DE3238554C2

DE3238554C2 -

Info

Publication number: DE3238554C2
Application number: DE3238554A
Authority: DE
Inventors: David V. Hillsborough Calif. Us Goeddel; Patrick W. San Francisco Calif. Us Gray
Original assignee: Genentech Inc
Current assignee: Genentech Inc
Priority date: 1981-10-19
Filing date: 1982-10-18
Publication date: 1989-11-23
Also published as: IL66992A0; GB2107718B; BG42527A3; NO1994025I1; DK163187B; JPH07106144B2; RU2092561C1; RO89534A; GT198277746A; CA1341590C; ES8402351A1; PL238671A1; JP2515308B2; CZ282154B6; ATE44289T1; JPS5890514A; ZW22282A1; MX166499B; RU2107728C1; EP0077670B1

Description

Die Erfindung betrifft das in den Ansprüchen 1 bis 5 angegebene Polypeptid mit Human-Immuninterferon (IFN-γ )-Eigenschaften, gemäß Anspruch 6 dessen DNA-Isolat, gemäß Anspruch 7 einen replizierbaren Expressionsträger, gemäß Anspruch 8 das Plasmid p-IFN-γ-trp 48, gemäß Anspruch 9 das Plasmid pSV-γ-69, gemäß Anspruch 10 das Plasmid pPGK-IFN-γ, gemäß den Ansprüchen 11 bis 15 bestimmte Mikroorganismen oder Zellkulturen und gemäß Anspruch 16 ein Verfahren zu dessen Herstellung.

Die Erfindung betrifft das Gebiet der rekombinanten DNA- Technik, Mittel und Verfahren zur Anwendung dieser Technik bei der Ermittlung der DNA-Sequenz und der abgeleiteten Aminosäuresequenz von Human-Immuninterferon sowie dessen Herstellung und verschiedene Produkte dieses Herstellungsverfahrens und die Verwendung dieser Produkte.

Insbesondere betrifft die Erfindung die Isolierung und Identifizierung von Human-Immuninterferon kodierenden DNA-Sequenzen und den Aufbau von rekombinanten DNA-Expressionsträgern, die derartige DNA-Sequenzen, funktionell verknüpft mit expressionsbewirkenden Promotorsequenzen, enthalten. Ferner betrifft die Erfindung Wirtskultursysteme, wie verschiedene Mikroorganismen und Wirbeltier-Zellkulturen, die mit diesen Expressionsträgern transformiert sind und somit auf die Expression der vorgenannten DNA-Sequenzen gerichtet sind. Weiter betrifft die Erfindung Mittel und Verfahren zur Umwandlung der Endprodukte einer derartigen Expression zu neuen Produkten, wie Arzneipräparaten, die sich zur Prophylaxe oder Therapie beim Menschen eignen. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung werden spezielle Expressionsträger zur Verfügung gestellt, deren Sequenz so beschaffen ist, daß von der Wirtszelle Human-Immuninterferon gebildet und in reifer Form ausgeschieden wird. Schließlich betrifft die Erfindung verschiedene Verfahren, die sich zur Herstellung der genannten DNA-Sequenzen, Expressionsträger, Wirtskultursysteme und deren Endprodukten eignen.

Die Erfindung beruht zum Teil auf der Human-Interferon kodierenden DNA-Sequenz und abgeleiteten Aminosäuresequenz. Ferner werden erfindungsgemäß Sequenzinformationen über die 3′- und 5′-flankierenden Sequenzen des Human-Immuninterferon-Gens zur Verfügung gestellt, wodurch dessen in vitro-Verknüpfung an Expressionsträger erleichtert wird. Insbesondere wird das 5′-DNA-Segment, das das mutmaßliche endogene Signalpolypeptid kodiert, welches unmittelbar der Aminosäuresequenz von mutmaßlichem reifem Human-Immuninterferon vorhergeht, bereitgestellt. Diese Befunde ermöglichten wiederum die Entwicklung von Mitteln und Vorrichtungen zur Herstellung von ausreichenden Mengen an Human-Immuninterferon mittels rekombinanter DNA- Technik, so daß die Bestimmung von dessen biochemischen Eigenschaften und biologischen Aktivitäten möglich wird.

Druckschriftliche Veröffentlichungen und andere Materialien, die den technischen Hintergrund der Erfindung erläutern und in speziellen Fällen auch zusätzliche Einzelheiten bezüglich der praktischen Durchführung der Erfindung liefern, sind am Ende der Beschreibung aufgelistet. In der Beschreibung selbst wird auf die Nummern dieser Druckschriftenliste verwiesen.

Nachstehend wird der technologische Hintergrund der Erfindung näher erläutert.

A. Human-Immuninterferon

Human-Interferon können auf der Basis ihrer unterschiedlichen Antigenität sowie ihrer unterschiedlichen biologischen und biochemischen Eigenschaften in 3 Gruppen eingeteilt werden.

Die erste Gruppe umfaßt eine Familie von Leukozyten-Interferonen ( α-Interferon, LeIF oder IFN-α ), die normalerweise vorwiegend von menschlichen Blutzellen nach viraler Induktion gebildet werden. Diese Interferone konnten auf mikrobiologischem Wege hergestellt werden, wobei biologisch aktive Produkte erhalten wurden (1, 2, 3). Aufgrund ihrer biologischen Eigenschaften boten sie sich in der Klinik als therapeutische Wirkstoffe zur Behandlung von viralen Infektionen und malignen Zuständen an (4). Zur zweiten Gruppe gehört Human-Fibroblasteninterferon ( β-Interferon, FIF oder IFN-β ), das normalerweise nach vibraler Induktion durch Fibroblasten gebildet wird. Es wurde ebenfalls auf mikrobiologischem Wege hergestellt und weist verschiedenste biologische Aktivitäten auf (5). Klinische Versuche lassen einen möglichen therapeutischen Wert erkennen. Die Leukozyten- und Fibroblasten-Interferone weisen in ihren biologischen Eigenschaften sehr klare Ähnlichkeiten auf, obwohl der Grad der Homologie in bezug auf die Aminosäuren relativ gering ist. Ferner enthalten beide Gruppen von Interferonen 165 bis 166 Aminosäuren und stellen säurestabile Proteine dar. Das Human-Immuninterferon (IFN-γ oder Human-γ-interferon), das Gegenstand der Erfindung ist, ist im Gegensatz zu den α- und β-Interferonen beim pH-Wert 2 labil, wird vorwiegend nach mitogener Lymphozyteninduktion gebildet und unterscheidet sich auch klar im Hinblick auf die Antigenität. Bis vor kurzem konnte Human-Immuninterferon nur in sehr untergeordneten Mengen nachgewiesen werden, was offensichtlich seine Charakterisierung behinderte. In letzter Zeit wurde über eine recht weitgehende, aber immer noch partielle Reinigung von Human-Immuninterferon berichtet (6). Demnach wird diese Verbindung von durch eine Kombination aus Phytohämagglutin und einen Phorbolester stimulierte Lymphozytenkulturen gebildet und durch sequentielle chromatographische Trennvorgänge gereinigt. Dieses Verfahren führte zu einem Produkt mit einem Molekulargewicht von 58 000.

Human-Immuninterferon wurde in sehr geringen Mengen durch Translation von mRNA in Oozyten gebildet, wobei eine für Human-Immuninterferon charakteristische Interferon-Aktivität gezeigt werden konnte und die Hoffnung genährt wurde, daß Human- Interferon-cDNA zu synthetisieren und zu klonieren ist (7).

Die bisher erhaltene Menge an Immuninterferon ist mit Sicherheit nicht ausreichend, um durch eindeutige Versuche die gereinigte Komponente zu charakterisieren und deren biologische Eigenschaften zu bestimmen. Jedoch lassen in vitro-Untersuchungen an rohen Präparaten sowie in vivo-Experimente mit Mäuse-γ-Interferon-Präparaten darauf schließen, daß es die primäre Aufgabe von Immuninterferon ist, als immunoregulatorisches Agens zu wirken (8, 9). Immuninterferon weist nicht nur wie alle Human-Interferone eine antivirale und antizelluläre Aktivität auf, sondern zeigt auch mit α- und β-Interferon eine potenzierende Wirkung auf diese Aktivitäten (10). Ferner soll die in vitro-antiproliferative Wirkung von γ-Interferon auf Tumorzellen etwa das 10- bis 100fache der Wirkung der anderen Interferonklassen betragen (8, 11, 12). Dieser Befund läßt zusammen mit der ausgeprägten immunoregulatorischen Rolle (8, 9) darauf schließen, daß IFN-γ eine wesentlich stärker ausgeprägte Antitumorwirkung besitzt als IFN-α und IFN-β. Tatsächlich zeigen in vivo-Versuche an Mäusen mit Mäuse-IFN-γ-Präparaten eine klare Überlegenheit im Vergleich zu antiviral induzierten Interferonen in bezug auf die antitumorale Wirkung gegen osteogenes Sarkom (13).

Alle diese Untersuchungen wurden aufgrund der zur Verfügung stehenden, sehr geringen Substanzmengen mit relativ unreinen Präparaten durchgeführt. Jedoch lassen diese Untersuchungen sicher einen Schluß auf die sehr wichtigen biologischen Funktionen von Immuninterferon zu. Immuninterferon besitzt nicht nur eine starke antivirale Wirkung, sondern auch vermutlich eine starke immunoregulatorische und antitumorale Wirkung, wodurch es zu einem vielversprechenden potentiellen Wirkstoff für klinische Zwecke wird.

Man nahm an, daß die Anwendung der rekombinanten DNA-Technik einen sehr wirksamen Weg zur Bereitstellung der erforderlichen größeren Mengen an Human-Immuninterferon darstellt. Unabhängig davon, ob die auf diese Weise hergestellten Materialien die Glycosylierung, die als charakteristisch für natives Material menschlichen Ursprungs gilt, umfaßt oder nicht; ist anzunehmen, daß diese Materialien biologisch aktiv sind und klinisch bei der Behandlung verschiedenster viraler, neoplastischer und immunosuppressiver Zustände oder Krankheiten eingesetzt werden können.

B. Rekombinante DNA-Technik

Die rekombinante DNA-Technik hat in letzter Zeit eine erhebliche Verfeinerung erfahren. Die Molekularbiologen sind in der Lage, verschiedene DNA-Sequenzen relativ leicht zu rekombinieren und neue DNA-Einheiten zu schaffen, die zur Bildung von erheblichen Mengen an exogenen Proteinprodukten in transformierten Mikroben fähig sind. Es stehen allgemeine Mittel und Verfahren zur in vitro-Verknüpfung von verschiedenen DNA-Fragmenten mit stumpfen oder kohäsiven Enden zur Verfügung, die zur Bildung von leistungsfähigen Expressionsträgern führen, mit denen spezielle Organismen transformiert werden können, so daß deren Syntheseleistung auf das gewünschte exogene Produkt gerichtet wird. Bei einzelnen Produkten ist dieses Verfahren jedoch recht umständlich. Die Kenntnisse sind noch nicht so weit fortgeschritten, daß regelmäßig Vorhersagen über die Erfolgsaussichten gemacht werden können. Versucht man, Erfolge ohne entsprechende experimentelle Basis vorherzusagen, so läuft man Gefahr zu scheitern.

Plasmide, d. h. nicht-chromosomale Schleifen von doppelstrangiger DNA in Bakterien und anderen Mikroben, die häufig in mehreren Kopien pro Zelle vorkommen, stellen ein Grundelement der rekombinanten DNA-Technik dar. Die in der Plasmid-DNA einkodierte Information umfaßt die Information, die erforderlich ist, das Plasmid in Tochterzellen zu reproduzieren (d. h. eine Replikationsstartstelle=origin) und im allgemeinen eine oder mehrere phänotypische Selektionseigenschaften, wie im Fall von Bakterien Resistenz gegenüber Antibiotika, die die Erkennung und bevorzugte Züchtung in selektiven Medien von Klonen der das betreffende Plasmid enthaltenden Wirtszelle erlauben. Der Wert von Plasmiden liegt darin, daß sie spezifisch durch die eine oder andere Restriktionsendonuclease oder "Restriktionsenzym", die jeweils unterschiedliche Stellen der Plasmid-DNA erkennen, gespalten werden können. Anschließend können heterologe Gene oder Genfragmente in das Plasmid eingesetzt werden, indem man eine Endenverbindung an der Spaltungsstelle oder an rekonstruierten Enden nahe der Spaltungsstelle durchführt. Somit werden sogenannte replizierbare Expressionsträger gebildet. Die DNA-Rekombination wird außerhalb der Zelle durchgeführt, aber der entstandene "rekombinante" replizierbare Expressionsträger oder Plasmid können in die Zellen nach einem als Transformation bekannten Verfahren eingeführt werden und es lassen sich große Mengen des rekombinanten Trägers durch Züchtung des Transformanten erhalten. Wird ferner das Gen in geeigneter Weise in bezug auf die Bereiche des Plasmids, die die Transkription und Translation der einkodierten DNA-Botschaft steuern, so kann der erhaltene Expressionsträger zur tatsächlichen Bildung der Polypeptidsequenz, die durch das eingesetzte Gen kodiert wird, verwendet werden; ein Vorgang, der als Expression bezeichnet wird. Die Expression wird in einem als Promotor bekannten Bereich, der durch RNA-Polymerase erkannt und gebunden wird, initiiert.

In der Transkriptionsphase der Expression erfolgt eine Entwindung der DNA, wobei sie eine Schablone für die initiierte Synthese von meßenger-DNA aus der DNA-Sequenz wird. Die meßenger-DNA wird wiederum in ein Polypeptid mit der durch die mRNA kodierten Aminosäuresequenz übersetzt. Jede Aminosäure wird durch ein Nucleotidtriplett oder "Codon" kodiert, die zusammen das "Strukturgen" bilden, d. h. den Teil, der die Aminosäuresequenz des exprimierten Polypeptidprodukts kodiert. Die Translation wird durch ein Startsignal (im allgemeinen ATG, das in der erhaltenen meßen ger-RNA zu AUG wird) initiiert. Sogenannte Stop-Codons definieren das Ende der Translation und daher die Bildung von weiteren Aminosäureeinheiten. Das erhaltene Produkt kann gegebenenfalls durch Lysis der Wirtszelle in mikrobiellen Systemen und Gewinnung des Produkts durch entsprechende Reinigung von anderen Proteinen erhalten werden.

In der Praxis kann die Verwendung der rekombinanten DNA-Technik zur Expression von vollkommen heterologen Polypeptiden - sogenannte direkte Expression - oder zur Expression eines heterologen Polypeptids führen, das mit einem Teil der Aminosäuresequenz eines homologen Polypeptids verschmolzen ist. In den letztgenannten Fällen wird das gewünschte bioaktive Produkt gelegentlich innerhalb des verschmolzenen homolog/heterologen Polypeptids biologisch inaktiv, bis es in einer extrazellulären Umgebung gespalten wird; vgl. GB-OS 20 07 676A und Wetzel, American Scientist, Bd. 68 (1980), S. 664.

C. Zellkulturtechnik

Zell- oder Gewebekulturen sind für genetische und zellphysiologische Untersuchungen gut eingeführt. Mittel und Methoden zur Erhaltung von permanenten Zellinien, die durch sukzessive Serienübertragungen von isolierten normalen Zellen hergestellt werden, stehen zur Verfügung. Für Forschungszwecke werden derartige Zellinien auf einem festen Träger in einem flüssigen Medium gehalten oder in Suspensionen mit einem Gehalt an unterstützenden Nährstoffen gezüchtet. Eine Vergrößerung des Herstellungsmaßstabs zur Herstellung von großen Präparatemengen scheint nur eine Frage der mechanischen Möglichkeiten zu sein. Zur Vertiefung wird in diesem Zusammenhang auf Microbiology, 2. Aufl., Harper and Row, Publishers, Inc. Hagerstown, Maryland (1973), insbesondere S. 1122 ff. und auf Scientific American, Bd. 245 (1981), S. 66 ff. verwiesen. Auf diese Literaturstellen wird vollinhaltlich Bezug ge nommen.

Die Erfindung beruht auf dem Befund, daß die rekombinante DNA-Technik mit Erfolg zur Herstellung von Human-Immuninterferon verwendet werden kann, vorzugsweise in direkter Form und in Mengen, die ausreichen, Tierversuche und klinische Untersuchungen, die Vorbedingungen für eine Marktzulassung sind, zu initiieren und durchzuführen. Das Produkt eignet sich für alle Formen der prophylaktischen oder therapeutischen Behandlung des Menschen bei viralen Infektionen und malignen Zuständen sowie Zuständen mit Immunosuppression oder Immunodefizit. Seine Formen umfassen verschiedene mögliche oligomere Formen, die assoziierte Glycosylierung einschließen können. Das Produkt wird durch gentechnisch manipulierte transformante Mikroorganismen oder transformante Zellkultursysteme gebildet. Somit besteht nun die Möglichkeit, Human-Interferon wirkungsvoller als bisher herzustellen und zu isolieren. Ein wesentlicher Faktor bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung besteht darin, daß es gelungen ist, einen Mikroorganismus oder eine Zellkultur genetisch so zu dirigieren, daß sie veranlaßt werden, Human-Immuninterferon, das von der Wirtszelle in reifer Form ausgeschieden wird, in isolierbaren Mengen zu bilden.

Gegenstand der Erfindung ist das auf diese Weise hergestellte Human-Immuninterferon sowie Mittel und Verfahren zu dessen Herstellung. Gegenstand der Erfindung sind ferner replizierbare DNA-Expressionträger, die Gensequenzen aufnehmen, welche Human-Immuninterferon in expressionsfähiger Form kodieren. Ein weiterer Gegenstand der Erfindung sind Mikroorganismenstämme oder Zellkulturen, die mit den vorstehend beschriebenen Expressionsträgern transformiert sind, sowie Mikroben- oder Zellkulturen von derart transformierten Stämmen oder Kulturen, die zur Bildung von Human-Immuninterferon fähig sind. Weiterhin sind Gegenstand der Erfindung verschiedene Verfahren zur Herstellung der genannten Immuninterferon-Gensequenzen, DNA- Expressionsträger, Mikroorganismenstämme und Zellkulturen sowie von speziellen Ausführungsformen davon. Gegenstand der Erfindung ist ferner die Herstellung von Fermentationskulturen dieser Mikroorganismen und Zellkulturen. Gegenstand der Erfindung ist schließlich die Herstellung von Human-Immuninterferon als direktes Expressionsprodukt, das von der Wirtszelle in reifer Form ausgeschieden wird. Dazu kann das die Sequenz von reifem Human-Immuninterferon kodierende Gen zusammen mit der 5′-flankierenden DNA, die das Signalpolypeptid kodiert, verwendet werden. Das Signalpolypeptid gilt als Hilfsmittel beim Transport des Moleküls zur Zellwand des Wirtsorganismus, wo es während des Sekretionsvorgangs von reifem Human-Interferon abgespalten wird. Diese Ausführungsform ermöglicht die Isolierung und Reinigung des gewünschten reinen Immuninterferons, ohne daß man Verfahren zu Hilfe nehmen muß, die dazu bestimmt sind, Verunreinigungen von intrazellulärem Wirtsprotein oder Zellbruchstücken zu beseitigen.

Der hier verwendete Ausdruck "reifes Human-Immuninterferon" bezieht sich auf die durch Mikroorganismen oder Zellkulturen bewerkstelligte Herstellung von Human-Immuninterferon, das nicht vom Signalpeptid oder Präsequenzpeptid, das unmittelbar für die Translation der Human-Immuninterferon-mRNA sorgt, begleitet ist. Somit wird erfindungsgemäß ein erstes rekombinantes Human-Immuninterferon zur Verfügung gestellt, das Methionin als erste Aminosäure (vorhanden aufgrund der Einfügung des ATG-Startsignalcodins vor dem Strukturgen) oder, wenn das Methionin intra- oder extrazellulär abgespalten ist, Cystein als im allgemeinen erste Aminosäure aufweist. Demgemäß kann reifes Human-Immuninterferon auch zusammen mit einem konjugierten Protein, das sich vom herkömmlichen Signalpolypeptid unterscheidet, hergestellt werden, wobei das Konjugat spezifisch in einer intra- oder extrazellulären Umgebung abspaltbar ist; vgl. GB-OS 20 07 676A. Schließlich kann das reife Human-Immuninterferon durch direkte Expression ohne die Notwendigkeit einer Abspaltung von nicht dazugehörigen, überflüssigen Polypeptiden hergestellt werden. Dies ist von besonderer Bedeutung, wenn ein bestimmter Wirt ein Signalpeptid nicht oder nicht wirksam genug entfernen kann, sofern der Expressionsträger so gebaut ist, daß er die Expression von reifem Human-Interferon zusammen mit dessen Signalpeptid bewirkt. Das auf diese Weise hergestellte reife Human-Immuninterferon wird gewonnen und soweit gereinigt, daß es als Wirkstoff bei der Behandlung von viralen und malignen Zuständen sowie bei Zuständen mit Immunosuppression oder Immunodefizit geeignet ist.

Human-Interferon wurde folgendermaßen erhalten:

1. Menschliches Gewebe, beispielsweise Milzgewebe oder periphere Blutlymphozyten werden mit Mitogenen gezüchtet, um die Bildung von Immuninterferon zu stimu lieren.
2. Zellpellets aus diesen Zellkulturen wurden in Gegenwart von Ribonuclease-Inhibitor extrahiert, um sämtliche zytoplasmatische RNA zu isolieren.
3. Eine Oligo-dT-Säule isolierte die gesamte meßenger-RNA (mRNA) in polyadenylierter Form. Diese mRNA wurde unter Verwendung eines Saccharose-Dichtegradienten und der Säure-Harnstoff-Gelelektrophorese einer Größenfraktionierung unterworfen.
4. Die entsprechende mRNA (12 bis 18 S) wurde in die entsprechende einzelsträngige komplementäre DNA (cDNA) umgewandelt, aus der doppelsträngige cDNA gebildet wurde. Nach poly-dC-tailing wurde sie in einen Vektor, z. B. ein Plasmid mit einem oder mehreren phänotypischen Markern, eingesetzt.
5. Die auf diese Weise hergestellten Vektoren wurden zur Transformation von Bakterienzellen unter Bildung einer Koloniebibliothek verwendet. Sowohl aus induzierter als auch aus nicht-induzierter mRNA (auf die vorstehende Weise erhalten) hergestellte radioaktiv markierte cDNA wurde zur getrennten Ermittlung von doppelten Koloniebibliotheken verwendet. Der Überschuß an cDNA wurde sodann entfernt. Die Kolonien wurden auf Röntgenfilme aufgebracht, um die induzierten cDNA-Klone zu identifizieren.
6. Von den induzierten cDNA-Klonen wurde die entsprechende Plasmid-DNA isoliert und sequenziert.
7. In einer ersten Ausführungsform wurde die sequenzierte DNA sodann in vitro zur Einfügung in einen entsprechenden Expressionsträger zugeschnitten, der zur Transformierung einer E. coli-Wirtszelle verwendet wurde, die wiederum in einem Medium gezüchtet wurde und die Expression des gewünschten Human-Immuninterferonprodukts durchführte.
8. Das auf diese Weise experimierte Human-Immuninterferon weist in seiner reifen Form zweifelsfrei 146 Aminosäuren auf, wobei am Beginn Cystein steht, und besitzt einen sehr stark basischen Charakter. Sein monomeres Molekulargewicht wurde mit 17 140 berechnet. Das Molekül kann sich zu oligomeren Formen, z. B. zur dimeren, trimeren oder tetrameren Form, assoziieren, was möglicherweise auf die Anwesenheit von zahlreichen basischen Resten, hydrophobe Eigenschaften, Salzbrückenbildung und dergleichen zurückzuführen ist. Die hohen Molekulargewichte, die früher bei natürlichem Material festgestellt wurden (6), die auf der Basis der Aminosäuresequenz allein nicht erklärbar sind, mögen auf derartige oligomeren Formen sowie auf den Kohlenhydratbeitrag aufgrund von Glycoxylierung nach der Translation zurückzuführen sein.
9. In bestimmten Wirtszellsystemen, insbesondere bei Ligatur in einem Expressionsträger, so daß eine Expression zusammen mit dem Signalpeptid stattfindet, wird die reife Form von Human-Immuninterferon in das Zellkulturmedium ausgebracht, was eine unermeßliche Hilfe bei Gewinnungs- und Reinigungsverfahren bedeutet.

Nachstehend werden bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung näher erläutert.

A. Mikroorganismen/Zellkulturen 1. Bakterienstämme/Promotoren

Die hier wiedergegebenen Versuche bedienen sich unter anderem des Mikroorganismus E. coli K-12 Stamm 294 (end A, thi^-, hsr^-, _khsm⁺), wie er in der GB-OS 20 55 382A beschrieben ist. Dieser Stamm erhielt bei der American Type Culture Collection die Hinterlegungsnummer ATCC 31446. Jedoch eignen sich auch verschiedene andere Mikroorganismenstämme, darunter bekannte E. coli-Stämme, wie E. coli B, E. coli X 1776 (ATCC 31537) und E. coli W 3110 (F^-, λ ^-, prototroph) (ATCC 27325), sowie andere Mikroorganismenstämme, von denen viele bei anerkannten Hinterlegungsstellen hinterlegt und dort erhältlich sind, beispielsweise bei der American Type Culture Collection (ATCC); vgl. den ATCC-Katalog. Hierzu wird auch auf die DE-OS 26 44 432 verwiesen. Beispiele für andere Mikroorganismen sind Bazillen, wie Bacillus subtilis und andere Enterobacteriaceae, von denen z. B. Salmonella typhimurium und Serratia marcescens erwähnt seien, wobei Plasmide verwendet werden, die die darin enthaltenen heterologen Gensequenzen replizieren und exprimieren können.

Zum Beispiel wurden β-Lactamase und Lactose-Promotorsysteme mit Erfolg zur Initiierung und Aufrechterhaltung der mikrobiellen Bildung von heterologen Polypeptiden verwendet. Einzelheiten zum Aufbau und zur Herstellung dieser Promotorsysteme gehen aus Chang et al., Nature, Bd. 275 (1978), S. 617 und Itakura et al., Science, Bd. 198 (1977), S. 1056 hervor. Auf diese Literaturstellen wird Bezug genommen. Kürzlich wurde ein System auf der Basis von Tryptophan entwickelt, das sogenannte trp-Promotorsystem. Einzelheiten bezüglich der Bauweise und Herstellung dieses System werden von Goeddel et al., Nucleic Acids Research, Bd. 8 (1980), S. 4057 und Kleid et al., Europäische Patentanmeldung 00 36 776 beschrieben. Auf diese Literaturstellen wird ebenfalls Bezug genommen. Es wurden zahlreiche andere mikrobielle Promotoren entdeckt und eingesetzt. Einzelheiten über deren Nucleotidsequenzen, die es dem Fachman ermöglichen, sie funktionell mit Plasmidvektoren zu verknüpfen, wurden veröffentlicht; vgl. z. B. Siebenlist et al., Cell, Bd. 20 (1980), S. 269. Auch auf diese Literaturstelle wird Bezug genommen.

2. Hefestämme/Hefe-Promotoren

Das Expressionssystem kann auch das Plasmid YRp7 (14, 15, 16) verwenden, welches zur Selektion und Replikation sowohl in E. coli als auch in der Hefe Saccharomyces cerevisiae fähig ist. Für die Selektion in Hefe enthält das Plasmid das TRP1- Gen (14, 15, 16), das eine Komplementation (Ermöglichung des Wachstums in Abwesenheit von Tryptophan) von Mutationen der Hefe in diesem Gen am Chromosom IV (17) bewirkt. Beim hier verwendeten Stamm handelte es sich um den Stamm RH2 18 (18), der bei der American Type Culture Collection ohne Einschränkungen hinterlegt ist (ATCC 44076). Es wird jedoch darauf hingewiesen, daß beliebige Stämme von Saccharomyces cerevisiae, die eine Mutation aufweisen, durch die die Zelle die Eigenschaft trp1 erhält, eine wirksame Umgebung zur Expression des das Expressionssystem enthaltenden Plasmids ist. Ein Beispiel für einen weiteren verwendbaren Stamm ist pep4-1 (19). Dieser tryptophan-auxotrophe Stamm weist eine Punktmutation im Gen TRP1 auf.

Wird an der 5′-Seite eines Nicht-Hefegens die 5′-Flanken-DNA- Sequenz (Promotor) aus einem Hefegen (für Alkoholdehydrogenase 1) angebracht, so kann sie die Expression eines fremden Gens in der Hefe, wenn sie in ein Plasmid zur Transformation von Hefe gebracht wird, fördern. Neben einem Promotor ist für die einwandfreie Expression eines Nicht-Hefegens in Hefe eine zweite Hefesequenz am 3′-Ende des Nicht-Hefegens am Plasmid erforderlich, so daß eine einwandfreie Termination der Transkription und Polyadenylierung in der Hefe möglich ist. Dieser Promotor kann im Rahmen der Erfindung ebenso wie andere Promotoren verwendet werden (vgl. unten). Bei bevorzugten Ausführungsformen wird die 5′-Flankensequenz des Hefe-3-Phos phoglycerat-kinase-Gens (20) aufwärts vom Strukturgen angeordnet, wiederum gefolgt von DNA mit einem Gehalt an Termination-Polyadenylierungs-Signalen, beispielsweise TRP1- (14, 15, 16) -Gen oder PGK (20) -Gen.

Da Hefe-5′-Flankensequenz (in Konjunktion mit 3′-Hefe-Termi nations-DNA) (vgl. unten) die Expression von fremden Genen in Hefe fördern kann, scheint es wahrscheinlich, daß die 5′-Flankensequenzen von beliebigen hoch-exprimierten Hefegenen zur Expression von wichtigen Genprodukten verwendet werden können. Da unter diesen Umständen Hefe bis zu 65 Prozent seines löslichen Proteins als glykolytische Enzyme (21) exprimierte und da dieser hohe Anteil auf die Bildung von hohen Anteilen an individuellen mRNAs zurückzuführen scheint (22), sollte es möglich sein, die 5′-Flankensequenzen von beliebigen anderen glykolytischen Genen für derartige Expressionszwecke zu verwenden, beispielsweise Enolase, Glyce rinaldehyd-3-phosphat-dehydrogenase, Hexokinase, Pyruvatdecarboxylase, Phosphofructokinase, Glucose-6-phosphat-isomerase, 3-Phosphoglycerat-mutase, Pyruvat-kinase, Triose phosphat-isomerase, Phosphoglycose-isomerase und Glucokinase. Beliebige 3′-Flankensequenzen dieser Gene können auch für eine geeignete Termination und mRNA-Polyadenylierung in einem derartigen Expressionssystem verwendet werden; vgl. oben. Beispiele für einige andere hoch-exprimierte Gene sind die für saure Phosphatasen (23) und diejenigen, die aufgrund von Mutationen in den 5′-Flankenbereichen (expressionssteigernde Mutanten) - im allgemeinen aufgrund der Anwesenheit eines TYl-transponierbaren Elements (24) - hohe Produktionsmengen exprimieren.

Von sämtlichen vorerwähnten Genen wird angenommen, daß sie durch Hefe-RNA-Polymerase II (24) transkribiert werden. Es ist möglich, daß die Promotoren für die RNA-Polymerase I und III, die Gene für ribosomale RNA, 5S RNA und tRNAs (24, 25) transkribieren, auch für derartige Expressionskonstruktionen wertvoll sind. Schließlich können viele Hefepromotoren auch eine transkriptionale Steuerung enthalten, so daß sie bei einer Veränderung der Wachstumsbedingungen ab- oder angestellt werden können. Beispiele für derartige Hefepromotoren sind die Gene, die die folgenden Proteine bilden: Alkohol-dehydrogenase II, Isocytochrom-c, saure Phosphatase, mit dem Stickstoffwechsel assoziierte abbauende Enzyme, Glycerin aldehyd-3-phosphat-dehydrogenase und für die Maltose- und Galactoseverwertung verantwortliche Enzyme (22). Ein derartiger Steuerungsbereich ist für die Steuerung der Expression von Proteinprodukten, insbesondere wenn ihre Bildung für die Hefe toxisch ist, sehr wertvoll. Es dürfte auch möglich sein, den Steuerungsbereich an eine 5′-Flankensequenz mit einer 5′-Flankensequenz, die einen Promotor von einem hoch exprimierten Gen enthält, zu bringen. Dies würde zu einem Hybridpromotor führen und sollte möglich sein, da es sich beim Steuerungsbereich und dem Promotor offensichtlich um physikalisch unterschiedliche DNA-Sequenzen handelt.

3. Zellkultursysteme/Zellkulturvektoren

Die Vermehrung von Wirbeltierzellen in Kulturen (Gewebekultur) wurde in den letzten Jahren zu einem Routineverfahren; vgl. Tissue Culture, Academic Press, Hrsg. Kruse und Patterson, (1973). Hier wurde die COS-7-Linie von Affennieren-fibroplasten als Wirt für die Herstellung von Immuninterferon verwendet (25a). Jedoch können die hier geschilderten Experimente in beliebigen Zellinien durchgeführt werden, die zur Replikation und Expression eines kompatiblen Vektors fähig sind, zum Beispiel WI38-, BHK-, 3T3-, CHO-, VERO- und HeLa- Zellinien. Ferner sind für den Expressionsvektor eine Replikationsstartstelle und ein Promotor, angeordnet vor dem zu exprimierenden Gen, zusammen mit allen erforderlichen Ribosomen- Bindungsstellen, RNA-Spleisstellen, Polyadenylierungsstellen und transkriptionalen Terminatorsequenzen erforderlich. Während im Rahmen dieser Beschreibung diese wesentlichen Elemente von SV40 genutzt werden, ist darauf hinzuweisen, daß es sich hierbei nur um bevorzugte Ausführungsformen handelt und die Erfindung keineswegs auf diese Sequenzen beschränkt ist. Beispielsweise können die Replikationsstartstellen von anderen viralen (z. B. Polyoma, Adeno, VSV, BPV und dergleichen) Vektoren, sowie jede zelluläre Startstelle der DNA- Replikation, die in einem nicht-integrierten Zustand funktioniert, verwendet werden.

B. Vektorsysteme 1. Direkte Expression von reifem Immuninterferon in E. coli

Bei dem Verfahren, das zur Durchführung der direkten Expression von IFN-γ in E. coli als reifem Interferon-Polypeptid (minus die Signalsequenz) verwendet wurde, handelte es sich um eine Variante des früher für menschliches Wachstumshormon (26) und menschliches Leukozyteninterferon (1) angewendeten Verfahrens, soweit die Kombination von synthetischen (N-terminalen) und cDNAs betroffen sind.

Aufgrund der Abteilung der Nucleotidsequenz von p69 (vgl. unten) und aufgrund eines Vergleichs mit der bekannten Spaltungsstelle zwischen Signalpeptid und reifem Polypeptid für einige IFN-αs (2) besitzt IFN-γ ein hydrophobes Signalpeptid von 20 Aminosäuren, gefolgt von 146 Aminosäuren von reifem IFN-γ (Fig. 5). Wie in Fig. 7 gezeigt, ist eine BstNI-Restrik trionsendonuclease-Stelle zweckmäßigerweise an der Aminosäure 4 von reifem IFN-γ positioniert. 2 synthetische Oligodesoxynucleotide wurden hergestellt, die ein ATG-translationales Initiierungscodon, Codone für die Aminosäuren 1, 2 und 3 (Cystein-Tyrosin-Cystein) enthalten und ein EcoRI-kohäsives Ende schaffen. Diese Desoxyoligonucleotide werden mit einem 100-Basenpaar-BstNI-PstI-Fragment von p69 verknüpft, um ein synthetisch-natürliches 1115 Basenpaar-Hybridgen aufzubauen, das IFN-γ kodiert und das durch EcoRi-PstI-Restriktionsstellen begrenzt ist. Dieses Gen wurde in das Plasmid pLeIF A trp 103 zwischen den EcoRI- und PstI-Stellen eingesetzt, wodurch das Expressionsplasmid-pIFN-γ trp 48 erhalten wurde. In diesem Plasmid wird das IFN-γ-Gen unter der Steuerung des E. coli trp-Promotors exprimiert (pLeIF A trp 103 ist ein Derivat von pLeIF A 25, in dem die EcoRI-Stelle distal zum LeIF A-Gen entfernt wurde. Das Verfahren zur Entfernung dieser EcoRI- Stelle wurde früher beschrieben (27)).

2. Expression in Hefe

Um ein heterologes Gen wie die cDNA für Immuninterferon in Hefe zu exprimieren, war es notwendig, einen Plasmidvektor mit einem Gehalt an 4 Komponenten aufzubauen. Bei der ersten Komponente handelt es sich um den Teil, der die Transformation von E. coli und Hefe ermöglicht und der somit ein selektierbares Gen von beiden Organismen enthalten muß. (In diesem Fall handelt es sich um das Gen für die Ampicillin-Resistenz von E. coli und das Gen TRP1 von Hefe.) Diese Komponente benötigt auch eine Replikationsstartstelle von beiden Organismen, die als Plasmid-DNA in beiden Organismen aufrechtzuerhalten ist. (In diesem Fall handelt es sich um die E. coli-Startstelle aus pBR322 und die ars1-Startstelle von Chromosom III von Hefe.)

Bei der zweiten Komponente des Plasmids handelt es sich um eine 5′-Flankensequenz eines hoch exprimierten Hefegens, um die Transkripton eines abwärts plazierten Strukturgens zu fördern. In diesem Fall wird als 5′-Flankensequenz die Sequenz aus dem Hefe-3-Phosphoglycerat-kinase (PGK)-Gen verwendet. Dieses Fragment ist so gebaut, daß ATG der PGK-Struktursequenz sowie 8 bp (bp=Basenpaar) aufwärts von dieser ATG entfernt werden. Diese Sequenz wurde ersetzt durch eine Sequenz, die sowohl eine XbaI- als auch eine EcoRI-Restriktionsstelle zur zweckmäßigen Verknüpfung dieser 5′- Flankensequenz an das Strukturgen enthielt.

Bei der dritten Komponente des Systems handelt es sich um ein Strukturgen, das so aufgebaut ist, daß es sowohl ATG-Trans lations-Start- als auch Translations-Stopsignale enthält. Die Isolierung und der Aufbau eines derartigen Gens ist weiter unten beschrieben.

Bei der vierten Komponente handelt es sich um eine Hefe-DNA- Sequenz, die die 3′-Flankensequenz eines Hefegens enthält, welches die geeigneten Signale zur Beendigung der Transkription und zur Polyadenylierung enthält.

Bei Anwesenheit all dieser Komponenten wurde in Hefe Immuninterferon gebildet.

3. Expression in Säugetier-Zellkultur

Die Strategie zur Synthese von Immuninterferon in Säugetier- Zellkulturen beruhte auf der Entdeckung eines Vektors der sowohl zur autonomen Replikation als auch Expression eines fremden Gens unter Steuerung einer heterologen Transkriptionseinheit fähig ist. Die Replikation dieses Vektors in Gewebekultur wurde erreicht, indem man eine DNA-Replikationsstartstelle (abgeleitet vom SV40-Virus) sowie eine Hilfsfunktion (T-Antigen) durch Einführung des Vektors in eine Zellinie, die dieses Antigen endogen exprimiert, bereitstellte (28, 29). Der späte Promotor von SV40-Virus ging dem Strukturgen von Interferon voran und gewährleistete die Transkription des Gens.

Der zur Erzielung der Expression von IFN-γ verwendete Vektor bestand aus pBR322-Sequenzen, die einen selektierbaren Marker für die Selektion in E. coli (Ampicillin-Resistenz) und eine E. coli-Startstelle für die DNA-Replikation bereitstellten. Diese Sequenzen wurden vom Plasmid pML-1 (28) abgeleitet und umfassen den Bereich von der EcoRI-Restriktionsstelle bis zur BamHI-Restriktionsstelle. Die SV40-Startstelle leitete sich von einem 342-Basenpaar-PvuII-HindIII-Fragment ab, das diesen Bereich umfaßte (30, 31) (beide Enden waren in EcoRI- Enden umgewandelt). Diese Sequenzen kodieren abgesehen davon, daß sie die virale Startstelle für die DNA-Replikation enthalten, den Promotor sowohl für die frühe als auch für die späte Transkriptionseinheit. Die Orientierung des SV40-Startstellenbereichs war so beschaffen, daß sich der Promotor für die späte Transkriptionseinheit proximal zu dem Interferon kodierenden Gen befand.

Fig. 1 zeigt das Ergebnis einer Saccharosegradientenzentrifugation von induzierter PBL (periphere Blutlymphozyten)- Poly(A)+ RNA. 2 Peaks von Interferonaktivität (schraffierte Kästchen) mit den Größen 12S und 16S wurden beobachtet. Die Position der ribosomalen RNA-Marker (unabhängig zentrifugiert) sind oberhalb des Absorptionsprofils angegeben.

Fig. 2 zeigt das Ergebnis einer Elektrophorese von induzierter PBL-Poly(A)+ RNA durch Säure-Harnstoff-Agarose. Nur ein Peak mit Aktivität wurde beobachtet, der zusammen mit 18S RNA wanderte. Die Positionen von ribosomalen RNA-Markern, die in einer benachbarten Bahn der Elektrophorese unterworfen wurden und durch Anfärben mit Ethidiumbromid sichtbar gemacht wurden, sind oberhalb des Aktivitätsprofils angegeben.

Fig. 3 zeigt ein Hybridisierungsmuster von 96 Kolonien mit induzierten und nicht-induzierten, mit ³²P-markierten cDNA- Tracern. 96 individuelle Transformanten wurden in einer Mikrotiterplatte gezüchtet und durch Replikaplattierung auf 2 Nitrocellulosemembranen aufgebracht. Sodann wurden die Filter mit ³²P-cDNA-Tracern, die entweder aus induzierter mRNA (oben) oder aus nicht-induzierten PBL-Kulturen isolierter mRNA (nicht induziert: unten) hergestellt worden waren, hybridisiert. Die Filter wurden zur Entfernung von nicht-hybridisierter RNA gewaschen und sodann auf einen Röntgenfilm gelegt. Dieser Filtersatz ist repräsentativ für 86 derartige Sätze (8300 unabhängige Kolonien). Ein Beispiel für einen "induzierten" Klon ist mit H12 bezeichnet.

Fig. 4 ist eine Restriktionsendonuclease-Karte des Klon 69- cDNA-Inserts. Das cDNA-Insert wird durch PstI-Stellen (Punkte an beiden Enden) und durch Oligo-dC-dG-Schwänze (einzelne Linien) begrenzt. Die Anzahl und Größe der durch Spaltung mit Restriktionsnuclease gebildeten Fragmente wurde durch Elektrophorese an 6prozentigem Acrylamidgel ermittelt. Die Positionen der Stellen wurden durch Nucleinsäuresequenzierung (dargestellt in Fig. 5) bestätigt. Der kodierende Bereich des größten offenen Leserasters ist mit einem Kästchen versehen und der schraffierte Bereich stellt die mutmaßliche Signalpeptidsequenz mit 20 Resten dar. Der punktierte Bereich stellt die Sequenz von reifem IFN (146 Aminosäuren) dar. Das 5′-Ende von mRNA befindet sich auf der linken Seite und das 3′-Ende auf der rechten Seite.

Fig. 5 zeigt die Nucleotidsequenz des Plasmid p69-cDNA-Inserts, erläutert jedoch die geläufigste Allelform von IFN-γ. Die abgeleitete Aminosäuresequenz des längsten offenen Ableserasters ist ebenfalls dargestellt. Die mutmaßliche Signalsequenz wird durch die mit S1 bis S20 bezeichneten Reste wiedergegeben.

Fig. 6 stellt einen Vergleich der IFN-γ-mRNA-Struktur mit der entsprechenden Struktur von Leukozyteninterferon (IFN-α ) und Fibroblasteninterferon (IFN-β ) dar. Die Klon 69-mRNA (mit Immuninterferon beschriftet) enthält signifikant größere Anteile an nicht-übersetzten Sequenzen.

Fig. 7 zeigt eine schematische Darstellung des Aufbaus des IFN-γ-trp 48. Ausgangsmaterial ist das 1250-Basenpaar-PstI-cDNA-Insert von Plasmid p69.

Fig. 8 zeigt eine Darstellung des zur Expression von IFN-γ in Affenzellen verwendeten Plasmids.

Fig. 9 zeigt eine Southern-Hybridisierung von 8 unterschiedlichen EcoRI-verdauten menschlichen Genom-DNAs, hybridisiert mit einem ³²P-markierten 600 Basenpaar-DdeI-Fragment vom cDNA- Insert von p69. 2 EcoRI-Fragmente hybridisieren klar mit dem Tracer in jeder DNA-Probe.

Fig. 10 zeigt eine Southern-Hybridisierung von menschlicher Genom-DNA, verdaut mit 6 verschiedenen Restriktionsendonucleasen, hybridisiert mit dem ³²P-markierten Tracer von p69.

Fig. 11 zeigt schematisch die Restriktionskarte des 3,1 kbp HindIII-Inserts von Vektor pB1, aus dem der PGK-Promotor isoliert wurde. Angegeben ist die Insertion einer EcoRI-Stelle und einer XbaI-Stelle in der 5′-Flanken-DNA des PGK-Gens.

Fig. 12 zeigt die 5′-Flankensequenz zusammen mit der Initiationscodonsequenz für das PGK-Gen vor der Insertion einer XbaI- und einer EcoRI-Stelle.

Fig. 13 zeigt schematisch Techniken, die zur Insertion einer XbaI-Stelle in Position 8 im PGK-Promotor und zur Isolierung eines 39bp-Fragments der 5′-Flankensequenz von PGK mit einem Gehalt an diesem XbaI-Ende und einem Sau3A-Ende.

Fig. 14 zeigt schematisch den Bau eines 300bp-Fragments mit dem obigen 39bp-Fragment zuzüglich der PGK-5′-Flankensequenz (265 bp) von PvuI bis Sau3A (vgl. Fig. 11) und einer EcoRI- Stelle benachbart zu XbaI.

Fig. 15 zeigt schematisch den Aufbau des 1500 bp-PGK-Promotor- Fragments (HindIII/EcoRI), das zusätzlich zu dem in Fig. 14 aufgebauten Fragment ein 1300 bp HindIII- bis PvuI-Fragment aus der PGK-5′-Flankensequenz (vgl. Fig. 11) enthält.

Fig. 16 erläutert die Zusammensetzung eines Expressionsvektors für Human-Immuninterferon in Hefe, der den modifizierten PGK-Promotor, die IFN-γ-cDNA und den Terminator-Bereich des Hefe-PGK-Gens, wie hier näher erläutert, enthält.

Nachstehend folgt eine ausführliche Beschreibung von bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung.

A. Quelle von IFN-γ-mRNA

Periphere Blutlymphozyten (PBLs) wurden durch Leukophorese von menschlichen Spendern gewonnen. Die PBLs wurden durch Ficoll-Hypaque-Gradientenzentrifugation weiter gereinigt und in RPMI 1640, 1 Prozent L-Glutamin, 25 millimolar HEPES und 1 Prozent Penicillin-Streptomycin-Lösung bis zu einer Konzentration von 5×10⁶ Zellen/ml gezüchtet. Diese Zellen wurden durch das Mitogen Staphylococcen-Enterotoxin B (1 µg/ml) zur Bildung von IFN-γ induziert und 24 bis 48 Stunden bei 37°C in 5 Prozent CO₂ gezüchtet. Die PBL-Kulturen wurden zur Erhöhung der relativen Ausbeute an IFN-γ- Aktivität mit 0,1 µg/ml Desacetylthymosin-α-1 versetzt.

B. Isolierung von meßenger-RNA

Die gesamte RNA aus PBL-Kulturen wurde im wesentlichen nach dem Verfahren von S. L. Berger et al. (33) extrahiert. Die Zellen wurden durch Zentrifugation pelletisiert und sodann in 10 millimolar NaCl, 10 millimolar Tris-HCl (pH-Wert 7,5), 1,5 millimolar MgCl₂ und 10 millimolar Ribonucleosid-Vanadyl- Komplex resuspendiert. Die Zellen wurden durch Zusatz von NP-40 (Endkonzentration 1 Prozent) lysiert. Die Zellkerne wurden durch Zentrifugation pelletisiert. Der Überstand enthielt die gesamte RNA, die durch mehrfache Phenol- und Chloroformextraktionen weiter gereinigt wurde. Die wäßrige Phase wurde auf 0,2 M NaCl gebracht. Sodann wurde die gesamte RNA durch Zugabe von 2 Volumina Äthanol ausgefällt. RNA aus nicht-induzierten (nicht-stimulierten) Kulturen wurde mit den gleichen Verfahren isoliert. Die Oligo-dT-Cellulose- Chromatographie wurde angewendet, um mRNA aus den Gesamt-RNA- Präparaten zu reinigen (34). Typische Ausbeuten aus 1 bis 2 Liter PBL-Kulturen betrugen 5 bis 10 mg gesamte RNA und 50 bis 200 µg Poly(A)+ RNA.

C. Größenfraktionierung von mRNA

2 Verfahren wurden zur Fraktionierung von mRNA-Präparaten angewendet. Diese Verfahren wurden unabhängig (und nicht zusammen) angewendet und ergaben jeweils eine signifikante Anreicherung an IFN-γ-mRNA.

Eine Saccharosegradientenzentrifugation in Gegenwart von denaturierend wirkendem Formamid wurde zur Fraktionierung von mRNA angewendet. Gradienten von 5 bis 25 Prozent Saccharose in 70 Prozent Formamid (32) wurden 19 Stunden bei 20°C und 154 000 g zentrifugiert. Sodann wurden nacheinander Fraktionen von 0,5 ml von oben aus dem Gradienten entnommen und mit Äthanol gefällt. Eine Aliquotmenge wurde in Xenopus laevis- Oozyten zur Translation der mRNA injiziert (35). Nach 24 stündiger Inkubation bei Raumtemperatur wurde das Inkubationsmedium auf seine antivirale Aktivität getestet, wozu ein Standardhemmtest zur Ermittlung der zytopathischen Wirkung unter Verwendung des vesikuläre Stomatitis erregenden Virus (Indiana-Stamm) oder von Encephalomyocarditis-Virus auf WISH (Humanamnion)-Zellen gemäß Stewart (36) angewendet wurde, mit der Abänderung, daß die Proben vor der Infektion mit dem Virus 24 Stunden (anstatt von 4 Stunden) mit den Zellen inkubiert wurden. Folgerichtig wurden 2 Aktivitätspeaks in der im Saccharosegradienten fraktionierten RNA beobachtet (Fig. 1). Ein Peak sedimentierte entsprechend einer berechneten Größe von 12S und enthielt 100 bis 400 Einheiten/ml an antiviraler Aktivität (verglichen mit IFN-α-Standard) pro 1 µg injizierter RNA. Der andere Aktivitätspeak sedimentierte entsprechend einer Größe von 16S und enthielt etwa die Hälfte der Aktivität des langsamer sedimentierenden Peaks. Beide Aktivitätspeaks sind offenbar auf IFN-γ zurückzuführen, da keine Aktivität festgestellt wurde, wenn die gleichen Fraktionen an Rinderzellinie (MDBK), die nicht durch Human-IFN-γ geschützt ist, untersucht wurden. Sowohl IFN-α- als auch IFN-β-Aktivität ließe sich mit dem MDBK-Test leicht nachweisen (5).

Die Fraktionierung von mRNA (200 µg) wurde auch mittels Elektrophorese durch Säure-Harnstoff-Agarose-Gele durchgeführt. Das Platten-Agarose-Gel (37, 38) war aus 1,75 Prozent Agarose, 0,025 M Natriumcitrat (pH-Wert 3,8) und 6 M Harnstoff zusammengesetzt. Die Elektrophorese wurde 7 Stunden bei 25 Milliampere und 4°C durchgeführt. Das Gel wurde sodann mit einer Rasierklinge in Scheiben geschnitten. Die einzelnen Scheiben wurden bei 70°C geschmolzen und 2mal mit Phenol und 1mal mit Chloroform extrahiert. Die Fraktionen wurden sodann der Äthanolfällung unterworfen und anschließend auf IFN-γ-mRNA durch Injektion in Xenopus laevis-Oozyten und auf antivirale Aktivität getestet. In den im Gel fraktionierten Proben wurde nur ein Aktivitätspeak beobachtet (Fig. 2). Dieser Peak wanderte gemeinsam mit 18S RNA und wies eine Aktivität von 600 Einheiten/ml pro 1 µg injizierter RNA auf. Diese Aktivität erwies sich ebenfalls IFN-γ-spezifisch, da sie MDBK-Zellen nicht schützte.

Dieser Größenunterschied zwischen den Aktivitätspeaks von Saccharosegradienten (12S und 16S) und Säure-Harnstoff- Gelen (18S) kann durch die Feststellung erklärt werden, daß diese unabhängigen Fraktionierungsmethoden nicht unter vollständigen Denaturierungsbedingungen durchgeführt wurden.

D. Herstellung einer Koloniebibliothek mit einem Gehalt an IFN-γ-Sequenzen

3 µg durch Gelfraktionierung erhaltene mRNA wurde zur Herstellung von doppelsträngiger cDNA gemäß Standardverfahren (26, 39) verwendet. Die cDNA wurde der Größenfraktionierung an 6prozentigem Polyacrylamidgel unterworfen. 2 Fraktionen mit unterschiedlichen Größen wurden durch Elektroelution erhalten, nämlich 138 ng 800 bis 1500 bp und 204 ng<1500 bp. Von jeder cDNA-Größe wurden 35 ng-Portionen mit Desoxy-C- Resten unter Verwendung von terminaler Desoxynucleotidyltransferase (40) erweitert und mit 300 ng des Plasmids pBR322 (41), das in ähnlicher Weise mit Desoxy-G-Resten an der PstI- Stelle geschwänzt war (40), verschmolzen. Die verschmolzenen Gemische wurden sodann in E. coli K12 Stamm 294 transformiert. Etwa 8000 Transformanten wurden mit der 800 bis 1500 bp cDNA und 400 Transformanten mit der<1500 bp cDNA erhalten.

E. Sichten (Screening) der Koloniebibliothek auf induzierte cDNAs

Die Kolonien wurden einzeln in Vertiefungen von Mikrotiterplatten mit einem Gehalt an LB (58)+5 µg/ml Tetracyclin inokuliert und nach Zusatz von DMSO in einer Menge von 7 Prozent bei -20°C gelagert. 2 Kopien der Koloniebibliothek wurden auf Nitrocellulosefiltern gezüchtet. Die DNA aus jeder Kolonie wurde nach dem Grundstein-Hogneß-Verfahren (42) am Filter fixiert.

Mit ³²P-markierte cDNA-Tracer wurden unter Verwendung von 18S-gelfraktionierter mRNA aus induzierten und nicht-induzierten PBL-Kulturen hergestellt. Oligo-dT_12-18 wurde als Primer verwendet. Die Reaktionsbedingungen entsprachen denen von (1). Filter mit einem Gehalt an 8000 Transformanten aus der 600 bis 1500 bp-cDNA-Größenfraktion und an 400 Transformanten aus der<1500 bp-cDNA-Größenfraktion wurden mit 20×10⁶ cpm induzierten ³²P-cDNA hybridisiert. Ein zweiter Filtersatz wurde mit 20×10⁶ cpm nicht-induzierter ³²P-cDNA hybridisiert. Die Hybridisierungszeit betrug 16 Stunden, wobei die Bedingungen gemäß Fritsch et al. (43) angewendet wurden. Die Filter wurden gründlich gewaschen (43) und sodann 16 bis 48 Stunden auf Kodak XR-5-Röntgenfilme unter Verwendung von DuPont Lightning-Plus-Verstärkerschirmen gelegt. Die Hybridisierungsmuster mit den beiden Tracern wurden für die einzelnen Kolonien verglichen. Etwa 40 Prozent der Kolonien hybridisierten klar mit beiden Tracern, während etwa 50 Prozent der Kolonien mit keinem der Tracer hybridisierten (vgl. Fig. 3). 124 Kolonien zeigten eine signifikante Hybridisierung mit dem induzierten Tracer, während die Hybridisierung mit dem nicht-induzierten Tracer nicht nachweisbar oder schwächer war. Diese Kolonien wurden einzeln in Vertiefungen von Mikrotiterplatten inokuliert, gezüchtet, auf Nitrocellulosefilter übertragen und, wie vorstehend erläutert, mit den gleichen beiden Tracern hybridisiert. Plasmid-DNA, die aus jeder dieser Kolonien durch ein Schnellverfahren (44) isoliert worden war, wurde ebenfalls an Nitrocellulosefilter gebunden und mit den induzierten und nicht-induzierten Tracern hybridisiert (45). DNA aus 22 Kolonien hybridisierten nur mit dem induzierten Tracer und wurden als "induzierte" Kolonien bezeichnet.

F. Charakterisierung von induzierten Kolonien

Plasmid-DNA wurde aus 5 der induzierten Kolonien hergestellt (46) und zur Charakterisierung der cDNA-Inserts verwendet. Unter Verwendung von Restriktionsendonuclease hergestellte Karten der 5 induzierten Plasmide (p67, p68, p69, p71 und p72) deuteten darauf hin, daß 4 Plasmide ähnliche Restrik tionsnuclease-Karten aufwiesen. Diese 4 Plasmide (p67, p69, p71 und p72) hatten jeweils 4 DdeI-Stellen, 2 HinfI-Stellen und eine einzelne RsaI-Stelle im cDNA-Insert. Das fünfte Plasmid (p68) enthielt ein gemeinsames DdeI-Fragment und war offenbar ein kurzer mit den anderen 4 Plasmiden verwandter cDNA-Klon. Die bei der Restriktionsnuclease-Kartenbildung nahegelegte Homologie wurde durch Hybridisierung bestätigt. Ein aus dem 600 bp-DdeI-Fragment des p67-Plasmids hergestellter (47) ³²P-markierter DNA-Tracer wurde zur Hybridisierung (42) der übrigen induzierten Kolonien verwendet. Sämtliche 5 mit Restriktionsnuclease karierten Kolonien ergaben eine Kreuzhybridisierung mit diesem Tracer, ebenso verhielten sich 17 andere Kolonien der 124 beim Screening auf induzierte/nicht-induzierte Kolonien ausgewählten 124 Kolonien. Die Länge des cDNA-Inserts in jedem dieser kreuzhybridisierten Plasmide wurde durch PstI-Verdauung und Gelelektrophorese bestimmt. Der Klon mit dem längsten cDNA-Insert war offensichtlich der Klon 69 mit einer Insertlänge von 1200 bis 1400 bp. Diese DNA wurde für sämtliche weiteren Versuche verwendet. Seine Restriktionsendonuclease-Karte ist in Fig. 4 dargestellt.

Das cDNA-Insert in p69 erwies sich aufgrund seiner Expressionsprodukte, das in 3 unabhängigen Expressionssystemen hergestellt wurde und antivirale Aktivität ergab (für Einzelheiten siehe weiter unten), als IFN-γ-cDNA.

G. Sequenzanalyse des cDNA-Inserts von p69

Die vollständige Nucleotidsequenz des Plasmid p69-cDNA-Inserts wurde durch das Didesoxynucliotid-Kettenendenverfahren (48) nach Subklonieren der Fragmente in den M13-Vektor-mp7 (49) und durch das chemische Verfahren gemäß Maxam-Gilbert (52) bestimmt. Der längste offene Ableseraster kodiert ein Protein von 166 Aminosäuren; vgl. Fig. 5. Beim ersten kodierten Rest handelt es sich um das erste met-Codon, das am 5′-Ende von cDNA auftritt. Die ersten 20 Reste am Aminoende dienen wahrscheinlich als Signalsequenz für die Sekretion der übrigen 146 Aminosäuren. Diese mutmaßliche Signalsequenz hat mit anderen charakteristischen Signalsequenzen Gemeinsamkeiten, beispielsweise in bezug auf Größe und hydrophobe Eigenschaften. Ferner sind die 4 Aminosäuren an der mutmaßlichen Spaltungssequenz (ser-leu-gly-cys) identisch mit den 4 an der Spaltstelle von verschiedenen Leukozyten-Interferonen (LeIF B, C, D, F und H (2)) aufgefundenen Resten. Die kodierte reife Aminosäuresequenz von 146 Aminosäuren (nachstehend als "rekombinantes Human-Immuninterferon" bezeichnet) weist ein Molekulargewicht von 17 140 auf.

Es gibt 2 potentielle Glycosylierungsstellen (50) in der kodierten Proteinsequenz, nämlich an den Aminosäuren 28 bis 30 (asn-gly-thr) und an den Aminosäuren 100 bis 102 (asn-tyr-ser). Die Existenz dieser Positionen stimmt mit der beobachteten Glycosylierung von Human-IFN-γ (6, 51) überein. Ferner liegen die einzigen beiden Cysteinreste (Positionen 1 und 3) sterisch zu eng beieinander, als daß sie eine Disulfidbrücke bilden könnten, was mit der beobachteten Stabilität von IFN-γ in Gegenwart von Reduktionsmitteln, wie β-Mercaptoäthanol, (51) übereinstimmt. Die abgeleitete reife Aminosäuresequenz ist im allgemeinen recht stark basisch, mit insgesamt 30 Lysin-, Arginin- und Histidinresten und nur insgesamt 19 Asparaginsäure- und Glutaminsäureresten.

Die mRNA-Struktur von IFN-γ, abgeleitet aus der DNA-Sequenz des Plasmids p69 unterscheidet sich deutlich von IFN-α (1, 2)- oder IFN-β (5)-mRNA. Wie aus Fig. 6 hervorgeht, ist der Kodierungsbereich von IFN-γ kürzer, während die 5′-nicht-übersetzten und 3′-nicht-übersetzten Bereiche wesentlich länger als bei IFN-α oder IFN-β sind.

H. Direkte Expression von rekombinanten Human-Immuninterferon in E. coli

Es wird auf Fig. 7 Bezug genommen. 50 µg Plasmid p69 wurden mit PstI verdaut. Das 1250-Basenpaar-Insert wurde durch Gelelektrophorese an 6prozentigem Polyacrylamidgel isoliert. Etwa 10 µg dieses Inserts wurden durch Elektroelution aus dem Gel gewonnen. 5 µg dieses PstI-Fragments wurden partiell mit 3 Einheiten BstNI 15 Minuten bei 37°C verdaut. Das Reaktionsgemisch wurde an 6prozentigem Polyacrylamidgel gereinigt. Etwa 0,5 µg des gewünschten 1100- Basenopaar-BstNI-PstI-Fragments wurden gewonnen. Die beiden angegebenen Desoxyoligonucleotide 5′-dAATTCATGTGTTATTGTC und 5′-dTGACAATAACACATG (Fig. 7) wurden nach der Phosphotriester- Methode (53) synthetisiert und folgendermaßen phosphoryliert. Jeweils 100 pMol der Desoxyoligonucleotide wurden in 30 µl 60 millimolarem Tris-HCl-Puffer vom pH-Wert 8, 10 millimolar MgCl₂, 15 millimolar β-Mercaptoäthanol und 240 µCi ( γ-³²P)- ATP (5000 Ci/mMol) vereinigt. 12 Einheiten T4-Poly nucleotid-kinase wurden zugesetzt. Die Umsetzung wurde 30 Minuten bei 37°C durchgeführt. 1 µl 10 millimolares ATP wurde zugesetzt. Die Reaktion wurde weitere 20 Minuten durchgeführt. Nach Φ-OH/CHCl₃-Extraktion wurden die Oligomeren mit 0,25 µg des BstNI-PstI 1100-Basenpaar-Fragments kombiniert und mit Äthanol gefällt. Diese Fragmente wurden 2 Stunden bei 20°C in 30 µl 20 millimolarem Tris-HCl-Puffer vom pH-Wert 7,5, 10 millimolar MgCl₂, 10 millimolar Dithiothreit, 0,5 millimolar ATP und 10 Einheiten T4-DNA-Ligase verknüpft. Das Gemisch wurde 1 Stunde mit 30 Einheiten PstI und 30 Einheiten EcoRI (zur Beseitigung der Polymerisation durch Verknüpfung von kohäsiven Termini) verdaut und der Elektrophorese an 6prozentigem Polyacrylamidgel unterworfen. Das 1115-Basen paar-Produkt (110 000 cpm) wurde durch Elektroelution ge wonnen.

Bei dem Plasmid pLeIF A trp 103 (vgl. Fig. 7) handelt es sich um ein Derivat des Plasmids pLeIF A 25 (1), in dem die EcoRI- Stelle distal zum LeIF A-Gen entfernt worden ist (27). 3 µg pLeIF A trp 103 wurden 90 Minuten bei 37°C mit 20 Einheiten EcoRI und 20 Einheiten PstI verdaut und der Elektrophorese an 6prozentigem Polyacrylamidgel unterworfen. Das große Vektorsegment (∼3900 Basenpaare) wurde durch Elektroelution gewonnen. Das 1115-Basenpaar-EcoRI-PstI-IFN-γ-DNA-Fragment wurde in 0,15 µg des hergestellten Vektors eingebunden. Durch Transformation von E. coli K-12 Stamm 294 (ATCC 31446) erhält man 120 gegen Tetracyclin resistente Kolonien. Plasmid-DNA wurde aus 60 dieser Transformanten hergestellt und mit EcoRI und PstI verdaut. 3 dieser Plasmide enthielten das gewünschte 1115-Basenpaar-EcoRI-PstI-Fragment. Die DNA-Sequenzanalyse bestätigte, daß diese Plasmide an den Verbindungen zwischen dem trp-Promotor, synthetischer DNA und cDNA die gewünschte Nucleotidsequenz aufwiesen. Eines dieser Plasmide, nämlich pIFN-γ-trp 48 wurde für weitere Untersuchungen ausgewählt. Dieses Plasmid wurde zur Transformation von E. coli K-12 Stamm W3110 (ATCC 27325) verwendet.

I. Genstruktur der IFN-γ-Kodiersequenz

Die Struktur des IFN-γ kodierenden Gens wurde durch Southern- Hybridisierung analysiert. Bei diesem Verfahren (54) werden 5 µg hochmolekulare Human-Lymphozyten-DNA (hergestellt gemäß 55) vollständig mit verschiedenen Restriktionsendonucleasen verdaut, der Elektrophorese an 1,0prozentigen Agarosegelen unterworfen (56) und auf ein Nitrocellulosefilter geblottet (54). Ein ³²P-markierter DNA-Tracer wurde aus einem 600 bp-DdeI- Fragment des cDNA-Inserts von p69 hergestellt (47) und mit dem Nitrocellulose-DNA-Blot hybridisiert (43). Es wurden 10⁷ cpm des Tracers 16 Stunden hybridisiert und sodann gemäß (43) gewaschen. 8 Genom-DNA-Proben von verschiedenen menschlichen Spendern wurden mit EcoRI-Restriktionsendonuclease verdaut und mit dem p69-³²P-markierten Tracer hybridisiert. Wie in Fig. 9 gezeigt, werden 2 klare Hybridisierungssignale mit Größen von 8,8 Kilobasenpaaren (kbp) und 2,0 kbp beobachtet, wobei die Größe durch Beweglichkeitsvergleich mit HindIII, verdaut mit λ DNA, geschätzt wurde. Dies könnte das Ergebnis von 2 IFN-γ-Genen oder eines einzelnen Gens, gespalten durch eine EcoRI-Stelle, sein. Da p69-cDNA keine EcoRI-Stelle enthält, wäre eine intervenierende Sequenz (Intron) mit einer internen EcoRI-Stelle erforderlich, um ein einzelnes Gen zu erklären. Um zwischen diesen Möglichkeiten zu unterscheiden, wurde eine weitere Southern-Hybridisierung mit dem gleichen Tracer gegen 5 andere Endonuclease-Verdauungsprodukte einer einzelnen Human-DNA durchgeführt (Fig. 10). Es wurden 2 hybridisierende DNA-Fragmente mit 2 anderen Endonuclease- Verdauungsprodukten, PvuII (6,7 kbp und 4,0 kbp) und HincII (2,5 kbp und 2,2 kbp) beobachtet. Jedoch liefern 3 Endonuclease- Verdauungsmuster nur ein einzelnes hybridisierendes DNA-Fragment: HindIII (9,0 kbp) BglII (11,5 kbp) und BamHI (9,5 kbp). 2 IFN-γ-Gene müßten in einem unüblich engen Abstand (weniger als 9,0 kbp) verknüpft sein, damit sie im gleichen HindIII- Hybridisierungsfragment enthalten sein könnten. Dieses Ergebnis legt es nahe, daß nur ein einzelnes homologes IFN-γ-Gen (in Abweichung von zahlreichen verwandten IFN-α-Genen) in Human genom-DNA vorhanden ist und daß dieses Gen durch eines oder mehrere Introns mit einem Gehalt an EcoRI-, PvuII- und HindII- Stellen gespalten wird. Diese Vorhersage wurde durch Hybridisierung eines ³²P-markierten (47) Fragments (hergestellt genau aus dem 3′-nicht-übersetzten Bereich der cDNA von p69 (130 bp DdeI-Fragment von 860 bp bis 900 bp in Fig. 5)) gegen ein EcoRI-Verdauungsprodukt von Humangenom-DNA gestützt. Nur das 2,0 kbp EcoRI-Fragment hybridisierte mit diesem Tracer, was darauf schließen läßt, daß dieses Fragment die 3′-nichtübersetzten Sequenzen enthält, während das 8,8 kbp EcoRI- Fragment die 5′-Sequenzen enthält. Die Genstruktur von IFN-γ (ein Gen mit mindestens einem Intron) unterscheidet sich deutlich von IFN-α (Mehrfachgene (2) ohne Introns (56)) oder IFN-β (ein Gen ohne Introns (57)).

J. Herstellung von Bakterienextrakten

Eine über Nacht gezüchtete Kultur von E. coli W3110/pIFN-γ trp 48 in Luria-Brühe+5 µg/ml Tetracyclin wurde zur Inokulation von M9 (58)-Medium mit einem Gehalt an 0,2 Prozent Glucose, 0,5 Prozent Casaminsäuren und 5 µg/ml Tetracyclin in einer 1 : 100-Verdünnung verwendet. Indolacrylsäure wurde bis zu einer Endkonzentration von 20 µg/ml zugesetzt, wenn der A₅₅₀- Wert zwischen 0,1 und 0,2 lag. 10-ml-Proben wurden durch Zentrifugation bei einem A₅₅₀-Wert von 1,0 geerntet und sofort in 1 ml mit Phosphat gepufferter Kochsalzlösung mit einem Gehalt an 1 mg/ml Rinderserumalbumin (PBS-BSA) resuspendiert. Die Zellen wurden durch Ultraschallbehandlung aufgebrochen und durch Zentrifugation von Zellbruchstücken befreit. Der Überstand wurde bis zur Testdurchführung bei 4°C gelagert. Die Interferonaktivität im Überstand wurde zu 250 Einheiten/ml bestimmt, wobei die Bestimmung mittels der Hemmung des zytopathischen Effekts (CPE) durch Vergleich mit IFN-α-Standard erfolgte.

K. Transformation von Hefestämmen und Medien

Hefestämme wurden gemäß (59) transformiert. E. coli Stamm
JA300 (thr leuB6 thi thyA trpC1117 hsdm^- hsdR^- str^R (20)
wurde zur Selektierung von Plasmiden mit einem Gehalt an funktionellem TRPI-Gen verwendet. Der Hefestamm RH2 18 mit dem Genotyp (trp1 ga12 SUC2 mal CUPI) (18) wurde als Hefetransformationswirt verwendet. RH2 18 ist ohne Einschränkungen bei der American Type Culture Collection unter der Nr. ATCC 44076 hinterlegt. M9 (Minimalmedium) mit 0,25 Prozent Casaminsäuren (CAA) und LB (rich medium) entsprechen den Angaben von Miller (58), wobei die Medien nach Autoklavisierung und Kühlung mit 20 µg/ml Ampicillin versetzt wurden. Hefe wurde auf folgenden Medien gezüchtet: YEPD mit einem Gehalt an 1 Prozent Hefeextrakt, 2 Prozent Pepton und 2 Prozent Glucose± 3 Prozent Difco-Agar. YNB+CAA enthielt 6,7 g Hefe-Stickstoffbase (ohne Aminosäuren (YNB), 10 mg Adenin, 10 mg Uracil, 5 g CAA, 20 g Glucose und±30 g Agar pro Liter.

L. Aufbau des Hefeexpressionsvektors

1. 10 µg YRp7 (14, 15, 16) wurde mit EcoRI verdaut. Die erhaltenen kohäsiven DNA-Enden wurden unter Verwendung von DNA- Polymerase I (Klenow-Fragment) stumpf gemacht. Man ließ Vektor und Insert auf 1 Prozent Agarose (SeaKem)-Gel laufen. Sodann wurde das Gel zerschnitten, der Elektroelution unterworfen und vor der Fällung mit Äthanol 2mal mit gleichen Volumina an Chloroform und Phenol extrahiert. Die erhaltenen stumpfendigen DNA-Moleküle wurden sodann 12 Stunden bei 12°C in einem Endvolumen von 50 µl miteinander verknüpft. Dieses Verknüpfungsgemisch wurde sodann zur Transformation von E. coli Stamm JA300 zur Verleihung von Ampicillin-Resistenz und Tryp tophan-Prototrophie verwendet. Plasmide, die das TRPI-Gen in beiden Orientierungen erhielten, wurden isoliert. pFRW1 wies das TRPI-Gen in der gleichen Orientierung wie YRP7 auf, während bei pFRW2 das TRPI-Gen in der entgegengesetzten Orientierung vorlag.

20 µg pFRW2 wurden mit HindIII linearisiert und der Elektrophorese an 1prozentigem Agarosegel unterworfen. Lineare Moleküle wurden vom Gel eluiert. 200 ng wurden sodann mit 500 ng des 3,1 kb HindIII-Inserts des Plasmids pB1 (13), bei dem es sich um ein Restriktionsfragment mit einem Gehalt am Hefe-3-Phosphoglycerat-kinase-Gen handelte, verknüpft. Das Verknüpfungsgemisch wurde zur Transformation von E. coli Stamm 294 verwendet, um Ampicillin-Resistenz und Tetra cyclin-Empfindlichkeit hervorgerufen. Ein aus einer dieser Rekombinanten hergestelltes Plasmid wies ein intaktes TRP1- Gen mit dem 3,1 kbp-HindIII-Fragment aus pB1-Insert-DNA an der HindIII-Stelle des Tetracyclin-Resistenz-Gens auf. Bei diesem Plasmid handelt es sich um pFRM31. 5 µg pFRM31 wurden vollständig mit EcoRI verdaut, 2mal mit Phenol und Chloroform extrahiert und sodann mit Äthanol gefällt. Die kohäsiven Enden des Moleküls wurden unter Verwendung von DNA-Polymerase I (Klenow-Fragment) im Verlauf einer Reaktion, bei der von jedem Desoxynucliosid-triphosphat eine Konzentration von 250 millimolar hergestellt wurde, gefüllt. Die Reaktion wurde 20 Minuten bei 14°C durchgeführt. Anschließend wurde die DNA 2mal mit Phenol-Chloroform extrahiert und hierauf mit Äthanol gefällt. Die resuspendierte DNA wurde vollständig mit ClaI verdaut und der Elektrophorese an 6prozentigem Acrylamidgel unterworfen. Das Vektorfragment wurde vom Gel eluiert, mit Phenol-Chloroform extrahiert und mit Äthanol gefällt.

Gereinigtes, vom Menschen stammendes 3-Phosphoglycerat-Enzym weist folgende 6 N-endständiges Aminsäuren auf:

Einer der aus dieser DNA-Sequenz des 141 bp-Sau3A- bis -Sau3A- Restriktionsfragments (enthaltend die interne HincII-Stelle; vgl. PGK-Restriktionskarte von Fig. 11) erzeugten Transla tions-Ableseraster bildet folgende Aminosäuresequenz:

Nach Entfernung des Initiator-Methionins ergibt sich für 5 von 6 Aminosäuren der PGK-N-endständigen Aminosäuresequenz eine Homologie mit der N-endständigen Aminosäuresequenz von Human-PGK.

Dieses Sequenzierungsergebnis läßt darauf schließen, daß der Start des Hefe-PGK-Strukturgens durch DNA im 141 bp-Sau3A- Restriktionsfragment von pB1 kodiert wird. Eine frühere Arbeit (20) ließ darauf schließen, daß die DNA-Sequenzen, die die PGK-mRNA angeben, möglicherweise in diesem Bereich das HindIII-Fragment liegen. Eine weitere Sequenzierung des 141 bp-Sau3A-Fragments ergibt eine weitere DNA-Sequenz des PGK-Promotors (Fig. 12).

Ein synthetisches Oligonucleotid mit der Sequenz 5′ATTTGTTGTAAA3′ wurde nach Standardmethoden (Crea et al., Nucleic Acids Res., Bd. 8 (1980), S. 2331, synthetisiert. 100 ng dieses Primers wurden am 5′-Ende markiert, wobei 10 Einheiten T4-Polynucleo tid-kinase in 20-µl-Reaktionsmedium mit einem Gehalt an 200 µCi [γ³²-P] ATP verwendet wurden. Diese markierte Primerlösung wurde in einer Primer-Reparaturreaktion als erste Stufe eines mehrstufigen Verfahrens mit dem Ziel, eine EcoRI- Restriktionsstelle in der PGK-5′-Flanken-DNA unmittelbar vor der PGK-Strukturgen-Sequenz einzuführen, eingesetzt.

100 µg pB1 (20) wurden vollständig mit HaeIII verdaut und sodann auf 6prozentigem Polyacrylamidgel laufen gelassen. Die oberste Bande an dem mit Ethidium gefärbten Gel (die den PGK- Promotorbereich enthält) wurde auf die vorstehend erläuterte Weise durch Elektroelution isoliert. Dieses 1200 bp-HaeIII- Stück von DNA wurde der Restriktion mit HincII unterworfen und sodann auf 6prozentigem Acrylamidgel laufen gelassen. Die 650-bp-Bande wurde durch Elektroelution isoliert. Es wurden 5 µg DNA isoliert. Dieses 650-bp-HaiIII- bis HincII- Stück von DNA wurde in 20 µl H₂O resuspendiert und sodann auf die vorstehend erläuterte Weise mit 20 µl der phosphorylierten Primerlösung vermischt. Dieses Gemisch wurde 1mal mit Phenol-Chloroform extrahiert und sodann mit Äthanol gefällt. Die getrocknete DNA wurde in 50 µl H₂O resuspendiert und sodann 7 Minuten in einem siedenden Wasserbad erwärmt. Diese Lösung wurde sodann rasch in einem Trockeneis/Äthanol- Bad (10 bis 20 Sekunden) gekühlt und hierauf in ein Eis/Wasser- Bad übertragen. Sodann wurde die Lösung mit 50 µl einer Lösung mit einem Gehalt an 10 µl 10X-DNA-Polymerase I-Puffer, 10 µl einer Lösung, die vorher in bezug auf jedes Desoxynucleosid-triphosphat (dATP, dTTP, dGTP und dCTP) auf eine Konzentration von 2,5 millimolar gebracht worden war, 25 µl H₂O und 5 Einheiten DNA-Polymerase I (Klenow-Fragment) versetzt. Dieses 100- µl-Reaktionsgemisch wurde 4 Stunden bei 37°C inkubiert. Die Lösung wurde sodann 1mal mit Phenol-Chloroform extrahiert. Hierauf wurde mit Äthanol gefällt, durch Lyophilisation getrocknet und schließlich mit 10 Einheiten Sau3A eine erschöpfende Restriktion durchgeführt. Man ließ diese Lösung sodann auf auf einem 6prozentigen Acrylamidgel laufen. Die Bande entsprechend einer Größe von 39 bp wurde aus dem Gel geschnitten und sodann auf die vorstehend erläuterte Weise durch Elektroelution isoliert. Diese 39-bp-Bande weist ein stumpfes Ende und ein Sau3A-kohäsives Ende auf. Dieses Fragment wurde zu einem modifizierten pFIF-trp-69-Vektor (5) geklont. 10 µg pFIF- trp-69 wurden mit XbaI linearisiert, 1mal mit Phenol-Chloroform extrahiert und sodann mit Äthanol gefällt. Das XbaI- kohäsive Ende wurde unter Verwendung von DNA-Polymerase I (Klenow-Fragment) in 50 µl Reaktionsmedium, das jeweils 250 mikromolar an den einzelnen Nucleosidtriphosphaten war, gefüllt. Diese DNA wurde mit BamHI geschnitten und auf 6prozentigem Acrylamidgel laufen gelassen. Das Vektorfragment wurde aus dem Gel durch Elektroelution isoliert und sodann in 20 µl H₂O resuspendiert. 20 ng dieses Vektors wurden 4 Stunden bei Raumtemperatur mit 20 ng des oben hergestellten 39-bp-Fragments verknüpft. 1/5 des Ligationsgemisches wurden zur Transformation von E. coli Stamm 294 verwendet, um diesem Stamm Ampicillin-Resistenz (auf LB+20 µg/ml amp-Platten) zu verleihen. Plasmide aus den Transformanten wurden durch ein Schnellsichtungsverfahren (44) überprüft. Ein Plasmid, pPGK-39, wurde für die Sequenzanalyse ausgewählt. 20 µg dieses Plasmids wurden mit XbaI verdaut, mit Äthanol gefällt und sodann mit 1000 Einheiten 45 Minuten bei 68°C mit bakterieller alkalischer Phosphatase behandelt. Die DNA wurde 3mal mit Phenol-Chloroform extrahiert und sodann mit Äthanol gefällt. Die dephosphorylierten Enden wurden sodann in 20 µl Reaktionsmedium mit einem Gehalt an 200 µCi [γ³²-P]-ATP und 10 Einheiten T₄-Polynucleotidkinase markiert. Das Plasmid wurde mit SalI geschnitten und auf einem 6prozentigen Acrylamidgel laufen gelassen.

Die markierte Insertbande wurde aus dem Gel isoliert und nach dem chemischen Abbauverfahren (52) sequenziert. Die DNA-Sequenz am 3′-Ende dieses Promotorstücks entsprach den Er wartungen.

2. Aufbau des 312 bp-PvuI- bis-EcoRI-PGK-Promotorfragments

25 µg pPGK-39 (Fig. 13) wurden gleichzeitig mit SalI und XbaI (jeweils 5 Einheiten) verdaut und sodann der Elektrophorese an einem 6prozentigen Gel unterworfen. Die 390-bp- Bande, die das 39-bp-Promotorstück enthielt, wurde durch Elektroelution isoliert. Die resuspendierte DNA wurde der Restriktion mit Sau3a und sodann der Elektrophorese an einem 8prozentigen Acrylamidgel unterworfen. Die 39-bp-PGK-Promotorbande wurde durch Elektroelution isoliert. Diese DNA enthielt 39 bp des 5′-Endes des PGK-Promotors an einem Sau3A- bis -XbaI-Fragment.

25 µg pB1 wurden der Restriktion mit PvuI und KpnI und sodann der Elektrophorese an einem 6prozentigen Acrylamidgel unterworfen. Die 0,8-kbp-Bande von DNA wurde durch Elektroelution isoliert und der Restriktion mit Sau3A und sodann der Elektrophorese an einem 6prozentigen Acrylamidgel unterworfen. Die 265-bp-Bande aus dem PGK-Promotor (Fig. 11) wurde durch Elektroelution isoliert.

Diese DNA wurde sodann mit dem 39-bp-Promotorfragment (vgl. oben) 2 Stunden bei Raumtemperatur verknüpft. Das Ligationsgemisch wurde der Restriktion mit XbaI und PvuI und sodann der Elektrophorese an einem 6prozentigen Acrylamidgel unterworfen. Das 312 bp-Xba- bis PvuI-Restriktionsfragment wurde durch Elektroelution isoliert und sodann zu einem Ligationsgemisch mit einem Gehalt an 200 ng pBR322 (41) (vorher isoliert unter Weglassen des 162-bp-PvuI- bis -PstI-Restriktionsfragments) und 200 ng des XbaI- bis -PstI-LeIF A-cDNA-Gens (vorher isoliert aus 20 µg pLeIF-trp A 25). Dieses 3 Faktoren enthaltende Ligationsgemisch wurde zur Transformation von E. coli Stamm 294 verwendet, um diesem Stamm Tetracyclin- Resistenz zu verleihen. Transformantenkolonien wurden einer Minisichtung (44) unterworfen. Eine der Kolonien, pPGK-300 wurde isoliert. Sie wies 304 bp von PGK-5′-Flanken-DNA verschmolzen mit LeIF A-Gen in einem auf pBR322 basierenden Vektor auf. Das 5′-Ende des LeIF A-Gens weist folgende Sequenz auf: 5′-CTAGAATTC-3′. Diese Verschmelzung der XbaI-Stelle aus dem PGK-Promotorfragment in diese Sequenz erlaubt die Hinzufügung einer EcoRI-Stelle an die XbaI-Stelle. pPGK-300 enthält somit einen Teil des in einem PvuI- bis-EcoRI-Fragment isolierten PGK-Promotors.

3. Aufbau eines 1500 bp-EcoRI- bis-EcoRI-PGK-Promotorfragments

10 µg pBI wurden mit PvuI und EcoRI verdaut und auf einem 6prozentigen Acrylamidgel laufen gelassen. Die 1,3-kb-PvuI- bis -EcoRI-DNA-Bande der PGK-5′-Flanken-DNA wurde durch Elektroelution isoliert. 10 µg pPGK-300 wurden mit EcoRI und PvuI verdaut. Das 312-bp-Promotorfragment wurde nach Elektrophorese des Verdauungsgemisches an einem 6prozentigen Acrylamidgel durch Elektroelution isoliert. 5 µg pFRL4 wurden mit EcoRI geschnitten, mit Äthanol ausgefällt und sodann 45 Minuten bei 68°C mit bakterieller alkalischer Phosphatase behandelt. Nach 3 DNA-Extraktion mit Phenol-Chloroform, Äthanolfällung und Resuspension in 20 ml H₂O wurden 200 ng des Vektors mit 100 ng 312 bp EcoRI- bis -PvuI-DNA aus pPGK-300 und 10 ng EcoRI- bis -PvuI-DNA aus pB1 verknüpft. Das Ligationsgemisch wurde zur Transformation von E. coli Stamm 294 verwendet, um diesem Stamm Ampicillin-Resistenz zu verleihen. Bei einer der erhaltenen Transformanten handelte es sich um pPGK-1500. Dieses Plasmid enthält das 1500-bp-PKG-Promotorfragment als ein EcoRI- bis -EcoRI oder HindIII- bis -EcoRI-Stück von DNA.

10 µg pPGK-1500 wurden vollständig mit ClaI und EcoRI verdaut. Anschließend wurde das Verdauungsgemisch der Elektrophorese an einem 6prozentigen Acrylamidgel unterworfen. Das 900-bp- Fragment, das den PGK-Promotor enthält, wurde durch Elektroelution isoliert. 10 µg pIFN-γ-trp 48 wurden vollständig mit EcoRI und HincII verdaut und der Elektrophorese an einem 6 prozentigen Acrylamidgel unterworfen. Die 938-bp-Bande, die die direkt exprimierbare IFN-γ-cDNA enthält, wurde durch Elektroelution aus dem Gel isoliert.

Der Hefeexpressionsvektor wurde in einer Dreifaktorenreaktion durch Verknüpfung des PGK-Promotorfragments (an einem ClaI- bis -EcoRI-Stück), des der Deletion unterworfenen pFRM-31 und der vorstehend isolierten IFN-γ-cDNA aufgebaut. Das Ligationsreaktionsgemisch wurde 12 Stunden bei 14°C inkubiert. Das Ligationsgemisch wurde sodann zur Transformation von E. coli Stamm 294 verwendet, um diesem Stamm Ampicillin-Resistenz zu verleihen. Transformanten wurden zur Feststellung der Anwesenheit des einwandfrei aufgebauten Expressionsplasmids pPGK- IFN-q (Fig. 16) analysiert. Plasmide mit einem Gehalt an diesem Expressionssystem wurden zur Transformation von Sphäroplasten des Hefestammes RH2 18 verwendet, um diesem Stamm Tryptophan-Prototrophie in einem kein Tryptophan enthaltenden Agar zu verleihen. Diese Rekombinantenhefe wurde dann auf die Anwesenheit von rekombinantem Human-Immuninterferon untersucht.

Hefeextrakte wurden folgendermaßen hergestellt: 10-ml-Kulturen wurden in YNB+CAA bis zum Erzielen eines A₆₆₀-Wertes von etwa 1 bis 2 gezüchtet. Sodann wurde zentrifugiert und in 500 µl PBS (20 millimolar NaH₂PO₄, pH-Wert 7,4, 150 millimolar NaCl) resuspendiert. Ein gleiches Volumen an Glasperlen (0,45 bis 0,5 mm) wurde zugegeben. Das Gemisch wurde 2 Minuten durchgewirbelt. Die Extrakte wurden 30 Sekunden bei 14 000 U/min zentrifugiert. Der Überstand wurde entfernt. Die Interferonaktivität im Überstand wurde zu 16 000 Einheiten/ml bestimmt, wobei die Bestimmung unter Vergleich mit einem IFN-α-Standard unter Anwendung des CPE-Hemmtests erfolgte.

M. Aufbau von Zellkulturvektor pSVγ 69

Das 342 Basenpaar-HindIII-PvuII-Fragment, das die SV40-Startstelle umfaßte, wurde in ein EcoRI-restriktionsstellengebundenes Fragment umgewandelt. Die HindIII-Stelle wurde durch Zusatz eines synthetischen Oligomers (5′dAGCTGAATTC) umgewandelt. Die PvuII-Stelle wurde durch stumpfendige Verknüpfung unter Verwendung von Polymerase I (Klenow-Fragment) in eine gefüllte EcoRI-Stelle verwandelt. Das erhaltene EcoRI-Fragment wurde in die EcoRI-Stelle von pML-1 (28) eingesetzt. Ein Plasmid mit dem vom amp^R-Gen wegorientierten SV40-späten Promotor wurde durch Entfernen der EcoRI-Stelle nächst dem amp^R-Gen von pML-1 (27) weiter modifiziert.

Das 1023 Basenpaar-HpaI-BglII-Fragment von geklonter HBV-DNA (60) wurde isoliert und die HpaI-Stelle von Hepatitis B-Virus (HPV) mit einem synthetischen Oligomeren (5′dGCGAATTCGC) in eine EcoRI-Stelle umgewandelt. Dieses EcoRI-BglII-gebundene Fragment wurde direkt in die EcoRI- BamHI-Stellen des vorstehend beschriebenen Plasmids, das die Startstelle von SV40 enthält, geklont.

In die verbleibende EcoRI-Stelle wurde das IFN-γ-Gen an ein 1250-Basenpaar-PstI-Fragment von p69 nach Umwandlung der PstI-Enden zu EcoRI-Enden eingesetzt. Klone wurden isoliert, in denen dem SV40-späten Promotor das Strukturgen von IFN-γ vorherging. Die erhaltenen Plasmide wurden sodann in Gewebekulturzellen (29) eingeführt, wobei eine DEAE-Dextrantechnik (61), die so modifiziert war, daß die Transfektion in Gegenwart des DEAE-Dextrans 8 Stunden durchgeführt wurde, angewendet wurde. Die Zellmedien wurden alle 2 bis 3 Tage ausgetauscht. 200 µl wurden täglich zur biologischen Interferonbestimmung entfernt. Typische Ausbeuten betrugen 50 bis 100 Einheiten/ml bei Proben, die 3 oder 4 Tage nach der Transfektion bestimmt wurden.

Die Analyse ergibt, daß bei Expressionprodukt der N-terminale CYS-TYR-CYS- Bereich von rekombinanten Human-Immuninterferon fehlt (vgl. Fig. 5), woraus folgt, daß die Spaltung des Signalpeptids an der CYS-GLN-Verknüpfung (Aminosäuren 3 und 4 in Fig. 5) erfolgt, so daß das reife Polypeptid tatsächlich aus 143 Aminosäuren besteht; siehe die zur Akte eingereichten Affidavits von Dr. J. Ramachandran und Prof. D. N. Ward.

N. Partielle Reinigung von des-CYS-TYR-CYS-rekombinanten Human-Immuninterferon

Um größere Mengen an aus Affenzellen abgeleitetem Human-IFN-γ zu erhalten, wurden frische Monolayers von COS-7-Zellen in 10 cm-Platten der Transfektion mit insgesamt 30 µg pDLIF3 in 110 ml DEAE-Dextran (200 µg/ml DEAE-Dextran, Molekulargewicht 500 000, 0,05 M Tris, pH-Wert 7,5, in DMEM) unterworfen. Nach 16 Stunden bei 37°C wurden die Platten 2mal mit DMEM gewaschen. 15 ml frisches DMEM, ergänzt mit 10 Prozent f.b.s., 2 millimolar Glutamin, 50 µg/ml Penicillin G und 50 mg/ml Streptomycin, wurden sodann zu jeder Platte gegeben. Die Medien wurden am folgenden Tag mit serumfreien DMEM ersetzt. Sodann wurden jeden Tag frische, serumfreie Medien zugesetzt. Die gesammelten Medien wurden bei 4°C aufbewahrt, bis sie entweder einem Test unterworfen oder an CPG gebunden wurden.

Die vereinigten Fraktionen von Proben vom 3. und 4. Tag nach der Transfektion enthielten im wesentlichen die gesamte Ak tivität.

0,5 g CPG ("controlled pore glass", 120/200 mesh) wurden zu 100 ml Zellüberstand gegeben. Das Gemisch wurde 3 Stunden bei 4°C gerührt. Nach kurzer Zentrifugation in einer "bench top"-Zentrifuge wurden die abgesetzten Kügelchen in eine Säule gepackt und gründlich mit 20 millimolaren NaPO₄-Puffer vom pH-Wert 7,2 mit einem Gehalt an 1 M NaCl und 0,1 Prozent β-Mercaptoäthanol gewaschen. Die Aktivität wurde sodann mit dem gleichen Puffer mit einem Gehalt an 30 Prozent Äthylenglykol eluiert. Schließlich wurde die Elution mit dem vorgenannten Puffer mit einem Gehalt an 50 Prozent Äthylenglykol fortgesetzt. Die gesamte Aktivität war im wesentlichen an CPG gebunden. 75 Prozent der eluierten Aktivität fanden sich in den mit 30 Prozent Äthylenglykol eluierten Fraktionen. Diese Fraktionen wurden vereinigt und mit 20 millimolaren NaPO₄-Puffer vom pH-Wert 7,2 mit einem Gehalt an 1 M NaCl auf eine Endkonzentration von 10 Prozent Äthylenglykol verdünnt und direkt auf eine mit 10 ml Con A- Sepharose-Säule aufgesetzt. Nach gründlichem Waschen mit 20 millimolarem NaPO₄-Puffer vom pH-Wert 7,2 mit einem Gehalt an 1 M NaCl wurde die Aktivität mit 20 millimolarem NaPO₄-Puffer mit einem Gehalt an 1 M NaCl und 0,2 M α-Methyl-D-Mannosid eluiert. Ein wesentlicher Anteil der Aktivität (55 Prozent) wurden nicht an dieses Lectin gebunden. 45 Prozent der Aktivität wurden mit α-Methyl-D-Mannosid eluiert.

Arzneipräparate

Die Verbindungen der Erfindung können nach bekannten Verfahren zu Arzneipräparaten verarbeitet werden, wobei das Human-Immuninterferon mit einem pharmakologisch verträglichen Träger kombiniert wird. Entsprechende Trägerstoffe und deren Formulierung sind in Remingtons Pharmaceutical Sciences, E. W. Martin, beschrieben. Diese Arzneipräparate enthalten eine wirksame Menge Interferonprotein zusammen mit einer geeigneten Menge an Träger, so daß pharmakologisch verträgliche Arzneipräparate, die sich zur Verabreichung an den Wirt eignen, erhalten werden.

A. Parenterale Verabreichung

Das erfindungsgemäße Human-Immuninterferon kann parenteral verabreicht werden, wenn eine Antitumorbehandlung, antivirale Behandlung oder eine Behandlung von immunosuppressiven Zuständen erforderlich ist. Die Dosierung kann ebenso wie bei anderen Human-Immuninterferonen, die gegenwärtig klinisch untersucht werden, erfolgen, z. B. (1-10)×10⁶ Einheiten täglich und im Fall von Materialien mit einer Reinheit von mehr als 1 Prozent bis zu etwa 50×10⁶ Einheiten täglich. Die IFN-γ- Dosen können zur Erzielung einer stärkeren Wirkung beträchtlich erhöht werden, was auf die weitgehende Abwesenheit von anderen, sich von IFN-γ unterscheidenden Proteinen, die bei aus menschlichen Quellen abgeleiteten Materialien bestimmte ungünstige Wirkungen hervorrufen können, zurückzuführen ist.

Eine geeignete Dosierung für im wesentlichen homogenes IFN-γ zur parenteralen Verabreichung besteht aus 3 mg IFN-γ mit einer spezifischen Aktivität von etwa 2×10⁸ U/mg, gelöst in 25 ml 5 n Serumalbumin (Mensch) -USP. Die Lösung wird durch ein bakteriologisches Filter gegeben. Die filtrierte Lösung wird aseptisch in 100 Fläschchen unterteilt, die jeweils 6×10⁶ Einheiten reines, zur parenteralen Verabreichung geeignetes Interferon enthalten. Die Fläschchen werden vor der Verwendung vorzugsweise in der Kälte (-20°C) gelagert.

Biologische Daten A. Charakterisierung der antiviralen Aktivität

Für Antikörper-Neutralisationsreaktionen werden Proben gegebenenfalls mit PBS-BSA auf eine Konzentration von 500 bis 1000 Einheiten/ml verdünnt. Gleiche Probenvolumina werden 2 bis 12 Stunden bei 4°C mit Reihenverdünnungen von Kaninchen- Antihuman-Leukozyten-, Fibroblasten- oder Immuninterferon- Antiseren inkubiert. Anti-IFN-α und -β wurden vom National Institut of Allergy and Infectious Diseases erhalten. Anti-IFN- γ wurde unter Verwendung von authentischem IFN-γ (Reinheit 5 bis 20 Prozent), gereinigt aus stimuliertem peripheren Blutlymphozyten, hergestellt. Die Proben wurden vor der Bestimmung 3 Minuten bei 12 000 g zentrifugiert. Zur Untersuchung der Stabilität beim pH-Wert 2 wurden die Proben durch Zusatz von 1 n HCl auf den pH-Wert 2 eingestellt, 2 bis 12 Stunden bei 4°C inkubiert und vor dem Test durch Zusatz von 1 n NaOH neutralisiert. Der Test auf Empfindlichkeit gegenüber Natriumdodecylsulfat (SDS) wurden durchgeführt, indem die Proben vor der Bestimmung 2 bis 12 Stunden bei 4°C mit gleichen Volumina 0,2prozentiger SDS-Lösung inkubiert wurden.

B. Charakterisierung von IFN-γ, gebildet durch E. coli- und COS-7-Zellen

Diese Tabelle zeigt das charakteristische Verhalten von IFN-α -β- und -γ-Standards nach verschiedenen Behandlungsweisen. Die durch E. coli W3110/pIFN-γtrp 48 und durch COS-7/pSVγ 69 gebildete Interferonaktivität ist säureempfindlich und SDS- empfindlich und wird durch Immuninterferon-Antiserum neutralisiert. Es wird nicht durch Antikörper gegen IFN-α oder -β neutralisiert. Diese Daten bestätigen, daß es sich bei den in diesen Systemen gebildeten Produkten um Immuninterferone handelt und daß das cDNA-Insert des Plasmids p69 IFN-γ kodiert.

Reinigung

Ein Verfahren, nach dem IFN-γ z. B. aus Bakterien gereinigt werden kann, ist in dem folgenden allgemeinen Schema beschrieben:

1. Extraktion der Zellen in einem Lysepuffer (etwa pH 8) von hoher Leitfähigkeit mittels Passage durch einen Homogenisator bei hohem Druck, Abkühlen des Abstroms in einem Eisbad.
2. Ausfällung der DNA durch Zugabe von Polyethylenimin unter Rühren z. B. bei 4°C.
3. pH-Ausfällung der bakteriellen Proteine, wobei wiederum IFN-γ in Lösung bleibt.
4. Abzentrifugieren der Feststoffe bei 4°C.
5. Konzentrieren des Überstands (nach erneuter Einstellung des pH) z. B. durch Ultrafiltration.
6. Dialyse des Konzentrats gegen einen Puffer von niedriger Leitfähigkeit.
7. Abzentrifugieren der Feststoffe, wobei IFN-γ in Lösung bleibt.
8. Ionenaustauschchromatographie an Carboxymethylcellulose, Elution mit einem Gradienten an zunehmender Ionenstärke.
9. Chromatographie an Calciumphosphat-Gel und Elution mit einem Gradienten an zunehmender Ionenstärke.
10. Ionenaustauschchromatographie an Carboxymethylcellulose unter schwach denaturierenden Bedingungen und Elution mit einem Gradienten an zunehmender Ionenstärke.
11. Abtrennung durch Gelfiltrationschromatographie.

Das genannte Verfahren ermöglicht Materialausbeuten mit einer Reinheit von mehr als 95%.

Das erfindungsgemäße Immuninterferonprotein wurde durch determinierte DNA-Gensequenzierung und abgeleitete Aminosäuresequenzierung (vgl. Fig. 5) definiert. Es wird darauf hingewiesen, daß für dieses spezielle erfindungsgemäße Interferon natürliche Allelvariationen existieren, die von Individuum zu Individuum unterschiedlich sein können. Diese Variationen machen sich durch Unterschiede bezüglich einer oder mehreren Aminosäuren in der Gesamtsequenz oder durch Deletionen, Substitutionen, Insertionen, Inversionen oder Additionen von einer oder mehreren dieser Aminosäuren in der Sequenz bemerkbar. Unter den Gegenstand der Erfindung fallen sämtliche derartigen Allelvariationen.

Es besteht tatsächlich die Möglichkeit einer Anwendung der rekombinanten DNA-Technik zur Herstellung verschiedener Human-IFN-γ-Derivate, die durch ein- oder mehrfache Aminosäuresubstitutionen, -deletionen, -additionen oder -auswechslungen in verschiedener Weise modifiziert sind.

Alle derartigen Modifikationen, die solche Derivate von Human-IFN-γ ergeben, werden von der vorliegenden Erfindung erfaßt, solange die essentielle charakteristische Human-IFN-γ-Aktivität der Art nach unbeeinträchtigt bleibt.

Mit Hilfe der DNA- und Aminosäuresequenzen von IFN-γ (siehe Fig. 5) besteht der vorteilhafteste Weg zur Nacharbeitung der Erfindung zweifellos darin, entweder das vollständige Gen zu synthetisieren (siehe z. B. 26) oder synthetische Desoxyoligonucleotide herzustellen, mit denen die cDNA-Quelle getestet werden kann, um das Gen mittels Standard-Hybridisierungsmethoden zu isolieren. Sobald man die Nucleotidsequenz mit dem Code für das gewünschte IFN-γ-Protein erhalten hat, lassen sich die Expression, Isolierung und Reinigung zu hoch-reinen IFN-γ-Präparaten in Anlehnung an die vorstehende Beschreibung durchführen.

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Claims

1. Polypeptid mit Human-Immuninterferon (IFN-γ )- Eigenschaften mit einer in Fig. 5 dargestellten Aminosäuresequenz und deren Allelvariationen, wobei Fig. 5 Bestandteil dieses Anspruchs ist.

2. Polypeptid nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Tripeptid-Sequenz CYS-TYR-CYS am N-terminalen Ende der in Fig. 5 dargestellten Aminosäuresequenz 1 bis 146 fehlt.

3. Polypeptid nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es zusätzlich die Aminosäure Methionin enthält, die am N-terminalen Ende der ersten Aminosäure des Interferons gebunden ist.

4. Polypeptid nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es zusätzlich ein abspaltbares Konjugat oder Signalprotein enthält, das am N-terminalen Ende der ersten Aminosäure des Interferons gebunden ist.

5. Polypeptid nach einem der Ansprüche 1, 3 und 4, dadurch gekennzeichnet, daß es frei ist von nativer Glycosylierung.

6. DNA-Isolat mit einer für das Polypeptid nach einem der Ansprüche 1 bis 4 kodierenden DNA-Sequenz.

7. Replizierbarer Expressionsträger, dadurch gekennzeichnet, daß er in einem Mikroorganismus oder einer Zellkultur zur Expression eines Polypeptids nach einem der Ansprüche 1 bis 4 fähig ist.

8. Plasmid pIFN-γ-trp 48 mit der in Fig. 7 dargestellten Struktur, wobei Fig. 7 Bestandteil dieses Anspruchs ist.

9. Plasmid pSV-γ-69 mit der in Fig. 8 dargestellten Struktur, wobei Fig. 8 Bestandteil dieses Anspruchs ist.

10. Plasmid pPGK-IFN-γ mit der in Fig. 16 dargestellten Struktur, wobei Fig. 16 Bestandteil dieses Anspruchs ist.

11. Mikroorganismus oder Zellkultur, dadurch gekennzeichnet, daß sie mit einem Expressionsträger nach einem der Ansprüche 7, 8, 9 oder 10 transformiert worden ist.

12. Zellkultur nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß sie durch Transformieren einer Säugetier- Zellkultur erhalten worden ist.

13. Zellkultur nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß sie durch Transformieren der COS-7-Linie von Affennieren-Fibroblasten erhalten worden ist.

14. Mikroorganismus nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß er durch Transformieren eines E. coli-Stammes erhalten worden ist.

15. Mikroorganismus nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß er durch Transformieren eines Hefestammes erhalten worden ist.

16. Verfahren zur Herstellung eines Polypeptids mit Human-Immuninterferon (IFN-γ )-Eigenschaften nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß man in einem transformierten Mikroorganismus oder einer transformierten Zellkultur gemäß einem der Ansprüche 11 bis 15 eine Expression eines Gens durchführt, das für das Polypeptid gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4 kodiert.