteksoppbygginger ble oppnådd ved ligering natten over ved 14°C av 100 ng AL4 7.1-armer og 40 ng ekstrahert, størrelsesfraksjonert DNA i 5 uliter reaksjonsvolum under anvendelse av "T4"-DNA-ligase (Biolabs). Rekombinant fag ble pakket in vitro med ekstrakter (Gros-vald, 1981, Gene, 13, 227-237) fremstilt med E. coli-stammene BHB2688 N205 recA~ (A. imm<4>34 clts b2 red3 Eam4 Sam7) og BHB2690 N205 recA - (A imm <434>clts b2 red3 Daml5 Sam7). Biblioteker ble titrert på E. coli LE392. Genome kloner ble sorteringsanalysert med AR-spesifikke DNA-prober ved in situ plakkhybridisering (Benton, 1977, Science 196, 180-182), og DNA ble isolert fra plakkrensede, positive kloner (Huynh,

1985, In DNA Cloning Techniques: a Practical Approach,

D. Glover, red. (Oxford: IRL Press), s. 49-78). Hindlll-innføyelser ble utskåret og subklonet i pEMBL 18 for restriksjonsanalyse og formering.

9. 1. 3. Primer- utvidelsesforsøk

RNA ble isolert fra MCF-7-celler som beskrevet ovenfor i avsnitt 8. Syntetiske oligonucleotider som var komplementære med nucleotider 40-60 (ARAP) og 76-97 (ARCP) i AR cDNA-32

sekvensen, ble P-endemerket med T4-polynucleotidkinase til en spesifikk aktivitet på 2-5 x 10 p cpm/ug. 1.000.000 cpm merket oligonucleotid ble anvendt til priming av første tråd cDNA-syntese på 50 ug MCF-7-RNA i det vesentlige som beskrevet ovenfor i avsnitt 8.1.4. Produktet ble behandlet med RNase A, ekstrahert med fenol og kloroform, ethanolutfelt, varmedenaturert i 80% formamid ved 100°C i 5 minutter og analysert ved elektroforese på standard 8% polyacrylamid-7M-urea-sekvenseringsgeler.

9. 1. 4. CAT- undersøkelse

MCF-7-celler ble dyrket som beskrevet ovenfor i avsnitt 6.2.1. For hvert forsøk ble 1-2 x 10^ celler anbrakt i en 100 mm skål i 10 ml medium, og 24 timer senere ble det tilsatt 20 ug calciumfosfatutfelt, supertvunnet plasmid-DNA

til cellene (Southern og Berg, 1982). Cellene ble skyllet med friskt medium i 4 timer etter transfeksjon og utsatt for et 25% glycerolsjokk i 90 sekunder. Celler ble på nytt skyllet og dekket med 20 ml friskt medium inneholdende 0 eller 100 ng/ml TPA. Celler ble vasket og høstet 40 timer etter glycerolsjokk og lysert ved hjelp av sonikering i 100 uliter 0,25 M Tris-HCl (pH 7,8). CAT-aktiviteten ble undersøkt som beskrevet av Gorman et al. (1982). Celleekstrakt (3-50 uliter) ble tilsatt til 2,5 mCi <14>C-kloramfenicol (NEN) i et 150 uliter

reaksjonsvolum 0,5 M Tris (pH 7,8), 0,5 mM acetylCoA. Reak-sjonsblandingene ble inkubert ved 3 7°C i 2 timer, ekstrahert med 1 ml ethylacetat og utviklet på silicagel TLC-plater med CHC1,:1-butanol (95:5). TLC-platene ble tørket og auto-14

radiografert. Acetylert og uacetylert C-kloramfenicol ble mengdebestemt ved telling av utklippede steder i "optifluor". Enheter av CAT-enzymatisk aktivitet ble beregnet som ug kloramfenicol acetylert pr. time/ug protein i celleekstraktet.

9. 1. 5. Kromosomhybridisering in situ

Plasmxd pAR9 ble prime-merket vilkårlig med <3>H-TTP og anvendt til hybridisering til normale, humane metafaseceller fremstilt fra fytohemagglutinin-stimulerte, perifere blod-lymfocytter på 500-800-båndstadiet. Denne probe svarer til AR cDNA som mangler det meste av det utranslaterte 3'-område, og ble innføyd på EcoRI-setet i pEMBLl8.

Hybridisering ble foretatt som beskrevet ovenfor

(Le Beau, 1985, PNAS, 82, 6692-6696) med 2, 4, 20 og 40 ng probe pr. ml hybridiseringsblanding. Autoradiografer ble fremstilt under anvendelse av "Kodak NTB-2" kjernesporemulsjon og diapositiver ved eksponering i 7-60 dager. Kromosombind-ing ble visualisert ved farving med kinicrinsennep.

9. 2. Kromosomlokalisering av AR- genet

Kromosomtildelingen av det humane AR-gen ble bestemt ved in situ hybridisering av <3>H-merket AR cDNA til normale metafasekromosomer. Sølvkorn ble bedømt på 50 metafase-flater idet 30% ikke var vilkårlig fordelt ved båndene 4ql3-4q21. Resultatet ble bekreftet ved polymerase-kjede-reaksjon (PCR) på hamster/humant somatisk cellehybrid DNA som kun inneholdt humant kromosom 4. Oligonucleotid-primere avledet fra AR exon 3 og nabointron, utviklet kun et 220 bp PCR-fragment i humant DNA og i hybrid DNA inneholdende kromosom 4, mens hamster-DNA var negativ.

Kromosomområde 4ql3-4q21 inneholder også genene for gro eller melanoma vekststimulerende aktivitet (A. Anisowicz, et al., 1987, Proe. Nati. Acad. Sei. USA. 84, 7188-7192.

A. Richmond et al., 1988, EMBO J. 7, 2025-2033), c-kit-reseptor (Yarden et al., 1987, EMBO J. 6:3341-3351), blod-platefaktor 4 (PF4) (Griffen et al., 1987, Cytogenetic Cell Genet., 45, 43-73), interferon-Y-induserbar faktor IP-10

(A.D. Luster et al., 1987, Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 84, 1868-1871), vitamin D-bindingsprotein (gruppespesifikk be-standdel) (N.E. Cooke et al., 1986, Human Genetics 73, 225-229), J.L. McCombs et al., 1986, Cytogenet Cell Genet, 42, 62-64), og statherin, et calciumregulerende spyttprotein (L.M. Sabatini et al., 1987, Am. J. Hum. Genet., 41, 1048-1060), Genet for EGF er lokalisert distalt ved 4q25.

Gro, IP-10 og PF4 tilhører en klasse strukturelt beslektede peptider som kan utgjøre en gruppe vekstfaktorer samlet på kromosom 4. c-kit koder for en celleoverflate-reseptor som er strukturelt og funksjonelt beslektet med flere vekstfaktorreseptorer som inneholder tyrosinspesifikk kinaseaktivitet, innbefattet EGF-reseptor, Neu oncogen, PDGF-reseptor og insulinreseptor. Vanligvis er genene for ligander og deres reseptorer beliggende på bestemte kromosomer, men noen befinner seg på vanlige kromosomale steder (Groffin,

1983, Nucl. Acids Res. 11:6331-6339, Pettenati, 1987, Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 84:2970-2974). Liganden for c-kit er ikke identifisert, og AR skal testes for en slik aktivitet.

Spesifikke translokasjoner ses ved mange ondartede tilstander. Den hyppigst observerte cytogene avvikelse ved kongenital akutt lymfoblastisk leukemi (ALL), t(4;ll)(q21;q23), omfatter det område hvor AR er beliggende (S. Heim et al., 1987, Leukemia, 1, 16-23). ALL klassifiseres nå ved morfologi som beskrevet av den fransk-amerikansk-britiske cooperative gruppe (FAB), B- og T-cellemarkører og kromosomal analyse. Disse klassifikasjoner utgjør grunnlaget for diagnose, prognose og behandling av ALL. 1/3 av alle tilfelle av ALL omfatter spesifikke translokasjoner, og t(4;ll) svarer til en dårlig prognosegruppe som hyppig består av spebarn under 16 måneder med en gjennomsnittlig over-levelsestid på mindre enn 1 år (Kocova et al., 1985, Cancer Genetics and Cytogenetics 16, 21-32). Translokasjoner omfattende område 4q21/ er også observert i T-lymfomer (E.G. Levine et al., 1986, Cancer Res., 46, 6481-6488) og et tilfelle av akutt myeloblastisk leukemi (AML) (A. Selypes et al., 1987, Human Genet, 76, 106-108). Dette område inneholder også genene for et dentalt dysgenesesyndrom og "piebald trait", en nedarvet lidelse som fører til flekket hudpigmentering på grunn av mangelfull melanoblastmigrering og differensiering (J.J. Hoo et al., 1986, Human Genet., 73, 230-231).

Bindingsundersøkelser mellom AR og de genetiske lid-elser lokalisert til kromosom 4ql3-4q21, tillater bestemmelse av betydningen av denne co-lokalisering. Nylige cytogeniske analyser antyder at område 4q21 inneholder gener som er involvert i lymfocytisk differensiering. I siste instans kan disse sammenhenger antyde ytterligere biologiske aktiviteter eller anvendelser for dette vekstregulerende molekyl.

9. 3. Genom kloning

Southern blot-analyse (se avsnitt 9.1. ovenfor) av MCF-7-DNA nedbrutt med Hindlll, EcoRI eller BamHI, viste enkeltbånd ved hhv. 12 kb, 8 kb og 20 kb, ved hybridisering med en 830 bp probe ( 32P-merket PvuII/Bsml nedbrutt pARl) inneholdende 5'-delen av AR-genet, noe som antyder at AR er et enkeltkopi-gen. En 170 bp probe (AR 170, Bsml-PvuII) fra 3'-enden av utviklet AR, innbefattet kodingsområdet for de transmembrane og cytoplasmatiske områder, ble hybridisert til samme Hindlll-, EcoRI- og BamHI-fragmenter, og også til et ytterligere 7,5 kb HindIII-fragment som innebærer at største-delen av AR-kodingsområdet er delt mellom to HindIII-fragmenter på 12 og 6,5 kb. Identiske bånd kunne ses ved Southern blot-analyse av nedbrutte fraksjoner fra human placenta, hjerne, melanoma (SK-MEL 28), brystcancer (HTB36), epidermoid carcinoma (A431) og lungecancer DNA, noe som antyder at AR-genet ikke har vært utsatt for større omleir-inger eller utvidelser.

Kloning av de to HindIII-fragmenter fra MCF-7-DNA foretrekkes, fordi de sannsynligvis inneholder det meste av, om ikke hele, AR-genet og dets nabosekvenser. Hindlll-nedbrutt MCF-7-DNA ble fraksjonert etter størrelse, og passende fraksjoner ble inkorporert ved ligering i AL47.1. Av tallrike positive kloner ble det utvalgt to, AARH12 og AARH6, for nærmere karakterisering. 12 og 6,4 kb-innføv-elsene ble subklonet i pEMBL18 og kartlagt med hensyn til flere restriksjonsseter. Ved å anvende nøyaktige oligonucleo-tidprimere og direkte sekvensdeling av forskjellige mindre subkloner, ble sekvensen bestemt av alle exoner og deres intronbindeledd, noe som ikke avslørte uoverensstemmelse med cDNA-sekvensen.

9. 4. Karakterisering av det AR- regulatoriske område ved 5'- enden

Genom kloning av AR førte til isolering av 6,5 kg av 5<1->nabosekvensen i 12 kb HindIII-fragmentet. 688 kb-fragmentet fra det første EcoRI-sete som befinner seg i 5'-delen i forhold til exon 1, til Smal-setet i exon 1 (stilling 40 i cDNA), ble subklonet og sekvensanalysert på begge tråder. Disse data er vist i fig. 17.

Primerutvidelse ble utført på MCF-7 RNA med 2 adskilte oligonucleotider fra exon 1. Et transkripsjonelt hovedstartsete, bekreftet av begge oligonucleotider, ble lokalisert i 5<1->delen 1 bp fra den lengste cDNA-klon. To mindre betyde-lige seter kunne observeres i stilling +1 og +2 i cDNA-sekvensen, noe som bekreftet at mange cDNA-kloner nesten hadde full lengde. Til funksjonell bekreftelse av det regulerende område av AR-genet ble det oppbygd et kimært gen (pXARElCAT) inneholdende 688 bp EcoRI- til Smal AR i 5'-naboområdet (sekvens 648 til +40, hvor +1 er det transkripsjonene hovedstartsete) som styrer ekspresjon av et promotor-løst kloramfenicol-acetyltransferase (CAT)-gen. Denne oppbygging kunne stimulere transkripsjon av CAT-genet ved forbigående innføring i MCF-7-celler, og aktiviteten ble stimulert 6-7 ganger ved tilsetning av TPA. Dette bekrefter både strukturelt og funksjonelt at 5<1->enden av AR-genet var klonet. Deretter ble det oppbygget en rekke 5'-CAT-utslett-elsesmutanter inneholdende AR-sekvenser -539 til +40 (Ela), -387 til -40 (Elb), -277 til +40 (Ele), -148 til +40 (Eld), -77 til +40 (Ele), -79 til +40 (Elg) eller +19 til +40 bp (Elh) i samme vektor. Basal aktivitet gikk tapt ved utslett-else etter del -77, dvs. Elh viste ingen målbar aktivitet, og alle disse oppbygginger utviste 3,5-7 ganger øket ekspresjon som reaksjon på behandling i 40 timer med 100 ng/ml TPA. Disse oppbygginger kan også anvendes ved kortvarige forsøk til fastsettelse av virkningene av eventuelle morfogener, mitogener, vekstfaktorer, legemidler eller rå fermenterings-ekstrakter på regulering av AR-ekspresjon, noe som gjør det mulig å identifisere hittil ukjente terapeutiske midler.

Cellekjerneforsøk viste 3-5 ganger øket transkripsjon av AR som reaksjon på TPA, noe som antyder at øket promotor-aktivitet minst er delvis ansvarlig for TPA-induksjonen av AR. Northern analyse av MCF-7-celler behandlet med TPA i nærvær eller fravær av actinomycin D, identifiserer AR som et relativt stabilt RNA med en halveringstid på mer enn 4 timer. Induksjonen av AR-ekspresjon som reaksjon på TPA har derfor mange sider og omfatter økt transkripsjon av et temmelig stabilt mRNA.

9. 5. Intron-/ exonorganisering i AR- genet, AR- proteinområder, utviklingsmessige og funksjonelle betydninger

Den komplette humane amphiregulin-genomsekvens er avbildet i fig. 17, og forholdet mellom exoner og proteinområdene i AR-molekylet er angitt skjematisk i fig. 18.

Primerutvidelsesanalyse av AR mRNA og undersøkelser med en kimær AR/CAT-promotor-oppbygging (CAT = kloramfenicol-acetyl-transferase, et markørgen) lokaliserer en funksjonell promotor i 5<1->enden innenfor 64 bp fra den lengste cDNA-klon. Videre finnes det en samstemmende TATA-boks 2 9 bp oppstrøms fra 5'-enden av cDNA-sekvensen. Forut for 3<1->enden av genet er det oppfattelsen at det finnes en polyadenyler-ingssignalsekvens, 64 nucleotider fra poly(A)-halen i cDNA. Det primære transkript av AR-genet er tilnærmet 10,2 kb.

6 exoner koder for det humane AR-forstadium og omfatter 10,2 kb genomt DNA. AR-exonene har en lengde fra 112 til 270 bp og avbrytes av introner på mellom 1,25 og 2,1 kb. De fem introner i AR avbryter kodingssekvensen på en slik måte at mange proteinområder er produkter av et enkelt exon.

Exon 1 koder for de utranslaterte 5'- og signalpeptidområder, exon 2 koder for det N-terminale forstadium, exon 5 inneholder det cytoplasmatiske område, og exon 6 representerer det utranslaterte 3'-område. Exon 3 og 4 koder sammen for det utviklede AR-protein, innbefattet både de hydrofile og de EGF-lignende sekvenser, samt det antatte transmembranområde. Sammenknytningen av exon 3 og 4 skjer mellom den andre og tredje løkke i det EGF-lignende område.

Når exonsammenkytningene legges over en rekke av aminosyresekvenser for AR, EGF og TGF-a, er det åpenbart at alle disse proteiner kodes av to exoner og at det avbrytende intron er lokalisert i samme stilling. Videre koder 3'-exonet hos hver av disse sekvenser også transmembranområdet i de tilsvarende forstadium-proteiner. I motsetning til dette er det EGF-lignende området inneholdt på et enkelt exon i alle andre mammale EGF-homologer for hvilke exonstrukturen er bestemt, innbefattet de ni EGF-lignende gjentagelser i EGF-forstadiet (Gray, 1983, Nature, 303, 722-725), de tre i LDL-reseptor (Yamamoto, 1984, Cel, 39, 27-38), og den ene i rotte-fibro-nectin (Patel, 1987, Embo J., 6, 2565-2572) og human koagula-sjonsfaktor XII (Cool, 1987, J. Biol. Chem., 262, 13662-13 673). Homologer fra hvirvelløse dyr, som Drosophilia Notch-genet

og lin-12 fra C. elegans, inneholder også flere EGF-lignende gjentagelser (Kidd, 1986, Molec. Cell. Biol., 6, 3094-3108, Greenwald, 1985, Cell, 43, 583-590). Til forskjell fra de mammale gener er de fleste EGF-lignende gjentagelser i Notch inneholdt i et enkelt kodingsområde hvor kun 4 av 36 temaer er splittet av avbrytende sekvenser. Det skal bemerkes at 2 av disse 4 er mer på linje med AR enn med Notch-gjentag-elses-samstemmighet, og én avbrytes av et intron på samme CXC-sekvens som EGF, TGF-a og AR. Nematode lin-12-genet inneholder minst 11 EGF-lignende enheter, hvorav 9 er inneholdt på det første exon og de resterende 2 befinner seg på adskilte exoner hvor den intakte EGF-lignende enhet er

flankert av introner.

Forskjeller i strukturen hos de exoner som koder for de EGF-lignende gjentagelser fra forskjellige organismer, antyder at de kan være av forskjellig opprinnelse. En gruppe inneholder det EGF-lignende tema bundet av introner, og den andre gruppe, hvor AR er medlem, har et avbrutt tema. Sekvenslikheten mellom de to grupper kan være resultatet av konvergent evolusjon eller introninnføyelse etter deres divergens fra et felles stamgen.

Intronbeliggenheten i den samme CXC-sekvens i EGF, TGF-a, AR og én av Notch-gjentagelsene antyder en felles opprinnelse, men nærmere undersøkelse avslører forskjellig intronfaseforekomst. Intronfaseforekomst henviser til om hvorvidt intronet avbryter leserammen etter første (I), andre (II) eller tredje (0) nucleotid i et kodon. Faseforekomst antas å ha evolusjonsmessig betydning fordi det blant forskjellige proteiner kan tillate blanding av exoner med funksjonelle områder. EGF og TGF-a har en fase II-intron i den EGF-lignende enhet, mens AR og Notch har fase I-introner. Et lignende skift på et nucleotid ses i det nest siste intron i proteaseområdet av komplement faktor B og elastase (Cambell, 1983, PNAS, 80, 4464, Swift, 1984, J. Biol. Chem. 259, 14271). De ikke-vilkårlige posisjoner for disse introner kan angi at en spesifikk introninnføyelsessekvens finnes i disse gener. Alternativt kan det ha vært selektivt trykk for å dele kodingsområdet på dette sete. Sammenligning av sekvenser ved exon-intron-sammenknytningsstedet i den EGF-lignende enhet for humant EGF, TGF-a, AR og den første Notch-gjentagelse, avslører ingen direkte gjentagelser som det ofte ses med flyttbare bestanddeler. Alle fire inneholder imidlertid sekvensen "gtaagt" ved grensen til sammenknytningen. Denne sekvens kan spille en viss rolle ved oppståelsen eller ved spleising av dette intron.

De virale EGF-homologer inneholder ingen introner, imidlertid viser en sammenligning mellom VGF, EGF, TGF-a og AR en homologi som strekker seg over transmembranområdet, mens derimot vekstfaktorene fra myxoma- og shopevirus slutter før dette hydrofobe område. Nylige undersøkelser tilveiebringer bevis for at TGF-a-forstadiet syntetiseres som et trans-membranprotein, og differensiell proteolytisk spaltning fører til utskillelse av større former som kan være celletypespesi-fikke (Teixido, 1987, Nature, 326, 883-885).

Andre EGF-homologer som inneholder transmembranområder, omfatter størkningsfaktorene, LDL, og de homøotiske gener Notch og lin-12, selv om ingen støter opp til en EGF-lignende gjentagelse. Tilstedeværelsen av EGF-temaet i flere membran-bundne forstadier antyder at de i noen tilfeller kan bearbeides som en utsondret vekstfaktor, eller kan forbli forbundet med membranen og kan spille en rolle ved intercellulær og/eller intracellulær kommunikasjon.

Noen AR-homologer omfatter homøotiske gener fra hvirvelløse dyr. Homøotiske genprodukter er involvert i regulering av celleutvikling. Notch-genproduktet medierer f.eks. det korrekte forløp fra en ectodermal celle til en neuroblast eller en dermoblast. I Notch-mutanter blir alle disse celler neuronale, og avkommet, kun hjerne, ingen hud, dør. Et homøotisk gen kan virke på en autokrin måte for å opprette eller bit holde et bestemt stadium i celler som uttrykker genproduktet, og kan være involvert i regulering av slike tilstander i til-støtende celler via celle-celle-interaksjoner. Det bør undersøkes om AR også virker som regulator på utviklings-stadiet av visse celletyper.

9. 6. Bearbeidelse av utviklet amphiregulin

Karakterisering av AR cDNA avslørte at 78- og 84-aminosyreformene av AR er syntetisert som den midterste del av et 252-aminosyre-transmembran-forstadium (se avsnitt 8.2. ovenfor). Setene for den proteolytiske spaltning av AR-forstadiet som ville føre til frigivelse av utviklet AR, passer ikke til spaltningssetene for noen kjent protease. På den N-terminale ende er setene Asp-Asp/Ser-Val og Glu-Gln/Val-Val, mens det C-terminale sete er Glu-Lys/Ser-Met. De to former av AR synes å være et resultat av vekslende proteolytisk bearbeiding ut fra et felles forstadium, da all cDNA og alle genome kloner utviser samme sekvens i dette område. Det er interessant at et intron ligger mellom de to N-terminale spaltningsseter, og det er mulig at "intronfor-skyvning" også kan være årsak til disse forskjeller.

MCF-7-celler danner 80% av deres AR i den større

84 aminosyreform, mens choriocarcinoma-cellelinjen HTB-36 danner 80% av sitt AR i den mindre 78 aminosyreform. For å bestemme om denne forskjell er forbundet med endringer på DNA-nivået anvendes polymerase-kjedereaksjonsteknikken (Scharf, 1986, Science, 233, 1076-1078) til isolering av AR exon 3 fra MCF-7-celler og HTB-36-celler, en linje som grunnleggende produserer høye nivåer av AR mRNA. Et AR intron-spesifikt "sense" oligonucleotid og et "antisense" oligonucleotid fra kodingsområdet for exon 3 ble anvendt til spesifikk utvidelse av det mellomliggende 220 bp fragment i AR-genet fra begge DNA-kilder. Direkte sekvensanalyse viste ingen uoverens-stemmelser hverken i intron-exon-sammenknytningen, eller i exon-3-kodingssekvensen mellom disse to humane DNA-kilder, noe som ytterligere antyder at de to former av AR er resultatet av vekslende proteolytisk spaltning av forstadiet. 9. 7. Strukturell sammenligning av AR- og EGF- lignende vekstfaktorer

AR viser tydelig sekvenshomologi med andre EGF-lignende proteiner, med opprettholdelse av 6 cysteiner involvert i 3 disulfidbindinger som definerer den sekundære struktur av de utviklede vekstfaktorer. Tidligere (ved hjelp av datamaskin) sammenligninger av aminosyresekvenser har ført til kategoriseringen av EGF-lignende temaer i to adskilte grupper: vekstfaktorer og blodkoaguleringsfaktorer (se fig. 13). To sekvensmønstre for sammenligning av AR

med andre kjente DNA- eller proteinsekvenser er utvalgt. Ut-velgelsen ble basert på den åpenbare evne hos disse sekvenser til å skjelne mellom de to grupper proteiner og fordi meget få hull var nødvendige for optimale oppstillinger. De nøy-aktige sekvenser er vist i tabell 1. Det første område tilsvarer de første 11 aminosyrer i den andre løkke i EGF, og

det andre område tilsvarer den tredje cysteinløkke i EGF.

Fire representanter for hver gruppe vekstfaktorer og blod-koagulerende faktorer ble utvalgt for å frembringe samstemmende sekvenser basert på deres veletablerte funksjonelle og strukturelle homologi. Humane sekvenser ble utvalgt når som helst det var mulig, fordi det i siste instans var ønskelig å sammenligne disse sekvenser med humant AR. Vekstfaktorene omfatter humant EGF, TGF-a, VGF og Shope-vekstfaktor, og koa-guleringsfaktorene omfatter human faktor IX, X, XII og protein C. AR ble også vurdert overfor databasen for begge disse homologe blokker. Den samstemmende sekvens ble vektlagt på grunnlag av hyppigheten en rest viser seg i en gitt stilling med.

Struktur-funksjonsanalyse av forskjellige TGF-a, VGF-og EGF-derivater har nylig ført til identifiseringen av forskjellige rester som er nødvendige for den biologiske aktivitet av disse vekstfaktorer. Rekombinante proteiner, syntetiske peptider, setespesifikke, kjemiske derivater og proteolytisk nedbrytning, har vært nyttige ved utviklingen av endrede molekyler. Noen generaliseringer omfatter (stillinger er relatert til oppstillingen i fig. 15): de 6 cysteiner (stilling 1, 19, 15, 26, 28 og 37) og deres disulfidløkke (1-15, 9-26, 28-37) er nødvendige for biologisk aktivitet, N-terminale utvidelser har liten innvirkning på aktiviteten,

en aromatisk rest (F, Y) er nødvendig i stilling 8, en ikke-

32 41 42 konservativ endring av Y , D eller L fører til tap av aktivitet og/eller dramatisk tap av reseptorbinding eller autofosforylering.

AR oppfyller alle kriterier bortsett fra de to siste som definerer rester som er nødvendige for EGF-reseptorbinding og/eller mitogen aktivitet. Utviklet AR avstumper like før D 41 og mangler fullstendig dette og det "avgjørende" leucin 42, men det konkurrerer stadig om EGF-reseptorbinding og erstatter EGF i noen mitogenforsøk. Disse forskjeller kan imidlertid være ansvarlige for den ikke-mettbare reseptor-bindingskinetikk og de markerte funksjonelle forskjeller fra EGF i visse forsøk, som TGF-6-synergisme, den differensielle virkning på utvalgte A431-subkloner, kryssbinding, fosforyler-ingsforsøk og dets evne til å binde DNA. Den ekstremt hydrofile strekning på den N-terminale del av utviklet AR kan også overbringe noen av disse forskjeller ved reseptorbinding eller biologisk aktivitet.

9. 8. AR- underkategori av EGF- overfamilie

En matriks av evolusjonsmessige avstander basert på oppstillingen i fig. 13 og datamaskinanalyse basert på

tabell I, ble beregnet. Denne matriks ble anvendt for å utlede et dendrogram for EGF-overfamilien. Undersøkelsen krever tilstedeværelsen av cysteinene og legger til et poeng for hver rest som passer til den vektlagte antatte sekvens.

Dette evolusjonsmessige tre forutsier at AR faller innenfor rammene av en ny underkategori av EGF-lignende vekstfaktorer, basert på både den strukturelle og funksjonelle homologi. En slik modell forutsier at andre medlemmer av denne vekstfaktor-familie kan forekomme, og at de kan identifiseres ved homologi med ovennevnte sekvensmønstre basert på tre kriterier: et kombinert poengtall med de to vekstfaktorområder på mer enn 20, et kombinert koaguleringsfaktorområde-poengtall på mindre enn 20 og et kombinert AR-områdepoengtall på mer enn 20. Alle hittil ukjente molekyler som oppfyller disse kriterier, vil også kunne forventes å ha noen funksjonell homologi med EGF, TGF-a, VGF eller AR. Molekyler med et kombinert AR-områdepoengtall på mer enn 40 vil kunne klassifiseres som et medlem av AR-familien innenfor EGF-overfamilien, og er omfattet av den foreliggende oppfinnelse.

10. Eksempel: Bakteriell ekspresjon av amphiregulin

10. 1. Materialer og fremgangsmåter

10. 1. 1. Plasmidoppbygginger

Plasmid pARDl

Plasmid pARDl inneholder 1,4 kb EcoROI cDNA-fragmentet (pARl) i pEMBL18 med en T- til C-endring i nucleotid-stilling 532 i cDNA tilsvarende valin-valin-sekvensen i den amino-terminale del av utviklet AR. Denne baseendring ble utført ved setestyrt mutagenese og ble bekreftet ved sekvensanalyse. Oppbyggingen tillater adgang til sammenknytningen mellom det amino-terminale AR-forstadieområde og det hydrofile område ved frembringelse av et Ddel-sete (CTAAG).

Plasmid pARSTOP

Plasmid pARSTOP er en mellomproduktoppbygging anvendt ved fremstilling av en AR-sekresjonsvektor. pARDl ble nedbrutt med Sspl og Xbal, og 515 bp-fragmentet som kodet for de carboxy-terminale 9 aminosyrer i utviklet AR, transmembran-områdene og de cytoplasmatiske områder og det utranslaterte 3'-område, ble isolert. 4,7 kb (Sspl-Xbal)-fragmentet inneholdende den resterende amino-terminale del av AR cDNA, ble gelrenset og ligert med kinasebehandlede, normaliserte, komplementære oligonucleotider ARST0P1 og ARST0P2 (avbildet nedenfor). Disse oligonucleotider har en stump 5'-ende som er forenlig med et Sspl-sete, etterfulgt av en sekvens som koder for de carboxy-terminale 9 aminosyrer i den utviklede AR-sekvens, et TAA-stoppkodon og EcoRV- og Xbal-seter.

YFGERCGEK<*> EcoRV/Xbal

ARST0P1 5' ATTTCGGTGAACGGTGTGGGGAAAAGTAAGATATCT

ARST0P2 3' TAAAGCCACTTGCCACACCCCTTTTCATTCTATAGAGTC

Plasmid pbAR

Plasmid pbAR inneholder en promotorløs TGF-6-leder knyttet til den utviklede 78 aminosyreform av AR. Den er oppbygd ved ligering av oligonucleotidene bLARN3 og bLARN4 med 240 bp Ddel- til Xbal-fragmentet fra pARSTOP i EcoRI/Xbal-nedbrutt pEMBL18. bLARN3 og bLARN4 er komplementære ved at de skaper et 5' EcoRI og et 3' Ddel-fremspring og et enkelt internt Nael-sete som er forenlig med setet nær den carboxy-terminale ende av TGF-8-ledersekvensen. Ligeringen vil øde-legge Ddel-setet og regenerere den korrekte aminosyresekvens valin-valin på den aminoterminale del av utviklet AR.

Sstll

AGVVKPPQNKTE SE

PHILI 5' GGGAGTAGTTAAGCCGCCCCAAAACAAGACGGAAAGTGA

PHIL2 3' CGCCCTCATCAATTCGGCGGGGTTTTGTTCTGCCTTTCACT

NTSDKPKRKKKGG

PHILI 5' AAATACTTCAGATAAACCCAAAAGAAAGAAAAAGGGAGG

PHIL2 3' TTTATGAAGTCTATTTGGGTTTTCTTTCTTTTTCCCTCC

EcoRI

KNGKNRRNRKKKN

PHI LI 5' CAAAAATGGAAAAAATCGAAGAAACAGAAAGAAGAAG

PHIL2 3' GTTTTTACCTTTTTTAGCTTCTTTGTCTTTCTTCTTCTTAA

Plasmid pDCHBARl

Plasmid pDCHBARl er en mammal ekspresjonsvektor

(fig. 19) utviklet til utskillelse av den fremstilte, utviklede 78 aminosyreform av AR. Den inneholder TGF-8-leder-/ utviklet AR-sekvensen fra pbAR styrt av CMV/HIV-promotoren, flankert av et SV40 polyadenyleringssignal. Vektoren inneholder også SV2dhfr med samme transkripsjonene orientering. PSVDR/bOM ble nedbrutt med Nael og Xbal, og 6 kb-vektoren ble renset bort fra den utklippede OncoM-kodingssekvens. pbAR ble også nedbrutt med Nael og Xbal, og 260 bp-fragmentet som koder for de carboxy-terminale 5 aminosyrer i TGF-8-signal-sekvensen og den utviklede 78 aminosyre AR-sekvens etterfulgt av et sluttkodon og EcoRV- og Xbal-seter, ble isolert. Sammenknytninger ble verifisert ved sekvensanalyse.

Plasmid pDCHBPHILE

Plasmid pDCHBPHILE er en mammal ekspresjonsvektor utviklet til utskillelse av et kimært AR/EGF-protein. Plas-midet er også utformet for å lette fremtidige sammensmelt-ningsoppbygginger mellom det AR-hydrofile område og andre vekstfaktorer. Denne oppbygging er dannet ved ligering av det 6,5 kb Sstll/Xbal-nedbrutte pDCHBARl-vektorfragment, 175 bp EcoRI/Xbal-fragmentet inneholdende det syntetiske, humane EGF-gen og oligonucleotidene PHILl og PHIL2. Disse oligonucleotider er komplementære med 5'-SsTII og 3' EcoRI-utvidelser og koder for den siste rest av TGF-6-signalsekvensen og hele det AR-hydrofile område. pDCHBARl tilveiebringer CMV/HIV-promotoren, alle aminosyrer i TGF-6-signalsekvensen, bortsett fra den siste, og SV40-polyadenyleringssekvensen. EGF-fragmentet ble erholdt fra dr. Timothy M. Rose (Oncogen)

og omfatter hensiktsmessige seter for fremtidig manipulering.

10. 1. 2. Fremstilling av pTAC- vektor

Plasmid TacPak/EGF ble erholdt fra dr. Timothy M. Rose (Oncogen) og består av følgende enheter: trp-lac-hybridpromotor og cro gen Shine-Delgarno-sekvens isolert som et Bglll/BamHI-fragment fra ekspresjonsvektor pl35-l som var avledet fra pDR540 (Pharmacia); alkalisk fosfatasesignalsekvens avledet fra de syntetiske oligonucleotider TacPakl og TacPak2

(dr. Rose, Oncogen); syntetisk EGF-sekvens overført fra plasmid pBM22/PAK/EGF; transkripsjonelt termineringsområde; pBR322-skjelett hvor det neomycinresistente gen helt er avledet fra plasmid pl35-l. TacPak/EGF ble nedbrutt med BamHI, 2-base-utfylt med dATP og dGTP for å skape et forenlig sete med det 2-base-utfylte Sali, og ble deretter nedbrutt med Pvul. Ved denne nedbrytning ble det syntetiske EGF-gen og største-delen av den alkaliske fosfatasesignalsekvens fjernet, men Tac-promotoren, Shine-Delgarno-sekvensene og initierende ATG forblir intakte. 2,8 kb-fragmentet ble gelrenset.

10. 1. 3. Fremstilling av modifisert amphiregulin cDNA- fragment

Plasmid pARSTOP ble nedbrutt med Sali, 2-base-utfylt med TTP og dCTP for å frembringe et sete forenlig med en BamHI 2-base-utfylt (dATP, dGTP) utvidelse, og ble deretter nedbrutt med Ddel og Bgll. Sistnevnte nedbrytning var nødven-dig for å fjerne co-vandrende DNA fra det ønskede 242 bp fragment som koder for den korte form av utviklet AR begynnende med VKPP og som slutter med CGEK etterfulgt av et syntetisk

innført stoppkodon. 243 bp-fragmentet ble gelrenset.

10. 1. 4. Fremstilling av de syntetiske oligonucleotider ALKPAR1 og ALKPAR2

De komplementære syntetiske oligonucleotider ALKPAR1 og ALKPAR2 ble utviklet med et 5' Pvul fremspring som var forenlig med TacPak/EGF Pvul/BamHI delvis utfylt fragment og en 3' Ddel-utvidelse som var forenlig med et delvis utfylt pARSTOP Ddel/Sall. Oligonucleotidene ble syntetisert på et "Applied Biosystems Oligonucleotide Synthesizer"-apparat og renset fra en acrylamidgel. Fosfater ble tilsatt oligonucleotidene med T4 kinase, og ekvimolare mengder normaliserte ved langsom av-kjøling etter varmedenaturering.

Pvul Ddel

IALALLPLLFTPVTKAVV

ALKPAR1 5' CGCCCTCGCACTTCTCCCACTGCTGTTCACTCCAGTGACAAAAGCTGTAG 3' ALKPAR2 3' TAGCGGGAGCGTGAAGAGGGTGACGACAAGTGAGGTCACTGTTTTCGACATCAAT 5'

10. 1. 5. Ligering og isolering av pTacAPARl

Det delvis utfylte 243 bp Ddel-til-Sall AR-fragment, det delvis utfylte 2,8 kb PvuI/BamHI TacPak/EGF-vektorfragment og kinasebehandlede, normaliserte oligonucleotider ALKPARl og ALKPAR2, ble ligert under anvendelse av DNA-ligase, transformert i kompetente E. coli JM109-celler og utvalgt på LB/neomycinplater. Den korrekte oppbygging ble bekreftet ved restriksjonsnedbrytninger og DNA-sekvensoppdeling. Sekvensen av pTacAPAR er avbildet i fig. 20.

10. 1. 6. Fremstilling av kimært, hydrofilt AR- område/ EGF-genfragment

Plasmid pDCHBPHILE ble nedbrutt med Sstll og Xbal til frembringelse av 286 bp-fragmentet som koder for de siste to rester av TGF-8-signalsekvensen (AG), 37 rester fra det hydrofile område av AR (WKP...RKKK) og den syntetiske sekvens med 53 rester av utviklet human EGF-sekvens (NSDS...WELR). 286 bp-fragmentet ble gelrenset.

10. 1. 7. Fremstilling av de syntetiske oligonucleotider APAREGF1 og APAREGF2

De komplementære syntetiske oligonucleotider APAREGF1 og APAREGF2 ble fremstilt med et 5' Pvul-fremspring som var forenlig med pTacAPARl Pvul/Xbal-fragment og en 3' Sstll-utvidelse som var forenlig med pDCHBPHILE SstII/XbaI-fragmentet. Oligonucleotider ble syntetisert på et "Applied Biosystems Oligonucleotide Synthesizer"-apparat og renset fra en acrylamidgel. Fosfater ble tilsatt til oligonucleotidene med T4 kinase, og ekvimolare mengder ble normalisert ved langsom

avkjøling etter varmedenaturering.

Pvul Sstll

IALALLPLLFTPVTK

APAREGF1 5' CGCCCTCGCACTTCTCCCACTGCTGTTCACTCCAGTGACACC 3'

APAREGF2 3' TAGCGGGAGCGTGAAGAGGGTGACGACAAGTGAGGTCACTGTGGCG 5'

10. 1. 8. Ligering og isolering av pTACAPHILE

286 bp Sstll/Xbal-fragmentet som koder for det hydrofile område av AR bundet til den utviklede EGF-sekvens,

2,8 kb Pvul/Xbal pTacAPARl-vektorfragmentet og kinasebehandlede, normaliserte oligonucleotider APAREGF1 og APAREGF2, ble ligert ved anvendelse av DNA-ligase, transformert i kompetent E. coli JM109 og utvalgt på LB/neomycinplater. Den korrekte oppbygging ble bekreftet ved restriksjonsnedbrytning og DNA-sekvensoppdeling. Nucleotidsekvensen av pTacAPHILE er vist i fig. 21. Det forventede translasjonsprodukt skulle spaltes mellom dipeptidet Ala-Gly umiddelbart etter den alkaliske fosfatasesignalsekvens, hvorved en ytterligere rest (glycin) ble tilføyd til det AR-hydrofile område. Nucleotidrester som avviker fra den normale, humane sekvens, er angitt med frem-hevet type (fig. 20).

10. 1. 9. Rensing av rekombinant amphiregulin

Plasmidene pTacAPARl og pTacAPHILE ble transformert i kompetent E. coli JM109 og dyrket til sammenflytning i 10 ml

LB ved 37QC til en A6Q0 på 0,7. Kulturene ble deretter tilsatt 100 uM IPTG og fikk lov til å gro i 24-72 timer. Kulturene ble sentrifugert to ganger ved 5000 omdr./minutt, 15 minutter hver, pelleten ble satt til side, og rensingen fortsatte med supernatanten. Prøver ble konsentrert 10 ganger på et "Amicon"-ultrafiltreringsapparat med "YM5"-membraner (avskjær-ing ved molekylvekt 5000). Konsentratet ble fortynnet med 5 volumer "MilliQ"-vann og rekonstituert til 1/10 av det opp-rinnelige kulturvolum. Iseddik ble tilsatt til 1 M, og prøvene ble anbrakt ved 4°C i 2-24 timer. Prøvene ble sentrifugert ved 19000 omdr./minutt, 20 minutter, 4°C i "Oakridge"-rør i en "SS34"-rotor, pelleten ble ekstrahert med 20 ml 1 M eddiksyre, og supernatantene ble kombinert. De klare supernatanter ble deretter dialysert mot 0,1 M eddiksyre i 2 dager, lyofilisert og oppbevart ved -20°C.

Cellepellets og rå, tørkede supernatanter ble undersøkt ved immunblotting og vekstinhibitoriske forsøk (GIA) for AR-protein. Cellepelleten fra 50 uliter sammenflytende kultur eller 100-200 uliter tørket supernatant ble testet på en 16% "Tricin"-polyacrylamidgel, farvet med "Fast Green" og over-ført til nitrocellulose. Western blots ble utført som beskrevet ovenfor i avsnitt 7.1.6.

10. 2. Resultater og diskusjon

Cellepelleter fra transformanter som bærer pTacAPARl, viste rikelige mengder immunreaktivt protein som migrerer ved 10 kD, samt noen nedbrytningsprodukter og mulige dimerer. Supernatantene hadde tilnærmet 100-200 ng/ml utsondret, immunreaktivt AR. GIA på supernatantene viste aktivitet ved tilnærmet 150 ng/ml AR på A431-A3-indikatorcellelinjen i sammenligning med rensede, native AR-standarder. Store mengder immunreaktivt protein ble produsert i dette system, hvorav det meste forble aggregert i cellen. Forsøk med periplasmatiske preparater og supernatanter viste utskillelse av aktivt protein etter vekst i 2-3 dager.

pTacAPHILE tilveiebringer en hensiktsmessig måte for

å knytte det hydrofile område av AR til den N-terminale del av

et vilkårlig klonet gen. Dette område kan bibringe endrede bindingskarakteristika til ligandenes normale reseptor, virke som en kjernelokaliseringssekvens, bindes til DNA eller til-

late transport gjennom lipidmembraner eller andre membraner som vanligvis er ugjennomtrengelige for den tilknyttede faktor.

11. Deponering av mikroorganismer

Følgende mikroorganismer er deponert ved Agricultural Research Culture Collection, Northern Regional Research

Center (NRRL), og er tildelt følgende aksesjonsnummere:

Claims (12)

1. Fremgangsmåte for fremstilling av terapeutisk aktivt amphiregulin med følgende aminosyresekvens 1 10 20 RjVKPPQNKTE SENTSDKPKR KKKGGKNGK 30 40 50 NR R NRKKKNPC NAEFQNFCIH GECKYI 60 70 78 EHLE AVTCKCQQEY FGERCGEK hvori Rx er V eller sekvensen SVRVEQV, eller et strukturelt nærliggende fragment derav med tilsvarende biologisk aktivitet, karakterisert ved at (a) en Escherlchia coli-vertcelle inneholdende en rekombinant vektor omfattende en nucleotidsekvens som koder for nevnte protein, dyrkes under kontroll av en annen nucleotidsekvens som regulerer genekspresjonen på en slik måte at et peptid eller protein med amphiregulinaktivitet frembringes av Escherlchia coli-cellen, eller (b) MCF-7-celler dyrkes i nærvær av 12-0-tetra-decanoyl-phorbol-13-acetat (TPA), og (c) amphiregulinet utvinnes fra kulturen i trinn (a) eller (b).

2. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at nucleotidsekvensen som koder for amphiregulin, omfatter en nucleotidsekvens som den avbildet i fig. 16 fra nucleotid nr. 1 til 1243.

3. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at den andre nucleotidsekvens som kontrollerer genekspresjon, omfatter en Tac-promotor.

4. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved(a) dyrkning av en Escherlchia coli stamme JM109 transformert med plasmid pTacAPARl som er deponert ved NRRL og tildelt aksesjonsnr. B-18441, og (b) utvinning av amphiregulin fra kulturen.

5. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved(a) dyrkning av en Escherlchia coli stamme JM109 transformert med plasmid pTacAPHILE som er deponert ved NRRL og tildelt aksesjonsnr. B-18442, og (b) utvinning av amphiregulin fra kulturen.

6. Vertscelle, karakterisert ved at den inneholder en rekombinant vektor omfattende en nucleotidsekvens som koder for en aminosyresekvens omfattende følgende aminosyresekvens for et amphiregulinprotein 1 10 20 RjVKPPQNKTE SENTSDKPKR KKKGGKNGK 30 40 50 NR R NRKKKNPC NAEFQNFCIH GECKYI 60 70 78 EHLE AVTCKCQQEY FGERCGEK hvori Rx er V eller sekvensen SVRVEQV, eller et strukturelt nærliggende fragment derav med tilsvarende biologiske aktivitet, under kontroll av en annen nucleotidsekvens som regulerer genekspresjon slik at cellen produserer et peptid eller protein med amphiregulinaktivitet.

7. Celle ifølge krav 6, karakterisert ved at nucleotidsekvensen som koder for amphiregulin, omfatter en nucleotidsekvens som avbildet i fig. 16 fra nucleotid 528 til 761.

8. Celle ifølge krav 6, karakterisert ved at den er en Escherlchia coli-celle.

9. Celle ifølge krav 6, karakterisert ved at den andre nucleotidsekvens som kontrollerer genekspresjonen, omfatter en Tac-promotor.

10. Rekombinant vektor for anvendelse i den egnede vertscelle ifølge krav 6, karakterisert ved at den er plasmid pARl, pARH12, pARH6, pTacAPARl eller pTacAPHILE, som er inneholdt i en Escherlchia coli cellelinje deponert ved NRRL og henholdsvis tildelt aksesjonsnr. B-18438, B-18439, B-18440, B-18441 eller B-18442.

11. Isolert og renset genomsekvens som koder for amphi-regulinproteinet fremstilt ifølge krav 1, karakterisert ved at nucleotidsekvensen er som avbildet i fig.17.

12. Nucleotidsekvens som koder for en amphiregulin-for-løper, karakterisert ved at den omfatter nucleotidkodingssekvensen som i alt vesentlig er som avbildet i fig. 16 fra ca. nucleotidrest nr. 1 til 1243.