BG60888B2 - Човешки имунен интерферон - Google Patents
Човешки имунен интерферон Download PDFInfo
- Publication number
- BG60888B2 BG60888B2 BG098388A BG9838894A BG60888B2 BG 60888 B2 BG60888 B2 BG 60888B2 BG 098388 A BG098388 A BG 098388A BG 9838894 A BG9838894 A BG 9838894A BG 60888 B2 BG60888 B2 BG 60888B2
- Authority
- BG
- Bulgaria
- Prior art keywords
- lys
- dna
- gene
- interferon
- ser
- Prior art date
Links
- 101000599940 Homo sapiens Interferon gamma Proteins 0.000 title claims abstract description 44
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 35
- 102000014150 Interferons Human genes 0.000 claims abstract description 29
- 108010050904 Interferons Proteins 0.000 claims abstract description 29
- 229940079322 interferon Drugs 0.000 claims abstract description 18
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 89
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 claims description 43
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 claims description 38
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 15
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims description 14
- 230000000840 anti-viral effect Effects 0.000 claims description 12
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 12
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 11
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 11
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 11
- 238000011282 treatment Methods 0.000 claims description 10
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 6
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 6
- 230000000259 anti-tumor effect Effects 0.000 claims description 6
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 claims description 6
- 238000011160 research Methods 0.000 claims description 6
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 claims description 5
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 claims description 4
- 241000700605 Viruses Species 0.000 claims description 4
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 claims description 4
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 claims description 3
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims description 3
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 claims description 3
- RAQMSGVCGSJKCL-FOHZUACHSA-N Asn-Gly-Thr Chemical compound C[C@@H](O)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O RAQMSGVCGSJKCL-FOHZUACHSA-N 0.000 claims description 2
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 claims description 2
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 claims description 2
- 230000002906 microbiologic effect Effects 0.000 claims description 2
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 claims 2
- YYAVDNKUWLAFCV-ACZMJKKPSA-N Ala-Ser-Gln Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(O)=O YYAVDNKUWLAFCV-ACZMJKKPSA-N 0.000 claims 1
- HZPSDHRYYIORKR-WHFBIAKZSA-N Asn-Ala-Gly Chemical compound OC(=O)CNC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O HZPSDHRYYIORKR-WHFBIAKZSA-N 0.000 claims 1
- JFOKLAPFYCTNHW-SRVKXCTJSA-N Gln-Arg-Lys Chemical compound C(CCN)C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)NC(=O)[C@H](CCC(=O)N)N JFOKLAPFYCTNHW-SRVKXCTJSA-N 0.000 claims 1
- FALJZCPMTGJOHX-SRVKXCTJSA-N Gln-Met-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O FALJZCPMTGJOHX-SRVKXCTJSA-N 0.000 claims 1
- GJLXZITZLUUXMJ-NHCYSSNCSA-N Gln-Val-Met Chemical compound CC(C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCC(=O)N)N GJLXZITZLUUXMJ-NHCYSSNCSA-N 0.000 claims 1
- LKDIBBOKUAASNP-FXQIFTODSA-N Glu-Ala-Glu Chemical compound OC(=O)CC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O LKDIBBOKUAASNP-FXQIFTODSA-N 0.000 claims 1
- KFKWRHQBZQICHA-STQMWFEESA-N L-leucyl-L-phenylalanine Natural products CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 KFKWRHQBZQICHA-STQMWFEESA-N 0.000 claims 1
- GQUDMNDPQTXZRV-DCAQKATOSA-N Lys-Arg-Asp Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O GQUDMNDPQTXZRV-DCAQKATOSA-N 0.000 claims 1
- JBRWKVANRYPCAF-XIRDDKMYSA-N Lys-Asn-Trp Chemical compound C1=CC=C2C(=C1)C(=CN2)C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)N)NC(=O)[C@H](CCCCN)N JBRWKVANRYPCAF-XIRDDKMYSA-N 0.000 claims 1
- QUYCUALODHJQLK-CIUDSAMLSA-N Lys-Asp-Asp Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O QUYCUALODHJQLK-CIUDSAMLSA-N 0.000 claims 1
- CBNMHRCLYBJIIZ-XUXIUFHCSA-N Lys-Ile-Met Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCCCN)N CBNMHRCLYBJIIZ-XUXIUFHCSA-N 0.000 claims 1
- XWYUBUYQMOUFRQ-IFFSRLJSSA-N Val-Glu-Thr Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCC(=O)O)NC(=O)[C@H](C(C)C)N)O XWYUBUYQMOUFRQ-IFFSRLJSSA-N 0.000 claims 1
- HPANGHISDXDUQY-ULQDDVLXSA-N Val-Lys-Phe Chemical compound CC(C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)O)N HPANGHISDXDUQY-ULQDDVLXSA-N 0.000 claims 1
- 108010040443 aspartyl-aspartic acid Proteins 0.000 claims 1
- 230000003054 hormonal effect Effects 0.000 claims 1
- 230000036039 immunity Effects 0.000 claims 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 claims 1
- 108010044056 leucyl-phenylalanine Proteins 0.000 claims 1
- 108010044348 lysyl-glutamyl-aspartic acid Proteins 0.000 claims 1
- 108700023046 methionyl-leucyl-phenylalanine Proteins 0.000 claims 1
- 108010073025 phenylalanylphenylalanine Proteins 0.000 claims 1
- 238000012552 review Methods 0.000 claims 1
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 abstract description 65
- 108010074328 Interferon-gamma Proteins 0.000 abstract description 49
- 102000008070 Interferon-gamma Human genes 0.000 abstract description 18
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 abstract description 12
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 abstract description 8
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 abstract description 8
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 abstract description 4
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 abstract 1
- 230000000704 physical effect Effects 0.000 abstract 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 59
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 56
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 45
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 42
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 41
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 38
- 238000010804 cDNA synthesis Methods 0.000 description 38
- 235000014680 Saccharomyces cerevisiae Nutrition 0.000 description 37
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 33
- 102000011755 Phosphoglycerate Kinase Human genes 0.000 description 32
- 101001099217 Thermotoga maritima (strain ATCC 43589 / DSM 3109 / JCM 10099 / NBRC 100826 / MSB8) Triosephosphate isomerase Proteins 0.000 description 32
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 32
- 102100037850 Interferon gamma Human genes 0.000 description 29
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 24
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 24
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 22
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 22
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 22
- 239000000047 product Substances 0.000 description 21
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 20
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 19
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 19
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 18
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 18
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 17
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 15
- HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N Acrylamide Chemical compound NC(=O)C=C HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 14
- 108020005029 5' Flanking Region Proteins 0.000 description 13
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 13
- LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N Ethylene glycol Chemical compound OCCO LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 12
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 12
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 12
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 11
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 11
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 11
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 11
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 11
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 10
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 10
- 229940047124 interferons Drugs 0.000 description 10
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 10
- 102000004594 DNA Polymerase I Human genes 0.000 description 9
- 108010017826 DNA Polymerase I Proteins 0.000 description 9
- 102000006992 Interferon-alpha Human genes 0.000 description 9
- 108010047761 Interferon-alpha Proteins 0.000 description 9
- 108090000467 Interferon-beta Proteins 0.000 description 9
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 9
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 9
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 9
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 9
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 9
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 9
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 9
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 9
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 8
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 8
- 239000004098 Tetracycline Substances 0.000 description 7
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 7
- OHDXDNUPVVYWOV-UHFFFAOYSA-N n-methyl-1-(2-naphthalen-1-ylsulfanylphenyl)methanamine Chemical compound CNCC1=CC=CC=C1SC1=CC=CC2=CC=CC=C12 OHDXDNUPVVYWOV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N phenol group Chemical group C1(=CC=CC=C1)O ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 7
- 229960002180 tetracycline Drugs 0.000 description 7
- 229930101283 tetracycline Natural products 0.000 description 7
- 235000019364 tetracycline Nutrition 0.000 description 7
- 150000003522 tetracyclines Chemical class 0.000 description 7
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 7
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 7
- 102100026720 Interferon beta Human genes 0.000 description 6
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 6
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 6
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 6
- YTRQFSDWAXHJCC-UHFFFAOYSA-N chloroform;phenol Chemical compound ClC(Cl)Cl.OC1=CC=CC=C1 YTRQFSDWAXHJCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 6
- 239000000463 material Substances 0.000 description 6
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 6
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 6
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 6
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 6
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 6
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 6
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 5
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 5
- LEHOTFFKMJEONL-UHFFFAOYSA-N Uric Acid Chemical compound N1C(=O)NC(=O)C2=C1NC(=O)N2 LEHOTFFKMJEONL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- TVWHNULVHGKJHS-UHFFFAOYSA-N Uric acid Natural products N1C(=O)NC(=O)C2NC(=O)NC21 TVWHNULVHGKJHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 5
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 5
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 5
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 5
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 5
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 5
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 5
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 5
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 5
- 230000032258 transport Effects 0.000 description 5
- 229940116269 uric acid Drugs 0.000 description 5
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 5
- OSJPPGNTCRNQQC-UWTATZPHSA-N 3-phospho-D-glyceric acid Chemical compound OC(=O)[C@H](O)COP(O)(O)=O OSJPPGNTCRNQQC-UWTATZPHSA-N 0.000 description 4
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 4
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 4
- 108010042407 Endonucleases Proteins 0.000 description 4
- 102000004533 Endonucleases Human genes 0.000 description 4
- 241001646716 Escherichia coli K-12 Species 0.000 description 4
- ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N Formamide Chemical compound NC=O ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241001460678 Napo <wasp> Species 0.000 description 4
- 238000002105 Southern blotting Methods 0.000 description 4
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 4
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 4
- 101150006914 TRP1 gene Proteins 0.000 description 4
- 108020004566 Transfer RNA Proteins 0.000 description 4
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 4
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 4
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 4
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 4
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 4
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 4
- 230000001506 immunosuppresive effect Effects 0.000 description 4
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 4
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 4
- 230000008569 process Effects 0.000 description 4
- 230000003362 replicative effect Effects 0.000 description 4
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 4
- 230000011664 signaling Effects 0.000 description 4
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 4
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 4
- 108020005065 3' Flanking Region Proteins 0.000 description 3
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 3
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 3
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 3
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 3
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 3
- 230000004543 DNA replication Effects 0.000 description 3
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 3
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 3
- 102000003996 Interferon-beta Human genes 0.000 description 3
- 108091092195 Intron Proteins 0.000 description 3
- 125000001429 N-terminal alpha-amino-acid group Chemical group 0.000 description 3
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 3
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 3
- 108010021757 Polynucleotide 5'-Hydroxyl-Kinase Proteins 0.000 description 3
- 102000008422 Polynucleotide 5'-hydroxyl-kinase Human genes 0.000 description 3
- 108091034057 RNA (poly(A)) Proteins 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 3
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 3
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 3
- 238000011161 development Methods 0.000 description 3
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 3
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 3
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 3
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 3
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 description 3
- 230000006870 function Effects 0.000 description 3
- 229940044627 gamma-interferon Drugs 0.000 description 3
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 3
- 230000004957 immunoregulator effect Effects 0.000 description 3
- 210000000287 oocyte Anatomy 0.000 description 3
- 238000007911 parenteral administration Methods 0.000 description 3
- 101150047627 pgk gene Proteins 0.000 description 3
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 3
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 3
- 108020004418 ribosomal RNA Proteins 0.000 description 3
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 3
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 3
- 239000001226 triphosphate Substances 0.000 description 3
- 235000011178 triphosphate Nutrition 0.000 description 3
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108020004463 18S ribosomal RNA Proteins 0.000 description 2
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000013563 Acid Phosphatase Human genes 0.000 description 2
- 108010051457 Acid Phosphatase Proteins 0.000 description 2
- 102000007698 Alcohol dehydrogenase Human genes 0.000 description 2
- 108010021809 Alcohol dehydrogenase Proteins 0.000 description 2
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 2
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 2
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 2
- 108020003215 DNA Probes Proteins 0.000 description 2
- 239000003298 DNA probe Substances 0.000 description 2
- 238000012270 DNA recombination Methods 0.000 description 2
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 2
- 241001302584 Escherichia coli str. K-12 substr. W3110 Species 0.000 description 2
- 102000005731 Glucose-6-phosphate isomerase Human genes 0.000 description 2
- 108010070600 Glucose-6-phosphate isomerase Proteins 0.000 description 2
- 241000700721 Hepatitis B virus Species 0.000 description 2
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 2
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 2
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 2
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 2
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 2
- 102000007562 Serum Albumin Human genes 0.000 description 2
- 108010071390 Serum Albumin Proteins 0.000 description 2
- 108091036066 Three prime untranslated region Proteins 0.000 description 2
- 241000251539 Vertebrata <Metazoa> Species 0.000 description 2
- 241000711975 Vesicular stomatitis virus Species 0.000 description 2
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 description 2
- 241000269368 Xenopus laevis Species 0.000 description 2
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 2
- 239000000853 adhesive Substances 0.000 description 2
- 230000001070 adhesive effect Effects 0.000 description 2
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 2
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 2
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 2
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 2
- 244000309466 calf Species 0.000 description 2
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 2
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 2
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 2
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 2
- 230000000120 cytopathologic effect Effects 0.000 description 2
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 2
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 2
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 2
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 2
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 102000006602 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Human genes 0.000 description 2
- 108020004445 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Proteins 0.000 description 2
- 230000002414 glycolytic effect Effects 0.000 description 2
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 2
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 2
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 2
- -1 isocytochrome c Proteins 0.000 description 2
- 230000003211 malignant effect Effects 0.000 description 2
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000002297 mitogenic effect Effects 0.000 description 2
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 description 2
- 210000005105 peripheral blood lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 2
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 2
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 2
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 2
- UNXRWKVEANCORM-UHFFFAOYSA-N triphosphoric acid Chemical compound OP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O UNXRWKVEANCORM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 2
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 2
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 2
- PLVPPLCLBIEYEA-WAYWQWQTSA-N (z)-3-(1h-indol-3-yl)prop-2-enoic acid Chemical compound C1=CC=C2C(\C=C/C(=O)O)=CNC2=C1 PLVPPLCLBIEYEA-WAYWQWQTSA-N 0.000 description 1
- GZCWLCBFPRFLKL-UHFFFAOYSA-N 1-prop-2-ynoxypropan-2-ol Chemical compound CC(O)COCC#C GZCWLCBFPRFLKL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100030310 5,6-dihydroxyindole-2-carboxylic acid oxidase Human genes 0.000 description 1
- 101710163881 5,6-dihydroxyindole-2-carboxylic acid oxidase Proteins 0.000 description 1
- GVUOPSNMFBICMM-UHFFFAOYSA-N 5-bromo-6-morpholin-4-yl-1h-pyrimidine-2,4-dione Chemical compound OC1=NC(O)=C(Br)C(N2CCOCC2)=N1 GVUOPSNMFBICMM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229930024421 Adenine Natural products 0.000 description 1
- GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N Adenine Chemical compound NC1=NC=NC2=C1N=CN2 GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100039986 Apoptosis inhibitor 5 Human genes 0.000 description 1
- DPWDPEVGACCWTC-SRVKXCTJSA-N Asn-Tyr-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O DPWDPEVGACCWTC-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101100427060 Bacillus spizizenii (strain ATCC 23059 / NRRL B-14472 / W23) thyA1 gene Proteins 0.000 description 1
- 244000063299 Bacillus subtilis Species 0.000 description 1
- 235000014469 Bacillus subtilis Nutrition 0.000 description 1
- 0 CC*(CCC=C1C[C@](CC=*C)*(C)C1)CCC=N* Chemical compound CC*(CCC=C1C[C@](CC=*C)*(C)C1)CCC=N* 0.000 description 1
- CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N Carbon dioxide Chemical compound O=C=O CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 description 1
- 108010062580 Concanavalin A Proteins 0.000 description 1
- YHDXIZKDOIWPBW-WHFBIAKZSA-N Cys-Gln Chemical compound SC[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(N)=O YHDXIZKDOIWPBW-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- JIZRUFJGHPIYPS-SRVKXCTJSA-N Cys-Tyr-Cys Chemical compound C1=CC(=CC=C1C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CS)N)O JIZRUFJGHPIYPS-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 1
- 238000007400 DNA extraction Methods 0.000 description 1
- 108010008286 DNA nucleotidylexotransferase Proteins 0.000 description 1
- 102000004163 DNA-directed RNA polymerases Human genes 0.000 description 1
- 108090000626 DNA-directed RNA polymerases Proteins 0.000 description 1
- 108090000204 Dipeptidase 1 Proteins 0.000 description 1
- 241000588921 Enterobacteriaceae Species 0.000 description 1
- 241001522878 Escherichia coli B Species 0.000 description 1
- 101000867232 Escherichia coli Heat-stable enterotoxin II Proteins 0.000 description 1
- 101100153154 Escherichia phage T5 thy gene Proteins 0.000 description 1
- QTANTQQOYSUMLC-UHFFFAOYSA-O Ethidium cation Chemical compound C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CC)=C1C1=CC=CC=C1 QTANTQQOYSUMLC-UHFFFAOYSA-O 0.000 description 1
- 108091029865 Exogenous DNA Proteins 0.000 description 1
- 208000034454 F12-related hereditary angioedema with normal C1Inh Diseases 0.000 description 1
- 108010001496 Galectin 2 Proteins 0.000 description 1
- 102100021735 Galectin-2 Human genes 0.000 description 1
- 108700039691 Genetic Promoter Regions Proteins 0.000 description 1
- 108700007698 Genetic Terminator Regions Proteins 0.000 description 1
- 102000030595 Glucokinase Human genes 0.000 description 1
- 108010021582 Glucokinase Proteins 0.000 description 1
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 1
- 102000005548 Hexokinase Human genes 0.000 description 1
- 108700040460 Hexokinases Proteins 0.000 description 1
- 101000959871 Homo sapiens Apoptosis inhibitor 5 Proteins 0.000 description 1
- 102000002265 Human Growth Hormone Human genes 0.000 description 1
- 108010000521 Human Growth Hormone Proteins 0.000 description 1
- 239000000854 Human Growth Hormone Substances 0.000 description 1
- 108090000144 Human Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000003839 Human Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010063296 Kinesin Proteins 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- 229930182816 L-glutamine Natural products 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N L-lysine Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 1
- 108090001090 Lectins Proteins 0.000 description 1
- 102000004856 Lectins Human genes 0.000 description 1
- 239000006137 Luria-Bertani broth Substances 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 1
- HLZORBMOISUNIV-DCAQKATOSA-N Met-Ser-Leu Chemical compound CSCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC(C)C HLZORBMOISUNIV-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 1
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 1
- 102000001105 Phosphofructokinases Human genes 0.000 description 1
- 108010069341 Phosphofructokinases Proteins 0.000 description 1
- 102000012288 Phosphopyruvate Hydratase Human genes 0.000 description 1
- 108010022181 Phosphopyruvate Hydratase Proteins 0.000 description 1
- 102000004203 Phosphoric Triester Hydrolases Human genes 0.000 description 1
- 108090000754 Phosphoric Triester Hydrolases Proteins 0.000 description 1
- 108091000080 Phosphotransferase Proteins 0.000 description 1
- 108010011939 Pyruvate Decarboxylase Proteins 0.000 description 1
- 102000017143 RNA Polymerase I Human genes 0.000 description 1
- 108010013845 RNA Polymerase I Proteins 0.000 description 1
- 102000009572 RNA Polymerase II Human genes 0.000 description 1
- 108010009460 RNA Polymerase II Proteins 0.000 description 1
- 102000014450 RNA Polymerase III Human genes 0.000 description 1
- 108010078067 RNA Polymerase III Proteins 0.000 description 1
- 230000007022 RNA scission Effects 0.000 description 1
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 1
- 101710141795 Ribonuclease inhibitor Proteins 0.000 description 1
- 229940122208 Ribonuclease inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 102100037968 Ribonuclease inhibitor Human genes 0.000 description 1
- 101100313751 Rickettsia conorii (strain ATCC VR-613 / Malish 7) thyX gene Proteins 0.000 description 1
- 101150014136 SUC2 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000293869 Salmonella enterica subsp. enterica serovar Typhimurium Species 0.000 description 1
- 241000607720 Serratia Species 0.000 description 1
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 1
- 244000261122 Torulopsis holmii Species 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- 108091023045 Untranslated Region Proteins 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 229960000643 adenine Drugs 0.000 description 1
- 230000007815 allergy Effects 0.000 description 1
- 210000001691 amnion Anatomy 0.000 description 1
- 230000002022 anti-cellular effect Effects 0.000 description 1
- 230000001028 anti-proliverative effect Effects 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 239000008346 aqueous phase Substances 0.000 description 1
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 1
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 230000000721 bacterilogical effect Effects 0.000 description 1
- 102000006635 beta-lactamase Human genes 0.000 description 1
- 230000000975 bioactive effect Effects 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 230000008827 biological function Effects 0.000 description 1
- 210000000601 blood cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000009835 boiling Methods 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 1
- 235000011089 carbon dioxide Nutrition 0.000 description 1
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 description 1
- 238000012832 cell culture technique Methods 0.000 description 1
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 1
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 1
- 238000002144 chemical decomposition reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003638 chemical reducing agent Substances 0.000 description 1
- 238000013375 chromatographic separation Methods 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 230000002759 chromosomal effect Effects 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 239000000356 contaminant Substances 0.000 description 1
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 1
- 108091092330 cytoplasmic RNA Proteins 0.000 description 1
- SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N dATP Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 1
- SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N dATP Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1CC(O)C(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J dCTP(4-) Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@@H]1O[C@H](COP([O-])(=O)OP([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O)[C@@H](O)C1 RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J 0.000 description 1
- HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N dGTP Chemical compound C1=NC=2C(=O)NC(N)=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N 0.000 description 1
- NHVNXKFIZYSCEB-XLPZGREQSA-N dTTP Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)C1 NHVNXKFIZYSCEB-XLPZGREQSA-N 0.000 description 1
- 230000000593 degrading effect Effects 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 239000005546 dideoxynucleotide Substances 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N dithiothreitol Chemical compound SC[C@@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 150000002085 enols Chemical class 0.000 description 1
- 231100000655 enterotoxin Toxicity 0.000 description 1
- 238000012869 ethanol precipitation Methods 0.000 description 1
- ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N ethidium bromide Chemical compound [Br-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CC)=C1C1=CC=CC=C1 ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960005542 ethidium bromide Drugs 0.000 description 1
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 description 1
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 1
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 1
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 1
- 239000012467 final product Substances 0.000 description 1
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 1
- 239000012737 fresh medium Substances 0.000 description 1
- 101150034785 gamma gene Proteins 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 230000035784 germination Effects 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000008187 granular material Substances 0.000 description 1
- 208000016861 hereditary angioedema type 3 Diseases 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 125000000487 histidyl group Chemical group [H]N([H])C(C(=O)O*)C([H])([H])C1=C([H])N([H])C([H])=N1 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- 239000005457 ice water Substances 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- PLVPPLCLBIEYEA-UHFFFAOYSA-N indoleacrylic acid Natural products C1=CC=C2C(C=CC(=O)O)=CNC2=C1 PLVPPLCLBIEYEA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000005304 joining Methods 0.000 description 1
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 1
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 1
- 239000002523 lectin Substances 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 230000036210 malignancy Effects 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 1
- HOVAGTYPODGVJG-VEIUFWFVSA-N methyl alpha-D-mannoside Chemical compound CO[C@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H]1O HOVAGTYPODGVJG-VEIUFWFVSA-N 0.000 description 1
- 238000009629 microbiological culture Methods 0.000 description 1
- 239000003226 mitogen Substances 0.000 description 1
- 230000001613 neoplastic effect Effects 0.000 description 1
- 239000002777 nucleoside Substances 0.000 description 1
- 210000004940 nucleus Anatomy 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 229940046166 oligodeoxynucleotide Drugs 0.000 description 1
- 201000008968 osteosarcoma Diseases 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- 229940056360 penicillin g Drugs 0.000 description 1
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 1
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 1
- PHEDXBVPIONUQT-RGYGYFBISA-N phorbol 13-acetate 12-myristate Chemical compound C([C@]1(O)C(=O)C(C)=C[C@H]1[C@@]1(O)[C@H](C)[C@H]2OC(=O)CCCCCCCCCCCCC)C(CO)=C[C@H]1[C@H]1[C@]2(OC(C)=O)C1(C)C PHEDXBVPIONUQT-RGYGYFBISA-N 0.000 description 1
- 239000002644 phorbol ester Substances 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 230000035479 physiological effects, processes and functions Effects 0.000 description 1
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 description 1
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 1
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 238000011321 prophylaxis Methods 0.000 description 1
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 1
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 description 1
- 230000022532 regulation of transcription, DNA-dependent Effects 0.000 description 1
- 239000003161 ribonuclease inhibitor Substances 0.000 description 1
- 239000002342 ribonucleoside Substances 0.000 description 1
- 210000003705 ribosome Anatomy 0.000 description 1
- 239000007320 rich medium Substances 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 238000012882 sequential analysis Methods 0.000 description 1
- 238000013207 serial dilution Methods 0.000 description 1
- 108010048397 seryl-lysyl-leucine Proteins 0.000 description 1
- 239000002356 single layer Substances 0.000 description 1
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 1
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 238000000527 sonication Methods 0.000 description 1
- 238000009987 spinning Methods 0.000 description 1
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 1
- 238000012430 stability testing Methods 0.000 description 1
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 1
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 238000000856 sucrose gradient centrifugation Methods 0.000 description 1
- 239000013589 supplement Substances 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 101150072314 thyA gene Proteins 0.000 description 1
- 238000012090 tissue culture technique Methods 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 230000014621 translational initiation Effects 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Landscapes
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Изобретението се отнася до получаване на нов рекомбинантен имунен интерферон и dеs-сys-тyr-сys рекомбинантен човешки имунен интерферон чрез рекомбинантни днк техники с помощта на който и да е от известните експресионни вектори и култури гостоприемници. Човешкият имунен (гама)интерферон (ifн) е изолиран и характеризиран чрез днк и аминокиселинни последователности, физични отнасяния и биологични активности. 7 претенции, 16 фигури
Description
Това изобретение се отнася до областта на рекомбинантната ДНК технология, до средствата и методите, които използва тази технология при откриването на ДНК последователността и при прогнозирането на амино киселинната последователност за човешкия имунен интерферон и неговото продуциране, както и до различните продукти на това продуциране и тяхната употреба.
По- специално, изобретението се отнася до изолирането и идентифицирането на ДНК последователности, кодиращи човешки имунен интерферон и до конструирането на рекомбинантни експресионни средства, съдържащи такива ДНК последователности, оперативно свързани с въздействащи на експресията промоторни последователности и с така
конструираните експресионни средства. В друг аспект, настоящето изобретение се отнася до гостоприемникови културални системи, като напр. различни микроорганизми и клетъчни култури на гръбначни, трансформирани с такива експресионни средства и по този начин насочени към експресията на ДНК последователностите?посочени по- горе. В други отношения изобретението се отнася до средствата и методите за превръщане на крайните продукти на подобна експресия до нови по своята същност като фармацевтични състави, приложими за профилактика или лечение на хора. В предпочитаните изпълнения това изобретение обезпечава специални експресионни средства, които са съгласувани с оглед продуциране и секретиране на човешки имунен интерферон в неговата зряла форма от гостоприемниковите клетки. В допълнение, настоящето изобретение се отнася до различни процеси, приложими за получаване на посочените ДНК последователности, експресионни средства, гостоприемникови културални системи и крайни продукти ,както и до специфични и асоциирани варианти на изпълнение.
Настоящето изобретение възниква частично от откриването на ДНК последователността и прогнозираната амино сикелинна последователности, кодираща човешки имунен интерферон. В допълнение, настоящето изобретение обезпечава информация за 3'- и 5'- фланкиращите последователности за човешкия имунен интерферонен ген, улеснявайки тяхното in vitro свързване в експресионните средства. По- специално, осигурява се 5'- ДНК сегмент, кодиращ вероятният ендогенен сигнален полипептид, непосредствено предхожда амино киселинната последователност на вероятният човешки имунен интерферон. Тези открития на свой ред дават възможност за развиване на средствата и методите за получаване, чрез ДНК технология, на задоволително количество човешки имунен интерферон,
така че , да стане възможно определянето на неговите биохимични свойства и биологична активност.Публикациите и другите материали, използвани тук за осветляване нивото на изобретението, и в специални случаи за осигуряване на допълнителни подробности, имащи отношение към практиката , са включени в литературната справка, и за удобство са номерирани в следващия по-долу текст и групирани в приложената библиография.
НИВО НА ИЗОБРЕТЕНИЕТО
А. Човешки имунен интерферон
Човешките интерферони могат да бъдат класифицирани в три групи на базата на различията в антигенността и биологичните и биохимични свойства.
Първата група обхваща семейство левкоцитни интерферони ( аинтерферон, LelF или IFN-а), които обикновено се продуцират главно от конституентни кръвни клетки при вирусна индукция. Те са били продуцирани микробиологично и е установено че притежават биологична активност (1,2,3). Техните биологични свойства са причина за приложението им в клиниката като терапевтични агенти за лечението на вирусни инфекции и злокачествени състояния (4).
Към втората група се причислява човешкият фибробластен интерферон ( β- интерферон, FIF или IFN-β), обикновено продуциран от фибробласти при вирусна индукция, които също са продуцирани по микробиологичен път и за които е установен широк обхват от биологични активности (5). Клиничните изпитвания също показват тяхната потенциална терапевтична стойност. Левкоцитните и фибробластни интерферони проявяват много ясно сходство в техните биологични свойства поради факта че степента на хомоложност на амино киселинно ниво е относително ниска. В допълнение, двете групи интерферони съдържат от 165 до 166 амино киселини и са киселинно стабилни протеини.
Човешкият имунен интерферон (γ- интерферон, IIF или IFN-γ), към които е насочено настоящето изобретение, е обратно на а- и βинтерфероните, pH 2 лабилен, и се продуцира главно при митогенна индукция на лимфоцити и е също така ясно антигенно отличим. До скоро човешкият имунен интерферон можеше да бъде открит само в много ниски нива, което очевидно възпрепятстваше неговото охарактеризиране. Напоследък е , докладвано за твърде екстензивно, но все още частично пречистване на човешкия имунен интерферон (6). Съединението е продуцирано от лимфоцитни култури, стимулирани с комбинация от фитохемаглутинин и форболов естер и пречистено чрез секвенционно хроматографско разделяне. Тази процедура води до получаване на продукт с молекулно тегло от 58, 000.
Чрез транслиране на тРНК в ооцити е продуциран в много малки количества човешки имунен интерферон, показващ характеристика на интерферонова активност, аналогична на човешкият имунен интерферон ,което дава надеждата, че имуноинтерферонова сДНК може да бъде синтезирана и клонирана (7).
Количеството имунен интерферон, получено досега, е наистина недостатъчно за провеждане на независими експерименти за охарактеризиране и за определяне на биологичните свойства на пречистеният компонент. Обаче in vitro изследванията, осъществени със суров препарат, така както и in vivo експериментите с муринови γ- интерферонови препарати
предполагат, че първичната функция на имуно интерферона може да бъде както на един имунорегулаторен агент (8, 9). Имуноинтерферонът притежава не само антивирусна и антиклетъчна активност както всички останали човешки интерферони, но показва също и потенциращ ефект за тези активности с а- и β- интерферон (10). Освен това, in vitro антипролиферативният ефект на γ- интерферона върху туморни клетки е приблизително 10- до 100- пъти по- висок от този, докладван за другите интерферонови класове (8, 11, 12 ). Този резултат, заедно с неговата ясно изразена имунорегулаторна роля (8, 9), предполага малко по- високи антитуморни възможности за IFN- γ отколкото за IFN- а и IFN- β. В действителност, in vivo експериментите с мишка и муринови IFN-γ препарати показват ясно превъзходство над антивирусно индуцираните интерферони в техният антитуворен ефект срещу остеогенна саркома (13).
Всички тези изследвания до настоящето изобретение са били осъществявани с твърде сурови препарати. Независимо от това, те в действителност предполагат много важни биологични функции за имунния интереферон. Имунният интерферон притежава не само потенциална асоциирана антивирусна активност, но вероятно и силна имунорегулаторна и антитуморна активност, ясно насочваща към потенциално многообещаващи клинични приложения.
Твърди се, че прилагането на рекомбинантната ДНК технология е найефективният начин за осигуряване на необходимото по-голямо количество човешки имунен интерферон. Дали така продуцираните материали включват или не гликозилации, за които се счита?че са характерни за природния , получен от човека, материал, те по всяка вероятност проявяват биологична активност, предполагаща тяхното клинично приложение за лечение на широк кръг вирусни, неопластични и имуносупреорни състояния или заболявания.
В. Рекомбинантна ДНК технология
Рекомбинантната ДНК технология достигна своята зряла възраст. Молекулярните биолози са в състояние да рекомбинират различни ДНК последователности с лекота, създавайки нови ДНК средства, способни да продуцират копия от различни ендогенни продукти в трансформирани микроорганизми. Основните средства и методи, които се използват, са in vitro свързванията на различни слепи или лепливи крайни фрагменти на ДНК, продуциращи потенциално експресиращи средства, които се използват в частично трансформираните организми, насочвайки ги по този начин към синтезирането на желан екзогенен продукт. Но за отделния продукт обмяната остава изменчива и науката не е в състояние да предскаже получаването на постоянен резултат. Този, който предсказва успешни резултати без да посочи експериментални данни, прави това с относителен
риск.
Плазмидът, нехромозомна бримка от двойноверижна ДНК, изолиран от бактерии и други микроорганизми, който е способен на многократно самовъзпроизвеждане, остава основен елемент на рекомбинантната ДНК технология. Включеното в информацията, кодирана в плазмидната ДНК,е онова, което е необхадимо за репродуциране на плазмида в дъщерни клетки ( т.е. източник на репликацията ) и обикновено една или повече фенотипично подбрани характеристики като, в случаите на бактерии, устойчивост на антибиотици, позволява клонове от гостоприемниковата клетка, съдържаща желания плазмид, да бъдат разпознати и преференциално култивирани на подбрана среда. Приложимастта на плазмидите лежи във възможността да бъдат специфично разградени с един или друг ендонуклеазен ензим или рестрикционен ензим, всеки от които разпознава различно място в плазмидната ДНК. Порадидова става възможно инсертирането на хетероложни гени или генни фрагменти в плазмида посредством присъединяване в мястото на разграждане или при реконструираните краища, съседни на мястото на разграждане. Така се формират така нар.
репликативно експресионни средства. ДНК рекомбинацията се осъществява извън клетката, но полученото в резултат рекомбинантно репликативно експресионно средство или плазмид, може да бъде въведено в клетката по известен на специалистите начин, наречен трансформация и по този начин да бъдат получени големи количества от рекомбинантното средство чрез култивиране на трансформантите. Нещо повече, когато генът е инсертиран съобразно частта на плазмида, регулираща транскрибцията и транслацията а кодираното ДНК съобщение, полученото в резултат експресионно средство може да бъде използвано за актуализиране получаването на полипептидната последователност, която инсертираният ген кодира, а целият процес се нарича експресия.
Експресията се инциира в област, наречена промоторна, която' се разпознава и свързва с РНК полимераза. В транскрибционната фаза на експресията, ДНК се деспирализира, превръщайки се в матрица за иницииран синтез на транспортна (т) РНК от ДНК последователността. Транспортната РНК на свой ред се транслира в полипептид, притежаващ амино киселинна последователност, кодирана от нуклеотидния триплет или код, която като цяло дава структурният ген, т.е. тази част, която кодира амино киселинната последователност на експресираният полипептиден продукт. Транслацията се инициира при старт сигнал (обикновено ATG, който в получената транспортна РНК преминава в AUG). Така наречените стоп кодони определят края на транслацията и следователно, продукцията на следващите амино киселинни единици. Крайният продукт може да бъде получен чрез лизиране, ако е необходимо, на гостоприемниковата кетка от микробната система и възстановяване iia продукта чрез подходящо пречистване от други протеини.
На практика, с използването на рекомбинантната ДНК технология може да се експресират изцяло хетероложни пептиди - така наречената директна експресия - или обратно, може да се експресират хетероложни полипептиди които са слети с част от амино киселинната последователност на хомоложен полипептид. В последните случаи, очакваният биоактивен продукт може да премине в биологично неактивна форма вътре в слетия хомоложно / хетероложен полипептид до разграждането му в извън клетъчна среда. Виж Англ. патентна публ. No 2007676А и Wetzel, American Scientist 68, 664(1980).
С. Технология на клетъчното култивиране
Техниката на клетъчното или тъканно култивиране за изучаване генетиката и физиологията на клетките е добре развита. Средствата и методите на тази технология служат за поддържане на постоянни клетъчни линии, получени чрез успешни серийни трансфери от изолирани нормални клетки. За използване при изследванията такива клетъчни линии се поддържат върху твърда повърхност в течна среда, или чрез култивиране в суспенсия, съдържаща твърди хранителни вещества. Изготвянето им в голям мащаб като че ли поставя само механични проблеми. За повече информация по отношение нивото на познанията в дадената област виж Microbiology, 2nd Edition, Harper and Row, Publishers, Inc. Hagerstown, Md.(1973), по-специално pp.1122 и Scientific American 245, 66 (1981), всеки от които включен в литературната справка.
ОБЩО ЗА ИЗОБРЕТЕНИЕТО
Настоящето изобретение се основава на откритието, че рекомбинантната ДНК технология може да бъде използвана за получаване на човешки имуноинтерферон, за предпочитане в директна форма и в количества, достатъчни за иницииране и провеждане тестуването на животни и хора при кленечни условия като предпоставка за одобрение за пазара. Продуктът е подходящ за използване във всички негови форми при профилактиката и лечението на хора с вирусна инфекция и злокачествени и имуносупресивни или имунодефицитни състояния. Тези негови форми включват различните възможн! олигомерни варианти, които да съдържат
I асоциирана гликозилация. Продуктът е получен чрез трансформирани по пътя на генното инженерство микроорганизми или чрез трансформирани клетъчни културални системи. Както се използва тук, терминът клетъчни трансформанти се отнася до клетки, в които е въведена ДНК, получена след екзогенно ДНК рекомбиниране и до потомството на която и да е от тези клетки, което съхранява така въведената ДНК. Така понастоящем съществува потенциал за получаване и изолиране на човешки имуноинтерферон по по-ефикасен начин. Особено значим фактор от настоящето изобретение в неговото предпочитано изпълнение е генетичното насочване на микроорганизмите за продуциране на човешки имунен интерферон в количства, позволяващи изолирането им след секретиране от гостоприемниковата клетка в зряла форма.
Настоящето изобретение обхваща така получения· имунен интерферон, както и средствата и методите за неговото получаване. По-нататък, то е насочено към реплициращи ДНК експресионни средства, помещаващи гениите секвенции, които кодират човешкия имуноинтерферон в подходяща за експресиране форма. Пб-нататък настоящето изобретение е насочено към щамове микроорганизми или клетъчни култури, трансформирани с експресионните средства, описани по-горе, и до микробиални или клетъчни култури на така трансформирани щамове или култури, способни да продуцират човешки имунен интерферон. В още един друг аспек изобретението е насочено към различни методи, приложими за получаване на генната последователност на посочения имунен интерферон, ДНК експресионните средства, щамове микроорганизми и клетъчни култури и тяхното специфично изпълнение. Още по-нататък това изобретение е насочено към получаване на ферментационни култури от дадените микроорганизми и клетъчни култури. В допълнение, това изобретение е насочено към получаване на човешки имунен интерферон като директен експресионен продукт, секретиран от гостоприемниковата клетка в зряла форма. Този подход предвижда използване на гена, кодиращ последователността на зрелия човешки имунен интерферон плюс 5' фланкиращата ДНК, кодираща сигналния полипептид. Счита се, че сигналният полипептид подпомага транспорта на молекулата до клетъчната
стена на гостоприемниковия организъм, където се разгражда по време на процеса на секретиране на зрелия човешки имуноинтерферонов продукт. Този вариант позволява изолирането и пречистването на очакваният зрял имунен интерферон,без да се прибягва до включване на процедури за елиминиране контаминанти на интрацелуларен гостоприемников протеин или клетъчни останки.
Изразът зрял продукт, използван в текста, обозначава човешкия имунен интерферон като продукт на микробиалната клетка или клетъчната култура, без сигнален пептид или предсеквенционен пептид, който да води непосредствено до транслация на човешка имуно интерферонова тРНК. Първи рекомбинантен имунен интерферон, осигурен съгласно настоящето изобретение е този, притежаващ метионин като първа амино киселина (представена благодарение на ATG страт сигналната кодонова инсерция срещу структурният ген) или, където метионинът е интра- или екстрацелуларно разграден и притежава както обикновено като първа амино киселина - цистеин. Зрял човешки имунен интерферон може също така да , бъде продуциран, j съгласно ' настоящето изобретение, заедно с конюгиран протеин, различен от конвенционалния сигнален пептид, като конюгата може да бъде специфично разграден в интра- или екстрацелуларна среда. Виж Англ. патентно описание Ν 2007676А. Накрая, зрелият човешки имунен >
интерферон може да бъде продуциран чрез директна експресия без необходимост от разграждане по-нататък на който и да е чежд, излишен полипептид. Това по-специално е важно когато даден гостоприемник може неефективно да отстрани сигналният пептид или изобщо да не го отстрани, когато експресионното средство е конструирано да експресира зрелият човешки имунен интерферон заедно с неговия сигнален пептид. Така продуцираният зрял човешки имунен интерферон се възстановява и пречиства до ниво, необходимо за приложение при лечение на вирусни, злокачествени и имуносупресивни или имунодефицитни състояния.
Човешкият имунен интерферон се получава в следната последователност:
1. Човешки тъкани, например тъкан от слезка на човек или лимфоцити от периферната кръв, се култивират с митогени за стимулиране продукцията на имунен интерферон.
2. Клетъчните гранули от такива клетъчни култури се екстрахират в присъствие на рибонуклеазен инхибитор за изолиране на цялата цитоплазматична РНК.
3. Олиго- dT колона изолира общата информационна (тРНК) в полиаденилационна форма. Тази тРНК се фракционира по размер с помощта на захарозен плътностен градиент и пикочно- кисела електрофореза.
4. Подходящата тРНК (12 до 18 S) се превръща в съответната едноверижна комплементарна ДНК (сДНК), от която се продуцира двойно верижна сДНК. След поли-dC удължаване, тя се инсертира във вектор, като плазмид, носещ един или повече фенотипични маркери.
5. Така създадените вектори се използват за трансформиране на бактериални клетки, осигуряващи колонийна библиотека. Радиобелязаната сДНК, изготвена от индуцирана и неиндуцирана тРНК, получена както е описано по-горе, се използва за отделно сондиране на двойните колонийни библиотеки. Излишъкът от сДНК след това се отстранява и колониите се експонират на радиоактивен филм така че да се идентифицират индуцираните сДНК клонове.
6. Съответната плазмидна ДНК се изолира и съгласува от индуцираните сДНК клонове.
7. Първата съгласувана ДНК след това се удължава in vitro за инсерция в подходящо експресионно средство, което се използва за трансформиране на гостоприемникови клетки от Е. coli, които на свой ред, са в състояние да растат и експресират желаният човешки имуно интерферонов продукт.
8. Така експресираният имунен интерферон несъмнено притежава 146 амино киселини в неговата зряла форма, започвайки от цистеин и е силно основен по характер. Неговото мономерно молекулно тегло е изчислено на 17, 140. Може би поради присъствието на множество основни остатъка, хидрофобността, образуването на мостове от соли и др., молекулата може да се асоциира в олигомерни форми, като напр. в димер, тример или тетрамер.Наблюдаваните по-рано високи молекулни тегла за природил материал (6), който не може да бъде установен само чрез преброяване на амино киселините , може да се дължи на такива олигомерни форми, така че да съдейства на карбохидрата от пост-транслационното гликозилиране.
9. В същинските гостоприемникови клетъчни системи, по-специално когато са свързани в експресионно средство така че да бъде експресиран заедно с неговия сигнален пептид, зрялата форма на човешкия имунен интерферон се довежда до клетъчно културалната среда, което подпомага възстановяването и пречистването.
ОПИСАНИЕ НА ПРЕДПОЧИТАНИТЕ ВАРИАНТИ НА ИЗПЪЛНЕНИЕ
А. Микроорганизми I Клетъчни култури
1. Бактериални щамове / Промотори
Описаните тук действия, са осъществени с участието на, inter alia, микроорганизма Е. coli К-12 щам 294 ( и A, thi-, hsr-, к hsm+), както е описано в Англ. патентна публ. N 2055382 А. Този щам е депозиран в АТСС под N 31446. Независимо от това, могат да бъдат използвани и много други микробиални щамове, включително Е. coli В, Е. coli X 1766 (ATCC N 31537 ) или други микробиални щамове, повечето от които са депозирани и (потенциално) на разположение от депозитните институти, като напр. АТСС, виж също и Германският Offenlegungssrift 2644432. Тези други микроорганизми включват, например, бактерии като Bacillus subtilis и други ентеробактерии, сред които могат да бъдат забелязани и Salmonella typhimurium и Serratia marcerans, използващи плазмиди, които могат да репликират и експресират хетероложни генни последователности.
Например, бета лактамазните и лактозо промоторните системи са използвани преимуществено за иницииране и поддържане на микробиалното продуциране на хетероложни полипептиди.Детайлите, отнасящи се до
конструирането на тези промоторни системи,са публикувани от Chang et al., Nature 275 617 ( 1978) и Itacura et al., Science 198 1056 (1977), които са включени в литературната справка. Наскоро е създадена така нар. trp промоторна система, основана на триптофана. Подробностите, отнасящи се до конструирането на такава системата публикувани от Goeddel et al., Nucleic Acid Research 8,4057 (1980) и Kleid et al., U. S. Ser. No 133 296, заявен на 24 март 1980, включени в литературната справка. Открити са и са използвани и много други бактериални промотори, а подробностите^отнасящи се до техните нуклеотидни последователности, позволяващи на специалистите в областта да ги свързват функционално в плазмидни вектори, са публикувани виж напр. Siebenlist et al., Cell 20, 269 (1980), включен в приложената литературна справка.
2. Дрождеви щамове / Дрождеви промотори
Използаната в изобретението експресионна система може да бъде плазмида YRp (14, 15, 16), който е способен на селекция и репликация както в E.coli, така и в дрождите Saccharomices cerevisiae. За селекция в дрожди, плазмидът съдържа гена TRP1 (14, 15, 16), чиито комплементи, позволяващи развитие в отсъствие на триптофан и съдържащи мутации в този ген, са намерени в хромозома IV (17). Използваният тук щам е RH218 (18), депозиран в АТСС без ограничения под N 44076. Обаче следва да се знае, че всеки щам Saccharomyces cerevisiae, съдържащ мутация, която прави клетката trpl, следва да бъде ефективна среда за експресия на плазмида, съдържащ експресионната система. Пример за друг щам, който би могъл да се използва, е рер 4-1 (19). Този триптофан ауксотрофен щам също притежава точкова мутация върху TRP1 гена.
Когато 5'- фланкиращата ДНК последователност (промотор) от дрождев ген (за алкохол дехидрогеназа) се постави върху 5'- края на ген с различен от дрождев произход, той може да съдейства за експресията на чужд ген в дрожди, ако бъде поместен в плазмид, приложим за трансформация на дрожди. Освен от промотор, истинската експресия на не-дрождев ген в дрожди изисква втора дрождева последователност, помесена при 3'- края на недрождев ген в плазмид, така че да позволи действително транскрибционно терминиране и полиаденилация в дрожди. Този промотор, както и други такива, може да бъде използван по подходящ начин в настоящето изобретение - виж по-горе. В предпочитаните варианти на изпълнение, 5'фланкиращата последователност от дрождевия 3- фосфоглицерат киназния ген (20) е разположен нагоре от структурния ген, последван отново от ДНК съдържаща терминатор - полиаденилационни сигнали, например TRP1 (14, 15, 16) гена или PGK (20) гена.
Тъй като 5'- фланкиращата последователност (свързана с 3'- дрождева терминираща ДНК) (по-горе) може функционално да съдейства за експресия на чужди гени в дрожди, като че ли онези от 5’- фланкиращите последователности на който и да е високо експресивен дрождев ген, могат да бъдат използвани за експресия на важни генни продукти. Докато при някои обстоятелства дрождите експресират до 65 процента от разтворимия си протеин като гликолитични ензими (21) и доколкото това високо ниво се явява резултат от продуцирането на високи нива от индививуалната тРНК (22), би било възможно използването на 5'- фланкиращите последователности от които и да са други гликолитични гени за подобни експресионни цели като напр. енолаза, глицералдехид-3-фосфат дехидрогеназа, хексокиназа, пируват декарбоксилаза, фосфофрукто киназа, глюкозо-6-фосфат изомераза, фосфоглюкозо изомераза и глюкокиназа. Всяка от 3'- фланкиращите последователности на тези гени може също да бъде използвана за
терминиране и шРНК полиаденилация в такива експресионни системи - виж по-горе. Други високо експресионни гени са гените за киселите фосфатази (23) и гените, които експресират високи нива на продуктивност благодарение на мутации в 5'- фланкиращите области ( мутанти, повишаващи експресията), обикновено поради присъствието на ΊΎ1 транспозициониращ елемент (24).
Всички отбелязани по-горе гени са такива, които могат да бъдат транскрибирани чрез дрождева РНК полимераза II (24). Възможно е промоторите за РНК полимераза I и III, които транскрибират гените за рибозомална РНК, 5S РНК и tPHK (24, 25) също да бъдат приложими за подобни експресионни структури.
Накрая, много дрождеви промотори също съдържат транскрибционен контрол, така че да могат да бъдат изключвани или включвани в зависимост от вариантите на условията на култивиране. Примери за такива дрождеви промотори са гените, които продуцират следните протеини : алкохол дехидрогеваза II, изоцитохром - с, кисела фосфатаза, разграждащи ензими, асоциирани с азотния метаболизъм, глицералдехид-3-фосфат дехидрогеназа и ензими, отговорни за използването на малтозата и галактозата (22). Такива контролни области биха били приложими при контролиране експресията на протеиновия продукт - по-специално когато тяхното получаване е токсично за дрождите. Би било възможно също така да се постави контролиращата област от една 5'- фланкираща последователност с 5'- фланкираща последователност, съдържаща промотор от високо експресиран ген. Това би довело до хибриден промотор и би било възможно доколкото контролиращата област и промоторната са отличими по физичен начин ДНК последователности.
3. Клетъчно културални системи / Клетъчно културални вектори
Размножаването на клетки от vertebrata в култура ( тъканна култура) е рутинна процедура за последните години (виж Tissue Culture, Academic Press, Kruse and Patterson eds, 1973). Тук е използвана линията COS-7 от маймунски бъбречни фибробласти като гостоприемник за получаване на имунен интерферон (25). Но детайлно описаните тук^експерименти могат да бъдат проведени в която и да е клетъчна линия, способна да реплицира и експресира конкурентен вектор като напр. WI138, ВНК, ЗТЗ, СНО, VERO и HeLa клетъчни линии. В допълнение, изискването за експресионен векторе е, източникът на репликация и промотора, да е локализиран пред гена за експресиране, по дължината на който и да е необходим рибозомален свързващ сайт, РНК сайт на разцепване, полиаденилационен сайт и тренскрибционни терминиращи последователности. Независимо че тук се използват тези основни елементи на SV40, би могло да се разбере, че макар и описано в рамките на предпочитаните варианти на изпълнение, изобретението не трябва да се счита ограничено в : тя*: .и Например, може да се използва източника на репликацията на други вирусни вектори (като Polioma, Adeno, VSV, BPV и други подобни), така както и източници на репликация от клетката, които биха могли да функционират в неинтегрирано състояние.
В. Векторни системи
1. Директна експресия на зрял имунен интерферон в Е. coli
Процедурата, използвана за получаване на директно експресиране на IFN-y в Е. coli като зрял интерферонов полипептид ( без сигнална последователност), е вариант на тази, която използва по-ранен човешки растежен хормон (26) и човешки левкоцитарен интерферон (1), доколкото включва комбинацията от синтетична (N- крайна) и сДНК.
Както се предполага от нуклеотидната последователност на р69, описана по-горе и от сравняването на познатите сайтове на разграждане между сигналният пептид^! зрелият полипептид за няколко IFN- а (2), IFN -у притежава хидрофобен сигнален пептид от 20 амино киселини, последван от 146 амино киселини на зрелия IFN -у (фиг. 5). Както е показано на фиг. 7, BStNI рестрикционният ендонуклеазен сайт е конвенционално локализиран при амино киселина 4 на зрелия IFN- у. Конструирани са два синтетични олиго дезоксинуклеотида, които включват ATG транслационен иницииращ кодон, кодони за амино киселини 1, 2 и 3 (цистеин- тирозин- цистеин) и се създава EcoRI кохезивен край. Тези дезоксиолигонуклеотиди са свързани към 100 двойки бази BstNI- PstI фрагмент от р69 за конструиране на синтетичноприроден хибриден ген с 1115 двойки бази, който кодира IFN - у и който .е свързан чрез EcoRl и PstI рестрикционни сайтове. Този ген се инсертира в плазмида pLelF A trp 103 между EcoRl и PstI сайтовете за получаване на експресионният плазмид pIFN- γ trp 48. В този плазмид IFN -γ гена е експресиран под контрола на Е. coli trp промотор. ( pLelF A trp 103 е получен от pLelF А 25 в който сайта EcoRl, дистално спрямо LelF А гена е отстранен. Използваната за отстраняване на този сайт процедура е описана по- рано (27).
2. Експресия в дрожди
За експресиране на хетероложен ген за имунен интерферон като сДНК в дрожди, е необходимо да се конструира плазмиден вектор, съдържащ четири компонента. Първият от тях е частта, позволяваща трансформиране както на Е. coli, така и на дрожди и по този начин следва да съдържа селективен ген от всеки организъм. (В случая това е гена за ампицилинова резистентност от Е. coli и гена TRP1 от дрожди). Този компонент също изисква източник на репликация ат два организма. (В случая това е езточника Е. coli от pBR322 и arsl източника от хромозома III на дрождите).
Вторият компонент от плазмида е 5'-фланкиращата последователност от високо експресивен ген. за подпомагане транскрибцията на разположеният надолу в последователността структурен ген. В този случай, използваната 5'фланкираща последователност произхожда от дрождевият 3- фосфоглицерат киназен (PGK) ген. фрагментът е конструиран така, че да отстрани ATG от PGK структурната последователност като 8 вр надолу от този ATG. Тази последователност е заместена с последователността, съдържаща и двата рестрекционни сайта - XbdI и EcoRl, за удобство прикрепени към 5’фланкиращата последователност от структурният ген.
Третият компонент от системата е структурен ген, конструиран по същия начин, че да съдържа едновременно ATG транслационен старт и транслационен стоп сигнал. Изолирането на структури от такъв ген е описано по-долу.
Четвъртият компонент е дрождева последователност, съдържаща 3'фланкираща секвенция от дрождев ген, който съдържа същински сигнал за тренскрибционно терминиране и полиаденилация.
Имунният интерферон е получен в присъствие на всички тези компоненти в дрождите.
3. Експресия в клетъчни култури на бозайници
Методиката за синтез на имунен интерферон в клетъчни култури на бозайници разчита на създаването на вектор, способен и на автономна репликация и на експресия на външен ген под контрола на хетероложна транскрибционна единица. Репликацията на този вектор в тъканна култура се осъществява чрез осигуряване на ДНК репликационен източник (получен от SV40 вирус) и обезпечава помощна функция (Т антиген) чрез въвеждането на вектора в клетъчна линия, ендогенно експресираща този антиген (28, 29). Късният промотор на SV вируса предшества структурният ген на интерферона и гарантира транскрибцията на гена.
Векторът, използвай за получаване на експресия на IFN-y^ce състои от pBR322 последователности, които осигуряват селективен маркер за подбор в Е. coli (ампицилин резистентен), както и Е. coli източник на ДНК репликация. Тези последователности са получени от плазмида pML- 1 (28) и обхващат областта между рестрикционните сайтове Е. coli и BamHI. Източникът SV40 е получен от 342 двойки бази PvuII- Hindlll фрагмент, покриващ тази област (30,31) (двата края са превърнати в EcoRI краища). Тези последователности, като допълнение към това, че обхващат вирусния източник на репликация на ДНК, кодират промотор едновременно за ранната и за късната транскрибционна единица. Ориентацията на областта за SV40 източника е такава, каквато е на промотора за късната транскрибционна единица - проксимално на гена, кодиращ интерферон.
КРАТКО ОПИСАНИЕ НА ЧЕРТЕЖИТЕ
Фиг. 1 показва захарозния г градиент на центрофугиране на индуцирана в лимфоцити от периферната кръв Поли(А) + РНК. Наблюдавани са два пика на интерферонова активност (както е показано чрез защриховани кутийки) с размери 12S и 16S. Местата на рибозомните РНК маркери (центрофугирани незабавно) са белязани над абсорбционният профил.
фиг. 2 показва електрофореза на индуцирана PBL Поли(А)+РНК върху пикочнокисела агароза. Наблюдаван е само един пик на активност, който е за 18S РНК. Позицията на рибозомалните РНК маркери, които са подложени на електрофореза в съседстна линия и визуализирани с етидиум бромид, са отбелязани над профила на активността.
Фиг. 3 показва образците на хибридизация на 96 колонии с индуцирани и неиндуцирани Р32- белязани сДНК сонди. 96 отделни трансформанта се култивират в микротитърна плака, прехвърлят се върху нитроцелулозна мембрана и след това филтратите се хибридизират с Р32 сДНК сонди, получени или от индукционна тРНК (както по-горе), или от тРНК, изолирани от неиндукционни PBL култури (по-долу), филтрите се промиват за отстраняване на нехибридизираната РНК и селд това се експонират върху чувствителен за ултравиолетовата светлина филм. Този комплекс от филтри е представителен за 86 такива комплекси (8300 независими колонии). Един примерен индуциран клон е отбелязан като Н12.
Фиг. 4 е карта на рестрикционните ендонуклеази на инсерционния клон 69 сДНК. сДНК инсерта е свързан чрез PstI сайтове (точки при двата края) и олиго dC- dG опашки ( единични линии). Броят и размерът на фрагментите, получени чрез разграждане с рестрикционни ендонуклеази се оценява с електрофореза върху 6 процентни акриламидни гелове. Позициите на сайтовете се потвърждава чрез съгласуване на нуклеиновите киселини (представено на фиг. 5 ). Кодиращата област от най- голямата отворена четяща рамка е оградена, а защрихованата част представя предполагаемата сигнална пептидна последователност от 20 остатъка, докато покритата с точки област представя зрялата IIF последователност (146 амино киселини). 5'- края от тРНК е наляво, а 3'- края е надясно.
фиг. 5 илюстрира нуклеотидната последователност на инсурционната плазмидна р69 сДНК. Представена е също предполагаемата амино киселинна последователностна най-дългата отворена четяща рамка. Предполагаемата сигнална последователност е представена от остатъците, отбелязани от S1 до S20.
фиг. 6 представя сравнение на IFN- γ тРНК структурата с тази на левкоцитарните (IFN- а) и фибробластни (IFN- β) интерферони. Клонът 69 тРНК (отбелязан като имунен) съдържа значително по-голямо количество
нетранслирани последователности.
фиг. 7 е схематична^иаграма на структурата на IFN-γ експресионният плазмид pIFN- у trp 48. Изходният материал е 1250 двойки бази PstI сДНК от плазмида р69.
Фиг. 8 показва диаграма на плазмид, приложим за експресия на IFN- у в клетки на маймуна.
фиг. 9 показва Southern хибридизация на разградена с EcoRI човешка геномна ДНК, хибридизирана с Р32- белязан Ddel фрагмент с 600 двойки бази от ДНК на инсерционния плазмид р69. Два EcoRI фрагмента ясно се хибридизират със сондата от всяка ДНК проба.
Фиг. 10 показва Southern хибридизация на човешка геномна ДНК, разградена с шест различни рестрикционни ендонуклеази, хибридизирани с Pi2- белязана сонда от р69.
фиг. 11 схематично илюстрира рестрикционната карта на 3.1 kbp Hindlll инсерта от вектора рВ 1 от който е изолиран промотора PGK. Обозначена е инсерцията на един EcoRI сайт и един Xbal сайт в 5'фланкиращата ДНК от гена PGK.
фиг. 12 илюстрира 5'-фланкиращата последователност от PGK гена преди инсертирането на Xbal и EcoRI сайтовете.
фиг. 13 представя схематично начините, използвани за инсертиране на Xbal сайта при позиция-8 в PGK промотора и за изолиране на 39 Ьр фрагмента от PGK, съдържащ този Xbal край и Sau3A край.
фиг. 14 представя схематично конструирането на 300 Ьр фрагмент, съдържащ горният 39 Ьр фрагмент, допълнителна PGK 5'- фланкираща последователност (265 Ьр) от Pvul към Sau3A (виж фиг. 11) и EcoRI сайт, съседен на Xbal.
фиг. 15 схематично илюстрира структурата на PGK промотора с 1500 bp (Hindlll / EcoRI), съдържащ допълнително към фрагмента конструиран съгл. фиг. 14, 1300 bp Hindlll към PGK 5'- фланкиращата последователност ( виж фиг. 11).
Фиг. 16 илюстрира състава на един експресионен вектор за човешки имунен интерферон в дрожди, съдържащ модифициран PGK промотор, IFN-y сДНК и терминаторната област на дрождевия PGK ген, както е описан поподробно тук.
ПОДРОБНО ОПИСАНИЕ
А. Източник на IFN - у тРНК
Левкоцити от човешка периферна кръв (PBLs) са получени чрез левкофореза. PBLs се пречистват посредством градиентно центрофугиране по Ficoll-Hypaque , след което се култивират при концентрация 5 х 106 клетки / мл в RPMI1640, 1 процент L- глутамин, 25 mM HEPES и 1 процент пеницилинстрептомицинов разтвор ( Gibco, Grand Island, NY). Тези клетки се индуцират за продуциране на IFN-γ чрез митогенен стафилококов ентеротоксин В (1 mg/ml) и се култивират за 24 до 48 часа при 37 С. Към PBL културите се добавя дезацетилтимозин- α- 1 (1 mg/ml) за повишаване на получената IFN- γ активност.
В. Изолиране на транспортна РНК
Общото количество на РНК от PBL културите се екстрахира по същество както е докладвано от Berger, S. L. et al. (33). Клетките се утаяват чрез центрофугиране и след това се ресуспендират в 10 mM NaCl, 10 тМ Tris- HCL (pH 7.5), 1.5 тМ MgCl, и 10 тМ рибонуклеозид ванадилов комплекс. Клетките се лизират чрез добавяне на NP-40 ( 1 процент крайна концентрация) и ядрата се утаяват чрез центрофугиране. Супернатантата съдържа общото количество РНК, което по-нататък се пречиства чрез многократна фенолна и хлороформна екстрекция. Водната фаза се довежда до 0.2М в NaCl, след което общото количество РНК се преципитира чрез добавяне на два обема етанол. РНК от неиндуцираните (нестимулирани) култури се изолира по същите методи. За пречистване на тРНК от общото количество РНК преципитат, се използва олиго-dT целулозна хроматография (34). Обикновено добива възлиза на 5- 10 милиграма обща РНК и 50- 200 микрограма поли(А) + РНК от 1-2 литра култивирани PBL.
С. Фракциониране по размер на тРНК
Два метода се използват за фракциониране на тРНК препаратите. Те са приложени независимо един от друг (вместо едновременно) и всеки от тях води до значително повишаване количеството на IFN- γ тРНК.
За фракциониране на тРНК се използва захарозо- градиентно центрофугиране в присъствие на денатуриран формамид. 5 до 25 процента захароза в 70 процента формамид се центрофугират (32) при 154 000 х g за 19 часа при 20° С. Последователните фракции (0.5 ml) след това се отстраняват, преципитират се с етанол и една аликвотна част се инжектира в ооцити на
Xenopus laevis за транслиране на тРНК (35). След 24 часа на стайна температура, инкубационната среда се изпитва за антивирусна активност в стандартна проба за ефекта на цитопатично инхибиране с помощта на везикуларният стоматитен вирус ( щам Indiana) или енцефаломиокардния вирус по WISH ( човешки амнион) клетки, както е описано от Stewart (36), с изключение на това, че пробите се инкубират с клетки за 24 часа ( вместо 4) преди провокация с вируса. Наблюдават се два постоянни пика на активност във фракционираната РНК (фиг. 1). Един пик е седиментиран с изчислен размер 12S и съдържа 100- 400 единици / ml антивирусна активност ( в сравнение с IFN-α стандарт ) за микрограм инжектирана РНК. Друг пик на активност, седиментиран като 16S по размер съдържа половината от активността на по- бавно седиментирания пик. Всеки от тези пикове на активност очевидно се дължи на IFN-γ, докато когато същата фракция се
изпитва върху клетъчна линия от телешки клетки ( MDBK), не се наблюдава активност, тъй като не се протекторат от човешки IFN- γ. Както IFN- a активността, така и IFN- β биха могли да бъдат открити лесно с MDBK (5).
Фракционирането на гпРНК (200 mg) се осъществява и посредством електрофореза върху пикочно- киселинни агарозни гелове. Плаката от агарозен гел (37,38) се състои от 1. 75 процента агароза, 0. 025 М натриев цитрат, рН 3. 8 и 6М пикочна киселина. Електрофорезата се провежда 7 часа при 25 милиампера и 4° С. След това теловете се нарязват с бръснарско ножче. Отделните срезове се размекват при 70° С и се екстрахират двукратно с фенол и еднократно с хлороформ. След това фракциите се преципитират с етанол и последователно се изпитват за IFN- γ mPHK чрез инжектиране в ооцити на Xenopus laevis и антивирусно действие. В така фракционираните гелни проби е наблюдаван само един пик на активност (фиг.2). Този пик се дължи на микриране заедно с 18S РНК и притежава активност от 600 единици / ml за микрограм от инжектираната РНК. Тази активност е вероятно IFN- γ специфична, доколкото не протектора MDBK клетки.
Несъответствието в размера на пиковете на активност, наблюдавани при захарозните градиенти ( 12S и 16S) и пикочно киселинните гелове (18S), може да бъде обяснено с наблюдението, че тези независими методи на фракциониране са неосъществими при условията на пълна денатурация.
D. Изготвяне на библиотека от колонии, съдържащи IFN- γ последовател ности
За получаване на двойно- верижна ДНК по стандартна процедура, се използват 3 μg гел-фракционирана тРНК (26, 39). сДНК се фракционира върху 6 процентен полиакриламиден гел. Две от фракциите се подлагат на електроелуация, 800- 1500 Ьр (138 ng) и > 1500 Ьр (204 ng ). Части от по 35 ng сДНК се удължават с дезоксиС остатъци с помощта на терминираща дезоксинуклеотидил трансфераза (40) и се ренатурират с 300 ng от празмида pBR322 (41), който по аналогичен начин е удължен с дезоксиС остатъци при PstI сайта (40). Всяка ренатурирана смес след това се трансформира в Е. coli К 12 щам 294. Получени са приблизително 8000 трансформанта с 800- 1500 Ьр сДНК и 400 трансформанта с > от 1500 Ьр сДНК.
E. Скрининг на колонийната библиотека за индуцирана сДНК
Колониите се инокулират индивидуално в кладенчетата на микротитърни плаки, съдържащи LB (58) + 5 mg/ml тетрациклин и се оставят на - 20°С след като се добави DMSO до 7 процента. Две копия на колониите се култивират върху нитроцелулозни филтри и ДНК от всяка от колониите се фиксира върху филтъра по метода на Grunstein- Hognes (42).
Р32- белязани сДНК сонди се изготвят с помощта на 18S гел гел фракционирана тРНК от индуцирани и неиндуцирани PBL култури. Олиго dT12_lg е използваният праймер, като условията на реакцията са описани по рано (1). филтри, съдържащи 8000 трансформанти с размер на сДНК 6001500 Ьр и трансформанти с размер > 1500 Ьр се хибридизират с 20 х 106 срт от индуцираната Р’: - сДНК. Втори комплекс от филтри се хибридизира с 20 х 106 срт от неиндуцираната Р’:- сДНК. Хибридизацията се провежда за 16 часа при условията, описани от Fritsch et al. (43). филтрите се промиват енергично (43) и след това се експонират на чувствителен на ултравиолетови лъчи филм Кодак XR-5 с подсилен екран на Du-Pont Lightnis-Plus за 16 до 18 часа. Всяко хибридизиране на образец от колониите се сравнява с двете сонди. Приблизително до 40 % от колониите се хибридизират ясно с двете сонди, докато около 50% от тях не успяват да се хибридизират (показано на фиг.З). 124 колонии се хибридизират значително с индукционната сонда, но без да може да бъде регистрирано или да бъде слабо регистрирано с неиндуктивната сонда. Тези колонии се инокулират индивидуално в кладенчетата на микротитърните плаки, култивират се и се хибридизират със същите две сонди, както е описано по-горе. Плазмидната ДНК, изолирана от всяка от тези колонии по метода (44),също се свързва към нитроцелулозните филтри и се хибридизира (45) с индукционна и неиндукционна сонди. ДНК от 22 колонии хибридизира само с индукционна сонда, поради което тези колонии се наричат индуцирани колонии.
('
F. Охарактеризиране на индуцираните колонии
От пет от индуцираните колонии (46) се изготвя плазмидна ДНК, която се използва за охарактеризиране на сДНК инсертите. Рестрикционните карти на пет индуцирани плазмида ( р67, р68, р69, р71 и р72) показват, че четири от тях са сходни. Това са р68, р69, р71 и р72, всеки от които има четири Ddel сайта, 2 HifI сайта и един Rsal сайт в сДНК. Петият плазмид (р68) съдържа общ Ddel фрагмент и очевидно е къс сДНК клон, свързан с останалите четири. Хомологията, предположена чрез рестрикционните карти е потвърдена и черз хибридизация. Р’2-белязана ДНК сонда се изготвя (47) от 600 bp Ddel фрагмент на плазмида р67 и се използва за хибридизация (42) с другите индуцирани колонии. Всичките пет картирани с рестрикционни ендонуклеази колонии се хибридизират кръстосано с тази сонда както 17 други колонии от индукционно / неиндукционният скрининг. Дължината на сДНК инсерта във всеки от тези кръстосано- хибридизирани плазмида се определя чрез PstI и гел електрофореза. Клонът с най- дълъг сДНК инсерт очевидно е клон 69 с дължина на инсерта 1200 - 1400 Ьр. Тази ДНК се
използва за всички по- нататъшни експерименти и нейната рестрикционна карта е показана на фиг. 4.
Чрез получаване на експресионни продукти в три независими експресионни системи, демонстриращи антивирусна активност^ е доказано, че сДНК инсерта в р69 е IFN- γ сДНК.
G. Секвенционен анализ на сДНК инсерта в р69
Пълната нуклеотидна последователност на р69 плазмидния инсерт е определена чрез дидезоксйнуклеотидно верижен терминиращ метод (48) посредством субклониране на фрагментите във вектора М13 шр7 (49) и химичната процедура на Махат- Gilbert (52). Най- дългата отворена четяща рамка кодира протеин от 166 амино киселини, представени на фиг.5. Първият кодиран остатък е първият met кодон, преброен от 5’- края на сДНК. Първите 20 остатъка при амино края вероятно служат като сигнална последователност за секретирането на останалите 146 амино киселини. Тази, вероятно сигнална, последователност притежава общите за останалите сигнални последователности характерни особености, като размер и хидрообност. Нещо повече, четири амино киселини, установени при вероятният сайт на разграждане ( ser- leu- cys);ca идентични с четири остатъка, установени при точките на разграждане на яколко левкоцитарни интерферона ( LelF В, С, D, F и Н (2)). Кодираната зряла амино киселинна последователност от 146 амино киселини (оттук нататък наричана рекомбинантен човешки имунен интерферон) притежава молекулно тегло 17 140.
Налице са две потенциални точки на гликозилация (50) в кодираната протеинова последователност - при амино киселини 28 до 30 (asn- gly- thr ) и амино киселини 100 - 102 (asn- tyr- ser). Съществуването на тези позиции се съгласува с наблюдаваното гликозилиране на човешки IFN- γ в присъствие на редуциращи агенти като β- меркаптоетанол (51). Предоложената зряла амино киселинна последователносте твърде базична, с общо 30 лизинови, аспарагинови и хистидинови остатъка и само общо 19 аспарагинови и глуаминови киселинни остатъка тРНК структурата на IFN- γ както е предположена от ДНК последователността на плазмида р69 е ясно различима от IFN- α (1, 2) или IFN- β (5) на тРНК. Както е представено на фиг. 6, кодиращата област на IFN- γ е по- къса, докато 5*- нетранслираните и 3'- нетранслираните региони са малко по-дълги както от IFN- а , така и от IFN- β.
Н. Експресия на рекомбинантен човешки интерферон в Е. coli
В съответствие с фиг. 7, 50 pg от плазмида р69 се разграждат с помощта на PstI и инсерта от 1250 двойки бази се изолира посредством гел електрофореза в 6 процентен полиакриламиден гел. Приблизително 10 pg от този инсерт се елуират от гела. След това, 5 pg от този PstI фрагмент се разгражда на части с 3 единици BstNI (Bethesda Research Labs ) за 15 минути при 37°С и реакционната смес се пречиства в 6 процентен полиакриламиден гел. Приблизително 0.5 pg от желаният BstNI- PstI фрагмент, състоящ се от 1100 двойки бази се възстановяват. Двата обозначени на фиг. 7 дезоксиолигонуклеотида - 5'- dAATTCATGTGTTATTGTC и 5'dTGACAATAACACATG , се инсертират по фосфотриестеразният метод (53) и се фосфорилират както следва : 100 pmol от всеки дезокси олигонуклеотид се комбинират в 30 μΐ от 60 mM Tris - НС1 (pH 8), 10 тМ MgCL, 15 тМ βмеркаптоетанол и 240 pCi (γ- Р32) АТф ( Amersham , 5000 Ci/mmol). Добавят
се 12 единици от Т4 полинуклеотид киназа и реакцията се оставя да продължи още 20 минути. След ф- ОН / СНС13 екстракция, олигомерите се комбинират с BstNI- PstI фрагмента, притежаващ 1100 двойки бази, и се преципитират с етанол. Тези фракции се лигатират при 20°С за два часа в 30 р 1 20 mM Tris - НС1 (pH 7.5), 10 mM MgCl2, 10 тМ дитиотреитол , 0.5 тМ АТф и 10 единици Т4 ДНК лигаза. Сместа се разгражда за един час с 30 единици PstI и 30 единици EcoRI ( за отстраняване на полимеризацията чрез лигатиране на кохезивният край ) и се подлага на лектрофореза в 6 процентен полиакриламиден гел. Продукта от 1115 двойки бази ( 110 000 срт) се възстановява чрез електроелуация.
Плазмидът pLelF А/гр 103 (фиг.7) е производен на плазмида pLelF А 25 (1), в който EcoRI сайта, дистално на LelF А гена е отстранен ( 27). 3 pg от pLelF A trp 103 се разгражда с 20 единици EcoRI и 20 единици PstI за 90 мин при 37°С и се подлага на електофореза в 6 процентен полиакриламиден гел. Големият векторен фрагмент ( ~ 3900 двойки бази) се възстановява чрез електроелуация. Фрагментът с големина 1115 двойки бази, EcoRI - PstI IFN- λ ДНК се включва в 0.15 pg от така изготвеният вектор. Трансформирането на
Е. coli К-12 щам 294 (АТСС N 31446) дава 120 устойчиви на тетрациклин колонии. Плазмидна ДНК се получава от 60 от тези трансформанти и се разгражда с EcoRI и PstI. Три от тези плазмиди съдържат разградения
EcoRI - Pstl 1115 двойки базов фрагмент. ДНК секвенционният анализ потвърждава, че тези плазмиди притежават желаната нуклеотидна последователност и свързването между trp промотора, синтетичнната ДНК и сДНК. Един от тези плазмиди - pIFN- λ trp 48 е избран за допълнително изследване. Този плазмид се използва за трансформиране на Е. coli К- 12 щам W3110 (АТСС N 27325).
I. Генна структура на IFN- γ кодиращата последователност Структурата на гена, кодиращ IFN- у,е анализирана чрез Southern хибридизация. В тази процедура (54), 5 микрограма от човешка лимфоцитна ДНК с високо молекулно тегло ( получена както е описано в 55), се
разгражда с различни рестрикционни ендонуклеази, подлага се на електрофореза върху 1.0 процентен агарозни гелове (56) и се оцветява върху нитроцелулозни филтри (54). Р32- белязана ДНК сонда се изготвя (47) от 600 bp Ddel фрагмент на сДНК инсерта на р69 и се хибридизира (43) с нитроцелулозна ДНК . Количество, възлизащо на 107 за минута^се хибридизира за 16 часа и след това се промива както е описано в (43). Осем геномни ДНК проби от райлични донори се разграждат с EcoRI рестрикционна ендонуклеаза и се хибридизират с р69 Р32- белязана сонда. Както е представено на фиг. 9, наблюдават се два ясни хибридизационни сигнала с размери 8.8 килобази двойки (kbp) и 2.0 kbp както се получава след сравняване мобилността с Hindlll разградена ХДНК. Това би могло да е резултат от два IFN - γ гена или от разделяне на един ген в EcoRI сайт.
Доколкото р69 не съдържа EcoRI сайт, ще бъде необходима интервентна последователност (интрон) с един вътрешен EcoRI сайт за обяснение на сигналния ген.За да се направи разлика между тези две възможности, се провежда друга Southern хибридизация със същата сонда срещу пет други ендонуклеазни разграждания на една човешка ДНК ( фиг. 10). Наблюдават се два други хибридизиращи фрагмента с две други ендонуклеазни разграждания, PvuII ( 6.7 kbp и 4.0 kbp) и Hindi ( 2. 5 kbp и 2. 2 kbp). Обаче три други ендонуклеазни образци на разграждане осигуряват само единичен ДНК хибридизационен фрагмент : Hindlll ( 9. 0 kbp), Bglll (11. 5 kbp) и BamHI ( 9. 5 kbp). Два IFN- у гена би трябвало да се свържат при необикновено близко разстояние ( по- малко от 9.0 кЬр^за да са разположени в рамките на един и същ Hindlll хибридизационен фрагмент. Този резултат предполага, че в човешката геномна ДНК присъства само един хомоложен IFN - γ ген ( за разлика от много свързани IFN- α гени) и че този ген е разделен от един или повече интрони, съдържащи EcoRI, PvuII и Hindi сайтове. Това предположение е потвърдено от хибридизацията на Р32- белязан (47) фрагмент, получен от непосредствено 3'- нетранслираният регион на сДНК фрагмента на сДНК р69 (130 bp Ddel фрагмент от 860 Ьр до 990 Ьр на фиг. 5) срещу едно EcoRI разграждане на човешка геномна ДНК. Само 2.0 kbp EcoRI фрагмента се хибридизират към тази сонда, предполагайки че този фрагмент съдържа 3'- нетранслирани последователности, докато 8.8 kbp EcoRI фрагмент съдържа 5'- последователности. Генната структура на IFN- γ (един ген с поне един интрон) е ясно отличим от IFN- α (мултиплени гени (2) без интрони (56) или IFN-β (един ген без интрони (57) ).
J. Получаване на бактериални екстракти
Нощна куртура на Е. coli W3110 / pIFN-γ trp 48 в бульон на Luria + 5 микрограма за ml тетрациклин се използва за инокулиране на М9 (58) среда, съдържаща 0.2 процента глюкоза, 0.5 процента казаминови киселини и 5 5 микрограма за ml тетрациклин при разреждане 1:100. Добавя се индол акрилова киселина до крайна концентрация 20 микрограма за т^когато А55Ое между 0. 1 и 0. 2. Добива от десет милилитрови проби се събира чрез центрофугиране при Д55О = 1. 0 и се ресуспендира незабавно в 1 ml фосфатно буферен разтвор, съдържащ 1 mg за ml телешки серумен албумин (PBS- BSA). Клетките се отварят чрез обработка с ултразвук и се очистват от останките чрез центрофугиране. Супернатантите се съхраняват при 4°С до изпитване. Интерфероновата активност в супернатантите се определя на 250 единици/ml чрез сравняване на IFN- а стандарти с ефекта от цитопатично инхибиращо изпитване (СЗЕ).
К. Трансформиране на дрожди / Щамове и среда
Дрождевите щамове се трансформират както е описано по-рано (59). Щам E.coli JA300 (thr leuB6 thi thyA trpC1117 hsdm- hsdR- str) (20) ce използват за подбор на плазмиди, съдържащи функционален TRPI ген. Дрождевият щам RH128 с генотипа (a trpl gal2 SUC2 mal CPUI) (18) се използва като гостоприемник за трансформиране . RH218 е депозиран в АТСС под N 44076. М9 ( минимална среда) с 0.25 процента казаминови киселини (САА) и LB (богата среда) са такива, каквито са описани от Miller (58) с добавка от 20 pg/ml ампицилин ( Sigma) след като средите се автокавират и охлаждат. Дрождите се култивират върху следната среда УЕРОсъдържаща1процент дрождев екстракт, 2 процента пептон и 2 процента глюкоза + 3 процента Difco агар. YNB + САА съдържа 6. 7 грама дрождева азотна база (без амино киселини) (YNB) (Difco), 10 mg аденин, 10 mg урацил, 5 грама САА, 20 грама глюкоза и +30 грама агар за литър.
L. Конструиране на дрождев експреснонен вектор
1. 10 pg YRp7 (14, 15, 16) се разграждат с EcoRI. Получените в резултат лепливи ДНК краища се правят слепи с помощта на ДНК полимераза I (Klenow fragment). Векторът и инсертът се прекарват през 1 процент агароза (SeaKem) гел, изрязват се от гела, подлагат се на електроелуация и се екстрахират двукратно с еднакве обеми хлороформ и енол преди преципитиране с етанол. Получените в резултат слепи ДНК молекули се смесват в краен обем 50 μΐ за 12 часа при 12°С. Тази смес след това се използва за трансформиране на Е. coli щам JA300 в ампицилиново резистентен и триптофаново прототрофен. Изолират се плазмидите, съдържащи TRPI гена в двете ориентации. pFRWl притежава TRPI гена в същата ориентация както YRp7, докато pFRW2 притежава TRPI гена в противоположна ориентация.
pg от pFRW2 се линеализират с Hindlll и се подлагат на електрофореза върху 1 процент агарозен гел. Линеарните молекули се елуират от гела и 20 ng от тях след това се лигатират с 500 ng от 3, lkb Hindlll инсерта от плазмид рВ1 (13), който е рестрикционен фрагмент, съдържащ дрождевият 3- фосфоглицерат кинезин ген. Тази лигаторна смес след това се използва за трансформиране на Е. coli щам 294 в щам, резистентен на ампицилин и чувствителен на тетрациклин. Плазмидът, получен от един такъв рекомбинант, притежава един интактен TRP1 ген с 3. 1 kbp Hindlll фрагмент от рВ1 инсерционна ДНК в Hindlll сайта на гена за тетрациклинова резистентност. Този плазмид е pFRM31. 5 pg от pFRM31 напълно се
разгражда с EcoRI, екстрахира се двукратно с фенол и хлороформ, след което се преципитира с етанол. Кохезивните краища от молекулата се запълват с помощта на ДНК полимераза I ( Klenow fragment) в реакция, доведена до 250 μΜ във всеки дезоксинуклеозид трифосфат. Реакцията след това се провежда за 20 минути при 14°С, през което време ДНК се екстраира двукратно с фенол- хлороформ и след това се преципитира с етанол. Ресуспендираната ДНК след това напълно се разгражда с Clal и се полага на електрофореза в 6 процентен акриламиден гел. Векторният фрагмент се елуира от гела, екстрахира се с фенол- хлороформ и се преципитира с етанол.
Шестте N- крайни амино киселини от 3- фосфоглицератният ензим, пречистен от хора са следните :
- 2- 3- 4- 5- 6
SER - LEU - SER - HSM - LYS - LEU Една от транслационните четящи рамки, генерирани от ДНК последователността на 141 bp Sau3A - to - Sau3A рестрикционни фрагмента (съдържащ интернален Hindi сайт ; виж PGK рестрикционната карта на фиг. 11), продуцира следната амино киселинна последователност :
- 2- 3- 4- 5- 6
MET - SER - LEU - SER - SER - LYS - LEU След отстраняване на инцииращият метионин може да се види, че PGK
N- крайната амино киселинна последователност притежава 5 от 6 -те амино киселини, хомоложни с N- крайната амино киселинна последователност на човешка PGK.
Този резултат от съгласуване предполага, че началото на PGK структурният ген е кодиран от ДНК в 141 bp Sau3A рестрикционният фрагмент на рВ1. По- ранни разработки (20) предполагат, че ДНК последователността, специфична за PGK тРНК може да се разполага в областта на Hind фрагмента. По- нататъшното съгласуване на 141 bp Sau3A фрагмента дава още от ДНК последователността на PGK промотора (фиг. 12),
Посредством стандартни методи (Crea et al., Nucleic Acids Res. 8, 2331 (1980) ) е синтезиран синтетичен олигонуклеотид c последователност 5' ATTTGTTGTAAA 3'. 100 ng от този праймер се маркира при 5' края с помощта на 10 единици Ш4 полинуклеотид киназа в 20 ul реакция, съдържаща също 200 gCi [ γ32 32 - Р] АТф. Този маркиран праймерен разтвор се използва в реакция за възстановяване на праймера, създадена като първи етап в многоетапен процес за включване на EcoRI рестрикционен сайт в PGK 5' -фланкираща ДНК, предшевстваща PGK последователността на структурния ген.
100 pg рВ 1 (20) се разгражда напълно с НаеШ, след което се пропуска през 6 процентен полиакриламиден гел. Горната ивица на оцветеният с етидиум гел (съдържащ PGK промоторен регион) се изолира чрез електроелуация както е описано по- горе. Тази част от ДНК, състояща се от 1200 Ьр НаеШ, се рестриктира с Hindi, след което се пропуска през 6 процентен акриламиден гел. Ивицата от 650 Ьр се изолира чрез електроелуиране. 5 pg от ДНК се изолират, след което тази 650 bp HaeIII-toHincII част от ДНК се ресуспендира в 20 μΐ Н2 О и се смесва се с 20 pl от фосфорилираният праймерен разтвор, описан по- горе. Тази смес се екстрахира еднократно с фенол- хлороформ, след което се преципитира с етанол. Сухата ДНК се ресуспендира в 50 μΐ Η, О и се нагрява във вряща вода за седем минути. След това този разтвор бързо се охлажда в суха леденоетанолна бани (10-20 секунди) и се прехвърля в ледена водна баня. Към този разтвор се добавят 50 μΐ от 10 х ДНК полимераза I буфер (Boeringer Mannheim), 10 μΐ от доведения до 2.5 мМ разтвор от всеки дезоксинуклеозид © трифосфат ( dATP, dTTP, dGTP и dCTP), 25 μΐ Η, Ο и 5 единици ДНК полимераза I, Klenow fragment. Тази 100 μΐ реакция се инкубира при 37°С за 4 часа. Разтворът след това се екстрахира 1х фенол-хлороформ, преципитира се с етанол, изсушава се чрез лиофилизация и се подлага на рестрикция до изчерпване с 10 единици Sau3A. Този разтвор след това се пропуска през 6 процентен акриламиден гел. Ивицата, съответстваща на 39 Ьр по размер, се изрязва от гела и се изолира чрез електроелуация, описана по-горе. Тази 39 Ьр ивица има един сляп край и един Sau3A леплив край. Този фрагмент се клонира в модифициран pFIF trp 69 вектор (5). 10 gg от pFIF trp 69 се линеализират с Xbal, екстрахират се 1 х с фенол- хлороформ , след което се преципитират с етанол. Xbal лепливият край се запълва с помощта на ДНК полимераза I Klenfw fragment в 50 μΐ реакция, съдържаща 250 μΜ във всеки нуклеозид трифосфат. Тази ДНК се срязва с BamHI, след това се пропуска през 6 процента акриламиден гел. Векторният фрагмент се изолира от гела чрез електроелуация и след това се ресуспендира в 20 μΐ Н2 О. 20 ng от този вектор се лигатира с 20 ng от 39 Ьр фрагмента, изготвен както е посочено погоре за 4 часа при стайна температура. Една пета от лигационната смес се
Q използва за трансформиране на Е. coli щам 294 в ампицилиново резистентен (върху LB + 20 gg/ml ампицилинови плаки). Плазмидите от трансформантите се изпитват посредством метода на бързото екраниране (44). Един плазмидр pPGK-39 е избран за секвенционен анализ. 20 gg от този плазмид се разгражда с Xbal, преципитира се с етанол и след това се подлага на въздействие със 100 единици бактериална алкална фосатаза при 68°С за 48 мин. След това ДНК се екстрахира трикратно с фенол- хлороформ и се преципитира с с етанол. Дефосфорилираните краища след това се маркират в у
gl реакционна смес, съдържаща 200 gCi [ γ32 -Р] АТф и 10 единици Т4
полинуклеотид киназа. Плазмидът се срязва със Sall и се пропуска през 6 процентен акриламиден гел.
Маркираната инсерционна ивица се изолира от гела и се съгласува по метода на химично разграждане (52). ДНК последователносттта при 3'-края от тази промоторна част е такава, каквато се очаква да бъде.
2. Конструиране на 321 bp PvuI-to-EcoRI PGK промоторен фрагмент gg pPGK-39 (фиг. 13) се разгражда едновремнно със Sall и Xbal ( 5 единици всеки ) и след това се подлагат на електрофореза върху 6 процентен полиакриламиден гел. Ивицата с 390 Ьр, представляваща 39 Ьр[ промоторната част се изолира чрез електроелуация. Ресуспендираната ДНК се подлага на рестрикция със Sau3A, след това се подлага на електрофореза върху 8 процентен акриламиден егл. 39 bp PGK промоторната ивица се изолира чрез електроелуация. Тази ДНК съдържа 39 Ьр от 5’ - края на PGK промотора от Sau3A-to-XbaI фрагмента.
pg от рВ1 се рестриктират с Pvul и ΚρηΙ, след което се подлагат на
електрофореза върху 6 процентен акриламиден гел. 0.8 kbp ивица от ДНК се изолират чрез електроелуиране, след това се рестриктират със Sau3A и се подлагат на електрофореза върху 6 процентен акриламиден гел. Ивицата с 265 Ьр от PGK промотора (фиг. 11) се изолира чрез електроелуиране.
След това ДНК се лигатира с 39 Ьр промоторния фрагмент за 2 часа при стайна температура. Лигаторната смес се рестриктира с Ха1 и Pvul, след което се подлага на електрофореза в 6 процентен акриламиден гел. Xba - to - Pvul рестрикционният размер с размер 312 Ьр се изолира чрез електроелуиране, след това се добавя към лигаторната смес, съдържаща 200 ng pBR322 (41) ( изолирана по-рано, пропускайки 162 bp Pvul -to - PstI рестрикционният рагмент) и 200 ng Xbal- to - PstI LelF А сДНК гена, изолиран от 20 pg pLelF tip A 25. Тази трикомпонентна лигаторна смес се използва за трансформиране на Е. coli щам 294 в щам, резистентен на тетрациклин. Трансормираните клонове се подлагат на мини скрининг (44) и една от колониите, PGK-300 се изолира като притежаваща 304 bp PGK 5'фланкираща ДНК, слята с LelF А гена в pBR322 основният вектор. 5'- края на LelF А гена притежава следната последователност : 5' - CTAGAATTC-3'. Така фузията на XbdI сайта от PGK промоторния фрагмент в тази последователност позолява добавянето към Xbal сайта на един EcoRl сайт.
Така pPGK - 300 съдържа част от PGK промотора, изолиран в Pvul - to EcoRl фрагмента.
3. Конструиране на 1500 bp EcoRI - to - EcoRI PGK промоторен фрагмент pg pBl се разгражда c Pvul и EcoRI и се пропуска през 6 процентен акриламиден гел. 1.3 kb Pvul - to - EcoRI ивицата ДНК от PGK 5' фланкиращата ДНК се изолира посредством електроелуиране. 10 pg pPGK300 се разгражда с coRI и Pvul и 312 bp промоторният фрагмент се изолира чрез електроелуация след електрофореза на разградената смес в 6 процентен акриламиден гел. 5 pg от pFRL4 се срязва с EcoRI, преципитира се с етанол и се третира с бактериална алкална фосфатаза при 68°С за 45 минути. След три екстракции на ДНК с фенол/хлороформ, преципитиране с етанол и ресуспендиране в 20 ml Н2 О, 200 ng от вектора се лигатират със 100 ng от 312 bp EcoRI - to - Pvul ДНК от pPGK - 300 и 100 ng EcoRI - to - Pvul ДНК от pBl. Лигаторната смес се използва за трансформиране на Е. coli щам 294 в ампицилиново резистентен. Един от получените трансформанти е pPGK 1500. Този плазмид съдържа 1500 bp PGK промоторен фрагмент като EcoRI to - EcoRI или Hindlll - to - EcoRI част от ДНК.
pg pPGK - 1500 се разграждат напълно с Clal и EcoRI след което
разградената смес се подлага на електофореза върху 6 процентен акриламиден гел. фрагментът с размер 900 Ьр, съдържащ PGK промотора^се изолира чрез електроелуиране. 10 pg pIFN - γ trp 48 се разгражда напълно с
EcoRI и HincII и се подлага на електрофореза върху 6 процентен акриламиден гел. Ивицата от 900 Ьр, съдържаща директно експресируемата IFN- γ сДНК ? се изолира от гела чрез електроелуиране.
Дрождевият експресионен вектор се изолира в трифакторна реакция чрез лигатиране заедно на PGK промоторният фрагмент ( в Clal - to - EcoRI част), делетираният pFRM - 31 и изолираната по- горе IFN- γ ДНК. Реакционната смес се инкубира на 14°С за 12 часа, след което се използва за трансормиране на Е. coli щам 294 в ампицилиново резистентен. Трансформантите се анализират за присъствие на действително конструиран експресионен плазмид , pPGK - IFN- γ (фиг. 16). Плазмидите, съдържащи експресионни системи се използват за трансформиране на сферопласти на дрождевия щам RH218 в триптофаново прототрофен при култивиране върху агар в отсъствие на триптофан. След това тези рекомбинантни дрожди се изпитват за присъствие на рекомбинантен човешки интерферон.
Дрождевите екстракти се получават по следният начин : 10 милилитрови култури се отглеждат в YNB+CAA до достигане на Α660ξ 1-2, събират се чрез центрофугиране и след това се ресуспендират в 500 μΐ PBS буфер (20 mM NaH, РО4, pH = 7.4, 150 mM NaCI). Добавя се еднакво количество стъклени топчета и сместа след това се бърка за 2'. Екстрактите се завъртат 30 секунде при 14000 грт и супернатантите се отстраняват : Интерфероновата активност в супернатантата се определя като 16 000 единици/ml посредством сравняване с IFN- а стандарт с помощта на СРЕ инхибиторни проби.
М. Конструиране на клетъчно културален вектор pSVy69
Hindlll-PvuII фрагментът, състоящ се от 342 двойки бази и обхващащ SV40 източника, се превръща в един EcoRl сайт рестрикционен свързващ фрагмент. Hindlll сайта се превръща чрез добавяне на синтетичен олигомер (5' dAGCTGAATTC), a PvuII сайта се превръща чрез свързване на слепите краища запълнени в EcoRl сайта с помощта на полимераза I ( Klenow fragment) . Полученият в резултат EcoRl фрагментсе инсертира в EcoRl сайта от pML-1 (28). Плазмид със SV40 късен промотор, ориентиран нагоре от amp* гена по- нататък се модифицира чрез отстраняване на EcoRl сайта, който е най-близо до amp* гена на pML- 1 (28).
Изолира се Hpal- Bglll фрагмента от клонираната HBV ДНК, състоящ се от 1023 двойки бази (60)^ и Hpal сайта от вируса на хепатит В (HBV) се превръща при един EcoRI сайт със синтетичен олигомер (5' dGCGAATTCGC). Този EcoRI - Bglll свързан фрагмент се клонира директно в EcoRI- BamHI сайтове от плазмида, описан по-горе, носещ източника на SV40.
В останалия EcoRI сайт се инсертира IFN-y ген върху 1250 двойки бази PstI фрагмент на р69 след превръщане на PstI краищата в EcoRI краища.Изолирани са клонове, в които SV40 късният промотор предшевства структурния ген на IFN- у. Получените в резултат плазмиди след това се въвеждат в клетки на тъканни култури (29) с помощта на DEAEдекстрановата техника (61) модифицирана така, че трансфекцията в присъствие на DEAE- декстран се провежда за 8 часа. Клетъчната среда се сменя на всеки 2-3 дни. Всеки ден се взимат по 200 микролитра за изследване. Типичният добив възлиза на 50-100 единици/ml за пробите, взети три или четири дни след началото на трансфекцията.
В продукта на трансфекция отсъства CYS-TYR-CYS N-крайна част на рекомбинантният човеки имунен интерферон (сравни фиг. 5), подкрепяйки появяването на сигнално пептидно разграждане при CYS-GLN връзката (амино киселини 3 и 4 на фиг. 5), така че зрелият олипептид фактически се състои от 143 амино киселини.
N. Частично пречистване на des-CYS-TYR-CYS рекомбинантен човешки имунен интерферон
За получаване на по-голямо количество от des-CYS-TYR-CYS рекомбинантен човешки имунен интерферон пресен монослой от COS-7 клетки от десет 10 cm плаки се трансектират с общо 30 pg pDLIF в 110 mis
DEAE-Dextran 500 000 MW, 0.05M Tris pH 7.5 в DMEM). След 16 часа при 37°C, плаките се промиват с DMEM. Към всяка плака се добавят 15 mis прясна DMEM, заместена с 10 процента f.b.s., 2mM глутамин, 50 μ/ml пеницилин G и 50 mg/ml стрептомицин. На следващия ден средата се замества с DMEM, свободен от серум. Прясна среда се добавя всеки ден. Събраната среда се пази на 4°С до следващото изпитване или свързване с CPG. Установено е, че фракциите от 3-4 дневни трансфекционни проби съдържат по същество цялата активност.
0.5 g CPG ( Electronucleics, CPG 350, размер на порите 120/200 ) се добавят към 100 ml клетъчна супернатанта и сместа се разбърква за 3 часа при 4°С. След кратко центрофуиране в настолна центрофуга топчетата се поставят в колона и внимателно се промиват с 20 mM NaPO4 IM NaCl 0.1 процента β- меркаптоетанол pH 7.2. Активността след това се елуира със същия буфер, съдържащ 30 процента етиленгликол, последвано от понататъшно елуиране с горния буфер, съдържащ 50 процента етиленгликол. По същества цялата активност се свързва с CPG. 75 процента от елуираната активност е установена във фракциите, елуирани с 30 процента етиленгликол. Тези фракции се отливат и се разреждат с 20 mM NaPO4 IM NaCl pH 7.2 до крайна концентрация от 10 процента етиленгликол и директно се прилагат към 10 ml Con A Sefarosa ( Pharmacia) колона. След старателно промиване с 20 mM NaPO4 IM NaCl pH 7.2 активността се елуирас 20 mM NaPO4 1М NaCl 0.2М а- метил- D- манозид. Съществено количество от активността (55 процента) не се свързва с лектин. 45 процента от активността се елуира с аметил-D- манозид.
ФАРМАЦЕВТИЧНИ СЪСТАВИ
Съединенията съгласно настоящето изобретение могат да бъдат формулирани съгласно известни методи за получаване на фармацевтично приложими състави, в които човешкият имунен интерферон е комбиниран в смес с подходящи във фармацевтично отношение носещи средства. Подходящи средства и техните форми са описани в Remington's Pharmaceutical Sciences от E.W. Martin, вкючена в литературната справка. Такива състави съдържат ефективно количество от интерфероновия протеин, заедно с подходящо количество средства за приготвяне на фармацевтично подходящи състави, удобни за въвеждане у пациента.
А. Парентерално въвеждане
Човешкият имунен интерферон от изобретението може да бъде въвеждан арентерално у пациенти, нуждаещи се от антитуморно или антивирусно лечение, както и у такива с имуносупресивни състояния. Дозите и количествата им могат да бъдат такива, каквито се използват напоследък при клинични изследвания на други човешки интерфери, като напр. около (ΙΙΟ) х 106 единици дневно, и в случаите на материали с чистота по-висока от 1 процент, или до 1 процент, до 50 χ 106 дневно. Дозите на IFN - γ могат да
бъдат повишени за по-гол^м ефект благодарение на липсата по същество на човешки протеини различни от ΙΙΝ-γ, които протеини в получени от човека материали могат да индуцират същински противоположен ефект.
Като пример за подходящи дози за хомогенен по същество IFN-γ за парентерална форма на приложение, 3 mg IFN-γ със специфична активност от, напр. 2х108 U/mg се разтварят в 25 ml 5N серумен албумин (човешки) USP, разтворът се прекарва през бактериологичен филтър и полученият филтриран разтвор се разпределя асептично в 100 епруветки, всяка от които съдържаща 6 χ 106 единици чист интерферон, подходящ за арентерално въвеждане. Епруветките се съхраняват за предпочитане на студено (-20°С ) до употреба.
ДАННИ ОТ БИОЛОГИЧНИ ИЗСЛЕДВАНИЯ
А. Охарактеризиране на антивирусната активност
За неутрализиране на антителата, пробите се неутрализират;ако е необходимо, до концентрация 500 - 1000 единици/ml с PBS - BSA. Еднакви обеми от пробата се инкубират за 2-12 часа при 4° при серийни разреждания на плъши античовешки лимфоцити, фибробласти или имуноинтерферонов антисерум. Анти- IFN- а и β са получени от National Institut of Allergy and Infectious Diseases. Анти- IFN- у се получава c помощта на автентичен IFN-γ (520 процента чистота), пречистени от стимулирани лимфоцити от периферна кръв. Пробите се центрофугират 3 минути при 12 ОООх g за 3 мин преди изследването. За тестуване на pH стабилността, пробите се довеждат до pH 2 чрез добавяне на IN НС1, инкубират се за 2-12 часа при 4° и се неутрализират чрез добавяне на 1 N NaOH преди изпитването. За тестуване на чувствителността на натриев додецилсулфат (SDS), пробите се инкубират с еднакъв обем от 0.2 процента SDS за 2-12 часа при 4°С преди изпитването.
В. Охарактеризиране на IFN- у , получени от Е. coli и COS-7 клетки Антивирусна актиВност ( единици/ ml)
Третиране IFN-a нетретирани 375 pH 2 375
Е. coli
IFN-β | IFN -у | W3110/ pIFN-ytrp48 екстракт | COS-7 кл/ pSVy69 супернатанта |
125 | 250 | 250 | 62.5 |
125 | <6 | <12 | <4 |
0.1 % SDS | 375 | - | <4 | < 8 | - |
Заешки анти- | <8 | 125 | 250 | 250 | 187 |
IFN-a | |||||
Заешки анти- | 375 | <8 | 187 | 250 | 125 |
IFN- β | |||||
Заешки анти- | 375 | 125 | <4 | <8 | <4 |
IFN-γ |
Таблицата показва характерното поведение на IFN-α, β и γ стандарти след различни третирания. Интерфероновата активност, получена от Е. coli W3110/pIFN-y trp 48 и от COS-7/pSVy69 е киселинно-чувствителна, SDSчувствителна и се неутрализира от антитела срещу IFN-a или β. Тези данни потвърждават, че продуктите получени с тези системи са имуно интерферони и че сДНК инсертите на плазмид р69 кодира IFN- у.
Имуноинтерфероновият протеин от изобретението е определен чрез определяне на ДНК гена и дедуктивното съгласуване на амино киселинните виж фиг. 5. Става ясно, че за този специален интерферон съществуват природни алелни варианции, проявяващи се от един индивид в друг . Тези вариации могат да бъдат демонстрирани чрез (една) амино киселинна разлика (ки) в цялата последователност или чрез делеции, замествания, инсерции, инверсии или добавяния на (една) амино киселина (и) в посочената последователност. Всички подобни алелни вариации са включени в рамките на обхвата на изобретението.
Представените предпочитани варианти на изпълнение следва да се приемат като създадени само да илюстрират настоящето изобретение, без да го ограничават повече от законния му обхват съобразно изложените по-долу патентни претенции.
Claims (61)
1. Рекомбинантен човешки имунен интерферон със следната амино- киселинна последователност:
CYS-TYR-CYS-GLN-ASP-PRO-TYR-VAL-LYS123456789
GLU - ALA - GLU - ASN - LEU - LYS - LYS - TYR - PHE 10 11 12 13 14 15 16 1718
ASN - ALA - GLY - HIS - SER - ASP - VAL - ALA - ASP 19 20 21 22 23 24 25 2627
ASN-GLY- THR - LEU-PHE - LEU-GLY-ILE - LEU -
28 29 30 31 32 33 34 3536
LYS - ASN -TRP-LYS- GLU- GLU- SER - ASP - ARG 37 38 39 40 41 42 43 4445 ' LYS-ILE- MET - GLN - SER - GLN - ILE - VAL - SER 46 47 48 49 50 51 52 5354
PHE-TYR-PHE-LYS-LEU-PHE-LYS-ASN-PHE 55 56 57 58 59 60 61 6263
LYS - ASP - ASP - GLN -SER-ILE- GLN -LYS-SER 64 65 66 67 68 69 70 7172
VAL - GLU - THR - ILE - LYS - GLU - ASP - MET - ASN 73 74 75 76 77 78 79 8081
VAL - LYS - PHE - PHE - ASN - SER - ASN - LYS - LYS82 83 84 85 86 87 88 8990
LYS - ARG - ASP - ASP - PHE - GLU - LYS - LEU - THR 91 92 93 94 95 96 97 9899
ASN -TYR-SER-VAL-THR - ASP - LEU - ASN - VAL 100 101 102 103 104 105 106 107108
GLN - ARG - LYS - ALA - ILE - HYS - GLU - LEU - ILEΜ 109 110 111 112 113 114 115 116 117
W GLN - VAL - MET - ALA - GLU - LEU - SER - PRO - ALA 118 119 120 121 122 123 124 125126
ALA- LYS - THR - GLY - LYS - ARG - LYS - ARG - SER127 128 129 130 131 132 133 134135
GLN - MET - LEU - PHE - ARG - GLY - ARG - ARG136 137 138 139 140 141 142143
ALA - SER - GLN.
144 145146
2. Човешки имунен интерферон съгласно претенция 1, съдържащ допълнително аминокиселината метионин, присъединена към N - края на амино- крайната аминокиселина на същия интерферон.
3. Човешки имунен интерферон съгласно претенция 1, допълнително съдържащ конюгат, способен на разграждане, който е присъединен към Nкрая на амино* крайната амино киселина от същия интерферон.
4. Гликозилиран човешки имунен интерферон съгласно претенция 1.
5. фармацевтичен състав, приложим за лечение на субект, нуждаещ се от антитуморно или антивирусно лечение или намиращ се в състояние на имуносупресия, който включва терапевтично ефективно количество човешки имунен интерферон съгласно претенция 1 в смес с подходящи фармацевтични носители.
6. Метод за лечение на субект, нуждаещ се от антитуморно или антивирусно лечение или намиращ се в състояние на имуносупресия, който включва въвеждане у такъв субект на терапевтично ефективно количество от човешкия имунен интерферон съгласно претенция 1.
7. Негликозилиран човешки имунен интерферон съгласно претенция 1 ·
Приложение: 16 фигури
ЛИТЕРАТУРА:
1. Goeddel et a\.,Nature 287,411 (1980).
2. Goeddel et al., Nature 290, 20 (1981).
3. Yelwerton et al., Nucleic Acids Research 9, 731 (1981).
4. Gutterman et al., Annals of Int. Med. 93, 399 (1980).
5. Goeddel et all., Nucleic Acids Research
8, 4057 (1980).
6. Yip et all., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 78, 1601 (1981).
7. Taniguchi et all., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 78, 3469 (1981).
6 8. Bloom, Nature 289, 593 (1980).
9. Sonnenfeld et all., Cellular Immunol. 40, 285 (1978).
10. Fleishmann et all., Infection and Immunity 26, 248 (1979).
11. Blalock et all., Cellular Immunology 49, 390 (1980).
12. Rudin et all., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 77, 5928 (1980).
13. Crane et all., J. Natl. Cancer Inst. 61, 871 (1978).
14. Stinchcomb et all., Nature 282, 39 (1979).
15. Kingsman et all., Gene 7, 141 (1979).
16. Tschumper et all., Gene Ϊ0, 157 (1980).
©
17. Mortimer et all., Microbiological Reviews 44, 519 (1980).
18. Miozzari et all., Journal of Bacteriology 134, 48 (1978).
19. Jones, Genetics 85, 23 (1977).
20. Hitzeman, et all., J. Biol. Chem. 255, 12073 (1980).
21. Hess et all., J. Adv. Enzime Regul. 7, 149 (1968).
22. Holland et all., Biochemistry 17, 4900 (1978).
23. Bostian et all., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 77, 4504 (1980).
24. The Molecular Biology of Yeast (Aug. 11-18, 1981), Cold Spring Harbor
Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y.
25. Chambon, Ann. Rev. Biochemistry, 44 613 (1975).
25a. Gluzman, Cell 23, 175 (1981)
26. Goeddel et all., Nature 281, 544 (1979).
27. Itacura et all., Science 198, 1056 (1977).
28. Lusky et all., Nature 293, 79 (1981).
29. Gluzman et all., Cold Spring Harbor Symp. Qant. Biol. 44, 293 (1980).
30. Fiers et all., Nature 273, 113 (1978).
31. Reddy et all., Science 200, 494 (1978).
32. Boedtker et all., Prog, in Nucleic Acids Res. Mol. Biol. 19, 253 (1976). ξ
33. Berger et al., Biochemistry 18, 5143 (1979).
34. Aviv et al., Proc Natl. Acad. Sci. USA 69, 1408 (1972).
35. Gurdon et al., J. Molec. Biol. 80, 539 (1975).
36. Stewart, The Interferon System. Springer, N.Y., p. 13-26 (1979).
37. Lehrach et al., Biochemistry 16, 4743 (1977).
38. Lynch et al., Virology 98, 251 (1979).
39. Wickens et al., J. Biol. Chem. 253, 2483 (1978).
40. Chang et al., Nature 275, 617 (1978).
41. Bolivar et al., Gene 2, 95/1977).
42. Grunstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 72, 3961 (1975).
©
43. Fritsch et al„ Cell 19, 959 (1980).
44. Birnboim et al., Nucleic Acids Res. 7, 1513 (1979).
45. Kafatos et al., Nucleic Acids Res. 7, 1541 (1979).
46. Clewell et al., Biochemistry 9, 4428 (1970).
47. Taylor et al., Biochim. Biophys. Acta 442, 324 (1976).
48. Smith, Methods Enzymol. 65, 560 (1980).
49. Messing et al., Nucleic Acids Res. 9, 309 (1981).
50. Winzler, Hormonal Proteins and Peptides (ed. Li)
Academic Press, New York, p.l (1973).
51. Nathan et al., Nature 292, 842 (1981).
52. Maxam et al., Methods in Enzymol. 65, 490 (1980).
53. Crea et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 75, 5765 (1978).
54. Southern, J. Molec. Biol. 98, 503 (1975).
55. Blin et al., Nucleic Acids Res. 3, 2303 (1976).
56. Lawn et al., Science 212, 1159 (1981).
57. Lawn et al., Nucleic Acids Res. 9, 1045 (1981).
58. Miller, Experiments in Molecular Genetics, p. 431-3, Cold Spring Harbor, N.Y. (1972).
59. Beggs, Nature 275, 104 (1978).
60. Valenzuella et al., Animal Virus Genetics (ed. Fields, Jaenisch and Fox), p. 57 , Academic Press, New York (1980).
61. McCutthan et al., J. Natl. Cancer Inst. 41, 351 (1968).
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US07/574,375 US5096705A (en) | 1981-10-19 | 1990-07-31 | Human immune interferon |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
BG60888B2 true BG60888B2 (bg) | 1996-05-31 |
Family
ID=24295848
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
BG098388A BG60888B2 (bg) | 1990-07-31 | 1994-01-20 | Човешки имунен интерферон |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
BG (1) | BG60888B2 (bg) |
-
1994
- 1994-01-20 BG BG098388A patent/BG60888B2/bg unknown
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US4929554A (en) | Human immune interferon | |
US5096705A (en) | Human immune interferon | |
US5582824A (en) | Recombinant DES-CYS-TYR-CYS human immune interferon | |
AU594045B2 (en) | Recombinant colony stimulating factor-1 | |
US4588585A (en) | Human recombinant cysteine depleted interferon-β muteins | |
WO1988003173A2 (en) | New forms of colony stimulating factor-1 | |
EP0271824B1 (de) | Pferde-Gamma-Interferon | |
JPH08187088A (ja) | 動物インターフェロン | |
BG60888B2 (bg) | Човешки имунен интерферон | |
BG60889B2 (bg) | Човешки имунен интерферон | |
BG60890B2 (bg) | Човешки имунен интерферон | |
BG61060B2 (bg) | Човешки имунен интерферон | |
BG60939B2 (bg) | Човешки имунен интерферон | |
HRP950157A2 (en) | Polypeptide with human interferon (ifn-gamma) characteristics | |
PH26492A (en) | Recombinant human immune interferon | |
NZ214261A (en) | Human immune interferon: production by recombinant dna technology | |
DD264706A5 (de) | Verfahren zur Herstellung von Polypeptiden (Pferde-Interforon-Gamma) |