DE3789859T2

DE3789859T2 - Formen des Koloniestimulierungsfaktors 1.

Info

Publication number: DE3789859T2
Application number: DE3789859T
Authority: DE
Inventors: Mazie Yee Pleasanton Ca 94566 Coyne; Robert Forgan San Rafael Ca 94901 Halenbeck; Ernest Seigo Richmond Ca 94804 Kawasaki; Kirston Edward El Cerrito Ca 94530 Koths; Martha Ballie Oakland Ca 94619 Ladner; George Arthur Berkeley Ca 94705 Martin; Janelle Nobel Oakland Ca 94618 Van Arsdell
Original assignee: Cetus Oncology Corp
Current assignee: Novartis Vaccines and Diagnostics Inc
Priority date: 1986-10-24
Filing date: 1987-10-23
Publication date: 1994-09-15
Anticipated expiration: 2007-10-24
Also published as: EP0272779A3; ES2052580T3; NO882772D0; AU8007087A; FI883056A; ATE105869T1; EP0272779B1; DK350188D0; AU646277B2; CA1339032C; JPH01501283A; FI102190B1; DE3789859D1; HUT47635A; WO1988003173A3; WO1988003173A2; JP2644794B2; NO301775B1; HU215241B; EP0272779A2

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft den Einsatz der Rekombinationstechnik zur Herstellung von Lymphokinen, die normalerweise in niedriger Konzentration erzeugt werden. Insbesondere betrifft die Erfindung die Clonierung und Expression von neuen DNA-Sequenzen, die N-terminale Deletionsmuteine des menschlichen koloniestimulierenden Faktors 1 (CSF-1) codieren.
Seit fast 15 Jahren ist bekannt, daß bestimmte Faktoren, die in verschiedenen Geweben in sehr niedrigen Konzentrationen hergestellt werden, die Fähigkeit besitzen, das Wachstum und die Entwicklung von Knochenmark-Stammzellen zu Granulocyten und/oder Makrophagen zu stimulieren. Das Vorliegen solcher Faktoren in Seren, Urinproben und Gewebeextrakten aus verschiedenen Arten kann unter Anwendung eines in vitro-Tests gezeigt werden, wobei die Stimulation der Koloniebildung durch Knochenmarkzellen, die in halbfestem Kulturmedium plattiert wurden, gemessen wird. Es gibt keinen bekannten verläßlichen in vivo-Test. Da diese Faktoren die Bildung solcher Kolonien induzieren, wurden sie alle zusammen koloniestimulierende Faktoren (CSF) genannt.
Kürzlich wurde gezeigt, daß es mindestens vier Unterklassen der menschlichen CSF-Proteine gibt, die gemäß den Zelltypen definiert werden können, die in den resultierenden Kolonien vorliegen. Eine Unterklasse, CSF-1, führt zu Kolonien, die hauptsächlich Makrophagen enthalten. Andere Unterklassen erzeugen Kolonien, die sowohl neutrophile Granulocyten als auch Makrophagen enthalten, die ausschließlich neutrophile Granulocyten enthalten und die neutrophile und eosinophile Granulocyten und Makrophagen enthalten.
Es gibt Maus-Faktoren, die den ersten drei der vorstehenden menschlichen CSFs entsprechen. Außerdem induziert ein IL-3 genannter Maus-Faktor aus Knochenmarkzellen der Maus Kolonien, die alle diese Zelltypen plus Megakaryocyten, Erythrocyten und Mastzellen in verschiedenen Kombinationen enthalten. Auch IL-3 des Menschen ist bekannt. Diese CSFs wurden von Dexter, T. M., Nature 309 (1984), 746, und Vadas, M. A., et al., J. Immunol. 130 (1983), 793, Metcalf, D., Science 229 (1985), 16-22, und Clark, S. C., et al., Science 236 (1987), 1229-1237, beschrieben.
Die vorliegende Erfindung betrifft die rekombinante Herstellung von Proteinen, die zur ersten dieser Unterklassen, CSF-1, zählen. Diese Unterklasse wurde durch spezifische Radioimmuntests und Radiorezeptortests weiter charakterisiert und beschrieben, z. B. sind die gegen gereinigten CSF-1 hervorgebrachten Antikörper befähigt, die CSF-1-Aktivität spezifisch zu unterdrücken, ohne die biologischen Aktivitäten der anderen Unterklassen zu beeinträchtigen, und die Makrophagen-Zellinie J774 enthält Rezeptoren, die spezifisch CSF-1 binden. Eine Beschreibung dieser Tests wurde von Das, S. K., et al., Blood 58 (1981), 630, veröffentlicht.
Reinigungsverfahren für verschiedene CSF-Proteine wurden veröffentlicht.
Stanley, E. R., et al., J. Biol. Chem. 252 (1977), 4305, berichteten über die Reinigung eines CSF-Proteins aus Maus- L929-Zellen bis zu einer spezifischen Aktivität von etwa 1 · 108 Einheiten/mg, das auch hauptsächlich die Produktion von Makrophagen stimulierte. Waheed, A., et al., Blood 60 (1982), 238, schilderten die Reinigung von Maus-L-Zellen-CSF-1 unter Verwendung einer Kaninchen-Antikörper-Säule bis zur augenscheinlichen Homogenität und beschrieben die ersten 25 Aminosäuren der Maus-Sequenz (Ben-Avram, C. M., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 882 (1985) , 4486) Stanley, E. R., et al., J. Biol. Chem. 252 (1977), 4305- 4312, beschrieben ein Reinigungsverfahren für CSF-1 aus menschlichem Urin, Das, S. K., et al., Blood 58 (1981), 630, J. Biol. Chem. 257 (1982), 13679, erhielten einen menschlichen CSF-1 aus Urin bei einer spezifischen Aktivität von 5 · 10&sup7; Einheiten/mg, der nur Makrophagenkolonien erzeugte, und sie zeigten den Zusammenhang von Glykosylierung der CSF-1-Proteine, hergestellt aus gezüchteten Maus-L-Zellen und aus menschlichem Urin, und ihren Aktivitäten. Wang, F. F., et al., J. Cell Biochem. 21 (1983), 263, isolierten menschlichen Urin- CSF-1 bis zu einer spezifischen Aktivität von 108 E/mg. Waheed, A., et al., beschrieben die Reinigung von menschlichem Urin-CSF-1 bis zu einer spezifischen Aktivität von 0,7 bis 2,3 · 10&sup7; E/mg auf einer Kaninchen-Antikörper-Säule (Exp. Hemat. 12 (1984), 434) Wu, M., et al., J. Biol. Chem. 254 (1979), 6226, zeigten die Herstellung eines CSF-Proteins aus gezüchteten menschlichen Pankreascarcinom(MIAPaCa)-Zellen, das zum Wachstum von Maus-Granulocyten- und -Makrophagenkolonien führte. Das resultierende Protein hatte eine spezifische Aktivität von etwa 7 · 10&sup7; Einheiten/mg.
Außerdem wurden teilweise gereinigte Präparate verschiedener CSFs aus konditionierten Mensch- und Maus-Lungenzellen- Medien (Fojo, S. S., et al., Biochemistry 17 (1978), 3109; Burgess, A. W., et al., J. Biol. Chem. 252 (1977), 1998), aus menschlichen T-Lymphoblastzellen (Lusis, A. J., et al., Blood 57 (1981), 13; US-Patent, 4 438 032), aus konditioniertem Medium von menschlicher Plazenta bis zur augenscheinlichen Homogenität und einer spezifischen Aktivität von 7 · 10&sup7; E/mg (Wu, M., et al., Biochemistry 19 (1980), 3846) beschrieben.
Bei dem Vorhaben, die CSF-Proteine im allgemeinen und insbesondere CSF-1 einer beliebigen nützlichen Funktion zuzuführen, bestand eine signifikante Schwierigkeit darin, daß sie nicht in ausreichenden Mengen in einer bestimmten und charakterisierbaren Form verfügbar waren, um ihre Verwendung in der Therapie praktisch durchführbar oder auch nur möglich zu machen. Die vorliegende Erfindung behebt diese Mißstände, indem sie das Ausgangsmaterial zum Erhalt bestimmter gereinigter Muteine des menschlichen CSF-1 mittels Rekombinationstechniken in zweckmäßigen Mengen bereitstellt.
(Ein CSF-Protein einer anderen Unterklasse, der Maus- und Mensch-GM-CSF, wurde gereinigt und die cDNAs cloniert. Gough et al., Nature 309 (1984), 763-767, haben gezeigt, daß sich dieses Protein von anderen CSFs, z. B. CSF-1, unterscheidet. In der WO 87/02060, veröffentlicht am 9. April 1987, wird außerdem beschrieben, daß dieses GM-CSF-Protein bei der Behandlung von Krebspatienten zur Regeneration der Leukocyten nach herkömmlicher Krebstherapie und zur Verminderung der Wahrscheinlichkeit von Virus-, Pilz- und Parasiteninfektionen z. B. beim "Aquired Immune Deficiency Syndrome" (AIDS) nützlich ist. Maus-IL-3 wurde von Fung, M. C., et al., Nature 307 (1984), 233, cloniert. IL-3 von Mensch und Gibbon wurden von Yang, Y.- C., et al., Cell 47 (1986), 3-10, und von Dorssers, L., et al., Gene (1987), im Druck, cloniert. Vgl. auch Yokota, T., et al., PNAS 81 (1984), 1070-1074; Wong, G. G., et al., Science 228 (1985), 810-815; Lee, F., et al., PNAS 82 (1985), 4360- 4364; und Cantrell, M. A., et al., PNAS 82 (1985), 6250-6254.) Auch die Clonierung einer cDNA, die eine Form des menschlichen CSF-1 codiert, insbesondere der nachstehend als pcCSF- 17 bezeichnete Clon, wurde veröffentlicht (Kawasaki, E. S., et al., Science 230 (1985), 292-296); PCT-Anmeldung Veröffentlichungs-Nr. WO 86/04607, veröffentlicht am 14. August 1986. Die Entdeckung eines Clons, der eine "Langform" des menschlichen CSF-1 codiert, wurde von Wong, G. G., et al., Science 235 (1987), 1504-1509, und von Ladner, M. D., et al., EMBO J. 6 (1987) , 2693-2698, veröffentlicht.
Die vorliegende Erfindung betrifft bisher nicht beschriebene Formen menschlicher CSF-1-Proteine.
In einem Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung somit eine DNA-Sequenz, die ein menschliches CSF-1-N 3- oder -N 2- Mutein codiert, das mindestens die Aminosäuresequenz:
(i) N 3 oder N 2/SCSF/C 150; oder
(ii) N 3 oder N 2/LCSF/C 150; oder
(iii) eine Modifikation von (i) oder (ii) aufweist, wobei 1 bis 5 Aminosäuren substituiert oder deletiert sind und wobei Dimere des Muteins im in vitro-CSF-1-Test die Bildung von primären Makrophagenkolonien stimulieren; die menschlichen Proteine, die zur "Langform" zählen, werden durch die in Fig. 2 dargestellte Aminosäuresequenz beschrieben und mit LCSF bezeichnet, und diejenigen, die zur "Kurzform" zählen, werden durch die in Fig. 1 dargestellte Sequenz beschrieben und mit SCSF bezeichnet.
In anderen Aspekten betrifft die Erfindung:
(a) einen Vektor, umfassend eine erfindungsgemäße DNA-Sequenz und ein Replicon, das in einem einzelligen Organismus wirksam ist;
(b) ein Expressionssystem, umfassend eine erfindungsgemäße DNA-Sequenz oder einen erfindungsgemäßen Vektor, funktionell verknüpft mit geeigneten Kontrollsequenzen;
(c) rekombinante Wirtszellen, die mit einem erfindungsgemäßen Expressionssystem transformiert sind;
(d) ein Verfahren zur Herstellung eines rekombinanten menschlichen CSF-1-Polypeptids, umfassend die Züchtung von Zellen, wie vorstehend, unter Bedingungen, die die Produktion des CSF- 1 bewirken.
Fig. 1 zeigt die DNA- und die abgeleiteten Aminosäuresequenzen für einen cDNA-Clon, der eine "Kurzform" des menschlichen CSF-1 (SCSF) codiert und mit pcCSF-17 bezeichnet wird.
Fig. 2 zeigt die cDNA- und die abgeleitete Aminosäuresequenz für eine cDNA, die eine "Langform" von huCSF-1 (LSCF) codiert.
Fig. 3 stellt ein Diagramm des Genoms dar, wobei der Ursprung der Kurz- und Langformen des menschlichen CSF-1 gezeigt werden.
Fig. 4 zeigt die RP-HPLC von rekombinantem CSF-1, hergestellt in E. coli durch die Expression eines Gens, das SCSF/ C 158 codiert.
Fig. 5 zeigt die RP-HPLC von rekombinantem CSF-1, hergestellt in E. coli aus einem Gen, das Asp&sub5;&sub9;-SCSF/C 150 codiert.
Fig. 6 zeigt die RP-HPLC-Analyse des Expressionsproduktes eines Gens, das Asp&sub5;&sub9;-SCSF/NY3C 150 codiert.

Ausführungsformen der Erfindung

A. Definitionen

"Ein Protein, das die Aktivität des koloniestimulierenden Faktors (CSF-1) besitzt", bezieht sich auf ein Protein, das das Aktivitätsspektrum zeigt, das nach dem Stand der Technik dem CSF-1 entspricht, d. h. wenn man es dem Standard-in vitro- Koloniestimulierungstest von Metcalf, D., J. Cell Physiol. 76 (1970), 89, unterwirft, führt es zur Bildung von primären Makrophagenkolonien. Nativer CSF-1 ist ein glykosyliertes Dimer; in einigen Fällen scheint die Dimerisierung für die Aktivität nötig zu sein. Im Umfang der Erfindung und in der Definition von CSF-1 sollen sowohl dimere als auch monomere Formen enthalten sein. Die monomere Form kann in vitro unter Bereitstellung von geeigneten Bedingungen in das Dimer umgewandelt werden, und das Monomer für sich ist als Antigen zur Herstellung von anti-CSF-1-Antikörpern nützlich.
Es zeigt sich, daß hier eine gewisse Artspezifität vorliegt: Menschlicher CSF-1 ist sowohl an menschlichen als auch an Maus-Knochenmarkzellen wirksam; Maus-CSF-1 zeigt bei menschlichen Zellen keine Aktivität. Somit sollte "menschlicher" CSF-1 im spezifischen Maus-Radiorezeptortest von Das, S. K., et al., Blood 58 (1981), 630, positiv sein, obwohl nicht notwendigerweise eine vollständige Korrelation besteht. Die biologische Aktivität des Proteins wird im allgemeinen auch durch neutralisierendes Antiserum gegen menschlichen Urin-CSF-1 gehemmt (Das, S. K., et al., a.a.O.). Unter bestimmten Umständen kann es jedoch sein (z. B. wenn ein spezielles Antikörperpräparat ein CSF-1-Epitop erkennt, das für die biologische Funktion nicht essentiell ist, und wenn das Epitop in dem speziellen CSF-1-Mutein, das getestet wird, nicht vorliegt), daß dieses Kriterium nicht zutrifft.
Kürzlich wurden bestimmte andere Eigenschaften des CSF-1 erkannt, einschließlich der Fähigkeit dieses Proteins, die Sekretion von Prostaglandinen der Serie E, Interleukin-1 und Interferon aus reifen Makrophagen zu stimulieren (Moore, R., et al., Science 223 (1984), 178). Den Mechanismus dieser letzteren Aktivitäten versteht man bisher noch nicht, zum Zweck der Definition wird hier festgestellt, daß das Kriterium zur Erfüllung der Definition in der Fähigkeit liegt, die Bildung von Monocyten-/Makrophagen-Kolonien unter Verwendung von Knochenmarkzellen aus der geeigneten Art als Ausgangsmaterial zu stimulieren, wobei unter den meisten Umständen (siehe vorstehend) diese Aktivität durch neutralisierendes Antiserum gegen gereinigten menschlichen Urin-CSF-1 gehemmt wird und, sofern für den Arttyp geeignet, eine positive Antwort auf den Radiorezeptortest erhalten wird. (Es ist bekannt, daß die proliferative Wirkung des CSF-1 auf Zellen mononuclearer phagocytischer Abstammung beschränkt ist (Stanley, E. R., The Lymphokines (1981), Stewart, W. E. II, et al., Hrsg., Humana Press, Clifton, NJ, S. 102-132) und daß Rezeptoren für CSF-1 auf diese Zellinien (Byrne, P. V., et al., Cell Biol. 91 (1981), 848) und auf placentare Trophoblast-verwandte Zellen beschränkt sind.)
Wie bei allen Proteinen hängt die genaue chemische Struktur von mehreren Faktoren ab. Da im Molekül ionisierbare Amino- und Carboxylgruppen vorliegen, kann ein spezielles Protein als saures oder basisches Salz oder in neutraler Form erhalten werden. Alle solche Präparate, bei denen unter geeigneten Umgebungsbedingungen ihre Aktivität erhalten bleibt, sind in der Definition enthalten. Ferner kann die primäre Aminosäuresequenz, sofern dies ohne Zerstörung der Aktivität möglich ist, durch Oxidation oder Reduktion modifiziert werden, oder sie kann durch Derivatisierung unter Verwendung von Zuckerresten (Glykosylierung) oder durch andere zusätzliche Moleküle, wie z. B. Lipide, Phosphat-, Acetylgruppen und dergleichen, gebräuchlicher durch Konjugation mit Sacchariden, vergrößert werden.
Die durch die hier beschriebenen Gene codierten Proteine können auch durch Proteolyse prozessiert werden. Man nimmt an, daß CSF-1 in der Natur in einer oder mehreren C-terminal deletierten Formen vorkommen kann. Auch kann die primäre Aminosäurestruktur (die am C-Terminus entweder abgeschnitten oder nicht abgeschnitten ist) unter Erzeugung von Komplexen, meist Dimeren, aggregieren. Nativer menschlicher Urin-CSF-1 wird als hochglykosyliertes Dimer mit 45 bis 90 kd isoliert, abhängig davon, nach welchem Verfahren und von wem die Messung durchgeführt wird. Native menschliche CSF-1-Proteine aus anderen Quellen, wie z. B. Monocyten, HL-60 und PanC-Zellinien zeigen ähnliche Eigenschaften. Aus MIAPaCa stammender CSF-1 scheint ein komplexes Gemisch aus glykosylierten dimeren Proteinen mit Molekulargewichten der Monomeren von 70, 48, 40, 30 und 26 kd zu sein, wobei diese durch Immunoblots einer SDS-PAGE bestimmt wurden. Bestimmte Aspekte einer solchen Vergrößerung werden durch posttranslationale Prozessierungssysteme des produzierenden Wirts erreicht; andere solche Modifikationen können in vitro eingeführt werden. In jedem Fall sind solche Modifikationen in der Definition enthalten, solange die vorstehend definierte Aktivität des Proteins nicht zerstört wird. Natürlich erwartet man, daß solche Modifikationen die Aktivität qualitativ oder quantitativ beeinflussen können, indem sie die Aktivität des Proteins in den verschiedenen Tests entweder steigern oder verringern. Insbesondere haben die Anmelder gezeigt, daß das nichtglykosylierte Monomer in einigen Tests Aktivität aufweisen kann.
Das Molekulargewicht des entglykosylierten Monomers wurde untersucht, jedoch konnten keine endgültigen Schlüsse gezogen werden, da die Schwierigkeit darin bestand, das Fehlen von Proteolyse während der Fermentation, der Reinigung und bei der Entglykosylierungsreaktion sicherzustellen. Trotzdem wurde von Das, S. K., et al., J. Biol. Chem. 257 (1982), 13679-13684, beschrieben, daß das Molekulargewicht dieses entglykosylierten Dimers nur 14 bis 17 kd betrug. Der von Wong, G. G., et al., (1987) (a.a.O.), beschriebene, rekombinant erzeugte CSF-1 hat anscheinend ein Molekulargewicht von etwa 21 kd. Andererseits liegt das Molekulargewicht, das aufgrund der Aminosäuresequenz errechnet wurde, die für die "Kurzform" von CSF mit 224 Aminosäuren (SCSF) hergeleitet wurde, in der Größenordnung von 26 kd, während das Molekulargewicht der "Langform" (LCSF) nach der Berechnung in einer Größenordnung von 55 kd liegt. Wenn deletierte Konstrukte dieser Gene in E. coli exprimiert werden (wo keine Glykosylierung stattfindet), bringen sie native Proteine hervor, die ein deutlich niedrigeres Molekulargewicht von 17 bis 18 kd für SCSF/C 150 und von etwa 30 kd für LCSF/C 221 aufweisen. Wenn LCSF oder SCSF in Säuger- oder Insektenzellen exprimiert werden, werden höhere Molekulargewichte erhalten, jedoch ist es schwierig zu sagen, zu welchem Ausmaß sie auf einer Glykosylierung beruhen und zu welchem Ausmaß sie auf der primären Aminosäuresequenz selbst beruhen. Wie vorstehend besprochen zeigt sich, daß im nativ hergestellten Protein tatsächlich C-terminale Verkürzungen vorliegen können.
Natürlich ist wohlbekannt, daß bei bakteriell produzierten reifen Proteinen, vor denen unmittelbar ein ATG-Startcodon steht, das N-terminale Methionin in der produzierten und gewonnenen Form entweder enthalten oder nicht enthalten sein kann. Demgemäß sind beide Formen umfaßt. Außerdem kann eine leichte Modifikation der N-terminalen Sequenz die Prozessierung des N-terminalen Methionins unterstützen, ferner wird nachstehend gezeigt, daß die Deletion der Reste 1 und 2 (beide Glutaminsäure) oder der Reste 1 bis 3 (Glu-Glu-Val) auf diese Art und Weise Unterstützung leistet. Demgemäß sind auch diese Formen eindeutig von der Definition umfaßt.
Neben der Tatsache, daß Expressionsprodukte erhalten werden, die am N-Terminus wirksamer prozessiert sind, sind die Proteine, die in E. coli aus Genen hergestellt werden, die diese N 2- und N 3-Muteine codieren, bei Untersuchung mittels RP-HPLC relativ homogen, wenn man sie mit den Expressionsprodukten von Genen vergleicht, die solche Formen codieren, bei denen die zwei N-terminalen Glutaminsäurereste erhalten bleiben. Diese Heterogenität könnte ein Phänomen sein, das mit der bakteriellen Expression dieser Proteine zusammenhängt, da sie nicht auftritt, wenn die Gene in Säugerzellen, wie z. B. CV-1-Zellen, exprimiert werden.
Das Folgende zur Wirkung von N-terminalen Modifikationen auf die Prozessierung von N-terminalem Methionin: Wenn Konstrukte, die das reife Protein codieren, intrazellulär in E. coli exprimiert werden, zeigt sich, daß das produzierte Protein im wesentlichen nicht unter Entfernung des N-terminalen Methionins prozessiert ist, d. h. das ganze sequenzierbare Material, das nach der Proteinreinigung gewonnen wird, beginnt mit Met. Wenn jedoch die entsprechenden Konstrukte, die N 2- deletierte CSF-1-Muteine codieren, unter ähnlichen Bedingungen exprimiert werden, liegen 23% des Proteins in einer Form vor, der das N-terminale Methionin fehlt. Bei N 3-Konstrukten steigt der Prozentsatz an Protein, das am N-Terminus unter Entfernung des Methionins prozessiert ist, auf etwa 95% an.
Zur Untersuchung der Heterogenität wird eine Umkehrphasen-HPLC-Analyse mit dem reduzierten CSF-1-Protein durchgeführt, das in E. coli aus verschiedenen rekombinanten Konstrukten hergestellt wurde, hierbei zeigen Konstrukte, die den reifen N-Terminus codieren, eine Heterogenität auf zwei Ebenen. Erstens liegen zwei Peaks von etwa dem gleichen Molekulargewicht und der gleichen augenscheinlichen Aminosäurezusammensetzung vor, deren Flächen zueinander in einem Verhältnis von etwa 70 : 30 stehen. Außerdem liegt ein weiterer Peak vor, der durch einen inneren Neustart zustandekommt, der in solchen Clonen auftritt, die Tyrosin als Rest 59 codieren, wie in Figur 6 gezeigt. Diese Komplikation wird ausgeräumt, indem das Gen stromaufwärts von Position 65, wie nachstehend beschrieben, neu entworfen wird. Konstrukte, die die N 2- und N 3-Formen codieren und die einen Asp-Rest als Rest 59, vorzugsweise über ein GAT-Codon, codieren, zeigen nicht das Fragment mit innerem Neustart und enthalten nur Protein, das die Retentionszeit des 70%-Peaks der reifen Proteinzusammensetzungen aufweist.
Kurzgefaßt können, zusätzlich zu den N-terminalen und C- terminalen Deletionen und Aggregationen, einzelne Aminosäurereste in der Kette durch Oxidation, Reduktion oder eine andere Derivatisierung modifiziert werden und diese Proteine auch gespalten und/oder aggregiert werden, wobei Fragmente erhalten werden, deren Aktivität erhalten bleibt. Trotz solcher Änderungen, die die Aktivität nicht zerstören, schließt die Definition noch die Proteinsequenz ein, und sie sind somit spezifisch enthalten. Auch auf CSF-1, der aus anderen Arten stammt, kann die Definition eines Proteins zutreffen, das die Aktivität des "menschlichen" CSF-1 aufweist, wenn es das erforderliche Aktivitätsmuster zeigt, das vorstehend für das menschliche Substrat dargestellt wurde.
Fig. 1 zeigt die Aminosäuresequenz für eine spezielle Form des menschlichen CSF-1, die durch den rekombinanten cDNA- Clon pcCSF-17 codiert wird. Dieses Protein enthält 224 Aminosäuren in der reifen Sequenz und eine Leader-Sequenz von 32 Aminosäuren. Wie hier gezeigt wird, ist das Protein, das als Expressionsprodukt dieses Clons erzeugt wird, in Tests aktiv, die für CSF-1 spezifisch sind, nämlich im Knochenmarkproliferationstest (wobei die Aktivität durch Zusatz von anti-CSF-1- Antikörpern zerstört wird), in Koloniestimulierungstests und in einem Radiorezeptortest.
Das reife Protein der in Fig. 1 gezeigten Aminosäuresequenz, das von dem hier erläuterten cDNA-Clon abgeleitet ist, wird kurz mit CSF-1 (SCSF) bezeichnet. Fig. 1 zeigt das Vorliegen einer aus 32 Resten bestehenden mutmaßlichen Signalsequenz, die bei Sekretion aus Säugerzellen vermutlich abgespalten wird; SCSF wird durch die in dieser Figur gezeigten Aminosäuren 1 bis 224 dargestellt. Insbesondere sind in dieser Erfindung Muteine enthalten, die Monomere und Dimere von bestimmten verwandten Formen von SCSF sind und die hier anhand ihrer Unterschiede zu SCSF gekennzeichnet sind.
Zur Vereinfachung wird die Aminosäuresequenz von SCSF als Referenz eingesetzt und andere eng verwandte Sequenzen, die CSF-1-Aktivität aufweisen, unter Bezug auf die in Fig. 1 gezeigte Sequenz gekennzeichnet. Da das N-terminale Methionin entweder enthalten oder nicht enthalten sein kann, sind beide Formen in allen Fällen enthalten, wenn das CSF-1-Protein in Bakterien erzeugt wird. Die Substitution einer speziellen Aminosäure wird durch Bezugnahme auf den Aminosäurerest angegeben, den sie ersetzt. Somit bezieht sich beispielsweise ser&sub9;&sub0;SCSF auf das Protein, das die in Fig. 1 gezeigte Sequenz aufweist, mit der Ausnahme, daß die Aminosäure in Position 90 Serin anstelle von Cystein ist. Deletionen aus den Termini werden durch N und darauffolgend die Anzahl der aus der N- terminalen Sequenz deletierten Aminosäuren oder, wenn Reste aus der C-terminalen Sequenz deletiert sind, durch C und die Position der letzten verbleibenden Aminosäure bezeichnet. Somit bezieht sich "SCSF/N 4" oder die "N 4-Form von SCSF" auf CSF-1 von Fig. 1, wobei die ersten vier Aminosäuren aus dem nativen N-Terminus deletiert wurden; "SCSF/C 130" oder die "C 130-Form von SCSF" bezieht sich auf CSF-1, wobei die letzten 94 Aminosäuren, die auf Aminosäure 130 folgen, deletiert wurden. Nachstehend werden z. B. Asp&sub5;&sub9;SCSF (der an Position 59 einen durch das Gen codierten Asparaginsäurerest anstelle des durch die cDNA codierten Tyrosinrestes enthält) und SCSF/C 158 erläutert, der nur die Aminosäuren 1 bis 158 von SCSF umfaßt.
Die CSF-1-Proteine, die Aminosäuresequenzen enthalten, die mit denjenigen verwandt sind, die von der gewonnenen Langform-cDNA abgeleitet sind, d. h. die ein 298 Aminosäure-"Extra"-Segment umfassen, eingefügt an Rest 150 des durch pcCSF-17 codierten Proteins, werden als Langformen des Proteins angesehen, und die in Fig. 2 als 1 bis 522 gezeigte Aminosäuresequenz wird willkürlich mit LCSF bezeichnet. Wieder kann diesem Molekül, wenn es in E. coli erzeugt wird, Methionin vorangestellt oder nicht vorangestellt sein. Die Bezeichnung für die Muteine von LCSF entspricht der vorstehend für SCSF beschriebenen Bezeichnung.
Die 522 Aminosäuren lange Sequenz, die z. B. durch pcDBhuCSF-4 und seine entsprechenden Clone codiert wird, ist die Sequenz von LCSF und kann auch mit huCSF-1 bezeichnet werden.
Die hier verwendeten Abkürzungen enthalten "huCSF-1" auch für alle menschlichen Formen des Proteins.
Der hier verwendete Begriff "diskretes Peptid" oder "Mutein" bezieht sich auf eine spezielle primäre Aminsosäuresequenz, die nicht Teil einer größeren Sequenz ist. Somit beziehen sich diese Begriffe auf Peptidmoleküle, die keine weiteren N- oder C-Aminosäuresequenz-Verlängerungen aufweisen. Die hier beanspruchten Proteinpräparate, die CSF-1-Aktivität aufweisen, können jedoch Monomere, Dimere oder andere Aggregate dieser einzelnen Peptide oder Muteine sein.
"Funktionell verbunden" bezieht sich auf die Nebeneinanderstellung, so daß die normale Funktion der Bestandteile erhalten wird. Eine codierende Sequenz, die mit Kontrollsequenzen "funktionell verbunden" ist, bezieht sich somit auf eine Konfiguration, wobei die codierende Sequenz unter der Kontrolle dieser Sequenzen exprimiert werden kann.
"Kontrollsequenzen" bezieht sich auf DNA-Sequenzen, die in einem speziellen Wirtsorganismus für die Expression einer funktionell verbundenen codierenden Sequenz nötig ist. Die Kontrollsequenzen, die für Prokaryoten geeignet sind, umfassen z. B. einen Promotor, gegebenenfalls eine Operatorsequenz, eine Ribosomenbindungsstelle und möglicherweise andere Sequenzen, die man bisher noch nicht richtig versteht. Eukaryotische Zellen verwenden bekanntermaßen Promotoren, Polyadenylierungssignale und Enhancer.
"Expressionssystem" bezieht sich auf DNA-Sequenzen, die eine gewünschte codierende Sequenz und Kontrollsequenzen in funktioneller Verknüpfung enthalten, so daß die mit diesen Sequenzen transformierten Wirte befähigt sind, die codierten Proteine herzustellen. Um die Transformation durchzuführen, kann das Expressionssystem auf einen Vektor aufgenommen werden; jedoch kann die relevante DNA dann auch in das Wirtschromosom integriert werden.
Die hier verwendeten Begriffe "Zelle", "Zellinie" und "Zellkultur" werden austauschbar benützt und alle diese Bezeichnungen umfassen die Nachkommenschaft. "Transformanten" oder "transformierte Zellen" umfassen die primäre Zelle oder davon abgeleitete Kulturen ohne Rücksicht auf die Zahl der Tranfers. Auch ist es so zu verstehen, daß alle Nachkommenschaft aufgrund von absichtlichen oder unbeabsichtigten Mutationen nicht genau den gleichen DNA-Gehalt haben muß. Die Nachkommenschaft der Mutanten ist umfaßt, die beim Absuchen die gleiche Funktionalität wie die ursprünglich transformierte Zelle aufweist. Wenn bestimmte Bezeichnungen gemeint sind, ist dies aus dem Zusammenhang ersichtlich.
"Wirksame Menge" bedeutet eine Menge, die zur Durchführung der angegebenen Funktion wirksam ist, wie z. B. zur Abtötung von Tumoren oder zur Besserung des Tumorleidens oder zur Verhinderung oder Heilung von Infektionskrankheiten.

B. Herstellung von CSF-1 für die pharmazeutische Anwendung:

Gewinnung des Gens

Obwohl die Existenz eines mit CSF-1 bezeichneten Aktivitätsmusters bereits seit einiger Zeit bekannt war, war das dafür verantwortliche Protein weder in ausreichender Reinheit und ausreichenden Mengen, um die Sequenzbestimmung erfolgreich durchzuführen, noch in ausreichender Reinheit und Quantität, um eine nützliche therapeutische Funktion bereitzustellen, erhalten worden. Da weder vollständig reine, brauchbare Mengen des Proteins noch seine codierende DNA verfügbar waren, war es nicht möglich, durch Bereitstellung von Muteinen die Struktur mit Hilfe von Modifikationen zu optimieren, und es war auch nicht möglich, dieses Protein in einer Therapie einzusetzen.
Die Verwendung von Rekombinationstechniken schafft bei diesen Mängeln Abhilfe. Wie in PCT WO 86/04607 (a.a.O.) beschrieben, wurden Sonden, die auf isoliertem menschlichem Urin-CSF-1, N-terminale Sequenz, beruhten, zur Untersuchung der menschlichen Genbank eingesetzt, wodurch das Gen in voller Länge erhalten wurde. Die clonierte menschliche genomische Sequenz kann unter Verwendung seiner eigenen Kontrollsequenzen direkt exprimiert werden, oder in für Säugersysteme geeigneten Konstruktionen, die zur Prozessierung von Introns befähigt sind. Die genomischen Sequenzen wurden auch als Sonden für eine menschliche cDNA-Bank eingesetzt, die aus einer CSF-1- produzierenden Zellinie erhalten wurde, wodurch die pcCSF-17- cDNA erhalten wurde, die ein Protein mit CSF-1-Aktivität codiert. Diese cDNA kann, wenn sie geeignet zubereitet wird, in COS- oder CV-1-Zellen direkt exprimiert werden, außerdem kann sie in Vektoren eingebaut werden, die für die Expression in vielen verschiedenen Wirten geeignet sind. Wie in der vorstehenden Anmeldung beschrieben, zeigen auch bestimmte Modifikationen der Primärstruktur CSF-1-Aktivität.
Wie hier beschrieben, wurde die menschliche cDNA, die die 224 Aminosäuren lange Form des Proteins codiert, als Sonde verwendet, um die Sequenzen, die den Maus-CSF-1 codieren, aus einer cDNA-Bank zu gewinnen, die in kgt10 aus L-929-mRNA hergestellt worden war, welche im Hinblick auf die Fähigkeit zur CSF-1-Produktion angereichert worden war. Zwei Clone wurden gewonnen, die ein ähnliches, 522 Aminosäuren langes Protein codieren. Die Clone weichen in der untranslatierten 3'-Region dramatisch voneinander ab. Im längeren Maus-Clon von 4 kb beträgt die untranslatierte 3'-Region mehr als 2 kb und ist der entsprechenden menschlichen Sequenz kaum ähnlich; der andere kürzere 2 kb-Clon enthält in der untranslatierten Region etwa 500 bp und zeigt eine starke Homologie mit der entsprechenden menschlichen DNA.
Anschließend wurden diese aus der Maus-Bank erhaltenen Langformen des CSF-1 als Grundlage zur Herstellung von Sonden verwendet, um die entsprechende menschliche Langsequenz zu gewinnen, deren Primärstruktur im Genom codiert ist. Aufgrund des Vergleichs der Maus-cDNAs mit den menschlichen genomischen Sequenzen wurde gefunden, daß eine Region des Gens, die sich manchmal wie eine Intron-Region verhält, offensichtlich eine Aminosäuresequenz codiert, die eine starke Homologie mit dem in der Maus-Sequenz enthalten 298 Aminosäuren langen "Extra"- Segment zeigt. Dies erlaubte die Konstruktion einer Oligonucleotid-Sonde, die auf der "Extra"-DNA beruhte, die im Maussystem zu Protein translatiert worden war. Da die menschliche genomische Sequenz verfügbar war, wurde die Sonde so entworfen, daß sie genau mit der menschlichen Sequenz übereinstimmte.
pcCSF-17 war als Okayama-Berg-Vektor aus MIAPaCa-mRNA hergestellt worden, die auf CSF-1-codierendes Material angereichert war; die cDNA-Bank, aus der die die Langform codierende cDNA erhalten wurde, wurde jedoch aus der aus MIAPaCa-Zellen extrahierten Gesamt-mRNA hergestellt und in λgt10 cloniert. Die λgt10-Bank wurde zuerst unter Verwendung der pcCSF-17-Sequenzen als Sonde durchgemustert, sodann wurden selektierte Sonden-positive Kandidaten unter Verwendung einer Oligonucleotid-Sonde durchgemustert, die auf der translatierten "Extra"-Sequenz der Maus-cDNA beruhte, die jedoch so modifiziert war, daß sie der verwandten Region im menschlichen Genom entsprach. Mehrere Clone wurden erhalten, die eine entsprechende "Langform" eines menschlichen Proteins codierten.
Die "Langform" kommt offensichtlich durch einen Unterschied im mRNA-Spleißen zustande, wie in Fig. 3 dargestellt. Die codierende "Extra"-Sequenz in der mRNA entsteht aus einer DNA, die am stromaufwärts liegenden Ende von Exon 6 liegt; in der Kurzform wird sie herausgespleißt. Verschiedene mRNA-codierten LSCFs weichen auch am 3'-Ende voneinander ab (nicht aber in der Proteinsequenz).
Die cDNA, die die "Langform" des Proteins aus dem menschlichen System codiert, kann in einer Art und Weise exprimiert werden, die der vorstehend für die Kurzform diskutierten Art und Weise ähnlich ist. Geeignete Wirte umfassen Säugerzellen, wodurch eine wirksamere Prozessierung des primären Proteinproduktes erhalten wird, außerdem umfassen sie, mit Hilfe einer Ligierung in Expressionvektoren, Bakterien, Hefe, Insektenzellen oder andere Wirte.
Natürlich eröffnet die Verfügbarkeit von DNA, die jede dieser Sequenzen codiert, die Möglichkeit, die Codonsequenz zu modifizieren, wodurch die erfindungsgemäßen Muteinformen mit CSF-1-Aktivität erzeugt werden.
Mit diesen Werkzeugen kann somit die vollständige codierende Sequenz für den menschlichen CSF-1 bereitgestellt werden, aus welcher die auf verschiedene Wirtssysteme anwendbaren Expressionsvektoren konstruiert und die codierende Sequenz exprimiert werden kann. Durch die verschiedenen Wirte, die in Zusammenhang mit den für solche Wirte geeigneten Expressionsvektoren verfügbar sind, wird eine Auswahl unter posttranslationalen Prozessierungssystemen und Umgebungsfaktoren möglich, wodurch eine strukturelle Regulierung des auf diese Weise erzeugten Proteins bereitgestellt wird.
Aus den vorstehenden Ausführungen wird deutlich, daß Teile der CSF-1-codierenden Sequenz als Sonden nützlich sind, um bei verschiedenen Arten andere CSF-1-codierende Sequenzen zu gewinnen. Demgemäß können Teile der cDNA oder der genomischen DNA, die mindestens sechs Aminosäuren codieren, in E. coli repliziert werden und die denaturierten Formen als Sonden zur Gewinnung weiterer CSF-1-codierender DNAs verwendet werden. Da zwischen der Nucleotidsequenz der menschlichen Form und derjenigen des entsprechenden Teils anderer Arten möglicherweise keine genau exakte Paarung zustandekommt, sollte man, um falsch positive Ergebnisse auszuschließen, Oligomere verwenden, die etwa 18 Nucleotide enthalten (die eine Sequenz von sechs Aminosäuren codieren), um die Hybridisierung unter Bedingungen einer genügenden Stringenz zur Vermeidung falsch positiver Ergebnisse zu erhalten. Die Sequenzen, die sechs Aminosäuren codieren, würden eine Information liefern, die für solche Sonden ausreichend ist.

C. Geeignete Wirte, Kontrollsysteme und Verfahren

Allgemein ausgedrückt umfaßt die Herstellung einer rekombinanten Form von CSF-1 typischerweise die folgenden Schritte:
Zuerst wird eine DNA erhalten, die das reife Protein (wird hier so verwendet, daß es alle Muteine enthalten soll), das Präprotein oder eine Fusion des CSF-1-Proteins mit einer weiteren Sequenz, die seine Aktivität nicht zerstört, oder mit weiteren Sequenzen, die unter kontrollierbaren Bedingungen abspaltbar sind (wie z. B. die Behandlung mit Peptidase), codiert, wodurch ein aktives Protein erhalten wird. Sofern die Sequenz nicht durch Introns unterbrochen ist, ist sie für die Expression in einem beliebigen Wirt geeignet. Sofern Introns vorliegen, ist eine Expression in solchen Säugersystemen oder anderen eukaryotischen Systemen möglich, die diese prozessieren können. Diese Sequenz sollte in herausschneidbarer und gewinnbarer Form vorliegen. Sodann wird die herausgeschnittene und gewonnene codierende Sequenz vorzugsweise in einer funktionellen Verknüpfung mit geeigneten Kontrollsequenzen in einen replizierbaren Expressionsvektor eingebracht. Der Vektor wird zur Transformation eines geeigneten Wirtes verwendet und der transformierte Wirt unter günstigen Bedingungen gezüchtet, wodurch die Produktion des rekombinanten CSF-1 bewirkt wird. Gegebenenfalls wird der CSF-1 aus dem Medium oder aus den Zellen isoliert; in einigen Fällen kann es sein, daß die Gewinnung und Reinigung des Proteins nicht nötig ist, da gewisse Verunreinigungen toleriert werden können. Z.B. ist für die in vitro-Züchtung von Zellen, aus denen ein Lymphokin-Faktor für die Verabreichung an ein Individuum isoliert wird, manchmal die vollständige Reinigung nicht erforderlich. Selbstverständlich jedoch wäre die Reinigung des erzeugten CSF-1 nötig, wenn er für eine therapeutische Behandlung verwendet werden soll, wobei er direkt an ein Individuum verabreicht wird.
Jeder der vorstehenden Schritte kann verschiedenartig ausgeführt werden. Z.B. können die gewünschten codierenden Sequenzen erhalten werden, indem geeignete cDNA aus cellulärem Messenger hergestellt und die cDNA so manipuliert wird, daß man die vollständige Sequenz enthält. Alternativ können genomische Fragmente erhalten und direkt in geeigneten Wirten angewendet werden. Die Konstruktionen für Expressionsvektoren, die in verschiedenen Wirten funktionell sind, werden unter Verwendung geeigneter Replicons und Kontrollsequenzen durchgeführt, wie nachstehend beschrieben. Geeignete Restriktionsstellen können, sofern sie nicht im Normalzustand verfügbar sind, an die Enden der codierenden Sequenz so angefügt werden, daß ein herausschneidbares Gen zur Insertion in diese Vektoren bereitgestellt wird.
Die Kontrollsequenzen, Expressionsvektoren und Transformationsverfahren hängen vom Typ der Wirtszelle ab, die zur Expression des Gens verwendet wird. Im allgemeinen sind zur Zeit als Wirte Prokaryoten-, Hefe-, Insekten- oder Säugerzellen nützlich. Da der native CSF-1 als glykosyliertes Dimer ausgeschieden wird, hat man angenommen, daß Wirtssysteme bevorzugt sind, die zu einer korrekten posttranslationalen Prozessierung befähigt sind. Da prokaryotische Wirte nicht in der Lage sind, eine Glykosylierung oder kontrollierte Dimerisierung durchzuführen, wären diese Wirte nur dann geeignet, wenn die unglykosylierte Form gereinigt und zu einer aktiven Form prozessiert werden kann. Dies ist, wie sich herausstellte, für CSF-1 der Fall. CSF-1 kann in E. coli wirksam als Monomer produziert und unter Verwendung verschiedener Techniken zu einer aktiven nichtglykosylierten dimeren Form gefaltet werden.
Jedoch können auch eukaryotische Zellen verwendet werden. Insbesondere Insekten- oder Säugerzellen sind bevorzugt. Sofern eine Sekretion gewünscht wird, hat man eine größere Sicherheit, daß die native Signalsequenz durch Insekten- oder Säugerzellwirte erkannt wird, die eine solche Sekretion ermöglichen und hierdurch die Reinigung erleichtern. CSF-1 wird in CHO-Zellen stabil produziert und kann auch in stabil transformierten CV-1-Zellen und Virus-infizierten Insektenzellen erzeugt werden.
Im besonderen Fall des menschlichen CSF-1 verdichten sich die Anzeichen, daß eine beträchtliche Deletion am C-Terminus des Proteins sowohl unter rekombinanten als auch unter nativen Bedingungen stattfinden kann und daß die in vitro-Aktivität des Proteins trotzdem noch erhalten bleibt. Es scheint, daß die isolierten nativen Proteine in einer Art C-terminal verkürzten Form oder als Gemische davon vorliegen können und daß sie eine variable C-terminale Prozessierung zeigen können. Die Aktivität dieser "verkürzten" Formen wird eindeutig aufgrund ihrer wohlüberlegten Herstellung erhalten. Das Mutein, das z. B. aus der SCSF/C 150-codierenden DNA erzeugt wurde, ist in CSF-1-Tests vollständig aktiv, wie auch dasjenige, das aus der LCSF/C 190-codierenden cDNA produziert wurde. Die Produkte der rekombinanten Expression von sowohl Lang- als auch Kurzformen der Gene scheinen Untereinheit-Molekulargewichte zu zeigen, die niedriger liegen als man aus der vollständigen Sequenzlänge erwarten würde. Man nimmt an, daß die "native" Prozessierung an verschiedenen proteolytischen Stellen stattfinden kann, umfassend z. B. in der Langform am Arg-Rest in Position 223, Lys-Rest in Position 238, Arg-Rest in Position 249 oder Arg in Position 411. Da klar ist, daß bestimmte C- terminal verkürzte Formen aktiv sind, können die verwendeten Konstrukte auch die entsprechenden verkürzten Formen der codierenden Sequenz umfassen.

C.1. Kontrollsequenzen und entsprechende Wirte

Prokaryoten werden häufig von verschiedenen Stämmen von E. coli verkörpert. Jedoch können auch andere mikrobielle Stämme verwendet werden, wie z. B. Bacillen, z. B. Bacillus subtilis, verschiedene Arten von Pseudomonas oder andere Bakterienstämme. In solchen prokaryotischen Systemen werden Plasmidvektoren verwendet, die Replikationsstellen und Kontrollsequenzen enthalten, die aus einer mit dem Wirt kompatiblen Art stammen. Z.B. wird E. coli typischerweise unter Verwendung von Abkömmlingen von pBR322 transformiert, einem Plasmid, das von Bolivar et al., Gene 2 (1977), 95, aus einer E. coli-Art abgeleitet wurde. pBR322 enthält Gene für Ampicillin- und Tetracyclinresistenz und stellt somit weitere Marker bereit, die bei der Konstruktion des gewünschten Vektors entweder erhalten bleiben oder zerstört werden können. Üblicherweise eingesetzte prokaryotische Kontrollsequenzen, die nach der Definition hier Promotoren zur Initiation der Transkription, gegebenenfalls mit einem Operator, zusammen mit Ribosomenbindungsstelle-Sequenzen enthalten, umfassen die üblicherweise verwendeten Promotoren, wie z. B. die Beta-Lactamase(Penicillinase)- und Lactose(lac)-Promotorsysteme (Chang et al., Nature 198 (1977), 1056) und das Tryptophan(trp)-Promotorsystem (Goeddel et al., Nucleic Acids Res. 8 (1980), 4057) sowie den von Lambda stammenden PL-Promotor und die N-Gen-Ribosomenbindungsstelle (Shimatake et al., Nature 292 (1981), 128), die sich als transportable Kontrollkassette bewährt hat. Jedoch kann jedes beliebige Promotorsystem verwendet werden, das mit Prokaryoten kompatibel ist.
Anfangs wurden im speziellen Fall von CSF-1 wegen des hohen Grades an posttranslationaler Prozessierung, die eine Glykosylierung und Dimerisierung umfaßt, bakterielle Systeme nur zögernd verwendet. Außerdem liegt insbesondere im N- terminalen Teil des Proteins, eine große Zahl von Cysteinresten vor. Tatsächlich weist die LCSF-Untereinheit insgesamt zehn Cysteinreste auf, wobei der letzte an Position 225 steht; in SCSF liegen sieben vor. Somit enthalten die beiden an den Positionen 7, 31, 49, 90, 102, 139 und 146 Cysteinreste; die Langform weist weitere Cysteine an Position 157, 159 und 225 auf. Man nimmt an, daß die Prozessierung zur Bildung des Dimers die Bildung mehrerer Bindungen innerhalb der Kette und mindestens einer Bindung zwischen den Ketten umfaßt. Es sind jedoch Techniken verfügbar, mit deren Hilfe bakteriell erzeugte Proteine dieses Typs gefaltet werden können, außerdem wurden spezifische Verfahren entwickelt, die zur Herstellung von gereinigtem biologisch aktivem CSF-1 aus Bakterien nützlich sind.
Außer den Bakterien können auch eukaryotische Mikroorganismen, wie z. B. Hefe, als Wirte verwendet werden. Laborstämme von Saccharomyces cerevisiae, der Bäckerhefe, werden am häufigsten verwendet, obwohl gewöhnlich auch eine ganze Anzahl anderer Stämme verfügbar sind. Vektoren, die den 2-Mikron- Replikationsursprung verwenden, werden erläutert, Broach, J. R., Meth. Enz. 101 (1983), 307, jedoch sind auch andere Plasmidvektoren bekannt, die für die Hefeexpression geeignet sind (vgl. z. B. Stinchcomb et al., Nature 282 (1979), 39, Tschempe et al., Gene 10 (1980), 157, und Clarke, L., et al., Meth. Enz. 101 (1983), 300). Kontrollsequenzen für Hefevektoren umfassen Promotoren für die Synthese von glykolytischen Enzymen (Hess et al., J. Adv. Enzyme Reg. 7 (1968), 149; Holland et al., Biochemistry 17 (1978), 4900). Weitere aus dem Stand der Technik bekannte Promotoren umfassen den Promotor für 3-Phosphoglyceratkinase (Hitzeman et al., J. Biol. Chem. 255 (1980), 2073) und diejenigen für andere glykolytische Enzyme, wie z. B. Glycerinaldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase, Hexokinase, Pyruvatdecarboxylase, Phosphofructokinase, Glucose-6- phosphat-Isomerase, 3-Phosphoglyceratmutase, Pyruvatkinase, Triosephosphatisomerase, Phosphoglucoseisomerase und Glucokinase. Andere Promotoren, die den weiteren Vorteil aufweisen, daß die Transkription durch die Wachstumsbedingungen kontrolliert werden kann, sind die Promotorregionen für Alkoholdehydrogenase-2, Isocytochrom C, saure Phosphatase, die mit dem Stickstoffstoffwechsel zusammenhängenden Abbauenzyme sowie Enzyme, die für die Verwertung von Maltose und Galactose verantwortlich sind (Holland, a.a.O.). Man nimmt auch an, daß Terminatorsequenzen am 3'-Ende der codierenden Sequenzen wünschenswert sind. Solche Terminatoren werden in der untranslatierten 3'-Region gefunden, die in den aus Hefe stammenden Genen auf die codierenden Sequenzen folgt. Viele der erläuterten Vektoren enthalten Kontrollsequenzen, die aus dem Enolasegen-enthaltenden Plasmid peno46 (Holland, M. J., et al., J. Biol. Chem. 256 (1981), 1385) oder dem aus YEp13 erhaltenen LEU2-Gen (Broach, J., et al., Gene 8 (1978), 121) abgeleitet sind, jedoch ist jeder beliebige Vektor geeignet, der einen Hefe-kompatiblen Promotor, Replikationsursprung und andere Kontrollsequenzen enthält.
Natürlich besteht auch die Möglichkeit, Gene, die Polypeptide codieren, in eukaryotischen Wirtszellkulturen zu exprimieren, die von multizellulären Organismen stammen. Vgl. z. B. Tissue Culture, Academic Press, Cruz und Patterson, Hrsg. (1973). Nützliche Wirtszellinien umfassen Maus-Myelome N51-, VERO- und HeLa-Zellen sowie Chinesische Hamster-Ovar(CHO)-Zellen. Expressionsvektoren für solche Zellen umfassen im allgemeinen Promotoren und Kontrollsequenzen, die mit Säugerzellen kompatibel sind, wie z. B. die üblicherweise verwendeten frühen und späten Promotoren aus dem Simian Virus 40 (SV40) (Fiers et al., Nature 273 (1978), 113), oder andere virale Promotoren, wie z. B. diejenigen, die aus Polyoma-, Adenovirus 2, Rinder-Papillom-Virus oder Vogel-Sarkom-Viren stammen, oder Immunglobulin-Promotoren und Hitzeschock-Promotoren. Allgemeine Aspekte der Transformationen mit Säugerzellwirtssystemen wurden von Axel, US-Patent-Nr. 4 399 216, erteilt am 16.
August 1983, beschrieben. Nun zeigt sich außerdem, daß bei der Optimierung der Expression "Enhancer"-Regionen wichtig sind; im allgemeinen sind dies Sequenzen, die stromaufwärts der Promotorregion gefunden werden. Replikationsursprünge können, falls nötig, aus viralen Quellen erhalten werden. Der Einbau in das Chromosom jedoch ist ein üblicher Mechanismus für die DNA-Replikation in Eukaryoten. Auch Pflanzenzellen sind nun als Wirte verfügbar, außerdem sind Kontrollsequenzen erhältlich, die mit Pflanzenzellen kompatibel sind, wie z. B. der Nopalin-Synthase-Promotor und Polyadenylierungs-Signalsequenzen (Depicker, A., et al., J. Mol. Appl. Gen. 1 (1982), 561).
Außerdem wurden kürzlich Expressionssysteme unter Verwendung von Insektenzellen beschrieben, wobei die durch Baculovirus-Vektoren bereitgestellten Kontrollsysteme benützt werden (Miller, D. W., et al., in Genetic Engineering (1986), Setlow, J. K., et al., Hrsg., Plenum Publishing, Bd. 8, S. 277-297). Auch mit diesen Systemen läßt sich der CSF-1 erfolgreich herstellen.

C.2. Transformationen

Die Transformation wird, abhängig von der verwendeten Wirtszelle, unter Einsatz herkömmlicher, für diese Zellen geeigneter Techniken durchgeführt. Die Calcium-Behandlung unter Verwendung von Calciumchlorid, wie von Cohen, S. N., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 69 (1972), 2110, beschrieben, wird bei Prokaryoten oder anderen Zellen eingesetzt, die starke Zellwandbarrieren aufweisen. Bei bestimmten Pflanzenzellen wird die Infektion mit Agrobacterium tumefaciens (Shaw, C. H., et al., Gene 23 (1983), 315) verwendet. Bei Säugerzellen ohne solche Zellwände wird das Calciumphosphat-Fällungsverfahren von Graham und van der Eb, Virology 52 (1978), 546, bevorzugt. Transformationen in Hefe werden nach der Methode von Van Solingen, P., et al., J. Bact. 130 (1977), 946, und Hsiao, C. L., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 76 (1979), 3829, durchgeführt.

C.3. Sonden-Untersuchung von mRNA durch Northern-Blotting; Sonde von cDNA oder Genbanken

Für das Northern-Blotting wird die RNA durch Agarose- Platten-Gelelektrophorese unter vollständig denaturierenden Bedingungen fraktioniert, wobei Formaldehyd (Maniatis, T., et al., Molecular Cloning (1982), Cold Spring Harbor Press, S. 202-203) oder 10 mM Methylquecksilber (CH&sub3;HgOH) (Bailey, J. M., et al., Anal. Biochem. 70 (1976), 75-85; und Sehgal, P. B., et al., Nature 288 (1980), 95-97) als denaturierendes Mittel verwendet wird. Für die Methylquecksilber-Gele werden 1,5% Gele zubereitet, indem die Agarose im Laufpuffer (100 mM Borsäure, 6 mM Natriumborat, 10 mM Natriumsulfat, 1 mM EDTA, pH 8,2) geschmolzen, sodann auf 60ºC abgekühlt und 1/100 Volumen von 1 M CH&sub3;HgOH zugefügt wird. Die RNA wird in 0,5 · Laufpuffer gelöst und durch zehnminütige Inkubation in 10 mM Methylquecksilber bei Raumtemperatur denaturiert. Beim Auftragen der Proben werden Glycerin (20%) und Bromphenolblau (0,05%) zugesetzt. Die Proben werden der Elektrophorese bei 500 bis 600 Volt/Stunde unter Pufferzirkulation unterworfen. Nach der Elektrophorese wird das Gel 40 Minuten in 10 mM 2- Mercaptoethanol gewaschen, um das Methylquecksilber zu entgiften, sodann werden die Northern-Blots hergestellt, indem die RNA aus dem Gel auf ein Membranfilter übertragen wird.
cDNA oder Genbanken werden unter Einsatz des Kolonie- oder Plaque-Hybridisierungsverfahrens durchgemustert. Bakterienkolonien oder Phagenplaques werden auf Duplikat-Nitrocellulose-Filterpapiere (S & S Typ BA-85) übertragen. Die Plaques oder Kolonien werden lysiert und die DNA durch die anschließende fünfminütige Behandlung mit 500 mM NaOH, 1,5 M NaCl, auf das Filter fixiert. Die Filter werden zweimal jeweils fünf Minuten mit 5 · Standard-Kochsalzlösung-Citrat (SSC) gewaschen, sodann luftgetrocknet und zwei Stunden bei 80ºC gebacken.
Die Gele für das Northern-Blotting oder die Duplikat-Filter für das Durchmustern von cDNA oder Genom werden sechs bis acht Stunden bei 25 bis 42ºC mit 10 ml/Filter DNA-Hybridisierungspuffer ohne Sonde (0 bis 50% Formamid, 5 bis 6 · SSC, pH 7,0, 5 · Denhardt-Lösung (Polyvinylpyrrolidon, plus Ficoll und Rinderserumalbumin; 1 · = 0,02% von jedem), 20 bis 50 mM Natriumphosphatpuffer bei pH 7,0, 0,2% SDS, 20 ug/ml Poly-U (wenn cDNA mit Sonde untersucht wird) und 50 ug/ml denaturierter Lachssperma-DNA) prähybridisiert. Anschließend werden die Proben durch Inkubation bei der geeigneten Temperatur etwa 24 bis 36 Stunden hybridisiert, wobei der Hybridisierungspuffer verwendet wird, der die Kinase-behandelte Sonde enthält (bei Oligomeren). Längere cDNA- oder Genfragment-Sonden wurden durch Nick-Translation oder durch Primerextension markiert.
Die Bedingungen von sowohl Prähybridisierung als auch Hybridisierung hängen von der gewünschten Stringenz ab und sind z. B. je nach der Länge der Sonden unterschiedlich. Typische Bedingungen für relativ lange Sonden (z. B. aus mehr als 30 bis 50 Nucleotiden) sind eine Temperatur von 42 bis 55ºC und ein Hybridisierungspuffer, der etwa 20 bis 50% Formamid enthält. Bedingungen für niedere Stringenz, die bei oligomeren Sonden von etwa 15 Nucleotiden erforderlich sind, umfassen niedrigere Temperaturen von etwa 25 bis 42ºC und niedrigere Formamid-Konzentrationen (0 bis 20%). Für längere Sonden können die Filter z. B. zuerst viermal jeweils 30 Minuten bei 40 bis 55ºC mit 2 · SSC, 0,2% SDS und 50 mM Natriumphosphatpuffer, pH 7, und anschließend zweimal mit 0,2 · SSC und 0,2% SDS gewaschen werden, sodann werden sie luftgetrocknet und zwei bis drei Tage bei -70ºC autoradiographiert. Für kürzere Sonden sind die Waschbedingungen etwas weniger hart.

C.4. Vektorkonstruktion

Die Konstruktion von geeigneten Vektoren, die die gewünschten codierenden und Kontroll-Sequenzen enthalten, wird unter Einsatz von Standard-Ligierungs- und -Restriktionstechniken durchgeführt, die aus dem Stand der Technik wohlbekannt sind. Isolierte Plasmide, DNA-Sequenzen oder synthetisierte Oligonucleotide werden gespalten, zugeschnitten und in der gewünschten Form wiederligiert.
Eine stellenspezifische DNA-Spaltung wird durch Behandlung mit dem geeigneten Restriktionsenzym (oder -enzymen) unter Bedingungen durchgeführt, die im allgemeinen aus dem Stand der Technik bekannt sind, wobei die Einzelheiten vom Hersteller dieser im Handel erhältlichen Restriktionsenzyme genau angegeben werden. Vgl., z. B., New England Biolabs, Produkt-Katalog. Im allgemeinen wird etwa 1 ug Plasmid- oder DNA- Sequenz durch eine Einheit Enzym in etwa 20 ul Pufferlösung gespalten; in den Beispielen hier wird typischerweise ein Überschuß des Restriktionsenzyms eingesetzt, um die vollständige Spaltung des DNA-Substrats sicherzustellen. Inkubationszeiten von etwa einer bis zwei Stunden bei etwa 37ºC können verwendet werden, jedoch sind auch Abweichungen hiervon tolerierbar. Nach jeder Inkubation wird das Protein durch Extraktion mit Phenol/Chloroform entfernt, worauf möglicherweise anschließend eine Etherextraktion folgt, sodann wird die Nucleinsäure aus den wäßrigen Fraktionen durch Ethanolfällung gewonnen. Gewünschtenfalls können die gespaltenen Fragmente durch Polyacrylamidgel- oder Agarosegel-Elektrophorese unter Verwendung von Standardtechniken nach der Größe aufgetrennt werden. Eine allgemeine Beschreibung der Auftrennung nach der Größe findet sich in Methods in Enzymology 65 (1980), 499-560.
Die durch Restriktion gespaltenen Fragmente können durch Behandlung mit dem großen Fragment der E. coli-DNA-Polymerase I (Klenow) in Gegenwart der vier Desoxynucleotidtriphosphate (dNTPs) mit glatten Enden versehen werden, wobei Inkubationszeiten von etwa 15 bis 25 Minuten bei 20 bis 25ºC in 50 mM Tris, pH 7,6, 50 mM NaCl, 6 mM MgCl&sub2;, 6 mM dTT und 5 bis 10 uM dNTPs verwendet werden. Das Klenow-Fragment füllt an den kohäsiven 5'-Enden auf, schneidet aber überstehende 3'-Einzelstränge ab, auch wenn die vier dNTPs vorliegen. Gewünschtenfalls kann eine selektive Reparatur innerhalb der, durch die Natur der kohäsiven Enden vorgegebenen Grenzen durchgeführt werden, indem nur eines der dNTPs oder ausgewählte dNTPs bereitgestellt werden. Nach Behandlung mit dem Klenow-Fragment wird das Gemisch mit Phenol/Chloroform extrahiert und mit Ethanol gefällt. Die Behandlung mit S1-Nuclease unter geeigneten Bedingungen führt zur Hydrolyse jedes beliebigen einzelsträngigen Teils.
Synthetische Oligonucleotide können durch das Triester- Verfahren von Matteucci, et al. (J. Am. Chem. Soc. 103 (1981), 3185-3191) oder unter Verwendung von automatisierten Syntheseverfahren hergestellt werden. Die Kinase-Behandlung der Einzelstränge vor der Anelierung oder für eine Markierung wird durchgeführt, indem ein Überschuß, z. B. etwa 10 Einheiten Polynucleotid-Kinase pro 1 nM Substrat in Gegenwart von 50 mM Tris, pH 7,6, 10 mM MgCl&sub2;, 5 mM Dithiothreit und 1 bis 2 mM ATP eingesetzt wird. Sofern die Kinase-Behandlung zur Markierung der Sonde durchgeführt wird, enthält das ATP 32γP mit hoher spezifischer Aktivität.
Ligierungen werden in Volumina von 15 bis 30 ul unter den folgenden Standard-Bedingungen und -Temperaturen durchgeführt: 20 mM Tris-Cl, pH 7,5, 10 mM MgCl&sub2;, 10 mM dTT, 33 ug/ml BSA, 10 bis 50 mM NaCl und entweder 40 uM ATP, 0,01 bis 0,02 (Weiss) Einheiten T4-DNA-Ligase bei 0ºC (für eine Ligierung von "kohäsiven Enden") oder 1 mM ATP, 0,3 bis 0,6 (Weiss) Einheiten T4-DNA-Ligase bei 14ºC (für eine Ligierung von "glatten Enden"). Intermolekulare Ligierungen von "kohäsiven Enden" werden üblicherweise bei 33 bis 100 ug/ml Gesamt-DNA-Konzentrationen (5 bis 100 nM Gesamt-End-Konzentration) durchgeführt. Intermolekulare Ligierungen von "glatten Enden" werden (üblicherweise unter Einsatz eines 10- bis 30-fachen molaren Überschusses an Linkern) bei 1 uM Gesamt-Enden-Konzentration durchgeführt.
Bei der Vektorkonstruktion unter Einsatz von "Vektorfragmenten" wird das Vektorfragment üblicherweise mit bakterieller alkalischer Phosphatase (BAP) versetzt, um das 5'-Phosphat zu entfernen und die Wiederligierung des Vektors zu verhindern. BAP-Spaltungen werden bei einem pH-Wert von 8 in etwa 150 mM Tris in Gegenwart von Na&spplus; und Mg²&spplus; unter Verwendung von 1 Einheit BAP pro ug Vektor etwa eine Stunde bei 60ºC durchgeführt. Zur Gewinnung der Nucleinsäurefragmente wird das Präparat mit Phenol/Chloroform extrahiert und mit Ethanol gefällt. Alternativ kann die Wiederligierung in Vektoren verhindert werden, indem diese doppelt gespalten werden, wobei die unerwünschten Fragmente einer weiteren Restriktionsenzym-Spaltung unterworfen werden.

C.5. Modifikation von DNA-Sequenzen

Wenn für Teile von Vektoren, die aus cDNA oder genomischer DNA stammen, Modifikationen der Sequenz erforderlich sind, wird eine stellenspezifische gezielte Mutagenese mittels Primer eingesetzt. Diese Technik entspricht nach dem Stand der Technik einem Standard und wird durchgeführt, indem ein synthetischer Oligonucleotid-Primer verwendet wird, der zu einer einzelsträngigen Phagen-DNA, die mutagenisiert werden soll, komplementär ist, mit Ausnahme einer begrenzten Fehlpaarung, die die gewünschte Mutation darstellt. Kurz gesagt wird das synthetische Oligonucleotid als Primer verwendet, um die Synthese eines zum Phagen komplementären Stranges zu steuern, sodann wird die resultierende doppelsträngige DNA in ein Phagentragendes Wirtsbakterium transformiert. Kulturen der transformierten Bakterien werden in Weichagarmedium plattiert, in welchem die Plaquebildung aus Phagen-enthaltenden Einzelzellen möglich ist.
Theoretisch werden 50% der neuen Plaques denjenigen Phagen enthalten, der als Einzelstrang die mutierte Form aufweist; 50% werden die ursprüngliche Sequenz aufweisen. Die Plaques werden mit Kinase-behandeltem synthetischem Primer bei einer Temperatur hybridisiert, die zwar die Hybridisierung mit exakter Paarung erlaubt, bei der aber die Fehlpaarungen mit dem ursprünglichen Strang ausreichend sind, um eine Hybridisierung zu verhindern. Sodann werden diejenigen Plaques, die mit der Sonde hybridisieren, herausgegriffen, gezüchtet und die DNA gewonnen. Einzelheiten der stellenspezifischen Mutationsverfahren werden nachstehend in spezifischen Beispielen beschrieben.

C.6. Überprüfung der Konstruktion

In den nachstehend beschriebenen Konstruktionen werden korrekte Ligierungen für die Plasmidkonstruktion bestätigt, indem zuerst der E. coli-Stamm MM294 oder ein anderer geeigneter Wirt mit dem Ligierungsgemisch transformiert wird. Erfolgreiche Transformanten werden durch eine Ampicillin-, Tetracyclin- oder eine andere Antibiotikaresistenz oder unter Verwendung anderer Marker, abhängig von der Art der Plasmidkonstruktion, selektiert, wie es dem Stand der Technik entspricht. Sodann werden Plasmide aus den Transformanten gemäß dem Verfahren von Clewell, D. B., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 62 (1969), 1159, hergestellt, gegebenenfalls anschließend an eine Chloramphenicol-Amplifikation (Clewell, D. B., J. Bacteriol. 110 (1972), 667). Die isolierte DNA wird durch Restriktion analysiert und/oder durch das Didesoxy-Verfahren von Sanger, F., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 74 (1977), 5463, wie weiterhin von Messing et al., Nucleic Acids Res. 9 (1981), 309, beschrieben, oder durch das Verfahren von Maxam et al., Methods in Enzymology 65 (1980), 499, sequenziert.

C.7. Beispiele für Wirte

Die folgenden Wirtsstämme wurden hier für die Clonierung und Expression verwendet:
Für die Clonierung und Sequenzierung und für die Expression der Konstruktion unter Kontrolle der meisten bakteriellen Promotoren wurde der E. coli-Stamm MM294 eingesetzt, erhalten aus dem E. coli Genetic Stock Center, GCSC #6135. Für die Expression unter der Kontrolle des PLNRBS-Promotors wird der E. coli-Stamm K12 MC1000 Lambda-lysogen, N&sub7;N&sub5;&sub3;cI857 SusP&sub8;&sub0;, ATCC 39531, verwendet.
Für M13-Phagenrekombinanten werden E. coli-Stämme eingesetzt, die für eine Phageninfektion empfänglich sind, wie z. B. E. coli K12 Stamm dG98. Der dG98-Stamm war am 13. Juli 1984 bei ATCC hinterlegt worden und hat die Hinterlegungsnummer 39768.
Die Säugerexpression wurde hier in COS-7-, COS-A2-, CV-1- und CHO-Zellen durchgeführt.

D. Bevorzugte Ausführungsformen

Die rekombinanten CSF-1-Proteine dieser Erfindung können zwei Gruppen von "Basis"-Proteinen zugeordnet werden, den N- terminalen Muteinen von LCSF und den N-terminalen Muteinen von SCSF. Diese Proteine haben ähnliche aber nicht identische primäre Aminosäuresequenzen und unterschiedliche Längen, wobei alle das für CSF-1 charakteristische Aktivitätsmuster zeigen oder spezifisch zu einem Mutein gespalten werden können, welches das für CSF-1 charakteristische Aktivitätsmuster zeigt, d. h. sie sind befähigt, Knochenmarkzellen so zu stimulieren, daß sie sich überwiegend in Monocyten differenzieren, und sie zeigen, innerhalb der im vorstehenden Abschnitt der Definitionen dargestellten Grenzen, Immunreaktion mit Antikörpern, die gegen nativen CSF-1 hervorgebracht wurden, und mit den Rezeptoren, die mit der CSF-1-Aktivität assoziiert sind. Bestimmte Ausführungsformen von Muteinen, die SCSF betreffen, wurden in der PCT Anmeldung Veröffentlichungs-Nr. WO 86/04607 nicht spezifisch offenbart, die auf der Priorität mehrerer Stammanmeldungen hierzu basiert. Außerdem werden in der EPO- Anmeldung die menschlichen Langformen von CSF-1, insbesondere LCSF und seine verwandten Muteine, nicht offenbart. Bestimmte N- und C-terminal deletierte Formen von LCSF sind besonders bevorzugt.
Einige spezifische Ausführungsformen von SCSF-Muteinen werden in der EPO-Anmeldung beschrieben. Wie in der EPO-Anmeldung dargestellt, kann an Position 59 Asp oder Tyr stehen, d. h. zusätzlich zum ursprünglich gewonnenen SCSF sind Muteine enthalten, bei denen die SCSF-Sequenz durch Substitution von Asp anstelle von Tyr an Position 59 verändert ist (d. h. Asp&sub5;&sub9;- SCSF). Umgekehrt weist LCSF an Position 59 Asp auf, das durch Tyr ersetzt sein kann (Tyr&sub5;&sub9;-LCSF).
Hier wird die Klasse von Muteinen von SCSF und LCSF beschrieben, denen die zwei oder drei N-terminalen Reste fehlen und die somit eine N-terminale Sequenz aufweisen, die ausgewählt ist aus der Gruppe, die aus Val-Ser-Glu-Tyr-Cys-Ser und Ser-Glu-Tyr-Cys-Ser besteht.
Von besonderem Interesse sind auch verschiedene C-terminale Deletionsmuteine. Die vorstehend zitierte EPO-Anmeldung offenbarte nur für SCSF gekürzte Formen - und nur C 158 und länger. Nach dem Stand der Technik ist nicht klar, in welchem Ausmaß die nativen Proteine in vivo vom C-Terminus prozessiert werden. Nun wurde nachgewiesen, daß mindestens die C-terminale Region hinter Aminosäure 150 von SCSF deletiert sein kann, wobei die CSF-1-Aktivität des Proteins in vitro im Knochenmarkproliferationstest erhalten bleibt. Ferner nimmt man an, daß die 23 Aminosäuren lange hydrophobe Sequenz, die sich in der Kurzform von Position 166 bis 188 und in der Langform von 464 bis 486 erstreckt, eine Membranankerfunktion aufweist und vom Protein abgetrennt wird, wenn dieses durch die Membran transportiert und sekretiert wird. Dieser Teil kann auch für die Membranbindung selbst verantwortlich sein und eine Wechselwirkung des an Zellmembranen gebundenen CSF-1 an seiner Bindungsstelle mit anderen Zellen erlauben. Diese Sequenzen können unabhängig voneinander insgesamt oder zum Teil entbehrlich sein. In jedem Fall zeigt sich, daß bei Isolierung des nativen Proteins und in den sekretierten Proteinen, die bei rekombinanter Herstellung erhalten werden, Formen von CSF-1 gefunden werden, die deutlich kürzer sind als der codierte SCSF oder der codierte LCSF. Die vorliegenden Daten zeigen, daß die Expression von SCSF-codierenden Konstrukten in CV-1-Zellen zu SCSF/C 158 im Überstand führen kann.
Demgemäß sind in der Erfindung CSF-1-Proteine enthalten, die NY2- oder N 3-Muteinformen von Proteinen sind, umfassend die Aminosäuresequenzen, enthaltend nur die ersten 150 Aminosäuren von SCSF oder LCSF oder ihrer Muteine mit der als Tyr oder Asp austauschbaren Position 59, wie vorstehend beschrieben, (die somit mit Ausnahme der letzten Aminosäure identisch sind), gegebenenfalls in der weiteren Sequenz durch eine beliebige Zahl von Aminosäuren verlängert. In dieser Gruppe sind insbesondere die N 3- oder N 2-Formen von C-terminalen Deletionen bevorzugt, die SCSF/C 150, SCSF/C 158, LCSF/C 150, LCSF/C 190, LCSF/C 191, CSF/C 221, LCSF/C 223, LCSF/C 236, LCSF/C 238, LCSF/C 249, LCSF/C 258 und LCSF/C 411 entsprechen.
Auch bevorzugt sind Konstruktionen, die die vorstehend erwähnten C-terminalen Deletionen codieren, wobei in der Sequenz der "Basis"-Sequenz Modifikationen von einer oder mehreren Aminosäuren, vorzugsweise 1 bis 5 und stärker bevorzugt 1 bis 2 Aminosäuren, enthalten sind.
Die verschiedenen CSF-1-Formen können somit auch Mutationen enthalten, welche die Funktionalität nicht zerstören, und zwar in solchen Regionen, die zwischen den verschiedenen Arten nicht hochkonserviert sind. Dies sind Deletionen und/oder Substitutionen von 1 bis 5 Aminosäuren in den Positionen 15 bis 20, 51 bis 52 und/oder 75 bis 84. Eine weitere solche Region ist diejenige in Position 191 bis 193 in SCSF und 489 bis 491 in LCSF. Die vorstehend zitierte EPO-Veröffentlichung beschreibt nur Mutanten von SCSF und des C-terminalen Muteins davon, deletiert zu C 158; demgemäß sind diese Muteine neu, da sie sowohl den Langform-LCSF als auch seine Muteine oder die weiter verkürzten SCSF/C 150-157 betreffen. Insbesondere wurde gefunden, daß Gln&sub5;&sub2;-Formen von sowohl SCSF als auch LCSF und ihre Muteine aktiv sind.
Außerdem wurde hier gezeigt, daß die Änderung einer oder mehrerer Glykosylierungsstellen zu aktiven Proteinen führen kann. LCSF weist vier Glykosylierungsstellen auf - an Position 122 bis 124, 140 bis 142, 349 bis 351 und an 383 bis 385; SCSF weist nur die ersten zwei auf. Somit ist auch jedes beliebige Mutein enthalten, das eine inaktivierende Mutation an einer oder an mehreren solchen Stellen enthält.
Außerdem wurde gezeigt, daß das Cystein an Position 90 für die Immunreaktivität entbehrlich ist. Demgemäß sind Muteine enthalten, die Ala&sub9;&sub0; oder Ser&sub9;&sub0; sind, wenn sich der angestrebte Zweck nur auf die Antigenität bezieht. Auch die Cysteine an den Positionen 157 und 159 von LCSF sind für die Aktivität entbehrlich, darüberhinaus zeigen die Ser&sub1;&sub5;&sub7;-, Ser&sub1;&sub5;&sub9;- und Ser&sub1;&sub5;&sub7;-Ser&sub1;&sub5;&sub9;-LCSF-Muteine (einschließlich der N- und C- terminal deletierten Formen) auf HPLC eine verbesserte Homogenität. Außerdem nimmt man an, daß die mutmaßlichen Membranankerbereiche von sowohl LCSF als auch SCSF für einige Typen der CSF-1-Aktivität entbehrlich sind.

Bevorzugte Ausführungsformen der CSF-1-codierenden DNA

Zusätzlich zur Modifikation der Aminosäuresequenzen kann auch die das Protein codierende DNA-Sequenz modifiziert werden, um die Expression in speziellen Systemen zu fördern. In E. coli z. B. resultieren Änderungen der Codons für die ersten sechs Aminosäuren der nativen Sequenz zu solchen Aminosäuren, die in Bakterien bevorzugt sind, in einer gesteigerten Produktion von sowohl LCSF als auch SCSF und ihren verkürzten Formen. Somit enthalten Vektoren (nachstehend mit O/E für "Over Expressing" bezeichnet) DNAs mit der N-terminalen codierenden Sequenz GAAGAAGTTTCTGAATAT oder den N - oder N 3-Verkürzungen davon. Diese wird als synthetisches HindIII/BstXI- Fragment bereitgestellt und unterscheidet sich vom nativen GAGGAGGTGTCGGAGTAC in den gezeigten unterstrichenen Positionen. Sofern die CSF-1-codierende DNA intrazellulär in Bakterien exprimiert werden soll, umfaßt ein Aspekt der Erfindung die Bereitstellung der CSF-1-codierenden DNA in einer Form, wobei eine geeignete Anzahl an Codons am N-Terminus gemäß den Regeln für Codons ausgewählt wird, die von Bakterien bevorzugt werden.
Außerdem können, hinsichtlich einer bakteriellen Expression, die DNA-Sequenzen stromaufwärts des ATG an Position 65 modifiziert werden, wodurch die Verwendung dieses ATG als innere Startstelle vermieden wird. Dies stellt für Tyr&sub5;&sub9;-Konstrukte ein ernsteres Problem dar als für Asp&sub5;&sub9;-Konstrukte. Ein Primer der Sequenz 5'-3'
wird bei der stellenspezifischen Mutagenese eingesetzt, um die mit Sternchen versehenen Änderungen des nativen Gens durch zuführen. Hieraus resultiert keine Änderung der codierten Aminosäuren.

E. Nutzen und Verabreichung

Die erfindungsgemäßen CSF-1-Proteine sind sowohl zur Stimulierung der Produktion von Monocyten-Vorläuferzellen/Makrophagenzellen aus Knochenmark-Stammzellen, wodurch die Wirksamkeit des Immunsystems gesteigert wird, als auch zur Stimulierung entsprechender Funktionen dieser differenzierten Zellen befähigt, wie z. B. zur Stimulierung der Sekretion von Lymphokinen in reifen Makrophagen. Auch sind sie nützliche Mittel gegen Infektionen, insbesondere als antivirale und antimikrobielle Mittel.
In einer Anwendungsform sind diese Proteine als Adjuvantien zur Chemotherapie nützlich. Man weiß, daß eine chemotherapeutische Behandlung zur Suppression des Immunsystems führt. Diese chemotherapeutischen Behandlungen haben jedoch, obwohl sie erfolgreich die Tumorzellen zerstören, gegen die sie gerichtet sind, aufgrund der Nebenwirkungen der chemotoxischen Mittel auf die Zellen des Immunsystems häufig den Tod des Patienten zur Folge. Die Verabreichung von CSF-1 an solche Patienten führt aufgrund der Fähigkeit von CSF-1, das Wachstum und die Differenzierung von aus Knochenmark stammenden Vorläufern zu Makrophagen zu vermitteln und steigern, zu einer Neustimulierung des Immunsystems, wodurch diese Nebenwirkung verhindert und somit die Anfälligkeit des Patienten, den Sekundärinfektionen zu erliegen, vermieden wird. Zu den Patienten, denen durch eine solche Behandlung geholfen werden könnte, zählen außerdem diejenigen, die wegen Leukämie mit Knochenmarktransplantaten behandelt werden; sie befinden sich häufig in einem immunsupprimierten Zustand, wodurch die Abstoßung verhindert wird. Auch bei diesen Patienten könnte durch die Verabreichung von CSF-1 die Immunsuppression aufgehoben werden.
Im allgemeinen würde jeder Patient, der an einer Immunsuppression leidet, ganz gleich ob aufgrund von Chemotherapie, Knochenmarktransplantation oder anderen zufälligen Formen von Immunsuppression, wie z. B. Krankheit (z. B. "Aquired Immune Deficiency Syndrome"), von der Verfügbarkeit von CSF-1 für die pharmakologische Anwendung profitieren. Außerdem könnten Patienten zur Unterstützung der Makrophagen des körpereigenen Systems mit größeren Mengen von vorher differenzierten Makrophagen versorgt werden, wobei die Makrophagen durch in vitro- Züchtung von Knochenmark oder anderen geeigneten Präparaten hergestellt werden, die mit CSF-1 behandelt werden. Diese Präparate umfassen Präparate der eigenen Blutmonocyten des Patienten, die auf diese Weise gezüchtet und sodann als lokale oder systemische Therapie wieder verabreicht werden können.
Die Fähigkeit von CSF-1, die Herstellung von Lymphokinen durch Makrophagen zu stimulieren und ihre Fähigkeit zur Abtötung von Zielzellen zu steigern, macht CSF-1 auch für die Behandlung von Neoplasmen und Infektionen direkt nützlich.
CSF-1 stimuliert die Herstellung von Interferonen durch Makrophagen, die aus der Maus stammen (Fleit, H. B., et al., J. Cell Physiol. 108 (1981), 347), ferner stimuliert menschlicher teilweise gereinigter CSF-1 aus MIAPaCa-Zellen die Poly- IC-induzierte Erzeugung von Interferon und TNF aus menschlichen Monocyten. Außerdem stimuliert CSF-1 die Bildung von myeloischem CSF durch menschliche Blutlymphocyten.
Die Behandlung von Patienten, die an AIDS leiden, mit CSF-1 alleine oder mit CSF-1 zusammen mit Erythropoietin und/oder einem antiviralen Mittel und/oder IL-2 wird in WO 87/03204, veröffentlicht am 4. Juni 1987, beschrieben. Im US-Patent 4 482 485, erteilt am 13. November 1984, wird festgestellt, daß CSF-1 als ergänzende Maßnahme bei der Behandlung von Krebs eingesetzt werden kann. Außerdem beschreibt EP 118 915, veröffentlicht am 19. September 1984, die Verwendung von CSF-1 zur Prophylaxe und Behandlung von Granulocytopenie und Makrophagocytopenie bei Patienten, die eine Krebstherapie erhalten, zur Verhinderung von Infektionen sowie zur Behandlung von Patienten mit implantiertem Knochenmark. Ralph et al., Cell Immunol. 105 (1987), 270-279, beschreiben die zusätzliche tumorizide Wirkung einer Kombination aus CSF-1 und Lymphokin auf Maussarkom-TU5-Ziele.
Somit kann CSF-1 zusätzlich zur Aufhebung der Immunsuppression selbst auch noch verwendet werden, um indirekt durch Stimulation von Makrophagensekretion und -aktivität die eindringenen Organismen oder die malignen Zellen zu zerstören.
CSF-1 kann zusammen mit einem anderen Lymphokin oder Cytokin, wie z. B. α-IFN, β-IFN, γ-IFN, IL-1, IL-2, IL-3, IL-4 oder TNF, zur Behandlung von Tumoren eingesetzt werden.
Der erfindungsgemäße CSF-1 kann nach herkömmlichen dem Stand der Technik entsprechenden Vorschriften für die Verabreichung von Proteinsubstanzen formuliert werden. Die Verabreichung durch Injektion ist bevorzugt; Formulierungen umfassen Lösungen oder Suspensionen, Emulsionen oder eine feste Zusammensetzung, die zu Injektionslösungen rekonstituiert werden kann. Geeignete Exzipienten umfassen z. B. Ringer-Lösung, Hank-Lösung, Wasser, Kochsalzlösung, Glycerin, Dextroselösungen und dergleichen. Außerdem kann der erfindungsgemäße CSF-1 mit Zellpräparaten vorinkubiert werden, um geeignete Antworten zu stimulieren, sodann kann dem Patienten entweder das gesamte Präparat oder der Überstand davon verabreicht werden. Wie nachstehend gezeigt, sind die Stoffe, die von verschiedenen Typen von Blutzellen als Antwort auf die CSF-1-Stimulation gebildet werden, gegen gewünschte Ziele wirksam, außerdem können die Eigenschaften dieser Blutzellen selbst, eindringende Viren oder Neoplasmen anzugreifen, verstärkt werden. Entweder können die eigenen Zellen des Patienten entnommen und auf diese Art und Weise eingesetzt werden oder es können z. B. Monocyten oder Lymphocyten aus einem anderen kompatiblen Individuum für die Inkubation verwendet werden.
In Arzneimitteln werden vorzugsweise die vorliegenden "menschlichen" Formen des CSF-1 eingesetzt.

F. Clonierung und Expression von menschlichem CSF-1

Nachstehend werden die Verfahren erläutert, die zum Erhalt der codierenden Sequenz für menschlichen CSF-1 verwendet werden, sodann wird diese Sequenz in Expressionsvektoren eingeführt und die Expression des gewünschten Proteins erhalten. Natürlich muß die Gewinnung der DNA nicht wiederholt werden; die beschriebenen Sequenzen können teilweise oder im Ganzen durch Synthese erhalten werden.

F.1. Reinigung von nativem menschlichem CSF-1 und Konstruktion der Sonde

Menschlicher Urin-CSF-1 wurde durch Standardverfahren teilweise gereinigt, wie von Das, S. K., et al., Blood 58 (1981), 630, beschrieben, und anschließend einem Affinitätsreinigungsschritt unterworfen, wobei ein monoclonaler Rattenantikörper gegen Maus-CSF-1, YYG106 genannt, gebunden an eine Sepharose 4 B-Säule, verwendet wurde (Stanley, E. R., Methods Enzymol. 116 (1985), 564). Als letzter Schritt der Reinigung wurde eine Umkehrphasen-HPLC in einem Puffersystem aus 0,1% TFA/30% Acetonitril bis 0,1% TFA/60% Acetonitril durchgeführt. Die Einzelheiten und Ergebnisse der Reinigung und der Konstruktion der Sonden werden in der PCT-Anmeldung WO 86/04607 (a.a.O.) beschrieben.

F.2. Herstellung der menschlichen genomischen Sequenz

Eine menschliche genomische Sequenz, die CSF-1 codiert, wurde aus der menschlichen Genbank von Maniatis im Lambda-Phagen Charon 4 erhalten, wobei Sonden verwendet wurden, die so konstruiert wurden, daß sie die N-terminale Sequenz des menschlichen Peptids codierten, wie in der PCT-Anmeldung WO 86/04607 (a.a.O.) beschrieben. Ein Charon 4A-Phage, der die CSF-1-Sequenz enthält, was durch Hybridisierung mit der Sonde, wie nachstehend beschrieben, bewiesen wurde, und der mit phCSF-1 bezeichnet wurde, wurde bei der American Type Culture Collection (ATCC) am 2. April 1985 hinterlegt und hat die Hinterlegungsnummer 40177. Bei der weiteren Untersuchung dieses Phagen wurde gefunden, daß Umstellungen und/oder Deletionen stattgefunden hatten und die korrekten Sequenzen nicht erhalten geblieben waren. Aus diesem Grund wurde aus der Genbank nach der gleichen Vorschrift eine andere Kolonie erhalten und vermehrt, um sicherzustellen, daß sie bei der Replikation stabil ist, sodann wurde sie mit phCSF-1a bezeichnet und bei der ATCC am 21. Mai 1985 unter Zuteilung der Hinterlegungsnummer 40185 hinterlegt. phCSF-1a enthielt eine 18 kb große Insertion und war befähigt, Restriktionsenzym-Spaltprodukte zu erzeugen, die auch mit der Sonde hybridisieren, sodann wurde damit eine Sequenzbestimmung und eine weitere Sondenkonstruktion durchgeführt.
Das gesamte 18 kb große Gen, das in phCSF-1a enthalten war, wurde sequenziert. Das Gen enthält 9 Exons, die durch 8 Introns getrennt sind, wie sich beim Vergleich mit den pcCSF- 17-Sequenzen von Fig. 1 zeigt. Die Bereiche der reifen Protein-cDNA entsprechen genau den genomischen Exon-Codons, mit Ausnahme von Codon 59; die "Langform" des menschlichen CSF-1-Proteins zeigt am 5'-Ende von Exon 6 einen verlängerten codierenden Bereich, wie nachstehend ausführlicher beschrieben.
Fig. 3 stellt ein Schema der genomischen Struktur des menschlichen CSF-1 dar. Das erste Exon enthält untranslatierte 5'-Sequenz und die ersten 13 Aminosäurereste der Signalsequenz. Die verbleibenden 19 Aminosäuren der Signalsequenz und die ersten 22 Aminosäuren des reifen CSF-Proteins werden im zweiten Exon codiert. Das Stopp-Codon erscheint in Exon 8, das außerdem 9 bp der untranslatierten 3'-Sequenz enthält. Das Gen überspannt etwa 18 kb und enthält mindestens 9 Exons, höchstwahrscheinlich 10, deren Größe im Bereich von 63 bp bis zu einem vermutlichen Maximum von 2 bis 3 kb liegt. Man nimmt an, daß die untranslatierte 3'-Sequenz entweder mit Exon 9 oder mit Exon 10 vervollständigt wird. Obwohl zwei getrennte Exons gezeigt werden, ist nicht klar, ob ein 9. Intron und 10. Exon vorliegt oder ob es eine andere Spleißstelle innerhalb von Exon 9 gibt. Wie nachstehend ausführlicher beschrieben, kommt die Kurzform von CSF-1 durch Einsatz der Spleißstelle in Richtung 3'-Ende von Exon 6 zustande; die Langform entsteht aus der Spleißstelle an der Stelle, die in Fig. 3 als Beginn dieses Exons dargestellt ist.
Die Größen der in Fig. 3 erläuterten Exons und Introns sind wie folgt: Exon Größe (bp) Intron Größe (kb)
Durch die Northern-Analyse wird bestätigt, daß der genomische Clon, abhängig von den Spleißstellen, in eine Reihe von RNA-Transkripte transkribiert wird. MIAPaCa-Zellen wurden unter serumfreien Bedingungen mit 50 ng/ml PMA und 10 uM Retinsäure drei Tage in drei aufeinanderfolgenden Induktionen induziert, sodann wurde die mRNA nach der dritten Induktion gemäß dem nachstehend beschriebenen allgemeinen Verfahren isoliert. Das mRNA-Isolat wurde einer Elektrophorese auf einem 1% Agarosegel, enthaltend 2,5 M Formaldehyd, unterworfen, auf Nitrocellulose geblottet und mit dem geeigneten Oligonucleotid als Sonde untersucht. Mehrere Banden, die mRNAs von 16S, 18S, 26S, 28S entsprechen und eine Anhäufung bei 22 bis 25S werden erhalten.
ML06, ein 20-mer, das der codierenden Sequenz in Exon 8 des Genoms entspricht, hybridisiert mit allen Transkripten davon, wodurch bestätigt wird, daß sie alle CSF-1 codieren. Die Sequenzen von Exon 8 sind natürlich üblicherweise sowohl in den Lang- als auch in den Kurzformen enthalten.
GM11, ein 40-mer, das am 5'-Ende des langen Exons 6 liegt und somit der 894 bp enthaltenden "Extra"-Insertion in der Langformsequenz entspricht, hybridisiert mit den Transkripten bei 28S und dem Cluster bei 22 bis 25S, nicht jedoch mit den verbleibenden drei. Somit sind dies offensichtlich Transkripte, die der Langform entsprechen.
Ein 20-mer, JV30, das sich mit dem 5'-Ende von Exon 9 des Genoms paart, hybridisiert mit dem 22- bis 25S-Cluster und mit den 16S- und 18S-mRNAs, nicht jedoch mit den 26S- oder 28S- mRNAs. Somit wird deutlich, daß 26S und 28S durch die Prozessierung zustande kommen, dies zeigt, daß das mutmaßliche Exon 10 in Fig. 3 enthalten ist. Eine weitere Sonde, eine aus einem menschlichen genomischen CSF-1-Fragment hergestellte 4,2 kb große Sonde, die 1500 bp innerhalb von Exon 9 beginnt, hybridisiert nur mit den 26S- und 28S-Transkripten.
Das CSF-1 codierende genomische Fragment kann für die Expression in eukaryotischen Zellen verwendet werden, die zur Prozessierung von Introns befähigt sind. Zur Expression des genomischen Fragments wird die Insertion in einen geeigneten Wirtsvektor, wie z. B. einen Rinderpapillomvirus- oder einen anderen Säugervirus-Vektor, unmittelbar stromabwärts eines geeigneten Promotors, wie z. B. des Maus- oder Mensch-Metallothionein-Promotors, ligiert.

F.3. Gewinnung von cDNA, die den menschlichen CSF-1 codiert pcCSF-17 (SCSF)

Die vom Menschen stammende Pankreaskarzinom-Zellinie MIAPaCa-2 wurde als mRNA-Quelle verwendet, um Sonden zu bestätigen und um eine cDNA-Bank herzustellen, die eine intronfreie Form der codierenden Sequenz des menschlichen CSF-1 enthält. Die MIAPaCa-Zellinie erzeugt CSF-1 in einem Spiegel, der etwa 10-fach unter dem der Maus-L-929-Zellen liegt. pcCSF-17 wurde aus dieser Bank erhalten, wie in der PCT-Anmeldung WO 86/04607 beschrieben.
Kurzgefaßt wurde eine 300 000 Clon-Bank, die aus einer angereicherten MIAPaCa-mRNA nach dem Verfahren von Okayama und Berg erhalten worden war, sodann unter Bedingungen hoher Stringenz mittels Sonde abgesucht, wobei die aus der genomischen DNA stammende Exon II-Sonde verwendet wurde. Zehn Kolonien, die mit der Sonde hybridisierten, wurden herausgegriffen und die Kolonien gereinigt. Diese Clone wurden durch eine transiente Expression in COS-7-Zellen auf das Vorliegen von CSF-1-codierenden Sequenzen getestet. Der Cloniervektor, der den SV40-Promotor enthält, wurde selbst zur Transformation von COS-7-Zellen verwendet.
Plasmid-DNA wurde unter Verwendung eines CsCl-Gradienten aus 10 positiven Clonen gereinigt, anschließend wurden COS-7- Zellen transfiziert, wobei eine Modifikation (Wang, A. M., et al., Science 228 (1985), 149) der Calciumphosphat-Mitfällungstechnik eingesetzt wurde. Nach dreitägiger Inkubation wurde die CSF-1-Produktion getestet, indem die Kulturüberstände dem Radiorezeptortest, der im wesentlichen wie von Das, S. K., et al., Blood 58 (1981), 630, beschrieben durchgeführt wurde, und einem Koloniestimulierungs(Knochenmarkproliferations)-Test unterworfen wurden, der im wesentlichen wie von Prystowsky, M. B., et al., Am. J. Pathol. 114 (1984), 149, beschrieben durchgeführt wurde. Neun von zehn herausgegriffenen Clonen zeigten keine transiente CSF-1-Produktion in COS-7-Zellen. Ein Clon, der tatsächlich die Expression zeigte, wurde gezüchtet, die Plasmid-DNA isoliert und die Insertion sequenziert. Die DNA- Sequenz ist in Fig. 1 zusammen mit der abgeleiteten Aminosäuresequenz dargestellt. Die cDNA in voller Länge beträgt 1,64 kb und codiert ein reifes CSF-1-Protein mit 224 Aminosäuren (SCSF), wie in Fig. 1 dargestellt. Der Clon wurde als CSF-17 mit der Cetus-Hinterlegungsnummer CMCC 2347 bezeichnet und bei der American Type Culture Collection am 14. Juni 1984 unter der Hinterlegungsnummer 53149 hinterlegt. Das Plasmid, das die CSF-1-codierende DNA trägt, wurde mit pcCSF-17 bezeichnet.

Clone, die LCSF codieren

Das wie vorstehend beschrieben hergestellte pcCSF-17 wurde als Sonde eingesetzt, wodurch weitere CSF-1-codierende Clone aus einer menschlichen cDNA-Bank erhalten wurden. Die Gesamt-mRNA wurde aus MIAPaCa-Zellen hergestellt, genau wie in der PCT-Anmeldung WO 86/04607 (a.a.O.) beschrieben, und zum Erhalt einer cDNA-Bank in λgt10-Phagenvektoren verwendet, indem die reversen Transkripte an EcoRI-Linker ligiert und das EcoRI-Spaltprodukt der so bereitgestellten cDNA in die EcoRI- Stelle von λgt10 eingefügt wurde, wie von Huynh, T. V., et al., in DNA Cloning Techniques: A Practical Approach, IRL Press, Oxford, 1984, D. Glover, Hrsg., beschrieben.
Über eine Million Phagen wurden durchgemustert, wobei eine einzelsträngige stark-markierte Sonde, die aus CSF-17 stammt, verwendet und Standardverfahren eingesetzt wurden, die im Folgenden kurz zusammengefaßt werden.
Ein EcoRI-Fragment von pcCSF-17-DNA, das die gesamte codierende Sequenz für CSF-1 umfaßte (in pcCSF-17 liegt eine EcoRI-Stelle unmittelbar hinter dem Stopp-Codon der codierenden Sequenz), wurde in M13 eingefügt und ein markierter zweiter Strang wie folgt synthetisiert: Etwa 1 pMol M13, der einzelsträngiges EcoRI-gespaltenes pcCSF-17 enthielt, wurde mit 10 pMol sequenzierendem Primer in 20 mM Tris, pH 7,9, 20 mM MgCl&sub2;, 100 mM NaCl und 20 mM β-Mercaptoethanol 5 Minuten bei 67ºC aneliert und sodann 45 Minuten auf 42ºC gebracht. Dem anelierten Präparat wurden jeweils 100 uMol dATP, dCTP und dTTP und 2,5 uMol P³²-markiertem (α)dGTP, zusammen mit 5 E Klenow-Fragment, zugesetzt. Das Reaktionsgemisch wurde 20 Minuten bei 37ºC inkubiert und die DNA auf einer P-6 dG (Bio- Rad) Spin-Säule gewonnen und zur Trennung der Stränge 10 Minuten gekocht.
Die auf diese Weise hergestellten Sonden wurden eingesetzt, um die Plaques (die auf Nitrocellulose übertragen worden waren) durch Hybridisierung unter stringenten Bedingungen (50% Formamid, 5 · SSC, 5 · Denhardt) 18 Stunden bei 42ºC durchzumustern.
Etwa 150 Phagenplaques waren positiv. Fünf dieser 150 Sonden-positiven Plaques waren ferner positiv, wenn bei 45ºC über Nacht in 5 · SSC, 5 · Denhardt hybridisiert wurde, wobei das Oligonucleotid JD11 verwendet wurde, ein 14-mer, das zu den Basen im Bereich des Aufeinandertreffens der Exon-2- und - 3-Spleißstellen komplementär ist.
Die fünf JD11-positiven Clone wurden sodann einer Hybridisierung mit dem Oligonucleotid GM11 unterworfen, das die Sequenz aufweist, die zu den Nucleotiden 506 bis 545 in Fig. 2 komplementär ist. Wie vorstehend beschrieben, zeigt diese Sequenz eine exakte Paarung mit dem Teil der menschlichen genomischen Sequenz, der dem "Extra"-Teil der Maus-cDNA, wie nachstehend beschrieben, entspricht, der das 298 Aminosäuren große "Extra"-Segment in den "Langformen" des Maus-CSF-1-Proteins codiert. Die Hybridisierung wurde in 20% Formamid, 5 · SSC, 5 · Denhardt 18 Stunden bei 45ºC durchgeführt. Drei Clone waren positiv, einschließlich der relevanten Clone 4 und 25.
Die komplette DNA-Sequenz für die relevanten codierenden Bereiche der cDNA-Insertionen in den Clonen 4 und 25 sowie die abgeleitete Aminosäuresequenz sind in Fig. 2 dargestellt. Die Sequenz wurde durch die Integration der bekannten Sequenz des genomischen Clons phCSF-1a, vorstehend beschrieben, erhalten, wobei die 298 Aminosäuren lange "Extra"-Insertion der Maus- Sequenzen, nachstehend beschrieben, als Vorlage verwendet wurde, wodurch die gesamte gezeigte Sequenz abgeleitet wurde. Die dargestellte Sequenz zeigt das Spleißen des "Extra"-Segments, das für die Codierung von 298 "Extra"-Aminosäuren ausreicht und das im Gen an der 5'-Seite von Exon 6 enthalten ist, zur Sequenz von pcCSF-17, vor dem ersten Nucleotid des Codons für den Gly-Rest an Aminosäureposition 150, in das Leseraster mit der verbleibenden CSF-17-Sequenz. Die Insertion ändert das Codon an Position 150 in ein Codon für Asparaginsäure, das am Ende der Insertion folgende Codon wird zu einen Gly-Rest und die verbleibende Sequenz der Reste, die mit His-Glu-Arg usw. abwärts bis zum C-terminalen Val-Rest weitergeht, bleibt die gleiche wie in pcCSF-17. Ansonsten ist LCSF in der Sequenz bis zum Rest 150 identisch mit SCSF, mit der Ausnahme, daß an Position 59 ein Asp-Rest anstelle des Tyr-Restes enthalten ist.
Zwei der Clone, 4 und 25, wurden zur Sequenzierung in M13mp18 oder M13mp19 cloniert, um die in Fig. 2 gezeigten Ergebnisse zu bestätigen, wobei die EcoRI-Restriktionsstellen verwendet wurden. Nach der Restriktionsenzym-Analyse scheinen diese zwei Clone identisch zu sein. Die vollständige Sequenz von Clon 4 wurde bestimmt, sie wird in Fig. 2 gezeigt; eine partielle Sequenzierung von Clon 25 ergibt übereinstimmende Ergebnisse. Sodann wurden sie in den modifizierten Okayama- Berg-Vektor pcDB subcloniert, der aus den veröffentlichten Okayama-Berg-Vektoren pcDV1 und pL1 (Okayama, H., et al., Mol. Cel. Biol. 3 (1983), 280-289) wie folgt hergestellt wurde:
pcDV1 wurde mit HindIII und KpnI gespalten und das große Fragment isoliert, das Amp®, den pBR322-Replikationsursprung und eine Polyadenylierungsstelle bereitstellt. pL1 wurde mit HindIII und PstI gespalten und das kleine Fragment isoliert, das den SV40-Promotor und den Replikationsursprung bereitstellt. Diese Fragmente wurden in einer dreiteiligen Ligierung mit dem synthetischen KpnI/PstI-gespaltenen Oligonucleotidfragment
neuligiert, wodurch pcDB erhalten wurde, ein Plasmid, das dem im Dokument gezeigten pcD-x entsprach, wobei "x" durch einen Polylinker ersetzt ist. Somit enthält pcDB den frühen SV40- Promotor und einen unmittelbar stromabwärts liegenden Linker, auf den eine Polyadenylierungsstelle folgt. Die in die Polylinkerregion ligierten Sequenzen, sollten unter der Kontrolle des frühen SV40-Promotors exprimiert werden.
Da deutlich wurde, daß den Clonen 4 und 25 im Vergleich zu CSF-17 einige 5'-Endsequenzen fehlten, wurden vor dem Testen der Expression die stromaufwärts liegenden Teile aus pc- CSF-17 anstelle der entsprechenden Teile der Clone 4 und 25 eingesetzt.
Die Vorschrift für diese Substitution sah folgendermaßen aus: pcCSF-asp59-BamBc1 (vgl. nachstehend) wurde mit SmaI, das am äußersten 5'-Ende der untranslatierten Sequenz schneidet (vgl. Fig. 1), gespalten und das linearisierte Plasmid an EcoRI-Linker ligiert und neuverbunden. Anschließend wurde das neuligierte Plasmid mit EcoRI gespalten, wodurch der gesamte codierende Bereich von der SmaI-Stelle am äußersten 5'-Ende bis zur EcoRI-Stelle unmittelbar stromabwärts des Stopp-Codons entfernt wurde. Diese wurde an der EcoRI-Stelle in den Polylinker von pcDB ligiert. Die codierenden Sequenzen stromabwärts der BstXI-Stelle, wobei diese Stelle etwa am Codon für Aminosäure 8 der reifen CSF-17-Proteinsequenz liegt (vgl. Figur 1), wurden durch Spaltung mit BstXI und KpnI entfernt. (KpnI spaltet den Linker etwas stromabwärts der EcoRI-Stelle nach dem Stopp-Codon). Diese deletierte Stromabwärts-Sequenz wurde durch das analoge BstI/KpnI-Fragment aus pM13-4 und pM13-25 ersetzt. Die resultierenden Clone pcDBhuCSF-4 und pcDBhuCSF-25 enthielten somit die codierenden Sequenzen stromabwärts des Codons für etwa Aminosäure 8 aus den Clonen 4 bzw. 25 und die Stromaufwärts-Sequenzen aus pCSF-17. Die ligierten Sequenzen stehen im Leseraster und unter der Kontrolle des frühen SV40-Promotors.

Mutein-codierende Sequenzen/eukaryotische Expressionsvektoren

Modifikationen der pcCSF-17-Insertionen wurden durchgeführt, um entsprechende Plasmide bereitzustellen, die Muteine des SCSF-Proteins codierten. Für eine stellenspezifische Mutagenese wurden pcCSF-17 und M13mp18 mit dem gleichen Restriktionsenzym gespalten, wobei die geeignete Region der CSF-1-codierenden Sequenz ausgeschnitten und die ausgeschnittene Sequenz in den M13-Vektor ligiert wurde. Für die Synthese des zweiten Stranges und die Gewinnung der gewünschten mutierten DNA wurden die folgenden Oligonucleotid-Primer eingesetzt:
für Pro&sub5;&sub2;SCSF, 5'-TACCTTAAACCGGCATTTCTC-3', der eine neue HpaII-Stelle an den Codons 52-53 hervorbringt;
für Gln&sub5;&sub2;SCSF, 5'-TACCTTAAACAGGCCTTTCTC-3', der eine neue StuI-Stelle an den Codons 52-53 hervorbringt;
für Asp&sub5;&sub9;SCSF, 5'-GGTACAAGATATCATGGAG-3', der eine neue EcoRV-Stelle an den Codons 59-60 hervorbringt.
Nach Auffüllen des zweiten Stranges unter Verwendung von Klenow wurden die Phagen in E. coli DG98 transformiert und die resultierenden Plaques mit der Kinase-behandelten markierten Sonde durchgemustert. Nach der Plaques-Reinigung wurden die gewünschten mutierten Insertionen wieder so eingebaut, daß sie die nicht-mutierten Insertionen in pcCSF-1 ersetzten, wodurch pCSF-Pro52, pCSF-Gln52 bzw. pCSF-Asp59 erhalten wurden.
Außerdem wurden Plasmide hergestellt, die drei Deletionsmutanten enthielten, die den C-terminal deletierten SCSF/C 158 codierten: pCSF-Bam, pCSF-BamBc1 und pCSF-BamTGA. Für pCSF-Bam wurde pcCSF-17 mit BamHI gespalten, sodann das stromaufwärts liegende BamHI/BamHI-Fragment des codierenden Bereichs isoliert und an das Vektorfragment neuligiert. Das Ligierungsgemisch wurde in E. coli MM294 transformiert und Plasmide mit der korrekten Orientierung isoliert. Das resultierende pCSF-Bam codiert 158 Aminosäuren des CSF-1- Proteins, fusioniert an sechs Reste am C-Terminus: Arg-His- Asp-Lys-Ile-His, die aus dem Vektor stammen.
Für pCSF-BamBc1, das die gesamte CSF-1 codierende Sequenz enthält, mit der Ausnahme, daß der Serin-Rest an Position 159 zu einem Stopp-Codon mutiert ist, wurde die codierende Sequenz aus pcCSF-17 ausgeschnitten und für die stellenspezifische Mutagenese in M13 ligiert, wobei der Primer 5'- GAGGGATCCTGATCACCGCAGCTCC-3' verwendet wurde. Dies führte zu einer neuen BclI-Stelle an den Codons 159-160. Die mutierte DNA wurde mit BstXI/ExoRI herausgeschnitten und in das mit BstXI/EcoRI gespaltene pcCSF-17 ligiert, das Ligierungsgemisch wurde in E. coli DG105, einen dam&supmin;-Wirt, transformiert und die Plasmid-DNA isoliert.
Für pCSF-BamTGA, in dem die Codons stromabwärts vom Stopp an Position 159 deletiert sind, wurde pCSF-BamBc1 mit XhoI und BclI gespalten und die Insertion in mit XhoI/BamHI gespaltenes pcCSF-17 ligiert.
Außerdem wurde pCSF-Gly150, das anstelle von Histidin an Position 151 ein TGA-Stopp-Codon enthält, aus der pcCSF-17-Insertion durch stellenspezifische Mutagenese unter Verwendung des geeigneten Primers, wie vorstehend beschrieben, hergestellt. Der geeignete Primer ist 5'-AGCCAAGGCTGATCAAGGCAGTCC- 3'. Somit wurde der stromabwärts liegende Teil der codierenden Sequenz mit BstXI/EcoRI aus pcCSF-17 für die Mutagenese in M13-Vektoren ausgeschnitten und nach der Plaques-Reinigung als BstXI/EcoRI-Insertion wieder eingebaut.
"Doppel"-Muteine wurden in ähnlicher Art und Weise hergestellt. Z.B. wurde für pCSF-Asp59-Gly150, das Asp&sub5;&sub9;SCSF/CY150 codiert, pcCSF-Asp59 mit BstXI/EcoRI gespalten, um das C-terminale Fragment für die stellenspezifische Mutagenese mit dem gleichen Primer wie vorstehend in M13 einzubringen, wodurch pCSF-Gly150 erhalten wurde. Das mutierte Fragment wurde anschließend auf den Vektor übertragen, wodurch pCSF-1-Asp59- Gly150 erhalten wurde.
Genauso wurde das Verfahren zur Herstellung von pCSF- BamBc1 wiederholt (mit der Ausnahme, daß als Ausgangsplasmid pCSF-Asp59 anstelle von pcCSF verwendet wurde), wodurch pCSF- Asp59-BamBclI erhalten wurde.
Unter Verwendung von Techniken, die zu den vorstehend für die Herstellung von pCSF-Gln52 und pCSF-Asp59 beschriebenen Techniken analog sind, werden die entsprechenden Plasmide, die die Langformen der entsprechenden Muteine enthalten, pLCSF- Gln52 und pLCSF-Tyr59, hergestellt. Das Verfahren ist wie vorstehend beschrieben, mit der Ausnahme, daß immer dann, wenn in diesem Verfahren pcCSF-17 verwendet wird, stattdessen pcDB- huCSF-4 oder ein gleichwertiges Plasmid eingesetzt wird und die entsprechenden Änderungen des Primers für das Tyr&sub5;&sub9;-Mutein durchgeführt werden.
Eine stellenspezifische Mutagenese wird auch eingesetzt, um die gewünschten Mutationen an Glykosylierungsstellen beider Proteine zu erhalten, und für den Ersatz von Cystein an Position 90; sie kann auch verwendet werden, um verschiedene C- terminale Deletionen der LCSF-codierenden DNA zu erhalten.

F.4. Transiente Expression von CSF-1

Expression von pcCSF-17

Die Expression von CSF-17-Plasmid-DNA (pcCSF-17) in COS- 7-Zellen wurde bestätigt und quantifiziert, wobei der Knochenmarkproliferationstest, der Koloniestimulierungstest und der Radiorezeptortest verwendet wurden. Es wird daran erinnert, daß die Spezifität des Knochenmarkproliferationstests für CSF-1 nur auf der Fähigkeit von CSF-1-Antiserum beruht, die Aktivität zu vermindern; und daß die Spezifität des Koloniestimulierungstest darauf beruht, welche Art von Kolonien erhalten werden. Beide Tests zeigten eine CSF-1-Produktion in der Größenordnung von mehreren tausend Einheiten pro ml.

Knochenmarkproliferation

Für den Knochenmarkstimulationstest, der die biologische Aktivität des Proteins mißt, wurden Knochenmarkzellen aus Balb/C-Mäusen mit seriellen Verdünnungen der 72-Stunden-Überstände behandelt und sodann die Proliferation der Zellen durch Aufnahme von markiertem Thymidin gemessen, im wesentlichen wie von Moore, R. N., et al., J. Immunol. 131 (1983), 2374, Prystowsky, M. B., et al., Am. J. Pathol. 114 (1984), 149, beschrieben. Als Kontrolle diente das Medium von induzierten MIAPaCa-Zellen. Die Spezifität für CSF-1 wurde durch die Zugabe der Kaninchen-Antiseren bestätigt, die gegen menschlichen Urin-CSF-1 hervorgebracht worden waren, diese Antiseren waren befähigt, die Thymidin-Aufnahme zu hemmen. Die Ergebnisse für die Überstände der COS-7-Zellen, transfiziert mit pcCSF-17, (CSF-17-Überstand) bei einer 1 : 16-Verdünnung sind in Tabelle 1 dargestellt. Tabelle 1 Einbau von ³H-Thymidin (cmp) keine Zusätze normales Serum anti-Mensch-CSF-1-Serum Medium MIAPaCa-Überstand CSF-17-Überstand
(Das anti-Mensch-CSF-1-Serum wurde hergestellt, wie von Das et al., a.a.O., beschrieben.)
Der MIAPaCa-Überstand enthielt (bei der vorstehend verwendeten 1 : 16-Verdünnung) 125 E/ml CSF-Aktivität, das entsprach 2000 E/ml im unverdünnten Überstand, wobei eine Einheit Kolonie-stimulierende Aktivität als die Menge an CSF definiert ist, die nötig ist, um im Test von Stanley, E. R., et al., J. Lab. Clin. Med. 79 (1972), 657, aus 10&sup5; Knochenmarkzellen/ml eine Kolonie herzustellen.
Diese Daten zeigen, daß die knochenmarkstimulierende Aktivität mit CSF-1 assoziiert ist, da die Thymidin-Aufnahme durch anti-CSF-1-Serum gehemmt wird. Die fallende Tendenz der Ergebnisse, die in diesem Knochenmarkproliferationstest bei vier Verdünnungen im Bereich von 1 : 8 bis 1 : 64 erhalten wurden, ergab für CSF-1 eine geschätzte Aktivität von 2358 E/ml, die in Gegenwart von Antiserum auf 424 E/ml herabgesetzt war, die jedoch in Gegenwart von Nichtimmun-Serum einen deutlichen Anstieg auf 3693 E/ml zeigte. Dies war mit den Spiegeln vergleichbar, die im nachstehenden Radiorezeptortest gezeigt werden.

Koloniestimulierung

Der direkte Test der CSF-17-Überstände auf Koloniestimulierung (Stanley, E. R., et al., J. Lab. Clin. Med., (a.a.O.)) zeigte 4287 E/ml, wobei die Aktivität durch die Gegenwart von Nichtimmun-Serum im wesentlichen nicht beeinflußt wurde, jedoch durch die Gegenwart von Kaninchen-anti-Mensch-CSF-1 auf 0 E/ml herabgesetzt wurde. Das läßt sich mit den 2562 E/ml in den MIAPaCa-Überständen vergleichen. 85% der Kolonien, die durch den Überstand der pcCSF-17-transformierten COS-7-Zellen induziert wurden, wiesen eine mononucleare Morphologie auf; die durch den MIAPaCa-Überstand induzierten Kolonien zeigten ein Verhältnis von 94% Makrophagen zu 6% Granulocyten.

Radiorezeptortest

Der Radiorezeptortest mißt die Konkurrenz zwischen ¹²&sup5;I- markiertem CSF-1 und der Testverbindung um spezifische Rezeptoren auf J774.2-Maus-Makrophagenzellen. Der wie vorstehend auf koloniestimulierende Aktivität getestete MIAPaCa-Überstand wurde als Standard eingesetzt (2000 E/ml). Es wurde gefunden, daß die CSF-1-Konzentration des Überstandes der pcCSF-17- transformierten COS-7-Zellen, basierend auf einer 1 : 10-Verdünnung, 2470 E/ml und, basierend auf einer 1 : 5-Verdünnung, 3239 E/ml betrug.
Somit wurden in den Medien von COS-7-Zellen, die mit pcCSF-17 transformiert waren, in allen Tests vergleichbare Werte für die CSF-1-Konzentration erhalten.

Expression von SCSF

In ähnlicher Art und Weise wie vorstehend für pcCSF-17 beschrieben, wurden die Mutein-codierenden Plasmide in COS-A2- Zellen transfiziert und eine transiente Expression der CSF-1- Aktivität durch den Knochenmarkproliferationstest und durch den Radioimmuntest unter Verwendung von anti-CSF-Antikörpern getestet. Das Expressionsprodukt von pCSF-Pro&sub5;&sub2; war inaktiv, was zeigt, daß die Substitution durch Prolin, wie erwartet, nicht konservativ ist. Alle anderen Muteine zeigten in beiden Tests Aktivität, wie in den nachstehenden Ergebnissen dargestellt: Tabelle 2 Expression von CSF-1-Konstrukten in COS-Zellen CSF-1-Plasmid Radioimmuntest Knochenmarkproliferationstest Kolonietest Tabelle 3 Maus-Knochenmark-Kolonietest CSF-1-Plasmid koloniebildende Einheiten/ml

Expression von pcDBhuCSF-4 und pcDBhuCSF-25

Die Vektoren vom Okayama/Berg-Typ, die diejenige DNA enthalten, die die Langform des menschlichen CSF-1 codieren, (pcDBhuCSF-4 und pcDBhuCSF-25), wurden in einer Art und Weise in COS-A2-Zellen transfiziert, wie vorstehend für die Transfektion von COS-7-Zellen mit pCSF-17 beschrieben. Die Überstände der transfizierten Zellen wurden auf CSF-1 analysiert, wobei der Radioimmuntest mit einem Antiserum eingesetzt wurde, das gegen CSF-1 hervorgebracht und wie von Das et al., a.a.O., beschrieben, hergestellt worden war, und außerdem wurden sie im vorstehend beschriebenen Knochenmarkproliferationstest getestet. Die Ergebnisse in Einheiten CSF-1 pro ml werden in Tabelle 4 gezeigt. Tabelle 4 Expression von pcDBhuCSF-4 und -25 in COS-A2-Zellen Probe RIA (Einheiten/ml) Knochenmark-Test Pseudoinfektion
Wie angegeben, enthielten die Überstände der mit einem der beiden Vektoren transfizierten Zellen Protein mit CSF-1- Aktivität.
In ähnlicher Art und Weise werden die Muteinformen dieser spezifischen LCSF-Langform-Proteine erhalten.

F.5. Eukaryotische Expression von CSF-1 in stabil transformierten Zellen

Die COS-7- oder COS-A2-Systeme stellen rekombinanten CSF- 1 bereit, indem sie die Replikation und die Expression der Vektorsequenzen vom Okayama-Berg-Typ erlauben. Es handelt sich um ein transientes Expressionsystem.
Die menschlichen CSF-1-Sequenzen können in prokaryotischen oder eukaryotischen Systemen auch stabil exprimiert werden. Im allgemeinen ist die Produktion mit prokaryotischen Wirten einfach, Eukaryoten dagegen erlauben die Verwendung der nativen Signalsequenz, wobei eine Sekretion stattfinden und jede beliebige posttranslationale Prozessierung ausgeführt werden kann. Die kann im Fall von CSF-1 wichtig sein, denn das native Protein ist ein Dimer. Bakterien produzieren CSF-1 als Monomer, das nach der Extraktion gegebenenfalls dimerisierenden Bedingungen unterworfen werden kann.
Das Okayama-Berg-Plasmid pcCSF-17 oder die analogen Vektoren, die die Muteine codierende DNA enthalten, z. B. pCSF- Asp&sub5;&sub9;-Gly&sub1;&sub5;&sub0; und pCSF-Asp&sub5;&sub9;-BamBc1, oder die analogen Vektoren pcDBhuCSF-4, pcDBhuCSF-25, pcDBmuCSF-L und pcDBmuCSF-S oder andere Vektoren, die Muteine von LCSF codieren, wobei die CSF- 1 codierende cDNA unter der Kontrolle des SV40-Promotors enthalten ist, können auch dazu verwendet werden, eine stabile Expression in Affen-CV-1-Zellen zu bewirken, der elterlichen Zellinie, aus der die COS-7-Linie abgeleitet wurde. Die Wirts- Affen-CV-1-Zellen werden bis zur Konfluenz gezüchtet und sodann unter Verwendung von 10 ug des Expressionsvektors und verschiedenen Mengen (1, 2, 5 und 10 ug) von pRSV-NEO2 (Gorman, C., et al., Science 221 (1983), 551-553) pro 500 000 Zellen cotransformiert. Die Transformanten werden in DMEM mit 10% FBS-Medium gezüchtet, das 100 ug/ml G418-Antibiotikum enthält, wobei das Plasmid pRSV-NEO2 die Resistenz gegen dieses Antibiotikum vermittelt. Die CV-1-Zellinie zeigt eine G418-Transformationshäufigkeit von etwa 10&supmin;5,12 Kolonien pro 10&sup6; Zellen pro ug DNA.
Die CV-1-Zellen werden, wie vorstehend beschrieben, cotransformiert und in G418-enthaltendem Medium selektiert. Resistente Clone werden auf Stabilität des G418-resistenten Phänotyps getestet, indem man sie in G418-freiem Medium wachsen läßt und sie anschließend wieder auf G418-enthaltendes Medium überführt. Die Fähigkeit dieser Kulturen zu überleben, nachdem sie auf Antibiotika-enthaltendes Medium überführt wurden, legt nahe, daß die pRSV-NEO2-DNA permanent im Zellgenom integriert ist. Zellen, die mit einem Markerplasmid stabil transformiert sind, zeigen mit etwa 50% Wahrscheinlichkeit die Integration der DNA eines cotransfizierenden Plasmids, somit werden etwa die Hälfte dieser Zellen in ihrer chromosomalen DNA das Expressionssystem für das CSF-1-Protein enthalten.
Mehrere Clone werden aus der Menge der G418-resistenten CV-1-Zellen, deren stabile Transformation wie vorstehend nachgewiesen wurde, herausgegriffen und jeweils in doppelter Ausfertigung in Flaschen bis fast zur Konfluenz gezüchtet. Eine Flasche jeder doppelten Ausfertigung wird mit SV40-Virus bei einer Infektionsmultiplizität von 5 infiziert und das Medium sechs Tage nach der Infektion geerntet, sodann wird es unter Verwendung eines Radioimmuntests auf CSF-1 getestet. Der Immuntest beruht auf der Konkurrenz von ¹²&sup5;I-markiertem MIAPaCa- CSF-1 um polyclonales "Kaninchen 52"-Antiserum, das gegen gereinigten menschlichen Urin-CSF-1 hervorgebracht wurde.
Einer der selektierten CV-1-Clone aus der Transfektion mit pcCSF-17 zeigte gemäß diesem Test eine CSF-1-Produktion von 2335 E/ml, wohingegen Zellen, die nicht mit SV40 infiziert waren, weniger als 20 E/ml zeigten. Kontrollen unter Verwendung von COS-7-Zellen, die mit 10 ug pcCSF-17 transformiert waren, zeigten ohne SV40-Infektion eine CSF-1-Produktion von 2400 E/ml.
Die CSF-1-produzierende CV-1-Zellinie enthält das CSF-1- Expressionssystem, das stabil in sein Genom integriert ist, somit kann sie für die Produktion von CSF-1 nach Infektion mit SV40 verwendet werden. Man vermutet, daß durch die Infektion das Expressionssystem aus dem Genom "freigesetzt" wird und das SV40-T-Antigen bereitgestellt wird, das für die Replikation der freigesetzten DNA benötigt wird. Ohne SV40-Infektion wird das integrierte Gen, das CSF-1 codiert, nicht wirksam exprimiert.
Die Optimierung der Expression der CSF-1-codierenden Sequenz durch die CV-1-(CSF-17)-Zellinie zeigte bei Messung mittels Radioimmuntest sechs Tage nach der SV40-Infektion 6500 bis 8000 E/ml, wobei eine Infektionsmultiplizität von mindestens 1 und ein 10% FBS-Medium eingesetzt wurde. Studien über Expressionsspiegel bei einer Multiplizität von 10 zeigten eine vergleichbare Produktion, jedoch nahm die Produktion bei Entfernung von FBS aus dem Medium am zweiten Tag nach der Infektion ab.
In einer anderen Ausführungsform können geeignete Kontrollsysteme und Wirtvektoren, die eine Expression in anderen eukaryotischen Wirten erlauben, verwendet werden, wodurch die CSF-1-codierenden Insertionen erhalten werden. Z.B. können CHO-Zellen und geeignete Vektoren eingesetzt werden. Außerdem werden Baculovirus-Vektoren, die diese Sequenzen enthalten, zur Infektion von Insektenzellen für die Produktion von Protein verwendet, wie von Miller, D. W., et al., in Genetic Engineering (1986), S. 277-297, (a.a.O.), beschrieben.

F.6. Prokaryotische Expression

Für die prokaryotische Expression wird der cDNA-Clon oder die genomische Sequenz mit den herausgeschnittenen Introns z. B. durch eine stellenspezifische Mutagenese so verändert, daß ein ATG-Start-Codon unmittelbar stromaufwärts der Glutaminsäure am N-Terminus und außerdem eine HindIII-Stelle unmittelbar stromaufwärts des ATG liegt, wodurch eine passende Stelle für die Insertion in die nachstehenden Standard-Wirt- Expressionsvektoren bereitgestellt wird. Dies kann direkt durchgeführt werden, indem die stellenspezifische Mutagenese mittels Insertion eines synthetischen Oligomers durchgeführt wird, das eine neue Sequenz enthält, die zum gewünschten AAGCTTATG komplementär ist, flankiert von Nucleotidsequenzen, die zum nativen Leader und den N-terminalen codierenden Sequenzen komplementär sind.
Das DNA-Fragment, das die gesamte codierende Sequenz enthält, wurde aus pcCSF-17 oder aus pcDBhuCSF-4 durch Spaltung mit EcoRI herausgeschnitten, durch Agarosegelelektrophorese isoliert und durch Elektroelution gewonnen. Zur Durchführung der Mutagenese wurde auch die DNA des Wirts-Bakteriophagen M13mp18 mit EcoRI behandelt und mit dem gereinigten Fragment unter Standardbedingungen ligiert und sodann in den gefrorenen kompetenten E. coli K12-Stamm DG98 transfiziert. Die Zellen wurden auf Medien plattiert, die 5 · 10&supmin;&sup4; M Isopropylthiogalactosid (IPTG), bezogen von Sigma Chem. (St. Louis, MO), und 40 ug/ml X-Gal enthielten. Nicht-komplementierende weiße Plaques wurden herausgegriffen und in frische Medien überführt. Mini-Kulturen wurden auf rekombinante Einzelstrang-Phagen-DNA der erwarteten Größe durchgemustert, sodann wurde die Struktur des gewünschten rekombinanten Phagen unter Verwendung von Restriktionsanalyse bestätigt.
Ein 34-mer, das zum N-Terminus und zu den Leadercodierenden Teilen der CSF-1-Sequenz komplementär war, das jedoch das Komplement zur gewünschten AAGCTTATG-Sequenz enthielt, wurde synthetisiert und gereinigt. In einer anderen Ausführungsform, wenn der negative "Sense"-Strang M13 verwendet wurde, wurde das positive Sense-34-mer eingesetzt. Ein Teil dieses 34-mer-Präparats, das später als Sonde verwendet werden sollte, wurde gemäß einer Modifikation der Technik von Maxam und Gilbert (Maxam, A., et al., Methods in Enzymology 68 (1980), 521, Academic Press) radiomarkiert, wie vor stehend angegeben.
Zur Durchführung der Nutagenese wurde der vor stehend hergestellte rekombinante Bakteriophage im E. coli K12-Stamm DG98 erzeugt und die Einzelstrang-Phagen-DNA gereinigt. Ein pMol Einzelstrang-Phagen-DNA und 10 pMol des vorstehenden synthetischen Nucleotidprimers (nicht Kinase-behandelt) wurden durch einminütiges Erhitzen bei 67ºC und sodann 30 Minuten bei 37ºC in 15 ul 20 mM Tris-Cl, pH 8, 20 mM MgCl&sub2;, 100 mM NaCl, 20 mM 2-Mercaptoethanol aneliert. Die anelierte DNA wurde mit DNA- Polymerase I (Klenow) und 500 uMol dNTPs 30 Minuten bei 0ºC inkubiert und anschließend auf 37ºC gebracht. Nach 5 Minuten, 20 Minuten und 45 Minuten wurden Aliquots (0,05 oder 0,25 pMol) entnommen, in E. coli K12-Stamm DG98 transformiert und plattiert.
Nach dem Wachstum werden die Platten bei 4ºC abgeschreckt und die Plaques mit PalI-Membranen, erhalten von Biodyne, oder S&S-Filtern abgehoben (1 bis 2 Minuten beim ersten Filter, mehr als 10 Minuten für das zweite Filter). Die Filter werden in 2,5 M NaCl, 0,5 M NaOH, (5 Minuten) denaturiert. Das denaturierende Medium wird mit 3 M Natriumacetat, pH 5,5, oder mit 1 M Tris-Cl, pH 7,5, enthaltend 1 M NaCl, neutralisiert, die Filter bei 80ºC eine Stunde im Vakuum gebacken und sodann bei hoher Stringenz prähybridisiert. Anschließend werden die Filter mit dem vorstehend hergestellten Kinase-behandelten synthetischen 34-mer bei hoher Stringenz mittels Sonde untersucht, gewaschen und über Nacht bei -70ºC autoradiographiert.
Die RF-Form jedes gewünschten mutierten Phagen wurde mit EcoRI behandelt, mittels Klenow mit glatten Enden versehen und sodann mit HindIII gespalten, wodurch das Gen als ein HindIII/glattes Fragment herausgeschnitten wurde.
Das Plasmid pFC54.t (ATCC 39789), das den PL-Promotor und die positive retroregulatorische Sequenz von Bacillus thuringiensis enthält (wie in der EPO-Anmeldung Veröffentlichungs- Nr. 717 331, veröffentlicht am 29. März 1985, beschrieben), wurde als Wirtsvektor eingesetzt. pFC54.t wurde mit HindIII/BamHI (glatt) gespalten und die gewünschten codierenden Sequenzen in den Vektor ligiert, wobei das durch HindIII/EcoRI (glatt) herausgeschnittene Fragment aus dem mutierten M13, abgeleitet von pcCSF-17 oder pcDBhuCSF-4, verwendet wurde. Nach der Transformation in E. coli MC1000 Lambda-lysogen und der Induktion wurde die Produktion von CSF- 1, vermutlich SCSF bzw. LCSF, erhalten und wie vorstehend beschrieben überprüft.
Auf diese Weise wurde z. B. das glatte HindIII/EcoRI-Fragment aus dem mutierten M13-Substrat aus pcCSF-17, wie vorstehend beschrieben, in pFC54.t ligiert, wodurch pPLCSF-17 erhalten wurde. pPLCSF-17 wurde anschließend mit BamHI gespalten und wiederligiert, wodurch pPLCSF-17/C 158 erhalten wurde, das die codierende Sequenz für den reifen SCSF enthält, vor der ein ATG-Start-Codon liegt und die so verkürzt ist, daß sie ein Protein codiert, das die ersten 158 Aminosäuren der SCSF-Sequenz aufweist, gefolgt von einem im-Leseraster-stehenden Prolin-Rest und einem Stopp-Codon aus der retroregulatorischen Sequenz von pFC54.t. pPLCSF-17/C l58 wurde durch stellenspezifische Mutagenese weiter modifiziert. Die HindIII/BamHI-codierende Sequenz wurde herausgeschnitten und in M13 ligiert. Ein geeigneter Primer wurde eingesetzt, um ein Stopp-Codon unmittelbar nach dem Codon, das die Aminosäure 158 codiert, zu plazieren und dahinter TGA einzusetzen. Hierdurch entsteht eine BamHI/BcII-Stelle für die weitere Manipulation. Sodann wurde das mutierte Fragment aus M13 herausgeschnitten und in das mit HindIII/BamHI gespaltene pPLCSF-17/C 158 ligiert, wodurch pPLCSF-17/C 158TGA erhalten wurde.
Andere Konstrukte, die Codons zur Substitution von Aminosäuren aufweisen, umfassen Modifikationen, die in SCSF Lys an Position 52 durch Gln oder Pro und/oder Tyr an Position 59 durch Asp ersetzen. Diese Konstrukte wurden genauso durch stellenspezifische Mutagenese von M13-Insertionen hergestellt, die das HindIII/EcoRI-(glatte)-Fragment aus dem ursprünglichen pPLCSF-17 enthielten. Sodann wurden bei der Konstruktion von entsprechenden Vektoren HindIII/EcoRI-Fragmente aus diesen mutierten Phagen anstelle der ursprünglichen HindIII/EcoRI-Insertion verwendet. Allgemein gesagt können gewünschte Mutationen an ausgewählten Stellen mittels Änderungen dieser Standardtechnik hergestellt werden.
Es ist möglich, den Spiegel der CSF-1-Produktion aus jedem beliebigen vorstehenden Konstrukt zu steigern, indem man das dritte Nucleotid in jedem der ersten sechs Codons des N- Terminus ändert. pFC54.t, enthaltend das CSF-1-codierende Fragment eines beliebigen Muteins, wird mit HindIII/BstXI gespalten und das herausgeschnittene Fragment (das das ATG und einen kurzen Teil der darauf folgenden codierenden Sequenz enthält) wird durch ein synthetisches HindIII/BstXI-Segment ersetzt, in dem die ersten sechs Codons die Sequenz GAAGAAGTTTCT GAATAT aufweisen. Der resultierende analoge Expressionsvektor weist keine Änderung der codierten Aminosäuresequenz auf; jedoch waren die Spiegel der Expression erhöht, wenn dieser modifizierte Vektor verwendet wurde. Die entsprechenden Vektoren werden durch ein vorangestelltes O/E ("Over Expression") gekennzeichnet. Auf diese Weise werden z. B. O/E pPLCSF-17, O/E pPLCSF-17/C 158 und O/E pPLCSF-17/C 158TGA erzeugt.
Der entsprechende Vektor O/E pPLCSF-17Asp&sub5;&sub9;/C 158TGA wurde synthetisiert, wie vorstehend beschrieben, mit der Ausnahme, daß M13, enthaltend die ursprüngliche EcoRI-Insertion, doppelt mutiert wurde, um eine HindIII-Stelle und ein ATG- Start-Codon unmittelbar von Aminosäure 1 des reifen Proteins zu plazieren und das Tyrosin-Codon an Rest 59 durch ein Codon zu ersetzen, das für Asparaginsäure steht. Die entsprechenden Vektoren O/E pPLCSF-17Asp&sub5;&sub9;/C 158 und O/E pPLCSF- 17Asp&sub5;&sub9;/C 158TGA werden entsprechend erzeugt. In allen vorstehenden Fällen kann jeder der intermediären Vektoren mit HindIII und BstXI gespalten werden und das synthetische DNA- Fragment, das die bevorzugten Codons enthält, anstelle der nativen Sequenz eingesetzt werden, die die ersten sechs Aminosäuren codiert.
Alle vorstehenden Vektoren sind so modifiziert, daß sie Proteine mit der für die Erfindung charakteristischen N-terminalen Deletion codieren, indem das geeignete synthetische Fragment anstelle der herausgeschnittenen HindIII/BstXI-DNA eingesetzt wird. Auf diese Weise wurden die entsprechenden Vektoren konstruiert, die CSF/N 2 und CSF/N 3 codieren, denen Glu-Glu und Glu-Glu-Val fehlt.
Außerdem wurden analoge Vektoren konstruiert, die unmittelbar nach dem Glycin-Rest an Position 150 des SCSF-Proteins ein Terminationscodon enthalten. Diese Vektoren wurden durch Mutagenese des HindIII/EcoRI-Fragments aus pPLCSF-17 oder pPLCSF-17Asp&sub5;&sub9; oder ihren entsprechenden Muteinen in HindIII/SmaI-gespaltenen M13 erhalten. Die resultierenden Vektoren, z. B. pPLCSF-17/C 150 und pPLCSF-17Asp&sub5;&sub9;/C 150 codieren somit die ersten 150 Aminsäurereste des reifen SCSF-Proteins.
Die vorstehenden Vektoren wurden in einen Lambda-lysogenen E. coli-Wirt, wie z. B. DG116, transformiert und durch eine hohe Temperatur (etwa 42ºC) induziert, wodurch CSF-1 und Muteine davon in monomerer oder aggregierter entglykosylierter Form erzeugt wurden. Die Erzeugung dieses Proteins kann nachgewiesen werden, indem ein Standard-Radioimmuntest oder andere CSF-1 spezifische Tests verwendet werden. Die Aktivität des Proteins kann durch die Anwendung von Faltungsverfahren meßbar verbessert werden.
Außerdem wurden Konstrukte unter Verwendung des Phosphatase-A-Promotors und der sekretorischen Leader-Sequenz anstelle des PL-Promotors hergestellt. Die Kontrollsequenzen, umfassend die retroregulatorischen 3'-Sequenzen, die denjenigen in pFC54.t entsprechen, werden durch Insertion der gewünschten codierenden Sequenz in NarI/BamHI-gespaltenen pSYC1089, einen Wirtsvektor, der diese Kontrollen enthält, bereitgestellt.
Um diesen Vektor praktisch zu nutzen, werden die relevanten CSF-codierenden Sequenzen in M13 so ligiert, daß die HindIII-Stelle unmittelbar vor dem ATG so verändert wird, daß eine ClaI-Stelle entsteht. Anschließend wird die mutierte Sequenz als ClaI/BclI-Fragment herausgeschnitten und in den gespaltenen pSYC1089-Vektor, wie beschrieben, ligiert. Die Produkte dieses Konstruktes, die den unter der Kontrolle des PL Promotors in den PL-Vektorserien erzeugten Kurzformen entsprechen, werden bei Expression in E. coli in den periplasmatischen Raum ausgeschieden und sind im Vergleich zu den Produkten der Gene, die unter PL-Kontrolle exprimiert werden, relativ gut löslich. Vektoren, die unter Verwendung des hier beschriebenen phoA-Systems konstruiert werden können, umfassen pPhoA-LCSF/C 158 und pPhoA/N 3C 150. Diese Vektoren werden zur Expression in einen nicht-Lambda-lysogenen Wirt, wie z. B. E. coli MM294, transformiert.
Außerdem wurden Vektoren unter Verwendung der DNA konstruiert, die aus dem Langform-Clon stammte. O/E pPLCSF- 17Asp&sub5;&sub9;/C 150, vorstehend beschrieben, wurde als Wirtsvektor für Konstrukte der Langform und verschiedener C-terminaler Verkürzungen der codierenden Langform-Sequenz eingesetzt. Da die Sequenzen stromaufwärts der BstXI-Stelle sowohl in den Kurz- als auch den Langformen vorliegen, können Vektoren, die die Kurzform oder deren Muteine enthalten, zu Langform-Vektoren umgewandelt werden, indem das BstXI- zu BamHI-Fragment dieses Vektors ausgetauscht wird, wodurch die Stromabwärts-Positionen der Sequenz herausgeschnitten werden und das TGA- Stopp-Codon zusammen mit dem BstXI- zu BamHI-Fragment von M13 eingebaut wird, das die Langform-codierende Sequenz aus Clon 4 oder ihre C-terminalen Verkürzungen enthält.
Demgemäß wurde der M13-Clon, der die Clon 4-Insertion enthält, mit geeigneten Oligomeren mutagenisiert, wodurch Stopp-Codons hinter den Resten an den Positionen hinter 150, 190, 191, 221, 223, 236, 238, 249, 258 und 411 eingefügt wurden. Z.B. wurde der reverse Strang von M13, enthaltend die Clon 4-Insertion, mit dem Oligonucleotid GGCTTGACCTGATCAGACTCTGAGG geprimt, um ein Stopp-Codon hinter dem Threonin-Rest an Position 191 zu plazieren und eine einzige BclI-Stelle unmittelbar danach bereitzustellen. Die mutagenisierte RF-Form des Phagen wurde mit BstXI und BamHI gespalten und in BstXI/BamHI-gespaltenen O/E pPLCSF- 17Asp&sub5;&sub9;/C 150 ligiert, wodurch O/E pPLLCSFAsp&sub5;&sub9;/C 150 erhalten wurde.
Die mutierte Langform kann verwendet werden, um die entsprechenden Kurzform-Fragmente aus Vektoren, die CSF-1-Proteine mit N-terminalen Deletionen codieren, wie auch aus den entsprechenden Konstruktionen in den phoA-kontrollierten Vektoren zu ersetzen. Z.B. wurden pPhoA-LCSF/N 3C 221 und pPhoA- LCSF/C 221 konstruiert und in E. coli MM294 transformiert. Natürlich kann auch mehr als eine Mutation der Langform durchgeführt werden; auch können Aminosäuresubstitutionen, wie z. B. Gly&sub5;&sub2; oder Tyr&sub5;&sub9;, ausgeführt werden.
Weitere Konstrukte für Muteine wurden hergestellt, die SCSF, LCSF und ihre Muteine codierten, wobei die Glykosylierungsstellen an den Positionen 122 bis 124 und 140 bis 142, die in beiden Proteinen vorliegen, durch Aminosäuren ersetzt wurden, die einer Glykosylierung nicht zugänglich sind. Die CSF-Proteine, die bei bakterieller Expression aus diesen Konstruktionen erzeugt wurden, sind in biologischen Tests aktiv; dies erhärtet die Aussage, daß die Glykosylierung für die Aktivität nicht nötig ist. Dagegen führt der Austausch jedes beliebigen Cystein-Restes zwischen den Positionen 1 bis 150 durch Serin oder Alanin zu inaktiven Proteinen, mit der Ausnahme, daß Muteine, die eine Substitution an Position 90 aufweisen, Immunreaktivität zeigen. Offensichtlich sind alle sieben Cystein-Reste für die richtige Faltung erforderlich oder mindestens wünschenswert.
Die Konstruktion von erfindungsgemäßen N 2- und N 3-Muteinen aus jedem beliebigen vorstehenden Vektor ist extrem einfach und umfaßt lediglich die Deletion des HindIII/BstXI- Fragments und dessen Ersetzen durch ein synthetisches Fragment, das die Codons für die ersten zwei oder drei Aminosäuren, je nachdem, nicht umfaßt. Somit wird jeder der vorstehenden Vektoren durch dieses einfache Substitutionsverfahren modifiziert, wodurch ein Vektor erhalten wird, der die erfindungsgemäßen Muteine codiert.
Zu den hergestellten rekombinanten Organismen zählt E. coli DG116 Lambda-lysogen, transformiert mit den folgenden Plasmiden, die Konstrukte für die Expression der angegebenen Kurzform-abgeleiteten CSF-1-Muteinformen sind:
Konstrukt Codiertes Protein
Die folgenden analogen rekombinanten Organismen, die Variationen der Langform codieren, wurden konstruiert:
Zur Expression der Konstruktionen wird der entsprechend transformierte E. coli (Lambda-lysogen, z. B. DG116, für die PL-Konstrukte, nicht-lysogen, z. B. MM294, für PhoA) bis zur gewünschten Zelldichte gezüchtet und anschließend die Produktion des codierten Proteins induziert. Sofern die Expression unter der Kontrolle des PL-Promotors stattfindet, wird die Expression durch eine Temperaturerhöhung auf 37ºC oder 42ºC induziert. Auch der Zusatz von etwa 0,5 bis 2% Casaminosäuren zum Medium trägt zur Steigerung der Expression bei. Die vorstehend beschriebenen Konstrukte führen zur Bildung von CSF-1 als unlösliches intrazelluläres Protein, das aus den lysierten Zellen gewonnen, gereinigt und gefaltet werden kann. Ähnliche Verfahren können zur Reinigung und Faltung des CSF-1 verwendet werden, der in den periplasmatischen Raum von E. coli, der mit den phoA-kontrollierten Genen transformiert ist, ausgeschieden wird.
Die Faltung beginnt im allgemeinen mit dem solubilisierten Monomer in chaotroper Umgebung, dies bleibt unter reduzierenden Bedingungen erhalten. Eine solche Erhaltung kann die Verwendung eines geeigneten Reduktionsmittels, wie z. B. β-Mercaptoethanol oder Dithiothreit (DTT), umfassen, jedoch kann der CSF-1 auch bereits reduziert sein und der Ausschluß von Oxidationsmitteln erforderlich sein. Typischerweise wird das solubilisierte Protein in z. B. 8 M Harnstoff oder 7 M Guanidinium-Hydrochlorid bei einem pH-Wert von etwa 7 bis 8,5 in Gegenwart von etwa 25 bis 100 mM einer Thiolverbindung gehalten. Wenn man mit dieser solubilisierten Form beginnt, kann das Monomer entweder direkt gefaltet werden oder es kann durch ein geeignetes Reinigungsverfahren, wie z. B. Chromatographie auf einem Adsorbens-Gel oder Gelpermeationschromatographie, vor der Faltung von restlichen Proteinen gereinigt werden. Die Gelpermeationschromatographie ist bevorzugt, da hiermit die gewünschte Monomerlänge, die im allgemeinen bereits vorher bekannt ist, einfach nach der Größe von Verunreinigungen mit anderen Molekulargewichten abgetrennt werden kann. Die Reinigung muß unter reduzierenden Bedingungen durchgeführt werden, um die Erzeugung von Disulfid-verknüpften Aggregaten zu verhindern. Unabhängig vom eingesetzten Chromatographieverfahren enthalten die Lösungen, die zum Beladen der Chromatographiesäulen oder für die Ansätze verwendet werden, und die Elutionslösungen somit vorzugsweise ein geeignetes Reduktionsmittel. In einigen Fällen kann anstelle des Reduktionsmittels ein niedriger pH-Wert eingesetzt werden, da ein niedriger pH- Wert in einigen Chromatographiesystemen auch in Abwesenheit von Reduktionsmitteln die Erzeugung von Disulfidbindungen verhindert.
Anschließend wird das teilweise gereinigte Monomer den Faltungsbedingungen zur Erzeugung des Dimers unterworfen. Während dieser Stufe ist die Proteinkonzentration sehr wichtig. Im allgemeinen erhält man gesteigerte Ausbeuten, wenn die Proteinkonzentration unter 2 mg/ml des CSF-1-Proteins liegt; eine Konzentration im Bereich von 0,03 bis 0,3 mg/ml ist bevorzugt. Die Faltungsbedingungen können eine allmähliche Entfernung der chaotropen Umgebung in einer geeigneten Zeitspanne, üblicherweise in mehreren Stunden, umfassen. Ein einfaches Verfahren ist die Verdünnung der Probe auf die gewünschte Konzentration des chaotropen Mittels, in einigen Fällen ist dies jedoch möglicherweise nicht bevorzugt, da das Protein dadurch auch verdünnt wird. Stärker bevorzugt sind Verfahren, die eine gleichbleibende Proteinkonzentration bereitstellen, wie z. B. eine Dialyse oder Hohlfaser-Diafiltration. Am Ende des Verfahrens, wenn die chaotrope Umgebung erschöpft ist, wird eine nichtdenaturierender Zustand erhalten. Wenn z. B. Guanidin-Hydrochlorid als chaotropes Mittel eingesetzt wird, wird eine Endkonzentration von weniger als etwa 2 M, vorzugsweise 0,5 bis 1 M, erreicht.
Die Faltung während der Entfernung der chaotropen Umgebung wird so ausgeführt, daß die Oxidation der Sulfhydrylgruppen zu Disulfiden gestattet wird, wodurch die resultierende biologisch aktive Dimerkonfiguration erhalten wird, die, im Fall von CSF-1, durch die Erzeugung von Disulfiden stabilisiert wird, wobei eine oder mehrere davon die zwei Ketten verknüpfen. Es werden auch Disulfide innerhalb der einzelnen Ketten gebildet. Geeignete Redoxbedingungen, die diese Dimererzeugung anregen, umfassen die SH/Disulfid-Reagens-Kombinationen, wie z. B. oxidiertes und reduziertes Glutathion. Das Verhältnis von reduziertem zu oxidiertem Glutathion oder einer anderen Sulfhydryl/Disulfid-Kombination beträgt typischerweise von etwa 2 mM/0,1 mM bis zu 0,5 mM/1,0 mM. Auch alternative Verfahren zur Bereitstellung dieser Oxidation sind anwendbar. Zwar kann die einfache Entfernung des Reduktionsmittel ohne Vorsichtsmaßnahmen zum Ausschluß von Luft und Metallionen zur Erzeugung von einigen korrekten Disulfidbindungen ausreichen, dies ist jedoch weniger bevorzugt. In jedem Fall sollte der pH-Wert der Lösung während des Faltungsverfahrens bei etwa 7,5 bis 9,0 gehalten werden. Es ist klar, daß im Faltungsverfahren die reduzierenden Bedingungen, unter denen die anfängliche Reinigung durchgeführt wurde, nicht länger angewendet werden.
Während des Faltungsverfahrens können. Aggregate des Monomers entstehen, die unlöslich sind. Dies wird durch die Temperaturkontrolle minimiert, wobei niedrige Temperaturen von etwa 0 bis 4ºC gegenüber höheren Temperaturen von 25 bis 37ºC bevorzugt sind. Nach vollständiger Faltung wird das Dimer unter Einsatz von Standardverfahren von anderen Proteinen gereinigt.
Wenn die erfindungsgemäßen Konstrukte, die die vom N-Terminus befreiten Muteine codieren, wie vorstehend erwähnt in E. coli exprimiert werden, wird das Methionin am N-Terminus wirksamer prozessiert als es bei den entsprechenden reifen Sequenzen der Fall ist. Insbesondere die Expression von pPLCSF- 17/C 150 führt zu einem Protein, bei dem die meisten, wenn nicht sogar alle der sequenzierbaren Moleküle N-terminales Methionin enthalten; die entsprechende Expression von pPLCSF- 17/N 2C 150 führt zu einem Protein, bei dem nur 78% der Moleküle das N-terminale Methionin beibehalten. Die Expression von pPLCSF-17/N 3C 150 ergibt ein Protein, wobei nur etwa 5% des Produktes am N-Terminus Methionin enthalten.
Die Fig. 4 bis 6 zeigen die Wirkung von N-terminalen Deletionen auf die resultierende Proteinheterogenität. Die Figuren 4 und 5 zeigen die RP-HPLC-Analysen von gereinigem CSF- 1, exprimiert in E. coli unter Verwendung von pPLCSF-17/C 158 (Tyr&sub5;&sub9;) bzw. pPLCSF-17/C 150 (Asp&sub5;&sub9;). Wie in beiden Figuren dargestellt, liegen unter den reduzierenden Bedingungen, unter denen diese Analysen durchgeführt wurden, zwei Hauptpeaks bei etwa 18 kd vor. Der vordere Peak, in Fig. 4 mit 18 K-A gekennzeichnet, (und der entsprechende Peak in Fig. 5) umfaßt etwa 70% des gesamten 18 kd-Proteins und weist im wesentlichen die gleiche Aminosäurezusammensetzung und das gleiche SDS- PAGE-Untereinheit-Molekulargewicht auf wie der hintere Peak (mit 18 K-B gekennzeichnet). Außerdem führt das 158 Codons große Konstrukt zu einer Hauptverunreinigung in Form eines 15 kd-Proteins, das offensichtlich das Produkt eines inneren Neustarts darstellt. Dieser Peak scheint bei dem Produkt des 150 Codons großen (Asp&sub5;&sub9;)-Konstruktes zu fehlen, dargestellt in Fig. 5.
Die Ergebnisse in Fig. 5 sollten mit den Ergebnissen von Fig. 6 genau verglichen werden, wo die RP-HPLC-Analyse der Expression von pPLCSF-17/N 3C 150 gezeigt wird. Die auf RP- HPLC sichtbare signifikante Heterogenität ist verschwunden und es wurde ein Einzelpeak erhalten, der dem führenden 70%-Peak von Fig. 5 entspricht.

G. Formulierung von CSF-1

Die rekombinant erzeugte menschliche CSF-1-Kurz- oder Langform kann unter Einsatz von pharmazeutischen Standardverfahren für die Verabreichung formuliert werden. Üblicherweise wird CSF-1 in injizierbarer Form hergestellt und kann entweder als Einzelwirkstoff oder in Kombination mit anderen Proteinen oder anderen Verbindungen eingesetzt werden, die eine komplementäre oder ähnliche Aktivität besitzen. Solche andere Verbindungen können andere Antitumormittel, wie z. B. Adriamycin, oder Lymphokine, wie z. B. IL-1, -2 und -3, Alpha-, Beta- und Gamma-Interferone und den Tumornekrosefaktor umfassen. Die Wirkung des CSF-1-Wirkstoffs kann durch das Vorliegen solcher zusätzlicher Komponenten gesteigert oder verbessert werden. Wie vorstehend beschrieben, kann der CSF-1 mit geeigneten Blutzellen nutzbringend in Wechselwirkung treten, somit umfassen die erfindungsgemäßen Mittel Inkubationsgemische solcher Zellen mit CSF-1, gegebenenfalls in Gegenwart zusätzlicher Lymphokine. Entweder können die Überstandfraktionen solcher Inkubationsgemische verwendet werden, genausogut kann auch das gesamte Gemisch, das die Zellen enthält, eingesetzt werden.

Hinterlegungen

Am 2. April 1985 haben die Anmelder den Phagen phCSF-1 in E. coli DG98 bei der American Type Culture Collection, Rockville, MD, USA (ATCC), unter der Hinterlegungsnummer 40177 hinterlegt. Am 21. Mai 1985 wurde phCSF-1a, in der Cetus-Sammlung CMCC 2312 genannt, für die Hinterlegung mit phCSF-1a/λ Charon 4A bezeichnet, bei ATCC hinterlegt und hat die Hinterlegungsnummer 40185. Am 14. Juni 1985 wurde pcCSF-17 in E. coli MM294, CMCC 2347 genannt, bei ATCC hinterlegt und hat die Hinterlegungsnummer 53149.
Außerdem wurde pcDBCSF4, hier mit pcDBhuCSF-4 (CMCC 2894) bezeichnet, am 24. Oktober 1986 bei ATCC hinterlegt und hat die ATCC-Hinterlegungsnummer 67250. Am 7. April 1987 wurde pPLCSF-17asp&sub5;&sub9;/C 150 in DG116 (CMCC 2946) bei ATCC hinterlegt und hat die Hinterlegungsnummer 67383.
Weitere Hinterlegungen wurden am 14. April 1987 wie folgt durchgeführt:
Stamm CMCC-Nr. ATCC-Nr.
pPhoA-LCSF/C 221 in MM294 3084 67 391
O/E pPLLCSF/N 3C 221 in DG116 3095 67 390
O/E pPLCSF-17asp&sub5;&sub9;/C 150 in DG116 3044 67 389
Diese Hinterlegungen wurden gemäß den Bestimmungen des Budapester Vertrages zur Internationalen Anerkennung der Hinterlegung von Mikroorganismen zum Zweck von Patentverfahren und den entsprechenden Vorschriften (Budapester Vertrag) durchgeführt. Dies stellt die Erhaltung von lebensfähigen Kulturen für 30 Jahre von Datum der Hinterlegung ab sicher. Die Hinterlegungen werden von ATCC gemäß den Bestimmungen des Budapester Vertrages zur Verfügung gestellt, wobei eine Vereinbarung zwischen den Anmeldern und ATCC besteht, die die permanente und ungehinderte Verfügbarkeit gemäß Erteilung des relevanten US-Patents sicherstellt. Der Bevollmächtigte sichert zu, daß die Kultur, sofern sie bei der Hinterlegung stirbt oder verlorengeht oder zerstört wird, wenn sie unter geeigneten Bedingungen kultiviert wurde, bei Benachrichtigung unverzüglich durch einen lebensfähigen Vertreter der gleichen Kultur ersetzt wird. Die Verfügbarkeit der Hinterlegungen darf nicht als Lizenz ausgelegt werden, die Erfindung unter Verletzung der Rechte durchzuführen, wobei diese Rechte unter der Autorität der jeweiligen Regierung gemäß ihrer Patentgesetzte gewährt werden.
Die Hinterlegungen wurden aus praktischen Gründen für die zuständigen Interessenten durchgeführt und bedeuten keine Zustimmung, daß eine geschriebene Beschreibung ausreichen würde, um die Durchführung der Erfindung zu erlauben, oder keine Absicht, die Erfindung auf diese spezifischen Konstrukte zu beschränken. Vorstehend wird eine vollständige geschriebene Beschreibung gegeben, die einen Praktiker mit üblichem Geschick befähigt, die hinterlegten Konstrukte zu verdoppeln und andere Formen von DNA oder Organismen, die diese enthalten, zu konstruieren, die die Durchführung der Erfindung zulassen, wie in den Patentansprüchen beansprucht.
Die hier dargestellten erläuternden Ausführungsformen sollen den Umfang der Erfindung in keiner Weise einschränken, vielmehr muß er gemäß den beiliegenden Patentansprüchen bestimmt werden.

Claims

1. DNA-Sequenz, die ein menschliches CSF-1-N 3- oder -N 2- Mutein codiert, das mindestens die Aminosäuresequenz:

(i) N 3 oder N 2/SCSF/C 150; oder

(ii) N 3 oder N 2/LCSF/C 150; oder

(iii) eine Modifikation von (i) oder (ii) aufweist, wobei 1 bis 5 Aminosäuren substituiert oder deletiert sind und wobei Dimere des Muteins die Bildung von primären Makrophagenkolonien im in vitro- CSF-1-Test stimulieren; und wobei der Begriff "SCSF" sich auf die CSF-Kurzform bezieht, der Begriff "LCSF" sich auf die CSF-Langform bezieht und der Begriff " " die Deletion einer oder mehrerer Aminosäuren am N-terminalen Ende oder die Verkürzung des Moleküls durch Deletion von aufeinanderfolgenden Aminosäuren am C-terminalen Ende bedeutet.

2. DNA-Sequenz nach Anspruch 1, wobei die DNA-Sequenz ein CSF-1-Polypeptid codiert, das außerdem die Aminosäuresequenz umfaßt, die als Aminosäuren 150-447 in Fig. 2 gezeigt ist.

3. DNA-Sequenz nach Anspruch 1, wobei die DNA-Sequenz ein CSF-1-Polypeptid codiert, welches eines der folgenden N 3-Muteine ist:

SCSF, gln&sub5;&sub2;SCSF, pro&sub5;&sub2;SCSF, SCSF/C 158-pro, gln&sub5;&sub2;SCSF/C 158-pro, pro&sub5;&sub2;SCSF/C 158-pro, SCSF/C 158, pro&sub5;&sub2;SCSF/C 158, SCSF/C 150, LCSF/C 150, gln&sub5;&sub2;LCSF/C 150, tyr&sub5;&sub9;LCSF/C 190, LCSF/C 191, LCSF/C 221, LCSF/C 223, LCSF/C 236, LCSF/C 238, LCSF/C 249, LCSF/C 250 und LCSF/C 411.

4. DNA-Sequenz nach Anspruch 1, wobei die DNA-Sequenz ein CSF-1-Polypeptid codiert, das ausgewählt ist aus:

(a) N 3-Muteinen von LCSF, SCSF, LCSF/C 150, tyr&sub5;&sub9;LCSF/C 150, SCSF/C 150 und gln&sub5;&sub2;-Muteinen davon;

(b) N 3-Muteinen von jedem der möglichen C-terminalen Deletionspolypeptide von LCSF/C 149 bis LCSF/C 52l und tyr&sub5;&sub9;-, gln&sub5;&sub2;- und tyr&sub5;&sub9;gln&sub5;&sub2;-Muteinen davon;

(c) N 3-Muteinen von LCSF/C 190, LCSF/C 191, LCSF/C 221, LCSF/c 223, LCSF/C 236, LCSF/C 238, LCSF/C 249, LCSF/C 258 und LCSF/C 411 und tyr&sub5;&sub9;-, gln&sub5;&sub2;-, tyr&sub5;&sub9;gln&sub5;&sub2;-, ser&sub1;&sub5;&sub7;-, ser&sub1;&sub5;&sub9;-, ser&sub1;&sub5;&sub7;ser&sub1;&sub5;&sub9;-Muteinen davon; und

(d) N 3-Muteinen von SCSF/C 158 und den gln&sub5;&sub2;-Muteinen davon.

5. DNA-Sequenz nach Anspruch 1, wobei die DNA-Sequenz ein Polypeptid codiert, welches LCSF/N 3C 221 oder LCSFser&sub1;&sub5;&sub7;ser&sub1;&sub5;&sub9;N 3c 221 oder SCSF/N 3C 158 umfaßt.

6. Vektor, umfassend eine DNA-Sequenz nach einem der Ansprüche 1 bis 5 und ein Replicon, das in einem einzelligen Organismus wirksam ist.

7. Vektor nach Anspruch 6, umfassend O/EpPLLCSF/N 3C 221, erhältlich aus ATCC 67390.

8. Expressionssystem, umfassend eine DNA-Sequenz nach einem der Ansprüche 1 bis 5 oder einen Vektor nach Anspruch 6 oder Anspruch 7, funktionell verknüpft mit geeigneten Kontrollsequenzen.

9. Rekombinante Wirtszellen, die mit einem Expressionssystem nach Anspruch 8 transformiert sind.

10. Verfahren zur Herstellung eines rekombinanten menschlichen CSF-1-Polypeptids, umfassend die Züchtung von Zellen nach Anspruch 9, unter Bedingungen, die die Produktion des CSF-1 bewirken.