DK175412B1 - Fremgangsmåde til fremstilling af TGF-beta, DNA og mRNA, som koder for TGF-beta, samt replicerbare vektorer omfattende DNA'en og værtsceller indeholdende vektorerne - Google Patents

Description

i DK 175412 B1

Peptider, som kan inducere den reversible fænotypiske omdannelse af pattedyrceller i kultur, er blevet givet 1 2

navnet transformerende vækstfaktor (TGF) ’ . Type-a-TGF

konkurrerer med epidermal vækstfaktor (EGF) om binding 5 til den samme celleoverfladereceptor^. En TGF-a-art på 50 aminosyrer er blevet renset og vist at have sekvens- ή.

homologi med EGF . TGF-a syntetiseres af forskellige transformerede cellelinier, men dens syntese er endnu ikke blevet påvist i normalt væv af ikke-embryonisk 10 oprindelse^’^^. TGF-a-arten på 50 aminosyrer syntetiseres fra begyndelsen som del af et forstadiemolekyle på 160 aminosyrer, som undergår N- og C-terminal proteolytisk 7 8 forarbejdning til dannelse af det modne peptid * . De- tektionen af TGF-a-arter med øjensynligt højere mole-12 9 15 kylvægte ’ ' kan skyldes variabel forarbejdning af forstadiet på 160 aminosyrer.

Type (i TGF-aktivitet er blevet isoleret fra tumorceller såvel som mange normale vsv^*^, herunder nyre^, placenta^ og blodplader^’^. TGF-β er til stede i 20 blodplader, som også indeholder plade-afledt vækstfak tor (POGF) og et EGF-lignende peptid^**. Okse-TGF-β er blevet påvist at accelerere sårheling hos rotter Behandling af NRK-fibroblaster med TGF-β resulterer imidlertid i en forøgelse i antallet af membranrecepto-20 25 rer for EGF .Denne iagttagelse er i overensstemmelse med den kendte evne hos TGF-β til i høj grad at forstærke aktiviteten af EGF og TGF-α på disse celler^*^ .

Endvidere kan TGF-β alene inducere AKR-2B-fibroblaster 21 til at danne kolonier i blød agar . De forhøjede niveauer 2 2 50 af TGF-β, som secerneres af nogle transformerede celler* , antyder at denne vækstregulator kunne spille en rolle ved malign omdannelse. ·

Foruden dens evne til at stimulere celleformering er TGF-β for nyligt blevet påvist at inhibere den forankrings- I DK 175412 B1 I 2 afhængige vækst af en række forskellige humane cancer- cellelinier1 . Det menes nu, at TGF-β kan være identisk eller meget lig med en vækstinhibitor isoleret fra cel- 2k ler fra den afrikanske grønne abe (BSC-1) . Om TGF-oj 5 har den virkning at stimulere eller inhibere væksten af en bestemt type cellelinie synes at afhænge af mange variable, herunder cellens fysiologiske tilstand og tilstedeværelsen af yderligere vækstfaktorer.

Okse-TGF-0 er blevet renset til sekvensbestemmelig renhed.

10 De første 15 aminoterminale rester i det modne protein fandtes at være Ala-Leu-Asp-Thr-Asn-Tyr-CMC-Phe-Ser-Ser-

Thr-Gly-Lys-Asn-CMC-, hvor CMC er S-carboxymethylcyste- H in repræsenterende cystein- eller halv-cystin-rester.

Human TGF-β fra human placenta og blodplader er blevet 15 renset til den samme grad. Placenta-TGF-β blev rappor- teret at have den følgende aminoterminale sekvens:

Ala-Leu-Asp-Thr-Asn-Tyr-CMC-Phe-(Ser-Ser)-Thr-Glu-Lys-Asn- I CMC-Val-X-Gln-Leu-Tyr-Ile-Asp-Phe-X-(Lys)-Asp-Leu-Gly-, hvori X var ubestemt, og CMC har den ovenstående betyd- 20 ning. Blodplade-TGF-β blev rapporteret at have den amino- terminale sekvens: Ala-Leu-Asp-Thr.-Asn-Tyr-X-Phe-Ser-, hvor CMC og X har den ovenstående betydning.

Human TGF-p blev rapporteret at være sammensat af to polypeptidkæder med meget ens molekylvægt (M = 12500), H 25 som holdes i kovalent forbindelse af disulfidbindinger.

Det blev betragtet som sandsynligt, at disulfidbindinger- ne spiller en vigtig rolle ved at give struktur til I TGF-P-molekylet.

Der er behov for en fremgangsmåde til fremstilling af I 30 TGF-P, som afskaffer behovet for biologiske materialer I fra mennesker som udgangsmateriale. Dette vil medvirke I væsentligt til sikkerheder for, at ingen infektiøse 3 DK 175412 B1 kontaminanter, f.eks. HFLI/-III- eller hepatitis-virus, er i stand til at komme ind i produktfremstillingsstrøm-men. Rekombinant syntese af TGF-β ville opfylde dette formål. For at kunne gøre dette kræves imidlertid nucle-5 insyre, som koder for TGF-β, til fremstilling af vektorer, < som skal anvendes ved en sådan rekombinant syntese af TGF-β. En sådan nucleinsyre er også nødvendig for diagnosen af TGF-β mRNA og genomisk DNA i vævsprøver.

Sammenfatning af opfindelsen 10 De ovennævnte formål opnås ifølge opfindelsen ved en fremgangsmåde, som er ejendommelig ved, at (a) der konstrueres en vektor, som inkluderer nucleinsyre, der koder for TGF-β, (b) en heterolog eukaryotisk værtscelle transformeres med vektoren, (c) den transformerede celle 13 dyrkes, og (d) der udvindes TGF-β fra kulturen.

Nucleinsyre, som koder for TGF-β, er tilvejebragt ifølge denne beskrivelse. Den er nyttig ved konstruktionen af de ovennævnte vektorer. Denne nucleinsyre eller en nucleinsyre, som er i stand til at hybridisere dermed, 20 mærkes også og anvendes ved diagnostiske prøvninger for DNA eller mRNA, som koder for TGF-β eller beslægtede proteiner.

Γ'

Fremstillingen af TGF-P-derivater ved rekombinante fremgangsmåder muliggøres af kendskabet til den TGF-p-kode'nde' 25 sekvens, som er angivet i denne beskrivelse. Disse deri vater inkluderer tavse og udtrykte mutanter i nucle-insyre'n, som koder for TGF-β.

Tavse mutanter involverer udskiftningen af en degenereret codon med en anden, hvor begge codoner koder for den 30 samme aminosyre, men hvor udskiftningen kunne udøve en gavnlig virkning på TGF-3-udbyttet i rekombinant I DK 175412 B1

I

B kultur, f.eks. ved modificering i den sekundære struktur I

af TGF-P-mRNA, og den gavnlige udskiftning identificeres I

B ved sigtning af TGF-p-udbytter fra transformanter. I

B Udtrykte TGF-P-mutanter falder inden for en eller flere I

B 5 af tre klasser: deletioner, udskiftninger eller indsæt- I

ninger. Deletioner er karakteriseret ved fjernelsen I

af aminosyrerester uden indsætning af en erstatningsrest. I

I Deletionsmuteret TGF-p-DNA er nyttig ved fremstilling I

B af TGF-P-fragmenter, f.eks. hvor det ønskes at dele- I

10 tere en immunepitop. I

B Udskiftningsmutationer er sådanne, hvorved én aminosyre- I

I rest er blevet erstattet med en anden. Sådanne mutationer I

I er yderst vanskelige at udføre ved andre fremgangsmåder I

B end rekombinant syntese, især udskiftninger rettet mod I

B 15 mål i det indre af den primære aminosyresekvens. De I

B r er nyttige ved modificering af den biologiske aktivitet I

I af TGF-p. I

B Indsætningsmutanter er sådanne, hvori en eller flere I

B rester er anbragt inde i eller ved en af enderne af I

B 20 TGF-P-nucleinsyren. Fusioner er typisk arter af indsæt- I

B ningsmutanter, hvori indsætningen sker ved de carboxyl- I

B eller aminoterminale rester af TGF-P. TGF-P-fusioner I

B med bakterielle eller andre immunogene proteiner er I

B nyttige til frembringelse af antistoffer over for TGF-P I

B 25 eller dets forud fastlagte fragmenter. I

B Kort beskrivelse af tegningerne I

B Fig. la er et skematisk diagram af TGF-p-mRNA'en, som I

B viser den indrammede kodesekvens. TGF-p-arten på 112 I

B aminosyrer (skraveret) er indkodet af kodesekvensens I

B 30 3’-ende. Dé sekvensbestemte cDNA-indsætninger ^PCI, I

I 3.19, 3.32, 4.10, 4.33, 4.37 og 5.7b (beskrevet nedenfor) I

5 DK 175412 B1 og den genomiske DNA-sekvens for det 31-utranslaterede område er anbragt på linie over diagrammet.

Fig. Ib gengiver sekvensen og den afledte aminosyrese-kvens af præTGF-Ø-cDNA’en bestemt ud fra de flere over-5 lappende cDNA'er og det genomiske 3'-område. Det 5'-ter- minale område, som kunne foldes til stabile hårnåle-løkker, er understreget. PræTGF-p-cDNA'en koder for et protein på 390 eller 354 aminosyrer, hvoraf de C-ter-minale 112 aminosyrer (indrammet) koder for moden TGF-p.

10 Et Arg-Arg dipeptid med en fed streg oven over går forud for det proteolyti ske spaltningscenter til frigørelse af TGF-β. Tre potentielle N-glycosyleringscentre i præTGF-0 er vist med en streg oven over. Stopcodonen efterfølges af den understregede G-C-rige sekvens og 15 en efterfølgende TATA-lignende sekvens. AATAAA polyadenyle- ringssignalet og TTCAGGCC sekvensen forud for det formodede polyadenyle-ringscenter er også understreget.

Fig. 2 gengiver et genomisk fragment, som koder for I en TGF-Ø-exon, og dets afledte aminosyresekvens. Pile I viser mRNA-forarbejdningscentrene (intron-exon-samlin- I ger). Antallet af rester svarer til fig. Ib.

I 20 Detailbeskrivelse I TGF-P har vist sig at være yderst vanskelig at synte- I tisere i rekombinant cellekultur under bevarelse af I dens vækstfremmende aktivitet. Som det kan ses af fig.

I lb, indeholder aminosyresekvensen af den modne TGF-P

I 25 et stort antal cysteinrester (9), hvoraf mindst nogle I øjensynligt er involveret i mellemkæde-tværbinding under I dannelse af den homodimere TGF-P, som udvindes fra natur- I lige kilder. Endvidere udtrykkes TGF-P som et forstadie- I molekyle med et stort aminoterminalt område, som ikke I 30 indeholder den genkendelige aminoterminale signalpeptid- I sekvens, som er typisk for de fleste secernerede prote- I DK 175412 B1 H iner, selv om TGF-β normalt forekommer i nogen grad H i det ekstracellulære medium. Uden at begrænse forkla- ringen heri til nogen bestemt teori kan det tænkes, at dette aminoterminale område indeholder et større 5 antal transmembranområder. Imidlertid har vi været i stand til at transformere eukaryotiske celler til at udtrykke heterolog TGF-β, uanset den forventede vanske- lighed ved at forarbejde det primære translationspro- dukt rigtigt i rekombinant kultur.

10 Denne opfindelse er rettet mod rekombinant syntese af TGF-p, der defineres som inkluderende biologisk aktiv H præTGF-β med den i fig. Ib viste sekvens, moden TGF-β, H polypeptidfragmenter deraf og indsætnings-, udskift- nings- og/eller deletionsmutanter af sådan præTGF-Ø, 15 moden TGF-β eller polypeptidfragmenter.

Biologisk aktiv TGF-β defineres som værende i stand

til at inducere EGF-forstærket forankringsuafhængig H

vækst af målcellelinier og/eller vækstinhibering af 23 neoplastiske cellelinier- . Forankringsuafhængig vækst 20 henfører til evnen hos TGF-β- og EGF-behandlede ikke- neoplastiske målceller til at danne kolonier i blodagar, en egenskab, som tilskrives transformation af cellerne (deraf navnet transformerende vækstfaktor). Dette skal ikke betyde, at TGF-β vil "fremkalde" cancer, fordi I 25 det nu vides, at mange normale celler udtrykker TGF-β.

Paradoksalt er TGF-β også kendt for at inhibere væksten af visse neoplastiske celler, såsom A549.

Biologisk aktivitet i den her beskrevne forstand inklu- I derer almindeligvis også evnen til at krydsreagere med I 30 antisera frembragt over for nativ TGF-β. Nativ TGF-β I er den, som opnås fra blodplader eller andre naturlige kilder. Immunologisk krydsreaktivitet er et mål for I en enkelt aktiv epitop og ikke nødvendigvis aktive TGF-β- 7 DK 175412 B1 domæner involveret i fremkaldelse af forankringsuafhængig vækst eller målceller. Imidlertid er immunologisk krydsreaktive proteiner i sig selv ikke biologisk aktive som defineret her, med mindre de også udøver vækst-5 påvirkende aktivitet. Selvfølgelig vil TGF-β, som er i stand til at fremkalde forankringsuafhængig vækst, hyppigt også udvise immunologisk krydsreaktivitet med antisera frembragt over for det native molekyle som en naturlig følge af opretholdelsen af den rette kon-10 formation.

Nucleotidsekvensen i fig. 16 blev opnået ved en. analyse af flere overlappende cDNA'er og genfragmenter, hvilket førte til bestemmelsen af en kontinuert sekvens på 2537 basepar svarende til TGF-P-forstadie-mRNA'en. Ifølge 15 fig. Ib er en ATG-startcodon lokaliseret 841 nucleotider fra 5'-enden og etablerer en kodesekvens på 1696 nucleotider, hvorved den koder for et 390 aminosyrer langt polypeptid. Flere områder i cDNA-sekvensen har et yderst højt G-C-indhold. ATG-startcodonen flankeres af to G-C-20 rige områder på omkring 200 bp hver. Desuden har flere områder af cDNA'en, især i 5‘-enden, mere end 80 % G-C-indhold. Lokaliseringen af disse G-C-rige områder falder sammen med de områder, hvori de mange cDNA-klonings-kunstprodukter forekom, og hvor der blev opnået cDNA'er 25 af delvis længde.

Flere strukturelle træk favoriserer udpegningen af ATG-codonen i position 953 som startcodonen for præTGF-p fremfor codonen i position 842 som vist i fig. Ib. For det første er sekvenssammenhængen i denne position i 30 rimelig overensstemmelse med den foreslåede startco- don-konsensussekvens G/A CCATGG^. For det andet kan der, selv om' der forud for denne ATG går en åben aflæsningsramme på omkring 850 bp kun findes én anden ATG i den samme aflæsningsramme. For det tredje viser ud- I DK 175412 B1

I 8 I

H regning af den mest sandsynligt anvendte aflæsningsramme, I

H baseret på purin-pyrimidin-fordelingen som beskrevet I

I af Shepherd"^, at kodesekvensen startende fra start-ATG- I

I codonen faktisk er den mest sandsynlige aflæsningsramme, I

I 5 medens der forud for denne ATG må vælges en anden aflæs- I

ningsramme som den mest sandsynlige. For det fjerde I

er denne ATG lokaliseret i et område på 40 nucleotider I

med relativt lavt G-C-indhold (ca. 50 S), hvilket kunne I

favorisere tilgængeligheden for ribosomet, især da det I

I 10 er lokaliseret i et større G-C-rigt område. Der er kun I

I en enkelt anden potentiel startcodon i den 5'-utrans- I

I laterede sekvens (position 842). Imidlertid er denne ATG place- I

I ret i en anden læseramme, er efterfulgt efter 19 tripletter af en stopkode og er I

I lokaliseret i et meget G-C-rigt område. I

Det 5 '-utranslaterede område af TGF-Ø-mRNA'en er mindst I

I 15 952 nucleotider langt (under den antagelse at ATG-start- I

codonen er lokaliseret ved nucleotid 953) og indeholder I

I en 61 nucleotider lang sekvens (192 - 252) bestående I

H næsten udelukkende af puriner. Den biologiske relevans I

af dette exceptionelt lange 5 '-utranslaterede område I

20 med højt G-C-indhold er ukendt, men det minder om den I

I strukturelle organisation af c-myc-mRNA. Imidlertid I

er der ingen slående sekvenshomologi mellem disse to I

I sekvenser. Det lange 5'-utranslaterede område i c-myc I

I er blevet hypotetiseret at have en funktionel betydning"^. I

25 Den G-C-rige 5'-proximale del af den 5'-utranslaterede I

I sekvens i human c-myc-mRNA har flere områder, som kunne I

I danne stabile hårnåleløkker. Ligeledes kan de første I

I 120 bp af den utranslaterede præTGF-Ø-cDNA teoretisk I

H foldes til hårnåleløkkestrukturer med en udregnet sta- I

I 30 bilitet på -91 kcal. Den lange 5'-utranslaterede sekvens I

I og de potentielt stabile hårnåleløkkestrukturer kunne I

I spille en rolle i mRNA-stabilitet eller i reguleringen I

I af transcription. I overensstemmelse hermed kan dette I

område deleteres og erstattes med andre 5'-utranslaterede I

I 35 sekvenser, f.eks. fra virale proteiner, for at identifi- I

9 DK 175412 B1 cere strukturer, som kan forbedre TGF-Ø-udbytter fra rekombinant cellekultur.

Stopcodonen forud for rest 2015 efterfølges umiddelbart af en bemærkelsesværdig G-C-rig sekvens på 75 nucleo-5 tider (fig. Ib). Denne sekvens består af mange gentagel ser af CCGCC og ender med GGGGGC. Den særegne natur af denne sekvens er sandsynligvis ansvarlig for, at den 3'-utranslaterede ende af mRNA'en ikke kunne klones som en cDNA-sekvens, måske på grund af den manglende 10 evne hos E. coli DNA-polymerase I til at anvende denne sekvens som skabelon for anden-strengs-cDNA-syntesen. Gentagelsessekvenser af lignende art er blevet fundet i promotorområderne af generne for human dihydrofolat- reductase, human transferrinreceptor, human adenosin- 40 15 deaminase og Herpesvirus-thymidinkinase . I det sidst- 40 nævnte tilfælde har McKnight et al. vist, at disse strukturelle elementer er af største vigtighed for trans- criptionseffektiviteten. Desuden er det blevet vist, at den promotorspecifikke transcriptionsfaktor Spl bindes 20 til sådanne sekvenser i det tidlige promotorområde i 41 42 SV40 og i en beslægtet abepromotor * .1 alle disse tilfælde efterfølges de G-C-rige gentagelser nært af

Goldberg-Hogness-TATA-sekvensen. I præTGF-β er disse sekvenser imidlertid lokaliseret i genets 3'-utrans- 25 laterede område, men efterfølges interessant nok også af en TATA-lignende sekvens. Der er ingen tegn på at dette område kunne fungere som promotorsekvens. præTGF-Ø- gensekvensen har hexanucleotidet AATAAA omkring 500 nucleotider nedad fra stopcodonen. Denne sekvens, som 30 sædvanligvis kommer 11 - 30 baser forud for polyadeny- 32 leringscentret , fungerer sandsynligvis som præTGF-Ø-mRNA-polyadenyleringssignalet, da dette ville være i overensstemmelse med størrelsen af præTGF-Ø-mRNA bedømt ud fra Northern-hybridiseringer, og eftersom 3'-utrans-35 laterede områder sjældent indeholder mellemliggende I DK 175412 B1 I 10

sekvenser. Benoist et al.*1·* har foreslået en konsensus- I

I sekvens TTCACTGC, som felger tæt på AATAAA-sekvensen I

og kommer umiddelbart før polyA-halen. En lignende se- I

I kvens, TTCAGGCC, følger efter AATAAA-sekvensen i det I

I 5 3’-utranslaterede område af præTGF-P-mRNA'en, hvilket I

H giver yderligere støtte til antagelsen af polyadeny- I

leringscentret ved position 2530 (fig. lb). I

PræTGF-p er et polypeptid på 354 aminosyrer (eller 390 I

H aminosyrer som vist i fig. Ib). Sammenligning af denne I

I 10 sekvens med den tidligere beskrevne N^-terminus af I

I moden TGF-P viser, at TGF-P udgør de C-terminale 112 I

aminosyrer af præTGF-P. Den modne TGF-P-monomer spaltes I

fra forstadiet ved Arg-Arg-dipeptidet, som kommer umid- I

I delbart før den modne TGF-p's NH^-terminus. Lignende I

I 15 proteolytiske spaltningscentre er blevet fundet i flere I

andre polypeptidforstadiesekvenser, herunder præpro- I

I 44 45 46 I

enkephalin ’ , calcitoninforstadiet og corticotro- I

I 47 I

pin-P-lipotropin-forstadiet . Bestemmelse af hydro- I

I phobicitetsprofilen ved den metode, som er beskrevet I

I 48 I

20 Kyte og Doolittle forudsiger, at denne Arg-Arg-se- I

H kvens er lokaliseret i et hydrophilt område, som ville I

I gøre den tilgængelig for en trypsinlignende peptidase. I

Η Efter-translations-spaltning af forstadiet giver den I

I modne TGF-P-monomer. Hvad der bliver af præsekvensen, I

I 25 vides ikke, men den kan give anledning til andre biologisk I

I aktive peptider. TGF-P-forstadiet indeholder flere par I

I af basiske rester (fig. Ib), som også kunne undergå I

I efter-translations-spaltning og give anledning til se- I

I parate polypeptidenheder. Imidlertid indeholder moden I

30 TGF-P to Arg-Lys-dipeptider, som øjensynligt ikke spal- I

I tes. Som vist i fig. Ib, indeholder præTGF-P-forstadiet I

I tre potentielle N-glycosyleringscentre, Asn-X-Ser eller I

I Thr (fig. Ib). Intet af disse er lokaliseret i moden I

I TGF-p. I overensstemmelse hermed tilvejebringes en- frem- I

35 gangsmåde, hvorved moden TGF-β renses fri for glyco- I

11 DK 175412 B1 proteiner ved adsorption af glycoproteinerne på immo-biliserede lectiner og eluering af TGF-β med den uad-sorberede fraktion.

Sekvensen for human TGF-β blev bestemt ved direkte amino-5 syresekvensanalyse og ved deduktion ud fra TGF-O-cDNA‘en.

Sekvensen af de forskellige TGF-P-peptider opnået ved clostripain-nedbrydning er i overensstemmelse med cDNA-sekvensen med undtagelse af nogle få rester, som antageligvis skyldes ukorrekt aroinosyretildeling ved sekvens-10 bestemmelsen. TGF-p-sekvensen på 112 aminosyrer indehol der 9 cysteinrester, medens resten af forstadiet kun indeholder to (fig. Ib). Tidligere undersøgelser har vist, at reduktion af TGF-p-dimeren på 25 kd resulterer i skabelsen af to polypeptidkæder på 12,5 kd*"*. Sekvens-15 analyse af TGF-P-aminoterminus og af de opnåede TGF-β- peptider efter clostripain-nedbrydning tyder stærkt på, at TGF-P-dimeren består af to identiske polypeptider.

Denne homodimere natur understøttes også af tilstedeværelsen af kun et enkelt hybridiserende DNA-fragment 20 ^ efter Southern-hybridisering af human genomisk DNA med en TGF-p-exon-sonde. Chou-Fasman-analyse^ af den sekundære struktur viser, at TGF-P-polypeptidet har en udstrakt β-ark-karakter med kun lidt, om overhovedet nogen, α-helicitet. Området umidelbart forud for basisk-25 dipeptid-spaltningscentret er sandsynligt i en a-helical konfiguration.

Et bemærkelsesværdigt træk ved TGF-p-forstadiet er, at det ikke indeholder en genkendelig aminoterminal signalpeptidsekvens, som er typisk for de fleste secer-30 nerede proteiner. Den mekanisme, hvorved TGF-β viser sig i det ekstracellulære medium, er ukendt, men kan være relativt ineffektiv, da moden TGF-p sædvanligvis også kan findes forbundet med cellerne hos gnavere eller mennesker. Det forstås heller ikke, hvordan TGF-β op- I DK 175412 B1 I iz lagres inden i blodplader. Fornylig er cDNA-sekvenser, I som koder for interleukin-l"^ ’ ^2 og tumornecrosefaktor^, blevet bestemt. Selv om begge viser sig i det ekstra- cellulære medium, indeholder ingen af dem et typisk 5 aminoterminalt signalpeptid.

En mulig mekanisme for TGF-p-frigivelse til det ekstra- cellulære medium er ved spaltning fra forstadiet fprank- ret i membranen med Nl^-terminus i cytoplasmaet og TGF-P- sekvensen på den udvendige side. De fleste proteiner, 10 som strækker sig tværs over membraner en enkelt gang, synes at have et transmembranområde på 20 23 uladede, hovedsageligt hydrofobe rester. Den eneste kendte undta- 54 gelse er T3-underenheden af T-celle-receptoren , som indeholder en Asp-rest i transmembranområdet. Et lig- 15 nende hydrofobt domæne kan ikke forudsiges ud fra den afledte aminosyresekvens af TGF-P-forstadiet, hvilket gør det usandsynligt, at dette protein har et enkelt transmembrandomæne.

Det er imidlertid tænkeligt, at TGF-P-forstadiet er 20 et protein roed flere transmembranområder. Sådanne pro- teiner, f.eks. rhodopsin^, den elektriske åls natrium- I kanalprotein^ og det overvejende indre protein i linse- I gab-junctions^ har deres N^-termini i cytoplasmaet I og indeholder flere transmembrandomæner, som faktisk H 25 indeholder flere ladede rester. Det er rouligt, at nog- I le af disse ladninger neutraliseres på grund af den I fysiske nærhed af rester med modsatte ladninger loka- I liseret i nabo-transmembran-områder. 1 de fleste til- fælde er transmembrandomænerne flankeret af ladede res- I 30 ter, som ofte er positive på cytoplasmasiden og negative I på den ekstracellulære side. Sammenligning af disse I træk med TGF-p-sekvensen tyder på, at TGF-P-forstadiet kan høre til denne klasse af roembranproteiner, da det indeholder flere potentielle transmembranområder og 13 DK 175412 B1 flere klynger af ladede rester. Vi foreslår, at de NH^-terroinale 21 aminosyrer, som er rige på positivt ladede rester, er lokaliseret på cytoplasmasiden af det første transmembranområde, som muligvis er lokaliseret mellem 3 resterne 59 og 80. Dette domæne efterfølges ved den udvendige side af to Arg-rester og en klynge på 5 negativt ladede glutaminsyrerester (aminosyrerne-91 -100). Et andet transmembranområde kunne være lokaliseret mellem resterne 127 og 151 og ligger forud for 10 en klynge af basiske rester (aminosyrerne 156 - 165) lokaliseret på cytoplasmasiden. Et tredie membranoverspændende område kunne findes mellem resterne 248 og 270 efter Arg-Arg-dipeptidet ved position 245. Det sidstnævnte område ville indeholde to positive ladninger, 15 som kunne neutralisere de to negativt ladede rester, som findes i det første eller andet transmembranområde.

Som resultat af denne konfiguration ville TGF-P-poly-peptidet og dets forudgående Arg-Arg-rester være lokaliseret på den udvendige side af membranen. Dette ville 20 muliggøre spaltning ved hjælp af en dibasisk peptidase 58 59 lokaliseret ved den side af cellemembranen * og ville igen resultere i frigivelsen af TGF-0 i det ekstracel-lulære miljø. Denne postulerede struktur af TGF-P-for-stadiet indebærer sandsynligvis, ligesom i humant rho-25 dopsin^ og det overvejende indre protein i linsefiber- membranen'* , at ikke alle potentielle N-glycosyleringscentre bærer carbonhydratdele. Det bør indses, at den ovenstående model er hypotetisk og på ingen måde skal betragtes som begrænsende for opfindelsens omfang. 1 2 3 4 5 6

Til de heri angivne formål defineres præTGF-P som det 2 normale TGF-p-forstadium afbildet i fig. 1 såvel som 3 andre forstadie former af TGF-P, hvori præsekvensen ikke 4 er den, der normalt er forbundet med TGF-p. Disse sidst 5 nævnte former skal betragtes som indsætningsmutanter 6 af DNA, som koder for moden TGF-Ø. Disse mutanter omfat- I DK 175412 B1 I 14

H ter almindeligvis en præsekvens, som er heterolog for I

TGF-β, i form af en fusion med moden TGF-β. De heterologe præsekvenser, som fortrinsvis opnås fra andre secernerede H proteiner, f.eks. prævæksthormon, præproinsulin, virale 5 hylsterproteiner, interferoner og gær- eller bakteriel- le præsekvenser, som genkendes af pattedyrværtsceller.

Sekvenserne for disse sekretoriske ledere er kendte ligesom egnede kilder til DNA, som koder for disse, hvis man ikke ønsker at syntetisere DNA*en in vitro.

10 De forbindes med DNA, som koder for moden TGF-P, ved restriktionsenzymnedbrydning af DNA'en indeholdende det ønskede signal og præTGF-P-DNA' en. Der fremstilles syntetiske oligonucleotider for at indføre unikke re- I striktionscentre (linkere) og, om nødvendigt, DNA-frag- 15 menter, som behøves til at fuldende en præsekvens og kodeområder for moden TGF-p fjernet under restriktions- enzymnedbrydningen. De syntetiserede linkere og/eller fragmenter ligeres derpå til restriktionsenzymnedbryd- ningsfragmenterne indeholdende erstatningssignalet og H 20 TGF-p-kodeområdet, indsættes i en kloningsvektor, og vektoren anvendes til at transformere bakterielle vær- ter. Mutantpræsekvensen klones derefter ind i en udtryk- kelsesvektor og anvendes til at transformere værtscel-r* ler. Et belysende eksempel under anvendelse af en virus- 25 hylsterprotein-præsekvens er beskrevet nedenfor.

Optimalt forbindes den komplette heterologe præsekvens I med den første codon i TGF-β-ΟΝΑ'en, selv om det er I inden for opfindelsens omfang at forbinde kodesekven- sen for moden TGF-β med den komplette heterologe præ- 30 sekvens plus en kort portion, f.eks. 21·- 45 basepar, I som stammer fra DNA'en, der koder for det modne hete- I rologe protein. Formålet med disse konstruktioner er I at indføre et højeffektivt sekretorisk system i stedet for det postulerede system for præTGF-β. Imidlertid I 35 er det på ingen måde nødvendigt at sercernere TGF-β 15 DK 175412 B1 for at producere det i rekombinant kultur.

Andre deletions-indsætnings-mutanter kan Fremstilles ved at Forbinde modne TGF-p-arter med virale proteiner udtrykt i store intracellulære mængder, f.eks. retro-5 virale kærneproteiner, stort T-antigen fra SV40 og lig nende, eller med immunogene bakterielle proteiner eller polypeptider, såsom kemotaktiske polypeptider, især det kraftigt kemotaktiske tripeptid Met-Leu-Phe-.

Udtrykte mutanter af præTGF-P, moden TGF-P eller frag-10 menter deraf vil udvise aminosyresekvenser, som gradvis afviger fra sekvensen i fig. 1, efterhånden som antallet og omfanget af indsætninger, deletioner og udskiftninger forøges. Denne afvigelse måles som en reduktion i homo-logi mellem præTGF-P og mutanten. Alle proteiner eller 15 polypeptider, som udviser den for TGF-P karakteristiske forankringsuafhængige vækstfremmende·biologiske aktivitet, er omfattet af denne opfindelse, uanset den grad af homologi, som de viser med proteinet i fig. 1. Grunden hertil er, at nogle områder af præTGF-P, f.eks.

20 præsekvensen, let muteres eller endog fuldstændig dele- teres, som i tilfældet af moden TGF-P, og 'denne biologiske aktivitet vil blive bevaret. På den anden side vil deletion af de ni cysteinrester (og ledsagende disul fidbindinger) i det modne TGF-P-molekyle have en 25 væsentlig skadelig virkning på denne biologiske aktivitet, og ville efter al sandsynlighed fuldstændigt ophæve biologisk aktivitet. Desuden kan en udskiftningsmutant udvise fuld vækstfremmende TGF-p-aktivitet og alligevel være mindre homolog, hvis der udskiftes rester indehol-30 dende funktionelt ens aminosyrekæder. Funktionelt ens henfører til dominante egenskaber af sidekæderne, såsom hydrofob, basisk, neutral eller sur, eller forekomst eller fravær af sterisk masse. Således er den grad af homologi, som et givet polypeptid har med præTGF-P,

I DK 175412 B1 I

I 16 I

I ikke hovedmålestokken for dets identitet som TGF-Ø. I

I Imidlertid skal som almen vejledning proteiner eller I

I polypeptider, som har i det mindste nogen fælles biolo- I

I gisk aktivitet med moden TGF-P fra naturlige kilder, I

I 5 og som er i det væsentlige homologe med sekvensen i I

I fig. Ib, f.eks. fra omkring 40 til omkring 100¾ homolog I

I med præTGF-P eller ethvert fragment deraf på over ca. I

I 20 rester, betragtes som faldende inden for omfanget I

I af betegnelsen TGF-P. Med hensyn til neoplastisk celle- I

I 10 vækstinhiberende aktivitet er polypeptider, som tidligere I

I er kendte for at udøve sådan vækstinhiberende aktivitet, I

I f.eks. interferoner, tumornecrosefaktor og lymfotoxin, I

men som ellers ikke nødvendigvis behøver at have homo- I

I loge områder med sekvenserne i fig. Ib, udelukket fra I

I 15 betegnelsen TGF-P. I

I Mere snævre og specifikke faktorer til at fastslå iden- I

titeten af et polypeptid som TGF-p er (a) evnen hos I

I antisera, som er i stand til i det væsentlige at neu- I

I tralisere den vækstinhiberende eller forankringsuafhæn- I

I 20 gige vækstfremmende aktivitet af moden TGF-p, til også I

I i det væsentlige at neutralisere aktiviteten af det I

I pågældende polypeptid, eller (b) evnen hos det pågældende I

I polypeptid til at konkurrere med TGF-P om TGF-P-cel- I

I leoverfladereceptoren. Imidlertid vil det indses, at I

I 25 immunologisk identitet og vækstfremmende identitet ikke I

I nødvendigvis har samme omfang. Et neutraliserende anti- I

I stof for moden TGF-P i fig. Ib behøver ikke at binde I

I et kandidatprotein, fordi det neutraliserende antistof I

I eventuelt ikke er rettet mod et center på TGF-p, som I

I 30 er kritisk for dens vækstfremmende aktivitet. I stedet I

I kan antistoffet binde et uskadeligt område og udøve I

dets neutraliserende virkning ved sterisk hindring. I

I Derfor behøver et kandidatprotein, som er muteret i I

I dette uskadelige område, ikke længere at binde det neu- I

35 traliserende antistof, men det ville ikke desto mindre I

17 DK 175412 B1 være TGF-β, hvad angår væsentlig homologi og biologisk aktivitet.

Det er vigtigt at bemærke, at egenskaber som molekylvægt og lignende for den native eller vild-type modne TGF-p 5 i fig. Ib opnået ud fra placenta eller blodplader kun er beskrivende for de native arter af TGF-β. De heri omhandlede mutanter kan variere betydeligt fra egenskaberne af nativ TGF-P, og dette kan faktisk være formålet med mutagenesen, som nærmere beskrevet nedenfor.

10 Selv om TGF-p som defineret her inkluderer nativ TGF-3, vil andre beslægtede biologisk aktive polypeptider falde inden for definitionen. TGF-p-arter, som de oven for beskrevne indsætningsmutanter, deletionsmutanter eller fusionsproteiner vil bringe mutanten uden for den mole-15 kylvægt, som er fastslået for nativ TGF-P. For eksempel ville fusionsproteiner med moden TGF-β eller præTGF-β selv have en større molekylvægt end nativ, moden TGF-P, medens deletionsmutanter af moden TGF-β vil have en lavere molekylvægt. På lignende måde behandles TGF-β 20 for at indføre glycosyleringscentre, hvilket resulterer i glycosyleret TGF-β, eller for at indføre serin i stedet for cystein ved centre, som ikke er kritiske for biologisk aktivitet. Endelig kan efter-translations-forarbejdning af human præTGF-β i cellelinjer afledt fra ikke-primat-25 pattedyr frembringe mikroheterogenitet i det aminotermi-nale område af moden TGF-P, således at alanin ikke længere vil være den aminoterminale aminosyre.

Bemærk at sprogbrugen "i stand til" at inducere foran-v kringsuafhængig vækst i definitionen af biologisk ak-30 tivitet betyder, at præTGF-β eller fragmenter deraf inkluderer polypeptider, som kan omdannes, f.eks. ved' enzymatisk nedbrydning, til et polypeptidfragment, som udviser den ønskede biologiske aktivitet. Typisk vil inaktive forstadier være fusionsproteiner, hvori moden I DK 175412 B1 I 18

I TGF-β ved hjælp af en peptidbinding ved dens carboxyl- I

terminus er forbundet med et uopløseligt eller gelatinøst I

protein. Sekvensen ved eller inden for området af denne I

peptidbinding vælges således, at den er modtagelig for I 5 proteolytisk hydrolyse, hvorved TGF-β frigives, enten I in vivo til frembringelse in situ eller, som del af en fremstillingsforskrift, in vitro.

Selv om TGF-β almindeligvis betyder human TGF-β, er TGF-β fra kilder som mus, svin, heste eller kvæg, in- 10 kluderet i definitionen af TGF-β, så længe den iøvrigt opfylder de oven for beskrevne standarder for biologisk aktivitet. TGF-β er ikke artsspecifik, f.eks. er både muse- og human TGF-β effektive til fremkaldelse af for- ankringsuafhængig vækst af den samme cellelinje. Der- H 15 for kan TGF-β fra én art anvendes til behandling af en anden art. DNA, som koder for TGF-p’en fra andre arter, opnås ved sondering af cDNA- eller genomiske biblioteker fra sådanne arter med mærket human præTGF-β- I cDNA.

20 Derivater af TGF-β er omfattet af denne opfindelse.

Derivater inkluderer glycosylerede og kovalente eller aggregative konjugater med andre TGF-D-molekyler, di- mere eller ubeslægtede kemiske dele. Kovalente deriva- ter fremstilles ved sammenknytning af funktionelle grup- 25 per med grupper, som findes i TGF-p-aminosyrekæderne eller ved N- eller C-termini, ved kendte metoder inden for faget. Disse derivater kan f.eks. inkludere:-ali- fatiske estere eller amider af carboxylterminus; alkyl- aminer eller rester indeholdende carboxylsidekæder, 30 f.eks. konjugater til alkylaminer ved asparaginsyre- j rester; 0-acyIderivater af hydroxygruppeholdige rester og N-acylderivater af den aminoterminale. aminosyre eller aminogruppeholdige rester, f.eks. konjugater med fMet- I Leu-Phe eller immunogene proteiner. Derivater af acyl- 19 DK 175412 B1 grupperne vælges blandt alkyldele (herunder n-alkyl med 3-10 carbonatomer), hvorved der dannes alkanoyl-derivater, og carbocycliske eller heterocycliske dele, hvorved der dannes aroylderivater. De reaktive grupper 5 er fortrinsvis difunktionelle forbindelser, som i sig selv er kendte til anvendelse ved tværbinding af proteiner til uopløselige matricer via reaktive sidegrupper.

Kovalente eller aggregative derivater er nyttige som reagenser ved immunoprøvning eller til affinitetsrens-10 ningsprocedurer. For eksempel insolubiliseres TGF-0 ved kovalent binding til cyanbromid-aktiveret "Sepha-rose,Ny ved i sig selv kendte metoder eller ved adsorption til polyalkenoverflader (med eller uden glutaral-dehyd-tværbinding) til anvendelse ved prøvning eller 15 rensning af anti-TGF-Ø-antistoffer eller celleoverflade- receptorer. TGF-0 mærkes også med en detekterbar gruppe, idet den f.eks. kan radioioderes ved chloramin-T-pro-ceduren, bindes kovalent til sjælden-jordart-chelater eller konjugeres til en anden fluorescerende del til 20 anvendelse ved diagnostiske prøvninger, især til diagnose af TGF-Ø-niveauer i biologiske prøver ved immunoprøvnin-ger af konkurrencetypen.

Mutant-TGF-0 fremstilles almindeligvis ved de forudbestemte dvs. stedspecifikke metoder. Formålet med 25 mutagenese er at konstruere DNA, som koder for TGF-0 som defineret ovenfor, dvs. TGF-P, som udviser biologisk aktivitet.

Selv om mutationsstedet er forudbestemt, er det ikke nødvendigt, at mutationen i sig selv er forudbestemt.

30 For at optimere mutanternes funktion i en given position gennemføres for eksempel tilfældig mutagenese ved målcodo-nen, og de udtrykte TGF-Ø-mutanter sigtes for optimal aktivitet. Teknikker til en frembringelse af udskift- I DK 175412 B1

I 20 I

B ningsmutationer ved forudbestemte steder i DNA med en I

B kendt sekvens er velkendte, f.eks. M13 startkædemuta- I

genese. I

TGF-p-mutagenese gennemføres ved foretagelse af amino- I

5 syreindsætninger, sædvanligvis af størrelsesordenen 1-5 aminosyrerester, eller deletioner af størrelses- B ordenen 1-10 rester. Udskiftninger, deletioner, indsæt- ninger eller enhver underkombination kan kombineres til opnåelse af en endelig konstruktion. Som bemærket 10 ovenfor inkluderer indsætninger amino- eller carboxyl- terminale fusioner, f.eks. med et hydrofobt eller immu- B nogent protein. Mutationerne i DNA'en, som koder for B sådanne mutationer, må ikke til sidst bringe sekvensen B ud af aflæsningsramme i en udtrykkelsesvektor, hvorved B 15 det resulterende protein ikke vil blive biologisk aktiv B TGF-Ø. Mutationerne må fortrinsvis heller ikke skabe B komplementære områder, som kunne frembringe transla- B tionsundertrykkende sekundær mRNA-struktur.

B DNA, som koder for TGF-Ø, opnås ved kemisk syntese, B 20 ved sigtning af reverse transkripter af mRNA fra pla- B centa eller andre celler eller ved sigtning af genomiske B biblioteker fra eukaryotiske celler. Denne DNA behøver B ikke at anvende de codoner, som er angivet i fig. Ib, B så længe værtscellen genkender de codoner, som anvendes.

B 25 DNA af denne art fremstilles let in vitro som DNA’en B i fig. Ib. Nyttige herved er også nucleinsyrer, enten B RNA eller DNA, som ikke koder for TGF-Ø som defineret B her, men som ikke desto mindre er i stand til at hybri- I disere med sådan DNA eller RNA. Ikke-kodende, men hy- I 30 bridiserende nucleinsyre er, selv om den ikke anvendes I ved den rekombinante syntese af TGF-Ø, nyttig som mel-’ I lemprodukt til fremstilling af mærkede sonder ved diag-

nostiske prøvninger for TGF-Ø-mRNA eller genomisk DNA

I i prøveceller.

21 DK 175412 B1

Diagnostisk nucleinsyre mærkes kovalent med et detek-terbart stof, såsom en fluorescerende gruppe, et radioaktivt atom eller en kemiluminescensgruppe ved i sig selv kendte metoder. Den anvendes derpå ved konventio-5 nelle Southern- eller Northern-hybridiseringsprøvnin- ger. Sådanne prøvninger anvendes til identifikation af TGF-P-vektorer og transformanter som beskrevet i de nedenstående eksempler, eller til in vitro diagnose, såsom detektion af TGF-p-mRNA i væv som et mål for mitogen 10 aktivitet.

TGF-p syntetiseres ifølge denne beskrivelse i værtsceller transformeret med vektorer indeholdende DNA, som koder for TGF-P. En vektor er en replicerbar nucle-insyrekonstruktion. Vektorer anvendes enten til at formere 15 og/eller til at udtrykke DNA, som koder for TGF-P, eller til at formere DNA, som hybridiserer med DNA eller RNA, som koder for TGF-p. En udtrykkelsesvektor er en replicerbar DNA-konstruktion, hvori en DNA-sekvens, som koder for TGF-P er operabelt forbundet med egnede styresekven-20 ser, som er i stand til at frembringe udtrykkeisen af TGF-P i en egnet vært. Sådanne styresekvenser inkluderer en transkriptionspromotor, en eventuel operatorsekvens til at styre transkriptionen, en sekvens, som koder for egnede mRNA-ribosom-bindingscentre, og se-25 kvenser, som styrer afslutningen af transkription og translation. Til udtrykkelse af TGF-P i eukaryotiske celler bør vektoren også inkludere DNA, som koder for et selektionsgen. Imidlertid kan selektionsgenet leveres af et uforbundet plasmid i cotransformation. 1

Vektorer omfatter plasmider, virus (herunder fager) og integrerbare DNA-fragmenter, dvs. fragmenter, som kan integreres i værtsgenomet ved rekombination. I den foreliggende beskrivelse er vektoren et plasmid i den forstand, at den klones i bakterieceller, men den inte- I DK 175412 B1

I 22 I

greres i værtscellegenomet efter cotransformation. Imid- I

H lertid er alle andre former for vektorer, som har en I

H ækvivalent funktion, og som er eller vil blive kendte I

inden for faget, egnede til anvendelse ifølge denne I

5 beskrivelse. Egnede vektorer vil indeholde replicon I

dg styresekvenser, som er afledt fra arter, der er kom- I

patible med den påtænkte udtrykkelsesvært. I

DNA-områder er operabelt forbundne, når de står i funk- I

tionelt forhold til hinanden. For eksempel er DNA for I

10 en præsekvens eller sekretorisk leder operabelt for- I

bundet med DNA for et polypeptid, hvis den udtrykkes I

som et præprotein, der deltager i sekretionen af poly- I

peptidet; en promotor er operabelt forbundet med en I

kodesekvens, hvis den styrer transkriptionen af sekvensen; I

15 eller et ribosombindingscenter er operabelt forbundet I

med en kodesekvens, hvis det er anbragt således, at I

H det tillader translation. Almindeligvis betyder "ope- I

rabelt forbundet" ud i ét og, i tilfælde af sekretoris- ke ledere, ud i ét og i aflæsningsfase.

20 Kulturer af celler afledt fra flercellede organismer

er de foretrukne værtsceller i denne beskrivelse. I

princippet er enhver højere eukaryotisk cellekultur brugbar, hvad enten den er fra hvirveldyr- eller ikke- I hvirveldyr-kultur. Imidlertid har interessen været størst 25 for hvirveldyrceller, og formering af hvirveldyrceller i kultur er blevet en rutineprocedure i de seneste år I [Tissue Culture, Academic Press, Kruse and Patterson, editors (1973)]. Eksempler på nyttige værtscellelinjer I er VERO- og HeLa-celler, kinesisk-hamster-ovarie- (CHO)- I 30 cellelinjer og WI38-, C0S-7- og MDCK-cellelinjer.

I Mange eukaryotiske celler vides at syntetisere endogen I TGF-p. Således syntetiserer mange potentielle værtscel- I ler TGF-P af værtsarten. Denne TGF-β er derfor til stede 23 DK 175412 B1 i den TGF — P, som produceres ved transkription og translation af den transformerede DNA.. F.eks. er hamster-TGF-β til stede i human-TGF-P-transformerede CHO-celler, og er således til stede i celleekstrakter indeholdende 5 human TGF-P indhøstet fra sådanne celler. Selv om dette ikke nødvendigvis er en ulempe, fordi dyre- og human-TGF-p er aktive krydsningsarter, ville det være ønskeligt at producere human TGF-p, der indeholder så lidt af dyremateri alet som muligt. Dette gennemføres ved (a) 10 at vælge værtsdyrcellelinjer, der syntetiserer så lidt af dyre-TGF-p'en som muligt, (b) at transformere dyrecellelinjen med en vektor for højeffektiv TGF-P-sekretion (beskrevet ovenfor) og udvinde human TGF-P fra dyrkningsmediet eller (c) at transformere en human celle-15 linje, hvorved enhver endogen hTGF-β vil være et til skud snarere end en forurening.

Udtrykkelsesvektorer for sådanne celler inkluderer almindeligvis et repliceringsorigin (til ekstrakromoso-mal formering), en promotor lokaliseret oven for TGF-20 P-kodesekvenserne, sammen med et ribosombindingscen ter, RNA-splejsningscenter (hvis der anvendes intron-holdig TGF-p-kodende genomisk DNA), et polyadenylerings-center og en transkriptionsafslutningssekvens.

Transkriptions- og translations-styresekvenserne i ud-25 trykkelsesvektorer, som skal anvendes til transforma tion af hvirveldyrceller, tilvejebringes fortrinsvis fra virale kilder. For eksempel afledes almindeligt anvendte promotorer fra polyoma, Adenovirus 2 og, mest foretrukkent, abevirus 40 (SV40). Den tidlige og den 30 sene promotor fra SV40 er særligt nyttige, fordi begge opnås nemt fra viruset som et fragment, der også indeholder det SV40-virale repliceringsorigin (Fiers et al., 1978, "Nature'*, 273: 113). Mindre eller større I DK 175412 B1 I 24 SV-fragmenter kan også anvendes, forudsat at sekvensen på omkring 250 bp, som strækker sig fra Hindi 11-centret I hen imod Bgll-centret i det virale repliceringsorigin, også er inkluderet. Endvidere er det også muligt at I 5 udnytte de humane TGF-p-genomiske promotor-, styre- og/eller signalsekvenser, der normalt er forbundet med TGF-β, forudsat at sådanne styresekvenser er kompatible med og genkendes af værtscellen.

Et repliceringsorigin kan enten tilvejebringes ved kon- 10 struktion af vektoren, så den inkluderer et exogent origin, som f.eks. kan afledes fra SV40 eller en anden viral (f.eks. Polyoma, Adenovirus, VSV eller BPV) kil- de, eller det kan tilvejebringes af værtscellens kromo- I somale repliceringsmekanisme. Hvis vektoren integreres 15 i værtscellekromosomet, er det sidstnævnte ofte til- strækkeligt.

I Fremfor at anvende vektorer, som indeholder virale re- pliceringsoriginer, kan man anvende cotransformation af pattedyrceller med en selekterbar markør og TGF-β- 20 DNA'en. Et eksempel på en egnet selekterbar markør er dihydrofolatreductase (DHFR) eller thymidinkinase. Så- danne markører er proteiner, almindeligvis enzymer, som muliggør identifikation af trans formante celler, dvs. celler, som havde været kompetente til at optage I 25 exogen DNA. Almindeligvis sker identifikationen ved I overlevelse af transformanter i et dyrkningsmedium, I som er toksisk, eller hvorfra cellerne ikke kan opnå I kritisk næring, hvis ikke de har optaget markørproteinet.

I Ved udvælgelse af en foretrukken værtspattedyrcelle I 30 til transkription med vektorer, som omfatter DNA-se- kvenser, der koder for både TGF-0 og DHFR, er det pas-’ I sende at vælge værten ifølge den anvendte type DHFR-pro- I tein. Hvis der anvendes vild-type-DHFR-protein, må det 25 DK 175412 B1 foretrækkes at vælge en værtscelle, som er deficient med hensyn til DHFR, hvilket muliggør anvendelsen af DHFR-kodesekvensen som markør for heldig transfektion i et selektivt medium, der mangler hypoxanthin, glycin 5 og thymidin. En passende værtscelle i dette tilfælde er den m.h.t. DHFR-aktivitet deficiente kinesisk-hams-ter-ovarie-(CHO)-cellelinje, der fremstilles og formeres som beskrevet af Urlaub and Chasin, 1980, "Proc.

Na ti. Acad. Sci." (USA) 77: 4216.

10 Hvis der på den anden side anvendes DNA, som koder for OHFR-protein med lav bindingsaffinitet til methotrexat (MTX), som den styrende sekvens, er det ikke nødvendigt at anvende DHFR-resistente celler. Da den mutante DHFR er resistent over for MTX, kan MTX-holdige medier 15 anvendes som middel til selektion, forudsat at værts cellerne selv er MTX-sensitive. De fleste eukaryotiske celler, som er i stand til at absorbere MTX, synes at være methotrexatsensiti ve. En sådan nyttig cellelinje er en CH0- linje, CH0-K1 (ATCC No. CCL 61)v.

20 Andre metoder, som kan tilpasses syntesen af TGF-β i rekombinant hvirveldyrcellekultur, er beskrevet i M-J.

Gething et al., ’’Nature'' 293: 620-625 ( 1981); N. Man-tei et al., "Nature" 281: 40-46; A. Levinson et al., EP 117 060 A og 117 058 A. 1 2 3 4 5 6 TGF-β udvindes fra lyserede, transformerede celler, 2 og uopløselige cellerester skilles fra ved centrifu 3 gering. Alternativt skilles kultursupernatanter fra 4 transformerede celler, der secernerer TGF-β, simpelthen 5 fra cellerne ved centrifugering. Derpå renses TGF-β 6 almindeligvis ved kendte metoder^' ^^ under anven- : delse af gel filtrering i nærvær af syre efterfulgt af HPLC og eluering på en acetonitrilgradient. Sådanne I DK 175412 B1 H metoder er ikke nødvendigvis af samme omfang som den rensning, der kræves for et terapeutisk produkt. Som H et yderligere eller alternativt rensningstrin opvar- mes cellelysater eller supernatanter i et tidsrum og 5 til en temperatur, som er tilstrækkelig til at dena- turere og udfælde forurenende proteiner, men ikke TGF-P; TGF-β er et bemærkelsesværdigt varmestabilt protein, H miske som resultat af udstrakt dannelse af disulfid- H bindinger. Som følge heraf bør opvarmningen gennemfø- 10 res i et medium, der indeholder lave mængder af disul- fidreagenser, såsom dithiotreitol eller lignende. Op- varmningen kombineres også med syrning, da TGF-P vi- des at være stabil over for 1 M eddikesyre.

H Moden nativ TGF-0 er ikke glycosyleret. Derfor adskil- 15 les den fra eventuelle resterende forurenende varme- H og syrestabile glycoproteiner ved adsorption af gly- coproteinerne på lectinsøjler, såsom 1 inselectinfor-'.

I bundet "SepharoseDette trin kan, mindre ønskeligt, H gå forud for varme- og syrebehandlingen. TGF-p vil elu- 20 eres med den uadsorberede fraktion.

Hvis der ønskes højrent produkt, underkastes den rå H eller delvis rensede blanding derefter chromatofokuse- ring.

TGF-p præpareres til indgivning ved blanding af TGF-P

25 i den ønskede renhedsgrad med fysiologisk acceptable bærere, dvs. bærere, som er ikke-toxiske for recipien- ter i de anvendte doseringer og koncentrationer. Al mindeligvis vil dette indebære kombination af TGF-β med puffere, antioxidanter, såsom ascorbinsyre, poly- 30 peptider med lav molekylvægt (mindre end ca. 10 rester), proteiner, aminosyrer, carbonhydrater, herunder glucose eller dextriner, chelateringsmidler, såsom EDTA, 27 DK 175412 B1 og andre excipienter. TGF-β til anvendelse ved terapeutisk indgivning må være steril. Dette opnås let ved filtrering igennem steril filtreringsmembraner (0,2 ^um).

TGF-β vil almindeligvis blive opbevaret som en vandig 5 opløsning, da den er højstabil over for termisk og oxi- dativ denaturering.

Der er blevet overvejet to typer anvendelser af TGF-β-prsparater.

Den første og foretrukne anvendelse er topisk til fremme 10 af overfladesårheling. Der er ingen begrænsninger med hensyn til typen af sår eller andet trauma, som kan behandles, og disse inkluderer (men er ikke begrænset til): første, anden og tredje grads forbrændinger (især anden og tredje grads); epidermale og interne kirurgiske 15 snit, herunder sådanne ved kosmetisk kirurgi; sår, her under rifter, snit og stik; og overfladeulcera, herunder decubitale (liggesår), diabetiske, dentale, hæmophilia-le og varikøse.

TGF-P-præparater påføres forbrændinger i form af et 20 sterilt irrigabile, fortrinsvis i kombination med en fysiologisk saltopløsning, eller i form af salver eller suspensioner, fortrinsvis i kombination med renset collagen. Præparaterne kan også være imprægneret i trans-dermale lapper, plastere og bandager, fortrinsvis i 25 flydende eller halvflydende form. Antimikrobielle mid ler, såsom sølvsulfadiazin, bør inkluderes i sådanne genstande eller præparater. Debridementsmidler, såsom proteolytiske enzymer, kan også inkluderes, hvis de ikke hydrolyserer TGF-β, eller der anvendes en hydro-30 lyseresistent TGF-P-mutant.

Den anden anvendelse er systemisk indgivning til heling I DK 175412 B1 I 28

af indre sår og lignende traumer. En sådan anvendelse I

er nyttig, forudsat at der er ingen eller kun begræn- I

sede uønskelige bivirkninger, såsom stimulering af neo- plastisk cellevækst hos patienter med cancer. TGF-P- 5 præparater til systemisk indgivning sammensættes fortrins- vis som sterile isotoniske parenterale injektioner eller infusioner.

H TGF-β kombineres eventuelt med aktiveringsmidler, såsom TGF-α, EGF eller andre vækstfaktorer. Mængden af akti- 10 veringsmiddel afhænger direkte af den mængde TGF-P, som er til stede i de aktiverede præparater, som indgives H til modtageren.

Den mængde aktiveret præparat, som skal anvendes, vil variere med de valgte vækstfaktorer og patientens kliniske 15 tilstand.

Imidlertid kan det almindeligvis fastslås, at TGF-P

fortrinsvis bør være til stede i en mængde på mindst ca. 1,0 ng/ml kombineret præparat, mere foretrukkent i en mængde på op til ca. 1,0 rag/ml. Da TGF-P-præparater ]

20 både provokerer og opretholder celleregeneration, indi- I

ceres en kontinuert indgivning eller periodisk genind- H givning.

For at simplificere eksemplerne vil visse hyppigt fore- I kommende procedurer blive angivet ved korte betegnelser.

25 Plasmider betegnes med et lille p med store bogstaver I og/eller tal før eller efter. De i denne beskrivelse I angivne udgangsplasmider er kommercielt tilgængelige eller er offentligt tilgængelige uden restriktioner I eller kan konstrueres ud fra sådanne tilgængelige plas- 30 mider i overensstemmelse med publicerede procedurer.

I Desuden kendes andre ækvivalente plasmider inden for 29 DK 175412 B1 faget og vil være nærliggende for den almindelige fagmand.

"Nedbrydning" af DNA henfører til katalytisk spaltning af DNA'en med et enzym, som kun virker på visse lokali-5 teter i DNA'en. Sådanne enzymer kaldes restriktionsen zymer, og de centre, for hvilke hvert enzym er specifikt, kaldes restriktionscentre. De forskellige restriktionsenzymer, der er anvendt ifølge denne beskrivelse, er kommercielt tilgængelige, og der anvendtes de reaktions-10 betingelser, cofaktorer og andre krav, som var fastlagt af enzymleverandøren. Restriktionsenzymer betegnes almindeligvis ved forkortelser sammensat af et stort bogstav efterfulgt af andre bogstaver repræsenterende den mikroorganisme, hvorfra hver restriktionsenzym oprindeligt·' 15 blev opnået, og derpå et tal, som betegner det bestemte enzym. I almindelighed anvendes omkring 1 yug plasmid eller DNA-fragment med omkring 2 enheder enzym i omkring 20 yul pufferopløsning. Passende puffere og substrat-mængder for bestemte restriktionsenzymer er specificeret 20 af producenten. Almindeligvis anvendes inkubationstider på omkring 1 time ved 37 °C, men de kan variere i overensstemmelse med leverandørens instruktioner. Efter inkubationen fjernes protein ved ekstraktion med phenol og chloroform, og den nedbrudte nucleinsyre udvindes 25 fra den vandige fraktion ved fældning med ethanol. Ned brydning med et restriktionsenzym efterfølges i få tilfælde af hydrolyse af de 5'-terminale phosphater med bakteriel alkalisk phosphatase for at forhindre de to restriktionsspaltede ender af et DNA-fragment i at "cir-30 kularisere" eller danne en lukket løkke, som ville forhindre indsætning af et andet DNA-fragment ved restriktionscentret. Med mindre andet er anført, efterfølges* nedbrydning af plasmider ikke af 5'-terminal dephos-phorylering. Procedurer og reagenser til dephosphory-35 lering er konventionelle (T. Maniatis et al., 1982, I DK 175412 B1 I 30

Molecular Cloning, side 133 - 134).

H "Udvinding" eller "isolation" af et givet fragment af DNA fra en restriktionsnedbrydning betyder adskillelse af nedbrydningsblandingen .på polyacrylamid- eller agarose- 5 gel ved elektroforese, identifikation af fragmentet af interesse ved sammenligning af dets mobilitet med mobiliteten af markør-DNA-fragmenter med kendt molekyl- vægt, fjernelse af gelsektionen indeholdende det ønskede fragment og adskillelse af gelen fra DNA. Denne proce- 10 dure er alment kendt; se f.eks. R. Lawn et al., 1981, "Nucleic Acids.Res." 9: 6103 - 6114, og D. Goeddel et al., 1980, "Nucleic Acids Res." 8: 4057.

"Southern-analyse" er en metode, hvorved tilstedeværelsen af DNA-sekvenser i en nedbrydningsblanding eller DNA- 15 holdig sammensætning bekræftes ved hybridisering til et kendt mærket oligonucleotid eller DNA-fragment. Til de her angivne formål skal "Southern-analyse", med mindre andet er anført, betyde adskillelse af nedbrydningsblan- dinger på 1 fe agarose, denaturering og overførsel til 20 nitrocellulose ved den metode, der er beskrevet af E.

I Southern, 1975, "J. Mol. Biol." 98: 503 - 517, og hybri- I disering som beskrevet af T. Maniatis et al., 1978, I "Cell" 15: 687 - 701.

"Transformation" betyder indførelse af DNA i en organis- 25 me, således at DNA'en er replicerbar, enten som ekstra- kromosomalt element eller som kromosomal integrant.

Med mindre andet er anført, er den fremgangsmåde, der I anvendes i denne beskrivelse til transformation af E.

coli, den CaCl^-metode, som er beskrevet af Mandel et I 30 al., 1970, "3. Mol. Biol." 53: 154.

I "Ligering" henfører til fremgangsmåden til dannelse af phosphodiesterbindinger mellem to dubbeltstrengede 31 DK 175412 B1 nucle insyrefragmenter (T. Maniatis et al., Id., side 146). Med mindre andet er anført, kan ligering gennemføres under anvendelse af kendte puffere og betingelser med 10 enheder T4-DNA-ligase {"ligase") pr. 0,3 ^ug 5 af tilnærmelsesvis ækvimolære mængder af de DNA-fragmen- ter, som skal ligeres.

"Præparation" af DNA fra transformanter betyder isolering af plasmid-DNA fra mikrobiel kultur. Med mindre andet er anført, kan den af Maniatis et al., Id. side 90.

10 beskrevne alkali/SD5-metode anvendes.

"Oligonucleotider" er korte enkelt- eller dobbeltstrengede polydeoxynucleotider, som syntetiseres kemisk ved kendte metoder og derpå renses på polyacrylamidgeler.

Alle litteraturhenvisninger betragtes udtrykkeligt som 15 inkorporeret i denne beskrivelse ved henvisningen.

EKSEMPEL 1

Rensninq og sekvensanalyse af human TGF-β

Den kendte rensningsmetode ifølge Assoian et al.*^ blev opskaleret og modificeret til opnåelse af tilstrække-20 ligt homogen ren human TGF-β til aminosyresekvensbestem melse. 250 enheder af humane blodplader blev ekstraheret i en Waring-blender med 1 liter syre-ethanol. Tilsætning af 4 liter ether gav anledning til et bundfald, som blev opsamlet ved vakuumfiltrering over Whatman nr.

25 - 1 papir. Bundfaldet blev opløst natten over i 50 ml 1 M eddikesyre og renset ved gelfiltrering på en "Biogel P-60" søjle (10 x 100 cm) ækvilibreret i 1 M eddikesyre. Fraktionerne indeholdende TGF-β blev identificeret ved analytisk SDS-polyacrylamidgel-elektroforese 30 og bioprøvning . Maksimumsfraktioner blev hældt sammen, I DK 175412 B1

I 32 I

I frysetørret og genopløst i 20 ml 1 M eddikesyre, 8 Μ I

urinstof. Efterfølgende gelfiltrering over en "8iogel I

I P-60" søjle (5 x 90 cm) i 1 M eddikesyre, 8 M urinstof I

I gav omkring 50 % ren TGF-P. Disse maksimumsfraktioner I

5 blev derpå fortyndet med 1 volumen vand og påført en I

I halvpræparativ RPP C^g (Synchropak) HPLC-søjle i 0,1 % I

I tri fluoreddikesyre og elueret med en 20 - 50 % acetoni- I

I trilgradient. Den således opnåede TGF-β blev kvantiseret I

ved aminosyreanalyse, hvilket viste et udbytte på omkring I

H 10 0,5 mg pr. præparation. Denaturerende SDS-polyacrylamid- I

gel-elektroforese blev gennemført som beskrevet6 . I I

overensstemmelse med tidligere arbejde vandrede den I

H ikke-reducerede TGF-P som et 25 kD protein i en SDS-poly- I

H acrylamidgel, medens reduktion med p-mercaptoethanol I

H 15 omdannede den til et molekyle på 12,5 kD. Dette tyder I

på, at TGF-P består af to 12,5 kD polypeptidkæder forbun- I

I det af intermolekylære disulfidbroer33.

For at opnå proteinsekvensinformation blev den rensede TGF-P reduceret, alkyleret og underkastet aminoterminal

20 sekvensanalyse. 1,2 nmol TGF-P blev dialyseret i 8 M

urinstof og reduceret ved inkubation i 0,1 M "Tris"-HCl I (pH 8,5), 10 mM dithiothreitol, 8 M urinstof. Efterføl- I gende alkylering fandt sted i nærvær af 50 mM iodacetat ved stuetemperatur i mørke. Denne reaktion blev afsluttet I 25 efter 50 minutter ved tilsætning af et overskud af p-

I mercaptoethanol og dialyse. 0,7 nmol af denne TGF-P

I blev anvendt til direkte N^-terminal sekvensanalyse.

1,2 nmol reduceret og alkyleret TGF-β blev nedbrudt I i 0,75 M urinstof, 50 mM NH^HCO,, 5 mM dithiothreitol I 30 i 24 timer med 1 % clostripain1 . Yderligere 1 % clostri- I pain tilsattes efter 12 timers reaktionstid. Reaktions- j I produkterne blev adskilt på en "Synchropak RPP C^g" I revers-fase-søjle (4,6 x 250 mm) med en 0 - 70 % aceto- I nitrilgradient i 0,1 % trifluoreddikesyre. Sekvensbe- 35 stemmelse fandt sted under anvendelse af enten en stærkt 33 DK 175412 B1 modificeret "Beckman 890C spinning cup sequencer"^ eller en dampfase-sequencer som beskrevet af Hewick et al. (Applied Biosystems, model 470A), med aminosyre-derivat-identifikation ved revers-fase-HPLC på en "Rainin 5 Microsorb C-8"· sejle. Aminosyresekvensen af flere pep tider blev bestemt. Et af disse fragmenter var det Nl·^-terminale segment, medens et andet stort peptid gav en sekvens på 37 aminosyrer, som overlappede den Nl^-ter-minale sekvens og fastslog 60 rester af sammenhængende 10 sekvens.

Umodificeret TGF-β blev også behandlet med CNBr. Spaltning ved methioninresten resulterede i fuldstændigt tab af. biologisk aktivitet, hvilket dokumenterede, at mindst en del af dette C-terminale octapeptid er nødven-15 dig for biologisk aktivitet (data ikke vist).

EKSEMPEL 2

Isolering af en TGF-P-exon

Den procedure, som blev fulgt til identifikation af nucleotidsekvensen, som koder for TGF-β, var mage til 20 den strategi, som blev anvendt tidligere for TGF-oJ.

Lange oligonucleotider udformet på basis af den delvise proteinsekvens blev anvendt som hybridiseringssonder til identifikation af en TGF-Ø-exon i et humant genomisk DNA-bibliotek. TGF-Ø-exonen blev derpå anvendt som sonde 25 til isolering af TGF-P-cDNA'er.

To 44-baser lange deoxyoligonucleotider, ØLP1 og ØLP2, komplementære til sekvenser, som koder for aminosyrerne henholdsvis 3 - 17 og 30 -.44, blev syntetiseret kemisk0 * . Valget af nucleotidsekvens var baseret på 30 den codontilbøjelighed, som iagttages i humane mRNA'er

CpG-dinucleotider, som er relativt sjældne i hvirvel- 26 I DK 175412 B1 I 34

H 27 I

dyr-DNA , blev undgået, hvor det var muligt. Desuden syntetiseredes 16 14-mere, som er komplementære til alle mulige codoner for aminosyrerne 13 - 17. Disse deoxyoligonucleotider og den tilsvarende aminosyresekvens H 5 er vist nedenfor.

NH2-AlaLeuAspThrAsnTyrCysPheSerSerThrGluLysAsnCysCysValArgGluLeuTyr CTGTGGTTGATAACGAAGAGGAGGTGTCTCTTCTTGACGACGCA 5’

I TTCTTGACGACGCA

T A A A

H LeuGlyTrpLysTrpIleHisGluProLysGlyTyrHi sAl aAsnPheCysLeuGlyProCysProTyr I ACCTTCACCTAGGTACTCGGTTTCCCGATAGTACGGTTGAAGAC 5'

Nucleotiderne mærket med en prik er rester, for hvilke der ikke er nogen usikkerhed i codonen.

H 2 Θ

Et humant genomisk DNA-bibliotek blev sigtet under lav-stringens-hybridiseringsbetingelser under anvendel- H 32 5 10 se af P-mærket PLP-1 som sonde. Omkring 7,5 x 10 rekombinante fager fra et humant genomisk føtal-lever- H 28 bibliotek blev hybridiseret under anvendelse af lav- ^1 65 32 stringens-betingelser med den P-mærkede 44-mer·.PLP-1

I efter replicaudpladning på nitrocellulosefiltre^. DNA

15 blev præpareret fra 58 af de hybridiserende fager og 32 hybridiseret med de P-mærkede PLP-1- pLP-2-oligonuc- I leotider under anvendelse af "prikdupnings"-analyseme-

I 67 6B

toden og Southern-hybridisering af BamHI-nedbryd- ningsblandinger. De to fag-DNA'er, som hybridiserede 20 med begge oligonucleotider, blev nedbrudt og sonderet I 32 med puljen af P-mærkede 14-mere igen ved Southern-hy- I bridisering. 14-mer-hybridiseringer blev gennemført I ved 37 °C i 6 X S5C, 0,5 % NP40, 6 mM EDTA, IX Denhart’s I opløsning og 50 ^ug/ml laksesperm-DNA. Flere vaskninger ) 35 DK 175412 B1 blev gennemført ved stuetemperatur i 6xSSC før autoradiografi. DNA fra fag βλ58 hybridiserede med oligonucleo-tiderne βίΡ-Ι, PLP-2 og med 14-mer-puljen. Sekvenserne, som hybridiserede til ØLP-2 og 14-merene blev lokalise-5 ret i det samme 4,2 kbp BamHI-fragment, medens sonden PLP-l hybridiserede til et 20 kbp BamHI-fragment. De hybridiserende BamHI-fragmenter blev subklonet i pBR322. Nucleotidsekvensen af mindre hybridiserende fragmenter 69 blev bestemt ved dideoxynucleotid-kædeafslutningsmetoden 10 efter subkloning i M13-derivater^.

Sigtningen af det genomiske DNA-bibliotek resulterede i isoleringen af en exon, som kodede for kun en del af TGF-P-kodesekvensen (resterne 10 - 60, fig. 3). For at opnå hele TGF-P-kodesekvensen blev denne exon anvendt 15 som sonde til at sigte et TlgtlO-baseret cDNA-bibliotek afledt fra human udløbsplacenta mRNA.

EKSEMPEL 3

Isolering af TGF-P-cDNA'er

Total RNA blev ekstraheret^ fra de forskellige celle- 20 kilder, og den polyadenylerede mRNA-fraktion blev isole- 72 ret ved oligo(dT)-cellulose-chromatografi . cDNA'en 73 blev præpareret ved start med dT^ eller deoxy- oligonucleotidet ACACGGGTTCAGGTAC (komplementært til

nucleotiderne 1270 - 1286). Den dobbeltstrengede cDNA

25 blev behandlet med nuclease SI (Miles Laboratories) efterfulgt af E. coli DNA-polymerase I, Klenow-fragment, (Boehringer Mannheim) og subklonet i EcoRI-spaltet 7gtl0 74 som beskrevet , undtagen at der anvendtes asymmetriske EcoRI-linkere^, hvorved man undgik behovet for EcoRI-me-30 thylase-behandlingen. Den rekombinante fag blev udpladet på E. coli C600 Hfl og replicaudpladet på nitrocellu-losefiltre^. Disse blev hybridiseret med ^P-mærkede^ ---— , d I DK 175412 B1 36 H specifikke restriktionsfragmenter v/ed 42 "C i 50 % forma- mid, 5x SSC, 50 mM natriumphosphat pH 6,8, 0,1 % natrium- pyrophosphat, 5x Denhardt's opløsning, 50 ^ug/ml lakse- sperm-DNA og vasket i 0,2x SSC, 0,1 % SOS ved den samme I 5 temperatur. Lav-stringens-hybridiseringsbetingelser^ I 32 blev anvendt i tilfælde af de P-mærkede deoxyoligo- nucleotider. Nucleotidsekvensen af TGF-P-cDNA-restrik- tionsfragmenterne blev bestemt ved dideoxyoligonucleo- 69 tid-kædeafslutnings-metoden efter subkloning i M13-fag- I 10 derivater^. De opnåede cDNA'er er skematisk vist i fig. la. "λβ01 blev isoleret fra et humant placenta-cDNA- H bibliotek under anvendelse af den genomiske exon (fig.

H 3) som sonde. Sigtningen af omkring 750 000 oligo-dT- startede placenta-cDNA-kloner resulterede i isoleringen

15 af en TGF-P-cDNA (¾ ØC1) på omkring 1050 bp. Den tidligere I

bestemte delvise TGF-P-sekvens fastslog aflæsningsrammen og afslørede sekvensen, som koder for det komplette TGF-P-polypeptid. Denne sekvens begynder med den terminale alaninrest og efterfølges 112 codoner senere H 20 af en stopcodon, kun 20 basepar fra 3'-enden. "^UC-EcoRI- cDNA-indsætningen blev på sin side anvendt til at sigte H A172-glioblastoma-cDNA-biblioteket, hvilket førte til isoleringen af 71BC3.19. Sigtning af et specifikt startet I 32 HT1080-fibrosarcoma-cDNA-bibliotek med det P-mærkede I 25 KpnI-Kpnl- og ovenfor beliggende EcoRI-KpnI-fragment I af ^PC3.19-cDNA-indsætningen gav ^PC4.10, 6.33 og 6.37.

Et andet lignende bibliotek blev sigtet med ^ØC4.33-ind- I sætningen og en syntetisk 40-mer svarende til nucleoti- derne 1-40, hvilket førte til isoleringen af /lpC5.7b. 1 30 Ingen af de mere end 70 TGF-B-cDNA'er isoleret fra for- I skellige oligo(dT)-startede cDNA-biblioteker indeholdt mere end nogle få nucleotider af 3'-utranslaterede om-' I råder, og den 3'-utranslaterede sekvens blev bestemt I under anvendelse af klonet genomisk DNA. Hybridiserings- 35 analyse viste, at 3'-enden af ^PCl-cDNA-indsætningen 37 DK 175412 B1 var til stede i den genomisk-DNA-holdige fag P^58. DNA-sekvensanalyse afslørede tilstedeværelsen af en exon, som·.kodede for den carboxylterminale del af TGF-β, efterfulgt af stopcodonen og den 31-utranslaterede ende 3 (fig. Ib). En AATAAA-hexanucleotid-sekvens blev mødt 300 bp nedad fra afslutningscodonen, hvilket muliggjorde en tilskrivning af det formodede polyadenylerings-center. Under antagelse af at dette faktisk er poly-adenyleringssignalet, er den udregnede størrelse af 10 TGF-p-mRNA i nær overensstemmelse med længden på 2,3 - 2,5 kb, som blev bestemt ud fra Northern-hybridiserings-forsøg (eksempel 4). Yderligere sigtning af oligo(dT)-startede placenta- og HT1080-cDNA-biblioteker under anvendelse af den genomiske DNA-sonde for den 3’-utrans-15 laterede ende identificerede ikke en eneste hybridise- rende cDNA-fag.

EKSEMPEL 4

Diagnostisk metode under anvendelse af TGF-P-cDNA-sonder

Polyadenyleret RNA blev udvundet fra hepatoma HEP-G2, 20 Wilms tumor TuWi, glioblastoma A172, blærecarcinoma T24, skællet epidermoidcarcinoma A431, brystcarcinoma MCF-7, nasopharyngealt carcinoma KB, fibrosarcoma HT1080, Burkitt lymphoma B-lymphoblaster Daudi og Raji, T-lym-phoblast Molt-4. Perifere blodlymphocytter blev fremstil-25 let og mitogen-induceret med staphylococ-enterotoxin B og phorbolmyristat som beskrevet . RNA blev indhøstet i dette tilfælde efter 24 timer. 4 ^ug polyadenyleret mRNA blev underkastet elektroforese i formaldehyd/1,2 % 29 30 agarosegel og duppet på nitrocellulosefiltre . Den 2 2 76 30 P-mærkede EcoRI-cDNA-indsætning fra 3PC1 blev anvéndt som sonde under de ovenfor anvendte høj-stringens-betin-gelser. Sammenligning med positionen af 28S- og 18S-rRNA'en på gelen antyder en længde på 2,3 - 2,5 kb for

I DK 175412 B1 I

I .38 I

TGF-β-mRNA'en . I nogle tilfælde kan en mindre mRNA-art I

H v/ære til stede, selv om delvis nedbrydning af mRNA'en I

ikke kan udelukkes. I

TGF-P-mRNA var detekterbar i alle humane tumorcelle- I

5 linier, inklusive tumorceller af neuroectodermal oprin- I

delse, såsom TuWi (Wilms tumor) og A172 (glioblastoma) I

og'icarcinomacellelinierne T24 (blærecarcinoma), AA31 I

(skællet epidermoidcarcinoma), MCF-7 (brystcarcinoma) I

og KB (nasopharyngealt carcinoma). HT1080, en fibrosar- I

10 coma-afledt cellelinie, som var blevet valgt som kilde I

for mRNA til cDNA-kloningen, indeholdt relativt høje I

niveauer af TGF-P-mRNA. TGF-P-mRNA var ikke kun til I

stede i cellelinier afledt fra faste tumorer af meso-, endo- og ectobl as tisk oprindelse, men var også detek- 15 terbar i tumorcellelinier af hæmatopoietisk oprindelse, f.eks. Daudi (Burkitt lymphoma B-lymphoblast), Raji I (Burkitt lymphoma B-lymphoblast) og Molt-4 (T-celleleu- kæmia). Tilstedeværelsen af TGF-P-mRNA er ikke begrænset til tumorceller, da den er klart detekterbar i placenta- 20 og perifer-blodlymphocyt-(PBL)-mRNA. Slående er det, at niveauet af TGF-P-mRNA er signifikant forhøjet efter mitagen -stimulering af PBL'er. TGF-P-mRNA var ikke detek- terbar i human lever, men var alligevel til stede i HEP-G2 hepatomacellelinien. I alle tilfælde vandrede 25 TGF-p-mRNA som et molekyle med en tilsyneladende længde på 2,3 - 2,5 kilobaser. I nogle tilfælde kan en mindre mRNA-art på omkring 1,8 - 1,9 kb være til stede, selv om dette kunne skyldes delvis nedbrydning af mRNA'en.

I EKSEMPEL 5 I 30 Rekombinant syntese af TGF-β I Plasmidet, som blev anvendt til rekombinant syntese I af TGF-β, var pMBTEé. Det følgende er en forudsagt frem- 39 DK 175412 B1 gangsmåde til fremstilling af dette plasmid som er en fremgangsmådevariant, der foretrækkes frem for den mere komplekse fremgangsmåde, som faktisk blev anvendt til dets konstruktion.

79 5 p342E nedbrydes med EcoRI, afstumpes med E. coli DNA- polymerase I (Klenow-fragment) og de fire dNTP'er, ned-brydes med Sall, og fragment I (indeholdende Amp -genet fra pBR322) udvindes.

p342E nedbrydes samtidigt med Sall og HindHI, og frag-10 mentet, som koder for HBsAg, udvindes som fragment 2.

Endelig nedbrydes SV40-genomet samtidigt med Hindlll og Hindi, og fragmentet på 596 bp indeholdende SV40-originet og den tidlige promotor udvindes som fragment 3.

15 Fragmenterne 1, 2 og 3 ligeres ved en tre-vejs-ligering, og ligeringsblandingen transformeres ind i E. coli stamme 294 (ATCC 31446). Den transformerede kultur udplades på ampicillinmediumplader, og resistente kolonier selekteres. Stump-endet p342E blev udvundet fra en transfor-20 mantkoloni.

Det stump-endede p342E nedbrydes samtidigt med Hindlll og EcoRI, og det store vektor fragment udvindes. Dette fragment ligeres til en polylinker med den følgende sekvens

EcoRI

AAGCTTATCGATTCTAG AAITC Hindi II UTal Xbal 1 og ligeringsblandingen anvendes til at transformere E. coli ATCC 31446 som beskrevet ovenfor. pCVSV-HBs udvindes fra en ampicillinresistent transformant.

I DK 175412 B1

I 40 I

I pCVSV-HBs nedbrydes samtidigt med Hindlll og EcoRI, I

og vektor fragmentet isoleres (Hindlll-EcoRI-fragmentet I

på 18 bp vil ikke vise sig i gelen på grund af dets I

ringe størrelse). I

I 5 pgD-DHFR-Trunc (EP patentansøgning nr. 84.305909.8), I

et plasmid indeholdende DNA, som koder for herpes sim- I

plex g0 proteinet, nedbrydes samtidigt med Stul og Hindlll I

og man udvinder fragmentet på omkring 760 bp, som indehol- I

der DNA, der koder for herpes simplex signalpeptidet I

I 10 og kodeområdet for den N-terminale del af det modne I

H HSV-lgD-protein. Plasmid pJ2.9 fra EP patentansøgning I

H nr. 84.305909.8 kan anvendes på samme måde. I

pPCl (fig. la) nedbrydes med Smal og BamHI, og 480 bp I

fragmentet udvindes. Dette fragment indeholder det meste I

15 af sekvensen, som koder for præTGF-P, inklusive sekven- I

H sen, som koder for N-terminus af rooden TGF-p via rest I

I 3u'

pPCl nedbrydes med BamHI og EcoRl, og 270 bp fragmentet I

udvindes. Disse to separate nedbrydninger af pPCl-ali- I

20 quoter blev gennemført, fordi BamHI-EcoRI-ppCl-fragmen- I

tet indeholder et Smal-center. 270 bp fragmentet inde- I

holder sekvensen, som koder for resten af TGF-P-moleky- I

let og strækker sig 20 bp ud over stopcodonen. I

pCVSV-HBs-vektorfragmentet ligeres ved en fire-vejs- I

I 25 ligering med de ovennævnte 760, 270 og 480 bp fragmenter. I

Den resulterende konstruktion (pCVSVgD) indeholdt således I en hybridkodesekvens (Herpes simplex gD-1 signalpeptid og en del af gD-1 hylsterproteinet forbundet i ramme I med præTGF-P-forstadiefragmentet) under styring af den' I 30 tidlige promotor fra SV/40. Denne hybridkodesekvens ef- terfølges igen af den 3'-utranslaterede sekvens og poly- adenyleringssignalet fra hepatitisoverfladeantigenet.

Al DK 175412 B1 pCVSVgD nedbrydes med EcoRI, afstumpes med Klenow og de fire dNTP'er og nedbrydes derefter med Pstl. Således opnås to fragmenter, og fragmentet, der inkluderer hybrid-kodesekvensen og SVAO-promotoren (fragment A) udvindes.

5 pCVSVgD nedbrydes med BamHI, afstumpes med Klenour og de fire dNTP'er og nedbrydes derefter med Pstl. Fire fragmenter opnås efter disse nedbrydninger. Fragmentet indeholdende pBR322-driginet og Amp -genet (omkring 1900 bp) udvindes som fragment B.

10 Fragmenterne A og B ligeres, og ligeringsblandingen anvendes til at transformere E. coli ATCC 31A46. Plasmidet j· pMBTE6 udvindes fra en Amp -koloni.

Plasmidet pMBTE6 blev transficeret ind i DHFR-deficiente CHO-celler (Urlaub and Chasin, 1980, P.N.A.S. J7_, 4216 -15 4220) sammen med plasmidet pFDll (Simonsen and Levinson, 1983, P.N.A.S. _80, 2495 - 2499). Det sidstnævnte plasmid koder for DHFR, hvorved det overfører methotrexatresi-stens på'de transficerede celler og gør det muligt at selektere TGF-P-udtrykkende transformanter. Enhver DHFR 20 pattedyrværtscelle er egnet til anvendelse. Alternativt kan man anvende enhver pattedyrværtscelle, cotransfor-mere værtscellen med et plasmid, som koder for neomycin-resistens, og identificere transformanter ved deres evne til at vokse i neomycinholdigt medium. 1 2 3 4 5 6

De transficerede CHO-celler blev selekteret ved dyrkning 2 i HGT’· medium. Cellerne fik lov at vokse til konfluens 3 i skåle med diameter 15 cm. Cellerne blev derefter dyr 4 ket i serumfrit medium i 48 timer før indhøsning. Dyrk 5 ningsmediet blev dekanteret fra skålene og prøvet ved' 6 .en blød-agar-prøvning for tilstedeværelsen af TGF-p som beskrevet7 .

I DK 175412 B1 I 42 50 ml supernatantmedium blev lyophilise ret og opløst i 700 ^ul A mM HC1 indeholdende 0,1.5ί okseserumalbumin.

200 yUl af denne opløsning og af på hinanden følgende tre-ganges fortyndinger blev prøvet. Antallet af kolonier 5 i blød agar med en diameter på over 89 ^um blev optalt.

H Den maksimale reaktion (plateau-værdi) opnået i nærvær af mætningsniveauer af TGF-P var omkring 1500 pr. plade.

Mindre end 50 kolonier blev opnået i fravær af TGF-β.

H En halv maksimal reaktion blev opnået med en 9-ganges H 10 fortynding af prøven afledt fra cellerne transformeret med et negativt kontrolplasmid. Udregninger fra værdier-H ne opnået ved rækkevis fortynding af MBTE6-supernatan- H ten viste, at den halve maksimalværdi blev opnået ved en 70 ganges fortynding.

H 15 Prøvningerne af række fortyndingerne viste, at celler H transformeret med MBTE6 og pFDll syntetiserer omkring 8-10 gange mere TGF-β pr. ml medium end CHO-celler' transficeret med pFDll alene eller med pFDll sammen med et kontrolplasmid (et som lignede pM8TE6, undtagen 20 at Herpes-kodesekvensen var erstattet med sekvensen, som koder for det bakterielle STII-signalpeptid), selv før subkloning og selektion i MTX-holdige medier. Denne yderligere mængde TGF-β er human TGF-β.

I Eftersom biologisk aktiv TGF-β findes i dyrkningsmediet, I 25 konkluderes det, at CHO-celler spalter præTGF-β på samme måde som humane celler in vivo og secernerer moden TGF-β.

I Denne konklusion bestyrkes meget stærkt af, at hældnin- gen af TGF-P-koncentrationsfortyndingskurven i den bløde agar er identisk for både den endogene naturlige TGF-β 30 og den rekombinante TGF-β, hvilket afspejler en lignen- I de, om ikke identisk affinitet til TGF-p-receptoren.

43.

DK 175412 B1

Bibliografi

^ 1· De Larco, J.E. and Todaro, G.J. Proc. Natl. Acad. Sci. USA

75, 4001-4005 (1978).

2* Roberts, A.B., Frolik, C.A., Anzano, M.A. and Sporn,,M.B.

Fed. Proc. 42, 2621-2625 (1983).

10

Todaro, G.J., Fryllng, C. and De Larco, J.E. Proc. Natl.

Acad. $ci. USA 77, 5258-5262 (1980).

4« Marquardt, H., Hunkap11 ler, M.W., Hood, L.E. and Todaro, G.J. Science 223, 1079-1082 (1984).

15 5. Roberts, A.B., Lamb, L.C., Newton, D.L., Sporn, M.B., De

Larco, J.E. and Todaro, G.J. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77, 3494-3498 (1980).

20 6. Ozanne, B., Fulton, R.J. and Kaplan, P.L. J. Cell Physiol.

105, 163-180 (1980).

7. Derynck, R., Roberts, A.8., Winkler, M.E., Chen, E.Y. and Goeddel, D.V. Cell 38, 287-297 (1984).

25 8. Lee, D.C., Rose, R.M., Webb, N.R. and Todaro, G.J. Nature 313, 489-491 (1985).

9. Linsley, P.S., Hargreaves, W.R., Twardzlk, D.R. and Todaro, 30 6.J. Proc. Natl. Acad. Sc1. USA 82, 356-360 (1985).

10. Roberts, A.B., Anzano, M.A., Lamb, L.C., Smith, J.M. and Sporn, M.8. Proc. Natl. Acad. Sc1. USA 78, 5339-5343 (1981).

I DK 175412 B1

I 4/> I

I Π. Roberts, A.B., Anzano, M.A., Lamb, L.C., Smith, J.M., Frolik,

I C.A., Marquardt, H., Todaro, G.J. and Sporn, M.B. Nature 295, I

I 417-419 (1982).

5 12. Roberts, A.B., Anzano, M.A., Meyers, C.A., Wldeman, J., I

I Blacher, R., Pan, Y.C., Stein, S., Lehman, S.R., Smith, J.M.,

Lamb, L.C. and Sporn, M.B. . Biochemistry 22, 5692-5698 (1983).

13. Frolik, C.A., Dart, L.L., Meyers, C.A., Smith, D.M. and Sporn, I 10 M.B. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80, 3676-3680 (1983).

I 14. Childs, C.B., Proper, J.A., Tucker, R.F. and Moses, H.L. Proc.

I Natl. Acad. Sci. USA 79, 5312-5316 (1982).

I 15 15. Assoian, R.K., Komoriya, A., Meyers, C.A., Miller, D.M. and I Sporn, M.B. 0. Biol. Chem. 258, 7155-7160 (1983).

I 16. Assoian, R.K., Grotendorst, G.R., Miller, D.M. and Sporn, M.B.

I Nature 309, 804-806 (1984).

I 20 I 17. Sporn, M.B., Roberts, A.B., Shull, 3.H., Smith, J.M., Ward, I J.M. and Sodek, J. Science 219, 1329-1331 (1983).

I 18. Frolik, C.A., Wakefield, L.M., Smith, D.M. and Sporn, M.B. J.

I 25 Biol. Chem. 259, 10995-11000 (1984).

19. Tucker, R.F., Branum, E.L., Shipley, G.0., Ryan, R.J. and I Moses, H.L. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, 6757-6761 (1984).

I 30 20. Assoian, R.K., Frolik, C.A., Roberts, A.B., Miller, D.M. and I Sporn, M.B. Cell 36, 35-41 (1984).

I 21. Tucker, R.F., Volkenant, M.E., Branum, E.L. and Moses, H.L.

I Cancer Res. 43, 1581-1586 (1983). j 45 DK 175412 B1 22. Anzano, M.A., Roberts, A.B., De Larco, J.E., Wakefield, L.M.,

Assolan, R.K., Roche, N.S., Smith, J.E., Lazarus, J.E. and Sporn, M.B. Molec. Cell. Biology 5, 242-247 (1985), 5 23. Roberts, A.B., Anzano, M.A., Wakefield, L.A., Roche, N.S.,

Stern, O.F. and Sporn, M.D. Proc. Natl. Acad. ScI. USA 82, 119-123 (1985).

24. Tucker, R.F., Shipley, G.D., Moses, H.L. and Holley, R.W.

10 Science 226, 705-707 (1984).

25. Mitchell, W.M. Meth. Enzymol. XLVII, p. 165-170 (1977).

26. Grantham, R., Gautier, C., Gouy, M., Oacobzone, M. and Mercier, 15 R. Nucl. Acids Res. 9, 43-73 (1981).

27. Bird, A.P. Nucl. Acids Res. 8, 1499-1504 (1980).

28. Lawn, R.M., Fritsch, E.F., Parker, R.C., Blake, G. and 20 Maniatis, T. Cell 15, 1157-1174 (1978). 1 2 3 4 5

Dobner, P.R., Kawasaki, E.S., Yu, L.Y. and Bancroft, F.C.

2

Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78, 2230-2234 (1981).

25 30. Thomas, P.S. Proc. Natl. Acad. Sc1. USA 77, 5201T5205 (1980).

3

Volckaert, G., Tavernier, J., Derynck, R., Devos, R. and Fiers, 4 W. Gene 15, 215-223 (1981).

30 32. Proudfoot, N.J. and Brownlee, G.6. Nature 253, 211-214 (1976).

5

Levy, W.P., Rubinstein, M., Shively, J., Del Valle, U., Lai, C.-Y-, Moschera, 0., Brink, L., Gerber, L., Stein, S. and Pestka, S. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78, 6186-6190 (1981).

I DK 175412 B1 H 34. Rinderknecht, E., O'Connor, B.H. and Rodriguez, H. J. Biol.

I Chen. 259, 6790-6797 (1984).

35. Kozak, M. Nucl. Acids Res. 12, 857-872 (1984).

H 36. Shepherd, J.C.W. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78, 1596-1600 I (1981).

37. Battey, J., Moulding, C.; Taub, R., Murphy, W., Stewart, T., I 10 Potter, H., Lenoir, 6. and Leder, P. Cel! 34, 779-787 (1983).

38. Udgår.

39. Udgår.

40. McKnight, S.L., Kingsbury, R.C., Spence, A. and Smith, M. Cell I 37, 253-262 (1984).

I 41. Dynan, W.S, and Tjian, R. Cell 35, 79-87 (1983).

20 I 42. Gidoni, D., Oynan, W.S. and Tjian, R. Nature 312, 409-413 (1984).

43. Benoist, C., O'Hare, K., Braetnach, R. and Chambon, P. Nucl.

I 25 Acids Res. 127-142 (1980).

I 44. Noda, M., Furutani, Y., Takahashi, H., Toysato, M., Hirose, T., I Imayama, S., Nakanishi, S. and Numa, S. Nature 295, 202-206 I (1982).

I . 30 I 45. Gubier, U., Seeburg, P., Hoffman, B.J., Gage, L.P. and I Udenfriend, S. Nature 295, 206-208 (1982).

% DK 175412 B1 47 46. Amara, S.G., Jonas, V., Rosenfeld, M., Ong, E.S. and Evans, R.M. Mature 298, 240-244 (1982).

47. Nakanishi, S., Inoue, A., Nakamura, M., Chang, A.C.Y., Cohen, ® S.N. and Numa, S. Nature 278, 423-427 (1979).

48. Kyte, J. and Doolittle, R.F. J. Mol. Biol. 157, 105-132,(1982).

49. Winzler, R.J. in Hormonal Proteins and Peptides 1, (Li, C.I., ed.) (New York, Academic Press) p. 1-15 (1973).

50. Garnier, J., Osguthorpe, O.J. and Robson, 6. J. Mol. Biol.

120, 97-120 (1978).

15 51. Arnon, P.E., Webb, A.C., Rosenwasser, L.J., Mucci, S.F., Rich, A., Wolff, S.M. and Dinarel lo, C.A. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, 7907-7911 (1984).

52. Lomedico, P., Guebler, U., Hellmann, P., Dukovich, M., Giri, ΛΛ J.G., Pan, Y.-C., Collier, K., Semionow, R., Chua, A.D. and Mizel, S.B. Nature 312, 458-462 (1984).

53. Pennica, D., Nedwin, G., Hayflick, J.S., Seeburg, P.H.,

Derynck, R., Pal ladi no, M.A., Kohr, VI. J., Aggarwal, 8.B. and 25 Goeddel, D.V. Nature 312, 724-729 (1984).

54. Van den Elsen, Shepley, B.-A., Borst, J., Collgan, J.E.,

Markham, A., Orkln, S. and Terhorst, C. Nature 312, 413-418 (1984).

30 55. Nathans, J. and Hogness, D. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 4851-4855 (1984).

I DK 175412 B1 I

I 56. Noda, M., Shimizu, S., Tanabe, T., Takal, T., Kayano, T., I Ikeda, T., Takahashl, H., Nakayama, H., Kanaoka, Y.t Minamlno, Η N., Kangawa, K., Matsuo, H., Raftery, M.A., Hi rose, T.,

Inayama, S., Hayashlda, H., Mlyata, T. and Numa, S. Nature I 5 312, 121-127 (1984).

I 57. Gorin, M.B., Yancey, B., Cline, J., Revel, J.-P. and Horwitz, I J. Cell 39, 49-59 (1984).

H 10 58. Noe, B.O., Moran, M.N. and Spless, J. 1n Peptides: Structure and Function (Pierce Chemical Company; Hurby, V. and Rich, I O.H., eds.), p. 219-228 (1983).

I 59. Devault, A., Zollinger, M. and Crine, P. 0. Biol. Chem. 259, 15 5146-5151 (1984).

I 60. Laenmili, U.K. Nature 227, 680-685 (1970).

I 61. Rodriguez, H., Kohr, W.J. and Harkins, R.N. Anal. Biochem.

20 ho, 538-547 (1984).

62. Hewick, R.M., Hunkapiller, M.W., Hood, L.E. and Dreyer, W.J.

I J. Biol. Chem. 256, 7990-7997 (1981).

25 63. Crea, R. and Horn, T. Nucl. Acids Res. 8, 2331-2348 (1980).

64. Beaucage, S.L. and Caruthers, M. Tetrahedron Lett. 22, 1859 I (1981).

I 30 65. Ullrich, A., Berman, C.H., Dull, T.J., Gray, A. and Lee, J.M.

I EMBO J. 3, 361-364 (1984).

I 66. Benton, W.O. and Davis, R.W. Science 196, 180-182 (1977).

49 DK 175412 B1 67. Kafatos, F.C., «tones, C.W. and Efstratiadls, A. Nucl. Acids Res. 7, 1541-1552 (1979).

68. Southern, E.M. J. Mol. Blol. 98, 503-517 (1975).

5 69. Sanger, F., Nicklen, S. and Coulson, A.R. Proc. Natl. Acad.

Sci. USA 74, 5463-5467 (1977).

70. Messing, J., Crea, R. and Seeburg, P.H. Nucl. Acids Res. 9, 10 309-321 (1981).

71. Ullrich, A., Shine, J., Chirgwin, J., Pictet, R., Tischer, E.,

Rutter, W.J. and Goodman, H.M. Science 196, 1313-1317 (1977).

15 72. Aviv, H. and Leder, P. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 69, 1408-1412 (1972).

73. Wickens, M.P., Buell, G.N. and Schimke, R.T. J. Biol. Chem.

253, 2483-2495 (1978).

20 74. Huynh, T.V., Young, R.A. and Davis, R.W. 1n DNA Cloning

Techniques, A Practical Approach (Glover, 0., ed.). (1RL,

Oxford) pp 49-78 (1985).

25 75. Norris, K.E., Iserentant, 0., Contreras, R. and Fiers, W. Gene 7, 355-362 (1979). 1 2 3

Taylor» J.M., Illmensee, R. and Summers, S. Biochim. Biophys.

Acta 442, 324-330 (1976).

30 2

Crowley et al., Molec. Cell. B1ol. 3, 44-55 (1983).

3

Anzano et al., Mol. Cell. Biol. 5, 242-247 (1985).

35 79. EP 73 656A

Claims (15)

1. Fremgangsmåde til fremstilling af TGF-β, kendetegnet ved, at (a) der kon- I I stmeres en vektor, som inkluderer nukleinsyre, der koder for TGF-β med den I I 5 aminosyresekvens som er vist i Figur 1b, eller en mutantsekvens deraf, (b) I I en hvirveldyr værtscelle transformeres med vektoren, (c) den transformerede I I celle dyrkes, og (d) moden TGF-β eller mutanter deraf udvindes fra kulturen, I I hvilken TGF-β eller mutant deraf har forankringsuafhængig vækstfremmende I biologisk aktivitet og udviser krydsreaktivitet med antisera frembragt overfor I I 10 nativ TGF-β. I

2. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at hvirveldyrcellen er en I I kinesisk-hamster-ovarie-cellelinie. I

3. Fremgangsmåde ifølge krav 1 eller 2, hvori nukleinsyren, som koder for I præ TGF-β er operabelt forbundet med en inducerbar promoter. I

4. Fremgangsmåde ifølge krav 1 eller 2, kendetegnet ved, at nukleinsyren, I som koder for præTGF-β er operabelt forbundet med en viral promotor. I 20

5. Fremgangsmåde ifølge krav 4, kendetegnet ved, at promotoren er en I SV40-promotor.

6. Fremgangsmåde ifølge ethvert af kravene 1 til 5, hvori TGF-β er human I 25 TGF-β.

7. DNA, som koder for TGF-β med den aminosyresekvens som er vist i Figur 1 b, og som er fri for en eller flere intrans, som findes i genomisk DNA. DK 175412 B1 51

8. Ekstrakromosomal DNA, som koder for TGF-β med den aminosyrese-kvens som er vist i Figur 1b.

9. mRNA, som koder for TGF-β fra en given art med aminosyresekvensen 5 som vist i Figur, 1 b, og som er cellefri og fri for mRNA, der koder for andre proteiner fra den givne art.

10. DNA ifølge krav 7 eller 8 eller mRNA ifølge krav 9, kendetegnet ved, at den er mærket med en detekterbar del. 10

11. Udtrykkelsesvektor der er anvendelig i fremgangsmåden ifølge krav 1, omfattende DNA som koder for præ TGF-β med aminosyresekvensen som vist i Figur 1b, eller en mutant sekvens deraf, hvorved ved udtrykkelse af nævnte TGF-β eller mutant deraf, der fremstilles moden TGF-β eller mutant 15 deraf med forankringsuafhængig vækstfremmende biologisk aktivitet som udviser krydsreaktivitet med antisera frembragt overfor nativ TGF-β.

12. Vektor ifølge krav 11, kendetegnet ved, at DNA’en der koder for præ TGF-β eller en mutant sekvens deraf er fri for intrans. 20

13. Værtscelle indeholdende vektoren ifølge krav 11 eller 12.

14. Celle ifølge krav 13, kendetegnet ved, at den er en hvirveldyrcelle.

15. Celle ifølge krav 13, kendetegnet ved, at den er en bakteriecelle.