DK174237B1 - DNA-sekvenser, der koder for N2- eller N3-trunkerede former af den lange form og den korte form af CSF-1 og anvendelse heraf i vektorer, ekspressionssystemer, rekombinante værtsceller, samt en fremgangsmåde til fremstilling...... - Google Patents

Description

DK 174237 B1

Teknisk område

Den foreliggende opfindelse vedrører anvendelsen af rekombinationsteknologi til fremstilling af lymfokiner, 5 som almindeligvis frembringes i lav koncentration. Opfindelsen angår nærmere bestemt kloning og ekspression af nye DNA-sekvenser, som koder for human kolonistimulerende faktor-1 (CSF-1).

10 Den kendte teknik

Man har i næsten 15 år vidst, at visse faktorer, som frembragtes i meget lav koncentration i en række væv, havde evnen til at stimulere væksten og udviklingen af 15 knoglemarvsstamceller til granulocytter og/eller makrofager. Tilstedeværelsen af sådanne faktorer i sera, urinprøver, og vævsekstrakter fra en række arter kan påvises ved at anvende en in vitro analyse, hvorved man maler stimuleringen af kolonidannelsen af benmarvsceller, 20 som er udpladet i et halvfast dyrkningsmedium. Der kendes ingen pålidelig in vitro analyse. Eftersom faktorerne inducerer dannelsen af sådanne kolonier har disse faktorer fået en samlet betegnelse "kolonistimulerende faktorer" (CSF).

25

Det er senere blevet vist, at der findes mindst 4 underklasser af humane CSF-proteiner, som kan defineres efter den celletype, som findes i de fremkomne kolonier.

En underklasse, CSF-1, resulterer i kolonier, som 30 hovedsagelig indeholder makrofager. Andre underklasser frembringer kolonier, som indeholder både neutrofile granulocytter og makrofager; som hovedsagelig indeholder neutrofile granulocytter, og som indeholder neutrofile og eosinofile granulocytter og makrofager.

35 i 2 DK 174237 B1

Der findes muse-faktorer, som er analoge til de første 3 af de ovennævnte humane CSF’er. Endvidere inducerer en musefaktor kaldet IL-3 kolonier fra musebenmarvsceller, som indeholder alle disse celletyper plus mega-5 karyocytter, erythrocytter og mastceller i forskellige kombinationer. Human-IL-3 er også kendt. En oversigt over disse CSF'er findes i Dexter, T.M, Nature (1984), 309:746, og Vadas, M.A., et al, J Immunol. (1983), 130:793, Metcalf, D. Science (1985), 229:16-22; Clark, 10 S.C., et al., Science (1987), 236:1229-1237.

Den foreliggende opfindelse angår fremstillingen af proteiner, som er medlemmer af den første af disse underklasser, CSF-1, ved rekombination. Denne underklasse 15 er blevet yderligere karakteriseret og beskrevet ved hjælp af specifikke radioimmunoanalyser og radioreceptoranalyser - f.eks. er antistoffer rejst mod renset CSF-1 i stand til specifikt at undertrykke CSF-l-aktivitet uden at påvirke de biologiske aktiviteter af andre 20 underklasser, og makrofagcellelinie J774 indeholder receptorer, som specifikt binder CSF-1. En beskrivelse af disse analyser blev publiceret af Das, S.K., et al.,

Blood (1981), 58:630.

25 Der er blevet publiceret oprensningsmetoder for forskellige CSF-proteiner.

Stanley, E.R., et al., J. Biol. Chem. (1977), 252:4305 beskrev oprensningen af et CSF-protein fra L929- 30 museceller til en specifik aktivitet på ca. 1 x 108 enheder/mg, hvilket protein også hovedsagelig stimulerede makrofagproduktion. Waheed, A., et al., Blood (1982), 60:238, beskrev oprensningen af CFS-1 fra muse-L-celler til tilsyneladende homogenitet ved at anvende en søjle 35 med kaninantistof, og beskrev de første 25 aminotyper af 3 DK 174237 B1 musesekvensen (Ben-Avram, C.M., et al,, Proc. Natl. Acad.

Sci.(USA) (1985), 882:4486).

Stanley, E.R., et al., J. Biol, Chem. (1977), 252:4305- 5 4312 beskrev en oprensningsprocedure for CSF-1 fra humanurin, og Das, S.K., et al., Blood (1981), 58:630; J,

Biol. Chem. (1982), 257:13679 opnåede et humant, urint CSF-1 med en specifik aktivitet på 5 χ 107 enheder/mg, hvilken faktor kun frembragte makrofagkolonier, og 10 beskrev relationen mellem glycosyleringen af CSF-1-proteinerene, som var fremstillet ud fra dyrkede muse-L-celler og humanurin, og deres aktiviteter, Wang, F.F., et al., J. Cell, Biochem. (1983), 21^:263, isolerede human urin CSF-1 til en specifik aktivitet på 10® enheder/mg. ...

15 Waheed, A., et al., beskrev oprensninger af humant, urint CSF-1 til en specifik aktivitet på 0,7-2,3 χ 107 enheder/mg på en søjle med kaninantistof (Exp. Hemat (1984), 12:434) .

20 Wu, M., et al., J. Biol. Chem. (1979), 254:6226 beskrev fremstillingen af et CSF-protein fra humane pancreas-carcinomaceller (MIAPaCa), hvilket protein resulterede i vækst af musegranulocytkolonier og makrofagkolonier. Det fremkomne protein havde en specifik aktivitet på ca. 7 x 25 107 enheder/mg.

Der er også blevet beskrevet delvise oprensninger af præparater af forskellige CSF'er fra konditioneret medie fra human- og muselungeceller (Fojo, S.S., et al,.

30 Biochemistry (1978), 1/7:3109; Burgess, A.W., et al., J.

Biol. Chem. (1977), 252:1998), fra humane T- lymfoplastceller (Lusis, A.J., et al, Blood (1981), 57:13, US patent nr. 4.438.032), fra konditioneret human placental medium til tilsyneladende homogenitet og en i 4 DK 174237 B1 specifik aktivitet på 7 x 107 enheder/mg (Wu, M. et al, Biochemistry (1980), lji:3846).

En væsentlig vanskelighed ved at anvende CSF-proteiner i 5 almindelighed og CSF-1 i særdeleshed på en nyttig måde, har været deres manglende tilgængelighed i særskilt og karakteriserbar form i tilstrækkelige mængder til at gøre deres anvendelse til terapeutisk brug praktisk eller endog mulig. I den foreliggende opfindelse afhjælpes 10 disse mangler ved at tilvejebringe et udgangsmateriale til at opnå renset human- og muse-CSF-1 i brugbare mængder ved hjælp af rekombinationsmetoder.

(Der er blevet oprenset et CSF-protein af en anden 15 underklasse, muse- og human-GM-CSF, og cDNA'erne er blevet klonet. Gough, et al., Nature (1984), 309:763-767 har vist, at dette protein er forskelligt fra andre CSF'er, f.eks. CSF-1. Dette GM-CSF-protein beskrives yderligere i W087/02060, publiceret 9. april 1987, som 20 værende nyttigt til behandling af kræftpatienter til regenerering af leukocytter efter traditionel kræftbehandling og til at nedsætte sandsynligheden for viral, bakteriel, svampe eller parasitisk infektion, såsom ved erhvervet immundefektsyndrom (AIDS). Muse-IL-3 er blevet 25 klonet af Fung, M.C., et al., Nature (1984), 307:233.

Human- og gibbon-IL-3 er blevet klonet af Yang, Y.-C., et al., Cell (1986), 47:3-10, og af Dorssers, L., et al.,

Gene (1987), i tryk. Se også Yokota, T., et al, PNAS (1984), jU: 1070-1074; Wong, G.G., et al., Science (1985), 30 228:810-815; Lee, F., et al., PNAS (1985), 82:43604364 og

Cantrelll M.A., et al., PNAS (1985), 82:6250-6254.)

Kloningen af et cDNA, som koder for en form af human-CSF-1, nærmere bestemt den klon, som herefter kaldes pcCSF-35 17, er også blevet publiceret (Kawasaki, E.S., et al., ) 5 DK 174237 B1

Science (1985), 230:292-296) ; PCT-ansøgning publikation nr. WO86/04607, publiceret 14,. august 1986. Genfindingen af en klon, som koder for en "lang form" af human-CSF-1 er blevet publiceret af Wong, G.G., et al, Science 5 (1987), 235:1504-1509 og af Ladner, M.D., et al., EMBO J.

(1987), 6:2693-2698.

Alle CSF-l'ere ifølge den kendte teknik er proteiner i fuld størrelse eller fusionsproteiner med den naturligt 10 forekommende N-terminus. Ansøgeren har konstateret, at DNA-sekvenserne ifølge den foreliggende opfindelse, der koder for et NV2- eller NV3-trunkeret CSF-1, tilvejebringer et CSF-1 uden indhold af N-methionin i uventet overlegne mængder i forhold til CSF-1 med den native N-15 terminus ved ekspression med E. coli-ekspressionssystem-er. Støtte for dette resultat findes i den oprindeligt indleverede beskrivelse (WO 88/03173), side 35, linje 18-28, og i sammenligningen af homogeniteten af CSF-1-ekspressionsprodukterne i Figur 7, der ses at være 20 heterogene som følge af tilstedeværelsen af en top for ASP-59 MET-SCSF/CV150 CSF-1 i HPLC-kromatografiet versus dets tilsvarende NV2- (Figur 8) og NV3-modstykkers (Figur 9), der mangler den N-teminale methionin, og ses at være i hovedsagen homogene (d.v.s., som en enkelt 25 top).

Forklaring af opfindelsen

Den foreliggende opfindelse angår hidtil ikke-beskrevne 30 former af de humane CSF-1- og muse-CSF-l-proteiner.

6 DK 174237 B1

Den foreliggende opfindelse angår således i ét aspekt en DNA-sekvens, der koder for et human-CSF-1 NV3- eller NV2-mutein, der mindst har aminosekvensen for: 5 (i) NV3 eller NV2/SCSF/CV150; eller for (ii) NV3 eller NV2/LCSF/CV150; eller for (iii) en modifikation af enten (i) eller (ii), hvor 1-5 aminosyrer er substitueret eller deleteret, og hvor dimerer af muteinet stimulerer dannelsen af primært 10 makrofagkolonier i in vitro CSF-l-analysen; de humane proteiner, der er relaterede til den "lange" form, beskrives i forhold til den i Fig. 2 viste aminosyre-sekvens, betegnet LCSF, og de, der er relaterede til den "korte form", beskrives i forhold til den i Fig.

15 1 viste aminosyresekvens, betegnet SCSF, I andre aspekter angår opfindelsen: (a) En vektor, der omfatter en DNA-sekvens ifølge 20 opfindelsen og et replika, der er operativt i en encellet organisme; (b) Et ekspressionssystem, der omfatter en DNA-sekvens ifølge opfindelsen eller en vektor ifølge opfindelsen, der er operativt bundet til passende 25 styringssekvenser; (c) Rekombinante værtsceller, der er transformerede med et ekspressionssystem ifølge opfindelsen; (d) En fremgangsmåde til fremstilling af et rekombin-ant human-CSF-l-polypeptid, ved hvilken celler dyrkes 30 som ovenfor under betingelser, der er effektive til fremstilling af CSF-l’et.

7 DK 174237 B1

Kort beskrivelse af tegningen

Fig. 1 viser DNA'et og de deducerede aminosyresekvenser 5 for en cDNA-klon, som koder for en "kort form" af human-CSF-1 (SCSF), kaldet pcCSF-17.

Fig, 2 viser cDNA'et og den deducerede aminosekvens for et cDNA, som koder for en "lang form" af huCSF-1 (LCSF), 10

Fig. 3 er et diagram af den genome klon, hvilket diagram viser oprindelsen af de korte og lange former af humanes F-l.

15 Fig. 4 viser RP-HPLC af det rekombinerede CSF-1, som frembringes i E. coli ved ekspressionen af et gen, som koder for SCSF/CV158.

Fig. 5 viser RP-HPLC af rekombineret CSF-1, som 20 frembringes i E. coli fra et gen, som koder for asp5Q

SCSF/CV150.

Fig. 6 viser RP-HPLC-analyse af ekspressionsproduktet af et gen, som koder for asp59 SCSF/NV3CV150.

25

Udforelsesformer for opfindelsen A. Definitioner 30 "Et protein med kolonistimulerende faktor-l-aktivitet (CSF-l-aktivitet)" refereret til et protein, som udviser det for CSF-1 erkendte aktivitetsspektrum - det vil sige, når det anvendes i den af Metcalf, D., J. Cell. Physiol:.

(1970), 76:89, beskrevne standardanalyse til undersøgelse 35 af in vitro kolonistimulerende aktivitet, resulterer det 8 DK 174237 B1 primært i dannelsen af makrofagkolonier. Nativ CSF-1 er en glycosyleret dimer; i nogle tilfælde formodes dimer-iseringen at være nødvendig for aktivitet. Både den dimere og monomere form ligger inden for rækkevidden af 5 opfindelsen og definitionen af CSF-1. Den monomere form kan omdannes til den dimere form ved tilvejebringelse af egnede betingelser iji vitro, og den monomere form er i sig selv nyttig som et antigen til frembringelse af antistoffer mod CSF-1.

10

Der synes at være nogen artsspecificitet: Human-CSF-1 fungerer på både human- og muse-benmarvsceller; mur in CSF-1 udviser ikke aktivitet med humanceller. Derfor skal "human" CSF-1 være positiv i den specifikke muse-15 radioreceptoranalyse af Das, S.K., et al., Blood (1981), 58:630, om end der ikke nødvendigvis er en fuldstændig korrelation. Proteinets biologiske aktivitet vil almindeligvis også blive hæmmet af neutraliserende antistof over for humanur in-CSF-1 (Das, S.K., et al., (se 20 ovenfor) i visse specielle tilfælde bliver dette kriterium imidlertid ikke opfyldt (såsom f.eks. når et bestemt antistofpræparat genkender en CSF-l-epitop, som ikke er essentiel for biologisk funktion, og hvilken epitop ikke er til stede i den bestemte CSF-l-mutein, som 25 undersøges).

Der er senere fundet visse andre egenskaber hos CSF-1, herunder dette proteins evne til at stimulere sekretioneringen af serie E-prostaglandine, interleukin-1 og 30 interferon fra modne makrofager (Moore, R., et al., Science (1984), 223:178). På nuværende tidspunkt forstår man ikke mekanismen bag disse sidstnævnte aktiviteter og med henblik på den her anvendte definition ligger kriteriet for opfyldelsen af definitionen i evnen til at 35 stimulere dannelsen af monocyt/makrofagkolonier under 9 DK 174237 B1 anvendelse af bentnarvsceller fra passende arter som udgangsmaterialer, under de fleste omstændigheder {se ovenfor) hæmningen af denne aktivitet med neutraliserende antiserum mod oprenset humanurin-CSF-1, og hvor det er 5 hensigtsmæssigt for artstypen et positivt svar på radioreceptoranalysen. (Det er kendt, at CSF-1's proliferative effekt er begrænset til celler af mononukleær, phago-cytisk afstamning, (Stanley, E.R., The Lymphokines (1981), Stewart, W.E. II, et al., redaktør, Humana Press, 10 Clifton, NJ, side 102-132) og at receptorer for CSF-1 er begrænset til disse cellelinier (Byrne, P.V., et al.,

Cell Biol. (1981). 91:848) og til placentale tropoplast-beslægtede celler).

15 Som det er tilfældet for alle proteiner, afhænger den præcise kemiske struktur af en række faktorer. Eftersom der i molekylet findes ioniserbare amino- og carboxyl-grupper, kan et bestemt protein opnås som et surt eller basisk salt eller i neutral form. Alle sådanne 20 præparater# som bevarer deres aktivitet, når de anbringes under egnede betingelser, er omfattet af definitionen. Endvidere kan den primære aminosyresekvens, hvis det kan gøres uden at ødelægge aktiviteten, være modificeret ved oxidation eller reduktion, eller forstørret ved derivat-25 isering under anvendelse af sukkerenheder (glycosylering) eller ved hjælp af andre supplerende molekyler, såsom lipider, phosphat, acetylgrupper og lignende, mere almindeligt ved konjugation med saccharider.

30 De proteiner, som kodes af de her beskrevne gener, kan også behandles ved proteolyse. Man formoder, at CSF-1 i naturen findes i en eller flere former ved en C-terminal-deletion. En primær aminosyrestruktur (hvad enten den er klippet i den C-terminale ende eller ej) kan også aggre-35 gere til dannelse af komplekser, hyppigst dimerer. Nativ, 10 DK 174237 B1 human, urin-CSF-1 isoleres som en meget glycosyleret dimer på 45-90 kd, hvilket afhænger af målingsmetoden og referenten. Native, humane CSF-l-proteiner fra andre kilder, såsom monocyter, HL-60, og PanC-cellelinier, har 5 lignende egenskaber. MIAPaCa-afledt CSF-1 synes at være en kompleks blanding af glycosylerede, dimere proteiner med monomermolekylvægte på 70, 48, 40, 30 og 26 kd, hvilket er bestemt ved immunoblot af SDS-PAGE. Visse aspekter af en sådan forstørrelse opnås ved den producer-10 ende værts posttranslationelle processeringssystem; andre sådanne modifikationer kan introduceres iji vitro. I alle tilfælde er sådanne modifikationer omfattet af definitionen så længe proteinets aktivitet som ovenfor defineret ikke ødelægges. Det kan selvfølgelig forventes, 15 at sadanne modifikationer kan påvirke aktiviteten kvantitativt eller kvalitativt, enten ved at forøge eller formindske proteinets aktivitet i de forskellige analyser. Ansøgere har specifikt vist, at den ikke-glyco-sylerede monomer kan have aktivitet i nogle analyser.

20

Molekylvægten af den deglycosylerede monomer er blevet undersøgt, men der kunne ikke drages endelige konklusioner på grund af vanskeligheder med at sikre, at der ikke skete proteolyse under fermentering, oprensning, og 25 ved deglycosyleringsreaktionen. Ikke desto mindre blev molekylvægten af denne deglycosylerede dimer beskrevet som kun værende 14-17 kd af Das, S.K., et al., J. Biol.

Chem. (1982), 257:13679-13684. Den af Wong, G.G., et al., (1987) (se ovenfor) beskrevne CSF-1 frembragt ved 30 rekombination synes at have molekylvægt på ca. 21 kd. På den anden side er den molekylvægt, som beregnes pa basis af den aminosyresekvens, som deduceres for den "korte" form af CSF (SCSF) på 224 aminosyrer, af størrelsesordenen 26 kd, medens molekylvægten for den "lange" form 35 (LCSF) beregnes til at være af størrelsesordenen 55 kd.

11 DK 174237 B1 Når deleterede konstruktioner af disse gener udtrykkes i E. coli (hvor glycosylering ikke finder sted) medfører de selvfølgelig dannelse af proteiner med en betydelig lavere molekylvægt - 17-18 kd for SCSF/CV150 og ca. 30 5 kd for LCSF/CV221. Når LCSF eller SCSF udtrykkes i pattedyrceller eller insektceller, opnås højere molekylvægte, men det er vanskeligt at sige, i hvilken udstrækning dette skyldes glycosylering og i hvilken udstrækning dette skyldes selve den primære aminosyresekvens. Som 10 ovenfor anført ser det ud til, at det nativt producerede protein faktisk kan indeholde C-terminale trunkeringer.

Det er selvfølgelig velkendt, at bakterielt frembragte .... modne proteiner, hvor genet har en umiddelbart foranstil-15 let ATG-start-codon, inkluderer eller inkluderer ikke den N-terminale methionin i den form, der fremstilles og udvindes. Følgelig er begge former inkluderet. Ydermere kan en lille modifikation af den N-terroinale sekvens hjælpe med ved processeringen af den N-terminale 20 methionin, og det er vist nedenfor, at deletion af resterne 1 og 2 (begge glutaminsyrer) eller resterne 1-3 (glu-glu-val) hjælper med på denne måde. Det er derfor klart, at disse former også er inkluderet i definitionen.

25 Udover at de ekspressionsprodukter, som mere effektivt processeres ved den N-terminale ende, er de proteiner, der produceres i E. coli udfra gener, der koder for NV2-og NV3-muteiner, forholdsvis homogene, når de vurderes ved RP-HPLC, til sammenligning med ekspressions- 30 produkterne fra gener, der koder for former, som bevarer de to N-terminale glutaminsyrerester. Denne heterogenitet kan være et fænomen, som er forbundet med bakterielle ekspressioner af disse proteiner, eftersom de ikke opstår, når generne udtrykkes i pattedyrceller, såsom 35 CV-l-celler.

DK 174237 B1 12

Angående effekten af N-terminale modifikationer på N-terminal methioninprocessering: Når konstruktioner, som koder for det modne protein, udtrykkes intracellulært i 5 E. coli, ser det ud til, at i det væsentlige intet af det producerede protein er blevet processeret til fjernelse af den N-terminale methionin - det vil sige alt sekventerbart materiale udvundet efter proteinoprensning begynder med met. Hvis de tilsvarende konstruktioner, som 10 koder for NV2-deleterede CSF-l-muteiner imidlertid udtrykkes under lignende betingelser, har 23% af proteinet ikke met i den N-terminale ende. For NV3-konstruk-tioner stiger procentdelen af protein, som processeres ved den N-terminale ende til fjernelse af methioninen, 15 til ca. 95%.

Når der udføres HPLC-analyse med omvendt fase på det formindskede CSF-l-protein, som produceres af forskellige rekombinerede konstruktioner i E. coli, udviser konstruk-20 tioner, som koder for den modne N-terminale ende, heterogenitet pa to niveauer. For det første er der to toppe med omtrent den samme molekylvægt og samme tilsyneladende aminosyresarnmensætning, hvor forholdet mellem arealerne er ca. 70:30. Der er en yderligere top, som 25 fremkommer på grund af en intern genstart, som sker i kloner, der koder for tyrosin ved aminosyrerest 59, hvilket er vist i fig. 6. Denne komplikation fjernes ved at redesigne genet opstrøms position 65, hvilket er beskrevet nedenfor. Konstruktioner, som kode for NV2- og 30 NV3-formerne, og som koder for en asp ved aminosyrerest 59, fortrinsvis via en GAT-codon, udviser ikke fragmentet med den interne genstart, og indeholder kun protein, som har en tilbageholdelsestid, svarende til 70%-toppen i de modne proteinsammensætninger.

35 13 DK 174237 B1

Udover N-terminale og C-terminale deletioner og aggregeringer kan individuelle aminosyrerester i kæden kort sagt være modificeret ved oxidation, reduktion eller anden derivatisering, og disse proteiner kan også være spaltet 5 og/eller aggregeret til opnåelse af fragmenter, der bevarer aktivitet. Sådanne ændringer, som ikke ødelægger aktiviteten, fjerner ikke proteinsekvensen fra definitionen og er specifikt inkluderet i definitionen. CSF-1 afledt fra andre arter kan opfylde definitionen på et 10 protein med aktiviteten af "human"-CSF-l ved, at det udviser det nødvendige aktivitetsmønster, som er anført ovenfor med hensyn til det humane substrat.

Fig. 1 viser aminosyresekvensen for en bestemt form af 15 human-CSF-1, som kodes af den rekombinerede cDNA-klon pcCSF-17. Dette protein indeholder 224 aminosyrer i den modne sekvens og en ledersekvens med 32 aminosyrer. Som vist her, er det protein, der produceres som ekspressionsproduktet fra denne klon, aktivt i analyser, som er 20 specifikke for CSF-1, nemlig knoglemarvprolifererings-analyse (hvor aktiviteten ødelægges ved tilsætning af antistoffer mod CSF-1) kolonistimuleringsanalyser og en radioreceptoranalyse.

25 Det modne protein af den aminosyresekvens, som er vist i fig. 1, og som er deduceret fra den her viste cDNA-klon, betegnes kort CSF-1 (SCSF); (eng: short CSF-1). Fig. 1 viser tilstedeværelsen af en 32-aminosyre formodet signalsekvens, som formodentlig fraspaltes ved secerner-30 ingen fra pattedyrceller; SCSF er repræsenteret ved aminosyrerne 1-224 vist i denne figur. Specifikt inkluderet i opfindelsen er muteiner, som er monomerer og dimerer af visse beslægtede former af SCSF, som er udpeget her ved deres forskelle fra SCSF.

35 14 DK 174237 B1

Af bekvemmelighedsgrunde vil aminosyresekvensen for SCSF blive anvendt som en reference og andre nært beslægtede sekvenser, som har CSF-l-aktivitet, vil blive udpeget under henvisning til den i fig. 1 viste sekvens. Eftersom 5 den N-terminale methionin kan være til stede eller ej er begge former inkluderet i alle tilfælde, hvor CSF-l-pro-teinet produceres i bakterien. Substitutionen af en bestemt aminosyre vil blive angivet under henvisning til den aminosyrerest, som den erstatter. F.eks, refererer 10 sergøSCSF således til det protein, som har den i fig. 1 viste sekvens med undtagelse af, at aminosyren i position 90 er serin i stedet for cystein. Deletioner fra de terminale ender angives med NV efterfulgt af det antal aminosyrer, som fjernes fra den N-terminale sekvens, 15 eller ved CV og den position af den sidste aminosyre, som bliver tilbage, når resterne fjernes fra den C-terminale sekvens. Saledes refererer "SCSF/NV4" eller "NV4-formen af SCSF" til CSF-1 i fig.l, hvor de første 4 aminosyrer fra den native N-terminale ende er blevet 20 fjernet; "SCSF/CV130" eller "cVl30-formen af SCSF" refererer til CSF-1, hvor de sidste 94 aminosyrer efter aminosyre 130 er blevet fjernet. Nedenfor er f.eks. illustreret asp5gSCSF (hvilket indeholder en aspargin- syrerest, som kodes af genet, i position 59 i stedet for 25 den tyrosinrest, som kodes af cDNA'et), og SCSF/CV158, som kun omfatter aminosyrerne 1-158 af SCSF.

De CSF-l-proteiner, som indeholder aminosyresekvenser relateret til de sekvenser, som kan deduceres fra den 30 udvundne lange form af cDNA - det vil sige, som inkluderer et 298 aminosyrer langt "ekstra" segment indsat ved aminosyrerest 150 i pcCSF-17 kodet protein, betragtes som lange former af proteinet, og den i fig. 2 viste aminosyresekvens 1-522 betegnes arbitrært LCSF.

35 Igen kan denne have en foranstående methionin, nar den 15 DK 174237 B1 produceres i E. coli. Notation med hensyn til muteiner af LCSF er analog med den ovenfor beskrevne med hensyn til SCSF.

5 Den 522 aminosyrer lange sekvens, som kodes i f.eks, pcDBhuCSF-4 og de tilsvarende kloner, er sekvensen for LCSF og kan også betegnes huSCF-1.

Udtrykkene "særskilt peptid" eller "mutein" refererer her 10 til en bestemt, primær aminosyresekvens, som ikke er en del af en større sekvens. Disse udtryk refererer således til peptidmolekyler, som ikke har nogen yderligere N- og C-aminosyresekvensforlængelse. De her beskrevne proteinpræparater, som har CSF-l-aktivitet, kan imidlertid være 15 monomerer, dimerer eller andre aggregater af disse særskilte peptider eller muteiner.

"Pa funktionsdygtig måde koblet til" refererer til en sadan sammenstilling, at komponenternes normale funktion 20 kan udføres. En kodesekvens som er "funktionsdygtigt koblet til" kontrolsekvenser refererer således til en konfiguration, hvor den kodende sekvens kan udtrykkes under styring af disse sekvenser.

25 "Styringssekvenser" refererer til DNA-sekvenser, som er nødvendige for ekspressionen af en funktionsdygtig koblet kodesekvens i en bestemt værtsorganisme. De styringssekvenser, som er egnede til f.eks. procaryoter, inkluderer en promoter, eventuelt en operatorsekvens, et 30 ribosombindingssted, og muligvis andre endnu dårligt forståede sekvenser. Eucaryote celler vides at udnytte promotorer, polyadenyleringssignaler og forstærkere (eng: enhancers).

16 DK 174237 B1 "Ekspressionssystem" refererer til DNA-sekvenser, som indeholder en ønsket kodende sekvens og styringssekvenser koblet funktionsdygtigt hertil, således at de værter, som transformeres med disse sekvenser, er i stand til at 5 producere de kodede proteiner. For at effektuere transformation kan ekspressionssystemet være inkluderet på en vektor; men det relevante DNA kan imidlertid også være integreret i værtskromosomet.

10 Udtrykkene "celle", "cellelinie" og "cellekultur" anvendes her ensbetydende og alle sådanne betegnelser inkluderer afkom. Udtrykkene "transformanter" eller "transformerede celler" inkluderer således den primære celle og kulturer hidrørende herfra uanset antallet af 15 overføringer. Det skal også forstås, at ikke alt afkom har præcist identisk DNA-indhold på grund af tilsigtede eller uundgåelige mutationer. Mutantafkom, som har den samme funktionalitet, som det screenes for i den oprindeligt transformerede celle, er inkluderet. Hvor 20 særskilte betegnelser er tilsigtede, vil det klart fremgå af sammenhængen.

En "effektiv mængde" betegner en mængde, som er effektiv til at udøve den specificerede funktion, såsom at dræbe 25 tumorer eller nedsætte tumorbelastningen eller forhindre eller helbrede infektiøse sygdomme.

B. Fremstilling af CSF-1 til farmaceutisk brug: Opnåelse af genet 30

Skønt man i nogen tid havde kendt eksistensen af et aktivitetsmønster kaldet CSF-1, havde man aldrig opnået det ansvarlige protein i tilstrækkelige renhed og i tilstrækkelige mængder til sekvensbestemmelse, ej heller 35 tilstrækkeligt rent og i tilstrækkelig mængde til at 17 DK 174237 B1 tilvejebringe en nyttig terapeutisk funktion. Fordi man ikke havde haft tilstrækkelig rene, praktiske mængder af proteinet ej heller det herfor kodende DNA, havde det ikke været muligt at optimere modifikationer i strukturen 5 til tilvejebringelse af muteiner, ej heller havde det været muligt at anvende dette protein i en terapeutisk sammenhæng.

Anvendelsen af rekombinant teknik afhjælper disse 10 mangler. Som beskrevet i PCT WO86/046Q7 (se ovenfor) blev prober, som er baseret på en N-terminal sekvens af isoleret humanurin-CSF-1, anvendt til at probere det humane genom-bibliotek til opnåelse af genet i fuld længde. Den humane, klonede genomsekvens kan udtrykkes 15 direkte under anvendelse af dens egne kontrolsekvenser, eller i konstruktioner, som er egnede til pattedyrsystemer, og som er i stand til at processere intronomrader. De genome sekvenser blev også anvendt som prober til et human-cDNA-bibliotek, som var opnået fra en 20 cellelinie, der producerer CSF-1 til opnåelse af det pcCFA-17-cDNA, som koder for protein med CSF-1- aktivitet. Når dette cDNA er fremstillet korrekt, kan det udtrykkes direkte i COS- eller CV-l-celler og kan indsættes i vektorer, der er egnet til ekspression i en 25 lang række værtsorganismer. Som beskrevet i ovennævnte ansøgning udviser visse modifikationer af den primære struktur også CSF-l-aktivitet.

Som her beskrevet blev det humane cDNA, som koder for den 30 224 aminosyrer lange form af proteinet, anvendt som en probe til genfinding af de sekvenser, som koder for muse-CSF-1, fra en cDNA-bank som er fremstillet i λgtl0 ud fra L-929 mRNA, der er blevet beriget for evnen til at producere CSF-1. Der blev fundet to kloner, som koder for 35 et tilsvarende 520 aminosyrer langt protein. Klonerne 18 DK 174237 B1 afviger særdeles meget fra hinanden i det ikke-translaterede 3'-område. I den længere, 4 kb lange museklon er det ikke-translaterede 3'-område mere end 2 kb, og ligner ikke meget den tilsvarende humane sekvens; 5 den anden kortere klon på 2 kb indeholder ca. 500 bp i det ikke-translaterede område og udviser betragtelig homologi med det tilsvarende, humane DNA.

Disse lange former af CSF-1 opnået fra muse-biblioteket 10 blev derefter anvendt som en basis til fremstilling af prober til opnåelse af den tilsvarende lange, humane sekvens, hvis primære struktur er kodet i genomet. Ved at sammenligne muse-cDNA’er med den humane genomsekvens så man et område af genet, der undertiden opførte sig som et 15 intronområde, kode for en aminosyresekvens, der udviser betragtelig homologi med det "ekstra", 298 aminosyre lange segment, der fandtes i musesekvensen. Dette muliggjorde konstruktionen af en oligonukleotidprobe baseret på det "ekstra" DNA, som var blevet omdannet til protein 20 i musesystemet. Eftersom den humane genomsekvens var tilgængelig, blev proben udformet til at passe til den præcise humane sekvens.

pcCSF-17 var blevet fremstillet som en Okayama-Berg-25 vektor ud fra MIAPaCa-mRNA beriget for det CSF-l-kodende materiale; cDNA-biblioteket, hvorfra cDNA'l, som kode for den lange form, blev opnået, blev fremstillet ud fra total mRNA ekstraheret fra MIAPaCa-celler og klonet i kgtlO. kgtlO-Biblioteket blev først screenet under anven-30 delse af pcCSF-17-sekvenser som en probe, og udvalgte, probepositive kandidater blev screenet under anvendelse af en oligonukleotidprobe baseret på den "ekstra", trans-laterede sekvens i muse-cDNA'et, men modificeret til at svare til det beslægtede område i det humane genom. Der 19 DK 174237 B1 blev opnået adskillige kloner som kodede for en tilsvarende "lang form" af et humant protein.

Den "lange" form opstår tilsyneladende ud fra en forskel 5 i mRNA-splejsning, hvilket er vist i fig. 3. Den "ekstra" kodende sekvens i mRNA'et opstår ud fra det DNA, der ligger i opstrøms enden af exon 6; det splejses ind i den korte form. Forskellige mRNA-kodede LCSF'er adskiller sig også ved 3'-enden (men ikke i proteinsekvens) 10

Det cDNA, som koder for den "lange form", af proteinet fra bade musesystemet, og det humane system kan udtrykkes pa lignenede made som diskuteret for den korte form ovenfor. Egnede værtsorganismer inkluderer pattedyrceller 15 til opnåelse af en mere effektiv processering af det primære proteinprodukt og ved hjælp af ligering i ekspressionsvektorer, bakterier, gær, insektceller eller andre værtsorganismer.

20 Tilgængeligheden af DNA, som koder for hver af disse sekvenser, tilvejebringer selvfølgelig mulighed for at modificere codonsekvensen til frembringelse af muteinformer, som også har CSF-l-aktivitet.

25 Med disse værktøjer kan man således tilvejebringe den fuldstændige, kodende sekvens for human-CSF-1, ud fra hvilke der kan konstrueres ekspressionsvektorer, som kan anvendes i en række værtssystemer, og den kodesekvens kan udtrykkes. En række værtsorganismer, som er tilgængelige 30 sammen med ekspressionsvektorer, der er egnede til sadanne værtsorganismer, giver en mulighed for at vælge mellem posttranslationelle processeringssystemer og mellem miljøfaktorer, som tilvejebringer konformat ionsregulering af det således producerede protein.

35 20 DK 174237 B1

Det fremgår af teksten ovenfor, at dele af den CSF-1-kodende sekvens er brugbare som prober til opnåelse af andre CSF-l-kodende sekvenser i en række arter. Følgelig kan dele af cDNA'et eller af det genome DNA, som koder 5 for mindst 6 aminosyrer, replikeres i E. coli og de denaturerede former kan anvendes som prober til opnåelse af yderligere DNA'er, som koder for CSF-1. Fordi der måske ikke er en helt nøjagtig baseparring mellem nukleotidsekvensen i den humane form og den tilsvarende 10 del fra andre arter, er oligomerer, som indeholder ca. 18 nukleotider (kodende for den 6 aminosyrer lange strækning), sandsynligvis nødvendig til opnåelse af hydrolysering under betingelser med tilstrækkelig stringenthed til at eliminere falske positiver. De 15 sekvenser, som koder for de 6 aminosyrer, vil tilvejebringe tilstrækkelig information til sådanne prober.

C. Egne værtsorganismer, styringssystemer og metoder 20 Fremstillingen af en rekombineret form af CSF-1 involverer i generelle former typisk følgende:

Der opnås først et DNA, som koder for det modne (omfatter her alle muteiner) protein, præ-proteinet eller en fusion 25 af CSF-l-proteinet med en yderligere sekvens, som ikke ødelægger dets aktivitet, eller med en yderligere sekvens, som kan fraspaltes under styrede betingelser (såsom behandling med peptidase) til frembringelse af et protein. Hvis sekvensen ikke afbrydes af intronområder er 30 den egnet til ekspression i en hvilken som helst værtsorganisme. Hvis der er intronområder, kan der opnås ekspression i mammale systemer eller i andre eucaryote systemer, som er i stand til at processere dem. Denne sekvens skal være i en form, som kan udskæres og 35 genfindes. Den udskårne eller genfundne, kodende sekvens 21 DK 174237 B1 placeres derpå fortrinsvis i funktionsdygtig kobling med egnede styringssekvenser i en ekspressionsvektor, som kan replikeres. Vektoren anvendes til at transformere en egnet vært, og den transformerede vært dyrkes under 5 gunstige betingelser til effektuering af produktionen af rekombineret CSF-1. CSF-1 isoleres eventuelt fra mediet eller fra cellerne;* udvinding og oprensning af proteinet er måske ikke nødvendig i nogle tilfælde, hvor nogle urenheder kan tolereres. Til in vitro dyrkning af celler, 10 hvorfra der isoleres en lymfokinfaktor til indgivelse i et menneske, er fuldstændig renhed f.eks. ikke altid påkrævet. Direkte anvendelse i terapi ved indgivelse til en person vil selvfølgelig kræve oprensning af det frembragte CSF-1.

15

Hvert af de ovennævnte trin kan udføres på en række mader. De ønskede kodende sekvenser kan f.eks. opnås ved at fremstille egnet cDNA ud fra cellulær messenger og manipulere cDNA'et til opnåelse af den fulde sekvens.

20 Alternativt kan genome fragmenter opnås og anvendes direkte i passende værtsorganismer. Konstruktionerne til ekspressionsvektorer, som kan fungere i en række værtsorganismer, fremstilles ved at anvende passende replikoner og styringssekvenser, hvilket er anført 25 nedenfor. Egnede restriktionssteder kan, hvis de ikke normalt er til stede, tilføjes i enderne af den kodende sekvens til tilvejebringelse af et gen, som kan udskæres, til indsættelse i vektorerne.

30 Styringssekvenserne, ekspressionsvektorerne og transformationsmetoderne afhænger af den type værtscelle, som anvendes til at udtrykke genet. Nyttige værtsorganismer er på nuværende tidspunkt almindeligvis procaryote celler, gær, insektceller eller pattedyrceller. Eftersom 35 nativ CSF-1 secerneres som en glycosyleret dimer, 22 DK 174237 B1 formodede man, at værtssystemer, som var i stand til at udføre en korrekt posttranlationel processionering, var foretrukne. Eftersom procaryote værtsorganismer ikke er i stand til at udføre glycosylering eller styret dimeriser-5 ing, er disse værtsorganismer kun hensigtsmæssige, hvis den ikke-glycosylerede form kan oprenses og processeres c· til en aktiv form. Dette er, som det viste sig, tilfældet for CSF-1. CSF-1 kan fremstilles effektivt som en monomer i E. coli og kan genfoldes under anvendelse af forskel-10 lige metoder til en aktiv, ikke-glycosyleret, dimer form.

Der kan imidlertid også anvendes eucaryote celler. Navnlig insektceller eller pattedyrceller foretrækkes.

Hvis secernering er ønsket, er der større sikkerhed for, 15 at den native signalsekvens vil blive genkendt af insektcelleværterne eller pattedyrcelleværterne, hvilket gør en sadan secernering mulig, og oprensning er derfor lettere, CSF-1 produceres stabilt i CHO-celler, og kan også produceres stabilt i transformerede CV-l-celler og 20 virusinficerede insektceller.

I det specielle tilfælde med human-CSF-1 ophobes der nu evidens for, at en betragtelig deletion ved den C-terminale ende af proteinet kan forekomme både under 25 rekombinantbetingelser og nativbetingelser, og at aktiviteten af proteinet in vitro stadig bevares. Det ser ud til, at de isolerede native proteiner kan være i en eller anden form med C-terminal trunkering eller blandinger heraf og kan udvise variabel C-terminal 30 processering. Aktiviteten af disse "trunkerede" former er klart fastslået ved den tilsigtede produktion. Det mutein, som fremstilles ud fra DNA, der koder for SCSF/CV150, er f.eks helt aktivt i analyser for CSF-1, hvilket også gælder det, der produceres ud fra cDNA, som 35 koder for LCSF/CV190. Produkterne fra rekombinant 23 DK 174237 B1 ekspression af både de lange og korte former af generne synes at udvise molekylvægte på underenheder, som ligger lavere end man ville forvente udfra sekvensen i fuld længde. Det formodes, at "naturlig" processering kan ske 5 ved en række proteolytiske steder, herunder f.eks. i den lange form ved arg-resten ved 223, ved lys-resten ved 238, ved arg-resten ved 249 eller ved arg ved 411. Eftersom det er klart, at visse C-terminalt forkortede former er aktive, kan de konstruktioner, som anvendes, 10 også inkludere de tilsvarende forkortede former af den kodende sekvens.

C.1 Styrinqssekvenser og tilsvarende værtsorganismer 15 Procaryoter repræsenteres hyppigst ved forskellige stammer af E. coli. Der kan imidletid også anvendes andre mikrobielle stammer, såsom bacilli, f.eks. Bacillus subtilis, forskellige arter af Pseudomonas eller andre bakteriestammer. I sådanne procaryote systemer anvendes 20 plasmidvektorer, som indeholder replikationssteder og styringssekvenser, der hidrører fra en art, som er kompatibel med den anvendte værtsorganisme. E. coli transformeres f.eks. typisk ved at anvende derivater af pBR322, et plasmid, som Bolivar, et al., har afledt fra 25 en E. coli-art (Gene (1977), _2:95). pBR322 Indeholder gener for ampicillinresistens og tetracyclinresistens og tilvejebringer således yderligere markører, som enten kan bevares eller ødelægges ved konstruktion af den ønskede vektor. Almindeligt anvendte procaryote styringssekvens-30 er, som her defineres til at inkludere promotorer for transkriptionsinitiering, eventuelt med en operator, sammen med ribosombindingssekvenser, inkluderer almindeligt anvendte promotorer som β-lactamase (penicillinase) og laktose(lac) promotersystemer (Chang, et al., Nature 35 (1977), 198:1056 og tryphtophan (trp) promotersystemet 24 DK 174237 B1 (Goeddel, et al., Nucleic Acid Res (1980), £:4057 og den lamdaafledte P^-promoter samt N-gen ribosombindingstedet (Shimatake, et al., Nature (1981), 292:128), som er gjort nyttigt i form af en flytbar styringskassette. Der kan 5 imidlertid anvendes et hvilket som helst promotersystem, som er kompatibelt med procaryote celler.

Der var i begyndelsen nogen utilbøjelighed til at anvende bakteriesystemer i det specielle tilfælde med CSF-1 på 10 grund af dets høje grad af posttranslationel processer-ing, hvilken inkluderer glycosylering og dimerisering. Desuden er der et stort antal cysteinrester, navnlig i den N-terminale del af proteinet. Der er faktisk i alt 10 cysteinrester in LCSF-underenheden, hvor den sidste er 15 ved position 225; der er 7 i SCSF. Begge indeholder således cysteinrester ved positionerne 7, 31, 49, 90, 102, 139, 146; den lange form har yderligere cysteiner ved 157, 159 og 225. Det formodes, at processering til dannelse af dimer inkluderer dannelsen af multiple 20 intrakædebindinger og mindst én interkædebinding. Der findes imidlertid metoder til genfoldning af bakterielt frembragte proteiner af denne type, og der blev udviklet specifikke protokoller, der er nyttige ved fremstilling af oprenset, biologisk aktiv CSF-1 fra bakterier.

25

Ud over bakterier kan eucaryote mikrober, såsom gær, også anvendes som værtsorganismer. Laboratoriestammer af Saccharomyces cerevisiae, bagegær, er hyppigst anvendt, omend et antal andre stammer er almindeligt tilgængelige.

30 Skønt vektorer, som udnytter 2 μ replikationsorigin er illustreret, Broach, J.R., Meth. Enz. (1983), 101:307, kendes der andre plasmidvektorer, som er egnede til gærekspression (se f.eks. Stinchcomb, et al., Nature (1979), 282:39, Tschempe, et al., Gene (1980), £0:157 og 35 Clarke, L., et al., Meth. Enz. (1983), 101:300) .

25 DK 174237 B1

Kontrolsekvenser til gærvektorer inkluderer promotorer for syntesen af glycolytiske enzymer {Hess, et al., J.

Ådv. Enzyme Reg. (1968), 7:149; Holland, et al.,

Biochemistry (1978), 17:4900). Yderligere promotorer 5 indenfor fagområdet inkluderer promotorer for 3-phospho-glyceratkinase (Hitzeman, et al., J. Biol. Chem. (1980), 255:2073), og promotorerne for andre glycolytiske enzymer, såsom glyceraldehyd-3-phosphatdehydrogenase, hexokinase, pyruvatdecarboxylase, phosphofrucotokinase, 10 glucose-6-phosphatisomerase, 3-phosphoglyceratmutase, pyruvatkinase, triosephosphatisomerase, phosphoglucose-isomerase og glucokinase. Andre promotorer, som har den yderligere fordel, at transkriptionen er styret af vækstbetingelser, er prorooterområderne for alkoholdihydro-15 genase 2, isocytochrom C, sur phosphatase, nedbrydende enzymer i forbindelse med nitrogenmetabolisme, samt enzymer, som er ansvarlige for udnyttelse af maltose og galactose (Holland, se ovenfor) . Man formoder også, at terminatorsekvenser ved 3'-enden af de kodende sekvenser 20 er ønskelig. Sådanne terminatorsekvenser findes i det ikke-translaterede 3'- område efter de kodende sekvenser i gærafledte gener. Mange af de her illustrerede vektorer indeholder styringssekvenser hidrørende fra det enolase-genholdige plasmid peno46 (Holland, M.J., et al., 25 Biol, Chem, (1981), 256:1385) eller LEU2-genet opnået fra YEpl3 (Broach, J., et el., Gene (1978), 8:121), men en hvilken som helst vektor, som indeholder en gærkompatibel promoter, replikationsorigin og andre styringssekvenser er egnet, 30

Det er selvfølgelig også muligt at udtrykke andre gener, som koder for polypeptider i eucaryote værtscellekulturer hidrørende fra multicellulære organismer. Se f.eks.

Tissue Culture, Academic Press, Cruz og Patterson, 35 redaktører (1973). Brugbare værtscellelinier omfatter 26 DK 174237 B1 musemyelomaer N51, VERO og HeLa-celler, samt kinesiske hamster ovarieceller (CHO-celler) . Ekspressionsvektorer for sådanne celler inkluderer almindeligvis promotorer og styringssekvenser, som er kompatible med pattedyrceller, 5 såsom f.eks. de almindeligt anvendte tidlige og sene promotorer fra abevirus 40 (SV 40) (Fiers, et al., Nature (1978), 273:113), eller andre virale promotorer, såsom de promotorer, der er afledt fra polyoma, Adenovirus 2, bovin papiloraa virus eller fugle sarcoma vira eller 10 immunoglobulinpromotorer og varmechokpromotorer.

Generelle aspekter af pattedyrcelleværtssystemtransforma-tioner er blevet beskrevet af Axel i US patent nr. 4.399.216, udstedt 16. august, 1983. Det ser nu også ud til, at "forstærker"-områder (eng: enhancer regions) er 15 vigtige ved optimering af ekspression; disse er almindeligvis sekvenser, som findes opstrøms promoter-området. Replikationsstartsteder kan om ønsket opnås fra virale kilder. Integration i kromosomet er imidlertid en almindelig mekanisme for DNA-replikation i eucaryote 20 celler. Planteceller er nu også tilgængelige som værtsorganismer og der findes styringssekvenser, som er kompatible med planteceller, såsom nopalinsynthase promotoren og polyadenylationsignalsekvenserne (Depicker, A., et al., J. Mol. Appl. Gen. (1982), 1:561).

25

For nylig er der endvidere blevet beskrevet ekspressionssystemer, som udnytter insektceller, der anvender styringssystemer fra baculovirusvektorer (Miller, D.W., et al., i Genetic Engineering (1986), Setlow, J.K., et 30 al. redaktører, Plenum Publishing, bind 8. side 277-297).

Disse systemer er også velegnede ved fremstilling af CSF-1.

27 DK 174237 B1 C.2 Transformationer

Afhængig af den anvendte værtscelle udføres transformation under anvendelse af standardmetoder, som 5 er egnede til sådanne celler. Calciumbehandlingen, som calciumchlorid, hvilket er beskrevet af Cohen, S.N.,

Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) (1972), 69:2110 anvendes til procaryote celler og andre celler, som indeholder væsentlige cellevægbarrierer. Infektion med Aqrobacterium 10 tumefaciens (Shaw, C.H., et al., Gene (1983), 23:315) anvendes til visse planteceller. Til pattedyrceller uden sådanne cellevægge foretrækkes calciumphosphatpræcipita-tionsmetoden ifølge Graham og van der Eb, (Virology (1978), _52:546) . Transformationer i gær udføres ved frem-15 gangsmåden ifølge Van Solingen, P., et al., J. Bact.

(1977), 130:946 og Hsiao, C.L., et al, Proc. Natl. Acad.

Sci. (USA) (1979), 76:3829.

C.3 Probering af mRNA med Northern Blot; probe af cDNA 20 eller genome biblioteker_ RNA blev fraktioneret til Northern blot ved agarosepladegelelektroforese under helt denaturerende betingelser under anvendelse af formaldehyd (Maniatis, 25 T., et al., Molecular Cloning (1982), Cold Spring Harbor

Press, side 202-203) eller i 10 mM methylkviksølv (CHgHgOH) (Bailey. J.M., et al., Anal. Biochem. (1976), 70:75-85, og Sehgal,P.B., et al,. Nature (1980), 288:95-97) som denatureringsmiddel. For methylkviksølvgeler blev 30 1,5% geler fremstillet ved at smelte agarose i elektroforesepuffer (100 mM borsyre, 6 mM natriumborat, 10 mM natriumsulfat, 1 mM EDTA, pH 8,2), afkøle til 60°C og tilsætte 1/100 volumen af 1 M CH3HgOH. RNA’et blev opløst i 0,5 x elektroforesepuf fer og denatureret ved 35 inkubering med 10 mM methylkviksølv i 10 minutter ved 28 DK 174237 B1 stuetemperatur. Til påsætning af prøverne blev der tilsat glycerol (201) og bromphenolblåt (0,05%). Prøverne blev underkastet elektroforese ved 500-600 volt x time med recirkulerende puffer. Efter elektroforesen blev gelen 5 vasket i 40 minutter i 10 mM 2-mercaptoethanol til afgiftning af methylkviksølvet, og der blev fremstillet Northern blot ved at overføre RNA’et fra gelen til et membranfilter.

10 cDNA Eller genome biblioteker blev screenet under anvendelse af kolonihybridiseringsproceduren eller plaquehybridiseringsproceduren. Bakterielle kolonier eller plague for fager overføres på to nitrocellulose-filterpapirer (S & S type BA-85). Plaquene eller 15 kolonierne blev lyseret, og DNA blev fikseret til filteret ved sekventiel behandling i 5 minutter med 500 mM NaOH, 1,5 M NaCl. Filtrene blev vasket to gange i 5 minutter hver gang med 5 x standard salincitrat (SSC) og blev lufttørret og bagt ved 80°C i to timer.

20

Gelerne til Northern blot eller duplikatfiltrene til cDNA-screening eller genomscreening blev præhybriseret ved 25-42°C i 6-8 timer med 10 ml DNA-hybriseringspuffer pr. filter uden probe (0-50% formamid, 5-6 x SSC, pH 7,0, 25 5 X Denhardt's opløsning (polyvinylpyrrolidin, plus

Ficoll og bovinserumalbumin; 1 x = 0,02% af hver), 20-50 mM natriumphosphatpuffer ved pH 7,0, 0,2% SDS, 20 pg/ml poly U (nar c DNA proberes) , og 50 μg/ml denatureret laksesperm DNA). Prøverne hybridiseres derefter ved 30 inkubering ved den passende temperatur i fra ca. 24 til 36 timer under anvendelse af hybridiseringspufferen, som indeholder kinasebehandlet probe (for oligomerer). Længere cDNA-prober eller prober af genomfragment blev mærket ved nick-translation eller ved primer forlængelse.

35 29 DK 174237 B1

Præhybridiserings- og hybridiseringsbetingelserne afhænger begge af den ønskede stringenthed og varierer f.eks. med probelængden. Typiske betingelser for forholdsvis lange prober (f.eks. mere en 30-50 nukleotider) udnytter 5 en temperatur på 42-55°C og en hybridiseringspuffer, der indeholder ca. 20%-50% formamid. For de lavere stringentheder, som er nødvendige for oligomere prober på ca. 15 nukleotider, anvendes lavere temperaturer på ca. 25-42°C, og lavere formamidkoncentrationer (0%-20%) . For længere 10 prober kan filtrene f.eks. vaskes 4 gange i 30 muinutter, hver gang ved 40-55°C med 2 x SSC, 0,2% SDS og 50 mM natriumphosphatbuffer ved pH 7, derefter vaskes to gange med 0,2 x SSC og 0,2% SDS, lufttørres og autoradio-graferes ved -70°C i fra 2 til 3 dage. Vaskebetingelserne 15 er noget mindre skrappe for kortere prober.

C.4 Vektorkonstruktion

Konstruktion af egnede vektorer, som indeholder de 20 ønskede kodesekvenser og styringssekvenser, udnytter standard ligeringsmetoder og restriktionsmetoder, som er velkendte indenfor fagområdet. Isolerede plasmider, DNA-sekvenser eller synthetiserede oligonukleotider spaltes, forsynes med en hale og genligeres i den ønskede form.

25

Stedsspecifik DNA-spaltning udføres ved behandling med det hensigtsmæssige restriktionsenzym (eller enzymer) under betingelser, som er velforståede inden for fagområdet, og under de forhold, som er specificeret af 30 producenten af disse restriktionsenzymer, som kan fås kommercielt. Se f.eks. produktkataloget fra New England Biolabs. Generelt spaltes ca. 1 plasmid eller DNA-sekvens med en enhed enzym i ca. 20 μΐ pufferopløsning; i eksemplerne her anvendes typisk et overskud af 35 restriktionsenzym for at sikre fuldstændig fordøjelse af 30 DK 174237 B1 DNA-substratet. Inkubationstider på fra ca. 1 time til ca. 2 timer ved ca. 37°c kan anvendes, omend variationer kan tolereres. Efter hver inkubering fjernes protein ved ekstraktion med phenol/chloroform, og kan efterfølges af 5 etherekstraktion, og nukleinsyren udvindes fra de vandige fraktioner ved præcipitering med ethanol. Om ønsket kan der udføres størrelsesseparation af spaltede fragmenter ved polyacrylamidgelelektroforese eller agarosegel-elektroforese under anvendelse af standardmetoder. En 10 generel beskrivelse af disse størrelsesseparationer findes i Methods in Enzymoloqy (1980), 65:499-560.

Restriktionsspaltede fragmenter kan forsynes med stumpe ender ved at behandle med det store fragment af E. coli 15 DNA-polymerase I (Klenow) i nærværelse af de 4 deoxy- nukleotidtriphosphater (dNTP'er) under anvendelse af inkuberingstider pa fra ca. 15 til 25 minutter ved fra 20 til 25°C i 50 mM Tris, pH 7,6, 50 mM NaCl, 6mM MgC^, 6 mM dTT og 5-10 μΜ dNTP’er. Klenow-fragmentet udfylder ved 20 de klæbrige 5’-ender, men fjerner fremstikkende 3'- enkeltstrenge, selvom de 4 dNTP'er er til stede. Om ønsket kan selektiv reparation udføres ved kun at tilføre den ene eller udvalgte dNTP'er inden for de begrænsninger, som dikteres af naturen af de klæbrige 25 ender. Efter behandling med Klenow-fragmentet ekstraheres blandingerne med phenol/chloroform og ethanol præcipiter-es. Behandling med SI nuklease under passende betingelser resulterer i hydrolyse af alle enkelsstrengede dele.

30 Syntetiske oligonukleotider kan fremstilles ved triester-metoden ifølge Matteucci, et al., (J. Am. Chem. Soc.

(1981), 103:3185-3191) eller under anvendelse af auto matiserede syntesemetoder. Kinasebehandling af enkels-strenge forud for reassociering (eng: annealing) eller 35 mærkning opnås ved at anvende et overskud, f.eks. ca. 10 31 DK 174237 B1 enheder polynukleotidkinase, i forhold til 1 nM substrat i nærværelse af 50mM Tris, pH 7,6, 10 mM MgC^, 5 roM di- thiothreitol, 1-2 mM ATP. Hvis kinasebehandlingen er til mærkning af proben vil ATP'et indeholde 32γΡ med høj 5 specifik aktivitet.

Ligering må udføres i volumerne på 15-30 μΐ under følgende standardbetingelser og -temperaturer: 20 mM

Tris-Cl pH 7,5, 10 mM MgCl2, 10 roM dTT, 33 pg/ml BSA, 10 10 mM-50 roM NaCl, og enten 40 μΜ ATP, 0,01-0,02 (Weiss) enheder T4 DNA-ligase ved 0°C (for ligering af "klæbrige ender") eller 1 mM ATP, 0,3-0,6 (Weiss) enheder T4 DNA-ligase ved 14°C (for ligering af "stumpe ender"). Ligeringer af intermolekylære "klæbrige ender" udføres 15 sædvanligvis ved totale DNA-koncentrationer på 33-100 ug/ml (total slutkoncentration 5-100nM). Ligeringer af intermolekylære stumpe ender (Hvortil der sædvanligvis anvendes et 10-30 gange molært overskud af linkere) udføres ved totale slutkoncentrationer på 1 μΜ.

20

Ved vektorkonstruktioner, hvortil der anvendes "vektor-fragmenter" behandles vektorfragmentet sædvanligvis med bakteriel alkalisk phosphatase (BAP) for at fjerne 5'-phosphat og forhindre genligering af vektoren. BAP-25 fordøjelser udføres ved pH 8 i ca. 150 mM Tris i nærværelse af Na+ og Mg+2 under anvendelse af ca. en enhed BAP pr. μg vektor ved 60°C i ca. 1 time. For at udvinde nukleinsyrefragmenterne ekstraheres præparatet med phenol/chloroform og ethanol-præcipiteres. Alternat-30 ivt kan genligering forhindres i vektorer, som er blevet dobbelt fordøjede ved en yderligere restriktionsenzymfordøjelse af de uønskede fragmenter.

32 DK 174237 B1 C.5 Modifikation af DNA-sekvenser

For dele af vektorer, som er afledt fra cDNA eller genomt DNA, som kræver sekvensmodifikationer, blev der anvendt 5 stedsspecifik, primerstyret mytagenisering. Denne metode er nu en standardmetode inden for fagområdet og udføres under anvendelse af et syntetisk primeroligonukleotid, som er komplementært til enkeltstrengede fag-DNA, som skal mutageniseres, med undtagelse af begrænset fej Ι-ΙΟ parring, som repræsenterer den ønskede mutation. I korthed anvendes det syntetiske oligonukleotid som en primer til at styre syntese af en streng, som er komplementær med fagen, og det fremkomne, dobbeltstrengede DNA transformeres ind i en fagnærende 15 værtsbakterie. Kulturer af de transformerede bakterier udplades i topagar, hvilket muliggør plaquedannelse ud fra enkeltceller, som rummer fagen.

Teoretisk vil 50* af de nye plaquer indeholde fagen med 20 den muterede form som en enkelt streng; 50% vil have den oprindelige sekvens. Plaquene hybridiseres med kinase-behandlet, syntetisk primer ved en temperatur, som tillader hybridisering af en nøjagtig baseparring, men ved hvilken fejlparringerne i den oprindelige streng er 25 tilstrækkelig til af forhindre hybridisering. Plaquer, som hybridiserer med proben opsamles derefter, dyrkes, og DNA'et udvindes. Detaljer vedrørende stedsspecifikke mutageneriseringsprocedurer er beskrevet nedenfor i specifikke eksempler.

30 C.6 Verifikation af konstruktion I de nedenfor anførte konstruktioner bliver korrekte ligeringer for plasmidkonstruktioner bekræftet ved først 35 at transformere E. coli, stamme MM294 eller en anden 33 DK 174237 B1 egnet vært med ligeringsblandingen. Vellykkede tranform-anter blev udvalgt blandt ampicillinresistens/ tetracyclinresistens eller en anden antibiotikaresistens eller under anvendelse af andre markører, afhængig af den 5 måde plasmidet er konstrueret på, hvilket en fagmand vil forstå. Der fremstilles derefter plasmider fra transformanterne ved fremgangsmåden ifølge Clewell/ D.B., et al.,

Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) (1969), 62:1159, eventuelt efterfulgt af chloramphenicolamplification (Clewell,

10 D.B., J. Bacteriol. (1972), 110:667. Det isolerede DNA

analyseres ved restriktionsmetoden og/eller sekventeres ved dideoxymetoden ifølge Sanger, F., et al., Proc. Natl.

Acad. Sci. (USA) (1977), 7£:5463, hvilket er yderligere beskrevet af Messing, et al., Nucleic Acid Res. (1981), 15 9:309, eller ved fremgangsmåden ifølge Maxam, et al.,

Methods in Enzymology (1980), 65:499.

C. 7 Eksempler på værtsorganismer 20 De værtsstammer, som anvendes heri ved kloning og ekspression, er følgende:

Til kloning og sekventering og til ekspression af konstruktioner under styring af de fleste bakterielle 25 promotorer, blev der som vært anvendt E. coli, stamme MM294, der er opnået fra E. coli Genetic Stock Center GCSC nr. 6135. Til ekspresssion under styring af plnRBS~ promoteren blev E. coli, stamme K12 MC1000 lambdalysogen, n7n53cI$357SusP80' atcc 39531 anvendt.

30

Til M13-fagrekombinanter blev der anvendt E. coli-stammer, som er følsomme overfor faginfektion, såsom E. coli K12, stamme DG98. Stammen DG98 er blevet deponeret hos ATCC 13. juli 1984 og har deponeringsnummer 39768.

35 34 DK 174237 B1

Pattedyrekspression er her blevet opnået i C0S-7-, COS-A2-, CV-1- og CHO-celler.

D. Foretrukne udførelsesformer 5

De rekombinerede CSF-l-proteiner ifølge den foreliggende opfindelse kan betragtes som to sæt af "basale" proteiner, N-terminal muteiner af LCSF og N-terminal muteiner af SCSF. Disse proteiner har en primær 10 aminosekvens, som ligner hinanden, men som ikke er identisk, samt forskellige længder, og alle udviser det aktivitetsmønster, som er karakteristisk for CSF-1, eller kan specifikt spaltes til et mutein, som udviser det aktivitetsmønster, som er karakteristisk for CSF-1, det 15 vil sige, at de er i stand til at stimulere knoglemarvsceller til hovedsageligt af differentiere til monocytter, og som indenfor de begrænsninger, der er anført i definitionsafsnittene ovenfor, er immunoreaktive med antistoffer, der er rejst mod nativ CSF-1 og med de 20 receptorer, der er knyttet til CSF-l-aktivitet. Visse udførelsesformer af muteiner, som havde reference til SCSF, blev ikke specifikt beskrevet i PCT-ansøgningen publikation nr. WO86/04607, som er baseret på prioriteten fra adskillige modansøgninger. I denne EPO-ansøgning er 25 de lange former af human-cSF-1 og de lange former af muse-CSF-1 ejheller beskrevet; nærmere bestemt LCSF og dens beslægtede muteiner. Visse N- og C-terminaldeleterede former af LCSF foretrækkes navnlig.

30 Nogle specifikke udførelsesformer for SCSF-muteiner er beskrevet i EPO-ansøgningen. Som anført i EPO-ansøgningen kan position 59 variere mellem asp og tyr - det vil sige, at udover den SCSF, som oprindeligt blev fundet, omfattes muteiner, hvor SCSF-sekvensen er ændret ved udskiftningen 35 af tyr med asp ved position 59 (det vil sig asp5g-SCSF).

35 DK 174237 B1

Omvendt har LCSF asp ved position 59, og denne kan udskiftes med tyr (ty^g-LCSF) .

Her beskrives den klasse af muteiner af SCSF og LCSF, som 5 mangler de to eller tre aminosyrerester i den N-terminale ende og således har en N-terminal sekvens udvalgt blandt val-ser-glu-tyr-cys-ser og ser-glu-tyr-cys-ser.

Forskellige muteiner med en C-terminal deletion har også 10 speciel interesse. I den ovenfor nævnte EPO-ansøgning beskrives der kun forkortede former for SCSF - og kun CV158 og længere former. Ud fra den kendte viden er det ikke klart, i hvilken udstrækning de native proteiner processeres fra den C-terminale ende in vivo. Det har nu 15 vist sig, at i det mindste det C-terminale område indtil aminosyre 150 i SCSF kan fjernes, og at proteinet vil bevare in vitro CSF-l-aktivitet i knoglemarvproliferer-ingsanalysen. Det antages endvidere, at den 23 aminosyrer lange hydrofobe sekvens, som går fra position 166-188 i 20 den korte form og fra 464-486 i den lange form, kan have en membranforankrings funktion og kan separeres fra proteinet, når det transporteres gennem membranen og secerneres. Denne del kan også være ansvarlig for selve " membranbindingen og tillader, at CSF-1, når det er bundet 25 til cellemembraner, vekselvirker med andre celler på bindingsstedet. Disse sekvenser kan uafhængigt være helt eller delvis unødvendige. I alle tilfælde ser det ud til, at former af CSF-1, som er betragteligt kortere end både den SCSF- og LCSF-kodede, findes ved isolering af det 30 native protein og i de secernerede proteiner, som opnås ved rekombinant fremstillingen. Nuværende resultater indikerer, at ekspression af konstruktioner, som koder for SCSF i CV-1 celler, kan resultere i SCSF/CV158 i supernatanten.

35 36 DK 174237 B1

Indenfor den foreliggende opfindelses rækkevidde er derfor CSF-l-proteiner, som omfatter de aminsyre-sekvenser, der kun indeholder de første 150 aminosyrer af SCSF eller LCSF eller de muteiner, hvor position 59 er 5 tyr eller asp, hvilket er beskrevet ovenfor (som derfor er identiske med undtagelse af den sidste aminosyre) eller NV2- eller NV3-varianterne heraf, eventuelt forlænget med et vilkårligt antal aminosyrer i en yderligere sekvens. I denne gruppe foretrækkes specielt C-terminale 10 deletioner svarende til SCSF/CV150, SCSF/CV158, LCSF/CV150, LCSF/CV190, LCSF/CV191, CSF/CV221, LCSF/-CV223, LCSF/CV236, LCSF/CV238, LCSF/CV249, LCSF/CV258 og LCSF/CV411 og deres tilsvarende NV2- og NV3-former.

15 Ligeledes foretrækkes konstruktioner, som koder for de ovennævnte C-terminale deletioner, hvori der er foretaget modifikationer af en eller flere aminosyrer, fortrinsvis fra 1 til 5 aminosyrer mere fortrinsvis fra 1 til 2 aminosyrer i sekvensen fra den "basale" sekvens.

20

De forskellige CSF-l-former kan således også indeholde mutationer, som ikke ødelægger funktionaliteten i omrader, som ikke er kraftigt konserverede blandt arterne. Disse er deletioner af 1 til 5 aminosyrer 25 og/eller substitutioner af positionerne 15-20, 51-52 og/eller 75-84. Et yderligere område af denne type er 191-193 i SCSF og 489-491 i LCSF. I ovennævnte EPO-publikation beskrives kun mutanter af SCSF og den C-terminale mutein deraf deleteret til CV158; følgelig er 30 ovennævnte muteiner nye, eftersom de har relation til bade den lange LCSF form og muteinerne heraf og til den

yderligere forkortede form SCSF/CV150-158. Det har navnlig vist sig, at glu52-formerne af både SCSF og LCSF

samt deres muteiner er aktive.

35 37 DK 174237 B1

Det er også vist her, at ændringen af et eller flere glycosyleringssteder kan resultere i aktive proteiner, LCSF har 4 glycosyleringssteder - ved 122-124, 140-142, 349-351 og 383-385; SCSF har kun de to førstnævnte.

5 Ligeledes inkluderet er derfor også enhver mutein, som indeholder en inaktiverende mutation ved et eller flere af disse steder.

Det har ligeledes vist sig, at cysteinet ved position 90 10 kan undværes med hensyn til immunoreaktivitet. Følgelig er muteiner, som er alagg eller ser90 inkluderet, når det foreliggende formål alene bygger på antigenecitet.

Cysteinerne ved 157 og 159 i LCSF er også undværlige med 15 hensyn til aktivitet, og ser 157-, ser 159- og ser 157 ser 159 LCSF-muteinerne (herunder de N- og C-terminal-deleterede former) udviser forbedret homogenitet ved HPLC. Det antages også, at de formodede membranforankringsomrader i både LCSF og SCSF er undværlige for nogle 20 typer CSF-l-aktivitet.

Foretrukne udførelsesformer for CSF-l-kodende DNA.

Den DNA-sekvens, som koder for proteinet, kan udover at 25 modificere aminosyresekvenserne modificeres for at hjælpe med til ekspression i bestemte systemer. I E. coli, for eksempel, resulterer ændringer af codonerne for de første 6 aminosyrer i den native sekvens til de aminosyrer, som er begunstigede i bakterier, i højere produktionsniveauer 30 for både LCSF og SCSF og for deres trunkerede former. Vektorer (der nedenfor betegnes O/E for "overekspression") indeholder således DNA'er med den N-terminale kodende sekvens GAAGAAGTTTCTGAATAT eller NV- eller NV3-trunkeringer heraf. Dette tilvejebringes i et syntetisk 38 DK 174237 B1

Hindlll/BstXI-fragment, og adskiller sig fra den native sekvens GAGGAGGTGTCGGAGTAC i de viste understregne positioner. Et aspekt af opfindelsen inkluderer, at når det CSF-1 kodende DNA skal udtrykkes intracellulært i 5 bakterier tilvejebringes det i en form, hvori et passende antal codoner ved den N-terminale ende udvælges ifølge reglerne for bakterieforetrukne codoner.

I forbindelse med bakteriel ekspression kan DNA-sekvens-10 erne opstrøms ATG i position 65 ligeledes være modificeret for at forhindre anvendelse af denne ATG som et internt startsted. Dette er et mere alvorligt problem for ty^g- end for asp5g-konstruktioner. En primer med sekvensen 5'-3T 15 Λτ * + + +

GG TACAAGATAT CAT GGAAGATACAAT GC GC T T C

anvendes ved stedsspecifik mutagenisering til frembring-20 else af de med * angivne ændringer i det native gen. Der sker ingen ændring i de kodede aminosyrer.

E. Anvendelse og indgivelse.

25 CSF-l-proteinerne ifølge den foreliggende opfindelse er både i stand til at stimulere monocytforstadiet/makro-fagcelleproduktion ud fra knoglemarvsstamceller, hvorved immunsystemets effektivitet forøges, og i disse differentierede celler til at stimulere funktioner, såsom 30 secerneringen af lymfokiner i de modne makrofager. De er ligeledes nyttige infektionsbekæmpende midler, navnlig som antivirale og antimikrobielle midler.

En anvendelse af disse proteiner er som hjælpemiddel ved 35 kemoterapi. Det er velkendt, at kemoterapeutisk behand- 39 DK 174237 B1 ling resulterer i undertrykkelse af immunsystemet. Skønt det ved kemoterapeutiske behandlinger lykkes at ødelægge de tumorceller, hvorimod de er rettet, resulterer kemoterapeutiske behandlinger ofte i personens død på 5 grund af de keraotoksiske midlers bivirkninger på immun-systemts celler. På grund af CSF-1’s evne til at mediere og forøge væksten og differentieringen af knoglemarvsafledte forstadier til makrofager, resulterer indgivelsen af CSF-1 i sådanne patienter i en restimulering af 10 immunsysternet til forebyggelse af denne bivirkning og dermed til forhindring af patientens tilbøjelighed til at bukke under for sekundær infektion. Andre patienter, som vil være hjulpet af en sådan behandling, inkluderer de patienter, som behandles for leukæmi ved hjælp af knogle-15 marvstransplantationer; de er ofte i en immunundertrykt tilstand for at forhindre afstødelse. For disse patienter kan immunundertrykkelsen også blive ophævet ved indgivelse af CSF-1.

20 Generelt vil enhver person, som lider af immunundertrykkelse, hvad enten det skyldes kemoterapi, knoglemarvstransplantation eller andre tilfældige former for immunundertrykkelse, såsom sygdomme (f.eks. erhvervet immun-_ defekt syndrom), have fordel af, at CSF-1 er tilgængeligt 25 til farmakologisk brug. Ydermere kan personer tilføres forøgede mængder af tidligere differentierede makrofager til supplering af de for systemet native makrofager, hvilke udefra kommende makrofager produceres ved in vitro dyrkning af knoglemarvspræparater eller andre egnede 30 præparater behandlet med CSF-1. Disse præparater inkluderer præparater fra patientens egne blodmonocytter, som kan dyrkes og føres tilbage til lokal eller systemets terapi.

40 DK 174237 B1 CSF-l's evne til at stimulere makrofagers produktion af lymfokiner og til at forøge deres evne til at dræbe målceller, gør også CSF-1 direkte nyttig ved behandling af neoplasmaer og infektioner.

5 CSF-1 stimulerer museafledte makrofagers produktion af interferoner (Fleit, H.B., et al., J. Cell. Physiol.

(1981) , 108:347, og delvis oprenset human-CSF-1 fra MIAPaCa-celler stimulerer humane monocytters poly IC- 10 inducerede produktion af interferon og TNF. Ydermere stimulerer CSF-1 humane blodmonocytters produktion af myeloid CSF.

Behandling af patienter, der lider af AIDS, med CSF-1 15 alene eller sammen med erythropoietin og/eller et antiviralt middel og/eller IL-2, er omtalt i W087/03204, publiceret 4. juni 1987. I beskrivelsen til US

patentskrift nr. 4.482.485, udstedt 13. november, 1984, angives, at CSF-1 kan anvendes som en supplering til 20 behandling af kræft. I EP nr. 118.915, publiceret 19. september, 1984, angives endvidere anvendelse af CSF-1 til forhindring og behandling af granulocytopeni og makrofagocytopeni hos patienter, der modtager kræftbehandling, til forhindring af infektioner og til 25 behandling af patienter med implanteret knoglemarv.

Ralph, et al., Cell. Immunol. (1987), 105:270-279 rapporterer den tilføjede tumordræbende virkning ved en kombination af CSF-1 og lymfokin på musesarcoma TU5-målceller.

30 (Muse-CSF-1 rapporteres uoverensstemmende til at stimulere muse makrofager til at være cytostatiske over P815-tumorceller (Wing, E.J., et al., J. Clin. Invest.

(1982) , 69:270) eller ikke at dræbe andre 35 leukæmimålceller (Ralph, P., et al., Cell. Immunol.

41 DK 174237 B1 (1983), 76:10). Nogawa, R.T., et el., Cell. Immunol.

(1980), 53:116, rapporterer, at CSF-1 kan stimulere makrofager til at fordøje og dræbe gærceller.) 5 CSF-1 kan således ud over at overvinde immunoundertrykkelse i sig selv anvendes til at ødelægge de invaderende organismer eller maligne celler indirekte ved at stimulere makrofag sekretioner og aktivitet.

10 CSF-1 kan anvendes sammen med andre lymfokiner eller cytokiner, såsom f.eks. oc-IFN, β-IFN, γ-IFN, IL-1, IL-2, IL-3, IL-4 eller TNF til at dræbe tumorer.

CSF-1 ifølge opfindelsen kan formuleres på traditionel 15 standard måde inden for fagområdet til indgivelse af proteinsubstanser. Indgivelse ved injektion foretrækkes; formulationer inkluderer opløsninger eller suspensioner, emulsioner eller en fast sammensætning til rekonstituering til injicerbare opløsninger. Egnede ekscipienser 20 inkluderer f.eks. Ringer's opløsning, Hank's opløsning, vand, salin, glycerol, dextrose opløsninger og lignende opløsninger. Endvidere kan CSF-1 ifølge opfindelsen præinkuberes med præparater af celler for at stimulere egnede svar og enten kan hele præparatet eller super-25 natanten herfra indføres i individet. Som vist nedenfor er de materialer, som produceres som svar på CSF-1-stimulering ved forskellige typer blodceller effektive mod ønskede målceller og disse blodcellers egenskaber til at angribe invaderende vira eller neoplasmaer kan forøg-30 es. Individets egne celler kan udtages og anvendes på denne måde, eller der kan f.eks. anvendes monocytter eller lymfocytter fra et andet kompatibelt individ ved inkubering.

42 DK 174237 B1

Det foretrækkes, at "humane" former af CSF-1 anvendes i farmaceutiske sammensætninger.

F. Kloning og ekspression af human-CSF-1 5

Det følgende illustrerer de metoder, som anvendes til opnåelse af den for human-CSF-1 kodende sekvens, til anvendelse af denne sekvens i ekspressionsvektorer og til opnåelse af ekspression af det ønskede protein.

10 Selvfølgelse behøver genfindelse af DNA'et ikke at gentages; de beskrevne sekvenser kan opnås delvis eller totalt ved syntese.

F. 1 Oprensning af nativ, human-CSF-1 og probe udformning 15

Humanurin-CSF-1 blev delvis oprenset ved standard metode som beskrevet af Das, S.K., et al., Blood (1981), 58:630, efterfulgt af et affinitetsoprensningstrin under anvendelse af monoklonalt rotteantistof mod muse-CSF-1, 20 betegnet YYG106, bundet til en Sepharose 4B søjle (Stanley, E.R., Methods Enzymol. (1985), 116:564) . Slut-trinnet i oprensningen var HPLC med omvendt fase i et puffersystem af 0,1% TFA/30% acetonitril - 0,1% TFA/60% acetonitril. Oprensningsdetaljerne og -resultaterne samt 25 udformningen af proberne er beskrevet i PCT-ansøgningen WO86/04607 (se ovenfor).

F. 2 Fremstilling af den human-genomsekvens 30 En humangenomsekvens, som koder for CSF-1, blev opnået fra Maniatis' humangenom-bibliotek i λ-fag Charon 4, under anvendelse af prober, som var udformet til at kode for den N-terminale sekvens af humanprotein, som beskrevet i PCT-ansøgningen W086/04607 (se ovenfor). En 35 Charon 4A-fag, som indeholdt CSF-1 sekvensen vurderet ved 43 DK 174237 B1 hybridisering til en probe som nedenfor beskrevet og betegnet phCSF-1 blev deponeret hos American Type Culture Collection (ATCC) 2. april, 1985 og har deponeringsnummer 40177. Ved senere undersøgelse af denne fag viste det 5 sig, at der var foregået omskiftninger og/eller deletioner, og de korrekte sekvenser blev ikke bevaret. Derfor blev en alternativ koloni, som var opnået fra det genome bibliotek på tilsvarende måde og opformeret til bekræftelse af stabilitaten via replikering, betegnet phCSF-la 10 og blev deponeret hos ATCC 21. maj, 1985 og fik deponeringsnummer 40185. phCSF-la Indeholdt en 18 kb lang indføjelse og var i stand til at frembringe restriktions-enzymfordøjelser, der også hybridiserede til proben, og den blev anvendt til sekvensbestemmelse og yderligere..

15 probekonstruktion.

Hele det 18 kb lange gen, som fandtes i phCSF-la, blev sekventeret. Genet indeholdt 9 exonområder adskilt af 8 intronområder, når der blev sammenlignet med pcCSF-17-20 sekvenserne i fig. 1. Områderne i det cDNA, som kode for det modne protein, svarer nøjagtigt til de genome exoncodoner med undtagelse af codon 59; den "lange form" af det humane CSF-l-protein viste et forlænget kodende område ved 5’-enden af exon 6, hvilket er beskrevet 25 yderligere nedenfor.

Fig. 3 repræsenterer et diagram af den genome struktur for human CSF-1. Det første exonområde indeholder en ikke-translateret 5'-sekvens og de første 13 aminosyre-30 rester af signalsekvensen. De resterende 19 aminosyrer i signalsekvensen og de første 22 aminosyrer i det modne CSF-l-protein er kodet i det andet exonområde. Stop-codonen forekommer i exon 8, der også omfatter 9 bp af den ikke-translaterede 3'-sekvens. Genet strækker sig 35 over ca. 18 kb og indeholder mindst 9 exonområder, højst 44 DK 174237 B1 sandsynlig 10, der i størrelse ligger fra 63 bp til et formodet maksimum på 2-3 kb. Det formodes, at den ikke-translaterede 3'-sekvens kan være afsluttet enten med exon 9 eller med exon 10. Skønt der er vist to separate 5 exon områder, er det ikke klart, om der er et niende intronområde og et tiende exonområde eller om der ligger et alternativt splejsningssted i exon 9. Som beskrevet yderligere nedenfor fremkommer den korte form af CSF-1 fra udnyttelsen af splejsningsstedet mod 3'-enden i exon 10 6; den lange form fremkommer fra splejsningsstedet på det sted, som i fig. 3 er vist som begyndelsen af dette exonområde.

Størrelserne af de i fig. 3 viste exon- og intronområder 15 er følgende: EXON STØRRELSE (bp) INTRON STØRRELSE (kb) 20 1 217 I 3,1 2 123 II 1,3 3 63 III 1,3 4 171 IV 4,6 5 148 V 1,2 eller 2,1 25 6 1025 eller 131 VI 0,6 7 49 VII 0,3 8 60 VIII 0,8 9 1400 (?) (IX) ? (10) ? 30

At den genome klon transkriberes til et antal RNA-transkripter afhængig af splejsningsstederne bekræftes ved Northern-analyse. MIAPaCa-celler blev induceret under serumfrie betingelser med 50 ng/ml PMA og 10 μΜ retinsyre 35 i 3 dage i 3 på hinanden følgende induktioner, og der 45 DK 174237 B1 blev isoleret mRNA efter den tredie induktion i overensstemmelse med den generelle procedure, som er beskrevet nedenfor. Det isolerede mRNA blev underkastet elektro-forese på en 1% agarosegel, som indeholdt 2,5 M 5 formaldehyd, blev overført på nitrocellulose og proberet med det hensigtsmæssige oligonukleotid. Der blev opnået $ en række bånd svarende til mRNA'er på 16S, 18S, 26S, 28S samt en pulje ved 22-25S.

10 ML06, en 20-mer, som svarer til den kodende sekvens i exon 8 i genomet, hybridiserede til alle transkripterne fra disse; dette bekræfter, således at alle koder for CSF-1. Sekvenserne i exon 8 er selvfølgelig fælles for bade de lange og korte former.

15 GM11, en 40-mer, som ligger i 5'-enden af det lange exon-område 6 og således svarer til den "ekstra" indføjelse som indeholder 894 bp i den lange form af sekvensen, hybridiserer til transkripterne ved 28S og klyngen ved 20 22-25S, men ikke til de resterende tre. Disse er således tilsyneladende transkripter, som svarer til den lange form.

En 20-mer, JV30, som baseparrer med 5'-enden af exon 9 i 25 genomet hybridiserer til 22-25S-klyngen og til 16S og 18S mRNA'er, men ikke til 26S eller 28S. 26S Og 28S synes således at resultere fra den processering, som viser sig at inkludere det formodede exonområde 10 i fig. 3. En yderligere probe, som er en 4,2 kb lang probe, der er 30 fremstillet ud fra et human-CSF-1 genomfragment, som begynder 1500 bp inde i exon 9, hybridiserer kun med 26S og 28S transkripterne.

Det genome fragment, som koder for CSF-1, kan anvendes 35 til ekspression i eucaryote celler, som er i stand til at 46 DK 174237 B1 processere intronområder. Til ekspression af det genome fragment ligeres indføjelsen ind i en egnet værtsvektor, såsom et bovin-papilloma-virus eller en anden pattedyrvirusvektor umiddelbart nedenstrøms en egnet promoter, 5 såsom metallothioneinpromotoren fra mus eller menneske.

F.3 Genfindelse af cDNA, som kode for human-CSF-1 pcCSF-17 (SCSF)_ 10 Den humanafledte pancreascarcinomacellelinie MlAPaCa-2 blev anvendt som en mRNA-kilde til at efterprøve prober og til dannelse af et cDNA-bibliotek, som indeholder en intronfri form af den kodende sekvens, som koder for human-CSF-1. MIAPaCa-cellelinien producerer CSF-1 i et 15 niveau pa ca. 10 gange under niveauet for L-929-musecel-lerne. pcCSF-17 Blev opnået fra dette bibliotek, hvilket er beskrevet i PCT-ansøgningen W086/04607.

I korthed blev et 300.000 klonbibliotek, som var opnået 20 fra et beriget MIAPaCa-mRNA ved fremgangsmåden ifølge Okayama og Berg, derefter proberet under betingelser med høj stringenthed, under anvendelse af exon-II-proben hidrørende fra det genome DNA. Der blev opsamlet 10 kolonier, som hybridiserede til proben og de blev 25 kolonioprenset. Disse kloner blev analyseret for til stedeværelsen af CSF-l-kodende sekvenser ved forbigående ekspression i COS-7-celler. Den kloningsvektor, som indeholdt SV40-promotoren, blev anvendt i sig selv ved transformeringen af COS-7-celler.

30

Der blev oprenset plasmid DNA fra 10 positive kloner under anvendelse af en CsCl-gradient, og COS-7-celler blev transficeret under anvendelse af en modifikation (Wang, A.M., et al., Science (1985), 228:149) af calcium-35 fosfatcopræcipiteringsmetoden. Efter inkubering i 3 dage 47 DK 174237 B1 blev CSF-l-produktionen analyseret ved at underkaste kultursupernatanterne den radioaktive receptoranalyse, som stort set blev udført som omtalt af Das, S.K. et al.,

Blood (1981), 58:630, samt en kolonistimuleringsanalyse 5 (knoglemarvsproliferering) udført stort set som omtalt af Prystowsky, M.B., et al., Am. J. Pathol. (1984), 114:149.

Ni ud af de ti opsamlede kloner viste ikke forbigående CSF-l-produktion i COS-7-celler. En klon, som udviste ekspression, blev dyrket, og plasmid-DNA*et blev 10 isoleret, og indføjelsen blev sekventeret. DNA-sekvensen sammen med den deducerede aminosyresekvens er vist i fig.

1. cDNA'et I fuld længde var 1,64 kb og koder for et modent CSF-l-protein på 224 aminosyrer (SCSF), hvilket er vist i fig. 1. Klonen blev betegnet CSF-17 med Cetus’s 15 deponeringsnummer CMCC 2347 og blev deponeret hos American Type Culture Collection 14. juni, 1985 med deponeringsnummer 53149. Det plasmid, som bærer det CSF- 1-kodende DNA, blev betegnet pcCSF-17.

20 LCSF-kodende kloner pcCSF-17, fremstillet som ovenfor beskrevet, blev anvendt som en probe til opnåelse af yderligere CSF-l-kodende kloner fra et humant cDNA-bibliotek. Total mRNA blev 25 fremstillet ud fra MIAPaCa-celler nøjagtigt som beskrevet i PCT-ansøgningen W086/04607 (se ovenfor) og blev anvendt til opnåelse af et cDNA-bibliotek i XgtlO-fagvektorer ved at ligere de tilbageskrevne transkripter til EcoRI-linkere og inføjede EcoRI-fordøjelsen af det således 30 opnåede c DNA i EcoRI-genkendelsesstedet i XgtlO, hvilket er beskrevet af Huynh, T.V, et al., i DNA Cloning Techniques: A Practical Approach, IRL Press, Oxford, 1984, D. Glover, redaktør.

48 DK 174237 B1

Mere end én million fager blev screenet under anvendelse af en enkeltstrenget, stærkt mærket probe hidrørende fra CSF-17 under anvendelse af standardmetoder, som er skitseret kort nedenfor.

5

Et EcoRI-fragment af pcCSF-17-DNA, som inkluderede hele den kodende sekvens for CSF-1 (der er et EcoRI-genkend-elsessted umiddelbart efter stopcodonerne i den kodende sekvens i pcCSF-17), blev indføjet i M13, og der blev 10 synthetiseret en mærket anden streng på følgede måde:

Ca. 1 pmol af M13, som indeholdt det enkeltstrengede,

EcoRI-fordøjede pcCSF-17, blev reassocieret (eng: annealed) med 10 pmol sekventeringsprimer i 20mM Tris, pH 7,9, 20 mM MgC^/ 100 mM NaCl, og 20 mM β-mercaptoethanol 15 ved 67°c i 5 minutter og derefter overført til 42°C i 45 minutter. Det præparat blev tilført 100 μπιοί af hver af dATP, dCTP og dTTP, samt 2,5 μιηοΐ P^-mærket (x)dGTP, sammen med 5 enheder Klenow-fragment. Reaktionsblandingen blev inkuberet ved 37°C i 20 minutter, og DNA'et blev 20 genfundet på en P-6-dG (Bio-Rad) spinsøjle og blev varmebehandlet i 10 minutter til adskillelse af strengene .

De således fremstillede prober blev anvendt til at 25 screene plaquerne (som var blevet overført til nitrocellulose) ved hybidisering under stringente betingelser (50¾ formamid, 5 x SSC, 5 x Denherdt's opløsning) ved 42°C i 18 timer.

30 Ca. 150 fagplaquer var positive. Fem af disse 150 probe-positive plaquer var yderligere probepositive ved anvendelse af oligonukleotidet JD11, en 14-mer, som er komplementær til baserne i splejseforbindelsesområdet af exonområde 2 og 3, når de blev hybridiseret ved 45°C 35 natten over i 5 x SSC, 5 X Denhardt's opløsning.

49 DK 174237 B1

De 5 JDll-positive kloner blev derefter udsat for hybrid-isering til oligonukleotidet GM11, som havde en sekvens, der var komplementær til nukleotiderne 506-545 i fig. 2.

5 Som ovenfor beskrevet, passer denne sekvens nøjagtigt til den del af den humane genomsekvens, som svarer til "ekstra''-delen i muse-cDNA, der er beskrevet ovenfor, som koder for det "ekstra" 298 aminosyrer lange segment i de "lange former" af muse-CSF-l-proteinet. Hybridisering 10 blev foretaget i 20% formamid, 5 x SSC, 5 x Denhardt’s opløsning ved 45°C i 18 timer. Tre kloner var positive, herunder de relevante kloner 4 og 25.

Den komplette DNA-sekvens for de relevante kodende 15 omrader af cDNA-indføjeiser i klonerne 4 og 25 sammen med den deducerede aminosyresekvens er vist i fig. 2. Sekvensen blev afledt ved at integrere den kendte sekvens af den genome klon, phCSF-la, der er beskrevet ovenfor, under anvendelse af den 298 aminosyre lange "ekstra" 20 indføjelse i musesekvenserne, som er beskrevet nedenfor, som en vejledning til at deducere den komplette, viste sekvens. Den afbildede sekvens viser indsplejsningen af det "ekstra" segment, som er tilstrækkeligt til at kode for 298 "ekstra" aminosyrer indeholdt i genet ved 5'-25 siden af exon 6, i sekvensen af pcCSF-17 mellem det første nukleotid i codonen for Gly-resten ved aminosyre-positionen 150 i læseramme med den resterende CSF-17-sekvens. Indføjelsen ændrer codonen ved 150 til en codon for asparginsyre, den efterfølgende codon ved slutningen 30 af indføjelsen rekonstitueres til et Gly og den resterende sekvens af resterne fortsætter med His-Glu-Arg osv. ned til den C-terminale Val-rest, som forbliver den samme som i pcCSF-17. LCSF er med undtagelse af, at den har Asp i stedet for Tyr i position 59 ellers identisk med 35 sekvensen for SCSF op til aminosyrerest 150.

50 DK 174237 B1

To af klonerne, 4 og 25, blev klonet i M13mpl8 eller M13mpl9 til sekventering for at bekræfte de resultater, som er vist i fig. 2, under anvendelse af EcoRI-5 restriktionsstederne. Disse 2 kloner ser ud til at være identiske ud fra restriktionsenzymanalyse. Den fuldstændige sekvens for klon 4 blev bestemt, og det er den, der er vist i fig. 2; delvis sekventering af klon 25 gav overensstemmende resultater. De blev derefter subklonet i 10 den modificerede Okayama-Berg-vektor pcDB, som blev fremstillet ud fra de publicerede Oklayama-Berg-vektorer pcDVl og pLl (Okayama, H., et al., Mol. Cel. Biol.

(1983), 3:280-289) på følgende måde: 15 pcDVl Blev fordøjet med Hindlll og Kpnl, og det store fragment, der gav AmpR, pBR322-replikationstartstedet samt et polyadenyleringssted, blev isoleret. pLl Blev fordøjet med Hindlll og PstI og det lille fragment, som tilvejebragte SV40-promoteren og replikationstartstedet, 20 blev isoleret. Disse fragmenter blev religeret ved en trevejs-ligering med det syntetiske, KpnI/Pstl-fordøjede oligonukleotid fragment

CTGCAGGAGCTCAGATCTTCTAGAGAATTCTCGAGCGGCCGCATCGATGGTACC 25 GACGTCCTCGAGTCTAGAAGATCTCTTAAGAGCTCGCCGGCGTAGCTACCATGG

til opnåelse af pcDB, et plasmid svarende til pcD-x vist i referencen, hvor "x" er erstattet med en polylinker. pcDB Indeholder således den tidlige SV40-promoter og en 30 umiddelbar nedenstrøms linker efterfulgt af et polyadenyleringssted. Sekvenser, som er ligeret ind i poly-linkeromradet, skulle blive udtrykt under styringen af den tidlige SV40-promoter.

51 DK 174237 B1

Fordi klonerne 4 og 25 synes at mangle nogle 5'-ende sekvenser sammenlignet med CSF-17 blev opstrømsdelene fra pcCSF-17 indsat i stedet for de af klonerne 4 og 25 før testning af ekspression.

5

Protokollen for denne substitution er følgende: pcCSF- asp59-BamBcl (se nedenfor) blev fordøjet med Smal, som skærer ved den yderste 5'-ende af den ikke-translaterede sekvens (se fig. 1), og det lineariserede plasmid blev 10 ligeret til EcoRI-linkere og genforseglet. Det genliger-ede plasmid blev derefter fordøjet med EcoRI, som fjerner hele det kodende område fra Smal-stedet ved den yderste 5'-ende til EcoRI-stedet umiddelbart nedenstrøms stop-codonerne. Dette blev ligeret ind i polylinkeren i pcDB 15 ve EcoRI-stedet. De kodende sekvenser nedenstrøms BstXI-stedet, hvilket sted ligger lokaliseret ved codonen for aminosyre 8 i den modne CSF-17-proteinsekvens (se fig.

1), blev fjernet ved fordøjelse med PstXI og Kpnl. (Kpnl skærer ind i linkeren lidt nedenstrøms EcoRI-stedet forbi 20 stopcodonen). Denne fjernede nedenstrøms sekvens blev erstattet med det analoge Bstl/KpnI-fragment fra pM13-4 og pM13-25. De fremkomne kloner pcDBhuCSF-4 og pcDBhuCSF-25 indeholdt således de kodende sekvenser nedenstrøms codonen for ca. aminosyre 8 fra klonerne 4 hhv. 25 og 25 opstrømssekvenserne fra pCSF-17. De ligerede sekvenser er i læseramme og under styring af den tidlige SV40-promoter.

Muteinkodende sekvenser/eucaryote ekspressionsvektorer 30

Der blev foretaget modifikationer af pcCSF-17-indføj-elserne til tilvejebringelse af tilsvarende plasmider, som koder for muteiner af SCSF-proteinet. Til steds-specific mutagenisering blev pcCSF-17 og M13mpl8 fordøjet 35 med det samme restriktionsenzym, som udskærer det 52 DK 174237 B1 hensigtsmæssige område af den CSF-l-kodende sekvens og den udskårne sekvens blev ligeret ind i M13-vektoren. Syntese af den anden streng og genfinding af det ønskede, muterede DNA, udnyttede følgende oligonukleotid primere: 5 for pro52SCSF, 5’-TACCTTAAACCGGCATTTCTC-3', hvilket fremkalder et nyt Hpall-sted ved codoner 52-53; 10 for gln52SCSF, 5'-TACCTTAAACAGGCCTTTCTC-3', hvilket fremkalder et nyt Stul-sted ved codoner 52-53; for asp59SCSF, 51-GGTACAAGATATCATGGAG-3', 15 hvilket fremkalder et nyt EcoRI-sted ved codoner 59-60.

Efter forlængelse af den anden streng under anvendelse af Klenow-fragment blev fagen transformeret ind i E. coli 20 DG98, og de fremkomne plaquer blev screenet med kinase- behandlet, mærket probe. Efter plaqueoprensning blev de ønskede, muterede indføjelser returneret til at erstatte de ikke-muterede indføjelser i pcCSF-1, hvilket gav pCSF-pro52, pCSF-gln52, og henholdsvis pCSF-asp59.

25

Der blev også fremstillet plasmider, som indeholdt 3 deletionsmutanter, der koder for C-terminal deleteret SCSF/CV158: pCSF-Bam, pCSF-BamBcl, og pCSF-BamTGA. For pCSF-Bam, blev pcCSF-17 fordøjet med BamHI, og 30 BamHI/BamHI-opstrøms fragmentet i det kodende område blev isoleret og genligeret til vektorfragmentet. Ligering-blandingen blev transformeret ind i E. coli MM294 og plasmiderne med den korrekte orientering blev isoleret.

De fremkomne pCSF-Bam koder for 158 aminosyrer i CSF-1-35 proteinet fusioneret til 6 aminosyrerester hidrørende fra 53 DK 174237 B1 vektoren ved den C-terminale ende: arg-his-asp-lys-ile- his.

Til pCSF-BamBcl, som indeholder hele den CSF-l-kodende 5 sekvens med undtagelse af, at serinen ved position 159 er muteret til en stopcodon, blev den kodende sekvens udskåret fra pcCSF-17 og ligeret ind i M13 til stedsspecifik mutagenisering under anvendelse af primeren: 5'-GAGGGATCCTGATCACCGCAGCTCC-3'. Dette resulterer i et nyt 10 BclI-sted ved codoner 159-160. Det muterede DNA blev udskåret med BstXI/EcoRI og ligeret ind i det med BstXI/EcoRI-fordøjede pcCSF-17, ligeringsblandingen blev transformeret ind i E. coli DG105, en dam--vært og plasmid-DNA'et blev isoleret.

15

For pCSF-BamTGA, i hvilket codonerne nedenstrøms stop-codonen 159 er fjernet, blev pCSF-BamBcl fordøjet med Xhol og Bell, og den indføjede sekvens blev ligeret i Xhol/BamHI-fordøjet pcCSF-17.

20

Ydermere blev pCSF-Glyl50, som indeholder en TGA-stopcodon i stedet for histidin ved position 151, fremstillet ud fra pcCSF-17-indføjelsen ved stedspecifik mutagenisering under anvendelse af den hensigtsmæssige 25 primer, hvilket er beskrevet ovenfor. Den hensigtsmæssige primer er 5' -AGCCAAGGCTGATCAAGGCAGTCC- 31 . Nedenstrøms-delen af den kodende sekvens blev således udskåret fra pcCSF-17 med BstXI/EcoRI ind i M13-vektorer til mutagenisering og blev ført tilbage efter plaqueoprensning som 30 en BstXI/EcoRI-indføjelse.

*

Der blev fremstillet "dobbelte" muteiner på lignende made. For pCSF-asp59-glyl50, der koder for asp59SCSF/CVl50, blev pcCSF-asp59 således f.eks.

35 fordøjet med BstXI/EcoRI til anbringelse af det C- 54 DK 174237 B1 terminale fragment i M13 til stedsspecifik mutagenisering med den samme primer som ovenfor til frembringelse af pCSF-glyl50. Det muterede fragment blev derefter ført tilbage til vektoren til opnåelse af pCSF-l-asp59-glyl50.

5

Fremgangsmåden til fremstilling af pCSF-BamBcl blev tilsvarende gentaget (med undtagelse af, at pCSF-asp59 blev anvendt i stedet for pcCSF som et udgangsplasmid) til opnåelse af pCSF-asp59-BamBclI.

10

Ved at anvende de analoge metoder til de ovenfor beskrevne til fremstilling af pCSF-gln52 og pCSF-asp59 blev de tilsvarende plasmider, som indeholder de lange former af de tilsvarende muteiner, pLCSF-gln52 og pLCSF-15 tyr59, fremstillet. Fremgangmåden er som ovenfor beskrevet med undtagelse af, at der hvor pcCSF-17 blev anvendt ved denne procedure, blev pcDBhuCSF-4 eller dets ækvivalente plasmid anvendt i stedet for og de hensigtsmæssige ændringer i primere for ty^g-muteinet blev 20 foretaget.

Stedsspecifik mutagenisering blev også anvendt til opnåelse af de ønskede mutationer med glycosyleringssteder i begge proteiner og til udskiftning af cystein ved 25 position 90; det kan også anvendes til opnåelse af forskellige C-terminale deletioner af det LCSF-kodende DNA.

F.4 Forbigående ekspression af CSF-1 30 Ekspression af pcCSD-17

Ekspression af plasmid DNA fra CSF-17 (pcCSF-17) i C0S-7-celler blev bekræftet og kvantiteret under anvendelse af knoglemarvsproli fereringsanalysen, kolonistimuleringsana-35 lysen og radioreceptoranalysen. Det skal erindres, at 55 DK 174237 B1 specificiteten af knoglemarvsprolifereringsanalysen for CSF-1 ligger alene i evnen hos antiserum mod CSF-1 til at formindske aktivitet; for kolonistimuleringsanalysen ligger det i naturen af de opnåede kolonier. Begge 5 analyser viste, at CSF-l-produktionen var af en størrelsesorden på adskillige enheder pr. ml.

Knoglemarvsproliferering 10 Til knoglemarvsstimuleringsanalysen, som måler proteinets biologiske aktivitet, blev knoglemarvsceller fra Balb/C-mus behandlet med seriefortyndinger af supernatanter efter 72 timers vækst, og proliferering af cellerne blev malt ved optagelse af mærket thyreidin, stort set som 15 beskrevet af Moore, R.N., et al., J. Immunol. (1983).

131;2374; Prystowsky, M.B., et al., Am. J. Pathol.

(1984), 114:149. Mediet fra inducerede MIAPaCa-celler blev anvendt som kontrol. Specificitet for CSF-1 blev bekræftet ved evnen af kaninantistof rejst mod humanurin 20 CSF-1 til at undertrykke thymidinoptagelse. Resultaterne for C0S-7-cellesupernatanter transficeret med pcCSF-17 (CSF-17-supernatant) med en fortynding på 1:16 er vist i tabel 1.

25 56 DK 174237 B1

Tabel 1 3H-thymidin inkorporering (cpm) 5

Ingen Normal Antiserum tilsætninger serum_mod human-CSF-1

Medium 861 786 2682 10 MIAPaCa- supernatant 12255 16498 3302 CSF-17- 15 supernatant 16685 21996 2324 (Antiseraet mod human-CSF-1 blev fremstillet som beskrevet af Das et al., se ovenfor) 20 MIAPaCa-supernatanten (ved den ovenfor anvendte fortynding på 1:16) indeholdt 125 enheder/ml CSF-aktivitet, hvilket svarer til 2000 enheder/ml i den ikke-fortyndede supernatant, hvor 1 enhed kolonistimulerende aktivitet defineres som den mængde CSF-1, som er nødvendig for at 25 producere 1 koloni ud fra 10^ knoglemarvscel ler/ml i analysen ifølge Stanley, E.R., et al., J. Lab. Clin. Med.

(1972), 79:657.)

Disse resultater viste, at den knoglemarvsstimulerende 30 aktivitet er knyttet til CSF-1, efter thymidinoptagelsen blev hæmmet af antiserum mod CSF-1. Regressionsresultater i denne knoglemarvsprolifereringsanalyse opnået ved 4 fortyndinger, som ligger fra 1:8 til 1:64, gav en beregnet aktivitet for CSF-1 i CSF-17-supernatanter på 35 2358 enheder/ml, hvilket blev formindsket til 424 57 DK 174237 B1 enheder/ml i nærværelse af antiserum, men viste en tilsyneladende forøgelse til 3693 enheder/ml i nærværelse af ikke-immunserum. Dette var sammenligneligt med de niveauer, som blev vist i radioreceptoranalysen nedenfor.

5

Kolonistimulering *

Direkte analyse af CSF-17-supernatanterne for kolonistimulering (Stanley, E.R., et al., J. Lab. Clin. Med.

10 (se ovenfor) viste 4287 enheder/ml, hvilket i det væsentlige ikke blev påvirket af tilstedeværelsen af ikke-immunserum, men blev reduceret til 0 enheder/ml i nærværelse af kaninantistof mod human-CSF-1. Dette skal sammenlignes med 2562 enheder/ml i MIAPaCa-super-15 natanterne. 85% Af de pcCSF-17-transformerede, COS-7-supernatantinducerede kolonier havde mononukleær morfologi: MIAPaCa-supernatantinducerede kolonier viste et forhold mellem makrofager og granolucytter på 94% mod 6%.

20

Radioreceptoranalysen

Radioreceptoranalysen måler konkurrencen mellem _ mærket CSF-1 og testforbindelsen for specifikke receptor-25 er på J774.2 musemakrofagceller. MIAPaCa-supernatant, der som ovenfor blev analyseret for kolonistimulerende aktivitet, blev anvendt som en standard (2000 enheder/ml) . CSF-l-koncentrationen i den pcCSF-17-transform-erede COS-7-supernatant fandtes at være 2470 enheder/ml 30 baseret på en fortynding på 1:10 og 3239 enheder/ml baseret på en fortynding på 1:5.

Der blev således i alle analyser fundet sammenlignelige værdier for CSF-l-koncentrationen i mediet fra COS-7-35 celler transformeret med pcCSF-17.

58 DK 174237 B1

Ekspression af SC5F

På lignende måde som beskrevet ovenfor for pcCSF-17 blev 5 de muteinkodende plasmider transficeret ind i C0S-A2-celler og forbigående ekspression af CSF-l-aktivitet blev analyseret ved knoglemarvsprolifereringsanalysen og ved radioimmunoanalysen under anvendelse af antistoffer mod CSF. Ekspressionsproduktet fra pCSF-pro52 var inaktivt, 10 hvilket som forventet indikerer, at substitutionen med prolin ikke er konservativ. Alle andre muteiner udviste aktivitet i begge analyser, hvilket er vist i resultaterne nedenfor: 15

Tabel 2 59 DK 174237 B1

Ekspression af CSF-l-konstruktioner i CQS-celler 5 CSF-1 Radio- Knoglemarvsanalyse (enheder/ml) plasmid_immunoanalyse proliferering_kolonier (enheder/ml) (enheder/ml) pcCSF-17 , 3130 2798 11.100 10 3080 3487 9750 3540 3334 11.500 pCSF-pro52 54,8 <25 <100 51,9 <25 <100 15 45,3 <25 <100 pCSF-gln52 1890 2969 6200 2250 2308 5500 1910 2229 4400 20 pCSF-asp59 3210 3381 9000 4680 3417 6800 3470 2812 10.600 25 pCSF-Bam 9600 8048 22.600 8750 8441 21.900 8400 10.995 21.700 pCSF-BamBcl 8800 26.000 30 10.700 21.600 15.450 24.200 pCSF-BamTGA 8450 22.600 7550 23.200 35 9700 20.000 60 DK 174237 B1 pCSF-Glyl50 26.850 55.710 5 Tabel 3

Knoglemarvskolonianalyse i mus CSF-1 Kolonidannende 10 Plasmid enheder/ml pCSF-17 1 25.000 2 25.000 3 23.500 15 pCSF-asp59gly15g 1 131.000 2 125.000 3 132.000 20 pCSF-asp5gBamBcl 1 72.000 2 78.000

Ekspression af pcDBhuCSF-4 og pcDBhuCSF-25 25 Vektorerne af Okayama/Berg-typen, som indeholdt den lange form af det for human-CSF-1 kodende DNA (pcDBhuCSF-4 og pcDBhuCSF-25) blev transficeret i C0S-A2-celler på præcis analog måde som beskrevet for transficeringen af COS-7-celler med pCSF-17. Supernatanterne af de transficerede 30 celler blev analyseret for CSF-1 under anvendelse af radioimmunoanalyse med antiserum rejst mod CSF-1 fremstillet som beskrevet af Das, et al., (se ovenfor) og også i den ovenfor beskrevne knoglemarvsprolifererings-analyse. Resultaterne i CSF-l-enheder pr. ml er vist i 35 tabel 4.

DK 174237 B1

Tabel 4 61

Ekspression af pcDBhuCSF-4 og -25 i C0S-A2-celler 5 RIA BM-analyse

Prøve (Enheder/ml) (Enheder/ml) pcDBhuCSF-4 16.979 9.200 10 pcDBhuCSF-25 15.926 8.000 medium 12,5 <50

Efterligningsinfektion 25,0 <50

Som det fremgår, indeholdt supernatanterne af de celler, 15 som var transficeret med den ene eller den vektor, protein med CSF-l-aktivitet.

På lignende måde opnåedes muteinformerne af disse specifikke LCSF-proteiner af lang form.

20 F.S.Eucaryot ekspression af CSF-1 i stabilt transformerede celler_ COS-7- eller COS-A2-systemer tilvejebringer rekombineret 25 CSF-1 ved at muliggøre replikation af og ekspression fra vektorsekvenserne af Okayama-Berg-typen. Det er et forbigående ekspressionssystem.

CSF-l-sekvenserne fra mennesket kan også udtrykkes 30 stabilt i procaryote eller eucaryote systemer. Generelt giver procaryote værter et let produktionssystem, medens eucaryote muliggør anvendelsen af den native signalsekvens til effektuering af secernering og udførelse af en hvilken som helst ønsket posttranslationel processer-35 ing. Det kan være vigtigt med hensyn til CSF-1, eftersom 62 DK 174237 B1 det native protein er en diiner. Bakteria frembringer CSF-1 som en monomer, som derefter kan underkastes dimeriseringsbetingelser efter ekstraktion, hvis dette er nødvendigt.

5

Okayama-Berg-plasmidet pcCSF-17 eller de analoge vektorer, som indeholder det DNA, som koder for muteiner, f.eks. pCSF-asp59-glyj50 og pCSF-aspsg-BamBcl, eller de analoge vektorer pcDBhuCSF-4, pcDBhuCSF-25, pcDBmuCSF-L 10 og pcDBmuCSF-S, eller andre vektorer, som koder for muteiner af LCSF, der indeholder det cDNA, som koder for CSF-1, under styring af SV4O-promotoren kan også anvendes til effektuering af stabil ekspression i CVl-abeceller, den modercellelinie, hvorfra COS-7-linien blev afledt.

15 CVl-værtsabecellerne blev dyrket til sammenflydning og derefter cotransformeret under anvendelse af 10 μg ekspressionsvektor, og forskellige mængder (1, 2, 5 og 10 Hg) af pRSV-NE02 (Gorman, C., et al., Science (1983), 221:551-553) pr. 500.000 celler. Transformanterne blev 20 dyrket ved DMEM med 10% FBS-medium, som indeholdt 100 μg/ml G418-antibiotika overfor hvilket pRSV-NE02-piasmidet giver modstandsdygtighed. CV-l-cellelinien udviser en G418-transformationshyppighed på ca. 10“^'12-kolonier pr. 106-celler pr. μg DNA.

25 CV-l-cellerne blev cotransformeret som ovenfor beskrevet og selekteret i G418-holdigt medium. Resistente kloner blev undersøgt for stabilitet af den fænotype, som er resistent mod G418, ved dyrkning i G418-frit medium og 30 derefter tilbageføring til G418-holdigt medium. Disse kulturers evne til at overleve, når de føres tilbage til det antibiotikaholdige medium antyder, at pRSV-NE02-DNA'et er integreret permanent i cellegenomet. Eftersom celler, som er transformeret stabilt med et 35 markørplasmid, har ca. 501 sandsynlighed for at have 63 DK 174237 B1 integreret DNA'et fra et cotransficerende plasmid, vil også halvdelen af disse celler indeholde ekspressionssystemet for CSF-l-proteinet i deres kromosomale DNA.

5 Adskillige kloner af de G418-resistente puljer af CV-1-celler, om hvilke man som ovenfor har påvist, at de er stabilt transformeret, opsamles og dyrkes i et dobbelt sæt kolber til næsten sammenflydning. En kolbe af hvert dobbeltsæt inficeres med SV40-virus ved en infektions-10 multiplicitet på 5, og mediet blev høstet 6 dage efter infektion til analyse af CSF-1 under anvendelse af en radioimmunoanalyse. Immunoanalysen er baseret på mærket MIAPaCa CSF-1 konkurrence om "kanin 52" polyklon-alt antiserum rejst mod oprenset humanurin-CSF-1.

15

En af de udvalgte CV-l-kloner fra transfektion med pcCSF-17 udviste ved denne analyse en CSF-l-produktion på 2335 enheder/ml, hvorimod celler, der ikke er inficeret med SV40, udviste mindre end 20 enheder/ml. Kontroller, 20 hvortil anvendtes COS-7-celler transformeret med 10μg pcCSF-17 udviste en CSF-l-produktion på 2400 enheder/ml uden SV40-infektion.

Den CSF-l-producerende CV-l-cellelinie indeholder CSF-1-25 ekspressionssystemet stabilt integreret i dens genom, og kan således anvendes til produktion af CSF-1 efter infektion med SV40. Infektion formodes "at frigøre" ekspressionssystemet fra genomet og tilvejebringe SV40 T-antigenet, som er nødvendigt for replikation af det 30 frigjorte DNA. Uden SV40-infektion bliver det integrerede gen, som koder for CSF-1, ikke udtrykt effektivt.

Optimering af CV-1 (CSF-17)- celleliniens ekspression af den CSF-l-kodende sekvens viste 6500-8000 enheder/ml, når 35 den blev målt ved radioimmunoanalysen 6 dage efter SV40- 64 DK 174237 B1 infektion under anvendelse af en infektionsmultiplicitet på mindst 1 og et 10%-FBS-medium. Undersøgelser af ekspressionsniveauet ved en multiplicitet på 10 viste tilsvarende produktion, men produktionen blev reduceret 5 ved fjernelse af FBS’et fra mediet den 2. dag efter infektionen.

Alternativt kan passende styringssystemer og værtsvektorer, som tillader ekspression i andre eucaryote 10 værter, anvendes til indføring af de CSF-1 kodende indføjelser. Der kan f.eks. anvendes CHO-celler og egnede vektorer. Endvidere anvendes baculovirus-vektorer, som indeholder disse sekvenser, til infektion af insektceller til produktion af protein, hvilket er beskrevet af 15 Miller, D.W., et al., i Genetic Engineering (1986), side 277-297 (se ovenfor).

F.6.Procaryot ekspression 20 Til procaryot ekspression ændres den cDNA-klon eller den genome sekvens, hvori der er indsat intronområde ved f.eks. stedsspecifik mutagenisering til indførelse af en en ATG-startcodon umiddelbart opstrøms glutaminsyren ved den N-terminale ende og et Hindlll-genkendkendelsessted 25 umiddelbart opstrøms ATG-codonen til tilvejebringelse af et hensigtsmæssigt sted til indsættelse i de nedenfor anførte standardværtsekspressionsvektorer. Dette kan gøres direkte ved at anvende indføjelse ved stedsspecifik mutagenisering med en syntetisk oligomer, som indeholder 30 en ny sekvens, der er komplementær til den ønskede sekvens AAGCTTATG, der er flankeret af nukleotid-sekvenser, som er komplementære til den native ledersekvens og de N-terminale, kodende sekvenser.

65 DK 174237 B1

Det DNA-fragment, som indeholder hele den kodende sekvens, blev udskåret fra pcCSF-17 eller fra pcDBhuCSF-4 ved fordøjelse med EcoRI, det blev isoleret ved agarosegelelektroforese og blev udvundet ved elektro-5 eluering. Til udføring af mutageniseringen blev DNA’et fra værtsbakteriofagen M13mpl8 også behandlet med EcoRI og ligeret med det oprensede fragment under standardbetingelser og blev transficeret ind i frosne kompetente E. coli K12-celler, stamme DG98. Cellerne blev udpladet i 10 medier indeholdende 5 x 10“^ M isopropylthiogalactosid (IPTG), der er opnået fra Sigma Chem. (St.Louis, Mo) og 40 pg/ml X-gal. Ikke-komplementerende, hvide plaquer blev opsamlet i frisk medie. Minikulturer blev screeenet for rekombineret enkeltstrenget fag-DNA af den forventede 15 størrelse, og strukturen af den ønskede, rekombinerede fag blev bekræftet ved restriktionsanalyse.

En 34-mer, som er komplementær til de områder af CSF-1 sekvensen, som koder for den N-terminale ende og lederen, 20 men som indeholder en komplementær sekvens til den ønskede AAGCTTATG-sekvens, blev syntetiseret og oprenset.

Når nonsensstreng M13 alternativt blev anvendt, blev den kodende 34-mer anvendt. En del af dette 34-mer-præparat,'·'' der skulle anvendes senere som probe, blev mærket 25 radioaktivt ved en modifikation af metoden ifølge Maxam og Gilbert (Maxam, A., et al., Methods in Enzymology (1980), 6J3:521, Academic Press), hvilket er anført ovenfor.

30 Til udførelse af mutageniseringen blev den ovenfor fremstillede, rekombinerede bakteriofag fremstillet i E. coli K12, stamme DB98, og det enkeltstrengede fag-DNA blev oprenset. Et pmol enkeltstrenget fag-DNA og 10 pmol af ovennævnte syntetiske nukleotid-primer (ikke 35 kinasebehandlet) blev reassocieret ved opvarmning i 1 66 DK 174237 B1 minut ved 67°c og derefter i 30 minutter ved 37°C i 15 μΐ 20 mM Tris-Cl, pH 8, 20 roM MgCl2, 100 mM NaCl, 20 mM 2- mercaptoethanol. Det reassocierede DNA blev inkuberet med DNA-polymerase I (Klenow) og 500 μιηοΐ dNTP'er i 30 minut-5 ter, 0°C, og blandingen blev derefter bragt til 37°C. Delprøver (0,05 eller 0,25 pmol) blev fjernet efter 5 minutter, 20 minutter og 45 minutter, blev transformeret ind i E. coli Kl2, stamme DG98 og blev udpladet, 10 Efter vækst blev pladerne afkølet ved 4°C og plaquerne blev løftet op med Pall-membraner fra Biodyne eller S&S-filtre (1-2 minutter i det første filter, mere end 10 minutter i det andet). Filtrene blev denatureret i 2,5 M NaCl, 0,5 M NaOH (5 minutter). Det denaturerende medium 15 blev neutraliseret med 3 M natriumacetat til pH 5,5 eller med 1 M Tris-Cl, pH 7,5, der indeholdt 1 M NaCl, filtrene blev varmebehandlet ved 80°C under vakuum i 1 time og blev derefter præhybridiseret ved høj stringenthed. Filtrene blev derefter proberet ved høj stringenthed med 20 den ovenfor fremstillede, kinasebehandlede, syntetiske 34-mer, blev vasket og autoradiograferet natten over ved -70°C.

RF-formen af hver ønsket muteret fag blev behandlet med 25 EcoRI, blev forsynet med stumpede ender med Klenow fragment, og derpå fordøjet med Hindlll til udskæring af genet som et Hindlll/stumpendet fragment.

Plasmider pFC54,t (ATCC 39789), som indeholder PL- 30 promoteren og den positive retroreguleringssekvens fra Bacillis thuringiensis (som beskrevet i EPO-ansøgning publikation nr. 717.331, publiceret 29. marts 1985), blev anvendt som en værtsvektor. pFC54.t Blev fordøjet med Hindi11/BamHI (stump), og de ønskede kodende sekvenser 35 blev ligeret ind i vektoren under anvendelse af det 67 DK 174237 B1

Hindlll/EcoRI (stump)-udskårne fragment fra den muterende M13 hidrørende fra pcCSF-17 eller pcDBhuCSF-4 . Efter transformering i E. Coli MC 1000 λ-lysogen og induktion blev der opnået CSF-l-produktion, som formentlig var SCSF 5 henholdvis LCSF, og det blev bekræftet som ovenfor beskrevet.

Således blev f.eks. det med Hindlll/EcoRI-skårne/ stumpe fragment fra M13-substratet, der var muteret fra pcCSF- 10 17, ligeret ind i pFC54.t som beskrevet ovenfor til opnåelse af pPLCSF-l7. pPL-CSF-17 blev derefter fordøjet med BamHI og blev genligeret til opnåelse af pP^CSF- 17/CV158, som indeholder den kodende sekvens for det ...

modne SCSF ved foranstillet ATG-startcodon og trunkeret 15 til at kode for et protein, som havde de første 158 aminosyrer af SCSF-sekvensen, efterfulgt af en prolin i læseramme og en stopcodon fra den retroregulatoriske sekvens i pFC54.t. pPLCSF-17/CVl58 Blev yderligere modificeret ved stedsspecifik mutagenisering. Den 20 Hindlll/ BamHI-kodende sekvens blev udskåret og ligeret ind i M13. Der blev anvendt en passende primer til at placere en stopcodon umiddelbart efter den codon, som koder for aminosyre 158 og med et efterfølgende TGA.

Dette frembringer et BamHI/BclI-sted for yderligere 25 manipulering. Det muterede fragment blev derefter udskåret fra M13 og genligeret i det Hindlll/BamHI-fordøjet pPkCSF-17/CVl58 til opnåelse af pP^CSF- 17/CV158TGA.

30 Andre konstruktioner med codoner for udskiftede aminosyrer inkluderer modifikationer, som erstatter lys ved position 52 med gin eller pro og/eller tyr ved 59 med asp i SCSF. Disse konstruktioner blev fremstillet analogt ved stedsstyret mutageniseret i M13-indføjelser, som 35 indeholdt Hindlll/EcoRI (stump) -fragmentet fra de 68 DK 174237 B1 oprindelige pPLCSF-17.HindIII/EcoRI-fragmenter fra disse muterede fager blev derefter anvendt i stedet for den oprindelige Hindlll/ EcoRI-indføjelse til konstruktion af tilsvarende vektorer. Generelt kan ønskede mutationer på 5 udvalgte steder frembringes ifølge variationer af denne standardteknik.

Det er muligt at forbedre niveauet af CSF-l-produktion ud fra en hvilken som helst af de ovennævnte konstruktioner 10 ved at ændre det 3. nukleotid i hver af de første 6 codoner i den N-terminale ende. pFC54.t, Som indeholder det CSF-l-kodende fragment for et hvilket som helst mutein, blev fordøjet med Hindlll/BstXI, og det udskårne fragment (som indeholder ATG og en kort del af den efter-15 følgende kodende sekvens) blev erstattet med et syntetisk HindiII/ BstXI-segment, hvor de første 6 codoner har sekvensen: GAAGAAGTTTCT GAATAT. Den fremkomne, analoge ekspressionsvektor repræsenterer ingen ændring i den kodede aminosyresekvens; men ekspressionsniveauet blev 20 forbedret, når denne modificerede vektor blev anvendt. De tilsvarende vektorer har foranstillet 0/E (overekspression) . Der dannes således f.eks. O/E pPLCSF-17, 0/E pPL-17/cVl58, og O/E pPLCSF-17/CVl58TGA.

25 Den tilsvarende vektor O/E pPLCSF-17asp5g/cVl58TGA blev

syntetiseret som beskrevet med undtagelse af, at den M13, som indeholdt den oprindelige EcoRI-indføjelse, blev dobbeltmuteret til udskiftning af Hindlll-stedet og ATG-startcodonen umiddelbart før aminosyre 1 i det modne 30 protein og til udskiftning af tyrosincodonen ved rest 59 med en codon, som repræsenterer asparginsyre. Der dannes saledes tilsvarende de korresponderende vektorer O/E pPLCSF-17asp59/CVl58, og O/E pPLCSF-17asp59/CVl58TGA. I

alle de ovennævnte tilfælde kan hver af mellemvektorerne 35 blive fordøjet med Hindlll og BstXI og det syntetiske 69 DK 174237 B1 DNA-fragment, som indeholder de foretrukne codoner kan substitueres i stedet for den native sekvens, der koder de første 6 aminosyrer.

5 Endvidere modificeres alle de ovennævnte vektorer til at kode for proteiner med N-terminale deletioner ved at udskifte det hensigtsmæssige syntetiske fragment for det udskårne HindIII/BstXI-DNA. På denne måde blev tilsvarende vektorer, som koder for CSF/NV2 og CSF/NV3, som 10 mangler glu-glu og glu-glu-val, konstrueret.

Der blev også konstrueret analoge vektorer, som indeholder en termineringscodon umiddelbart efter glycin-resten ved position 150 af SCSF-proteinet. Disse vektorer 15 blev opnået ved mutagenisering af Hindlll/EcoRI-fragment-et fra pPLCSF-17 eller pPLCSF-17asp5g eller de tilsvarende muteiner ind i Hindlll/Smal-fordøjet M13. De fremkomne vektorer f.eks. pP^CSF-^/cVlSO og pP^CSF- 17asp5g/CVl50 koder derfor for de første 150 aminosyre-20 rester i det modne SCSF-protein.

Ovennævnte vektorer producerer, når de transformeres ind i en E. coli λ-lysogen vært, såsom DG116, og induceres ved høj temperatur (ca. 42°C), CSF-1 og muteiner heraf i 25 monomer form eller aggregeret deglycosyleret form. Produktionen af dette protein kan påvises ved at anvende standardradioimmunoanalyse eller andre CSF-1 specifikke analyser. Aktiviteten af proteinet kan måleligt forbedres ved at anvende genfoldningsprocedurer.

30

Der er også blevet fremstillet konstruktioner under anvendelse af phosphatase A-promoteren og den sekret-oriske ledersekvens i stedet for PL-promotoren. Styringssekvenserne, herunder de retroregulerende 3'-sekvenser 35 svarende til sekvenserne i pFC54.t, tilvejebringes ved at 70 DK 174237 B1 indføje den ønskede kodende sekvens i den Narl/BamHI-fordøjet pSYC1089, en værtsvektor, som indeholder disse styresekvenser.

5 For at anvende denne vektor genligeres de relevante CSF-kodende sekvenser i M13 til ændring af Hindlll-stedet umiddelbart foran ATG til et Clal-sted. Den muterede sekvens udskæres derefter som et Clal/BclI-fragment og ligeres ind i den fordøjede pSYCl089-vektor som 10 beskrevet. Produkterne af denne konstruktion, hvilket svarer til de korte former, som frembringes under styringen af Pk-promoteren in PL-vektorserien, secerneres ind i det periplasmatiske rum, når det udtrykkes i E.

coli og er relativt opløselig sammenlignet med produkter 15 af gener udtrykt under P^-styring, Der kan konstrueres vektorer under anvendelse af phoA-systemet, som beskrevet her, herunder pPhoA-LCSF/CVl58 og pPhoA/NV3CVl50- Disse vektorer transformeres til ekspression ind i en ikke-λ-lysogen vært, såsom E. coli MM294.

20

Der blev også konstrueret vektorer under anvendelse af DNA hidrørende fra klonen med den lange form. 0/E pPLCSF- 17asp5g/CVl50, som beskrevet ovenfor, blev anvendt som værtsvektor til konstruktioner af den lange form og af 25 forskellige C-terminale trukeringer i den kodende sekvens for den lange form. Fordi sekvenserne opstrøms BstXI-stedet er fælles for både den korte og den lange form, kan vektorer, som indeholder den korte form og muteiner heraf, omdannes til vektorer med den lange form ved at 30 udskifte BstXI til BamHI-fragmentet i denne vektor, hvilket udskærer nedenstrømsdelene af sekvensen gennem og inkluderende TGA-stopcodonen med BstXI til BamHI-frag-mentet i M13, der indeholder den sekvens, som koder for den lange form, fra klon 4 eller C-terminale trunkeringer 35 heraf.

71 DK 174237 B1 Følgelig blev M13-klonen, som indeholdt klon 4-indføjelsen mutageniseret med passende oligomerer til indføjelse af stopcodoner efter aminosyreresterne ved 5 positionerne 150, 190, 191, 221, 223, 236, 238, 249, 258 og 411. F.eks, blev den modsatte M13-streng, som indeholdt klon 4-indføjelsen primet med oligonukleotidet GGCTTGACCTGATCAGACTCTGAGG for at placere en stopcodon efter threoninresten ved position 191 og tilvejebringe et 10 unikt BclI-sted umiddelbart derefter. Den mutageniserede RF-forra af fagen blev fordøjet med BstXI pg BamHI og ligeret ind i BstXI/BamHI-fordøjet 0/E pPLCSF-

17asp5g/CVl50 til frembringelse af O/E

pPLLCSFasp59/cVl50.

15

Den muterede lange form kan anvendes til at erstatte de tilsvarende fragmenter af den korte form fra vektorer, som koder for CSF-1- proteiner, med N-terminale deletioner, såvel som fra de tilsvarende konstruktioner i 20 de phoA-styrede vektorer, F.eks. blev phoA-LCSF/NV3CV221 og pPhoA-LCSF/CV221 konstrueret og transformeret ind i E, coli MM294. Selvfølgelig kan der effektueres mere end en mutation af den lange form; der kan også foretages aminosyresubstitutioner, såsom gly$2 eller tyr^g.

25

Der blev frembragt yderligere konstruktioner til muteiner, som koder for SCSF, LCSF og muteiner heraf, hvor glycosyleringsstederne ved positionerne ved 122-124 og 140-142, som er fælles for begge proteiner, er blevet 30 erstattet med aminosyrer, der ikke udsættes for glycosylering. De CSF-proteiner, som produceres ved bakteriel ekspression af disse konstruktioner, er aktive i biologiske analyser; dette underbygger den formodning, at glycosylering ikke er nødvendig for aktivitet.

35 Erststatning af et hvilket som helst af cysteinresterne 72 DK 174237 B1 mellem positionerne 1-150 ved serin eller alanin resulterer imidlertid i inaktive proteiner, med undtagelse af, at muteiner med en substitution ved position 90 har immunoreaktivitet. Det er klart, at alle de 7 5 cysteiner er nødvendinge eller i det mindste ønskelige for en korrekt genfoldning.

Konstruktion af NV2- og NV3-muteiner ifølge den forliggende opfindelse ud fra en hvilken som helst af de 10 oven for nævnte vektorer er yderst nemt og involverer simpelthen, at Hindlll/BstXI-fragmentet fjernes og erstattes med et syntetisk fragment, som ikke omfatter codonerne for de første 2 henholdsvis 3 aminosyrer. Således kan hver af de ovennævnte vektorer modificeres 15 til opnåelse af en vektor, som koder for muteinerne ifølge den foreliggende opfindelse ved hjælp af denne enkle substitutionsmetode.

Omfattet af de fremstillede rekombinerede organismer er 20 E. coli DG116 λ-lysogen transformeret med følgende plasmider, som er konstruktioner til ekspression af de angivne kort-form-afledede CSF-1- muteinformer: 73 DK 174237 B1

Konstruktion Kodet protein

pPLCSF-17 SCSF

5 pPLCSF-17gln52 gln52SCSF

pPLCSF-17pro52 pro52SCSF

pPLCSF-17/CVl58 SCSF/CVl58-pro pPLCSF-17gln52/CVl58 gln52SCSF/CV158-pro pPLCSF-17pro52/CVl58 pro52SCSF/CVl58-pro

10 pPLCSF-17asp59 asp59SCSF

pPLCSF-17/CVl58TGA SCSF/CV158 O/E pPLCSF-17/CVl58TGA SCSF/CV158 pPLCSF-17pro52/CVl58TGA pro52SCSF/CVl58 pPLCSF-17asp59/CVl58TGA asp59SCSF/CVl58 15 0/E pPLCSF^17asp59/CVl58TGA asp59SCSF/CVl58 pPLCSF-17/CVl50 SCSF/CV150 0/E pPLCSF-17/CVl50 SCSF/CV150 pPLCSF-17asp59/CVl50 asp59SCSF/CVl50 0/E pPLCSF-17asp59/CVl50 asp59SCSF/CVl50 20 0/E pPLCSF-17asp59/NV2CVl50 asp59SCSF/NV2cVl50 0/E pPLCSF-17asp59/NV3CVl50 asp59SCSF/NV3CVl50 Følgende analoge, rekombinerede organismer, der koder for variationer af den lange form, blev konstrueret: 25 0/E pPLLCSF/CVl50 LCSF/CV1/CV150 0/E pPLLCSFgln52/CVl50 gln52LCSF/CVl50 0/E pPLLCSFtyr59/CVl90 tyr59LCSF/CVl90 0/E pPLLCSF/CVl91 LCSF/CV191 30 0/E pPLLCSF/NV2CVl91 LCSF/NV2CV190 0/E pPLLCSF/cV221 LCSF/CV221 0/E pPLLCSF/NV3CV221 LCSF/NV3CV221 O/E pPLLCSF/CV223 LCSF/CV223 O/E pPLLCSF/CV236 LCSF/CV236 74 DK 174237 B1 0/E pPLLCSF/CV238 LCSF/CV238 0/E pPLLCSF/CV249 LCSF/CV249 0/E pPLLCSF/CV250 LCSF/CV250 0/E pPLLCSF/CV411 LCSF/CV411 5 phoA-LCSF/CV221 LCSF/CV221 phoA-LCSF/NV3CV221 LCSF/NV3CV221 0/E phoA-LCSF/CV221 LCSF/CV221 0/E phoA-LCSF/NV3CV221 LCSF/NV3CV221 10

Til ekspression af konstruktionerne dyrkes egnede transformerede E. coli (λ-lysogen, f.eks. DG116 for PL- konstruktionerne/ ikke-lysogen f.eks. MM294 for Phoa) til den ønskede celledensitet og produktionen af det kodede 15 protein induceres derefter. Hvis der sker ekspression under styring af PL-promotoren, inducerer en stigning i temperaturen til 37°C eller 42°C en ekspression. Tilsætningen af ca. 0,5-2¾ casaminosyrer til mediet hjælper også med til at forøge ekspression. De ovenfor 20 beskrevne konstruktioner resulterer i dannelsen af CSF-1 som et uopløseligt, intracellulært protein, som kan udvindes fra de lyserede celler, oprenses og genfoldes. Lignende procedurer kan anvendes til at oprense og genfolde det CSF-1, som secerneres til det peri-25 plasmatiske rum af E. coli, der er transformeret med phoA-styrede gener.

Generelt begynder genfoldningen med den opløste monomer i et chaotropt miljø, som bevares under reducerende beting-30 eiser. En sådan bevarelse kan involvere anvendelsen af et egnet reducerende middel, såsom β-mercaptoethanol eller dithiothreitol (DDT), men CSF-1'en kan allerede være reduceret og udelukkelsen af oxiderende midler kan være tilstrækkelig. Det opløste protein bevares typisk f.eks.

35 i 8 M urinstof eller 7 M guanidiniumhydrochlorid, ved en pH-værdi på fra ca. 7 til 8,5 i nærværelse af fra ca. 25 75 DK 174237 B1 til 100 mM thiol-forbindelse. Ud fra denne opløste form kan monomeren enten genfoldes direkte eller oprenses fra resterende proteiner ved hjælp af en egnet oprensningsprocedure, såsom kromatografi på en adsorberende gel 5 eller gel-gennemtrængningskromatografi forud for genfoldning. Gel-gennemtrængningskromatografi foretrækkes, eftersom det tillader en let størrelsesseparation af den ønskede monomerlængde, som almindeligvis kendes i forvejen, fra urenheder med andre molekylvægte. Det er 10 nødvendigt, at oprensningen udføres under reducerende betingelser for at forhindre dannelsen af disulfidbundne aggregater. Uanset den anvendte kromatografiske metode, foretrækkes det at tilsætte et egnet reducerende middel i de opløsninger, som anvendes til at lade de kromatograf- — 15 iske søjler eller batchportioner og i elueringsopløsning-er. I nogle tilfælde kan lav pH-værdi anvendes i stedet for et reducerende middel, eftersom en lav pH-værdi vil forhindre dannelse af en disulfidbinding i nogle kromatografiske systemer, endog i fravær af et reducerende 20 middel.

Den delvis oprensede monomer udsættes derefter for genfoldningsbetingelser til dannelse af dimeren. Proteinkoncentrationen under dette trin er af stor vigtighed, 25 Almindeligvis forøges udbyttet, hvis proteinkoncentra-tionene er mindre end 2 mg/ml CSF-l-protein; der foretrækkes et koncentrationsområde på fra 0,03 til 0,3 mg/ml. Genfoldningsbetingelser kan inkludere gradvis fjernelse af det chaotrope miljø over en passende 30 tidsperiode, sædvanligvis flere timer. En let metode er fortynding af prøven til den ønskede koncentration af det chaotrope middel, men det kan i visse tilfælde ikke være foretrukket, eftersom proteinet også bliver fortyndet.

Mere foretrukne er metoder, som tilvejebringer en 35 konstant proteinkoncentration, såsom dialyse eller 76 DK 174237 B1 hulfiberdiafiltrering. I slutningen af processen, når det chaotrope miljø er udtømt, opnås et ikke-denaturerende niveau. Hvis der f.eks. anvendes guanidinhydrochlorid som et chaotropt middel opnåes en slutkoncentration på mindre 5 end 2 M, og fortrinsvis fra 0,5 til 1 M.

Genfoldningen under fjernelse af det chaotrope miljø udføres på en sådan måde, at der tillades oxidation af sulfhydrylgrupperne til disulfider for at etablere den 10 resulterende biologisk aktive dimerkonfiguration, som i tilfældet med CSF-1 stabiliseres ved dannelsen af disulfider, hvoraf en eller flere kan koble de 2 kæder.

Der dannes også intrakædesulfider. Egnede redoxbeting-elser, som fremmer denne dannelse af dimerer inkluderer 15 SH/disulfidreagentkombinationer, såsom oxideret og reduceret glutathion. Forholdet mellem reduceret og oxyderet glutathion eller en anden sulfhydryl/disulfidkombination ligger typisk fra ca. 2 mM/0,1 mM til 0,5 mM/1,0 mM. Alternative metoder til tilvejebringelse af 20 denne oxidation kan også accepteres. Simpel fjernelse af det reducerende middel uden forholdsregler for at udelukke luft og metalioner kan være tilstrækkelig til at effektuere dannelsen af nogle korrekte disulfidkoblinger, men dette er mindre foretrukket. I alle tilfælde bør pH-25 værdien af opløsningen under genfoldningsprocessen bevares ved fra ca. 7,5 til 9,0. Det er klart, at ved genfoldningsprocessen anvendes ikke længere de reducerende betingelser, hvorunder den initielle oprensning blev udført.

30

Under genfoldningsprocessen kan der dannes aggregater af monomerer, som er uopløselige. Dette gøres mindst muligt ved temperaturstyring, hvorved lave temperaturer på ca.

0-4°C foretrækkes i forhold til højere temperaturer på 35 fra 25 til 37°C. Efter at genfoldningen er færdig 77 DK 174237 B1 oprenses dimeren fra andre proteiner under anvendelse af standardprocedurer.

Når konstruktioner, som koder for muteiner, hvor den N-5 terminale ende er fjernet, udtrykkes i E. coli, som ovenfor nævnt, processeres methioninen ved den N-terminale ende mere effektivt end det er tilfældet for de tilsvarende modne sekvenser. Specielt resulterer ekspression af pPLCSG17/CVl50 i et protein, hvor de 10 fleste molekyler, hvis ikke alle molekyler, som kan sekventeres indeholder N-terminal methionin; tilsvarende resulterer ekspression af pPLCSF-17/NV2CVl50 i et protein, hvor kun 78% af molekylerne bevarer den N-terminale methionin. Ekspression af pPLCSF-17/NV3CVl50 15 giver protein, hvor kun ca. 5% af produktet indeholder methionin ved den N-terminaleende.

Figurerne 4-6 viser effekten af N-terminale deletioner på den fremkomne proteinheterogenitet. Fig. 4 og 5 viser RP-20 HPLC-analyserne af oprenset CSF-1 udtrykt i E. coli under anvendelse af pPLCSF-l7/cVl58 (tyr5g) henholdsvis pPLCSF-17/cVl50 (aspgg). Som vist i begge figurer er der 2 hovedtoppe ved ca. 18 kd under de reducerende beting- ' eiser under hvilke analyserne blev udført. Den førende 25 top, der er mærket 18 K-A i fig. 4 (og den tilsvarende top i fig. 5) omfatter ca. 70% af den totale mængde af det 18 kd store protein og har stort set den samme aminosyresammensætning og SDS-PAGE subunit-molekylvægt som sportoppen (mærket 18 K-B). Ydermere resulterer den 30 158 codon lange konstruktion i en hovedurenhed i form af et 15 kd stort protein, som tilsyneladende er produktet af en intern genstart. Denne top synes at mangle i produktet med den 150 codon lange konstruktion (aspjg), som er vist i fig. 5, 35 78 DK 174237 B1

De resultater, som er vist i fig. 5, bør korrekt sammenlignes med resultaterne i fig. 6, som repræsenterer RP-HPLC-analyse fra ekspressionen af pPLCSF-17/NV2cVl50 henholdvis PPLCSF-17/NV3CV150. I begge tilfælde er den 5 væsentlige heterogenitet, som ses på RP-HPLC, forsvundet, og der er opnået en enkelt top svarende til den 70% store førende top i fig. 5.

f Formulering af CSF-1 10 *

Den ved rekombination frembragte human-CSF-1, hvadenten det er den korte eller lange form, kan formuleres til indgivelse under anvendelse af farmaceutiske standardprocedurer. Almindeligvis vil CSF-1 blive fremstillet i 15 injicerbar form og kan anvendes som enten den eneste aktive bestanddel eller sammen med andre proteiner eller andre forbindelser, som har komplementær eller lignende aktivitet. Sadanne andre forbindelser kan inkludere alternative antitumor-midler, såsom adriamycin, eller 20 lymfokiner, såsom IL-1, -2 eller -3, χ-, β- eller y- interferoner samt tumornekrosefaktor. Effekten af den CSF-l-aktive bestanddel kan forstærkes eller forbedres ved tilstedeværelse af sådanne yderligere komponenter.

Som ovenfor beskrevet kan CSF-1 vekselvirke på fordel-25 agtig måde med passende blodceller, og sammensætningerne ifølge den foreliggende opfindelse inkluderer derfor inkuberingsblandinger af sådanne celler med CSF-1, eventuelt i nærværelse af yderligere lymfokiner. Enten supernatantfraktionerne af sådanne inkuberingsblandinger 30 eller hele blandingen indeholdende cellerne kan anvendes.

Deponeringer

Den 2. april 1985 har Ansøger hos American Type Culture 35 Collecton, Rockville, MD, USA (ATCC) deponeret fagen 79 DK 174237 B1 phCSF-1 i E. coli DG98f deponeringsnr. 40177. Den 21. maj 1985 blev phCSF-la, som i Cetus samlingen betegnes CMCC 2312, her betegnet phCSF-la/λ Charon 4A med hensyn til deponering, deponeret hos ATCC og har deponeringsnr.

5 40185. Den 14. juni 1985 blev pcCSF-17 i E. coli MM294, betegnet CMCC 2347, deponeret hos ATCC og har deponeringsnr. 53149.

Endvidere blev pcDBCSF4, her betegnet pcDBhuCSF-4 (CMCC

10 2894), deponeret hos ATCC den 24. oktober 1986 og har ATCC deponeringsnr. 67250. Den 7. april 1987 blev pPLCSF- 17asp59/CVl50 i DG116 (CMCC 2946) deponeret hos ATCC og har deponeringsnr. 67.383.

15 Yderligere deponeringer blev foretaget den 14. april 1987, hvilket gælder følgende:

Stamme CMCC nr. ATCC nr.

20 pPhoA-LCSF/CV221 i MM294 3084 67.391 O/E pPLLCSF/NV3CV221 i DG116 3095 67.390 0/E pPLCSF-17asp59/CVl50 25 i DG116 3044 67.389

Disse deponeringer blev foretaget under retningslinierne ifølge Budapest Traktaten vedrørende International Anerkendelse af Deponering af Mikroorganismer af Patent-30 mæssige Hensyn samt Reguleringerne herunder (Budapest Traktaten). Dette sikrer opretholdelse af en levende kultur i 30 ar fra deponeringsdagen. De deponerede stammer vil være tilgængelige hos ATCC under vilkårerne ifølge Budapest Traktaten og underkastet en overenskomst 35 mellem Ansøger og ATCC, som sikrer permanent og 80 DK 174237 B1 ubegrænset tilgængelighed ved udstedelse af det relevante US-patent. Assignator herfor er enig i, at hvis den deponerede kultur dør eller går tabt eller bliver ødelagt, når den dyrkes under passende betingelser, vil 5 den ved notifikation straks blive erstattet med en levende prøve af den samme kultur. Tilgængeligheden af deponeringerne skal ikke antages som en licens til at udøve opfindelsen i modstrid med de rettigheder, som er givet under enhver regerings autoritet i overensstemmelse 10 med landets patentlove.

Disse deponeringer blev foretaget af hensyn til den relevante offentlighed og udgør ikke en indrømmelse af, at en skrevet beskrivelse ikke vil være tilstrækkelig til 15 at udøve opfindelsen, og har ikke til hensigt at begrænse opfindelsen til disse specifikke konstruktioner. Ovenfor er anført en fuldstændig skrevet beskrivelse, som gør en fagmand i stand til at kopiere konstruktionerne, som de er deponeret og at konstruere alternative former af DNA 20 eller organismer, som indeholder DNA'et, hvilket muliggør udøvelse af opfindelsen som anført.

Opfindelsens rækkevidde skal ikke tages som begrænset til de illustrerede udførelsesformer ovenfor, men skal 25 fastlægges i overensstemmelse med de tilhørende krav.

Claims (11)

1. DNA-sekvens, kendetegnet ved, at den 5 koder for human-CSF-1 NV3- eller NV2-mutein, der mindst har aminosyresekvensen for: (i) NV3 eller NV2/SCSF/CV150; eller for (ii) NV3 eller NV2/LCSF/CV150; eller for 10 (iii)en modifikation af enten (i) eller (ii), hvor 1- 5 aminosyrer er substitueret eller deleteret, og hvor dimerer af muteinet stimulerer dannelsen af primært makrofagkolonier i in vitro CSF-l-analysen; og hvor udtrykket "SCSF" refererer til den korte form af CSF, 15 udtrykket "LCSF" refererer til den lange form af CSF, og udtrykket "V" indikerer deletion af én eller flere aminosyrer ved molekylets "N"-terminale ende eller trunkering ved deletion af efterfølgende aminosyrer ved den "C"-terminale ende. 20

2. DNA-sekvens ifølge krav 1, kendetegn-e t ved, at DNA-sekvensen koder for et CSF-l-polypeptid, der yderligere omfatter den aminosyresekvens, der er vist som aminosyrerne 150-447 i Figur 2. 25

3. DNA-sekvens ifølge krav 1, kendetegn-e t ved, at DNA-sekvensen koder for et CSF-l-polypeptid, der er et NV3-mutein af en hvilken som helst af følgende: 30 DK 174237 B1 SCSF, gln-SCSF, pros.'SCSF, SCSF/CVl58-pro, gln-SCSF/CVl58-pro, pros;SCSF/CVl58-pro, SCSF/CV158, pro<_SCSF/CVl58, SCSF/CV150, LCSF/CV150, gln5:LCSF/cVl50, tyr-.LCSF/CVl90, LCSF/CV191, LCSF/CV221, LCSF/CV223,

4. DNA-sekvens ifølge krav 1, kendetegn-e t ved, at DNA-sekvensen koder for et CSF-l-polypeptid 10 udvalgt blandt: (a) NV3-muteiner af LCSF, SCSF, LCSF/CV150, tyr^ vLCSF/CV 150, SCSF/V150 og gln5:-muteiner heraf; 15 (b) NV3-muteiner af hver af de mulige C-terminale deletionspolypeptider fra LCSF/CV149 til LCSF/CV521, og tyrs?", gln5;- og tyrjjglnsc-mutein-er heraf; (c) NV3-muteiner af LCSF/CV190, LCSF/CV191,

20 LCSF/CV221, LCSF/CV223, LCSF/CV236, LCSF/CV238, LCSF/CV249, LCSF/CV258 og LCSF/CV411 og tyr53-, gln5:-, tyrssglnjc-/ seri.57-, ser:53-, ser:s-?-muteiner heraf; og (d) NV3-muteiner af SCSF/CV158 og glns^-muteinerne 25 heraf.

5. DNA-sekvens ifølge krav l, kendetegn-e t ved, at DNA-sekvensen koder for et polypetid DK 174237 B1 omfattende LCSF/NV3CV221 eller LCSFseri5-seri5?NV3CV221 eller SCSF/NV3CV158.

5 LCSF/CV236, LCFT/CV238, LCSF/CV249, LCSF/CV250, og CSF/CV411.

6. Vektor, kendetegnet ved, at den omfatter 5 en DNA-sekvens ifølge et hvilket som helst af kravene 1-5 og et replikon, der er operativt i en encellet organisme.

7. Vektor ifølge krav 6, kendetegnet ved, at den omfatter 0/EpPLLCSF/NV3CV221, der kan opnås fra ATCC 10 67390.

8. Ekspressionssystem, kendetegnet ved, at det omfatter en DNA-sekvens ifølge et hvilket som helst af kravene 1-5 eller en vektor ifølge krav 6 eller krav 15 7, der er operativt bundet til passende styringssekvens er.

9. Rekombinante værtsceller, kendetegn- e t ved, at de er transformerede med et ekspressions- 20 system ifølge krav 8.

10. Fremgangsmåde til fremstilling af rekombinant human-CSF-l-polypeptid, kendetegnet ved, at cellerne ifølge krav 9 dyrkes under betingelser, der 25 effektive til fremstilling af CSF-1.

11. Proteinpræparat, kendetegnet ved, at det omfatter et protein, der kodes af DNA'et ifølge et hvilken som helst af kravene 1-5, og en farmaceutisk 30 acceptabel bærer.