LU87442A1 - L'amphireguline:une nouvelle glycoproteine bifonctionnelle modulatrice de la croissance - Google Patents

Description

89/B 52 799

J s |λ GRAND-DUCHÉ DE LUXEMBOURG

......L..........S.........

Monsieur le Ministre du........25.......janvier........19.8.9 . de l’Économie et des Classes Moyennes _ ,Service de la Propriété Intellectuelle

TltredellVré ......................— I LUXEMBOURG

Demande de Brevet d’invention —............-..........................................(1) I. Requête

La société dite: ONCOGEN, 3005 First Avenue, SEATTLE/__^ 2) .........WASHIngîIIQM 98±2J-^Etats Unis_.dlAmérigue)L_x.éprésentée- paii----------------- .........Monsieur......JacgaM_dgj^^a.e,E_ aglssrnt.......^^ ---------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------:------------------------------ ( 3) dépose(nt) ce..................vingt-cinq janvier 1900 quatre-vingt neuf........................ ( 4) à........J..5....................heures, au Ministère de l’Économie et des Classes Moyennes, à Luxembourg: 1. la présente requête pour l’obtention d’un brevet d’invention concernant: "L ' amphiréguline : une.....nouvelle glycoprotéine__________________________________________________________ ( 5) bifonctionnelle modulatrice de......la croissance.1*__________________________________________________________________________________ 2. la description en langue ......française............................................................de l’invention en trois exemplaires; 3. ................34............................................planches de dessin, en trois exemplaires; 4. la quittance des taxes versées au Bureau de l’Enregistrement à Luxembourg, le .....2.5.......janvier: „1.9..8.9..... ; 5. la délégation de pouvoir, datée de..................................................................... le ..................janvier......1.9.89 , ; 6. le document d’ayant cause (autorisation); déclare(nt) en assumant la responsabilité de cette déclaration, que l’(es) inventeur(s) est (sont): ( 6) ........."ne......pas......mentionner!'.........................................................................................................................................................-............................................................................— revendique(nt) pour la susdite demande de brevet la priorité d’une (des) demande(s) de ( 7) .........orevets..................................................................................................................déposée(s) en (8)......aux Etats Unis d'Amérique________________ le (9).....25..01..1988.......(ISO,.......14.8..,3.2.7.)...;......le......lSJläJSBMMüu.......13..1...38.4)......et.......................................................................

msm&ys).........le.....11..01...1.989.............................................................................................................................................................................................................................................

au nom de (11)s...............inventeurs......................................................................................................................................................................................................................................................

élit(élisent) domicile pour lui (elle) et, si désigné, pour son mandataire, à Luxembourg .......................................................................................

35, Boulevard Royal................................................................................ .............. (12) sollicite(nt) la délivrance d’un brevet d’invention pour l’objet décrit et représenté dans les annexes susmentionnées, ^^averajeumement de cette délivrance à................§........................................................................................................................................................................................mois. (13) r Le déposW7ynandataire:.............................................................................................................................................................................................................................................................................. (14) ( I U Π. Procès-verbal de Dépôt

La susdite Wemande de brevet d’invendoriaeté déposée au Ministère de l’Économie et des Classes Moyennes, Service de la Propriété Intellectuellé'âLuxembourg, en date du: 25 j an Vier 1989 „f* » <jï* J " ·#»/ *· Λ" .

/ ?........* T, y 4'.·· * î £ ' Pr. le Ministre de l’Économie et des Classes Moyennes, à...............™.....................heures '· Ί i p. d.

;-V*f / .7 ·' Le chef du service de la propriété intellectuelle, f 'y-» / ' - V<v-- .·* _ J , A68007__ ( Ο ψ K EXPLICATIONS RELATIVES AU FORMULAIRE DElfëfiÿr“" w- * J f \ (1) s’il y a lieu "Demande de certificat d’addition au brevet principal, à la demande de brevet principal No............du............” - (2) inscrire les nom, prénom, profession, ’ adresse du demandeur, lorsque celui-ci est un particulier ou les dénomination sociale, forme juridique, adresse du siège social, lorsque le demandeur est une personne morale - (3) inscrire p j* >} les nom, prénom, adresse du mandataire agrée, conseil en propriété industrielle, muni d’un pouvoir spécial, s’il y a lieu: "représenté par............agissant en qualité de mandataire" ( *7 / r -(4) date de dépôt en toutes lettres - (5) titre de l’invention - (6) inscrire les noms, prénoms, adresses des inventeurs ou l’indication "(voir) désignation séparée (suivra)”, lorsque la dési* ^ ^s, f gnation se fait ou se fera dans un document séparé, ou encore l’indication ”ne pas mentionner”, lorsque l'inventeur signe ou signera un document de non-mention àjoindre à une désignation ηηίοαη,Αΐΐιι fnrm>e_l‘7\ hpAU^f iflPiif H'nHHitînn mnriÂl» ri’ui-MîtyS hn>v/>r/>iimnpi»n ίΡΒΡΛ nrnrf»rrinn int*mnrinnnli* f Pf’T) — tJD Τ-ΐπΓ rinn«: ternit*! le nremîer Hénnf a AtA pffprfiit» 89/B 52 799

REVENDICATION DE LA PRIORITE

de la demande de brevet / du modèle d’utilité KK AUX ETATS UNIS D'AMERIQUE Du' 25.01.1988 (No. 148.327);

Du 15.04.1988 (No. 181.884)et Du 17.01.1989 Mémoire Descriptif déposé à l’appui d’une demande de

BREVET D’INVENTION

au

Luxembourg

au nom de : otlcoGEN

SEATTLE, WASHINGTON 98121 (Etats Unis d'Amérique) ^OUr * "L'amphiréguline: une nouvelle glycoprotéine bifonctionnelle modulatrice de la croissance." L1amphiréquline :_une nouvelle glycoprotéine bifonctionnelle modulatrice de la croissance.

r- 1. Introduction,

La présente invention concerne la production et les utilisations de 1 ’amphiréguline, qui est une nouvelle protéine régulatrice de la croissance. Les protéines conformes à 1'invention inhibent fortement la croissance de plusieurs lignées de cellules d’origine tumorale, mais favorisent la croissance de plusieurs autres lignées de cellules. Une grande variété d'applications thérapeutiques de ce régulateur bifonctionnel de la croissance sont décrites, notamment le traitement de plaies, de même que le diagnostic et le traitement de cancers, mais sans limitation à ces applications, 1. Arrière-plan de l'invention.

La croissance et la différenciation des cellules semblent initiées, favorisées, entretenues et régulées par un grand nombre de facteurs et d'hormones ayant des effets de stimulation, d’inhibition et de synergie. L'altération et/ou l'effondrement du mécanisme d'homéostasie cellulaire semblent être une cause fondamentale des affections en relation avec la croissance, y compris les néoplasmes. Les facteurs de modulation de la croissance sont impliqués dans une grande variété de processus pathologiques et = physiologiques, notamment la transduction de signaux, la communication, la croissance et le développement cellulaires, l'embryogénèse, la réponse immunitaire, l’hématopoïèse, la survie et la différenciation cellulaire, l'inflammation, la reconstitution et le remodelage tissulaires, l'athérosclérose et le cancer. Il y a donc grand intérêt d'isoler, de caractériser et de définir les mécanismes fonctionnels des facteurs 2 modulateurs de la croissance en raison de leur application potentielle pour le diagnostic, le pronostic et le traitement du cancer. De plus, l’acquisition de la connaissance de ces facteurs favorisera la compréhension des mécanismes fondamentaux sous-jacents à la régulation de la croissance normale et à sa disparition dans les cellules cancéreuses.

Le facteur de croissance épidermique (EGF), le facteur oC de croissance transformant (TGF £>C ), le facteur de croissance issu des plaquettes (PDGF), le facteur de croissance fibroblastique (FGF), le facteur de croissance nerveuse (NGF), le facteur ß de croissance transformant (TGFyS), les facteurs de croissance insuliniques I et II (IGF I, IGF II), les facteurs de croissance hématopoïétiques tels que l'érythropoïétine, les facteurs de stimulation de colonies (CSF 1 et 2), les interleukines (IL-1 à 6), les interférons (IFN , ß , ^ ), les facteurs de nécroses des tumeurs o( et ß (TNF o(, ß ), la leukoréguline, 1'oncostatine M et divers autres facteurs moins bien définis sont des protéines modulatrices de la croissance et de la différentiation produites par divers types de cellules dans les conditions physiologiques normales ou en réponse à des Stimuli exogènes. Ces facteurs semblent agir pour la plupart de façon autocrine et paracrine. (Pour des articles de revue, voir : Goustin et al., 1986, Cancer r. Res. 46 : 1015 à 1019? Rozengurt, 1986, Science 234 ; 161 à 166? Pardee, 1987, Cancer Res. 47 : 1488 à 1491? Sachs, 1986, Sei., Amer. 254 : 40 à 47? Marshall, 1987, Cell 50 : 5 à 6? Melcher et Anderson, 1987, Cell 30 : 715 à 720? Clemens et McNurlan, 1985, Biochem. J. 226 : 345 à 360? Nathan, 1987, J. Clin. Invest. 79 : 319 à 326? Sporn et Roberts, 1986, J. Clin. Invest. 78 : 329 à 332? Old, 1987, Nature, 326 : 330 à 331? Beutler et 3

Cerami, 1987, New Eng. J. Med. 316 : 379 à 385; Weinstein, J. Cell. Biochem., 33 : 213 à 224? Zarling et al., 1987, Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 83 : 9739 à 9744; Sporn et Todaro, 1985; N. Eng. J. Med. 303 ; 878 r à 880; Sporn et Roberts, 1985, Nature 313 : 745 à 747).

Les esters de phorbol biologiquement actifs, comme le 13-acétate de 12-0-tétradécanoylphobol (TPA) sont de puissants promoteurs des tumeurs in vivo et suscitent et modulent une grande variété de réponses biologiques et biochimiques in vivo et aussi in vitro (Blumberg, 1981, Crit. Rev. Toxicol. 9 : 153 à 197; Slaga, 1983, Cancer Surv. 2 : 595 à 612). On sait depuis quelque temps que le TPA inhibe la croissance de la lignée cellulaire MCF67 de l'adénocarcinome mammaire humain. De plus, le TPA modifie aussi la morphologie des cellules MCF-7 puisque les cellules traitées avec du TPA manifestent les caractéristiques morphologiques de cellules sécrétoires (Osborne et al., 1981, J. Clin. Invest. 67 : 943 à 951; Valette et al., 1987, Cancer Res. 47 : 1615 à 1620).

3. Aperçu de l'invention.

La présente invention concerne 11amphiréguline qui est un nouveau facteur régulateur de la croissance qui manifeste une activité bifonctionnelle et inhabituelle de régulation de la croissance cellulaire. L1amphiréguline inhibe la croissance des cellules néoplasiques, mais favorise la croissance de certaines cellules normales. L'amphiréguline est une glycoprotéine extrêmement hydrophile ayant un poids moléculaire médian de 22.500 daltons, qui existe sous deux formes distinctes mais fonctionnellement équivalentes, une forme tronquée et une forme plus grande. Sauf les six résidus N-terminaux supplémentaires existant dans la forme plus grande, les deux formes sont parfaitement homologues au niveau des 4 acides aminés (Fig. 12). L'invention est basée pour partie sur la découverte que les cellules MCF-7 traitées au moyen de TPA libèrent une glycoprotéine qui inhibe la croissance de la lignée cellulaire du ^ carcinome épidermoïde A431 et d'autres lignées cellulaires tumorales, mais augmente la croissance de fibroblastes humains normaux et de certaines autres lignées cellulaires.

L'invention est décrite au moyen d'exemples dans lesquels 1'amphiréguline est identifiée, purifiée jusqu'à homogénéité et caractérisée en détail pour ce qui est de la structure et des fonctions. Dans d'autres exemples, l'isolement et le séquençage du cADN et des clones génomiques codant pour le précurseur de 1'amphiréguline sont décrits. Ces clones ont été utilisés pour préparer des vecteurs d'expression capables de diriger la synthèse à un niveau élevé de 1'amphiréguline biologiquement active dans des cellules hôtes bactériennes transformées et eucaryotes transfectées.

Une grande variété d'applications de ce facteur remarquable entrent dans le cadre de 1'invention.

4. Brève description des figures.

Fig. 1. HPLC à inversion de phase préparative μ des fractions de tête et de lavage.

Fig. 2. HPLC inversion de phase semi-^ préparative des fractions 47 à 62 rassemblées en pool de la Fig. 1.

Fig. 3A. HPLC à inversion de phase analytique du pool I de l'essai précédent.

Fig. 3B. HPLC à inversion de phase analytique du pool II de l'essai précédent.

Fig. 4. Chromatogramme de perméation de gel de fractions des Fig. 3A et 3B sur des colonnes Bio-Sil 5 TSK 250. La chromatographie a été effectuée comme décrit à la section 6.3.2. ci-après. (A) HPLC de la fraction 35 concentrée (Fig. 3A); (B) HPLC de la fraction 36 concentrée (Fig. 3A); (C) HPLC de la fraction 37 concentrée (Fig. 3A); (D) HPLC des fractions 41 et 42 concentrées réunies (Fig. 3B).

Fig. 5. Analyse de l'AR purifié et de l'AR S-pyridyléthylée (SPE-AR) par HPLC par perméation de gel sur colonnes Bio-Sil TSK 250. La chromatographie a été effectuée comme décrit à la section 6.3.2. ci-après. Les marqueurs de poids moléculaire utilisés ont été l'ovalbumine de 43 kD, le chymotrypsinogène A de 25 kD, la ribonucléase de 14 kD et l'insuline de 5 kD, (A) AR, (B) SPE-AR.

Fig. 6. Analyse de l'AR et de la SPE-AR sur une colonne RPSC C3 ultraporeuse à inversion de phase (4,6 x 75 mm). Le gradient a été établi entre le solvant primaire, du TFA à 0,1% et le solvant secondaire, de 1 ' acétonitrile avec 0,1% de TFA, au débit de 1 ml par minute à la température ambiante. Des fractions de 1 ml ont été collectées (A) AR, (B) SPE-AR.

Fig. 7. Analyse SDS-PAGE des protéines AR. (A) Un gel SDS-PAGE à 15% (0,75 mm x 18 cm x 15 cm); Bio-Rad) avec un système tampon discontinu a été examiné à un courant constant de 30 milliampères. Les marqueurs de poids moléculaire utilisés ont été la phosphorylase B de 92,5 kD, le BSA de 66,2 kD, l'ovalbumine de 43 kD, l'anhydrase carbonique de 31 kD, le chymotrypsinogène A de 25,7 kD, l'inhibiteur de la trypsine de soya de 21,5 kD, la lactoglobuline de 18,4 kD, le lysozyme de 14,4 kD, l'aprotonine de 6,2 kD et la sous-unité d'insuline de 3 kD. Colonne 1 : AR; colonne 2 : NG-AR; colonne 3 : SPE-AR; colonne 4 : NG-SPE-AR. (B) Un minigel SDS-PAGE à 20% 6 (0,75 mm x 10 cm 7 cm) a été examiné sous tension constante de 200 volts. Les mêmes marqueurs de poids moléculaire que ci-dessus ont été utilisés. Colonne 1 : AR; colonne 2 : NG-AR; colonne 3 : NG-AR traitée par la phospholipase, séparée sur HPLC à inversion de phase.

Fig. 8. Analyse IEF de l'AR marqué par -^5^t Les étalons suivants ayant des valeurs de Pj entre 4,65 et 9,6 ont été utilisés : phycocyanine, 4,65; - lactoglobuline B, 5,1; anhydrase carbonique bovine, 6,1; anhydrase carbonique humaine, 6,5; myoglobine de cheval, 7,0; myoglobine de baleine, 8,05; ^ -chymotrypsine, 8,8 et cytochrome C, 9,6.

Fig. 9. (A) Courbe dose-réponse de l'AR pour l'inhibition de l'incorporation de la 125j_ désoxyuridine dans l'ADN de cellules A431; (B) effet stimulant de l'AR sur l'incorporation de la 125χ_ désoxyuridine dans l’ADN de fibroblastes de prépuce humain (Sadamoto).

Fig. 10. Compétition de la fixation du 125χ_ EGF sur des cellules A431 fixées ou des membranes plasmiques de A431 par l'EGF de souris et l'AR. Les dosages de fixation ont été effectués comme décrit à la section 6.1.5. ci-après. On a utilisé des échantillons de 100JUl et de 50 JL_L par cupule pour les dosages avec les cellules fixées ou les membranes, respectivement.

Symbole Origine du récepteur Compétiteur

• Cellules fixées EGF

• * Cellules fixées AR

O Membranes EGF

^ Membranes AR

Fig. 11. Analyse d'hydropathie de l'AR et de l'EGF humain (Kyte et Doolittle). (A) AR (restes 1 à 7 84); (B) AR (restes 44 à 84); (C) EGF (restes 1 à 53); (D) précurseur de l'AR (restes 1 à 252 ); (E) comparaison de l'AR humain (restes 1 à 84) et de l'EGF (restes 1 à 53) (l'alignement est conforme à la Fig. 13, de sorte que le reste cystérine 46 de l'AR à maturité correspond au reste de cystéine 6 de l'EGF à maturité).

Fig. 12. Séquence des acides aminés de l'AR à maturité et de l'AR tronqué. Le code habituel à une seule lettre pour les acides aminés est utilisé : Alanine (A); Arginine (R); Asparagine (N); Acide Aspartique (D); Cystéine (C); Glutamine (Q); Acide Glutamique (E); Glycine (G); Histidine (H); Isoleucine (I); Leucine (L); Lysine (K); Méthionine (M); Phénylalanine (F); proline (P); Sérine (S); Thréonine (T); Tryptophane (W); Tyrosine (Y) et Valine (V).

Fig. 13. Comparaison des séquences des acides aminés de 1 ' amphirêguline (AR) et de membres de la superfamille EGF.

Fig. 14. (A) Fixation de la 125I-AR sur la cellulose (o-o), l'ADN dénaturé-cellulose (D-O) et l'ADN natif-cellulose (û-û). (B) Fixation de la 125I_ AR sur la cellulose (o-—-o) et l'ADN-cellulose (0—a) comparée à la fixation du ^2^I-EGF sur la cellulose (û-ù) et l'ADN-cellulose (V—V).

Fig. 15. Peptides synthétiques d'amphirêguline produits par une technique en phase solide. Cinq peptides correspondant aux restes 166 à 184 (n° 259), 108 à 130 (n° 264), 31 à 50 (n° 279), 71 à 90 (n° 280) et 221 à 240 (n° 281) ont été produits par synthèse en phase solide, puis purifiés par HPLC avec inversion de phase.

Fig. 16. Séquence de nucléotides et séquence d'acides aminés déduite du clone de cADN de pARl, codant pour 1'amphirêguline humaine.

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Fig. 17. Séquence génomique de 1'amphiréguline humaine.

Fig. 18. Diagramme schématique de la structure d'exon et des domaines protéiques de la molécule AR, en relation avec la séquence génomique.

Fig. 19. Séquence nucléotidique du vecteur d'expression pDCHBARl.

Fig. 20. Séquence nucléotidique de pTacAPARl.

Fig. 21. Séquence nucléotidique de pTacAPHILE.

5. Description détaillée de l'invention.

La présente invention concerne 1'amphiréguline (AR), les séquences nucléotiques codant pour l'AR et le précurseur de l'AR, outre la production de l'AR suivant les procédés classiques et de l'ADN recombinant.

L'AR, qui est un nouveau facteur de régulation de la croissance cellulaire, est exprimée et sécrétée par les cellules MCF-7 traitées au moyen de TPA, sous deux formes distinctes mais fonctionnellement équivalentes. Les deux formes sont identiques par leur structure, sauf un supplément de 6 restes aminoterminaux dans la forme la plus grande. L'AR a une puissante activité inhibitrice sur la synthèse de l'ADN dans les cellules néoplasiques et est donc intéressante comme puissant agent antitumoral. Un intérêt particulier est offert par l'aptitude de l'AR à favoriser la croissance des fibroblastes et de diverses autres cellules normales, ce qui suggère que l'AR peut être utile pour traiter des états nécessitant une accélération de la croissance cellulaire, à savoir les brûlures et les plaies.

L'AR, ou ses fragments et dérivés, ont une utilité thérapeutique potentielle étendue pour le traitement et la surveillance des affections néoplasiques, de même que pour le traitement des plaies, L'AR peut aussi trouver son utilité dans la 9 modulation de la résorption osseuse et de la réponse immunitaire, de même que dans la stimulation de la cascade de l'acide arachidonique. Le gène amphiréguline et les produits de ce gène, des procédés pour les produire et leur utilisation sont décrits en détail dans les sous-sections et exemples ci-après.

5.1. Production et purification de 11amphiréguline.

L'amphiréguline est sécrétée par la lignée cellulaire du carcinome mammaire humain MCF-7 lorsque ces cellules ont été traitées au moyen de 13-acétate de 12-0-tétradécanoylphorbol (TPA) qui est un agent favorisant les tumeurs. L'amphiréguline peut être isolée du milieu conditionné de ces cellules MCF-7 traitées par TPA et mises en culture et peut être ensuite purifiée jusqu'à une activité spécifique élevée. L'amphiréguline peut aussi être isolée d'autres lignées cellulaires avec ou sans traitement inducteur par TPA ou par d'autres agents favorisant les tumeurs. En variante, 1'amphiréguline peut être produite suivant les techniques de l'ADN combinant, ou bien par synthèse peptidique en phase solide.

L'amphiréguline peut être purifiée suivant divers modes opératoires et techniques connus, notamment, mais non limitativement, la chromatographie (par exemple la chromatographie liquide avec inversion de phase, par perméation de gel, par échange de liquides, par échange d'ions, par exclusion dimensionnelle et par affinité), la centrifugation, l'électrophorèse, la différence de solubilité, et suivant différentes autres techniques courantes pour la purification des protéines.

Dans une forme de réalisation spécifique de 11 invention, les cellules MCF-7 sont traitées au moyen de TPA pendant 48 heures et cultivées dans du milieu frais exempt de sérum pendant 4 jours. Le milieu 10 conditionné résultant est collecté et utilisé pour préparer l'AR brute comme décrit dans la section 6.2. ci-après. Une combinaison de chromatographie liquide avec inversion de phase et de chromatographie par perméation de gel peut être appliquée pour purifier l'AR jusqu'à homogénéité apparente, comme décrit dans la section 6.3. ci-après, et donne de l'AR purifiée de 1842 à 2270 fois par rapport au produit brut initial. Le procédé est reproductible et donne des préparations d'AR purifiée ayant des activités spécifiques entre 2,7 et 3,4 x 106 unités par mg de protéine.

5.2. Le gène amphiréguline.

5.2.1. Isolement et clonage du gène amphiréguline.

Pour l'application du procédé de l'invention, la séquence nucléotidique codant pour 11amphiréguline humaine ou son équivalent fonctionnel peut servir à engendrer des molécules recombinantes qui orienteront l'expression et 1'amphiréguline humaine qui est le produit. La séquence nucléotidique codant pour l'AR peut être isolée de sources cellulaires produisant une activité de type AR. Par exemple, dans une forme de réalisation spécifique, la lignée cellulaire du carcinome mammaire humain MCF-7 est utilisée comme source de la séquence nucléotidique codant pour l'AR. La séquence codante peut être obtenue en clonant le cADN de l'ARN isolé et purifié de ces sources cellulaires, ou bien par clonage génomique. Des : bibliothèques génomiques ou de cADN de clones peuvent être préparées au départ des fragments de l'ADN engendrés suivant des techniques connues, notamment, mais non limitativement, le recours aux enzymes de restriction.

Les fragments qui contiennent le gène pour l'AR peuvent être identifiés de différentes façons connues. Par exemple, une fraction de la séquence des 11 acides aminés de l'AR peut être utilisée pour en déduire la séquence de 11ADN, laquelle séquence de l'ADN peut être alors synthétisée par voie chimique, marquée radioactivement et utilisée comme sonde d'hybridation.

D'autres procédés qui peuvent être appliqués pour isoler le gène AR sont notamment, mais non limitativement, la synthèse chimique de la séquence elle-même du gène à partir d'une séquence connue qui peut, par exemple, être issue de la séquence des acides aminés de l'AR. En variante, la traduction in vitro du mARN sélectionné, suivie de dosages fonctionnels ou immunologiques des produits de traduction est applicable. Le gène identifié et isolé peut être inséré ensuite dans un vecteur de clonage approprié. Un grand nombre de systèmes vecteur-hôte connus peuvent être utilisés. Des vecteurs possibles sont notamment, mais non limitativement, les plasmides et les virus modifiés au cas où le système vecteur est compatible avec la cellule hôte. De tels vecteurs sont notamment, mais non limitativement, les bactériophages, comme les dérivés du bactériophage lambda, ou les plasmides, comme les dérivés des plasmides PBR322 et pUC. Les molécules recombinantes peuvent être introduites dans les cellules hôtes par transformation, transfection, infection, électroporation et ainsi de suite.

Dans une forme de réalisation particulière, le gène AR exprimé par les cellules MCF-7 est cloné en sélectionnant le mARN produit en réponse au traitement des cellules MCF-7 par TPA et en constituant une bibliothèque de cADN dans le bactériophage 7^9^10. Du fait que les cellules MCF-7 n'ayant pas subi le traitement ne semblent pas synthétiser et sécréter la protéine AR, il a été présumé que l'induction de l'AR par le TPA pouvait être observée au niveau de la 12 transcription et qu'une telle bibliothèque de cADN pourrait être considérablement enrichie pour les séquences contenant l'AR. Le sondage de la bibliothèque de cADN au moyen d'oligonucléotides dégénérés et présumés les meilleurs sur base de l'usage des codons humains (Lathe, 1985, J. Mol. Biol. 183 : 1 à 12 et comme décrit dans la section 8.1. ci-après) a conduit à l'isolement de clones de cADN de l'AR. Ces clones de cADN ont été utilisés ensuite pour caractériser le mARN de l'AR et le gène AR. De surcroît, la séquence nucléotidique du cADN de l'AR (section 8.2. ci-après et Pig. 16) peut être utilisée pour déduire la séquence primaire des acides aminés de l'AR.

En raison de la dégénérescence inhérente des séquences nucléotidiques codantes, d'autres séquences d’ADN qui codent sensiblement pour la même séquence d'acides aminés ou une séquence fonctionnellement équivalente d'acides aminés peuvent être utilisées pour appliquer les procédés de l'invention. Ces modifications de la séquences des nucléotides pour l'AR comprennent les délétions, additions ou substitutions de nucléotides différentes conduisant à une séquence qui code pour un produit de gène identique ou fonctionnellement équivalent. Le produit de gène peut contenir des délétions, additions ou substitutions de restes d'acides aminés dans la séquence conduisant à des modifications silencieuses qui donnent ainsi un produit bioactif. Ces substitutions d'acides aminés peuvent être faites sur la base de la similitude de polarité, de charge, de solubilité, de caractère hydrophobe, de caractère hydrophile et/ou de caractère amphipatique des restes en cause. Par exemple, des acides aminés à charge négative sont notamment l'acide aspartique et l'acide glutamique; des acides aminés à charge positive sont notamment la lysine et l'arginine; 13 des acides aminés comprenant des groupes de tête polaires non chargés et des groupes de tête non polaires, ayant des indices d'hydrophilie semblables sont notamment la leucine, 1'isoleucine, la valine; la glycine, l'alanine; l'asparagine, la glutamine; la sérine, la thréonine; la phênylalanine et la tyrosine.

Le cADN de l'AR peut être utilisé comme sonde pour détecter le raARN de l'AR dans les cellules MCF-7 ayant subi l'induction par TPA. Le mARN de l'AR a une longueur d'environ 1400 paires de bases.

Comme décrit dans la section 9 ci-après, le cADN de l'AR peut être utilisé pour caractériser le gène AR. L'attribution du gène AR humain sur le chromosone a été déterminée par hybridation in situ du cADN de l'AR marqué au avec des chromosones normaux en métaphase, ce qui révèle que le gène AR humain réside dans la région 4ql3-21 du chromosone 4, qui est une région que l'on croit impliquée dans la différentiation des lymphocytes (voir section 9.2. ci-après). Le cADN a été utilisé aussi pour isoler l'ADN génomique couvrant tout le gène AR, y compris la région régulatrice 5'. Le gène AR s'est révélé avoir une longueur d'environ 10 kb et est subdivisé en 6 exons. La région régulatrice 5 ' a été incorporée dans un vecteur d'expression contenant un gêne chloramphénicol acétyltransférase (CAT) exempt de promoteur. Ce vecteur construit a été à même de stimuler la transcription du gène CAT lorsqu'il est introduit de façon transitoire dans les cellules MCF-7 et l'activité a été stimulée de 6 à 7 fois par une addition de TPA (voir section 9.4. ci-après). Dans des formes de réalisation spécifiques de l'invention, cette région régulatrice 5' peut être utilisée dans des vecteurs d'expression pour régler la transcription du gène AR ou bien d'autres gènes de structure. Le produit construit AR-CAT hybride peut 14 être utilisé également pour rechercher les facteurs qui régulent l'expression de l'AR, comme décrit dans la section 9A.

5.2.2. Construction de vecteurs d'expression contenant la séquence codant pour 1'amphiréguline.

Pour exprimer une forme biologiquement active et à maturité de l'AR, il a fallu choisir un système vecteur d'expression/hôte qui assure non seulement de hauts niveaux de transcription et de translation, mais aussi les traitements adéquats du produit de gène. Ceci est spécialement important lors de l'utilisation de la séquence codante complète du précurseur de 1'amphiréguline dans les produits d'expression construits, du fait que la forme à maturité de 1'amphiréguline semble être issue du précurseur par des événements de traitement cellulaire. Par exemple, on peut choisir une cellule hôte de mammifère en raison de son aptitude à traiter et sécréter correctement 1’amphiréguline dans le milieu extracellulaire.

Spécifiquement, il apparaît que deux formes d'amphiréguline à maturité sont synthétisées comme partie médiane d'un précurseur commun de 252 acides aminés à partir duquel les deux formes à maturité sont dégagées par des événements de traitement protéolytique alternés. De plus, 1'amphiréguline est glycosylée et peut subir la sulfatation de la tyrosine, ce qui souligne d'avantage l'importance de choisir un système d'expression qui est capable d'exécuter ces modifications succédant à la traduction, si la chose est souhaitée, dans le produit final.

Divers systèmes animal hôte/vecteur d'expression (c'est-à-dire les .vecteurs qui contiennent les éléments nécessaires pour diriger la réplication, la transcription et la traduction de la séquence codante pour l'ARN dans une cellule hôte appropriée) 15 peuvent être utilisés avec un succès égal par l'homme de métier. Ce sont notamment, mais non limitativement, les systèmes vecteur d'expression viral/cellule hôte de mammifère (par exemple cytomégalovirus, virus de la vaccine, adénovirus, etc.); les systèmes vecteur d'expression viral d'insecte/cellule d'insecte (par exemple baculovirus)? ou des systèmes d'expression de promoteur non viral issu des génomes des cellules de mammifères (par exemple le promoteur métallothionine de souris).

Les éléments d'expression de ces vecteurs varient par leur puissance et leurs spécificités. Suivant le système hôte/vecteur qui est utilisé, l'un quelconque parmi de nombreux éléments de transcription et de traduction peut être utilisé. Par exemple, lors du clonage dans des systèmes avec cellule de mammifère, des promoteurs isolés du génome de cellules de mammifères (par exemple le promoteur métallothionine de souris) ou isolés de virus qui croissent dans ces cellules (par exemple le promoteur 7,5 K du virus de la vaccine ou la répétition terminale longue du virus du sarcome de la souris de Moloney) peuvent être utilisés. Les promoteurs produits suivant les techniques de l'ADN recombinant ou les techniques synthétiques peuvent être utilisés aussi pour assurer la transcription des séquences insérées.

Des signaux d'initiation spécifiques sont également nécessaires pour une traduction suffisante des séquences insérées codant pour la protéine. Ces signaux sont notamment le codon d'initiation AGT et les séquences adjacentes. Dans les cas où le gène AR complet, y compris son propre codon d'initiation et les séquences adjacentes, est inséré dans les vecteurs d'expression appropriés, des signaux de contrôle de traduction supplémentaires peuvent être inutiles.

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Toutefois, dans les cas où seule une partie de la séquence codante est insérée, des signaux de contrôle de traduction exogènes, notamment le codon d'initiation ATG, doivent être apportés. De plus, le codon d1 initiation doit se trouver en phase avec le cadre de lecture des séquences codant pour l'ARN pour assurer la traduction de toute la partie insérée. Ces signaux de contrôle de traduction exogènes et codons d’initiation peuvent avoir différentes origines, tant naturelles que synthétiques. L'efficacité d'expression peut être accentuée par inclusion de séquences d'atténuation de transcription, d'éléments d'accentuation, etc.

L'un quelconque des procédés déjà décrits pour insérer des fragments d'ADN dans un vecteur peut être appliqué pour construire les vecteurs d'expression contenant le gène AR et les signaux de contrôle de transcription/traduction appropriés. Ces procédés peuvent comprendre les techniques de l'ADN recombinant in vitro, les techniques de synthèse et les techniques de recombinaison in vivo (recombinaison génétique).

Par exemple, dans les cas où un adénovirus est utilisé comme vecteur d'expression, la séquence codant pour 11AR peut être unie par ligation à un complexe de contrôle de transcription/translation de 1'adénovirus, par exemple le promoteur tardif et la séquence signal tripartite. Ce gène hybride peut être inséré ensuite dans le génome de l'adénovirus par recombinaison in vitro ou in vivo. L'insertion dans une région non essentielle du génome viral (par exemple la région El ou E3) conduit à un virus recombinant qui est viable et capable d'exprimer l'AR chez les hôtes infectés. De même, le promoteur 7,5 K de- la vaccine peut être utilisé.

Un autre système d'expression qui pourrait être utilisé pour exprimer l'AR est un système 17 d'insecte. Dans un tel système, le virus de la polyhédrose nucléaire d'Autographa californica (AcNPV) est utilisé comme vecteur pour exprimer des gènes étrangers. Ce virus se multiple dans les cellules de Spodoptera frugiperda. La séquence codant pour l'AR peut être clonée dans des régions non essentielles (par exemple le gène polyhédrine ) du virus et mise sous contrôle d'un promoteur de l'AcNPV (par exemple le promoteur polyhédrine). L'insertion avec succès de la séquence codant pour l'AR conduit à l'inactivation du gène polyhédrine et à la production du virus recombinant non occlus (c'est-à-dire du virus exempt de l'enveloppe protéique pour laquelle code le gène polyhédrine). Ces virus recombinants sont utilisés ensuite pour infecter des cellules de Spodoptera frugiperda dans lesquelles le gène inséré est exprimé.

Les vecteurs rétroviraux préparés dans des lignées cellulaires d'emballage amphotropes permettent une expression hautement efficace dans de nombreux types de cellules. Ce procédé permet d'évaluer le traitement, la régulation ou la fonction de la séquence insérée codant pour la protéine qui sont spécifiques du type de cellule.

De plus, il est possible de choisir une souche de cellule hôte qui module l'expression des séquences insérées ou qui modifie et traite le produit de gène de la façon spécifique souhaitée. L'expression par certains promoteurs peut être augmentée en présence de certains inducteurs (par exemple les ions zinc et cadmium pour les promoteurs métallothionine). Pour cette raison, l'expression de l'AR produit par génie génétique peut être maîtrisée. Ceci est important si la protéine produite par le gène étranger cloné est létale pour les cellules hôtes. De plus, les modifications (par exemple la glycosylation) et le traitement (par 18 exemple la coupure) des protéines produites sont importants pour la fonction de la protéine. Des cellules hôtes différentes ont des mécanismes caractéristiques et spécifiques pour le traitement après traduction et pour la modification des protéines. Il est possible de choisir des lignées cellulaires ou systèmes hôtes convenables pour assurer la modification et le traitement appropriés de la protéine étrangère exprimée.

Des vecteurs d'expression qui peuvent être utilisés conformément à la présente invention sont notamment, mais non limitativement, les suivants.

Le plasmide pSV2Neo. Le plasmide pSV2Neo est décrit par Southern et al. (1982), J. Mol. Applied Genetics 1, 327 à 341.

Le plasmide pSV2dhfr. Le plasmide pSV2dhfr (Subramani et al., 1981, Mol. Cell. Biol. 1, 854 à 864), contient le gène dihydrofolate réductase (dhfr) de la souris sous le contrôle du promoteur de SV40.

Le plasmide pH3M. Le plasmide pH3M (Aruffo et al., 1987, Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A., 84, 3365 à 3369), contient un promoteur hybride composé de l'enhancer précoce immédiat AD169 du cytomégalovirus (CMV) humain fusionné aux positions -67 à +80 de LTR de HIV. Le LTR est suivi d'un polylinker avec des sites 5' vers 3’ : HindlII, Xbal, Xhol, BstXl, Xhol, PstI et Xbal. Les petits signaux épissage de l'antigène t/polyadénylation de pSV2 et une origine de réplication de SV40 sont en aval du polylinker. Ce dernier permet l'amplification dans les cellules contenant le grand antigène T de SV40, comme les cellules COS et WOP. Un gène tARN suppresseur entretient la croissance dans les vecteurs à base de pVX et les bactéries portant le plasmide P3, comme MC1061/P3.

Le plasmide pH3M/b0ncM. Le plasmide pH3M/b0ncM

19 a été acquis chez Najma Malik, Oncogen. Il contient la séquence signal TGF /î 51 non traduite de singe fusionnée sur la séquence codant pour l'Oncostatine M insérée dans pH3M aux sites Hindlll/Xhol (complétés). La séquence TGFfi> consiste en la région 51 non traduite de 85 paires de bases commençant à un site HindiII (partant du polylinker pSP65) et à un site PstI adjacent du cAND de TGFfi, suivie de 87 paires de bases codant pour la séquence signal de l'acide aminé 29, qui est normalement coupée dans une séquence dipeptidique glycine-leucine.

Le plasmide pH3ARP. Le plasmide pH3ARP est un vecteur basé sur pH3M conçu pour l'expression transitoire du précurseur de l'AR dans des cellules COS. Il contient 13 paires de bases de la région 5' non traduite de l'AR, la région codante complète et les séquences 3' non traduites. Ce plasmide est formé par ligation du fragment de 4 kb du vecteur pH3M digéré par HindlII et Xbal, des oligonucléotides EVSAL3 et EVSAL4 et du fragment de cADN HgAl/Xbal de 1,1 kb purifié sur gel provenant de PARI. EVSAL3 et EVSAL4 sont complémentaires avec des sites 5' HindlII, EcoRV, Sali et Hgal, Le produit construit contient aussi les sites polylinker EcoRI à Xbal provenant de pEMBLl8 succédant immédiatement à la région 3' non traduite.

EcoRV Hgal HindlII Sali

EVSAL3 5' AGCTTGATATCGTCGA

CGCAL4 3' ACTATAGCAGCTGACGC

Le plasmide pSVDR/bOM. Le plasmide psVDR/bOM a été acquis chez Jeff Kallestad, Oncogen. C'est un produit de fusion entre pSV2dhfr et pH3M/bOM et il constitue un vecteur avec un cADN actionné par le 20 promoteur CMV/HIV de pH3M flanqué d'une séquence signal de TGF ß et de signaux de polyadénylation de SV40, en plus du gène dhfr de souris actionné par le promoteur précoce de SV40. Il a été produit par ligation de pH3M/bOM digéré par BamHl/NruI (complété) avec pSV2dhfr digéré par BamHI.

Le plasmide pHras. Le plasmide pHras est un vecteur d'expression de mammifère développé par Stan McKnight, Univ. of Washington, Dept of Pharmacology. C'est un vecteur de pML qui contient un fragment de 754 paires de bases EcoRI jusqu'à Tthllll de Harvey Ras LTR, un polylinker avec Smal, BamHI, Sali, PstI, HindiII et Clal suivi du cADN DHFR de souris et du signal 3' non traduit/polyadénylation du virus de l'hépatite B. La distance à partir de BamHI dans le polylinker jusqu'à l'ATG de DHFR est de 54 paires de bases.

Le plasmide pHLARGE. Le plasmide pHLARGE est un produit construit d'expression de mammifère qui contient les séquences génomiques d'AR de 10 kb (Smal à HinlII) actionnées par le Harvey Ras LTR et suivies d'un gène DHFR exempt de promoteur et non fonctionnel. Il a été formé par ligation ternaire des fragments suivants : un fragment Smal/HindlII de pHras de 4,6 kb, un fragment génomique AR Smal/HindlII de 6,0 kb provenant de pARH12, et un fragment génomique AR HindiII de 6,4 kb provenant de pARH6.

Le plasmide pHLARGlpcD. Le plasmide pHLARGlpcD est un produit construit d'expression de mammifère polycistronique. Il contient la séquence de cADN du précurseur de l'AR suivie du gène dhfr de la souris actionné par un Harvey Ras LTR unique. Le produit de transcription primaire est un message polycistronique comprenant 64 paires de bases entre le codon d'arrêt de l'AR et le codon d'initiation ATG de dhfr, ce qui 21 permet au ribosome d'opérer une réinitiation et de poursuivre la traduction. Le pH3ARP a été digéré avec EcoRV et le fragment de 700 paires de bases a été isolé. Ce fragment contenait la région 5' non traduite de 13 paires de base de l'AR, la région codant pour le précurseur complet de l'AR et une séquence 5' non traduite de 21 paires de bases. Ce fragment a été assemblé par ligation avec le vecteur pHras phosphatasé, complété et coupé par BamHI.

Le plasmide pLOSNL. Le plasmide pLOSNL a été acquis chez Dusty Miller, Fred Hutchison Cancer Research Center, Seattle, WA. Ce vecteur d'expression rétroviral a été conçu pour engendrer des stocks viraux exempts de helpers amphotropes de titre élevé capables d'infecter une grande variété d'hôtes mais non de s'y répliquer. Le vecteur contient un virus de la leucémie de la souris de Moloney muté LTR avec des signaux d'emballage délétés; des séquences psi+; le gène ornithine transcarbamylase (OTC) contenant deux sites Xhol pour l'insertion d'un cADN et l'inactivation ultérieure du gène OTC, SV2Neo, qui est un marqueur sélectionnable, le 3' LTR et un squelette de pBR322 résistant à Amp.

Le plasmide pLARSNL. Le plasmide pLARNSL est un produit construit d'expression rétroviral amphotrope contenant la région codante du cADN du précurseur de l'AR, exempt de queue poly(A), actionné le LTR viral. SV2Neo permet la sélection en fonction de l'expression des transfectants. Le pLARSNL a été engendré par ligation du fragment Sali de 800 paires de bases provenant de pHLARGlpcD avec le fragment de vecteur pLOSNL digéré par XHol et phosphaté de 7,7 kb.

22 5.2.3. Identification des transfectants ou des transformants qui expriment 11amphiréguline comme produit de gène.

Les cellules hôtes qui contiennent la séquence recombinante codant pour l'AR et qui expriment le produit biologiquement actif à maturité, peuvent être identifiées suivant au moins quatre voies générales : (a) hybridation ADN-ADN, ADN-ARN ou ARN-ARN antisens,· (b) la présence ou l'absence de fonctions "marqueur" du gène; (c) l'évaluation du degré de transcription comme le mesure l'expression des produits transcrits du mARN de l'AR dans la cellule hôte et (d) la détection du produit de gène à maturité que révèle 1'immunodosage et, en dernier recours, son activité biologique.

Suivant la première approche, la présence de la séquence codant pour l'AR humaine insérée dans le vecteur d'expression peut être détectée par hybridation ADN-ADN en utilisant des sondes qui comprennent des séquences nucléotiques qui sont homologues de la séquence codant pour l'AR humaine.

Suivant la seconde approche, le système vecteur d'expression recombinant/hôte peut être identifié et sélectionné sur la base de la présence ou de l'absence de certaines fonctions de gène "marqueur" (par exemple l'activité de thymidine kinase, la résistance à certains antibiotiques, la résistance au méthotrexate, le phénotype de transformation, la formation d'un corps d'occlusion dans un baculovirus, etc.). Par exemple, si la séquence codant pour l'AR est insérée dans une séquence d'un gène marqueur du vecteur, les recombinants contenant la séquence codant pour l'AR peuvent être identifiés par l'absence de la fonction du gène marqueur. En variante, un gène marqueur peut être monté en tandem avec la séquence AR sous le contrôle d'un promoteur qui est identique à 23 celui utilisé pour contrôler l'expression de la séquence codant l'AR ou bien qui en est différent. L'expression du marqueur en réponse à l'induction ou à la sélection indique l'expression de la séquence codant pour l'AR.

Suivant la troisième approche, l'activité de transcription pour la région codant pour l'AR peut être évaluée par des essais d'hybridation. Par exemple, l'ARN polyadénylé peut être isolé et analysé par Northern blot au moyen d'une sonde homologue avec la séquence codant pour AR ou avec des parties particulières de celle-ci. En variante, les acides nucléiques totaux de la cellule hôte peuvent être extraits et soumis à des essais d'hybridation avec de telles sondes.

Suivant la quatrième approche, l'expression du produit protéique à maturité peut être évaluée par voie immunologique, par exemple par un Western blot, des immunodosages tels que la radioimmunoprécipitation, le test immunoenzymatique en phase solide (ELISA), etc. Le dernier test pour le succès du système d'expression revient toutefois à détecter l'AR biologiquement active produite par le gène. Lorsque la cellule hôte sécrète le produit de gène, le milieu exempt de cellules obtenu à partir des cellules hôtes transfectantes cultivées peut être soumis à un dosage de l'activité de l'AR. Lorsque le produit de gène n'est pas sécrété, les produits de lyse cellulaire peuvent faire l'objet d'un tel dosage de l'activité. Dans un cas ou dans l'autre, les dosages biologiques, par exemple les dosages par inhibition ou stimulation de la croissance décrits ici et des dosages analogues, peuvent être exécutés.

24 5.3. Structure de 1'amphiréquline.

Le séquençage des acides aminés de l'AR purifiée révèle que la préparation est formée par un mélange inégal de deux formes presque identiques de l'AR (voir Fig. 12). L'une des formes, qui est la plus grande des deux, constitue à peu près 16% de la préparation. L'autre forme, qui est l’AR tronquée, constitue le reste et la majeure partie de la préparation et diffère de 1'homologue plus long uniquement par l'absence de l'hexapeptide aminoterminal, SVRVEQ. Les deux formes sont, par ailleurs, parfaitement homologues au niveau des acides aminés.

L'AR est une glycoprotéine extrêmement hydrophile ayant un poids moléculaire relatif médian de 22.500 daltons. Le traitement par la N-glycanase, qui élimine les hydrates de carbone N-liés, fait migrer l'AR à l'état de bande unique avec un poids moléculaire relatif de 14.000, en bon accord avec les calculs du poids moléculaire basés sur les données de la chromatographie par perméation de gel de l'AR. Dans des conditions non réductrices, l'AR migre de même. Par conséquent, l'AR est une glycoprotéine à chaîne unique.

La structure primaire de l'AR a été comparée à celle de nombreuses séquences protéiques. Ces comparaisons montrent que l'AR est une protéine remarquable n'ayant d'homologie de structure sensible avec autres des protéines comparées. La structure primaire de l'AR est cependant en relation avec celle de divers autres facteurs de croissance, dont la plupart appartiennent à la superfamille EGF. Il apparaît rationnel de considérer l’AR comme un membre de ce groupe de protéines, parce que diverses de ses particularités de structure sont étroitement parallèles aux particularités de structure hautement conservées observables dans la famille des protéines EGF. Par 25 exemple, la séquence N-terminale de AR ressemble aux séquences N-terminales de TGFy3, VGF et MGF, du fait que cette région est riche en restes de proline, de sérine et de thréonine. L'AR comprend aussi des sites pour la glycosylation N-liés comme en contiennent les régions de précurseurs N-terminales de TGF et de VGF. L'AR présente, en outre, une homologie de structure avec d'autres protéines analogues à EGF, avec la conservation de 6 restes de cystéine intervenant dans 3 ponts disulfure qui définissent la structure secondaire des formes à maturité de ces facteurs de croissance. Néanmoins, l'analyse d'hydropathie révèle des différences significatives entre les séquences homologues de l'AR et de l'EGF. Pour des comparaisons plus détaillées entre l'AR et d'autres membres de la superfamille EGF, il convient de se référer au tableau I, à la Fig. 13 et aux sections 9.7 et 9.8.

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TABLEAU I

Protéine Espèce Région n° 1 Région n° 2

EGF Humaine GLHDGVCMYIE CNCWGYIGERC

TGF 0( Humaine CFH-GTCRFLV CVCHSGYVGARC

VGF Vaccine GLH-GDCIHAR CRCSHGYTGIRC

SGF Shope GLNNGTCFTIA CVCRINYEGSRC

Facteur IV Humaine GLNXGSCKDDI CWCPFGFEGKNC

Facteur X Humaine CQNXGKCKDGL CTCLEGFEGKNC

Facteur XII Humaine GLHXGRCLEVE CHCPVGYTGPFC

Protéine C Humaine CCGXGTCIDGI CDCRSGWEGRFC

AR Humaine CIH-GECKYIE CKCQQEYFGERC

Cotes d'homologie combinées pour les régions n° 1 et n° 2.

Cote EFG Cote Coag. Cote AR

Famille des facteurs de croissance >20 <20 <40

Facteurs de coagulation <25 >25 <40

Sous-famille de 1'amphiréguline <20 <20 >40

Les séquences d'acides aminés de 1 'amphiréguline illustrées à la Fig. 12, de même que leurs équivalents fonctionnels, entrent dans le cadre de l'invention. Par exemple, 1'amphiréguline produite peut contenir des délétions, additions ou substitutions de restes d'acides aminés dans la séquence, qui se traduisent par des modifications silencieuses donnant donc un produit bioactif. Ces substitutions d'acides 27 aminés peuvent être opérées sur la base de la similitude de polarité, de charge, de solubilité, de caractère hydrophobe, de caractère hydrophile et/ou de caractère amphypatique des restes en cause. Par exemple, les acides aminés à charge négative sont notamment l'acide aspartique et l'acide glutamique; les acides aminés à charge positive sont notamment la lysine et l'arginine, et les acides aminés à groupe de tête polaire non chargée ayant un caractère hydrophile semblable sont la leucine, 1'isoleucine, la valine, la glycine, l'alanine, l'asparagine, la glutamine, la sérine, la thréonine, la phénylalanine et la tyrosine.

5.4. Propriétés de 1'amphiréguline.

L'AR est une glycoprotéine à chaîne simple qui a un poids moléculaire médian d'environ 22.500 daltons et qui manifeste des activités bifonctionnelles de modulation de la croissance sur diverses cellules en culture. Du point de vue de la structure, l'AR est apparentée à la famille EGF des facteurs de croissance et peut, de plus, avoir des similitudes fonctionnelles avec d'autres membres de cette famille, comme l'indique l'aptitude de l'AR à entrer efficacement en compétition avec 1'EGF pour la fixation sur les récepteurs.

L'AR est une protéine monomère qui nécessite des ponts disulfure intracaténaires pour son activité, qui ne requiert pas de glycosylation pour ses activités biologiques, qui est stable en milieu modérément acide ou alcalin et qui est stable lors d'un traitement thermique à 56°C pendant 30 minutes. L'AR perd son activité biologique complète lorsqu'elle est réduite, lorsqu'elle est chauffée à 100°C pendant 5 minutes, lorsqu'elle est soumise à la digestion par la trypsine, 1'endopeptidase Lys-C, 1'endopeptidase ArG et 1'endopeptidase Glu.

La coupure protéolytique au moyen de la 28 phospholipase D semble convertir l‘AR en un ou des fragments actifs ayant des poids moléculaires relatifs d'environ 5.600, comme l'indique l'analyse SDS-PAGE. Les fragments actifs de l'AR entrent dans le cadre de l'invention et sont envisagés plus en détail à la section 5.5. ci-après.

L'AR a de puissants effets antiprolifératifs in vitro sur diverses lignées de cellules cancéreuses humaines d'origine épithéliale. Par exemple, l'AR inhibe effectivement la synthèse de 1'ADN par les cellules du carcinome épidermique de la vulve A431, de l'adénocarcinome mammaire HTB 132, du carcinome épidermoïde cervical CRL 1550, de l'adénome papillaire ovarien HTB 75, du tératocarcinome ovarien HTB 1572 et de l'adénocarcinome mammaire HTB 26. Une inhibition de 50% de la synthèse de l'ADN est observée sur les cellules A431 traitées au moyen d'AR 0,13nM.

Les cellules normales NRK-SA6 du rein de rat ne forment d'ordinaire pas de colonies sur gélose molle. Toutefois, la combinaison de l'EGF exogène et du TGF ß ajoutée au milieu de culture de ces cellules induit une croissance indépendante de l'ancrage, ce qui indique un phénotype transformé. Une combinaison d'AR exogène et de TGF ß induit aussi la croissance indépendante de l'ancrage des cellules NRK-SA6, mais à un degré moindre (voir tableau VI), ce qui apporte une preuve directe que l'AR et l'EGF sont fonctionnellement apparentés.

' L'action synergique de l'AR avec le TGF$ implique fortement l'AR comme important facteur de régulation de la croissance cellulaire. Par conséquent, la présente invention procure des outils de recherche antérieurement inacessibles pour rechercher le passé complexe et récent de la régulation normale de la croissance cellulaire et la perte caractéristique de 29 régulation de la croissance chez les cellules néoplasiques.

L'AR induit également la prolifération des fibroblastes du prépuce humain (Tableau IV). Un doublement de la synthèse de l'ADN par ces cellules a été observé à une concentration en AR environ 50pM. Une stimulation maximale jusqu1 à environ six foix apparaît pour environ 5nM.

Le mécanisme par lequel l'AR amène la prolifération ou l'inhibition de la croissance cellulaire n'est pas connu. Néanmoins, les études préliminaires visant à caractériser la fixation de l'AR sur les récepteurs suggèrent que l'AR peut avoir un récepteur spécifique. L'AR entre en compétition avec l'EGF pour la fixation sur les récepteurs de l'EGF et peut entrer en compétition aussi avec l'EGF pour d'autres récepteurs communs, y compris peut-être le récepteur spécifique de l'AR lui-même. Il est connu que le ligand formant la liaison avec le récepteur de l'EGF amorce un signal de stimulation de la croissance, en partie, en activant l'activité de thyrosine kinase. La fixation de l'AR sur les récepteurs de l'EGF peut de même amorcer une réponse proliférative ou, réciproquement, peut bloquer l'initiation d'un signal prolifératif en limitant le nombre des récepteurs de l'EGF disponibles pour fixer l'EGF ou d'autres ligands engendrant le signal.

En variante, un autre mécanisme par lequel l'AR inhibe la croissance cellulaire est possible et est suggéré par les données rassemblées au tableau I. Quatres clones de la lignée de cellules A431, qui ont des sites de fixation de l'EGF en nombre variable par cellule, ont fait l'objet d'un.test de la sensibilité à l'activité inhibitrice de l'AR. L'absence observée de corrélation entre la sensibilité à l’AR et le nombre 30 des sites de fixation de l'EGF par cellule suggère que le signal inhibiteur de la croissance engendré par l'AR est initié par un événement de fixation sur un récepteur qui n'implique pas le récepteur de l'EGF. Un tel événement peut antagoniser les signaux de prolifération de croissance engendrés par d'autres facteurs de croissance comme, par exemple, TGF Ainsi, l'AR peut exercer son effet antiprolifératif en bloquant spécifiquement une réponse mitogène de la cellule à TGF ou à d'autres facteurs de croissance autocrines.

L'AR est une protéine extrêmement hydrophile dont la séquence des acides aminés engendre un profil d’hydropathie unique ayant peu de simulitude avec les profils des autres protéines de la famille EGF (Fig. 11). L'AR est une protéine basique ayant un PI de 7,6 à 8,0.

5.4.1. Caractérisation de l'induction de l'AR par le TP A.

Le TPA induit une réponse diversifiée chez les cellules, notamment des modifications de la morphologie cellulaire, une prolifération et une différenciation cellulaires, un transport membranaire, des interactions récepteur-ligand, une phosphorylation des protéines et un métabolisme des phospholipides. La protéine kinase C (PKC) est une protéine kinase dépendant de Ca2+ et des phospholipides, qui fonctionne comme récepteur du TPA. La fixation du TPA sur PKC conduit à la phosphorylation de nombreux substrats, notamment les récepteurs des facteurs de croissance, les protéines du cytosquelette et les protéines régulatrices transactivantes.

Le cAMP est une autre protéine régulatrice qui exerce divers effets sur les cellules, principalement â 1'intervention de la protéine kinase A dépendante du 31 cAMP. Les taux intracellulaires de cAMP sont régulés par une combinaison d'activation à médiation par récepteur et d'inhibition de l'adénylate cyclase. Diverse études montrent que l'expression d'un gène induite par le TPA et le cAMP peut converger en un ^ trajet commun. Pour étudier la régulation de l'expression du gène AR, la Demanderesse a choisi d'observer l'effet de divers activateurs ou inhibiteurs de ces deux trajets régulateurs sur la production de l'ARN spécifique de l'AR dans des cellules MCF-7.

La forsholine est un agent qui active l'adénylate cyclase et conduit à une augmentation du cAMP intracellulaire. Administrée à des cellules MCF-7 à 25jjJA pendant 4 heures, elle induit une stimulation marquée du mARN de l'AR, ce qui suggère que les trajets par le cAMP jouent aussi un rôle dans la régulation de l'expression de l'AR.

5.5. Dérivés, analogues et peptides apparentés à 1'amphiréguline.

La production et l'utilisation de dérivés, analogues et peptides apparentés à l'AR sont également envisagées et entrent dans le cadre de l'invention. Ces dérivés, analogues et peptides, qui manifestent une activité modulatrice de la croissance, peuvent trouver des applications dans le diagnostic, le pronostic et le traitement d'une grande variété d'affections néoplasiques. Ces dérivés, analogues ou peptides peuvent avoir des activités biologiques accrues ou affaiblies en comparaison de l'AR native et/ou peuvent augmenter ou limiter la variété des cellules sensibles à l'effet de l'AR comme régulateur de croissance tout en restant dans le cadre de l'invention. De même, la production et l'utilisation de dérivés, analogues et peptides apparentés à l'AR qui manifestent une activité accrue Ou diminuée de stimulation de la croissance 32 et/ou qui augmentent ou limitent la variété des cellules sensibles à l'activité stimulatrice de croissance par l'AR, peuvent trouver d'utiles applications, notamment, mais non limitativement, dans le traitement des plaies et des brûlures.

Les dérivés, analogues et peptides apparentés à l'AR faisant l'objet de l'invention peuvent être produits suivant différents moyens connus. Les modes opératoires et manipulations au niveau génétique et au niveau des protéines entrent dans le cadre de la présente invention.

Au niveau des protéines, de nombreuses modifications chimiques pourraient être exploitées pour produire des dérivés, analogues ou peptides analogues à l'AR suivant des techniques connues, notamment, mais non limitativement, la coupure chimique spécifique par des endopeptidases (par exemple le bromure de cyanogène, la trypsine, la chimotrypsine, la protéase V8 et analogues) ou des exopeptidases, l'acétylation, la formylation, l'oxydation, etc.

5.6. Production d'anticorps antiamphiréguline.

Il entre aussi dans le cadre de l'invention de produire des anticorps polyclonaux et monoclonaux qui reconnaissent 1'anphiréguline et les protéines apparentées.

On connaît différentes techniques qui peuvent être appliquées à la production d'anticorps polyclonaux pour les épitopes de l'AR. Pour produire ces anticorps, différents hôtes animaux peuvent être immunisés par injection de la protéine AR ou de d'un AR synthétique, notamment, mais non limitativement, les lapins, souris, rats, etc. Différents adjuvants peuvent être utilisés pour augmenter la réponse d'immunité suivant 1'espèce à laquelle appartient l'hôte, notamment, mais non limitativement, de l'adjuvant (complet ou imcomplet) de 33

Freund, des gels minéraux tels que l'hydroxyde d'aluminium, des substances tensioactives telles que la lysolécithine et les polyols Pluronic, des agents polyanioniques, des protides, des émulsions huileuses, de 1'hémocyanine d'arapède, du dinitrophénol et des adjuvants d'utilité potentielle pour l'homme, comme le BCG (Bacille Calmette-Guerin) et Corynebacterium parvum.

Un anticorps monoclonal pour un épitope de l'AR peut être préparé en appliquant une technique quelconque qui assure la production des molécules de l'anticorps par des lignées de cellules immortelles en culture. Ce sont, non limitativement, la technique de l'hybridome décrite à l'origine par Köhler et Milstein (1975, Nature 256, 49 à 497), la technique plus récente de l'hybridome des cellules B humaines (Kosbor et collaborateurs, 1983, Immunology Today 4:72) et la technique de l'hybridome EBV (Cole et collaborateurs, 1985, Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., pages 77 à 96).

Des fragments de l'anticorps, qui contiennent 1'iodiotype de la molécule, pourraient être produits suivant des techniques connues. Par exemple, de tels fragments sont, non limitativement, le fragment F(ab')2 qui peut être produit par digestion de la molécule de l'anticorps dans de la pepsine; les fragments Fab' qui peuvent être produits en réduisant les ponts disulfure du fragment F(ab')2 et les deux Fab ou fragments de Fab qui peuvent être produits en faisant réagir la molécule de 11 anticorps avec de la papaïne et un agent réducteur.

Les anticoprs contre 1'AR peuvent trouver leurs applications dans la détection qualitative et quantitative de l'AR à maturité ainsi que de ses précurseurs et de ses sous-composants, dans la purification des protéines AR par affinité et aussi 34 dans l'élucidation de la biosynthèse, du métabolisme et de la fonction de l'AR. Les anticorps contre l'AR peuvent être utiles aussi comme agents de diagnostic et de traitement.

5.7. Utilisations de l'amphiréquline.

Le caractère bifonctionnel de 1'amphiréguline lui ouvre une grande variété d'applications in vitro et in vivo. Tout composé qui contient de l'AR ou bien les fragments et dérivés de celle-ci qui manifestent une activité inhibitrice de la croissance et/ou stimulatrice de la croissance, tant isolément que conjointement avec d'autres facteurs inhibiteurs ou agents immunomodulatoirs de la croissance qui sont biologiquement actifs, peuvent s'utiliser pour l'application du procédé de l'invention.

La localisation du gène AR dans une région impliquée dans la différenciation des lymphocytes suggère que l'AR peut jouer un rôle dans le développement des cellules hématopoïétiques, dans l'activation et dans l'immunosuppression. Cette fonction est également confirmée par 1'homologie entre la région AR3 non traduite de l'AR et les régions semblables de diverses autres cytokines.

Les composés de l'invention peuvent être utilisés pour la modulation de 1'angiogenèse, de la résorption osseuse, de la réponse immunitaire et des fonctions synaptiques et effectrices neuronales. L'AR peut être utilisée aussi pour moduler la cascade de l'acide arachidonique. L'oxydation enzymatique de 1'acide arachidonique conduit à une multitude de produits importants téls que les prostaglandines, les thromboxanes, les prostacyclines et les leucotriènes. Ces produits sont des agents ubiquitaires extrêmement puissants ayant de nombreux effets physiologiques y compris, par exemple, la contraction musculaire, 35 l'agrégation plaquettaire, la migration leucocytaire et la sécrétion gastrique. L'AR, les molécules apparentées à l'AR et leurs compositions peuvent être spécialement utiles pour le traitement des plaies, de même que pour le diagnostic et le traitement des cancers.

5.7.1. Traitement des plaies.

L'AR peut être utilisée dans un procédé pour traiter les plaies, comme les plaies cutanées, les plaies de la cornée et divers autres ruptures de l'épithélium ou du stroma, comme les ulcères chroniques, les brûlures, les incisions chirurgicales, les plaies traumatiques et les lésions aux organes creux garnis d'un épithélium, comme l'oesophage, l'estomac, l'intestin grêle et le côlon, la bouche et le tractus génito-urinaire. Le procédé est fondé sur l'application topique d'une composition de traitement contenant de l'AR dans un excipient physiologiquement acceptable.

Les compositions de la présente invention peuvent être utilisées pour traiter une grande variété de plaies, notamment en substance toutes les plaies cutanées, les plaies de la cornée et les lésions aux organes creux garnis d'un épithélium. Les plaies se prêtant à un tel traitement sont notamment celles résultant de traumatismes tels que les brûlures, abrasions, entailles et analogues, de même que les opérations chirurgicales, comme les incisions • chirurgicales et les greffes de peau. D'autres états susceptibles d'un traitement au moyen des compositions de la présente invention sont notamment les états chroniques, comme les ulcères chroniques, les ulcères diabétiques et autres états échappant à la cicatrisation (trophique).

L'AR peut être incorporée à des excipients physiologiquement acceptables pour l'application à 36 L’endroit affecté. La nature des excipients peut varier "beaucoup et dépend de l'endroit d'application envisagé. Pour l'application sur la peau, une base de crème ou d'onguent est habituellement préférée; des bases appropriées sont notamment la lanoline, le Silvadene (Marion) (en particulier pour le traitement des brûlures), 1'Aquaphor (Duke Laboratories, South Norwalk, Connecticut) et analogues. Si la chose est souhaitée, il est possible d'incorporer des compositions d'AR à des bandages et autres pansements pour assurer une exposition continue de la plaie au peptide. Les applications par aérosol peuvent se révéler utiles aussi.

La concentration de l'AR dans la composition de traitement n'est pas critique, mais doit être suffisante pour induire la prolifération des cellules épithéliales. Les compositions peuvent être appliquées topiquement à l'endroit affecté, par exemple comme collyre dans l'oeil ou bien à l'état de crèmes, pommades ou lotions sur la peau. Dans le cas de l'oeil, un traitement fréquent est souhaitable et est habituellement effectué à intervalles de 4 heures sinon moins. Sur la peau, il est souhaitable de maintenir sans interruption la composition de traitement au contact de la région affectée pendant la guérison, avec des applications de la composition de traitement deux à quatre fois par jour ou encore plus fréquemment,

La quantité utilisée du polypeptide de l'invention varie avec le mode d'administration, le recours à d'autres composés actifs et d'autres facteurs semblables et situe, en général, dans l'intervalle d'environ 1 à 100 microgrammes. Le polypeptide de l'invention peut être utilisé dans un excipient physiologiquement acceptable, comme de la solution physiologique salée, de la solution physiologique salée 37 tamponnée au phosphate, etc. La quantité de composé qui est utilisée est déterminée par voie empirique sur la base de la réponse des cellules in vitro et de la réponse des animaux d'expérience aux polypeptides de l'invention ou aux compositions les contenant.

Les dérivés de l'AR peuvent être utilisés isolément ou conjointement avec d'autres facteurs, inhibiteurs ou immunomodulateurs de la croissance.

5.7.2. Diagnostic et traitement des affections néoplasiques.

Les compositions de la présente invention peuvent être utiles pour le diagnostic, le pronostic et le traitement d'une large variété d'affections néoplasiques.

Un grand nombre d'applications diagnostiques de l'AR et des molécules apparentées est envisagé. Dans la pratique de l'invention, les polypeptides peuvent être munis d'un marqueur, comme un radio-isotope, une enzyme, un agent fluorescent, un agent chimiluminescent, un fragment d'enzyme, une particule, etc. Ces composés peuvent être utilisés pour titrer le nombre des récepteurs pour l'AR sur une cellule. L'identification des récepteurs pour l'AR est une indication de la sensibilité potentielle de la cellule aux effets biologiques de l'AR et des molécules apparentées. L'AR, les molécules apparentées a l'AR et/ou les anticorps contre celles-ci peuvent être utilisés dans des dosages compétitifs pour détecter l'AR dans les milieux, en particulier les milieux physiologiques. De nombreuses épreuves diagnostiques connues sont applicables.

La présence de l'AR et les teneurs en AR dans les liquides et tissus de l'organisme peuvent être en relation directe ou inverse avec la présence de certains cancers et leur dissémination. Les épreuves 38 permettant de détecter et/ou mesurer quantitativement l'AR peuvent trouver leur application dans le diagnostic et le pronostic du cancer. (Voir section 5.6. ci-dessus).

La présente invention concerne aussi la détection du mARN de l'AR. Les dosages qui mettent en jeu des sondes d'acides nucléiques pour détecter les séquences comprenant tout ou partie d'une séquence de gène connue sont bien connus et applicables. Les teneurs en mARN de l'AR peuvent révéler des affections néoplasiques naissantes ou existantes et, par conséquent, les dosages, qui permettent une mesure quantitative des taux de mARN de l'AR consituent un outil de diagnostic précieux.

De plus, les cellules malignes qui expriment le récepteur de l'AR peuvent être détectées en utilisant de l'AR ou des molécules apparentées à l'AR qui sont marquées, lors d'un test de fixation sur les récepteurs, ou bien à l'aide des anticorps contre le récepteur de l'AR lui-même. Les cellules peuvent être discernées en fonction de la présence et de la densité des récepteurs de l'AR, ce qui constitue un moyen pour prévoir la sensibilité de ces cellules aux activités biologiques de l'AR.

L'AR peut être utilisée comme composé antinéoplasique. Pour une application in vivo, les compositions de l'invention peuvent être administrées par diverses voies, notamment, mais non limitativement, l'injection, la perfusion, la voie topique, la voie parentérale, etc. L'administration peut être faite dans tout excipient physiologiquement acceptable, notamment de la solution physiologique salée tamponnée au phosphate, de la solution physiologique salée, de l'eau stérilisée, etc. L'AR et les molécules apparentées peuvent être encapsulées aussi dans des liposomes et 39 peuvent être conjuguées à des anticorps qui identifient la tumeur ou les antigènes spécifiques de la cellule et s'y fixent de manière à constituer un moyen de "cibler" les compositions de l'invention.

L'AR peut être utile in vivo pour induire une différenciation terminale des cellules tumorales. Ces cellules se sont écartées du cours ordinaire de la différenciation cellulaire caractéristique des cellules normales et sont suceptibles d'une prolifération ininterrompue. Au contraire, les cellules normales se différencient en cellules qui sont incapables, dans la plupart des circonstantes, d'une nouvelle division cellulaire. Par conséquent, l'aptitude de l'AR à réactiver la différenciation des cellules normales dans les tumeurs et, en dernier recours, d'arrêter la poursuite de la croissance des tumeurs, peut trouver une application précieuse dans le traitement des tumeurs.

L'AR et les dérivés apparentés, analogues et leurs peptides peuvent être utilisés seuls ou avec au moins un autre composé antiprolifératif, notamment, par exemple, un interféron, le TGF ßl, TGF ß2, le facteur ß de nécrose tumorale, le facteur o( de nécrose tumorale, etc. pour le traitement des carcinomes sensibles aux hormones qui peuvent attaquer une grande variété d'organes, comme les poumons, le sein, la prostate, le côlon, etc. Les carcinomes sensibles aux hormones peuvent aussi être traités en induisant la production de l'AR dans les cellules du carcinome. Ces inducteurs sont notamment, mais non limitativement, des oestrogènes, comme le 17-ß estradiol, des composés ayant une activité oestrogène et des composés ayant une activité antioestrogène, comme le Tamoxifen. Toute combinaison de ces composés peut être utilisée aussi comme agent inducteur.

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Les composés de 1'invention peuvent être utilisés in vitro pour inhiber la croissance de cellules ou lignées de cellules sensibles à l'AR plutôt que de cellules qui ne sont pas sensibles. De cette façon, des mélanges hétérogènes ou des lignées ; cellulaires peuvent être débarrassés des cellules indésirables au cas où les cellules indésirables sont sensibles à l'activité inhibitrice de la croissance manifestée par l'AR. Par exemple, les composés de l'invention peuvent être utilisés in vitro pour supprimer les cellules malignes de la moelle en vue des transplantations autologues de moelle et pour supprimer ou inhiber la prolifération des cellules malignes dans le sang avant la retransfusion.

La concentration la plus efficace de l'AR pour inhiber la prolifération de cellules d'une variété donnée peut être déterminée en ajoutant différentes concentrations de l’AR aux cellules tumorales en question et en surveillant le degré auquel la prolifération cellulaire est inhibée. La concentration la plus efficace des inducteurs pris isolément et/ou des combinaisons d'inducteurs peut être évaluée par surveillance de la production de l'AR dans les cellules carcinomateuses.

6. Exemple ; Production, purification et caracté risation de 11amphiréguline humaine.

Les sous-sections ci-après décrivent la purification et la caractérisation de 1'amphiréguline produite par des cellules MCF-7 traitées au moyen de TPA.

6.1. Matériels et procédés.

Les procédés ci-après ont été appliqués pour induire dans des cellules MCF-7 la synthèse de l'AR pour préparer et caractériser de l'AR sensiblement pure.

41 6.1.1. Electrophorèse sur gel SDS-polyacrylamide.

Les protéines ont été analysées sur des plaques de gel SDS-PAGE (normal ou mini du système Bio-Rad) comme décrit (Laemmli, 1970, Nature 227 : 680 à 685), et ont été détectés par coloration à l'argent (Merril et al., 1981, Science 211 : 1487 à 1439).

6.1.2. Focalisation isoélectrique.

On a exécuté la focalisation isoélectrique essentiellement comme décrit dans la notice technique Isolab pour les gels de focalisation isoélectrique Résolve. En résumé, les échantillons ont été appliqués sur des gels d'agarose prémoulés (85 mm x 100 mm, pH 3 à 10) et ont été focalisés à l'aide d'un appareil de focalisation isoélectrique Résolve modèle FR-2500 en utilisant une alimentation d'électrophorèse commandée par ordinateur Bio-Rad modèle 3000 Xi. Des étalons IEF Bio-Rad ont été focalisés parallèlement aux échantillons et colorés et le gel sec a été exposé à du film Kodak X-Omat AR avec un éclairage Cronex DuPont et un écran intensificateur.

6.1.3. Iodation des protéines.

Les protéines ont été marquées au moyen de 125i suivant le procédé à la chloramine T (Barridge, 1978, Methods Enzymol. 50 : 54 à 65).

6.1.4. Détermination des protéines.

Les concentrations des protéines ont été déterminées par absorption à diverses longueurs d'ondes (210 à 280 nm). Les procédés de Lowry (Lowry et al., 1951, J. Biol. Chem. 193 : 265 à 275) et Bradford (1976, Anal. Biochem. 72 : 248 à 252) ont été utilisés avec un étalon d'albumine de sérum de boeuf (BSA).

6.1.5. Dosage de la fixation de 125i-EGF.

Les dosages de fixation ont été exécutés soit dans des plaques de culture de tissu à 48 cupules lorsque des cellules A431 fraîchement cultivées et/ou 42 fixées au formol ont été utilisées comme décrit (Carpenter et al.f 1979, J. Biol. Chem. 254 , 4484 à 4891; Shoyab et al., 1979, Nature 279 : 387 à 391;

DeLarco et al., 1980, J. Biol. Chem. 255 : 3685 à 3690), soit en immobilisant des membranes plasmiques sur des plaques en poly(chlorure de vinyle) à 98 cupules comme décrit (Kimball et Warren, 1984,

Biochem. Biophys. Acta 771 : 82 à 88).

6.2. Production de 11amphiréguline.

6.2.1. Collecte du milieu conditionné des cellules MCF-7 traitées par TPA.

On a cultivé des cellules MCF-7 dans des fioles pour culture de tissu Corning T 150 dans un volume total de 25 ml de 50% d'IMDM (milieu de Dulbecco modifié d'Iscove) + 50% de DMEM contenant 0,6yjLg/ml d'insuline et 15% de sérum foetal bovin inactivé par la chaleur (milieu complet pour MCF-7). On a introduit environ 1 x 10^ cellules dans chaque flacon et on les a incubées à 37*C avec 5% de CO2. Au jour six, on a recueilli tout le milieu et introduit dans chaque flacon 20 ml de milieu complet pour MCF-7 frais contenant 100 ng/ml de TPA. On a recueilli le milieu 48 heures plus tard et rincé chaque flacon avec 15 ml de 50% de IDMM + 50% de DMEM (milieu exempt de sérum) et on a introduit 25 ml de milieu frais exempt de sérum dans chaque flacon avant de mener l'incubation à 37eC avec 5% de CO2· Ob a recueilli quatre jours plus tard le milieu exempt de sérum conditionné, on l'a centrifugé pour séparer les débris et on l'a conservé à -20°C. On a introduit à nouveau 25 ml de milieu exempt de sérum dans les flacons et on a recueilli tous les trois ou quatre jours le milieu exempt de sérum conditionné. On a dosé sur une aliquote de milieu conditionné de chaque récolte l'activité inhibitrice de croissance (GIA) sur des cellules A431 du carcinome 43 épidermoïde humain. Habituellement, on a recueilli sur chaque lot de cellules MCF-7 traitées par TPA trois à quatre récoltes de milieu conditionné.

6.2.2. Isolement de l'AR brute.

On a décongelé environ 4500 ml de milieu conditionné qu'on a centrifugé à 4°C pendant 15 minutes à 3500 tours par minute. On a concentré le surnageant dans un appareil de concentration Amicon de 2 litres au moyen d'une membrane YM10 (Amicon) à 4°C. Lorsque le volume retenu est arrivé à environ 200 ml, on a ajouté 1000 ml d'eau Mili-E-Q froide et on a reconcentré le mélange jusqu'à 200 ml.

On a retiré le concentré et on l'a transféré dans une fiole de centrifugation Corning de 250 ml prérefroidie. Sous agitation, on a ajouté lentement de l'acide acétique concentré jusqu'à une concentration finale IM de l'acide acétique. On a laissé reposer le mélange pendant 1 heure à 4°C et on l'a centrifugé pendant 20 minutes à 40.000 g à 4°C dans une centrifugeuse Sorval RC-5B. On a recueilli le surnageant et on l'a conservé à 4°C. On a mis le culot en suspension dans 30 ml d'acide acétique IM et on l'a recentrifugé comme décrit ci-dessus. On a une nouvelle fois recueilli le surnageant avec prudence et on l'a rassemblé en pool avec le premier surnageant, puis on a dialysé le tout contre 17 litres d'acide acétique 0,1M dans du tube de dialyse Spectrapore n° 3 (coupure de poids moléculaire à environ 3000). On a changé trois fois le tampon de dialyse au cours de deux jours. On a lyophilisé le produit retenu. On a recueilli le produit sec, on l'a rassemblé en pool, puis pesé et conservé à -20°C jusqu'à utilisation ultérieure. Cette matière est appelée ici poudre brute.

44 6.3. Purification de 1'amphiréquline.

6.3.1. Chromatographie liquide avec inversion de phase.

On a mis 950 mg de poudre brute (provenant d'environ 9 litres de milieu conditionné exempt de sérum) en suspension dans 300 ml de TFA à 0,1% (acide trifluoroacétique) et on a centrifugé le tout pendant 20 minutes à 7000 g. On a recueilli soigneusement le surnageant et on l'a déposé sur une colonne de C18 préparative (2,54 cm x 27 cm; 125-105 micromètres; Waters) amenée à l'équilibre avec du TFA à 0,1% dans de l'eau. On a mis le support Chromatograph ique en suspension dans de 1 ’acétonitrile (MeCN) avec 0,1% de TFA et on a versé la dispersion dans une colonne d'un diamètre de 2,54 cm, puis on a lavé la colonne avec 400 ml de MeCN avec 0,1% de TFA, après quoi on l'a amenée à l'équilibre avec 600 ml de TFA à 0,1% dans de l'eau. Avec un débit de 4 ml par minute, on a exécuté la chromatographie à la température ambiante. On a lavé la colonne avec 650 ml de TFA à 0,1% dans de l'eau. On a recueilli ensemble la fraction de tête et les fractions de lavage. On a ensuite exécuté une élution pas à pas de la façon suivante î (1) 650 ml de MeCN 20%/H2O avec 0,1% de TFA, (2) 650 ml de MeCNC 40%/H20 avec 0,1% de TFA, (3) 650 ml de MeCN 60%/H2O avec 0,1% de TFA et (4) 650 ml de MeCN 100% avec 0,1% de TFA. On a prélevé une aliquote sur chaque fraction et on en a vérifié le GIA. Environ 77% de l'activité totale de GIA a été observée dans les fractions de tête et de lavage.

On a injecté des fractions de têtes et de lavage de façon isocratique dans une colonne Partisil 10 ODS-3 préparative (10 micromètres, 2,2 cm x 50 cm, Whatman) raccordée à un système de chromatographie liquide à haute performance (HPLC) (Waters). On a réglé le débit à 4 ml par minute. Après admission de l'échantillon sur la colonne, on a lavé 45 celle-ci avec 250 ml de TFA à 0,1% dans de l'eau. On a entretenu un gradient linéaire entre le solvant primaire, du TFA à 0,1% dans de l'eau, et le solvant secondaire, de 1'acétonitrile contenant 0,1% de TFA, les conditions de gradient étant : 0 à 15% en 10 minutes, 15 à 15% en 30 minutes, 15 à 25% en 150 minutes, 25 à 65% en 5 minutes et 65 à 100% en 10 minutes. Tous les solvants étaient de qualité HPLC. On a recueilli des fractions de 14 ml et dosé le GIA dans des aliquotes de chaque fraction. On a observé deux larges pics d'activité (Fig. 1). On a davantage purifié et caractérisé le pic élué en premier lieu (élué entre 20 et 23% d'acétonitrile).

On a rassemblé en pool les fractions 47 à 62. On a ajouté 224 ml de TFA à 0,1% dans de l'eau à la fraction ainsi constituée. On a injecté le mélange de façon isocratique sur une colonne jiA.-Bondapack-C18 semi-préparative (7,8 mm x 300 mm, Wauters) à un débit de 2 ml par minute à la température ambiante. Les conditions du gradient linéaire étaient : 0 à 17% en 10 minutes, 17 à 17% en 30 minutes, 17 à 25% en 320 minutes et 25 à 100% en 40 minutes. Le débit était de 1 ml par minute pendant le gradient, les fractions collectées étant de 4 ml. On a prélevé des aliquotes pour le dosage du GIA. On a observé deux pics majeurs d'activité élués à des concentrations en acétonitrile d'environ 20% et 21%, respectivement (Fig. 2).

On a rassemblé en pool les fractions 49 à = 53. On a ajouté 20 ml de TFA à 0,1% à la fraction ainsi constituée. On a appliqué le mélange de façon isocratique sur une colonne ^u.-Bondapack-C18 (3,9 mm x 300 mm, Wauters) au débit de 1 ml par minute à la température ambiante. Les conditions de gradient étaient 0 à 18% en 10 minutes, 18 à 18% en 30 minutes, 18 â 25% en 280 minutes et 25 à 100% en 20 minutes, le 46 débit étant de 0,4 ml par minute et les fractions collectées étant de 2 ml. La majeure partie de l'activité a émergé de la colonne à une concentration en acétonitrile d'environ 21,5% (Fig. 3A). On a rassemblé en pool les fractions 54 à 59 (Fig. 2) et on les a chromatographiées exactement comme décrit ci-dessus à propos de la Fig. 3A. La majeure partie de 1'activité s'est éluée de la colonne à une concentration en acétonitrile d'environ 22,2% (Fig. 3B).

6.3.2. Chromatographie par perméation de gel.

On a concentré individuellement les fractions 35 à 38 (Fig. 3A) jusqu'à environ 70 yiAlitres au moyen d'un appareil de concentration Speed-Vac (Savant), dans lequel on a introduit un volume égal d*acétonitrile contenant 0,1% de TFA. On a injecté cet échantillon de 140 yuLLitres sur deux colonnes Bio-sil TSK-250 (chacune de 7,5 mm x 300 mm, Bio-rad) montées en tandem. On a effectué 1'élution de façon isocratique avec une phase mobile d*acétonitrile 50%/eau avec 0,1% de TFA à la température ambiante. Le débit était de 0,4 ml par minute avec une vitesse d'enregistrement de 0,25 cm par minute et on a recueilli des fractions de 0,4 ml sur des aliquotes desquelles on a dosé le GIA. Les profils chromatographiques des fractions 35, 36 et 37 (Fig. 3A) constituent les Fig. 4A, 4B et 4C, respectivement.

On a rassemblé en pool les fractions 41 et 42 (Fig. 3B ) et on les a concentrées à 70 microlitres, puis on les a soumises à la chromatographie par perméation de gel comme décrit ci-dessus. Le profil -chromatographique est indiqué à la Fig. 4D.

i 47 6.4. Mesures de la croissance cellulaire.

6.4.1. Mesure de la modulation de la croissance cellulaire d'après l'incorporation de la ^-^^I-désoxy-uridine dans l'ADN.

On a exécuté les dosages dans des plaques à 96 cupules plates (Falcon 3072). On a utilisé des cellules du carcinome épidermoïde humain de la vulve (A431) comme cellules indicatrices de l'activité inhibitrice de la croissance (GIA) et des fibroblastes de prépuce humain (Sadamoto) comme cellules indicatrices de l'activité stimulatrice de la croissance (GSA). On a introduit dans toutes les cupules, à l'exception des cupules périphériques, 3,5 x 10^ cellules dans 50 ^litres de DMEM additionné de 5% de sérum foetal bovin (FBS) inactivé par la chaleur, de pénicilline/streptomycine (PS) et de glutamine (milieu de test). On a introduit 50 microlitres de PBS dans les cupules périphériques. On a introduit dans chaque cupule, 3 heures plus tard, 50 microlitres d'échantillon de test dans le milieu de test, les cupules de contrôle ne recevant que 50 microlitres de milieu de test. On a utilisé trois cupules pour chaque concentration de l'échantillon de test. On a incubé des plaques à 37 °C pendant 2 à 3 jours. Ensuite, on introduit dans chaque cupule 100 microlitres d'une solution de ^-^^I-iodo-2 désoxyuridine (4 Ci/mg - 0,5 mCi/ml (2 microlitres par ml dans du milieu de test)) et on a incubé les plaques à 37°C. Après 4 à 6 heures, on a aspiré le milieu hors des cupules qu'on a lavées une fois avec 200 microlitres de PBS. On a introduit ensuite 200 microlitres de méthanol dans chaque cupule et on a incubé les plaques pendant 10 minutes à la température ambiante, puis on a éliminé le méthanol par aspiration. On a introduit dans chaque cupule 200 microlitres 48 d'hydroxyde de sodium IM et on a incubé les plaques pendant 30 minutes à 37°C. On a éliminé 1'hydroxyde de sodium avec des tampons Titerteh (Flow Labs). On a transféré les tampons dans des tubes en matière plastique de 12 mm x 75 mm pour déterminer avec un compteur gamma quantitativement 11 incorporation de la 125I-IUdR.

6.4.2. Mesure des colonies sur gélose molle.

On a introduit une couche de base de 0,5 ml de gélose à 0,5% (Agar Noble; Difco Laboratories, Detroit, Michigan) dans du DMEM contenant 10% de FBS inactivé par la chaleur dans des plaques pour culture de tissu Costar à 24 cupules. On a appliqué par-dessus la couche de base de gélose 0,5 ml de gélose à 0,3% contenant le même mélange de milieu et de FBS, 5 à 10 x 102 cellules de test, ainsi que les facteurs à examiner en diverses concentrations. On a incubé les plaques à 37 °C en atmosphère humide à 5% de CO2 dans de l'air et on les a réalimentées après 7 jours par addition de 0,5 ml de gélose à 0,3% contenant le même milieu et les mêmes concentrations de substances à examiner. On a dénombré les colonies non fixées et non colorées et déterminé le nombre des colonies de plus de 20 cellules entre les jours 7 et 14.

6.4.3. Mesure de l'inhibition de la croissance cellulaire.

On a étalé des cellules A431, à 2,1 x 10^ cellules par cupule dans 0, 3 ml de milieu (DMEM avec 10% FBS, P/S et glutamine), dans des plaques Costar à 24 cupules (environ 2 cm2 par cupule) et on les a incubées pendant 2 heures à 37°C. Ensuite, on a introduit dans chaque cupule des échantillons de test en diverses concentrations, en. deux exemplaires, dans 0,3 ml de milieu. On a introduit le milieu exempt de l'échantillon dans les cupules de contrôle. On a incubé 49 les plaques à 37°C pendant 72 heures. On a ensuite évacué le milieu par aspiration et lavé les cellules avec 1 ml de PBS par cupule, puis on a dégagé les cellules avec 0,5 ml de trypsine (0,5%)-EDTA (0,5 mM) et on les a comptées à l'aide d'un compteur de Coulter.

6.5. Analyse de la structure primaire de l'AR.

6.5.1. Réduction et S-pyridyléthylation.

On a séché de l'AR (20 à 30 microgrammes) dans des tubes de raicrocentrifugation en polypropylène de

1.5 ml, puis on l'a mise en suspension dans 100 microlitres d'urée 3M dans du TRIS.HCl, 0,05 M de pH 7,5. On a ajouté 4 microlitres de 2-mercaptoéthanol au mélange qu'on a agité et purgé à l'azote, puis incubé à 25°C. Après 2,5 heures, on a additionné le mélange de 4,5 microlitres de 4-vinylpyridine fraîchement distillé et on a purgé chaque tube à nouveau à l'azote avant 2 heures d'incubation à 25°C. On a acidifié le mélange de réaction juusqu'à pH 2,0 avec du TFA à 10%. On a purifié l'AR S-pyridyléthylêe par HPLC à inversion de phase sur une colonne yu.-Bondapak C18 (3,9 mm x 300 mm, Waters). On a augmenté linéairement la concentration en acétonitrile (1% par minute) pendant 55 minutes, le débit étant de 1 ml par minute et le solvant primaire étant du TFA à 0,1%. L'AR

S-pyridyléthylée (SPE-AR) s'est éluée à environ 26,5% d'acétonitrile, soit une concentration en acétonitrile supérieure d'environ 4% à celle pour l'AR non traitée.

6.5.2. Traitement par la N-glycanase.

On a séché de l'AR ou de l'AR S-pyridyléthylée (10 à 20 microgrammes) dans des tubes de centrifugation en polypropylène 1,5 ml, puis on l'a mise en suspension dans 80 microlitres de tampon au phosphate 0,1 M de pH

5.5 et additionnée de 10 à 20 microlitres de N-glycanase (0,25 unité par microlitre, Genzyme), après quoi on a incubé le mélange à 37°C avant d’ajouter 50 0,9 ml de TFA à 0,2% au mélange de réaction et d’injecter l'échantillon au débit de 1 ml par minute sur une colonne HPLC à inversion de phase RPSC ultrapore (4,6 mm x 75 mm, Altex) préalablement amenée à l'équilibre avec le solvant primaire qui est du TFA à 0,1%. De l'acétonitrile avec 0,1% de TFA était le solvant secondaire. On a augmenté la concentration en acétonitrile linéairement (0,4% par minute) pendant 85 minutes à la température ambiante. L’AR N-déglycosylée et l'AR N-déglycosylée S-pyridyléthylée se sont éluées à des concentrations en acétonitrile d'environ 16,5% et 20,5%, respectivement.

6.5.3. Coupure enzymatique de l'AR S-pyridyléthylé traité par la N-glycanase.

On a effectué la coupure avec 1'endopeptidase Lys-C dans 60 microlitres de tampon acide acétique-TRÏS 0,1M de pH 8,0, à 25°C pendant 16 heures, le rapport enzyme/substrat étant de 1 â 5 (en poids). On a effectué des digestions par 11endopeptidase Arg et la protéase V8 de S. aureus dans 80 microlitres de TRIS.HCl 0,05M, de pH 8,0 et de bicarbonate d'ammonium 0,1M, à 37°C pendant 16 heures, à nouveau avec un rapport enzyme/substrat de 1 à 5.

6.5.4. Coupure chimique.

Pour la coupure au reste méthionine par le CNBr, on a séché 5 microgrammes d'AR S-pyridyléthylée traitée par la N-glycanase dans des tubes de microcentrifugation en polypropylène de 1,5 ml, puis on a mis le composé en suspension dans 75 microlitres d'acide formique à 70% avant d'ajouter 25 microlitres de solution de CNBr (25 mg par ml dans HCOOH à 70%), de mélanger et de purger le tube à l'azote. On a exécuté la réaction pendant 22 heures à 25°C à l'obscurité. On a dilué le mélange de réaction jusqu 'à 1,1 ml avec de l'eau et on l'a porté à sec dans un appareil de 51 concentration Speed-Vac. On a rais l'échantillon séché en suspension dans 20 microlitres de 2-aminoéthanol et on l'a laissé reposer pendant 10 minutes à 22°C, avant de le sécher sous vide. On a mis le mélange en suspension dans 0,9 ml à TFA à 0,2%.

6.5.5. Isolement des peptides.

On a séparé les peptides sur une colonne HPLC à inversion de phase C8 (4,6 mm x 100 mm, Whatman) raccordée à un système HPLC (Waters). On a déposé l'échantillon acidifié (pH 2,0) sur une colonne amenée a l'équilibre avec du TFA à 0,1% (solvant primaire) au débit de 1 ml par minute et on a poursuivi le lavage de la colonne avec environ 15 ml de TFA à 0,1%. On a utilisé des gradients linéaires entre le solvant primaire et le solvant secondaire, à savoir de 1 ' acétonitrile avec 0,1% de TFA, les conditions de gradient étant : 0 à 50% en 125 minutes au débit de 0,5 ml par minute.

6.5.6. Analyse des acides aminés.

On a soumis les échantillons séchés à l'hydrolyse avec du HCl à point d'ébullition constant (5,7M, Pierce) contenant 1% (en poids) de phénol, sous pression réduite, dans un ballon d'hydrolyse en verre bouché au Téflon (Pierce), à 105°C pendant 16 heures. On a séché les produits d'hydrolyse dans un appareil de concentration Speed Vac (Savant Instruments) et on en a formé les dérivés avec 1'isothiocyanate de phényle pendant 20 minutes à la température ambiante. Par HPLC à inversion de phase sur une colonne C18 (4,5 mm x 250 mm, IBM) on a étudié les dérivés phénylthiocarbamyliques des acides aminés. On a entretenu le gradient linéaire entre le solvant primaire, à savoir de l'acétate de sodium 0,15M de pH

6,4 avec 0,05% de triéthylamine amené à pH 6,4 avec de l’acide acétique, et le solvant secondaire, à savoir de 52 l'acétonitrile à 60%, à un débit de 1 ml par minute à 38°C, 6.5.7. Détermination de la séquence des acides aminés.

On a déterminé les séquences peptidiques à l'aide d'un séquenceur à phase gazeuse Applied Biosystem modèle 475 comme décrit (Hewick et al., 1981, J. Biol. Chem. 256 : 7990 à 7997). On a exécuté trois cycles préalables de dégradation d'Edman avant d'appliquer l’échantillon, dans chaque essai. On a utilisé le TFA à 25% pour convertir les dérivés triazoliniques en acides aminés phénylthiohydantoînés. L'identification de ces derniers acides a été exécutée en suite continue sur un analyseur modèle 12 OA PTH (Applied Biosystem), comme décrit (Hunkapiller et Hood, 1983, Science 219 : 650 à 659).

6.5.8. Traitements divers.

On a utilisé pour les présentes expériences (tableau I) 50 à 100 unités d'AR soit semi pure (stade C18 à inversion de phase, semi préparatif) soit apparemment pure. La N-glycanase et 1O-glycanase ont été acquises chez Genzyme Corp., Boston et les autres enzymes chez Boehringer Mannheim Biochemicals ou chez Worthington Biochemicals. Les traitements ont été exécutés dans 50 à 200 microlitres d'un tampon convenable. On a utilisé les enzymes en excès, habituellement de 5 à 20% (en poids) de la concentration du substrat. Après les traitements, on a dosé le GIA dans les échantillons en éliminant les substances gênantes par divers moyens analytiques. Dans la plupart des cas, on a ajusté le pH de l'échantillon à environ 2 avec du TFA à 10%. On a déposé les échantillons sur une colonne RPSC C3 ultraporeuse à inversion de phase (4,6 mm χ-75 mm, Altex) amenée à l'équilibre avec du TFA à 0,1%. On a poursuivi le lavage de la colonne avec du solvant primaire, à savoir 53 du TFA à 0,1%. On a commencé ensuite l'élution avec de 1'acétonitrile contenant 0,1% de TFA comme solvant secondaire. Les conditions de gradient étaient : 0 à 50% pendant 0,2 minute et 50 à 50% pendant 19,8 minutes, le débit étant de 0,5 ml par minute et les fractions collectées étant de 2 ml. On a prélevé des aliquotes pour le dosage de GIA. L'activité AR s'est habituellement éluée dans la fraction 4.

6.6. Etudes de fixation de l'ADN.

On a exécuté comme décrit (Herick et Alberts, 1971, Methods in Enzymology, 21:198) la fixation de l'AR sur la cellulose-ADN natif de thymus de veau, l'ADN dénaturé de thymus de veau et la cellulose. On a réhydraté les celluloses (10 mg) dans 500 microlitres de tampon de chargement (Tris 20 mM, pH 7,4, 10% de glycérol, EDTA 1 mM, ß -mercaptoéthanol 1 mM, BSA à 100 microgrammes par ml et NaCl 50 mM). On a exécuté les réactions en double dans des tubes d'Eppendorf de 1,5 ml avec 300 microlitres de cellulose hydratée (volume tassé) lavée à cinq reprises avec du tampon de chargement. Ensuite, on a introduit dans chaque tube 0,2 ng de l^I-AR (activité spécifique de 425 microcuries par microgrammes) ou d'une autre protéine marquée au dans 250 micro litres de tampon de chargement. On a mélangé les échantillons et on les a incubés à 4eC pendant 20 minutes avec agitation périodique, puis on les a lavés à cinq reprises avec 200 microlitres de tampon de chargement pour chaque lavage. On a exécuté l'élution pas à pas avec du

NaCl 0,1M, 0,15M, 0,25M, 0,6M, IM et 2M dans du tampon de chargement (cinq fois avec 200 microlitres pour chaque concentration). On a défini la matière spécifiquement fixée comme étant celle éluée à une concentration à NaCl de 0,25M ou davantage, la matière éluée à une concentration en NaCl de 0,15M sinon moins 54 étant considérée comme fixée non spécifiquement.

6.7. Résultats.

6.7.1. Production de l'AR par des cellules MCF-7 traitées par TPA.

Les cellules MCF-7 cultivées sur un substrat plastique manifestent deux particularités épithélioïdes typiques ; les cellules sont petites et polygonales. Le TPA induit de profondes modifications morphologiques en proportion de la dose appliquée. Après le traitement par le TPA, les cellules MCF-7 perdent leur morphologie bien définie, deviennent rondes et s'étalent. Le TPA suscite, en fonction de la dose appliquée, une réduction du nombre des cellules et une augmentation du volume des cellules, par comparaison avec les cellules non traitées.

Le milieu exempt de sérum et conditionné provenant des cellules MCF-7 ne contenait aucune activité inhibitrice de croissance détectable pour les cellules A431. Néanmoins, les surnageants exempts de sérum séparés des cellules MCF-7 traitées par le TPA pendant deux à trois jours se sont révélés inhiber la prolifération des cellules du carcinome épidermoïde A431. L'induction optimale de l'activité inhibitrice a été observée entre 5 et 100 ng par ml de TPA. Même après élimination du TPA, les cellules MCF-7 traitées par le TPA ont sécrété cette activité dans du milieu exempt de sérum pendant au moins huit jours. Bien qu'une réduction de l'activité inhibitrice de la croissance ait été observée au cours du temps après la suppression du TPA, ces résultats indiquent une amphiréguline, dont l'expression est induite ou augmentée dans les cellules MCF-7 qui ont été traitées par du TPA.

55 6.7.2. Caractérisation initiale.

Le tableau I résume les effets de divers traitements physiques, chimiques et enzymatiques sur l'activité antiproliférative de l'amphirêguline. La GIA (activité inhibitrice de croissance) de l'amphirêguline est apparue résistante au traitement par l'acide acétique IM, 1'hydroxyde d'ammonium IM, l'urée 6M, le métaperiodate de sodium 0,01M le chauffage à 56°C pendant 30 minutes et au traitement par la neuraminidase, la N-glycanase, l'O-glycanase, la lipase et la phospholipase A2, C ou D. Toutefois, l'activité est sensible à un chauffage de 10 minutes à 100eC, à la réduction, à la réduction et à la réaction avec la 4-vinylpyridine, de même qu'à la digestion avec des protéinases telles que la trypsine, 1'endopeptidase Lys-C, 11endopeptidase Arg et 1'endopeptidase Glu (V- 8). Ces résultats suggèrent que l'amphirêguline est une protéine contenant des unités cystéine dans une ou des liaisons disulfure qui sont essentielles pour son activité biologique. Cette protéine peut contenir des unités d'oligosaccharides et/ou de lipides qui ne sont pas obligatoires pour l'activité biologique.

56

TABLEAU II

Effets de divers traitements sur la GIA de 1'amphiréguline

Traitement Résistance %

Acide acétique IM (2 h à 4°C) 102 NH4OH IM (2 h à 4°C) 97 56°C pendant 30 minutes 96 100° pendant 10 minutes 5

Urée 6M (2 h à 25°C) 82 2-Mercaptoéthanol 0,2M (2,5 h à 25°C) 6 2-Mercaptoéthanol + 4-vinylpyridine (2,5 h à 25°C) + (2 h à 25°C) 1 Métaperiodate de sodium (0,01M) (6h a 4°C, obscurité) 86 TPCK - trypsine (6h à 37°C) 3 TPCK-trypsine + inhibiteur de la trypsine de soya (6h à 37°C) 82

Inhibiteur de la trypsine de soya (6 h à 37°Ce) 109

Endopeptidase Lys-C (20 h à 25°C) 5

Endopepdidase Arg (16hà37°C) 4

Endopepdidase Glu (16 h à 37eC) 6

Neuraminidase (16 h à 37°C) 103 N-glycanase (16 h à 37°C) 90 O-glycanase (16 h à 37°C) 102

Neuraminidase + N-glycanase (16 h à 37°C) 94

Neuraminidase + O-glycanase (16 h à 37°C) 105

Phospholidase A2 (6h à 37°C) 82

Phospholidase C (6 h à 37°C) 95 57

Phospholidase D (6h à 37°C) 80

Lipase (6h à 37eC) 111 6.7.3. Purification de l'amphiréguline.

Un résumé de la purification de l'amphiréguline est présenté au tableau III. Une purification de 1842 fois avec un rendement de 5,1% a été obtenue pour la fraction TSK 250-1 et une purification de 2270 fois avec un rendement de 1,7% a été obtenue pour la fraction TSK 250-11. Ce procédé est reproductible. L'amphiréguline a été purifiée avec des résultats semblables à quatre occasions différentes. L'activité spécifique de l'amphiréguline purifiée se situe entre 2,6 et 3,4 x 106 unités par mg de protéine. L’amphiréguline purifiée de la colonne TSK 250-1 ayant une activité d'environ 3,0 x 106 a été utilisée pour des déterminations de structure et d'autres études biochimiques.

Note du tableau III.

Les détails sont donnés à la section 6.1.3. et ses sous-sections, ci-dessus. Une unité de GIA est la quantité de facteur requise pour inhiber de 50% l'incorporation de la 125I-désoxyuridine dans les cellules A431.

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59 6.7.4. Analyse de l'amphiréguline (AR) et de l'amphi-réguline S-pyridyléthylée (SPE-AR) par HPLC.

Des chromatogrammes par perméation de gel de l'AR et de la SPE-AR sur une colonne TSK 250 (7,5 mm x 500 mm, Biorad) constituent les Fig. 5A et 5B, respectivement. L'activité s'est éluée en même temps que le pic de la protéine (5A). Les poids moléculaires de l'AR et de la SPE-AR, évalués d'après les données de la Fig. 5, sont d'environ 14.000 et 17.000, respectivement. Les poids moléculaires calculés pour les structures de l'AR tronquée et de l'Ar apparaissant à la Fig. 12 sont d'environ 8.500 et 9.100 daltons, respectivement.

L'AR et la SPE-AR s'éluent à l'état de pics uniques symétriques d'une colonne HPLC à inversion de phase RPSC C3 ultra-poreuse (4,5 mm x 75 mm, Alt ex) (Fig. 6A et B). La GIA s'élue avec le pic de la protéine (Fig. 6A). La SPE-AR s'élue à une concentration en acétonitrile d'environ 21%, soit environ 4% d'acétonitrile de plus que pour la protéine non traitée. Ces résultats suggèrent que l'AR est riche en restes de cystéine qui sont modifiés par la 4-vinylpyridine, ce qui rend l'AR plus hydrophobe et la fait s'éluer à une concentration plus élevée en acétonitrile.

6.7.5. Analyse SDS-PAGE de l'AR.

La Fig. 7A illustre une analyse de l'AR, de l'AR traitée par la N-glycanase (NG-AR), de la SPE-AR et de la SPE-AR traitée par la N-glycanase (NG-SPE-AR) dans 1'acrylamide à 15% dans les conditions réductrices (Fig. 7A). L'AR et la SPE-AR migrent dans le gel sous la forme d'une bande unique diffuse large ou le poids moléculaire relatif médian est d'environ 22.500 avec un intervalle d'environ 20.000 jusqu'à 25.000 (colonnes 1 et 3). Le traitement de l'AR et de la SPE-AR par la N- 60 glycanase accélère la migration de ces protéines. La NG-AR et la NG-SPE-AR migrent à 1 ' état de bande unique avec des poids moléculaires médians de 14.000 et 14.500 daltons, respectivement. Des résultats semblables ont été observés lorsque les protéines sont passées dans le gel à 15% dans des conditions non réductrices (données non indiquées). Le traitement de l'AR par la neuraminidase, l'O-glycanase ou la neuraminidase et 1'O-glycanase ensemble ne modifie par sa mobilité électrophorétique dans le gel dans des condititons réductrices ou non réductrices. Des lors, l'AR est une glycoprotéine à chaîne unique contenant une ou des chaînes d'oligosaccharide N-liées qui ne sont pas nécessaires pour l'activité inhibitrice de croissance de l'AR in vitro.

Le traitement de la NG-AR ou de l'AR par la phophoslipase D (PLD) (chou) conduit à une réduction de la GIA jusqu'à 80% du témoin. La NG-AR traitée par la phospholipase D a été soumise à une HPLC avec inversion de phase sur une colonne C3 et les pics actifs purifiés ont été analysés sur SDS-PAGE à 20% (Fig. 7B). Une bande unique de Mr 5600 a été observéée. Ces résultats montrent que la phospholipase D ou bien une ou des protéases contaminantes quelconques de la préparation de PLD convertissent l'AR en un ou plusieurs fragments actifs.

6.7.6. Analyse par focalisation isoélectrique (IEF) de l'AR.

L'analyse IEF de l'AR marquée au 125i a exécutée comme décrit dans la section 6.1.1.2., ci-dessus. L'AR se focalise en une bande large unique avec un PI entre 7,6 et 8 (Fig. 8). La NG-AR se focalise en une bande unique avec un PI dJenviron 8,05. L'AR est donc une glycoprotéine N-liée à chaîne unique basique.

61 6.7.7. Propriétés biologiques.

L'inhibition de l'incorporation de la 125j_ désoxyuridine dans 1'ADN des cellules A431 par diverses concentrations de l'AR purifiée est illustrée à la Fig. 9A. On a observé à environ 0,2 ng par cupule une inhibition de 50% de la synthèse de l'ADN. Par conséquent, une inhibition de 50% de la synthèse de l'ADN dans les cellules du carcinome épidermoïde humain A431 a été observée à une concentration environ 0,13 nM de la protéine pure. Il convient cependant d'observer que la GIA de l'AR dépend des conditions expérimentales, par exemple le nombre de cellules par cupule (densité des cellules), le temps d'application du facteur, la durée du traitement, la concentration en sérum et diverses autres variables.

Lorsque des cellules A431 ont été cultivées en présence et en l'absence de diverses concentrations en AR, la croissance cellulaire étant surveillée par dénombrement direct des cellules, il a été observé que l'AR inhibe la prolifération des cellules A431 en proportion de la dose appliquée (données non indiquées). Par conséquent, le degré d'incorporation de la ^^i-désoxyuridine dans l'ADN est une bonne mesure de la croissance cellulaire.

1 ΛΡ

La stimulation de l'incorporation de la désoxyuridine dans l'ADN des fibroblastes de prépuce humain (Sadamoto) par diverses concentrations de l'AR purifiée est illustrée à la Fig. 9B. Une stimulation de deux fois de l'incorporation de la 125i-dêsoxyuridine a été observée à environ 0,7 ng par ml, soit une concentration en AR environ 0,05 nM. La réponse maximum a été une stimulation d’environ six fois de l'incorporation de la 125I-désoxyuridine dans ces fibroblastes. Par conséquent, l'AR agit comme facteur de croissance sur les fibroblastes humains, même en 62 présence de 5% de FBS.

L'effet de l'AR sur l'incorporation de la 125j-désoxyuridine à l'ADN de diverses lignées de cellules humaines tumorales et non tumorales et de certaines lignées de cellules non humaines a été étudié. Ces données sont rassemblées au tableau IV. L'AR inhibe la croissance de divers clones de cellules A431, de cellules du carcinone mammaire humain HTB 132, de cellules du tératocarcinome ovarien humain HTB 1575, de cellules du carcinome épidermoïde cervical humain CRL 155, de cellules de l'adénome papillaire ovarien humain HTB 75 et de cellules de l'adénocarcinome mammaire humain HTB 26. Elle ne manifeste aucun effet significatif sur diverses autres cellules (tableau III). L'AR simule l'incorporation de la ^25j_ désoxyuridine dans diverses lignées de cellules fibroblasiques humaines, de cellules tumorales pituitaires humaines CRL 7396, de cellules de l'adénocarcinome ovarien humain HTB 77, de cellules du rein de singe vert d'Afrique BSC 1 et de cellules rénales de rats SA6. L'AR n'affecte pas sensiblement la prolifération des cellules T, B ou endothéliales. L'AR ne supprime pas les réponses des cellules T humaines polifératives ou cytotoxiques dans des cultures leucocytaires mixtes (MLC).

L'AR est une protéine monomère qui nécessite des liaisons disulfure entre chaînes pour son activité, qui ne nécessite pas de glycosylation pour son activité, qui est stable en milieu modérément acide ou basique et qui est stable lors d'un chauffage de 30 minutes à 56°C. L'AR perd l'activité biologique complète lorsqu'elle est réduite, lorsqu'elle est chauffée pendant 5 minutes à 100°C ou lorsqu'elle est soumise à la digestion par la trypsine, 1'endopeptidase Lys-c, 1'endopeptidase ARG ou 1'endopeptidase GLU.

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© fi U !3 65 L'effet de l'AR et de l'EGF sur la formation d'une colonie de cellules NRK-SA6 dans la gélose molle en l'absence et en présence de TGFyJ a fait l'objet ; d'une observation dont les résultats sont rassemblés au tableau V. L’EGF induit une croissance des cellules SA6 indépendante de l'ancrage en fonction de la dose en présence de TGF ß, mais l'AR s'est révélée être un inducteur très faible de la formation de colonies SA6 sur la gélose molle (tableau V).

TABLEAU y

Effet de l'AR et de l'EGF sur la formation de colonies de cellules NRK-SA6 sur la gélose molle.

Addition Nombre de (par ml) colonies par 6 champs Néant 0 TGFfè (1 ng) 0 AR (2 ng) 0 AR (4 ng) 0 AR (2 ng) + TGFyâ (1 ng) 7 AR (4 ng) + TGFyâ (1 ng) 8 EGF (2 ng) 0 EGF (4 ng) 6 EGF (2 ng) + TGFß (1 ng) 30 EGF (4 ng) + TGFß (1 ng) 114

Les dosages sont exécutés comme décrit dans la section. Une colonie est un amas d'au moins 6 cellules.

66 6.7.8. Effet de l'AR sur la fixation de l'EGF sur ses récepteurs spécifiques.

L'AR s'est révélée inhiber la fixation du 125j-egf sur les cellules A431, de même que sur les membranes plasmiques de A431 (Fig. 10). Une inhibition de 50% de la fixation du 125j_egp sur les cellules fixées et les membranes a été observée à environ 1,1 nM et 1,8 nM d'EGF, respectivement, tandis qu'une réduction de 50% de la fixation de l'EGF sur les cellules et les membranes a été observée à environ 1,8 nM et 5,7 nM d'AR, respectivement. L'EGF non marqué inhibe complètement l'interaction entre les récepteurs et le 125j_ggp £ 3es concentrations supérieures dans les deux systèmes. Néanmoins, la compétition maximale avec l'AR a été de 75% et 50% pour la fixation sur les cellules et les membranes, respectivement. Les courbes de compétition pour l'AR ne sont de plus pas parallèles à celles relevées avec l'EGF. Ces résultats suggèrent que l'AR manifeste une moindre affinité que l'EGF pour les récepteurs de l'EGF. De même, l'AR pourrait avoir son propre récepteur spécifique prochement apparenté au récepteur de l'EGF.

Différents clones de la lignée cellulaire A431 ayant diverses sensibilités à l'inhibition par l'AR ont été sélectionnés et une absence de corrélation entre la sensibilité à l’AR et le nombre des récepteurs de l'EGF par cellule ou le KD a été observée (tableau VI).

67

TABLEAU VI

Absence de corrélation entre les sensibilités à 1 ' amphirêguline de divers clones A431 et le nombre de KD ou de récepteurs de l'EGF

Paramètres de fixation de Sensibilité l’EGF relative -— à l'ÀR (GIA)

Clone Sites de KD

A431 fixation par (NM) cellules A-3 4,6 x 105 1,80 34 F-8 9,0 x 105 3,13 20 A-2 5,1 x 105 1,38 11 A-8 5,3 x 105 3,18 1

Divers clones de A431 ont été sélectionnés par culture dans la gélose molle. La fixation de l'EGF a été effectuée comme décrit à la section 6.6.1.5. ci-dessus. Kg et les nombres de sites de fixation ont été calculés diaprés des diagrammes de Scatchard (Scatchard et al., 1949, Ann., N.Y., Acad. Sei. 51 : 660 à 672).

6.7.9 Structure chimique de 11amphirêguline.

La séquence des acides aminés de 1'amphirêguline a été déduite de l'analyse par microséquençage de la protéine S-pyridyléthylée (SPE-AR) et des fragments produits par 1'endoprotêinase Lys-C, la protéinase V8 de Staphylococcus aureus et 1'endopeptidase Arg. Les séquences de la protéine tronquée et de la protéine contenant les six acides aminés supplémentaires sont les suivantes : 68 AR tronquée 1 10 20

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30 40 50

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60 70 78

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AR plus grande 1 10 20

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30 40 50

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60 70

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Les séquences ci-dessus sont formées à l'aide des abréviations à une lettre habituelles pour chaque acide aminé. Les restes d'acides aminés dont l'identité est douteuse sont indiqués entre parenthèses. La lettre "X" désigne un acide aminé d'identité inconnue. La quantité de l'AR plus grande s'est révélée être d'environ 16% de celle de l'AR tronquée.

La séquence de l'AR a été comparée à celle de toutes les protéines de la banque de données de la National Biomédical Research Foundation (PIR 13), de la banque de données de séquences génétiques (Boit Beranek et Newman, Inc., Los Alamos National laboratory (release ne 50) et de la bibliothèque de séquences d'ADN de l'European Molecular Biology Laboratory (release n° 12). Ces recherches ont révélé que l'AR est une nouvelle protéine et est un membre de la superfamille EGF des facteurs de croissance. Cette 69 famille comprend l'EGF (souris, homme, rat, boeuf, etc.)» le TGFO(, les facteurs de croissance viraux (vaccine, myxomatose et fibrome de Shope), l'activateur du plasminogène humain, le facteur IX bovin, le facteur X humain, le récepteur de LDL, la protéine C bovine, la protéine du noyau de protéoglycane humain, le produit du gène Notch de la Drosophile, le produit du gène lin 12 de C. eleqans et le produit de gène spécifique de lignée cellulaire de l'oursin S. purpuratus. L'alignement de la structure de l'AR avec les structures des protéines de la superfamille EGF révèle que l'AR, comme les autres membres de la superfamille EGF, contient les six résidus de cystéine essentiels d'identification, respecte la conservation de l'espacement des résidus de cystéine et contient une partie des acides aminés caractéristiques et hautement conservés. Il est apparent que l'AR se situe entre les membres de la famille des facteurs de croissance qui ressemblent à EGF et à TGF et ceux qui ressemblent à MGF, SFGF, spécialement en termes d'utilisation de l'asparagine. Par exemple, à la position 2, (première cystéine = 1), tous les TGF et EGF ont une proline, le VGF a une glycine et le MGF, le SFGF et l'AR ont une asparagine. Dans la même boucle, à la position 7, les EGF et VGF ont une glycine, les TGF ont une glutamine et le MGF, le SFGF et l'AR ont une asparagine. Toutefois, dans la troisième boucle, l'AR n’a pas le tour bêta conservé à la position 34 (une asparagine dans MGF et SFGF ou une glycine dans tous les autres membres), mais comprend un acide glutamique (faible potentiel de tour bêta). L'AR a une structure différente pour la troisième boucle hautement conservée, ce qui peut affecter la fixation sur le récepteur. L'AR n’a pas les restes d'asparagine qui sont peut-être utilisés dans MGF et SFGF comme sites de 70 glycosylation dans la structure propre du facteur de croissance.

La séquence N-terminale de l'AR a une certaine homologie avec les séquences N-terminales des TGF, de VGF et de MGF du fait qu'elle est riche en prolines, en serines et en thréonines et comprend, comme les TGF et le VGF, des sites de glycosylation N-liés potentiels (en fait il y a un tel site) avec la possibilité d'une glycosylation o-liée dans cette région qui est riche en sérines, thréonines et prolines. Cette région est hautement conservée entre l'extrémité N-terminale des précurseurs de TGF et 1'extrémité N-terminale de VGF et se révèle être une région fortement glycosylée.

L'AR est une protéine extrêmement hydrophile, surtout dans la région contenant les acides aminés 8 à 45 (Fig. 2). Le profil d'hydropathie de l'AR manifeste peu de similitude avec ceux des autres membres de la famille EGF. Le profil d'hydropathie de la partie C-terminale de l'AR, bien que structurellement apparenté à ceux d'autres membres de la famille EGF, est différent des profils des autres membres de cette famile (Fig. 11 B et C).

6.7.10. L'AR fixe spécifiquement l'ADN.

La 125I-AR a fait l'objet d'un test de son aptitude à se fixer sur la cellulose, l'ADN dénaturé-cellulose et l'AND natif-cellulose, suivant le mode opératoire décrit à la section 6.6. ci-dessus. Les résultats présentés à la Fig. 14A indiquent que l'AR se fixe spécifiquement sur l'ADN-cellulose dont l'ADN est dénaturé ou natif, mais ne se fixe pas sur la cellulose. La fixation sur l'ADN natif est trois ou quatre fois plus importante que la fixation sur l'ADN dénaturé.

L'aptitude de l'AR à se fixer spécifiquement sur l'ADN fait la différence entre l'AR et les autres 71 membres de la superfamille EGF. Par exemple, l'EGF n'est à même de se fixer sur l'ADN-cellulose (Fig. 14B). Ces résultats suggèrent fortement que le domaine N-terminal hydrophile de 45 acides aminés de l'AR, qui n'existe pas dans l'EGF ni dans les autres membres de la famille EGF, peut être une séquence de localisation nucléaire impliquée dans le ciblage de l'AR sur le noyau, où le facteur entre en interaction avec l'ADN.

7. Exemple ; anticorps contre 11amphiréquline.

La production d'anticorps contre l'AR et l'AR synthétique, outre les peptides précurseurs de l'AR, est décrite dans les sous-sections ci-après.

7.1. Matériels et procédés.

7.1.1. Synthèse de peptides en phase solide.

On a produit et purifié de 1'amphiréguline comme décrit à la section 6 ci-dessus. Cinq peptides correspondant aux restes 31 à 50 (n° 279), 71 à 90

(n° 280), 108 à 130 (n° 264), 166 à 184 (n° 259) et 221 à 240 (n° 281) de la structure primaire de l'AR

(Fig. 15) ont été synthétisés suivant les techniques en phase solide dans un synthétiseur automatique de peptides Applied Biosystems Inc., sensiblement comme décrit (Merrifield, 1973, J. Amer. Chem. Soc. 85 : 2149). Les peptides synthétisés ont été détachés des résines de support suivant une technique de coupure par HF (Tarn et al., 1988, J. Amer. Chem. Soc. 105 : 6442). Les peptides synthétiques ont été purifiés par HPLC avec inversion de phase.

7.1.2. Production d'anticorps.

On a préparé des antisérums polyclonaux contre l'AR à maturité et les peptides syntéthiques de l'AR, chimiquement conjugués à 1'hémocyanine d'arapède, en recourant à des lapins blancs adultes jeunes de Nouvelle zélande. On a conjugué les peptides 72 synthétiques à l'héraocyanine d'arapède comme décrit (Ishikawa et al., 1983, Immunoassay 4 ; 235) et on n'a pas conjugué l'AR à maturité.

On a mis l'AR ou les peptides conjugués en émulsion avec du système adjuvant de Ribi (Ribi Immunochem. Research, Inc., Hamilton, MT). On a administré une dose totale de 1 ml à chaque lapin, à savoir 0,8 ml par voie intramusculaire en deux sites de chaque patte arrière et 0,2 ml par voie sous-cutanée en un site. Pour produire les antisérums contre l'AR à maturité, on a utilisé 30 microgrammes d'AR à maturité pour l'inoculation primaire, puis 15 microgrammes pour les injections de rappel ultérieures. Pour produire les antisérums contre les peptides synthétiques de 1'AR, on a utilisé 100 microgrammes de peptide conjugué pour l'inoculation primaire et 50 microgrammes pour les injections de rappel ultérieures. Les injections de rappel ont été faites toutes les 3 à 4 semaines et les lapins ont été saignés 10 à 14 jours après les injections de rappel.

7.1.3. Immunoprécipitation.

On a marqué l'AR radioactivement avec du 125j suivant le procédé à la chloramine T (Barridge, 1978, Methods Enzymol. 50 : 54 à 65). On a mélangé 10 microlitres de sérum polyclonal (ou de dilution avec v PBS) avec 10 microlitres de 125I-AR (50 mg par ml, activité spécifique de 425 microcuries par microgramme) et 30 microlitres de PBS et on a procédé au dosage essentiellement comme décrit (LeBier et al., 1982, J. Immunol. 129 : 2287 à 2292).

7.1.4. Radio-immunodosage.

On a dilué les sérums, polyclonaux à 1;50 dans du PBS. On a dilué la 125i_ar (l microgramme par ml, activité spécifique de 425 microcuries par microgramme) à 1:200 avec du TNEN/0,1% de BSA (Tris 20 mM, pH 7,4, 73 EDTA 5 niM, NaCl 150 mM, 0,05% de NP-40, 01% de BSA). On a mélangé 10 microlitres d'AR non marquée (1 mg par ml), 10 microlitres de sérum polyclonal dilué et 30 microlitres de 125l-AR diluée et on a procédé à 1'incubation pendant 45 minutes à la température » ambiante. On a préparé la solution de protéine A-

Sepharose de la façon suivante : on a réhydraté 200 mg de protéine A-Sepharose sèche Pharmacia avec 1,4 ml de PBS et on a lavé 80 microlitres du produit réhydraté qu'on a dilué jusqu'à 400 microlitres avec une solution contenant du Tris 100 mM de pH 8,1, du NaCl 150 mM, 0,5% de Triton X-100, du PMSF 2 mM, 1% d'Aprotinine et 0,5 microgramme par ml de Levpeptine. On a ajouté ensuite 20 microlitres de solution de protéine A au mélange qu'on a mis à incuber pendant encore 30 minutes. On a ensuite lavé les perles de Sepharose deux fois avec 500 microlitres de TNEN/0,1% de BSA, on les a remises en suspension dans 50 microlitres de SB (Tris 80 mM de pH 6,8, 3% de SDS, 15% de glycol, 0,01% de bleu bromophénol, 5% de β -mercaptoéthanol) et on les a chauffées pendant 5 minutes à 100°C. On a centrifugé les échantillons et dosé la radioactivité des surnageants dans un compteur gamma. Ce mode opératoire permet de déceler à peine 100 pg d'AR.

7.1.5. Test immunoenzymatique en phase solide (ELISA).

On a modifié le mode opératoire micro-ELISA en phase solide que décrit la demande de brevet E.U.A. n° 740 124 du 20 mai 1985. On a préparé des microplaques de TerasaXi en introduisant, dans chaque cupule, 5 microlitres de peptides synthétiques d'AR qu'on a dilués dans du PBS jusqu'à diverses concentrations avant de laisser la solution s'évaporer à siccité à la température ambiante au cours de la nuit. On a ajouté 5% de Blotto dans du PBS aux plaques qu'on a laissé reposer à la température ambiante 74 pendant une heure. Ensuite on a introduit dans chaque cupule 10 microlitres des dilutions de la solution d'anticorps polyclonal (diluée dans du PBS/1% de Blotto/0,05% de Triton X-100) avant de procéder à une incubation à la température ambiante pendant une heure, puis à quatre lavages avec du PBS. On a introduit dans chaque cupule 5 microlitres d'IgG antilapin de chèvre conjuguée à de la peroxydase (Cappel) à la dilution de 1:1000 dans du PBS/lM de Blotto/0,05% de Triton X-100, avant de procéder à une incubation à la température ambiante pendant 1 heure, puis à six lavages avec du PBS. On a ajouté 10 microlitres de solution Micro-EIA chromogène (Genetic Systems Corp.) à la dilution de 1:20, puis on a lu l'absorbance à DO492 après 20 minutes et 40 minutes, conformément au protocole Micro-EIA de Genetic Systems.

7.1.6. Western blot.

On a soumis des échantillons à l'électrophorèse sur un gel de polyacrylamide à 15% ou un gel de tricine-polyacrylamide à 16% avec un appareil minigel BioRad. On a placé le gel en position adjacente à une feuille de nitrocellulose et on l'a pris en sandwich dans la cassette, de façon que la nitrocellulose se trouve du côté cathodique. On a excuté le transfert de la protéine avec un courant à 400 mA à puissance constante pendant 30 minutes. On a ensuite retiré la nitrocellulose et on l'a imbibée jusqu'au lendemain à 4eC dans 2,5% de Blotto/PBS/0,2% de NP-40.

Ensuite, on a exposé le filtre de nitrocellulose à de l'antisérum dilué dans du 2,5% de Blotto/PBS/0,2% de NP-40 comme tampon de réaction pendant 90 minutes à la température ambiante sur une plate-forme basculante, avant quatre lavages (5 minutes pour chaque lavage) dans 2,5% de Blotto/PBS/0,2% de NP- 40.

75

On a ensuite déposé sur la feuille de nitrocellulose de la protéine A conjuguée à de la phosphatase alcaline (Cappel) diluée à 1:500 dans du 2,5% de Blotto/PBS/0,25% de NP-40 et on a procédé à l'incubation à la température ambiante pendant 60 minutes dans une cuvette basculante. On a ensuite lavé le filtre quatre fois (3 minutes pour chaque lavage) avec du PBS/0,2% de NP-40, puis pendant 5 minutes dans du tampon "APS" (TRIS 100 nM de pH 9,5, NaCl 100 mM, MgCl2 5 niM). On a développé le filtre dans du réactif chromogène (40 ml de tampon APS, 12 mg de phosphate de 5-bromo-4-chloro-3-indolyle (Sigma), 6,8 mg de bleu de p-nitro-tétrazolium (Sigma), préparé juste avant usage et filtré à travers un filtre de 0,2 micromètre), puis on a arrêté la réaction avec de l'eau et on a laissé sécher le filtre à l'air.

7.2. Caractérisation des anticorps contre AR.

On a caractérisé par radio-immunoprécipitation, radio-immunodosage, ELISA et Western blot les sérums polyclonaux dirigés contre l'AR à maturité et des peptides synthétiques de l'AR. Les résultats sont donnés au tableau VII.

76

TABLEAU VII

Caractérisation des anticorps contre 11amphiréguline et les peptides synthétiques de 11AR

Sérum Dosage polyclonal -

contre RIP RIA ELISA WB

AR à maturité l:256a 1:250 ND 1:250 (0,100 pb)b (1 ng)

Peptide 259 1:256 ND ND ND

Peptide 264 1:256 1:250 1:100 1:100 (0,100 pb) (5 ng) (0,1 ng) 1:500 (1 ng)

Peptide 279 ND ND 1:100 ND

(5 ng)

Peptide 280 ND ND 1:100 ND

(5 ng)

Peptide 281 ND ND 1:100 ND

(5 ng) a = une dilution de l'antisérum est nécessaire; b = les valeurs entre parenthèses indiquent la sensibilité du dosage; RIP = radio-immunoprécipitation; RIA = radio-immunodosage; ELISA = test immunoenzymatique en phase solide; WB = Western blot; ND = Non Déterminé.

8. Exemple : clonage du cADN du précurseur de 11amphiréguline.

L'exemple ci-après décrit le clonage et l'analyse des cADN codant pour le précurseur de 1'amphiréguline provenant de cellules du carcinome mammaire humain MCF-7 traitées par le TPA.

77 8.1. Matériels et procédés.

8.1.1. Préparation de l'ARN.

On a isolé l'ARN de cellules subconfluentes cultivées dans des flacons pour culture de tissu T150 ou bien d'échantillons de tissu congelés frais en appliquant le procédé au guanidinium décrit par Chirgwin (1979, Biochemistry, 18, 5294). On a lavé les cellules de 4 fioles T150 dans du PBS, on les a traitées à la trypsine, on les a lavées à nouveau dans du PBS et on a remis le culot en suspension dans 8 ml d'une solution d'isothiocyanate de guanidinium 4M. On a collecté 1'ADN en faisant passer la solution à travers une aiguille n° 18. On â déposé l'échantillon sur 2,4 ml de CsCl 5,7M dans un tube Beckman SW41Ti et on l'a centrifugé à 32.000 tours par minute pendant 20 heures à 20°C. On a remis les culots en suspension dans 300 microlitres de CsCl 2,5M et on les a précipités au moyen de 2 volumes d'éthanol à la température ambiante. On a remis les culots en suspension dans 300 microlitres d'eau, puis on a ajouté 35 microlitres d'acétate de sodium 3M (pH 5,2) et 800 microlitres d'éthanol pour précipiter l'ARN à -70 °C. On a répété la précipitation et ensuite lavé brièvement l'ARN avant de le remettre en suspension dans 100 microlitres d'eau, de le doser quantitativement à DO250 et ^e 1® conserver à -70eC.

8.1.2. Marquage statistique avec du 32p-.TTp.

On a excisé les fragments spécifiques de la région codant pour l'AR hors d'un gel d'agarose à basse température (BioRad) et on les a marqués avec du 32p_ TTP (NEN, 3000 Curies par millimole) suivant le procédé de marquage statistique mis au point par Feinberg (1983, Biochem., 137, 266). Par- une chromatographie sur une colonne de Sephadex de 1,5 ml, on a séparé les désoxyribonucléosides non incorporés. Les activités 78 spéficiques étaient typiquement de 0,5 à 2,5 x 10^ coups par minute par microgramme.

8.1.3. Gels d'ARN et analyse par Northern blot.

On a soumis à l'électrophorèse 10 ou 20 microgrammes de l'ARN total sur des gels de 1,2% d'agarose/formaldéhyde en vue de l'analyse par Northern blot. On a préparé les gels d'agarose/formaldéhyde dans de l'acide N-morpholinopropanesulfonique (MOPS) 40 mM, pH 7,0/EDTA 1 mM/acétate de sodium 10 mM/formaldéhyde désionisé 2,2 M (pH 5,6) dans un appareil pour gel IBI VCV, avec des plaques givrées. On a dénaturé l'ARN dans le même tampon avec 50% de formamide à 65 eC et on l'a fait passer dans du MOPS 1 X entre 20 et 30 mA pendant 3 à 5 heures. On a rincé le gel dans du SSC lOx pendant 30 minutes, puis on l'a transféré sur des membranes Hybond-N (Amersham), on a fait la réticulation dans l'UV (1200 microjoules), puis on a procédé à la préhybridation et à l'hybridation dans du SSPE 5x (le SSPE lx est du NaCl 0,18 M/phosphate de sodium 10 mM, pH 7,7, EDTA 0,1 mM), du milieu de Denhardt 5x, du SDS à 0,5% et 20 microgrammes par ml d'ADN de sperme de saumon dénaturé, comme porteur. On a exécuté les hybridations à 42 °C pendant 16 heures avec 2 x 10^ coups par minute par ml du ^P-ARBPl. Qn a iav© les empreintes plusieurs fois dans du SSC 2x avec 0,1% de SDS à la température ambiante, puis dans du SSC lx avec 0,1% de SDS à 65eC, avant l'exposition sur du film Kodak X-OMAT avec deux écrans intensificateurs Dupont Lightning Plus à -70eC. On a coté les bandes comme (+) si elles sont clairement visibles après exposition pendant une nuit, (+/-) si elles sont visible après 3 jours d'exposition et (++) si elles sont décelables après 6 heures.

79 8.1.4. Clonage du cADN.

On a récolté des cellules MCF-7 pour en obtenir l'ARN après traitement au moyen de 100 microgrammes par ml de 13-acétate de 12-0-tétradêcanoylphorbol (TPA) pendant 24, 40 et 72 heures. On a isolé le poly(A)+ARN des aliquotes rassemblées en pool de ces échantillons et on l'a utilisé comme modèle pour la synthèse du cADN en double brin sensiblement comme décrit (Gubler et Hoffman, 1983, Gene 25:263). On a opéré la ligation du cADN à queue G dans le site EcoRI de ^ gtlO au moyen des adaptateurs oligonucléotidiques BRI (Rose et collaborateurs, 1986, Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 83 : 1261 à 1265).

Spécifiquement, on a dénaturé par la chaleur 5 microgrammes de poly(A)+ARN de MCF-7 traitées par le TPA et on a fixé une amorce de 5 microgrammes d'oligo(dT) au moyen de 100 unités de transcriptase reverse dans 45 microlitres de volume de réaction. On a exécuté la synthèse du second brin avec 4 unités de RNase H et 115 unités d'ADN pol. I d'E. coli. Ensuite, on a utilisé 10 microgrammes d'ADN polymerase de T4 pour supprimer les surplombs en 3 ' et obtenir des extrémités non collantes. On a fractionné suivant dimensions l'ensemble des 6,8 microgrammes de cADN en double brin sur une colonne de Sephadex G50 pour sélectionner les cADN de plus de 500 paires de bases, puis on a fixé une queue dG sur 150 ng de cADN avec de la désoxynucléotidyl transferase terminale. On a opéré la ligation du cADN à queue dG dans le site EcoRI de Λ gtlO au moyen d'adaptateurs BRI (AATTCCCCCCCCCCCC). On a procédé à l'emballage in vitro de l'ADN lié (Grosveld et collaborateurs, 1981, Gene 13 : 227 à 237) et on l'a déposé sur C600 rK"mK hfl d'E. coli avec une efficacité de 106 recombinants par microgramme de cADN. Sur 2,5 x 105 recombinants, on a prélevé deux i 80 empreintes sur nitrocellulose, puis on a examiné les filtres avec des sondes oligonucléotidiques dégénérées et présumées meilleures, marquées au 32p (tableau VIII ci-après) déduites de la séquence primaire de l'AR telle que déterminée par dégradation d'Edman automatisée de l'AR S-pyridyléthylée réduite et traitée par la N-glycanase (section 6, ci-dessus).

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l û Λ ß 82 L'analyse de restriction a révélé une rareté de sites dans le segment inséré de cADN de pARl, avec des sites uniques pour Bsml, EcoRV, Hgal, Nael, PvuII, Smal et SstI et deux sites pour Sspl. Aucune digestion ne s'est faite dans le segment inséré par BamHI, Clal, EcoRI, HindlII, Kpnl, PstI, Pvul, SphI, StuI et Xbal. Un fragment Bsml à PvuII de 170 paires de bases a été isolé et utilisé pour sonder une deuxième bibliothèque de cADN de 100.000 recombinants qui avait été obtenue sensiblement comme décrit ci-dessus. On a identifié 13 clones positifs comprenant des segments insérés s'échelonnant de 300 paires de bases à 1,3 kb, six étant supérieur à 1 kb, et cinq contenant un site SsTI unique dont il est connu qu'il est situé dans les 100 paires de bases à partir de l'extrémité 5' de pARl. On a sous-cloné quatre des cinq derniers segments insérés (pAR3, pAR5, pAR9, pAR13) pour une nouvelle restriction avec analyse de séquence. Tous ces clones avaient des cartes de restriction identiques basées sur Bsml, EcoRV, PvuII, SstI et Smal, sauf pAR9 qui avait une troncature 3' de 100 paires de bases et qui s'est révélé ultérieurement provenir d'une piste A5, suffisant probablement pour l'amorçage avec oligo(dT).

8.2. Analyse de la séquence nucléotidique des clones de cADN de l'AR.

On a utilisé des amorces oligonucléotidiques exactes pour séquencer les deux brins du clone pARl de 1230 paires de bases en appliquant le procédé de terminaison de chaîne didésoxy (Sänger et al., 1977, Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A., 74 : 5463 à 5467). La séquence nucléotidique complète et la séquence des acides aminés qui en est déduite pour le clone pARl sont illustrées à la Fig. 16. Un cadre de lecture ouvert de 965 paires de bases commence au nucléotide n° 1. Le premier AUG se trouve à la position 210, mais 83 ne satisfait pas au consensus optimal de Kozak pour les sites d'initiation de translation (Kozak, 1984, Nucleic Acids Research 12 : 857 à 872; Kozak, 1986, Cell 44 : 282 à 292) à cause de l'absence d'une purine à la position -3. Toutefois, ces triplets AUG peuvent servir J de codon initiateur, comme Kozak l'a observé dans environ 3% des messages examinés, et la présence d'une adénosine à la position -1 dans ces trois AUG "moins favorisés" et dans le mARN d'AR est d'une importance possible. Bien qu'une deuxième méthionine soit située au nucléotide 378, qui n'est pas conforme à la séquence de consensus de l'initiateur, le premier AUG est, croit-on, le site d'amorçage de traduction véritable du fait qu'il est suivi d'une série prévue de 19 acides aminés à restes principalement hydrophobes qui est interrompue par 3 prolines, ce qui est typique d'une séquence peptidique signal (Heijne, 1983, J. Biochem. 133 : 17 à 21).

Le plus long cadre de lecture commençant avec une méthionine code un polypeptide de 252 acides aminés qui comprend le peptide signal de 19 restes. La séquence codante est précédée de 209 nucléotides de la séquence 5' non traduite et suivie d'un signal de fin de traduction TAA et de 262 nucléotides de séquence 3' non traduite. Une séquence signal d'addition poly(A) potentielle, AATAA, est située à 64 nucléotides à l'amont de la série des 15 restes adénylate, probablement pour constituer la queue poly(A). La région 3' non traduite d'AR contient quatre copies de la séquence ATTTTA, qui est aussi présente dans certaines lymphokines, cytokines et divers protooncogenes. Dans GM-CSF, cette séquence intervient dans la déstabilisation et la dégradation de l'ARN (Shaw, 1986, Celle 46 : 659 à 667). La conservation de ce motif dans des molécules d'une fonctionnalité semblable 84 suggère que l'AR peut aussi avoir une relation avec cette classe de lymphokines.

La séquence du cADN confirme la séquence peptidique de l'AR à maturité (section 6 ci-dessus), sauf à la position 113 des acides aminés (Fig. 15) que le séquençage de la protéine a révélé être l'acide aspartique (D) et qui a été présumé être l'asparagine (AAT = N) à partir des clones de cADN. Sur les cinq cADN examinés, tous avaient leurs extrémités 5' dans les premières 25 paires de bases de la séquence de pARl.

La comparaison de la séquence du cADN avec les sondes présumées les meilleures a révélé 74% (ARK41) et 77% (ARK31) d'homologie générale. Aucune sonde n'a eu de concordance sur plus de huit paires de base successives, mais dans l'ensemble, 50 des 67 nucléotides alignés pour ARK41 ont donné un signal détectable dans des conditions très peu contraignantes. L'usage des codons par la séquence de mARN de l'AR diffère beaucoup des fréquences d'usage indiquées par Lathe (Lathe, 1985, J. Mol. Biol. 183 : 1 à 12), ce qui explique pourquoi les oligonucléotides dégénérés ont donné des signaux plus intenses dans cette circonstance. A partir des séquences du cADN et de la protéine, deux protéines d'un poids moléculaire de 9772 et de 9173 sont prévues pour les deux formes de l'AR à maturité sur la base des séquences du cADN (Fig. 16) et de la protéine (section 6.7.9. ci-dessus). Le profil d'hydropathie de l'AR est représenté à la Fig. HD.

Le précurseur de l'AR comprend 3 sites potentiels de N-glycosylation, dont un dans le domaine N-terminal (position 30 à Fig. 16) et 2 dans la région hydrophile de l'AR à maturité '(positions 113 et 119). On sait que la glycolysation contribue pour 10 à 12 kd au poids moléculaire de l'AR à maturité et qu'elle est 85 susceptible de se faire par addition d'hydrate de carbone à l'un de ces sites ou aux deux dans le domaine hydrophile.

Le domaine N-terminal riche en sérine du précurseur de 1’AR (Fig. 15) contient trois sites potentiels de sulfatation de la tyrosine en Y^l, γ82 et γ87, sur base de la présence de restes acides, ou acides aminés induisant la torsion, et de l'absence de résidus qui pourraient contribuer à un empêchement stérique (Huttner, 1987, TIBS 12 : 301 à 303). La plupart des protéines sulfatées sur la tyrosine sont des protéines sécrétoires. Les modifications par sulfatation des tyrosines sont présumées impliquées dans l'activation, le transport ou le traitement protéolytique des protéines précurseurs. Le domaine riche en sérine de l'AR peut aussi contenir des chaînes d'hydrate de carbone 0-liées vu l'abondance des restes de sêrine/thréonine (23 sur 81) dans cette région de la molécule, qui sont des sites pour de telles liaisons. Sous ce rapport, des formes O-glycosylées d'un autre membre de la famille EGF, à savoir TGF û( , ont été identifiées (Ignotz et al., 1986, PNAS, 83, 6307 à 6311).

Aucun des restes de sérine dans le précurseur de l'AR ne s'adapte à la séquence de consensus pour les sites de phosphorylation de la Kinase sous dépendance du cAMP (Grima et al., 1985, Proc. Natl. Acad. Sei. Ü.S.A. 82 : 617 à 621), et aucun des restes de tyrosine ne présente de similitude de la séquence de flanquement avec des restes de phosphotyrosine connus.

Le domaine hydrophile de la protéine AR à maturité est composé de nombreu-x acides aminés à charge positive (16 sur 37 restes sont de la lysine ou de l'arginine), notamment deux séries successives de 4 ou 5 restes chargés basiques. Le signal de ciblage 86 nucléaire du grand antigène T de SV40 est semblable à cette région de l'AR et contient une séquence KKKRK caractéristique précédée par de petits acides aminés (glycine, alanine, proline) qui peuvent permettre la formation d'une structure 0( -hélicoïdale (Burglin et al., 1987, EMBO 6 : 2617 à 2625; Dingwall et al., 1987, EMBO 6 : 69 à 74). L'analyse de mutation a défini quatre restes basiques consécutifs comme étant la particularité prépondérante de la séquence de localisation nucléaire de SV40 (Manford, 1984, Cell, 37, 801 à 813). D’autres protéines nucléaires comprenant des séries semblables d'acides aminés basiques qui interviennent, croit-on, dans le ciblage nucléaire sont notamment la nucléoplasmine, la grande protéine T du virus du polyome, les histones et c-myc. La fusion de diverses séquences signal nucléaires sur les gènes de la pyruvate kinase de poulet, de l'albumine, des immunoglobulines, de la ferritine et de la /2-galactosidase, conduit à la localisation de ces protéines par ailleurs cytoplasmiques dans le noyau (Moreland, 1987, Mol. Cell. Biol. 7 : 4048 à 4057). Le fait que les séquences hydrophiles de l'AR sont ou non impliquées dans le ciblage de ce modulateur de croissance dans le noyau n'a pas été vérifié, mais l'aptitude de l'AR à se fixer spécifiquement sur l'ADN implique que l'AR a un rôle fonctionnel au sein du noyau. Sous ce rapport, l'AR peut réguler la synthèse de l'ADN, le cycle cellulaire et divers autres événements dans le noyau.

Le précurseur de TGF o( contient des cystéines multiples dans le domaine cytoplasmiques C-terminal, dont certaines subissent une. fixation covalente du palmitate (Bringman, 1987, Cell, 48, 429 à 440). Au contraire, le précurseur de l'AR ne comprend pas de cystéines dans son domaine cytoplasmique et il n ' est 87 donc pas à prévoir qu'il contienne des restes palmitate. Bien que la fonction biologique de la fixation du palmitate ne soit pas connue/ cela constitue encore une autre différence entre l'AR et les autres membres de la superfamille EGF.

8.3. Sources cellulaires pour la synthèse de 11amphiréguline.

L'analyse par Northern blot (Thomas/ 1980, PNAS, 77, 5201) au moyen de fragments de cADN de l'AR marqués au 32p en ot a révélé l'hybridation sur une seule espèce d'ARN de 1,4 kb à partir de divers tissus humains normaux et de diverses lignées cellulaires tumorales. Une bande unique a été observée sur les Northern blots, en utilisant soit AREB1 (fragment BstEII à PvuII de 480 paires de bases de pARl contenant la région codante complète de l'AR à maturité et une partie des domaines N-terminaux précurseurs et transmembranaires), soit AR170 (fragment Bsml à PuvII de 170 paires de bases de pARl contenant uniquement la moitié c-terminale de l'AR à maturité) comme sondes marquées. Les résultats rassemblés au tableau IX ci-après montrent qu'un faible niveau d'expression (+) de l'ARN de l'AR a été observé dans le tissu du poumon et du pancréas normal de l'adulte. Une expression plus faible, mais décelable, (+/-) a été observée dans le tissu normal du rein, du foie et du cerveau.

88

TABLEAU IX

Tissu humain normal ARN d'AR

Poumon +

Foie +/-

Pancréas +

Rein +/-

Rate

Cerveau +/-

Placenta

Intestin, foetal

Du fait que l'AR a été isolée à l'origine de cellules MCF-7 traitées par le TPA, il était intéressant de déterminer la durée pour l'induction de l'ARN de l'AR par le TPA dans ces cellules. Des cellules MCF-7 ont été traitées au moyen de TPA pendant 0, 1, 3, 6, 18, 24 et 48 heures et l'ARN total a été isolé, puis passé en quantité de 10 microgrammes sur chaque colonne d'un gel d'agarose à 1,2% de formaldéhyde et ensuite transféré sur des membranes en Nylon et examiné avec la sonde ARBP1 complémentaire de la région codante complète de l'AR â maturité. On a observé une augmentation impressionnante de l'ARN de 1,4 kb de l'AR déjà 1 heure après le traitement par le TPA, les taux les plus élevés étant atteints entre 18 et 24 heures. Des Northern blots ultérieurs, sondés au moyen de ^p-ARBPl, ont révélé que le TPA stimule la synthèse de l'ARN de l'AR dans d'autres lignées du cancer mammaire, bien que les taux les plus élevés n'aient jamais été aussi hauts que dans les cellules MCF-7 ayant subi l'induction par le TPA.

De nombreuses lignées cellulaires tumorales ont fait l'objet d'un dosage des taux d'ARN de l'AR

89 tant avant qu'après 24 heures d'induction par le TPA. Les résultats sont rassemblés au tableau X ci-après. A quelques exceptions près, les seules sources décelables de l'ARN de l'AR ont été les lignées du cancer mammaire humain traitées par le TPA. Une telle exception est la lignée Caki-1, ou lignée du carcinome rénal humain à cellules claires, qui exprime constitutivement des taux élevés d'ARN de l'AR qui sont comparables aux quantités observées dans les cellules MCF-7 ayant subi l'induction par le TPA. Toutes les lignées cellulaires du cancer mammaire traitées par le TPA qui ont été observées ont manifesté une hybridation spécifique de l'AR.

Apparemment, l'AR remplit un certain rôle fonctionnel dans le tissu des poumons, du pancréas, des reins, du foie et du cerveau de l'adulte, peut-être en étant impliqué dans une grande variété de processus, notamment la guérison des plaies, la régénération des tissus et le maintien des neurones.

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91 9. Exemple ; Clonage génomique et analyse du gène amphiréguline.

L'exemple ci-après décrit le clonage génomique du gène amphiréguline humain, sa structure et son organisation intron/exon. Les implications fonctionnelles et évolutionnaires relatives à la superfamille EGF des facteurs de croissance sont également envisagées.

9.1. Matériels et procédés.

9.1.1. Hybridations par Southern blot.

On a isolé l'ADN génomique total (Maniatis, 1982, dans Molecular Cloning : A Laboratory Manual) de cellules subconfluentes dans des fioles pour culture de tissu T150. On a mis 20 microgrammes d'ADN à digérer avec les enzymes de restriction indiquées, on en a fait l'électrophorèse sur un gel d'agarose à 0,8% et le report sur Hybond-N (Amersham) avec du tampn de fond SSC 20x (Southern, 1975, J. Mol. Bio., 98, 503 à 517), puis on a fixé l’ADN par exposition à 1200 micro joules d'UV de courte longueur d'onde. On a hybridé les filtres à 65 °C pendant une nuit dans du tampon d'hybridation (SSC 6x, solution de Denhardt 5x, SDS 0,5% et 20 microgrammes par ml d'ADN de sperme de saumon dénaturé) contenant, par ml, 2 x 106 coups par minute du fragment spécifique de l'AR marqué au Les sondes ont été marquées statistiquement jusqu’à une activité spécifique de 5 à 25 x 108 coups par minute par microgramme. Les filtres ont été lavés abondamment dans du SSC lx à 65 °C, puis autoradiographiés pendant une nuit à -70°C.

9.1.2. Construction de la bibliothèque génomique.

On a choisi le bactériophage lambda L41.1 comme vecteur de clonage et on a préparé des bras traités à la phosphatase après digestion avec BamHI, EcoRI et HindlII. On a mis de l'ADN de haut poids 92

moléculaire de cellules MCF-7 à digérer avec HindlII, puis on en a fait l'électrophorèse sur un gel d'agarose à 0,8% à basse température (BioRad), puis le fractionnement dimensionnel. On a fait fondre à 65°C la fraction sur agarose enrichie au maximum en le fragment de restriction souhaité, puis on a extrait l'ADN avec du phénol et du NaOAc, après quoi on l'a précipité par l'éthanol et remis en suspension à 25 à 100 microgrammes par ml. La constitution des bibliothèques a consisté en une ligation pendant une nuit à 14 °C avec 100 ng de bras de lambda L41.1 et 40 nG d'ADN

fractionné suivant dimensions et extrait, dans un volume de réaction de 5 microlitres, en présence d'ADN ligase de T4 (Biolabs). On a emballé le phage recombinant in vitro avec des extraits (Grosveld, 1981, Gene, 13, 227 à 237) préparés avec les souches de E. coli suivantes î BHB2688 N205 recA“ (lambda imm4^4 cITS be red3 Eam4 Sam7) et BHB2690 N205 recA“ (lambda imm434 cits be red3 Daml5 Sam7). On a titré les bibliothèques sur E. coli LE392. On a débrouillé les clones génomiques avec des sondes d'ADN spécifiques de l'AR par hybridation sur plaque in situ (Benton, 1977, Science 196, 180 à 182) et on a isolé l'ADN des clones positifs purifiés sur plaque (Huynh, 1985 dans DNA cloning techniques : a practical approach, D. Glover, ed. (Oxford : IEL Press), pages 49 à 78). On a excisé les segments insérés HindlII et on les a sous-clonés dans pEMBL 18 en vue de l'analyse par restriction et de la propagation.

9.1.3. Dosage par extension d'amorce.

On a isolé l'ARN des cellules MCF-7 comme décrit dans la section 8, ci-dessus. On a marqué les oligonucléotides synthétiques complémentaires des nucléotides 40 à 60 (ARAP) et 76 à 97 (ARCP) dans la séquence de cADN de l'AR à leurs extrémités au moyen de 93 32p avec de la polynucléotide kinase de T4 jusqu'à une activité spécifique de 2 à 5 x 10® coups par minute par microgranime. On a utilisé 1.000.000 de coups par minute d'oligonucléotide marqué pour amorcer la synthèse du premier brin de cADN sur 50 microgrammes d'ARN de MCF-7, sensiblement comme dans la section 8.1.4. ci-dessus. On a traité les produits avec de la RNase A, on les a extraits au phénol et au chloroforme, précipités par l'éthanol, dénaturés par la chaleur dans le formamide à 80% à 100 eC pendant 5 minutes et analysés par électrophorèse sur des gels de séquençage ordinaires de Polyacrylamide à 8% avec de l'urée 7M.

9.1.4. Dosage par CAT.

On a cultivé des cellules MCF-7 comme décrit dans la section 6.2.1. ci-dessus. Pour chaque dosage, on a étalé 1 à 2 x 10^ cellules dans une boîte de 100 mm dans 10 ml de milieu et 24 heures plus tard, on a ajouté aux cellules (Southern et Berg, 1982) 20 microgrammes d'ADN de plasmide en superhélice précipité par le phosphate de calcium. On a rincé les cellules avec du milieu frais 4 heures après la transfection et on les a soumises au choc par le glycérol à 25% pendant 90 secondes. On a rincé les cellules à nouveau et on les a recouvertes de 20 ml de milieu frais contenant 0 ou 100 ng de TPA par ml. On a lavé les cellules et on les a récoltées 40 heures après le choc par le glycérol, puis on les a lysées par les ultrasons dans 100 microlitres de Tris.HCl 0,25 M (pH 7,8). On a dosé l'activité CAT essentiellement comme décrit par Gorman et collaborateurs (1982). On a ajouté l'extrait cellulaire (3 à 50 microlitres) à 2,5 mCi de ^C-chloramphénicol- (NEN) dans un volume de réaction de 150 microlitres de Tris 0,5 M (pH 7,8) et d'acétylCoA 0,05 mM. On a incubé les mélanges de réaction pendant 2 heures à 37°C, puis on les a 94 extraits avec 1 ml d'acétate d'éthyle et développés sur des plaques de gel de silice pour CCM avec du chloroforme:1-butanol (95:5). On a séché les plaques « CCM et on les autoradiographiées. On a dosé quantitativement le ^c-chloramphénicol acétylé et non acétylé en comptant les taches excisées dans de l'Optifluor. On a calculé le nombre d’unités d'activité enzymatique CAT en microgrammes de chloramphénicol acétylé par heure par microgrammes de protéine dans l'extrait cellulaire.

9.1.5. Hybridation chromosomique in situ.

Au moyen de ^h-ttp, on a marqué statistiquement le plasmide pAR9 qu’on a utilisé pour l'hybridation avec des cellules humaines en métaphase préparées à partir de lymphocytes du sang périphérique stimulés par de la phytohémagglutinine, au stade des bandes 500 à 800. Cette sonde correspond à un cADN de 1'AR auquel manque beaucoup de la région 3' non traduite et insérée dans le site EcoRI de pEMBL18.

On a fait 1'hybridation comme décrit précédemment (Le Beau, 1985, PNAS, 82, 6692 à 6696) avec 2, 4, 20 et 40 ng de sonde par ml de mélange d'hybridation. On a préparé des autoradiographies avec de l'émulsion nucléaire Kodak NTB-2 en exposant les lames pendant 7 à 60 jours. On a visualisé les bandes des chromosomes par coloration à la quinicrine-raoutarde.

9.2. Localisation du gène AR dans le chromosome.

On a localisé le gène AR humaine dans le chromosome par hybridation in situ du cADN d'AR marqué au 3h avec des chromosomes en métaphase normale. On a compté les grains d'argent sur 50 étalements de métaphase ou 30% étaient répartis de façon non statistique aux bandes 4ql3-4q21. Le résultat a été confirmé par réaction en chaîne de la polymérase (PCR) 95 sur de 1'ADN hybride de cellules somatiques de hamster/être humain ne contenant que le chromosome humain 4. Les amorces oligonucléotidiques issues de l'exon 3 de l'AR et l'intron en flanc ont engendré un fragment PCR de 220 paires de bases uniquement dans 1'ADN humain et l'ADN hybride contenant le chromosome 4, alors que l'ADN de hamster est restée négatif,

La région 4ql3-4q21 du chromosome contient aussi les gènes pour gro ou activité simulatrice de la croissance du mélanome (Anisowicz, A, et collaborateurs, 1987, Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A., 84, 7188 à 7192? Richmond, A. et collaborateurs, 1988, EMBO J. 7, 2025 à 2033), le récepteur c-kit (Yarden et collaborateurs, 1987, EMBO J. 6, 3341 à 3351), le facteur plaquettaire 4 (PF4) (Griffin et collaborateurs, 1987, Cytogenetic Cell Genet., 45, 43 à 73), le facteur inductible d'interféron gamma OP-10 (Luster, A.D. et collaborateurs, 1987, Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A., 84, 1868 à 1871), la protéine de fixation de la vitamine D (composant spécifique du groupe) (Cooke, N.E. et collaborateurs, 1986, Human Genetics 73, 225 à 229; McCombs, J.L. et collaborateurs, 1986, Cytogenet Cell Genet, 42, 62 à 64) et la stathérine qui est une protéine salivaire régulatrice du calcium (Sabatini, L.M. et collaborateurs, 1987, Am. J. Hum. Genet., 41, 1048 à 1060). Le gène pour EGF est situé distalement en 4q25.

Gro, IP-10 et PF4 appartiennent à une classe de peptides apparentés par leur structure qui peuvent constituer une famille de facteurs de croissance rassemblés sur le chromosome 4. Le c-kit code pour un récepteur superficiel cellulaire qui est en relation de structure et de fonction avec différents récepteurs des facteurs de croissance qui contiennent une activité de kinase spécifique de la tyrosine, notamment le 96 récepteur de l'EGF, l'oncogène Neu, le récepteur PDGF et le récepteur de l'insuline. De façon générale, les gènes pour les ligands et leurs récepteurs sont . cartographiés sur des chromosomes distincts, mais certains sont cartographiés sur des localisations chromosomiques communes (Groffin, 1983, Nucl. Acids Res. 11:6331 à 6339; Pettenati, 1987, Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A., 84:2970 à 2974). Le ligand pour c-kit n'a pas été identifié et l'AR doit faire l'objet d’un essai pour une telle activité.

Des translocations spécifiques sont observées dans de nombreuses affections malignes. L'aberration cytogénétique la plus fréquemment observée dans la leucémie lymphoblastique aiguë (ALL) congénitale, t(4;11) (q21? q23) implique la région sur laquelle l'AR a été cartographiée (Heim, S. et collaborateurs, 1987, Leukemia, 1, 16 à 23). Les ALL sont à présent classifiées par morphologie de la façon définie par le groupe de coopération franco-américano-britannique (FAB), les marqueurs des cellules B et T et l'analyse chromosomique. Ces classifications servent de base pour le diagnostic, le pronostic et le traitement de l'ALL. Un tiers de tous les cas d'ALL met en jeu des translocations spécifiques et t(4;ll) correspond à un groupe à pronostic défavorable, très fréquent chez les enfants au-dessous de 16 mois avec une survie médiane inférieur à 1 an (Kocova et collaborateurs, 1985, Cancer Genetics et Cytogenetics, 16, 21 à 32). Les trans locations mettant en jeu la région 4q21 ont été observées aussi dans les lymphomes T (Levine, E.G. et collaborateurs, 1986, Cancer Res., 46, 6481 à 6488) et dans un cas de leucémie myéloblastique aiguë (AML) (Selypes, A et collaborateurs, 1987, Human Genet, 76, 106 à 108). Cette région contient également les gènes pour un syndrome de dysgénèse dentaire et le "piebald 97 ! trait" qui est un trouble héréditaire conduisant à une pigmentation mouchetée de la peau due à une migration et une différenciation déficientes des mélanoblastes , (Hoo, J.J. et collaborateurs, 1986, Human Genet., 73, 230 à 231).

Les études de liaisons factorielles entre l'AR et les troubles génétiques localisés sur le chromosome en 4ql3-4q21 doivent permettre de déterminer la signification de cette colocalisation. L'analyse cytogénétique courante suggère que la région 4q21 contient des gènes impliqués dans la différenciation lymphocytaire. En dernier recours, ces associations peuvent suggérer d'autres activités ou applications biologiques pour cette molécule régulatrice de la croissance.

9.3. Clonage génomique.

L'analyse par Southern blot (section 9.1. ci-dessus) de 1'ADN de MCF-7 digéré par HindlII, EcoRI ou BamHI a révélé des bandes uniques de 12 kb, 8 kb et 20 kb, respectivement, lors de l'hybridation avec une sonde de 830 paires de bases (pARl digéré par Pvull/Bsml et marqué au 32P) contenant la partie 5' du gène AR, ce qui suggère que ce dernier est un gène à copie unique. Une sonde de 170 paires de bases (AR 170, BsmI-PvuII) à partir de l'extrémité 3' de l'AR à maturité, y compris les régions codantes du domaine transmembranaire et cytoplasmique, s'est hybridée sur les mêmes fragments HindlII, EcoRI et BamHI et aussi sur un fragment HindlII de 7,5 kb supplémentaire, ce qui implique que la plus grande partie de la région codante de l'AR est divisée entre deux fragments HindlII de 12 et de 6,5 kb. Des bandes identiques on été observées par analyse suivant Southern de produits de digestion de l'ADN de placenta, de cerveau, de mélanome (SK-ML 28), de cancer mammaire (HTB36), de 98 carcinome épidermoïde (A431) et de cancer pulmonaire de l'être humain, ce qui suggère que le gène AR n'a pas subi de réorganisation ou d'amplification importante , quelconque.

La Demanderesse a choisi de cloner les deux fragments HindiII de l'ADN de MCF-7 parce qu'il est probable qu'il contient la majeure partie sinon la totalité du gène AR et ses séquences de flanc. L'ADN de MCF-7 digéré par HindlII a été soumis au fractionnement dimensionnel et les fractions appropriées ont été assemblées par ligation dans L47.1. Parmi les nombreux clones positifs, deux clones, à savoir 7^ ARH12 et ARH6, ont été sélectionnés pour une caractérisation plus détaillée. Les segments insérés de 12 et 6,4 kb ont été sous-clonés dans pEMBL18 et divers sites de restriction ont été cartographiés. Avec des amorces oligonucléotidiques exactes et par séquençage direct de divers sous-clones plus petits, la séquence de tous les exons et de leurs jonctions aux introns a été déterminée et n'a révélé aucun désaccord avec la séquence de cADN.

9.4. Caractérisation de la région régulatrice 51.

Le clonage génomique de l'ARN a conduit à l'isolement d'une séquence de flanc 5' de 6,5 kb contenue dans le fragment HindlII de 12 kb. Le fragment de 688 paires de bases à partir du premier site EcoRI 5' de l'exon 1 jusqu'au site Smal dans l'exon 1 (position 40 dans le cADN) a été sous-cloné et séquencé pour les deux brins. Les données sont présentées à la Fig. 17.

Une extension d'amorce a été effectuée sur l'ARN de MCF-7 au moyen de deux oligonucléotides distincts provenant de l'exon 1. Un site de départ de transcription majeur, confirmé par les deux oligonucléotides, a été localisé à 1 paire de bases en 99 5' sur le clone de cADN le plus long. Aux positions +1 et +2, deux sites mineurs ont été observés dans la séquence du cADN, ce qui confirme que beaucoup des clones de cADN sont pratiquement en longueur complète. Pour confirmer fonctionnellement la région régulatrice du gène AR, la Demanderesse à construit un gène hybride (pXARElCAT) contenant la région de flanc 5' de l'AR d'EcoRI à Smal AR de 688 paires de bases (séquence 648 à +40 avec +1 comme site de départ de transcription majeur) provoquant l'expression d’un gène chloramphénicol acétyltransférase (CAT) sans promoteur. Ce produit construit a été à même de stimuler la transcription du gène CAT lorsqu'il est introduit de façon transitoire dans des cellules MCF-7 et l'activité a été stimulée de 6 à 7 fois par l'addition de TPA. Ceci confirme des points de vue tant structurels que fonctionnels que la Demanderesse a cloné l'extrémité 5' du gène AR. La demanderesse a construit ensuite une série de mutants par délétion 5 ' CAT contenant les séquences de l'AR -539 à +40 (Ela), -387 à +40 (Elb), -277 à +40 (Elc), -148 à +40 (Eld), -77 à +40 (Ele), -79 â +40 (Elg) ou +19 à +40 paires de bases (Elh) dans le même vecteur. L'activité de base s'est perdue lors de la délétion au-delà de la partie -77, c'est-à-dire que Elh n'a manifesté aucune activité mesurable, et tous ces produits construits ont manifesté une expression améliorée de 3,5 à 7 fois en réponse à un traitement de 40 heures par 100 ng par ml de TPA. Ces produits construits peuvent être utilisés aussi pour des dosages transitoires pour évaluer l'efficacité de morphogènes, de mitogènes, de facteurs de croissance, de médicaments ou d ' extraits de fermentation bruts quelconques sur la régulation de l'expression de l'AR, ce qui permet ainsi d'identifier de nouveaux agents thérapeutiques.

100

Les expériences de passage rapide nucléaire révèlent une transcription de l'AR augmentée de 3 à 5 fois en réponse au TPA, ce qui suggère que l'activité accrue du promoteur est au moins partiellement responsable de l’induction de l'AR par le TPA. L'analyse suivant Northern des cellules MCF-7 traitées par TPA en présence ou en 1 ' absence d ' actinomycine D identifie l'AR comme étant un ARN relativement stable ayant une demi-vie supérieure à 4 heures. L'induction de l'expression de l'AR sous l'effet du TPA présente donc des aspects multiples impliquant une transcription accrue d'un mARN stable.

9.5. Organisation intron/exon du gène AR/ domaines protéiques de l'AR, implications évolutionnaires et fonctionnelles.

La séquence génomique complète de 1'amphiréguline humaine est représentée à la Fig. 17 et la relation entre les exons et les domaines protéiques de la molécule d'AR est représentée schématiquement à la Fig. 18.

Une analyse par extension d'amorce du mARN de l'AR et des études au moyen de produits construits hybrides AR/promoteur de CAT (CAT = chloramphénicol acétyltransferase qui est un gène marqueur) localise un promoteur fonctionnel dans les 64 paires de bases en 5' avant l'extrémité du clone cADN le plus long. Par conséquent, il existe une boîte TATA de consensus à 29 paires de bases à l'amont de l'extrémité 5' de la séquence du cADN. L'extrémité 3' du gène est précédée par une séquence signal de polyadénylation de consensus à 64 nucléotides de la queue poly(A) dans le cADN. Le produit transcrit primaire du gène AR est d'environ 10,2 kb.

Six exons codent pour le précurseur de l'AR humaine et occupent 10,2 Tcb de l'ADN génomique. Les » » 101 exons de l'AR ont une longueur de 112 à 270 paires de bases et sont interrompues par des introns de 1,25 kb à 2,1 kb. Les cinq introns de l'AR interrompent la séquence codante, de sorte que beaucoup des domaines protéiques sont des produits d'un exon unique. L'exon 1 , code pour les domaines de peptides signal et 5 ' non traduit, l'exon 2 code pour le précurseur N-terminal, l'exon 5 contient la région cytoplasmique et l'exon 6 représente la région 3' non traduite. Conjointement, les exons 3 et 4 codent la protéine AR à maturité, y compris les séquences hydrophiles et les séquences analogues à EGF, de même que le domaine transmembranaire présumé. La jonction entre les exons 3 et 4 a lieu entre la deuxième boucle et la troisième de la région analogue à EGF.

Lorsque les jonctions d'exons se superposent à un alignement des séquences d'acides aminés de l'AR, de l'EGF et du TGF , il est évident que toutes ces protéines sont codées par deux exons et que 1'intron d'interruption est situé à la même position. De plus, l'exon 3' de chacun code aussi pour le domaine transmembranaire des protéines précurseurs correspondantes. Au contraire, la région semblable à l'EGF est contenue dans un exon unique dans tous les autres homologues d'EGF de mammifères pour lesquels la structure d'exon a été déterminée, notamment les 9 unités répétitives analogues à EGF dans le précurseur d'EGF (Gray, 1983, Nature, 303, 722 à 725); les trois dans le récepteur LDL (Yamamoto, 1984, Cel, 39, 27 à 38); et celle dans la fibronectine de rat (Patel, 1987,

Embo, J., 6, 2565 à 2572) conjugué et le facteur de coagulation humain XII (Cool, 1987, J. Biol. Chem., 262, 1366 à 1373). Les homologues d'invertébrés, comme le gène Notch de la Drosophile et lin-12 de C. elegans contiennent aussi des unités répétitives multiple 102 analogues à EGF (Kiud, 1986, Molec. Cell. Biol., 6, 3094 à 3108; Greenwald, 1985, Cell, 43, 583 à 590). Au contraire des gènes de mammifères, la plupart des unités répétitives analogues à EGF dans Notch sont contenues dans une région codante unique dans laquelle seuls 4 des 36 motifs sont séparés par des séquences interposées. Il est remarquable que 2 de ces 4 motifs manifestent un alignement plus serré avec l'AR qu’avec le consensus répétitif de Notch et que l'un est même interrompu par un intron à la même séquence CXC que EGF, TGFûf et AR. Le gène lin-12 de nématode contient au moins 11 unités analogues à EGF, dont 9 sont situées sur le premier exon et dont les deux dernières sont sur des exons distincts, l'unité analogue à EGF intacte étant flanquée par des introns.

Les différences de la structure des exons codant pour les unités répétitives analogues à EGF de divers organismes suggèrent qu'ils peuvent avoir des origines différentes. Un groupe contient le motif analogue à EGF délimité par des introns et l'autre groupe, dont l'AR est un membre, a un motif interrompu. La similitude des séquences entre les deux groupes pourraient être le résultat d'une évolution convergente ou bien d'une insertion d'intron après leur divergence à partir d'un gène ancestral commun.

La localisation de 1'intron dans la même séquence CXC d'EGF, de TGFo( et d'AR et de l'une des unités répétitives de Notch suggère une origine commune, mais un examen plus détaillé révèle une différence de phase des introns. La phase des introns signifie que 1'intron interrompt le cadre de lecture après le premier (I), deuxième (II) ou troisième (0) nucléotide d'un codon. La phase est, croit-on, d'importance évolutionnaire dans la mesure où elle permet le passage lent d'exons contenant un domaine 103 fonctionnel parmi diverses protéines. EGF et TGF Cl ont un intron de phase II dans l'unité analogue à EGF, tandis que l'AR et le Notch ont des introns de phase I. Un déplacement semblable d'un nucléotide est observé dans l'avant-dernier intron à l'intérieur du domaine ’ protéase du facteur B du complément et de l'élastase (Cambell, 1983, PNAs, 80, 4464; Swift, 1984, J. Biol. Chem. 259, 14271). Les positions non statistiques de ces introns peuvent impliquer qu'une séquence d'insertion d'introns spécifique existe dans ces gènes. En variante, il peut y avoir eu une pression de sélection pour couper la région codante à ce cycle. La comparaison des séquences aux sites de jonctions exon-intron dans l'unité analogue à EGF pour l'EGF, le TGF, l'AR humaine et la première unité répétitive de Notch n'indique pas d'unités répétitives directes telles qu'elles sont souvent observées avec les éléments transposables. Toutefois, les quatre possèdent la séquence 'gtaagt' formant la limite de la jonction. Cette séquence peut jouer un certain rôle dans l'origine ou dans l'épissage de cet intron.

Les EGF homologues viraux ne contiennent pas d'introns, mais un alignement entre VGF, EGF, TGF et AR révèle une homologie s'étendant à travers le domaine transmembranaire, tandis que le facteur de croissance des virus de la myxomatose et du papillome de Shope se termine avant cette région hydrophobe. Des études récentes apportent des indices que le précurseur de TGF û( est synthétisé à l'état de protéine transmembranaire et que la coupure protéolytique différencielle conduit à la sécrétion de formes plus grandes qui peuvent être spécifiques du type de cellule (Teixido, 1987, Nature, 326, 883 à 885).

D'autres EGF homologues qui contiennent des domaines transmembranaires sont notamment les facteurs 104 de coagulation, le LDL et les gènes Notch et lin-12 homéotiques, bien qu'aucun ne soit adjacent à une unité répétitive analogue à EGF. La présence du motif EGF dans différents précurseurs liés à la membrane suggère que dans certaines circonstantes, il peuvent être traités comme un facteur de croissance sécrété ou bien peuvent rester associés à la membrane et peuvent jouer un rôle dans la communication intercellulaire et/ou intracellulaire.

Certains des AR homologues comprennent des gènes homéotiques d'invertébrés. Les produits de gènes homéotiques sont impliqués dans la régulation du développement cellulaire. Par exemple, le produit de gène Notch intervient dans la conversion correcte d'une cellule ectodermique en un neuroblaste ou en un dermoblaste. Dans les mutants Notch, toutes ces cellules deviennent des cellules nerveuses et la descendance, toute du cerveau et aucune de la peau, meurt. Un gène homéotique peut fonctionner de façon autocrine pour établir ou entretenir un état déterminé dans des cellules exprimant le produit de gène et peut être impliqué dans la régulation de tels états dans des cellules adjacentes à l'intervention d'interactions de cellule à cellule. Le fait que l'AR intervient aussi ou n'intervient pas dans la régulation de l'état de développement de certains types de cellules devrait être soumis à investigation.

9.6. Traitement de 1'amphiréquline à maturité.

La caractérisation du cADN de l'AR a révélé que les formes à 78 et 84 acides aminés de l'AR sont synthétisées comme partie médiane d’un précurseur transmembranaire de 252 acides aminés (section 8.2 ci-dessus). Les sites pour la coupure protéolytique du précurseur de l'AR qui pourraient conduire au dégagement de l'AR à maturité ne concordent pas avec 105 les sites de coupure par une protéase connue quelconque. A l'extrémité N-terminale, les sites sont Asp-Asp/Ser-Val et Glu-Gln/Val-Val, tandis que le site C-terminal est Glu-Lys/Ser-MET. Les deux formes de l'AR semblent être le résultat d'un traitement protéolytique alternant d'un précurseur commun, du fait que tout le cADN et les clones génomiques ont révélé la même séquence dans cette région. Un fait intéressant est qu'un intron se trouve entre les deux sites de coupure N-terminaux et qu'il est possible que ce "glissement d'intron" puisse aussi expliquer ces différences.

Les cellules MCF-7 produisent 80% de leur AR sous la forme à 84 acides aminés qui est la plus grande, tandis que la lignée cellulaire du choriocarcinome HTB-36 produit 80% de son AR sous la forme à 78 acides aminés qui est la plus petite. Pour déterminer si cette différence est associée à des altérations au niveau de l'ADN, la Demanderesse a utilisé la réaction en chaîne de la polymérase (Scharf, 1986, Science, 233, 1076 à 1078) pour isoler l'exon 3 de l'AR des cellules MCF-7 et des cellules HTB 36, lesquelles constituent une lignée qui produit constitutivement de grandes quantités de mARN d'AR. Un oligonucléotide "sens" spécifique de 1'intron de l'AR et un oligonucléotide "antisens" provenant de la région de l'exon 3 ont été utilisés pour amplifier spécifiquement le fragment intermédiaire de 220 paires de bases du gène AR des deux sources d'ADN. L'analyse par séquence directe n'a pas révélé de désaccord dans les jonctions intron/exon, ni dans la séquence codante de l'exon 3 entre ces deux sources d'ADN humain, ce qui suggère davantage que les deux formes de l'AR résultent d'une coupure protéolytique alternante du précurseur.

106 9.7. Comparaison de structure des facteurs de croissance AR et analogues à EGF.

L'AR manifeste une nette homologie de séquence avec d'autres protéines analogues à EGF, avec la conservation des 6 cystéines impliquées dans trois liaisons disulfure qui définissent la structure secondaire des facteurs de croissance à maturité. Des comparaisons antérieures (assistées par ordinateur) des séquences d'acides aminés ont conduit à la répartition des motifs analogues à EGF en deux groupes distincts : les facteurs de croissance et les facteurs de coagulation du sang (voir Fig. 13). La Demanderesse a sélectionné deux motifs de séquence pour la comparaison avec l'AR et d'autres ADN ou séquences protéiques connus. La sélection a été basée sur l'aptitude apparente de ces séquences à faire la distinction entre les deux groupes de protéines et parce que de très rares interruptions ont été nécessaires pour un alignement optimal. Les séquences exactes sont données au tableau I. La première région correspond aux 11 premiers acides aminés de la seconde boucle de l'EGF et la deuxième correspond à la troisième boucle de cystéine de l'EGF. Quatre exemples représentatifs de chaque groupe de facteurs de croissance et de facteurs de coagulation du sang ont été sélectionnés pour engendrer des séquences de consensus basées sur leur homologie de fonction et de structure bien établie. Les séquences humaines ont été sélectionnées chaque fois que la chose a été possible, du fait que la Demanderesse désirait en dernier recours les comparer à l'AR humaine. Les facteurs de croissance en question sont : EGF, TGF et VGF humain et le facteur de croissance du papillome de Shope et les facteurs de coagulation sont les facteurs IX, X et XII humains et la protéine C. L'AR a été soumise aussi à une 107 comparaison avec les bases de données pour ces deux blocs d'homologie. La séquence de consensus a été pondérée sur la base de la fréquence avec laquelle un reste apparaît dans une position donnée.

L'analyse structure-fonction de divers dérivés de TGFC^ , VGF et EGF a récemment conduit à l'identification de divers restes qui sont nécessaires pour l'activité biologique de ces facteurs de croissance. Les protéines recombinantes, les peptides synthétiques, les dérivés chimiques spécifiques d'un site et la dégradation protéolytique ont tous été utiles pour produire des molécules modifiées. Certaines généralisations comprennent (les positions sont relatives à l'alignement à la Fig. 15) : les 6 cystéines (positions 1, 19, 15, 26, 28 et 39) et leurs boucles disulfure (1-15, 9-26, 28-37) sont nécessaires pour l'activité biologique, les prolongements N-terminaux ont peu d'effet sur l'activité, un reste aromatique (F, Y) est nécessaire à la position 8, une modification non conservative de γ32# d41 ou L^2 conduit à une perte d'activité et/ou à une grave baisse de la fixation sur le récepteur ou de 1'autophosphorylation.

A l'exception des deux derniers, l'AR

satisfait à tous les critères qui définissent les restes nécessaires pour la fixation au récepteur de l'EGF et/ou l'activité mitogène. L'AR à maturité est coupée juste avant D^l et est absolument exempte de celui-ci et de la leucine 42 "cruciale", mais entre encore en compétition pour la fixation sur les récepteurs de l'EGF et se substitue à l'EGF dans certains dosages des mitogènes. Toutefois, ces différences peuvent être responsables de la cinétique non saturable de fixation sur les récepteurs et de ses différences fonctionnelles marquées avec l'EGF dans 108 certains dosages, comme la synergie avec TGFyô, l'effet différentiel sur les sous-clones de A431 sélectionnés, les liaisons croisées, les dosages de phosphorylation , et l'aptitude à la fixation sur l'ADN. La région extrêmement hydrophile à l'extrémité N-terminale de l'AR a maturité peut également conférer certaines de ces différences dans la fixation sur le récepteur ou l'activité biologique.

9.8. L'AR comme sous-catégorie de la superfamille EGF.

La Demanderesse a calculé une matrice des distances évolutionnaires basée sur l'alignement de la Fig. 13 et l'analyse par ordinateur fondée sur le tableau I. Cette matrice a été utilisée pour déduire un arbre d'évolution pour la superfamille EGF. Le critère de recherche nécessite la présence des cystéines et ajoute un point pour chaque reste qui convient à la séquence de consensus pondérée. Cet arbre d'évolution prévoit que l'AR se situe dans une nouvelle sous-catégorie des facteurs de croissance analogues à EGF, sur la base de l'homologie tant de structure que de fonction. Un tel modèle prévoit que d'autres membres de cette famille de facteurs de croissance peuvent exister et qu'ils peuvent être identifiés par homologie avec les diagrammes de séquences ci-dessus basés sur un critère ternaire : une cote combinée de deux régions de facteurs de croissance supérieure a 20, une cote combinée de régions de facteurs de coagulation inférieure à 20 et une cote combinée de régions d'AR supérieure à 20. Toutes les nouvelles molécules satisfaisant à ces critères seraient à prévoir comme ayant une certaine homologie de fonction avec EGF, TGFty , VGF ou AR. Les molécules ayant une cote combinée de régions d'AR supérieure à 40 seraient à classer comme membres de la famille AR à l'intérieur de la superfamille EGF et entreraient dans le cadre de la 109 présente invention.

10. Exemple; expression bactérienne de 1'amphiréquline.

10.1. Matériels et procédés.

10.1.1. Constructions de plasmides.

Le plasmide pARDl. Le plasmide pARDl contient le fragment de cADN de 1,4 kb EcoRI (pARl) dans pEMBLl8 avec une modification de T en C à la position 532 des nucléotides dans le cADN, correspondant à la séquence valine-valine à l'extrémité amino-terminale de l'AR à maturité. Cette modification de la base a été effectuée par mutagénèse dirigée au site et a été confirmée par analyse de la séquence. Le produit construit donne accès à la jonction entre le domaine amino-terminal du précurseur de l'AR et la région hydrophile en créant un site Ddel (CTAAG).

Le plasmide pARSTOP. Le plasmide pARSTOP est un produit construit intermédiaire utilisé dans la préparation d'un vecteur de sécrétion de l'AR. Le pARDl a été mis à digérer avec Sspl et Xbal et le fragment de 525 paires de bases codant pour les 9 acides aminés carboxy-terminaux de l'AR à maturité, les domaines transmembranaire et cytoplasmique et la région 3 ' non traduite a été isolé. Le fragment (Sspl-Xbal) de 4,7 kb contenant la partie amino-terminale restante du cADN de l'AR a été purifié sur gel et assemblé par ligation avec les oligonucléotides ARSTOP1 et ARSTOP2 complémentaires traités par la kinase et renaturés (voir ci-après). Ces oligonucléotides ont une extrémité 5' non collante compatible avec un site Sspl, suivie d'une séquence codant pour les 9 acides aminés carboxyterminaux de la séquence de l'AR à maturité, d'un codon stop TAA et de sites EcoRV et XbAI.

110

YFGERCGEK* EcoRV/Xbal ARSTOP1 5' ATTTCGGTGAACGGTGTGGGGAAAAGTAAGATATCT

ARSTOP2 3' TAAAGCCACTTGCCACACCCCTTTTCATTCTATAGAGTC

- Le plasmide pbAR. Le plasmide pbAR contient une séquence signal TGFß sans promoteur fixée sur la forme à maturité de l'AR comprenant 78 acides aminés.

Il a été construit en assemblant par ligation les oligonucléotides bLARN3 et bLARN4 avec le fragment Ddel à Xbal de 240 paires de bases provenant de pARSTOP dans PEMBL18 digéré par EcoRl/Xbal. bLARN3 et bLARN4 sont complémentaires et créent un surplomb 5'EcoRI et un surplomb 3'Ddel et un site Nael interne unique compatible avec celui proche de 1'extrémité carboxyterminal de la séquence signal TGF ß . La ligation détruit le site Ddel et régénère la séquence correcte des acides aminés valine-valine à l'extrémité aminoterminale de l'AR à maturité.

Sstll

AGVVKPPQNKTESE PHIL1 5' GGGAGTAGTTAAGCCGCCCCAAAACAAGACGGAAAGTGA

PHIL2 3' CGCCCTCATCAATTCGGCGGGGTTTTGTTCTGCCTTTCACT

NTSDKPKRKKKGG PHIL1 5 ' AAATACTTCAGATAAACCCAAAAGAAAGAAAAAGGGAGG

PHIL2 3' TTTATGAAGTCTATTTGGGTTTTCTTTCTTTTTCCCTCC

EcoRI

KNGKNRRNRKKKN PHIL1 5' caaaaatggaaaaaatcgaagaaacagaaagaagaag PHIL2 3 ' gtttttaccttttttagcttctttgtctttcttcttcttaa \ ί 111

Le plasmide pDCHBARl. Le plasmide pDCHBARl est un vecteur d'expression de mammifère (Fig. 19) conçu pour sécréter la forme à maturité de l'AR traitée contenant 78 acides aminés. Il contient la séquence signal TGF/3/AR à maturité provenant de pBAR actionnée par le promoteur CMV/HIV, que flanque un signal de polyadénylation de SV40. Le vecteur contient aussi SV2dhfr dans la même orientation de transcription. PSVDR/boM a été soumis à la digestion par Nael et Xbal et le vecteur de 6 kb a été séparé de la séquence codante OncoM excisée. Le pbAR a aussi été mis à digérer avec Nael et Xbal, et le fragment de 260 paires dé bases codant pour les 5 acides aminés carboxyterminaux de la séquence signal TGF Jb, et la séquence de l'AR à maturité de 78 acides aminés suivie d'un codon d'arrêt et de sites EcoRV et Xbal. Les jonctions ont été vérifiées par analyse de la séquence.

Le plasmide pDCHBPHILE. Le plasmide pDCHBPHILE est un vecteur d'expression de mammifère conçu pour la sécrétion d'une protéine AR/EGF hybride. Ce plasmide est aussi configuré pour faciliter la fusion future de produits construits entre le domaine hydrophile de l'AR et d'autres facteurs de croissance. Ce produit construit a été formé en unissant par ligation le fragment de vecteur pDCHBARl digéré par Sstll/xbal de 6,5 kb, le fragment EcoRl/Xbal de 175 paires de bases contenant le gène EGF humain synthétique et les oligonucléotides PHIL1 et PHIL2. Ces oligonucléotides sont complémentaires avec les extensions 5' Sstll et 3' EcoRI et codent pour le dernier reste de la séquence signal TGFß et l'ensemble du domaine hydrophile de l'AR. Le pDCHBARl apporte le promoteur CMV/HIV, sauf le dernier acide aminé de la séquence signal TGFß, et la séquence de polyadénylation de SV40. Le fragment EGF a été acquis chez le Docteur Timothy M. Rose (Oncogen) et 112 comprend des sites se prêtant à une manipulation future.

10.1.2. Préparation du vecteur pTAC.

Le plasmide TacPak/EGF a été acquis chez le Docteur Timothy M. Rose (Oncogen) et est composé des unités suivantes : le promoteur hybride trp-lac et la séquence Shine-Delgarno du gène Cro isolé à l'état de fragment BglOO/BamHI du vecteur d'expression pl35-l# lui-même issu de pDR540 (Pharmacia); la séquence phosphatase alcaline provenant des oligonucléotides synthétiques TacPakl et TacPak2 (Docteur Rose, Oncogen), la séquence EGF synthétique apportée au départ du plasmide pBM22/PAK/EGF; la région de terminaison de transcription; le squelette de pBR322 avec le gène de résistance à la néomycine, tous en provenance du plasmide pl35-l. Le plasmide TacPak/EGF a été mis à digérer avec BamHI, complété avec 2 bases au moyen de dATP et de dGTP pour créer un site compatible avec Sali complété par 2 bases, et ensuite mis à digérer avec Pvul. Cette digestion élimine le gène EGF synthétique et la plus grande partie de la séquence signal phosphatase alcaline, mais laisse subsister le promoteur Tac, et les séquences Shine-Delgarno et le codon ATG d'initiation intacts. Le fragment de 2 kb a été purifié sur gel.

10.1.3. Préparation du fragment de cADN d'amphiréguline modifié.

Le plasmide pARSTOP a été mis à digérer avec Sali, complétée avec 2 bases au moyen de TTP et de dCTP pour créer un site compatible avec une extension BamHI complétée par 2 bases (dATP, dGTP), puis mis à digérer avec Ddel et BglI. Cette dernière digestion a été nécessaire pour éliminer l'ADN migrant simultanément hors du fragment souhaité de 242 paires de bases qui code pour la forme courte de l'AR à maturité commençant 113 à VKPP et se terminant à CGEK, que suit un codon stop introduit par voie synthétique. Le fragment de 243 paires de bases a été purifié sur gel.

10.1.4. Préparation des oligonucléotides synthétiques a ALKPARl et ALKPAR2.

Les oligonucléotides synthétiques complémentaires ALKPARl et ALKPAR2 ont été construits avec un surplomb 5 ' Pvul compatible avec un fragment Pvul/BamHI partiellement complété de TacPak/EGF et une extension 31 Ddel compatible avec le fragment DdEl/SalI partiellement complété de pARSTOP. Ils ont été synthétisés sur un appareil pour synthèse des oligonucléotides Applied Biosystems et purifiés sur un gel d’acrylamide. Des phosphates ont été ajoutés sur les oligonucléotides au moyen de kinase de T4 et des quantités équimolaires en ont été renaturées par refroidissement lent après dénaturation thermique.

Pvul

IALALLPLL ALKPARl 5' CGCCCTCGCACTTCTCCCACTGCTG

ALKPAR2 3' TAGCGGGAGCGTGAAGAGGGTGACGAC

Ddel FTPVTKAVV ALKPARl 5 ' TTCACTCCAGTGACAAAAGCTGTAG 3 ' ALKPAR2 3' AAGTGAGGTCACTGTTTTCGACATCAAT 5' 10.1.5. Ligation et isolement de pTacAPARl.

Le fragment AR Ddel à Sali partiellement complété de 243 paires de bases, le fragment de vecteur Pvul/BamHI partiellement complété de 2,8 kb de TacPak/EGF et les oligonucléotides ALKPAR1+2 renaturés et traités par la kinase ont été assemblés au moyen d'ADN ligase, puis transformés" dans des cellules JM109 de E. coli compétentes et ensuite sélectionnés sur des plaques LB/néomycine. Le produit construit correct a 114 été confirmé par la digestion avec des enzymes de restriction et séquençage de l'ADN. La séquence de pTacAPAR est donnée à la Fig. 20.

10.1.6. Préparation du fragment de gène hybride domaine hydrophile d'AR/EGF.

v On a mis le plasmide pDCHBPHILE à digérer avec

Sstll et Xbal pour engendrer le fragment de 286 paires de bases qui code pour les 2 derniers restes de la séquence signal TGF fi> (AG), 37 restes du domaine hydrophile d'AR (VVKP ... RKKK) et la séquence synthétique de 53 restes de la séquence EGF humain à maturité (NSDS ... WELR). Ce fragment de 286 paires de bases a été purifié sur gel.

10.1.7. Préparation des oligonucléotides APAREGF1 et APAREGFl.

Les olinucléotides synthétiques complémentaires APAREGFl et APAREGF2 sont conçus avec un surplomb 5 ' Pvul compatible avec le fragment Pvul/Xbal de pTacAPARl et avec une extension 31 Sstll compatible avec le fragment Sstll/Xbal de pDCHBPHILE. Les oligonucléotides ont été synthétisés sur un appareil pour la synthèse des oligonucléotides Applied Biosystems et purifiés sur un gel d'acrylamide. Des phosphates ont été ajoutés sur les oligonucléotides au moyen de kinase de T4 et des quantités équimolaires ont été renaturées par refroidissement lent après dénaturation thermique.

115

Pvul

IALALLPLL APAREGF1 5 * CGCCCTCGCACTTCTCCCACTGC

APAREGF2 3' TAGCGGGAGCGTGAAGAGGGTGACG

Sstll

F T P V T K

APAREGFl 5 ’ TGTTCACTCCAGTGACACC 31 APAREGF2 3' ACAAGTGAGGTCACTGTGGGG 5' 10.1.8. Ligation et isolement de pTACAPHILE.

Le fragment Sstll/Xbal de 286 paires de bases codant pour le domaine hydrophile de l'AR uni à la séquence EGF à maturité, le fragment de vecteur pTacAPARl PvUl/Xbal de 2,8 kb et les oligonucléotides APAREGFl+2 renaturés et traités par la kinase ont été assemblés au moyen d*ADN ligase, transformés dans des cellules JM109 d'E. coli compétentes et sélectionnés sur des plaques LB/néomycine. Le produit construit correct a été confirmé par digestion avec des enzymes de restriction et séquençage de l'ADN. La séquence des nucléotides de pTacAPHILE est donnée à la Fig. 21. Le porduit de traduction prévu devrait être coupé dans le dipeptide Ala-Gly juste après la séquence signal phosphatase alcaline, ajoutant ainsi un reste supplémentaire (glycine) au domaine hydrophile de l'AR. Les restes nucléotidiques qui diffèrent de la séquence humaine normale sont écrits en caractères gras (Fig. 20).

10.1.9. Purification de 1'amphiréguline recombinante.

On a transformé les plasmides pTacAPARl et pTacAPHILE dans des cellules JM109 d'E. Coli compétentes qu'on a fait croître jusqu'à la confluence dans 10 ml de milieu LB à 37°C jusqu'à une A^qq de 0,7. On a soumis ensuite les cultures à l'induction au moyen de 100 microgrammes d'iPTG et on a laissé la croissance se poursuivre pendant 24 à 72 heures. On a centrifugé 116 les cultures deux fois à 5000 tours par minute, à chaque reprise pendant 15 minutes, on a recueilli le culot et on a poursuivi la purification avec le surnageant. On a concentré les échantillons de 10 fois dans un appareil d'ultrafiltration Amicon avec des membranes YM5 (coupure à un poids moléculaire de 5000). On a dilué le concentré avec 5 volumes d'eau MilliQ et on l'a redilué au dixième du volume orriginal de culture. On a ajouté de l'acide acétique glacial jusqu'à IM, puis conservé les échantillons à 4°C pendant 2 à 24 heures. On a centrifugé les échantillons à 19.000 tours par minute pendant 20 minutes à 4°C dans des tubes Oakridge dans le rotor SS34, puis on a extrait le culot avec 20 ml d'acide acétique IM et rassemblé les surnageants en pool. On a ensuite soumis les surnageants clarifiés à la dialyse contre de l'acide acétique 0,1M pendant 2 jours, puis on les a lyophilisés et conservés à -20°C.

Par immunotransfert et évaluation de l'activité inhibitrice de croissance (GIA), on a dosé la protéine AR dans les culots de cellules et les surnageants bruts portés à sec. On a fait passer le culot cellulaire provenant de 50 microlitres de culture confluente ou de 100 à 200 microlitres de surnageant porté à sec sur un gel de polyacrylamide à 16% de tricine, puis on a fait la coloration au vert solide et opéré le transfert sur nitrocellulose. On a exécuté les Western blots comme dans décrit dans la section 7.1.6. ci-dessus.

10.2. Résultats et discussion.

Les culots de cellules des transformants véhiculant pTacAPARl ont révélé d'abondantes quantités d'une protéine immunoréactive migrant à 10 kD, ainsi qu'une certaine quantité de produits de dégradation et dimères probables. Les surnageants contenaient environ 117 100 à 200 ng par ml d'AR. immunoréactive sécrétée. La mesure de l'activité inhibitrice de croissance des surnageants a indiqué environ 150 ng par ml d'AR pour la lignée cellulaire A431-A3 témoin, la comparaison étant faite avec des étalons d'AR natifs purifiés. De grandes quantités de protéine immunoréactive ont été produites dans ces systèmes et sont restées principalement contenues dans les cellules. Le dosage sur les préparations périplasmiques et les surnageants a révélé une sécrétion de protéines actives après 2 à 3 jours de croissance.

Le plasmide pTacAPHILE constitue un moyen commode pour fixer le domaine hydrophile de l'AR sur l'extrémité N-terminale d'un gène cloné quelconque, cette région pourrait conférer des caractéristiques de fixation modifiées au récepteur normal du ligand, servir de séquence de localisation nucléaire, se fixer sur 1'ADN ou permettre un transport à travers les membranes lipidiques ou autres qui sont normalement imperméables au facteur attaché.

11. Dépôt des microorganismes.

Les microorganismes ci-après ont été déposés a 1'Agricultural Research Culture Collection, Northern Regional Research Center (NRRL) et ont reçu les numéros d'accès suivants :

Microorganimes Plasmide N° d'accès

Escherichia coli HB101 pARl

Escherichia coli HB101 pARH12

Escherichia coli HB101 pARHö

Escherichia coli JM109 pTacAPARl

Escherichia coli JM109 pTacAPHILE

L'invention n'est pas limitée aux lignées 118 cellulaires déposées ni aux formes de réalisation décrites qui sont susceptibles de nombreuses variantes et modifications sans sortir du cadre de l'invention.

Il convient d'observer aussi que tous les numéros de restes d'acides aminés et de paires de bases et toutes les dimensions indiquées pour les nucléotides et peptides ont une valeur approximative et une utilité descriptive.

Claims (39)

119

1. Protéine, caractérisée en ce qu'elle a une î séquence d'acides aminés comprenant î 1 10 20 VVKPPQNKTE SENTSDKPKR K K K. G G K 30 40 50 N G K N RRNRKKKNPC NAEFQNFCIH 60 70 GECKYIEHLE AVTCKCQQEY FGERCG

78. K

2. Protéine suivant la revendication 1, caractérisée en ce qu'elle a un poids moléculaire d'environ 8500 à 25.000 daltons.

3. Protéine suivant l'une quelconque des revendications 1 et 2, caractérisée en ce qu'elle a un pi d'environ 7,6 à 8,0.

4. Protéine suivant la revendication 1, caractérisée en ce qu'elle est glycosylée.

5. Protéine suivant la revendication 1, caractérisée en ce qu'elle est non glycosylée.

6. Protéine, caractérisée en ce qu'elle a une séquence d'acides aminés comprenant î 1 10 20 SVRVEQVVKP PQNKTESENT SDKPK 30 40 50 RK K KG GKNGKNRRNR KKKNPCNAEF 60 70 QNFCIHGECK YIEHLEAVTC KCQQE 120 80 84 Y F G E R CGEK

7. Protéine suivant la revendication 6, caractérisée en ce qu'elle a un poids moléculaire d'environ 9100 à 25.000 daltons.

8. Protéine suivant l'une quelconque des revendications 6 et 7, caractérisée en ce qu'elle a un pi d'environ 7,6 à 8,0.

9. Protéine suivant la revendication 6, caractérisée en ce qu'elle est glycosylée.

10. Protéine suivant la revendication 6, caractérisée en ce qu'elle est non glycosylée.

11. Protéine suivant l'une quelconque des revendications 1 à 5 ou peptide ou fragment de celle-ci, caractérisé en ce qu'il inhibe la croissance de lignées de cellules cancéreuses humaines d'origine épithéliale.

12. Protéine suivant la revendication 11, caractérisée en ce que la lignée de cellules cancéreuses humaines d'origine épithéliale comprend des cellules du carcinome épidermoïde de la vulve A431 ou de l'adénocarcinome mammaire HTB132.

13. Protéine suivant l'une quelconque des revendications 1 à 5 ou peptide ou fragment de celle-ci, caractérisé en ce qu'il stimule la croissance des fibroblastes du prépuce humain cultivés in vitro.

14. Protéine suivant la revendication 13, caractérisée en ce que les fibroblastes du prépuce humain constituent les lignées de cellules Sakamoto ou Goodwin.

15. Protéine suivant l'une quelconque des revendications 1 à 5 ou peptide ou fragment de celle-ci, qui comprend un régulateur bifonctionnel de la 121 croissance cellulaire qui inhibe la croissance de lignées de cellules cancéreuses humaines d'origine épithéliale et stimule la croissance de fibroblastes du prépuce humain cultivés in vitro.

16. Protéine suivant la revendication 15, caractérisée en ce la lignée de cellules cancéreuses humaines d'origine épithéliale comprend des cellules du carcinome épidermoïde de la vulve A431 ou de l'adénocarcinome mammaire HTB132.

17. Protéine suivant l'une quelconque des revendications 15 et 16, caractérisée en ce que les fibroblastes du prépuce humain constituent les lignées de cellules Sakamoto ou Goodwin.

18. Protéine suivant l'une quelconque des revendications 11 à 17 ou peptide ou fragment de celle-ci, caractérisé en ce que l'inhibition ou la stimulation de la croissance cellulaire est déterminée par 1'épreuve suivante : (a) des cupules de microtitrage contenant chacune 3,5 x 10^ cellules dans 50 microlitres de milieu d'essai comprenant du DMEM additionné de 5% de sérum foetal bovin inactivé par la chaleur (FBS), de pénicilline/streptomycine et de glutamine sont incubées pendant 3 heures; (b) 50 microlitres du milieu d'essai contenant de 1'amphiréguline sont introduits dans chaque cupule expérimentale, tandis que 50 microlitres du milieu d'essai exempt d'amphiréguline sont introduits dans chaque cupule témoin et sont incubés à 37eC pendant 2 à 3 jours; (c) 100 microlitres d'une solution comprenant de la ^25j_^0^0_2 · _125_j_^^SOXyUrj[(jine (i-udR) sont introduits dans chaque cupule et incubés à 37°C pendant 4 à 6 heures; (d) le milieu est éliminé et chaque cupule est 122 lavée une fois avec du PBS; (e) 200 microlitres de méthanol sont introduits dans chaque cupule et incubés pendant 10 minutes à la température ambiante, puis éliminés? ' (f) 200 microlitres d'une solution d'hydroxyde de sodium IM sont introduits dans chaque cupule et incubés à 37°C pendant 30 minutes, et (g) la solution d'hydroxyde de sodium IM est collectée et soumise au comptage dans un compteur gamma, dans lequel la présence des coups de radioactivité est une mesure de l'incorporation de la •^^^I-IUdR et de la prolifération cellulaire, tandis que l'absence des coups est indicatrice de l'inhibition de la prolifération cellulaire.

19. Protéine suivant l'une quelconque des revendications 6 à 10 ou peptide ou fragment de celle-ci, caractérisé en ce qu'il inhibe la croissance de lignées de cellules cancéreuses humaines d'origine épithéliale.

20. Protéine suivant la revendication 19, caractérisée en ce que la lignée de cellules cancéreuses humaines d'origine épithéliale comprend des cellules du carcinome épidermoïde de la vulve A431 ou de l'adénocarcinome mammaire HTB132.

21. Protéine suivant l'une quelconque des revendications 6 à 10 ou peptide ou fragment de celle-ci, caractérisé en ce qu'il stimule la croissance des fibroblastes du prépuce humain cultivés in vitro.

22. Protéine suivant la revendication 21, caractérisée en ce que les fibroblastes du prépuce humain constituent les lignées de cellules Sakamoto ou Goodwin.

23. Protéine suivant l'une quelconque des revendications 6 à 10 ou peptide ou fragment de celle-ci, qui comprend un régulateur bifonctionnel de la i i i i i 123 croissance cellulaire qui inhibe la croissance de lignées de cellules cancéreuses humaines d'origine épithéliale et stimule la croissance de fibroblastes du prépuce humain cultivés in vitro.

24. Protéine suivant la revendication 23, caractérisée en ce que la lignée de cellules cancéreuses humaines d'origine épithéliale comprend des cellules du carcinome épidermoïde de la vulve A431 ou de l'adénocarcinome mammaire HTB132.

25. Protéine suivant l'une quelconque des revendications 23 et 24, caractérisée en ce que les fibroblastes du prépuce humain constituent les lignées de cellules Sakamoto ou Goodwin.

26. Protéine suivant l'une quelconque des revendications 19 à 25 ou peptide ou fragment de celle-ci, caractérisé en ce- que l'inhibition ou la stimulation de la croissance cellulaire est déterminée par 1'épreuve suivante : (a) des cupules de microtitrage contenant chacune 3,5 x 104 cellules dans 50 microlitres de milieu d'essai comprenant du DMEM additionné de 5% de sérum foetal bovin inactivé par la chaleur (FBS), de pénicilline/streptomycine et de glutamine sont incubés pendant 3 heures; (b) 50 microlitres du milieu d'essai contenant de 1'amphirêguline sont introduits dans chaque cupule expérimentale, tandis que 50 microlitres du milieu d'essai exempt d'amphirêguline sont introduits dans chaque cupule témoin et sont incubés à 37°C pendant 2 à 3 jours; (c) 100 microlitres d'une solution comprenant de la 125];_i0a0_2 ,-125_x_(j4SOXyUri(jine (1-UdR) sont introduits dans chaque cupule et incubés à 37°C pendant 4 à 6 heures; (d) le milieu est éliminé et chaque cupule est 124 lavée une fois avec du PBS; (e) 200 microlitres de méthanol sont introduits dans chaque cupule et incubés pendant 10 minutes à la température ambiante, puis éliminés; (f) 200 microlitres d'une solution d'hydroxyde de sodium IM sont introduits dans chaque cupule et incubés à 37eC pendant 30 minutes, et (g) la solution d'hydroxyde de sodium IM est collectée et soumise au comptage dans un compteur gamma, dans lequel la présence des coups de radioactivité est une mesure de l'incorporation de la •*-^I-IUdR et de la prolifération cellulaire, tandis que l'absence des coups est indicatrice de l'inhibition de la prolifération cellulaire.

27. Amphiréguline, facteur bifonctionnel de régulation de la croissance, obtenue par le procédé comprenant ; (a) la culture de cellules MCF-7 en présence de 13-acétate de 12-0-tétradécanoylphorbol-13 (TPA); (b) la collecte du milieu conditionné des cellules MCF-7, et (c) l'isolement de l'amphiréguline hors du milieu conditionné. 28, - Séquence nucléotidique codant pour le précurseur de 1'amphiréguline comprenant la séquence nucléotidique codante, en substance telle qu'illustrée : à la Fig. 16, environ du reste de nucléotide n° 1 jusqu'à environ le reste de nucléotide n° 1243. 29. -Précurseur de 1'amphiréguline comprenant la séquence d'acides aminés, en substance tel qu'illustré à la Fig. 16, environ du reste d'acide aminé n° 1 jusqu'à environ le reste d'acide aminé n° 252. 30, - Procédé pour produire 1'amphiréguline, caractérisé en ce qu'il comprend : 125 (a) la culture d'une cellule d1Escherichia coli contenant une séquence nucléotidique codant pour 1'amphiréguline sous le contrôle d'une seconde séquence nucléotidique qui régule l'expression du gène de façon * qu'un peptide ou une protéine ayant l'activité de 1'amphiréguline soit produit par la cellule d*Escherichia coli, et (b) l’isolement de 1'amphiréguline hors de la culture.

31. Procédé suivant la revendication 30, dans lequel la séquence nucléotidique codant pour 1'amphiréguline comprend la séquence nucléotidique en substance telle qu'illustrée à la Fig. 16, du nucléotide n° 1 au nucléotide n° 1243.

32. Procédé suivant la revendication 30, dans lequel la seconde séquence nucléotidique qui régule l'expression du gène comprend un promoteur Tac.

33. Procédé pour produire 1'amphiréguline, caractérisé en ce qu1 il comprend : (a) la culture de la souche JM 109 d'Escherichia coli transformée par le plasmide pTacAPARl tel que déposé au NRRL avec le numéro d'accès , et (b) l'isolement de 1'amphiréguline hors de la culture,

34. Procédé pour produire 1'amphiréguline, caractérisé en ce qu'il comprend : r. (a) la culture de la souche JM 109 d'Escherichia coli transformée par le plasmide pTacAPHILE tel que déposé au NRRL avec le numéro d'accès , et (b) l'isolement de 1'amphiréguline hors de la culture.

35. Cellule manipulée par génie génétique, caractérisée en ce qu'elle contient une séquence nucléotidique codant pour 1'amphiréguline sous le contrôle d'une seconde séquence nucléotidique qui 126 régule l'expression du gène de façon que la cellule produise de l'amphiréguline. 36, - Cellule manipulée par génie génétique suivant la revendication 35, caractérisée en ce que la séquence nucléotidique codant pour l'amphiréguline comprend la séquence nucléotidique en substance telle qu'illustrée à la Fig. 16, du nucléotide n° 528 au nucléotide n° 761. 37, - Cellule manipulée par génie génétique suivant l'une quelconque des revendications 35 et 36, caractérisée en ce qu'elle est une cellule d1Escherichia coli. 38, - Cellule manipulée par génie génétique suivant l'une quelconque des revendications 35 et 36, caractérisée en ce que la seconde séquence nucléotidique qui contrôle l'expression du gène comprend un promoteur Tac. 39, - Plasmide pARl, tel que contenu dans une lignée cellulaire d'Escherichia coli portant le plasmide déposée au NRRL sous le numéro d’accès 40, - Plasmide pARH12, tel que contenu dans une lignée cellulaire d'Escherichia coli portant le plasmide déposée au NRRL sous le numéro d'accès 41, - Plasmide pARH6, tel que contenu dans une lignée cellulaire d'Escherichia coli portant le plasmide déposée au NRRL sous le numéro d'accès 42, - Plasmide pTacAPARl, tel que contenu dans une lignée cellulaire d'Escherichia coli portant le plasmide déposée au NRRL sous le numéro d'accès 43, - Plasmide pTacAPHILE, tel que contenu dans une lignée cellulaire d1 Escherichia coli portant le plasmide déposée au NRRL sous le numéro d'accès 44, - Anticorps, caractérisé en ce qu’il reconnaît un épitope de l'amphiréguline. 45, - Anticorps suivant la revendication 44, 127 / caractérisé en ce que l'anticorps comprend la séquence d'acides aminés s DTYSGKREPFSGDHSADGFE. V r

46. Anticorps suivant la revendication 44, caractérisé en ce que l'anticorps comprend la séquence ^ d'acides aminés s SSSEPSSGADYDYSEEYDNE.

47. Anticorps suivant la revendication 44, caractérisé en ce que l'anticorps comprend la séquence d'acides aminés : VKPPQNKTESENTSDKPKRKKKG.

48. Anticorps suivant la revendication 44, caractérisé en ce que l'anticorps comprend la séquence d'acides aminés : EAVTCKCQQEYFGERCGEK.

49. Anticorps suivant la revendication 44, caractérisé en ce que l'anticorps comprend la séquence d'acides aminés s VQLRRQYVRKYEGEAEERKK.

50. Séquence nucléotidique génomique, caractérisée en ce qu'elle code pour le gène amphiréguline contenant la séquence nucléotidique, en substance telle qu'illustrée à la Fig. 17.