JP2515308B2 - ヒト免疫インタ−フエロン - Google Patents

ヒト免疫インタ−フエロン

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Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、組換えDNA技術の領域に係る。即ち本発明
は、組換えDNA技術を利用してヒト免疫インターフェロ
ンのDNA配列とそれから演繹推定されるアミノ酸配列を
解析するための手段と方法に係り、更にヒト免疫インタ
ーフェロンの製法及びこの製法により産生される種々の
産生物及びそれらの用途に係る。
より詳細には本発明は、ヒト免疫インターフェロンを
コードするDNA配列の単離及び同定、これらDNA配列を発
現プロモーター配列に有効に発現し得るように（正しく
読み取られるように）結合させて得られる組換えDNA発
現ベヒクルの構成並びにこうして構成される発現ベヒク
ルに係る。本発明は更に、前記の如き発現ベヒクルで形
質転換され従って前記DNA配列を発現し得る培養系、例
えば種々の微生物及び脊椎動物細胞培養（セルカルチャ
ー）に係る。更に本発明は、前記の如く発現した目的産
生物をヒトの病気の予防処置又は治療処置に有用な新規
な安全体例えば薬剤に転換する手段及び方法に係る。好
ましい具体例によれば本発明は、ヒト免疫インターフェ
ロンが成熟した形態で宿主細胞から分泌されるように正
当に結合された特定の発現ベヒクルを提供する。更に本
発明は、前記DNA配列、発現ベヒクル、宿主培養系、目
的産生物及び該産生物を含む完全体の製造に有用な種々
の方法並びに対応するそれらの特定具体例に係る。
本発明は、部分的には、ヒト免疫インターフェロンを
コードするDNA配列及びそれから推定される構成アミノ
酸配列を知見したことを端緒とする。更に本発明は、ヒ
ト免疫インターフェロン遺伝子の３′−及び５′−フラ
ンキング（flanking）配列に関する配列情報を提供す
る。その結果、インビトロ（in vitro）で該配列を発現
ベヒクルへ結合することが容易になる。特に本発明は、
所謂成熟ヒト免疫インターフェロンのアミノ酸配列の直
前に位置する所謂内因性（endogenous）シグナルポリペ
プチドをコードする５′−DNAセグメントを提供する。
これらの知見に基いて、組換えDNA技術を用いることに
より十分な量のヒト免疫インターフェロンの産生手段及
び方法の開発が次第に可能となり、従ってこの物質の生
化学的特性及び生物活性の測定も可能になった。
本発明のバックグラウンドを明らかにし且つ特定の場
合には本発明の実施に関する詳細を補う目的で、本文中
に多くの刊行物及び学術論文を参照として引用した。便
宜上、これらの参考文献に参照番号を付し、目録として
本明細書末尾に添付した。本文中では参考文献を参照番
号で示す。
ヒトインターフェロンは抗原性、生物学的特性、生化
学的特性の違いに基いて３つのグループに分類し得る。
第１グループはヒト白血球インターフェロン（α−イ
ンターフェロン、LeIF又はIFN−α）類である。このグ
ループのインターフェロンは、通常、ヒト血液の成分細
胞のウィルス誘発によって主として産生する。IFN−α
は、既に、微生物で産生され、生物学的に活性であるこ
とが知見され（後記参考文献１、２及び３参照。以下、
同様に、括弧でくくった参照番号によって後掲の参考文
献を引用して示す）、ウィルス感染症及び悪性腫瘍状態
の治療薬としての臨床使用が促進されている（４）。
第２グループはヒト線維芽細胞インターフェロン（β
−インターフェロン、FIF又はIFN−β）である。このグ
ループのインターフェロンは、通常、線維芽細胞のウィ
ルス誘発によって産生する。IFN−βも同じく微生物で
産生され、広い範囲の生物学的活性を示すことが知見さ
れた（５）。臨床試験もIFN−βの潜在的治療価値を示
唆している。
IFN−αとIFN−βは、アミノ酸レベルでの相同（homo
logy）の程度が比較的低いにもかかわらず、生物学的特
性が極めて類似している。更に、これらのインターフェ
ロンはいずれも、165乃至166個のアミノ酸を含み且つ酸
に対して安定なタンパクである。
本発明の目的たるヒト免疫インターフェロン（IFN−
γ、ヒトガンマインターフェロンともいう）は、IFN−
α及びIFN−βと対照的にpH2で不安定であり、主として
リンパ球のマイトゲン誘発によって産生し、しかも明ら
かに異なった抗原性を示す。すなわちヒトIFN−γはヒ
トIFN−γ抗血清により中和されるが、ヒトIFN−αに対
する抗体またはヒトIFN−βに対する抗体のいずれによ
っても中和されない。
最近まで、ヒトIFN−γを極めて低いレベルでしか検
出されなかったため、特性決定が困難であった。最近に
なって、ヒトIFN−γのかなり進んだ精製が報告された
（６）が、この精製もまだ部分的なものである。この報
告によれば、フイトヘムアグルチニン（phytohaemagglu
tin）とホルボールエステル（phorbol ester）との組合
せを用いてリンパ球培地（カルチャー）を刺激して化合
物（IFN−γ）を産生し、一連のクロマトグラフ分離に
よってこの化合物を精製した。この方法で分子量58,000
の産生物が得られた。
mRNAを卵母細胞中で翻訳するとヒトIFN−γに特有の
インターフェロン活性を示す極めて少量のヒトIFN−γ
が産生した。これにより、IFN−γcDNAの合成及びクロ
ーニングが可能でると予想された（７）。
これまでは、十分な量のIFN−γが得られなかったた
め、精製した成分の特性決定及び生物学的特性を明らか
にするための実験を行なうことができなかった。しかし
乍ら、粗製剤を用いたインビトロ（in vitro）テスト及
びネズミIFN−γ製剤を用いたインビボ（in vivo）テス
トにより、IFN−γの主たる作用は免疫調節剤たる作用
であろうと推定されていた（8,9）。IFN−γは、全ての
ヒトインターフェロンに共通の抗ウィルス活性及び抗細
胞活性を有しており、加えて、IFN−α及びIFN−βの活
性に相乗効果を与える（10）。更に、腫瘍細胞に対する
IFN−γのin vitro抗増殖効果は、他のグループのイン
ターフェロンの約10乃至100倍であると報告された（8,1
1,12）。この結果と顕著な免疫調節作用（8,9）とを合
せて考慮すると、IFN−γはIFN−α及びIFN−βよりも
遥かに顕著な抗腫瘍作用を有すると推定される。事実、
マウス及びネズミIFN−γ製剤を用いたin vivoテストで
は、骨肉腫に対する抗腫瘍作用が、抗ウィルス的に誘発
されたインターフェロンよりも明らかにすぐれているこ
とが証明された（13）。
IFN−γが極めて入手し難いため本発明以前の前記の
如きテストではいずれも、かなり粗な製剤を使用せざる
を得なかった。にもかかわらず、これらのテストからIF
N−γの極めて重要な生物学的作用を確信することがで
きた。IFN−γは、抗ウィルス活性を保有するのみでな
く、多分強力な免疫調節及び抗腫瘍活性を有しており、
極めて有望な治療薬になり得る筈である。
以上をまとめるならば、本発明以前にIFN−γの存在
は知られその生物学的作用面における有効性が期待され
ていたにもかかわらず、IFN−γは純粋なかたちで単離
されていなかった。
組換えDNA技術を応用した方法によって、必要な量の
ヒトIFN−γを極めて有効に産生し得ることが判明し
た。産生される物質は、天然のヒト由来物質の特徴であ
ると思われるグリコシレーション（glycosylation）を
含むか否かに関わり無く、ウィルス，新生（腫瘍）及び
免疫抑制の見られる種々の症状又は病気の治療のために
臨床使用することが可能な生物活性を示すであろう。
組換えDNA技術は、かなり複雑な応用の段階に到達し
た。分子生物学者は、種々のDNA配列をかなり容易に組
換えて、形質転換微生物中で大量の外因性（exogenou
s）タンパク産物を産生し得る新しいDNA完全体を作成し
得る。種々の平滑末端又は“付着”末端を有するDNA断
片をin vitroで結合し、特定微生物の形質転換に使用し
得る有効は発現ベヒクルを製造し、これらのベヒクルに
所望の外因性産物を有効に合成させるための一般的な手
段及び方法はすでに開発されている。しかし乍ら、個々
の産物に関しては、技術がまだ開発途上であり、常に成
功を予測し得るほどには技術は進歩していない。実際、
実験による裏付けをもたずに結果の成功を予言した学者
もいるが、彼等の方法は、実行不能である危険を含む。
プラスミド、すなわちしばしば細胞１個当りマルチコ
ピーとして細菌又は他の微生物中に見出される二本鎖DN
Aの非染色体ループは依然として組換えDNA技術の基本的
要素である。プラスミドDNAがコードする情報には、娘
細胞内でプラスミドを再生するのに必要な情報、すなわ
ち複製の開始点（オリジン）が含まれ、さらに通常は、
所望のプラスミドを含有する宿主細胞のクローンを識別
し且つ選択培地で優先的に増殖させうるような１つもし
くはそれ以上の選択特性、たとえば抗生物質に対する耐
性が含まれる。プラスミドの有用性は、それぞれプラス
ミドDNA上の異なる部位を識別する或る種の制限エンド
ヌクレアーゼすなわち「制限酵素」により特異的に開裂
させうる点にある。その後、開裂部位またはこの開裂部
位に隣接して再構成した末端における末端−末端結合に
より、異種遺伝子もしくは遺伝子断片をプラスミド中に
挿入することができる。このようにして、いわゆる複製
可能な発現ベヒクルが形成される。DNAの組換えは細胞
の外部で行なわれ、得られた「組換え体」である複製可
能な発現ベヒクル、すなわちプラスミドを形質転換とし
て知られる過程により細胞中に導入し、この形質転換体
を増殖させることにより組換えベヒクルを多量に得るこ
とができる。さらに、コードされているDNAメッセージ
の転写及び翻訳を支配するプラスミドの部分に対して遺
伝子が適正に挿入されれば、得られる発現ベヒクルを使
用して挿入遺伝子がコードするポリペプチド配列を実際
に産生させることができる。この過程を発現と名付け
る。
発現ば、プロモーターとして知られる領域で開始され
る。RNAポリメラーゼがこのプロモーターを識別し結合
する。発現の転写期において、DNAはほどけて（unwindi
ng）、DNA配列からメッセンジャーRNAを合成する鋳型と
して露出させる。次いで、メッセンジャーRNAは、メセ
ンジャーRNAがコードしていたアミノ酸配列を有するポ
リペプチドに翻訳される。各アミノ酸はヌクレオチドト
リプレットすなわち「コドン」によりコードされ、この
コドンが集合して「構造遺伝子」すなわち発現されるポ
リペプチド産生物のアミノ酸配列をコードする部分を構
成する。翻訳は「開始」信号（通常ATGであって、これ
は得られるメッセンジャーRNAにおいてはAUGになる）に
おいて開始する。いわゆる停止コドンは翻訳の終了を規
定し、従ってそれ以後アミノ酸ユニットは産生されな
い。産生した産生物は、必要に応じ微生物系で宿主細胞
を溶菌しかつ他の細菌蛋白質を適当に精製除去して産生
物を回収することにより得られる。
実際、組換えDNA技術の使用により、いわゆる直接的
発現法により全く異種のポリペプチドの発現が可能にな
り、或いは同種ポリペプチドのアミノ酸配列の一部と融
合した異種ポリペプチドを発現させることもできる。後
者の場合、目的とする生物活性産物は、時に、融合した
同種／異種ポリペプチド中で、細胞外環境において開裂
されるまで、生物的に不活性の形で存在する。英国特許
出願公報第2007676A号及びWetzel,American Scientist,
68,664（1980）参照。
遺伝学及び細胞生理学を研究するための細胞培養又は
組織培養技術は十分に確立している。単離した正常細胞
から連続トランスファ処理により永久細胞系（permanen
t cell line）を得てこれを維持する手段及び方法もす
でに知られている。研究に使用するためには、これらの
細胞系を液体培地中の固体担体上に維持するか、又は栄
養支持体を含む懸濁液中で増殖させる。機械的な問題さ
え解決できれば量産は容易である。技術の現状を更に十
分に理解するために、Microbiology,第２版、Harper an
d Row,Publishers,Inc,Hagerstown,Maryland（1973）、
特に1122頁以降、及び、Scientific American,245,66頁
以降（1981）を参考文献として引用する。
本発明は、ヒトIFN−γが組換えDNA技術によって、好
ましくは直接的な形態で、且つ市場で認可されるための
動物実験及び臨床試験を開始し且つ実施するに充分な量
で、上手く産生し得るという知見に基いている。産生物
は、その全ての形態において、人間のウィルス感染、悪
性腫瘍及び免疫抑制又は免疫欠如状態に対する予防又は
治療処置での使用に適している。その形態は、様々な可
能性のあるオリゴマーの形態を含んでおり、又、グリコ
シレーション（associatedglycosylation）を含むこと
もある。産生物は遺伝学的に操作された微生物又は細胞
培地系（セルカルチャーシステム）により産生される。
従って、従来よりもより有効にヒトIFN−γを産生し、
単離し得る可能性がある。その最適具体例は、単離し得
る量且つ成熟形態（mature form）でヒトIFN−γが産生
されて宿主細胞から分泌されるように微生物又はセルカ
ルチャーを遺伝学的に製造する方法である。
本発明は、このように産生されるヒトIFN−γ並びに
その産生手段及び方法を含む。本発明は更に、発現可能
な形態でヒトIFN−γをコードする遺伝子配列を含む複
製可能なDNA発現ベヒクルに係る。更に本発明は、前記
発現ベヒクルで形質転換した微生物菌株又はセルカルチ
ャーに係り、又、ヒトIFN−γを産生し得る前記の如く
形質転換された菌株又はカルチャーの微生物カルチャー
又はセルカルチャーに係る。更に本発明は、前記IFN−
γ遺伝子配列、DNA発現ベヒクル、微生物菌株及びセル
カルチャーを調製するのに有用な種々の方法並びに特定
の具体例に係る。更に本発明は、前記微生物及びセルカ
ルチャーの醗酵カルチャー（培地）の調製に係る。さら
に本発明は、直接発現産物として成熟形態で宿主細胞か
ら分泌されるヒトIFN−γの製造に係る。この方法は、
成熟ヒトIFN−γの配列をコードする遺伝子に加えて、
シグナルポリペプチドをコードする５′−フランキング
DNA配列を使用する。シグナルポリペプチドは、宿主生
物の細胞壁へ分子を運搬する際に補助的役割を果し、こ
の細胞壁において成熟ヒトインターフェロン産生物の分
泌過程中に開裂されると信じられている。この具体例に
より、細胞内宿主タンパク質又は細胞砕片の汚染物を除
去するように設計された関連方法を用いなくても、意図
する熟成IFN−γを単離且つ精製し得るようになる。
本明細書中、「成熟ヒトIFN−γ」とは、シグナルペ
プチド又はプレシーケンスペプチドを伴わないヒトIFN
−γの微生物又はセルカルチャー産生物を示し、このシ
グナルペプチド又はプレシーケンスペプチドはヒトIFN
−γmRNAの翻訳の際に常に存在するものである。従って
本発明は、第一アミノ酸としてのメチオニンを有してい
る。（構造遺伝子の前にATG開始シグナルコドンを挿入
することにより存在する）か、或いはメチオニンが細胞
内で又は細胞外で開裂されている場合は第一アミノ酸と
してのメチオニンを欠いている成熟ヒトIFN−γを提供
する。成熟ヒトIFN−γは通常のシグナルポリペプチド
以外のものとの複合タンパク質として産生され得、この
複合体は細胞外環境で特定的に開裂され得る（英国特許
出願公開第2007676A号参照）。最後に、成熟ヒトIFN−
γは外因性の余分のポリペプチドを開裂除去する必要も
なく直接発現により産生され得る。発現ベヒクルがシグ
ナルペプチドと成熟ヒトインターフェロンとを一緒に発
現し且つ所与の宿主がシグナルペプチドを除去できない
か或いは有効的に除去できない場合にはこのことは特に
重要である。このように産生された成熟ヒトIFN−γ
は、ウィルス病、悪性腫瘍及び免疫抑制又は免疫欠如状
態の治療に使用し得る適合レベルにまで回収、精製され
る。
本発明の生理活性ポリペプチドは次のようにして得ら
れた。
1.ヒト組織、例えばヒト脾組織又は末梢血液リンパ球を
IFN−γの産生を刺激するためマイトゲンと共に培養し
た。
2.前記セルカルチャーからのセルペレットについて、前
細胞質RNAを単離するためリボヌクレアーゼ阻害剤の存
在下で抽出した。
3.オリゴdT−カラムによりポリアデニル酸形態の全メッ
センジャーRNA（mRNA）を単離した。このmRNAをショ糖
密度勾配と酸−尿素ゲル電気泳動法とを用いてサイズ分
画した。
4.適当なmRNA（12乃至18S）を対応する一本鎖相補DNA
（cDNA）に転換し、これから二本鎖のcDNAを産生した。
ポリ−dCテーリング（poly−dC tailing）の後、前記DN
Aを一つ又は複数の表現型マーカーを有するプラスミド
のようなベクターの中に挿入した。
5.このように調製されたベクターを使用してコロニーラ
イブラリを提供する細菌細胞を形質転換した。前記のよ
うに誘導された誘発及び非誘発mRNAから調製された同位
体標識cDNAを複数に移されたコロニーライブラリ（dupl
icatecolony libraries）を個別に試験するために用い
た。次に余分のcDNAを除去し、誘発dDNAクローンを同定
するためコロニーをＸ線フィルムに露出させた。
6.誘発cDNAクローンから対応するプラスミドDNAを単離
し、配列した。
7.次に配列されたDNAを適当な発現ベヒクルの中に挿入
するためにin vitro処理し、この発現ベヒクルを適当な
宿主細胞を形質転換するために用い、この宿主細胞を今
度は培地の中で増殖させ、所望のヒトIFN−γ産生物を
発現させた。
8.このようにして産生したヒトIFN−γは確かにシステ
インで始まるその成熟形態で146個のアミノ酸を有して
おり、その特性は非常に塩基性である。その単量体分子
量は17,140と計算された。恐らく多くの塩基性残基、疎
水性，塩ブリッジ形成等が存在するため、分子はオリゴ
マーの形で例えば二量体、三量体又は四量体の形でそれ
自身会合する。天然物質で以前に観察された高分子量
（６）は、アミノ酸配列のみに基づいて計算され得なか
ったものであり、翻訳後のグリコシレーションによる炭
水化物の寄与と同様そのようなオリゴマーの存在に基づ
くものかもしれない。
9.幾つかの宿主細胞システムでは、特に20個のアミノ酸
のシグナルペプチドと共に発現されるように発現ベヒク
ルに結合したとき、ヒトIFN−γの成熟形態はセルカル
チャー培地の中に運ばれ、回収及び精製方法において測
り知れないほど助けとなる。
A.微生物／セルカルチャー 1.細菌株／プロモーター ここに記載する本発明の好適具体例は、とりわけ、英
国特許出願公開第2055382A号に記載の微生物E. coliＫ
−12株294（end A,thi-，hsr-，khsm+）を用いて実施し
た。この菌株はブダペスト条約に基づいてアメリカン
タイプ カルチャー コレクションに、ATCC寄託番号第
31446号で寄託されている。しかし、他の種々の微生物
菌株、例えば、E.coli B,E.coli X1776（ATCC第31537
号），E. coliW3110（F-、λ-，原始栄養株protrophi
c）（ATCC第27325号）のような公知のE.coli菌株或いは
他の微生物菌株も有用であり、これらの微生物菌株の多
くは寄託されており、アメリカンタイプカルチャーコレ
クション（ATCC）のような認可された微生物寄託施設か
ら入手しうる（可能性がある）。ATCCカタログリスト参
照。又、ドイツ公開公報第2644432号参照。これらの他
の微生物には、例えばBacillus subtilisのようなBacil
li並びにSalmonella typhimurium及びSerratia marcesa
nsのような他の腸内菌等があり、これらは異種遺伝子配
列を複製し、発現し得るプラスミドを用いて使用され
る。
例えば、ベータラクタマーゼ及びラクトースプロモー
ターシステムが、異種ポリペプチドの微生物的産生を開
始させ且つ維持するために有利に用いられた。これらの
プロモーターシステムの構成と構造に関する詳細はchan
g et al.,Nature，275,617（1978）及びItakura et a
l.,Science，198,1056（1977）を参照されたい。最近、
トリプトファンに基くシステム、いわゆるtrpプロモー
ターシステムが開発された。このシステムの構成と構造
に関する詳細はGoeddel et al.,Nucleic Acids Researc
h,8,4057（1980）及び1980年３月24日付で出願されたKl
eid et al．の米国特許出願U.S.S.N.第133,296号を参照
されたい。他の多くの微生物プロモーターが発見され利
用されており、当業者がプラスミドベクター中に機能的
にそれらを結合し得るようにそのヌクレオチド配列に関
する詳細が発表されている。例えばSiebenlist et al.,
Cell，20,269（1980）参照。
2.酵母菌株／酵母菌プロモーター ここで用いる発現システムはE. coliと酵母菌のSacch
aromyces cerevisiaeとの両方において選択と複製が可
能なプラスミドYRp7（14,15,16）でもよい。酵母菌での
選択のため、プラスミドはTRP１遺伝子（14,15,16）を
含有し、この遺伝子は酵母菌の第IV染色体に見い出され
るこの遺伝子上の突然変異（17）を含む酵母菌を補足す
る（すなわちトリプトファンの不在下での増殖を許容す
る）。ここではアメリカンタイプカルチャーコレクショ
ンに制限なしに寄託されているSaccharomyces cerevisi
ae菌株RH218（ATCC寄託番号第44076号）（18）を用い
た。しかし、菌体をtrp１にする突然変異を含むどのSac
charomyces cerevisiae菌株も発現システムを含むプラ
スミドの発現のための有効な環境となり得るということ
が理解されよう。他の菌株pep４−１（19）も用い得
る。このトリプトファン栄養要求菌株も又TRP１遺伝子
上に点突然変異を有している。
（アルコール脱水素酵素１用の）酵母菌遺伝子由来
５′−フランキングDNA配列（プロモーター）を非酵母
菌遺伝子の５′−側に配置し、外来遺伝子をプラスミド
中に配置し、これを用いて酵母菌を形質転換すると、酵
母菌中で異種遺伝子の発現を促進（プロモート）し得
る。プロモーターの他に更に、酵母菌での非酵母菌遺伝
子の適正な発現には第二の酵母菌配列を必要とし、この
第二の配列は酵母菌での適正な転写終了とポリアデニル
化とを許容するためプラスミド上で非酵母菌遺伝子の
３′−末端に配置される。このプロモーターも他のもの
と同様に本発明で好適に用いられ得る（以下参照）。好
ましい具体例では、酵母菌３−ホスホグリセリン酸キナ
ーゼ遺伝子（20）の５′−フランキング配列を構造遺伝
子の上流に配置し、この構造遺伝子に続いて更に終了−
ポリアデニル化シグナル含有DNA、例えばTRP1遺伝子（1
4,15,16）又はPGK遺伝子（20）を配置して使用する。
酵母菌５′−フランキング配列は（３′−酵母菌終了
DNAと共に使用すると、後述）酵母菌での外来遺伝子の
発現を促進し得るため、高度に発現されたいかなる酵母
菌遺伝子の５′−フランキング配列も重要な遺伝子産物
の発現に用い得る。或る環境の下で酵母菌は糖分解酵素
としての可溶性蛋白質を65％まで発現し（21）、且つこ
の高レベルは個々のmRNAの高レベル産生の結果と思われ
る（22）から、いかなる他の糖分解遺伝子の５′−フラ
ンキング配列もそのような発現目的に使用し得る筈であ
る。例えば、エノラーゼ、グリセルアルデヒド−３−燐
酸デヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルビン酸脱炭
酸酵素、ホスホフルクトキナーゼ、グルコース−６−燐
酸イソメラーゼ、３−ホスホグリセリン酸ムターゼ、ピ
ルビン酸キナーゼ、三炭糖燐酸イソメラーゼ、ホスホグ
ルコースイソメラーゼ及びグルコキナーゼ等。これらの
遺伝子の３′−フランキング配列のいずれも上述のよう
な発現システムで適正な終了及びmRNAポリアデニル化に
用いられ得る。他の幾つかの高度に発現された遺伝子は
酸性ホスファターゼ（23）遺伝子であり、５′−フラン
キング領域での突然変異（発現を高める突然変異体）、
通常TY1転移可能要素（transposable element）（24）
の存在により高レベルの産生を発現する遺伝子である。
前記遺伝子は全て酵母菌RNAポリメラーゼII（24）に
より転写されると考えられる。リボゾームRNA,5S RNA及
びtRNA（24,25）に対する遺伝子を転写するRNAポリメラ
ーゼＩ及びIIIに対するプロモーターも又そのような発
現構成で有用であり得る。
最後に、多くの酵母菌プロモーターは又転写制御作用
を有しており、従って増殖条件の変化によりオフにした
りオンにしたりし得る。そのような酵母菌プロモーター
は例えば次の蛋白質を産生する遺伝子である。即ち、ア
ルコールデヒドロゲナーゼII,イソチトクロム−c,酸性
ホスファターゼ、窒素代謝と関連した分解酵素、グリセ
ルアルデヒド−３−燐酸デヒドロゲナーゼ、麦芽糖とガ
ラククトース利用に関係する酵素（22）等である。その
ような制御領域はタンパク産生物の発現を制御するの
に、特にそれらの産生が酵母菌に対し有毒であるとき、
非常に有用であろう。又高度に発現された遺伝子由来の
プロモーター含有５′−フランキング配列を一つの５′
−フランキング配列の制御領域と組み合わせることも可
能であろう。この結果ハイブリッドプロモーターが生
じ、制御領域とプロモーターは物理的に別個のDNA配列
であると思われるためこの組み合わせは可能であろう。
3.セルカルチャーシステム／セルカルチャーベクター 培養（組織培養）での脊椎動物細胞の増殖は最近では
通常の方法となった（Tissue Culture,Academic Press,
Kruse and Patterson eds.,1973参照）。ここではIFN−
γ産生用宿主としてCOS−７系サル腎線維芽細胞を用い
た（25a）。しかし、ここに詳細に説明する実験は、適
合性のベクターを複製及び発現し得るいかなる細胞系で
も遂行され得る。例えば、WI38,BHK,3T3,CHO,VERO,及び
HeLa細胞系等。更に発現ベクターに必要とされるもの
は、複製のオリジン（開始点）並びに発現されるべき遺
伝子の前に配置されたプロモーターであり、これらは必
要なリボゾーム結合部位、RNAスプライス部位、ポリア
デニル化部位、及び転写終了配列と共に配置される。本
発明ではSV40のこれらの本質的な要素を使用し、好まし
い具体例として本発明を説明するが、本発明はこれらの
配列に限定されるべきでないことが理解されよう。例え
ば、宿主DNAに組み込まれていない状態で機能し得るDNA
複製の細胞性オリジンと同様、他のウィルス（例えば、
Polyoma,Adeno,VSV,BPV等）性ベクターの複製オリジン
も用い得る。
B.ベクターシステム 1.E. coliでの成熟IFN−γの直接発現 成熟インターフェロンポリペプチド（マイナスシグナ
ル配列）としてE. coliでIFN−γを直接発現させるため
に用いた方法は、それが合成Ｎ−末端とcDNAの結合を含
んでいるので、ヒト成長ホルモン（26）とヒトIFN−α
（１）に対して以前に用いた方法の変形である。
後述されるp69のヌクレオチド配列から、並びに幾つ
かのIFN−α（２）のシグナルペプチドと成熟ポリペプ
チドとの間の公知の開裂部位との比較により推論される
ように、IFN−γは、20個のアミノ酸から成る疎水性シ
グナルペプチド及びそれに続く成熟IFN−γの146個のア
ミノ酸を有している（第５図）。第７図に示されている
ように、B stNI制限エンドヌクレアーゼ部位は、好都合
なことに、成熟IFN−γの第四アミノ酸に位置してい
る。ATG翻訳開始コドン、第一、二、三アミノ酸（シス
テイン−チロシン−システイン）のコドンを導入し且つ
E coRI付着末端を創出するために、２つの合成デオキシ
オリゴヌクレオチドが設計された。これらのデオキシオ
リゴヌクレオチドをp69の1100塩基対B stNI−P stＩ断
片に結合し、IFN−γをコードし且つE coRI及びP stＩ
制限部位を末端に有する1115塩基対の合成−天然ハイブ
リッド遺伝子を構成した。この遺伝子をE coRIとP stＩ
部位間でプラスミドpLeIF A trp103に挿入し、発現プラ
スミドpIFN−γ trp48を構成した。このプラスミドで
はIFN−γ遺伝子はE. coli trpプロモーターの制御下で
発現される。（pLeIF A trp103はpLeIF A 25の誘導体で
あり、LeIF A遺伝子から遠位のE coRI部位が除去されて
いる。このE coRI部位を除去するために用いられた方法
については既に公表されている（27）。尚、プラスミド
pLeIF A25は、大腸菌中でヒト白血球インターフェロン
（ヒト LeIF）を高レベルで発現させるのに適してお
り、pBR322から構成されたものである（１）。
2.酵母菌での発現 IFN−γをコードするcDNAのような異種遺伝子を酵母
菌で発現するため、４つの成分を含むプラスミドベクタ
ーを構成することが必要であった。最初の成分はE. col
iと酵母菌の両方の形質転換を可能にする部分であり、
従って各種の選択し得る遺伝子を含んでいなければなら
ない。
（ここでは、これはE. coliのアンピシリン耐性遺伝子
及び酵母菌のTRP1遺伝子である。）この成分は又両方の
生体中でプラスミドDNAとして維持されるために両方の
生体の複製オリジンを必要とする。（ここでは、これは
pBR322のE. coliオリジン及び酵母菌の第III染色体のar
s１オリジンである。） プラスミドの第二の成分は、下流に位置する構造遺伝
子の転写をプロモートするための、高度に発現された酵
母菌遺伝子の５′−フランキング配列である。ここで用
いた５′−フランキング配列は酵母菌３−ホスホグリセ
リン酸キナーゼ（PGK）遺伝子の配列である。断片はPGK
構造遺伝子配列のATGからこのATGから上流の8bpまでを
切り出すようにして構成された。５′−フランキング配
列に構造遺伝子がうまく結合するように、この５′−フ
ランキング配列はX baＩ及びE coRI制限部位の両方を含
む配列で置換されている。
システムの第三の成分はATG翻訳開始シグナルと翻訳
停止シグナルの両方を含むように構成された構造遺伝子
である。そのような遺伝子の単離と構成については以下
で説明する。
第四の成分は酵母菌遺伝子の３′−フランキング配列
を含む酵母菌DNA配列であり、これは転写終了とポリア
デニル化の適正なシグナルを含んでいる。これらの成分
が全て存在した場合に、IFN−γが酵母菌で産生され
た。
3.哺乳動物セルカルチャーでの発現 哺乳動物細胞培養（セルカルチャー）での免疫インタ
ーフェロンの合成方法は、異種転写ユニットの制御下で
外来遺伝子の自律的複製と発現の両方が可能なベクター
の開発に依存していた。組織培養でのこのベクターの複
製は、ベクターに（SV40ウィルス由来の）DNA複製オリ
ジンを提供することと、ヘルパー機能としてＴ抗原を内
因的に発現する細胞系（28,29）へベクターを導入する
ことで達成された。SV40ウィルスの後期プロモーターは
インターフェロンの構造遺伝子の上流に存在し、遺伝子
の転写を確保していた。
IFN−γを発現させるために用いたベクターは、DNA複
製のE. coliオリジンとともにE. coliでの選択のために
選択し得るマーカー（アンピシリン耐性）を提供するpB
R322配列で構成されていた。これらの配列は、プラスミ
ドpML−１（28）から誘導され、E coRI及びB amHI制限
部位に及び領域を含んでいた。SV40オリジンはこの領域
（30,31）を含む342塩基対P vuII−HindIII断片から誘
導される（両方の末端はE coRI末端に転換される）。こ
れらの配列は、DNA複製のウィルス性オリジンを含むの
に加えて、初期及び後期転写ユニットの両方に対するプ
ロモーターをコードしている。SV40オリジン領域の方向
性は、後期転写ユニットに対するプロモーターがインタ
ーフェロンをコードする遺伝子を近くに配置されるよう
にした。
第１図は、誘発末梢血リンパ球（PBL）ポリ（Ａ）＋R
NAの蔗糖密度勾配遠心分離の結果を示している。インタ
ーフェロン活性を有する２つのピークが12Sと16Sのサイ
ズで観察された（斜線を付したヒストグラムにより示さ
れている）。リボソームRNAマーカー（別個に遠心分離
した）の位置は吸収プロフィールの上方に示した。
第２図は、誘発PBLポリ（Ａ）＋RNAの酸−尿素−アガ
ロース電気泳動の結果を示している。18S RNAと共に移
動するたった一つの活性ピークが観察された。隣接する
レーンで電気泳動にかけ且つ臭化エチジウム染色により
可視化したリボソームRNAマーカーの位置は活性プロフ
ィールの上方に示した。
第３図は、誘発及び非誘発の32P−標識cDNAプローブ
と96個のコロニーとのハイブリダイゼーションパターン
を示す。96個の個々の形質転換体をマイクロタイタープ
レートで成育させ、レプリカ（replica）を２枚のニト
ロセルロース膜上に移し、次にフィルターを誘発mRNA
（第３図Ａ）か或いは非誘発PBLカルチャーから単離し
たmRNA（誘発されていない、第３図Ｂ）から調製した32
P−cDNAプローブとハイブリダイズした。フィルターを
ハイブリダイズしていないRNAを除去するため洗浄し、
次にＸ線フィルムに露出させた。このフィルターのセッ
トはそのような86個のセット（8300個の独立したコロニ
ー）の典型例を表わしている。「誘発」クローンの例は
H12として示されている。
第４図は、クローン69 cDNA挿入物の制限エンドヌク
レアーゼマップである。cDNA挿入物はP stＩ部位（両端
に点で示す）とオリゴdC−dGテール（１本線で示す）を
末端に有している。制限ヌクレアーゼ開裂により生成す
る断片の数と大きさは６％アクリルアミドゲル電気泳動
により評価した。部位の位置は核酸配列（第５図に表
示）により確認された。最大のオープン解読フレームの
コード領域は箱型に囲われており、斜線領域は推定した
20残基シグナルペプチド配列を表わし、他方点の領域は
成熟IFN配列（146アミノ酸）を表わしている。mRNAの
５′末端は左側にあり、３′末端は右側にある。
第５図は、プラスミドp69 cDNA挿入物のヌクレオチド
配列を示している。しかしながら、この配列はIFN−γ
中の最も普遍的な相同形（allelic form）を示してい
る。最大のオープン解読フレームの推定アミノ酸配列も
示されている。推定シグナル配列はS1からS20で示す残
基により表わされている。
第６図は、IFN−γmRNA構造とIFN−α及びIFN−βの
構造との比較図である。クローン69mRNA（IFN−γ）は
かなり多量の翻訳されない配列を含んでいる。
第７図は、IFN−γ発現プラスミドpIFN−γ trp48の
構成を示す模式図である。出発物質はプラスミドp69か
らの1250塩基対P stIcDNA挿入物である。
第８図は、サル細胞でのIFN−γの発現に用いられる
プラスミドの構成を示す図である。
第９図は、８種のE coRI消化ヒトゲノムDNAをp69のcD
NA挿入物からの32P−標識600塩基対D deＩ断片とハイブ
リダイズするSouthernハイブリダイゼーションの結果を
示す。２つのE coRI断片は明らかに各々のDNAサンプル
中でプローブとハイブリダイズする。
第10図は、６種の制限エンドヌクレアーゼで消化した
ヒトゲノムDNAをp69由来32P−標識プローブとハイブリ
ダイズするSouthernハイブリダイゼーションの結果を示
す。
第11図は、PGKプロモーターが単離されたベクターpB1
の3.1kbp HindIII挿入物の制限マップを示す。PGK遺伝
子の５′−フランキングDNAへのE coRI部位及びX baＩ
部位の挿入が示されている。
第12図は、X baＩ部位及びE coRI部位の挿入前のPGK
遺伝子に対する初期コード配列を加えた５′−フランキ
ング配列を示す。
第13図は、PGKプロモーター上の位置−８にX baＩ部
位を挿入するために、及びこのX baＩ末端及びS au3A末
端を含むPGKの５′−フランキング配列の39bp断片を単
離するために用いられた技術を図式的に示す。
第14図は、上記39bp断片、P vuＩからS au3Aまでの付
加PGK５′−フランキング配列（265bp）（第11図参照）
とX baＩに隣接するE coRI部位とを含む300bp断片の構
成を図式的に示す。
第15図は、第14図で構成された断片に加えて、PGK
５′−フランキング配列のHindIIIからP vuＩまでの130
0bp断片（第11図参照）を含む1500bpPGKプロモーター断
片（HindIII/E coRI）の構成を図式的に示す。
第16図は、改良PGKプロモーター、IFN−γcDNA及び酵
母菌PGK遺伝子の終了領域とを含む酵母菌でのヒトIFN−
γに対する発現ベクターの組成を示す。これについては
以下に詳細に説明する。
A.IFN−γmRNAの起源 末梢血リンパ球（PBL）を白血球泳動法により人間の
提供者から採取した。PBLを更にフイコール−ハイパッ
ク（Ficoll−Hypaque）勾配遠心法により精製し、次にR
PMI1640、１％Ｌ−グルタミン,25mMのHEPES（Ｎ−２−
ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ′−２−エタンスルホ
ン酸）及び１％ペニシリン−ストレプトマイシン溶液
（Gibco,Grand Island,NY）中５×106個/mlの細胞濃度
で培養した。これらの細胞をマイトゲンぶどう球菌エン
テロトキシンＢ（１μg/ml）により誘発してIFN−γを
産生させ、５％CO2中37℃で24時間から48時間培養し
た。IFN−γ活性の相対収率を増加させるためデスアセ
チルチモシン−α−１（0.1μg/ml）をPBL培養物に加え
た。
B.メッセンジャーRNAの単離 PBL培養物からの全RNAを本質的にBerger,S.L.et al．
（33）により報告されているようにして抽出した。細胞
を遠心によってペレットにし、次に10mMのNaCl,10mMの
トリス−HCl（pH7.5）、1.5mMのMgCl2及び10mMのリボヌ
クレオシドバナジル複合体中に再懸濁した。細胞をNP−
40（最終濃度１％）の添加により溶解し、核を遠心によ
りペレットにした。上澄みは全RNAを含んでおり、これ
を多数回のフェノール及びクロロホルム抽出により更に
精製した。水相をNaCl 0.2Mにし、次に全RNAを２倍量の
エタノールの添加により沈殿させた。非誘発（刺激しな
い）培養物からRNAを同じ方法により単離した。オリゴ
ーdTセルロースクロマトグラフィーを全RNA標本（34）
からmRNAを精製するために用いた。培養したPBL1〜2lか
らの典型的な収量は、全RNAが５乃至10mgであり、ポリ
（Ａ）＋RNAが50乃至200μｇであった。
C.mRNAのサイズ分画 mRNA標本を分画するため２つの方法を用いた。これら
の方法は（一緒によりもむしろ）別々に用いられ、その
結果各々でかなりの量のIFN−γmRNAが得られた。
mRNAを分画するために、変性剤ホルムアミドの存在下
でのショ糖勾配遠心法を用いた。70％のホルムアミド中
の５％乃至25％のショ糖勾配（32）を20℃で19時間154,
000×ｇで遠心した。次に連続画分（0.5ml）を勾配の頂
部から除去し、エタノール沈殿し、その一定量をmRNAの
翻訳のためXenopus laevis卵母細胞の中に注入した（3
5）。室温に24時間置いた後、Stewart（36）により説明
されたWISH（ヒト羊膜）細胞上でVesicular Stomatitis
ウィルス（インディアナ株）又はEncephalomyocarditis
ウィルスを用いる標準的細胞変性効果抑制試験でインキ
ュベーション培地の抗ウィルス活性を分析した。ただ
し、ここでは、ウィルス感染に先立ち（４時間のかわり
に）24時間サンプルを細胞とインキュベートした。２つ
の活性ピークが常にショ糖密度勾配分画RNAで観察され
た（第１図）。片方のピークは12Sの計算値（サイズ）
で沈降し、注入RNA1μｇにつき（IFN−α基準で）100−
400ユニット/mlの抗ウィルス活性を有していた。活性の
他方のピークはサイズ16Sで沈降し、遅い沈殿ピークの
活性の約半分を有していた。ヒトIFN−γが効果を有し
ないウシ細胞系（MDBK）で同じ画分を分析しても活性が
観察されなかったことから、これらの各々の活性ピーク
はIFN−γによるものと思われる。IFN−α活性とIFN−
βの活性の両方ともMDBK分析で容易に検出される筈であ
る（５）。
mRNA（200μｇ）の分画を、酸−尿素−アガロ−スゲ
ル電気泳動法でもおこなった。スラブアガロ−スゲル
（37,38）を、1.75％アガロース、0.025Mクエン酸ナト
リウム（pH3.8）及び6M尿素で構成した。電気泳動を25
ミリアンペア、４℃で７時間おこなった。次にゲルをか
みそりの刃で細分した。個々の薄片を70℃で溶解し、フ
ェノールで二度、クロロホルムで一度抽出した。次に画
分をエタノール沈殿させ、その後Xenopus laevis卵母細
胞に注入し抗ウィルス分析によりIFN−γmRNAを分析し
た。たった一つの活性ピークがゲル分画サンプルで観察
された（第２図）。このピークは18S RNAと共に移動
し、注入RNA 1μｇにつき600ユニット/mlの活性を有し
ていた。この活性は、又MDBK細胞を保護せず、IFN−γ
に特異的と思われる。
ショ糖密度勾配（12Sおよび16S）と酸−尿素ゲル（18
S）で観察された活性ピーク間のサイズの相異はこれら
の別々の分画方法が全く同一の変性条件下では遂行され
ないことにより説明され得る。
D.IFN−γ配列を含むコロニーライブラリの調製 ゲル分画した３μｇのmRNAを使用し、標準操作法（2
6,39）で二本鎖cDNAを調製した。６％ポリアクリルアミ
ドゲルでcDNAをサイズ分画した。２種のサイズ画分800
−1500bp（138ng）と＞1500bp（204ng）とを電気泳動溶
出した。各サイズのcDNAのサンプル35ngにターミナルデ
オキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（40）を用い
てデオキシ−Ｃ残基をつなぎ、同様にPstI部位（40）に
デオキシ−Ｇ残基をテーリングした300ngのプラスミドp
BR322（41）とアニール（anneal）した。アニール後の
各混合物を用いてE.coli K−12株294を形質転換した。8
00−1500bpcDNAから約8000株，＞1500bpのcDNAから約40
0株の形質転換体が得られた。
E.誘発cDNAのコロニーライブラリのスクリーニング 各コロニーを、LB（58）＋５μg/mlのテトラサイクリ
ンを入れたマイクロタイタープレートのウエル（well）
に別々に接種し、DMSO（ジメチルスルホキシド）を７％
まで加えた後−20℃で貯蔵した。コロニーライブラリの
２種のコピーをニトロセルロースフィルター上で増殖さ
せ、各コロニーから得られるDNAをGrunstein−Hogness
法（42）でフィルターに固定した。
誘発および非誘発PBL培地からゲル分画したmRNAのサ
イズ18S画分を用いて32P−標識cDNAプローブを調製し
た。プライマーとしてオリゴdT12-18を使用し既報
（１）の反応条件を用いた。600−1500bpサイズのcDNA
画分から得た8000株の形質転換体と＞1500bpサイズのcD
NA画分から得た400株の形質転換体とを含む１組のフィ
ルターを、20×106cpmの誘発32P−cDNAとハイブリダイ
ズさせた。もう１組のフィルターを20×106cpmの非誘発
32P−cDNAとハイブリダイズさせた。Fritsch等（43）が
示した条件でハイブリダイゼーションを16時間継続し
た。フィルターをよく洗浄し（43）、DuPont Lightning
−Plus増感板を密着させたKodak XR−5 X線フィルムに1
6〜48時間露出した。２種のプローブに関して各コロニ
ーのハイブリダイゼーションパターンを比較した。約40
％のコロニーは明らかに双方のプローブとハイブリダイ
ズし、約50％のコロニーはいずれのプローブともハイブ
リダイズしなかった（第３図）。124個のコロニーは誘
発プローブとかなりハイブリダイズしたが、非誘発プロ
ーブについては検出不能な程弱いものであった。これら
の各コロニーをマイクロタイタープレートのウエルに個
別に接種し、増殖させてニトロセルロースフィルターに
移し、前記と同様に２種のプローブとハイブリダイズさ
せた。同様に各コロニーから急速法（rapidmethod）（4
4）によって単離したプラスミドDNAをニトロセルロース
フィルターに付着させ、誘発及び非誘発プローブとハイ
ブリダイズあっせた（45）。22個のコロニーから得たDN
Aは誘発プローブのみとハイブリダイズした。これらを
“誘発”コロニーと名付けた。
F.誘発コロニーの特性決定 22個の誘発コロニーのうちから任意に選択した５つの
コロニーからプラスミドDNAを調製し（46）、これを用
いて挿入cDNAの特性決定を行なった。５つの誘発プラス
ミド（p67,p68,p69,p71及びp72）の制限エンドヌクレア
ーゼマッピングによれば４つのプラスミドが同様の制限
ヌクレアーゼマップを有すると推定された。これらの４
種のプラスミド（p67,p69,p71,p72）は夫々、挿入cDNA
中に４個のD deＩ部位と２個のHinfI部位と１個のR sa
Ｉ部位とを有していた。第５のプラスミド（p68）は共
通のD deＩ断片を有しており、他の４種に比較して短い
cDNAクローンであると思われた。制限ヌクレアーゼマッ
ピングによって推定された相同性（homology）はハイブ
リダイゼーションによって確認された。プラスミドp67
の600bpのD deＩ断片から32P−標識DNAプローブを調製
し（47）、これを使用して他の誘発コロニーとのハイブ
リダイゼーション（42）を実施した。制限ヌクレアーゼ
でマッピングされた５つのコロニー全部がこのプローブ
とクロスハイブリダイズした。誘発／非誘発スクリーニ
ングに選択した124個のうちの他の17個のコロニーも同
様であった。クロスハイブリダイズするこれらのプラス
ミドの各個における挿入cDNAの長さを、P stＩ消化及び
ゲル電気泳動法によって測定した。最長の挿入cDNAを有
するクローンは挿入物長1200−1400bpのクローン69と考
えられる。以後の実験全部にこのDNAを使用した。この
制限エンドヌクレアーゼマップを第４図に示す。
p69の挿入cDNAは、３つの独立発現系で産生された発
現産物によって抗ウィルス活性を生ずるIFN−γcDNAで
あることが証明された。これに関して以下に詳述する。
G.p69の挿入cDNAの配列解析 プラスミドp69の挿入cDNAの完全ヌクレオチド配列を
決定するために、断片をM13ベクターmp7（49）でサブク
ローニング後にジデオキシヌクレオチドチェーンターミ
ネーションメソッド（48）で処理しMaxam−Gilbert法
（52）で処理した。最長のオープン解読フレームは、第
５図に示す166個のアミノ酸から成るタンパクをコード
している。コードされた第一残基は、cDNAの５′−末端
の第一metコドンである。アミノ末端の最初の20個の残
基は残りの146個のアミノ酸の分泌のためのシグナル配
列として機能すると推定される。この推定シグナル配列
は、別の特性付けされたシグナル配列と共通の特徴、例
えばサイズ及び疎水性を有する。更に、推定された開裂
配列に見られる４個のアミノ酸（ser−leu−gly−cys）
は、数種のIFN−α（LeIF B,C,D,F及びH,（２））の開
裂点で見られる４個の残基に等しい。146個のアミノ酸
から成るコードされた成熟アミノ酸配列は分子量17,140
である。
コードされたタンパク配列中のアミノ酸28−30（asn
−gly−thr）及びアミノ酸100−102（asn−tyr−ser）
にグリコシレーションが可能な２個の位置（50）が存在
する。このような位置の存在は、ヒトIFN−γ（6,51）
の周知のグリコシレーションに一致する。更に、２個し
かないステイン残基（位置１及び３）は立体配置から見
て余りにも近接しているためジスルフィドブリッジを形
成し得ない。このことは、β−メルカプトエタノール
（51）の如き還元剤の存在中でのIFN−γの周知の安定
性に一致する。推定された成熟アミノ酸配列はほぼ完全
に塩基性であり、全部で30個のリジン，アルギニン、ヒ
スチジン残基を有しており、アスパラギン酸及びグルタ
ミン酸残基は全部で19しかない。
プラスミドp69のDNA配列から推定されたIFN−γのmRN
A構造は、IFN−α（1,2）又はIFN−β（５）のmRNAとは
明らかに異なる。第６図に示す如く、IFN−α又はIFN−
βに比較してIFN−γのコード領域はより短く、５′及
び３′の末翻訳領域はより長い。
H.E.coli内での成熟IFN−γの直接発現 第７図に示す如く、50μｇのプラスミドp69をP stＩ
で消化し、６％ポリアクリルアミドゲル上の電気泳動で
1250bpの挿入物を単離した。約10μｇの挿入物がゲルか
ら電気泳動溶出した。このP stＩ断片５μｇを３ユニッ
トのB stNI（Bethesda Research Labs）で37℃で15分間
部分消化し、６％ポリアクリルアミドゲルを用いて反応
混合物を精製した。所望の1100塩基対B stNI−P stＩ断
片約0.5μｇを回収した。ホスホトリエステル法（53）
によって図示の２個のデオキシオリゴヌクレオチド即ち
５′−dAATTCATGTGTTATTGTCと５′−dTGACAATAACACATG
（第７図）とを合成し、下記の如くリン酸化した。30μ
ｌの60mMのトリス−HCl（pH8）と10mMのMgCl2と15mMの
β−メルカプトエタノールと240μci（γ−32P）ATP（A
mersham,5000ci/mmole）中で各デオキシオリゴヌクレオ
チド100pmoleを合せた。12ユニットのT4ポリヌクレオチ
ドキナーゼを添加し、37℃で30分間反応させた。10mMの
ATPを１μｌ添加し更に20分間反応させた。φ−OH/CHCl
3抽出後、オリゴマーを0.25μｇのB stNI−P stI1100塩
基対断片と合せてエタノール沈殿した。30μｌの20mMト
リス−HCl（pH7.5）と10mMのMgCl2と10mMジチオスレイ
トールと0.5mMのATPと10ユニットのT4DNAリガーゼ中で
前記の断片を20℃で２時間結合した。（付着末端の結合
による重合体を排除すべく）混合物を30ユニットのP st
Ｉと30ユニットのEcoRIとによって１時間消化し、６％
ポリアクリルアミドゲルを用いて電気泳動にかけた。電
気泳動溶出により1115塩基対の産生物（110,000cpm）を
回収した。
プラスミドpLeIF A trp 103（第７図）は、LeIF A遺
伝子から離れたE coRI部位が除去された（27）プラスミ
ドpLeIF A 25（１）の誘導体である。３μｇのpLeIF A
trp 103を20ユニットのE coRIと20ユニットのP stＩと
を用いて37℃で90分間消化し、６％ポリアクリルアミド
ゲルを用いて電気泳動にかけた。（〜3900塩基対の）大
きいベクター断片を電気泳動溶出により回収した。この
ように調製した0.15μｇのベクターに1115塩基対のE co
RI−P stIIFN−γ DNA断片を結合した。E.coli k−12株
294（ATCC No.31446）を形質転換して120個のテトラサ
イクリン耐性コロニーを得た。これらの形質転換体60個
からプラスミドDNAを調製し、E coRIおよびP stＩで消
化した。これらのプラスミドのうちの３個が所望の1115
塩基対E coRI−P stＩ断片を含んでいた。DNA配列の解
析により、これらのプラスミドが、trpプロモーター、
合成DNA及びcDNA間の結合部に所望のヌクレオチド配列
を有することが確認された。これらのプラスミドの１つ
pIFN−γ trp 48を選択して更に研究を続けた。該プラ
スミドを用いてE.coli K−12株W3110（ATCC No.27325）
を形質転換した。
I.IFN−γをコードする配列の遺伝子構造 IFN−γをコードする遺伝子の構造をSouthernハイブ
リダイゼーションによって解析した。この方法（54）で
は、５μｇの高分子量ヒトリンパ球DNA（55の如く調
製）を種々の制限エンドヌクレアーゼで完全消化し、1.
0パーセントのアガロースゲルを用いて電気泳動にかけ
（56）、ニトロセルロースフィルター（54）に塗抹し
た。32P−標識DNAプローブをp69の挿入cDNAの600bp D d
eＩ断片から調製し（47）、ニトロセルロースに移したD
NAとハイブリダイズした（43）。１分間当り107カウン
トのプローブを16時間ハイブリダイズし、前記（43）の
如く洗浄した。別々の提供者から得た８個のゲノムDNA
サンプルを制限エンドヌクレアーゼE coRIで消化し、p6
9 32P−標識プローブとハイブリダイズした。第９図に
示す如く、２個の明白なハイブリダイゼーションシグナ
ルから見られた。HindIII消化λDNAとの移動度比較によ
れば、これらは夫々、8.8キロ塩基対（kbp）及び2.0kbp
を有すると推定された。これは２個のIFN−γ遺伝子が
あるか、又は１個の遺伝子がE coRI部位によって切断
（split）された結果であろう。p69 cDNAがE coRI部位
を含まないので、１個の遺伝子を発現させるには内部E
coRI部位を有する介在配列（イントロン）が必要であっ
た。これらの可能性を見分けるために、異なる他の５種
のエンドヌクレアーゼで消化した１個のヒトDNA（第10
図）に対して同じプローブ用いてSouthernハイブリダイ
ゼーションを実施した。２種の他のエンドヌクレアーゼ
P vuII,HincIIでは夫々２個のハイブリダイズDNA断片
（P vuIIでは6.7kbpと4.0kbp,HincIIでは2.5kbpと2.2kb
p）が見られた。しかし乍ら３種のエンドヌクレアーゼH
indIII,Bg lII,BamHIによる消化パターンでは夫々１個
のハイブリダイズDNA断片（HindIIIでは9.0kbp、Bg lII
では11.5kbp,BamHIでは9.5kbp）しか得られなかった。
同一HindIIIハイブリダイズ断片に含まれるためには２
個のIFN−γ遺伝子が異常に接近して（9.0kbp未満）結
合していなればならない。この結果より、ヒトゲノムDN
Aには（多数存在したIFN−α遺伝子と違って）ひとつの
同質の（homologous）IFN−γ遺伝子が存在しておりこ
の遺伝子がE coRI,P vuII,HincII部位を含む１個以上の
イントロンによって切断されると推定される。この推定
を確認するために、p69から得たcDNAの３′−未翻訳領
域のみから調製した32P標識断片（第５図の860番目から
990番目までの130塩基対のD deＩ断片）をE coRI消化し
たヒトゲノムDNAにハイブリダイズした（47）。2.0kbpE
coRI断片のみがこのプローブにハイブリダイズした。
このことは、この断片が３′−未翻訳配列を含んでおり
8.8kbpE coRI断片が５′−配列を含むことを示す。IFN
−γの遺伝子構造（少くとも１個のイントロンを有する
１個の遺伝子）は、IFN−α（イントロン（56）を有さ
ない多数遺伝子（multiple genes）（２））又はIFN−
β（イントロン（57）を有さない１個の遺伝子）と明ら
かに異なっている。
J.細菌抽出物の調製 ５μg/mlのテトラサイクリンを加えたLuriaブロスで
１晩培養したE.coli W3110/pINF−γtrp 48を、0.2％の
グルコースと0.5％のカザミノ酸と５μg/mlのテトラサ
イクリンとを含むM9（58）培地に希釈度1:100で接種し
た。A550が0.1乃至0.2のときに最終濃度20μg/mlになる
までインドールアクリル酸を添加した。A550＝1.0で遠
心して10mlのサンプルを採取し、1mg/mlのウシ血清アル
ブミンを含む1mlの燐酸塩緩衝食塩水（PBS−BSA）に直
ちに再懸濁させた。超音波で細胞を破砕し残渣を遠心で
除去した。アッセイ（分析）を行なうまで上清を４℃で
保存した。細胞変性効果（CPE）阻止アッセイで標準IFN
−αと比較すると、上清中のインターフェロン活性は25
0ユニット/mlと測定された。
K.酵母の形質転換／菌株及び培地 酵母菌を既報（59）に準じて形質転換した。E.coli株
J A300（ATCC No.33588）（thr leu B6 thi thy A trp
C1117 hsdm − hsd R- strR（20）を用いて発現能のあ
るTRPＩ遺伝子を含むプラスミドを選択した。遺伝子型
（a trp 1 gal 2 SUC2 mal CUP I）（18）を有する酵母
菌Saccharomyces cerevisiae RH218を酵母形質転換宿主
として使用した。S.cerevisiae RH218は、アメリカン・
タイプ・カルチャー・コレクション（ATCC No.44076）
に寄託されている。0.25％のカザミノ酸（CAA）を含むM
9（最小栄養培地）およびLB（リッチ培地）は、Miller
（58）によって記載されているように、培地をオートク
レーブで処理し冷却してから20μｇ・mlのアンピシリン
（Sigma）を添加して得られた。下記の培地によって酵
母を増殖させた。１％の酵母抽出物と２％のペプトンと
２％のグルコース、これに所望により３％Difco寒天と
を含むYEPD。１中に6.7gの酵母窒素塩基（アミノ酸非
含有）（YNB）（Difco）と10mgのアデニンと10mgのウラ
シルと5gのCAAと20gのグルコース、これに所望により30
gの寒天とを含むYNB＋CAA。
L.酵母発現ベクターの構成 1.10μｇのYRp7（14,15,16）をE coRIで消化した。得
られたDNAの付着末端をDNAポリメラーゼＩ（Klenow断
片）で平滑末端化した。ベクターと挿入物とを１％のア
ガロース（Seakem）ゲルに流し、ゲルから切り取り、電
気泳動溶出して等容量のクロロホルムとフェノールとで
２回抽出し、エタノール沈殿した。得られた平滑末端DN
A分子を最終容量50μｌで12℃で12時間結合させた。こ
の結合混合物（ligation mix）でE. coli株JA300をアン
ピシリン耐性及びトリプトファン原栄養性に形質転換し
た。夫々反対の方向を向いたTRPＩ遺伝子を含むプラス
ミドを単離した。pFRW1はYRp7と同方向のTRPＩ遺伝子を
有しており、pFRW2はYRp7と反対方向を向いたTRPＩ遺伝
子を有していた。
20μｇのpFRW2をHindIIIで直線化し、１％のアガロー
スゲルを用いて電気泳動にかけた。直線上分子をゲルか
ら溶出し、次に200ngを、酵母３−ホスホグリセリン酸
キナーゼ遺伝子を含む制限断片であるプラスミドpB1（1
3）の3.1kb HindIII挿入物500ngと結合させた。結合混
合物を用いてE. coli株294をアンピシリン耐性及びテト
ラサイクリン感受性に形質転換した。このような組換体
の１つから調製したプラスミドは、テトラサイクリン耐
性遺伝子のHindIII部位にpB1挿入DNAの3.1kbp HindIII
断片を有する完全なTRPＩ遺伝子を有していた。このプ
ラスミドはpFRM31である。５μｇのpFRM31をE coRIで完
全に消化し、フェノール及びクロロホルムで２回抽出し
エタノール沈殿した。夫々250μＭのデオキシヌクレオ
シドトリホスフェートを用いた反応でDNAポリメラーゼ
Ｉ（Klenow断片）を用いて分子の付着末端を充填した。
反応を14℃で20分間継続後、フェノール−クロロホルム
で２回抽出し、DNAをエタノールで沈殿させた。次にDNA
を含む再懸濁液をClaＩで完全に消化し、６％アクリル
アミドゲルを用いて電気泳動にかけた。ベクター断片を
ゲルから溶出し、フェノール−クロロホルム抽出し、エ
タノール沈殿した。
ヒトから精製した３−ホスホグリセリン酸キナーゼ酵
素の６個のＮ−末端アミノ酸は下記の配列を有してい
た。
1 − 2 − 3 − 4 − 5 − 6 SER−LEU−SER−SER−LYS−LEU− 141塩基対のS au3A−S au3A制限断片のDNA配列から生
成した翻訳解読フレームの１個は、（内部HincII部位を
含む。第11図のPGK制限マップ参照）下記のアミノ酸配
列を生成する。
1 − 2 − 3 − 4 − 5 − 6 MET−SER−LEU−SER−SER−LYS−LEU− イニシエーターたるメチオニンを除くとPGKのＮ−末
端アミノ酸配列は、ヒトPGKのＮ−末端アミノ酸配列と
５乃至６個のアミノ酸の相同性（homology）を示した。
この配列決定により酵母PGK構造遺伝子の起点が、pB1
の141塩基対S au3A制限断片中のDNAによりコードされる
と推定できる。従来の研究（20）では、PGK mRNAを特定
化するDNA配列がHindIII断片のこの領域に存在するであ
ろうと推定されていた。更に141塩基対S au3A断片の配
列にはより多くのPGKプロモーターのDNA配列が含まれて
いる（第12図）。
配列５′−ATTTGTTGTAAA−３′を有する合成オリゴヌ
クレオチドを標準法により合成した（Crea他、Nucleic
Acids Res.,8,2331（1980））。
100ngのプライマーの５′−末端を20μｌの反応液中
で200μCiの［γ−32P］ATP及び10ユニットのT4ポリヌ
クレオチドキナーゼで標識した。この標識プライマー溶
液を用いてプライマー修復反応（primer−repair react
ion）を実施した。この反応は、PGK構造遺伝子配列の直
前に位置すPGK5′−フランキングDNAにE coRI制限部位
を入れる多段階プロセスの第１段階である。
100μｇのpB1（20）をH aeIIIで完全消化し６％のポ
リアクリルアミドゲルで電気泳動する。エチジウム染色
ゲル上の最上部のバンド（PGKプロモーター領域を含
む）を前記の如き電気泳動溶出により単離した。このDN
Aの1200塩基対H aeIII断片をHincIIで消化し、次に６％
アクリルアミドゲルで電気泳動した。電気泳動溶出によ
り650塩基対のバンドを単離した。５μｇのDNAを単離し
た。DNAの650塩基対H aeIII−HincII断片を20μｌのH2O
に再度懸濁させ、次に20μｌの前記の燐酸化プライマー
溶液と混合した。この混合物をフェノール−クロロホル
ムで１回抽出し次にエタノール沈殿させた。乾燥したDN
Aを50μｌのH2Oを再度懸濁させ、次に沸騰水浴で７分間
加熱した。この溶液をドライアイス−エノタール浴で
（10乃至20秒間）急冷し、氷水浴に移した。次に、この
溶液に、10μｌのDNAポリメラーゼＩの10倍緩衝液（Boe
hringer Mannheim）とデオキシヌクレオシドトリホスフ
ェート（dATP,dTTP,dGTP及びdCTP）を夫々2.5mMにした1
0μｌの溶液と25μｌのH2Oと５ユニットのDNAポリメラ
ーゼI Klenow断片とを含む溶液50μｌを添加した。この
100μｌの反応溶液を37℃で４時間インキュベートし
た。次に溶液をフェノール−クロロホルム抽出し、エタ
ノール沈殿し、凍結乾燥して10ユニットのS au3Aで完全
に消化した。溶液を６％アクリルアミドゲルで電気泳動
した。39塩基対のサイズに相当するバンドをゲルから切
取り前記の電気泳動溶出で単離した。この39塩基対のバ
ンドは１個の平滑末端と１個のS au3A付着末端とを有す
る。この断片を改造したpFIF trp 69ベクター（５）に
クローニングした。10μｇのpFIF trp69をX baＩで直線
化し、フェノール−クロロホルムで１回抽出し、エタノ
ール沈殿した。ヌクレオシドトリホスフェートを夫々25
0μＭ含む50μｌの反応溶液中でDNAポリメラーゼI Klen
ow断片を使用してX baＩ付着末端を充填した。このDNA
をB amHIで切取り６％アクリルアミドゲルで電気泳動し
た。ベクター断片を電気泳動溶出によってゲルから単離
し次に20μｌのH2Oに再度懸濁させた。20ngのこのベク
ターと前記で調製した20ngの39塩基対断片とを室温で４
時間結合させた。結合混合物の1/5量を使用してE. coli
株294を（LB＋20μg/ml ampプレート上で）アンピシリ
ン耐性に形質転換した。形質転換体から得たプラスミド
をクイックスクリーンプロセス（quick screenprocedur
e）（44）でテストした。配列解析のためにプラスミドp
PGK−39を選択した。20μｇのプラスミドをX baＩで消
化し、エタノール沈殿後1000ユニットの細菌由来アルカ
リ性ホスファターゼと共に68℃で45分間処理した。DNA
を３回フェノール−クロロホルム抽出し、エタノール沈
殿させた。200μCiの［γ−32P］ATPと10ユニットのT4
ポリヌクレオチドキナーゼとを含む20μｌの反応溶液中
で脱リン酸末端を標識した。プラスミドをS alＩで切断
し６％のアクリルアミドゲルで電気泳動した。
標識した挿入バンドをゲルから単離し、Maxam−Gilbe
rt法（52）によって配列を決定した。このプロモーター
断片の３′−末端のDNA配列は予想通りであった。
2.312塩基対PvuI−E coRI PGKプロモーター断片の構成 25μｇのpPGK−39（第13図）を（夫々５ユニットの）
S alＩとX baＩとで同時に消化し６％ゲルを用いて電気
泳動にかけた。39塩基対のプロモーター断片を含む390
塩基対のバンドを電気泳動溶出により単離した。再懸濁
DNAをS au3Aで消化し、８％アクリルアミドゲルを用い
て電気泳動にかけた。39塩基対PGKプロモーターバンド
を電気泳動溶出により単離した。このDNAは、S au3A−X
baＩ断片にPGKプロモーターの５′−末端の39塩基対を
含んでいた。
25μｇのpB1をPvuＩとKpnＩとで消化し、６％アクリ
ルアミドゲルを用いて電気泳動にかけた。DNAの0.8kbp
バンドを電気泳動溶出により単離し、S au3Aで消化し
て、６％アクリルアミドゲルを用いて電気泳動にかけ
た。PGKプロモーターから得た265bpバンド（第11図）を
電気泳動溶出により単離した。
次に、このDNAと前記の39bpプロモーター断片とを室
温で２時間結合した。結合混合物をX baＩとPvuＩとで
消化し、６％アクリルアミドゲルを用いて電気泳動にか
けた。304bp X baＩ−PvuＩ断片を電気泳動溶出により
単離し、これを200ngの（先に単離したPvuＩ−PstI 162
塩基の対断片の欠如した）pBR322（41）と、200ngのX b
aＩ−PstI LeIF A cDNA遺伝子とを含む結合混合物に添
加した。このLeIF A cDNA遺伝子は先に20μｇのpLeIF t
rp A 25から単離されている。この３因子結合混合物を
用いてE. coli株294をテトラサイクリン耐性に形質転換
した。形質転換体コロニーをミニスクリーニングし（4
4）、コロニーの１つ、即ちpBR322をベースとするベク
ター中でLeIF A遺伝子に融合した304塩基対のPGK5′−
フランキングDNAを有するpPGK300を単離した。LeIF A遺
伝子の５′−末端は、配列５′−CTAGAATTC−３′を有
する。従ってこの配列にPGKプロモーター断片からX ba
Ｉ部位が融合すると、X baＩ部位にE coRI部位が付加す
ることが可能になる。従ってpPGK−300はPuvI−E coRI
断片中に単離されたPGKプロモーター部分を含む。
3.1500塩基対のE coRI−E coRI PGKプロモーター断片の
構造 10μｇのpB1をPvuＩ及びE coRIで消化し６％アクリル
アミドゲルで電気泳動した。1.3kbのPvuＩ−E coRI DNA
バンドをPGK5′−フランキングDNAから電気泳動溶出に
より単離した。10μｇのpPGK−300をE coRI及びPvuＩで
消化し、６％アクリルアミドゲルを用いて消化混合物
（digestion mix）を電気泳動にかけ、次に電気泳動溶
出して312bpのプロモーター断片を単離した。５μｇのp
FRL 4をE coRIで切断し、エタノール沈殿させ、68℃で
細菌由来アルカリ性ホスファターゼで45分間処理した。
フェノール／クロロホルムで３回抽出し、DANをエタノ
ール沈殿させ、20mlのH2Oに再懸濁させた。200ngのベク
ターを、pPGK−300から単離した100ngの312bpのE coRI
−PvuI DNA−pB1から単離した100ngのE coRI−PvuI DNA
と結合させた。結合混合物を用いてE. coli株294をアン
ピシリン耐性に形質転換した。得られた形質転換体の１
つがpPGK−1500であった。このプラスミドは、DNAのE c
oRI−E coRI又はHindIII−E coRI断片として1500bpのPG
Kプロモーター断片を含んでいた。
10μｇのpPGK−1500をClaＩ及びE coRIで完全消化
し、消化混合物を６％アクリルアミドゲル電気泳動にか
けた。電気泳動溶出によりPGKプロモーターを含む900bp
の断片を単離した。10μｇのpIFN−γtrp48をE coRI及
びHincIIで完全消化し、６％アクリルアミドゲル電気泳
動にかけた。電気泳動溶出により直接発現できるIFN−
γ cDNAを含む938bpのバンドがゲルから単離された。
（ClaＩ−E coRI断片上の）PGKプロモーター断片と欠
失pFRM−31と前記の単離IFN−γ cDNAとを３断片結合反
応によって酵母発現ベクターを構成した。結合反応は14
℃にて12時間行なわれた。次にこの結合混合物を用いて
E. coli K−12株249をアンピシリン耐性に形質転換い
た。形質転換体を分析し、適正な構成の発現プラスミド
pPGK−IFN−γの存在を確認した（第16図）。発現系を
含むプラスミドを用い、トリプトファン欠失寒天中で酵
母菌RH218のスフェロプラストをトリプトファン原栄養
性に形質転換した。これらの組換え酵母に対し、IFN−
γの存在を調べるアッセイを実施した。
酵母抽出物を下記の如く調製した。10mlの培養液をYN
B＋CAA中でA660１−２まで増殖させ、遠心により集
め、500μｌのPBS緩衝液（20mMのNaH2PO4,pH＝7.4,150m
MのNaCl）に再懸濁させた。等容量のガラスビーズ（0.4
5−0.5mm）を添加し、混合物を２分間攪拌した。抽出物
を14,000rpmで30秒間遠心し、上清を取出した。CPE阻止
アセッイを用いて標準IFN−αと比較すると、上清中の
インターフェロン活性の測定値は16,000ユニット/mlで
あった。
M.セルカルチャーベクターpSVγ69の構成 SV40オリジンを含む342bpのHindIII−PvuII断片をE c
oRI制限部位末端を有する断片に変えた。HindIII部位に
合成オリゴマー（５′−dAGCTGAATTC）を添加して、ポ
リメラーゼＩ（Klenow断片）を作用させて充填し、PvuI
I部位は平滑末端結合によってE coRI部位に変えた。得
られたE coRI断片をpML−１（28）のE coRI部位に挿入
した。ampR遺伝子に逆向きとなるSV40後期プロモーター
を有するプラスミドに於いて、pML−１（27）のampR遺
伝子に最も近いE coRI部位を除去してこのampR遺伝子を
更に改造した。
クローンHBV DNA（60）の1023bpのHpaＩ−BalII断片
を単離し、Ｂ型肝炎ウィルス（HBV）のHpaI部位を合成
オリゴマー（５′−dGCGAATTCGC）でE coRI部位に転換
した。このE coRI−Bg lIIの付いた断片をSV40のオリジ
ンをもつ前記プラスミドのE coRI−B amHI部位に直接ク
ローニングした。
p69の1250bp P stＩ断片に於いてP stＩ末端をE coRI
末端に転換し、残りのE coRI部位にIFN−γ遺伝子を挿
入した。IFN−γの構造遺伝子の前にSV40後期プロモー
ターを有するクローンを単離した。DEAE−デキストラン
の存在中でトランスフェクションを８時間行なうように
改変したDEAE−デキストラン法（61）を用いて、前記で
得られたプラスミドを組織培養細胞（29）に導入した。
細胞培地を２〜３日毎に交換した。毎日200μｌずつ取
出してインターフェロンのバイオアッセイを行なった。
トランスフェクションの３〜４日後に検定したサンプル
での典型的な収率は50乃至100ユニット/mlであった。
N.サル細胞由来IFN−γの部分精製 サル細胞がつくるヒトIFN−γをより多量に製造する
ために、10個の10cmプレート内の新しい単層COS−７
に、110mlのDEAE−デキストラン（200μg/mlのDEAEデキ
ストラン500,000MW、0.05Mのトリス、pH7.5、DMEM中）
中の総量30μｇのpDLIF3をトランスフェクトした。37℃
で16時間維持し、プレートをDMEMで２回洗浄した。10％
のf.b.s.と2mMのグルタミンと50μg/mlのペニシリンＧ
を加えた15mlの新しいDMEMを補充し、次に50mg/mlのス
トレプトマイシンを各プレートに添加した。翌日、培地
を血清を含まないDMEMに代えた。以後、この血清を含ま
ない培地を毎日新しく添加した。収集した培地をアッセ
イを行なう迄又はCPGに結合する迄４℃に維持した。ト
ランスフェクションの３〜４日後のサンプルからプール
した画分は活性をほぼ全部含むことが判明した。
0.5gのCPG（コントロールド−ポアガラス、Electronu
cleonics、CPG350、メッシュサイズ120/200）を100mlの
細胞上清に添加し、混合物を４℃で３時間撹拌した。ベ
ンチトップ遠心機で短時間遠心し、沈降ビーズをカラム
に詰め、20mMリン酸ナトリウム（Na3PO4，Na2HPO4，NaH
2PO4又はPBS）、1M NaCl、0.1％β−メルカプトエタノ
ール（pH7.2）で完全に洗浄した。30％のエチレングリ
コールを含む前記緩衝液及び50％のエチレングリコール
を含む前記緩衝液を順次用いて活性を溶出させた。ほぼ
全部の活性がCPGに付着していた。75％の溶出活性は、3
0％エチレングリコールで溶出した画分中に存在した。
これらの画分をプールし20mMリン酸ナトリウム、1MのNa
Cl、pH7.2で希釈し最終濃度をエチレングリコール10％
にして、10mlのCno Aセファロース（Pharmacia）カラム
に直接かけた。20mMリン酸ナトリウム、1MのNaCl、pH7.
2で完全洗浄後、20mMリン酸ナトリウム、1MのNaCl、0.2
Mのα−メチル−Ｄ−マンノサイドで活性を溶出した。
かなりの量の活性（55％）がこのレクチンに付着しなか
った。α−メチル−Ｄ−マンノサイドによって45％の活
性が溶出した。
薬剤組成物 薬剤として有用な組成物を製造するための公知の方法
に準じて本発明物質を製剤化し得る。即ち、本発明によ
り得られたヒトIFN−γ産生物を、薬剤上許容し得る賦
形剤と混合組合せる。適当な賦形剤及びその製剤化はE.
W.Martin,RemingtonのPharmaceutical Sciencesに記載
されている。この書物を参考文献としてここに引用す
る。このような組成物は、宿主に有効投与するのに適し
た薬剤上許容し得る組成物を調製するために有効量の本
発明のインターフェロンタンパク質を適正量の賦形剤を
組合せて得られる。
A.非経口投与 本発明のヒトIFN−γを、抗腫瘍治療又は抗ウィルス
治療を要する患者、又は、免疫制御状態を示す患者に非
経口投与し得る。用法及び用量は、他のヒトインターフ
ェロンの臨床研究で常用の用法及び用量に準じる。例え
ば日用量約１乃至10×106ユニットで使用され、純度１
％より下と考えられる物質は従来と同様に例えば50×10
6ユニット／日で使用される。IFN−γ以外のヒトタンパ
ク質即ちヒト由来物質中に存在すると或る種の好ましく
ない作用を生じる恐れのあるタンパク質がほぼ全く混在
しないので、効能の良くするためにIFN−γの用量をか
なり増すことができる。
ほぼ同型のIFN−γの非経口投与に適した剤形の一例
としては、特異的比活性例えば２×108ユニット/mgのIF
N−γ 3mgを25mlの5N血清アルブミン（ヒト）−USPに溶
解し、溶液を滅菌フィルターに通し、過した溶液を無
菌的に100本のバイアルに分注する。各バイアルは、非
経口投与に適した純インターフェロン６×106ユニット
を収容している。使用するまでバイアルを低温（−20
℃）保存するのが好ましい。
バイオアッセイデータ A.抗ウィルス活性の特性決定 抗体中和のために、必要ならば、サンプルをPBS−BSA
で500〜1000ユニット/mlの濃度まで希釈する。希釈度を
順次増加したラビットの抗ヒトIFN−α抗血清、抗ヒトI
FN−β抗血清又は抗ヒトIFN−γ抗血清を夫々用い、等
容量ずつのサンプルを４℃にて２〜12時間インキュベー
トした。National Institute of Allergy and Infectio
ns Diseasesから抗IFN−αと抗IFN−βとを入手した。
刺激末梢血リンパ球から精製した（純度５〜20％）の標
準IFN−γを用いて抗IFN−γを調製した。アッセイを行
なう前にサンプルを12,000×ｇで３分間遠心した。pH2
の安定度をテストするためにアッセイ以前に1NのHClを
添加してサンプルをpH2に調整し、４℃にて２〜12時間
インキュベートし、1NのNaOHを添加して中和した。ドデ
シル硫酸ナトリウム（SDS）感受性をテストするために
アッセイ以前にサンプルを等容量の0.2％SDSと共に４℃
で２〜12時間インキュベートした。
B.E.coli及びCOS−７細胞により産生したIFN−γの特性
決定 この表は、種々の処理後の標準IFN−α、β、γの作
用特性を示す。E.coli W3110/pIFN−γ trp 48及びCOS
−7/pSVγ69により産生したインターフェロン活性は、
酸感受性、SDS感受性でありIFN−γ抗血清により中和さ
れるが、IFN−α又はβに対する抗体によって中和され
ない。これらのデータより、前記の系に於いて産生した
インターフェロンがIFN−γでありプラスミドp69の挿入
cDNAがIFN−γをコードしていることが確認される。
精製 たとえば細菌等からIFN−γを精製する一方法を以下
に述べる一般的な大要に従って記載する。
1.高電導性の溶菌バッファー（pH約8.0）中で細胞を高
圧力でホモゲナイザー中を通過させ、次いで氷浴中で流
出物を冷却することによる、細胞からの抽出、 2.撹拌下例えば約４℃でのポリエチレン−イミン添加に
よるDNAの沈殿、 3.溶液中にIFN−γを再び残しつつ細菌タンパク質のpH
による沈殿除去、 4.4℃での遠心分離による固相分離、 5.（pHの再調整後）限外濾過等による上澄みの濃縮、 6.低伝導性バッファーによる濃縮物の透析、 7.遠心分離による固相除去によって、溶液中にIFN−γ
を残すこと、 8.イオン強度を順次増加する溶出法による、カルボキシ
メチルセルロース上でのイオン交換クロマトグラフィ
ー、 9.イオン強度を順次増加する溶出法による、燐酸カルシ
ウムゲル上でのクロマトグラフィー、 10.イオン強度を順次増加する溶出法による、弱い変性
条件下でのカルボキシメチルセルロース上イオン交換ク
ロマトグラフィー、 11.ゲル濾過クロマトグラフィーによる分離。
この方法によれば、90％以上、更には95％以上の純度
を有する物質の精製が可能である。
本発明のIFN−γタンパク質の構造は、DNA遺伝子を決
定し、それに基いてアミノ酸配列を決定することによっ
て解明された−第５図参照。本文に記載したこの特定イ
ンターフェロンについて自然に起こったアレル変異（al
lelic variation）が存在しこの変異が個々人の間で起
こることが理解されるであろう。これらのアレル変異
は、ある場合には全体配列中の１個（又は複数）のアミ
ノ酸の違いにより示され、又ある場合には該配列中の１
個（又は複数）のアミノ酸の欠失、置換、挿入、転位又
は付加により示される。これらのアレル変異体の全部が
本発明の範囲内に包含される。なお、本明細書で用いる
「アレル変異」または「アレル変異体」という語句は、
同種由来の、同一の遺伝子座を占める、塩基配列に固体
差レベルの変異を有する遺伝子によりコードされている
アミノ酸配列を有する蛋白質を指す。実際、種々のヒト
IFN−γ誘導体の製造に組換えDNA技術を使用することに
大きな可能性が存在する。この誘導体は単一の又は多数
のアミノ酸の置換、欠失、付加又は順序の置き挽えによ
って種々修飾されたものである。これらヒトIFN−γ誘
導体を生成する前記のごとき修飾は全て、基本的な特性
であるヒトIFN−γ活性が不変のまま残っている限り、
本発明の範囲に含まれる。
上記IFN−γのDNA及びアミノ酸配列（第５図参照）を
用いて、本発明を疑いを残さずに追試するのに最適な方
法は、（例えば26に示すごとき）合成手段による完全な
遺伝子の製造であり、又は合成デオキシオリゴヌクレオ
チドを製造し、この合成デオキシオリゴヌクレオチドを
プローブに使って、ヒトゲノムライブラリ又は他のcDNA
ソースから、標準的なハイブリダイゼーション技術によ
って目的遺伝子を単離する方法である。必要とするIFN
−γタンパク質をコードしているヌクレオチド配列が一
旦既知となれば発現をさせ、単離し、高度の純化したIF
N−γの製剤を製造する方法は上記記載の方法に従って
実施し得る。
好ましい特定具体例に基いて本発明を説明してきた
が、本発明はこれらの特定具体例に限定されること無
く、むしろ特許請求の範囲の適法範囲に限定されると解
釈すべきであることも理解されよう。
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968）．
【図面の簡単な説明】
第１図は、誘発末梢血リンパ球ポリ（Ａ）＋RNAの70％
ホルムアミド中５〜25％ショ糖密度勾配遠心分離の結果
を示す図、 第２図は、誘発末梢血リンパ球ポリ（Ａ）＋RNAの6M尿
素中1.75％アガロースゲル電気泳動の結果を示す図、 第３図Ａは、誘発32P−標識cDNAとコロニーとのハイブ
リダイゼーションパターンを示す写真、 第３図Ｂは、非誘発32P−標識cDNAとコロニーとのハイ
ブリダイゼーションパターンを示す写真、 第４図は、クローン69の挿入cDNAの制限エンドヌクレア
ーゼマップ、 第５図は、プラスミドp69挿入cDNAのヌクレオチド配列
図、 第６図は、３種のインターフェロン、IFN−α、IFN−β
及びIFNーγの構造の比較図、 第７図は、IFN−γ発現プラスミドpIFN−γ trp 48の
構成を示す説明図、 第８図は、サル細胞でのIFN−γ発現に用いられるプラ
スミドの構成を示す図、 第９図は、８種のE coRI消化ヒトゲノムDNAとp69の挿入
cDNA32P−標識プローブとのSouthernハイブリダイゼー
ションの結果を示す写真、 第10図は、６種の制限エンドヌクレアーゼで消化したヒ
トゲノムDNAとp69由来32P−標識プローブとのSouthern
ハイブリダイゼーションの結果を示す写真、 第11図は、ベタクーpB1の3.1Kbp H indIII挿入物の制限
マップ、 第12図は、酵母３−ホスホグリセリン酸キナーゼ構造遺
伝子の５′−末端部及び５′−フランキングDNAのDNA配
列を示す図、 第13図は、PGKプロモーターにXbaI部位を挿入し且つPGK
5′−フランキング配列の39bp断片を単離する工程図、 第14図は、プラスミドpPGK−39から得た39から得た39bp
断片とpB1から得た265bp P vuＩ−S au3A付加PGK5′−
フランキング配列とpLeIF trp Aから得たX baＩに隣接
するEcoRI部位とを有する300bp断片の構成を示す図、 第15図は、第14図の300bp断片に加えてPGK5′−フラン
キング配列から得た1300bp H indIII−P vuＩ断片を有
する1500bp PGKプロモーター断片の構成を示す図、 第16図は、酵母菌中でヒトIFN−γを発現するベクターp
PGK−IFN−γの構成を示す図である。
フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 // Ｃ１２Ｎ 15/09 Ｃ１２Ｒ 1:865） (Ｃ１２Ｐ 21/02 (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ａ６１Ｋ 37/66 ＡＤＵ Ｃ１２Ｒ 1:865） ＡＤＹ (Ｃ１２Ｐ 21/02 ＡＢＨ Ｃ１２Ｒ 1:91） 9162−4Ｂ Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ (56)参考文献 特開 昭55−98118（ＪＰ，Ａ) 特開 昭56−85296（ＪＰ，Ａ) 特開 昭58−13397（ＪＰ，Ａ) 特表 昭57−500961（ＪＰ，Ａ) Ｎａｔｕｒｅ，Ｖｏｌ．292（1981. ８）Ｐ．842−844 Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ ｉ．ＵＳＡ，Ｖｏｌ．78，Ｎｏ．３ （1981．３）Ｐ．1601−1605

Claims (14)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】次のアミノ酸配列 のヒト免疫インターフェロンまたはそのアレル変異体で
    あって、pH2で不安定であり、ヒト免疫インターフェロ
    ン抗血清により中和されるがヒト白血球インターフェロ
    ンに対する抗体またはヒト線維芽細胞インターフェロン
    に対する抗体のいずれによっても中和されず、通常ヒト
    免疫インターフェロンに伴う他のタンパクを含まないヒ
    ト免疫インターフェロンまたはそのアレル変異体。
  2. 【請求項２】Ｎ−末端にメチオニンを有する特許請求の
    範囲第１項に記載のヒト免疫インターフェロン。
  3. 【請求項３】天然のグリコシレーションを伴わない特許
    請求の範囲第１項または第２項に記載のヒト免疫インタ
    ーフェロンまたはそのアレル変異体。
  4. 【請求項４】前記ヒト免疫インターフェロンまたはその
    アレル変異体を発現し得る複製可能な発現ベヒクルで形
    質転換された微生物又は哺乳動物細胞によって産生され
    た特許請求の範囲第１項に記載のヒト免疫インターフェ
    ロンまたはそのアレル変異体。
  5. 【請求項５】ヒト免疫インターフェロンをコードする組
    換えDNA配列を哺乳動物細胞系中で発現させることによ
    って産生された特許請求の範囲第４項に記載のヒト免疫
    インターフェロン。
  6. 【請求項６】細胞系がサルのCOS−７細胞系である特許
    請求の範囲第５項に記載のヒト免疫インターフェロン。
  7. 【請求項７】ヒト免疫インターフェロンをコードする組
    換えDNA配列を大腸菌中で発現させることによって産生
    された特許請求の範囲第４項に記載のヒト免疫インター
    フェロン。
  8. 【請求項８】製薬上許容し得る担体と共に、次のアミノ
    酸配列： のヒト免疫インターフェロンまたはそのアレル変異体で
    あって、pH2で不安定であり、ヒト免疫インターフェロ
    ン抗血清により中和されるがヒト白血球インターフェロ
    ンに対する抗体またはヒト線維芽細胞インターフェロン
    に対する抗体のいずれによっても中和されず、通常ヒト
    免疫インターフェロンに伴う他のタンパクを含まないヒ
    ト免疫インターフェロンまたはそのアレル変異体を治療
    上有効な量で含む抗腫瘍組成物。
  9. 【請求項９】非経口投与に適することを特徴とする特許
    請求の範囲第８項に記載の組成物。
  10. 【請求項１０】製薬上許容し得る担体と共に、次のアミ
    ノ酸配列： のヒト免疫インターフェロンまたはそのアレル変異体で
    あって、pH2で不安定であり、ヒト免疫インターフェロ
    ン抗血清により中和されるがヒト白血球インターフェロ
    ンに対する抗体またはヒト線維芽細胞インターフェロン
    に対する抗体のいずれによっても中和されず、通常ヒト
    免疫インターフェロンに伴う他のタンパクを含まないヒ
    ト免疫インターフェロンまたはそのアレル変異体を治療
    上有効な量で含む抗ウイルス性組成物。
  11. 【請求項１１】非経口投与に適することを特徴とする特
    許請求の範囲第10項に記載の組成物。
  12. 【請求項１２】製薬上許容し得る担体と共に、次のアミ
    ノ酸配列： のヒト免疫インターフェロンまたはそのアレル変異体で
    あって、pH2で不安定であり、ヒト免疫インターフェロ
    ン抗血清により中和されるがヒト白血球インターフェロ
    ンに対する抗体またはヒト線維芽細胞インターフェロン
    に対する抗体のいずれによっても中和されず、通常ヒト
    免疫インターフェロンに伴う他のタンパクを含まないヒ
    ト免疫インターフェロンまたはそのアレル変異体を治療
    上有効な量で含む免疫調節治療用組成物。
  13. 【請求項１３】非経口投与に適することを特徴とする特
    許請求の範囲第12項に記載の組成物。
  14. 【請求項１４】次のアミノ酸配列： のヒト免疫インターフェロンまたはそのアレル変異体を
    含むポリペプチドの製造方法であって前記ポリペプチド
    の遺伝子を発現させ得る複製可能な発現ベヒクルで形質
    転換された微生物又は哺乳動物細胞を増殖させて前記ポ
    リペプチドを産生させ、前記ポリペプチドを回収するこ
    とからなる方法。
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