DE3650266T2 - DNS-Sequenzen, rekombinante DNS-Moleküle und Verfahren zur Herstellung von "mullerian inhibiting substance"-ähnlichen Polypeptiden. - Google Patents

Description

• Die Erfindung betrifft DNA-Sequenzen, rekombinante DNA- Moleküle und Verfahren zum Herstellen von der Müller'schen Inhibitorsubstanz (MIS) ähnlichen Polypeptiden. Genauer betrifft die vorliegende Erfindung DNA-Sequenzen und rekombinante DNA-Moleküle, die dadurch charakterisiert sind, daß sie wenigstens ein MIS-artiges Polypeptid kodieren. Entsprechend können mit diesen Sequenzen transformierte Wirte bei den Verfahren der Erfindung verwendet werden, um MIS-artig¬ Polypeptide der Erfindung herzustellen. Diese Polypeptide besitzen eine Antitumoraktivität und sind bei Behandlung von Krebs, besonders Krebs des weiblichen Genitaltraktes (e.g., Ovarialkrebs) verwendbar.
• Die Herstellung von wenigstens zwei Testikulärfaktoren durch die männlichen Gonaden kurz nach der Differentiation wurde zuerst für die normale männliche Reproduktionsentwicklung als notwendig postuliert, entsprechend den Kastrastionsversuchen bei fetalen Kaninchen von Jost (C. R. Soc. Biol., 140, 463-64 (1946 und C. R. Soc. Biol., 141, 135-36 (1947)). Es zeigte sich, daß ein Faktor, Testosteron, für die Differentiation von Epididymis, Vas deferens und seminalen Vesiclen aus den Wolff'schen Gängen verantwortlich ist. Die Virilisation des Männchens war jedoch nicht vollständig, bis ein zweiter, nicht steroidaler Faktor vorhanden war, um die Regression der Müller'schen Gänge, der Anlagen des weiblichen Reproduktionssystems zu stimulieren. Jost nannte diesen zweiten regulatorischen Faktor später Müller'sche Inhibitorsubstanz (MTS) (Rec. Prog. Horm Res., 8, 379-418 (1953)). Das Interesse an der Reinigung von MIS wurde durch die Entdeckung gesteigert, daß Rinder-MTS zusätzlich zu seiner wichtigen Rolle bei der Entwicklung gegenüber der menschlichen Ovarialtumorzellinie HOC-21 sowohl in vitro (Donahoe et al., Science, 205, 913-15 (1979); und Fuller et al., J. Clin. Endocrinol. Metab., 54, 1051-55 (1982)) als auch in vivo in einem bloßen Mausmodell (Donahoe et al., Ann. Surg., 194, 472-80 (1981)) cytotoxisch war. Hoch gereinigte Fraktionen von Rinder-MIS inhibierten auch das Koloniewachstum der primären Ovarial- und Endometrialkrebsarten, erhalten von Patienten (Fuller et al., Gyn. Oncol. (1985)).
• Eine Vielzahl von Ansätzen ist verwendet worden, um die Reinigung von MIS zu versuchen (für Reviews siehe Josso et al.. Rec. Prog. Hom. Res., 33, 117-67 (1977) und Donahoe et al., Rec. Prog. Hom. Res., 38, 279-330 (1982)). Die Testes von neugeborenen Kälbern enthalten bis zu 8 Wochen nach der Geburt einen hohen Anteil an MIS (Donahoe et al., Biol. Reprod., 16, 238-43 (1977)), was eine zugängliche Gewebequelle für die biochemische Reinigung liefert. Donahoe und Mitarbeiter erhielten ursprünglich aktive, rohe MIS-Zubereitungen aus Kalb- Testes durch Inkubation mit Guanidinhydrochlorid in Gegenwart eines Proteaseinhibitors (Swann et al., Dev. Biol, 69, 73-84 (1979)). Nachfolgende Fraktionierung durch Ionenaustausch- oder Gelfiltrationschromotographie steigerte die Reinheit etwa um das Dreißigfache. Ähnliche Ergebnisse wurden von anderen erhalten, die mit einem Inkubationsmedium aus fetalen Kalbtestes arbeiteten (Picard et al., Biomedicine 25 147-50 (1976), und Josso et al. Rec. Prog. Hom. Res., 33, 117-67 (1977)). Die Reinheit von Rinder-MIS wurde weiter gesteigert, als sequentielle Ionenaustauschchromatographie mit sequentieller Lectinaffinitätschromatographie verbunden wurde (Budzik et al., Cell 21, 909-15 (1980; U.S. Patent 4,404,188; und U.S. Patent 4,510,131). Die Ergebnisse von Eudzik et. al. (unten) legten nahe, daß Rinder-MIS ein Glycoprotein mit hohem Molekulargewicht ist, und lieferten halb gereinigte MIS- Fraktionen, die verwendet wurden, um anti-MIS monoclonale Antikörper herzustellen (Mudgett-Hunter et al., J. Immunol., 128, 1327-33 (1982); Shima et al., Hybridoma, 3, 201-14 (1984); und U.S. Patent 4,487,833). Durch Lectinaffinität gereinigtes Rinder-MIS, fraktioniert durch Gelfiltration unter nativen Bedingungen, zeigte einen einzelnen Peak bei annähernd 200.000 Dalton, obgleich auf denaturierendem Polyacrylamidgel diese Fraktion mehrere Komponenten enthielt, die eine Struktur mit mehreren Untereinheiten nahelegte (Budzik et al., Cell, 21, 909-15 (1980)).
• Danach wurde Matrixgel Green A verwendet, um eine mehr als 2000-fache Reinigung von Rinder-MIS mit einem damit verbundenen 60%igen Erhalt der Ausgangsaktivität zu erzielen. Dies wurde dadurch erreicht, daß man die MIS-Stabilität mit den dialysierbaren Schutzstoffen 2-Mercaptoethanol, EDTA, und Nonidet-P40 (NP40) stabilisierte. Die Analyse der 2000-fach gereinigten MIS-Fraktion durch SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese zeigte an, daß nur eine Komponente, die bei 140.000 Dalton wanderte, gegenüber der Reduktion empfindlich war, obgleich eine Anzahl von anderen Resten entdeckt wurde. Die Reduktion der Probe vor der Elektrophorese zeigte eine neue Bande bei 74.000 Dalton mit dem gleichzeitigen Verlust der 140.000 Dalton Spezies, während die Wanderungen aller anderen Komponenten in dieser Fraktion effektiv unverändert waren (Budzik et al., Cell, 34, 307-14 (1983)). Dies stimmt mit der Annahme überein, daß Rinder-MIS ein Dimer von über Disulfid verbundenen Untereinheiten mit einem Gesamtmolekulargewicht von 124.000 Dalton ist (Picard et al., Mol. Cell Endocrinol., 12, 17-30 (1978)).
• MIS mit größerer Reinheit und in größeren Mengen wird dringend für onkologische Untersuchungen benötigt, da die gegenwärtigen Verfahren zur Behandlung von Krebs des weiblichen Genitaltraktes nicht adäquat sind. Krebsarten des weiblichen Genitaltraktes stellen annähernd 9 % aller Krebsarten beim Menschen dar. Gegenwärtig verwenden die Ärzte die Chirurgie und die Bestrahlung, wenn Krebsarten des Genitaltraktes in frühen Stadien (z. B. Ovarialkarzinom-Stufe I-IIa) entdeckt werden. Obgleich diese Verfahren der Behandlung wirksam sind, machen sie diese Patientinnen steril. Chemoterapie wird in fortgeschrittenen Stufen (Stufe III-IV) verwendet, wenn die Patientinnen als inoperabel eingestuft werden. Von den chemotherapeutischen Mitteln werden Cisplatin, Adriamycin und Cytoxan sehr häufig verwendet. Es hat sich gezeigt, daß diese Arzneimittel besonders wirksam sind, wenn sie in Cisplatin enthaltenen Rezepturen kombiniert werden und auf einer Langzeitbasis verwendet werden. Jedes dieser Arzneimittel wird als hochgradig toxisch eingeschätzt, und deren Verwendung erfordert einen intermittierenden Krankenhausaufenthalt der Patientinnen.
• Von MIS als ein natürlicher biologischer Regressor wird angenommen, daß es aufgrund seiner Spezifizität geringere Nebenwirkungen besitzt. Andere potentielle Verwendungsmöglichkeiten von MIS beinhalten die Behandlung von Tumoren mit hohen Dosen an Epithelwachstumsfaktor-(EGP)- Rezeptoren (Hutson et al., Science, 223, 586-89 (1984)), wie die von Kopf und Nacken, Lunge, der Epithelbeschichtung des Verdauungstraktes, Cornea und Haut. Es wird ebenfalls angenommen, daß MIS die Keimzellenmeiose inhibieren könnte, da die Substanz auf den Granulosazellen des Graff'schen Follikels lokalisiert worden ist. Entsprechend wird seine Verwendung als Verhütungsmittel weiter erforscht. Diese Anwendungen mit einem breiteren Potential steigern die Wichtigkeit weiter, eine adäquate Quelle von MIS bereitzustellen.
• Ein Reinigungsverfahren für Rinder-MIS ist von Donahoe und Mitarbeitern entwickelt worden (Budzik et al., in Developmental Mechanisms: Normal and Abnormal, Lash, J. W., ed Alan R. Liss, Inc., Scientific, Medical and Scholarly Publications, Seiten 207-23 (1985)). Wenn man ein Verfahren in großem Maßstab verwendet, können etwa 1 mg 80%igen Proteins aus 1.000 Testes neugeborener Kälber isoliert werden. Jedoch ist dieses Reinigungsverfahren arbeitsintensiv und teuer. Besonders wichtig ist es, daß es nicht genug Material für extensive onkologische Studien bereitstellt. Rekombinante DNA-Technologie würde eine größere Quelle von Rinder-MIS bereitstellen.
• Obgleich die meiste Arbeit an MIS bei Rinder-MIS durchgeführt worden ist, ist auch einiges Interesse an Hühner- MIS vorhanden. Es erscheint anhand eines Artikels in Chemical Week, (30. Januar 1985, Seite 69), daß C. S. Teng vorgibt, Hühner-MIS gereinigt zu haben und das MIS-Gen aus Hühnerembryos isoliert hat. Jedoch wurden keine weiteren Details berichtet.
• Für die klinische Verwendung wird menschliches MIS gegenüber MIS tierischen Ursprungs bevorzugt. Jedoch ist menschliches MIS sogar noch schwieriger zu erhalten, da menschliches Gewebe in ausreichenden Mengen nicht verfügbar ist; entsprechend besteht der einzige Weg, menschliches MIS herzustellen, in der rekombinanten DNA-Technologie. Entsprechend ist die Isolierung des menschlichen Gens für MIS von herausragender Bedeutung.
• Die vorliegende Erfindung geht die vorhergehenden Probleme dadurch an, daß man DNA-Sequenzen, die wenigstens ein MIS- artiges Polypeptid kodieren, rekombinante DNA-Moleküle, die solche Sequenzen umfassen, Wirte, die solche Sequenzen umfassen, und Verfahren zum Herstellen solcher Polypeptide in Wirten, die mit solchen DNA-Sequenzen transformiert sind, und in höherer Reinheit als bis jetzt erhältlich bereitstellt.
• Die DNA-Sequenzen der vorliegenden Erfindung werden aus der Gruppe ausgewählt, die besteht aus
• a) den DNA-Sequenzen
• (der Sequenz des menschlichen Gens);
• (der Sequenz von menschlicher cDNA);
• (der Sequenz des Rindergens): und
• (der Sequenz von Rinder-cDNA); und
• (b) DNA-Sequenzen, die zu den vorgenannten DNA- Sequenzen hybridisieren und die bei Expression ein menschliches MIS-artiges Polypeptid oder ein Rinder-MIS-artiges Polypeptid kodieren und vorzugsweise einen deutlichen Grad an Homologie (bevorzugter wenigstens über 70% Homologie und besonders bevorzugt wenigstens über 80% Homologie) in bezug auf die zuvor genannten DNA-Sequenzen besitzen;
• (c) DNA-Sequenzen, die bei der Expression ein Polypeptid kodieren, das bei Expression eine der zuvor genannten DNA-Sequenzen kodiert. Rekombinante DNA-Moleküle, die diese DNA-Sequenzen enthalten, Wirte, die mit diesen transformiert wurden, und MIS-artige Polypeptide, die durch sie bei Expression kodiert sind, sind ebenfalls Teil der Erfindung.
• Die DNA-Sequenzen, rekombinanten DNA-Moleküle, Wirte und Verfahren dieser Erfindung ermöglichen die Produktion von MIS- artigen Polypeptiden zur Verwendung bei der Behandlung von Ovarialkrebs und anderen empfindlichen Krebsarten.
• Auch im Rahmen der vorliegenden Erfindung sind die Polypeptide, die ausgewählt werden, aus der Gruppe, die besteht aus:
• (die vollständige Aminosäurensequenz von menschlichem MIS- Protein);
• (die Aminosäurensequenz von reifem menschlichen MIS-Protein);
• (die vollständige Aminosäurensequenz von Rinder-MIS-Protein):
• (die Aminosäurensequenz von reifem Rinder-MIS-Protein); und MIS-artige Polypeptide, die damit verwandt sind, eine pharmazeutische Zusammensetzung gegen Krebs, umfassend eines der vorhergenannten Polypeptide und einen pharmazeutisch annehmbaren Träger und Verfahren zur Verwendung solcher Zusammensetzung bei der Behandlung von empfänglichen Krebsarten, besonders Krebsarten des weiblichen Genitaltraktes (e.g. Ovarialkrebs).
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
• Figur 1 zeigt die Aminosäurensequenzen, erhalten aus der Sequenzanalyse von trpytischen Peptiden von Rinder-MIS. Nur zwei der 23 erhaltenen Sequenzen sind gezeigt.
• Figur 2 zeigt die sechzehn Pools von chemisch synthetisierten Oligonucleotid-DNA-Proben, die verwendet wurden, um den Rinder-cDNA-Klon zu isolieren.
• Figur 3 zeigt die Nucleotidsequenz des Rindergens, das die cDNA-Sequenz in voller Länger und die Promotorregion einschließt.
• Figur 4 zeigt die Konstruktion des Plasmids pBG3II.bmis, das verwendet werden kann, um die Rinder-DNA-Sequenz der Erfindung zu exprimieren.
• Figur 5 zeigt den menschlichen Genom-Klon chmis33 und vergleicht ihn mit dem Rinder-cDNA-Klon ps21. Die festen Blöcke sind Exons, die die Protein kodierenden Bereiche enthalten.
• Figur 6 zeigt die Nucleotidsequenz des menschlichen Gens in dem Cosmidklon chmis33. Die Proteinsequenz wird unterhalb der DNA-Sequenz angezeigt. Sie wird an vier Stellen durch Introns unterbrochen.
• Figur 7 zeigt den Aufbau der Plasmide pBG311.hmis und pBG312.hmis, die verwendet werden können, um die menschliche DNA-Sequenz der Erfindung zu exprimieren.
• Figur 8 zeigt den Aufbau des Plasmids pD1, das die cDNA in voller Länger enthält und das verwendet werden kann, um die menschliche DNA-Sequenz der Erfindung zu exprimieren.
• Damit die hier beschriebene Erfindung vollständiger verstanden werden kann, wird die folgende, genaue Beschreibung vorgestellt.
• In der Beschreibung werden die folgenden Ausdrücke verwendet:
Nucleotid
• - Eine monomere Einheit von DNA oder RNA aus einem Zuckerrest (Pentose), einem Phosphat und einer stickstoffhaltigen heterozyklischen Base. Die Base ist mit dem Zuckerrest über den glykosidischen Kohlenstoff (1' Kohlenstoff der Pentose) verbunden und die Kombination von Base und Zucker wird eine Nucleosid genannt. Die Base charakterisiert das Nucleotid. Die vier DNA-Basen sind Adenin ("A"), Guanin ("G"), Cytosin ("C") und Thymin ("T"). Die vier RNA-Basen sind A, G, C und Uracil ("U").
DNA-Sequenz
• - Eine lineare Anordnung von Nucleotiden, die miteinander über Phosphodiesterbindungen zwischen den 3' und 5' Kohlenstoffatomen benachbarter Pentosen verbunden sind.
Codon
• - Eine DNA-Sequenz von drei Nucleotiden (ein Triplet) das durch mRNA eine Aminosäure kodiert, ein Translationsstartsignal oder ein Translationsterminierungssignal. Zum Beispiel kodieren die Nucleotid-Triplets TTA, TTG, CTT, CTC, CTA und CTG die Aminosäure Leucin ("Leu"), TAG, TAA und TGA sind Translationsstoppsignale und ATG ist ein Translationsstartsignal.
Ableserahmen
• - Die Anordnung von Codons während der Translation von mRNA in Aminosäuresequenzen. Während der Translation muß der geeignete Ableserahmen beibehalten werden. Zum Beispiel kann die DNA-Sequenz GCTGGTTGTAAG über drei Ableserahmen oder Phasen exprimiert werden, von denen jede eine unterschiedliche Aminosäurensequenz liefert:
Polypeptide
• - Eine lineare Anordnung von Aminosäuren, die miteinander über Peptidbindungen zwischen den α-Amino- und Carboxygruppen benachbarter Aminosäuren verbunden sind.
Genom
• - Die gesamte DNA einer Zelle oder eines Virus. Es beinhaltet unter anderem das Strukturgen, das die Polypeptide der Substanz kodiert, als auch Operator, Promotor und Ribosom- Binde- und Interaktionssequenzen einschließlich der Sequenzen wie die Shine-Dalgarno-Sequenzen.
Gen
• - Eine DNA-Sequenz, die durch ihr Template oder Messenger RNA ("mRNA") eine Sequenz von Aminosäuren, die für ein spezifisches Polypeptid charakteristisch sind, kodiert.
Transkription
• - Das Verfahren zum Herstellen von mRNA aus einem Gen oder einer DNA-Sequenz.
Translation
• - Das Verfahren zum Herstellen eines Polypeptids aus mRNA.
Expression
• - Das Verfahren, das von einem Gen oder einer DNA-Sequenz durchlaufen wird, um ein Polypeptid herzustellen. Es ist eine Kombination von Transkription und Translation.
cDNA-Klon
• - Ein Klon mit einem DNA-Einschub, der aus mRNA synthetisiert wurde, und keine Introns enthält. Der Vektor kann ein Plasmid oder ein Phage sein.
Genomischer Klon
• - Ein Klon mit einem DNA-Einschub, der ein Fragment eines Genoms ist (i.e., isoliert aus der Gesamtzell- DNA). Es kann Introns enthalten, die den das Protein kodierenden Bereich des Gens unterbrechen. Der Vektor kann ein Plasmid, ein Phage oder ein Cosmid sein.
Exon
• - Teile des Gens, die nach der Transkription in der mRNA nach dem Spleißen der Precursor-RNA zurückgehalten werden.
Introns
• - Teile des Gens, die nach der Transkription herausgeschnitten werden.
Plasmid
• - Eine nicht chromosomale doppelkettige DNA-Sequenz aus einem intakten "Replikon", so daß das Plasmid in einer Wirtszelle repliziert wird. Wenn das Plasmid in einen einzelligen Organismus gegeben wird, können die Charakteristika dieses Organismus verändert werden oder transformiert werden als ein Ergebnis der DNA des Plasmids. Zum Beispiel transformiert ein Plasmid, das das Gen für die Tetracyclinresistenz (TET ) trägt, eine Zelle, die zuvor gegenüber Tetracyclin sensitiv war, in eine, die diesem gegenüber resistent ist. Eine durch ein Plasmid transformierte Zelle wird als ein "Transformant" bezeichnet.
Phage oder Bakteriophage
• - Bakterieller Virus, von denen viele aus DNA-Sequenzen bestehen, die in einer Proteinhülle oder -Beschichtung ("Capsid") eingekapselt sind.
Cosmid
• - Ein Plasmid mit der cohäsiven Endstelle ("cos") des Bakteriophagen λ. Cosmide können aufgrund des Vorhandenseins der cos-Stelle in ein λ-Hüllprotein verpackt werden und verwendet werden, einen geeigneten Wirt zu infizieren. Aufgrund ihrer Kapazltät für große Fragmente fremder DNA sind Cosmide als Klon-Träger verwendbar.
Klon-Träger
• - Ein Plasmid, Phagen-DNA, Cosmid oder andere DNA-Sequenz, die in der Lage ist, in einer Wirtszelle zu replizieren, gekennzeichnet durch eine oder eine kleine Anzahl von Endonuclease-Erkennungsstellen, an denen solche DNA- Sequenzen in einer vorhersehbaren Weise ohne den begleitenden Verlust einer essentiellen biologischen Funktion der DNA, e.g., Replikation, Herstellung von Hüllproteinen oder den Verlust von Promotor oder Bindestellen, geschnitten werden können, und die einen Marker enthalten, der für die Identifikation der transformierten Zellen geeignet ist, e.g., Tetracyclinresistenz oder Ampicillinresistenz. Ein Klonträger wird oft als ein Vektor bezeichnet.
Klonen
• - Das Verfahren, eine Population eines Organismus oder DNA-Sequenzen, die sich von einem solchem Organismus oder einer Sequenz durch asexuelle Reproduktion ableiten, zu erhalten.
Rekombinantes DNA-Molekül oder Hybrid-DNA
• - Ein Molekül bestehend aus DNA-Segmenten von unterschiedlichen Genomen, die miteinander end-to-end außerhalb der lebenden Zellen verbunden wurden, und in der Lage sind, in lebenden Zellen erhalten zu werden.
Expressions-Kontroll-Sequenz
• - Eine Sequenz von Nucleotiden, die die Expression von Genen kontrolliert und reguliert, wenn sie operativ mit solchen Genen verbunden sind. Sie beinhalten das Lac-System, daß β-Lactamase-System, das trp- System, die tac-und trc-Systeme, die Hauptoperator- und Promotorbereiche des Phagen λ, den Kontrollbereich des fd- Hüllprotein, die frühen und späten Promotoren von SV40, Promotoren, abgeleitet vom Polyomavirus und Adenovirus, Metallothioninpromotoren, der Promotor für 3- Phosphoglyceratkinase oder andere glycolytische Enzyme, die Promotoren von saurer Phosphotase, e.g., Pho5, die Promotoren der Hefe-α-Reifefaktoren, und andere Sequenzen, die bekannt sind, daß sie die Expression von Genen von prokaryotischen oder eukaryotischen Zellen kontrollieren, und deren Viren oder Kombinationen davon. Für Krebszellen kann das Gen verbunden sein mit einem eurkaryotischen Promotor wie dem für den frühen SV40-Bereich, gekoppelt an das Gen, das für Dihydrofolatreductase kodiert, und selektiv verstärkt in Ovarialzellen vom chinesischen Hamster, um eine Zellinie zu produzieren, die viele Kopien aktiv transcribierter eukaryotischer Gene enthält.
MIS-artiges Polypeptid
• - Ein Polypeptid, das eine biologische oder immunologische Aktivität eines MIS-Proteins zeigt. So wie er hier verwendet wird, soll der Ausdruck "biologische Aktivität eines MIS-Proteins" so verstanden werden, daß er bedeutet, daß das MIS-artige Polypeptid einen Querschnitt biologischer Aktivität besitzt, der dem von natürlichem MIS- Protein im wesentlichen ähnlich ist (e.g., es ist in der Lage, die Regression der Müller'schen Gänge zu stimulieren oder ist gegenüber ein oder mehreren Arten der Ovarialtumorzellen, zum Beispiel der Zellinie HOC-21, cytotoxisch, und bevorzugt stimuliert es sowohl die Regression der Müller'schen Gänge und ist auch gegenüber einer oder mehreren Arten der Ovarial- Tumorzellen cytotoxisch). So wie er hier verwendet wird, soll der Ausdruck "immunologische Aktivität eines MIS-Proteins" so verstanden werden, daß es die Fähigkeit eines MIS-artigen Polypeptids bedeutet, mit einem Antikörper eine Kreuzreaktion zu zeigen, der für ein natürliches MIS-Protein spezifisch ist. Ein Beispiel eines solchen Antikörpers wird in dem U.S. Patent 4,487,833 offenbart. Ein MIS-artiges Polypeptid kann Aminosäuren zusätzlich zu denen eines natürlichen MIS-Proteins enthalten, oder es braucht nicht alle der Aminosäuren des natürlichen MIS-Proteins beinhalten. Zum Beispiel kann es ein N-terminales Methionin enthalten. Auch kann dieses Polypeptid ein reifes Protein oder ein unreifes Protein oder ein Protein, abgeleitet von einem unreifen Protein (zum Beispiel, ein Protein, wo nur ein Teil der Signalsequenz gespaltet worden ist) sein. Beispiele solcher Polypeptide sind Derivate von MIS- Polypeptiden, die durch Modifikation der MIS-Aminosäurensequenz hergestellt wurden, um eine Verbesserung in den Eigenschaften zu erzielen, e.g., größere Lagerstabilität oder gesteigerte Halbwärtszeit in vivo. So wie er hier verwendet wird, soll der Ausdruck "MIS-artige Polypeptide, abgeleitet davon" so verstanden werden, daß er nicht nur ein beanspruchtes MIS- Polypeptid (e.g., Rinder-MIS oder menschliches MIS) bedeutet, sondern auch verschiedene verwandte Polypeptide der Arten, die in diesem Paragraph beschrieben werden.
• Die vorliegende Erfindung betrifft DNA-Sequenzen und rekombinante DNA-Moleküle, die MIS-Polypeptide kodieren, und Verfahren zur Herstellung dieser Polypeptide.
• Bei unserer Isolierung und dem Klonieren einer DNA-Sequenz der Erfindung haben wir eine Auswahlstrategie, basierend auf Rinder-MIS-Protein, angewandt. Entsprechend reinigten wir ein Rinder-MIS-Protein aus Rindertestes und bestimmten die Aminosäurensequenz verschiedener Fragmente dieses Proteins. Basierend auf diesen Proteinsequenzen synthetisierten wir dann einige gegensinnige Oligonucleotid-DNA-Proben, die den Bereichen von gereinigtem Rinderprotein entsprachen, die eine minimale Nucleotiddegeneration zeigten. Wir verwendeten dann diese Proben, um eine Rinder-cDNA-Bibliothek aus E. coli- Zellen, die cDNA-Sequenzen aus Rindertestes, eingeschoben in einen Phagen-Klonvektor, enthielten.
• Zum Screenen hybridisierten wir die Oligonucleotidproben an die Rinder-cDNA-Bibliothek unter Verwendung eines Plaque- Hybridisations-Screening-Assays, und wir selektierten die Klone, die mit einer Anzahl unserer Proben hybridisierten. Nach dem Isolieren und Subklonen der ausgewählten Rinder-cDNA- Einschübe in Plasmide bestimmten wir deren Nucleotidsequenzen und verglichen sie mit unserem Aminosäuresequenzen aus den Peptiden des gereinigten Rinder-MIS-Proteins. Als ein Ergebnis dieses Vergleiches fanden wir, daß die Nucleotidsequenzen aller isolierten Klone, die Aminosäurensequenzen von Rinder-MIS- Protein kodierten.
• Wir verwandten den Einschub eines Rinder-MIS-cDNA-Klons (pS21), um das menschliche MIS-Gen aus einer menschlichen Cosmid-Bibliothek und einen partiellen cDNA-Klon aus einer menschlichen cDNA-Bibliothek zu isolieren. Wir stellten die menschliche cDNA-Bibliothek aus Gesamt-RNA her, die von menschlichen neugeborenen Testis extrahiert wurden.
• Die cDNA-Sequenzen oder genomischen DNA-Sequenzen dieser Erfindung können mit Expressionskontrollsequenzen operativ verbunden werden und in verschiedenen Krebs- oder anderen eurkaryotischen oder prokaryotischen Wirtszellen verwendet werden, um die MIS-artigen Polypeptide herzustellen, die sie kodieren. Zusätzlich sind die cDNA-Sequenzen oder genomischen DNA-Sequenzen der Erfindung als Proben verwendbar, um menschliche cDNA-Bibliotheken in bezug auf andere Sequenzen zu screenen, die MIS-artige Polypeptide kodieren.
• Die menschliche genomische DNA-Sequenz, die oben beschrieben wurde, besitzt einige Introns. DNA-Sequenzen und rekombinante DNA-Moleküle, in denen ein oder mehrere oder alle dieser Introns zerstört wurden, werden auch als innerhalb des Rahmens der vorliegenden Erfindung liegend betrachtet.
• Die Rinder- und menschlichen MIS-artigen Polypeptide (und vorzugsweise die menschlichen MIS-artigen Polypeptide) dieser Erfindung sind als Arzneimittel gegen Krebs verwendbar. Zum Beispiel können solche Zusammensetzungen eine gegen Krebs wirksame Menge eines MIS-artigen Polypeptids dieser Erfindung und einen pharmazeutisch annehmbaren Träger enthalten. Solche Therapien umfassen im allgemeinen ein Verfahren zur Behandlung von Patienten auf eine pharmazeutisch annehmbare Weise mit diesen Zusammensetzungen.
• Im allgemeinen können die pharmazeutischen Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung formuliert und verabreicht werden, wobei man Verfahren verwendet, die denen ähnlich sind, die für andere pharmazeutisch wichtige Polypeptide (e.g. Alpha-Interferon) verwendet werden. Entsprechend können die Polypeptide in lyophilisierter Form gelagert werden, mit sterilem Wasser direkt vor der Verabreichung rekonstituiert werden und intravenös verabreicht werden. Vorzugsweise werden die pharmazeutischen Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung in Dosierungen und Verabreichungsarten verabreicht, die denen ähnlich sind, die für das MIS-Protein verwendet worden sind, so wie es in U.S. Patent 4,510,131 offenbart wurde, dessen Offenbarung unter Bezugnahme darauf hier eingeschlossen wird.
• Eine breite Vielzahl von Wirt/Klon-Träger-Kombinationen kann beim Klonen oder Exprimieren der MIS-artigen Polypeptid- DNA-Sequenzen, die in Übereinstimmung mit dieser Erfindung hergestellt werden, verwendet werden. Zum Beispiel können verwendbare Klon- oder Expressionsträger aus Segmenten von chromosomalen, nicht chromosomalen und synthetischen DNA- Sequenzen wie verschiedenen bekannten Derivaten von SV40 und anderen bakteriellen Plasmiden, e.g. Plasmiden von E.coli einschließlich col E1, pCR1, pBR322, pMB9 und deren Derivate, Plasmiden mit einem breiteren Wirtsbereich, e.g., RP4, Phagen- DNAs, e.g., den zahllosen Derivaten von Phagen λ, e.g., NM 989, und anderen DNA-Phagen, e.g. M13 und filamentösen, einzelsträngigen DNA-Phagen und Vektoren, abgeleitet von Kombinationen von Plasmiden und Phagen-DNAs wie Plasmiden, die modifiziert worden sind, um Phagen-DNA zu verwenden, oder anderen Expressionskontrollsequenzen oder Hefeplasmiden wie das 2u Plasmid oder Derivaten davon bestehen. Für das Klonen von cDNA ist der bevorzugte Expressionsvekor λgt10, und der bevorzugte Wirt ist E.coli BNN102. Für die Tierzellenexpression sind die bevorzugten Expressionsvektoren pBG311 und pBG312 bei Ovarialzellen vom chinesischen Hamster (CHO).
• Innerhalb jedes spezifischen Klon- oder Expressionsträgers können verschiedene Stellen für den Einschub der MTS-artigen Polypeptid-DNA-Sequenzen der Erfindung ausgewählt werden. Diese Stellen werden üblicherweise durch die Restriktionsendonuklease bestimmt, die diese schneidet, und sie sind den Fachleuten gut bekannt. Verschiedene Verfahren zum Einschub von DNA-Sequenzen in diese Stellen, um rekombinante DNA-Moleküle zu bilden, sind ebenso gut bekannt. Diese beinhalten zum Beispiel dG-dC- oder dA-dT-Tailing, eine direkte Verbindung, synthetische Linker, Exonuklease und Polymerase verbundene Reparaturreaktionen, gefolgt von der Bindung, oder Ausdehnung des DNA-Strangs mit DNA-Polymerase und einem entsprechenden einzelsträngigen Template gefolgt von der Bindung. Es soll natürlich selbstverständlich sein, daß ein Klon- oder Expressionsträger, das bei dieser Erfindung verwendbar ist, nicht notwendigerweise eine Restriktionsendonukleasestelle für den Einschub des gewählten DNA-Fragmentes besitzen muß. Anstelle dessen könnte der Träger über andere Mittel mit dem Fragment verbunden werden.
• Verschiedene Expressionskontrollsequenzen können auch ausgewählt werden, um die Expression der DNA-Sequenzen der Erfindung zu bewirken. Diese Expressionskontrollsequenzen beinhalten zum Beispiel das Lac-System, das β-Lactamase-System, das trp-System, das tac-System, das trc-System, die Hauptoperator- und Promotorbereiche vom Phagen λ, die Kontrollbereiche vom fd-Hüllprotein, den Promotor für 3- Phosphoglyceratkinase oder andere glycolytische Enzyme, die Promotoren von saurer Phosphatase, e.g., Pho5, die Promotoren der Hefe-α-Reifefaktoren, Promotoren für Säugetierzellen wie den frühen SV40-Promotor, den späten Adenovirus-Promotor und Metallothioninpromotor, und andere Sequenzen, die dafür bekannt sind, daß sie die Expression von Genen der prokaryotischen oder eukaryotischen Zellen oder deren Viren steuern, und verschiedene Kombinationen davon. Bei Säugetierzellen ist es zusätzlich möglich, die Expressionseinheiten dadurch zu verstärken, daß man das Gen an das für die Hydropholatreduktase koppelt, und eine Selektion für Wirtsovarialzellen vom chinesischen Hamster anwendet.
• Für die Expression der DNA-Sequenzen dieser Erfindung werden die DNA-Sequenzen operativ an eine oder mehrere der oben beschriebenen Expressionskontrollsequenzen im Expressionsvektor gebunden. Eine solche operative Bindung, die bewirkt werden kann, bevor oder nachdem die gewählte MIS-artige Polypeptid- DNA-Sequenz in einen Klonvektor eingeschoben wurde, ermöglicht den Expressionskontrollsequenzen, die Expression der DNA- Sequenz zu kontrollieren und zu promoten.
• Der Vektor oder Expressionsträger und besonders die Stellen, die darin für den Einschub des ausgewählten DNA- Fragmentes und der Expressionskontrollsequenz, die in dieser Erfindung verwendet wird, ausgewählt wurden, wird über eine Vielzahl von Faktoren bestimmt, e.g., die Anzahl von Stellen, die gegenüber einem besonderen Restriktionsenzym empfänglich sind, die Größe des zu exprimierenden Proteins, die Expressionscharakteristika wie die Anordnung von Start- und Stop-Codons in bezug auf die Vektorsequenzen, und andere Faktoren, die von den Fachleuten erkannt werden. Die Wahl eines Vektors, einer Expressionskontrollsequenz und der Einschubstelle für eine besondere MIS-artige Polypeptidsequenz wird über eine Balance dieser Faktoren bestimmt, wobei nicht alle Auswahlmöglichkeiten für einen gegebenen Fall gleich effektiv sind.
• Es sollte auch selbstverständlich sein, daß die DNA- Sequenzen, die die MIS-artigen Polypeptide der Erfindung kodieren, die an der ausgewählten Stelle eines Klon- oder Expressionsträgers eingeschoben werden, Nucleotide einschließen können, die kein Teil des tatsächlichen Gens sind, die das MIS- artige Polypeptid kodieren, oder ein Fragment des gesamten Gens für dieses Polypeptid enthalten können. Es ist nur erforderlich, daß, welche DNA-Sequenz auch immer verwendet wird, ein transformierter Wirt ein MIS-artiges Polypeptid herstellt. Zum Beispiel können die MIS-artigen Polypeptidverwandten DNA-Sequenzen der Erfindung im gleichen Ableserahmen in einem Expressionsvektor der Erfindung an wenigstens einen Teil einer DNA-Sequenz, die wenigstens ein eukaryotisches oder prokaryotisches Trägerprotein kodiert, oder eine DNA-Sequenz, die wenigstens eine eukaryotische oder prokaryotische Signalsequenz kodiert, oder Kombinationen davon gebunden werden. Solche Konstruktionen können bei der Expression der gewünschten, dem MIS-artigen Polypeptid verwandten DNA-Sequenz helfen, die Reinigung verbessern oder die Sekretion und vorzugsweise Reifung des MIS-artigen Polypeptids aus der Wirtszelle erlauben. Die dem MIS-artigen Polypeptid verwandte DNA-Sequenz kann alternativ ein ATG-Startcodon, allein oder zusammen mit anderen Codons, enthalten, direkt gebunden an die Sequenz, die die erste Aminosäure eines reifen nativen MIS- artigen Polypeptids kodiert. Solche Konstruktionen ermöglichen die Produktion von zum Beispiel einem Methionyl oder anderem Peptidyl-MIS-artigen Polypeptid, was Teil dieser Erfindung ist. Dieses N-terminale Methionin oder Peptid kann entweder dann intra- oder extrazellulär über eine Vielzahl von bekannten Verfahren abgespalten werden, oder das MIS-artige Polypeptid mit dem daran gebundenen Methionin oder Peptid kann in den pharmazeutischen Zusammensetzungen und Verfahren dieser Erfindung ungespalten verwendet werden.
• Der Klonträger oder Expressionsvektor mit den MIS-artigen Polypeptid-Kodiersequenzen der Erfindung wird in Übereinstimmung mit dieser Erfindung verwendet, um einen geeigneten Wirt so zu transformieren, daß dem Wirt ermöglicht wird, die MIS-artigen Polypeptide zu exprimieren, die die DNA- Sequenz kodiert.
• Verwendbare Klon- oder Expressionswerte können Stämme von E.coli wie E.coli C600, E.coli ED8767, E.coli DH1, E.coli LE392, E.coli HB 101, E.coli X1776, E.coli X2282, E.coli MRCI, E.coli BNN102, E.coli JM83, E.coli JA221, und Stämme von Pseudomonas, Bacillus, und Streptomyces, Hefen und andere Pilze, tierische Wirte wie CHO-Zellen, COS-Zellen oder Mäusezellen, andere tierische (einschließlich menschlicher) Wirte, Pflanzenzellen in Kultur und andere Wirte einschließen.
• Die Auswahl eines geeigneten Wirts wird auch über eine Vielzahl von Faktoren gesteuert, die im Stand der Technik bekannt sind. Diese schließen zum Beispiel die Kompatibilität mit dem ausgewählten Vektor, die Toxizität der durch das Hybridplasmid kodierten Proteine, die Empfänglichkeit des gewünschten Proteins gegenüber proteolytischem Abbau durch Wirtszellenenzyme, Kontamination oder Binden des zu exprimierenden Proteins durch Wirtszellproteine, die während der Reinigung schwierig zu entfernen sind, die Einfachheit der Gewinnung des gewünschten Proteins, die Expressionscharakteristika, die Bio-Sicherheit und die Kosten. Eine Balance dieser Faktoren muß mit dem Verständnis gewählt werden, daß nicht alle Wirt-Vektor-Kombinationen für entweder das Klonen oder die Expression eines besonderen rekombinanten DNA- Moleküls gleich wirksam sind.
• Es sollte selbstverständlich sein, daß die MIS-artigen Polypeptide (hergestellt in Übereinstimmung mit dieser Erfindung in diesen Wirten) Polypeptide in Form von gebundenen Proteinen (e.g., gebunden an ein prokaryotisches, eukaryotisches oder in Kombination N-terminales Segment für die direkte Ausscheidung, um die Stabilität zu verbessern, um die Reinigung zu verbessern oder um die mögliche Spaltung des N- terminalen Segmentes zu verbessern), in Form eines Precursors von MIS-artigen Polypeptiden (e.g., ausgehend von dem Gesamten oder Teilen einer MIS-artigen Polypeptidsignalsequenz oder einer anderen eukaryotischen oder prokaryotischen Signalsequenz), in der Form eines reifen MIS-artigen Polypeptids, oder in der Form eines fmet-MIS-artigen Polypeptids. Wie oben herausgestelltl soll der Ausdruck "MIS- artige Polypeptide, die davon abgeleitet sind", so wie er hier verwendet wird, so verstanden werden, daß er solche MIS-artigen Polypeptide einschließt.
• Eine besonders nützliche Form eines Polypeptids in Übereinstimmung mit der Erfindung oder wenigstens eines Vorläufers davon ist ein reifes MIS-artiges Polypeptid mit einer leicht spaltbaren Aminosäure oder Reihe von Aminosäuren, die an das Aminoende gebunden sind. Solche Konstruktion erlaubt die Synthese des Polypeptids in einem geeigneten Wirt, wo ein Startsignal, das nicht in dem reifen Polypeptid vorhanden zu sein braucht, erforderlich ist, und dann Spaltung in vivo oder in vitro der zusätzlichen Aminosäuren, um reife MIS-artige Polypeptide herzustellen. Solche Verfahren sind im Stand der Technik vorhanden. Siehe e.g. United States Patente 4.332.892, 4.338.397 und 4.425.437. Die Polypeptide können auch glycolysiert sein wie natürliches MIS-Protein, unglycolysiert oder ein Glycolysierungsmuster haben, das sich von dem von natürlichem MIS-Protein unterscheidet. Solche Glycolysierung wird von der Wahl der Wirtszelle oder der Post-Expressions- Behandlung abhängen, die für das besondere MIS-artige Polypeptid ausgewählt wurde.
• Die Polypeptide der Erfindung beinhalten auch MIS-artige Polypeptide, die bei Expression durch DNA-Sequenzen kodiert werden, die durch unterschiedlihe Codons für einige oder alle Codons der vorliegenden DNA-Sequenzen charakterisiert sind. Diese substituierten Codons können Aminosäuren kodieren, die denen identisch sind, die durch die ersetzten Codons kodiert werden, jedoch zu höherer Ausbeute des Polypeptides führen. Alternativ kann der Ersatz eines oder einer Kombination von Codons, was zu dem Aminosäurenersatz oder zu einem längeren oder kürzeren MIS-artigen Polypeptid führt, dessen Eigenschaften in einer nützlichen Weise verändern (e.g. Steigern der Stabilität, Steigern der Löslichkeit oder Steigern der therapeutischen Aktivität).
• Damit die Erfindung besser verstanden werden wird, werden die folgenden Beispiele angegeben. Diese Beispiele dienen nur für Zwecke der Veranschaulichung und sind nicht so gemeint, daß sie den Rahmen der Erfindung in irgendeiner Weise einschränken.
BEISPIELE BEISPIEL 1 SEQUENZIEREN VON RINDER-MIS-PROTEIN
• Wir isolierten Rinder-MIS-Protein aus Testis von neugeborenen Rindern über das Verfahren von Budzik et al. (Cell 34, 307-414 (1983)). Nachdem wir es aus der Matrix Gel Green A Säule mit 0,5M NaCl eluiert hatten, konzentrierten wir die Rinder-MIS-Fraktion (Green-3) und dialysierten gegen PES und 0,01% Nonidet-P40 und lagerten bei -70º.
• Analytisches Reduzieren von SDS-PAGE indizierte, daß MIS (Green-3 Fraktion) zwei Hauptpolypeptide von 74 Kd und 70 Kd und einige kleinere Komponenten einschließlich Spezies nahe 140 und 95 Kd enthielt. Wir erhielten hochgereinigte Proben der 74 und 70 Kd Spezies durch Kombination einer semi-prep SDS-PAGE gefolgt von Elektroelution. Jedes davon wurde der N-terminalen Analyse unterzogen. Sowohl das 70 Kd als auch das 74 Kd Polypeptid besaß das gleiche N-Ende (ArgGluGluValpheSer).
• Wir spalteten separat annähernd 1 Nanomol jeweils des reduzierten und carboxymethylierten 74 kKd und 70 Kd MIS- Polypeptids mit TPCK-Trypsin. Nach der Carboxymethylierung resuspendierten wir die gereinigten Polypeptide in 0,1M NH&sub4;HCO&sub3; plus 0,1mM CaCl&sub2;, und inkubierten dann mit TPCK-Trypsin bei 37º C über 16 Stunden. Während dieser Inkubation gaben wir dreimal Trypsin bis auf eine Endkonzentration von 2,0% Gesamtprotein zur Zeit Null, 4,0% nach 4 Stunden und 6,0% nach 12 Stunden hinzu.
• Wir trennten die Spaltungsfragmente aus diesen Spaltungen durch Hochdruckflüssigkeitschromatographie unter Verwendung eines Gradienten von Acetonitril von 0,75% in 0,1% Trifluoressigsäure auf, um die Peptide, die an eine C-18-Säule gebunden waren, zu eluieren. Die zwei tryptischen Karten waren sehr ähnlich, was die gleiche Primärstruktur anzeigte und nahelegte, daß das 70 Kd Polypeptid sich vom 74 Kd Polypeptid ableitet. Daher kombinierten wir ausgewählte erhaltene Peaks von jeder Spaltung und unterwarfen sie der Sequenzanalyse unter Verwendung eines Gasphasensequenzers (Applied Biosystems 470A). Wir analysierten PTH-Aminosäuren durch Hochdruckflüssigkeitschromatographie auf einer 5 um Cyanosäule (Hypersil) unter Verwendung eines Gradienten von Acetonitril:Methanol (4:1) von 15-55% in 0,02M Natriumacetat (pH 5,7).
• Die tryptische Spaltung ergab über 20 Peaks. Sechs davon führten zu Proteinsequenzen. Die Sequenz eines tryptischen Peptids, #T105-106, ist in Figur 1 gezeigt.
• Die analytische Spaltungen von ¹²&sup5;J-markierten 24 Kd und 70 Kd MIS durch Trypsin or S. aureus V8 Protease zeigten, daß die meisten der gebildeten Peptide größer als 10 Kd waren und in geringer Ausbeute über HPLC auf einer C18-Säule gewonnen wurden. Unter Verwendung von sowohl SDS-Harnstoff PAGE und HPLC-Analyse beobachteten wir wiederum, daß erhaltene Spaltungsprodukte zwischen 70 Kd und 74 Kd MIS auftraten, was bestätigte, daß die zwei Polypeptide verwandt waren.
• Um das Ausmaß der Spaltung durch TPCK-Trypsin bei basischem pH zu steigern, succinilierten wir ein Nmol von MIS vor der Spaltung und trennten die erhaltenen Peptide auf einer C8-Säule (90% Ausbeute). Wir erhielten sechs weitere Peptidsequenzen im Bereich von 5 bis 16 Resten; zwei davon bestätigten die zuvor erhaltenen Sequenzen. Die Sequenz des tryptischen Peptids #T81 wird in Figur 1 gezeigt.
• Wir verbesserten weiter die Effizienz der Spaltung von MIS durch TPCK-Trypsin durch Zugabe von 2M Harnstoff zur Spaltung. Unter Verwendung der auf diese Weise hergestellten Peptide erhielten wir elf zusätzliche Peptidsequenzen. Insgesamt erhielten wir 23 Peptidsequenzen, von denen zwei in Figur 1 gezeigt sind.
BEISPIEL 2 SYNTHESE VON OLIGONUCLEOTID-DNA-PROBEN
• Nachdem die Aminosäuresequenzen verschiedener Bereiche des Rinder-MIS-Proteins bestimmt worden waren (siehe Figur 1), synthetisierten wir chemisch zwei Pools von gegensinnigen Oligonucleotid-DNA-Proben, die einige dieser Proteinsequenzen kodierten (Siehe Figur 2). Wir synthetisierten die zwei Pools (1-4 und 9-12), die in Figur gezeigt sind, da sie Bereichen des MIS-Proteins entsprechen, die minimale Nucleinsäuren der Generation besitzen. Für jede Aminosäurensequenz synthetisierten wir Mischungen von Proben, die allen möglichen Codons komplementär sind. Die Proben waren den DNA-Sequenzen komplementär, die die Aminosäuresequenz kodieren, i.e., die Proben waren gegensinnig, um zu ermöglichen, daß die Proben die entsprechenden Sequenzen in mRNA als auch in DNA erkennen. Die Aminosäurensequenzen der zwei ausgewählten Bereiche des MIS- Proteins und aller möglichen Nucleotidcodonkombinationen, die sie kodieren, sind in Figur 2 gezeigt. Codedegenerierungen werden wie folgt angegeben: N = C, T, A oder G; R = A oder G; Y = C oder T; und H = A, C oder T.
• Die zwei Pools der Proben, abgeleitet von den den Sequenzen in den tryptischen Fragmenten T105-106 und T81 aus Figur 1 waren 17-Mere mit 256facher Degenerierung oder 20-Mere mit 512facher Degenerierung. Wir synthetisierten jeden Pool dadurch in Gruppen von vier, daß man bei einem degenerierten Codon in der Mitte der Probe splittete. Entsprechend stellten wir das 256fach degenerierte 17-Mer von TIOS-106 in vier Unterpools [1- 4] von 64 und das 512fache degenerierte 20-Mer von TB1 in vier Pools [9-12] von 128 her. Dies erlaubte uns, die Degenerierung dadurch zu reduzieren, daß man sie individuell auf Northern- Blots verwendete, um den Unterpool zu unterscheiden, der die richtige Sequenz enthielt (siehe unten). Wir synthetisierten die Proben auf einem Applied Biosystems 380A DNA-Synthesizer und reinigten sie durch Gelelektrophorese. Wir markierten die Proben unter Verwendung von [γ-32P]-ATP und Polynucleotidkinase (Maxam und Gilbert, Proc. Natl. Acad. Sci. 74 560 (1977)).
• Wir verwendeten die Northern-Analyse, um die Degenerierung der zwei Probenbereiche 1-4 und 9-12 zu reduzieren. Wir hybridisierten die Proben individuell an Nothern-Blots mit RNA von zwei Wochen alten und drei Monate alten Rindertestis und der Niere vom erwachsenen Rind. Da nur zwei Wochen alte Rindertestis biologisch aktives MIS enthielten, erwarteten wir, daß die Northern-Analyse unterscheiden würde, welche Probe innerhalb einer Gruppe die richtige MIS-Sequenz enthielt. Die weniger degenerierte Probe würde dann verwendet werden, um die cDNA-Bibliothek zu screenen. Nothern-Blots mit MIS-Proben 1-4 legten nahe, daß Probe 2 die richtige Oligomersequenz enthielt, während Nothern-Blots mit MIS-Proben 9-12 anzeigten, daß Probe 12 die richtige Oligomersequenz enthielt. In beiden Fällen wurde ein 2.000-Nucleotid-Transkript in der RNA von zwei Wochen alten Rindertestis und nicht in den anderen RNAs beobachtet. Wir teilten Unterpool 2 in vier Unterpools (13-16) mit 16facher Degenerierung, während Probe 12 in vier Unterpools (17-20) mit 32facher Degenerierung unterteilt wurde. Northern-Analyse mit diesen Proben bestätigte, daß die korrekten Auswahlen getroffen worden waren, da ein Subpool aus dem Probenbereich 1-4 (16) und ein Unterpool von Probenbereich 9-12 (18) beide zu einem 2.000 Nucleotidtranscript in der zwei Wochen alten Rindertestis-RNA hybridisierten. Das Transkript war nicht bei den drei Monate alten Rindertestis oder -Nieren vorhanden.
BEISPIEL 3 KONSTRUKTION UND SCREENING VON EINER RINDERTESTIS-cDNA- Bibliothek
• Wir konstruierten eine Rinder-cDNA-Bibliothek von Poly A&spplus; mRNA, isoliert aus Rindertestis. Wir insertierten die cDNA- Sequenzen in λgt10 und verstärkten die Sequenzen in E.coli BNN 102 Zellen.
A. Extraktion von RNA aus Rindertestis
• Wir erhielten Testis von zwei Wochen alten Kälbern direkt nach der Schlachtung. Wir entfernten die seminiferen Tubuli von der Tunica Albuginea und froren sie schnell in flüssigem Stickstoff ein. Wir pulversierten etwa 10g des gefrorenen Gewebes und homogenisierten das erhaltene Material in 100 ml Extraktionspuffer (4M Guanidinthiocyanat, 0,5% SDS, 25mM Natriumcitrat, 0,1% Sigma Antischaum) unter Verwendung eines Polytrons für 2 Minuten bei hoher Geschwindigkeit. Wir zentrifugierten das Homogenat für 20 Minuten bei 8.000 UpM in einer Sorvall RC2B-Zentrifuge bei 4ºC. Wir erhielten 75 ml des Überstandes und schichteten diesen auf 30 ml (3 Röhrchen mit jeweils 10 ml) einer CsCl-Lösung (5,7M CsCl, 25mM NaOAc pH 5,0, 1mM EDTA) und zentrifugierten diesen dann in einem SW28-Rotor bei 22.000 UpM über 16 Stunden. Wir resuspendierten die Pellets in 10 ml 10um Tris-HCL (pH 7,4) 1mM EDTA und 0,1% SDS. Wir fällten dann mit Ethanol die Nucleinsäuren in 0,3M Natriumacetat bei -20ºC über Nacht aus und überführten sie dann in ein Pellet bei 14K UpM in einer Sorvall RC2B-Zentrifuge (SS34-Rotor) bei 4ºC über 20 Minuten. Wir resuspendierten die Pellets in 5 ml 0,3M Natriumacetat und fällten die Nucleinsäuren wiederum mit Ethanol wie oben beschrieben aus. Wir resuspendierten das Endpellet in 300 ul H&sub2;O und lagerten es bei -20ºC. Wir reicherten diese RNA-Zubereitung in bezug auf Poly(A) RNA durch Durchlauf über eine Oligo(dT)-Zellulose- Säule (PL Biochem) an.
B. Konstruktion einer cDNA-Bibliothek aus zwei Wochen alten Rindertestis Poly A&spplus;mRNA in λGT10 1. cDNA-Synthese
• Wir synthetisierten cDNA aus 25 ug poly A&spplus; mRNA, die aus zwei Wochen alten Rindertestis wie oben beschrieben isoliert worden war. Wir verdünnten die mRNA auf 500 ug/ml in H&sub2;O und denaturierten durch Behandlung mit Methyl-Quecksilberhydroxid (CH&sub3;HgOH). Wir gaben dann 1M CH&sub3;HgOH (Alfa Venetron) auf 50mM hinzu. 5 ul 50mM CH&sub3;HgOH wurde dann auf 25 ug mRNA in 50 ul H&sub2;O hinzugegeben und über 10 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Wir beendeten die Reaktion durch Zugabe von 10 ul 1,4M β- Mercaptoethanol.
• Wir fügten dann denaturierte mRNA-Mischung zu einer Reaktionsmischung aus 0,1M Tris-HCl (pH 8,3) bei 42ºC, 0,01M MgCl&sub2;, 0,01M DTT, 1mM dATP, 0,5mM dCTP und 50 uCi³H-dCTP (25,7 Ci/mmol, New England Nuclear), 1mM dGTP, 1mM dTTP, 2,5mM Vanadyl Ribonucleosidkomplex (Bethesda Research Labs), 20 ug Oligo dT 12-18 (PL Biochem) und 196 U AMV Reverse Transcriptase (Seikagaku America). Das Endvolumen der Reaktionsmischung betrug 200 ul. Wir inkubierten die Mischung für 3 Minuten bei Raumtemperatur und 3 Stunden bei 44ºC und beendeten dann die Reaktion durch Zugabe von 1/20 Vol. 0,5M Na&sub2;EDTA (pH 80).
• Wir extrahierten dann die Reaktionsmischung mit einer Mischung von TE-gesättigten Phenol und Chloroform (50:50). (TE- Puffer ist 10mM Tris-HCl, pH 7,0 1 mM Na&sub2;-EDTA). Wir extrahierten dann die organische Phase mit TE-Puffer zurück, und wir chromotographierten die vereinigten wäßrigen Phasen durch eine 5 ml Sterilpipette mit einem 7x29 cm Bett Sephadex G150 in 0,01M Tris HCl (pH 7,4), 0,1M NaCl, 0,01M Na&sub2;EDTA, 0,05% SDS. Wir zählten ein Aliquot jeder Fraktion in einem LKB Flüssigscintillationszähler. Wir sammelten den Frontpeak minus dem Schwanz, und wir fällten die cDNA mit 2,5 Vol. 95% Ethanol bei -20ºC aus. Die Ausbeute an cDNA, wie sie als cDNA-mRNA Hybrid erhalten wurde, betrug 8,1 ug.
2. Doppelstrangsynthese
• Wir resuspendierten die cDNA in H&sub2;O, und wir setzten doppelte Doppelstrangreaktionen an, wobei jede 4 ug cDNA enthielt. Jede 400 ul Reaktion enthielt 0,02M Tris-HCl PH 7,5, 0,2M KCl, 0,005M MgCl&sub2;, 0,5mM dATP + 100 uCi α-dATP³² (3.000 Ci/mmol, New England Nuclear), 1mM dCTP, 1mM dGTP, 1mM dTTP, 100 u DNA Pol 1 Klenow Faktion (Boehringer Mannheim), und 4 U RNase H (P.L. Biochem). Wir inkubierten die Reaktion über 1 Stunde bei 12ºC, 1,5 Stunden bei Raumtemperatur und beendeten die Reaktion durch Zugabe von 1/20 Vol. 0,5M Na&sub2;EDTA pH 8,0. Wir extrahierten dann die Reaktionsmischungen mit Phenol: Chloroform wie in dem cDNA-Syntheseschritt, beschrieben in dem vorangegangenen Abschnitt, und fällten das extrahierte Material durch Zugabe von 0,2 Vol. 10M Ammoniumacetat und 2,5 Vol. 95% Ethanol bei -70ºC über 20 Minuten. Wir wärmten die erhaltenen Mischungen auf Raumtemperatur auf und zentrifugierten über 15 Minuten in einer Eppendorf-Zentrifuge, um die doppelsträngige cDNA als Pellet auszufällen. Wir resuspendierten die Pellets in TE-Puffer und wiederholten die Ausfällung mit Ammoniumacetat (2M Endkonzentration) und Ethanol zweimal.
• Wir trockneten die Pellets in einem Schnellverdampfer und resuspendierten diese dann in 100 ul TE-Puffer. Wir fügten dann 25 ug gekochte RNase A (Sigma) hinzu, inkubierten die Mischung bei 37ºC über 30 Minuten, extrahierten mit Phenol: Chloroform und chromotographierten durch Sephadex G150, wie oben für den cDNA-Syntheseschritt beschrieben.
• Um stumpfe Enden sicherzustellen, resuspendierten wir die doppelsträngige cDNA in H&sub2;O und fügten sie zu einer Reaktionsmischung hinzu, die 0,033 M Trisacetat pH 7,8, 0,066M Kaliumacetat, 0,01M Mg Acetat, 0,17mM DTT, 88 ug BSA, 0,25mM dATP, dCTP, dGTP, dTTP, und 18 U T&sub4; DNA Polymerase (New England Biolabs) enthielt. Das Endvolumen der Reaktion betrug 300 ul. Wir inkubierten die Reaktion über 1 Stunde bei 37ºC und extrahierten dann und fällten mit 2M Ammoniumacetat und 2,5 Vol. 95% Ethanol zweimal aus, so wie oben beschrieben für den zweiten Strangsyntheseschritt.
• Wir verbanden 2 ug der stumpfendigen cDNA mit einem einzigen Oligomerlinker, gebildet durch Anknüpfen von Linker 27, ein 22-Mer mit der Sequenz 5' AATTGAGCT CGA GCG CGG CCG C an 5, phosphorylierten Linker 28, ein 18-Mer mit der Sequenz 5' GCXG GCC GCG CTC GAG CTC 3'f. Der verbundene Linker enthielt ein phosphoryliertes stumpfes Ende für die Bindung an stumpfendige cDNA und eine nicht phosphorylierte 5, abstehende Sequenz (AATT) für die Bindung an EcoR1 gespaltenes λgt10. Der Linker enthielt Erkennungssequenzen für die folgenden Restriktionsenzyme: Alul, Aval, Ban2, Bsp12, Fnu4H, FnuD2, Hal3, Hgi Al, Hhal, HinP1, Notl, Sstl, XhoI, Xma3.
• Wir verbanden dann 2 ug des Linkers 27-28 mit 2 ug cDNA in 0,05M Tris-HCl pH 7,8, 0,01M MgCl&sub2;, 0,03M NaCl, 1mM Spermidin, 0,2mM Na&sub2;EDTA, 2mM DTT, 100 ug/ml BSA, 0,4mM ATP, und 1.000 U T&sub4; DNA Ligase (New England Biolabs) in 26 ul Endvolumen bei 4ºC über 24 Stunden. Um überschüssigen Linker zu entfernen und die cDNA größenmäßig aufzutrennen, extrahierten wir die Verbindungsreaktion mit einer Mischung von TE-gesättigten Phenol und Chloroform. Wir reextrahierten die organische Schicht mit TEN-Puffer (0,01M Tris-HCl pH 7,5, 0,1M Nacl, und 1mM Na&sub2;EDTA) und die kombinierten wässrigen Phasen wurden auf einer 1x30 cm Biogel A50 (BioRad)-Säule chromotographiert, die zuvor mit TEN-Puffer equilibriert worden war. Wir ließen aliquote Teile der Säulenfraktionen auf ein 1% Agarosegel in TBE-Puffer (0,089 M Tris-HCl, 0,089M Borsäure und 2,5mM Na&sub2;EDTA) fließen, und wir trockneten das Gel und belichteten den Kodak XAR-5 Film bei 70ºC. Wir sammelten Fraktionen, die cDNA größer als 500 Bp enthielten, und fällten sie mit Ethanol aus. Die Ausbeute der größenfraktionierten doppelsträngigen cDNA betrug 900 ng.
3. Bibliothek-Aufbau
• Wir mischten 6 ug EcoR1 geschnittenen λ-gt10 mit 250 ng cDNA in 0,05M Tris-HCl pH 7,8, 0,01M MgCl&sub2;, 0,03M NaCl, 1mM Spermidin, 0,2 mM Na&sub2;EDTA, 2mM DTT, und 100 ug/ml BSA in 31.2 ul. Wir erhitzten diese Komponenten auf 70ºC über 3 Minuten, 45ºC für 15 Minuten, kühlten auf Eis und zentrifugierten sie dann über 5 Sekunden in einer Eppendorf-Zentrifuge. Wir stellten die Reaktionsmischung auf 0,25mM ATP und 2.000 U T&sub4;- DNA-Ligase (NEB) ein, und inkubierten dann bei 15ºC über 16 Stunden. Wir packten 3,4 ul aliquote Teile der Verbindung in Phagenteilchen unter Verwendung einer Amersham Packmischung, entsprechend dem Protokoll, das von Amersham geliefert wird, und verwendeten die gepackte DNA, um E.coli BNN102 Zellen zu infizieren. Die Beschichtung der Bibliothek ergab 5,4x10&sup6; unabhängige Plaques, die wir verstärkten und mit CsCl-Banden färbten. 41% der Plaques hatten Einschübe, die eine Bibliothek- Komplexizität von 2,2x10&sup6; Rekombinanten angab. Der Titer des CsCI-Banden gefärbten Phagen betrug 1,6x10¹³ PFU/ml.
C. Screening der Bibliothek
• Wir screenten die Bibliothek mit der markierten Oligonucleotidprobe 16 in bezug auf Nucleotidsequenzen, die MIS-Proteinsequenzen kodieren, wobei die Plaque-Hybridisations- Screening-Technik von Benton und Davis (Science, 196, 180 (1977)) verwendet wurde.
• Wir pelletisierten eine Übernachtkultur von BNN102-Zellen in L-Brühe und 0,2% Maltose und resuspendierten diese in einem gleichen Volumen von SM-Puffer (50mM Tris-HCl, pH 7,5, 100mM NaCl, 10mM MgSO&sub4;, und 0,01% Gelatine). Danach adsorbierten wir 0,3 ml Zellen mit 5x10&sup4; Phagenteilchen bei Raumtemperatur über 15 Minuten vor. Wir verdünnten die Suspension dann auf 8 ml in LB plus 10mM MgSO&sub4; und 0,7% Agarose bei 55ºC und beschichteten sie dann auf LB Mg Platten. Wir stellten dreißig solcher Platten her und inkubierten die Platten dann bei 37ºC für annähernd 8 Stunden, bis sich die Plaques fast berührten. Wir kühlten die Platten dann auf 4ºC über 1 Stunde ab, um die Agarose härten zu lassen.
• Wir gaben dann über 5 Minuten Nitrozellulosefilter auf die Platten, die die rekombinanten Plaques enthielten, und wir hoben die Filter dann ab und lysierten sie dadurch, daß wir sie auf einen Pool aus 0,5N NaOH/1,5M NaCl über 5 Minuten gaben und sie dann für 5 Minuten in dem gleichen Puffer untertauchten. Wir neutralisierten die Filter dann dadurch, daß wir sie in 0,5 Tris-HCl (pH 7,4), 1,5M NaCl, zweimal für jeweils 5 Minuten untertauchten. Wir spülten sie dann für 2 Minuten in 1M NH&sub4;OAc, trockneten sie an der Luft und erhitzten sie über 2 Stunden bei 80ºC.
• Wir hybridisierten vor und hybridisierten die Filter mit der Oligonucleotidprobe 16 in 0,2% Polyvinylpyrrolidon, 0,2% Ficoll (MW 400.000), 0,2% Rinderserumalbumin, 0,05M Tris-Hcl (pH 7,5), 1M Natriumchlorid, 0,1% Natriumpyrophosphat, 1% SDS, 10% Dextransulfat (MW 5000.000) und 100 ug/ml tRNA. Wir wiesen hybridisierende λ-cDNA-Sequenzen durch Autoradiographie nach. Mittels dieser Technik entnahmen wir und screenten 19 positive Plaques bei einer gringeren Dichte unter Verwendung der gleichen Probe erneut.
• Wir isolierten die DNA dieser Klone, spalteten Sie mit XhoI und hybridisierten sie mit Oligomerproben 16 und 18 unter Verwendung der Southern Blot-Technik (E. M. Southern, J. Mol. Biol., 98, pp. 503-18 (1975)). Neun dieser Klone enthielten eingeschobene cDNA, die nicht nur mit Probe 16, die das tryptische Peptid T105-106 kodiert, sondern auch mit Probe 18, die das tryptische Peptid T81 kodiert, hybridisierte.
• Wir spalteten die DNA von Klon λ8.21 mit Sacl, isolierten den 2.000 Bp-Einschub und subklonten das Fragment in pUC18, um rekombinantes Plamid pS21 herzustellen. Wir entfernten ebenfalls den Einschub von Klon λ8.21 unter Verwendung von XhoI und subklonten diesen in pUC18, um ein rekombinantes Plasmid pX21 herzustellen. Wir sequenzierten dieses Plasmid mit der Methode von Maxam und Gilbert (Proc. Natl. Acad. Sci., 74, 560 (1977)). Diese Analyse zeigte, daß das Klon pS21 Nucleotidsequenzen enthielt, die den Aminosäuresequenzen des Rinder-MIS-Proteins entsprachen. Innerhalb der 2.000 Basenpaare dieses Einschubs befanden sich DNA-Sequenzen, die alle 23 Peptide kodieren, die sequentiert worden sind einschließlich des reifen N-Endes (i.e., Arg Glu Glu Val Phe Ser). Der Klon enthielt 30 Basenpaare einer Sequenz aufwärts, die 10 Aminosäuren kodierte, was vermutlich eine Führungssequenz darstellt.
• Um zu bestätigen, daß die DNA-Sequenz für das gesamte Reifeprotein erhalten worden war, isolierten wir das genomische Klon für Rinder-MIS (cbmislo) aus einer Cosmid-Bibliothek und sequenzierten das 5'-Ende mit dem Verfahren von Church and Gilbert (Proc. Natl. Acad. Sci., 81, 1991-95 (1984)). Dieses lieferte die Sequenz aufwärts des 5'-Endes des Einschubes in Klon pS21. Ein ATG wurde im gleichen Ableserahmen lokalisiert wie bei der reifen Proteinsequenz, 72 Bp aufwärts des Arg- Restes an dem reifen N-Terminus. Diese 72 Bp kodieren einen 24 Aminosäurenführungsabschnitt. Die ersten 16 oder 17 Aminosäuren dieses Führungsabschnittes scheinen eine Signalsequenz darzustellen, die dem Protein ermöglicht, ausgeschieden zu werden (abgeleitet von der Von Heijne Analyse, Eur. J. Biochem., 133, 17-21 (1983)). Die übrigen 7 oder 8 Aminosäuren werden danach abgespalten, um das reife Protein zu bilden. (Es ist nicht klar, ob diese Spaltung notwendig ist, um das Protein zu aktivieren). Eine Promotorsequenz TATA ist aufwärts von dem initiierenden Methionin (34 Bp) gelegen, was nahelegt, daß der nicht übertragene 5'-Bereich sehr kurz ist. Wir bestätigten dieses durch das folgende Primerextensionsexperiment, das zeigte, daß die RNA-Initiation etwa 10 Nucleotide aufwärts des initiierenden ATG beginnt. Ein gegensinniges Oligomer (5'- A*GTCCCAGGCTTGCTGAAAGATGALLLLLLGTGCCC 3') wurde an Poly A&spplus; RNA aus Rindertestis hybridisiert und mit reverser Transkriptase verlängert. Das Primerextensionsprodukt wurde auf einem sequenzierenden Gel auf 166-167 Nucleotide geschätzt. Dieses setzte das 5'-Ende der mRNA 10 oder 11 Nucleotide aufwärts des initiierenden ATGs. Diese Analyse bewies, daß wir das gesamte Gen für Rinder-MIS isoliert hatten, das ein 58 Kd-Protein kodiert. Die DNA-Sequenz ist in Figur 3 gezeigt. Die ersten 100 Bp enthalten den Promotor und den nicht übertragenen 5'- Bereich. Dieser wird gefolgt von 1.875 Bp, die das Rinder-MIS- Protein kodieren, und von 81 Bp einer nicht übertragenen 3'- Sequenz.
BEISPIEL 4 ISOLATION DES MENSCHLICHEN GENOMISCHEN KLONS
• Unter Verwendung des Rinder cDNA-Klons pS21 isolierten wir das menschliche Klon (chmis33) aus einer menschlichen Cosmid- Bibliothek. Wir sequenzierten das gesamte Gen, das in fünf Exons enthalten ist, die eine Distanz von 2,8 kb überspannen. Figur 5 zeigt die generelle Struktur des menschlichen Gens, während Figur 6 die Nucleotidsequenz zeigt. In Figur 6 enthalten die ersten 100 Bp den menschlichen Promotor und die nicht übertragene 5'-Region. Das wird gefolgt von 2622 Bp, die die 5 das Protein kodierenden Bereiche enthalten, die unten als die DNA-Sequenz angegeben werden. Die letzten 112 Bp sind der nicht übertragene 3'-Bereich.
BEISPIEL 5 KONSTRUKTION EINER MENSCHLICHEN cDNA VOLLER LÄNGE
• Wir konstruierten eine menschliche cDNA in voller Länge in pBG312 (pD1) über eine Vierwegeverbindung, wie sie in Figur 8 gezeigt ist, mit den folgenden Fragmenten: 1) 271 Bp Stul-MstII Fragment von pGAPl.6; 2; 2) 232 Bp MstII - XhoI Fragment von pMIS D/F; 3) 1299 Bp XhoI - StuI Fragment von pBG312.hmis; und 4) das 6251 Bp StuI Fragment von pBG312.hmis. Die Konstruktion des pBG312.hmis wird in Beispiel 7 beschrieben. Die Konstruktion von pGAP1.6 und pMIS D/F werden unten beschrieben.
• Wir bildeten Plasmid pGAP1.6, dem das erste Intron durch Sprungmutagenese fehlt. Das 1.600 Bp PvuII Fragment aus chmis 33 (Fig. 5) wurde in den SmaI-Platz von pUC18 subkloniert, um pUC18.PV2 zu erzeugen. Dieses Plasmid wurde mit SspI linearisisert, denaturiert und dann mit denaturiertem pUC18.PV2, gespalten mit StuI und MstII, verbunden. Dieses erlaubte die Bildung von Hybridduplices zwischen dem gespaltenen SspI und dem mit StuI und MstII gespaltenen puC18.PV2. Wir verbanden dann ein Oligomer mit der Sequenz aus dem 3'-Ende von Exon 1 und dem 5'-Ende von Exon 2 (i.e., unter Auslassen des ersten Intron) mit den Hybridduplices. Wir verwendeten ein großes Fragment der DNA-Polymerase I, um den zweiten Strang zu synthetisieren. Wir transformierten dann E. Coli und gescreente Kolonien mit dem ³²P-markierten Oligomer. Wir identifizierten einen positiven Klon, pGAP1.6 und sequenzierten diesen, um sicherzustellen, daß das erste Intron zerstört worden war. Wir isolierten das 271 Bp StuI-MstII- Fragment für die Vierwegebindung (Fig. 8).
• Die Konstruktion von pMIS D/F, bei dem die Introns 2, 3 und 4 zerstört sind, beinhaltete zwei Schritte. Im ersten Schritt isolierten wir einen Lambda-Klon λMIS21 aus einer λgt10 cDNA- Bibliothek, hergestellt aus RNA, die aus COS-Zellen isoliert worden war, die mit pBG312.hmis transfiziert worden waren (siehe Beispiel 7). Wir sequenzierten diesen Einschub dieses Klons und stellten fest, daß die Introns 3 und 4 fehlten. Im zweiten Schritt isolierten wir das 269 Bp AvaI - XhoI-Fragment von λMIS21, das sich von Exon 3 bis zum 5'-Ende von Exon 5 erstreckt, und verbanden es mit einem Linker und dem XhoI - HindIII-Fragment von Vektor pCHSA35 (unten beschrieben). Der Linker wurde durch Synthetisieren von zwei Oligomeren mit 63 Nucleotiden mit der DNA-Sequenz von der MstII-Stelle in Exon 2 zu der AvaI-Stelle in Exon 3, wobei Intron 2 fehlte, hergestellt. Zusätzlich enthielt der Linker die DNA-Sequenz, die eine HindIII-Stelle am 5'-Ende (benachbart der MstII- Stelle) kodiert. Die Dreiwegeverbindung ergab Plasmid pMID D/F, bei dem Introns 2, 3 und 4 fehlten. Das 323 Bp MstII - XhoI Fragment wurde dann für die Vierwegeverbindung isoliert (Fig. 8).
• pcHSA35 ist ein Plasmid, das aus Plasmid pcHSA36 konstruiert wurde. pcHSA36 wurde in der Kultursammlung der American Type Culture Collection in Rockville, Maryland, am 9. Dezember 1982 hinterlegt und ist dort als HSA-B identifiziert und es wurde ATCC Zugangsnummer 39253 zugeordnet. pcHSA36 wurde mit Restriktionsenzym BstEII bis zur Vervollständigung gespalten, mit der Exonuklease Bal31 stumpfendig abgeschnitten, gefolgt von der Spaltung mit dem Restriktionsenzym BamHI und die Sticky Ends stumpf mit dem großen Fragment der DNA- Polymerase I stumpfendig abgeschnitten. Das erhaltene lineare Plasmid wurde durch Ligation kreisförmig geschlossen, und ein Plasmid mit einer einzelnen XhoI-Stelle wurde isoliert und als pcHSA35 bezeichnet.
BEISPIEL 6 EXPRESSION DES RINDERGENS
• Wir kombinierten Sequenzen aus dem Rinder-cDNA-Klon (px21) mit Sequenzen aus dem rindergenomischen Cosmidklon (cbmis.15) im tierischen Zellexpressionsvektor pBG311, um das gesamte Rinderprotein in COS-Zellen und CHO-Zellen zu exprimieren (Figur 4). Die Expression kann dadurch nachgewiesen werden, daß man RNA durch Northern und S1-Analyse analysiert. Auch kann Rinder-MIS durch einen RIA und durch den Organkulturansatz nachgewiesen werden. E.coli-Stamm JM83, der das Plasmid pBG311.bmis beherbergte, ist bei der In Vitro International Inc. Hinterlegungsstelle als Hinterlegungsnummer IVI 10090 hinterlegt worden. Hinterlegungsnummer IVI 10090 wurde in die American Type Culture Collection ("ATCC") am 20. Juni 1991 überführt und ist bei der ATCC unter der Zugangsnummer ATCC 68814 hinterlegt.
BEISPIEL 7 EXPRESSION DES MENSCHLICHEN GENS IN TIERISCHEN ZELLEN
• Um das menschliche MIS-Gen in tierischen Zellen zu exprimieren, schoben wir das 4,5 kb AflII-Fragment aus chmis33 in die tierischen Zellexpressionsvektoren pBG311 und pBG312, beschrieben von Cate et al. (Cell, 45, 685-698 (1986)), um pBG311.hmis und pBG312.hmis jeweils herzustellen (Fig. 7) pBG311 verwendet den frühen SV40-Promotor, während pBG312 den späten Adenovirus-2 Hauptpromotor verwendet, um die Expression anzutreiben. Wir führten diese Konstruktionen in COS-Zellen (fehlerhafte SV40 transformierte Simianzellen; Gluzman, Cell, 23, 175-152 (1981)) für vorübergehende Expression und später in Ovarialzellen vom chinesischen Hamster (CHO) (Chasin und Urlaub, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77, 4216-4220 (1980)) für die stabile Expression über.
• Wir transfizierten COS-Zellen mit pBG312.hmis unter Verwendung des DEAE/Dextran-Verfahrens von Sompayrac und Danna (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78 7575-7578 (1981)). Wir verwendeten eine S1-Analyse, um zu zeigen, daß das menschliche MIS-Gen transcribiert wird und daß die RNA gespliced wird. Wir verwendeten dann einen Organkulturansatz (Donahoe et al., J. Surg. Res., 23, 141-148 (1977)), um zu demonstrieren, daß mit dem menschlichen MIS-Gen transfizierte COS-Zellen biologisch aktives MIS ausscheiden. Konditionierte Medien aus mit pBG312.hmis transfizierten COS-Zellen erzeugten eine Regression der Müller'schen Gänge der dritten Stufe bei diesem Test, während die Kontrollmedien und die konditionierten Medien aus COS-Zellen, die mit der menschlichen Gewebeplasminogenaktivator cDNA transfiziert worden waren, keine Regression verursachten. Das zeigte, daß mit menschlichem MIS-Gen transfizierte COS- Zellen biologisch aktives MIS ausscheiden, das die Rückbildung der Müller'schen Gänge in vitro bei der Ratte verursacht.
• Um das menschliche MIS-Gen in CHO-Zellen zu exprimieren, führten wir das Plasmid pBG311.hmis und das Plasmid pSV2DHFR (Subramani et al., Mol. Cell Biol., 1, 854-864 (1981)) in CHO- Zellen ein, denen die Hydrofolatreduktase fehlte, wobei man das Verfahren von Scahill et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80, 4654-4658 (1983) verwendete. Wir wählten fünfundzwanzig Klone aus, die in einem Medium ohne Nucleoside wuchsen, und expandierten sie auf T75-Kolben. Wir isolierten die gesamte RNA aus diesen Klonen und analysierten sie in bezug auf das Verhandensein von menschlicher MIS-mRNA über einen SI-Assay; zehn dieser Klone enthielten menschliche MIS-mRNA. Wir testeten dann das konditionierte Medium aus eine Zellinie, die positiv in bezug auf MIS-mRNA war, 311-22, im Organkulturassay; es produzierte eine Regression der Müller'schen Gänge der Stufe 3- 4 im Organkulturansatz, während das konditionierte Medium aus einer Kontrollzellinie G2 keine Regression verursachte.
• Wir reinigten teilweise das menschliche rekombinante MIS aus dem konditionierten Medium der Zellinie 311-22, wobei man die Linsen-Lectin-Chromatographie verwendete, und analysierten auf Western-Blots mit zwei unterschiedlichen Antikörpern (Towbin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76, 4350 (1979)). Es ergab sich ein Antikörper gegen denaturiertes Rinder-MIS, während ein anderer gegen ein Peptid menschlichen MIS hervorstach. In beiden Fällen kannten die Antikörper ein Protein in dem konditionierten Medium von 311-22 mit einem Molekulargewicht von annähernd 70.000. Es gab kein nachweisbares Protein im konditionierten Medium der Kontroll- CHO-Zellinie G2. Dieses zeigte, daß das menschliche MIS, hergestellt in den CHO-Zellen, im gleichen oder annähernd gleichen Ausmaß wie Rinder-MIS, das von neugeborenen Testis isoliert wurd, glykolysiert ist. Wir haben auch in CHO-Zellen produziertes MIS dadurch markiert, daß man die Zellen über 24 Stunden in Gegenwart von [³H]-Glucosamin züchtete. Die Glykoproteine wurden dann ansatzweise aus dem konditionierten Medium mit Linsen-Lectin-Sepharose gereinigt, und MIS wurde mit dem gegen denaturiertes Rinder-MIS gerichteten Antikörper immunopräzipitiert.
• Wir haben die Identität und Struktur von rekombinanten MIS bestätigt. Wir konzentrierten konditioniertes serumfreies Medium aus Klon 311-2A9B7 (verstärkt in 30 nM Methotrexat) durch Ultrafiltration und extrahierten die Glykoproteine mit Linsen-Lectin. Eine 70 kd Bande wurde anhand von Coomassie- Feckenfärbung nach SDS-PAGE nachgewiesen, die nicht im konditionierten Medium einer Zellinie vorhanden war, das als Negativkontrolle diente. Wir führten eine 2-D Gelelektrophorese durch (nichtreduzierend-reduzierend), die zeigte, daß das menschliche rekombinante MIS ein reduzierbares Disulfiddimer ist. CNBr-Mapping des Proteins ergab ein Muster von Fragmenten, das mit der bekannten Methioninverteilung von MIS übereinstimmte. Wir reinigten teilweise 20 ug der 70 kd Bande aus 400 ml konditioniertem serumfreien Medium durch eine Kombination von Linsen-Lectin und Gelfiltrationschromatographie. Wir elektroeluierten das Protein auf einem präparativen SDS-Gel und führten eine Proteinmikrosequenzanalyse durch. Das Aminoende des rekombinanten Proteins ist L R A E E, was zeigt, daß menschliches MIS richtig von den CHO- Zellen hergestellt wird. Der Grad der Expression von MIS in den CHO-Zellinien kann durch Methotrexat-angeregte Genverstärkung gesteigert werden, sowie beschrieben von Kaufman and Sharp (J. Mol. Biol., 159, 601-621 (1982)).
• E.coli-Stamm JA221, der das Plasmid pBG312.hmis beherbergte, ist bei der In Vitro Internationl Inc. Hinterlegungsstelle als Hinterlegungsnummer IVI 10089 hinterlegt worden. Die Hinterlegungsnummer IVI 10089 wurde an die ATCC am 20. Juni 1991 überführt und ist bei der ATCC unter der Zugangsnummer 68813 hinterlegt.
BEISPIEL 8 EXPRESSION DER MENSCHLICHEN cDNA
• Das Plasmid pD1, beschrieben in Beispiel 5 enthält die cDNA-Sequenz in voller Länge in dem tierischen Expressionsvektor pBG312. Plasmid pD1 kann in COS-Zellen unter Verwendung des DEAE/Dextranprotokolls von Sompayrac und Dann eingeführt werden (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78, 7575-7578 (1981)), um menschliches MIS zu zu produzieren. Die gesamte menschliche cDNA-Sequenz kann vom Plasmid pD1 unter Verwendung von Af1II entfernt werden und in die Sma1-Stelle von pBG311 eingeschoben werden, um die menschliche cDNA in CHO-Zellen zu exprimieren.
• Der Einschub von pD1, der den menschlichen cDNA-Einschub in voller Länge enthält, kann entfernt werden und in E. coli und Hefevektoren eingeschoben werden, was die Expression von menschlichem MIS in E. coli und Hefe erlaubt. Diese Konstruktionen können DNA-Sequenzen enthalten, die das gesamte menschliche MIS-Protein kodieren, oder DNA-Sequenzen, die das reife menschliche MIS-Protein kodieren.
• Während wir hiervor eine Anzahl von Ausführungsformen der Erfindung beschrieben haben, ist es offensichtlich, daß unsere grundsätzlichen Konstruktionen verändert werden können, um anderen Ausführungsformen bereitzustellen, die die Verfahren und Zusammensetzungen der Erfindung verwenden. Daher wird es eingeschätzt, daß der Rahmen der Erfindung eher durch die hier beigefügten Ansprüche als durch die spezifischen Ausführungsformen, die hiervor beispielhaft präsentiert worden sind, definiert werden soll.

Claims (19)

1. Eine DNS-Sequenz, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus den DNS-Sequenzen mit der Formel:

2. Ein rekornbinantes DNS-Molekül, umfassend eine DNS- Sequenz, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus

(a) den DNS-Sequenzen von Anspruch 1;

(b) DNS-Sequenzen, die zu einer der DNS-Sequenzen von (a) hybridisieren und die Expression für Human-MIS oder Rinder-MIS codieren; und

(c) DNS-Sequenzen, die als Ergebnis des genetischen Codes zu den oben definierten DNS-Sequenzen degeneriert sind und die Expression für Human-MIS oder Rinder-MIS codieren.

3. Das rekombinante DNS-Molekul nach Anspruch 2, wobei die DNS-Sequenz operativ mit einer Expressionskontrollsequenz in dem rekombinanten DNS-Molekül verbunden ist.

4. Das rekombinante DNS-Molekül nach Anspruch 3, wobei die Expressionskontrollsequenzaus der Gruppe ausgewählt wird, die besteht aus den frühen und den späten Promotoren von SV40, dem lac System, dem tac System, dem trc System, dem trp System, Adenovirus-Hauptspätpromotor, Hauptoperator und Promoter- Bereichen des Phagen λ, den Kontrollbereichen des fd Hüllproteins, dem Promoter für 3-Phosphoglyceratkinase oder anderen proteolytischen Enzymen, den Promotoren saurer Phosphatase, den Promotoren Hefe-α-Paarungsfaktoren und anderen Sequenzen, die die Expression von Genen von prokaryotischen oder eukaryotischen Zellen oder deren Viren kontrollieren.

5. Das rekombinante DNS-Molekül nach Anspruch 3, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus pBG311.bmis (IVI 10090, ATCC 68814), pBG312.hmis (IVI 10089, ATCC 68813) und pBG311.hmis, das durch Einfügen des 4.5kb Af1II Fragmentes von dem Smal-Ort des pBG312.hmis in den Smal-Ort des pBG311 gebildet werden kann.

6. Ein Wirt, transformiert mit dem rekombinanten DNS- Molekül von Anspruch 2.

7. Ein Wirt, transformiert mit dem rekombinanten DNS- Molekül von Anspruch 3.

8. Ein Wirt, transformiert mit dem rekombinanten DNS- Molekül von Anspruch 4.

9. Ein Wirt, transformiert mit dem rekombinanten DNS- Molekül von Anspruch 5.

10. Ein Wirt, transformiert mit dem rekombinanten DNS- Molekül von Anspruch 2, wobei der Wirt ausgewählt wird aus der Gruppe bestehend aus Stämmen von E. coli, Pseudomonas, Bacillus, Hefen, COS-Zellen, CHO-Zellen oder anderen Pilz-, Maus, Schwein oder anderen Tier- oder Pflanzenwirten und Human- Gewebezellen.

11. Ein Verfahren zum Herstellen eines MIS-artigen Polypeptides, wobei das Verfahren den Schritt vom Kultivieren eines Wirtes, transformiert mit einem rekombinanten DNS-Molekül nach Anspruch 3, umfasst.

12. Das Verfahren nach Anspruch 11, wobei das rekombinante DNS-Molekül aus der Gruppe ausgewählt wird, bestehend aus pBG311.bmis (IVI 10090, ATCC 68814), pBG312.hmis (IVI 10089, ATCC 68813) und pBG311.hmis, das durch Einfügen des 4.5kb Af1II Fragmentes von dem Smal-Ort des pBG312.hmis in den Smal-Ort des pBG311 gebildet werden kann.

13. Das Verfahren nach Anspruch 11, wobei der Wirt Stämme von E. coli, Pseudomonas, Bacillus, Heaen oder anderen Pilzen, Maus, Schwein, COS-Zellen, CHO-Zellen oder anderen Tier- oder Pflanzenwirten und menschlichen Gewebezellen umfaßt.

14. Ein rekombinantes MIS-artiges Human-Polypeptid ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus

und Fragmenten davon, die die biologische und immunologische Aktivität eines MIS-Proteins zeigen.

15. Ein rekombinantes MIS-artiges Rinder-Polypeptid, im wesentlichen frei von Verunreinigungen von Rinderproteinen und ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus

und Fragmenten davon, die die biologische und immunologische Aktivität eines MIS-Proteins zeigen.

16. Ein synthetisches oder semisynthetisches Polypeptid, umfassend die Aminosäuresequenz eines der MIS-artigen Polypeptide nach Anspruch 14 oder 15.

17. Eine pharmazeutische Zusammensetzung zur Behandlung von empfänglichen Krebsarten, wobei die Zusammensetzung eine gegen Krebs wirksame Menge wenigstens eines MIS-artigen Polypeptides nach Anspruch 14 oder 15 und einen pharmazeutisch annehmbaren Träger umfaßt.

18. Eine pharmazeutische Zusammensetzung zur Behandlung von empfänglichen Krebsarten, wobei die Zusammensetzung eine gegen Krebs wirksame Menge wenigstens eines MIS-artigen Polypeptides nach Anspruch 16 und einen pharmazeutisch annehmbaren Träger umfaßt.

19. Die Verwendung einer gegen Krebs wirksamen Menge einer pharmazeutischen Zusammensetzung nach Anspruch 17 oder 18 zur Herstellung eines pharmazeutisch annehmbaren Medikamentes, das bei der Behandlung von empfänglichen Krebsarten wirksam ist.