BG60889B2 - човешки имунен интерферон - Google Patents

Abstract

Изобретението се отнася до получаването на нов, рекомбинантен човешки интерферон и dеs-сys-тyr-сys рекомбинантен човешки интерферон чрез рекомбинантна днк техника с помощта на който и да е от познатите експресионни вектори и култури гостоприемници. Човешкият имунен (гама)интерферон (ifn) е изолирани характеризиран чрез днк и аминокиселинни последователности, физични отнасяния и биологична активност.

Description

ОБЛАСТ НА ИЗОБРЕТЕНИЕТО

Това изобретение се отнася до областта на рекомбинантната ДНК технология, до средствата и методите, които използва тази технология при откриването на ДНК последователността и при прогнозирането на аминокиселинната последователност за човешкия имунен интерферон и неговото продуциране, както и до различните продукти на това продуциране и тяхната употреба.

По- специално, изобретението се отнася до изолирането и идентифицирането на ДНК последователности, кодиращи човешки имунен интерферон и до конструирането на рекомбинантни експресионни средства, съдържащи такива ДНК последователности, оперативно свързани с въздействащи на експресията промоторни последователности и с така конструираните експресионни средства. В друг аспект, настоящето изобретение се отнася до гостоприемникови културални системи, като напр. различни микроорганизми и клетъчни култури на гръбначни, трансформирани с такива експресионни средства и по този начин насочени към експресията на ДНК последователностите посочени по- горе. В други отношения, изобретението се отнася до средствата и методите за превръщане на крайните продукти на подобна експресия до нови по своята същност, като фармацевтични състави, приложими за профилактика или лечение на хора. В предпочитаните изпълнения, това изобретение обезпечава специални

експресионни средства, които са съгласувани с оглед продуциране и секретиране на човешки имунен интерферон в неговата зряла форма от гостоприемниковите клетки. В допълнение, настоящето изобретение се отнася до различни процеси, приложими за получаване на посочените ДНК последователности, експресионни средства, гостоприемникови културални системи и крайни продукти ,както и до специфични и асоциирани варианти на изпълнение.

Настоящето изобретение възниква частично от откриването на ДНК последователността и прогнозираната амино киселинна последователност, кодираща човешки имунен интерферон. В допълнение, настоящето изобретение обезпечава информация за 3'- и 5'- фланкиращите последователности за човешкия имунен интерферонен ген, улеснявайки тяхното in vitro свързване в експресионните средства. По- специално, осигурява се 5'- ДНК сегмент, кодиращ вероятния ендогенен сигнален полипептид, непосредствено предхожда амино киселинната последователност на вероятния човешки имунен интерферон. Тези открития, на свой ред, дават възможност за развиване на средствата и методите за получаване чрез ДНК технология на задоволително количество човешки имунен интерферон, така че , на свой ред да стане възможно определянето на неговите биохимични свойства и биологична активност.Публикациите и другите материали, използвани тук за осветляване нивото на изобретението, и в специални случаи за осигуряване на допълнителни подробности, имащи отношение към практиката , са включени в литературната справка и за удобство са номерирани в следващия по- долу текст и групирани в приложената библиография.

НИВО НА ИЗОБРЕТЕНИЕТО

А. Човешки имунен интерферон

Човешките интерферони могат да бъдат класифицирани в три групи на базата на различията в антигенността и биологичните и биохимични свойства.

Първата група обхваща семейство левкоцитни интерферони ( аинтерферон, LelF или IFN-а), които обикновено се продуцират главно от конституентни кръвни клетки при вирусна индукция. Те са били продуцирани микробиологично и е установено, че притежават биологична активност (1,2,3). Техните биологични свойства са причина за приложението им в клиниката като терапевтични агенти за лечението на вирусни инфекции и злокачествени състояния (4).

Към втората група се причислява човешкият фибробластен интерферон ( β- интерферон, FIF или IFN-β), обикновено продуциран от фибробласти при вирусна индукция, които също са продуцирани по микробиологичен път и за които е установен широк обхват от биологични активности (5). Клиничните изпитвания също показват тяхната потенциална терапевтична стойност. Левкоцитните и фибробластни интерферони проявяват много ясно сходство в техните биологични свойства поради факта,че степента на хомоложност на амино киселинно ниво е относително ниска. В допълнение, двете групи интерферони съдържат от 165 до 166 амино киселини и са киселинно стабилни протеини.

Човешкият имунен интерферон (γ- интерферон, IIF или IFN-y), към които е насочено настоящето изобретение, е ,обратно на а- и βинтерфероните, pH 2 лабилен, и се продуцира главно при митогенна индукция на лимфоцити и е също така ясно антигенно отличим. До скоро човешкият имунен интерферон можеше да бъде открит само в много ниски нива, което очевидно възпрепятства неговото охарактеризиране. Напоследък е докладвано за твърде екстензивно, но все още частично пречистване на човешкия имунен интерферон (6). Съединението е продуцирано от лимфоцитни култури, стимулирани с комбинация от фитохемаглутинин и форболов естер и пречистено чрез секвенционно хроматографско разделяне. Тази процедура води до получаване на продукт с молекулно тегло от 58, 000.

Чрез транслиране на шРНК в ооцити е продуциран в много малки количества човешки имунен интерферон, показващ характеристика на интерферонова активност, аналогична на човешкият имунен интерферон, което дава надеждата, че имуноинтерферонова сДНК може да бъде синтезирана и клонирана (7).

Количеството имунен интерферон, получено досега,е наистина недостатъчно за провеждане на независими експерименти за охарактеризиране и за определяне на биологичните свойства на пречистения компонент. Обаче, in vitro изследванията, осъществени със суров препарат, така както и in vivo експериментите с муринови у- интерферонови препарати предполагат, че първичната функция на имуно интерферона може да бъде както на един имунорегулаторен агент (8, 9). Имуноинтерферонът притежава не само антивирусна и антиклетъчна активност както всички останали човешки интерферони, но показва също и потенциращ ефект за тези активности с а- и β- интерферон (10). Освен това, in vitro антипролиферативният ефект на γ- интерферона върху туморни клетки е приблизително 10- до 100- пъти по- висок от този, докладван за другите интерферонови класове (8, 11, 12 ). Този резултат, заедно с неговата ясно изразена имунорегулаторна роля (8, 9), предполага малко по- високи антитуморни възможности за IFN- γ отколкото за IFN- а и IFN- β. В действителност, in vivo експериментите с мишка и муринови IFN-y препарати

показват ясно превъзходство над антивирусно индуцираните интерферони в техния антитуворен ефект срещу остеогенна саркома (13).

Всички тези изследвания, до настоящето изобретение, са били осъществявани с твърде сурови препарати. Независимо от това, те в действителност предполагат много важни биологични функции за имунния интерферон. Имунният интерферон притежава не само потенциална асоциирана антивирусна активност, но вероятно и силна имунорегулаторна и антитуморна активност, ясно насочваща към потенциално многообещаващи клинични приложения.

Твърди се, че прилагането на рекомбинантната ДНК технология е найефективният начин за осигуряване на необходимото по-голямо количество човешки имунен интерферон. Дали така продуцираните материали включват или не гликозилации, за които се счита,че са характерни за природния , получен от човека материал, те по всяка вероятност проявяват биологична активност, предполагаща тяхното клинично приложение за лечение на широк кръг вирусни, неопластични и имуносупреорни състояния или заболявания.

В. Рекомбинантна ДНК технология

Рекомбинантната ДНК технология достигна своята зряла възраст. Молекулярните биолози са в състояние да рекомбинират различни ДНК последователности с лекота, създавайки нови ДНК средства, способни да продуцират копия от различни ендогенни продукти в трансформирани микроорганизми. Основните средства и методи, които се използват, са in vitro свързванията на различни слепи или лепливи крайни фрагменти на ДНК, продуциращи потенциално експресиращи средства, които се използват в частично трансформираните организми, насочвайки ги по този начин към синтезирането на желан екзогенен продукт. Но за отделния продукт обмяната остава изменчива и науката не е в състояние да предскаже получаването на постоянен резултат. Този, който предсказва успешни резултати,без да посочи експериментални данни, прави това с относителен риск.

Плазмидът, нехромозомна бримка от двойноверижна ДНК, изолиран от бактерии и други микроорганизми, който е способен на многократно самовъзпроизвеждане, остава основен елемент на рекомбинантната ДНК технология. Включеното в информацията, кодирана в плазмидката ДНК,е онова, което е необходимо за репродуциране на плазмида в дъщерни клетки (т.е. източник на репликацията ) и обикновено една или повече фенотипично подбрани характеристики,като в случаите на бактерии, устойчивост на антибиотици, позволява клонове от гостоприемниковата клетка, съдържаща желания плазмид, да бъдат разпознати и преференциално култивирани на подбрана среда. Приложимостта на плазмидите лежи във възможността да бъдат специфично разградени с един или друг ендонуклеазен ензим или рестрикционен ензим, всеки от които разпознава различно място в плазмидната ДНК. Поради това става възможно инсертирането на хетероложни гени или генни фрагменти в плазмида посредством

присъединяване в мястото на разграждане или при реконструираните краища, съседни на мястото на разграждане. Така се формират така нар. репликативно експресионни средства. ДНК рекомбинацията се осъществява извън клетката, но полученото в резултат рекомбинантно репликативно експресионно средство или плазмид, може да бъде въведено в клетката по известен на специалистите начин, наречен трансформация и по този начин да бъдат получени големи количества от рекомбинантното средство чрез култивиране на трансформантите. Нещо повече, когато генът е инсертиран съобразно частта на плазмида, регулираща транскрибцията и транслацията,а кодираното ДНК съобщение, полученото в резултат експресионно средство може да бъде използвано за актуализиране получаването на полипептидната последователност, която инсертираният ген кодира, а целият процес се нарича експресия.

Експресията се инциира в област, наречена промоторна, която се разпознава и свързва с РНК полимераза. В транскрибционната фаза на експресията, ДНК се деспирализира, превръщайки се в матрица за иницииран синтез на транспортна (ш) РНК от ДНК последователността. Транспортната РНК на свой ред се транслира в полипептид, притежаващ амино киселинна последователност, кодирана от нуклеотидния триплет или код, която като цяло дава структурния ' ген , т.е. тази част, която кодира амино киселинната последователност на експресирания полипептиден продукт. Транслацията се инициира при старт сигнал (обикновено ATG, който в получената транспортна РНК преминава в AUG). Така наречените стоп кодони определят края на транслацията и следователно, продукцията на следващите амино киселинни единици. Крайният продукт може да бъде получен чрез лизиране, ако е необходимо, на гостоприемниковата кетка от микробната система и възстановяване на продукта чрез подходящо пречистване от други

протеини.

На практика, с използването на рекомбинантната ДНК технология може да се експресират изцяло хетероложни пептиди - така наречената директна експресия - или обратно, може да се експресират хетероложни полипептиди, които са слети с част от амино киселинната последователност на хомоложен полипептид. В последните случаи, очакваният биоактивен продукт може да премине в биологично неактивна форма вътре в слетия хомоложно / хетероложен полипептид до разграждането му в извън клетъчна среда. Виж Англ. патентна публ. No 2007676А и Wetzel, American Scientist 68, 664(1980).

С. Технология на клетъчното култивиране

Техниката на клетъчното или тъканно култивиране за изучаване генетиката и физиологията на клетките е добре развита. Средствата и методите на тази технология служат за поддържане на постоянни клетъчни линии, получени чрез успешни серийни трансфери от изолирани нормални клетки. За използване при изследванията такива клетъчни линии се поддържат върху твърда повърхност в течна среда или чрез култивиране в суспензия, съдържаща твърди хранителни вещества. Изготвянето им в голям мащаб като че ли поставя само механични проблеми. За повече информация по отношение нивото на познанията в дадената област виж Microbiology, 2nd Edition, Harper and Row, Publishers, Inc. Hagerstown, Md.(1973), по-специално pp.1122 и Scientific American 245, 66 (1981), всеки от които е включен в литературната справка.

ОБЩО ЗА ИЗОБРЕТЕНИЕТО

Настоящето изобретение се основава на откритието, че рекомбинантната ДНК технология може да бъде използвана за получаване на човешки имуноинтерферон, за предпочитане в директна форма и в количества, достатъчни за иницииране и провеждане тестуването на животни и хора при клинични условия като предпоставка за одобрение за пазара. Продуктът е подходящ за използване във всички негови форми при профилактиката и лечението на хора с вирусна инфекция и злокачествени и имуносупресивни или имунодефицитни състояния. Тези негови форми.

включват различните възможни олигомерни варианти, които да съдържат асоциирана гликозилация.; Продуктът е получен чрез трансформирани по пътя на генното инженерство микроорганизми или чрез трансформирани клетъчни културални системи. Както се използва тук, терминът клетъчни трансформанти се отнася до клетки, в които е въведена ДНК, получена след екзогенно ДНК рекомбиниране и до потомството на която и да е от тези клетки, което съхранява така въведената ДНК. Така понастоящем съществува потенциал за получаване и изолиране на човешки имуноинтерферон по по-ефикасен начин. Особено значим фактор от настоящето изобретение в неговото предпочитано изпълнение е генетичното насочване на микроорганизмите за продуциране на човешки имунен интерферон в количества, позволяващи изолирането им след секретиране от гостоприемниковата клетка в зряла форма.

Настоящето изобретение обхваща така получения имунен интерферон, както и средствата и методите за неговото получаване. По-нататък то е насочено към реплициращи ДНК експресионни средства, помещаващи

гениите секвенции, които кодират човешкия имуноинтерферон в подходяща за експресиране форма. По-нататък настоящето изобретение е насочено към щамове микроорганизми или клетъчни култури, трансформирани с експресионните средства, описани по-горе, и до микробиални или клетъчни култури на така трансформирани щамове или култури, способни да продуцират човешки имунен интерферон. В един друг аспект изобретението е насочено към различни методи, приложими за получаване на генната последователност на посочения имунен интерферон, ДНК експресионните средства, щамове микроорганизми и клетъчни култури и тяхното специфично изпълнение. Още по-нататък, това изобретение е насочено към получаване на ферментационни култури от дадените микроорганизми и клетъчни култури. В допълнение, това изобретение е насочено към получаване на човешки имунен интерферон като директен експресионен продукт, секретиран от гостоприемниковата клетка в зряла форма. Този подход предвижда използване на гена, кодиращ последователността на зрелия човешки имунен интерферон плюс 5' фланкиращата ДНК, кодираща сигналния полипептид. Счита се, че сигналният полипептид подпомага транспорта на молекулата до клетъчната стена на гостоприемниковия организъм, където се разгражда по време на процеса на секретиране на зрелия човешки ймуноинтерферонов продукт.

с

Този вариант позволява изолирането и пречистването на очакваният зрял имунен интерферон,без да се прибягва до включване на процедури за елиминиране контаминанти на интрацелуларен гостоприемников протеин или клетъчни останки.

Изразът зрял продукт, използван в текста, обозначава човешкия имунен интерферон като продукт на микробиалната клетка или клетъчната култура, без сигнален пептид или предсеквенционен пептид, който да води непосредствено до транслация на човешка имуно интерферонова тРНК. Първи рекомбинантен имунен интерферон, осигурен съгласно настоящето изобретение е този, притежаващ метионин като първа амино киселина (представена благодарение на ATG старт сигналната кодонова инсерция срещу структурния ген) или, където метионинът е интра- или екстрацелуларно разграден и притежава както обикновено като първа аминокиселина цистеин. Зрял човешки имунен интерферон може също така да бъде продуциран, в съгласие е настоящето изобретение, заедно с конюгиран протеин, различен от конвенционалния сигнален пептид, като конюгатът може да бъде специфично разграден в интра- или екстрацелуларна среда. Виж Англ. патентно описание Ν 2007676А. Накрая, зрелият човешки имунен интерферон може да бъде продуциран чрез директна експресия без необходимост от разграждане по-нататък на който и да е чужд, излишен полипептид. Това по-специално е важно, когато даден гостоприемник може неефективно да отстрани сигналния пептид или изобщо да не го отстрани, когато експресионното средство е конструирано да експресира зрелия човешки имунен интерферон заедно с неговия сигнален пептид. Така продуцираният зрял човешки имунен интерферон се възстановява и пречиства до ниво, необходимо за приложение при лечение на вирусни, злокачествени и имуносупресивни или имунодефицитни състояния.

Човешкият имунен интерферон се получава в следната последователност:

1. Човешки тъкани, например тъкан от слезка на човек или лимфоцити от периферната кръв, се култивират с митогени за стимулиране продукцията на имунен интерферон.

2. Клетъчните гранули от такива клетъчни култури се екстрахират в присъствие на рибонуклеазен инхибитор за изолиране на цялата цитоплазматична РНК.

3. Олиго- dT колона изолира общата информационна (шРНК) в полиаденилационна форма. Тази тРНК се фракционира по размер с помощта на захарозен плътностен градиент и пикочно- кисела електрофореза.

4. Подходящата тРНК (12 до 18 S) се превръща в съответната едноверижна комплементарна ДНК (сДНК), от която се продуцира двойноверижна сДНК. След поли-dC удължаване, тя се инсертира във вектор, като плазмид, носещ един или повече фенотипични маркери.

5. Така създадените вектори се използват за трансформиране на бактериални клетки, осигуряващи колонийна библиотека. Радиобелязаната сДНК, изготвена от индуцирана и неиндуцирана тРНК, получена както е описано по-горе, се използва за отделно сондиране на двойните колонийни библиотеки. Излишъкът от сДНК след това се отстранява и колониите се експонират на радиоактивен филм така,че да се идентифицират индуцираните сДНК клонове.

6. Съответната плазмидна ДНК се изолира и съгласува от индуцираните сДНК клонове.

7. Първата съгласувана ДНК след това се удължава in vitro за инсерция в подходящо експресионно средство, което се използва за трансформиране на гостоприемникови клетки от Е. coli, които на свой ред са в състояние да растат и експресират желания човешки имуно интерферонов продукт.

8. Така експресираният имунен интерферон несъмнено притежава 146 амино киселини в неговата зряла форма, започвайки от цистеин и е силно основен по характер. Неговото мономерно молекулно тегло е изчислено на 17, 140. Може би поради присъствието на множество основни остатъци, хидрофобността, образуването на мостове от соли и др., молекулата може да се асоциира в олигомерни форми, като напр. в димер, тример или тетрамер.Наблюдаваните по-рано високи молекулни тегла за природил материал (6), който не може да бъде установен само чрез преброяване на амино киселините , може да се дължи на такива олигомерни форми, така че да съдейства на карбохидрата от пост-транслационното гликозилиране.

9. В същинските гостоприемникови клетъчни системи, по-специално когато са свързани в експресионно средство така ,че да бъде експресиран заедно с неговия сигнален пептид, зрялата форма на човешкия имунен интерферон се довежда до клетъчно културалната среда, което подпомага възстановяването и пречистването.

ОПИСАНИЕ НА ПРЕДПОЧИТАНИТЕ ВАРИАНТИ НА ИЗПЪЛНЕНИЕ

А. Микроорганизми / Клетъчни култури

1. Бактериални щамове / Промотори

Описаните тук действия са осъществени с участието на, inter alia, микроорганизма Е. coli К-12 щам 294 ( и A, thi-, hsr-, _к hsm+), както е описано в Англ. патентна публ. N 2055382 А. Този щам е депозиран в АТСС под N 31446. Независимо от това, могат да бъдат използвани и много други микробиални щамове, включително Е. coli В, Е. coli X 1766 (ATCC N 31537 ) или други микробиални щамове, повечето от които са депозирани и (потенциално) на разположение от депозитните институти, като напр. АТСС, виж също и Германският Offenlegungssrift 2644432. Тези други микроорганизми включват, например, бактерии като Bacillus subtilis и други ентеробактерии, сред които могат да бъдат забелязани и Salmonella typhimurium и Serratia marcerans, използващи плазмиди, които могат да репликират и експресират хетероложни генни последователности.

Например, ft -лактамазните и лактозо промоторните системи са използвани преимуществено за иницииране и поддържане на микробиалното продуциране на хетероложни полипептиди.Детайлите, отнасящи се до конструирането на тези промоторни системи,са публикувани от Chang et al., Nature 275 617 ( 1978) и Itacura et al., Science 198 1056 (1977), които са включени в литературната справка. Наскоро е създадена така нар. trp промоторна система, основана на триптофана. Подробностите, отнасящи се до конструирането на такава система,са публикувани от Goeddel et al., Nucleic Acid Research 8,4057 (1980) и Kleid et al., U. S. Ser. No 133 296, заявен на 24 март 1980, включени в литературната справка. Открити са и са използвани и много други бактериални промотори, а подробностите отнасящи се до техните нуклеотидни последователности, позволяващи на специалистите в областта да ги свързват функционално в плазмидни вектори, са публикувани, виж напр. Siebenlist et al., Cell 20, 269 (1980), включен в приложената литературна справка.

2. Дрождеви щамове / Дрождеви промотори

Използаната в изобретението експресионна система може да бъде плазмидът YRp (14, 15, 16), който е способен на селекция и репликация както в E.coli, така и в дрождите Saccharomices cerevisiae. За селекция в дрожди плазмидът съдържа гена TRP1 (14, 15, 16), чиито комплементи, позволяващи развитие в отсъствие на триптофан и съдържащи мутации в този ген, са намерени в хромозома IV (17). Използваният тук щам е RH218 (18), депозиран в АТСС без ограничения под N 44076. Обаче следва да се знае, че всеки щам Saccharomyces cerevisiae, съдържащ мутация, която прави клетката trpl, следва да бъде ефективна среда за експресия на плазмида, съдържащ експресионната система. Пример за друг щам, който би могъл да се използва, е рер 4-1 (19). Този триптофан ауксотрофен щам също притежава точкова мутация върху TRP1 гена.

Когато 5'- фланкиращата ДНК последователност (промотор) от дрождев ген (за алкохол дехидрогеназа) се постави върху 5'- края на ген с различен от дрождев произход, той може да съдейства за експресията на чужд ген в дрожди, ако бъде поместен в плазмид, приложим за трансформация на дрожди. Освен от промотор, истинската експресия на не-дрождев ген в дрожди изисква втора дрождева последователност, поместена при 3'-края на недрождев ген в плазмид, така че да позволи действително транскрибционно терминиране и полиаденилация в дрожди. Този промотор, както и други такива, може да бъде използван по подходящ начин в настоящето изобретение - виж по-горе. В предпочитаните варианти на изпълнение, 5'фланкиращата последователност от дрождевия 3- фосфоглицерат киназния ген (20) е разположен нагоре от структурния ген, последван отново от ДНК

съдържаща терминатор - полиаденилационни сигнали, например TRP1 (14, 15, 16) гена или PGK (20) гена.

Тъй като 5'- фланкиращата последователност (свързана с 3'- дрождева терминираща ДНК) (по-горе) може функционално да съдейства за експресия на чужди гени в дрожди, като че ли онези от 5'- фланкиращите последователности на който и да е високо експресивен дрождев ген, могат да бъдат използвани за експресия на важни генни продукти. Докато при някои обстоятелства дрождите експресират до 65 процента от разтворимия си протеин като гликолитични ензими (21) и Доколкото това високо ниво се явява резултат от продуцирането на високи нива от индивидуалната тРНК (22), би било възможно използването на 5'- фланкиращите последователности от които и да са други гликолитични гени за подобни експресионни цели като напр. енолаза, глицералдехид-3-фосфат дехидрогеназа, хексокиназа, пируват декарбоксилаза, фосфофрукто киназа, глюкозо-6-фосфат изомераза, фосфоглюкозо изомераза и глюкокиназа. Всяка от 3'- фланкиращите последователности на тези гени може също да бъде използвана за терминиране и тРНК полиаденилация в такива експресионни системи - виж по-горе. Други високо експресионни гени са гените за киселите фосфатази (23) и гените, които експресират високи нива на продуктивност благодарение на мутации в 5'- фланкиращите области ( мутанти, повишаващи експресията), обикновено поради присъствието на ΊΎ1 транспозициониращ елемент (24). Всички отбелязани по-горе гени са такива, които могат да бъдат транскрибирани чрез дрождева РНК полимераза II (24). Възможно е промоторите за РНК полимераза I и III, които транскрибират гените за рибозомална РНК, 5S РНК и tPHK (24, 25) също да бъдат приложими за подобни експресионни структури.

-I

Накрая, много дрождеви промотори също съдържат транскрибционен контрол, така че да могат да бъдат изключвани или включвани в зависимост j t от вариантите на условията на култивиране. Примери за такива дрождеви промотори са гените, които продуцират следните протеини : алкохол дехидрогеваза II, изоцитохром - с, кисела фосфатаза, разграждащи ензими, асоциирани с азотния метаболизъм, глицералдехид-3-фосфат дехидрогеназа и ензими, отговорни за използването на малтозата и галактозата (22). Такива контролни области биха били приложими при контролиране експресията на

протеиновия продукт - по-специално когато тяхното получаване е токсично за дрождите. Би било възможно също така да се постави контролиращата област от една 5’- фланкираща последователност с 5'- фланкираща последователност, съдържаща промотор от високо експресиран ген. Това би довело до хибриден промотор и би било възможно доколкото контролиращата област и промоторната са отличими по физичен начин ДНК последователности.

3. Клетъчно културални системи / Клетъчно културални вектори

Размножаването на клетки от vertebrata в култура ( тъканна култура) е рутинна процедура за последните години (виж Tissue Culture, Academic Press, Kruse and Patterson eds, 1973). Тук е използвана линията COS-7 от маймунски бъбречни фибробласти като гостоприемник за получаване на имунен интерферон (25). Но детайлно описаните ’ тук екстерименти могат да бъдат проведени в която и да е клетъчна линия, способна да реплицира и експресира конкурентен вектор като напр. WI138, ВНК, ЗТЗ, СНО, VERO и HeLa клетъчни линии. В допълнение, изискването за експресионен вектор е източникът на репликация и промотора, да е локализиран пред гена за експресиране, по дължината на който и да е необходим рибозомален свързващ сайт, РНК сайт на разцепване, полиаденилационен сайт и транскрибиционни терминиращи последователности. Независимо, че тук се използват тези основни елементи на SV40, би могло да се разбере, че макар и описано в рамките на предпочитаните варианти на изпълнение, изобретението не трябва да се счита ограничено в тези рамки. Например, може да се използва източникът на репликацията на други вирусни вектори (като Polioma, Adeno, VSV, BPV и други подобни), така както и източници на репликация от клетката, които биха могли да функционират в неинтегрирано състояние.

В. Векторни системи

1. Директна експресия на зрял имунен интерферон в Е. coli

Процедурата, използвана за получаване на директно експресиране на

IFN-y в Е. coli като зрял интерферонов полипептид ( без сигнална последователност), е вариант на тази, която използва по-ранен човешки растежен хормон (26) и човешки левкоцитарен интерферон (1), доколкото включва комбинацията от синтетична (N- крайна) и сДНК.

Както се предполага от нуклеотидната последователност на р69, описана по-горе,и от сравняването на познатите сайтове на разграждане между сигналния пептид и зрелия полипептид за няколко IFN- а (2), IFN -у притежава хидрофобен сигнален пептид от 20 амино киселини, последван от 146 амино киселини на зрелия IFN -у (фиг. 5). Както е показано на фиг. 7,

BStNI рестрикционният ендонуклеазен сайт е конвенционално локализиран при амино киселина 4 на зрелия IFN- у. Конструирани са два синтетични олиго дезоксинуклеотида, които включват ATG транслационен иницииращ кодон, кодони за амино киселини 1, 2 и 3 (цистеин- тирозин- цистеин) и се създава EcoRI кохезивен край. Тези дезоксиолигонуклеотиди са свързани към 100 двойки бази BstNI- PstI фрагмент от р69 за конструиране на синтетичноприроден хибриден ген с 1115 двойки бази, който кодира IFN - у и който е свързан чрез EcoRI и PstI рестрикционни сайтове. Този ген се инсертира в плазмида pLelF A trp 103 между EcoRI и PstI сайтовете за получаване на експресионния плазмид pIFN- γ trp 48. В този плазмид IFN -γ генът е

експресиран под контрола на Е. coli trp промотор. ( pLelF A trp 103 е получен от pLelF А 25, в който сайтът EcoRI, дистално спрямо LelF А гена е отстранен. Използваната за отстраняване на този сайт процедура е описана по- рано (27).

2. Експресия в дрожди

За експресиране на хетероложен ген за имунен интерферон като сДНК в дрожди, е необходимо да се конструира плазмиден вектор, съдържащ четири компонента. Първият от тях е частта, позволяваща трансформиране както на Е. coli, така и на дрожди и по този начин следва да съдържа селективен ген от всеки организъм. (В случая това е генът за ампицилинова резистентност от Е. coli и гена TRP1 от дрожди). Този компонент също изисква източник на репликация от два организма. (В случая това е източника E.coli от pBR322 и arsl източника от хромозома III на дрождите).

Вторият компонент от плазмида е 5'-фланкиращата последователност от високо експресивен ген за подпомагане транскрибцията на разположения надолу в последователността структурен ген. В този случай, използваната 5'фланкираща последователност произхожда от дрождевия 3- фосфоглицерат киназен (PGK) ген. фрагментът е конструиран така, че да отстрани ATG от PGK структурната последователност като 8 вр надолу от този ATG. Тази последователност е заместена с последователността, съдържаща и двата рестрикционни сайта - XbdI и EcoRI, за удобство прикрепени към 5'фланкиращата последователност от структурния ген.

Третият компонент от системата е структурен ген, конструиран по същия начин, че да съдържа едновременно ATG транслационен старт и транслационен стоп сигнал. Изолирането на структури от такъв ген е описано по-долу.

Четвъртият компонент е дрождева последователност, съдържаща 3'фланкираща секвенция от дрождев ген, който съдържа същински сигнал за тренскрибционно терминиране и полиаденилация.

Имунният интерферон е получен в присъствие на всички тези компоненти в дрождите.

3. Експресия в клетъчни култури на бозайници

Методиката за синтез на имунен интерферон в клетъчни култури на бозайници разчита на създаването на вектор, способен и на автономна репликация и на експресия на външен ген под контрола на хетероложна транскрибционна единица. Репликацията на този вектор в тъканна култура се осъществява чрез осигуряване на ДНК репликационен източник (получен от SV40 вирус) и обезпечава помощна функция (Т антиген) чрез въвеждането на вектора в клетъчна линия, ендогенно експресираща този антиген (28, 29). Късният промотор на SV вируса предшевства структурния ген на интерферона и гарантира транскрибцията на гена.

Векторът, използван за получаване на експресия на IFN-y,ce състои от pBR322 последователности, които осигуряват селективен маркер за подбор в Е. coli (ампицилин резистентен), както и Е. coli източник на ДНК репликация. Тези последователности са получени от плазмида pML- 1 (28) и обхващат областта между рестрикционните сайтове Е. coli и BamHI. Източникът SV40 е получен от 342 двойки бази PvuII- Hindlli фрагмент, покриващ тази област (30,31) (двата края са превърнати в EcoRI краища). Тези последователности, като допълнение към това, че обхващат вирусния източник на репликация на ДНК, кодират промотор едновременно за ранната и за късната транскрибционна единица. Ориентацията на областта за SV40 ί

източника е такава, каквато е на промотора за късната транскрибционна единица - проксимално на гена, кодиращ интерферон.

КРАТКО ОПИСАНИЕ НА ЧЕРТЕЖИТЕ

Фиг. 1 показва захарозния градиент на центрофугиране на индуцирана в лимфоцити от периферната кръв Поли(А) + РНК. Наблюдавани са два пика на интерферонова активност (както е показано чрез защриховани кутийки) с размери 12S и 16S. Местата на рибозомните РНК маркери (центрофугирани незабавно) са белязани над абсорбционния профил.

Фиг. 2 показва електрофореза на индуцирана PBL Поли(А)+РНК върху пикочнокисела агароза. Наблюдаван е само един пик на активност, който е за

18S РНК. Позицията на рибозомалните РНК маркери, които са подложени на електрофореза в съседна линия и визуализирани с етидиум бромид, са отбелязани над профила на активността.

фиг. 3 показва образците на хибридизация на 96 колонии с индуцирани и неиндуцирани Р³²- белязани сДНК сонди. 96 отделни трансформанта се култивират в микротитърна плака, прехвърлят се върху нитроцелулозна мембрана и след това филтратите се хибридизират с Р³² сДНК сонди, получени или от индукционна тРНК (както по-горе), или от тРНК, изолирани от неиндукционни PBL култури (по-долу), филтрите се промиват за отстраняване на нехибридизираната РНК и след това се експонират върху чувствителен за ултравиолетовата светлина филм. Този комплекс от филтри е представителен за 86 такива комплекси (8300 независими колонии). Един примерен индуциран клон е отбелязан като Н12.

фиг. 4 е карта на рестрикционните ендонуклеази на инсерционния клон 69 сДНК.сДНК инсертьт е свързан чрез PstI сайтове (точки при двата края) и олиго dC- dG опашки ( единични линии). Броят и размерът на фрагментите, получени чрез разграждане с рестрикционни ендонуклеази,се оценява с електрофореза върху 6 процентни акриламидни гелове. Позициите на сайтовете се потвърждава чрез съгласуване на нуклеиновите киселини (представено на фиг. 5 ). Кодиращата област от най- голямата отворена четяща рамка е оградена, а защрихованата част представя предполагаемата сигнална пептидна последователност от 20 остатъка, докато покритата с точки област представя зрялата IIF последователност (146 амино киселини). 5'-краят от тРНК е наляво, а 3'- края е надясно.

фиг. 5 илюстрира нуклеотидната последователност на инсурционната плазмидна р69 сДНК. Представена е също предполагаемата амино киселинна последователност на най-дългата отворена четяща рамка. Предполагаемата сигнална последователност е представена от остатъците, отбелязани от S1 до S20.

фиг. 6 представя сравнение на IFN- γ тРНК структурата с тази на левкоцитарните (IFN- а) и фибробластни (IFN- β) интерферони. Клонът 69 тРНК (отбелязан като имунен) съдържа значително по-голямо количество нетранслирани последователности.

фиг. 7 е схематична диаграма на структурата на IFN-γ експресионния плазмид pIFN- γ trp 48. Изходният материал е 1250 двойки бази PstI сДНК от плазмида р69.

фиг. 8 показва диаграма на плазмид, приложим за експресия на IFN- γ в клетки на маймуна.

фиг. 9 показва Southern хибридизация на разградена с EcoRI човешка геномна ДНК, хибридизирана с Р³²- белязан Ddel фрагмент с 600 двойки бази от ДНК на инсерционния плазмид р69. Два EcoRI фрагмента ясно се хибридизират със сондата от всяка ДНК проба.

Фиг. 10 показва Southern хибридизация на човешка геномна ДНК,

разградена с шест различни рестрикционни ендонуклеази, хибридизирани с Р³²- белязана сонда от р69.

Фиг. 11 схематично илюстрира рестрикционната карта на 3.1 kbp Hindlll инсерта от вектора ρΒΙ,οτ който е изолиран промоторът PGK. Обозначена е инсерцията на един EcoRI сайт и един Xbal сайт в 5'фланкиращата ДНК от гена PGK.

фиг. 12 илюстрира 5'-фланкиращата последователност от PGK гена преди инсертирането на Xbal и EcoRI сайтовете.

Фиг. 13 представя схематично начините, използвани за инсертиране на Xbal сайта при позиция-8 в PGK промотора и за изолиране на 39 Ьр фрагмента от PGK, съдържащ този Xbal край и Sau3A край.

фиг. 14 представя схематично конструирането на 300 Ьр фрагмент, съдържащ горния 39 Ьр фрагмент, допълнителна PGK 5'- фланкираща последователност (265 Ьр) от Pvul към Sau3A (виж фиг. 11) и EcoRI сайт, съседен на Xbal.

фиг. 15 схематично илюстрира структурата на PGK промотора с 1500 bp (Hindlll / EcoRI), съдържащ допълнително към фрагмента конструиран съгл. фиг. 14, 1300 bp Hindlll към PGK 5'- фланкиращата последователност (виж фиг. 11).

фиг. 16 илюстрира състава на един експресионен вектор за човешки имунен интерферон в дрожди, съдържащ модифициран PGK промотор, IFN-y сДНК и терминаторната област на дрождевия PGK ген, както е описан поподробно тук.

ПОДРОБНО ОПИСАНИЕ

А. Източник на IFN - у тРНК

Левкоцити от човешка периферна кръв (PBLs) са получени чрез левкофореза. PBLs се пречистват посредством градиентно центрофугиране по Ficoll-Hypaque , след което се култивират при концентрация 5 х 10^б клетки / мл в RPMI1640, 1 процент L- глутамин, 25 mM HEPES и 1 процент пеницилинстрептомицинов разтвор ( Gibco, Grand Island, NY). Тези клетки се индуцират за продуциране на IFN-γ чрез митогенен стафилококов ентеротоксин В (1 mg/ml) и се култивират за 24 до 48 часа при 37 ’ С. Към PBL културите се добавя дезацетилтимозин- α- 1 (1 mg/ml) за повишаване на получената IFN- γ

активност.

B. Изолиране на транспортна РНК

Общото количество на РНК от PBL културите се екстрахира по същество както е докладвано от Berger, S. L. et al. (33). Клетките се утаяват чрез центрофугиране и след това се ресуспендират в 10 mM NaCl, 10 mM Tris- HCL (pH 7.5) , 1.5 тМ MgCl₂ и 10 тМ рибонуклеозид ванадилов комплекс. Клетките се лизират чрез добавяне на NP-40 ( 1 процент крайна концентрация) и ядрата се утаяват чрез центрофугиране. Супернатантата съдържа общото количество РНК, което по-нататък се пречиства чрез многократна фенолна и хлороформна екстракция. Водната фаза се довежда до 0.2М в NaCl, след което общото количество РНК се преципитира чрез добавяне на два обема етанол. РНК от неиндуцираните (нестимулирани) култури се изолира по същите методи. За пречистване на тРНК от общото количество РНК преципитат, се използва олиго-dT целулозна хроматография (34) . Обикновено добивът възлиза на 5- 10 милиграма обща РНК и 50- 200 микрограма поли(А) + РНК от 1-2 литра култивирани PBL.

C. Фракциониране по размер на тРНК

Два метода се използват за фракциониране на тРНК препаратите. Те са приложени независимо един от друг (вместо едновременно) и всеки от тях води до значително повишаване количеството на IFN- γ тРНК.

За фракциониране на тРНК се използва захарозо- градиентно центрофугиране в присъствие на денатуриран формамид. 5 до 25 процента захароза в 70 процента формамид се центрофугират (32) при 154 000 х g за 19 часа при 20° С. Последователните фракции (0.5 ml) след това се отстраняват, преципитират се с етанол и една аликвотна част се инжектира в ооцити на Xertopus laevis за транслиране на тРНК (35). След 24 часа на стайна температура, инкубационната среда се изпитва за антивирусна активност в стандартна проба за ефекта на цитопатично инхибиране с помощта на везикуларния стоматитен вирус ( щам Indiana) или енцефаломиокардния вирус по WISH ( човешки амнион) клетки, както е описано от Stewart (36), с изключение на това, че пробите се инкубират с клетки за 24 часа ( вместо 4) преди провокация с вируса. Наблюдават се два постоянни пика на активност във фракционираната РНК (фиг. 1). Един пик е седиментиран с изчислен размер 12S и съдържа 100- 400 единици / ml антивирусна активност ( в сравнение с IFN-α стандарт ) за микрограм инжектирана РНК. Друг пик на активност, седиментиран като 16S по размер,съдържа половината от активността на по- бавно седиментирания пик. Всеки от тези пикове на активност очевидно се дължи на IFN-y, докато когато същата фракция се изпитва върху клетъчна линия от телешки клетки (MDBK), не се наблюдава активност, тъй като не се протектират от човешки IFN- у. Както IFN- a активността, така и IFN- β биха могли да бъдат открити лесно с MDBK (5).

Фракционирането на тРНК (200 mg) се осъществява и посредством електрофореза върху пикочно- киселинни агарозни гелове. Плаката от агарозен гел (37, 38) се състои от 1. 75 процента агароза, 0. 025 М натриев цитрат, pH 3. 8 и 6М пикочна киселина. Електрофорезата се провежда 7 часа при 25 милиампера и 4° С. След това теловете се нарязват с бръснарско ножче. Отделните срезове се размекват при 70° С и се екстрахират двукратно с фенол и еднократно с хлороформ. След това фракциите се преципитират с етанол и последователно се изпитват за IFN- у тРНК чрез инжектиране в ооцити на Xenopus laevis и антивирусно действие. В така фракционираните гелни проби е наблюдаван само един пик на активност (фиг.2). Този пик се дължи на микриране заедно с 18S РНК и притежава активност от 600 единици / ml за микрограм от инжектираната РНК. Тази активност е вероятно IFN- у специфична, доколкото не протектира MDBK клетки.

Несъответствието в размера на пиковете на активност, наблюдавани при захарозните градиенти ( 12S и 16S) и пикочно киселинните телове (18S), може да бъде обяснено с наблюдението, че тези независими методи на фракциониране са неосъществими при условията на пълна денатурация.

D. Изготвяне на библиотека от колонии, съдържащи IFN- у последователности

За получаване на двойно- верижна ДНК по стандартна процедура, се използват 3 pg гел-фракционирана тРНК (26, 39). сДНК се фракционира върху 6 процентен полиакриламиден гел. Две от фракциите се подлагат на електроелуация, 800- 1500 Ьр (138 ng) и > 1500 Ьр (204 ng ). Части от по 35 ng сДНК се удължават с дезоксиС остатъци с помощта на терминираща дезоксинуклеотидил трансфераза (40) и се ренатурират с 300 ng от празмида pBR322 (41), който по аналогичен начин е удължен с дезоксиС остатъци при PstI сайта (40). Всяка ренатурирана смес след това се трансформира в Е. coli К 12 щам 294. Получени са приблизително 8000 трансформанта с 800- 1500 Ьр сДНК и 400 трансформанта с > от 1500 Ьр сДНК.

Е. Скрининг на колонийната библиотека за индуцирана сДНК

Колониите се инокулират индивидуално в кладенчетата на микротитърни плаки, съдържащи LB (58) + 5 mg/ml тетрациклин и се оставят на - 20°С след като се добави DMSO до 7 процента. Две копия на колониите се култивират върху нитроцелулозни филтри и ДНК от всяка от колониите се фиксира върху филтъра по метода на Grunstein- Hognes (42).

Р³²- белязани сДНК сонди се изготвят с помощта на 18S гел гел фракционирана тРНК от индуцирани и неиндуцирани PBL култури. Олиго dT_!2__]g е използваният праймер, като условията на реакцията са описани по рано (1). филтри, съдържащи 8000 трансформанта с размер на сДНК 6001500 Ьр и трансформанта с размер > 1500 Ьр се хибридизират с 20 χ 10⁶ срт от индуцираната Р³² - сДНК. Втори комплекс от филтри се хибридизира с 20 х 10⁶ срт от неиндуцираната Р³²- сДНК. Хибридизацията се провежда за 16 часа при условията, описани от Fritsch et al. (43). филтрите се промиват енергично (43) и след това се експонират на чувствителен на ултравиолетови лъчи филм Кодак XR-5 с подсилен екран на Du-Pont Lightnis-Plus за 16 до 18 часа. Всяко хибридизиране на образец от колониите се сравнява с двете сонди. Приблизително до 40 % от колониите се хибридизират ясно с двете сонди, докато около 50% от тях не успяват да се хибридизират (показано на фиг.З). 124 колонии се хибридизират значително с индукционната сонда, но без да може да бъде регистрирано или да бъде слабо регистрирано с неиндуктивната сонда. Тези колонии се инокулират индивидуално в кладенчетата на микротитърните плаки, култивират се и се хибридизират със същите две сонди, както е описано по-горе. Плазмидната ДНК, изолирана от всяка от тези колонии по метода (44),също се свързва към нитроцелулозните филтри и се хибридизира (45) с индукционна и неиндукционна сонда. ДНК от

колонии хибридизира само с индукционна сонда, поради което тези колонии се наричат индуцирани колонии.

F. Охарактеризиране на индуцираните колонии

От пет от индуцираните колонии (46) се изготвя плазмидна ДНК, която се използва за охарактеризиране на сДНК инсертите. Рестрикционните карти на пет индуцирани плазмида ( р67, р68, р69, р71 и р72) показват, че четири от тях са сходни. Това са р68, р69, р71 и р72, всеки от които има четири Ddel сайта, 2 HifI сайта и един Rsal сайт в сДНК. Петият плазмид (р68) съдържа общ Ddel фрагмент и очевидно е къс сДНК клон, свързан с останалите четири. Хомологията, предположена чрез рестрикционните карти,е потвърдена и чрез хибридизация. Р³²-белязана ДНК сонда се изготвя (47) от 600 bp Ddel фрагмент на плазмида р67 и се използва за хибридизация (42) с другите индуцирани колонии. Всичките пет картирани с рестрикционни ендонуклеази колонии се хибридизират кръстосано с тази сонда както 17 други колонии от индукционно / неиндукционния. скрининг. Дължината на сДНК инсерта във всеки от тези кръстосано- хибридизирани плазмиди се определя чрез PstI и гел електрофореза. Клонът с най- дълъг сДНК инсерт очевидно е клон 69 с дължина на инсерта 1200 - 1400 Ьр. Тази ДНК се с

използва за всички по- нататъшни експерименти и нейната рестрикционна карта е показана на фиг. 4.

Чрез получаване на експресионни продукти в три независими експресионни системи, демонстриращи антивирусна активност е доказано, че сДНК инсерта в р69 е IFN- γ сДНК.

G. Секвенционен анализ на сДНК инсерта в р69

Пълната нуклеотидна последователност на р69 плазмидния инсерт е определена чрез дидезоксинуклеотидно верижен терминиращ метод (48) посредством субклониране на фрагментите във вектора М13 тр7 (49) и химичната процедура на Махат- Gilbert (52). Най- дългата отворена четяща рамка кодира протеин от 166 амино киселини, представени на фиг.5. Първият кодиран остатък е първият met кодон, преброен от 5'- края на сДНК. Първите 20 остатъка при амино края вероятно служат като сигнална последователност за секретирането на останалите 146 амино киселини. Тази, вероятно сигнална, последователност притежава общите за останалите сигнални последователности характерни особености, като размер и хидрофобност. Нещо повече, четири амино киселини, установени при вероятния сайт на разграждане ( ser- leu- cys) са идентични с четири остатъка, установени при точките на разграждане на няколко левкоцитарни интерферона ( LelF В, С, D, F и Н (2)). Кодираната зряла амино киселинна последователност от 146 амино киселини (оттук нататък наричана рекомбинантен човешки имунен интерферон) притежава молекулно тегло 17 140.

Налице са две потенциални точки на гликозилация (50) в кодираната протеинова последователност - при амино киселини 28 до 30 (asn- gly- thr ) и амино киселини 100 - 102 (asn- tyr- ser ). Съществуването на тези позиции се съгласува с наблюдаваното гликозилиране на човешки IFN- γ в присъствие на редуциращи агенти като β- меркаптоетанол (51). Предложената зряла амино : киселинна последователност е твърде базична, с общо 30 лизинови, аспарагинови и хистидинови остатъка и само общо 19 аспарагинови и глутаминови киселинни остатъка.

тРНК структурата на IFN- γ, както е предположена от ДНК последователността на плазмида р69,е ясно различима от IFN- α (1, 2) или IFN- β (5) на тРНК. Както е представено на фиг. 6, кодиращата област на IFN- γ е по- къса, докато 5'- нетранслираните и 3'- нетранслираните региони са малко по-дълги както от IFN- а , така и от IFN- β.

Н. Експресия на рекомбинантен човешки интерферон в Е. coli

В съответствие с фиг. 7, 50 pg от плазмида р69 се разграждат с помощта на PstI и инсерта от 1250 двойки бази се изолира посредством гел електрофореза в 6 процентен полиакриламиден гел. Приблизително 10 pg от този инсерт се елуират от гела. След това, 5 pg от този PstI фрагмент се разгражда на части с 3 единици BstNI (Bethesda Research Labs ) за 15 минути при 37°С и реакционната смес се пречиства в 6 процентен полиакриламиден гел. Приблизително 0.5 pg от желания BstNI- PstI фрагмент, състоящ се от

1100 двойки бази се възстановяват. Двата обозначени на фиг. 7 дезоксиолигонуклеотида - 5'- dAATTCATGTGTTATTGTC и 5'dTGACAATAACACATG , се инсертират по фосфотриестеразния метод (53) и се фосфорилират както следва : 100 pmol от всеки дезокси олигонуклеотид се комбинират в 30 μΐ от 60 mM Tris - НС1 (pH 8), 10 тМ MgCl₂, 15 тМ βмеркаптоетанол и 240 pCi (γ- Р³²) АТф ( Amersham, 5000 Ci/mmol). Добавят се 12 единици от Т4 полинуклеотид киназа и реакцията се оставя да продължи още 20 минути. След ф- ОН / СНС1₃ екстракция, олигомерите се комбинират с BstNI- PstI фрагмента, притежаващ 1100 двойки бази и се преципитират с етанол. Тези фракции се лигатират при 20°С за два часа в 30 μ 1 20 mM Tris - НС1 (pH 7.5), 10 mM MgCl₂, 10 тМ дитиотреитол , 0.5 тМ АТф и 10 единици Т4 ДНК лигаза. Сместа се разгражда за един час с 30 единици PstI и 30 единици EcoRI ( за отстраняване на полимеризацията чрез лигатиране на кохезивният край ) и се подлага на електрофореза в 6

процентен полиакриламиден гел. Продуктът от 1115 двойки бази (110 000 срт) се възстановява чрез електроелуация.

Плазмидът pLelF A trp 103 (фиг.7) е производен на плазмида pLelF А 25(1), в който EcoRI сайтът, дистално на LelF А гена,е отстранен ( 27). 3 pg от pLelF A trp 103 се разгражда с 20 единици EcoRI и 20 единици PstI за 90 мин при 37°С и се подлага на електофореза в 6 процентен полиакриламиден гел. Големият векторен фрагмент ( ~ 3900 двойки бази) се възстановява чрез електроелуация. фрагментът с големина 1115 двойки бази, EcoRI - PstI IFN- λ

ДНК се включва в 0.15 pg от така изготвения вектор. Трансформирането на

Е. coli К-12 щам 294 (АТСС N 31446) дава 120 устойчиви на тетрациклин колонии. Плазмидна ДНК се получава от 60 от тези трансформанти и се разгражда с EcoRI и PstI. Три от тези плазмида съдържат разградения

EcoRI - PstI 1115 двойки базов фрагмент. ДНК секвенционният анализ потвърждава, че тези плазмиди притежават желаната нуклеотидна последователност и свързването между trp промотора, синтетичната ДНК и сДНК. Един от тези плазмиди - pIFN- λ trp 48 е избран за допълнително изследване. Този плазмид се използва за трансформиране на Е. coli К-12 щам W3110 (АТСС N 27325).

I. Генна структура на IFN- γ кодиращата последователност Структурата на гена, кодиращ IFN- у_ке анализирана чрез Southern хибридизация. В тази процедура (54), 5 микрограма от човешка лимфоцитна ДНК с високо молекулно тегло (получена както е описано в 55), се разгражда с различни рестрикционни ендонуклеази, подлага се на електрофореза върху 1.0 процентен агарозни гелове (56) и се оцветява върху нитроцелулозни филтри (54). Р³ - белязана ДНК сонда се изготвя (47) от 600 bp Ddel фрагмент на сДНК инсерта на р69 и се хибридизира (43) с нитроцелулозна ДНК . Количество, възлизащо на 10⁷ за минута се хибридизира за 16 часа и след това се промива както е описано в (43). Осем геномни ДНК проби от различни донори се разграждат с EcoRI рестрикционна ендонуклеаза и се хибридизират с р69 Р³²- белязана сонда. Както е представено на фиг. 9, наблюдават се два ясни хибридизационни сигнала с размери 8.8 килобази двойки (kbp) и 2.0 kbp както се получава след сравняване мобилността с Hindlll разградена ХДНК. Това би могло да е резултат от два IFN - γ гена или от разделяне на един ген в EcoRI сайт. Доколкото р69 не съдържа EcoRI сайт, ще бъде необходима интервентна последователност (интрон) с един вътрешен EcoRI сайт за обяснение на сигналния ген.За да се направи разлика между тези две възможности, се провежда друга Southern хибридизация със същата сонда срещу пет други ендонуклеазни разграждания на една човешка ДНК ( фиг. 10). Наблюдават се два други хибридизиращи фрагмента с две други ендонуклеазни разграждания, PvuII ( 6.7 kbp и 4.0 kbp) и HincII ( 2. 5 kbp и 2. 2 kbp). Обаче три други ендонуклеазни образци на разграждане осигуряват само единичен ДНК хибридизационен фрагмент : Hindlll ( 9. 0 kbp), Bglll (11. 5 kbp) и BamHI ( 9. 5 kbp). Два IFN- γ гена би трябвало да се свържат при необикновено близко разстояние ( по- малко от 9.0 kbp),за да са разположени в рамките на един и същ Hindlll хибридизационен фрагмент. Този резултат предполага, че в човешката геномна ДНК присъства само един хомоложен IFN - γ ген ( за разлика от много свързани IFN- а гени) и че този ген е разделен от един или повече интрони, съдържащи EcoRI, PvuII и HincII сайтове. Това предположение е потвърдено от хибридизацията на Р³²- белязан (47) фрагмент, получен от непосредствено 3'- нетранслирания регион на сДНК фрагмента на сДНК р69 (130 bp Ddel фрагмент от 860 Ьр до 990 Ьр на фиг. 5) срещу едно EcoRI разграждане на човешка геномна ДНК. Само 2.0 kbp EcoRI фрагмента се хибридизират към тази сонда, предполагайки че този фрагмент съдържа 3'- нетранслирани последователности, докато 8.8 kbp EcoRI фрагмент съдържа 5'- последователности. Генната структура на IFN- γ (един ген с поне един интрон) е ясно отличим от IFN- а (мултиплени гени (2) без интрони (56) или IFN-β (един ген без интрони (57) ).

J. Получаване на бактериални екстракти

Нощна куртура на Е. coli W3110 / pIFN-γ trp 48 в бульон на Luna + 5 микрограма за ml тетрациклин се използва за инокулиране на М9 (58) среда, съдържаща 0.2 процента глюкоза, 0.5 процента казаминови киселини и 5 5 микрограма за ml тетрациклин при разреждане 1:100. Добавя се индол акрилова киселина до крайна концентрация 20 микрограма за ml когато А₅₅₀е между 0. 1 и 0. 2. Добивът от десет милилитрови проби се събира чрез .

центрофугиране при А₅₅₀ = 1. 0 и се ресуспендира незабавно в 1 ml фосфатно буферен разтвор, съдържащ 1 mg за ml телешки серумен албумин (PBS- BSA). Клетките се отварят чрез обработка с ултразвук и се очистват от останките чрез центрофугиране. Супернатантите се съхраняват при 4°С до изпитване. Интерфероновата активност в супернатантите се определя на 250 единици/ml чрез сравняване на IFN- а стандарти с ефекта от цитопатично инхибиращо изпитване (СЗЕ).

К. Трансформиране на дрожди / Щамове и среда

Дрождевите щамове се трансформират както е описано по-рано (59). Щам E.coli JA300 (thr leuB6 thi thyA trpC 1117 hsdm- hsdR- str^R )(20) ce използват за подбор на плазмиди, съдържащи функционален TRPI ген. Дрождевият щам RH128 с генотипа (a trpl gal2 SUC2 mal CPUI) (18) се използва като гостоприемник за трансформиране . RH218 е депозиран в АТСС под N 44076. М9 ( минимална среда) с 0.25 процента казаминови киселини (САА) и LB (богата среда) са такива, каквито са описани от Miller (58) с добавка от 20 pg/ml ампицилин ( Sigma) след като средите се автоклавират и охлаждат. Дрождите се култивират върху следната среда YEPD съдържа 1 процент дрождев екстракт, 2 процента пептон и 2 процента глюкоза + 3 процента Difco arap. YNB + САА съдържа 6. 7 грама дрождева азотна база (без амино киселини) (YNB) (Difco), 10 mg аденин, 10 mg урацил, 5 грама САА, 20 грама глюкоза и +30 грама агар за литър.

L. Конструиране на дрождев експресионен вектор

1. 10 pg YRp7 (14, 15, 16) се разграждат с EcoRI. Получените в резултат лепливи ДНК краища се правят слепи с помощта на ДНК полимераза I (Klenow fragment). Векторът и инсертът се прекарват през 1 процент агароза (SeaKem) гел, изрязват се от гела, подлагат се на електроелуация и се екстрахират двукратно с еднакви обеми хлороформ и енол преди преципитиране с етанол. Получените в резултат слепи ДНК молекули се смесват в краен обем 50 μΐ за 12 часа при 12°С. Тази смес след това се използва за трансформиране на Е. coli щам JA300 в ампицилиново резистентен и триптофаново прототрофен. Изолират се плазмидите, съдържащи TRPI гена в двете ориентации. pFRWl притежава TRPI гена в същата ориентация както YRp7, докато pFRW2 притежава TRPI гена в

противоположна ориентация.

pg от pFRW2 се линеализират с Hindlll и се подлагат на електрофореза върху 1 процент агарозен гел. Линеарните молекули се елуират от гела и 20 ng от тях след това се лигатират с 500 ng от 3, lkb Hindlll инсерта от плазмид рВ1 (13), който е рестрикционен фрагмент, съдържащ дрождевия 3- фосфоглицерат кинезин ген. Тази лигаторна смес след това се използва за трансформиране на Е. coli щам 294 в щам, резистентен на ампицилин и чувствителен на тетрациклин. Плазмидът, получен от един такъв рекомбинант, притежава един интактен TRP1 ген с 3. 1 kbp Hindlll фрагмент от рВ1 инсерционна ДНК в Hindlll сайта на гена за тетрациклинова резистентност. Този плазмид е pFRM31. 5 pg от pFRM31 напълно се разгражда с EcoRI, екстрахира се двукратно с фенол и хлороформ, след което се преципитира с етанол. Кохезивните краища от молекулата се запълват с помощта на ДНК полимераза I ( Klenow fragment) в реакция, доведена до 250 цМ във всеки дезоксинуклеозид трифосфат. Реакцията след това се провежда за 20 минути при 14°С, през което време ДНК се екстраира двукратно с фенол- хлороформ и след това се преципитира с етанол. Ресуспендираната ДНК след това напълно се разгражда с Clal и се полага на електрофореза в 6 процентен акриламиден гел. Векторният фрагмент се елуира от гела, екстрахира се с фенол- хлороформ и се преципитира с етанол.

ί i

Шестте N- крайни амино киселини от 3- фосфоглицератният ензим, j пречистен от хора са следните :

i ^! 1- 2- 3- 4- 5- 6

SER - LEU - SER - HSM - LYS - LEU i

Една от транслационните четящи рамки, генерирани от ДНК последователността на 141 bp Sau3A - to - Sau3A рестрикционни фрагмента (съдържащ интернален Hindi сайт ; виж PGK рестрикционната карта на фиг. 11), продуцира следната амино киселинна последователност :

1. 2- 3- 4- 5- 6

V MET - SER - LEU - SER - SER - LYS - LEU След отстраняване на инйциращия метионин може да се види, че PGK N- крайната амино киселинна последователност притежава 5 от 6 -те амино киселини, хомоложни с N- крайната амино киселинна последователност на човешка PGK.

Този резултат от съгласуване предполага, че началото на PGK структурния ген е кодиран от ДНК в 141 bp Sau3A рестрикционния фрагмент на рВ1. По- ранни разработки (20) предполагат, че ДНК последователността, специфична за PGK шРНК може да се разполага в областта на Hind фрагмента. По- нататъшното съгласуване на 141 bp Sau3A фрагмента дава още от ДНК последователността на PGK промотора (фиг. 12).

Посредством стандартни методи (Crea et al., Nucleic Acids Res. 8, 2331 (1980) ), е синтезиран синтетичен олигонуклеотид c последователност 5' ATTTGTTGTAAA 3'. 100 ng от този праймер се маркира при 5' края с помощта на 10 единици Ш4 полинуклеотид киназа в 20 ul реакция, съдържаща също 200 pCi [ γ^{32 32} - Р] АТф. Този маркиран праймерен разтвор се използва в реакция за възстановяване на праймера, създадена като първи етап в многоетапен процес за включване на EcoRI рестрикционен сайт в PGK 5' -фланкираща ДНК, предшевстваща PGK последователността на

структурния ген.

100 pg рВ1 (20) се разгражда напълно с НаеШ, след което се пропуска през 6 процентен полиакриламиден гел. Горната ивица на оцветения с етидиум гел (съдържащ PGK промоторен регион) се изолира чрез електроелуация както е описано по- горе. Тази част от ДНК, състояща се от 1200 Ьр НаеШ, се рестриктира с Hindi, след което се пропуска през 6 процентен акриламиден гел. Ивицата от 650 Ьр се изолира чрез електроелуиране. 5 pg от ДНК се изолират, след което тази 650 bp HaeIII-toHincII част от ДНК се ресуспендира в 20 μΐ Н₂ О и се смесва с 20 μΐ от фосфорилирания праймерен разтвор, описан по- горе. Тази смес се екстрахира еднократно с фенол- хлороформ, след което се преципитира с етанол. Сухата ДНК се ресуспендира в 50 μΐ Н₂ О и се нагрява във вряща вода за седем минути. След това този разтвор бързо се охлажда в суха леденоетанолна баня (10-20 секунди) и се прехвърля в ледена водна баня. Към този разтвор се добавят 50 μΐ от 10 х ДНК полимераза I буфер (Boeringer Mannheim), 10 μΐ от доведения до 2.5 мМ разтвор от всеки дезоксинуклеозид трифосфат ( dATP, dTTP, dGTP и dCTP), 25 μΐ Η₂ Ο и 5 единици ДНК полимераза I, Klenow fragment. Тази 100 μΐ реакция се инкубира при 37°С за 4 часа. Разтворът след това се екстрахира 1х фенол-хлороформ, преципитира се с етанол, изсушава се чрез лиофилизация и се подлага на рестрикция до изчерпване с 10 единици Sau3A. Този разтвор след това се пропуска през 6 процентен акриламиден гел. Ивицата, съответстваща на 39 Ьр по размер, се изрязва от гела и се изолира чрез електроелуация, описана по-горе. Тази 39 Ьр ивица има един сляп край и един Sau3A леплив край. Този фрагмент се клонира в модифициран pFIF trp 69 вектор (5). 10 gg от pFIF trp 69 се линеализират с Xbal, екстрахират се 1 х с фенол- хлороформ , след което се преципитират с етанол. Xbal лепливият край се запълва с помощта на ДНК полимераза I Klenfow fragment в 50 gl реакция, съдържаща 250 μΜ във всеки нуклеозид трифосфат. Тази ДНК се срязва с BamHI, след това се пропуска през 6 процента акриламиден гел. Векторният фрагмент се изолира от гела чрез електроелуация и след това се ресуспендира в 20 gl Н_г О. 20 ng от този вектор се лигатира с 20 ng от 39 Ьр фрагмента, изготвен както е посочено погоре за 4 часа при стайна температура. Една пета от лигационната смес се използва за трансформиране на Е. coli щам 294 в ампицилиново резистентен (върху LB + 20 gg/ml ампицилинови плаки). Плазмидите от трансформантите се изпитват посредством метода на бързото екраниране (44). Един плазмид pPGK-39 е избран за секвенционен анализ. 20 gg от този плазмид се разгражда с Xbal, преципитира се с етанол и след това се подлага на въздействие със 100 единици бактериална алкална фосатаза при 68°С за 48 мин. След това ДНК се екстрахира трикратно с фенол- хлороформ и се преципитира с с етанол. Дефосфорилираните краища след това се маркират в 20 gl реакционна смес, съдържаща 200 gCi [ γ³²-Ρ] АТф и 10 единици Т4 полинуклеотид киназа. Плазмидът се срязва със Sall и се пропуска през 6 процентен акриламиден гел.

Маркираната инсерционна ивица се изолира от гела и се съгласува по метода на химично разграждане (52). ДНК последователносттта при 3'-края от тази промоторна част е такава, каквато се очаква да бъде.

2. Конструиране на 321 bp PvuI-to-EcoRI PGK промоторен фрагмент gg pPGK-39 (фиг. 13) се разгражда едновремнно със Sall и Xbal ( 5 единици всеки ) и след това се подлагат на електрофореза върху 6 процентен полиакриламиден гел. Ивицата с 390 Ьр, представляваща 39 Ьр промоторната част се изолира чрез електроелуация. Ресуспендираната ДНК се подлага на рестрикция със Sau3A, след това се подлага на електрофореза върху 8 процентен акриламиден гел. 39 bp PGK промоторната ивица се изолира чрез електроелуация. Тази ДНК съдържа 39 Ьр от 5' - края на PGK промотора от Sau3A-to-XbaI фрагмента.

pg от рВ1 се рестриктират с Pvul и ΚρηΙ, след което се подлагат на електрофореза върху 6 процентен акриламиден гел. 0.8 kbp ивица от ДНК се изолират чрез електроелуиране, след това се рестриктират със Sau3A и се подлагат на електрофореза върху 6 процентен акриламиден гел. Ивицата с 265 Ьр от PGK промотора (фиг. И) се изолира чрез електроелуиране.

След това ДНК се лигатира с 39 Ьр промоторния фрагмент от по-горе за 2 часа при стайна температура. Лигаторната смес се рестриктира с Ха1 и Pvul, след което се подлага на електрофореза в 6 процентен акриламиден гел. Xba - to - Pvul рестрикционният фрагмент с размер 312 Ьр се изолира чрез електроелуиране, след това се добавя към лигаторната смес, съдържаща 200 ng pBR322 (41) ( изолирана по-рано, пропускайки 162 bp Pvul -to - PstI рестрикционния фрагмент) и 200 ng Xbal- to - PstI LelF А сДНК гена, изолиран от 20 pg pLelF trp A 25. Тази трикомпонентна лигаторна смес се използва за трансформиране на Е. coli щам 294 в щам, резистентен на тетрациклин. Трансформираните клонове се подлагат на мини скрининг (44) и една от колониите, PGK-300 се изолира като притежаваща 304 bp PGK 5'фланкираща ДНК, слята с LelF А гена в pBR322 основния вектор. 5-краят на LelF А гена притежава следната последователност : 5' - CTAGAATTC-3'. Така фузията на XbdI сайта от PGK промоторния фрагмент в тази последователност позволява добавянето към Xbal сайта на един EcoRl сайт. Така pPGK - 300 съдържа част от PGK промотора, изолиран в Pvul - to EcoRl фрагмента.

3. Конструиране на 1500 bp EcoRI - to - EcoRI PGK промоторен фрагмент pg pBl се разгражда c Pvul и EcoRI и се пропуска през 6 процентен акриламиден гел. 1.3 kb Pvul - to - EcoRI ивицата ДНК от PGK 5' фланкиращата ДНК се изолира посредством електроелуиране. 10 pg pPGK300 се разгражда с EcoRI и Pvul и 312 bp промоторният фрагмент се изолира чрез електроелуация след електрофореза на разградената смес в 6 процентен акриламиден гел. 5 pg от pFRL4 се срязва с EcoRI, преципитира се с етанол и се третира с бактериална алкална фосфатаза при 68°С за 45 минути. След три екстракции на ДНК с фенол/хлороформ, преципитиране с етанол и ресуспендиране в 20 ml Н₂ О, 200 ng от вектора се лигатират със 100 ng от 312 bp EcoRI - to - Pvul ДНК от pPGK - 300 и 100 ng EcoRI - to - Pvul ДНК от ' pBl. Лигаторната смес се използва за трансформиране на Е. coli щам 294 в ампицилиново резистентен. Един от получените трансформанти е pPGK 1500. Този плазмид съдържа 1500 bp PGK промоторен фрагмент като EcoRI to - EcoRI или Hindlll - to - EcoRI част от ДНК.

pg pPGK - 1500 се разграждат напълно с Clal и EcoRI,след което разградената смес се подлага на електрофореза върху 6 процентен акриламиден гел. Фрагментът с размер 900 Ьр, съдържащ PGK промотора,се изолира чрез електроелуиране. 10 pg pIFN - γ trp 48 се разгражда напълно с EcoRI и Hindi и се подлага на електрофореза върху 6 процентен акриламиден гел. Ивицата от 900 Ьр, съдържаща директно експресируемата IFN- γ сДНК, се изолира от гела чрез електроелуиране.

Дрождевият експресионен вектор се изолира в трифакторна реакция чрез лигатиране заедно на PGK промоторния фрагмент ( в Clal - to - EcoRI част), делетирания ί pFRM - 31 и изолираната по-горе IFN-γ ДНК. Реакционната смес се инкубира на 14°С за 12 часа, след което се използва за трансормиране на Е. coli щам 294 в ампицилиново резистентен. Трансформантите се анализират за присъствие на действително конструиран експресионен плазмид , pPGK - IFN- γ (фиг. 16). Плазмидите, съдържащи експресионни системи,се използват за трансформиране на сферопласти на дрождевия щам RH218 в триптофаново прототрофен при култивиране върху агар в отсъствие на триптофан. След това тези рекомбинантни дрожди се изпитват за присъствие на рекомбинантен човешки интерферон.

Дрождевите екстракти се получават по следния начин : 10 милилитрови култури се отглеждат в YNB+CAA до достигане на А₆₆₀= 1-2, събират се чрез центрофугиране и след това се ресуспендират в 500 μΐ PBS буфер (20 mM NaH₂ РО₄, pH = 7.4, 150 тМ NaCl). Добавя се еднакво количество стъклени топчета и сместа след това се бърка за 2'. Екстрактите се завъртат 30 сек. при 14000 грш и супернатантите се отстраняват . Интерфероновата активност в супернатантата се определя като 16 000 единици/ml посредством сравняване с IFN- а стандарт с помощта на СРЕ инхибиторни проби.

М. Конструиране на клетъчно културален вектор pSVy69

Hindlll-PvuII фрагментът, състоящ се от 342 двойки бази и обхващащ SV40 източника, се превръща в един EcoRI сайт рестрикционен свързващ фрагмент. Hindlll сайтът се превръща чрез добавяне на синтетичен олигомер (5' dAGCTGAATTC), a PvuII сайтът се превръща чрез свързване на слепите краища запълнени в EcoRI сайта с помощта на полимераза I ( Klenow fragment) . Полученият в резултат EcoRI фрагмент се инсертира в EcoRI сайта от pML-1 (28). Плазмид със SV40 късен промотор, ориентиран нагоре от amp* гена,по- нататък се модифицира чрез отстраняване на EcoRI сайта, който е най-близо до amp* гена на pML- 1 (28).

Изолира се Hpal- Bglll фрагментът от клонираната HBV ДНК, състоящ се от 1023 двойки бази (60) и Hpal сайтът от вируса на хепатит В (HBV) се превръща при един EcoRl сайт със синтетичен олигомер (5' dGCGAATTCGC). Този EcoRl - Bglll свързан фрагмент се клонира директно в EcoRl- BamHI сайтове от плазмида, описан по-горе, носещ източника на SV40.

В останалия EcoRl сайт се инсертира IFN-y ген върху 1250 двойки бази PstI фрагмент на р69 след превръщане на PstI краищата в EcoRl краища.Изолирани са клонове, в които SV40 късният промотор предшевства структурния ген на IFN- у. Получените в резултат плазмиди след това се въвеждат в клетки на тъканни култури (29) с помощта на DEAEдекстрановата техника (61) модифицирана така, че трансфекцията в присъствие на DEAE- декстран се провежда за 8 часа. Клетъчната среда се сменя на всеки 2-3 дни. Всеки ден се взимат по 200 микролитра за изследване. Типичният добив възлиза на 50-100 единици/ml за пробите, взети три или четири дни след началото на трансфекцията.

В продукта на трансфекция отсъства CYS-TYR-CYS N-крайна част на рекомбинантния човеки имунен интерферон (сравни фиг. 5), подкепяйки появяването на сигнално пептидно разграждане при CYS-GLN връзката (амино киселини 3 и 4 на фиг. 5), така че зрелият олипептид фактически се състои от 143 амино киселини.

N. Частично пречистване на des-CYS-TYR-CYS рекомбинантен човешки имунен интерферон

За получаване на по-голямо количество от des-CYS-TYR-CYS рекомбинантен човешки имунен интерферон, пресен монослой от COS-7 клетки от десет 10 cm плаки се трансектират с общо 30 pg pDLIF в 110 mis

DEAE-Dextran 500 000 MW, 0.05M Tris pH 7.5 в DMEM). След 16 часа при 37°C, плаките се промиват с DMEM. Към всяка плака се добавят 15 mis прясна DMEM, заместена с 10 процента f.b.s., 2mM глутамин, 50 μ/ml пеницилин G и 50 mg/ml стрептомицин. На следващия ден средата се замества с DMEM, свободен от серум. Прясна среда се добавя всеки ден. Събраната среда се пази на 4°С до следващото изпитване или свързване с CPG. Установено е, че фракциите от 3-4 дневни трансфекционни проби съдържат по същество цялата активност.

0.5 g CPG ( Electronucleics, CPG 350, размер на порите 120/200 ) се добавят към 100 ml клетъчна супернатанта и сместа се разбърква за 3 часа при 4°С. След кратко центрофугиране в настолна центрофуга, топчетата се поставят в колона и внимателно се промиват с 20 mM NaPO₄ IM NaCl 0.1 процента β- меркаптоетанол pH 7.2. Активността след това се елуира със същия буфер, съдържащ 30 процента етиленгликол, последвано от понататъшно елуиране с горния буфер, съдържащ 50 процента етиленгликол. По същество цялата активност се свързва с CPG. 75 процента от елуираната активност е установена във фракциите, елуирани с 30 процента етиленгликол. Тези фракции се отливат и се разреждат с 20 mM NaPO₄ IM NaCl pH 7.2 до

крайна концентрация от 10 процента етиленгликол и директно се прилагат към 10 ml Con A Sefarosa ( Pharmacia) колона. След старателно промиване с 20 mM NaPO₄ IM NaCl pH 7.2 активността се елуира с 20 mM NaPO₄ 1М NaCl 0.2М а- метил- D- манозид. Съществено количество от активността (55 процента) не се свързва с лектин. 45 процента от активността се елуира с а метил-D- манозид.

ФАРМАЦЕВТИЧНИ СЪСТАВИ .:.- '.ίΛί«9ώα·ϊ-»»&4*Μ->·.ζ

.. .

Съединенията съгласно настоящето изобретение могат да бъдат формулирани съгласно известни методи за получаване на фармацевтично приложими състави, в които човешкият имунен интерферон е комбиниран в смес с подходящи във фармацевтично отношение носещи средства. Подходящи средства и техните форми са описани в Remington's Pharmaceutical Sciences от E.W. Martin, вкючена в литературната справка. Такива състави съдържат ефективно количество от интерфероновия протеин, заедно с подходящо количество средства за приготвяне на фармацевтично подходящи състави, удобни за използване от пациента.

А. Парентерално въвеждане

Човешкият имунен интерферон от изобретението може да бъде въвеждан парентерално на пациенти, нуждаещи се от антитуморно или антивирусно лечение, както и на такива с имуносупресивни състояния. Дозите и количествата им могат да бъдат такива, каквито се използват напоследък при клинични изследвания на други човешки интерфери, като напр. около (ΙΙΟ) χ 10⁶ единици дневно, и в случаите на материали с чистота по-висока от 1 процент, или до 1 процент, до 50 χ 10⁶ дневно. Дозите на IFN - у могат да бъдат повишени за по-голям ефект благодарение на липсата по същество на човешки протеини различни от ΙΙΝ-γ, които протеини в получени от човека материали могат да индуцират същински противоположен ефект.

Като пример за подходящи дози за хомогенен по същество IFN-y за парентерална форма на приложение, 3 mg IFN-y със специфична активност от, напр. 2х10⁸ U/mg се разтварят в 25 ml 5N серумен албумин (човешки) USP, разтворът се прекарва през бактериологичен филтър и полученият филтриран разтвор се разпределя асептично в 100 епруветки, всяка от които съдържаща 6 χ 10⁶ единици чист интерферон, подходящ за парентерално въвеждане. Епруветките се съхраняват за предпочитане на студено (-20°С ) до употреба.

ДАННИ ОТ БИОЛОГИЧНИ ИЗСЛЕДВАНИЯ

А. Охарактеризиране на антивирусната активност

За неутрализиране на антителата, пробите се неутрализират, ако е необходимо, до концентрация 500 - 1000 единици/ml с PBS - BSA. Еднакви обеми от пробата се инкубират за 2-12 часа при 4° при серийни разреждания на плъши античовешки лимфоцити, фибробласти или имуноинтерферонов антисерум. Анти- IFN- а и β са получени от National Institut of Allergy and Infectious Diseases. Анти- IFN- γ се получава c помощта на автентичен IFN-γ (520 процента чистота), пречистени от стимулирани лимфоцити от периферна кръв. Пробите се центрофугират 3 минути при 12 ОООх g за 3 мин преди изследването. За тестуване на pH стабилността, пробите се довеждат до pH 2 чрез добавяне на IN НС1, инкубират се за 2-12 часа при 4° и се неутрализират чрез добавяне на 1 N NaOH преди изпитването. За тестуване на чувствителността на натриев додецилсулфат (SDS), пробите се инкубират с еднакъв обем от 0.2 процента SDS за 2-12 часа при 4°С преди изпитването.

В. Охарактеризиране на IFN- γ, получени от Е. coli и COS-7 клетки АнтиВирусна активност ( единици/ ml)

Е. coli

W3110/ COS-7 кл/

Третиране	IFN-a	IFN-β	IFN -γ	pIFN-ytrp48 екстракт	pSVy69 супернатанта
нетретирани	375	125	250	250	62.5
pH 2	375	125	<6	<12	<4

0.1% SDS	375	-	<4	< 8	-
Заешки анти-	<8	125	250	250	187
IFN-a
Заешки анти-	375	<8	187	250	125
IFN-β
Заешки анти-	375	125	<4	<8	<4

IFN-γ

Таблицата показва характерното поведение на IFN-α, β и γ стандарти след различни третирания. Интерфероновата активност, получена от Е. coli W3110/pIFN-y trp 48 и от COS-7/pSVy69 е киселинно-чувствителна, SDSчувствителна и се неутрализира от антитела срещу IFN-a или β. Тези данни потвърждават, че продуктите,получени с тези системи,са имуно интерферони и че сДНК инсертите на плазмид р69 кодира IFN- γ.

Имуноинтерфероновият протеин от изобретението е определен чрез определяне на ДНК гена и дедуктивното съгласуване на амино киселинните виж фиг. 5. Става ясно, че за този специален интерферон съществуват природни алелни варианции, проявяващи се от един индивид в друг . Тези вариации могат да бъдат демонстрирани чрез (една) амино киселинна разлика (ки) в цялата последователност или чрез делеции, замествания, инсерции, инверсии или добавяния на (една) амино киселина (и) в посочената последователност. Всички подобни алелни вариации са включени в рамките на обхвата на изобретението.

Представените предпочитани варианти на изпълнение следва да се приемат като създадени само да илюстрират настоящето изобретение, без да го ограничават повече от законния му обхват съобразно изложените по-долу патентни претенции.

ЛИТЕРАТУРА:

1. Goeddel et Nature 287,411 (1980).

2. Goeddel et al., Nature 290, 20 (1981).

3. Yelwerton et al., Nucleic Acids Research 9, 731 (1981).

4. Gutterman et al., Annals oflnt. Med. 93, 399 (1980).

5. Goeddel et all., Nucleic Acids Research 8, 4057 (1980).

6. Yip et all., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 78, 1601 (1981).

7. Taniguchi et all., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 78, 3469 (1981).

8. Bloom, Nature 289, 593 (1980).

9. Sonnenfeld et all., Cellular Immunol. 40, 285 (1978).

10. Fleishmann et all., Infection and Immunity 26, 248 (1979).

11. Blalock et all., Cellular Immunology 49, 390 (1980).

12. Rudin et all., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 77, 5928 (1980).

13. Crane et all., J. Natl. Cancer Inst. 61, 871 (1978).

14. Stinchcomb et all., Nature 282, 39 (1979).

15. Kingsman et all., Gene Ί, 141 (1979).

16. Tschumper et all., Gene 10,157 (1980).

17. Mortimer et all., Microbiological Reviews 44, 519 (1980).

18. Miozzari et all., Journal of Bacteriology 134, 48 (1978).

19. Jones, Genetics 85, 23 (1977).

20. Hitzeman, et all., J. Biol. Chem. 255, 12073 (1980).

21. Hess et all., J. Adv. Enzime Regul. 7, 149 (1968).

22. Holland et all., Biochemistry Yl, 4900 (1978).

23. Bostian et all., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 77, 4504 (1980).

24. The Molecular Biology of Yeast (Aug. 11-18, 1981), Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y.

25. Chambon, Ann. Rev. Biochemistry, 44 613 (1975).

25a. Gluzman, Cell 23, 175 (1981)

26. Goeddel et all. Nature 281, 544 (1979).

27. Itacura et all, Sciencel98, 1056 (1977).

28. Lusky et all. Nature 293, 79 (1981).

29. Gluzman et all. Cold Spring Harbor Symp. Qant. Biol. 44, 293 (1980).

30. Fiers et all. Nature 273, 113 (1978).

31. Reddy et all. Science 200, 494 (1978).

32. Boedtker et all. Prog, in Nucleic Acids Res. Mol. Biol. 19, 253 (1976).

33. Berger et al. Biochemistry 18, 5143 (1979).

34. Aviv et al. Proc Natl. Acad. Sci. USA 69, 1408 (1972).

35. Gurdon et al, J. Molec. Biol. 80, 539 (1975).

36. Stewart, The Interferon System. Springer, N.Y, p. 13-26 (1979).

37. Lehrach et al. Biochemistry 16, 4743 (1977).

38. Lynch et al. Virology 98, 251 (1979).

39. Wickens et al, J. Biol. Chem. 253, 2483 (1978).

40. Chang et al. Nature 275, 617 (1978).

41. Bolivar et al. Gene 2, 95 (1977).

42. Grunstein et al. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 72, 3961 (1975).

43. Fritsch et al. Cell 19, 959 (1980).

44. Birnboim et al. Nucleic Acids Res. 7, 1513 (1979).

45. Kafatos et al. Nucleic Acids Res. 7,1541 (1979).

46. Clewell et al. Biochemistry 9, 4428 (1970).

47. Taylor et al, Biochim. Biophys. Acta 442, 324 (1976).

48. Smith, Methods Enzymol. 65, 560 (1980).

49. Messing et al. Nucleic Acids Res. 9, 309 (1981).

50. Winzler, Hormonal Proteins and Peptides (ed. Li)

Academic Press, New York, p.l (1973).

51. Nathan et al., Nature 292, 842 (1981).

52. Maxam et al., Methods in Enzymol. 65, 490 (1980).

53. Crea et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 75, 5765 (1978).

54. Southern, J. Molec. Biol. 98, 503 (1975).

55. Blin et al., Nucleic Acids Res. 3, 2303 (1976).

56. Lawn et al., Science 212, 1159 (1981).

57. Lawn et al., Nucleic Acids Res. 9, 1045 (1981).

58. Miller, Experiments in Molecular Genetics, p. 431-3, Cold Spring Harbor, N.Y. (1972).

59. Beggs, Nature 275, 104 (1978).

60. Valenzuella et al., Animal Virus Genetics (ed. Fields, Jaenisch and Fox), p. 57 , Academic Press, New York (1980).

61. McCutthan et al., J. Natl. Cancer Inst. 41, 351 (1968).

Claims (2)

1. ПАТЕНТНИ ПРЕТЕНЦИИ

   1. Метод за получаване на репликативно експресионно средство, способно да експресира полипептид в трансформиран микроорганизъм или клетъчна култура, който да включва амино киселинната последователност des-CYS-TYR-CYS на рекомбинантен човешки имунен интерферон, състоящ се от конструиране на първата ДНК последователност, кодираща този полипептид и оперативно свързване на тази първа ДНК последователност с втора ДНК последователност, способна да предизвика експресия на тази първа ДНК последователност.
2. 2. Метод за получаване на репликативно експресионно средство, способно да експресира полипептид в трансформиран микроорганизъм или клетъчна култура, който да включва амино киселинната последователност на рекомбинантен човешки имунен интерферон, състоящ се от конструиране на първата ДНК последователност, кодираща този полипептид и оперативното й свързване с втора ДНК последователност, способна да предизвика експресия на посочената първа ДНК последователност.