JP2003000247A - トランスフォーミング増殖因子αＨＩＩ - Google Patents
トランスフォーミング増殖因子αＨＩＩInfo
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 トランスフォーミング増殖因子αHIIポリペ
プチド、そのポリペプチドをコードするポリヌクレオチ
ド、組換え技術による該ポリペプチドの生産法、および
その使用法を提供する。 【解決手段】 トランスフォーミング増殖因子αHIIポ
リペプチドは創傷治癒の刺激、神経学的障害の治療、目
の障害の治療、腎障害と肝障害の治療及び胚形成と脈管
形成の刺激などに有用である。
プチド、そのポリペプチドをコードするポリヌクレオチ
ド、組換え技術による該ポリペプチドの生産法、および
その使用法を提供する。 【解決手段】 トランスフォーミング増殖因子αHIIポ
リペプチドは創傷治癒の刺激、神経学的障害の治療、目
の障害の治療、腎障害と肝障害の治療及び胚形成と脈管
形成の刺激などに有用である。
Description
【発明の詳細な説明】
【０００１】本発明は新たに同定されたポリヌクレオチ
ド、該ポリヌクレオチドによってコードされるポリペプ
チド、該ポリヌクレオチド及びポリペプチドの使用、及
び該ポリヌクレオチド及びポリペプチドの生産に関す
る。本発明のポリペプチドはヒトトランスフォーミング
増殖因子α相同体であろうと同定された。より具体的に
述べると、本発明のポリペプチドは、トランスフォーミ
ング増殖因子αHIIだろうと同定された。以下、これを
「TGFα-HII」ということもある。本発明は、そのよう
なポリペプチドの作用を阻害することにも関係する。 【０００２】細胞の成長と分化は、様々な刺激因子、阻
害因子、共同作用因子及びホルモンによって開始、促
進、維持及び調節されているようである。細胞ホメオス
タシス機構の変化及び/又は破壊は、腫瘍形成を含む成
長関連疾患の根本的な原因であると思われる。成長モジ
ュラー（modular）因子は、シグナル変換、細胞連絡、
成長と発生、胚形成、免疫応答、造血細胞の生存と分
化、炎症、組織の修復と再生、アテローム性動脈硬化及
び癌を含む、極めて多様な病理学的及び生理学的過程に
関係する。特に、上皮増殖因子（EGF）、トランスフォ
ーミング増殖因子α（TGFα）、ベータセルリン（betac
ellulin）、アンフィレグリン（amphiregulin）及びワ
クシニア増殖因子は、種々の細胞タイプが正常な生理学
的条件下に若しくは外因性の刺激に応答して生産する成
長及び分化調節タンパク質であり、EGFファミリーの構
成要素である。 【０００３】これらのペプチド増殖因子は、自己分泌機
構及び傍分泌機構によって創傷細胞に影響を及ぼす。ま
た、これらの増殖因子は、皮膚、角膜及び胃腸路のよう
な組織における創傷治癒にも重要な役割を果たし、3つ
の鎖間ジスルフィド結合の配置が保存されていることを
含めて、すべての因子が本質的なアミノ酸配列相同性を
共有する。さらに、このファミリーの因子はすべて、分
子量170,000の膜貫通型糖タンパク質受容体に結合し、
その受容体の細胞質ドメインにあるチロシンキナーゼ活
性を活性化する（Buhrow, S.A.ら, J. Bio. Chem., 25
8:7824-7826（1983））。 【０００４】これらの受容体は、皮膚ケラチン生成細
胞、繊維芽細胞、血管内皮細胞及びGI路の上皮細胞を含
む多くのタイプの細胞に発現する。これらのペプチド増
殖因子は、創傷治療に関与するいくつかの細胞（血小
板、ケラチン生成細胞及び活性化マクロファージを含
む）によって合成される。また、これらの増殖因子は、
ある種の細胞の成長及び分化の刺激（例えば腫瘍形成）
にも関係付けられているし、他のタイプの細胞の阻害に
も関係付けられている。 【０００５】ベータセルリンは32キロダルトンの糖タン
パク質であり、これはタンパク質加水分解的切断によっ
て、より大きい膜貫通型前駆体からプロセシングされる
ようである。ベータセルリンのカルボキシル末端ドメイ
ンは、ラットのトランスフォーミング増殖因子αの対応
部分と50%の配列類似性を持つ。ベータセルリンは、レ
チナール色素上皮細胞と血管平滑筋細胞にとって、強力
な有糸分裂促進物質である。 【０００６】アンフィレグリンは、新生物細胞における
DNA合成に対して強力な阻害活性を示し、ある種の正常
細胞の成長をも促進する、二作用性細胞増殖調節因子で
ある。アンフィレグリンには、創傷と癌の治療を含む種
々の用途が挙げられている。例えば、アンフィレグリン
は、上皮由来の数種類のヒト癌細胞系に対して、試験管
内で強力な抗増殖作用を持つ。また、アンフィレグリン
は、米国特許出願第5,115,096号に示されるように、ヒ
ト包皮繊維芽細胞の増殖を誘導する。 【０００７】TGFαは、多面発現性の生物学的作用を持
つ。TGFαの構成要素のいくつかは、発ガン的にトラン
スフォームした繊維芽細胞のいくつかによって（Ciardi
elloら, J. Cell. Biochem., 42:45-57（1990））、ま
た、腎臓癌、乳癌、偏平上皮癌、黒色腫及び膠芽腫を含
む種々の腫瘍によって（Derynck, R.ら, Cancer Res.,4
7:707-712（1987））合成される。高レベルのTGFαを発
現させる腫瘍細胞を持つ形質転換マウスを分析すること
によって、TGFαの発現が、正常細胞が腫瘍形成細胞に
変換する際の原因因子でありうることが直接的に立証さ
れている。TGFα形質転換動物は、TGFα発現を制御する
プロモーターの選択とマウスの株によって、種々の新生
物病変を示す（Sandgrenら, Cell, 61:1121-1135（199
0））。 【０００８】TGFαは、正常な胚の発生と成人の生理機
能にもある役割を果たす（Derynck,R. Adv. Cancer Re
s., 58:27-5（1992））。TGFαは、皮膚、脳、胃腸粘膜
及び活性化マクロファージを含む多くの組織で発現され
ている。したがって、TGFαは、上皮細胞の成長を制御
する重要な因子であり、創傷治療にも役割を果たす。ま
た、TGFαは、脈管形成性であることもわかっている（S
chreiberら, Science,232:1250-1253（1986））。 【０００９】本発明のポリペプチドは、トランスフォー
ミング増殖因子TGFα-HIIであろうと同定された。この
同定は、ヒトTGFαに対するアミノ酸相同性の結果とし
てなされた。 【００１０】本発明の一側面によれば、新規成熟ポリペ
プチド並びにその類縁体及び生物学的に活性かつ診断又
は治療に有用な断片が提供される。本発明のポリペプチ
ドはヒト由来である。 【００１１】本発明のもう1つの側面によると、本発明
のポリペプチドをコードする単離された核酸分子（mRN
A、DNA、cDNA、ゲノムDNAを含む）並びに生物学的に活
性かつ診断又は治療に有用なその断片、類縁体及び断片
が提供される。 【００１２】本発明のさらなる側面によれば、組換え技
術によって上記ポリペプチドを生産する方法であって、
本発明ポリペプチドをコードする核酸配列を含有する組
換え原核及び/又は真核宿主細胞を培養することからな
る方法が提供される。 【００１３】本発明のさらなる側面によれば、創傷治療
を刺激して外傷又はAIDS痴呆後の正常な神経学的機能を
修復するため、目の障害を治療するため、ある種の細胞
を標的にするため、腎障害及び肝障害を治療するため、
毛包の発育を促進するため、火傷、潰瘍及び角膜切開の
治療として血管形成を刺激するため、胚形成を刺激する
ためなどといった治療目的で、上記ポリペプチド又は上
記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを使用す
る方法が提供される。 【００１４】本発明のさらなる側面によれば、本発明の
核酸配列に特異的にハイブリッド形成しうる長さを持つ
核酸分子を含む核酸プローブも提供される。 【００１５】本発明のさらなる側面によれば、上記ポリ
ペプチドに対する抗体が提供される。 本発明のさらな
る側面によれば、本発明ポリペプチドに対するアゴニス
ト（作用薬）が提供される。 【００１６】本発明のさらなる側面によれば、上記ポリ
ペプチドに対するアンタゴニスト（拮抗薬）が提供され
る。これらのアンタゴニストは、例えば、角膜炎、新生
組織形成（腫瘍、癌など）及び乾癬の治療において、上
記ポリペプチドの作用を阻害するのに使用できる。 【００１７】本発明のさらなる側面によれば、本発明ポ
リペプチドの過剰発現及び上記ポリペプチドをコードす
る核酸配列中の突然変異に関係する疾患を検出するため
の診断的検定法が提供される。 【００１８】本発明のさらなる側面によれば、科学的研
究、DNAの合成及びDNAベクターの製造に関係する試験管
内用途に、上記ポリペプチド又は上記ポリペプチドをコ
ードするポリヌクレオチドを使用する方法が提供され
る。 【００１９】当業者にとって、本発明のこれらの側面と
他の側面は、本明細書の教示から明らかなはずである。 【００２０】以下の図面は本発明の実施態様を例示する
ものであって、請求の範囲が包含する本発明の範囲を限
定するものではない。 【００２１】図１〜図６は、TGFα-HIIの推定アミノ酸
配列に対応させたcDNA配列を表す。アミノ酸には標準的
な一文字略号を使用している。推定シグナル配列には下
線を引いておいた。 【００２２】図７〜図１０は、ヒトベータセルリン、ヒ
トTGFα及びヒトTGFα-HII（第3列）間のアミノ酸配列
相同性を比較した図である。「*」は、本発明のポリペ
プチドに保存されていることがわかった保存EGFモチー
フを表す。下線はヒトTGFαの成熟配列を表す。 【００２３】本発明の一側面によれば、図１〜図６の推
定アミノ酸配列（配列番号2）を持つ成熟ポリペプチド
若しくは1995年5月24日にATCC寄託番号97160として寄託
されたクローンのcDNAによってコードされる成熟ポリペ
プチドをコードする単離された核酸（ポリヌクレオチ
ド）が提供される。 【００２４】本発明のポリペプチドをコードするポリヌ
クレオチドは、ヒトの脳と初期段階の脳組織から得るこ
とができる。本発明のポリヌクレオチドは、2週齢の胚
から得たcDNAライブラリー中に発見された。これは、構
造的にEGFファミリーに関係している。このポリヌクレ
オチドは、374アミノ酸残基からなるタンパク質（その
うち45アミノ酸残基はリーダー配列と推定される）をコ
ードする読み取り枠を含有する。このタンパク質は、ヒ
トTGFαに対して最も高い相同性を示し、236アミノ酸の
範囲にわたって26%の同一性と46%の類似性を持つ。TGF
α-HIIは、EGFファミリーの全構成要素に認められる6個
の保存システイン残基すべてを含有する。 【００２５】配列番号2に記載の本発明の完全長ポリペ
プチドは、配列番号2のアミノ酸1からアミノ酸45までか
らなる推定シグナル配列を持ち、これは、このポリペプ
チドの細胞からの分泌を促進する。配列番号2のアミノ
酸46からアミノ酸214までは前駆体配列と推定されるか
ら、このポリペプチドはさらにプロセシングされて、こ
の部分が切り離される。さらに、アミノ酸264からアミ
ノ酸344までは、膜貫通部分であると推定される。この
部分は、このポリペプチドを特定の標的部位に誘導し
て、後述する生物学的機能を発揮するのに必要だと考え
られる。この膜貫通部分もこのペプチドから切り離され
うるので、本発明ペプチドの推定可溶性部分は、配列番
号2のアミノ酸215〜アミノ酸264からなる。 【００２６】本発明のポリヌクレオチドはRNA型であっ
てもよいし、cDNA、ゲノムDNA及び合成DNAを含むDNA型
であってもよい。DNAは二本鎖であってよいし、一本鎖
であってもよく、一本鎖の場合はコーディング鎖でもよ
いし、非コーディング（アンチセンス）鎖でもよい。成
熟ポリペプチドをコードするコーディング配列は、図１
〜図６に示すコーディング配列（配列番号1）又は上記
寄託クローンのコーディング配列と同一であってもよい
し、その遺伝コードの重複性又は縮重性の結果として図
１〜図６のDNA（配列番号1）又は上記寄託cDNAと同じ成
熟ポリペプチドをコードする、異なるコーディング配列
であってもよい。 【００２７】図１〜図６の成熟ポリペプチド（配列番号
2）をコードするポリヌクレオチド又は上記寄託cDNAに
よってコードされる成熟ポリペプチドをコードするポリ
ヌクレオチドは、例えば、その成熟ポリペプチドのコー
ディング配列のみを含んでもよいし、その成熟ポリペプ
チドのコーディング配列と付加的コーディング配列（リ
ーダー又は分泌配列など）若しくはプロタンパク質配列
を含んでもよいし、或いはその成熟ポリペプチド（付加
的コーディング配列を伴ってもよい）と非コーディング
配列（イントロンや成熟ポリペプチドに関するコーディ
ング配列の5'及び/又は3'側にある非コーディング配列
など）とを含んでもよい（ただしこれらに限られるわけ
ではない）。 【００２８】したがって、「ポリペプチドをコードする
ポリヌクレオチド」という用語は、そのポリペプチドの
コーディング配列のみを含むポリヌクレオチドと、さら
に付加的なコーディング配列及び/又は非コーディング
配列をも含むポリヌクレオチドとを包含する。 【００２９】さらに本発明は、図１〜図６の推定アミノ
酸配列（配列番号2）を持つポリペプチド若しくは上記
寄託クローンのcDNAによってコードされるポリペプチド
の断片、類縁体及び誘導体をコードする、上述のポリヌ
クレオチドの変種にも関係する。このポリペプチドの変
種は、上記ポリヌクレオチドの天然に存在する対立遺伝
子変種であってもよいし、上記ポリヌクレオチドの天然
には存在しない変種であってもよい。 【００３０】したがって本発明は、図１〜図６に示す成
熟ポリペプチド（配列番号2）又は上記寄託クローンのc
DNAによってコードされる成熟ポリペプチドと同じ成熟
ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、並びに図
１〜図６のポリペプチド（配列番号2）若しくは上記寄
託クローンのcDNAによってコードされるポリペプチドの
断片、誘導体又は類縁体をコードする上記ポリヌクレオ
チドの変種を包含する。そのようなヌクレオチド変種と
しては、欠失変種、置換変種及び付加又は挿入変種が挙
げられる。上述のように、本発明のポリヌクレオチド
は、図１〜図６に示すコーディング配列（配列番号1）
若しくは上記寄託クローンのコーディング配列の天然に
存在する対立遺伝子変種であるコーディング配列を持っ
てもよい。当該技術分野で知られているように、対立遺
伝子変種は、コードされるポリペプチドの機能を実質的
に変えない1以上のヌクレオチドの置換、欠失又は付加
を持ちうる代替型のポリヌクレオチド配列である。 【００３１】本発明は、上記成熟ポリペプチドのコーデ
ィング配列が宿主細胞によるポリペプチドの発現と分泌
を促進するポリヌクレオチド配列（例えばポリペプチド
の細胞からの輸送を制御するための分泌配列として機能
するリーダー配列）に同じ読み枠で融合しているポリヌ
クレオチドをも包含する。リーダー配列を持つポリペプ
チドはプレタンパク質であり、そのリーダー配列は宿主
によって切断されて、そのポリペプチドの成熟型を形成
しうる。本発明ポリヌクレオチドは、成熟タンパク質に
5'アミノ酸残基が追加されたプロタンパク質をコードし
てもよい。プロ配列を持つ成熟タンパク質はプロタンパ
ク質であり、そのタンパク質の不活性型である。そのプ
ロ配列が切断されると、活性な成熟タンパク質が残る。 【００３２】したがって、本発明のポリヌクレオチド
は、成熟タンパク質、プロ配列を持つタンパク質、又は
プロ配列とプレ配列（リーダー配列）の両方を持つタン
パク質をコードできる。 【００３３】本発明のポリヌクレオチドは、本発明ポリ
ペプチドの精製に利用されるマーカー配列にインフレー
ム（in frame）融合したコーディング配列を持ってもよ
い。細菌宿主の場合は、pQE-9ベクターによって供給さ
れるヘキサヒスチジン標識をマーカー配列にして、その
マーカーに融合した成熟ポリペプチドの精製に備えるこ
とができ、また、COS-7細胞のような哺乳類宿主を使用
する場合は、例えば血球凝集素（HA）標識をマーカー配
列にすることができる。HA標識は、インフルエンザ血球
凝集素タンパク質由来のエピトープに対応する（Wilso
n, I.ら, Cell,37:767（1984））。 【００３４】「遺伝子」という用語は、ポリペプチド鎖
の生産に関与するDNAの区分を意味し、コーディング配
列の前後の領域（リーダー及びトレーラー）と、個々の
コーディング部分（エクソン）間の介在配列（イントロ
ン）とを含む。 【００３５】完全長TGFα-HII遺伝子の断片をcDNAライ
ブラリー用のハイブリッド形成プローブとして用いるこ
とにより、その完全長遺伝子そのものや、その遺伝子に
対する高い配列類似性又は類似の生物学的活性を持つ他
の遺伝子を単離することができる。このタイプのプロー
ブは、少なくとも30塩基からなることが好ましく、50塩
基以上を含んでもよい。また、このプローブは、完全長
転写物に相当するcDNAクローン、ゲノムクローン、若し
くは調節及びプロモーター領域、エクソン並びにイント
ロンを含む完全なTGFα-HII遺伝子を含有するクローン
を同定するためにも使用できる。スクリーニングの一例
では、オリゴヌクレオチドプローブの合成に既知のDNA
配列を用いることによって、上記遺伝子のコーディング
領域を単離する。本発明遺伝子の配列に相補的な配列を
持つ標識オリゴヌクレオチドを用いて、ヒトのcDNA、ゲ
ノムDNA又はmRNAのライブラリーをスクリーニングし、
そのプローブがハイブリッド形成するライブラリーの構
成要素を決定する。 【００３６】さらに、本発明は、配列間に少なくとも70
%、好ましくは少なくとも90%、より好ましくは少なくと
も95%の同一性がある場合に上述の配列にハイブリッド
形成する、ポリヌクレオチドに関する。特に本発明は、
厳密な条件下で上述のポリヌクレオチドにハイブリッド
形成するポリヌクレオチドに関する。本明細書で使用す
る「厳密な条件」という用語は、配列間に少なくとも95
%、好ましくは少なくとも97%の同一性がある場合にの
み、ハイブリッド形成が起こることを意味する。好まし
い態様として、上述のポリヌクレオチドにハイブリッド
形成するポリヌクレオチドは、図１〜図６のcDNA（配列
番号1）又は上記寄託cDNAによってコードされる成熟ポ
リペプチドと実質上同じ生物学的機能又は活性を保持す
るポリペプチドをコードする。 【００３７】また、上記ポリヌクレオチドは、上述のよ
うに、本発明のポリヌクレオチドにハイブリッド形成
し、かつ、該ポリヌクレオチドに対して同一性を持つ
（活性は保持しても、保持しなくてもよい）、少なくと
も20塩基、好ましくは30塩基、より好ましくは少なくと
も50塩基を含んでもよい。このようなポリヌクレオチド
は、例えば、配列番号1のポリヌクレオチドに関する
（例えば回収用）プローブや、PCRプライマーとして使
用できる。 【００３８】したがって、本発明は、配列番号2のポリ
ペプチドをコードするポリヌクレオチドに対して少なく
とも70%の同一性、好ましくは少なくとも90%の同一性、
より好ましくは少なくとも95%の同一性を持つポリヌク
レオチド、及び少なくとも30塩基、好ましくは少なくと
も50塩基からなるその断片、並びにそのようなポリヌク
レオチドによってコードされるポリペプチドに関する。 【００３９】本明細書で言及する寄託物は、特許手続上
の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約に
基づいて維持される。これらの寄託物は当業者の利便の
ために提供されるに過ぎず、これが35U.S.C§112で求め
られる寄託であると認めるわけではない。寄託物に含ま
れるポリヌクレオチドの配列とそれによってコードされ
るポリペプチドのアミノ酸配列は、参考として本明細書
の一部を構成し、万一、本明細書に記載する配列の説明
と矛盾する場合は、これが支配的となる。上記寄託物を
製造、使用又は販売するには承諾が必要な場合があり、
本明細書はそのような承諾を与えるものではない。 【００４０】さらに本発明は、図１〜図６の推定アミノ
酸配列（配列番号2）を持つポリペプチド又は上記寄託c
DNAによってコードされるアミノ酸配列を持つポリペプ
チド、及びそのようなポリペプチドの断片、類縁体及び
誘導体に関する。 【００４１】図１〜図６のポリペプチド（配列番号2）
又は上記寄託cDNAによってコードされるポリペプチドに
関して「断片」、「誘導体」及び「類縁体」という場
合、これらの用語は、そのようなポリペプチドと実質上
同じ生物学的機能又は活性を保持するポリペプチドを意
味する。したがって類縁体には、プロタンパク質部分の
切断によって活性化されて活性な成熟ポリペプチドを生
成しうるプロタンパク質が含まれる。 本発明のポリペ
プチドは、組換えポリペプチド、天然のポリペプチド及
び合成ポリペプチドのいずれであってもよく、組換えポ
リペプチドが好ましい。 【００４２】図１〜図６のポリペプチド（配列番号2）
又は上記寄託cDNAによってコードされるポリペプチドの
断片、誘導体又は類縁体は、（i）1以上のアミノ酸残基
が保存的又は非保存的アミノ酸残基（好ましくは保存的
アミノ酸残基）で置換されているもの（その置換アミノ
酸残基は遺伝コードによってコードされるものであって
もよいし、そうでなくてもよい）であってもよいし、
（ii）1以上のアミノ酸残基が置換基を含有するもので
あってもよく、或いは（iii）成熟ポリペプチドがもう1
つの化合物（例えばそのポリペプチドの半減期を増大さ
せるための化合物（ポリエチレングリコールなど））に
融合しているものや、（iv）リーダー又は分泌配列や、
成熟ポリペプチド又はプロタンパク質配列の精製に使用
される配列などといった付加的アミノ酸が成熟ポリペプ
チドに融合しているものであってもよい。そのような断
片、誘導体及び類縁体は、本明細書の教示から、当業者
の範囲に含まれると考えられる。 【００４３】本発明のポリペプチド及びポリヌクレオチ
ドは、単離型で提供されることが好ましく、また、均一
に精製されることが好ましい。 【００４４】「単離された」という用語は、その物質が
その当初の環境（例えばそれが天然物ならばその自然環
境）から取り出されていることを意味する。例えば、生
きた動物中に存在する天然のポリヌクレオチド又はポリ
ペプチドは「単離された」とは言えないが、その天然系
中に共在する物質の一部又は全部から分離されたそのポ
リヌクレオチド又はポリペプチドは「単離された」と言
える。そのようなポリヌクレオチドがベクターの一部で
あったり、かつ/または、そのようなポリヌクレオチド
又はポリペプチドが組成物の一部であっても、そのよう
なベクター又は組成物がその自然環境の一部でないとい
う点で、「単離された」と言える。 【００４５】本発明のポリペプチドは、配列番号2のポ
リペプチド（特にその成熟ポリペプチド）及び配列番号
2のポリペプチドに対して少なくとも70%の類似性（好ま
しくは70%の同一性）、より好ましくは配列番号2のポリ
ペプチドに対して少なくとも90%の類似性（より好まし
くは90%の同一性）、さらに好ましくは配列番号2のポリ
ペプチドに対して少なくとも95%の類似性（さらに好ま
しくは90%の同一性）を持つポリペプチドを包含し、ま
た、一般的には少なくとも30アミノ酸、より好ましくは
少なくとも50アミノ酸を含有する上記ポリぺプチドの一
部をも包含する。 【００４６】当該技術分野では知られているように、2
つのポリペプチド間の「類似性」は、一方のポリペプチ
ドのアミノ酸配列と保存的アミノ酸置換を、他方のポリ
ペプチドの配列と比較することによって決定される。本
発明ポリペプチドの断片又は一部を用いて、対応する完
全長ポリペプチドを、ペプチド合成によって生産するこ
とができる。つまり、これらの断片は、完全長ポリペプ
チドを生産するための中間体として使用できる。本発明
ポリヌクレオチドの断片又は一部は、本発明の完全長ポ
リヌクレオチドの合成に使用できる。 【００４７】本発明は、本発明のポリヌクレオチドを含
むベクター、本発明のベクターで遺伝子操作された宿主
細胞、及び組換え技術による本発明ポリペプチドの生産
にも関係する。 【００４８】宿主細胞は、本発明のベクター（例えばク
ローニングベクターであってもよいし、発現ベクターで
あってもよい）によって遺伝子操作（形質導入又は形質
転換若しくはトランスフェクション）される。ベクター
は、例えばプラスミド、ウイルス粒子、ファージなどの
形態をとりうる。操作された宿主細胞は、プロモーター
の活性化、形質転換体の選択若しくは本発明遺伝子の増
幅に適した改良が施された従来の栄養培地で培養でき
る。温度やpHなどといった培養条件は、発現用に選択し
たその宿主細胞に対して過去に用いられた条件であり、
当業者には明らかだろう。 【００４９】本発明のポリヌクレオチドは、組換え技術
によってポリペプチドを生産するために使用できる。し
たがって、例えば、そのポリヌクレオチドは、ポリペプ
チド発現用の種々の発現ベクターのいずれにも組込むこ
とができる。そのようなベクターとしては、染色体DNA
配列、非染色体DNA配列及び合成DNA配列、例えばSV40の
誘導体、細菌性プラスミド、ファージDNA、バクロウイ
ルス、酵母プラスミド、プラスミドとファージDNAの組
み合わせに由来するベクター、ウイルスDNA（例えばワ
クシニア、アデノウイルス、家禽ポックスウイルス、偽
性狂犬病ウイルス）などが挙げられる。ただし、その他
のベクターであっても、それがその宿主内で複製可能か
つ生存可能であるかぎり、使用できる。 【００５０】適当なDNA配列は、種々の手法によってベ
クターに挿入できる。一般的には、当該技術分野で知ら
れる手法で、適当な制限部位にDNA配列を挿入する。そ
のような手法その他は、当業者の範囲に含まれると考え
られる。 【００５１】発現ベクター中のDNA配列は、mRNA合成を
指令する適当な発現制御配列（プロモーター）に作動可
能に連結される。そのようなプロモーターの代表例とし
ては、LTR又はSV40プロモーター、大腸菌lac又はtrp、
ファージλPＬプロモーター、及び原核細胞、真核細胞
若しくはそれらのウイルス中の遺伝子の発現を制御する
ことが知られているその他のプロモーターを挙げること
ができる。発現ベクターは、翻訳開始用のリボソーム結
合部位と転写終結区（ターミネーター）をも含有する。
またベクターは、発現の増幅に適した配列を含んでもよ
い。 【００５２】さらに発現ベクターは、形質転換された宿
主細胞の選択に利用できる表現型特徴を与えるための1
以上の選択可能マーカー遺伝子（例えば真核細胞培養用
のネオマイシン耐性やジヒドロ葉酸レダクターゼ、大腸
菌におけるテトラサイクリン耐性やアンピシリン耐性な
ど）を含有することが好ましい。 【００５３】上述の適当なDNA配列と適当なプロモータ
ー又は制御配列とを含有するベクターを、適当な宿主の
形質転換に使用することによって、その宿主にそのタン
パク質を発現させることができる。 【００５４】適当な宿主の代表例としては、大腸菌、ス
トレプトミセス、ネズミチフス菌などの細菌細胞、酵母
などの真菌細胞、キイロショウジョウバエS2及びSpodop
teraSf9などの昆虫細胞、CHO、COS又はボーズ黒色腫な
どの動物細胞、アデノウイルス、植物細胞などを挙げる
ことができる。適当な宿主の選択は、本明細書の教示か
ら、当業者の範囲に含まれると考えられる。 【００５５】より具体的に述べると、本発明は、上に広
く記述した配列の1以上を含む組換え構築物をも包含す
る。これらの構築物は、本発明の配列が正方向又は逆方
向に挿入されているベクター（プラスミドやウイルスベ
クターなど）を含む。この態様の好ましい側面では、上
記構築物がさらに、上記配列に作動可能に連結した調節
配列（プロモーターなどを含む）をも含有する。好適な
ベクターとプロモーターは当業者に多数知られており、
市販されている。次に挙げるベクターはその例である。
細菌用：pQE70、pQE60、pQE-9（Qiagen）、pBS、pD10、
phagescript、psiX174、pbluescriptSK、pbsks、pNH8
A、pNH16a、pNH18A、pNH46A（Stratagene）、ptrc99a、
pKK223-3、pKK233-3、pDR540、pRIT5（Pharmacia）。真
核細胞用：pWLNEO、pSV2CAT、pOG44、pXT1、pSG（Strat
agene）、pSVK3、pBPV、pMSG、pSVL（Pharmacia）。た
だし、他のプラスミド又はベクターであっても、それが
その宿主内で複製可能かつ生存可能である限り、使用で
きる。 【００５６】プロモーター領域は、CAT（クロラムフェ
ニコールトランスフェラーゼ）ベクターや、選択可能マ
ーカーを持つ他のベクターを用いて、任意の所望の遺伝
子から選択できる。適当なベクターはPKK232-8とpCM7で
ある。特に有名な細菌プロモーターとしては、lacI、la
cZ、T3、T7、gpt、λPＲ、PＬ及びtrpが挙げられる。真
核プロモーターとしては、CMV即時型初期、HSVチミジン
キナーゼ、初期及び後期SV40、レトロウイルスのLTR、
マウスメタロチオネイン-Iが挙げられる。適当なベクタ
ーとプロモーターの選択は、当該技術分野の通常の技術
水準に十分含まれる。 【００５７】さらなる態様として、本発明は、上述の構
築物を含有する宿主細胞に関する。本発明の宿主細胞
は、哺乳類細胞のような高等真核細胞であってもよい
し、酵母細胞のような下等真核細胞であってもよく、ま
た、細菌細胞のような原核細胞であってもよい。宿主細
胞への上記構築物の導入は、リン酸カルシウムトランス
フェクション、DEAE-デキストラン媒介トランスフェク
ション、又はエレクトロポレーションによって達成でき
る（Davis, L., Dibner, M. Battey, I., Basic Method
s in Molecular Biology（1986））。 【００５８】宿主細胞中の構築物を従来のように使用す
ることによって、その組換え配列によってコードされる
遺伝子産物を生産することができる。別法として、本発
明のポリペプチドを従来のペプチド合成装置で合成する
こともできる。 【００５９】成熟タンパク質は、適当なプロモーターの
制御下に、哺乳類細胞、酵母、細菌その他の細胞中で発
現させることができる。本発明のDNA構築物から得られ
るRNAを用いて上記タンパク質を生産するには、無細胞
翻訳系も使用できる。原核宿主及び真核宿主での使用に
適したクローニングベクターと発現ベクターは、Sambro
okら, Molecular Cloning: A Laboratory Manual（第2
版,ニューヨーク州コールドスプリングハーバー（198
9））に記述されており、その開示は参考文献として本
明細書の一部を構成する。 【００６０】本発明のポリペプチドをコードするDNAの
高等真核生物による転写は、そのベクターにエンハンサ
ー配列を挿入することによって増大する。エンハンサー
はDNAのシス作用性要素であり、通常10〜300bpで、プロ
モーターに作用してその転写を増大させる。複製起点の
後期側100〜270bpにあるSV40エンハンサー、サイトメガ
ロウイルス初期プロモーターエンハンサー、複製起点の
後期側にあるポリオーマエンハンサー及びアデノウイル
スエンハンサーなどがその例である。 【００６１】一般的に、組換え発現ベクターは、複製起
点、その宿主細胞の形質転換を可能にする選択可能マー
カー（例えば大腸菌のアンピシリン耐性遺伝子やサッカ
ロミセス・セレビシェTRP1遺伝子）及び下流構造配列の
転写を指令する高発現遺伝子由来のプロモーターを含む
だろう。そのようなプロモーターは、なかんずく、3-ホ
スホグリセリン酸キナーゼ（PGK）のような解糖系酵
素、α-因子、酸性ホスファターゼ又は熱ショックタン
パク質をコードするオペロンから得ることができる。異
種構造配列は、翻訳開始配列と終止配列及び好ましくは
翻訳されたタンパク質の周辺腔又は細胞外培地への分泌
を指令することのできるリーダー配列に対して適当な位
相で、組み立てられる。任意に、その異種配列が、発現
した組換え産物の安定化や簡便な精製などといった所望
の特徴を付与するN-末端同定ペプチド（identification
peptide）を含む融合タンパク質をコードしてもよい。 【００６２】細菌の使用に有用な発現ベクターは、所望
のタンパク質をコードする構造ＤＮＡ配列を、適当な翻
訳開始シグナル及び翻訳終止シグナルと共に、機能的プ
ロモーターに対して作動可能な解読位相（reading phas
e）に挿入することによって、構築される。ベクター
は、そのベクターの維持を保証し、かつ、所望であれ
ば、その宿主内での増幅を提供するために、1以上の表
現型選択可能マーカーと複製起点とを含むだろう。形質
転換に好適な原核宿主としては、大腸菌、枯草菌、ネズ
ミチフス菌並びにシュードモナス属、ストレプトミセス
属及びスタフィロコッカス属に属する様々な種が挙げら
れる。ただし、他の宿主も選択肢として使用できる。 【００６３】細菌の使用に有用な発現ベクターの典型例
として、周知のクローニングベクターpBR322（ATCC3701
7）の遺伝要素を含む市販のプラスミドに由来する、選
択可能マーカーと細菌性複製起点とを含むものを挙げる
ことができる（ただしこれに限られるわけではない）。
そのような市販ベクターとしては、例えばpKK223-3（Ph
armacia Fine Chemicals,スウェーデン国ウプサラ）及
びGEM1（Promega Biotec.,米国ウィスコンシン州マディ
ソン）が挙げられる。これらのpBR322「骨格」部分を、
適当なプロモーター及び発現させようとする構造配列と
組み合わせる。 【００６４】適当な宿主株を形質転換し、その宿主株を
適当な細胞密度まで成長させた後、選択したプロモータ
ーを適当な手段（例えば温度変化や化学誘導）によって
誘導し、細胞をさらに培養する。 【００６５】典型的には、細胞を遠心分離によって収集
し、物理的又は化学的手段によって破壊し、得られた粗
抽出物をさらなる精製のために確保する。 【００６６】タンパク質の発現に使用する微生物細胞
は、凍結−融解サイクル、超音波処理、機械的破壊又は
細胞溶解剤の使用などといった任意の便利な方法で破壊
でき、そのような方法は当業者にはよく知られている。 【００６７】組換えタンパク質の発現には、種々の哺乳
類細胞培養系も使用できる。哺乳類発現系の例として
は、Gluzman, Cell, 23:175（1981）に記載のサル腎繊
維芽細胞のCOS-7系や、適合するベクターを発現させる
ことのできる他の細胞系（例えばC127、3T3、CHO、HeLa
及びBHK細胞系）が挙げられる。哺乳類発現ベクター
は、複製起点、適当なプロモーター及びエンハンサーを
含み、さらに必要なリボソーム結合部位、ポリアデニル
化部位、スプライス供与部位とスプライス受容部位、転
写終止配列及び5'隣接非転写配列をも含むだろう。必要
な非転写遺伝要素を提供するには、SV40のスプライス部
位とポリアデニル化部位に由来するDNA配列を使用でき
る。 【００６８】本発明ポリペプチドは、硫酸アンモニウム
又はエタノール沈殿、酸抽出、陰イオン又は陽イオン交
換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラ
フィー、疎水相互作用クロマトグラフィー、アフィニテ
ィークロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイトクロ
マトグラフィー及びレクチンクロマトグラフィーを含む
方法によって、組換え細胞培養から回収、精製できる。
必要とあれば、成熟タンパク質の配置の完成に、タンパ
ク質再生段階を使用できる。最後に、最終的な精製段階
として、高性能液体クロマトグラフィー（HPLC）を使用
できる。 【００６９】本発明のポリペプチドは、天然の精製産物
であってもよいし、化学合成法の生成物であってもよ
く、また組換え技術によって原核宿主又は真核宿主（例
えば培養された細菌細胞、酵母細胞、高等植物細胞、昆
虫細胞及び哺乳類細胞など）から生産されるものであっ
てもよい。組換え生産法に使用する宿主によって、本発
明のポリペプチドはグリコシル化されることもあるし、
グリコシル化されないこともある。本発明のポリペプチ
ドは、開始メチオニンアミノ酸残基を含んでもよい。 【００７０】本発明のポリヌクレオチドとポリペプチド
は、ヒト疾患の治療法又は診断法を発見するための研究
用試薬及び研究材料として使用できる。 【００７１】本発明のポリペプチドは、受容体の特徴づ
けに使用できる。現在、EGFファミリー受容体には、EGF
R1、EGFR2、EGFR3、EGFR4と呼ばれる4種類のEGF受容体
が含まれる。EGFR2受容体はERB-2とも呼ばれ、この分子
は様々な診断的又は治療的適応に有用である（Prignet,
S.A.及びLemoine, N.R.,Prog. Growth Factor Res.,4:
1-24（1992））。TGFα-HIIポリペプチドは、おそらく
これら受容体の1以上のリガンドであり、さらに同定さ
れる新しいEGF型受容体のリガンドでもあるだろう。TGF
α-HIIの使用は、そのような受容体の同定、特徴づけ及
びクローニングに役立ちうる。例えば、EGF受容体遺伝
子は、鳥類赤芽球症ウイルスのv-erb-B癌遺伝子の細胞
相同体である。EGF受容体の過剰発現や、そのタンパク
質のキナーゼ調節部分の欠失は、細胞の腫瘍形成性トラ
ンスフォーメーションを引き起こしうる（Manjusri, D.
ら, Human Cytokines, 364及び381（1991））。 【００７２】本発明のポリペプチドは、外傷やその他の
損傷性病状（例えばAIDS痴呆、老人性痴呆など）の結果
として減少した神経学的機能の回復又は増進にも使用で
きる。TGFαとその相同体は、脳のほとんどの部分で、E
GF/TGFα受容体に対する最も豊富なリガンドであること
がわかっている（Kaserら, Brain Res Mol Brain Res:1
6:316-322（1992））。EGFが小さく不連続な領域にしか
存在しないのに対して、TGFαは脳の様々な領域に広く
分布しているようである。このことは、TGFαが脳組織
において生理学的な役割を果たしているのかもしれない
ことを示唆している。脳内にTGFαに対する受容体部位
がこれほど数多く存在することは、TGFが正常な脳細胞
の分化と機能の促進に関して重要な効用を持つことを示
唆している。したがって、神経学的機能が減少している
場合は、本発明のポリペプチドを投与することによっ
て、脳を刺激し、適正な神経学的機能を高めることがで
きる。 【００７３】TGFα-HII又はその可溶型は、目の障害
（例えば角膜炎）の治療にも使用できる。様々な実験に
よって、このような病状にTGFα遺伝子ファミリーの構
成要素が関連付けられている。最近の報文に、これらの
増殖因子が目の疾患に果たす役割に関するデータのいく
つかが要約されている（Mannら, Cell 73:249-261（199
3））。最近の実験では、TGFα遺伝子を欠くいくつかの
マウスが、目の固有質に対する白血球その他の細胞の浸
潤による角膜炎を示すことがわかっている。 【００７４】さらに、TGFα増殖因子の標的細胞に対す
る特異性を、標的細胞を破壊するための仕組みとして活
用することもできる。例えば、TGFα-HII又はその可溶
型を毒性分子（例えば標的細胞を不活化する放射性医
薬）に（種々の方法で）カップリングすることができ
る。これらの増殖因子−毒素融合物は標的細胞を殺す
（場合によっては、種々の「傍観者（bystander）」作
用によって、隣接細胞をも殺す）。このような毒素融合
物遺伝子の最近の例は、Mesriら, J. Biol. Chem. 268:
4853-62（1993）に公表されている。TGFα-HIIとその関
連分子をリポソームに封入したり、腫瘍又は細胞特異的
抗原を認識、結合する抗体と共役させることによって、
細胞を「標的にする（targeting）」手段を与えること
もできる。 【００７５】同じ方法で、TGFα-HIIを抗新生物化合物
として使用することもできる。EGFファミリーの構成要
素はトランスフォームした細胞に対して抗増殖作用を示
すからである。生体内で使用する場合、本発明のポリプ
チドは、注射、注入、局所投与、非経口投与など（ただ
しこれらに限られない）、種々の方法で投与できる。投
与は、生理学的に許容できる任意の担体（リン酸緩衝食
塩水、食塩水、滅菌水など）を使用して行なうことがで
きる。 【００７６】TGFα-HIIポリペプチド断片も、ある種の
腎疾患の治療に使用できる。これらの増殖因子が腎臓で
発現することがわかっているからである。したがって、
これらの因子は、この器官の適正な生理学的維持に必要
なのだろう。 【００７７】TGFαとその相同体及び肝細胞増殖因子
は、部分的肝切除及び急性肝細胞壊死後の肝細胞再生を
引き起こすので（Masuhara, M.ら, Hepatology 16:1241
-1249（1992））、肝再生又は肝不全に関する処置も可
能である。 【００７８】TGFα-HIIを必要とする重要な処置は、創
傷治癒に関する処置である。本発明の組成物は、実質上
あらゆる皮膚創傷、角膜創傷及び上皮で裏打ちされた身
体の中空器官を含む、様々な創傷の処置に使用できる。
処置に適した創傷としては、火傷、擦傷、切り傷などの
外傷によるものと、外科的切開及び皮膚移植などの手術
によるものが挙げられる。本発明ポリペプチドによる処
置に適した他の状態としては、慢性潰瘍、糖尿病性潰瘍
などの慢性病や、非治癒（non-healing）（栄養）状態
が挙げられる。 【００７９】TGFα-HIIやその可溶性断片は、患部に適
用するための生理学的に許容できる担体に組込むことが
できる。担体の性質は、意図する適用部位によって大き
く異なる。皮膚への適用には、通常、クリーム基剤や軟
膏基剤が好ましい。好適な基剤としては、ラノリン、シ
ルバジン（Marion）（特に火傷の治療用）、アクアフォ
ア（Aquaphor; Duke Laboratories,コネチカット州サウ
スノーウォーク）などが挙げられる。所望であれば、TG
Fα-HII含有組成物を包帯その他の創傷用治療材料に組
込むことによって、創傷を本発明ペプチドに継続してさ
らすこともできる。エアロゾルの適用も用途があるだろ
う。 【００８０】治療組成物中のTGFα-HII濃度は決定的な
問題ではないが、上皮細胞増殖を誘導するに足る濃度で
なければならない。本発明組成物は、患部に局所的に
（一般的には点眼剤として目に、若しくはクリーム、軟
膏又はローションとして皮膚に）適用できる。目の場
合、頻繁な処置が好ましく、通常は、4時間未満の間隔
で適用する。皮膚には、1日に2〜4回若しくはそれ以上
頻繁に治療組成物を適用しながら、治癒中は継続して患
部に治療組成物を保持することが望ましい。 【００８１】本発明ポリペプチドの使用量は、投与法、
他の活性化合物の使用などによって変動するが、一般的
には、約1μg〜100μgの範囲である。本発明ポリペプチ
ドは、食塩水、リン酸緩衝食塩水などといった生理学的
に許容できる担体と共に使用できる。使用する化合物の
量は、試験管内での細胞の応答や本発明ポリペプチド又
は本発明ポリペプチドを含有する製剤に対する実験動物
の応答に基づいて、実験的に決定されるだろう。 【００８２】TGFα-HIIやその可溶性断片は、血管形
成、骨再吸収、免疫応答、シナプスエフェクター機能及
びニューロンエフェクター機能の調節に使用できる。TG
Fα-HIIは、アラキドン酸カスケードの調節にも使用で
きる。 【００８３】TGFα-HIIやその可溶性断片は、最終分化
に関する応用にも使用できる。多くのTGFα因子とそれ
らの相同体は、それらの標的細胞における最終分化を誘
導する。この性質は、その因子を投与し、標的細胞の死
を誘導することによって、生体内で活用できる。この方
法は、医学的に望ましくない細胞タイプ（癌など）の過
剰増殖に関係する障害や他の増殖性障害（例えば炎症、
乾癬など）について検討されている。生体内投与に加え
て、試験管内投与が正当な場合も種々ある。例えば、骨
髄の場合は、細胞を増殖因子及び/又はその誘導体で処
理することによって、骨髄から望ましくない細胞集団を
除去することができる。 【００８４】また、脱毛症、抜け毛、その他毛包の発育
に影響を与える皮膚状態に関する応用もある。TGFα増
殖因子がそのような状態に関与することは、数系統の証
拠が示唆している。上述のように、TGFα遺伝子にヌル
（無効）突然変異を含有するように操作された「ノック
アウト」マウスは、量的及び質的毛髪合成に関して異常
を示す。さらに、マウスにおけるマッピング研究によっ
て、毛髪の成長に影響を与えるいくつかの突然変異がTG
Fα遺伝子座にマッピングされることがわかっている（M
annら, Cell 73:249-261（1993））。いくつかの形態の
脱毛症と抜け毛の治療には、TGFα-HII又はその誘導体
の局所的又は全身的投与を使用することができ、これら
の主張は本発明の範囲に包含される。 【００８５】ある種の疾患病理は、TGFα-HII増殖因子
の全身的臨床投与によって、部分的又は完全に改善でき
る。この投与は、遺伝子療法（下記参照）の形態をとる
こともできるし、TGFα-HII DNAの組換え構築物又はペ
プチド化学合成によって合成されたペプチド又はタンパ
ク質の投与によって行なうこともできる（Wooら, Prote
in Engineering 3:29-37（1989））。 【００８６】本発明は、本発明のポリペプチドに対する
アゴニスト化合物又はアンタゴニスト化合物を同定する
ための化合物スクリーニング法を提供する。例えば、TG
Fα-HII受容体を発現させる哺乳類細胞又は膜調製物
を、候補化合物と共にインキュベートし、その受容体か
ら第2シグナルを発生させる（その化合物の）能力を測
定することによって、それが有効なアゴニストであるか
どうかを決定する。そのような第2伝達子（メッセンジ
ャー）系としては、cAMPグアニル酸環化酵素、イオンチ
ャンネル又はホスホイノシチド加水分解が挙げられる
が、これらに限られるわけではない。有効なアンタゴニ
ストは、上述の方法で、受容体に結合するが、第2メッ
センジャー応答を引き出さず、したがってその受容体を
TGFα-HIIから遮断するアンタゴニスト化合物を検出す
ることによって決定される。 【００８７】本発明ポリペプチドに対する受容体に特異
的な潜在的アンタゴニストを同定するためのもう1つの
検定法は、競争検定法である。この競争検定法では、本
発明ポリペプチドに対する受容体を過剰に発現する原形
質膜（例えばヒトA431癌細胞）を単離する。10nM
１２５I-TGFα-HIIを含有する培地で連続希釈した試験
試料（体積は約10μl）を、潜在的アンタゴニスト化合
物の存在下に、上記原形質膜5μgに加え、4℃で4時間イ
ンキュベートする。その反応混合物を希釈し、直ちにミ
リポアフィルターに通す。次にそのフィルターをすばや
く洗浄し、結合した放射活性をガンマカウンターで測定
する。次に、結合したTGFα-HIIの量を測定する。上記
化合物の不在下に対照検定をも行なって、そのアンタゴ
ニストが、結合したTGFα-HIIの量を減少させるかどう
かを決定する。 【００８８】潜在的アンタゴニスト化合物としては、そ
のポリペプチドに結合する抗体や（場合によっては）オ
リゴペプチドが挙げられる。また、密接に関係するタン
パク質であって、その受容体に結合するが、そのポリペ
プチドの不活性型であるので、本発明ポリペプチドの作
用を妨害するものも、潜在的アンタゴニストになりう
る。 【００８９】もう1つのアンタゴニスト化合物は、アン
チセンス技術を用いて作成されるアンチセンス構築物で
ある。アンチセンス技術は、アンチセンスDNA又はRNA若
しくは三重らせん形成による遺伝子発現の制御に使用で
き、これらの方法は共に、DNA又はRNAに対するポリヌク
レオチドの結合に基づく。例えば、本発明の成熟ポリペ
プチドをコードするポリヌクレオチド配列の5'コーディ
ング部分を用いて、約10〜40塩基対長のアンチセンスRN
Aオリゴヌクレオチドを設計する。DNAオリゴヌクレオチ
ドは、転写に関与する遺伝子の領域に相補的になるよう
に設計されるので（三重らせん−Leeら, Nucl. Acids.
Res., 6:3073（1979）；Cooneyら, Science, 241:456
（1988）；Dervanら, Science, 251:1360（1991）を参
照）、本発明ポリペプチドの転写と生産を妨害する。ア
ンチセンスRNAオリゴヌクレオチドは生体内でmRNAにハ
イブリッド形成し、そのmRNA分子の本発明ポリペプチド
への翻訳を遮断する（アンチセンス−Okano, J. Neuroc
hem., 56:560（1991）；Oligodeoxynucleotides as Ant
isense Inhibitors of Gene Expression, CRC Press,フ
ロリダ州ボカラトン（1988）を参照）。アンチセンスRN
A又はDNAが生体内で発現して、本発明ポリペプチドの生
産を阻害しうるように、上述のオリゴヌクレオチドを細
胞に送達することもできる。 【００９０】本発明ポリペプチドに結合し、受容体にお
けるその作用を遮断することによって、正常な生物学的
活性を妨害する小分子も、アンタゴニスト化合物であ
る。小分子が、本発明ポリペプチドに対する受容体を結
合してもよい。そのような小分子の例としては、小ペプ
チド又は小さいペプチド様分子が挙げられるが、これら
に限られるわけではない。 【００９１】上記アンタゴニストは、新生組織形成（例
えば癌や腫瘍）の治療に使用できる。腫瘍細胞によるEG
Fファミリー構成要素の分泌又は生産を阻害すると、腫
瘍が緩解することが知られている。 【００９２】本発明ポリペプチドに対するアンタゴニス
トは、ある種の皮膚障害（例えば乾癬）の処置にも治療
的に使用できる。乾癬障害などの疾患から採取した皮膚
生検におけるこの増殖因子ファミリーの構成要素の発現
レベルは、上昇していることがわかっている（Cookら,
Cancer Research, 52:3224-3227（1992））。上記アン
タゴニストは、後述のような医薬的に許容できる担体と
の組成物として使用できる。 【００９３】本発明ポリペプチド、アゴニスト化合物又
はアンタゴニスト化合物は、適当な医薬担体と組み合わ
せて使用できる。そのような組成物は、治療有効量の上
記ペプチド又は化合物と、医薬的に許容できる担体又は
賦形剤とを含有する。そのような担体としては、塩水、
緩衝塩水、デキストロース、水、グリセロール、エタノ
ール及びそれらの組み合わせが挙げられるが、これらに
限られるわけではない。製剤は投与法に適するものとす
る。 【００９４】本発明は、本発明医薬組成物の1以上の成
分で満たされた1以上の容器を含む医薬パック又はキッ
トをも提供する。そのような容器には、医薬品又は生物
学的製品の製造、使用又は販売を規制する政府機関によ
って規定された形式で、ヒト投与に関する製造、使用又
は販売の該機関による認可を反映する情報を付すことが
できる。さらに、本発明のポリペプチド又は化合物を他
の治療用化合物と共に使用してもよい。 【００９５】上記医薬組成物は、経口経路、局所経路、
静脈内経路、腹腔内経路、筋肉内経路、皮下経路、鼻孔
内経路又は皮内経路など、都合の良い方法で投与でき
る。上記医薬組成物は、特定の適応症の処置及び／又は
予防に有効な量で投与される。一般的には、少なくとも
約10μg/kg-体重の量で投与され、ほとんど場合は、約8
mg/kg-体重/日を超えない量で投与されるだろう。ほと
んどの場合、日用量は、投与経路、症状などを考慮し
て、約10μg/kg〜約1mg/kg-体重である。 【００９６】本発明のポリペプチドと、ポリペプチドで
あるアゴニスト及びアンタゴニストを、本発明に従って
使用する場合は、それを生体内における上記ポリペプチ
ドの発現によってすることもできる。これはしばしば
「遺伝子療法」と呼ばれる。 【００９７】したがって、例えば、患者から得た細胞
を、生体外で、ポリペプチドをコードするポリヌクレオ
チド（DNA又はRNA）で操作し、そのポリペプチドで処置
しようとする患者に、操作したその細胞を与えることが
できる。このような方法は当該技術分野では良く知られ
ており、本明細書の教示から明らかである。例えば、本
発明のポリペプチドをコードするRNAを含有するレトロ
ウイルスプラスミドベクターを使用して、細胞を操作す
ることができる。 【００９８】さらに、生体内でポリペプチドを発現させ
るために、例えば当該技術分野で知られる手法によっ
て、生体内で細胞を操作することもできる。例えば、本
発明ポリペプチドをコードするRNAを含有するレトロウ
イルスプラスミドベクターをパッケージング細胞に形質
導入すると、そのパッケージング細胞が目的の遺伝子を
含有する感染性ウイルス粒子を生産するようになる。生
体内で細胞を操作し、生体内で本発明のポリペプチドを
発現させるには、これらの生産細胞を患者に投与すれば
よい。そのような方法による本発明ポリペプチドの上記
その他の投与法は、本発明の教示から、当業者には明ら
かなはずである。 【００９９】上述のレトロウイルスプラスミドベクター
の供給源となりうるレトロウイルスとしては、モロニー
ネズミ白血病ウイルス、脾臓壊死ウイルスや、ラウス肉
腫ウイルス、ハーヴェー肉腫ウイルス、鳥類白血病ウイ
ルス、テナガザル白血病ウイルス、ヒト免疫不全症ウイ
ルス、アデノウイルス、脊髄増殖性肉腫ウイルス及び乳
癌ウイルスなどのレトロウイルスが挙げられるが、これ
らに限られるわけではない。一態様として、レトロウイ
ルスプラスミドベクターをモロニーネズミ白血病ウイル
スから得る。 【０１００】ベクターは1又はそれ以上のプロモーター
を含む。使用できる好適なプロモーターとしては、レト
ロウイルスLTR、SV40プロモーター、Millerら, Biotech
niques,第7巻,第9号, 980-990（1989）に記載のヒトサ
イトメガロウイルス（CMV）プロモーター、その他のプ
ロモーター（例えばヒストンプロモーター、pol IIIプ
ロモーター、β-アクチンプロモーター（ただしこれら
に限らない）のような真核細胞プロモーターなどの細胞
性プロモーター）が挙げられるが、これらに限られるわ
けではない。使用できるその他のウイルスプロモーター
としては、アデノウイルスプロモーター、チミジンキナ
ーゼ（TK）プロモーター及びB19パルボウイルスプロモ
ーターが挙げられるが、これらに限られるわけではな
い。適当なプロモーターの選択は、本明細書の教示か
ら、当業者には明らかだろう。 【０１０１】本発明のポリペプチドをコードする核酸配
列は、好適なプロモーターの制御下にある。使用できる
好適なプロモーターとしては、アデノウイルスプロモー
ター（アデノウイルス主要後期プロモーターなど）、異
種プロモーター（サイトメガロウイルス（CMV）プロモ
ーターなど）、呼吸器合胞体ウイルス（RSV）プロモー
ター、誘導性プロモーター（MMTプロモーターやメタロ
チオネインプロモーターなど）、熱ショックプロモータ
ー、アルブミンプロモーター、ApoAIプロモーター、ヒ
トグロビンプロモーター、ウイルスチミジンキナーゼプ
ロモーター（単純ヘルペスチミジンキナーゼプロモータ
ーなど）、レトロウイルスLTR（上述の修飾レトロウイ
ルスLTRを含む）、β-アクチンプロモーター、ヒト成長
ホルモンプロモーターが挙げられるが、これらに限るわ
けではない。プロモーターは、本発明ポリペプチドをコ
ードする遺伝子を制御する天然のプロモーターであって
もよい。 【０１０２】上記レトロウイルスプラスミドベクターで
パッケージング細胞を形質導入することによって、生産
細胞系を作成する。トランスフェクションできるパッケ
ージング細胞の例としては、Miller, Human Gene Thera
py,第1巻, 5-14（1990）（この刊行物の全内容は参考文
献として本明細書の一部を構成する）に記載のDAN、PE5
01、PA317、ψ-2、ψ-AM、PA12、T19-14X、VT-19-17-H
2、ψCRE、ψCRIP、GP+E-86及びGP+envAm12細胞系が挙
げられるが、これらに限るわけではない。ベクターは、
当該技術分野で知られる任意の手段で、パッケージング
細胞に導入される。そのような手段としては、エレクト
ロポレーション、リポソームの使用及びリン酸カルシウ
ム沈降法が挙げられるが、これらに限るわけではない。
もう1つの方法として、レトロウイルスプラスミドベク
ターをリポソームに封入するか、脂質にカップリングし
た後、宿主に投与してもよい。 【０１０３】上記生産細胞系は、本発明ポリペプチドを
コードする核酸配列を含む感染性レトロウイルスベクタ
ー粒子を生成する。このようなレトロウイルスベクター
粒子は、試験管内又は生体内で、真核細胞の形質導入に
使用できる。形質導入された真核細胞は、本発明ポリペ
プチドをコードする核酸配列を発現させるだろう。形質
導入できる真核細胞としては、胚幹細胞、胚癌細胞、造
血幹細胞、肝細胞、繊維芽細胞、筋芽細胞、ケラチン生
成細胞、内皮細胞及び気管支上皮細胞が挙げられるが、
これらに限られるわけではない。 【０１０４】本発明は、診断薬としての本発明遺伝子の
使用にも関係する。本発明遺伝子の突然変異型の検出
は、本発明ポリペプチドの過少発現がもたらす疾患（例
えば不適当な創傷治癒、不適当な神経学的機能、目の障
害、腎障害、肝障害、毛包発育、血管形成、胚形成な
ど）又はその疾患に対する罹病性の診断を可能にする。 【０１０５】本発明のヒト遺伝子に突然変異を持つ個体
は、種々の技術によってDNAレベルで検出できる。診断
用の核酸は、血液、尿、唾液、組織生検及び検死体など
といった患者の細胞から得ることができる。ゲノムDNA
は、検出に直接使用してもよいし、分析に先立って、PC
Rを用いて酵素的に増幅してもよい（Saikiら, Nautre,
324:163-166（1986））。RNAやcDNAも同じ目的に使用で
きる。例えば、本発明ポリペプチドをコードする核酸に
相補的なPCRプライマーを使用して、その突然変異を同
定及び分析することができる。例えば、欠失や挿入は、
増幅産物のサイズが正常な遺伝子型とは異なることによ
って検出できる。点変異は、放射線で標識したRNA配列
若しくは放射線で標識したアンチセンスDNA配列に、増
幅したDNAをハイブリッド形成させることによって同定
できる。完全に一致する配列は、RNaseA消化若しくは融
解温度の相違によって、ミスマッチを持つ二本鎖分子と
識別することができる。 【０１０６】参照遺伝子と突然変異を持つ遺伝子の間の
配列の相違は、直接DNA配列決定法によって明らかにで
きる。さらに、クローン化したDNA部分をプローブとし
て使用することにより、特定のDNA部分を検出すること
もできる。この方法の感度は、PCRと組み合わせると、
著しく増大する。例えば、配列決定プライマーを、改良
PCRによって生成した二本鎖PCR産物又は一本鎖鋳型分子
と共に使用する。配列決定は、放射線標識ヌクレオチド
を用いる従来の手法か、蛍光標識を用いる自動配列決定
法によって行なう。 【０１０７】DNA配列の相違に基づく遺伝子試験は、変
性剤を含む（若しくは含まない）ゲルにおけるDNA断片
の電位泳動移動度の変化を検出することによって、達成
できる。小さい配列の欠失と挿入は、高分解能ゲル電気
泳動によって可視化できる。配列が異なるDNA断片は、
変性ホルムアミド勾配ゲルで識別できる。この場合、異
なるDNA断片の移動度は、それぞれの融解温度又は部分
的融解温度に従って、ゲル中の異なる位置で遅延する
（例えばMyersら, Science, 230:1242（1985）を参照の
こと）。 【０１０８】特定の位置における配列の変化は、化学的
切断法や、RNase及びS1保護などのヌクレアーゼ保護検
定法でも明らかにできる（例えばCottonら, PNAS, USA,
85:4397-4401（1985）を参照）。 【０１０９】したがって、特定のDNA配列の検出は、ハ
イブリッド形成、RNase保護、化学的切断、直接DNA配列
決定などの方法、若しくは制限酵素の使用（例えば制限
断片長多形（Restriction Fragment Length Polymorphi
sms；RFLP））及びゲノムDNAのサザンブロッティングに
よって達成できる。より従来的なゲル電気泳動とDNA配
列決定に加えて、インシチュー分析でも突然変異を検出
することができる。 【０１１０】また、本発明は、種々の組織における本発
明ポリペプチドのレベルの変化を検出する診断的検定法
に関する。正常な対照組織試料に比べて本発明タンパク
質の発現が過剰であることは、新生組織形成、皮膚障
害、目の障害及び炎症などといったある種の疾患状態の
存在を示しうるからである。宿主から得た試料中の本発
明ポリペプチドのレベルを検出するのに使用する検定法
は、当業者には良く知られており、ラジオイムノアッセ
イ、競争結合検定、ウェスタンブロット分析、そして好
ましくはELISA検定が挙げられる。ELISA検定法では、先
ず、本発明ポリペプチドの抗原に特異的な抗体（好まし
くはモノクローナル抗体）を調製する。さらに、そのモ
ノクローナル抗体に対するリポーター抗体を調製する。
リポーター抗体には、放射活性や蛍光などの検出可能な
試薬（この例では西洋ワサビペルオキシダーゼ酵素）を
結合する。次に、宿主から試料を取り出し、その試料中
のタンパク質を結合する固体支持体（例えばポリスチレ
ン皿）上でインキュベートする。次に、非特異的タンパ
ク質（ウシ血清アルブミンなど）と共にインキュベート
することによって、皿上の遊離のタンパク質結合部位を
すべて覆う。次に、上記モノクローナル抗体をその皿中
でインキュベートする。この間に、モノクローナル抗体
は、ポリスチレン皿に結合した本発明ポリペプチドのす
べてに結合する。未結合のモノクローナル抗体を緩衝液
で洗い流す。次に、西洋ワサビペルオキシダーゼに結合
したリポーター抗体をその皿に入れ、本発明ポリペプチ
ドに結合したモノクローナル抗体にレポーター抗体を結
合させる。次に、未結合のリポーター抗体を洗い流す。
次に、ペルオキシダーゼ基質をその皿に加える。与えら
れた期間中に発色する色の量を標準曲線と比較すれば、
与えられた体積の患者試料中に存在するタンパク質量の
測定値が得られる。 【０１１１】競争検定法を用いて、宿主から得た試料中
の本発明ポリペプチドのレベルを決定することもでき
る。この検定法では、本発明ポリペプチドに対する受容
体を過剰発現させる原形質膜を単離する。次に、標識さ
れた本発明ポリペプチドを含有する試験試料をその原形
質膜に加え、規定の時間インキュベートする。その反応
混合物には、本発明ポリペプチドを含有すると思われる
宿主から得た試料も加える。次に、その反応混合物をフ
ィルターに通し、そのフィルターをすばやく洗浄した
後、結合した放射活性を測定することによって、受容体
に関する競争量（したがってその試料中の本発明ポリペ
プチドの量）を決定する。 【０１１２】TGFα-HIIに対する抗体は、癌の診断と治
療に使用できる。癌細胞の多くは、新生組織形成又は過
形成の過程で、種々のTGFαファミリー構成要素を上方
調節するからである。これらの抗体はTGFα-HIIに結合
して、それを不活化する。TGFα-HII（及び/又はそのフ
ァミリー構成要素）に対するモノクローナル抗体は、あ
る種の障害（例えば過形成及び新生組織形成増殖異常な
ど（ただしこれに限られない））の診断と治療に、臨床
的に用いられる。新生物組織による増殖因子発現の上方
調節は、患者の血液中の増殖因子の増大を検出する種々
の血清検定法の基礎をなす。これらの検定法は、通常、
診断的に応用されるばかりでなく、予後（手術や化学療
法などに続いて、ごく微量な腫瘍細胞の存在を検出する
ため）にも応用される。 【０１１３】また、TGFα-HII受容体を発現させる悪性
細胞は、標識したTGFα-HIIを受容体結合検定法で用い
るか、若しくはTGFα-HII受容体自体に対する抗体を使
用することによって検出できる。細胞はTGFα-HIIに対
する受容体の存在と密度によって識別できるので、これ
は、TGFα-HIIの生物学的活性に対するそのような細胞
の感受性を予測する手段となる。 【０１１４】本発明の配列は、染色体同定にも有効であ
る。本発明の配列は、個々のヒト染色体上の特定の位置
に特異的に誘導され、それにハイブリッド形成できる。
また、染色体上の特定の部位を同定することは、現在必
要とされていることでもある。現在のところ、染色体位
置の標識に利用できる、実際の配列データ（反復多形
（repeat polymorphisms））に基づく染色体標識試薬は
ほとんどない。本発明による染色体に対するDNAのマッ
ピングは、それらの配列を疾患に関係する遺伝子と相関
させる重要な第1段階である。 【０１１５】簡単に述べると、配列は、そのcDNAからPC
Rプライマー（15〜25bpが好ましい）を調製することに
よって、染色体に対してマッピングできる。ゲノムDNA
中の2エクソン以上にまたがることによって増幅過程を
複雑にすることのないプライマーをすばやく選択するに
は、3'非翻訳領域のコンピューター分析を用いる。次
に、個々のヒト染色体を含有する体細胞ハイブリッドの
PCRスクリーニングに、これらのプライマーを用いる。
そのプライマーに対応するヒト遺伝子を含有するハイブ
リッドのみが、増幅断片を生成するだろう。 【０１１６】体細胞ハイブリッドのPCRマッピングは、
特定のDNAを特定の染色体に割り当てる迅速な方法であ
る。同じオリゴヌクレオチドプライマーで本発明を用い
ると、同様の方法で、特定の染色体に由来する断片のパ
ネル若しくは大きいゲノムクローンのプールで、サブマ
ッピング（sublocalization）を達成できる。染色体に
対するマッピングに同様に使用できる他のマッピング法
としては、インシチューハイブリッド形成、染色体特異
的cDNAライブラリーを構築するためのハイブリッド形成
による予備選択及び標識フロー選別（labeled flow-sor
ted）染色体による予備スクリーニングが挙げられる。 【０１１７】中期染色体に対するcDNAクローンの蛍光イ
ンシチューハイブリッド形成（FISH）を用いると、1段
階で正確な染色体位置を得ることができる。この技術は
50又は60塩基程度のcDNAでも使用できる。この技術の総
説としては、Vermaら, HumanChromosomes: a Manual of
Basic Techniques, Pergamon Press,ニューヨーク（19
88）を参照のこと。 【０１１８】配列を正確な染色体位置にマッピングした
ら、その配列の染色体上の物理的位置を遺伝子マップデ
ータと相関させることができる。そのようなデータは、
例えばV. McKusick, Mendelian Inheritance in Man
（ジョーンズホプキンス大学ウェルチ医学図書館からオ
ンラインで入手できる）に認められる。次に、同じ染色
体領域にマッピングされた疾患と遺伝子の関係を連鎖分
析（linkage analysis）（物理的に隣接する遺伝子の同
時遺伝）によって同定する。 【０１１９】次に、患者と非患者の間で、そのcDNA又は
ゲノム配列の相違を決定する必要がある。ある突然変異
がその患者の一部又は全部に観測され、正常な個体には
観測されない場合、その突然変異はその疾患の原因因子
であるかもしれない。 【０１２０】物理的マッピング技術と遺伝子マッピング
技術の現在の解像度では、その疾患に関係する染色体領
域に正確にその位置が特定されるcDNAは、50〜500個の
潜在的原因因子のうちの一つであろう（1メガ塩基マッ
ピング解像度と20kbにつき1遺伝子と仮定）。 【０１２１】本発明ポリペプチド、その断片その他の誘
導体、その類縁体、若しくはそれらを発現させる細胞
は、それらに対する抗体を生産するための免疫原として
使用できる。これらの抗体は、例えばポリクローナル抗
体やモノクローナル抗体でありうる。本発明は、キメラ
抗体、一本鎖抗体、擬人化抗体及びFab断片又はFab発現
ライブラリーの産物をも包含する。このような抗体及び
断片の生産法は、当該技術分野で種々知られている。 【０１２２】本発明の配列に対応するポリペプチドに対
して生じる抗体は、動物（好ましくはヒト以外の動物）
にそのポリペプチドを直接注射するか、投与することに
よって得ることができる。そのようにして得た抗体は、
そのポリペプチド自体に結合するだろう。この方法で
は、そのペプチドの断片のみをコードする配列を使用し
て、その全天然ポリペプチドを結合する抗体を生成させ
ることもできる。そのような抗体は、そのポリペプチド
を発現させる組織からそのポリペプチドを単離するため
に使用できる。 【０１２３】モノクローナル抗体の製造には、連続的継
代細胞系培養によって生産される抗体を与える任意の技
術を使用できる。その例としては、ハイブリドーマ技術
（Kohler及びMilstein, 1975, Nature, 256:495-49
7）、トリオーマ（trioma）技術、ヒトB細胞ハイブリド
ーマ技術（Kozborら, 1983, Immunology Today 4:72）
及びヒトモノクローナル抗体を生産するためのEBVハイ
ブリドーマ技術（Coleら, 1985, Monoclonal Antibodie
s and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., 77-96
頁）が挙げられる。 【０１２４】一本鎖抗体の生産について記述した技術
（米国特許4,946,778）は、本発明の免疫原性ポリペプ
チド産物に対する一本鎖抗体の生産に適合させることが
できる。また、形質転換マウスを用いて、本発明の免疫
原性ポリペプチド産物に対する擬人化抗体を発現させる
こともできる。 【０１２５】以下の実施例を参照して、本発明をさらに
説明する。ただし、本発明はこれらの実施例に限定され
ないと理解すべきである。特に指定しない限り、割合や
量はすべて重量に基づく。 【０１２６】以下の実施例の理解を容易にするため、頻
繁に使用する方法及び/又は用語をいくつか説明してお
く。 【０１２７】「プラスミド」は、小文字pとその前後の
大文字及び/又は数字で指定する。本明細書における出
発プラスミドは市販されているか、公に無制限に入手で
きるか、若しくは入手できるプラスミドから公表された
方法に従って構築できる。さらに、当該技術分野では、
本明細書に記述するプラスミドと等価なプラスミドが知
られており、それらは当業者には明らかだろう。 【０１２８】DNAの「消化」とは、そのDNA中の特定の配
列でのみ作用する制限酵素によるDNAの触媒的切断を意
味する。本明細書で使用する種々の制限酵素は市販され
ており、それらの反応条件、補因子その他の必要条件
は、当業者に知られているであろうものを使用した。分
析には、通常、1μgのプラスミド又はDNA断片を約2単位
の酵素と共に約20μlの緩衝溶液中で使用する。プラス
ミド構築用のDNA断片を単離する場合は、通常、より大
きい体積中で、5〜50μgのDNAを20〜250単位の酵素で消
化した。特定の制限酵素に適した緩衝液と基質の量は、
製造者によって指定される。通常は37℃で約1時間のイ
ンキュベーション時間を使用するが、これは供給者の指
示に従って変えることができる。消化後、その反応液を
ポリアクリルアミドゲルで直接電気泳動して、所望の断
片を単離する。 【０１２９】切断した断片のサイズ分離は、Goeddel,
D.ら, Nucleic Acids Res., 8:4057（1980）に記載の8%
ポリアクリルアミドゲルを用いて行なう。 【０１３０】「オリゴヌクレオチド」とは、化学的に合
成できる一本鎖ポリデオキシヌクレオチド又は2本の相
補的ポリデオキシヌクレオチド鎖を意味する。そのよう
な合成オリゴヌクレオチドは5'リン酸基を持たないの
で、キナーゼの存在下にATPでリン酸基を付加しない
と、もう1つのオリゴヌクレオチドには連結しないだろ
う。合成オリゴヌクレオチドは、脱リン酸化されていな
い断片に連結するだろう。 【０１３１】「連結」とは、2本の二本鎖核酸断片間の
リン酸ジエステル結合の形成過程をいう（Maniatis, T.
ら,同上,146頁）。特に規定しない限り、連結は、既知
の緩衝液と条件を用いて、連結すべきほぼ等モル量のDN
A断片0.5μgにつき10単位のT4 DNAリガーゼ（「リガー
ゼ」）で、達成することができる。特に明言しない限
り、形質転換はGraham, F.及びVan der Eb, A., Virolo
gy,52:456-457（1973）の方法で行なった。 【０１３２】実施例1：可溶型TGFα-HIIの細菌発現と精
製 TGFα-HIIをコードするDNA配列（ATCC番号97160）を、
まず、プロセシングされたTGFα-HIIタンパク質（シグ
ナルペプチド配列を欠く）の5'配列に対応するPCRオリ
ゴヌクレオチドプライマーと、TGFα-HII遺伝子の3'側
にあるベクター配列に対応するPCRオリゴヌクレオチド
プライマーとを用いて増幅した。TGFα-HIIに対応する
追加のヌクレオチドを、その5'配列と3'配列のそれぞれ
に付加した。5'オリゴヌクレオチドプライマーは、 【数１】 という配列を持ち、BamHI制限酵素部位（太字部分）
と、それに続く、プロセシングされたタンパク質コドン
の推定末端アミノ酸から始まるTGFα-HIIコーディング
配列の21ヌクレオチドとを含有する。3'配列（5'GGGAAG
CTTTTAATACTGAAATCGTACAGGAC3'；配列番号4）は、HindI
II部位に相補的な配列を含有し、それに、TGFα-HIIの2
3ヌクレオチドが続いている。これらの制限酵素部位
は、細菌発現ベクターpQE-9（Quiagen, Inc.,カリフォ
ルニア州91311チャッツワース）上の制限酵素部位に対
応する。pQE-9は抗生物質耐性（Ampｒ）、細菌性複製起
点（ori）、IPTGで制御できるプロモーターオペレータ
ー（P/O）、リボソーム結合部位（RBS）、6-His標識及
び制限酵素部位をコードする。pQE-9をBamHIとHindIII
で消化した。増幅した配列をpQE-9中に連結し、ヒスチ
ジン標識及びRBSと枠を合わせて挿入した。次に、その
連結混合物を用いて、Sambrook, J.ら, Molecular Clon
ing: A Laboratory Manual, Cold Harbor Laboratory P
ress（1989）に記載の手法で、大腸菌M15/rep4株（Qiag
en, Inc.）を形質転換した。M15/rep4は、lacI抑制因子
を発現し、かつ、カナマイシン耐性（Kanｒ）を付与す
るプラスミドpREP4の複数コピーを含有する。LBプレー
ト上で成長するそれらの能力によって形質転換体を同定
し、アンピシリン/カナマイシン耐性コロニーを選択し
た。プラスミドDNAを単離し、制限分析によってそれを
確認した。所望の構築物を含有するクローンを、Amp（1
00μg/ml）とKan（25μg/ml）の両方を補足したLB液体
培地で、終夜（O/N）培養した。そのO/N培養物を、1:10
0〜1:250の比率で、大きい培養に接種した。光学密度60
0（O.D.６００）が0.4〜0.6になるまで細胞を生育し
た。次に、IPTG（「イソプロピル-(-D-チオガラクトピ
ラノシド」）を最終濃度1mMで加えた。IPTGは、lacI抑
制因子を不活化することによって、P/Oをきれいにし、
遺伝子発現の増大を誘導する。細胞をさらに3〜4時間生
育した。次に、遠心分離によって細胞を収集した。細胞
ペレットをカオトロピック剤6M塩酸グアニジン中で可溶
化した。清浄化の後、この溶液から、6-His標識を含有
するタンパク質による強固な結合が可能な条件下に、ニ
ッケル-キレートカラムでのクロマトグラフィーによっ
て、可溶化したTGFα-HIIを精製した（Hochuli, E.ら,
J. Chromatography 411:177-184（1984））。TGFα-HII
（純度85%）を6M塩酸グアニジンpH5.0でカラムから溶出
させ、再生のために、3M塩酸グアニジン、100mMリン酸
ナトリウム、10mMグルタチオン（還元型）及び2mMグル
タチオン（酸化型）に調節した。この溶液を12時間イン
キュベートした後、タンパク質を10mMリン酸ナトリウム
に対して透析した。 【０１３３】実施例2：バクロウイルス発現系によるTGF
α-HIIのクローニングと発現 完全長TGFα-HIIタンパク質をコードするDNA配列（ATCC
番号97160）を、その遺伝子の5'及び3'配列に対応するP
CRオリゴヌクレオチドプライマーを用いて増幅した。三
組のプライマーを使用した。第1のプライマー対は、 【数２】 と、5'GCGTCTAGACTAGTATAGAACACTGTAGTCC3'（配列番号
6）である。この構築物は、配列番号1のヌクレオチド32
1に始まってヌクレオチド1248で終わり、推定リーダー
配列を含む。第2のプライマー対は、 【数３】 と、5'GCGTCTAGACTAGTATAGAACACTGTAGTCC3'（配列番号
8）である。この構築物は、配列番号1のヌクレオチド40
2に始まってヌクレオチド1248で終わり、推定リーダー
配列を含まない。第3のプライマー対は、 【数４】 と、5'GCGTCTAGACTAGTATAGAACACTGTAGTCC3'（配列番号1
0）である。この構築物は、配列番号1のヌクレオチド11
00に始まってヌクレオチド1248で終わり、本発明ポリペ
プチドの推定可溶性部分である。上記3種類の5'プライ
マーはすべて、BamHI制限酵素部位（太字部分）を持
ち、その部分に、真核細胞における翻訳開始の効率のよ
いシグナルに似たヌクレオチド（Kozak, M., J.Mol. Bi
ol., 196:947-950（1987））が続いている（翻訳開始コ
ドン「ATG」には下線を引いた）。第3のプライマー対に
ついては、バクロウイルスシグナルペプチド配列をpA2G
Pベクターに組込んだ。 【０１３４】上記3'プライマーは、制限エンドヌクレア
ーゼXbaIの切断部位を含有し、TGFα-HII遺伝子の3'TGF
αドメインに相補的なヌクレオチドを持つ。増幅された
配列を、市販のキット（「Geneclean」, BIO 101 Inc.,
カリフォルニア州ラジョラ）を用いて、1%アガロースゲ
ルから単離した。次に、その断片をエンドヌクレアーゼ
BamHIとXbaIで消化した後、1%アガロースゲルで再び精
製した。この断片をF2と命名した。 【０１３５】第1及び第2のプライマー対にはベクターpA
2を使用し、第3のプライマー対にはpA2GPベクターを使
用した。バクロウイルス発現系（総説としてはSummers,
M.D.及びSmith, G.E., 1987, A manual of methods fo
r baculovirus vectors and insect cell culture proc
edures, Texas Agricultural Experimental Station Bu
lletin No. 1555を参照のこと）によるTFGα-HIIタンパ
ク質の発現には、pA2ベクター（pVL941ベクターを改良
したもの、後述）を使用した。この発現ベクターは、Au
tographa californica核多角体病ウイルス（AcMNPV）の
強力なポリヘドリン（polyhedrin）プロモーターと、そ
れに続く制限エンドヌクレアーゼ認識部位とを含有す
る。効率のよいポリアデニル化のために、シミアンウイ
ルス（SV）40のポリアデニル化部位を使用した。組換え
ウイルスを簡単に選択するため、大腸菌由来の(-ガラク
トシダーゼ遺伝子を、ポリヘドリン遺伝子のポリアデニ
ル化シグナルに先行するポリヘドリンプロモーターと同
じ方向に挿入した。ポリヘドリン配列の両端には、同時
にトランスフェクションされる野生型ウイルスDNAの細
胞媒介相同組換え用のウイルス配列を隣接させた。pRG1
の代わりに、pAc373、pVL941及びpAcIM1（Luckow, V.A.
及びSummers, M.D., Virology, 170:31-39）などといっ
た他の多くのバクロウイルスベクターも使用できる。 【０１３６】上記プラスミドを制限酵素BamHIとXbaIで
消化した後、ウシ腸ホスファターゼを用いて、当該技術
分野で知られる手法で、脱リン酸化した。次に、市販の
キット（「Geneclean」, BIO 101 Inc.,カリフォルニア
州ラジョラ）を用いて、そのDNAを1%アガロースゲルか
ら単離した。このベクターをV2と命名した。 【０１３７】断片F2と脱リン酸化プラスミドV2をT4 DNA
リガーゼで連結した。次に、大腸菌HB101細胞を形質転
換し、TGFα-HII遺伝子を持つプラスミド（pBacTGFα-H
II）を含有する細菌を、制限酵素BamHIとXbaIを用いて
同定した。クローン化された断片の配列をDNA配列決定
によって確認した。 【０１３８】リポフェクション法（Felgnerら, Proc. N
atl. Acad. Sci. USA, 84:7413-7417（1987））を用い
て、5μgのプラスミドpBacTGFα-HIIを、市販の直鎖化
したバクロウイルス（「BaculoGoldＴＭ baculovirus D
NA」, Pharmingen,カリフォルニア州サンディエゴ）1.0
μgと同時にトランスフェクションした。 【０１３９】1μgのBaculoGoldＴＭウイルスDNAと5μg
のプラスミドpBac-TGFα-HIIを、血清非含有グレース培
地（Life Technologies Inc.,メリーランド州ガイサー
スブルク）50μlの入ったマイクロタイタープレートの
滅菌ウェル中で混合した。その後、リポフェクチン10μ
lとグレース培地90μlを加え、混合し、室温で15分間イ
ンキュベートした。次に、血清を含まないグレース培地
1mlが入っている35mm組織培養プレートに接種したSf9昆
虫細胞（ATCC CRL1711）に、上記トランスフェクション
混合物を滴下した。プレートを前後にゆすって、新たに
加えた溶液を混合した。次に、そのプレートを27℃で5
時間培養した。5時間後、トランスフェクション溶液を
プレートから取り除き、10%ウシ胎児血清を補足したグ
レース昆虫培地1mlを加えた。そのプレートを培養器に
戻し、培養を27℃で4日間続けた。 【０１４０】4日後、上清を集め、Summers及びSmith
（上記）の記述と同様に、プラーク検定を行なった。改
良点として、「Blue Gal」（Life Technologies Inc.,
ガイサースブルク）を含むアガロースゲルを使用した。
これは、青く染色したプラークの単離を容易にする。
「プラーク検定」に関する詳細な説明は、Life Technol
ogies Inc.（ガイサースブルク）が発行している昆虫細
胞培養とバクロウイルス学に関するユーザーズガイドの
9-10頁にも認められる。 【０１４１】連続希釈の4日後、ウイルスを細胞に加
え、青く染色したプラークをエッペンドルフピペットの
チップで拾った。次に、組換えウイルスを含有する寒天
を、グレース培地200μlの入ったエッペンドルフチュー
ブ中に再懸濁した。短い遠心分離によって寒天を除去
し、組換えバクロウイルスを含有する上清を用いて、35
mm皿に接種したSf9細胞を感染させた。4日後、これらの
培養皿の上清を収集し、4℃で保存した。 【０１４２】Sf9細胞を、10%熱不活化FBSを補足したグ
レース培地で生育した。その細胞を組換えバクロウイル
スV-TGFα-HIIに感染多重度（MOI）2で感染させた。6時
間後、培地を除去し、メチオニンとシステインを欠くSF
900 II培地（Life Technologies Inc.,ガイサースブル
ク）に置換した。42時間後、5μCiの３５S-メチオニン
と5μCiの３５S-システイン（Amersham）を加えた。細
胞をさらに16時間培養した後、遠心分離によって収集
し、標識されたタンパク質をSDS-PAGEとオートラジオグ
ラフィーで可視化した。 【０１４３】実施例3：COS細胞における組換えTGFα-HI
Iの発現 プラスミド、TGFα-HII HAの発現は、1）SV40複製起
点、2）アンピシリン耐性遺伝子、3）大腸菌複製起点、
4）CMVプロモーターとそれに続くポリリンカー領域、SV
40イントロン及びポリアデニル化部位を含有するベクタ
ーpcDNA3/Amp（Invitrogen）によった。全TGFα-HII前
駆体と、その3'末端にインフレーム（in frame）融合し
たHA標識とをコードするDNA断片を、上記ベクターのポ
リリンカー領域にクローニングした。したがって、その
組換えタンパク質の発現はCMVプロモーターに制御され
る。HA標識は、既に記述したように、インフルエンザ血
球凝集素タンパク質に由来するエピトープに対応する
（I. Wilson, H. Niman, R. Heighten, A. Cherenson,
M. Connolly及びR. Lerner, Cell, 37:767（1984））。
標的タンパク質にHA標識を融合すると、HAエピトープを
認識する抗体で組換えタンパク質を容易に検出できるよ
うになる。 【０１４４】プラスミド構築法は次の通りである。TGF
α-HIIをコードするDNA配列（ATCC番号97160）を、次の
2つのプライマーを用いて、クローン化した原型EST（th
e original EST cloned）に対するPCRによって構築し
た。5'プライマー 【数５】 は、BamHI部位（太字部分）と、それに続く、開始コド
ンから始まるTGFα-HIIコーディング配列の18ヌクレオ
チドとを含有する。3'配列（5'GCGCTCGAGGTATAGAACACTG
TAGTCC3'；配列番号12）は、XhoI部位、TGFαドメイン
の最後の19ヌクレオチド並びにXhoI部位に相補的な配列
を含有する。pcDNA3/Ampベクターは、BamHI/XhoIクロー
ニング部位を含み、このクローニング部位を利用する
と、PCR挿入物の読み枠が3'HA標識とそれに続く停止コ
ドンの読み枠に合う。したがって、PCR産物は、BamHI部
位、936塩基対のコーディング配列、及びXhoI部位を含
有する。そのPCR増幅DNA断片とベクターpcDNA3/Ampを、
BamHI及びXhoI制限酵素で消化し、連結した。その連結
混合物で大腸菌SURE株（Stratagene Cloning Systems,
カリフォルニア州92037ラジョラ）を形質転換し、その
形質転換培養をアンピシリン培地プレートで培養して、
耐性コロニーを選択した。プラスミドDNAを形質転換体
から単離し、制限分析によって正しい断片の存在を調べ
た。この組換えTGFα-HIIを発現させるため、DEAE-デキ
ストラン法（J. Sambrook, E. Fritsch, T.Maniatis, M
olecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring
Laboratory Press（1989））によって、COS細胞を上記
発現ベクターでトランスフェクションした。TGFα-HII
HAタンパク質の発現は、放射線標識と免疫沈降法（E. H
arlow, D. Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, C
old Spring Harbor Laboratory Press（1988））によっ
て検出した。トランスフェクションの2日後に、細胞を
３５S-システインで8時間標識した。次に、培養培地を
集め、細胞を界面活性剤（RIPA緩衝液（150mM NaCl, 1%
NP-40, 0.1%SDS, 1%NP-40, 0.5%DOC, 50mM Tris, pH7.
5）で溶解した（Wilson, I.ら,同上, 37:767（198
4））。細胞溶解液と培養培地の両方を、HA特異的モノ
クローナル抗体で沈殿させた。沈殿したタンパク質を15
%SDS-PAGEゲルで分析した。 【０１４５】実施例4：遺伝子療法による発現 皮膚生検によって対象から繊維芽細胞を得る。得られた
組織を組織培養培地に入れ、小片に分割する。少量の組
織を組織培養フラスコの湿った表面に乗せる。各フラス
コに、約10片を入れる。そのフラスコを上下逆さにし、
きつく密閉して、室温に終夜放置する。室温で24時間
後、そのフラスコを逆さにし、組織塊をフラスコの底に
固定したまま、新鮮な培地（例えば10%FBS、ペニシリン
及びストレプトマイシンを含むハムF12培地）を加え
る。次に、これを37℃で約1週間培養する。この時点
で、新鮮な培地を加え、以降、数日毎に交換する。さら
に2週間培養すると、繊維芽細胞の単層が生じる。その
単層をトリプシン処理して、より大きなフラスコに移
す。 【０１４６】モロニーネズミ肉腫ウイルスの長末端反復
を伴うpMV-7（Kirschmeier, P.T.ら, DNA, 7:219-25（1
988））を、EcoRIとHindIIIで消化した後、ウシ腸ホス
ファターゼで処理する。その直鎖ベクターをアガロース
ゲルで分画し、ガラスビーズを用いて精製する。 【０１４７】本発明ポリペプチドをコードするcDNAを、
それぞれ5'末端配列及び3'末端配列に対応するPCRプラ
イマーを用いて増幅する。その5'プライマーはEcoRI部
位を含有し、その3'プライマーはHindIII部位を含む。
モロニーネズミ肉腫ウイルス直鎖骨格と増幅したEcoRI
及びHindIII断片を、T4 DNAリガーゼの存在下に、等量
ずつ混合する。得られた混合物を、上記2断片の連結に
適した条件下に維持する。その連結混合物を用いて細菌
HB101を形質転換し、それを、カナマイシン含有寒天上
で培養することによって、目的の遺伝子がベクターに正
しく挿入されていることを確認する。 【０１４８】両種性pA317又はGP+am12パッケージング細
胞を、10%ウシ血清（CS）、ペニシリン及びストレプト
マイシンを含むダルベッコ改良イーグル培地（DMEM）
中、コンフルエント密度まで組織培養する。次に、上記
遺伝子を含有するMSVをその培地に加え、パッケージン
グ細胞をそのベクターで形質導入する。パッケージング
細胞は、上記遺伝子を含有する感染性ウイルス粒子を生
産するようになる（このパッケージング細胞を生産細胞
と呼ぶ）。 【０１４９】形質導入された生産細胞に新鮮な培地を加
えた後、コンフルエント生産細胞の10cmプレートから培
地を収集する。感染性ウイルス粒子を含有するその消費
済み培地をミリポアフィルターに通して、剥離した生産
細胞を除去し、その培地を用いて、繊維芽細胞を感染さ
せる。繊維芽細胞の亜コンフルエント（sub-confluen
t）プレートから培地を除去し、生産細胞から得た培地
にすばやく置換する。この培地を除去し、新鮮な培地で
置換する。ウイルスの力価が高ければ、実質上全ての繊
維芽細胞が感染され、選択の必要はないだろう。力価が
極めて低い場合は、neoやhisなどの選択可能マーカーを
持つレトロウイルスベクターを使用する必要がある。 【０１５０】次に、操作した上記繊維芽細胞を、そのま
ま、若しくはサイトデックス3ミクロキャリアービーズ
（cytodex 3 microcarrier beads）上でコンフルエント
に成長させた後、宿主に注射する。その繊維芽細胞は、
上記タンパク質産物を生産するようになっている。 【０１５１】上の教示を考慮すれば、本発明には数多く
の改良や変更を加えることができるので、詳しく説明し
た態様以外にも、添付の請求の範囲内で本発明を実施す
ることができる。 【０１５２】 【配列表】 (１) 一般的情報： (ｉ) 出願人／発明者：ウェイ等 (ii) 発明の名称： トランスフォ−ミング増殖因子α ＨＩＩ (iii) 配列の数： １２ (iv) 連絡先： (Ａ) 宛名：カレラ、バイアーン、ベイン、ジルフィラン、セッチ、 ステュワート・アンド・オルスタイン (Ｂ) 通り：ベッカー・ファーム・ロード６番 (Ｃ) 市：ローズランド (Ｄ) 州：ニュージャージー (Ｅ) 国：アメリカ合衆国 (Ｆ) ＺＩＰ：０７０６８ (ｖ) コンピューター解読書式： (Ａ) 媒体型：３.５インチディスケット (Ｂ) コンピューター：ＩＢＭ ＰＳ／２適合 (Ｃ) オペレーティング・システム：ＭＳ−ＤＯＳ (Ｄ) ソフトウエア：ワード・パーフェクト ５.１ (vi) 本出願のデータ： (Ａ) 出願番号： (Ｂ) 出願日： (Ｃ) 分類： (vii) 優先権主張出願のデータ： (Ａ) 出願番号：なし (Ｂ) 出願日：なし (viii) 弁理士／代理人 情報： (Ａ) 氏名：フェラロ、グレゴリー・ディー (Ｂ) 登録番号：３６,１３４ (Ｃ) 参照／整理番号：３２５８００−３５１ (ix) 電話連絡先情報： (Ａ) 電話番号：２０１−９９４−１７００ (Ｂ) ファックス番号：２０１−９９４−１７４４ (２) 配列番号１の情報： (ｉ) 配列の特徴： (Ａ) 長さ：１６９５ 塩基対 (Ｂ) 型：核酸 (Ｃ) 鎖の数：一本鎖 (Ｄ) トポロジー：直鎖状 (ii) 配列の種類：cＤＮＡ (xi) 配列：配列番号１： CACTCGTCTG CCCCTGGACT CCCGTCTCCT CCTGTCCTCC GGCTTCCCAG AGCTCCCTCC 60 TTATGGCAGC AGCTTCCCGC GTCTCCGGCG CAGTTCTCAG CGGACGACCC TCTCGCTCCG 120 GGGCTGAGCC CAGTCCCTGG ATGTTGCTGA AACTCTCGAG ATCATGCGCG GGTTTGGCTG 180 CTGCTTCCCC GCCGGGTGCC ACTGCCACCG CCGCCGCCTC TGCTGCCGCC GTCCGCGGGA 240 TGCTCAGTAG CCCGCTGCCC GGCCCCCGCG ATCCTGTGTT CCTCGGAAGC CGTTTGCTGC 300 TGCAGAGTTG CACGAACTAG TCATGGTGCT GTGGGAGTCC CCGCGGCAGT GCAGCAGCTG 360 GACACTTTGC GAGGGCTTTT GCTGGCTGCT GCTGCTGCCC GTCATGCTAC TCATCGTAGC 420 CCGCCCGGTG AAGCTCGCTG CTTTCCCTAC CTCCTTAAGT GACTGCCAAA CGCCCACCGG 480 CTGGAATTGC TCTGGTTATG ATGACAGAGA AAATGATCTC TTCCTCTGTG ACACCAACAC 540 CTGTAAATTT GATGGGGAAT GTTTAAGAAT TGGAGACACT GTGACTTGCG TCTGTCAGTT 600 CAAGTGCAAC AATGACTATG TGCCTGTGTG TGGCTCCAAT GGGGAGAGCT ACCAGAATGA 660 GTGTTACCTG CGACAGGCTG CATGCAAACA GCAGAGTGAG ATACTTGTGG TGTCAGAAGG 720 ATCATGTGCC ACAGATGCAG GATCAGGATC TGGAGATGGA GTCCATGAAG GCTCTGGAGA 780 AACTAGTCAA AAGGAGACAT CCACCTGTGA TATTTGCCAG TTTGGTGCAG AATGTGACGA 840 AGATGCCGAG GATGTCTGGT GTGTGTGTAA TATTGACTGT TCTCAAACCA ACTTCAATCC 900 CCTCTGCGCT TCTGATGGGA AATCTTATGA TAATGCATGC CAAATCAAAG AAGCATCGTG 960 TCAGAAACAG GAGAAAATTG AAGTCATGTC TTTGGGTCGA TGTCAAGATA ACACAACTAC 1020 AACTACTAAG TCTGAAGATG GGCATTATGC AAGAACAGAT TATGCAGAGA ATGCTAACAA 1080 ATTAGAAGAA AGTGCCAGAG AACACCACAT ACCTTGTCCG GAACATTACA ATGGCTTCTG 1140 CATGCATGGG AAGTGTGAGC ATTCTATCAA TATGCAGGAG CCATCTTGCA GGTGTGATGC 1200 TGGTTATACT GGACAACACT GTGAAAAAAA GGACTACAGT GTTCTATACG TTGTTCCCGG 1260 TCCTGTACGA TTTCAGTATG TCTTAATCGC AGCTGTGATT GGAACAATTC AGATTGCTGT 1320 CATCTGTGTG GTGGTCCTCT GCATCACAAG GAAATGCCCC AGAAGCAACA GAATTCACAG 1380 ACAGAAGCAA AATACAGGGC ACTACAGTTC GGACAATACA ACAAGAGCGT CCACGAGGTT 1440 AATCTAAAGG GAGCATGTTT CACAGTGGCT GGACTACCGA GAGCTTGGAC TACACAATAC 1500 AGTATTATAG ACAAAAGAAT AAGACAAGAG ATCTACACAT GTTGCCTTGC ATTTGTGGTA 1560 ATCTACACCA ATGAAAACAT GTACTACAGC TATATTTGAT TATGTATGGA TATATTTGAA 1620 ATAGTATACA TTGTCTTGAT GTTTTTTCTG TAATGTAAAT AAACTATTTA TATCACACAA 1680 AAAAAAAAAA AAAAA 1695 (２) 配列番号２の情報： (ｉ) 配列の特徴： (Ａ) 長さ：３７４アミノ酸 (Ｂ) 型：アミノ酸 (Ｃ) 鎖の数： (Ｄ) トポロジー：直鎖状 (ii) 配列の種類：蛋白質 (xi) 配列：配列番号２： Met Val Leu Trp Glu Ser Pro Arg Gln Cys Ser Ser Trp Thr Leu Cys 1 5 10 15 Glu Gly Phe Cys Trp Leu Leu Leu Leu Pro Val Met Leu Leu Ile Val 20 25 30 Ala Arg Pro Val Lys Leu Ala Ala Phe Pro Thr Ser Leu Ser Asp Cys 35 40 45 Gln Thr Pro Thr Gly Trp Asn Cys Ser Gly Tyr Asp Asp Arg Glu Asn 50 55 60 Asp Leu Phe Leu Cys Asp Thr Asn Thr Cys Lys Phe Asp Gly Glu Cys 65 70 75 80 Leu Arg Ile Gly Asp Thr Val Thr Cys Val Cys Gln Phe Lys Cys Asn 85 90 95 Asn Asp Tyr Val Pro Val Cys Gly Ser Asn Gly Glu Ser Tyr Gln Asn 100 105 110 Glu Cys Tyr Leu Arg Gln Ala Ala Cys Lys Gln Gln Ser Glu Ile Leu 115 120 125 Val Val Ser Glu Gly Ser Cys Ala Thr Asp Ala Gly Ser Gly Ser Gly 130 135 140 Asp Gly Val His Glu Gly Ser Gly Glu Thr Ser Gln Lys Glu Thr Ser 145 150 155 160 Thr Cys Asp Ile Cys Gln Phe Gly Ala Glu Cys Asp Glu Asp Ala Glu 165 170 175 Asp Val Trp Cys Val Cys Asn Ile Asp Cys Ser Gln Thr Asn Phe Asn 180 185 190 Pro Leu Cys Ala Ser Asp Gly Lys Ser Tyr Asp Asn Ala Cys Gln Ile 195 200 205 Lys Glu Ala Ser Cys Gln Lys Gln Glu Lys Ile Glu Val Met Ser Leu 210 215 220 Gly Arg Cys Gln Asp Asn Thr Thr Thr Thr Thr Lys Ser Glu Asp Gly 225 230 235 240 His Tyr Ala Arg Thr Asp Tyr Ala Glu Asn Ala Asn Lys Leu Glu Glu 245 250 255 Ser Ala Arg Glu His His Ile Pro Cys Pro Glu His Tyr Asn Gly Phe 260 265 270 Cys Met His Gly Lys Cys Glu His Ser Ile Asn Met Gln Glu Pro Ser 275 280 285 Cys Arg Cys Asp Ala Gly Tyr Thr Gly Gln His Cys Glu Lys Lys Asp 290 295 300 Tyr Ser Val Leu Tyr Val Val Pro Gly Pro Val Arg Phe Gln Tyr Val 305 310 315 320 Leu Ile Ala Ala Val Ile Gly Thr Ile Gln Ile Ala Val Ile Cys Val 325 330 335 Val Val Leu Cys Ile Thr Arg Lys Cys Pro Arg Ser Asn Arg Ile His 340 345 350 Arg Gln Lys Gln Asn Thr Gly His Tyr Ser Ser Asp Asn Thr Thr Arg 355 360 365 Ala Ser Thr Arg Leu Ile 370 (２) 配列番号３の情報： (ｉ) 配列の特徴： (Ａ) 長さ：３０ 塩基対 (Ｂ) 型：核酸 (Ｃ) 鎖の数：一本鎖 (Ｄ) トポロジー：直鎖状 (ii) 配列の種類：オリゴヌクレオチド (xi) 配列：配列番号３： CCCGGATCCG CACGAGACAT ACCTTGTCCG 30 (２) 配列番号４の情報： (ｉ) 配列の特徴： (Ａ) 長さ：３２ 塩基対 (Ｂ) 型：核酸 (Ｃ) 鎖の数：一本鎖 (Ｄ) トポロジー：直鎖状 (ii) 配列の種類：オリゴヌクレオチド (xi) 配列：配列番号４： GGGAAGCTTT TAATACTGAA ATCGTACAGG AC 32 (２) 配列番号５の情報： (ｉ) 配列の特徴： (Ａ) 長さ：３３ 塩基対 (Ｂ) 型：核酸 (Ｃ) 鎖の数：一本鎖 (Ｄ) トポロジー：直鎖状 (ii) 配列の種類：オリゴヌクレオチド (xi) 配列：配列番号５： CGCGGATCCG CCATCATGGT GCTGTGGGAG TCC 33 (２) 配列番号６の情報： (ｉ) 配列の特徴： (Ａ) 長さ：３１ 塩基対 (Ｂ) 型：核酸 (Ｃ) 鎖の数：一本鎖 (Ｄ) トポロジー：直鎖状 (ii) 配列の種類：オリゴヌクレオチド (xi) 配列：配列番号６： GCGTCTAGAC TAGTATAGAA CACTGTAGTC C 31 (２) 配列番号７の情報： (ｉ) 配列の特徴： (Ａ) 長さ：３３ 塩基対 (Ｂ) 型：核酸 (Ｃ) 鎖の数：一本鎖 (Ｄ) トポロジー：直鎖状 (ii) 配列の種類：オリゴヌクレオチド (xi) 配列：配列番号７： CGCGGATCCG CCATCATGCT ACTCATCGTA GCC 33 (２) 配列番号８の情報： (ｉ) 配列の特徴： (Ａ) 長さ：３１ 塩基対 (Ｂ) 型：核酸 (Ｃ) 鎖の数：一本鎖 (Ｄ) トポロジー：直鎖状 (ii) 配列の種類：オリゴヌクレオチド (xi) 配列：配列番号８： GCGTCTAGAC TAGTATAGAA CACTGTAGTC C 31 (２) 配列番号９の情報： (ｉ) 配列の特徴： (Ａ) 長さ：３１ 塩基対 (Ｂ) 型：核酸 (Ｃ) 鎖の数：一本鎖 (Ｄ) トポロジー：直鎖状 (ii) 配列の種類：オリゴヌクレオチド (xi) 配列：配列番号９： CGCGGATCCA GAACACCACA TACCTTGTCC G 31 (２) 配列番号１０の情報： (ｉ) 配列の特徴： (Ａ) 長さ：３１ 塩基対 (Ｂ) 型：核酸 (Ｃ) 鎖の数：一本鎖 (Ｄ) トポロジー：直鎖状 (ii) 配列の種類：オリゴヌクレオチド (xi) 配列：配列番号１０： GCGTCTAGAC TAGTATAGAA CACTGTAGTC C 31 (２) 配列番号１１の情報： (ｉ) 配列の特徴： (Ａ) 長さ：３３ 塩基対 (Ｂ) 型：核酸 (Ｃ) 鎖の数：一本鎖 (Ｄ) トポロジー：直鎖状 (ii) 配列の種類：オリゴヌクレオチド (xi) 配列：配列番号１１： CGCGGATCCG CCATCATGGT GCTGTGGGAG TCC 33 (２) 配列番号１２の情報： (ｉ) 配列の特徴： (Ａ) 長さ：２８ 塩基対 (Ｂ) 型：核酸 (Ｃ) 鎖の数：一本鎖 (Ｄ) トポロジー：直鎖状 (ii) 配列の種類：オリゴヌクレオチド (xi) 配列：配列番号１２： GCGCTCGAGG TATAGAACAC TGTAGTCC 28
ド、該ポリヌクレオチドによってコードされるポリペプ
チド、該ポリヌクレオチド及びポリペプチドの使用、及
び該ポリヌクレオチド及びポリペプチドの生産に関す
る。本発明のポリペプチドはヒトトランスフォーミング
増殖因子α相同体であろうと同定された。より具体的に
述べると、本発明のポリペプチドは、トランスフォーミ
ング増殖因子αHIIだろうと同定された。以下、これを
「TGFα-HII」ということもある。本発明は、そのよう
なポリペプチドの作用を阻害することにも関係する。 【０００２】細胞の成長と分化は、様々な刺激因子、阻
害因子、共同作用因子及びホルモンによって開始、促
進、維持及び調節されているようである。細胞ホメオス
タシス機構の変化及び/又は破壊は、腫瘍形成を含む成
長関連疾患の根本的な原因であると思われる。成長モジ
ュラー（modular）因子は、シグナル変換、細胞連絡、
成長と発生、胚形成、免疫応答、造血細胞の生存と分
化、炎症、組織の修復と再生、アテローム性動脈硬化及
び癌を含む、極めて多様な病理学的及び生理学的過程に
関係する。特に、上皮増殖因子（EGF）、トランスフォ
ーミング増殖因子α（TGFα）、ベータセルリン（betac
ellulin）、アンフィレグリン（amphiregulin）及びワ
クシニア増殖因子は、種々の細胞タイプが正常な生理学
的条件下に若しくは外因性の刺激に応答して生産する成
長及び分化調節タンパク質であり、EGFファミリーの構
成要素である。 【０００３】これらのペプチド増殖因子は、自己分泌機
構及び傍分泌機構によって創傷細胞に影響を及ぼす。ま
た、これらの増殖因子は、皮膚、角膜及び胃腸路のよう
な組織における創傷治癒にも重要な役割を果たし、3つ
の鎖間ジスルフィド結合の配置が保存されていることを
含めて、すべての因子が本質的なアミノ酸配列相同性を
共有する。さらに、このファミリーの因子はすべて、分
子量170,000の膜貫通型糖タンパク質受容体に結合し、
その受容体の細胞質ドメインにあるチロシンキナーゼ活
性を活性化する（Buhrow, S.A.ら, J. Bio. Chem., 25
8:7824-7826（1983））。 【０００４】これらの受容体は、皮膚ケラチン生成細
胞、繊維芽細胞、血管内皮細胞及びGI路の上皮細胞を含
む多くのタイプの細胞に発現する。これらのペプチド増
殖因子は、創傷治療に関与するいくつかの細胞（血小
板、ケラチン生成細胞及び活性化マクロファージを含
む）によって合成される。また、これらの増殖因子は、
ある種の細胞の成長及び分化の刺激（例えば腫瘍形成）
にも関係付けられているし、他のタイプの細胞の阻害に
も関係付けられている。 【０００５】ベータセルリンは32キロダルトンの糖タン
パク質であり、これはタンパク質加水分解的切断によっ
て、より大きい膜貫通型前駆体からプロセシングされる
ようである。ベータセルリンのカルボキシル末端ドメイ
ンは、ラットのトランスフォーミング増殖因子αの対応
部分と50%の配列類似性を持つ。ベータセルリンは、レ
チナール色素上皮細胞と血管平滑筋細胞にとって、強力
な有糸分裂促進物質である。 【０００６】アンフィレグリンは、新生物細胞における
DNA合成に対して強力な阻害活性を示し、ある種の正常
細胞の成長をも促進する、二作用性細胞増殖調節因子で
ある。アンフィレグリンには、創傷と癌の治療を含む種
々の用途が挙げられている。例えば、アンフィレグリン
は、上皮由来の数種類のヒト癌細胞系に対して、試験管
内で強力な抗増殖作用を持つ。また、アンフィレグリン
は、米国特許出願第5,115,096号に示されるように、ヒ
ト包皮繊維芽細胞の増殖を誘導する。 【０００７】TGFαは、多面発現性の生物学的作用を持
つ。TGFαの構成要素のいくつかは、発ガン的にトラン
スフォームした繊維芽細胞のいくつかによって（Ciardi
elloら, J. Cell. Biochem., 42:45-57（1990））、ま
た、腎臓癌、乳癌、偏平上皮癌、黒色腫及び膠芽腫を含
む種々の腫瘍によって（Derynck, R.ら, Cancer Res.,4
7:707-712（1987））合成される。高レベルのTGFαを発
現させる腫瘍細胞を持つ形質転換マウスを分析すること
によって、TGFαの発現が、正常細胞が腫瘍形成細胞に
変換する際の原因因子でありうることが直接的に立証さ
れている。TGFα形質転換動物は、TGFα発現を制御する
プロモーターの選択とマウスの株によって、種々の新生
物病変を示す（Sandgrenら, Cell, 61:1121-1135（199
0））。 【０００８】TGFαは、正常な胚の発生と成人の生理機
能にもある役割を果たす（Derynck,R. Adv. Cancer Re
s., 58:27-5（1992））。TGFαは、皮膚、脳、胃腸粘膜
及び活性化マクロファージを含む多くの組織で発現され
ている。したがって、TGFαは、上皮細胞の成長を制御
する重要な因子であり、創傷治療にも役割を果たす。ま
た、TGFαは、脈管形成性であることもわかっている（S
chreiberら, Science,232:1250-1253（1986））。 【０００９】本発明のポリペプチドは、トランスフォー
ミング増殖因子TGFα-HIIであろうと同定された。この
同定は、ヒトTGFαに対するアミノ酸相同性の結果とし
てなされた。 【００１０】本発明の一側面によれば、新規成熟ポリペ
プチド並びにその類縁体及び生物学的に活性かつ診断又
は治療に有用な断片が提供される。本発明のポリペプチ
ドはヒト由来である。 【００１１】本発明のもう1つの側面によると、本発明
のポリペプチドをコードする単離された核酸分子（mRN
A、DNA、cDNA、ゲノムDNAを含む）並びに生物学的に活
性かつ診断又は治療に有用なその断片、類縁体及び断片
が提供される。 【００１２】本発明のさらなる側面によれば、組換え技
術によって上記ポリペプチドを生産する方法であって、
本発明ポリペプチドをコードする核酸配列を含有する組
換え原核及び/又は真核宿主細胞を培養することからな
る方法が提供される。 【００１３】本発明のさらなる側面によれば、創傷治療
を刺激して外傷又はAIDS痴呆後の正常な神経学的機能を
修復するため、目の障害を治療するため、ある種の細胞
を標的にするため、腎障害及び肝障害を治療するため、
毛包の発育を促進するため、火傷、潰瘍及び角膜切開の
治療として血管形成を刺激するため、胚形成を刺激する
ためなどといった治療目的で、上記ポリペプチド又は上
記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを使用す
る方法が提供される。 【００１４】本発明のさらなる側面によれば、本発明の
核酸配列に特異的にハイブリッド形成しうる長さを持つ
核酸分子を含む核酸プローブも提供される。 【００１５】本発明のさらなる側面によれば、上記ポリ
ペプチドに対する抗体が提供される。 本発明のさらな
る側面によれば、本発明ポリペプチドに対するアゴニス
ト（作用薬）が提供される。 【００１６】本発明のさらなる側面によれば、上記ポリ
ペプチドに対するアンタゴニスト（拮抗薬）が提供され
る。これらのアンタゴニストは、例えば、角膜炎、新生
組織形成（腫瘍、癌など）及び乾癬の治療において、上
記ポリペプチドの作用を阻害するのに使用できる。 【００１７】本発明のさらなる側面によれば、本発明ポ
リペプチドの過剰発現及び上記ポリペプチドをコードす
る核酸配列中の突然変異に関係する疾患を検出するため
の診断的検定法が提供される。 【００１８】本発明のさらなる側面によれば、科学的研
究、DNAの合成及びDNAベクターの製造に関係する試験管
内用途に、上記ポリペプチド又は上記ポリペプチドをコ
ードするポリヌクレオチドを使用する方法が提供され
る。 【００１９】当業者にとって、本発明のこれらの側面と
他の側面は、本明細書の教示から明らかなはずである。 【００２０】以下の図面は本発明の実施態様を例示する
ものであって、請求の範囲が包含する本発明の範囲を限
定するものではない。 【００２１】図１〜図６は、TGFα-HIIの推定アミノ酸
配列に対応させたcDNA配列を表す。アミノ酸には標準的
な一文字略号を使用している。推定シグナル配列には下
線を引いておいた。 【００２２】図７〜図１０は、ヒトベータセルリン、ヒ
トTGFα及びヒトTGFα-HII（第3列）間のアミノ酸配列
相同性を比較した図である。「*」は、本発明のポリペ
プチドに保存されていることがわかった保存EGFモチー
フを表す。下線はヒトTGFαの成熟配列を表す。 【００２３】本発明の一側面によれば、図１〜図６の推
定アミノ酸配列（配列番号2）を持つ成熟ポリペプチド
若しくは1995年5月24日にATCC寄託番号97160として寄託
されたクローンのcDNAによってコードされる成熟ポリペ
プチドをコードする単離された核酸（ポリヌクレオチ
ド）が提供される。 【００２４】本発明のポリペプチドをコードするポリヌ
クレオチドは、ヒトの脳と初期段階の脳組織から得るこ
とができる。本発明のポリヌクレオチドは、2週齢の胚
から得たcDNAライブラリー中に発見された。これは、構
造的にEGFファミリーに関係している。このポリヌクレ
オチドは、374アミノ酸残基からなるタンパク質（その
うち45アミノ酸残基はリーダー配列と推定される）をコ
ードする読み取り枠を含有する。このタンパク質は、ヒ
トTGFαに対して最も高い相同性を示し、236アミノ酸の
範囲にわたって26%の同一性と46%の類似性を持つ。TGF
α-HIIは、EGFファミリーの全構成要素に認められる6個
の保存システイン残基すべてを含有する。 【００２５】配列番号2に記載の本発明の完全長ポリペ
プチドは、配列番号2のアミノ酸1からアミノ酸45までか
らなる推定シグナル配列を持ち、これは、このポリペプ
チドの細胞からの分泌を促進する。配列番号2のアミノ
酸46からアミノ酸214までは前駆体配列と推定されるか
ら、このポリペプチドはさらにプロセシングされて、こ
の部分が切り離される。さらに、アミノ酸264からアミ
ノ酸344までは、膜貫通部分であると推定される。この
部分は、このポリペプチドを特定の標的部位に誘導し
て、後述する生物学的機能を発揮するのに必要だと考え
られる。この膜貫通部分もこのペプチドから切り離され
うるので、本発明ペプチドの推定可溶性部分は、配列番
号2のアミノ酸215〜アミノ酸264からなる。 【００２６】本発明のポリヌクレオチドはRNA型であっ
てもよいし、cDNA、ゲノムDNA及び合成DNAを含むDNA型
であってもよい。DNAは二本鎖であってよいし、一本鎖
であってもよく、一本鎖の場合はコーディング鎖でもよ
いし、非コーディング（アンチセンス）鎖でもよい。成
熟ポリペプチドをコードするコーディング配列は、図１
〜図６に示すコーディング配列（配列番号1）又は上記
寄託クローンのコーディング配列と同一であってもよい
し、その遺伝コードの重複性又は縮重性の結果として図
１〜図６のDNA（配列番号1）又は上記寄託cDNAと同じ成
熟ポリペプチドをコードする、異なるコーディング配列
であってもよい。 【００２７】図１〜図６の成熟ポリペプチド（配列番号
2）をコードするポリヌクレオチド又は上記寄託cDNAに
よってコードされる成熟ポリペプチドをコードするポリ
ヌクレオチドは、例えば、その成熟ポリペプチドのコー
ディング配列のみを含んでもよいし、その成熟ポリペプ
チドのコーディング配列と付加的コーディング配列（リ
ーダー又は分泌配列など）若しくはプロタンパク質配列
を含んでもよいし、或いはその成熟ポリペプチド（付加
的コーディング配列を伴ってもよい）と非コーディング
配列（イントロンや成熟ポリペプチドに関するコーディ
ング配列の5'及び/又は3'側にある非コーディング配列
など）とを含んでもよい（ただしこれらに限られるわけ
ではない）。 【００２８】したがって、「ポリペプチドをコードする
ポリヌクレオチド」という用語は、そのポリペプチドの
コーディング配列のみを含むポリヌクレオチドと、さら
に付加的なコーディング配列及び/又は非コーディング
配列をも含むポリヌクレオチドとを包含する。 【００２９】さらに本発明は、図１〜図６の推定アミノ
酸配列（配列番号2）を持つポリペプチド若しくは上記
寄託クローンのcDNAによってコードされるポリペプチド
の断片、類縁体及び誘導体をコードする、上述のポリヌ
クレオチドの変種にも関係する。このポリペプチドの変
種は、上記ポリヌクレオチドの天然に存在する対立遺伝
子変種であってもよいし、上記ポリヌクレオチドの天然
には存在しない変種であってもよい。 【００３０】したがって本発明は、図１〜図６に示す成
熟ポリペプチド（配列番号2）又は上記寄託クローンのc
DNAによってコードされる成熟ポリペプチドと同じ成熟
ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、並びに図
１〜図６のポリペプチド（配列番号2）若しくは上記寄
託クローンのcDNAによってコードされるポリペプチドの
断片、誘導体又は類縁体をコードする上記ポリヌクレオ
チドの変種を包含する。そのようなヌクレオチド変種と
しては、欠失変種、置換変種及び付加又は挿入変種が挙
げられる。上述のように、本発明のポリヌクレオチド
は、図１〜図６に示すコーディング配列（配列番号1）
若しくは上記寄託クローンのコーディング配列の天然に
存在する対立遺伝子変種であるコーディング配列を持っ
てもよい。当該技術分野で知られているように、対立遺
伝子変種は、コードされるポリペプチドの機能を実質的
に変えない1以上のヌクレオチドの置換、欠失又は付加
を持ちうる代替型のポリヌクレオチド配列である。 【００３１】本発明は、上記成熟ポリペプチドのコーデ
ィング配列が宿主細胞によるポリペプチドの発現と分泌
を促進するポリヌクレオチド配列（例えばポリペプチド
の細胞からの輸送を制御するための分泌配列として機能
するリーダー配列）に同じ読み枠で融合しているポリヌ
クレオチドをも包含する。リーダー配列を持つポリペプ
チドはプレタンパク質であり、そのリーダー配列は宿主
によって切断されて、そのポリペプチドの成熟型を形成
しうる。本発明ポリヌクレオチドは、成熟タンパク質に
5'アミノ酸残基が追加されたプロタンパク質をコードし
てもよい。プロ配列を持つ成熟タンパク質はプロタンパ
ク質であり、そのタンパク質の不活性型である。そのプ
ロ配列が切断されると、活性な成熟タンパク質が残る。 【００３２】したがって、本発明のポリヌクレオチド
は、成熟タンパク質、プロ配列を持つタンパク質、又は
プロ配列とプレ配列（リーダー配列）の両方を持つタン
パク質をコードできる。 【００３３】本発明のポリヌクレオチドは、本発明ポリ
ペプチドの精製に利用されるマーカー配列にインフレー
ム（in frame）融合したコーディング配列を持ってもよ
い。細菌宿主の場合は、pQE-9ベクターによって供給さ
れるヘキサヒスチジン標識をマーカー配列にして、その
マーカーに融合した成熟ポリペプチドの精製に備えるこ
とができ、また、COS-7細胞のような哺乳類宿主を使用
する場合は、例えば血球凝集素（HA）標識をマーカー配
列にすることができる。HA標識は、インフルエンザ血球
凝集素タンパク質由来のエピトープに対応する（Wilso
n, I.ら, Cell,37:767（1984））。 【００３４】「遺伝子」という用語は、ポリペプチド鎖
の生産に関与するDNAの区分を意味し、コーディング配
列の前後の領域（リーダー及びトレーラー）と、個々の
コーディング部分（エクソン）間の介在配列（イントロ
ン）とを含む。 【００３５】完全長TGFα-HII遺伝子の断片をcDNAライ
ブラリー用のハイブリッド形成プローブとして用いるこ
とにより、その完全長遺伝子そのものや、その遺伝子に
対する高い配列類似性又は類似の生物学的活性を持つ他
の遺伝子を単離することができる。このタイプのプロー
ブは、少なくとも30塩基からなることが好ましく、50塩
基以上を含んでもよい。また、このプローブは、完全長
転写物に相当するcDNAクローン、ゲノムクローン、若し
くは調節及びプロモーター領域、エクソン並びにイント
ロンを含む完全なTGFα-HII遺伝子を含有するクローン
を同定するためにも使用できる。スクリーニングの一例
では、オリゴヌクレオチドプローブの合成に既知のDNA
配列を用いることによって、上記遺伝子のコーディング
領域を単離する。本発明遺伝子の配列に相補的な配列を
持つ標識オリゴヌクレオチドを用いて、ヒトのcDNA、ゲ
ノムDNA又はmRNAのライブラリーをスクリーニングし、
そのプローブがハイブリッド形成するライブラリーの構
成要素を決定する。 【００３６】さらに、本発明は、配列間に少なくとも70
%、好ましくは少なくとも90%、より好ましくは少なくと
も95%の同一性がある場合に上述の配列にハイブリッド
形成する、ポリヌクレオチドに関する。特に本発明は、
厳密な条件下で上述のポリヌクレオチドにハイブリッド
形成するポリヌクレオチドに関する。本明細書で使用す
る「厳密な条件」という用語は、配列間に少なくとも95
%、好ましくは少なくとも97%の同一性がある場合にの
み、ハイブリッド形成が起こることを意味する。好まし
い態様として、上述のポリヌクレオチドにハイブリッド
形成するポリヌクレオチドは、図１〜図６のcDNA（配列
番号1）又は上記寄託cDNAによってコードされる成熟ポ
リペプチドと実質上同じ生物学的機能又は活性を保持す
るポリペプチドをコードする。 【００３７】また、上記ポリヌクレオチドは、上述のよ
うに、本発明のポリヌクレオチドにハイブリッド形成
し、かつ、該ポリヌクレオチドに対して同一性を持つ
（活性は保持しても、保持しなくてもよい）、少なくと
も20塩基、好ましくは30塩基、より好ましくは少なくと
も50塩基を含んでもよい。このようなポリヌクレオチド
は、例えば、配列番号1のポリヌクレオチドに関する
（例えば回収用）プローブや、PCRプライマーとして使
用できる。 【００３８】したがって、本発明は、配列番号2のポリ
ペプチドをコードするポリヌクレオチドに対して少なく
とも70%の同一性、好ましくは少なくとも90%の同一性、
より好ましくは少なくとも95%の同一性を持つポリヌク
レオチド、及び少なくとも30塩基、好ましくは少なくと
も50塩基からなるその断片、並びにそのようなポリヌク
レオチドによってコードされるポリペプチドに関する。 【００３９】本明細書で言及する寄託物は、特許手続上
の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約に
基づいて維持される。これらの寄託物は当業者の利便の
ために提供されるに過ぎず、これが35U.S.C§112で求め
られる寄託であると認めるわけではない。寄託物に含ま
れるポリヌクレオチドの配列とそれによってコードされ
るポリペプチドのアミノ酸配列は、参考として本明細書
の一部を構成し、万一、本明細書に記載する配列の説明
と矛盾する場合は、これが支配的となる。上記寄託物を
製造、使用又は販売するには承諾が必要な場合があり、
本明細書はそのような承諾を与えるものではない。 【００４０】さらに本発明は、図１〜図６の推定アミノ
酸配列（配列番号2）を持つポリペプチド又は上記寄託c
DNAによってコードされるアミノ酸配列を持つポリペプ
チド、及びそのようなポリペプチドの断片、類縁体及び
誘導体に関する。 【００４１】図１〜図６のポリペプチド（配列番号2）
又は上記寄託cDNAによってコードされるポリペプチドに
関して「断片」、「誘導体」及び「類縁体」という場
合、これらの用語は、そのようなポリペプチドと実質上
同じ生物学的機能又は活性を保持するポリペプチドを意
味する。したがって類縁体には、プロタンパク質部分の
切断によって活性化されて活性な成熟ポリペプチドを生
成しうるプロタンパク質が含まれる。 本発明のポリペ
プチドは、組換えポリペプチド、天然のポリペプチド及
び合成ポリペプチドのいずれであってもよく、組換えポ
リペプチドが好ましい。 【００４２】図１〜図６のポリペプチド（配列番号2）
又は上記寄託cDNAによってコードされるポリペプチドの
断片、誘導体又は類縁体は、（i）1以上のアミノ酸残基
が保存的又は非保存的アミノ酸残基（好ましくは保存的
アミノ酸残基）で置換されているもの（その置換アミノ
酸残基は遺伝コードによってコードされるものであって
もよいし、そうでなくてもよい）であってもよいし、
（ii）1以上のアミノ酸残基が置換基を含有するもので
あってもよく、或いは（iii）成熟ポリペプチドがもう1
つの化合物（例えばそのポリペプチドの半減期を増大さ
せるための化合物（ポリエチレングリコールなど））に
融合しているものや、（iv）リーダー又は分泌配列や、
成熟ポリペプチド又はプロタンパク質配列の精製に使用
される配列などといった付加的アミノ酸が成熟ポリペプ
チドに融合しているものであってもよい。そのような断
片、誘導体及び類縁体は、本明細書の教示から、当業者
の範囲に含まれると考えられる。 【００４３】本発明のポリペプチド及びポリヌクレオチ
ドは、単離型で提供されることが好ましく、また、均一
に精製されることが好ましい。 【００４４】「単離された」という用語は、その物質が
その当初の環境（例えばそれが天然物ならばその自然環
境）から取り出されていることを意味する。例えば、生
きた動物中に存在する天然のポリヌクレオチド又はポリ
ペプチドは「単離された」とは言えないが、その天然系
中に共在する物質の一部又は全部から分離されたそのポ
リヌクレオチド又はポリペプチドは「単離された」と言
える。そのようなポリヌクレオチドがベクターの一部で
あったり、かつ/または、そのようなポリヌクレオチド
又はポリペプチドが組成物の一部であっても、そのよう
なベクター又は組成物がその自然環境の一部でないとい
う点で、「単離された」と言える。 【００４５】本発明のポリペプチドは、配列番号2のポ
リペプチド（特にその成熟ポリペプチド）及び配列番号
2のポリペプチドに対して少なくとも70%の類似性（好ま
しくは70%の同一性）、より好ましくは配列番号2のポリ
ペプチドに対して少なくとも90%の類似性（より好まし
くは90%の同一性）、さらに好ましくは配列番号2のポリ
ペプチドに対して少なくとも95%の類似性（さらに好ま
しくは90%の同一性）を持つポリペプチドを包含し、ま
た、一般的には少なくとも30アミノ酸、より好ましくは
少なくとも50アミノ酸を含有する上記ポリぺプチドの一
部をも包含する。 【００４６】当該技術分野では知られているように、2
つのポリペプチド間の「類似性」は、一方のポリペプチ
ドのアミノ酸配列と保存的アミノ酸置換を、他方のポリ
ペプチドの配列と比較することによって決定される。本
発明ポリペプチドの断片又は一部を用いて、対応する完
全長ポリペプチドを、ペプチド合成によって生産するこ
とができる。つまり、これらの断片は、完全長ポリペプ
チドを生産するための中間体として使用できる。本発明
ポリヌクレオチドの断片又は一部は、本発明の完全長ポ
リヌクレオチドの合成に使用できる。 【００４７】本発明は、本発明のポリヌクレオチドを含
むベクター、本発明のベクターで遺伝子操作された宿主
細胞、及び組換え技術による本発明ポリペプチドの生産
にも関係する。 【００４８】宿主細胞は、本発明のベクター（例えばク
ローニングベクターであってもよいし、発現ベクターで
あってもよい）によって遺伝子操作（形質導入又は形質
転換若しくはトランスフェクション）される。ベクター
は、例えばプラスミド、ウイルス粒子、ファージなどの
形態をとりうる。操作された宿主細胞は、プロモーター
の活性化、形質転換体の選択若しくは本発明遺伝子の増
幅に適した改良が施された従来の栄養培地で培養でき
る。温度やpHなどといった培養条件は、発現用に選択し
たその宿主細胞に対して過去に用いられた条件であり、
当業者には明らかだろう。 【００４９】本発明のポリヌクレオチドは、組換え技術
によってポリペプチドを生産するために使用できる。し
たがって、例えば、そのポリヌクレオチドは、ポリペプ
チド発現用の種々の発現ベクターのいずれにも組込むこ
とができる。そのようなベクターとしては、染色体DNA
配列、非染色体DNA配列及び合成DNA配列、例えばSV40の
誘導体、細菌性プラスミド、ファージDNA、バクロウイ
ルス、酵母プラスミド、プラスミドとファージDNAの組
み合わせに由来するベクター、ウイルスDNA（例えばワ
クシニア、アデノウイルス、家禽ポックスウイルス、偽
性狂犬病ウイルス）などが挙げられる。ただし、その他
のベクターであっても、それがその宿主内で複製可能か
つ生存可能であるかぎり、使用できる。 【００５０】適当なDNA配列は、種々の手法によってベ
クターに挿入できる。一般的には、当該技術分野で知ら
れる手法で、適当な制限部位にDNA配列を挿入する。そ
のような手法その他は、当業者の範囲に含まれると考え
られる。 【００５１】発現ベクター中のDNA配列は、mRNA合成を
指令する適当な発現制御配列（プロモーター）に作動可
能に連結される。そのようなプロモーターの代表例とし
ては、LTR又はSV40プロモーター、大腸菌lac又はtrp、
ファージλPＬプロモーター、及び原核細胞、真核細胞
若しくはそれらのウイルス中の遺伝子の発現を制御する
ことが知られているその他のプロモーターを挙げること
ができる。発現ベクターは、翻訳開始用のリボソーム結
合部位と転写終結区（ターミネーター）をも含有する。
またベクターは、発現の増幅に適した配列を含んでもよ
い。 【００５２】さらに発現ベクターは、形質転換された宿
主細胞の選択に利用できる表現型特徴を与えるための1
以上の選択可能マーカー遺伝子（例えば真核細胞培養用
のネオマイシン耐性やジヒドロ葉酸レダクターゼ、大腸
菌におけるテトラサイクリン耐性やアンピシリン耐性な
ど）を含有することが好ましい。 【００５３】上述の適当なDNA配列と適当なプロモータ
ー又は制御配列とを含有するベクターを、適当な宿主の
形質転換に使用することによって、その宿主にそのタン
パク質を発現させることができる。 【００５４】適当な宿主の代表例としては、大腸菌、ス
トレプトミセス、ネズミチフス菌などの細菌細胞、酵母
などの真菌細胞、キイロショウジョウバエS2及びSpodop
teraSf9などの昆虫細胞、CHO、COS又はボーズ黒色腫な
どの動物細胞、アデノウイルス、植物細胞などを挙げる
ことができる。適当な宿主の選択は、本明細書の教示か
ら、当業者の範囲に含まれると考えられる。 【００５５】より具体的に述べると、本発明は、上に広
く記述した配列の1以上を含む組換え構築物をも包含す
る。これらの構築物は、本発明の配列が正方向又は逆方
向に挿入されているベクター（プラスミドやウイルスベ
クターなど）を含む。この態様の好ましい側面では、上
記構築物がさらに、上記配列に作動可能に連結した調節
配列（プロモーターなどを含む）をも含有する。好適な
ベクターとプロモーターは当業者に多数知られており、
市販されている。次に挙げるベクターはその例である。
細菌用：pQE70、pQE60、pQE-9（Qiagen）、pBS、pD10、
phagescript、psiX174、pbluescriptSK、pbsks、pNH8
A、pNH16a、pNH18A、pNH46A（Stratagene）、ptrc99a、
pKK223-3、pKK233-3、pDR540、pRIT5（Pharmacia）。真
核細胞用：pWLNEO、pSV2CAT、pOG44、pXT1、pSG（Strat
agene）、pSVK3、pBPV、pMSG、pSVL（Pharmacia）。た
だし、他のプラスミド又はベクターであっても、それが
その宿主内で複製可能かつ生存可能である限り、使用で
きる。 【００５６】プロモーター領域は、CAT（クロラムフェ
ニコールトランスフェラーゼ）ベクターや、選択可能マ
ーカーを持つ他のベクターを用いて、任意の所望の遺伝
子から選択できる。適当なベクターはPKK232-8とpCM7で
ある。特に有名な細菌プロモーターとしては、lacI、la
cZ、T3、T7、gpt、λPＲ、PＬ及びtrpが挙げられる。真
核プロモーターとしては、CMV即時型初期、HSVチミジン
キナーゼ、初期及び後期SV40、レトロウイルスのLTR、
マウスメタロチオネイン-Iが挙げられる。適当なベクタ
ーとプロモーターの選択は、当該技術分野の通常の技術
水準に十分含まれる。 【００５７】さらなる態様として、本発明は、上述の構
築物を含有する宿主細胞に関する。本発明の宿主細胞
は、哺乳類細胞のような高等真核細胞であってもよい
し、酵母細胞のような下等真核細胞であってもよく、ま
た、細菌細胞のような原核細胞であってもよい。宿主細
胞への上記構築物の導入は、リン酸カルシウムトランス
フェクション、DEAE-デキストラン媒介トランスフェク
ション、又はエレクトロポレーションによって達成でき
る（Davis, L., Dibner, M. Battey, I., Basic Method
s in Molecular Biology（1986））。 【００５８】宿主細胞中の構築物を従来のように使用す
ることによって、その組換え配列によってコードされる
遺伝子産物を生産することができる。別法として、本発
明のポリペプチドを従来のペプチド合成装置で合成する
こともできる。 【００５９】成熟タンパク質は、適当なプロモーターの
制御下に、哺乳類細胞、酵母、細菌その他の細胞中で発
現させることができる。本発明のDNA構築物から得られ
るRNAを用いて上記タンパク質を生産するには、無細胞
翻訳系も使用できる。原核宿主及び真核宿主での使用に
適したクローニングベクターと発現ベクターは、Sambro
okら, Molecular Cloning: A Laboratory Manual（第2
版,ニューヨーク州コールドスプリングハーバー（198
9））に記述されており、その開示は参考文献として本
明細書の一部を構成する。 【００６０】本発明のポリペプチドをコードするDNAの
高等真核生物による転写は、そのベクターにエンハンサ
ー配列を挿入することによって増大する。エンハンサー
はDNAのシス作用性要素であり、通常10〜300bpで、プロ
モーターに作用してその転写を増大させる。複製起点の
後期側100〜270bpにあるSV40エンハンサー、サイトメガ
ロウイルス初期プロモーターエンハンサー、複製起点の
後期側にあるポリオーマエンハンサー及びアデノウイル
スエンハンサーなどがその例である。 【００６１】一般的に、組換え発現ベクターは、複製起
点、その宿主細胞の形質転換を可能にする選択可能マー
カー（例えば大腸菌のアンピシリン耐性遺伝子やサッカ
ロミセス・セレビシェTRP1遺伝子）及び下流構造配列の
転写を指令する高発現遺伝子由来のプロモーターを含む
だろう。そのようなプロモーターは、なかんずく、3-ホ
スホグリセリン酸キナーゼ（PGK）のような解糖系酵
素、α-因子、酸性ホスファターゼ又は熱ショックタン
パク質をコードするオペロンから得ることができる。異
種構造配列は、翻訳開始配列と終止配列及び好ましくは
翻訳されたタンパク質の周辺腔又は細胞外培地への分泌
を指令することのできるリーダー配列に対して適当な位
相で、組み立てられる。任意に、その異種配列が、発現
した組換え産物の安定化や簡便な精製などといった所望
の特徴を付与するN-末端同定ペプチド（identification
peptide）を含む融合タンパク質をコードしてもよい。 【００６２】細菌の使用に有用な発現ベクターは、所望
のタンパク質をコードする構造ＤＮＡ配列を、適当な翻
訳開始シグナル及び翻訳終止シグナルと共に、機能的プ
ロモーターに対して作動可能な解読位相（reading phas
e）に挿入することによって、構築される。ベクター
は、そのベクターの維持を保証し、かつ、所望であれ
ば、その宿主内での増幅を提供するために、1以上の表
現型選択可能マーカーと複製起点とを含むだろう。形質
転換に好適な原核宿主としては、大腸菌、枯草菌、ネズ
ミチフス菌並びにシュードモナス属、ストレプトミセス
属及びスタフィロコッカス属に属する様々な種が挙げら
れる。ただし、他の宿主も選択肢として使用できる。 【００６３】細菌の使用に有用な発現ベクターの典型例
として、周知のクローニングベクターpBR322（ATCC3701
7）の遺伝要素を含む市販のプラスミドに由来する、選
択可能マーカーと細菌性複製起点とを含むものを挙げる
ことができる（ただしこれに限られるわけではない）。
そのような市販ベクターとしては、例えばpKK223-3（Ph
armacia Fine Chemicals,スウェーデン国ウプサラ）及
びGEM1（Promega Biotec.,米国ウィスコンシン州マディ
ソン）が挙げられる。これらのpBR322「骨格」部分を、
適当なプロモーター及び発現させようとする構造配列と
組み合わせる。 【００６４】適当な宿主株を形質転換し、その宿主株を
適当な細胞密度まで成長させた後、選択したプロモータ
ーを適当な手段（例えば温度変化や化学誘導）によって
誘導し、細胞をさらに培養する。 【００６５】典型的には、細胞を遠心分離によって収集
し、物理的又は化学的手段によって破壊し、得られた粗
抽出物をさらなる精製のために確保する。 【００６６】タンパク質の発現に使用する微生物細胞
は、凍結−融解サイクル、超音波処理、機械的破壊又は
細胞溶解剤の使用などといった任意の便利な方法で破壊
でき、そのような方法は当業者にはよく知られている。 【００６７】組換えタンパク質の発現には、種々の哺乳
類細胞培養系も使用できる。哺乳類発現系の例として
は、Gluzman, Cell, 23:175（1981）に記載のサル腎繊
維芽細胞のCOS-7系や、適合するベクターを発現させる
ことのできる他の細胞系（例えばC127、3T3、CHO、HeLa
及びBHK細胞系）が挙げられる。哺乳類発現ベクター
は、複製起点、適当なプロモーター及びエンハンサーを
含み、さらに必要なリボソーム結合部位、ポリアデニル
化部位、スプライス供与部位とスプライス受容部位、転
写終止配列及び5'隣接非転写配列をも含むだろう。必要
な非転写遺伝要素を提供するには、SV40のスプライス部
位とポリアデニル化部位に由来するDNA配列を使用でき
る。 【００６８】本発明ポリペプチドは、硫酸アンモニウム
又はエタノール沈殿、酸抽出、陰イオン又は陽イオン交
換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラ
フィー、疎水相互作用クロマトグラフィー、アフィニテ
ィークロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイトクロ
マトグラフィー及びレクチンクロマトグラフィーを含む
方法によって、組換え細胞培養から回収、精製できる。
必要とあれば、成熟タンパク質の配置の完成に、タンパ
ク質再生段階を使用できる。最後に、最終的な精製段階
として、高性能液体クロマトグラフィー（HPLC）を使用
できる。 【００６９】本発明のポリペプチドは、天然の精製産物
であってもよいし、化学合成法の生成物であってもよ
く、また組換え技術によって原核宿主又は真核宿主（例
えば培養された細菌細胞、酵母細胞、高等植物細胞、昆
虫細胞及び哺乳類細胞など）から生産されるものであっ
てもよい。組換え生産法に使用する宿主によって、本発
明のポリペプチドはグリコシル化されることもあるし、
グリコシル化されないこともある。本発明のポリペプチ
ドは、開始メチオニンアミノ酸残基を含んでもよい。 【００７０】本発明のポリヌクレオチドとポリペプチド
は、ヒト疾患の治療法又は診断法を発見するための研究
用試薬及び研究材料として使用できる。 【００７１】本発明のポリペプチドは、受容体の特徴づ
けに使用できる。現在、EGFファミリー受容体には、EGF
R1、EGFR2、EGFR3、EGFR4と呼ばれる4種類のEGF受容体
が含まれる。EGFR2受容体はERB-2とも呼ばれ、この分子
は様々な診断的又は治療的適応に有用である（Prignet,
S.A.及びLemoine, N.R.,Prog. Growth Factor Res.,4:
1-24（1992））。TGFα-HIIポリペプチドは、おそらく
これら受容体の1以上のリガンドであり、さらに同定さ
れる新しいEGF型受容体のリガンドでもあるだろう。TGF
α-HIIの使用は、そのような受容体の同定、特徴づけ及
びクローニングに役立ちうる。例えば、EGF受容体遺伝
子は、鳥類赤芽球症ウイルスのv-erb-B癌遺伝子の細胞
相同体である。EGF受容体の過剰発現や、そのタンパク
質のキナーゼ調節部分の欠失は、細胞の腫瘍形成性トラ
ンスフォーメーションを引き起こしうる（Manjusri, D.
ら, Human Cytokines, 364及び381（1991））。 【００７２】本発明のポリペプチドは、外傷やその他の
損傷性病状（例えばAIDS痴呆、老人性痴呆など）の結果
として減少した神経学的機能の回復又は増進にも使用で
きる。TGFαとその相同体は、脳のほとんどの部分で、E
GF/TGFα受容体に対する最も豊富なリガンドであること
がわかっている（Kaserら, Brain Res Mol Brain Res:1
6:316-322（1992））。EGFが小さく不連続な領域にしか
存在しないのに対して、TGFαは脳の様々な領域に広く
分布しているようである。このことは、TGFαが脳組織
において生理学的な役割を果たしているのかもしれない
ことを示唆している。脳内にTGFαに対する受容体部位
がこれほど数多く存在することは、TGFが正常な脳細胞
の分化と機能の促進に関して重要な効用を持つことを示
唆している。したがって、神経学的機能が減少している
場合は、本発明のポリペプチドを投与することによっ
て、脳を刺激し、適正な神経学的機能を高めることがで
きる。 【００７３】TGFα-HII又はその可溶型は、目の障害
（例えば角膜炎）の治療にも使用できる。様々な実験に
よって、このような病状にTGFα遺伝子ファミリーの構
成要素が関連付けられている。最近の報文に、これらの
増殖因子が目の疾患に果たす役割に関するデータのいく
つかが要約されている（Mannら, Cell 73:249-261（199
3））。最近の実験では、TGFα遺伝子を欠くいくつかの
マウスが、目の固有質に対する白血球その他の細胞の浸
潤による角膜炎を示すことがわかっている。 【００７４】さらに、TGFα増殖因子の標的細胞に対す
る特異性を、標的細胞を破壊するための仕組みとして活
用することもできる。例えば、TGFα-HII又はその可溶
型を毒性分子（例えば標的細胞を不活化する放射性医
薬）に（種々の方法で）カップリングすることができ
る。これらの増殖因子−毒素融合物は標的細胞を殺す
（場合によっては、種々の「傍観者（bystander）」作
用によって、隣接細胞をも殺す）。このような毒素融合
物遺伝子の最近の例は、Mesriら, J. Biol. Chem. 268:
4853-62（1993）に公表されている。TGFα-HIIとその関
連分子をリポソームに封入したり、腫瘍又は細胞特異的
抗原を認識、結合する抗体と共役させることによって、
細胞を「標的にする（targeting）」手段を与えること
もできる。 【００７５】同じ方法で、TGFα-HIIを抗新生物化合物
として使用することもできる。EGFファミリーの構成要
素はトランスフォームした細胞に対して抗増殖作用を示
すからである。生体内で使用する場合、本発明のポリプ
チドは、注射、注入、局所投与、非経口投与など（ただ
しこれらに限られない）、種々の方法で投与できる。投
与は、生理学的に許容できる任意の担体（リン酸緩衝食
塩水、食塩水、滅菌水など）を使用して行なうことがで
きる。 【００７６】TGFα-HIIポリペプチド断片も、ある種の
腎疾患の治療に使用できる。これらの増殖因子が腎臓で
発現することがわかっているからである。したがって、
これらの因子は、この器官の適正な生理学的維持に必要
なのだろう。 【００７７】TGFαとその相同体及び肝細胞増殖因子
は、部分的肝切除及び急性肝細胞壊死後の肝細胞再生を
引き起こすので（Masuhara, M.ら, Hepatology 16:1241
-1249（1992））、肝再生又は肝不全に関する処置も可
能である。 【００７８】TGFα-HIIを必要とする重要な処置は、創
傷治癒に関する処置である。本発明の組成物は、実質上
あらゆる皮膚創傷、角膜創傷及び上皮で裏打ちされた身
体の中空器官を含む、様々な創傷の処置に使用できる。
処置に適した創傷としては、火傷、擦傷、切り傷などの
外傷によるものと、外科的切開及び皮膚移植などの手術
によるものが挙げられる。本発明ポリペプチドによる処
置に適した他の状態としては、慢性潰瘍、糖尿病性潰瘍
などの慢性病や、非治癒（non-healing）（栄養）状態
が挙げられる。 【００７９】TGFα-HIIやその可溶性断片は、患部に適
用するための生理学的に許容できる担体に組込むことが
できる。担体の性質は、意図する適用部位によって大き
く異なる。皮膚への適用には、通常、クリーム基剤や軟
膏基剤が好ましい。好適な基剤としては、ラノリン、シ
ルバジン（Marion）（特に火傷の治療用）、アクアフォ
ア（Aquaphor; Duke Laboratories,コネチカット州サウ
スノーウォーク）などが挙げられる。所望であれば、TG
Fα-HII含有組成物を包帯その他の創傷用治療材料に組
込むことによって、創傷を本発明ペプチドに継続してさ
らすこともできる。エアロゾルの適用も用途があるだろ
う。 【００８０】治療組成物中のTGFα-HII濃度は決定的な
問題ではないが、上皮細胞増殖を誘導するに足る濃度で
なければならない。本発明組成物は、患部に局所的に
（一般的には点眼剤として目に、若しくはクリーム、軟
膏又はローションとして皮膚に）適用できる。目の場
合、頻繁な処置が好ましく、通常は、4時間未満の間隔
で適用する。皮膚には、1日に2〜4回若しくはそれ以上
頻繁に治療組成物を適用しながら、治癒中は継続して患
部に治療組成物を保持することが望ましい。 【００８１】本発明ポリペプチドの使用量は、投与法、
他の活性化合物の使用などによって変動するが、一般的
には、約1μg〜100μgの範囲である。本発明ポリペプチ
ドは、食塩水、リン酸緩衝食塩水などといった生理学的
に許容できる担体と共に使用できる。使用する化合物の
量は、試験管内での細胞の応答や本発明ポリペプチド又
は本発明ポリペプチドを含有する製剤に対する実験動物
の応答に基づいて、実験的に決定されるだろう。 【００８２】TGFα-HIIやその可溶性断片は、血管形
成、骨再吸収、免疫応答、シナプスエフェクター機能及
びニューロンエフェクター機能の調節に使用できる。TG
Fα-HIIは、アラキドン酸カスケードの調節にも使用で
きる。 【００８３】TGFα-HIIやその可溶性断片は、最終分化
に関する応用にも使用できる。多くのTGFα因子とそれ
らの相同体は、それらの標的細胞における最終分化を誘
導する。この性質は、その因子を投与し、標的細胞の死
を誘導することによって、生体内で活用できる。この方
法は、医学的に望ましくない細胞タイプ（癌など）の過
剰増殖に関係する障害や他の増殖性障害（例えば炎症、
乾癬など）について検討されている。生体内投与に加え
て、試験管内投与が正当な場合も種々ある。例えば、骨
髄の場合は、細胞を増殖因子及び/又はその誘導体で処
理することによって、骨髄から望ましくない細胞集団を
除去することができる。 【００８４】また、脱毛症、抜け毛、その他毛包の発育
に影響を与える皮膚状態に関する応用もある。TGFα増
殖因子がそのような状態に関与することは、数系統の証
拠が示唆している。上述のように、TGFα遺伝子にヌル
（無効）突然変異を含有するように操作された「ノック
アウト」マウスは、量的及び質的毛髪合成に関して異常
を示す。さらに、マウスにおけるマッピング研究によっ
て、毛髪の成長に影響を与えるいくつかの突然変異がTG
Fα遺伝子座にマッピングされることがわかっている（M
annら, Cell 73:249-261（1993））。いくつかの形態の
脱毛症と抜け毛の治療には、TGFα-HII又はその誘導体
の局所的又は全身的投与を使用することができ、これら
の主張は本発明の範囲に包含される。 【００８５】ある種の疾患病理は、TGFα-HII増殖因子
の全身的臨床投与によって、部分的又は完全に改善でき
る。この投与は、遺伝子療法（下記参照）の形態をとる
こともできるし、TGFα-HII DNAの組換え構築物又はペ
プチド化学合成によって合成されたペプチド又はタンパ
ク質の投与によって行なうこともできる（Wooら, Prote
in Engineering 3:29-37（1989））。 【００８６】本発明は、本発明のポリペプチドに対する
アゴニスト化合物又はアンタゴニスト化合物を同定する
ための化合物スクリーニング法を提供する。例えば、TG
Fα-HII受容体を発現させる哺乳類細胞又は膜調製物
を、候補化合物と共にインキュベートし、その受容体か
ら第2シグナルを発生させる（その化合物の）能力を測
定することによって、それが有効なアゴニストであるか
どうかを決定する。そのような第2伝達子（メッセンジ
ャー）系としては、cAMPグアニル酸環化酵素、イオンチ
ャンネル又はホスホイノシチド加水分解が挙げられる
が、これらに限られるわけではない。有効なアンタゴニ
ストは、上述の方法で、受容体に結合するが、第2メッ
センジャー応答を引き出さず、したがってその受容体を
TGFα-HIIから遮断するアンタゴニスト化合物を検出す
ることによって決定される。 【００８７】本発明ポリペプチドに対する受容体に特異
的な潜在的アンタゴニストを同定するためのもう1つの
検定法は、競争検定法である。この競争検定法では、本
発明ポリペプチドに対する受容体を過剰に発現する原形
質膜（例えばヒトA431癌細胞）を単離する。10nM
１２５I-TGFα-HIIを含有する培地で連続希釈した試験
試料（体積は約10μl）を、潜在的アンタゴニスト化合
物の存在下に、上記原形質膜5μgに加え、4℃で4時間イ
ンキュベートする。その反応混合物を希釈し、直ちにミ
リポアフィルターに通す。次にそのフィルターをすばや
く洗浄し、結合した放射活性をガンマカウンターで測定
する。次に、結合したTGFα-HIIの量を測定する。上記
化合物の不在下に対照検定をも行なって、そのアンタゴ
ニストが、結合したTGFα-HIIの量を減少させるかどう
かを決定する。 【００８８】潜在的アンタゴニスト化合物としては、そ
のポリペプチドに結合する抗体や（場合によっては）オ
リゴペプチドが挙げられる。また、密接に関係するタン
パク質であって、その受容体に結合するが、そのポリペ
プチドの不活性型であるので、本発明ポリペプチドの作
用を妨害するものも、潜在的アンタゴニストになりう
る。 【００８９】もう1つのアンタゴニスト化合物は、アン
チセンス技術を用いて作成されるアンチセンス構築物で
ある。アンチセンス技術は、アンチセンスDNA又はRNA若
しくは三重らせん形成による遺伝子発現の制御に使用で
き、これらの方法は共に、DNA又はRNAに対するポリヌク
レオチドの結合に基づく。例えば、本発明の成熟ポリペ
プチドをコードするポリヌクレオチド配列の5'コーディ
ング部分を用いて、約10〜40塩基対長のアンチセンスRN
Aオリゴヌクレオチドを設計する。DNAオリゴヌクレオチ
ドは、転写に関与する遺伝子の領域に相補的になるよう
に設計されるので（三重らせん−Leeら, Nucl. Acids.
Res., 6:3073（1979）；Cooneyら, Science, 241:456
（1988）；Dervanら, Science, 251:1360（1991）を参
照）、本発明ポリペプチドの転写と生産を妨害する。ア
ンチセンスRNAオリゴヌクレオチドは生体内でmRNAにハ
イブリッド形成し、そのmRNA分子の本発明ポリペプチド
への翻訳を遮断する（アンチセンス−Okano, J. Neuroc
hem., 56:560（1991）；Oligodeoxynucleotides as Ant
isense Inhibitors of Gene Expression, CRC Press,フ
ロリダ州ボカラトン（1988）を参照）。アンチセンスRN
A又はDNAが生体内で発現して、本発明ポリペプチドの生
産を阻害しうるように、上述のオリゴヌクレオチドを細
胞に送達することもできる。 【００９０】本発明ポリペプチドに結合し、受容体にお
けるその作用を遮断することによって、正常な生物学的
活性を妨害する小分子も、アンタゴニスト化合物であ
る。小分子が、本発明ポリペプチドに対する受容体を結
合してもよい。そのような小分子の例としては、小ペプ
チド又は小さいペプチド様分子が挙げられるが、これら
に限られるわけではない。 【００９１】上記アンタゴニストは、新生組織形成（例
えば癌や腫瘍）の治療に使用できる。腫瘍細胞によるEG
Fファミリー構成要素の分泌又は生産を阻害すると、腫
瘍が緩解することが知られている。 【００９２】本発明ポリペプチドに対するアンタゴニス
トは、ある種の皮膚障害（例えば乾癬）の処置にも治療
的に使用できる。乾癬障害などの疾患から採取した皮膚
生検におけるこの増殖因子ファミリーの構成要素の発現
レベルは、上昇していることがわかっている（Cookら,
Cancer Research, 52:3224-3227（1992））。上記アン
タゴニストは、後述のような医薬的に許容できる担体と
の組成物として使用できる。 【００９３】本発明ポリペプチド、アゴニスト化合物又
はアンタゴニスト化合物は、適当な医薬担体と組み合わ
せて使用できる。そのような組成物は、治療有効量の上
記ペプチド又は化合物と、医薬的に許容できる担体又は
賦形剤とを含有する。そのような担体としては、塩水、
緩衝塩水、デキストロース、水、グリセロール、エタノ
ール及びそれらの組み合わせが挙げられるが、これらに
限られるわけではない。製剤は投与法に適するものとす
る。 【００９４】本発明は、本発明医薬組成物の1以上の成
分で満たされた1以上の容器を含む医薬パック又はキッ
トをも提供する。そのような容器には、医薬品又は生物
学的製品の製造、使用又は販売を規制する政府機関によ
って規定された形式で、ヒト投与に関する製造、使用又
は販売の該機関による認可を反映する情報を付すことが
できる。さらに、本発明のポリペプチド又は化合物を他
の治療用化合物と共に使用してもよい。 【００９５】上記医薬組成物は、経口経路、局所経路、
静脈内経路、腹腔内経路、筋肉内経路、皮下経路、鼻孔
内経路又は皮内経路など、都合の良い方法で投与でき
る。上記医薬組成物は、特定の適応症の処置及び／又は
予防に有効な量で投与される。一般的には、少なくとも
約10μg/kg-体重の量で投与され、ほとんど場合は、約8
mg/kg-体重/日を超えない量で投与されるだろう。ほと
んどの場合、日用量は、投与経路、症状などを考慮し
て、約10μg/kg〜約1mg/kg-体重である。 【００９６】本発明のポリペプチドと、ポリペプチドで
あるアゴニスト及びアンタゴニストを、本発明に従って
使用する場合は、それを生体内における上記ポリペプチ
ドの発現によってすることもできる。これはしばしば
「遺伝子療法」と呼ばれる。 【００９７】したがって、例えば、患者から得た細胞
を、生体外で、ポリペプチドをコードするポリヌクレオ
チド（DNA又はRNA）で操作し、そのポリペプチドで処置
しようとする患者に、操作したその細胞を与えることが
できる。このような方法は当該技術分野では良く知られ
ており、本明細書の教示から明らかである。例えば、本
発明のポリペプチドをコードするRNAを含有するレトロ
ウイルスプラスミドベクターを使用して、細胞を操作す
ることができる。 【００９８】さらに、生体内でポリペプチドを発現させ
るために、例えば当該技術分野で知られる手法によっ
て、生体内で細胞を操作することもできる。例えば、本
発明ポリペプチドをコードするRNAを含有するレトロウ
イルスプラスミドベクターをパッケージング細胞に形質
導入すると、そのパッケージング細胞が目的の遺伝子を
含有する感染性ウイルス粒子を生産するようになる。生
体内で細胞を操作し、生体内で本発明のポリペプチドを
発現させるには、これらの生産細胞を患者に投与すれば
よい。そのような方法による本発明ポリペプチドの上記
その他の投与法は、本発明の教示から、当業者には明ら
かなはずである。 【００９９】上述のレトロウイルスプラスミドベクター
の供給源となりうるレトロウイルスとしては、モロニー
ネズミ白血病ウイルス、脾臓壊死ウイルスや、ラウス肉
腫ウイルス、ハーヴェー肉腫ウイルス、鳥類白血病ウイ
ルス、テナガザル白血病ウイルス、ヒト免疫不全症ウイ
ルス、アデノウイルス、脊髄増殖性肉腫ウイルス及び乳
癌ウイルスなどのレトロウイルスが挙げられるが、これ
らに限られるわけではない。一態様として、レトロウイ
ルスプラスミドベクターをモロニーネズミ白血病ウイル
スから得る。 【０１００】ベクターは1又はそれ以上のプロモーター
を含む。使用できる好適なプロモーターとしては、レト
ロウイルスLTR、SV40プロモーター、Millerら, Biotech
niques,第7巻,第9号, 980-990（1989）に記載のヒトサ
イトメガロウイルス（CMV）プロモーター、その他のプ
ロモーター（例えばヒストンプロモーター、pol IIIプ
ロモーター、β-アクチンプロモーター（ただしこれら
に限らない）のような真核細胞プロモーターなどの細胞
性プロモーター）が挙げられるが、これらに限られるわ
けではない。使用できるその他のウイルスプロモーター
としては、アデノウイルスプロモーター、チミジンキナ
ーゼ（TK）プロモーター及びB19パルボウイルスプロモ
ーターが挙げられるが、これらに限られるわけではな
い。適当なプロモーターの選択は、本明細書の教示か
ら、当業者には明らかだろう。 【０１０１】本発明のポリペプチドをコードする核酸配
列は、好適なプロモーターの制御下にある。使用できる
好適なプロモーターとしては、アデノウイルスプロモー
ター（アデノウイルス主要後期プロモーターなど）、異
種プロモーター（サイトメガロウイルス（CMV）プロモ
ーターなど）、呼吸器合胞体ウイルス（RSV）プロモー
ター、誘導性プロモーター（MMTプロモーターやメタロ
チオネインプロモーターなど）、熱ショックプロモータ
ー、アルブミンプロモーター、ApoAIプロモーター、ヒ
トグロビンプロモーター、ウイルスチミジンキナーゼプ
ロモーター（単純ヘルペスチミジンキナーゼプロモータ
ーなど）、レトロウイルスLTR（上述の修飾レトロウイ
ルスLTRを含む）、β-アクチンプロモーター、ヒト成長
ホルモンプロモーターが挙げられるが、これらに限るわ
けではない。プロモーターは、本発明ポリペプチドをコ
ードする遺伝子を制御する天然のプロモーターであって
もよい。 【０１０２】上記レトロウイルスプラスミドベクターで
パッケージング細胞を形質導入することによって、生産
細胞系を作成する。トランスフェクションできるパッケ
ージング細胞の例としては、Miller, Human Gene Thera
py,第1巻, 5-14（1990）（この刊行物の全内容は参考文
献として本明細書の一部を構成する）に記載のDAN、PE5
01、PA317、ψ-2、ψ-AM、PA12、T19-14X、VT-19-17-H
2、ψCRE、ψCRIP、GP+E-86及びGP+envAm12細胞系が挙
げられるが、これらに限るわけではない。ベクターは、
当該技術分野で知られる任意の手段で、パッケージング
細胞に導入される。そのような手段としては、エレクト
ロポレーション、リポソームの使用及びリン酸カルシウ
ム沈降法が挙げられるが、これらに限るわけではない。
もう1つの方法として、レトロウイルスプラスミドベク
ターをリポソームに封入するか、脂質にカップリングし
た後、宿主に投与してもよい。 【０１０３】上記生産細胞系は、本発明ポリペプチドを
コードする核酸配列を含む感染性レトロウイルスベクタ
ー粒子を生成する。このようなレトロウイルスベクター
粒子は、試験管内又は生体内で、真核細胞の形質導入に
使用できる。形質導入された真核細胞は、本発明ポリペ
プチドをコードする核酸配列を発現させるだろう。形質
導入できる真核細胞としては、胚幹細胞、胚癌細胞、造
血幹細胞、肝細胞、繊維芽細胞、筋芽細胞、ケラチン生
成細胞、内皮細胞及び気管支上皮細胞が挙げられるが、
これらに限られるわけではない。 【０１０４】本発明は、診断薬としての本発明遺伝子の
使用にも関係する。本発明遺伝子の突然変異型の検出
は、本発明ポリペプチドの過少発現がもたらす疾患（例
えば不適当な創傷治癒、不適当な神経学的機能、目の障
害、腎障害、肝障害、毛包発育、血管形成、胚形成な
ど）又はその疾患に対する罹病性の診断を可能にする。 【０１０５】本発明のヒト遺伝子に突然変異を持つ個体
は、種々の技術によってDNAレベルで検出できる。診断
用の核酸は、血液、尿、唾液、組織生検及び検死体など
といった患者の細胞から得ることができる。ゲノムDNA
は、検出に直接使用してもよいし、分析に先立って、PC
Rを用いて酵素的に増幅してもよい（Saikiら, Nautre,
324:163-166（1986））。RNAやcDNAも同じ目的に使用で
きる。例えば、本発明ポリペプチドをコードする核酸に
相補的なPCRプライマーを使用して、その突然変異を同
定及び分析することができる。例えば、欠失や挿入は、
増幅産物のサイズが正常な遺伝子型とは異なることによ
って検出できる。点変異は、放射線で標識したRNA配列
若しくは放射線で標識したアンチセンスDNA配列に、増
幅したDNAをハイブリッド形成させることによって同定
できる。完全に一致する配列は、RNaseA消化若しくは融
解温度の相違によって、ミスマッチを持つ二本鎖分子と
識別することができる。 【０１０６】参照遺伝子と突然変異を持つ遺伝子の間の
配列の相違は、直接DNA配列決定法によって明らかにで
きる。さらに、クローン化したDNA部分をプローブとし
て使用することにより、特定のDNA部分を検出すること
もできる。この方法の感度は、PCRと組み合わせると、
著しく増大する。例えば、配列決定プライマーを、改良
PCRによって生成した二本鎖PCR産物又は一本鎖鋳型分子
と共に使用する。配列決定は、放射線標識ヌクレオチド
を用いる従来の手法か、蛍光標識を用いる自動配列決定
法によって行なう。 【０１０７】DNA配列の相違に基づく遺伝子試験は、変
性剤を含む（若しくは含まない）ゲルにおけるDNA断片
の電位泳動移動度の変化を検出することによって、達成
できる。小さい配列の欠失と挿入は、高分解能ゲル電気
泳動によって可視化できる。配列が異なるDNA断片は、
変性ホルムアミド勾配ゲルで識別できる。この場合、異
なるDNA断片の移動度は、それぞれの融解温度又は部分
的融解温度に従って、ゲル中の異なる位置で遅延する
（例えばMyersら, Science, 230:1242（1985）を参照の
こと）。 【０１０８】特定の位置における配列の変化は、化学的
切断法や、RNase及びS1保護などのヌクレアーゼ保護検
定法でも明らかにできる（例えばCottonら, PNAS, USA,
85:4397-4401（1985）を参照）。 【０１０９】したがって、特定のDNA配列の検出は、ハ
イブリッド形成、RNase保護、化学的切断、直接DNA配列
決定などの方法、若しくは制限酵素の使用（例えば制限
断片長多形（Restriction Fragment Length Polymorphi
sms；RFLP））及びゲノムDNAのサザンブロッティングに
よって達成できる。より従来的なゲル電気泳動とDNA配
列決定に加えて、インシチュー分析でも突然変異を検出
することができる。 【０１１０】また、本発明は、種々の組織における本発
明ポリペプチドのレベルの変化を検出する診断的検定法
に関する。正常な対照組織試料に比べて本発明タンパク
質の発現が過剰であることは、新生組織形成、皮膚障
害、目の障害及び炎症などといったある種の疾患状態の
存在を示しうるからである。宿主から得た試料中の本発
明ポリペプチドのレベルを検出するのに使用する検定法
は、当業者には良く知られており、ラジオイムノアッセ
イ、競争結合検定、ウェスタンブロット分析、そして好
ましくはELISA検定が挙げられる。ELISA検定法では、先
ず、本発明ポリペプチドの抗原に特異的な抗体（好まし
くはモノクローナル抗体）を調製する。さらに、そのモ
ノクローナル抗体に対するリポーター抗体を調製する。
リポーター抗体には、放射活性や蛍光などの検出可能な
試薬（この例では西洋ワサビペルオキシダーゼ酵素）を
結合する。次に、宿主から試料を取り出し、その試料中
のタンパク質を結合する固体支持体（例えばポリスチレ
ン皿）上でインキュベートする。次に、非特異的タンパ
ク質（ウシ血清アルブミンなど）と共にインキュベート
することによって、皿上の遊離のタンパク質結合部位を
すべて覆う。次に、上記モノクローナル抗体をその皿中
でインキュベートする。この間に、モノクローナル抗体
は、ポリスチレン皿に結合した本発明ポリペプチドのす
べてに結合する。未結合のモノクローナル抗体を緩衝液
で洗い流す。次に、西洋ワサビペルオキシダーゼに結合
したリポーター抗体をその皿に入れ、本発明ポリペプチ
ドに結合したモノクローナル抗体にレポーター抗体を結
合させる。次に、未結合のリポーター抗体を洗い流す。
次に、ペルオキシダーゼ基質をその皿に加える。与えら
れた期間中に発色する色の量を標準曲線と比較すれば、
与えられた体積の患者試料中に存在するタンパク質量の
測定値が得られる。 【０１１１】競争検定法を用いて、宿主から得た試料中
の本発明ポリペプチドのレベルを決定することもでき
る。この検定法では、本発明ポリペプチドに対する受容
体を過剰発現させる原形質膜を単離する。次に、標識さ
れた本発明ポリペプチドを含有する試験試料をその原形
質膜に加え、規定の時間インキュベートする。その反応
混合物には、本発明ポリペプチドを含有すると思われる
宿主から得た試料も加える。次に、その反応混合物をフ
ィルターに通し、そのフィルターをすばやく洗浄した
後、結合した放射活性を測定することによって、受容体
に関する競争量（したがってその試料中の本発明ポリペ
プチドの量）を決定する。 【０１１２】TGFα-HIIに対する抗体は、癌の診断と治
療に使用できる。癌細胞の多くは、新生組織形成又は過
形成の過程で、種々のTGFαファミリー構成要素を上方
調節するからである。これらの抗体はTGFα-HIIに結合
して、それを不活化する。TGFα-HII（及び/又はそのフ
ァミリー構成要素）に対するモノクローナル抗体は、あ
る種の障害（例えば過形成及び新生組織形成増殖異常な
ど（ただしこれに限られない））の診断と治療に、臨床
的に用いられる。新生物組織による増殖因子発現の上方
調節は、患者の血液中の増殖因子の増大を検出する種々
の血清検定法の基礎をなす。これらの検定法は、通常、
診断的に応用されるばかりでなく、予後（手術や化学療
法などに続いて、ごく微量な腫瘍細胞の存在を検出する
ため）にも応用される。 【０１１３】また、TGFα-HII受容体を発現させる悪性
細胞は、標識したTGFα-HIIを受容体結合検定法で用い
るか、若しくはTGFα-HII受容体自体に対する抗体を使
用することによって検出できる。細胞はTGFα-HIIに対
する受容体の存在と密度によって識別できるので、これ
は、TGFα-HIIの生物学的活性に対するそのような細胞
の感受性を予測する手段となる。 【０１１４】本発明の配列は、染色体同定にも有効であ
る。本発明の配列は、個々のヒト染色体上の特定の位置
に特異的に誘導され、それにハイブリッド形成できる。
また、染色体上の特定の部位を同定することは、現在必
要とされていることでもある。現在のところ、染色体位
置の標識に利用できる、実際の配列データ（反復多形
（repeat polymorphisms））に基づく染色体標識試薬は
ほとんどない。本発明による染色体に対するDNAのマッ
ピングは、それらの配列を疾患に関係する遺伝子と相関
させる重要な第1段階である。 【０１１５】簡単に述べると、配列は、そのcDNAからPC
Rプライマー（15〜25bpが好ましい）を調製することに
よって、染色体に対してマッピングできる。ゲノムDNA
中の2エクソン以上にまたがることによって増幅過程を
複雑にすることのないプライマーをすばやく選択するに
は、3'非翻訳領域のコンピューター分析を用いる。次
に、個々のヒト染色体を含有する体細胞ハイブリッドの
PCRスクリーニングに、これらのプライマーを用いる。
そのプライマーに対応するヒト遺伝子を含有するハイブ
リッドのみが、増幅断片を生成するだろう。 【０１１６】体細胞ハイブリッドのPCRマッピングは、
特定のDNAを特定の染色体に割り当てる迅速な方法であ
る。同じオリゴヌクレオチドプライマーで本発明を用い
ると、同様の方法で、特定の染色体に由来する断片のパ
ネル若しくは大きいゲノムクローンのプールで、サブマ
ッピング（sublocalization）を達成できる。染色体に
対するマッピングに同様に使用できる他のマッピング法
としては、インシチューハイブリッド形成、染色体特異
的cDNAライブラリーを構築するためのハイブリッド形成
による予備選択及び標識フロー選別（labeled flow-sor
ted）染色体による予備スクリーニングが挙げられる。 【０１１７】中期染色体に対するcDNAクローンの蛍光イ
ンシチューハイブリッド形成（FISH）を用いると、1段
階で正確な染色体位置を得ることができる。この技術は
50又は60塩基程度のcDNAでも使用できる。この技術の総
説としては、Vermaら, HumanChromosomes: a Manual of
Basic Techniques, Pergamon Press,ニューヨーク（19
88）を参照のこと。 【０１１８】配列を正確な染色体位置にマッピングした
ら、その配列の染色体上の物理的位置を遺伝子マップデ
ータと相関させることができる。そのようなデータは、
例えばV. McKusick, Mendelian Inheritance in Man
（ジョーンズホプキンス大学ウェルチ医学図書館からオ
ンラインで入手できる）に認められる。次に、同じ染色
体領域にマッピングされた疾患と遺伝子の関係を連鎖分
析（linkage analysis）（物理的に隣接する遺伝子の同
時遺伝）によって同定する。 【０１１９】次に、患者と非患者の間で、そのcDNA又は
ゲノム配列の相違を決定する必要がある。ある突然変異
がその患者の一部又は全部に観測され、正常な個体には
観測されない場合、その突然変異はその疾患の原因因子
であるかもしれない。 【０１２０】物理的マッピング技術と遺伝子マッピング
技術の現在の解像度では、その疾患に関係する染色体領
域に正確にその位置が特定されるcDNAは、50〜500個の
潜在的原因因子のうちの一つであろう（1メガ塩基マッ
ピング解像度と20kbにつき1遺伝子と仮定）。 【０１２１】本発明ポリペプチド、その断片その他の誘
導体、その類縁体、若しくはそれらを発現させる細胞
は、それらに対する抗体を生産するための免疫原として
使用できる。これらの抗体は、例えばポリクローナル抗
体やモノクローナル抗体でありうる。本発明は、キメラ
抗体、一本鎖抗体、擬人化抗体及びFab断片又はFab発現
ライブラリーの産物をも包含する。このような抗体及び
断片の生産法は、当該技術分野で種々知られている。 【０１２２】本発明の配列に対応するポリペプチドに対
して生じる抗体は、動物（好ましくはヒト以外の動物）
にそのポリペプチドを直接注射するか、投与することに
よって得ることができる。そのようにして得た抗体は、
そのポリペプチド自体に結合するだろう。この方法で
は、そのペプチドの断片のみをコードする配列を使用し
て、その全天然ポリペプチドを結合する抗体を生成させ
ることもできる。そのような抗体は、そのポリペプチド
を発現させる組織からそのポリペプチドを単離するため
に使用できる。 【０１２３】モノクローナル抗体の製造には、連続的継
代細胞系培養によって生産される抗体を与える任意の技
術を使用できる。その例としては、ハイブリドーマ技術
（Kohler及びMilstein, 1975, Nature, 256:495-49
7）、トリオーマ（trioma）技術、ヒトB細胞ハイブリド
ーマ技術（Kozborら, 1983, Immunology Today 4:72）
及びヒトモノクローナル抗体を生産するためのEBVハイ
ブリドーマ技術（Coleら, 1985, Monoclonal Antibodie
s and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., 77-96
頁）が挙げられる。 【０１２４】一本鎖抗体の生産について記述した技術
（米国特許4,946,778）は、本発明の免疫原性ポリペプ
チド産物に対する一本鎖抗体の生産に適合させることが
できる。また、形質転換マウスを用いて、本発明の免疫
原性ポリペプチド産物に対する擬人化抗体を発現させる
こともできる。 【０１２５】以下の実施例を参照して、本発明をさらに
説明する。ただし、本発明はこれらの実施例に限定され
ないと理解すべきである。特に指定しない限り、割合や
量はすべて重量に基づく。 【０１２６】以下の実施例の理解を容易にするため、頻
繁に使用する方法及び/又は用語をいくつか説明してお
く。 【０１２７】「プラスミド」は、小文字pとその前後の
大文字及び/又は数字で指定する。本明細書における出
発プラスミドは市販されているか、公に無制限に入手で
きるか、若しくは入手できるプラスミドから公表された
方法に従って構築できる。さらに、当該技術分野では、
本明細書に記述するプラスミドと等価なプラスミドが知
られており、それらは当業者には明らかだろう。 【０１２８】DNAの「消化」とは、そのDNA中の特定の配
列でのみ作用する制限酵素によるDNAの触媒的切断を意
味する。本明細書で使用する種々の制限酵素は市販され
ており、それらの反応条件、補因子その他の必要条件
は、当業者に知られているであろうものを使用した。分
析には、通常、1μgのプラスミド又はDNA断片を約2単位
の酵素と共に約20μlの緩衝溶液中で使用する。プラス
ミド構築用のDNA断片を単離する場合は、通常、より大
きい体積中で、5〜50μgのDNAを20〜250単位の酵素で消
化した。特定の制限酵素に適した緩衝液と基質の量は、
製造者によって指定される。通常は37℃で約1時間のイ
ンキュベーション時間を使用するが、これは供給者の指
示に従って変えることができる。消化後、その反応液を
ポリアクリルアミドゲルで直接電気泳動して、所望の断
片を単離する。 【０１２９】切断した断片のサイズ分離は、Goeddel,
D.ら, Nucleic Acids Res., 8:4057（1980）に記載の8%
ポリアクリルアミドゲルを用いて行なう。 【０１３０】「オリゴヌクレオチド」とは、化学的に合
成できる一本鎖ポリデオキシヌクレオチド又は2本の相
補的ポリデオキシヌクレオチド鎖を意味する。そのよう
な合成オリゴヌクレオチドは5'リン酸基を持たないの
で、キナーゼの存在下にATPでリン酸基を付加しない
と、もう1つのオリゴヌクレオチドには連結しないだろ
う。合成オリゴヌクレオチドは、脱リン酸化されていな
い断片に連結するだろう。 【０１３１】「連結」とは、2本の二本鎖核酸断片間の
リン酸ジエステル結合の形成過程をいう（Maniatis, T.
ら,同上,146頁）。特に規定しない限り、連結は、既知
の緩衝液と条件を用いて、連結すべきほぼ等モル量のDN
A断片0.5μgにつき10単位のT4 DNAリガーゼ（「リガー
ゼ」）で、達成することができる。特に明言しない限
り、形質転換はGraham, F.及びVan der Eb, A., Virolo
gy,52:456-457（1973）の方法で行なった。 【０１３２】実施例1：可溶型TGFα-HIIの細菌発現と精
製 TGFα-HIIをコードするDNA配列（ATCC番号97160）を、
まず、プロセシングされたTGFα-HIIタンパク質（シグ
ナルペプチド配列を欠く）の5'配列に対応するPCRオリ
ゴヌクレオチドプライマーと、TGFα-HII遺伝子の3'側
にあるベクター配列に対応するPCRオリゴヌクレオチド
プライマーとを用いて増幅した。TGFα-HIIに対応する
追加のヌクレオチドを、その5'配列と3'配列のそれぞれ
に付加した。5'オリゴヌクレオチドプライマーは、 【数１】 という配列を持ち、BamHI制限酵素部位（太字部分）
と、それに続く、プロセシングされたタンパク質コドン
の推定末端アミノ酸から始まるTGFα-HIIコーディング
配列の21ヌクレオチドとを含有する。3'配列（5'GGGAAG
CTTTTAATACTGAAATCGTACAGGAC3'；配列番号4）は、HindI
II部位に相補的な配列を含有し、それに、TGFα-HIIの2
3ヌクレオチドが続いている。これらの制限酵素部位
は、細菌発現ベクターpQE-9（Quiagen, Inc.,カリフォ
ルニア州91311チャッツワース）上の制限酵素部位に対
応する。pQE-9は抗生物質耐性（Ampｒ）、細菌性複製起
点（ori）、IPTGで制御できるプロモーターオペレータ
ー（P/O）、リボソーム結合部位（RBS）、6-His標識及
び制限酵素部位をコードする。pQE-9をBamHIとHindIII
で消化した。増幅した配列をpQE-9中に連結し、ヒスチ
ジン標識及びRBSと枠を合わせて挿入した。次に、その
連結混合物を用いて、Sambrook, J.ら, Molecular Clon
ing: A Laboratory Manual, Cold Harbor Laboratory P
ress（1989）に記載の手法で、大腸菌M15/rep4株（Qiag
en, Inc.）を形質転換した。M15/rep4は、lacI抑制因子
を発現し、かつ、カナマイシン耐性（Kanｒ）を付与す
るプラスミドpREP4の複数コピーを含有する。LBプレー
ト上で成長するそれらの能力によって形質転換体を同定
し、アンピシリン/カナマイシン耐性コロニーを選択し
た。プラスミドDNAを単離し、制限分析によってそれを
確認した。所望の構築物を含有するクローンを、Amp（1
00μg/ml）とKan（25μg/ml）の両方を補足したLB液体
培地で、終夜（O/N）培養した。そのO/N培養物を、1:10
0〜1:250の比率で、大きい培養に接種した。光学密度60
0（O.D.６００）が0.4〜0.6になるまで細胞を生育し
た。次に、IPTG（「イソプロピル-(-D-チオガラクトピ
ラノシド」）を最終濃度1mMで加えた。IPTGは、lacI抑
制因子を不活化することによって、P/Oをきれいにし、
遺伝子発現の増大を誘導する。細胞をさらに3〜4時間生
育した。次に、遠心分離によって細胞を収集した。細胞
ペレットをカオトロピック剤6M塩酸グアニジン中で可溶
化した。清浄化の後、この溶液から、6-His標識を含有
するタンパク質による強固な結合が可能な条件下に、ニ
ッケル-キレートカラムでのクロマトグラフィーによっ
て、可溶化したTGFα-HIIを精製した（Hochuli, E.ら,
J. Chromatography 411:177-184（1984））。TGFα-HII
（純度85%）を6M塩酸グアニジンpH5.0でカラムから溶出
させ、再生のために、3M塩酸グアニジン、100mMリン酸
ナトリウム、10mMグルタチオン（還元型）及び2mMグル
タチオン（酸化型）に調節した。この溶液を12時間イン
キュベートした後、タンパク質を10mMリン酸ナトリウム
に対して透析した。 【０１３３】実施例2：バクロウイルス発現系によるTGF
α-HIIのクローニングと発現 完全長TGFα-HIIタンパク質をコードするDNA配列（ATCC
番号97160）を、その遺伝子の5'及び3'配列に対応するP
CRオリゴヌクレオチドプライマーを用いて増幅した。三
組のプライマーを使用した。第1のプライマー対は、 【数２】 と、5'GCGTCTAGACTAGTATAGAACACTGTAGTCC3'（配列番号
6）である。この構築物は、配列番号1のヌクレオチド32
1に始まってヌクレオチド1248で終わり、推定リーダー
配列を含む。第2のプライマー対は、 【数３】 と、5'GCGTCTAGACTAGTATAGAACACTGTAGTCC3'（配列番号
8）である。この構築物は、配列番号1のヌクレオチド40
2に始まってヌクレオチド1248で終わり、推定リーダー
配列を含まない。第3のプライマー対は、 【数４】 と、5'GCGTCTAGACTAGTATAGAACACTGTAGTCC3'（配列番号1
0）である。この構築物は、配列番号1のヌクレオチド11
00に始まってヌクレオチド1248で終わり、本発明ポリペ
プチドの推定可溶性部分である。上記3種類の5'プライ
マーはすべて、BamHI制限酵素部位（太字部分）を持
ち、その部分に、真核細胞における翻訳開始の効率のよ
いシグナルに似たヌクレオチド（Kozak, M., J.Mol. Bi
ol., 196:947-950（1987））が続いている（翻訳開始コ
ドン「ATG」には下線を引いた）。第3のプライマー対に
ついては、バクロウイルスシグナルペプチド配列をpA2G
Pベクターに組込んだ。 【０１３４】上記3'プライマーは、制限エンドヌクレア
ーゼXbaIの切断部位を含有し、TGFα-HII遺伝子の3'TGF
αドメインに相補的なヌクレオチドを持つ。増幅された
配列を、市販のキット（「Geneclean」, BIO 101 Inc.,
カリフォルニア州ラジョラ）を用いて、1%アガロースゲ
ルから単離した。次に、その断片をエンドヌクレアーゼ
BamHIとXbaIで消化した後、1%アガロースゲルで再び精
製した。この断片をF2と命名した。 【０１３５】第1及び第2のプライマー対にはベクターpA
2を使用し、第3のプライマー対にはpA2GPベクターを使
用した。バクロウイルス発現系（総説としてはSummers,
M.D.及びSmith, G.E., 1987, A manual of methods fo
r baculovirus vectors and insect cell culture proc
edures, Texas Agricultural Experimental Station Bu
lletin No. 1555を参照のこと）によるTFGα-HIIタンパ
ク質の発現には、pA2ベクター（pVL941ベクターを改良
したもの、後述）を使用した。この発現ベクターは、Au
tographa californica核多角体病ウイルス（AcMNPV）の
強力なポリヘドリン（polyhedrin）プロモーターと、そ
れに続く制限エンドヌクレアーゼ認識部位とを含有す
る。効率のよいポリアデニル化のために、シミアンウイ
ルス（SV）40のポリアデニル化部位を使用した。組換え
ウイルスを簡単に選択するため、大腸菌由来の(-ガラク
トシダーゼ遺伝子を、ポリヘドリン遺伝子のポリアデニ
ル化シグナルに先行するポリヘドリンプロモーターと同
じ方向に挿入した。ポリヘドリン配列の両端には、同時
にトランスフェクションされる野生型ウイルスDNAの細
胞媒介相同組換え用のウイルス配列を隣接させた。pRG1
の代わりに、pAc373、pVL941及びpAcIM1（Luckow, V.A.
及びSummers, M.D., Virology, 170:31-39）などといっ
た他の多くのバクロウイルスベクターも使用できる。 【０１３６】上記プラスミドを制限酵素BamHIとXbaIで
消化した後、ウシ腸ホスファターゼを用いて、当該技術
分野で知られる手法で、脱リン酸化した。次に、市販の
キット（「Geneclean」, BIO 101 Inc.,カリフォルニア
州ラジョラ）を用いて、そのDNAを1%アガロースゲルか
ら単離した。このベクターをV2と命名した。 【０１３７】断片F2と脱リン酸化プラスミドV2をT4 DNA
リガーゼで連結した。次に、大腸菌HB101細胞を形質転
換し、TGFα-HII遺伝子を持つプラスミド（pBacTGFα-H
II）を含有する細菌を、制限酵素BamHIとXbaIを用いて
同定した。クローン化された断片の配列をDNA配列決定
によって確認した。 【０１３８】リポフェクション法（Felgnerら, Proc. N
atl. Acad. Sci. USA, 84:7413-7417（1987））を用い
て、5μgのプラスミドpBacTGFα-HIIを、市販の直鎖化
したバクロウイルス（「BaculoGoldＴＭ baculovirus D
NA」, Pharmingen,カリフォルニア州サンディエゴ）1.0
μgと同時にトランスフェクションした。 【０１３９】1μgのBaculoGoldＴＭウイルスDNAと5μg
のプラスミドpBac-TGFα-HIIを、血清非含有グレース培
地（Life Technologies Inc.,メリーランド州ガイサー
スブルク）50μlの入ったマイクロタイタープレートの
滅菌ウェル中で混合した。その後、リポフェクチン10μ
lとグレース培地90μlを加え、混合し、室温で15分間イ
ンキュベートした。次に、血清を含まないグレース培地
1mlが入っている35mm組織培養プレートに接種したSf9昆
虫細胞（ATCC CRL1711）に、上記トランスフェクション
混合物を滴下した。プレートを前後にゆすって、新たに
加えた溶液を混合した。次に、そのプレートを27℃で5
時間培養した。5時間後、トランスフェクション溶液を
プレートから取り除き、10%ウシ胎児血清を補足したグ
レース昆虫培地1mlを加えた。そのプレートを培養器に
戻し、培養を27℃で4日間続けた。 【０１４０】4日後、上清を集め、Summers及びSmith
（上記）の記述と同様に、プラーク検定を行なった。改
良点として、「Blue Gal」（Life Technologies Inc.,
ガイサースブルク）を含むアガロースゲルを使用した。
これは、青く染色したプラークの単離を容易にする。
「プラーク検定」に関する詳細な説明は、Life Technol
ogies Inc.（ガイサースブルク）が発行している昆虫細
胞培養とバクロウイルス学に関するユーザーズガイドの
9-10頁にも認められる。 【０１４１】連続希釈の4日後、ウイルスを細胞に加
え、青く染色したプラークをエッペンドルフピペットの
チップで拾った。次に、組換えウイルスを含有する寒天
を、グレース培地200μlの入ったエッペンドルフチュー
ブ中に再懸濁した。短い遠心分離によって寒天を除去
し、組換えバクロウイルスを含有する上清を用いて、35
mm皿に接種したSf9細胞を感染させた。4日後、これらの
培養皿の上清を収集し、4℃で保存した。 【０１４２】Sf9細胞を、10%熱不活化FBSを補足したグ
レース培地で生育した。その細胞を組換えバクロウイル
スV-TGFα-HIIに感染多重度（MOI）2で感染させた。6時
間後、培地を除去し、メチオニンとシステインを欠くSF
900 II培地（Life Technologies Inc.,ガイサースブル
ク）に置換した。42時間後、5μCiの３５S-メチオニン
と5μCiの３５S-システイン（Amersham）を加えた。細
胞をさらに16時間培養した後、遠心分離によって収集
し、標識されたタンパク質をSDS-PAGEとオートラジオグ
ラフィーで可視化した。 【０１４３】実施例3：COS細胞における組換えTGFα-HI
Iの発現 プラスミド、TGFα-HII HAの発現は、1）SV40複製起
点、2）アンピシリン耐性遺伝子、3）大腸菌複製起点、
4）CMVプロモーターとそれに続くポリリンカー領域、SV
40イントロン及びポリアデニル化部位を含有するベクタ
ーpcDNA3/Amp（Invitrogen）によった。全TGFα-HII前
駆体と、その3'末端にインフレーム（in frame）融合し
たHA標識とをコードするDNA断片を、上記ベクターのポ
リリンカー領域にクローニングした。したがって、その
組換えタンパク質の発現はCMVプロモーターに制御され
る。HA標識は、既に記述したように、インフルエンザ血
球凝集素タンパク質に由来するエピトープに対応する
（I. Wilson, H. Niman, R. Heighten, A. Cherenson,
M. Connolly及びR. Lerner, Cell, 37:767（1984））。
標的タンパク質にHA標識を融合すると、HAエピトープを
認識する抗体で組換えタンパク質を容易に検出できるよ
うになる。 【０１４４】プラスミド構築法は次の通りである。TGF
α-HIIをコードするDNA配列（ATCC番号97160）を、次の
2つのプライマーを用いて、クローン化した原型EST（th
e original EST cloned）に対するPCRによって構築し
た。5'プライマー 【数５】 は、BamHI部位（太字部分）と、それに続く、開始コド
ンから始まるTGFα-HIIコーディング配列の18ヌクレオ
チドとを含有する。3'配列（5'GCGCTCGAGGTATAGAACACTG
TAGTCC3'；配列番号12）は、XhoI部位、TGFαドメイン
の最後の19ヌクレオチド並びにXhoI部位に相補的な配列
を含有する。pcDNA3/Ampベクターは、BamHI/XhoIクロー
ニング部位を含み、このクローニング部位を利用する
と、PCR挿入物の読み枠が3'HA標識とそれに続く停止コ
ドンの読み枠に合う。したがって、PCR産物は、BamHI部
位、936塩基対のコーディング配列、及びXhoI部位を含
有する。そのPCR増幅DNA断片とベクターpcDNA3/Ampを、
BamHI及びXhoI制限酵素で消化し、連結した。その連結
混合物で大腸菌SURE株（Stratagene Cloning Systems,
カリフォルニア州92037ラジョラ）を形質転換し、その
形質転換培養をアンピシリン培地プレートで培養して、
耐性コロニーを選択した。プラスミドDNAを形質転換体
から単離し、制限分析によって正しい断片の存在を調べ
た。この組換えTGFα-HIIを発現させるため、DEAE-デキ
ストラン法（J. Sambrook, E. Fritsch, T.Maniatis, M
olecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring
Laboratory Press（1989））によって、COS細胞を上記
発現ベクターでトランスフェクションした。TGFα-HII
HAタンパク質の発現は、放射線標識と免疫沈降法（E. H
arlow, D. Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, C
old Spring Harbor Laboratory Press（1988））によっ
て検出した。トランスフェクションの2日後に、細胞を
３５S-システインで8時間標識した。次に、培養培地を
集め、細胞を界面活性剤（RIPA緩衝液（150mM NaCl, 1%
NP-40, 0.1%SDS, 1%NP-40, 0.5%DOC, 50mM Tris, pH7.
5）で溶解した（Wilson, I.ら,同上, 37:767（198
4））。細胞溶解液と培養培地の両方を、HA特異的モノ
クローナル抗体で沈殿させた。沈殿したタンパク質を15
%SDS-PAGEゲルで分析した。 【０１４５】実施例4：遺伝子療法による発現 皮膚生検によって対象から繊維芽細胞を得る。得られた
組織を組織培養培地に入れ、小片に分割する。少量の組
織を組織培養フラスコの湿った表面に乗せる。各フラス
コに、約10片を入れる。そのフラスコを上下逆さにし、
きつく密閉して、室温に終夜放置する。室温で24時間
後、そのフラスコを逆さにし、組織塊をフラスコの底に
固定したまま、新鮮な培地（例えば10%FBS、ペニシリン
及びストレプトマイシンを含むハムF12培地）を加え
る。次に、これを37℃で約1週間培養する。この時点
で、新鮮な培地を加え、以降、数日毎に交換する。さら
に2週間培養すると、繊維芽細胞の単層が生じる。その
単層をトリプシン処理して、より大きなフラスコに移
す。 【０１４６】モロニーネズミ肉腫ウイルスの長末端反復
を伴うpMV-7（Kirschmeier, P.T.ら, DNA, 7:219-25（1
988））を、EcoRIとHindIIIで消化した後、ウシ腸ホス
ファターゼで処理する。その直鎖ベクターをアガロース
ゲルで分画し、ガラスビーズを用いて精製する。 【０１４７】本発明ポリペプチドをコードするcDNAを、
それぞれ5'末端配列及び3'末端配列に対応するPCRプラ
イマーを用いて増幅する。その5'プライマーはEcoRI部
位を含有し、その3'プライマーはHindIII部位を含む。
モロニーネズミ肉腫ウイルス直鎖骨格と増幅したEcoRI
及びHindIII断片を、T4 DNAリガーゼの存在下に、等量
ずつ混合する。得られた混合物を、上記2断片の連結に
適した条件下に維持する。その連結混合物を用いて細菌
HB101を形質転換し、それを、カナマイシン含有寒天上
で培養することによって、目的の遺伝子がベクターに正
しく挿入されていることを確認する。 【０１４８】両種性pA317又はGP+am12パッケージング細
胞を、10%ウシ血清（CS）、ペニシリン及びストレプト
マイシンを含むダルベッコ改良イーグル培地（DMEM）
中、コンフルエント密度まで組織培養する。次に、上記
遺伝子を含有するMSVをその培地に加え、パッケージン
グ細胞をそのベクターで形質導入する。パッケージング
細胞は、上記遺伝子を含有する感染性ウイルス粒子を生
産するようになる（このパッケージング細胞を生産細胞
と呼ぶ）。 【０１４９】形質導入された生産細胞に新鮮な培地を加
えた後、コンフルエント生産細胞の10cmプレートから培
地を収集する。感染性ウイルス粒子を含有するその消費
済み培地をミリポアフィルターに通して、剥離した生産
細胞を除去し、その培地を用いて、繊維芽細胞を感染さ
せる。繊維芽細胞の亜コンフルエント（sub-confluen
t）プレートから培地を除去し、生産細胞から得た培地
にすばやく置換する。この培地を除去し、新鮮な培地で
置換する。ウイルスの力価が高ければ、実質上全ての繊
維芽細胞が感染され、選択の必要はないだろう。力価が
極めて低い場合は、neoやhisなどの選択可能マーカーを
持つレトロウイルスベクターを使用する必要がある。 【０１５０】次に、操作した上記繊維芽細胞を、そのま
ま、若しくはサイトデックス3ミクロキャリアービーズ
（cytodex 3 microcarrier beads）上でコンフルエント
に成長させた後、宿主に注射する。その繊維芽細胞は、
上記タンパク質産物を生産するようになっている。 【０１５１】上の教示を考慮すれば、本発明には数多く
の改良や変更を加えることができるので、詳しく説明し
た態様以外にも、添付の請求の範囲内で本発明を実施す
ることができる。 【０１５２】 【配列表】 (１) 一般的情報： (ｉ) 出願人／発明者：ウェイ等 (ii) 発明の名称： トランスフォ−ミング増殖因子α ＨＩＩ (iii) 配列の数： １２ (iv) 連絡先： (Ａ) 宛名：カレラ、バイアーン、ベイン、ジルフィラン、セッチ、 ステュワート・アンド・オルスタイン (Ｂ) 通り：ベッカー・ファーム・ロード６番 (Ｃ) 市：ローズランド (Ｄ) 州：ニュージャージー (Ｅ) 国：アメリカ合衆国 (Ｆ) ＺＩＰ：０７０６８ (ｖ) コンピューター解読書式： (Ａ) 媒体型：３.５インチディスケット (Ｂ) コンピューター：ＩＢＭ ＰＳ／２適合 (Ｃ) オペレーティング・システム：ＭＳ−ＤＯＳ (Ｄ) ソフトウエア：ワード・パーフェクト ５.１ (vi) 本出願のデータ： (Ａ) 出願番号： (Ｂ) 出願日： (Ｃ) 分類： (vii) 優先権主張出願のデータ： (Ａ) 出願番号：なし (Ｂ) 出願日：なし (viii) 弁理士／代理人 情報： (Ａ) 氏名：フェラロ、グレゴリー・ディー (Ｂ) 登録番号：３６,１３４ (Ｃ) 参照／整理番号：３２５８００−３５１ (ix) 電話連絡先情報： (Ａ) 電話番号：２０１−９９４−１７００ (Ｂ) ファックス番号：２０１−９９４−１７４４ (２) 配列番号１の情報： (ｉ) 配列の特徴： (Ａ) 長さ：１６９５ 塩基対 (Ｂ) 型：核酸 (Ｃ) 鎖の数：一本鎖 (Ｄ) トポロジー：直鎖状 (ii) 配列の種類：cＤＮＡ (xi) 配列：配列番号１： CACTCGTCTG CCCCTGGACT CCCGTCTCCT CCTGTCCTCC GGCTTCCCAG AGCTCCCTCC 60 TTATGGCAGC AGCTTCCCGC GTCTCCGGCG CAGTTCTCAG CGGACGACCC TCTCGCTCCG 120 GGGCTGAGCC CAGTCCCTGG ATGTTGCTGA AACTCTCGAG ATCATGCGCG GGTTTGGCTG 180 CTGCTTCCCC GCCGGGTGCC ACTGCCACCG CCGCCGCCTC TGCTGCCGCC GTCCGCGGGA 240 TGCTCAGTAG CCCGCTGCCC GGCCCCCGCG ATCCTGTGTT CCTCGGAAGC CGTTTGCTGC 300 TGCAGAGTTG CACGAACTAG TCATGGTGCT GTGGGAGTCC CCGCGGCAGT GCAGCAGCTG 360 GACACTTTGC GAGGGCTTTT GCTGGCTGCT GCTGCTGCCC GTCATGCTAC TCATCGTAGC 420 CCGCCCGGTG AAGCTCGCTG CTTTCCCTAC CTCCTTAAGT GACTGCCAAA CGCCCACCGG 480 CTGGAATTGC TCTGGTTATG ATGACAGAGA AAATGATCTC TTCCTCTGTG ACACCAACAC 540 CTGTAAATTT GATGGGGAAT GTTTAAGAAT TGGAGACACT GTGACTTGCG TCTGTCAGTT 600 CAAGTGCAAC AATGACTATG TGCCTGTGTG TGGCTCCAAT GGGGAGAGCT ACCAGAATGA 660 GTGTTACCTG CGACAGGCTG CATGCAAACA GCAGAGTGAG ATACTTGTGG TGTCAGAAGG 720 ATCATGTGCC ACAGATGCAG GATCAGGATC TGGAGATGGA GTCCATGAAG GCTCTGGAGA 780 AACTAGTCAA AAGGAGACAT CCACCTGTGA TATTTGCCAG TTTGGTGCAG AATGTGACGA 840 AGATGCCGAG GATGTCTGGT GTGTGTGTAA TATTGACTGT TCTCAAACCA ACTTCAATCC 900 CCTCTGCGCT TCTGATGGGA AATCTTATGA TAATGCATGC CAAATCAAAG AAGCATCGTG 960 TCAGAAACAG GAGAAAATTG AAGTCATGTC TTTGGGTCGA TGTCAAGATA ACACAACTAC 1020 AACTACTAAG TCTGAAGATG GGCATTATGC AAGAACAGAT TATGCAGAGA ATGCTAACAA 1080 ATTAGAAGAA AGTGCCAGAG AACACCACAT ACCTTGTCCG GAACATTACA ATGGCTTCTG 1140 CATGCATGGG AAGTGTGAGC ATTCTATCAA TATGCAGGAG CCATCTTGCA GGTGTGATGC 1200 TGGTTATACT GGACAACACT GTGAAAAAAA GGACTACAGT GTTCTATACG TTGTTCCCGG 1260 TCCTGTACGA TTTCAGTATG TCTTAATCGC AGCTGTGATT GGAACAATTC AGATTGCTGT 1320 CATCTGTGTG GTGGTCCTCT GCATCACAAG GAAATGCCCC AGAAGCAACA GAATTCACAG 1380 ACAGAAGCAA AATACAGGGC ACTACAGTTC GGACAATACA ACAAGAGCGT CCACGAGGTT 1440 AATCTAAAGG GAGCATGTTT CACAGTGGCT GGACTACCGA GAGCTTGGAC TACACAATAC 1500 AGTATTATAG ACAAAAGAAT AAGACAAGAG ATCTACACAT GTTGCCTTGC ATTTGTGGTA 1560 ATCTACACCA ATGAAAACAT GTACTACAGC TATATTTGAT TATGTATGGA TATATTTGAA 1620 ATAGTATACA TTGTCTTGAT GTTTTTTCTG TAATGTAAAT AAACTATTTA TATCACACAA 1680 AAAAAAAAAA AAAAA 1695 (２) 配列番号２の情報： (ｉ) 配列の特徴： (Ａ) 長さ：３７４アミノ酸 (Ｂ) 型：アミノ酸 (Ｃ) 鎖の数： (Ｄ) トポロジー：直鎖状 (ii) 配列の種類：蛋白質 (xi) 配列：配列番号２： Met Val Leu Trp Glu Ser Pro Arg Gln Cys Ser Ser Trp Thr Leu Cys 1 5 10 15 Glu Gly Phe Cys Trp Leu Leu Leu Leu Pro Val Met Leu Leu Ile Val 20 25 30 Ala Arg Pro Val Lys Leu Ala Ala Phe Pro Thr Ser Leu Ser Asp Cys 35 40 45 Gln Thr Pro Thr Gly Trp Asn Cys Ser Gly Tyr Asp Asp Arg Glu Asn 50 55 60 Asp Leu Phe Leu Cys Asp Thr Asn Thr Cys Lys Phe Asp Gly Glu Cys 65 70 75 80 Leu Arg Ile Gly Asp Thr Val Thr Cys Val Cys Gln Phe Lys Cys Asn 85 90 95 Asn Asp Tyr Val Pro Val Cys Gly Ser Asn Gly Glu Ser Tyr Gln Asn 100 105 110 Glu Cys Tyr Leu Arg Gln Ala Ala Cys Lys Gln Gln Ser Glu Ile Leu 115 120 125 Val Val Ser Glu Gly Ser Cys Ala Thr Asp Ala Gly Ser Gly Ser Gly 130 135 140 Asp Gly Val His Glu Gly Ser Gly Glu Thr Ser Gln Lys Glu Thr Ser 145 150 155 160 Thr Cys Asp Ile Cys Gln Phe Gly Ala Glu Cys Asp Glu Asp Ala Glu 165 170 175 Asp Val Trp Cys Val Cys Asn Ile Asp Cys Ser Gln Thr Asn Phe Asn 180 185 190 Pro Leu Cys Ala Ser Asp Gly Lys Ser Tyr Asp Asn Ala Cys Gln Ile 195 200 205 Lys Glu Ala Ser Cys Gln Lys Gln Glu Lys Ile Glu Val Met Ser Leu 210 215 220 Gly Arg Cys Gln Asp Asn Thr Thr Thr Thr Thr Lys Ser Glu Asp Gly 225 230 235 240 His Tyr Ala Arg Thr Asp Tyr Ala Glu Asn Ala Asn Lys Leu Glu Glu 245 250 255 Ser Ala Arg Glu His His Ile Pro Cys Pro Glu His Tyr Asn Gly Phe 260 265 270 Cys Met His Gly Lys Cys Glu His Ser Ile Asn Met Gln Glu Pro Ser 275 280 285 Cys Arg Cys Asp Ala Gly Tyr Thr Gly Gln His Cys Glu Lys Lys Asp 290 295 300 Tyr Ser Val Leu Tyr Val Val Pro Gly Pro Val Arg Phe Gln Tyr Val 305 310 315 320 Leu Ile Ala Ala Val Ile Gly Thr Ile Gln Ile Ala Val Ile Cys Val 325 330 335 Val Val Leu Cys Ile Thr Arg Lys Cys Pro Arg Ser Asn Arg Ile His 340 345 350 Arg Gln Lys Gln Asn Thr Gly His Tyr Ser Ser Asp Asn Thr Thr Arg 355 360 365 Ala Ser Thr Arg Leu Ile 370 (２) 配列番号３の情報： (ｉ) 配列の特徴： (Ａ) 長さ：３０ 塩基対 (Ｂ) 型：核酸 (Ｃ) 鎖の数：一本鎖 (Ｄ) トポロジー：直鎖状 (ii) 配列の種類：オリゴヌクレオチド (xi) 配列：配列番号３： CCCGGATCCG CACGAGACAT ACCTTGTCCG 30 (２) 配列番号４の情報： (ｉ) 配列の特徴： (Ａ) 長さ：３２ 塩基対 (Ｂ) 型：核酸 (Ｃ) 鎖の数：一本鎖 (Ｄ) トポロジー：直鎖状 (ii) 配列の種類：オリゴヌクレオチド (xi) 配列：配列番号４： GGGAAGCTTT TAATACTGAA ATCGTACAGG AC 32 (２) 配列番号５の情報： (ｉ) 配列の特徴： (Ａ) 長さ：３３ 塩基対 (Ｂ) 型：核酸 (Ｃ) 鎖の数：一本鎖 (Ｄ) トポロジー：直鎖状 (ii) 配列の種類：オリゴヌクレオチド (xi) 配列：配列番号５： CGCGGATCCG CCATCATGGT GCTGTGGGAG TCC 33 (２) 配列番号６の情報： (ｉ) 配列の特徴： (Ａ) 長さ：３１ 塩基対 (Ｂ) 型：核酸 (Ｃ) 鎖の数：一本鎖 (Ｄ) トポロジー：直鎖状 (ii) 配列の種類：オリゴヌクレオチド (xi) 配列：配列番号６： GCGTCTAGAC TAGTATAGAA CACTGTAGTC C 31 (２) 配列番号７の情報： (ｉ) 配列の特徴： (Ａ) 長さ：３３ 塩基対 (Ｂ) 型：核酸 (Ｃ) 鎖の数：一本鎖 (Ｄ) トポロジー：直鎖状 (ii) 配列の種類：オリゴヌクレオチド (xi) 配列：配列番号７： CGCGGATCCG CCATCATGCT ACTCATCGTA GCC 33 (２) 配列番号８の情報： (ｉ) 配列の特徴： (Ａ) 長さ：３１ 塩基対 (Ｂ) 型：核酸 (Ｃ) 鎖の数：一本鎖 (Ｄ) トポロジー：直鎖状 (ii) 配列の種類：オリゴヌクレオチド (xi) 配列：配列番号８： GCGTCTAGAC TAGTATAGAA CACTGTAGTC C 31 (２) 配列番号９の情報： (ｉ) 配列の特徴： (Ａ) 長さ：３１ 塩基対 (Ｂ) 型：核酸 (Ｃ) 鎖の数：一本鎖 (Ｄ) トポロジー：直鎖状 (ii) 配列の種類：オリゴヌクレオチド (xi) 配列：配列番号９： CGCGGATCCA GAACACCACA TACCTTGTCC G 31 (２) 配列番号１０の情報： (ｉ) 配列の特徴： (Ａ) 長さ：３１ 塩基対 (Ｂ) 型：核酸 (Ｃ) 鎖の数：一本鎖 (Ｄ) トポロジー：直鎖状 (ii) 配列の種類：オリゴヌクレオチド (xi) 配列：配列番号１０： GCGTCTAGAC TAGTATAGAA CACTGTAGTC C 31 (２) 配列番号１１の情報： (ｉ) 配列の特徴： (Ａ) 長さ：３３ 塩基対 (Ｂ) 型：核酸 (Ｃ) 鎖の数：一本鎖 (Ｄ) トポロジー：直鎖状 (ii) 配列の種類：オリゴヌクレオチド (xi) 配列：配列番号１１： CGCGGATCCG CCATCATGGT GCTGTGGGAG TCC 33 (２) 配列番号１２の情報： (ｉ) 配列の特徴： (Ａ) 長さ：２８ 塩基対 (Ｂ) 型：核酸 (Ｃ) 鎖の数：一本鎖 (Ｄ) トポロジー：直鎖状 (ii) 配列の種類：オリゴヌクレオチド (xi) 配列：配列番号１２： GCGCTCGAGG TATAGAACAC TGTAGTCC 28
【図面の簡単な説明】
【図１】 TGFα-HIIの推定アミノ酸配列に対応させたc
DNA配列を表す。 【図２】 TGFα-HIIの推定アミノ酸配列に対応させたc
DNA配列を表す。 【図３】 TGFα-HIIの推定アミノ酸配列に対応させたc
DNA配列を表す。 【図４】 TGFα-HIIの推定アミノ酸配列に対応させたc
DNA配列を表す。 【図５】 TGFα-HIIの推定アミノ酸配列に対応させたc
DNA配列を表す。 【図６】 TGFα-HIIの推定アミノ酸配列に対応させたc
DNA配列を表す。 【図７】 ヒトベータセルリン、ヒトTGFα及びヒトTGF
α-HII（第3列）間のアミノ酸配列相同性を比較した図
である。 【図８】 ヒトベータセルリン、ヒトTGFα及びヒトTGF
α-HII（第3列）間のアミノ酸配列相同性を比較した図
である。 【図９】 ヒトベータセルリン、ヒトTGFα及びヒトTGF
α-HII（第3列）間のアミノ酸配列相同性を比較した図
である。 【図１０】 ヒトベータセルリン、ヒトTGFα及びヒトT
GFα-HII（第3列）間のアミノ酸配列相同性を比較した
図である。
DNA配列を表す。 【図２】 TGFα-HIIの推定アミノ酸配列に対応させたc
DNA配列を表す。 【図３】 TGFα-HIIの推定アミノ酸配列に対応させたc
DNA配列を表す。 【図４】 TGFα-HIIの推定アミノ酸配列に対応させたc
DNA配列を表す。 【図５】 TGFα-HIIの推定アミノ酸配列に対応させたc
DNA配列を表す。 【図６】 TGFα-HIIの推定アミノ酸配列に対応させたc
DNA配列を表す。 【図７】 ヒトベータセルリン、ヒトTGFα及びヒトTGF
α-HII（第3列）間のアミノ酸配列相同性を比較した図
である。 【図８】 ヒトベータセルリン、ヒトTGFα及びヒトTGF
α-HII（第3列）間のアミノ酸配列相同性を比較した図
である。 【図９】 ヒトベータセルリン、ヒトTGFα及びヒトTGF
α-HII（第3列）間のアミノ酸配列相同性を比較した図
である。 【図１０】 ヒトベータセルリン、ヒトTGFα及びヒトT
GFα-HII（第3列）間のアミノ酸配列相同性を比較した
図である。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(72)発明者 イン−フェイ・ウェイ
アメリカ合衆国20878メリーランド州ダー
ネスタウン、ストロー・ベイル・レイン
13524番
(72)発明者 ポール・エス・メイスナー
アメリカ合衆国20838メリーランド州バー
ンズビル、バーンズビル・ロード18040番
(72)発明者 ニ・ジャン
アメリカ合衆国20878メリーランド州ゲイ
ザーズバーグ、ウエストサイド・ドライブ
305番 アパートメント204
Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA11 BA80 CA02 DA06
EA04 GA11 GA13 HA01
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 【請求項１】 本明細書の実施例のいずれかに記載のポ
リヌクレオチド。
Priority Applications (1)
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|---|---|---|---|
| JP2002143471A JP2003000247A (ja) | 2002-05-17 | 2002-05-17 | トランスフォーミング増殖因子αＨＩＩ |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2002143471A JP2003000247A (ja) | 2002-05-17 | 2002-05-17 | トランスフォーミング増殖因子αＨＩＩ |
Related Parent Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP08534782 Division |
Related Child Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2005348542A Division JP2006087443A (ja) | 2005-12-01 | 2005-12-01 | トランスフォーミング増殖因子αＨＩＩ |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2003000247A true JP2003000247A (ja) | 2003-01-07 |
Family
ID=19194599
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2002143471A Withdrawn JP2003000247A (ja) | 2002-05-17 | 2002-05-17 | トランスフォーミング増殖因子αＨＩＩ |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2003000247A (ja) |
-
2002
- 2002-05-17 JP JP2002143471A patent/JP2003000247A/ja not_active Withdrawn
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