BG60939B2 - човешки имунен интерферон - Google Patents

Abstract

Интерферонът се получава чрез рекомбинантна днк технология с помощта на който и да е от даден асортимент експресионен вектор и гостоприемникови култури. Рекомбинантният човешки имунен гама -интерферон (ifn ) е изолиран и характеризиран чрез неговата днк и аминокиселинни последователности, физичниотнасяния и биологична активност. Получени са и видове dеs-сys-тyr-сys.

Description

ОБЛАСТ НА ИЗОБРЕТЕНИЕТО

Настоящото изобретение се отнася до областта на рекомбинантната ДНК технология, до средствата и методите, които тя използва за разкриване ДНК секвенцията и прогнозираните амино киселинни последователности на човешкия имунен интерферон, както и до получаването му и до различните продукти при това получаване и тяхната употреба.

По-специално, настоящото изобретение се отнася до изолирането и идентифицирането на ДНК последователности, кодиращи човешки имунен интерферон и до конструирането на рекомбинантни ДНК експресионни средства, съдържащи такива ДНК последователности, оперативно свързани към съдействащи за експресията промоторни последователности и към така конструираните експресионни средства. В друг аспект, настоящото изобретение се отнася до гостоприемникова културална

система, като напр. различни микроорганизми, клетъчни култури от гръбначни, предварително трансформирани с подобни експресионни средства и по този начин - насочени към експресия на ДНК последователностите, посочени по-горе. Съгласно още един от аспектите, настоящото изобретение се отнася до средствата и методите за превръщане на крайните продукти на дадена експресия до нови по своята същност, като напр. фармацевтични състави, приложими за профилактика или лечение на хора. В предпочитаните изпълнения настоящото изобретение осигурява частично експресионни средства, които са съгласувани по същество така, че човешкият имунен интерферон се получава в зряла форма от гостоприемникови клетки. В допълнение, изобретението се

отнася до различни методи, приложими за получаване на посочените ДНК последователности, до клетъчно културални гостоприемникови системи и крайните им продукти, такива каквито са, както и до специфичните и свързани с тях изпълнения.

Настоящото изобретение възниква частично от откриването на ДНК последователността и прогнозираните амино киселинни последователности, кодиращи човешкия имунен интерферон.В допълнение. настоящото изобретение обезпечава секвенционна информация за 3'- и 5'- фланкиращите последователности от гена за човешкия имунен интерферон, улеснявайки свързването in vitro вътре в експресионните системи. По-специално, осигурен е 5-ДНК сегмент, кодиращ предполагаемия ендогенен сигнален полипептид, който предшества амино киселинната последователност на предполагаемия зрял човешки имунен интерферон. Тези открития на свой ред дават възможност за усъвършенстване на средствата и методите за получаване, посредством рекомбинантната ДНК технология, на задоволително количество човешки имунен интерферон, така че да бъде възможно, от друга страна, определянето на неговите биохимични свойства и биологична активност.

Публикациите *и другите материали, илюстриращи нивото на техниката за изобретението, и в специални случаи, осветляващи допълнителни детайли за практиката, са включени в литературна справка и за удобство са номерирани в текста като съответно са групирани в приложената библиография.

НИВО НА ИЗОБРЕТЕНИЕТО

А. Човешки имунен интерферон

Човешкият интерферон може да бъде класифициран в три групи на базата на различия в антигенността и биологичните и биохимични свойства.

Първата група се състои от семейство левкоцитни интерферони ( а интерферон, LelF или IFN - а ), които нормално се продуцират главно от конституентни клетки на човешка кръв при вирусно индуциране. Те са получени по микробиологичен път и е установено, че са биологично активни ζ 1,2,3 У Техните биологични свойства подсказват тяхното приложение в клиниката като терапевтични агенти за лечение на вирусни инфекции и злокачествени образувания (Т).

Във втората група е човешкият фибробластен интерферон (β интеферон, FIF или IFN- β), нормално продуциран от фибробласти при вирусно индуциране, които са също получени по микробиологичен път и за които е установено, че проявяват широк кръг биологични активности®. Клинични изследвания показват и тяхната потенциално терапевтична значимост. Левкоцитните и фибробластните интерферони проявяват много ясно сходство в биологичните си свойства, независимо от факта, че степента на хомоложност на амино киселинно ниво е

относително ниска. В допълнение, двете групи интерферони включват от 165 до 166 амино киселини и са киселинно стабилни протеини.

Човешкият имунен интерферон ( γ- интерферон, IIF или IFN -γ ), към които този интерферон се адресира, е, в противоположност на X и интерфероните, pH 2 лабилен, продуцира се главно при митогенна индукция на лимфоцити и е ясно отличим в антигенно отношение. Доколкото човешкият интерферон понастоящем може да бъде открит

само в много малки количества, това възпрепятства неговото характеризиране. Напоследък е докладвано за твърде екстензивно, но все още частично пречистване на човешки имунен интерферон®. Посочва се, че съединението е продуцирано от лимфоцитни култури, стимулирани с комбинация от фитохемаглутинин и форболов естер, и пречистено чрез секвенционно хроматографско разделяне. Този метод води до продукт с молекулно тегло 58, 000 .

Посредством транслация на тРНК в ооцити в много малки количества е получен човешки имунен интерферон , показващ характеристика на интерфероновата активност, присъща за човешки интерферон и по този начин изразяващ надеждата, че имунно интерефронова сДНК може да бъде синтезирана и клонирана(7).

Количеството имунен интерферон, получено до сега, е действително незадоволително с оглед провеждане на недвусмислени експерименти относно характеристиката и биологичните свойства на пречистеното съединение. Обаче, in vitro изследвания, проведени със суров препарат, както и in vivo експерименти с муринови γ-интерферонови препарати предполагат, че основната функция на имунния интерферон е функцията му на имунорегулаторен агент (8,9). Имунният интерферон не само притежава общата за всички човешки интерферони антивирусна и антиклетъчна активност, но показва и потенциално въздействие върху тези активности с а- и в-интерферона (10). Освен това, докладвано е, че in vitro антипролиферативният ефект на ^интерферона върху туморни клетки е от 10 до 100 пъти по-силен от този при останалите интерферонови класове(8,11,12). Този резултат, заедно с неговата изразена

имунорегулаторна функция (8,9), предполага по-силни антитуморни възможности за IFN -γ, отколкото за IFN-α и IFN-β. В действителност, in vivo експериментите с мишки и муринови IFN-γ препарати показват ясно превъзходство над антивирусно индуцираните интерферони в техния антитуморен ефект срещу остеогенна саркома(13).

Всички тези изследвания до настоящето изобретение, са осъществявани с твърде суров препарат. Но те наистина предполагат много важни биологични функции за имунния интерферон. Последният не само притежава потенциална асоциирана антивирусна активност, но вероятно

притежава и силна имунорегулаторна и антитуморна активност, ясно насочваща към потенциално многообещаващо клинично приложение.

Разбираемо е, че в случая рекомбинантната ДНК технология би била най-ефективният начин за получаване на необходимото по-голямо количество човешки имунен интерферон. Дали така продуцираните материали ще включват гликозилирания, които се считат присъщи за нативния, получен от човека материал, или не, те биха показвали биоактивност, допускаща тяхното клинично приложение при лечение на широк кръг от вирусни, неопластични и имуносупресиращи състояния или заболявания.

В. Рекомбинантна ДНК технология

Рекомбинантната ДНК технология достигна своята зряла възраст.

Молекулярните биолози са способни да рекомбинират различни ДНК последователности с лекота, създавайки нови ДНК средства, способни да продуцират копия от различни екзогенни продукти в трансформирани микроби. Основните средства и методи под ръка са in vitro свързванията на различни слепи или лепливи крайни фрагменти на ДНК,

продуциращи потенциални експресиращи средства, които се използват в частично трансформираните организми, насочвайки по този начин тяхната синтеза към желан екзогенен продукт. Обаче, по отношение на отделния продукт, обмяната остава изменчива и науката няма напредък по отношение на етапа на предсказването и получаването на постоянен резултат. Този, който предсказва успешни резултати без да подчертава експерименталните данни, прави това с относителен риск.

Плазмидът, нехромозомна бримка от двойно верижна ДНК, установен в бактерии и други микроби, способен на многократно самовъзпроизвеждане в клетката,остава основен елемент на

рекомбинантната ДНК технология. Включен в информацията, кодирана в плазмидната ДНК* е онова, което е необходимо за репродукция на плазмида в дъщерни клетки (т.е. произход на репликацията) и обикновено една или повече фенотипно подбрани характеристики като тези, в случаите на бактерии, устойчивост на антибиотици, което позволява клонове на гостоприемниковата клетка*съдържаща желания плазмид* да бъдат разпознати и преференциално култивирани на подбрана среда. Приложимостта на плазмидни линии се основава на възможността да бъдат специфично разградени с един или друг ендонуклеазен ензим или рестрикционен ензим, всеки от които разпознава различен сайт от плазмидната ДНК. Поради това става възможно и инсертирането на хетероложни гени или генни фрагменти в плазмида посредством присъединяване в мястото на разграждане или при реконструираните краища, съседни на мястото на разграждане. Така се формират така наречените репликативно експресионни средства. ДНК рекомбинацията се осъществява извън клетката, но полученото в резултат рекомбинантно репликативно експресионно средство, или плазмид, може да бъде въведено в клетки по известен на специалистите начин, наречен трансформация^ да бъдат получени големи количества от рекомбинантното средство чрез

култивиране на трансформантите. Нещо повече, когато генът е инсертиран съобразявайки се с частта от плазмида, регулираща транскрибцията и транслацията на кодираното ДНК съобщение,полученото в резултат експресионно средство може да бъде използвано да актуализира получаването на полипептидната последователност, която инсертираният ген кодира, а целият процес се нарича експресия .

Експресията се инициира в област, позната като промоторна, която се разпознава от и свързва с РНК полимераза. В транскрибционната фаза на експресията, ДНК се деспирализира, превръщайки се в матрица за иницииран синтез на транспортна (т) РНК от ДНК последователността.

Транспортната РНК на свой ред се транслира в полипептид, притежаващ амино киселинна последователност, кодирана от нуклеотидния¹ триплет или код, която като цяло дава структурния ген , т.е. тази част, която кодира амино киселинната последователност на експресирания полипептиден продукт. Транслацията се инициира при старт сигнал ( обикновено ATG, който в получената транспортна РНК преминава в AUG).

Така наречените стоп кодони определят края на транслацията и следователно, продукцията на следващите амино киселинни единици.

Крайният продукт може да бъде получен чрез лизинг, ако е необходимо, на гостоприемниковата клетка, в микробиална система и възстановяване на продукта с подходящо пречистване от други протеини.

На практика,C използването на рекомбинантната ДНК технология може да се експресират изцяло хетероложни полипептиди - така наречената директна експресия - или обратно може да се експресират хетероложни полипептиди, които са сляти с част от амино киселинната последователност на хомоложен полипептид. В последните случаи, очакваният биоактивен продукт може да премине в биологично неактивна форма вътре в слетия хомоложно/хетероложен полипептид до разграждането му в извън клетъчна среда. Виж Англ. патент публ. N 2007676 и Wetzel, American Scientist 68,664 (1980).

С. Технология на клетъчните култури

Технологията на клетъчните или тъканни култури за изучаване на генетиката и физиологията на клетките е добре развита. Средствата и методите на тази технология служат за поддържане на постоянни клетъчни линии, получени чрез успешни серийни трансфери от изолирани нормални клетки. За използване при изследваният!, такива клетъчни линии се поддържат върху твърда повърхност в течна среда, или чрез култивиране в суспенсия, съдържаща твърди хранителни вещества. Изготвянето им в голям мащаб като че поставя само механични проблеми. За повече информация по отношение нивото на познанията в дадената област виж Microbiology, 2nd Eddition, Harper and Row,Publishers, Inc., Hagerstown, Md. (1973), по-специално стр.1122 и Scientific American 245,66 (1981), всеки от които е включен в литературната справка.

ОБЩО ЗА ИЗОБРЕТЕНИЕТО

Настоящото изобретение се основава на откритието, че рекомбинантната ДНК технология може да бъде използвана за получаване на човешки имуноинтерферон, за предпочитане в директна форма, и в количества, достатъчни за иницииране и провеждане на тестуване на животни и хора при клинични условия като предпоставка за одобрението на пазара. Продуктът е подходящ за използване във всички негови форми при профилактиката и лечението на хора с вирусна инфекция и злокачествени и имуносупресивни или имунодефицитни състояния. Тези негови форми включват различни възможни олигомерни форми, които могат да включват асоциирана гликозилация. Продуктът е получен чрез трансформирани по пътя на генното инженерство микроорганизми или трансформирани клетъчно културални системи. Както е употребено тук, терминът клетъчни трансформанти се отнася до клетки, в които е въведена ДНК, получена след екзогенна ДНК рекомбинация, и до потомството на която и да е такава клетка, която съхранява така въведената ДНК. Така понастоящем съществува потенциал за получаване и изолиране на човешки имуноинтерферон по по-ефикасен начин. Особено значим фактор от настоящето изобретение, в неговото най-предпочитано изпълнение_?е постигането на генетично насочване на микроорганизмите или клетъчните култури да продуцират човешки имунен интерферон в

количества,които позволяват изолирането им след секретиране от гостоприемниковата клетка в зряла форма.

Настоящото изобретение обхваща така полученият имунен интерферон, както и средствата и методите за неговото получаване. По нататък настоящото изобретение е насочено към реплициращи ДНК експресионни средства, помещаващи гениите секвенции, които кодират човешкия имуноинтерферон в подходяща за експресиране форма. Понататък, настоящото изобретение е насочено към щамове микроорганизми или клетъчни култури, трансформирани с експресионните средства, описани по-горе_? и до микробиални или клетъчни култури на така трансформирани щамове или култури,способни да продуцират човешки имуно интерферон. В още един друг аспект,настоящото изобретение е насочено към различни методи,приложими за получаване на генната последователност на посочения имуноинтерферон, ДНК експресионните средства, щамове микроорганизми и клетъчни култури и тяхното специфично изпълнение. Още по-нататък, това изобретение е насочено към получаване на ферментационни култури от дадените микроорганизми и клетъчни култури. В допълнение,това изобретение е насочено към получаване на човешки имуноинтерферон, като директен експресионен продукт, секретиран от гостоприемниковата клетка в зряла форма. Този подход предвижда използване на гена _? кодиращ последователността на зрелия човешки имуноинтерферон плюс 5' фланкиращата ДНК, кодираща сигналния' полипептид.Счита се, че сигналният полипептид подпомага транспорта на молекулата до клетъчната стена на гостоприемниковия организъм, където се разгражда по време на процеса на секретиране на зрелия човешки имуноинтерферонов продукт.

Така експресираният човешки имуноинтерферон несъмнено притежава 146 амино киселини в своята зряла форма, започвайки от цистеин, и е основен по своя характер.Молекулното тегло на мономерната му форма е изчислено като 17,140. Вероятно поради присъствието на много основни остатъци, хидрофобността, образуването на мостове и др., молекулата може да се асоциира в олигомерни форми като напр. в димерна,тримерна или тетрамерна форма. Наблюдаваните по-рано високи молекулни тегла за природни материали(б), които не могат да бъдат изчислени само на базата на аминокиселинната последователност, може би се дължат на такива олигомерни форми угака както и съдействието за карбохидрата от посттранслационна гликозилация.

В същинските клетъчни гостоприемникови системи, по-специално когато са свързани в експресионно средство^така че да бъде експресиран заедно с неговия сигнален пептид, зрялата форма от човешкия

1] имуноинтерферон се транспортира в средата на клетъчната култура, подпомагана от методите за възстановяване и пречистване.

ОПИСАНИЕ НА ПРЕДПОЧИТАНИТЕ НАЧИНИ НА ИЗПЪЛНЕНИЕ

А. Микроорганизми / Клетъчни култури

1.Бактериални щамове / Промотори

Описаните тук действия се осъществяват с участието на микроорганизма Е. coli К-12 щам294 ( и A, thi-, hsr-, hsm+), както е описано в Англ.патентно описание No 2055382 А. Този щам е депозиран в Американската колекция за типови култури АТСС под No 31446. Но и много други микробиални щамове са използваеми, включително известните щамове Е. coli В, Е. coli X 1776 ( ATCC No 31537) и Е. coli W 3110 (F-, λ-, протрофични) (ATCC No 27355) или други микробиални щамове, повечето от които са депозирани и (потенциално) на разположение от оторизираните депозитни институции за микроорганизми, като АТСС. Виж също Германският Offenlegungsschrift

2644432. Тези други микроорганизми включват, например, бактерии като Bacillus subtilis и други ентеробактерии, сред които могат да бъдат забелязани като примери Salmonella typhimurium nSerratia marcesans, които могат да репликират и експресират хетероложните генни последователности.

Като примери, бета лактамазните и лактозо промоторните системи се използват преимуществено за иницииране и поддържане на микробиалното продуциране на хетероложни полипептиди. Детайлите, отнасящи се до конструирането на тези промоторни системи, са публикувани от Chang et al., Nature 275 617 (1978) и Itakura et al., Science 198 1056 (1977), които са включени в литературната справка. Наскоро е създадена т.нар. trp промоторна система,основана на триптофана. Подробностите, отнасящи се до конструирането на такава система, са публикувани от Goeddel et al., Nucleic Acid Research 8,4057 (1980) и Kleid et al.,U.S.Ser.No 133 296, заявен на 24 март 1980,които са включени в литературната справка. Открити са и са използвани много други микробиални промотори, а подробностите, отнасящи се до техните нуклеотидни последователности ,позволяващи на специалистите в областта да ги свързват функционално в плазмидни вектори, са публикувани -виж напр. Siebenlist et al., Cell 20, 269 (1980), който е включен в приложената литературна справка.

2. Дрождеви щамове / Дрождеви промотори

Използваната в изобретението експресионна система може да бъде плазмида YRpQ4,15,16), който е способен на селекция и репликация както в Е. coli, така и в дрождите Saccharomyces cerevisiae. За селекция в дрожди плазмидът съдържа гена TRP1Q4,15,10, чиито комплементи (позволяващи развитие в отсъствие на триптофан),съдържащи мутации в този ген, са намерени върху хромозома IV(17). Използваният тук щам е RH218QS), депозиран в АТСС без ограничения (АТСС No 44076 ). Но следва да се разбере, че всеки щам Saccharomyces cerevisiae,съдържащ мутация, която прави клетката trpl, следва да бъде ефективна среда за

експресия на плазмида,съдържащ експресионната система. Пример за друг щам, който може да бъде използван е pep4-lQ9). Този триптофан ауксотрофен щам също притежава точкова мутация върху TRP1 гена.

Когато 5'-фланкираща ДНК последователност (промотор) от дрождев ген (за алкохол дехидрогеназа 1) се постави върху 5'- края на ген с различен от дрожди произход, той може да съдейства експресията на чужд ген в дрожди,ако бъде поставен в плазмид, приложим за трансформация на дрожди. Освен промотор, истинската експресия на не-дрождев ген в дрожди изисква втора дрождева последователност, поставена при 3'- края от недрождевия ген в плазмид, така че да позволи действително транскрибционно терминиране и полиаденилация в дрожди. Този промотор може да бъде подходящо използван в настоящото изобретение, така като и други - виж по-горе. В предпочитаните варианти на изпълнение, 5'-фланкиращата последователност от дрождевия 3фосфоглицерат киназен ген (20) се помества нагоре от структурния ген, последван отново от ДНК съдържащ терминатор - полиаденилационни сигнали, например TRP1 £14,15,16) гена или PGK(2Q) гена.

Тъй като 5'- фланкиращата последователност (свързана с 3'- дрождева терминираща ДНК) (по-горе) може функционално да съдейства за

експресия на чужди гени в дрожди, като че онези от 5'- фланкиращите последователности от който и да е високо експресивен дрождев ген може да бъде използван за експресията на важни генни продукти. Докато при някои обстоятелства дрождите експресират до 65 процента от разтворимия си протеин като гликолитични ензими (21) и докато това високо ниво се явява като резултат от продуцирането на високи нива от индивидуалната тРНК (22), би било възможно използването на 5'-фланкиращите последователности от които и да са други гликолитични гени за такива

експресионни цели - като напр. енолаза, глицералдехид-3-фосфат дехидрогеназа, хексокиназа, пируват декарбоксилаза, фосфофруктокиназа, глюкозо-6-фосфат изомераза, 3-фосфоглицерат мутаза, пируват киназа, триозефосфат изомераза, фосфоглюкозо изомераза и глюкокиназа. Всяка от 3'-фланкиращите последователности на тези гени може също да бъде използвана за терминиране и тРНК полиаденилиране в такива експресионни системи -вж. по-горе. Други високо експресионни гени са тези за киселите фосфатази (23) и онези, които експресират високи нива на продуктивност благодарение на мутации в 5'-фланкиращи области (мутанти, които повишават експресията)- обикновено благодарение на присъствието на TY1 транспозициониращ елемент (24).

Всички гени, маркирани по-горе, са такива, които могат да бъдат транскрибирани чрез дрождева РНК полимераза 11(24). Възможно е промоторите за РНК полимераза I и III, които транскрибират гените за рибозомална РНК, 5S РНК, и tPHK(24,25), също да бъдат приложими в такива експресионни структури.

Накрая, много дрождеви промотори също съдържат транскрибционен контрол* така че да могат да бъдат изключвани или включвани чрез варианти на условията на развитие. Някои примери от такива дрождеви промотори са гените, които продуцират следните протеини : Алкохол дехидрогеназа П,изоцитохром -с, кисела фосфатаза, деградиращи ензими асоциирани с азотния метаболизъм, глицералдехид-3-фосфат дехидрогеназа и ензими, отговорни за използването на малтозата и галактозата (22). Такива контролни области биха били много приложими при контролиране експресията на протеиновия продукт - по-специално, когато тяхното получаване е токсично за дрождите. Би било възможно също така да се постави контролната област от една 5’-фланкираща последователност с 5*фланкираща последователност съдържаща промотор от високо експресиран ген. Това би довело до хибриден промотор и би било възможно, доколкото контролиращата област и промоторната са физически отличими ДНК последователности.

3.Клетъчно културални системи / Клетъчно културални вектори

Размножаването на клетки от гръбначни в култура (тъканна култура) е рутинна процедура през последните години (виж Tissue Culture, Academic Press, Kruse and Patterson eds,1973). Тук е използвана линията COS-7 от фибробласти на маймунски бъбреци като гостоприемник за получаване на имуноинтерферон (25). Но експериментите, детайлно описани тук,могат да бъдат проведени в която и да е клетъчна линия, способна на репликация и експресия на конкурентен вектор, като напр., WI138, ВНК, ЗТЗ, СНО, VERO, и HeLa клетъчни линии. В допълнение, това което се изисква за експресионен вектор, е източник на репликация и промотор, локализиран пред гена за експресиране, по дължината на който и да е необходим рибозомален свързващ сайт, РНК сайт на разцепване, полиаденилационен сайт и транскрибционни терминиращи последователности. Независимо, че тук се използват тези есенциални елементи на SV40, би могло да се разбере, че изобретението, макар и описано в рамките на предпочитани варианти на изпълнение, не трябва да се конструира ограничено в тези последователности.Например, може да се използва източникът на репликацията на други вирусни вектори (като Polyoma, Adeno, VSV, BPV и други подобни), така като и клетъчни източници на репликация, които биха могли да функционират в неинтегрирано състояние.

В. Векторни системи

1.Директна експресия на зрял имуноинтерферон в Е. coli

Процедурата, използвана за получаване на директна експресия на IFN-γ

в Е. coli като зрял интерферонов полипептид (минус сигнална последователност)^ вариант от тази, която използва по-ранен човешки растежен хормон Q.6) и човешки левкоцитарен интерферон (Т), доколкото включва комбинацията от синтетична (N-крайна) и сДНК.

Както се предполага от нуклеотидната последователност на р69, описана по-горе,и от сравняването на познатите сайтове на разграждане между сигналния пептид и зрелия полипептид за няколко IFN-a (2) , IFN-γ притежава хидрофобен сигнален пептид от 20 амино киселини, последван от 146 амино киселини на зрелия IFN-γ (фиг. 5). Както е показано на фиг.7, BStNI рестрикционният ендонуклеазен сайт е конвенционално локализиран при амино киселина 4 на зрелия IFN-J'. Конструирани са два синтетични олигодезоксинуклеотида,които включват ATG транслационен иницииращ кодон,кодони за амино киселини 1, 2 и 3 (цистеин-тирозин-цистеин) и се създава EcoRI козезивен край. Тези дезоксиолигонуклеотиди са свързани към 100 двойки бази BstNI-PstI фрагмент от р69 за конструиране на синтетично-природен хибриден ген с 1115 двойки бази, който кодира IFN-|r и който е свързан чрез EcoRI и PstI рестрикционни сайтове. Този ген се инсертира в плазмида pLelF A trp 103 между EcoRI и PstI сайтовете за получаване на експресионния плазмид pIFN-γ trp 48. В този плазмид IFN-γ генът е експресиран под контрола на E.coli trp промотор. pLelF A trp 103 е получен от pLelF A 25, в който сайтът EcoRI, дистално спрямо LelF А гена, е отстранен. Използваната за отстраняване на този сайт процедура е описана по-рано (27).

2. Експресия в дрожди

За експресиране на хетероложен ген като сДНК за имуноинтерферон в дрожди, необходимо е да се конструира плазмиден вектор, съдържащ четири компонента на Е. coli, така и на дрожди и по този начин следва да съдържа селективен ген от всеки организъм. ( В този случай това е гена за ампицилинова устойчивост от E.coli и генът TRP1 от дрожди ). Този компонент също изисвква източник на репликация от двата организма(В случая това е източникът E.coli от pBR322 и arsl източникът от хромозомът III на дрождите).

Вторият компонент от плазмида е 5'-фланкиращата последователност от високо експресивен ген за подпомагане на транскрибцията на поместения надолу в последователността структурен ген. В този случай, използваната 5'-фланкираща последователност е тази, която е от дрождевата 3-фосфоглицерат киназа (PGK) гена, фрагментът е конструиран така,че да отстрани ATG от PGK структурната последователност като 8 вр надолу от този ATG. Тази последователност е заместена с последователността,съдържаща и двата рестрикционни сайта XbdI и EcoRI, за удобство прикрепени към 5'-фланкиращата последователност от структурния ген.

Третият компонент от системата е структурен ген,конструиран по същия начин,че да съдържа едновременно ATG транслационен старт и транслационен стоп сигнал. Изолирането на структури от такъв ген е описано по-горе.

Четвъртият компонент е дрождева последователност, съдържаща 3'фланкираща последователност от дрождев ген, който съдържа същински сигнал за транскрибционно терминация и полиаденилация.

Имуноинтерферонът е получен в присъствието на всички тези компоненти в дрождите.

З.Експресия в клетъчни култури на бозайници

Методиката за синтез на имунен интерферон в клетъчни култури на бозайници разчита на създаването на вектор, способен и на автономна репликация и на експресия на външен ген под контрола на хетероложна транскрибционна единица. Репликацията на този вектор в тъканна култура се осъществява чрез осигуряване на ДНК репликационен източник (получен от SV40 вирус),и обезпечаване на помощна функция (Т антиген )

чрез въвеждане на вектора в клетъчна линия, ендогенно експресираща този антиген(28,29). Късният поромотор на SV вируса предшества структурния ген на интерферона и гарантира транскрибцията на гена.

Векторът,използван за получаване на експресия на IFN-γ, се състои от pBR322 последователности, които осигуряват селективен маркер за подбор в Е. coli (ампицилин резистентен), както и Е. coli източник на ДНК репликация. Тези последователности са получени от плазмида pML-l(28) и обхващат областта между рестрикционните сайтове Е. coli и BamHI. Източникът SV40 е получен от 342 двойки бази PvuII-Hindlll фрагмент, покриващ тази област (30,3 Г) (двата края са превърнати в EcoRI краища). Тези последователности, като допълнение към това,че обхваща вирусния източник на ДНК репликация,кодират промотор едновременно за ранната и за късната транскрибционна единица. Ориентацията на областта за SV40 източника е такава, каквато е на промотора за късната транскрибционна единица -проксимално на гена, кодиращ интерферон.

КРАТКО ОПИСАНИЕ НА ЧЕРТЕЖИТЕ фиг.1 показва захарозния градиент на центрофугиране на индуцирана в лимфоцити от периферната кръв Поли(А) + РНК. Наблюдавани са два пика на интерферонова активност (както е показано на защрихованите кутийки) с размери 12S и 16S. Местата на рибозомалните РНК маркери(центрофугирани незабавно) са белязани погоре в абсорбционен профил.

фиг.2 показва електрофорезис на индуцирана PBL Поли(А)+РНК посредством киселина-уреа-агароза. Наблюдаван е само един пик на активност,който е за 18S РНК.Позицията на рибозомалните РНК маркери, които са подложени на електрофореза в съседна линия и визуализирани чрез оцветяване с етидиум бромид са отбелязани над профила на активността.

фиг. 3 показва образците на хибридизация на 96 колонии с индуцирани и неиндуцирани 32р-белязани сДНК сонди. В микротитърни панички са култивирани 96 индивидуални трансформанта, прехвърлят се върху нитроцелулозни мембрани и след това филтратите се хибридизират с Р³² сДНК сонди,получени или от индукционна тРНК (както по-горе) _? или тРНК, изолирани от неиндукционни PBL култури(неиндуцирани, подолу). филтрите се промиват за отстраняване на нехибридизирана РНК и след това се експонират върху чувствителен за ултравиолетовата светлина филм. Този комплекс от филтри е представителен за 86 такива комплекси (8300 независими колонии). Един пример за индуциран клон е отбелязан като Н12.

фиг.4 е карта на рестрикционните ендонуклеази на инсерционния клон 69 сДНК.сДНК инсъртът е свързан чрез PstI сайтове (точки на двата края) и олиго dC-dG опашки (единични линии). Броят и размерът на фрагментите_?получени чрез разграждане с рестрикционни ендонуклеази^се оценява с електрофореза върху 6 процентни акриламидни гелове. Позициите на сайтовете се потвърждавагчрез съгласуване на нуклеиновите киселини(представено на фиг.5). Кодиращият регион от най-голямата отворена четяща рамка е ограден¹, а защрихованата част представя предполагаемата сигнална пептидна последователност от 20

остатъка,докато покритата с точки област представя зрялата IIF последователност (146 амино киселини). 5'-края от тРНК е наляво, а 3' края е надясно.

Фиг. 5 илюстрира нуклеотидната последователност на инсерционния плазмид р69 сДНК. Предполагаемата амино киселинна последователност на най-дългата отворена четяща рамка също е представена. Предполагаемата сигнална последователност е представена от остатъците, отбелязани със S1 до S20.

Фиг. 6 е сравнение на IFN-y тРНК структурата с тази на левкоцитарните (IFN-α) и фибробластни (IFN-β) интерферони. Клонът 69 тРНК(отбелязан като имунен) съдържа значително по-голямо количество нетранслирани последователности.

фиг. 7 е схематична диаграма на структурата на IFN-y експресионният плазмид pIFN-γ trp 48. Изходният материал е 1250 двойки бази PstI сДНК от плазмид р69.

Фиг. 8 показва диаграма на плазмид, приложим за експресия на IFN-y в клетки на маймуна.

фиг.9 показва Southern хибридизация на разградена с EcoRI човешка геномна ДНК, хибридизирана с 32р-белязан Ddel фрагмент с 600 двойки бази от ДНК на инсерционния р69. Два EcoRI фрагмента ясно се хибридизират със сондата на всяка ДНК проба.

фиг. 10 показва Southern хибридизация на човешка геномна ДНК, разградена с шест различни рестрикционни ендонуклеази,хибридизирани с Р³²-белязана сонда от р69.

фиг. 11 схематично илюстрира рестрикционната карта на 3.1 kbp Hindlll инсерта от вектора рВ1, от който е изолиран промоторът РСК.Обозначена е инсерцията на един EcoRI сайт и един ХЬа1сайт в 5'фланкиращата ДНК от гена PGK.

фиг. 12 илюстрира 5'-фланкиращата последователност от PGK гена преди инсертирането на Xbal и EcoRI сайтове.

фиг. 13 схематично представя техниките,използвани за инсертиране на Xbal сайта при позиция - 8 в PGK промотора и за изолиране на 39 Ьр фрагмент от РвК^съдържащ този Xbal край и Sau3A край.

фиг. 14 схематично илюстрира конструирането на 300 Ьр фрагмент,съдържащ горният 39 Ьр фрагмент, допълнителна PGK 5'фланкираща последователност (265 Ьр) от Pvul към Sau3A (виж фиг. 11), и EcoRI сайт, съседен на Xbal.

фиг. 15 схематично илюстрира структурата на 1500 bp PGK промотора (Hindlll / EcoRI), който съдържа, допълнително към фрагмента,конструиран на фиг.14 , 1300 bp Hindlll към PGK 5’фланкиращата последователност (виж фиг. 11).

фиг. 16 представя състава на един експресионен вектор за човешки имуноинтерферон в дрожди, съдържащ модифициран PGK промотор, IFN-γ сДНК и терминаторната област от дрождевият PGK ген, както е описан по-подробно тук.

ПОДРОБНО ОПИСАНИЕ

А.Източник на IFN-γ mPNK

Лимфоцити човешка от периферна кръв (PBLs) са получени чрез левкофореза .PBLs се пречистват посредством Ficaoll-Hypaque градиентно центрофугиране и след това се култивират при концентрация 5 χ 10⁶ клетки/мл в RPMI1640, 1 процент L-глутамин, 25 mM HEPES и 1 процент пеницилин-стрептомицинов pa3TBop(Gibco, Grand Island, NY). Тези клетки са индуцирани да продуцират IFN-γ чрез митогенен стафилококов ентеротоксин В (1 mg/ml) и се култивират за 24 до 48 часа при 37° С. Добавя се дезацетилтимозин-а-1 (0,1 mg/ml) към PBL културите за повишаване получената IFN-h активност.

В. Изолиране на транспортна РНК

Общото количество РНК от PBL културите се екстрахира предимно както е докладвано от Berger, S.L. et. al. (33). Клетките се утаяват чрез центрофугиране и след това се ресуспендират в 10 mM NaCl, 10 тМ TrisНС1(рН 7,5) 1,5 тМ MgCl₂ и 10 тМ рибонуклеозид ванадилов комплекс. Клетките се лизират чрез добавяне на NP-40 (1 процент крайна концентрация), и ядрата се утаяват чрез центрофугиране. Супернатантата съдържа общото количество РНК, което по-нататък се пречиства чрез многократна фенолна и хлороформна екстракция. Водната фаза се довежда до 0,2М в NaCl, след което общото количество РНК се преципитира чрез добавяне на два обема етанол.РНК от неиндуцираните(нестимулирани) култури се изолира по същите методи. За пречистване на тРНК от общото количестно РНК преципитат се използва олиго-d Т целулозна хроматография(34). Обикновено се добиват 5-10 милиграма обща РНК и 50 - 200 микрограма поли(А) + РНК от 1-2 литра култивирани PBL.

С. фракциониране по размер на тРНК

За фракциониране на тРНК препаратите се използват два метода. Те са използвани независимо един от друг (по-добре отколкото едновременно) и всеки от тях води до значително обогатяване на IFN-y тРНК.

За фракциониране на тРНК се използва захарозното градиентно центрофугиране в присъствие на денатуриран формамид. От 5 до 25 процента захароза в 70 процента формамид се центрофугират (32) при 154,000 х g за 19 часа при 20° С. Последователните фракции (0,5 ml) след

това се отстраняват ,преципитират се с етанол и една аликвотна част се инжектира в ооцити на Xenopus laevis за транслиране на тРНК (35). След 24 часа на стайна температура инкубационната среда се изпитва за антивирусна активност в стандартна проба за ефект на цитопатично инхибиране с помощта на везикуларния стоматитен вирус (щам Indiana) или енцефаломиокардитния вирус по У/18Н(човешки амнион) клетки,както е описано от Stewart(36), с изключение на това, че пробите се инкубират с клетки за 24 часа (вместо 4) преди провокация с вируса. . Наблюдават се два постоянни пика на активност във фракционираната РНК (фиг.1). Един пик е седиментиран с изчислен размер 12S и съдържа 100-400 единици/мл антивирусна активност ( сравнено с IFN-α стандарт) за микрограм инжектирана РНК. Друг пик на активност, седиментиран като

16S по размер съдържа около половината от активността на по-бавно

седиментирания пик. Всеки от тези пикове на активност очевидно се дължи на IFN-y, докато когато същата фракция се изпитва върху клетъчна линия от телешки клетки (MDBK), не се наблюдава активност, тъй като те не се протектират от човешки IFN-γ. Както IFN-a активността, така и IFNβ активността биха били лесно откриваеми с MDBK (5).

Фракционирането на тРНК (200 mg) се осъществява и посредством електрофореза върху пикочно-киселинни агарозни гелове.Пластината от агарозен гел (37,30 се състои от 1,75 процента агароза, 0,025 М натриев цитрат, pH 3,8 и 6М пикочна киселина.Електрофорезата се осъществява 7 часа при 25 милиампера и 4° С. След това теловете се нарязват с бръснарско ножче. Отделните срезове се размекват при 70°С и се екстрахират двукратно с фенол и веднъж с хлороформ. След това фракциите се преципитират е етанол и последователно се изпитват за IFNγ тРНК чрез инжектиране в ооцити на Xenopus laevis и антивирусно действие. Наблюдаван е само един пик на активност в така фракционираните гелни проби(фиг.2). Този пик се дължи на мигриране заедно с 18S РНК и притежава активност от 600 единици / м1 за микрограм от инжектираната РНК. Тази активност е вероятно IFN-γ

специфична,доколкото не протектира MDBK клетки.

Несъответствието в размера между пиковете на активност наблюдавани върху захарозните градиенти (12S и 16S) и пикочно киселинните гелове(188), може да бъде обяснено е наблюдението, че тези независими методи на фракциониране са неосъществими при условия на пълна денатурация.

D. Изготвяне на библиотека от колонии, съдържащи IFN-γ последователности

За получаване на двойно-верижна ДНК по стандартна процедура се използват 3 pg гел-фракционирана тРНК (26,3^)· сДНК се фракционира върху 6 процента полиакриламиден гел. Две от фракциите се подлагат на електроелуиране, 800-1500 bp(138 ng) и >1500 bp(204 ng). 35 ng-ови порции от всяка сДНК се разширяват с дезоксиС остатъци с помощта на терминална дезоксинуклеотидил трансфераза(4(У) и се ренатурира с 300 ng от плазмида pBR3220f), който по аналогичен начин е удължен с дезоксиС остатъци при PstI сайта 00). Всяка ренатурирана смес след това се трансформира в Е. coli К12 щам 294. Получени са приблизително 8000 трансформанта с 800 - 1500 Ьр сДНК и 400 трансформанта с > от 1500 Ьр сДНК.

Е. Скриниране на библиотеката с колонии за индуцирани сДНКи

Колониите се инокулират индивидуално в кладенчета на микротитърни панички,съдържащи LB(58) +5 mg/ml тетрациклин и се оставят нд -20° С след добавяне на DMSO до 7 процента. Върху нитроцелулозни филтри се култивират две копия на колониите и ДНК от всяка колония се фиксира върху филтъра по метода на Grunstein-Hognes(45·

Р³²-белязани сонди сДНК се изготвят с помощта на 18S гел фракционирана тРНК от индуцирани и неиндуцирани PBL култури. Олиго dT12-18 е праймерът, който се използва, като условията на реакцията са описани по-рано (1). филтри, съдържащи 8000 трансформанти с размер на сДНК 600-1500 Ьр и трансформанти с размер >1500 Ьр се хибридизират с 20 х 10⁶ срш от индуцираната Р³²-сДНК. Втори комплекс от филтри се хибридизира с 20 х 10⁶230. срш от индуцираната Р³²-сДНК. Хибридизацията се провежда за 16 часа при условията,описани от Fritch et al. (43). филтрите се промиват енергично(43) и след това се експонират с ултравиолетово облъчване върху филм Kodak XR-5 с подсилен екран на Du-Pont LightningPlus за 16 до 48 часа. Приблизително 40 процента от колониите се хибридизират ясно с двете сонди, докато приблизително 50 процента от колониите не успяват да се хибридизират ( представено на фиг. 3). 124 колонии се хибридизират значително с индукционната сонда, но без да може да бъде регистрирано или по-слабо с неиндуктивната сонда. Тези

колонии се инокулират индивидуално в кладенчетата на микротитърните пластинки,култивират се и се хибридизират със същите две сонди, както е описано по-горе. Плазмидната ДНК, изолирана от всяка от тези колонии по метода ¢44) също се свързва към нитроцелулозните филтри и се хибридизира (45) с индукционна и неиндукционна сонди.ДНК от 22 колонии хибридизират само с индукционна сонда и се наричат индуцирани колонии.

F. Охарактеризиране на индуцираните колонии

От пет от индуцираните колонии(46) се изготвя плазмидна ДНК, която се използва за охарактеризиране на сДНК инсертите.

Рестрикционните карти на пет индуцирани плазмида(р67, р68 , р69, р71 и р72) предполагат, че четири имат сходни рестрикционни карти.Тези четири са р67, р69, р71 и р72, всеки от които има четири Ddel сайта, 2 Hinfl сайта и един Rsal сайт в сДНК. Петият плазмид (р68 ) съдържа общ Ddel фрагмент и очевидно е къс сДНК клон, свързан с останалите четири. Хомологията, предположена чрез рестрикционните карти е потвърдена и чрез хибридизация. Р³²- белязана ДНК сонда се изготвя (47) от 600 pb Ddel фрагмент на плазмида р67 и се използва за хибридизация 02) с другите индуцирани колонии. Всичките пет от картираните с рестрикционни ендонуклеази колонии се хибридизират кръстосано с тази сонда както 17 други колонии от индукционно / неиндукционния^η скрининг. Дължината на сДНК инсерта във всеки от тези кръстосано-хибридизирани плазмида се определя чрез PstI и тел електрофореза. Клонът с най-дълъг сДНК инсерт очевидно е клон 69 с дължина на инсерта 1200 - 1400 Ьр. Тази ДНК се използва за всички по-нататъшни експерименти и нейната рестрикционна карта е показана на фиг.4.

Чрез получаване на експресионни продукти в три независими експресионни системи, демонстриращи антивирусна активност е доказано, че сДНК инсерта в р69 е IFN-γ сДНК.

в-Секвенционен анализ на сДНК инсерта в р69

Пълната нуклеотидна последователност на р69 плазмидния инсерт е определена чрез дидезоксинуклеотидно верижния терминиращ метод (48) чрез субклониране на фрагментите във вектора М13 тр709) и химичната процедура на Maxam-Gilbert (52). Най-дългата отворена четяща рамка кодира протеин от 166 амино киселини,представени на фиг.5. Първият кодиран остатък е първият мет кодон, преброен в 5'-края на сДНК. Първите 20 остатъка при амино края вероятно служат като сигнална последователност за секретирането на останалите 146 амино киселини. Тази вероятно сигнална последователност притежава общите за останалите сигнални последователности характерни особености,като размер и хидрофобност.Нещо повече, четирите амино киселини,установени при вероятния сайт на разграждане (ser-leu-cys) са идентични с четири остатъка, установени при точките на разграждане на няколко левкоцитарни интерферона ( LelF В, С, D, F и Н (2)).

Кодираната зряла амино киселинна последователност от 146 амино

киселини (от тук нататък наричана рекомбинантен човешки имуноинтерферон) притежава молекулно тегло 17 140.

Налице са две потенциални точки на гликозилация(50) в кодираната протеинова последователност, при амино киселини 28 до 30 (asn-gly-thr) и амино киселини 100-102 ( asn-tyr-ser ). Съществуването на тези позиции се съгласува с наблюдаваното гликозилиране на човешки IFN-y(6,5f). В допълнение, само два цистеинови остатъка са достатъчно близко, за да образуват дисулфидни мостове, което се съгласува с наблюдаваната стабилност на IFN-y в присъствие на редуциращи агенти като вмеркаптоетанол(3 f).

Предположената зряла амино киселинна последователност е твърде базична, с общо 30 лизинови, аргининови и хистидинови остатъка и само общо 19 аспарагинови и глутаминови

киселинни остатъка.

тРНК структурата на IFN - у * както е предположена от ДНК последователността на плазмида р69^е отчетливо различима от IFN-a(l,2) или IFN-β (5) на тРНК. Както е представено на фиг.6, кодиращата област на IFN-y е по-къса_?докато 5' нетранслираните и 3' нетранслираните региони са малко по-дълги както от IFN-a, така и от I

IFN-β.

Н. Експресия на рекомбинантен човешки имунен интерферон в E.coli

Така както е отразено на фиг. 7, 50 μg от плазмида р69 се разграждат с помощта на PstI и инсерта от 1250 двойки бази се изолира посредством

гел електрофореза в 6 процентен полиакриламиден гел. Приблизително 10 pg от този инсерт се електроелуират от тела. След това, 5 pg от този PstI фрагмент се разгражда на части с 3 единици BstNI ( Bethesda Research Labs) за 15 минути при 37° С и реакционната смес се пречиства в 6 процентен полиакриламиден гел. Приблизително 0,5 pg от желания BstNI-PstI фрагмент, състоящ се от 1100 двойки бази се възстановяват. Двата обозначени на фиг.7 дезоксиолигонуклеотида, 5' dAATTCATGTGTTATTGTC и 5’ - dTGACAATAACACATG се синтезират по фосфотриестерния метод (53) и се фосфорилират както следва : 100 pmol от всеки дезоксиолигонуклеотид се комбинират в 30 pl от 60 mM Tris-HCL (pH 8), ЮтМ MgCl₂ , 15 тМ β-меркаптоетанол и 240 μ Ci ( γ- 32Р) АТф (Amersham, 5000 Ci / mmol). Добавят се 12 единици от Т4 полинуклеотид киназа и реакцията се оставя на 37° С за 30 минути. Добавя се 1 pl от 10 тМ АТф и реакцията се оставя да продължи още 20 мин. След ф-ОН/ СНС1 3 екстракция, олигомерите се комбинират с BstNI-PstI фрагмента,притежаващ 1100 двойки бази и се преципитират с етанол. Тези фрагменти се лигатират при 20°С за 2 часа в 30 pl 20mM Tris-HCl (pH 7,5),

ЮтМ MgCl₂, Ю тМ дитиотреитол, 0,5 мМ АТф и 10 единици Т4 ДНК лигаза. Сместа се разгражда за 1 час с 30 единици PstI и 30 единици EcoRl (за отстраняване на полимеризацията чрез лигатиране на кохезивния край) и се подлага на електрофореза в 6 процентен полиакриламиден гел. Продуктът от 1115 двойки бази ( 110,000 срт) се възстановява чрез електроелуация.

Плазмидът pLelF A trp 103 (фиг. 7) е производен на плазмида pLelF А 25 (Т),в който EcoRl сайта ,дистално на LelF А гена е отстранен (27). 3pg от pLelF A trp 103 се разгражда с 20 единици EcoRl и 20 единици PstI за 90 мин при 37° С и се подлага на електрофореза в 6 процентен полиакриламиден гел. Големият векторен фрагмент ( ~ 3900 двойки бази ) се възстановява чрез електроелуация. фрагментът с големина 1115 двойки бази, EcoRI-PstI IFN -λ ДНК, се включва в 0,15 pg от така изготвения вектор. Трансформирането на E.coli К-12 щам 294 ( АТСС N 31446 ) дава 120 устойчиви на тетрациклин колонии. Плазмидна ДНК се получава от 60 от тези трансформанти и се разгражда с EcoPI и Pstl. Три от тези плазмида съдържат разградения EcoRI - Pstl 1115 двойки бази фрагмент.ДНК секвенционният анализ потвърждава, че тези плазмиди притежават желаната нуклеотидна последователност и свързването между trp промотора,синтетичната ДНК и сДНК. Един от тези плазмиди pIFN-λ trp 48 е избран за допълнително изследване. Този плазмид се използва за трансформиране на Е. coli К-12 щам W3110 ( АТСС N 27325).

I. Генна структура на IFN -γ кодиращата последователност

Структурата на гена, кодиращ IFN-y,e анализирана чрез Southern хибридизация. В тази процедура (54), 5 микрограма от човешка лимфоцитна ДНК с високо молекулно тегло (получена както в 55) се разгражда с различни рестрикционни ендонуклеази, подлага се на електрофореза в 1,0 процентни агарозни гелове (56) и се изсушава на нитроцелулозни филтри (54). р³²-белязана ДНК сонда се получава (47) от 600 bp Ddel фрагмент на сДНК инсерт от р69 и се хибридизира (43) с нитроцелулозна ДНК. Количество, възлизащо на 10⁷ за минута от сондата^ се хибридизира за 16 часа и след това се промива както е описано в (43). Осем геномни ДНК проби от различни донори (хора) се разграждат с EcoRI рестрикционна ендонуклеаза и се хибридизират с р69 р³²-белязаната сонда. Както е представено на фиг. 9, наблюдават се два ясни хибридизационни сигнала с размер,възлизащ на 8,8 килобази двойки ( кЬр ) и 2,0 kbp както може да се установи при сравняване на подвижностите с Hindlll разградена ХДНК. Това може да бъде резултатът от разцепването на два IFN- γ гена или само на един ген при EcoRI сайта. Докато р69 не съдържа EcoRI сайт, една междинна структура с междинен EcoRI сайт , наречена интрон би била необходимата да обясни единичния ген. За да се различат тезе две възможности, се провежда друга Southern хибридизация

със същата сонда срещу пет други ендонуклеазни разграждания на единична човешка ДНК (фиг. 10 ). Наблюдават се два хибридизационни ДНК фрагмента с две други рестрикционни ендонуклеази - PvuII (6,7 kbp и 4,0 kbp ) и Hindi (2,5 kbp и 2,2 kbp). Обаче, три ендонуклеазно разграждащи образци осигуряват само един хибридизационен ДНК фрагмент : Hindlll (0,9 kbp), Bdlll (11,5 kbp) и BamHI (9,5 kbp). Два IFN -γ гена би трябвало да бъдат присъединени към едно необичайно място в рамките на същия хибридизационен фрагмент. Този резултат предполага, че само отделен хомоложен IFN-y ген (за разлика от много свързани IFN-a гени ) присъства в човешката геномна ДНК и че този ген е част от един

или повече интрони, съдържащи EcoRI, PvuII, и Hindi сайтове. Това предположение е потвърдено от хибридизиране на р³² -белязан (47) фрагмент,получен от 3' нетранслираната област на сДНК от р69 (130 Ьр Ddel фрагмент от 860 Ьр до 990 Ьр на фиг. 5 ) срещу EcoRI разградената човешка геномна ДНК. Само 2,0 kbp EcoRI фрагмента се хибридизира към тази сонда, което предполага че този фрагмент съдържа 3' нетранслирани последователности, докато 8,8 kbp EcoRI фрагмента съдържа 5' последователности. Генната структура на IFN-γ (един ген с поне един интрон ) е ясно отличима от IFN-a (мултиплени гени (2) без интрони (56) или IFN-β (един ген без интрони (57)).

J. Получаване на бактериални екстракти

Пренощувала култура на Е. coli W 3110 / pIFN -у trp 48 в бульон на

Luria + 5 микрограма за ml тетрациклин се използва за инокулиране на среда М9 (58), съдържаща 0,2 процента глюкоза, 0,5 процента казаминова киселина и 5 микрограма за ml тетрациклин при разреждане 1:100. Добавя се индол акрилова киселина до крайна концентрация 20 микрограма за ml, когато А550 е между 0,1 и 0,2 . Проби от по 10 ml се центрофугират при А550 = 1,0,утайката се събира и веднага се ресуспендира в 1 мл разтвор на фосфатен буфер, съдържащ 1 mg3a ml говежди серумен албумин ( PBSBSA).Клетките се отварят чрез звукова обработка (сонификация ) и се пречистват от клетъчните стени чрез центрофугиране. Супернатантите се оставят на 4°С до момента на изпитването. Интерфероновата активност в супернататнтите се определя като 250 единици / ml чрез сравняване с IFN-a стандарти посредством изпитване за ефекта на цитопатично инхибиране (CFE).

К. Трансформация на дрожди / щамове и среда

Дрождевите щамове се трансформират така,както е описано по-рано G9· За подбор на плазмиди,съдържащи функционален TRPI ген се използва щам Е. coli JA300 (thr leuB6 thi thyA trpC1117 hsdm- hsdR- (20). Дрождевият щам RH218,притежаващ генотипа ( a trp gal2 SUC2 mal CUPl) (18), се използва като гостоприемников организъм, който ще бъде трансформиран. RH218 е депозиран в АТСС N 44076. М9 (минимална хранителна среда ) с 0,25 процента казаминови киселини (САА) и ЬВ(богата среда ) се използват така, както са описани от Miller(58) с добавяне на 20 pg/ml ампицилин (Sigma) след автоклавиране и охлаждане. Дрождите се култивират върху следната среда: YEPD, съдържаща 1% дрождев екстракт, 2% пептон и 2% глюкоза ±3 % Difco агар. YNB + САА съдържат 6,7 грама дрождева нитроген база (без амино киселини )(YNB) (Difco), 10 mg аденин, 10 mg урацил, 5 грама САА, 20 грама глюкоза и ±30 грама агар за литър.

L. Конструиране на дрождев експресионен вектор

1. 10 pg YRp7 04,15,16) се разграждат c EcoRI. Получените в резултат лепливи ДНК краища се правят слепи с помощта на ДНК полимераза I ( Klenow фрагмент ). Векторът и инсертът се пропускат през 1 процентен агарозен (SeaKem) гел, срязан от гела, електроелуиран и екстрахиран двукратно с еднакви обеми хлороформ и фенол преди преципитирането с етанол. Получените в резултат ДНК молекули със слепи краища се лигатират заедно в краен обем от 50 μΐ за 12 часа при 12 °C. Тази смес след това се използва за трансформиране на Е. coli щам JA300 в ампицилиново резистентен и триптофан прототрофен организъм. Изолират се плазмидите, съдържащи TRPI гена от двете ориентации. pFRWl притежава TRPI ген в същата ориентация както

YRp7 докато pFRW2 притежава TRPI ген в обратна ориентация.

pg от pFRW2 се линеаризира с Hindlll и се подлага на

електрофореза в 1 агарозен гел. Линеарните молекули се елуират от гела, след което 200 ng се лигатират с 500 ng от 3,1 kb Hindlll инсерт от плазмида рВ1 03) ,който е рестрикционен фрагмент,съдържащ дрождевия

3-фосфоглицерат киназен ген. Лигационната смес се използва за трансформиране на E.coli щам 294 в ампицилиново резистентен и чувствителен на тетрациклин организъм. Плазмидът, изготвен от един такъв рекомбинант притежава интактен TRP1 ген с Hindlll фрагмент с размер 3,1 kbp от рВ1 инсерционна ДНК в Hindlll сайта от тетрациклиново резистентния ген. Плазмидът е pFRM31. 5 pg от pFRM31 се разгражда напълно с EcoRI, екстрахира се двукратно с фенол и хлороформ и след това се преципитира с етанол. Кохезивните краища на молекулата се запълват с участието на ДНК Полимераза I ( Klenow фрагмент ) в реакция, която се осъществява в 250 μΜ от всеки дезоксинуклеозид трифосфат.Реакцията се осъществява за 20 мин при 14°С, през което време ДНК се екстрахира двукратно с фенол-хлороформ, след което се преципитира с етанол. След това ресуспендираната ДНК напълно се разгражда с Clal и се подлага на електрофореза в 6 процентен акриламиден гел. Векторният фрагмент се елуира от гела, екстрахира се с фенолхлороформ и се преципитира с етанол.

Шестте N-крайни амино киселини от 3-фосфоглицерат киназния ензим,пречистени от хора,са както следва :

- 2 - 3-4-5-6

SER - LEU - SER - HSM - LYS - LEU Една от тронслационните четящи рамки, генерирани от ДНК последователността на 141 bp Sau3A - to - Sau3A рестрикционен фрагмент (съдържащ междинен HincII сайт; виж PGK рестрикционна карта на фиг. 11) ,продуцира следната амино киселинна последователност.

1-2-3-4-5-6

MET- SER - LEU - SER - SER - LYS - LEU След отстраняване на иницииращия метионин се вижда, че PGK N крайната амино киселинна последователност притежава 5 от 6 амино киселинната хомология с N-крайна амино киселинна последователност на човешка PGK.

Резултатът от съгласуването предполагаме началото на дрождевия PGK структурен ген е кодирано от ДНК в 141 bp Sau3A рестрикционния фрагмент от рВ1. По-ранни разработки (20) показват предполагането, че ДНК последователностите, специфизиращи PGK mRNK , по всяка вероятност се намират в тази област от Hindlll фрагмента.Понататъшното съгласуване на 141 вр Sau3A фрагмента дава повече ДНК последователност от PGK промотора (фиг. 12).

Посредством стандартни методики е синтезиран синтетичен олигонуклеотид с последователността 5' ATTTGTTGTAAA 3' ( Сгеа et al.,Nucleic Acids Res. 8,2331 (1980)). 100 ng от този праймер се бележат при

5' -края с помощта на 10 единици Т4 полинуклеотид киназа в 20 μΐ реакция,същържаща също 200 pCi от [ γ 32 -Р ] АТф. Този белязан праймерен разтвор се използва за реакция на възстановяване, създадена като първи етап в многостъпален процес за влагане на EcoRI рестрикционен сайт в PGK 5'- фланкираща ДНК, предшестваща PGK последователността на структурния ген.

100 pg от рВ1 (2ф се разгражда напълно с НаеШ^след което се прекарва през 6 процентен полиакриламиден гел. Най-горната ивица от оцветения с етидиум гел (съдържащ PGK ) се изолира посредством електроелуация,както е описано по-горе. Тази 1200 bp НаеШ част от ДНК се рестриктира с Hindi ₉ след което се пропуска през 6 процентен акриламиден гел. Ивицата от 650 Ьр е изолирана посредством електроелуация. Изолират се 5 pg от ДНК. Тази 650 bp HaeIII-to-HincII част от ДНК се ресуспендира в 20 pl Н2О, след което се смесва с 20 pl фосфорилиран разтвор на праймера описан по-горе. Тази смес се екстрахира 1 х с фенол-хлороформ, след което се преципитира с етанол.Сухата ДНК се ресуспендира в 50 pl Н2О и след това се нагрява във вряща водна баня за седем минути. Този разтвор след това бързо се охлажда в суха ледено-етанолна баня (10п - 20 секунди ), след което се прехвърля в ледена водна баня.Към този разтвор се добавят 50 pl 10 х ДНК полимераза I буфер ( Boeringer Mannheim ), 10 pl от предварително приготвен 2,5 мМ разтвор за всеки дезоксинуклеозид трифосфат (dATP, dTTP, dGTP и dCTP ), 25 pl H2O и 5 единици от ДНК полимераза I, Klenow фрагмент.Тази 100 pl реакция се инкубира при 37 °C за 4 часа. След това разтворът се екстрахира еднократно с фенол-хлороформ,преципитира се с етанол, изсушава се чрез лиофилизиране, след което се подлага на въздействието до пълно изтощаване на ензима с 10 единици Sau3A. Този разтвор след това се пропуска през 6 процентен акриламиден гел. Ивицата, съответстваща на 39 Ьр по размер се срязва от гела и се изолира чрез електроелуиране както е описано по-горе. Тази 39 Ьр ивица притежава един сляп край. Фрагментът се клонира в модифициран pFIF trp 69 вектор (5).. 10 gg от pFIF trp 69 се линеаризира е Xbal, екстрахира се еднократно с фенол-хлороформ,след което се преципитира с етанол. Лепливият Xbal край се запълва с участието на ДНК полимераза I Klenow фрагмент в 50 μΐ реакция, съдържаща 250 μΜ от всеки нуклеозид трифосфат.Тази ДНК се срязва с ВашН^след което се пропуска през 6 процентен полиакриламиден гел. Векторният фрагмент се изолира от гела чрез електроелуация?след което се ресуспендира в 20 μΐ Н2О. 20 ng от този вектор се лигатират с 20 ng от 39 Ьр фрагмента,изготвен както по-горе за 4 часа при стайна температура. Една четвърт от сместа се използва за трансформиране на E.coli щам 294 в ампицилиново резистентен ( върху LB + 20 μβ / ml amp ). Плазмидите от трансформантите се изследват чрез процедура на бърз скрининг 0£). Един плазмид, pPGK-39 е подбран за секвенционен анализ. 20 μg от този плазмид се разграждат с Xbal, преципитират се с етанол и след това се третират с 1000 единици бактериална алкална фосфатаза при 68°С за 45мин. ДНК се екстрахира трикратно с фенол-хлороформ и се

преципитира с етанол.

Дефосфорилираните краища след това се бележат в 20 μ£ реакция,съдържаща 200 μ€ΐ от { γ32 - Р ] АТф и 10 единици от Т4 полинуклеотид киназа.Плазмидът се срязва със Sall и се пропуска през 6 процентен акриламиден гел.

Белязаната инсерционна ивица се изолира от гела и се съгласува по метода на химична деградация (52)· ДНК последователността при 3' - края на тази промоторна част е както се очаква.

2. Конструиране на 312 pb Pvul - to - EcoRI PGK промоторен фрагмент μg pPGK-39 ( фиг. 13 ) се разгражда едновременно със Sall и Xbal ( по 5 единици всеки ), след което се подлага на електрофореза в 6 процентен гел.Ивицата,състояща се от 390 pb и съдържаща 39 Ьр промоторна част, се изолира чрез електроелуация.Ресуспендираната ДНК се подлага на рестрикция със Sau 3 А, след което се подлагат на електрофореза в 8 процентен акриламиден гел. 39 pb PGK промоторната ивица се изолира посредством електроелуиране. Тази ДНК съдържа 39 Ьр от 3' -края на PGK промотора върху Sau3A - to- Xbal фрагмент.

gg рВ1 се подлага на рестрикция с Pvul и Крп1,след което се подлага на електрофореза в 6 процентен акриламиден гел.Ивицата с 0,8 kbp от ДНК се изолира чрез електроелуиране, след което се рестриктира със Sau3A и се подлага на електрофореза в 6 процентен акриламиден гел. Ивицата с 265 pb от PGK промотора (фиг. 11 ) се изолира чрез

електроелуиране.

Тази ДНК след това се свързва (лигатира) с 39 рв промоторния фрагмент от горната структура за два часа при стайна температура. Лигаторната смес се рестриктира с Xbal и Pvul, след което се подлага на електрофореза в 6 процентен акриламиден гел. Xba - to - Pvul рестрикционният фрагмент с размер 312 Ьр се изолира чрез електроелуация,след това се добавя към лигационната смес, съдържаща 200 ng pBR322 (41) ( изолирана по-рано,пропускайки 162 pb Pvul - to - PstI рестрикционния фрагмент ) и 200 ng от Xbal - to - PstI LelF А сДНК гена, изолиран по-рано от 20 gg pLelF trp A 25 .Тази трикомпонентна лигаторна смес се използва за трансформиране на Е. coli щам 294 в тетрациклиново резистентен. Трансформирането клонове се минискринират (44) и една от колониите, pPGK - 300 се изолира като притежаваща 304 bp PGK 5'фланкираща ДНК, слята с LelF А гена в pBR322 основния вектор. 5' - края на LelF А гена притежава следната последователност : 5 ' - CTAGAATTC - 3' . Така фузията на XbdI сайта от PGK промоторния фрагмент в тази последователност позволява добавянето към Xbal сайта на един EcoRI сайт. Така pPGK -300 съдържа част от PGK промотора,изолиран в Pvul to - EcoRI фрагмента.

3. Конструиране на 1500 pb EcoRI - to - EcoRI PGK промоторен фрагмент.

pg рВ1 се разгражда с Pvul и EcoRI се пропуска през 6 процентен акриламиден гел. 1,3 kb Pvul - to- EcoRI ивицата ДНК

от PGK 5' -фланкиращата ДНК се изолира посредством електроелуация. 10 pg pPGK - 300 се разгражда с EcoRI и Pvul и 312 pb промоторният фрагмент се изолира чрез електроелуация след електрофореза на разградената смес в 6 процентен акриламиден гел. 5 pg от pFRL4 се срязва с EcoRI, преципитира се с етанол и се третира с бактериална алкална фосфатаза при 68 °C за 45 минути.След три екстракции на ДНК с фенол/хлороформ,преципитиране с етанол и ресуспендиране в 20 ml Н2О, 200 ng от вектора се лигатира със 100 ng от 312 pb EcoRI - to - Pvul ДНК от pPGK -300 и 100 ng EcoRI - to - Pvul ДНК от pBl. Лигационната смес се използва за трансформация на Е. coli щам 294 в ампицилиново резистентен. Един от получените трансформанти е pPGK -1500. Този плазмид съдържа 1500 bp PGK промоторен фрагмент като EcoRI - to EcoRI или Hindlli - to - EcoRI част от ДНК.

gg от pPGK - 1500 се разгражда напълно с Clal и EcoRI,след което разградената смес се подлага на електрофореза върху 6 процентен акриламиден гел. Фрагментът с размер от 900 pb, съдържащ PGK промотора, се изолира чрез електроелуация. 10 gg от pIFN - γ trp 48 се разгражда напълно с EcoRI и Hindi и се подлага на електрофореза върху 6 процентен акриламиден гел.Ивицата от 900 pb, съдържаща директно експресируемата IFN - γ сДНК^се изолира от гела чрез електроелуиране.

Дрождевият експресионен вектор се конструира в три факторна реакция чрез лигатиране заедно на PGK промоторния фрагмент ( в Clal to - EcoRI част ), делетирания. pFRM - 31 и изолираната по-горе IFN -γ ДНК.Реакционната смес се инкубира на 14 ° С за 12 часа, след което се използва за трансформиране на E.coli щам 294 в ампицилин резистентен. Трансформантите се анализират за присъствие на действително конструиран експресионен плазмид, pPGK - IFN - γ ( фиг. 16 ).

Плазмидите, които съдържат експресионни системи, са използвани за трансформиране на сферопласти на дрождевия щам RH218 до триптофаново прототрофен в безтриптофанов агар. Тези рекомбинантни дрожди след това се изпитват за наличност на рекомбинантен човешки имунен интерферон.

Дрождевите екстракти се изготвят както следва: Десет милилитрови култури се отглеждат в YNB + САА до достигане на А 660 ~ 1 - 2 , събират се чрез центрофугиране, след което се ресуспендират в 500 μΐ PBS буфер ( 20 mM NaH2PO4 , pH = 7,4 , 150 mM NaCl). Добавя

се еднакъв обем стъклени топчета ( 0,45 - 0,5 mm ) и сместа след това се завихря за 2'. Екстрактът се върти 30 секунди при 14000 rpm и супернатантата се отстранява : интерфероновата активност в супернатантата се определя като 16 000 единици / ml чрез сравняване с IFN -а стандарт с помощта на СРЕ инхибиторното изпитване.

М. Конструиране на клетъчно - културалния вектор pSVy69

Фрагментът с 342 двойки бази Hindlll-PvuII, обхващащ SV40 източникаj се превръща в EcoRI рестрикционно свързан фрагмент. Hindlll сайтът се превръща чрез добавяне на синтетичен олигомер ( 5’ dAGCTGAATTCC ) и PvuII сайта се превръща чрез сляпо свързване в

EcoRI сайт, запълнен с използване на полимераза I ( Klenow фрагмент).

Полученият в резултат EcoRI фрагмент се инсертира в EcoRI сайта на pML - 1(2$). Плазмид със SV40 късен промотор,ориентиран далече от amp R гена по-нататък се модифицира чрез отстраняване на EcoRI сайта в близост от amp R гена на pML-Ι (28).

Изолира се фрагментът Hpal - Bglll с 1023 двойки бази от клонираната ДНК (Ъб) и Hpal сайта от хепатит В вируса (HBV) се превръща в EcoRI сайт със синтетичен олигомер ( 5' dGCGAATTCGC ). Този EcoRI - Bglll свързан фрагмент се клонира директно в EcoRI-BamHI сайтовете на плазмида,описан по-горе и носещ източника SV40.

В оставащия EcoRI сайт се исертира IFN - γ ген в 1250 двойки бази PstI фрагмент на р69 след конверсията на PstI краищата в EcoRI краища. Изолират се клоновете, в които SV40 късният промотор предшества структурния ген на IFN - γ. Получените в резултат плазмиди след това се въвеждат в клетки на тъканни култури (29) с помощта на DEAEдекстрановата техника (61) модифицирана така,че трансфекцията в присъствие на ДЕАЕ -декстран протича за 8 часа. Клетъчната среда се променя на всеки 2-3 дни. Ежедневно се отделят по 200 микролитра за интерфероново биоизследване. Типичният добив от 50 - 100 единици/ml за проба се установява три или четири дни след трансфекцията.

В продукта на трансфекция липсва CYS - TYR - CYS N-крайна част на рекомбинантния човешки имунен интерферон (сравни фиг.5), което подкрепя появата на разграждане на сигнален пептид при CYS - GLY свързването (амино киселини 3 и 4 на фиг. 5 ), така че зрелият полипептид фактически се състои от 143 амино киселини.

Ν. Частично пречистване на des-CYS - TYR - CYS рекомбинантен човешки имунен интерферон

За получаване на по-голямо количество от des - CYS - TYR - CYS рекомбинантен човешки имунен интерферон,пресен монослой от COS-7 клетки в десет 10 см пластинки се трансфектират с общо 30 pg pDLIF3 в 110 mis DEAE-Dextran (200 pg/ml DEAE Dextran 500 000 MW, 0,05M Tris pH 7,5, в DMEM ).След 16 часа при 37 °C. пластинките се промиват двукратно с DMEM. Към всяка пластинка се добавят 15 mis пресен DMEM ,заместен с 10 процента f.b.s.,2 mM глутамин, 50 μ /μΐ пеницилин G и 50 Mg / μΐ стрептомицин .Средата се замества на следващия ден със

свободна от серум DMEM . Свободната от серума среда след това се добавя всеки ден. Събраната среда се съхранява на 4 ° докато се изследва или се свърже с CPG. фракциите от 3-тия и 4-ти ден на посттрансфекционните проби, както е установено, съдържат по същество цялата активност.

Към 100 μΐ клетъчна супернатанта се добавят 0,5 g CPG и сместа се бърка 3 часа при 4°С. След кратко центрофугиране в центрофуга, утаените топчета се поставят в колона и внимателно се промиват с 20 μΜ NaPO4 IM NaCL 0,1 процента β -меркаптоетанол при pH 7,2. След това активността се елуира с добавяне на същия буфер, съдържащ 30 процента

етилен гликол,последвано от по-нататъшна елуация с горния буфер,съдържащ 50 процента етилен гликол. Цялата активност се свързва с СРС.Установено е, че 75 процента от цялата активност се намира във фракциите, елуирани с 30 процента етиленгликол. Тези фракции се отливат и разреждат с 20 mM NaPO4 1 М NaCl pH 7,2 до крайна концентрация 10 процента етилен гликол и директно се прилага към 10 ml Con A Sepharosa (Pharmacia ) колона. След старателно промиване с 20 mM NaPO4 IM NaCl pH 7,2, активността се елуира с 20 mM NaPO4 IM NaCl 0,2М а - метил - D

- манозид. Съществено количество от активността ( 55 процента ) не се свързва към този лектин. 45 процента от активността се елуира с а-метилD- маноза.

ФАРМАЦЕВТИЧНИ СЪСТАВИ

Съединенията от настоящото изобретение могат да бъдат включени с помощта на познати методи във фармацевтични състави, където човешкият имуноинтерферонен продукт се комбинира съвместно с фармацевтично подходящи носители. Подходящи носители и техните форми са описани в Remington's Pharmaceutical Sciences от E.W. Martin, като този източник е включен в приложената литературна справка. Такива състави биха съдържали ефективно количество интерферонов протеин заедно с подходящо количество от средствата, необходими за приготвяне на фармацевтични състави, подходящи за ефективно въвеждане в гостоприемника.

А. Парентално въвеждане

Човешкият имунен интерферон може да бъде въвеждан парентерално у субекти, нуждаещи се от антитуморно или антивирусно лечение и у такива с признаци на имуносупресия. Дозите и начина на прилагането им могат да бъдат такива,каквито се използват напоследък

при клинични изследвания на други човешки интерферони, като напр. около (1-10) χ 10⁶ единици дневно, и в случаите на материали с чистота повисока от 1 процент, до напр. 50 χ 10⁶ единици на ден. Дозите на IFN -у могат да са значително повишени за по-голям ефект вследствие на по същество липсата на човешки протеини, като пример за подходяща доза за по същество хомогенен IFN - у в парентална форма на приложение, 3 mg IFN - у със специфична активност от, например, 2 χ 10⁶ U/ mg може да бъдат разтворени в 25 ml 5N серумен албумин ( human) - USP, разтворът да се прекара през бактериологичен филтър и филтратът да се разпредели в 100 епруветки, всяка от които съдържаща 6 χ 10⁶ единици чист интерферон, подходящ за парентерално въвеждане. Епруветките се съхраняват за предпочитане на студено ( - 20 °C ) преди използване.

ДАННИ ОТ БИОЛОГИЧНИ ИЗПИТВАНИЯ

А. Охарактеризиране на антивирусната активност

За неутрализиране на антителата, пробите се разреждат, ако е необходимо, до концентрация от 500 - 1000 единици / ml с PBS-BSA. Еднакви обеми от пробите се инкубират за 2-12 часа при 4 градуса със серийни разреждания на плъши античовешки левкоцити, фибробласти, или антисерум на имуноинтерферон. Анти -IFN -а и β са получени от Националният Институт за Алергия и Инфекциозни Заболявания.Анти IFN-γ се получава с помощта на автентичен IFN - γ ( 5-20 процента чистота), пречистен от стимулирани лимфоцити от периферна кръв. Пробите се центрофугират 3 минути при 12 000 х g 3 минути преди изпитването.За изпитване стабилността при pH 2, пробите се довеждат до рН2 чрез добавяне на IN НС1, инкубират се за 2 - 12 часа при 4 ° и се неутрализират чрез добавяне на IN NaOH преди изпитването. За изследване чувствителността на додецилсулфат ( SDS ) пробите се инкубират с еднакъв обем от 0,2 процента SDS за 2-12 часа преди изпитването.

В. Охарактеризиране на IFN - γ, продуциран от Е. coli и COS - 7 клетки

		Антивирусна	активност ( единици / ml )
				Е. coli W3110/	COS -7
клетъчен
				pIFN-γ trp48	pSVy69
Третиране	IFN-a	IFN-β	IFN-γ	екстракт	супернатанта
нетре-	375	125	250	250	62,5
тирани
pH 2	375	125	<6	<12	<4
0,1	375	-	<4	<8	-
процент
SDS
плъхове	<8	125	250	250	187
анти
IFN-a
плъхове	375	<8	187	250	125
анти
IFN-β
плъхове	375	125	<4	<8	<4
анти
IFN-γ

Тази таблица показва характерното поведение на IFN -α, β и у стандарти след различни третирания. Интерфероновата активност,получена от Е. coli W 3110 / pIFN - γ trp 48 и чрез COS-7 /pSVy69, е киселинно чувствителна, SDS - чувствителна и се неутрализира чрез имуноинтерферонов антисерум. Тя не се неутрализира от антителата на IFN- а или β. Тези данни потвърждават, че продуктите, получени в тези системи са имуноинтерферони и че сДНК инсерта на плазмид р69 кодира

Имуноинтерфероновият протеин съгласно изобретението е определен посредством детерминиран ДНК ген и дедуктивно амино киселинно съгласуване - фиг. 5. Става ясно, че за този специален интерферон, обхванат тук, съществуват природни алелни варианти и се появяват от индивид в индивид. Тези варианти могат да бъдат демонстрирани чрез амино киселинните различия във всички последователности или чрез делеции, замествания, инсерции, инверсии или добавяния на една или повече амино киселини в дадена последователност.Всички такива алелни варианти са включени в обхвата на това изобретение.

Независимо, че литературната справка е направена с оглед специално предпочитаните изпълнения, следва да се разбира,че настоящото изобретение е създадено без да се ограничава до тях, а до законния обхват на приложените претенции.

Claims (13)

1. ПАТЕНТНИ ПРЕТЕНЦИИ

   1. Трансформиран микроорганизъм или клетъчна култура, трансформирана с репликиращо експресионно средство, способно да експресира в дадения микроорганизъм или дадената клетъчна култура полипептид, обхващащ амино киселинната последователност на des-CYSTYR-CYS рекомбинантен човешки имунен интереферон.
2. 2. Клетъчна култура съгласно претенция 1, представляваща трансформирана COS - линия от фибробласти на маймунски бъбрек.
3. 3. Трансформиран микроорганизъм или клетъчна култура,трансформирана с репликиращо експресионно средство, способно да експресира в дадения микроорганизъм или клетъчна линия полипептид, включващ амино киселинната последователност на човешки имунен интерферон.
4. 4. Микроорганизъм съгласно претенция 3 или 1, представляващ трансформиран щам на Е. coli.
5. 5. Микроорганизъм съгласно претенция 3 или 1, представляващ трансформиран щам дрожди.
6. 6. Трансфромиран микроорганизъм или клетъчна култура съгласно претенции 3 или 1, където посоченият полипептид притежава сигнален пептид,съседен на N- крайната част от посочения интерферон.
7. 7. Трансформиран микроорганизъм или клетъчна култура съгласно претенции 3 или 1, където полипептидът е свободен от сигнален пептид.
8. 8. Реплициращо експресионно средство,способно в трансформирания микроорганизъм или клетъчна култура да експресира полипептид, обхващащ амино киселинната последователност на des-CYS-TYR-CYS рекомбинантен човешки имунен интерферон.
9. 9. Реплициращо експресионно средство,способно да експресира в трансформирания микроорганизъм или клетъчна култура полипептид,включващ амино киселинната последователност на рекомбинантен човешки имунен интерферон.
10. 10. Експресионно средство съгласно претенция 8 или 9, където даденият полипептид притежава сигнален пептид,съседен на N- трайната част от посочения' интерферон.
11. 11. Експресионно средство съгласно претенции 8 или 9, където посоченият полипептид е свободен от сигнален пептид.
12. 12. Култура от клетки,трансформирани с рекомбинантен експресионен вектор,способен да експресира полипептид, със следната амино киселинна последователност:

    GLN ASP PRO TYR VAL LYS GLU ALA GLU ASN LEU LYS LYS

    TYR PHE ASN ALA GLY HIS SER ASP VAL ALA ASP ASN GLY

    THR LEU PHE LEU GLIILE LEU LYS ASN TRP LYS GLU GLU

    40 50

    SER ASP ARG LYS ILE MET GLN SER GLN ILE VAL SER PHE

    TYR PHE LYS LEU PHE LYS ASN PHE LYS ASP ASP GLN SER

    ILE GLN LYS SER VAL GLU THR ILE LYS GLU ASP MET ASN

    80 90

    VAL LYS PHE PHE ASN SER ASN LYS LYS LYS ARG ASP ASP

    100

    PHE GLU LYS LEU THR ASM TYR SER VAL THR ASP LEU ASN

    110

    VAL GLN ARG LYS ALA ILE HIS GLU LEU ILE GLN VAL MET

    120 130

    ALA GLU LEU SER PRO ALA ALA LYS THR GLY LYS ARG LYS

    140

    ARG SER GLN MET LEU PHE ARG GLU ARG ARG ALA SER

    143

    GLN.

    ©
13. 13.Култура от трансформирани клетки,способни да експресират полипептид, който обхваща амино киселинната последователност :

    1 10

    CYS TYR CYS GLN ASP PRO TYR VAL LYS GLU ALA GLU ASN 20

    LEU LYS LYS TYR PHE ASN ALA GLY HIS SER ASP VAL ALA _ ASP ASN GLY THR LEU PHE LEU GLY ILE LEU LYS ASN TRP

    40 50

    LYS GLU GLU SER ASP ARG LYS ILE MET GLN SER GLN ILE

    VAL SER PHE TYR PHE LYS LEU PHE LYS ASN PHE LYS ASP

    ASP GLN SER ILE GLN LYS SER VAL GLU THR ILE LYS GLU

    100

    ARG ASP ASP PHE GLU LYS LEU THR ASN TYR SER VAL THR

    110

    ASP LEU ASN VAL GLN ARG LYS ALA ILE HIS GLU LEU ILE

    130

    GLN VAL MET ALA GLU LEU SER PRO ALA ALA LYS THR GLY

    140

    LYS ARG LYS ARG SER GLN MET LEU PHE ARG GLY ARG ARG

    146

    ALA SER GLN.