BG60888B2 - Human immune interferon - Google Patents
Human immune interferon Download PDFInfo
- Publication number
- BG60888B2 BG60888B2 BG098388A BG9838894A BG60888B2 BG 60888 B2 BG60888 B2 BG 60888B2 BG 098388 A BG098388 A BG 098388A BG 9838894 A BG9838894 A BG 9838894A BG 60888 B2 BG60888 B2 BG 60888B2
- Authority
- BG
- Bulgaria
- Prior art keywords
- lys
- dna
- gene
- interferon
- ser
- Prior art date
Links
- 101000599940 Homo sapiens Interferon gamma Proteins 0.000 title claims abstract description 44
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 35
- 102000014150 Interferons Human genes 0.000 claims abstract description 29
- 108010050904 Interferons Proteins 0.000 claims abstract description 29
- 229940079322 interferon Drugs 0.000 claims abstract description 18
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 89
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 claims description 43
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 claims description 38
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 15
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims description 14
- 230000000840 anti-viral effect Effects 0.000 claims description 12
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 12
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 11
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 11
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 11
- 238000011282 treatment Methods 0.000 claims description 10
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 6
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 6
- 230000000259 anti-tumor effect Effects 0.000 claims description 6
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 claims description 6
- 238000011160 research Methods 0.000 claims description 6
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 claims description 5
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 claims description 4
- 241000700605 Viruses Species 0.000 claims description 4
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 claims description 4
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 claims description 3
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims description 3
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 claims description 3
- RAQMSGVCGSJKCL-FOHZUACHSA-N Asn-Gly-Thr Chemical compound C[C@@H](O)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O RAQMSGVCGSJKCL-FOHZUACHSA-N 0.000 claims description 2
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 claims description 2
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 claims description 2
- 230000002906 microbiologic effect Effects 0.000 claims description 2
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 claims 2
- YYAVDNKUWLAFCV-ACZMJKKPSA-N Ala-Ser-Gln Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(O)=O YYAVDNKUWLAFCV-ACZMJKKPSA-N 0.000 claims 1
- HZPSDHRYYIORKR-WHFBIAKZSA-N Asn-Ala-Gly Chemical compound OC(=O)CNC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O HZPSDHRYYIORKR-WHFBIAKZSA-N 0.000 claims 1
- JFOKLAPFYCTNHW-SRVKXCTJSA-N Gln-Arg-Lys Chemical compound C(CCN)C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)NC(=O)[C@H](CCC(=O)N)N JFOKLAPFYCTNHW-SRVKXCTJSA-N 0.000 claims 1
- FALJZCPMTGJOHX-SRVKXCTJSA-N Gln-Met-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O FALJZCPMTGJOHX-SRVKXCTJSA-N 0.000 claims 1
- GJLXZITZLUUXMJ-NHCYSSNCSA-N Gln-Val-Met Chemical compound CC(C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCC(=O)N)N GJLXZITZLUUXMJ-NHCYSSNCSA-N 0.000 claims 1
- LKDIBBOKUAASNP-FXQIFTODSA-N Glu-Ala-Glu Chemical compound OC(=O)CC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O LKDIBBOKUAASNP-FXQIFTODSA-N 0.000 claims 1
- KFKWRHQBZQICHA-STQMWFEESA-N L-leucyl-L-phenylalanine Natural products CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 KFKWRHQBZQICHA-STQMWFEESA-N 0.000 claims 1
- GQUDMNDPQTXZRV-DCAQKATOSA-N Lys-Arg-Asp Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O GQUDMNDPQTXZRV-DCAQKATOSA-N 0.000 claims 1
- JBRWKVANRYPCAF-XIRDDKMYSA-N Lys-Asn-Trp Chemical compound C1=CC=C2C(=C1)C(=CN2)C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)N)NC(=O)[C@H](CCCCN)N JBRWKVANRYPCAF-XIRDDKMYSA-N 0.000 claims 1
- QUYCUALODHJQLK-CIUDSAMLSA-N Lys-Asp-Asp Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O QUYCUALODHJQLK-CIUDSAMLSA-N 0.000 claims 1
- CBNMHRCLYBJIIZ-XUXIUFHCSA-N Lys-Ile-Met Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCCCN)N CBNMHRCLYBJIIZ-XUXIUFHCSA-N 0.000 claims 1
- XWYUBUYQMOUFRQ-IFFSRLJSSA-N Val-Glu-Thr Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCC(=O)O)NC(=O)[C@H](C(C)C)N)O XWYUBUYQMOUFRQ-IFFSRLJSSA-N 0.000 claims 1
- HPANGHISDXDUQY-ULQDDVLXSA-N Val-Lys-Phe Chemical compound CC(C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)O)N HPANGHISDXDUQY-ULQDDVLXSA-N 0.000 claims 1
- 108010040443 aspartyl-aspartic acid Proteins 0.000 claims 1
- 230000003054 hormonal effect Effects 0.000 claims 1
- 230000036039 immunity Effects 0.000 claims 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 claims 1
- 108010044056 leucyl-phenylalanine Proteins 0.000 claims 1
- 108010044348 lysyl-glutamyl-aspartic acid Proteins 0.000 claims 1
- 108700023046 methionyl-leucyl-phenylalanine Proteins 0.000 claims 1
- 108010073025 phenylalanylphenylalanine Proteins 0.000 claims 1
- 238000012552 review Methods 0.000 claims 1
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 abstract description 65
- 108010074328 Interferon-gamma Proteins 0.000 abstract description 49
- 102000008070 Interferon-gamma Human genes 0.000 abstract description 18
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 abstract description 12
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 abstract description 8
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 abstract description 8
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 abstract description 4
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 abstract 1
- 230000000704 physical effect Effects 0.000 abstract 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 59
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 56
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 45
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 42
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 41
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 38
- 238000010804 cDNA synthesis Methods 0.000 description 38
- 235000014680 Saccharomyces cerevisiae Nutrition 0.000 description 37
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 33
- 102000011755 Phosphoglycerate Kinase Human genes 0.000 description 32
- 101001099217 Thermotoga maritima (strain ATCC 43589 / DSM 3109 / JCM 10099 / NBRC 100826 / MSB8) Triosephosphate isomerase Proteins 0.000 description 32
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 32
- 102100037850 Interferon gamma Human genes 0.000 description 29
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 24
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 24
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 22
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 22
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 22
- 239000000047 product Substances 0.000 description 21
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 20
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 19
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 19
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 18
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 18
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 17
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 15
- HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N Acrylamide Chemical compound NC(=O)C=C HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 14
- 108020005029 5' Flanking Region Proteins 0.000 description 13
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 13
- LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N Ethylene glycol Chemical compound OCCO LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 12
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 12
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 12
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 11
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 11
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 11
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 11
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 11
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 10
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 10
- 229940047124 interferons Drugs 0.000 description 10
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 10
- 102000004594 DNA Polymerase I Human genes 0.000 description 9
- 108010017826 DNA Polymerase I Proteins 0.000 description 9
- 102000006992 Interferon-alpha Human genes 0.000 description 9
- 108010047761 Interferon-alpha Proteins 0.000 description 9
- 108090000467 Interferon-beta Proteins 0.000 description 9
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 9
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 9
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 9
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 9
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 9
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 9
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 9
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 9
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 8
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 8
- 239000004098 Tetracycline Substances 0.000 description 7
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 7
- OHDXDNUPVVYWOV-UHFFFAOYSA-N n-methyl-1-(2-naphthalen-1-ylsulfanylphenyl)methanamine Chemical compound CNCC1=CC=CC=C1SC1=CC=CC2=CC=CC=C12 OHDXDNUPVVYWOV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N phenol group Chemical group C1(=CC=CC=C1)O ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 7
- 229960002180 tetracycline Drugs 0.000 description 7
- 229930101283 tetracycline Natural products 0.000 description 7
- 235000019364 tetracycline Nutrition 0.000 description 7
- 150000003522 tetracyclines Chemical class 0.000 description 7
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 7
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 7
- 102100026720 Interferon beta Human genes 0.000 description 6
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 6
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 6
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 6
- YTRQFSDWAXHJCC-UHFFFAOYSA-N chloroform;phenol Chemical compound ClC(Cl)Cl.OC1=CC=CC=C1 YTRQFSDWAXHJCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 6
- 239000000463 material Substances 0.000 description 6
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 6
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 6
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 6
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 6
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 6
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 6
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 5
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 5
- LEHOTFFKMJEONL-UHFFFAOYSA-N Uric Acid Chemical compound N1C(=O)NC(=O)C2=C1NC(=O)N2 LEHOTFFKMJEONL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- TVWHNULVHGKJHS-UHFFFAOYSA-N Uric acid Natural products N1C(=O)NC(=O)C2NC(=O)NC21 TVWHNULVHGKJHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 5
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 5
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 5
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 5
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 5
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 5
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 5
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 5
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 5
- 230000032258 transport Effects 0.000 description 5
- 229940116269 uric acid Drugs 0.000 description 5
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 5
- OSJPPGNTCRNQQC-UWTATZPHSA-N 3-phospho-D-glyceric acid Chemical compound OC(=O)[C@H](O)COP(O)(O)=O OSJPPGNTCRNQQC-UWTATZPHSA-N 0.000 description 4
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 4
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 4
- 108010042407 Endonucleases Proteins 0.000 description 4
- 102000004533 Endonucleases Human genes 0.000 description 4
- 241001646716 Escherichia coli K-12 Species 0.000 description 4
- ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N Formamide Chemical compound NC=O ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241001460678 Napo <wasp> Species 0.000 description 4
- 238000002105 Southern blotting Methods 0.000 description 4
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 4
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 4
- 101150006914 TRP1 gene Proteins 0.000 description 4
- 108020004566 Transfer RNA Proteins 0.000 description 4
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 4
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 4
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 4
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 4
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 4
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 4
- 230000001506 immunosuppresive effect Effects 0.000 description 4
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 4
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 4
- 230000008569 process Effects 0.000 description 4
- 230000003362 replicative effect Effects 0.000 description 4
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 4
- 230000011664 signaling Effects 0.000 description 4
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 4
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 4
- 108020005065 3' Flanking Region Proteins 0.000 description 3
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 3
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 3
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 3
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 3
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 3
- 230000004543 DNA replication Effects 0.000 description 3
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 3
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 3
- 102000003996 Interferon-beta Human genes 0.000 description 3
- 108091092195 Intron Proteins 0.000 description 3
- 125000001429 N-terminal alpha-amino-acid group Chemical group 0.000 description 3
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 3
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 3
- 108010021757 Polynucleotide 5'-Hydroxyl-Kinase Proteins 0.000 description 3
- 102000008422 Polynucleotide 5'-hydroxyl-kinase Human genes 0.000 description 3
- 108091034057 RNA (poly(A)) Proteins 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 3
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 3
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 3
- 238000011161 development Methods 0.000 description 3
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 3
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 3
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 3
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 3
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 description 3
- 230000006870 function Effects 0.000 description 3
- 229940044627 gamma-interferon Drugs 0.000 description 3
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 3
- 230000004957 immunoregulator effect Effects 0.000 description 3
- 210000000287 oocyte Anatomy 0.000 description 3
- 238000007911 parenteral administration Methods 0.000 description 3
- 101150047627 pgk gene Proteins 0.000 description 3
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 3
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 3
- 108020004418 ribosomal RNA Proteins 0.000 description 3
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 3
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 3
- 239000001226 triphosphate Substances 0.000 description 3
- 235000011178 triphosphate Nutrition 0.000 description 3
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108020004463 18S ribosomal RNA Proteins 0.000 description 2
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000013563 Acid Phosphatase Human genes 0.000 description 2
- 108010051457 Acid Phosphatase Proteins 0.000 description 2
- 102000007698 Alcohol dehydrogenase Human genes 0.000 description 2
- 108010021809 Alcohol dehydrogenase Proteins 0.000 description 2
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 2
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 2
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 2
- 108020003215 DNA Probes Proteins 0.000 description 2
- 239000003298 DNA probe Substances 0.000 description 2
- 238000012270 DNA recombination Methods 0.000 description 2
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 2
- 241001302584 Escherichia coli str. K-12 substr. W3110 Species 0.000 description 2
- 102000005731 Glucose-6-phosphate isomerase Human genes 0.000 description 2
- 108010070600 Glucose-6-phosphate isomerase Proteins 0.000 description 2
- 241000700721 Hepatitis B virus Species 0.000 description 2
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 2
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 2
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 2
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 2
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 2
- 102000007562 Serum Albumin Human genes 0.000 description 2
- 108010071390 Serum Albumin Proteins 0.000 description 2
- 108091036066 Three prime untranslated region Proteins 0.000 description 2
- 241000251539 Vertebrata <Metazoa> Species 0.000 description 2
- 241000711975 Vesicular stomatitis virus Species 0.000 description 2
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 description 2
- 241000269368 Xenopus laevis Species 0.000 description 2
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 2
- 239000000853 adhesive Substances 0.000 description 2
- 230000001070 adhesive effect Effects 0.000 description 2
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 2
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 2
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 2
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 2
- 244000309466 calf Species 0.000 description 2
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 2
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 2
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 2
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 2
- 230000000120 cytopathologic effect Effects 0.000 description 2
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 2
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 2
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 2
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 2
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 102000006602 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Human genes 0.000 description 2
- 108020004445 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Proteins 0.000 description 2
- 230000002414 glycolytic effect Effects 0.000 description 2
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 2
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 2
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 2
- -1 isocytochrome c Proteins 0.000 description 2
- 230000003211 malignant effect Effects 0.000 description 2
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000002297 mitogenic effect Effects 0.000 description 2
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 description 2
- 210000005105 peripheral blood lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 2
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 2
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 2
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 2
- UNXRWKVEANCORM-UHFFFAOYSA-N triphosphoric acid Chemical compound OP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O UNXRWKVEANCORM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 2
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 2
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 2
- PLVPPLCLBIEYEA-WAYWQWQTSA-N (z)-3-(1h-indol-3-yl)prop-2-enoic acid Chemical compound C1=CC=C2C(\C=C/C(=O)O)=CNC2=C1 PLVPPLCLBIEYEA-WAYWQWQTSA-N 0.000 description 1
- GZCWLCBFPRFLKL-UHFFFAOYSA-N 1-prop-2-ynoxypropan-2-ol Chemical compound CC(O)COCC#C GZCWLCBFPRFLKL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100030310 5,6-dihydroxyindole-2-carboxylic acid oxidase Human genes 0.000 description 1
- 101710163881 5,6-dihydroxyindole-2-carboxylic acid oxidase Proteins 0.000 description 1
- GVUOPSNMFBICMM-UHFFFAOYSA-N 5-bromo-6-morpholin-4-yl-1h-pyrimidine-2,4-dione Chemical compound OC1=NC(O)=C(Br)C(N2CCOCC2)=N1 GVUOPSNMFBICMM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229930024421 Adenine Natural products 0.000 description 1
- GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N Adenine Chemical compound NC1=NC=NC2=C1N=CN2 GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100039986 Apoptosis inhibitor 5 Human genes 0.000 description 1
- DPWDPEVGACCWTC-SRVKXCTJSA-N Asn-Tyr-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O DPWDPEVGACCWTC-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101100427060 Bacillus spizizenii (strain ATCC 23059 / NRRL B-14472 / W23) thyA1 gene Proteins 0.000 description 1
- 244000063299 Bacillus subtilis Species 0.000 description 1
- 235000014469 Bacillus subtilis Nutrition 0.000 description 1
- 0 CC*(CCC=C1C[C@](CC=*C)*(C)C1)CCC=N* Chemical compound CC*(CCC=C1C[C@](CC=*C)*(C)C1)CCC=N* 0.000 description 1
- CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N Carbon dioxide Chemical compound O=C=O CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 description 1
- 108010062580 Concanavalin A Proteins 0.000 description 1
- YHDXIZKDOIWPBW-WHFBIAKZSA-N Cys-Gln Chemical compound SC[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(N)=O YHDXIZKDOIWPBW-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- JIZRUFJGHPIYPS-SRVKXCTJSA-N Cys-Tyr-Cys Chemical compound C1=CC(=CC=C1C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CS)N)O JIZRUFJGHPIYPS-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 1
- 238000007400 DNA extraction Methods 0.000 description 1
- 108010008286 DNA nucleotidylexotransferase Proteins 0.000 description 1
- 102000004163 DNA-directed RNA polymerases Human genes 0.000 description 1
- 108090000626 DNA-directed RNA polymerases Proteins 0.000 description 1
- 108090000204 Dipeptidase 1 Proteins 0.000 description 1
- 241000588921 Enterobacteriaceae Species 0.000 description 1
- 241001522878 Escherichia coli B Species 0.000 description 1
- 101000867232 Escherichia coli Heat-stable enterotoxin II Proteins 0.000 description 1
- 101100153154 Escherichia phage T5 thy gene Proteins 0.000 description 1
- QTANTQQOYSUMLC-UHFFFAOYSA-O Ethidium cation Chemical compound C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CC)=C1C1=CC=CC=C1 QTANTQQOYSUMLC-UHFFFAOYSA-O 0.000 description 1
- 108091029865 Exogenous DNA Proteins 0.000 description 1
- 208000034454 F12-related hereditary angioedema with normal C1Inh Diseases 0.000 description 1
- 108010001496 Galectin 2 Proteins 0.000 description 1
- 102100021735 Galectin-2 Human genes 0.000 description 1
- 108700039691 Genetic Promoter Regions Proteins 0.000 description 1
- 108700007698 Genetic Terminator Regions Proteins 0.000 description 1
- 102000030595 Glucokinase Human genes 0.000 description 1
- 108010021582 Glucokinase Proteins 0.000 description 1
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 1
- 102000005548 Hexokinase Human genes 0.000 description 1
- 108700040460 Hexokinases Proteins 0.000 description 1
- 101000959871 Homo sapiens Apoptosis inhibitor 5 Proteins 0.000 description 1
- 102000002265 Human Growth Hormone Human genes 0.000 description 1
- 108010000521 Human Growth Hormone Proteins 0.000 description 1
- 239000000854 Human Growth Hormone Substances 0.000 description 1
- 108090000144 Human Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000003839 Human Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010063296 Kinesin Proteins 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- 229930182816 L-glutamine Natural products 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N L-lysine Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 1
- 108090001090 Lectins Proteins 0.000 description 1
- 102000004856 Lectins Human genes 0.000 description 1
- 239000006137 Luria-Bertani broth Substances 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 1
- HLZORBMOISUNIV-DCAQKATOSA-N Met-Ser-Leu Chemical compound CSCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC(C)C HLZORBMOISUNIV-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 1
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 1
- 102000001105 Phosphofructokinases Human genes 0.000 description 1
- 108010069341 Phosphofructokinases Proteins 0.000 description 1
- 102000012288 Phosphopyruvate Hydratase Human genes 0.000 description 1
- 108010022181 Phosphopyruvate Hydratase Proteins 0.000 description 1
- 102000004203 Phosphoric Triester Hydrolases Human genes 0.000 description 1
- 108090000754 Phosphoric Triester Hydrolases Proteins 0.000 description 1
- 108091000080 Phosphotransferase Proteins 0.000 description 1
- 108010011939 Pyruvate Decarboxylase Proteins 0.000 description 1
- 102000017143 RNA Polymerase I Human genes 0.000 description 1
- 108010013845 RNA Polymerase I Proteins 0.000 description 1
- 102000009572 RNA Polymerase II Human genes 0.000 description 1
- 108010009460 RNA Polymerase II Proteins 0.000 description 1
- 102000014450 RNA Polymerase III Human genes 0.000 description 1
- 108010078067 RNA Polymerase III Proteins 0.000 description 1
- 230000007022 RNA scission Effects 0.000 description 1
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 1
- 101710141795 Ribonuclease inhibitor Proteins 0.000 description 1
- 229940122208 Ribonuclease inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 102100037968 Ribonuclease inhibitor Human genes 0.000 description 1
- 101100313751 Rickettsia conorii (strain ATCC VR-613 / Malish 7) thyX gene Proteins 0.000 description 1
- 101150014136 SUC2 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000293869 Salmonella enterica subsp. enterica serovar Typhimurium Species 0.000 description 1
- 241000607720 Serratia Species 0.000 description 1
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 1
- 244000261122 Torulopsis holmii Species 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- 108091023045 Untranslated Region Proteins 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 229960000643 adenine Drugs 0.000 description 1
- 230000007815 allergy Effects 0.000 description 1
- 210000001691 amnion Anatomy 0.000 description 1
- 230000002022 anti-cellular effect Effects 0.000 description 1
- 230000001028 anti-proliverative effect Effects 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 239000008346 aqueous phase Substances 0.000 description 1
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 1
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 230000000721 bacterilogical effect Effects 0.000 description 1
- 102000006635 beta-lactamase Human genes 0.000 description 1
- 230000000975 bioactive effect Effects 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 230000008827 biological function Effects 0.000 description 1
- 210000000601 blood cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000009835 boiling Methods 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 1
- 235000011089 carbon dioxide Nutrition 0.000 description 1
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 description 1
- 238000012832 cell culture technique Methods 0.000 description 1
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 1
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 1
- 238000002144 chemical decomposition reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003638 chemical reducing agent Substances 0.000 description 1
- 238000013375 chromatographic separation Methods 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 230000002759 chromosomal effect Effects 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 239000000356 contaminant Substances 0.000 description 1
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 1
- 108091092330 cytoplasmic RNA Proteins 0.000 description 1
- SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N dATP Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 1
- SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N dATP Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1CC(O)C(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J dCTP(4-) Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@@H]1O[C@H](COP([O-])(=O)OP([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O)[C@@H](O)C1 RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J 0.000 description 1
- HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N dGTP Chemical compound C1=NC=2C(=O)NC(N)=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N 0.000 description 1
- NHVNXKFIZYSCEB-XLPZGREQSA-N dTTP Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)C1 NHVNXKFIZYSCEB-XLPZGREQSA-N 0.000 description 1
- 230000000593 degrading effect Effects 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 239000005546 dideoxynucleotide Substances 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N dithiothreitol Chemical compound SC[C@@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 150000002085 enols Chemical class 0.000 description 1
- 231100000655 enterotoxin Toxicity 0.000 description 1
- 238000012869 ethanol precipitation Methods 0.000 description 1
- ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N ethidium bromide Chemical compound [Br-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CC)=C1C1=CC=CC=C1 ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960005542 ethidium bromide Drugs 0.000 description 1
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 description 1
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 1
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 1
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 1
- 239000012467 final product Substances 0.000 description 1
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 1
- 239000012737 fresh medium Substances 0.000 description 1
- 101150034785 gamma gene Proteins 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 230000035784 germination Effects 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000008187 granular material Substances 0.000 description 1
- 208000016861 hereditary angioedema type 3 Diseases 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 125000000487 histidyl group Chemical group [H]N([H])C(C(=O)O*)C([H])([H])C1=C([H])N([H])C([H])=N1 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- 239000005457 ice water Substances 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- PLVPPLCLBIEYEA-UHFFFAOYSA-N indoleacrylic acid Natural products C1=CC=C2C(C=CC(=O)O)=CNC2=C1 PLVPPLCLBIEYEA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000005304 joining Methods 0.000 description 1
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 1
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 1
- 239000002523 lectin Substances 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 230000036210 malignancy Effects 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 1
- HOVAGTYPODGVJG-VEIUFWFVSA-N methyl alpha-D-mannoside Chemical compound CO[C@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H]1O HOVAGTYPODGVJG-VEIUFWFVSA-N 0.000 description 1
- 238000009629 microbiological culture Methods 0.000 description 1
- 239000003226 mitogen Substances 0.000 description 1
- 230000001613 neoplastic effect Effects 0.000 description 1
- 239000002777 nucleoside Substances 0.000 description 1
- 210000004940 nucleus Anatomy 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 229940046166 oligodeoxynucleotide Drugs 0.000 description 1
- 201000008968 osteosarcoma Diseases 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- 229940056360 penicillin g Drugs 0.000 description 1
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 1
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 1
- PHEDXBVPIONUQT-RGYGYFBISA-N phorbol 13-acetate 12-myristate Chemical compound C([C@]1(O)C(=O)C(C)=C[C@H]1[C@@]1(O)[C@H](C)[C@H]2OC(=O)CCCCCCCCCCCCC)C(CO)=C[C@H]1[C@H]1[C@]2(OC(C)=O)C1(C)C PHEDXBVPIONUQT-RGYGYFBISA-N 0.000 description 1
- 239000002644 phorbol ester Substances 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 230000035479 physiological effects, processes and functions Effects 0.000 description 1
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 description 1
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 1
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 238000011321 prophylaxis Methods 0.000 description 1
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 1
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 description 1
- 230000022532 regulation of transcription, DNA-dependent Effects 0.000 description 1
- 239000003161 ribonuclease inhibitor Substances 0.000 description 1
- 239000002342 ribonucleoside Substances 0.000 description 1
- 210000003705 ribosome Anatomy 0.000 description 1
- 239000007320 rich medium Substances 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 238000012882 sequential analysis Methods 0.000 description 1
- 238000013207 serial dilution Methods 0.000 description 1
- 108010048397 seryl-lysyl-leucine Proteins 0.000 description 1
- 239000002356 single layer Substances 0.000 description 1
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 1
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 238000000527 sonication Methods 0.000 description 1
- 238000009987 spinning Methods 0.000 description 1
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 1
- 238000012430 stability testing Methods 0.000 description 1
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 1
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 238000000856 sucrose gradient centrifugation Methods 0.000 description 1
- 239000013589 supplement Substances 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 101150072314 thyA gene Proteins 0.000 description 1
- 238000012090 tissue culture technique Methods 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 230000014621 translational initiation Effects 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Landscapes
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Изобретението се отнася до получаване на нов рекомбинантен имунен интерферон и dеs-сys-тyr-сys рекомбинантен човешки имунен интерферон чрез рекомбинантни днк техники с помощта на който и да е от известните експресионни вектори и култури гостоприемници. Човешкият имунен (гама)интерферон (ifн) е изолиран и характеризиран чрез днк и аминокиселинни последователности, физични отнасяния и биологични активности. 7 претенции, 16 фигуриThe invention relates to the production of novel recombinant immune interferon and des-cys-tyr-cys recombinant human immune interferon by recombinant DNA techniques using any of the known expression vectors and host cultures. Human immune (gamma) interferon (ifn) has been isolated and characterized by DNA and amino acid sequences, physical properties and biological activities. 7 claims, 16 figures
Description
Това изобретение се отнася до областта на рекомбинантната ДНК технология, до средствата и методите, които използва тази технология при откриването на ДНК последователността и при прогнозирането на амино киселинната последователност за човешкия имунен интерферон и неговото продуциране, както и до различните продукти на това продуциране и тяхната употреба.This invention relates to the field of recombinant DNA technology, to the means and methods used by this technology in detecting the DNA sequence and in predicting the amino acid sequence for human immune interferon and its production, as well as the various products of this production and their production. use.
По- специално, изобретението се отнася до изолирането и идентифицирането на ДНК последователности, кодиращи човешки имунен интерферон и до конструирането на рекомбинантни експресионни средства, съдържащи такива ДНК последователности, оперативно свързани с въздействащи на експресията промоторни последователности и с такаMore particularly, the invention relates to the isolation and identification of DNA sequences encoding human immune interferon and to the construction of recombinant expression agents containing such DNA sequences operatively linked to expression-promoting promoter sequences and thus
конструираните експресионни средства. В друг аспект, настоящето изобретение се отнася до гостоприемникови културални системи, като напр. различни микроорганизми и клетъчни култури на гръбначни, трансформирани с такива експресионни средства и по този начин насочени към експресията на ДНК последователностите?посочени по- горе. В други отношения изобретението се отнася до средствата и методите за превръщане на крайните продукти на подобна експресия до нови по своята същност като фармацевтични състави, приложими за профилактика или лечение на хора. В предпочитаните изпълнения това изобретение обезпечава специални експресионни средства, които са съгласувани с оглед продуциране и секретиране на човешки имунен интерферон в неговата зряла форма от гостоприемниковите клетки. В допълнение, настоящето изобретение се отнася до различни процеси, приложими за получаване на посочените ДНК последователности, експресионни средства, гостоприемникови културални системи и крайни продукти ,както и до специфични и асоциирани варианти на изпълнение.constructed expression means. In another aspect, the present invention relates to host culture systems, such as e.g. various vertebrate microorganisms and cell cultures transformed with such expression agents and thus directed to the expression of DNA sequences ? mentioned above. In other respects, the invention relates to the means and methods of converting the end products of such expression to new inherently pharmaceutical compositions useful for the prophylaxis or treatment of humans. In preferred embodiments, the present invention provides special expression agents that are coordinated with a view to producing and secreting human immune interferon in its mature form from host cells. In addition, the present invention relates to various processes applicable to the preparation of said DNA sequences, expression agents, host culture systems and end products, and to specific and associated embodiments.
Настоящето изобретение възниква частично от откриването на ДНК последователността и прогнозираната амино сикелинна последователности, кодираща човешки имунен интерферон. В допълнение, настоящето изобретение обезпечава информация за 3'- и 5'- фланкиращите последователности за човешкия имунен интерферонен ген, улеснявайки тяхното in vitro свързване в експресионните средства. По- специално, осигурява се 5'- ДНК сегмент, кодиращ вероятният ендогенен сигнален полипептид, непосредствено предхожда амино киселинната последователност на вероятният човешки имунен интерферон. Тези открития на свой ред дават възможност за развиване на средствата и методите за получаване, чрез ДНК технология, на задоволително количество човешки имунен интерферон,The present invention arises in part from the discovery of the DNA sequence and the predicted amino-sikelin sequence encoding human immune interferon. In addition, the present invention provides information on the 3'- and 5'-flanking sequences of the human immune interferon gene, facilitating their in vitro binding in expression agents. In particular, a 5'-DNA segment encoding the probable endogenous signal polypeptide is provided immediately preceding the amino acid sequence of the probable human immune interferon. These findings, in turn, enable the development of the means and methods of obtaining, through DNA technology, a satisfactory amount of human immune interferon,
така че , да стане възможно определянето на неговите биохимични свойства и биологична активност.Публикациите и другите материали, използвани тук за осветляване нивото на изобретението, и в специални случаи за осигуряване на допълнителни подробности, имащи отношение към практиката , са включени в литературната справка, и за удобство са номерирани в следващия по-долу текст и групирани в приложената библиография.so that its biochemical properties and biological activity can be determined. Publications and other materials used herein to illuminate the level of the invention and, in special cases, to provide further details pertinent to the practice, are included in the references, and for convenience they are numbered in the text below and grouped in the accompanying bibliography.
НИВО НА ИЗОБРЕТЕНИЕТОBACKGROUND OF THE INVENTION
А. Човешки имунен интерферонA. Human immune interferon
Човешките интерферони могат да бъдат класифицирани в три групи на базата на различията в антигенността и биологичните и биохимични свойства.Human interferons can be classified into three groups based on differences in antigenicity and biological and biochemical properties.
Първата група обхваща семейство левкоцитни интерферони ( аинтерферон, LelF или IFN-а), които обикновено се продуцират главно от конституентни кръвни клетки при вирусна индукция. Те са били продуцирани микробиологично и е установено че притежават биологична активност (1,2,3). Техните биологични свойства са причина за приложението им в клиниката като терапевтични агенти за лечението на вирусни инфекции и злокачествени състояния (4).The first group comprises a family of leukocyte interferons (ainterferon, LelF or IFN-a), which are usually produced mainly by constitutive blood cells upon viral induction. They have been produced microbiologically and have been shown to have biological activity (1,2,3). Their biological properties are the reason for their use in the clinic as therapeutic agents for the treatment of viral infections and malignancies (4).
Към втората група се причислява човешкият фибробластен интерферон ( β- интерферон, FIF или IFN-β), обикновено продуциран от фибробласти при вирусна индукция, които също са продуцирани по микробиологичен път и за които е установен широк обхват от биологични активности (5). Клиничните изпитвания също показват тяхната потенциална терапевтична стойност. Левкоцитните и фибробластни интерферони проявяват много ясно сходство в техните биологични свойства поради факта че степента на хомоложност на амино киселинно ниво е относително ниска. В допълнение, двете групи интерферони съдържат от 165 до 166 амино киселини и са киселинно стабилни протеини.The second group includes human fibroblast interferon (β-interferon, FIF or IFN-β), usually produced by viral induction fibroblasts, which are also produced by a microbiological pathway and for which a wide range of biological activities have been identified (5). Clinical trials have also shown their potential therapeutic value. Leukocyte and fibroblast interferons show very clear similarities in their biological properties due to the fact that the degree of homology at the amino acid level is relatively low. In addition, the two interferon groups contain 165 to 166 amino acids and are acid-stable proteins.
Човешкият имунен интерферон (γ- интерферон, IIF или IFN-γ), към които е насочено настоящето изобретение, е обратно на а- и βинтерфероните, pH 2 лабилен, и се продуцира главно при митогенна индукция на лимфоцити и е също така ясно антигенно отличим. До скоро човешкият имунен интерферон можеше да бъде открит само в много ниски нива, което очевидно възпрепятстваше неговото охарактеризиране. Напоследък е , докладвано за твърде екстензивно, но все още частично пречистване на човешкия имунен интерферон (6). Съединението е продуцирано от лимфоцитни култури, стимулирани с комбинация от фитохемаглутинин и форболов естер и пречистено чрез секвенционно хроматографско разделяне. Тази процедура води до получаване на продукт с молекулно тегло от 58, 000.The human immune interferon (γ-interferon, IIF or IFN-γ) to which the present invention is directed is inverse to α- and β-interferons, pH 2 labile, and is mainly produced by mitogenic induction of lymphocytes and is also clearly antigenically distinct . Until recently, human immune interferon could only be detected at very low levels, which obviously impeded its characterization. Recently, a very extensive but still partial purification of human immune interferon has been reported (6). The compound is produced from lymphocyte cultures stimulated with a combination of phytohaemagglutinin and phorbol ester and purified by sequential chromatographic separation. This procedure results in a product having a molecular weight of 58,000.
Чрез транслиране на тРНК в ооцити е продуциран в много малки количества човешки имунен интерферон, показващ характеристика на интерферонова активност, аналогична на човешкият имунен интерферон ,което дава надеждата, че имуноинтерферонова сДНК може да бъде синтезирана и клонирана (7).By translating mRNA into oocytes, very small amounts of human immune interferon are produced, exhibiting a characteristic of interferon activity similar to human immune interferon, which gives hope that immunointerferon cDNA can be synthesized and cloned (7).
Количеството имунен интерферон, получено досега, е наистина недостатъчно за провеждане на независими експерименти за охарактеризиране и за определяне на биологичните свойства на пречистеният компонент. Обаче in vitro изследванията, осъществени със суров препарат, така както и in vivo експериментите с муринови γ- интерферонови препаратиThe amount of immune interferon obtained so far is indeed insufficient to conduct independent experiments to characterize and determine the biological properties of the purified component. However, in vitro studies performed with crude preparation as well as in vivo experiments with murine γ-interferon preparations
предполагат, че първичната функция на имуно интерферона може да бъде както на един имунорегулаторен агент (8, 9). Имуноинтерферонът притежава не само антивирусна и антиклетъчна активност както всички останали човешки интерферони, но показва също и потенциращ ефект за тези активности с а- и β- интерферон (10). Освен това, in vitro антипролиферативният ефект на γ- интерферона върху туморни клетки е приблизително 10- до 100- пъти по- висок от този, докладван за другите интерферонови класове (8, 11, 12 ). Този резултат, заедно с неговата ясно изразена имунорегулаторна роля (8, 9), предполага малко по- високи антитуморни възможности за IFN- γ отколкото за IFN- а и IFN- β. В действителност, in vivo експериментите с мишка и муринови IFN-γ препарати показват ясно превъзходство над антивирусно индуцираните интерферони в техният антитуворен ефект срещу остеогенна саркома (13).suggest that the primary function of immune interferon may be as of an immunoregulatory agent (8, 9). Immunointerferon not only has antiviral and anti-cellular activity like all other human interferons, but also shows a potentiating effect on these activities with α- and β-interferon (10). In addition, the in vitro antiproliferative effect of γ-interferon on tumor cells is approximately 10- to 100-fold greater than that reported for other interferon classes (8, 11, 12). This result, together with its pronounced immunoregulatory role (8, 9), suggests slightly higher antitumor potential for IFN-? Than for IFN-? And IFN- ?. In fact, in vivo experiments with mouse and murine IFN-γ preparations show a clear superiority over antiviral-induced interferons in their antitumor effect against osteogenic sarcoma (13).
Всички тези изследвания до настоящето изобретение са били осъществявани с твърде сурови препарати. Независимо от това, те в действителност предполагат много важни биологични функции за имунния интереферон. Имунният интерферон притежава не само потенциална асоциирана антивирусна активност, но вероятно и силна имунорегулаторна и антитуморна активност, ясно насочваща към потенциално многообещаващи клинични приложения.All these studies of the present invention have been carried out with too crude preparations. Nevertheless, they actually suggest very important biological functions for immune interferon. Immune interferon has not only potential associated antiviral activity, but probably also strong immunoregulatory and antitumor activity, clearly targeting potentially promising clinical applications.
Твърди се, че прилагането на рекомбинантната ДНК технология е найефективният начин за осигуряване на необходимото по-голямо количество човешки имунен интерферон. Дали така продуцираните материали включват или не гликозилации, за които се счита?че са характерни за природния , получен от човека, материал, те по всяка вероятност проявяват биологична активност, предполагаща тяхното клинично приложение за лечение на широк кръг вирусни, неопластични и имуносупреорни състояния или заболявания.It is claimed that the application of recombinant DNA technology is the most effective way of providing the greater amount of human immune interferon required. Do the materials produced in this way include or are not glycosylation considered ? that they are characteristic of natural human-derived material, they are likely to exhibit biological activity suggesting their clinical application for the treatment of a wide range of viral, neoplastic and immunosuppressive conditions or diseases.
В. Рекомбинантна ДНК технологияB. Recombinant DNA technology
Рекомбинантната ДНК технология достигна своята зряла възраст. Молекулярните биолози са в състояние да рекомбинират различни ДНК последователности с лекота, създавайки нови ДНК средства, способни да продуцират копия от различни ендогенни продукти в трансформирани микроорганизми. Основните средства и методи, които се използват, са in vitro свързванията на различни слепи или лепливи крайни фрагменти на ДНК, продуциращи потенциално експресиращи средства, които се използват в частично трансформираните организми, насочвайки ги по този начин към синтезирането на желан екзогенен продукт. Но за отделния продукт обмяната остава изменчива и науката не е в състояние да предскаже получаването на постоянен резултат. Този, който предсказва успешни резултати без да посочи експериментални данни, прави това с относителенRecombinant DNA technology has reached adulthood. Molecular biologists are able to recombine different DNA sequences with ease, creating new DNA agents capable of producing copies of various endogenous products in transformed microorganisms. The main agents and methods used are in vitro binding of various blind or sticky DNA fragments producing potentially expressing agents that are used in partially transformed organisms, thereby directing them to synthesize the desired exogenous product. But for the individual product, the exchange remains volatile and science is unable to predict a permanent result. The one who predicts successful results without providing experimental data does so with a relative
риск.risk.
Плазмидът, нехромозомна бримка от двойноверижна ДНК, изолиран от бактерии и други микроорганизми, който е способен на многократно самовъзпроизвеждане, остава основен елемент на рекомбинантната ДНК технология. Включеното в информацията, кодирана в плазмидната ДНК,е онова, което е необхадимо за репродуциране на плазмида в дъщерни клетки ( т.е. източник на репликацията ) и обикновено една или повече фенотипично подбрани характеристики като, в случаите на бактерии, устойчивост на антибиотици, позволява клонове от гостоприемниковата клетка, съдържаща желания плазмид, да бъдат разпознати и преференциално култивирани на подбрана среда. Приложимастта на плазмидите лежи във възможността да бъдат специфично разградени с един или друг ендонуклеазен ензим или рестрикционен ензим, всеки от които разпознава различно място в плазмидната ДНК. Порадидова става възможно инсертирането на хетероложни гени или генни фрагменти в плазмида посредством присъединяване в мястото на разграждане или при реконструираните краища, съседни на мястото на разграждане. Така се формират така нар.Plasmid, a non-chromosomal double strand DNA strand isolated from bacteria and other microorganisms capable of multiple reproduction, remains an essential element of recombinant DNA technology. Included in the information encoded in the plasmid DNA is that which is necessary to reproduce the plasmid in daughter cells (i.e., the source of replication) and typically one or more phenotypically selected characteristics such as, in the case of bacteria, antibiotic resistance, allows clones of the host cell containing the desired plasmid to be recognized and preferentially cultured in the selected medium. The applicability of plasmids lies in the ability to be specifically degraded by one or the other endonuclease enzyme or restriction enzyme, each of which recognizes a different site in plasmid DNA. Therefore, it is possible to insert heterologous genes or gene fragments into the plasmid by joining them at the site of degradation or at the reconstructed ends adjacent to the site of degradation. That's how they form so-called
репликативно експресионни средства. ДНК рекомбинацията се осъществява извън клетката, но полученото в резултат рекомбинантно репликативно експресионно средство или плазмид, може да бъде въведено в клетката по известен на специалистите начин, наречен трансформация и по този начин да бъдат получени големи количества от рекомбинантното средство чрез култивиране на трансформантите. Нещо повече, когато генът е инсертиран съобразно частта на плазмида, регулираща транскрибцията и транслацията а кодираното ДНК съобщение, полученото в резултат експресионно средство може да бъде използвано за актуализиране получаването на полипептидната последователност, която инсертираният ген кодира, а целият процес се нарича експресия.replicative expression agents. DNA recombination takes place outside the cell, but the resulting recombinant replicative expression agent or plasmid can be introduced into the cell in a manner known in the art, called transformation, and thus obtain large quantities of the recombinant agent by culturing the transformants. Moreover, when the gene is inserted according to the part of the plasmid that regulates transcription and translation and the encoded DNA message, the resulting expression means can be used to update the production of the polypeptide sequence that the inserted gene encodes, and the whole process is called expression.
Експресията се инциира в област, наречена промоторна, която' се разпознава и свързва с РНК полимераза. В транскрибционната фаза на експресията, ДНК се деспирализира, превръщайки се в матрица за иницииран синтез на транспортна (т) РНК от ДНК последователността. Транспортната РНК на свой ред се транслира в полипептид, притежаващ амино киселинна последователност, кодирана от нуклеотидния триплет или код, която като цяло дава структурният ген, т.е. тази част, която кодира амино киселинната последователност на експресираният полипептиден продукт. Транслацията се инициира при старт сигнал (обикновено ATG, който в получената транспортна РНК преминава в AUG). Така наречените стоп кодони определят края на транслацията и следователно, продукцията на следващите амино киселинни единици. Крайният продукт може да бъде получен чрез лизиране, ако е необходимо, на гостоприемниковата кетка от микробната система и възстановяване iia продукта чрез подходящо пречистване от други протеини.Expression is initiated in an area called a promoter that is recognized and binds to RNA polymerase. In the transcription phase of expression, DNA is desirculated, becoming an template for initiating synthesis of transport (m) RNA from the DNA sequence. The transport RNA is in turn translated into a polypeptide having an amino acid sequence encoded by the nucleotide triplet or code that generally gives the structural gene, i. that portion that encodes the amino acid sequence of the expressed polypeptide product. The translation is initiated at the start signal (usually ATG, which in the resulting transport RNA passes into AUG). The so-called stop codons determine the end of translation and, therefore, the production of subsequent amino acid units. The final product can be obtained by lysis, if necessary, of the host cell from the microbial system and recovery of the product by appropriate purification from other proteins.
На практика, с използването на рекомбинантната ДНК технология може да се експресират изцяло хетероложни пептиди - така наречената директна експресия - или обратно, може да се експресират хетероложни полипептиди които са слети с част от амино киселинната последователност на хомоложен полипептид. В последните случаи, очакваният биоактивен продукт може да премине в биологично неактивна форма вътре в слетия хомоложно / хетероложен полипептид до разграждането му в извън клетъчна среда. Виж Англ. патентна публ. No 2007676А и Wetzel, American Scientist 68, 664(1980).In practice, using recombinant DNA technology, fully heterologous peptides can be expressed - so-called direct expression - or vice versa, heterologous polypeptides that are fused to a portion of the amino acid sequence of a homologous polypeptide can be expressed. In the latter cases, the expected bioactive product may undergo biologically inactive form within the fusion homologous / heterologous polypeptide until degraded in an extracellular environment. See Eng. patent publication 2007676A and Wetzel, American Scientist 68, 664 (1980).
С. Технология на клетъчното култивиранеC. Cell culture technology
Техниката на клетъчното или тъканно култивиране за изучаване генетиката и физиологията на клетките е добре развита. Средствата и методите на тази технология служат за поддържане на постоянни клетъчни линии, получени чрез успешни серийни трансфери от изолирани нормални клетки. За използване при изследванията такива клетъчни линии се поддържат върху твърда повърхност в течна среда, или чрез култивиране в суспенсия, съдържаща твърди хранителни вещества. Изготвянето им в голям мащаб като че ли поставя само механични проблеми. За повече информация по отношение нивото на познанията в дадената област виж Microbiology, 2nd Edition, Harper and Row, Publishers, Inc. Hagerstown, Md.(1973), по-специално pp.1122 и Scientific American 245, 66 (1981), всеки от които включен в литературната справка.The cell or tissue culture technique for studying the genetics and physiology of cells is well-developed. The means and methods of this technology serve to maintain permanent cell lines obtained through successful serial transfers from isolated normal cells. For research use, such cell lines are maintained on a solid surface in a liquid medium or by culturing in a suspension containing solid nutrients. Making them on a large scale seems to only pose mechanical problems. For more information on the level of knowledge in the field, see Microbiology, 2nd Edition, Harper and Row, Publishers, Inc. Hagerstown, Md. (1973), in particular pp.1122 and Scientific American 245, 66 (1981), each of which is included in the literature.
ОБЩО ЗА ИЗОБРЕТЕНИЕТОTOTAL INVENTION
Настоящето изобретение се основава на откритието, че рекомбинантната ДНК технология може да бъде използвана за получаване на човешки имуноинтерферон, за предпочитане в директна форма и в количества, достатъчни за иницииране и провеждане тестуването на животни и хора при кленечни условия като предпоставка за одобрение за пазара. Продуктът е подходящ за използване във всички негови форми при профилактиката и лечението на хора с вирусна инфекция и злокачествени и имуносупресивни или имунодефицитни състояния. Тези негови форми включват различните възможн! олигомерни варианти, които да съдържатThe present invention is based on the discovery that recombinant DNA technology can be used to obtain human immunointerferon, preferably in direct form and in quantities sufficient to initiate and conduct testing of animals and humans under germination conditions as a prerequisite for market approval. The product is suitable for use in all its forms in the prevention and treatment of people with viral infection and malignant and immunosuppressive or immunodeficient conditions. These forms of it include the various possible! oligomeric variants to contain
I асоциирана гликозилация. Продуктът е получен чрез трансформирани по пътя на генното инженерство микроорганизми или чрез трансформирани клетъчни културални системи. Както се използва тук, терминът клетъчни трансформанти се отнася до клетки, в които е въведена ДНК, получена след екзогенно ДНК рекомбиниране и до потомството на която и да е от тези клетки, което съхранява така въведената ДНК. Така понастоящем съществува потенциал за получаване и изолиране на човешки имуноинтерферон по по-ефикасен начин. Особено значим фактор от настоящето изобретение в неговото предпочитано изпълнение е генетичното насочване на микроорганизмите за продуциране на човешки имунен интерферон в количства, позволяващи изолирането им след секретиране от гостоприемниковата клетка в зряла форма.And associated glycosylation. The product is obtained by genetically engineered microorganisms or by transformed cell culture systems. As used herein, the term cellular transformants refers to cells into which DNA has been introduced, obtained after exogenous DNA recombination, and to the progeny of any of those cells that stores the DNA so introduced. Thus, there is currently a potential to produce and isolate human immunointerferon in a more efficient manner. A particularly important factor of the present invention in its preferred embodiment is the genetic targeting of microorganisms to produce human immune interferon in amounts allowing them to be isolated after secretion by the host cell into mature form.
Настоящето изобретение обхваща така получения· имунен интерферон, както и средствата и методите за неговото получаване. По-нататък, то е насочено към реплициращи ДНК експресионни средства, помещаващи гениите секвенции, които кодират човешкия имуноинтерферон в подходяща за експресиране форма. Пб-нататък настоящето изобретение е насочено към щамове микроорганизми или клетъчни култури, трансформирани с експресионните средства, описани по-горе, и до микробиални или клетъчни култури на така трансформирани щамове или култури, способни да продуцират човешки имунен интерферон. В още един друг аспек изобретението е насочено към различни методи, приложими за получаване на генната последователност на посочения имунен интерферон, ДНК експресионните средства, щамове микроорганизми и клетъчни култури и тяхното специфично изпълнение. Още по-нататък това изобретение е насочено към получаване на ферментационни култури от дадените микроорганизми и клетъчни култури. В допълнение, това изобретение е насочено към получаване на човешки имунен интерферон като директен експресионен продукт, секретиран от гостоприемниковата клетка в зряла форма. Този подход предвижда използване на гена, кодиращ последователността на зрелия човешки имунен интерферон плюс 5' фланкиращата ДНК, кодираща сигналния полипептид. Счита се, че сигналният полипептид подпомага транспорта на молекулата до клетъчнатаThe present invention encompasses the immune interferon thus obtained as well as the means and methods for preparing it. Further, it is directed to replicating DNA expression agents containing gene sequences that encode human immunointerferon in a suitable expression form. The present invention is further directed to strains of microorganisms or cell cultures transformed with the expression agents described above and to microbial or cell cultures of such transformed strains or cultures capable of producing human immune interferon. In yet another aspect, the invention is directed to various methods applicable to obtain the gene sequence of said immune interferon, DNA expression agents, microorganism and cell culture strains and their specific embodiment. Still further, this invention is directed to the preparation of fermentation cultures from the given microorganisms and cell cultures. In addition, this invention is directed to the preparation of human immune interferon as a direct expression product secreted by the host cell in mature form. This approach involves the use of the gene encoding the sequence of mature human immune interferon plus the 5 'flanking DNA encoding the signaling polypeptide. The signaling polypeptide is thought to promote the transport of the molecule to the cellular
стена на гостоприемниковия организъм, където се разгражда по време на процеса на секретиране на зрелия човешки имуноинтерферонов продукт. Този вариант позволява изолирането и пречистването на очакваният зрял имунен интерферон,без да се прибягва до включване на процедури за елиминиране контаминанти на интрацелуларен гостоприемников протеин или клетъчни останки.a wall of the host organism where it degrades during the secretion process of the mature human immunointerferon product. This option allows isolation and purification of the expected mature immune interferon without resorting to procedures for eliminating contaminants of the intracellular host protein or cellular debris.
Изразът зрял продукт, използван в текста, обозначава човешкия имунен интерферон като продукт на микробиалната клетка или клетъчната култура, без сигнален пептид или предсеквенционен пептид, който да води непосредствено до транслация на човешка имуно интерферонова тРНК. Първи рекомбинантен имунен интерферон, осигурен съгласно настоящето изобретение е този, притежаващ метионин като първа амино киселина (представена благодарение на ATG страт сигналната кодонова инсерция срещу структурният ген) или, където метионинът е интра- или екстрацелуларно разграден и притежава както обикновено като първа амино киселина - цистеин. Зрял човешки имунен интерферон може също така да , бъде продуциран, j съгласно ' настоящето изобретение, заедно с конюгиран протеин, различен от конвенционалния сигнален пептид, като конюгата може да бъде специфично разграден в интра- или екстрацелуларна среда. Виж Англ. патентно описание Ν 2007676А. Накрая, зрелият човешки имунен >The term mature product, as used herein, refers to human immune interferon as a product of a microbial cell or cell culture, with no signal peptide or pre-sequencing peptide that results directly in translation of human immune interferon mRNA. The first recombinant immune interferon provided according to the present invention is one having methionine as the first amino acid (represented by the ATG stratal signal codon insertion against the structural gene) or, where methionine is intra- or extracellularly degraded and has as usual the first amino acid cysteine. Mature human immune interferon can also be produced according to the present invention, together with a conjugated protein other than the conventional signal peptide, the conjugate can be specifically degraded in intra- or extracellular media. See Eng. patent description Ν 2007676A. Finally, the mature human is immune
интерферон може да бъде продуциран чрез директна експресия без необходимост от разграждане по-нататък на който и да е чежд, излишен полипептид. Това по-специално е важно когато даден гостоприемник може неефективно да отстрани сигналният пептид или изобщо да не го отстрани, когато експресионното средство е конструирано да експресира зрелият човешки имунен интерферон заедно с неговия сигнален пептид. Така продуцираният зрял човешки имунен интерферон се възстановява и пречиства до ниво, необходимо за приложение при лечение на вирусни, злокачествени и имуносупресивни или имунодефицитни състояния.interferon can be produced by direct expression without the need for further degradation of any foreign, redundant polypeptide. This is particularly important when a host may ineffectively remove the signal peptide or not remove it at all when the expression agent is designed to express mature human immune interferon together with its signal peptide. The mature human immune interferon thus produced is recovered and purified to the level necessary for use in the treatment of viral, malignant and immunosuppressive or immunodeficient conditions.
Човешкият имунен интерферон се получава в следната последователност:Human immune interferon is obtained in the following sequence:
1. Човешки тъкани, например тъкан от слезка на човек или лимфоцити от периферната кръв, се култивират с митогени за стимулиране продукцията на имунен интерферон.1. Human tissues, such as human spleen tissue or peripheral blood lymphocytes, are cultured with mitogens to stimulate the production of immune interferon.
2. Клетъчните гранули от такива клетъчни култури се екстрахират в присъствие на рибонуклеазен инхибитор за изолиране на цялата цитоплазматична РНК.2. The cell granules of such cell cultures are extracted in the presence of a ribonuclease inhibitor to isolate all cytoplasmic RNA.
3. Олиго- dT колона изолира общата информационна (тРНК) в полиаденилационна форма. Тази тРНК се фракционира по размер с помощта на захарозен плътностен градиент и пикочно- кисела електрофореза.3. The oligodT column isolates the total information (mRNA) in polyadenylation form. This mRNA was fractionated by size using sucrose density gradient and uric acid electrophoresis.
4. Подходящата тРНК (12 до 18 S) се превръща в съответната едноверижна комплементарна ДНК (сДНК), от която се продуцира двойно верижна сДНК. След поли-dC удължаване, тя се инсертира във вектор, като плазмид, носещ един или повече фенотипични маркери.4. The appropriate mRNA (12 to 18 S) is converted to the corresponding single stranded complementary DNA (cDNA) from which double stranded cDNA is produced. After poly-dC extension, it is inserted into a vector, such as a plasmid carrying one or more phenotypic markers.
5. Така създадените вектори се използват за трансформиране на бактериални клетки, осигуряващи колонийна библиотека. Радиобелязаната сДНК, изготвена от индуцирана и неиндуцирана тРНК, получена както е описано по-горе, се използва за отделно сондиране на двойните колонийни библиотеки. Излишъкът от сДНК след това се отстранява и колониите се експонират на радиоактивен филм така че да се идентифицират индуцираните сДНК клонове.5. The vectors thus created are used to transform bacterial cells providing a colonial library. Radiolabeled cDNA prepared from induced and non-induced mRNA prepared as described above is used to separately probe the double colony libraries. The excess cDNA is then removed and the colonies are exposed to a radioactive film so as to identify the induced cDNA clones.
6. Съответната плазмидна ДНК се изолира и съгласува от индуцираните сДНК клонове.6. The corresponding plasmid DNA is isolated and matched by the cDNA-induced clones.
7. Първата съгласувана ДНК след това се удължава in vitro за инсерция в подходящо експресионно средство, което се използва за трансформиране на гостоприемникови клетки от Е. coli, които на свой ред, са в състояние да растат и експресират желаният човешки имуно интерферонов продукт.7. The first matched DNA is then extended in vitro for insertion into a suitable expression agent, which is used to transform E. coli host cells, which in turn are able to grow and express the desired human immune interferon product.
8. Така експресираният имунен интерферон несъмнено притежава 146 амино киселини в неговата зряла форма, започвайки от цистеин и е силно основен по характер. Неговото мономерно молекулно тегло е изчислено на 17, 140. Може би поради присъствието на множество основни остатъка, хидрофобността, образуването на мостове от соли и др., молекулата може да се асоциира в олигомерни форми, като напр. в димер, тример или тетрамер.Наблюдаваните по-рано високи молекулни тегла за природил материал (6), който не може да бъде установен само чрез преброяване на амино киселините , може да се дължи на такива олигомерни форми, така че да съдейства на карбохидрата от пост-транслационното гликозилиране.8. The immune interferon thus expressed undoubtedly possesses 146 amino acids in its mature form, beginning with cysteine and is highly basic in character. Its monomeric molecular weight is estimated to be 17, 140. Perhaps due to the presence of many basic residues, hydrophobicity, formation of bridges from salts, etc., the molecule can be associated in oligomeric forms, such as e.g. in the dimer, trimmer or tetramer. The previously observed high molecular weights for the naturally occurring material (6), which cannot be ascertained solely by amino acid counting, can be due to such oligomeric forms so as to promote the carbohydrate from post-translational glycosylation.
9. В същинските гостоприемникови клетъчни системи, по-специално когато са свързани в експресионно средство така че да бъде експресиран заедно с неговия сигнален пептид, зрялата форма на човешкия имунен интерферон се довежда до клетъчно културалната среда, което подпомага възстановяването и пречистването.9. In true host cell systems, especially when bound in an expression agent so that it is expressed together with its signal peptide, the mature form of human immune interferon is brought to the cell culture medium, which promotes recovery and purification.
ОПИСАНИЕ НА ПРЕДПОЧИТАНИТЕ ВАРИАНТИ НА ИЗПЪЛНЕНИЕDESCRIPTION OF THE PREFERRED EMBODIMENTS
А. Микроорганизми I Клетъчни културиA. Microorganisms I Cell cultures
1. Бактериални щамове / Промотори1. Bacterial Strains / Promoters
Описаните тук действия, са осъществени с участието на, inter alia, микроорганизма Е. coli К-12 щам 294 ( и A, thi-, hsr-, к hsm+), както е описано в Англ. патентна публ. N 2055382 А. Този щам е депозиран в АТСС под N 31446. Независимо от това, могат да бъдат използвани и много други микробиални щамове, включително Е. coli В, Е. coli X 1766 (ATCC N 31537 ) или други микробиални щамове, повечето от които са депозирани и (потенциално) на разположение от депозитните институти, като напр. АТСС, виж също и Германският Offenlegungssrift 2644432. Тези други микроорганизми включват, например, бактерии като Bacillus subtilis и други ентеробактерии, сред които могат да бъдат забелязани и Salmonella typhimurium и Serratia marcerans, използващи плазмиди, които могат да репликират и експресират хетероложни генни последователности.The actions described herein were performed with the participation of, inter alia, the microorganism E. coli K-12 strain 294 (and A, thi-, hsr-, k hsm +), as described in Eng. patent publication N 2055382 A. This strain is deposited in ATCC under N 31446. However, many other microbial strains may be used, including E. coli B, E. coli X 1766 (ATCC N 31537) or other microbial strains, most of which are deposited and (potentially) made available by depository institutions, such as. ATCC, see also German Offenlegungssrift 2644432. These other microorganisms include, for example, bacteria such as Bacillus subtilis and other enterobacteriaceae, among which Salmonella typhimurium and Serratia marcerans, which can replicate and exaggerate sequences, may be observed.
Например, бета лактамазните и лактозо промоторните системи са използвани преимуществено за иницииране и поддържане на микробиалното продуциране на хетероложни полипептиди.Детайлите, отнасящи се доFor example, beta lactamase and lactose promoter systems are predominantly used to initiate and maintain the microbial production of heterologous polypeptides.
конструирането на тези промоторни системи,са публикувани от Chang et al., Nature 275 617 ( 1978) и Itacura et al., Science 198 1056 (1977), които са включени в литературната справка. Наскоро е създадена така нар. trp промоторна система, основана на триптофана. Подробностите, отнасящи се до конструирането на такава системата публикувани от Goeddel et al., Nucleic Acid Research 8,4057 (1980) и Kleid et al., U. S. Ser. No 133 296, заявен на 24 март 1980, включени в литературната справка. Открити са и са използвани и много други бактериални промотори, а подробностите^отнасящи се до техните нуклеотидни последователности, позволяващи на специалистите в областта да ги свързват функционално в плазмидни вектори, са публикувани виж напр. Siebenlist et al., Cell 20, 269 (1980), включен в приложената литературна справка.constructs of these promoter systems have been published by Chang et al., Nature 275 617 (1978) and Itacura et al., Science 198 1056 (1977), which are included in the literature. Recently, a so-called trp-based tryptophan promoter system was created. Details concerning the design of such a system have been published by Goeddel et al., Nucleic Acid Research 8.4057 (1980) and Kleid et al., U. S. Ser. No. 133,296, filed March 24, 1980, incorporated by reference. Many other bacterial promoters have been identified and used, and details regarding their nucleotide sequences allowing those of skill in the art to bind them functionally to plasmid vectors have been published, see, e.g. Siebenlist et al., Cell 20, 269 (1980), incorporated herein by reference.
2. Дрождеви щамове / Дрождеви промотори2. Yeast strains / Yeast promoters
Използаната в изобретението експресионна система може да бъде плазмида YRp (14, 15, 16), който е способен на селекция и репликация както в E.coli, така и в дрождите Saccharomices cerevisiae. За селекция в дрожди, плазмидът съдържа гена TRP1 (14, 15, 16), чиито комплементи, позволяващи развитие в отсъствие на триптофан и съдържащи мутации в този ген, са намерени в хромозома IV (17). Използваният тук щам е RH218 (18), депозиран в АТСС без ограничения под N 44076. Обаче следва да се знае, че всеки щам Saccharomyces cerevisiae, съдържащ мутация, която прави клетката trpl, следва да бъде ефективна среда за експресия на плазмида, съдържащ експресионната система. Пример за друг щам, който би могъл да се използва, е рер 4-1 (19). Този триптофан ауксотрофен щам също притежава точкова мутация върху TRP1 гена.The expression system used in the invention may be the YRp plasmid (14, 15, 16), which is capable of selection and replication in both E. coli and the yeast Saccharomices cerevisiae. For selection in yeast, the plasmid contains the TRP1 gene (14, 15, 16), whose complement, allowing development in the absence of tryptophan and containing mutations in this gene, has been found in chromosome IV (17). The strain used here is RH218 (18) deposited in the ATCC without restriction below N 44076. However, it should be known that any strain of Saccharomyces cerevisiae containing a mutation that makes the trpl cell should be an effective expression medium for the plasmid containing the expression system. An example of another strain that could be used is rep 4-1 (19). This tryptophan auxotrophic strain also has a point mutation on the TRP1 gene.
Когато 5'- фланкиращата ДНК последователност (промотор) от дрождев ген (за алкохол дехидрогеназа) се постави върху 5'- края на ген с различен от дрождев произход, той може да съдейства за експресията на чужд ген в дрожди, ако бъде поместен в плазмид, приложим за трансформация на дрожди. Освен от промотор, истинската експресия на не-дрождев ген в дрожди изисква втора дрождева последователност, помесена при 3'- края на недрождев ген в плазмид, така че да позволи действително транскрибционно терминиране и полиаденилация в дрожди. Този промотор, както и други такива, може да бъде използван по подходящ начин в настоящето изобретение - виж по-горе. В предпочитаните варианти на изпълнение, 5'фланкиращата последователност от дрождевия 3- фосфоглицерат киназния ген (20) е разположен нагоре от структурния ген, последван отново от ДНК съдържаща терминатор - полиаденилационни сигнали, например TRP1 (14, 15, 16) гена или PGK (20) гена.When a 5'-flanking DNA sequence (promoter) of a yeast gene (for alcohol dehydrogenase) is placed at the 5'-end of a gene other than yeast origin, it can promote expression of a foreign gene in yeast if placed in a plasmid applicable to yeast transformation. In addition to the promoter, true expression of a non-yeast gene in yeast requires a second yeast sequence mixed at the 3'-end of the non-yeast gene in a plasmid to allow actual transcriptional termination and polyadenylation in yeast. This promoter, as well as others, can be used appropriately in the present invention - see above. In preferred embodiments, the 5'-flanking sequence of the yeast 3-phosphoglycerate kinase gene (20) is upstream of the structural gene, followed by DNA containing a terminator-polyadenylation signal, e.g., the TRP1 (14, 15, 16) gene or PGK ( 20) the gene.
Тъй като 5'- фланкиращата последователност (свързана с 3'- дрождева терминираща ДНК) (по-горе) може функционално да съдейства за експресия на чужди гени в дрожди, като че ли онези от 5’- фланкиращите последователности на който и да е високо експресивен дрождев ген, могат да бъдат използвани за експресия на важни генни продукти. Докато при някои обстоятелства дрождите експресират до 65 процента от разтворимия си протеин като гликолитични ензими (21) и доколкото това високо ниво се явява резултат от продуцирането на високи нива от индививуалната тРНК (22), би било възможно използването на 5'- фланкиращите последователности от които и да са други гликолитични гени за подобни експресионни цели като напр. енолаза, глицералдехид-3-фосфат дехидрогеназа, хексокиназа, пируват декарбоксилаза, фосфофрукто киназа, глюкозо-6-фосфат изомераза, фосфоглюкозо изомераза и глюкокиназа. Всяка от 3'- фланкиращите последователности на тези гени може също да бъде използвана заBecause the 5'-flanking sequence (linked to 3'-yeast termination DNA) (above) can functionally contribute to the expression of foreign genes in yeast, it seems that those of the 5'-flanking sequences of any high an expression yeast gene, can be used to express important gene products. While in some circumstances yeasts express up to 65 percent of their soluble protein as glycolytic enzymes (21) and insofar as this high level results from the production of high levels of individual mRNA (22), the use of 5'-flanking sequences of any other glycolytic genes for similar expression purposes such as e.g. enolase, glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, hexokinase, pyruvate decarboxylase, phosphofructo kinase, glucose-6-phosphate isomerase, phosphoglucose isomerase and glucokinase. Each of the 3'-flanking sequences of these genes can also be used for
терминиране и шРНК полиаденилация в такива експресионни системи - виж по-горе. Други високо експресионни гени са гените за киселите фосфатази (23) и гените, които експресират високи нива на продуктивност благодарение на мутации в 5'- фланкиращите области ( мутанти, повишаващи експресията), обикновено поради присъствието на ΊΎ1 транспозициониращ елемент (24).termination and mRNA polyadenylation in such expression systems - see above. Other high expression genes are the genes for acid phosphatases (23) and genes that express high levels of productivity due to mutations in the 5'-flanking regions (expression-enhancing mutants), usually due to the presence of a ΊΎ1 transposing element (24).
Всички отбелязани по-горе гени са такива, които могат да бъдат транскрибирани чрез дрождева РНК полимераза II (24). Възможно е промоторите за РНК полимераза I и III, които транскрибират гените за рибозомална РНК, 5S РНК и tPHK (24, 25) също да бъдат приложими за подобни експресионни структури.All the above mentioned genes are those that can be transcribed by yeast RNA polymerase II (24). It is possible that RNA polymerase I and III promoters that transcribe ribosomal RNA, 5S RNA and tRNA genes (24, 25) may also be applicable to similar expression structures.
Накрая, много дрождеви промотори също съдържат транскрибционен контрол, така че да могат да бъдат изключвани или включвани в зависимост от вариантите на условията на култивиране. Примери за такива дрождеви промотори са гените, които продуцират следните протеини : алкохол дехидрогеваза II, изоцитохром - с, кисела фосфатаза, разграждащи ензими, асоциирани с азотния метаболизъм, глицералдехид-3-фосфат дехидрогеназа и ензими, отговорни за използването на малтозата и галактозата (22). Такива контролни области биха били приложими при контролиране експресията на протеиновия продукт - по-специално когато тяхното получаване е токсично за дрождите. Би било възможно също така да се постави контролиращата област от една 5'- фланкираща последователност с 5'- фланкираща последователност, съдържаща промотор от високо експресиран ген. Това би довело до хибриден промотор и би било възможно доколкото контролиращата област и промоторната са отличими по физичен начин ДНК последователности.Finally, many yeast promoters also contain transcriptional control so that they can be excluded or switched on depending on variants of cultivation conditions. Examples of such yeast promoters are the genes that produce the following proteins: alcohol dehydrogenase II, isocytochrome c, acid phosphatase, degrading enzymes associated with nitrogen metabolism, glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase and enzymatic enzyme, and enzymatic enzyme utilization ). Such control regions would be useful in controlling the expression of the protein product - in particular when their production is toxic to yeast. It would also be possible to insert the control region of a 5'-flanking sequence with a 5'-flanking sequence containing a promoter of a highly expressed gene. This would lead to a hybrid promoter and would be possible as long as the control region and the promoter are physically distinct DNA sequences.
3. Клетъчно културални системи / Клетъчно културални вектори3. Cell culture systems / Cell culture vectors
Размножаването на клетки от vertebrata в култура ( тъканна култура) е рутинна процедура за последните години (виж Tissue Culture, Academic Press, Kruse and Patterson eds, 1973). Тук е използвана линията COS-7 от маймунски бъбречни фибробласти като гостоприемник за получаване на имунен интерферон (25). Но детайлно описаните тук^експерименти могат да бъдат проведени в която и да е клетъчна линия, способна да реплицира и експресира конкурентен вектор като напр. WI138, ВНК, ЗТЗ, СНО, VERO и HeLa клетъчни линии. В допълнение, изискването за експресионен векторе е, източникът на репликация и промотора, да е локализиран пред гена за експресиране, по дължината на който и да е необходим рибозомален свързващ сайт, РНК сайт на разцепване, полиаденилационен сайт и тренскрибционни терминиращи последователности. Независимо че тук се използват тези основни елементи на SV40, би могло да се разбере, че макар и описано в рамките на предпочитаните варианти на изпълнение, изобретението не трябва да се счита ограничено в : тя*: .и Например, може да се използва източника на репликацията на други вирусни вектори (като Polioma, Adeno, VSV, BPV и други подобни), така както и източници на репликация от клетката, които биха могли да функционират в неинтегрирано състояние.The propagation of vertebrata cells in culture (tissue culture) has been a routine procedure in recent years (see Tissue Culture, Academic Press, Kruse and Patterson eds, 1973). The COS-7 line from monkey kidney fibroblasts was used here as a host for the production of immune interferon (25). However, the detailed experiments described herein can be performed in any cell line capable of replicating and expressing a competing vector such as e.g. WI138, BHK, 3T3, CHO, VERO and HeLa cell lines. In addition, the requirement for an expression vector is that the replication source and promoter be located in front of the expression gene along any ribosomal binding site, RNA cleavage site, polyadenylation site, and transcriptional termination sequences. Although these basic elements of the SV40 are used here, it can be understood that, although described within the preferred embodiments, the invention should not be construed as limited in: it *: .and, for example, the source may be used replication of other viral vectors (such as Polioma, Adeno, VSV, BPV, and the like), as well as sources of cell replication that could function in a non-integrated state.
В. Векторни системиB. Vector systems
1. Директна експресия на зрял имунен интерферон в Е. coli1. Direct expression of mature immune interferon in E. coli
Процедурата, използвана за получаване на директно експресиране на IFN-y в Е. coli като зрял интерферонов полипептид ( без сигнална последователност), е вариант на тази, която използва по-ранен човешки растежен хормон (26) и човешки левкоцитарен интерферон (1), доколкото включва комбинацията от синтетична (N- крайна) и сДНК.The procedure used to obtain the direct expression of IFN-γ in E. coli as a mature interferon polypeptide (without signal sequence) is a variant of that using earlier human growth hormone (26) and human leukocyte interferon (1), insofar as it involves the combination of synthetic (N-terminal) and cDNA.
Както се предполага от нуклеотидната последователност на р69, описана по-горе и от сравняването на познатите сайтове на разграждане между сигналният пептид^! зрелият полипептид за няколко IFN- а (2), IFN -у притежава хидрофобен сигнален пептид от 20 амино киселини, последван от 146 амино киселини на зрелия IFN -у (фиг. 5). Както е показано на фиг. 7, BStNI рестрикционният ендонуклеазен сайт е конвенционално локализиран при амино киселина 4 на зрелия IFN- у. Конструирани са два синтетични олиго дезоксинуклеотида, които включват ATG транслационен иницииращ кодон, кодони за амино киселини 1, 2 и 3 (цистеин- тирозин- цистеин) и се създава EcoRI кохезивен край. Тези дезоксиолигонуклеотиди са свързани към 100 двойки бази BstNI- PstI фрагмент от р69 за конструиране на синтетичноприроден хибриден ген с 1115 двойки бази, който кодира IFN - у и който .е свързан чрез EcoRl и PstI рестрикционни сайтове. Този ген се инсертира в плазмида pLelF A trp 103 между EcoRl и PstI сайтовете за получаване на експресионният плазмид pIFN- γ trp 48. В този плазмид IFN -γ гена е експресиран под контрола на Е. coli trp промотор. ( pLelF A trp 103 е получен от pLelF А 25 в който сайта EcoRl, дистално спрямо LelF А гена е отстранен. Използваната за отстраняване на този сайт процедура е описана по- рано (27).As suggested by the nucleotide sequence of p69 described above and by comparing known degradation sites between the signal peptide? the mature polypeptide for several IFN-? (2), IFN-? has a hydrophobic signal peptide of 20 amino acids, followed by 146 amino acids of mature IFN-? (Fig. 5). As shown in FIG. 7, the BStNI restriction endonuclease site is conventionally located at amino acid 4 of mature IFN-γ. Two synthetic oligo deoxynucleotides have been constructed that include an ATG translation initiation codon, amino acid codons 1, 2, and 3 (cysteine tyrosine cysteine) and an EcoRI cohesive end is created. These deoxyoligonucleotides are linked to 100 base pairs of the BstNI-PstI fragment of p69 to construct a synthetic, 1115 base pair synthetic hybrid gene that encodes IFN-γ and which is linked via EcoR1 and PstI restriction sites. This gene is inserted into plasmid pLelF A trp 103 between EcoR1 and PstI sites to produce the expression plasmid pIFN- γ trp 48. In this plasmid, the IFN -γ gene is expressed under the control of the E. coli trp promoter. (pLelF A trp 103 was obtained from pLelF A 25 in which the EcoR1 site distal to the LelF A gene was removed. The procedure used to remove this site was described previously (27).
2. Експресия в дрожди2. Expression in yeast
За експресиране на хетероложен ген за имунен интерферон като сДНК в дрожди, е необходимо да се конструира плазмиден вектор, съдържащ четири компонента. Първият от тях е частта, позволяваща трансформиране както на Е. coli, така и на дрожди и по този начин следва да съдържа селективен ген от всеки организъм. (В случая това е гена за ампицилинова резистентност от Е. coli и гена TRP1 от дрожди). Този компонент също изисква източник на репликация ат два организма. (В случая това е езточника Е. coli от pBR322 и arsl източника от хромозома III на дрождите).In order to express a heterologous immune interferon gene such as cDNA in yeast, it is necessary to construct a plasmid vector containing four components. The first of these is the part that allows transformation of both E. coli and yeast and thus should contain a selective gene from each organism. (In this case, it is the ampicillin resistance gene from E. coli and the yeast TRP1 gene). This component also requires a source of replication for two organisms. (In this case, the E. coli source from pBR322 and the arsl source from yeast chromosome III).
Вторият компонент от плазмида е 5'-фланкиращата последователност от високо експресивен ген. за подпомагане транскрибцията на разположеният надолу в последователността структурен ген. В този случай, използваната 5'фланкираща последователност произхожда от дрождевият 3- фосфоглицерат киназен (PGK) ген. фрагментът е конструиран така, че да отстрани ATG от PGK структурната последователност като 8 вр надолу от този ATG. Тази последователност е заместена с последователността, съдържаща и двата рестрекционни сайта - XbdI и EcoRl, за удобство прикрепени към 5’фланкиращата последователност от структурният ген.The second component of the plasmid is the 5'-flanking sequence of a highly expressed gene. to aid in the transcription of the downstream structural gene. In this case, the 5'-flanking sequence used is derived from the yeast 3- phosphoglycerate kinase (PGK) gene. the fragment is designed to remove the ATG from the PGK structural sequence as 8 bp down from that ATG. This sequence is replaced by a sequence containing both restriction sites, XbdI and EcoR1, for convenience attached to the 5'flange sequence of the structural gene.
Третият компонент от системата е структурен ген, конструиран по същия начин, че да съдържа едновременно ATG транслационен старт и транслационен стоп сигнал. Изолирането на структури от такъв ген е описано по-долу.The third component of the system is a structural gene constructed in the same way as to contain both an ATG translation start and a translational stop signal. The isolation of structures from such a gene is described below.
Четвъртият компонент е дрождева последователност, съдържаща 3'фланкираща секвенция от дрождев ген, който съдържа същински сигнал за тренскрибционно терминиране и полиаденилация.The fourth component is a yeast sequence comprising a 3'-flanking sequence of a yeast gene that contains a substantive signal for transcriptional termination and polyadenylation.
Имунният интерферон е получен в присъствие на всички тези компоненти в дрождите.Immune interferon is obtained in the presence of all these components in yeast.
3. Експресия в клетъчни култури на бозайници3. Expression in mammalian cell cultures
Методиката за синтез на имунен интерферон в клетъчни култури на бозайници разчита на създаването на вектор, способен и на автономна репликация и на експресия на външен ген под контрола на хетероложна транскрибционна единица. Репликацията на този вектор в тъканна култура се осъществява чрез осигуряване на ДНК репликационен източник (получен от SV40 вирус) и обезпечава помощна функция (Т антиген) чрез въвеждането на вектора в клетъчна линия, ендогенно експресираща този антиген (28, 29). Късният промотор на SV вируса предшества структурният ген на интерферона и гарантира транскрибцията на гена.The methodology for the synthesis of immune interferon in mammalian cell cultures relies on the creation of a vector capable of both autonomous replication and expression of an external gene under the control of a heterologous transcription unit. Replication of this vector in tissue culture is accomplished by providing a DNA replication source (derived from the SV40 virus) and providing an auxiliary function (T antigen) by introducing the vector into a cell line endogenously expressing this antigen (28, 29). The late promoter of the SV virus precedes the structural gene of interferon and guarantees the transcription of the gene.
Векторът, използвай за получаване на експресия на IFN-y^ce състои от pBR322 последователности, които осигуряват селективен маркер за подбор в Е. coli (ампицилин резистентен), както и Е. coli източник на ДНК репликация. Тези последователности са получени от плазмида pML- 1 (28) и обхващат областта между рестрикционните сайтове Е. coli и BamHI. Източникът SV40 е получен от 342 двойки бази PvuII- Hindlll фрагмент, покриващ тази област (30,31) (двата края са превърнати в EcoRI краища). Тези последователности, като допълнение към това, че обхващат вирусния източник на репликация на ДНК, кодират промотор едновременно за ранната и за късната транскрибционна единица. Ориентацията на областта за SV40 източника е такава, каквато е на промотора за късната транскрибционна единица - проксимално на гена, кодиращ интерферон.The vector to use for IFN-γ expression is composed of pBR322 sequences that provide a selective marker for E. coli (ampicillin resistant) as well as E. coli DNA replication source. These sequences are derived from plasmid pML-1 (28) and span the region between the restriction sites E. coli and BamHI. The SV40 source was obtained from 342 base pairs of the PvuII-HindIII fragment covering this region (30,31) (both ends converted to EcoRI ends). These sequences, in addition to encompassing the viral source of DNA replication, encode a promoter for both the early and late transcription units. The orientation of the SV40 source region is that of the late transcription unit promoter - proximal to the interferon encoding gene.
КРАТКО ОПИСАНИЕ НА ЧЕРТЕЖИТЕBRIEF DESCRIPTION OF THE DRAWINGS
Фиг. 1 показва захарозния г градиент на центрофугиране на индуцирана в лимфоцити от периферната кръв Поли(А) + РНК. Наблюдавани са два пика на интерферонова активност (както е показано чрез защриховани кутийки) с размери 12S и 16S. Местата на рибозомните РНК маркери (центрофугирани незабавно) са белязани над абсорбционният профил.FIG. 1 shows the sucrose d gradient of lymphocyte-induced spinning of peripheral blood Poly (A) + RNA. Two peaks of interferon activity (as indicated by shaded boxes) of 12S and 16S sizes were observed. The sites of ribosomal RNA markers (centrifuged immediately) are marked above the absorption profile.
фиг. 2 показва електрофореза на индуцирана PBL Поли(А)+РНК върху пикочнокисела агароза. Наблюдаван е само един пик на активност, който е за 18S РНК. Позицията на рибозомалните РНК маркери, които са подложени на електрофореза в съседстна линия и визуализирани с етидиум бромид, са отбелязани над профила на активността.FIG. 2 shows PBL induced poly (A) + RNA electrophoresis on uric acid agarose. Only one peak of activity was observed, which is for 18S RNA. The position of ribosomal RNA markers, which were subjected to adjacent line electrophoresis and visualized with ethidium bromide, were noted above the activity profile.
Фиг. 3 показва образците на хибридизация на 96 колонии с индуцирани и неиндуцирани Р32- белязани сДНК сонди. 96 отделни трансформанта се култивират в микротитърна плака, прехвърлят се върху нитроцелулозна мембрана и след това филтратите се хибридизират с Р32 сДНК сонди, получени или от индукционна тРНК (както по-горе), или от тРНК, изолирани от неиндукционни PBL култури (по-долу), филтрите се промиват за отстраняване на нехибридизираната РНК и селд това се експонират върху чувствителен за ултравиолетовата светлина филм. Този комплекс от филтри е представителен за 86 такива комплекси (8300 независими колонии). Един примерен индуциран клон е отбелязан като Н12.FIG. 3 shows the hybridization patterns of 96 colonies with induced and uninduced P 32 - labeled cDNA probes. 96 individual transformants were cultured in a microtiter plate, transferred to a nitrocellulose membrane, and then the filtrates were hybridized to P 32 cDNA probes obtained either from induction mRNA (as above) or from mRNA isolated from non-induction PBL cultures ( below), the filters are washed to remove non-hybridized RNA and subsequently exposed to a UV-sensitive film. This filter complex is representative of 86 such complexes (8300 independent colonies). An exemplary induced clone is designated H12.
Фиг. 4 е карта на рестрикционните ендонуклеази на инсерционния клон 69 сДНК. сДНК инсерта е свързан чрез PstI сайтове (точки при двата края) и олиго dC- dG опашки ( единични линии). Броят и размерът на фрагментите, получени чрез разграждане с рестрикционни ендонуклеази се оценява с електрофореза върху 6 процентни акриламидни гелове. Позициите на сайтовете се потвърждава чрез съгласуване на нуклеиновите киселини (представено на фиг. 5 ). Кодиращата област от най- голямата отворена четяща рамка е оградена, а защрихованата част представя предполагаемата сигнална пептидна последователност от 20 остатъка, докато покритата с точки област представя зрялата IIF последователност (146 амино киселини). 5'- края от тРНК е наляво, а 3'- края е надясно.FIG. 4 is a map of the restriction endonucleases of the insertion clone 69 cDNA. The insert cDNA is linked via PstI sites (dots at both ends) and oligo dC-dG tails (single lines). The number and size of the fragments obtained by restriction endonuclease digestion were evaluated by electrophoresis on 6 percent acrylamide gels. The positions of the sites were confirmed by nucleic acid matching (presented in Fig. 5). The coding region of the largest open reading frame is enclosed, and the shaded portion represents the putative signal peptide sequence of 20 residues, while the dotted region represents the mature IIF sequence (146 amino acids). The 5'-end of the mRNA is to the left and the 3'-end is to the right.
фиг. 5 илюстрира нуклеотидната последователност на инсурционната плазмидна р69 сДНК. Представена е също предполагаемата амино киселинна последователностна най-дългата отворена четяща рамка. Предполагаемата сигнална последователност е представена от остатъците, отбелязани от S1 до S20.FIG. 5 illustrates the nucleotide sequence of the insertion plasmid p69 cDNA. The putative amino acid sequence of the longest open reading frame is also provided. The putative signal sequence is represented by the residues indicated from S1 to S20.
фиг. 6 представя сравнение на IFN- γ тРНК структурата с тази на левкоцитарните (IFN- а) и фибробластни (IFN- β) интерферони. Клонът 69 тРНК (отбелязан като имунен) съдържа значително по-голямо количествоFIG. 6 presents a comparison of the IFN-γ mRNA structure with that of leukocyte (IFN-?) And fibroblast (IFN-?) Interferons. The 69 mRNA clone (designated as immune) contains a significantly larger amount
нетранслирани последователности.untranslated sequences.
фиг. 7 е схематична^иаграма на структурата на IFN-γ експресионният плазмид pIFN- у trp 48. Изходният материал е 1250 двойки бази PstI сДНК от плазмида р69.FIG. 7 is a schematic diagram of the structure of the IFN-γ expression plasmid pIFN-? Trp 48. The starting material is 1250 base pairs of PstI cDNA from plasmid p69.
Фиг. 8 показва диаграма на плазмид, приложим за експресия на IFN- у в клетки на маймуна.FIG. 8 shows a plasmid diagram useful for expression of IFN-γ in monkey cells.
фиг. 9 показва Southern хибридизация на разградена с EcoRI човешка геномна ДНК, хибридизирана с Р32- белязан Ddel фрагмент с 600 двойки бази от ДНК на инсерционния плазмид р69. Два EcoRI фрагмента ясно се хибридизират със сондата от всяка ДНК проба.FIG. 9 shows a Southern hybridization of digested with EcoRI human genomic DNA hybridized with a P 32 - labeled Ddel fragment with 600 base pairs of the DNA insert of plasmid p69. Two EcoRI fragments were clearly hybridized to the probe from each DNA sample.
Фиг. 10 показва Southern хибридизация на човешка геномна ДНК, разградена с шест различни рестрикционни ендонуклеази, хибридизирани с Pi2- белязана сонда от р69.FIG. 10 shows Southern hybridization of human genomic DNA digested with six different restriction endonucleases hybridized with a β12 labeled p69 probe.
фиг. 11 схематично илюстрира рестрикционната карта на 3.1 kbp Hindlll инсерта от вектора рВ 1 от който е изолиран промотора PGK. Обозначена е инсерцията на един EcoRI сайт и един Xbal сайт в 5'фланкиращата ДНК от гена PGK.FIG. 11 schematically illustrates the restriction map of a 3.1 kbp HindIII insert from vector pB 1 from which the PGK promoter is isolated. The insertion of one EcoRI site and one Xbal site into the 5'-flanking DNA of the PGK gene is indicated.
фиг. 12 илюстрира 5'-фланкиращата последователност от PGK гена преди инсертирането на Xbal и EcoRI сайтовете.FIG. 12 illustrates the 5'-flanking sequence of the PGK gene prior to insertion of the Xbal and EcoRI sites.
фиг. 13 представя схематично начините, използвани за инсертиране на Xbal сайта при позиция-8 в PGK промотора и за изолиране на 39 Ьр фрагмента от PGK, съдържащ този Xbal край и Sau3A край.FIG. 13 schematically shows the methods used to insert the Xbal site at position-8 in the PGK promoter and isolate the 39 bp fragment from the PGK containing that Xbal end and the Sau3A end.
фиг. 14 представя схематично конструирането на 300 Ьр фрагмент, съдържащ горният 39 Ьр фрагмент, допълнителна PGK 5'- фланкираща последователност (265 Ьр) от Pvul към Sau3A (виж фиг. 11) и EcoRI сайт, съседен на Xbal.FIG. 14 schematically shows the construction of a 300 bp fragment containing the above 39 bp fragment, an additional PGK 5'-flanking sequence (265 bp) from Pvul to Sau3A (see Fig. 11) and an EcoRI site adjacent to Xbal.
фиг. 15 схематично илюстрира структурата на PGK промотора с 1500 bp (Hindlll / EcoRI), съдържащ допълнително към фрагмента конструиран съгл. фиг. 14, 1300 bp Hindlll към PGK 5'- фланкиращата последователност ( виж фиг. 11).FIG. 15 schematically illustrates the structure of a 1500 bp PGK promoter (HindIII / EcoRI) containing, in addition to the fragment, constructed acc. FIG. 14, 1300 bp HindIII to PGK 5'-flanking sequence (see Fig. 11).
Фиг. 16 илюстрира състава на един експресионен вектор за човешки имунен интерферон в дрожди, съдържащ модифициран PGK промотор, IFN-y сДНК и терминаторната област на дрождевия PGK ген, както е описан поподробно тук.FIG. 16 illustrates the composition of a yeast human immune interferon expression vector comprising a modified PGK promoter, IFN-γ cDNA and the terminator region of the yeast PGK gene, as described in more detail herein.
ПОДРОБНО ОПИСАНИЕDETAILED DESCRIPTION
А. Източник на IFN - у тРНКA. IFN source in the tRNA
Левкоцити от човешка периферна кръв (PBLs) са получени чрез левкофореза. PBLs се пречистват посредством градиентно центрофугиране по Ficoll-Hypaque , след което се култивират при концентрация 5 х 106 клетки / мл в RPMI1640, 1 процент L- глутамин, 25 mM HEPES и 1 процент пеницилинстрептомицинов разтвор ( Gibco, Grand Island, NY). Тези клетки се индуцират за продуциране на IFN-γ чрез митогенен стафилококов ентеротоксин В (1 mg/ml) и се култивират за 24 до 48 часа при 37 С. Към PBL културите се добавя дезацетилтимозин- α- 1 (1 mg/ml) за повишаване на получената IFN- γ активност.Human peripheral blood leukocytes (PBLs) were obtained by leukophoresis. PBLs were purified by Ficoll-Hypaque gradient centrifugation, then cultured at 5 x 10 6 cells / ml in RPMI1640, 1 percent L-glutamine, 25 mM HEPES, and 1 percent penicillin-streptomycin solution (Gibco, Grand Island, NY). These cells were induced to produce IFN-γ by mitogenic staphylococcal enterotoxin B (1 mg / ml) and cultured for 24 to 48 hours at 37 C. Desacetylthymosin-α-1 (1 mg / ml) was added to PBL cultures. increased IFN- γ activity obtained.
В. Изолиране на транспортна РНКC. Isolation of transport RNA
Общото количество на РНК от PBL културите се екстрахира по същество както е докладвано от Berger, S. L. et al. (33). Клетките се утаяват чрез центрофугиране и след това се ресуспендират в 10 mM NaCl, 10 тМ Tris- HCL (pH 7.5), 1.5 тМ MgCl, и 10 тМ рибонуклеозид ванадилов комплекс. Клетките се лизират чрез добавяне на NP-40 ( 1 процент крайна концентрация) и ядрата се утаяват чрез центрофугиране. Супернатантата съдържа общото количество РНК, което по-нататък се пречиства чрез многократна фенолна и хлороформна екстрекция. Водната фаза се довежда до 0.2М в NaCl, след което общото количество РНК се преципитира чрез добавяне на два обема етанол. РНК от неиндуцираните (нестимулирани) култури се изолира по същите методи. За пречистване на тРНК от общото количество РНК преципитат, се използва олиго-dT целулозна хроматография (34). Обикновено добива възлиза на 5- 10 милиграма обща РНК и 50- 200 микрограма поли(А) + РНК от 1-2 литра култивирани PBL.The total amount of RNA from PBL cultures was essentially extracted as reported by Berger, S. L. et al. (33). Cells were precipitated by centrifugation and then resuspended in 10 mM NaCl, 10 mM Tris-HCL (pH 7.5), 1.5 mM MgCl, and 10 mM ribonucleoside vanadyl complex. Cells were lysed by the addition of NP-40 (1 percent final concentration) and nuclei were precipitated by centrifugation. The supernatant contains the total amount of RNA, which is further purified by repeated phenolic and chloroform extraction. The aqueous phase was adjusted to 0.2M in NaCl, after which the total amount of RNA was precipitated by the addition of two volumes of ethanol. RNA from uninduced (unstimulated) cultures was isolated by the same methods. For purification of the mRNA from the total amount of RNA precipitate, oligo-dT cellulose chromatography (34) was used. Typically, the yield is 5- 10 milligrams total RNA and 50-200 micrograms poly (A) + RNA of 1-2 liters of cultured PBL.
С. Фракциониране по размер на тРНКC. TRNA size fractionation
Два метода се използват за фракциониране на тРНК препаратите. Те са приложени независимо един от друг (вместо едновременно) и всеки от тях води до значително повишаване количеството на IFN- γ тРНК.Two methods are used to fractionate the mRNA preparations. They are applied independently (rather than simultaneously) and each results in a significant increase in the amount of IFN-γ mRNA.
За фракциониране на тРНК се използва захарозо- градиентно центрофугиране в присъствие на денатуриран формамид. 5 до 25 процента захароза в 70 процента формамид се центрофугират (32) при 154 000 х g за 19 часа при 20° С. Последователните фракции (0.5 ml) след това се отстраняват, преципитират се с етанол и една аликвотна част се инжектира в ооцити наSucrose gradient centrifugation in the presence of denatured formamide is used to fractionate the mRNA. 5 to 25 percent sucrose in 70 percent formamide were centrifuged (32) at 154,000 xg for 19 hours at 20 ° C. The successive fractions (0.5 ml) were then removed, precipitated with ethanol, and an aliquot injected into oocytes on
Xenopus laevis за транслиране на тРНК (35). След 24 часа на стайна температура, инкубационната среда се изпитва за антивирусна активност в стандартна проба за ефекта на цитопатично инхибиране с помощта на везикуларният стоматитен вирус ( щам Indiana) или енцефаломиокардния вирус по WISH ( човешки амнион) клетки, както е описано от Stewart (36), с изключение на това, че пробите се инкубират с клетки за 24 часа ( вместо 4) преди провокация с вируса. Наблюдават се два постоянни пика на активност във фракционираната РНК (фиг. 1). Един пик е седиментиран с изчислен размер 12S и съдържа 100- 400 единици / ml антивирусна активност ( в сравнение с IFN-α стандарт ) за микрограм инжектирана РНК. Друг пик на активност, седиментиран като 16S по размер съдържа половината от активността на по- бавно седиментирания пик. Всеки от тези пикове на активност очевидно се дължи на IFN-γ, докато когато същата фракция сеXenopus laevis for translation of tRNAs (35). After 24 hours at room temperature, the incubation medium was tested for antiviral activity in a standard sample for the effect of cytopathic inhibition using vesicular stomatitis virus (Indiana strain) or WISH (human amnion) cell encephalomyocardial virus, as described by Stewart (36 ), except that the samples were incubated with cells for 24 hours (instead of 4) before challenge with the virus. Two constant peaks of activity in the fractionated RNA were observed (Fig. 1). One peak is sedimented at a calculated size of 12S and contains 100-400 units / ml of antiviral activity (compared to IFN-α standard) per microgram of injected RNA. Another activity peak, sedimented as 16S in size, contains half of the activity of the slower sedimented peak. Each of these activity peaks is apparently due to IFN-γ, whereas when the same fraction is
изпитва върху клетъчна линия от телешки клетки ( MDBK), не се наблюдава активност, тъй като не се протекторат от човешки IFN- γ. Както IFN- a активността, така и IFN- β биха могли да бъдат открити лесно с MDBK (5).tested on calf cell line (MDBK), no activity was observed as they were not protected by human IFN-γ. Both IFN-α activity and IFN-β could be readily detected by MDBK (5).
Фракционирането на гпРНК (200 mg) се осъществява и посредством електрофореза върху пикочно- киселинни агарозни гелове. Плаката от агарозен гел (37,38) се състои от 1. 75 процента агароза, 0. 025 М натриев цитрат, рН 3. 8 и 6М пикочна киселина. Електрофорезата се провежда 7 часа при 25 милиампера и 4° С. След това теловете се нарязват с бръснарско ножче. Отделните срезове се размекват при 70° С и се екстрахират двукратно с фенол и еднократно с хлороформ. След това фракциите се преципитират с етанол и последователно се изпитват за IFN- γ mPHK чрез инжектиране в ооцити на Xenopus laevis и антивирусно действие. В така фракционираните гелни проби е наблюдаван само един пик на активност (фиг.2). Този пик се дължи на микриране заедно с 18S РНК и притежава активност от 600 единици / ml за микрограм от инжектираната РНК. Тази активност е вероятно IFN- γ специфична, доколкото не протектора MDBK клетки.The fractionation of gpRNA (200 mg) was also accomplished by electrophoresis on uric acid agarose gels. The agarose gel plate (37,38) consists of 1. 75 percent agarose, 0. 025 M sodium citrate, pH 3. 8, and 6M uric acid. The electrophoresis was carried out for 7 hours at 25 milliamps and 4 ° C. The wires were then cut with a razor blade. The individual sections were softened at 70 ° C and extracted twice with phenol and once with chloroform. The fractions were then precipitated with ethanol and sequentially tested for IFN-γ mRNA by injection into Xenopus laevis oocytes and antiviral activity. Only one activity peak was observed in the fractionated gel samples (Figure 2). This peak is due to microwaveting together with 18S RNA and has an activity of 600 units / ml per microgram of injected RNA. This activity is probably IFN- γ specific, insofar as it does not protect MDBK cells.
Несъответствието в размера на пиковете на активност, наблюдавани при захарозните градиенти ( 12S и 16S) и пикочно киселинните гелове (18S), може да бъде обяснено с наблюдението, че тези независими методи на фракциониране са неосъществими при условията на пълна денатурация.The discrepancy in the magnitude of the activity peaks observed with sucrose gradients (12S and 16S) and uric acid gels (18S) can be explained by the observation that these independent fractionation methods are not feasible under complete denaturation conditions.
D. Изготвяне на библиотека от колонии, съдържащи IFN- γ последовател ностиD. Preparation of a library of colonies containing IFN-γ sequences
За получаване на двойно- верижна ДНК по стандартна процедура, се използват 3 μg гел-фракционирана тРНК (26, 39). сДНК се фракционира върху 6 процентен полиакриламиден гел. Две от фракциите се подлагат на електроелуация, 800- 1500 Ьр (138 ng) и > 1500 Ьр (204 ng ). Части от по 35 ng сДНК се удължават с дезоксиС остатъци с помощта на терминираща дезоксинуклеотидил трансфераза (40) и се ренатурират с 300 ng от празмида pBR322 (41), който по аналогичен начин е удължен с дезоксиС остатъци при PstI сайта (40). Всяка ренатурирана смес след това се трансформира в Е. coli К 12 щам 294. Получени са приблизително 8000 трансформанта с 800- 1500 Ьр сДНК и 400 трансформанта с > от 1500 Ьр сДНК.For the production of double stranded DNA by standard procedure, 3 μg of gel-fractionated mRNA is used (26, 39). The cDNA was fractionated on a 6 percent polyacrylamide gel. Two fractions were electroeluted, 800-1,500 bp (138 ng) and> 1500 bp (204 ng). Parts of 35 ng of cDNA were elongated with deoxyC residues using termination deoxynucleotidyl transferase (40) and renatured with 300 ng of pBR322 (41), which was similarly extended with deoxyC residues at the PstI site (40). Each renatured mixture was then transformed into E. coli K 12 strain 294. Approximately 8000 transformants with 800-1,500 bp cDNA and 400 transformants with> 1500 bp cDNA were obtained.
E. Скрининг на колонийната библиотека за индуцирана сДНКE. Colonial library screening for induced cDNA
Колониите се инокулират индивидуално в кладенчетата на микротитърни плаки, съдържащи LB (58) + 5 mg/ml тетрациклин и се оставят на - 20°С след като се добави DMSO до 7 процента. Две копия на колониите се култивират върху нитроцелулозни филтри и ДНК от всяка от колониите се фиксира върху филтъра по метода на Grunstein- Hognes (42).Colonies were inoculated individually into wells of microtiter plates containing LB (58) + 5 mg / ml tetracycline and left at -20 ° C after DMSO was added to 7 percent. Two copies of the colonies were cultured on nitrocellulose filters, and DNA from each colony was fixed on the filter by the Grunstein-Hognes method (42).
Р32- белязани сДНК сонди се изготвят с помощта на 18S гел гел фракционирана тРНК от индуцирани и неиндуцирани PBL култури. Олиго dT12_lg е използваният праймер, като условията на реакцията са описани по рано (1). филтри, съдържащи 8000 трансформанти с размер на сДНК 6001500 Ьр и трансформанти с размер > 1500 Ьр се хибридизират с 20 х 106 срт от индуцираната Р’: - сДНК. Втори комплекс от филтри се хибридизира с 20 х 106 срт от неиндуцираната Р’:- сДНК. Хибридизацията се провежда за 16 часа при условията, описани от Fritsch et al. (43). филтрите се промиват енергично (43) и след това се експонират на чувствителен на ултравиолетови лъчи филм Кодак XR-5 с подсилен екран на Du-Pont Lightnis-Plus за 16 до 18 часа. Всяко хибридизиране на образец от колониите се сравнява с двете сонди. Приблизително до 40 % от колониите се хибридизират ясно с двете сонди, докато около 50% от тях не успяват да се хибридизират (показано на фиг.З). 124 колонии се хибридизират значително с индукционната сонда, но без да може да бъде регистрирано или да бъде слабо регистрирано с неиндуктивната сонда. Тези колонии се инокулират индивидуално в кладенчетата на микротитърните плаки, култивират се и се хибридизират със същите две сонди, както е описано по-горе. Плазмидната ДНК, изолирана от всяка от тези колонии по метода (44),също се свързва към нитроцелулозните филтри и се хибридизира (45) с индукционна и неиндукционна сонди. ДНК от 22 колонии хибридизира само с индукционна сонда, поради което тези колонии се наричат индуцирани колонии.P 32 -labeled cDNA probes were prepared using 18S gel gel fractionated mRNA from induced and non-induced PBL cultures. Oligo dT 12 _g is the primer used, the reaction conditions described earlier (1). filters containing 8000 cDNA size transformers of 6001500 bp and transformants of> 1500 bp size hybridize with 20 x 10 6 cpm of induced P ' : - cDNA. A second set of filters was hybridized with 20 x 10 6 cpm of the non-induced P ' : - cDNA. Hybridization was performed for 16 hours under the conditions described by Fritsch et al. (43). the filters are vigorously flushed (43) and then exposed to UV-sensitive Kodak XR-5 film with Du-Pont Lightnis-Plus Reinforced Screen for 16 to 18 hours. Each hybridization of a sample of colonies is compared with the two probes. Approximately up to 40% of the colonies hybridize clearly with both probes, while about 50% of them fail to hybridize (shown in Fig. 3). 124 colonies hybridize significantly with the induction probe, but without being detectable or poorly registered with the non-inductive probe. These colonies were inoculated individually into the wells of the microtiter plates, cultured and hybridized with the same two probes as described above. Plasmid DNA isolated from each of these colonies by method (44) also binds to nitrocellulose filters and hybridizes (45) with induction and non-induction probes. The DNA of 22 colonies hybridizes with an induction probe only, which is why these colonies are called induced colonies.
('('
F. Охарактеризиране на индуцираните колонииF. Characterization of induced colonies
От пет от индуцираните колонии (46) се изготвя плазмидна ДНК, която се използва за охарактеризиране на сДНК инсертите. Рестрикционните карти на пет индуцирани плазмида ( р67, р68, р69, р71 и р72) показват, че четири от тях са сходни. Това са р68, р69, р71 и р72, всеки от които има четири Ddel сайта, 2 HifI сайта и един Rsal сайт в сДНК. Петият плазмид (р68) съдържа общ Ddel фрагмент и очевидно е къс сДНК клон, свързан с останалите четири. Хомологията, предположена чрез рестрикционните карти е потвърдена и черз хибридизация. Р’2-белязана ДНК сонда се изготвя (47) от 600 bp Ddel фрагмент на плазмида р67 и се използва за хибридизация (42) с другите индуцирани колонии. Всичките пет картирани с рестрикционни ендонуклеази колонии се хибридизират кръстосано с тази сонда както 17 други колонии от индукционно / неиндукционният скрининг. Дължината на сДНК инсерта във всеки от тези кръстосано- хибридизирани плазмида се определя чрез PstI и гел електрофореза. Клонът с най- дълъг сДНК инсерт очевидно е клон 69 с дължина на инсерта 1200 - 1400 Ьр. Тази ДНК сеPlasmid DNA was prepared from five of the induced colonies (46), which was used to characterize cDNA inserts. The restriction maps of five induced plasmids (p67, p68, p69, p71, and p72) show that four of them are similar. These are p68, p69, p71 and p72, each of which has four Ddel sites, 2 HifI sites and one Rsal site in cDNA. The fifth plasmid (p68) contains a common Ddel fragment and is apparently a short cDNA clone bound to the other four. The homology suggested by the restriction maps was confirmed by hybridization. A β 2- labeled DNA probe was prepared (47) from a 600 bp Ddel fragment of plasmid p67 and used for hybridization (42) with other induced colonies. All five restriction endonuclease mapped colonies cross-hybridized with this probe as did 17 other induction / non-induction screening colonies. The length of the insert cDNA in each of these cross-hybridized plasmids was determined by PstI and gel electrophoresis. The clone with the longest cDNA insert is apparently a clone 69 with an insert length of 1200 - 1400 bp. This DNA is
използва за всички по- нататъшни експерименти и нейната рестрикционна карта е показана на фиг. 4.used for all further experiments and its restriction map is shown in FIG. 4.
Чрез получаване на експресионни продукти в три независими експресионни системи, демонстриращи антивирусна активност^ е доказано, че сДНК инсерта в р69 е IFN- γ сДНК.By producing expression products in three independent expression systems demonstrating antiviral activity, the insert cDNA in p69 has been shown to be IFN-γ cDNA.
G. Секвенционен анализ на сДНК инсерта в р69G. Sequential analysis of insert cDNA in p69
Пълната нуклеотидна последователност на р69 плазмидния инсерт е определена чрез дидезоксйнуклеотидно верижен терминиращ метод (48) посредством субклониране на фрагментите във вектора М13 шр7 (49) и химичната процедура на Махат- Gilbert (52). Най- дългата отворена четяща рамка кодира протеин от 166 амино киселини, представени на фиг.5. Първият кодиран остатък е първият met кодон, преброен от 5’- края на сДНК. Първите 20 остатъка при амино края вероятно служат като сигнална последователност за секретирането на останалите 146 амино киселини. Тази, вероятно сигнална, последователност притежава общите за останалите сигнални последователности характерни особености, като размер и хидрообност. Нещо повече, четири амино киселини, установени при вероятният сайт на разграждане ( ser- leu- cys);ca идентични с четири остатъка, установени при точките на разграждане на яколко левкоцитарни интерферона ( LelF В, С, D, F и Н (2)). Кодираната зряла амино киселинна последователност от 146 амино киселини (оттук нататък наричана рекомбинантен човешки имунен интерферон) притежава молекулно тегло 17 140.The complete nucleotide sequence of the p69 plasmid insert was determined by a dideoxynucleotide chain termination method (48) by subcloning the fragments in vector M13-p7 (49) and the Mahat-Gilbert chemical procedure (52). The longest open reading frame encodes a protein of 166 amino acids shown in FIG. 5. The first encoded residue is the first met codon counted at the 5'-end of the cDNA. The first 20 residues at the amino terminus probably serve as a signal sequence for secretion of the remaining 146 amino acids. This signaling sequence probably has features common to the other signaling sequences, such as size and hydrophobicity. Moreover, four amino acids found at the probable degradation site (serucleys) ; ca identical to the four residues found at the degradation points of few leukocyte interferons (LelF B, C, D, F and H (2)). The encoded mature amino acid sequence of 146 amino acids (hereinafter referred to as recombinant human immune interferon) has a molecular weight of 17,140.
Налице са две потенциални точки на гликозилация (50) в кодираната протеинова последователност - при амино киселини 28 до 30 (asn- gly- thr ) и амино киселини 100 - 102 (asn- tyr- ser). Съществуването на тези позиции се съгласува с наблюдаваното гликозилиране на човешки IFN- γ в присъствие на редуциращи агенти като β- меркаптоетанол (51). Предоложената зряла амино киселинна последователносте твърде базична, с общо 30 лизинови, аспарагинови и хистидинови остатъка и само общо 19 аспарагинови и глуаминови киселинни остатъка тРНК структурата на IFN- γ както е предположена от ДНК последователността на плазмида р69 е ясно различима от IFN- α (1, 2) или IFN- β (5) на тРНК. Както е представено на фиг. 6, кодиращата област на IFN- γ е по- къса, докато 5*- нетранслираните и 3'- нетранслираните региони са малко по-дълги както от IFN- а , така и от IFN- β.There are two potential points of glycosylation (50) in the encoded protein sequence - for amino acids 28 to 30 (asn-gly-thr) and amino acids 100 - 102 (asn-tyr-ser). The existence of these positions is consistent with the observed glycosylation of human IFN-γ in the presence of reducing agents such as β-mercaptoethanol (51). The mature amino acid sequence provided is too basic, with a total of 30 lysine, asparagine and histidine residues and only a total of 19 aspartic and gluamine acid residues. The mRNA structure of IFN-γ as suggested by the DNA sequence of plasmid p69 is clearly different from the plasmid p69 IF-α , 2) or IFN-β (5) on tRNA. As shown in FIG. 6, the coding region of IFN-γ is shorter, while the 5 * - untranslated and 3'-untranslated regions are slightly longer than both IFN-α and IFN-β.
Н. Експресия на рекомбинантен човешки интерферон в Е. coliN. Expression of recombinant human interferon in E. coli
В съответствие с фиг. 7, 50 pg от плазмида р69 се разграждат с помощта на PstI и инсерта от 1250 двойки бази се изолира посредством гел електрофореза в 6 процентен полиакриламиден гел. Приблизително 10 pg от този инсерт се елуират от гела. След това, 5 pg от този PstI фрагмент се разгражда на части с 3 единици BstNI (Bethesda Research Labs ) за 15 минути при 37°С и реакционната смес се пречиства в 6 процентен полиакриламиден гел. Приблизително 0.5 pg от желаният BstNI- PstI фрагмент, състоящ се от 1100 двойки бази се възстановяват. Двата обозначени на фиг. 7 дезоксиолигонуклеотида - 5'- dAATTCATGTGTTATTGTC и 5'dTGACAATAACACATG , се инсертират по фосфотриестеразният метод (53) и се фосфорилират както следва : 100 pmol от всеки дезокси олигонуклеотид се комбинират в 30 μΐ от 60 mM Tris - НС1 (pH 8), 10 тМ MgCL, 15 тМ βмеркаптоетанол и 240 pCi (γ- Р32) АТф ( Amersham , 5000 Ci/mmol). ДобавятIn accordance with FIG. 7, 50 pg of plasmid p69 were digested using PstI and an insert of 1250 base pairs was isolated by gel electrophoresis in a 6 percent polyacrylamide gel. Approximately 10 pg of this insert was eluted from the gel. Then, 5 µg of this PstI fragment was digested into 3 units of BstNI (Bethesda Research Labs) for 15 minutes at 37 ° C and the reaction mixture was purified on a 6 percent polyacrylamide gel. Approximately 0.5 pg of the desired BstNI-PstI fragment consisting of 1100 base pairs was recovered. The two indicated in FIG. 7 deoxyoligonucleotides - 5'-dAATTCATGTGTTATTGTC and 5'dTGACAATAACACATG, are inserted by the phosphotriesterase method (53) and phosphorylated as follows: 100 pmol of each deoxy oligonucleotide are combined in 30 µM 60M, 60 µM 60M, 60M ΐ 60M 60 60M 60 60M 60 60 Mΐ MgCL, 15 mM β mercaptoethanol and 240 pCi (γ-P 32 ) ATF (Amersham, 5000 Ci / mmol). They add
се 12 единици от Т4 полинуклеотид киназа и реакцията се оставя да продължи още 20 минути. След ф- ОН / СНС13 екстракция, олигомерите се комбинират с BstNI- PstI фрагмента, притежаващ 1100 двойки бази, и се преципитират с етанол. Тези фракции се лигатират при 20°С за два часа в 30 р 1 20 mM Tris - НС1 (pH 7.5), 10 mM MgCl2, 10 тМ дитиотреитол , 0.5 тМ АТф и 10 единици Т4 ДНК лигаза. Сместа се разгражда за един час с 30 единици PstI и 30 единици EcoRI ( за отстраняване на полимеризацията чрез лигатиране на кохезивният край ) и се подлага на лектрофореза в 6 процентен полиакриламиден гел. Продукта от 1115 двойки бази ( 110 000 срт) се възстановява чрез електроелуация.12 units of T4 polynucleotide kinase were taken and the reaction was allowed to continue for another 20 minutes. After--OH / CHCl1 3 extraction, the oligomers were combined with the BstNI-PstI fragment having 1100 base pairs and precipitated with ethanol. These fractions were ligated at 20 ° C for two hours in 30 µl of 20 mM Tris-HCl (pH 7.5), 10 mM MgCl 2 , 10 mM dithiothreitol, 0.5 mM ATf, and 10 units of T4 DNA ligase. The mixture was digested for one hour with 30 units of PstI and 30 units of EcoRI (to remove polymerization by ligation of the cohesive end) and subjected to 6% polyacrylamide gel electrophoresis. The product of 1,115 base pairs (110,000 ct) is recovered by electroelution.
Плазмидът pLelF А/гр 103 (фиг.7) е производен на плазмида pLelF А 25 (1), в който EcoRI сайта, дистално на LelF А гена е отстранен ( 27). 3 pg от pLelF A trp 103 се разгражда с 20 единици EcoRI и 20 единици PstI за 90 мин при 37°С и се подлага на електофореза в 6 процентен полиакриламиден гел. Големият векторен фрагмент ( ~ 3900 двойки бази) се възстановява чрез електроелуация. Фрагментът с големина 1115 двойки бази, EcoRI - PstI IFN- λ ДНК се включва в 0.15 pg от така изготвеният вектор. Трансформирането наPlasmid pLelF A / g 103 (Figure 7) is derived from plasmid pLelF A 25 (1), in which the EcoRI site distal to the LelF A gene is removed (27). 3 pg of pLelF A trp 103 was digested with 20 units of EcoRI and 20 units of PstI for 90 min at 37 ° C and subjected to electrophoresis on a 6 percent polyacrylamide gel. The large vector fragment (~ 3900 base pairs) is recovered by electroelution. The 1115 base pair fragment, EcoRI-PstI IFN-λ DNA, was inserted into 0.15 pg of the vector thus prepared. The transformation of
Е. coli К-12 щам 294 (АТСС N 31446) дава 120 устойчиви на тетрациклин колонии. Плазмидна ДНК се получава от 60 от тези трансформанти и се разгражда с EcoRI и PstI. Три от тези плазмиди съдържат разграденияE. coli K-12 strain 294 (ATCC N 31446) yields 120 tetracycline resistant colonies. Plasmid DNA was obtained from 60 of these transformants and digested with EcoRI and PstI. Three of these plasmids contain degradation
EcoRI - Pstl 1115 двойки базов фрагмент. ДНК секвенционният анализ потвърждава, че тези плазмиди притежават желаната нуклеотидна последователност и свързването между trp промотора, синтетичнната ДНК и сДНК. Един от тези плазмиди - pIFN- λ trp 48 е избран за допълнително изследване. Този плазмид се използва за трансформиране на Е. coli К- 12 щам W3110 (АТСС N 27325).EcoRI - Pstl 1115 base fragment pairs. DNA sequence analysis confirms that these plasmids have the desired nucleotide sequence and the binding between the trp promoter, synthetic DNA and cDNA. One of these plasmids, pIFN- λ trp 48, was selected for further study. This plasmid was used to transform E. coli K-12 strain W3110 (ATCC N 27325).
I. Генна структура на IFN- γ кодиращата последователност Структурата на гена, кодиращ IFN- у,е анализирана чрез Southern хибридизация. В тази процедура (54), 5 микрограма от човешка лимфоцитна ДНК с високо молекулно тегло ( получена както е описано в 55), сеI. Gene Structure of the IFN-γ Coding Sequence The structure of the gene encoding IFN-γ was analyzed by Southern hybridization. In this procedure (54), 5 micrograms of high molecular weight human lymphocyte DNA (prepared as described in 55) is
разгражда с различни рестрикционни ендонуклеази, подлага се на електрофореза върху 1.0 процентен агарозни гелове (56) и се оцветява върху нитроцелулозни филтри (54). Р32- белязана ДНК сонда се изготвя (47) от 600 bp Ddel фрагмент на сДНК инсерта на р69 и се хибридизира (43) с нитроцелулозна ДНК . Количество, възлизащо на 107 за минута^се хибридизира за 16 часа и след това се промива както е описано в (43). Осем геномни ДНК проби от райлични донори се разграждат с EcoRI рестрикционна ендонуклеаза и се хибридизират с р69 Р32- белязана сонда. Както е представено на фиг. 9, наблюдават се два ясни хибридизационни сигнала с размери 8.8 килобази двойки (kbp) и 2.0 kbp както се получава след сравняване мобилността с Hindlll разградена ХДНК. Това би могло да е резултат от два IFN - γ гена или от разделяне на един ген в EcoRI сайт.digested with various restriction endonucleases, electrophoresed on 1.0 percent agarose gels (56) and stained with nitrocellulose filters (54). The P 32 -labeled DNA probe was prepared (47) from a 600 bp Ddel fragment of p69 insert cDNA and hybridized (43) with nitrocellulose DNA. An amount of 10 7 per minute was hybridized for 16 hours and then washed as described in (43). Eight genomic DNA samples from raylichni donors were digested with EcoRI restriction endonuclease and hybridized with the p69 32 P - labeled probe. As shown in FIG. 9, two clear 8.8 kilobase pair (kbp) and 2.0 kbp hybridization signals are observed as obtained after comparing mobility with HindIII degraded CDNA. This could be the result of two IFN - γ genes or the division of one gene into an EcoRI site.
Доколкото р69 не съдържа EcoRI сайт, ще бъде необходима интервентна последователност (интрон) с един вътрешен EcoRI сайт за обяснение на сигналния ген.За да се направи разлика между тези две възможности, се провежда друга Southern хибридизация със същата сонда срещу пет други ендонуклеазни разграждания на една човешка ДНК ( фиг. 10). Наблюдават се два други хибридизиращи фрагмента с две други ендонуклеазни разграждания, PvuII ( 6.7 kbp и 4.0 kbp) и Hindi ( 2. 5 kbp и 2. 2 kbp). Обаче три други ендонуклеазни образци на разграждане осигуряват само единичен ДНК хибридизационен фрагмент : Hindlll ( 9. 0 kbp), Bglll (11. 5 kbp) и BamHI ( 9. 5 kbp). Два IFN- у гена би трябвало да се свържат при необикновено близко разстояние ( по- малко от 9.0 кЬр^за да са разположени в рамките на един и същ Hindlll хибридизационен фрагмент. Този резултат предполага, че в човешката геномна ДНК присъства само един хомоложен IFN - γ ген ( за разлика от много свързани IFN- α гени) и че този ген е разделен от един или повече интрони, съдържащи EcoRI, PvuII и Hindi сайтове. Това предположение е потвърдено от хибридизацията на Р32- белязан (47) фрагмент, получен от непосредствено 3'- нетранслираният регион на сДНК фрагмента на сДНК р69 (130 bp Ddel фрагмент от 860 Ьр до 990 Ьр на фиг. 5) срещу едно EcoRI разграждане на човешка геномна ДНК. Само 2.0 kbp EcoRI фрагмента се хибридизират към тази сонда, предполагайки че този фрагмент съдържа 3'- нетранслирани последователности, докато 8.8 kbp EcoRI фрагмент съдържа 5'- последователности. Генната структура на IFN- γ (един ген с поне един интрон) е ясно отличим от IFN- α (мултиплени гени (2) без интрони (56) или IFN-β (един ген без интрони (57) ).Since p69 does not contain an EcoRI site, an intervention sequence (intron) with an internal EcoRI site will be required to explain the signal gene. To differentiate between these two options, another Southern hybridization with the same probe is performed against five other endonuclease degradation sites. one human DNA (Fig. 10). Two other hybridization fragments with two other endonucleases were observed, PvuII (6.7 kbp and 4.0 kbp) and Hindi (2.5 kbp and 2. 2 kbp). However, three other degradation endonuclease samples provide only a single DNA hybridization fragment: HindIII (9. 0 kbp), Bglll (11. 5 kbp) and BamHI (9. 5 kbp). Two IFN-? Genes would have to bind at an unusually close distance (less than 9.0 kBp ^ to be located within the same HindIII hybridization fragment. This result suggests that only one homologous IFN is present in human genomic DNA - γ gene (unlike the many related IFN- α genes) and that this gene is split by one or more introns containing EcoRI, PvuII and Hindi sites. this assumption is confirmed by hybridization to P 32 - labeled (47) fragment, obtained from the immediate 3'-untranslated region of the c69 pDNA cDNA fragment (130 bp Ddel fragment from 860 bp to 990 bp in Figure 5) against a single EcoRI degradation of human genomic DNA Only 2.0 kbp EcoRI fragments hybridize to this probe, suggesting that this fragment contains 3'-untranslated sequences, whereas an 8.8 kbp EcoRI fragment contains the 5'-sequences The gene structure of IFN- γ (one gene with at least one intron) is clearly distinguishable from IFN- α (multiple genes (2) without introns (56) or IFN-β (one gene without introns) (57) ).
J. Получаване на бактериални екстрактиJ. Preparation of bacterial extracts
Нощна куртура на Е. coli W3110 / pIFN-γ trp 48 в бульон на Luria + 5 микрограма за ml тетрациклин се използва за инокулиране на М9 (58) среда, съдържаща 0.2 процента глюкоза, 0.5 процента казаминови киселини и 5 5 микрограма за ml тетрациклин при разреждане 1:100. Добавя се индол акрилова киселина до крайна концентрация 20 микрограма за т^когато А55Ое между 0. 1 и 0. 2. Добива от десет милилитрови проби се събира чрез центрофугиране при Д55О = 1. 0 и се ресуспендира незабавно в 1 ml фосфатно буферен разтвор, съдържащ 1 mg за ml телешки серумен албумин (PBS- BSA). Клетките се отварят чрез обработка с ултразвук и се очистват от останките чрез центрофугиране. Супернатантите се съхраняват при 4°С до изпитване. Интерфероновата активност в супернатантите се определя на 250 единици/ml чрез сравняване на IFN- а стандарти с ефекта от цитопатично инхибиращо изпитване (СЗЕ).E. coli W3110 / pIFN-γ trp 48 overnight broth in Luria broth + 5 micrograms per ml of tetracycline is used to inoculate M9 (58) medium containing 0.2 percent glucose, 0.5 percent casamic acids and 5 5 micrograms per ml tetracycline at a dilution of 1: 100. Indole acrylic acid is added to a final concentration of 20 micrograms per m 2 when A 55 O is between 0. 1 and 0. 2. A ten milliliter sample is collected by centrifugation at D 55 O = 1.0 and resuspended immediately in 1 ml phosphate. buffer solution containing 1 mg per ml of calf serum albumin (PBS-BSA). The cells were opened by sonication and purified from debris by centrifugation. The supernatants were stored at 4 ° C until tested. Interferon activity in supernatants was determined at 250 units / ml by comparing IFN-α standards with the effect of the cytopathic inhibitory assay (3E).
К. Трансформиране на дрожди / Щамове и средаK. Yeast Transformation / Strains and Environment
Дрождевите щамове се трансформират както е описано по-рано (59). Щам E.coli JA300 (thr leuB6 thi thyA trpC1117 hsdm- hsdR- str) (20) ce използват за подбор на плазмиди, съдържащи функционален TRPI ген. Дрождевият щам RH128 с генотипа (a trpl gal2 SUC2 mal CPUI) (18) се използва като гостоприемник за трансформиране . RH218 е депозиран в АТСС под N 44076. М9 ( минимална среда) с 0.25 процента казаминови киселини (САА) и LB (богата среда) са такива, каквито са описани от Miller (58) с добавка от 20 pg/ml ампицилин ( Sigma) след като средите се автокавират и охлаждат. Дрождите се култивират върху следната среда УЕРОсъдържаща1процент дрождев екстракт, 2 процента пептон и 2 процента глюкоза + 3 процента Difco агар. YNB + САА съдържа 6. 7 грама дрождева азотна база (без амино киселини) (YNB) (Difco), 10 mg аденин, 10 mg урацил, 5 грама САА, 20 грама глюкоза и +30 грама агар за литър.Yeast strains were transformed as described previously (59). E. coli strain JA300 (thr leuB6 thi thyA trpC1117 hsdm-hsdR-str) (20) will be used to select plasmids containing a functional TRPI gene. The yeast strain RH128 with the genotype (a trpl gal2 SUC2 mal CPUI) (18) was used as a host for transformation. RH218 is deposited in ATCC under N 44076. M9 (minimum medium) with 0.25 percent casamic acids (CAA) and LB (rich medium) are as described by Miller (58) with 20 pg / ml ampicillin (Sigma) supplement after the media are autocavored and cooled. Yeast is cultured on the following medium HPLC containing 1 percent yeast extract, 2 percent peptone and 2 percent glucose + 3 percent Difco agar. YNB + CAA contains 6. 7 grams of yeast nitrogen base (excluding amino acids) (YNB) (Difco), 10 mg of adenine, 10 mg of uracil, 5 grams of CAA, 20 grams of glucose and +30 grams of agar per liter.
L. Конструиране на дрождев експреснонен векторL. Construction of a yeast express vector
1. 10 pg YRp7 (14, 15, 16) се разграждат с EcoRI. Получените в резултат лепливи ДНК краища се правят слепи с помощта на ДНК полимераза I (Klenow fragment). Векторът и инсертът се прекарват през 1 процент агароза (SeaKem) гел, изрязват се от гела, подлагат се на електроелуация и се екстрахират двукратно с еднакве обеми хлороформ и енол преди преципитиране с етанол. Получените в резултат слепи ДНК молекули се смесват в краен обем 50 μΐ за 12 часа при 12°С. Тази смес след това се използва за трансформиране на Е. coli щам JA300 в ампицилиново резистентен и триптофаново прототрофен. Изолират се плазмидите, съдържащи TRPI гена в двете ориентации. pFRWl притежава TRPI гена в същата ориентация както YRp7, докато pFRW2 притежава TRPI гена в противоположна ориентация.1. 10 pg of YRp7 (14, 15, 16) were digested with EcoRI. The resulting adhesive DNA ends are made blind using DNA polymerase I (Klenow fragment). The vector and the insert were passed through a 1 percent agarose (SeaKem) gel, excised from the gel, electroeluted, and extracted twice with equal volumes of chloroform and enol before being precipitated with ethanol. The resulting blank DNA molecules were mixed in a final volume of 50 μΐ for 12 hours at 12 ° C. This mixture was then used to transform E. coli strain JA300 into ampicillin-resistant and tryptophan prototrophic. Plasmids containing the TRPI gene in both orientations were isolated. pFRW1 has the TRPI gene in the same orientation as YRp7, while pFRW2 has the TRPI gene in the opposite orientation.
pg от pFRW2 се линеализират с Hindlll и се подлагат на електрофореза върху 1 процент агарозен гел. Линеарните молекули се елуират от гела и 20 ng от тях след това се лигатират с 500 ng от 3, lkb Hindlll инсерта от плазмид рВ1 (13), който е рестрикционен фрагмент, съдържащ дрождевият 3- фосфоглицерат кинезин ген. Тази лигаторна смес след това се използва за трансформиране на Е. coli щам 294 в щам, резистентен на ампицилин и чувствителен на тетрациклин. Плазмидът, получен от един такъв рекомбинант, притежава един интактен TRP1 ген с 3. 1 kbp Hindlll фрагмент от рВ1 инсерционна ДНК в Hindlll сайта на гена за тетрациклинова резистентност. Този плазмид е pFRM31. 5 pg от pFRM31 напълно сеpg of pFRW2 was linearized with HindIII and electrophoresed on 1 percent agarose gel. The linear molecules were eluted from the gel and 20 ng of them were then ligated with 500 ng of 3, 1kb HindIII insert of plasmid pB1 (13), which is a restriction fragment containing the yeast 3-phosphoglycerate kinesin gene. This ligator mixture was then used to transform E. coli strain 294 into a strain resistant to ampicillin and sensitive to tetracycline. The plasmid derived from one such recombinant possesses an intact TRP1 gene with a 3.1 kbp HindIII fragment of pB1 insertion DNA at the HindIII site of the tetracycline resistance gene. This plasmid is pFRM31. 5 pg of pFRM31 completely seizes
разгражда с EcoRI, екстрахира се двукратно с фенол и хлороформ, след което се преципитира с етанол. Кохезивните краища от молекулата се запълват с помощта на ДНК полимераза I ( Klenow fragment) в реакция, доведена до 250 μΜ във всеки дезоксинуклеозид трифосфат. Реакцията след това се провежда за 20 минути при 14°С, през което време ДНК се екстраира двукратно с фенол- хлороформ и след това се преципитира с етанол. Ресуспендираната ДНК след това напълно се разгражда с Clal и се полага на електрофореза в 6 процентен акриламиден гел. Векторният фрагмент се елуира от гела, екстрахира се с фенол- хлороформ и се преципитира с етанол.decomposed with EcoRI, extracted twice with phenol and chloroform, then precipitated with ethanol. The cohesive ends of the molecule were filled using DNA polymerase I (Klenow fragment) in a reaction brought to 250 μΜ in each deoxynucleoside triphosphate. The reaction was then carried out for 20 minutes at 14 ° C, during which time the DNA was extracted twice with phenol-chloroform and then precipitated with ethanol. The resuspended DNA was then completely digested with Clal and electrophoresed on a 6 percent acrylamide gel. The vector fragment was eluted from the gel, extracted with phenol-chloroform and precipitated with ethanol.
Шестте N- крайни амино киселини от 3- фосфоглицератният ензим, пречистен от хора са следните :The six N-terminal amino acids of the 3-phosphoglycerate enzyme purified by humans are the following:
- 2- 3- 4- 5- 6- 2- 3- 4- 5-6
SER - LEU - SER - HSM - LYS - LEU Една от транслационните четящи рамки, генерирани от ДНК последователността на 141 bp Sau3A - to - Sau3A рестрикционни фрагмента (съдържащ интернален Hindi сайт ; виж PGK рестрикционната карта на фиг. 11), продуцира следната амино киселинна последователност :SER-LEU-SER-HSM-LYS-LEU One of the translational reading frames generated by the DNA sequence of the 141 bp Sau3A-to-Sau3A restriction fragment (containing an internal Hindi site; see PGK restriction map in Fig. 11) produces the following amino acid sequence:
- 2- 3- 4- 5- 6- 2- 3- 4- 5-6
MET - SER - LEU - SER - SER - LYS - LEU След отстраняване на инцииращият метионин може да се види, че PGKMET - SER - LEU - SER - SER - LYS - LEU After removal of the initiating methionine, it can be seen that PGK
N- крайната амино киселинна последователност притежава 5 от 6 -те амино киселини, хомоложни с N- крайната амино киселинна последователност на човешка PGK.The N-terminal amino acid sequence has 5 of the 6 amino acids homologous to the N-terminal amino acid sequence of human PGK.
Този резултат от съгласуване предполага, че началото на PGK структурният ген е кодиран от ДНК в 141 bp Sau3A рестрикционният фрагмент на рВ1. По- ранни разработки (20) предполагат, че ДНК последователността, специфична за PGK тРНК може да се разполага в областта на Hind фрагмента. По- нататъшното съгласуване на 141 bp Sau3A фрагмента дава още от ДНК последователността на PGK промотора (фиг. 12),This alignment result suggests that the onset of the PGK structural gene is encoded by DNA in the 141 bp Sau3A restriction fragment of pB1. Earlier developments (20) have suggested that the DNA sequence specific for PGK mRNA may be located in the region of the Hind fragment. Further alignment of the 141 bp Sau3A fragment further provides the DNA sequence of the PGK promoter (Fig. 12),
Посредством стандартни методи (Crea et al., Nucleic Acids Res. 8, 2331 (1980) ) е синтезиран синтетичен олигонуклеотид c последователност 5' ATTTGTTGTAAA 3'. 100 ng от този праймер се маркира при 5' края с помощта на 10 единици Ш4 полинуклеотид киназа в 20 ul реакция, съдържаща също 200 gCi [ γ32 32 - Р] АТф. Този маркиран праймерен разтвор се използва в реакция за възстановяване на праймера, създадена като първи етап в многоетапен процес за включване на EcoRI рестрикционен сайт в PGK 5' -фланкираща ДНК, предшевстваща PGK последователността на структурния ген.A synthetic oligonucleotide of sequence 5 'ATTTGTTGTAAA 3' was synthesized by standard methods (Crea et al., Nucleic Acids Res. 8, 2331 (1980)). 100 ng of this primer was labeled at the 5 'end using 10 units of III4 polynucleotide kinase in a 20 µl reaction also containing 200 gCi [γ 32 32 - P] ATf. This labeled primer solution is used in a primer recovery reaction created as a first step in a multi-step process to incorporate an EcoRI restriction site into a PGK 5 'flanking DNA preceding the PGK sequence of the structural gene.
100 pg рВ 1 (20) се разгражда напълно с НаеШ, след което се пропуска през 6 процентен полиакриламиден гел. Горната ивица на оцветеният с етидиум гел (съдържащ PGK промоторен регион) се изолира чрез електроелуация както е описано по- горе. Тази част от ДНК, състояща се от 1200 Ьр НаеШ, се рестриктира с Hindi, след което се пропуска през 6 процентен акриламиден гел. Ивицата от 650 Ьр се изолира чрез електроелуиране. 5 pg от ДНК се изолират, след което тази 650 bp HaeIII-toHincII част от ДНК се ресуспендира в 20 μΐ Н2 О и се смесва се с 20 pl от фосфорилираният праймерен разтвор, описан по- горе. Тази смес се екстрахира еднократно с фенол- хлороформ, след което се преципитира с етанол. Сухата ДНК се ресуспендира в 50 μΐ Η, О и се нагрява във вряща вода за седем минути. След това този разтвор бързо се охлажда в суха леденоетанолна бани (10-20 секунди) и се прехвърля в ледена водна баня. Към този разтвор се добавят 50 μΐ от 10 х ДНК полимераза I буфер (Boeringer Mannheim), 10 μΐ от доведения до 2.5 мМ разтвор от всеки дезоксинуклеозид © трифосфат ( dATP, dTTP, dGTP и dCTP), 25 μΐ Η, Ο и 5 единици ДНК полимераза I, Klenow fragment. Тази 100 μΐ реакция се инкубира при 37°С за 4 часа. Разтворът след това се екстрахира 1х фенол-хлороформ, преципитира се с етанол, изсушава се чрез лиофилизация и се подлага на рестрикция до изчерпване с 10 единици Sau3A. Този разтвор след това се пропуска през 6 процентен акриламиден гел. Ивицата, съответстваща на 39 Ьр по размер, се изрязва от гела и се изолира чрез електроелуация, описана по-горе. Тази 39 Ьр ивица има един сляп край и един Sau3A леплив край. Този фрагмент се клонира в модифициран pFIF trp 69 вектор (5). 10 gg от pFIF trp 69 се линеализират с Xbal, екстрахират се 1 х с фенол- хлороформ , след което се преципитират с етанол. Xbal лепливият край се запълва с помощта на ДНК полимераза I Klenfw fragment в 50 μΐ реакция, съдържаща 250 μΜ във всеки нуклеозид трифосфат. Тази ДНК се срязва с BamHI, след това се пропуска през 6 процента акриламиден гел. Векторният фрагмент се изолира от гела чрез електроелуация и след това се ресуспендира в 20 μΐ Н2 О. 20 ng от този вектор се лигатира с 20 ng от 39 Ьр фрагмента, изготвен както е посочено погоре за 4 часа при стайна температура. Една пета от лигационната смес се100 µg of pB 1 (20) was completely digested with NaCl, then passed through a 6 percent polyacrylamide gel. The upper band of ethidium stained gel (containing the PGK promoter region) was isolated by electroelution as described above. This portion of the DNA, consisting of 1200 bp NaCl, was restriction with Hindi and then passed through a 6 percent acrylamide gel. The 650 bp band was isolated by electroelution. 5 pg of DNA was isolated, then this 650 bp HaeIII-toHincII portion of DNA was resuspended in 20 μΐ H 2 O and mixed with 20 pl of the phosphorylated primer solution described above. This mixture was extracted once with phenol-chloroform and then precipitated with ethanol. The dry DNA was resuspended in 50 μΐ О, O and heated in boiling water for seven minutes. This solution was then rapidly cooled in a dry ice / ethanol bath (10-20 seconds) and transferred to an ice water bath. To this solution were added 50 μΐ of 10 x DNA polymerase I buffer (Boeringer Mannheim), 10 μΐ of the solution up to 2.5 mM of each deoxynucleoside © triphosphate (dATP, dTTP, dGTP and dCTP), 25 μΐ Η, Ο and 5 units DNA polymerase I, Klenow fragment. This 100 μΐ reaction was incubated at 37 ° C for 4 hours. The solution was then extracted 1x phenol-chloroform, precipitated with ethanol, dried by lyophilization and subjected to restriction to 10 units of Sau3A. This solution was then passed through a 6 percent acrylamide gel. The band corresponding to 39 bp in size was cut from the gel and isolated by electroelution described above. This 39 bp strip has one blind end and one Sau3A sticky end. This fragment was cloned into a modified pFIF trp 69 vector (5). 10 gg of pFIF trp 69 were linearized with Xbal, extracted 1 x with phenol-chloroform, and then precipitated with ethanol. The xbal adhesive end was filled with DNA polymerase I Klenfw fragment in a 50 μΐ reaction containing 250 μΜ in each nucleoside triphosphate. This DNA was cut with BamHI, then passed through a 6 percent acrylamide gel. The vector fragment was isolated from the gel by electroelution and then resuspended in 20 μΐ H 2 O. 20 ng of this vector was ligated with 20 ng of 39 bp fragment prepared as indicated above for 4 hours at room temperature. One fifth of the ligation mixture is used
Q използва за трансформиране на Е. coli щам 294 в ампицилиново резистентен (върху LB + 20 gg/ml ампицилинови плаки). Плазмидите от трансформантите се изпитват посредством метода на бързото екраниране (44). Един плазмидр pPGK-39 е избран за секвенционен анализ. 20 gg от този плазмид се разгражда с Xbal, преципитира се с етанол и след това се подлага на въздействие със 100 единици бактериална алкална фосатаза при 68°С за 48 мин. След това ДНК се екстрахира трикратно с фенол- хлороформ и се преципитира с с етанол. Дефосфорилираните краища след това се маркират в уQ used to transform E. coli strain 294 into ampicillin-resistant (on LB + 20 gg / ml ampicillin plates). Transformants plasmids are tested by the rapid screening method (44). One plasmid pPGK-39 was selected for sequence analysis. 20 gg of this plasmid was digested with Xbal, precipitated with ethanol and then subjected to 100 units of bacterial alkaline phosphatase at 68 ° C for 48 min. The DNA was then extracted three times with phenol-chloroform and precipitated with ethanol. The dephosphorylated ends are then marked in y
gl реакционна смес, съдържаща 200 gCi [ γ32 -Р] АТф и 10 единици Т4gl reaction mixture containing 200 gCi [γ 32 -P] ATf and 10 units of T4
полинуклеотид киназа. Плазмидът се срязва със Sall и се пропуска през 6 процентен акриламиден гел.polynucleotide kinase. The plasmid was cut with Sall and passed through a 6 percent acrylamide gel.
Маркираната инсерционна ивица се изолира от гела и се съгласува по метода на химично разграждане (52). ДНК последователносттта при 3'-края от тази промоторна част е такава, каквато се очаква да бъде.The labeled insertion strip is isolated from the gel and coordinated by the chemical degradation method (52). The DNA sequence at the 3'-end of this promoter portion is as it is expected to be.
2. Конструиране на 321 bp PvuI-to-EcoRI PGK промоторен фрагмент gg pPGK-39 (фиг. 13) се разгражда едновремнно със Sall и Xbal ( 5 единици всеки ) и след това се подлагат на електрофореза върху 6 процентен полиакриламиден гел. Ивицата с 390 Ьр, представляваща 39 Ьр[ промоторната част се изолира чрез електроелуация. Ресуспендираната ДНК се подлага на рестрикция със Sau3A, след това се подлага на електрофореза върху 8 процентен акриламиден егл. 39 bp PGK промоторната ивица се изолира чрез електроелуация. Тази ДНК съдържа 39 Ьр от 5’ - края на PGK промотора от Sau3A-to-XbaI фрагмента.2. Construction of the 321 bp PvuI-to-EcoRI PGK promoter fragment gg pPGK-39 (Fig. 13) was digested simultaneously with Sall and Xbal (5 units each) and then electrophoresed on a 6 percent polyacrylamide gel. The 390 bp band representing 39 bp [the promoter is isolated by electroelution. The resuspended DNA was subjected to restriction with Sau3A, then electrophoresed on 8 percent acrylamide el. 39 bp The PGK promoter band is isolated by electroelution. This DNA contains 39 bp from 5 '- the end of the PGK promoter of the Sau3A-to-XbaI fragment.
pg от рВ1 се рестриктират с Pvul и ΚρηΙ, след което се подлагат наpg from pB1 are restricted with Pvul and ΚρηΙ, and then subjected to
електрофореза върху 6 процентен акриламиден гел. 0.8 kbp ивица от ДНК се изолират чрез електроелуиране, след това се рестриктират със Sau3A и се подлагат на електрофореза върху 6 процентен акриламиден гел. Ивицата с 265 Ьр от PGK промотора (фиг. 11) се изолира чрез електроелуиране.electrophoresis on a 6 percent acrylamide gel. The 0.8 kbp strand of DNA was isolated by electroelution, then restricted with Sau3A and electrophoresed on a 6 percent acrylamide gel. The 265 bp band from the PGK promoter (Fig. 11) was isolated by electrical elution.
След това ДНК се лигатира с 39 Ьр промоторния фрагмент за 2 часа при стайна температура. Лигаторната смес се рестриктира с Ха1 и Pvul, след което се подлага на електрофореза в 6 процентен акриламиден гел. Xba - to - Pvul рестрикционният размер с размер 312 Ьр се изолира чрез електроелуиране, след това се добавя към лигаторната смес, съдържаща 200 ng pBR322 (41) ( изолирана по-рано, пропускайки 162 bp Pvul -to - PstI рестрикционният рагмент) и 200 ng Xbal- to - PstI LelF А сДНК гена, изолиран от 20 pg pLelF tip A 25. Тази трикомпонентна лигаторна смес се използва за трансформиране на Е. coli щам 294 в щам, резистентен на тетрациклин. Трансормираните клонове се подлагат на мини скрининг (44) и една от колониите, PGK-300 се изолира като притежаваща 304 bp PGK 5'фланкираща ДНК, слята с LelF А гена в pBR322 основният вектор. 5'- края на LelF А гена притежава следната последователност : 5' - CTAGAATTC-3'. Така фузията на XbdI сайта от PGK промоторния фрагмент в тази последователност позолява добавянето към Xbal сайта на един EcoRl сайт.The DNA was then ligated with the 39 bp promoter fragment for 2 hours at room temperature. The ligator mixture was restricted with Xa1 and Pvul and then electrophoresed on a 6 percent acrylamide gel. The Xba-to-Pvul size restriction of size 312 bp was isolated by electrical elution, then added to the ligator mixture containing 200 ng pBR322 (41) (isolated earlier, omitting 162 bp Pvul-to-PstI restriction fragment) and 200 ng Xbalto - PstI LelF A cDNA gene isolated from 20 pg pLelF type A 25. This three-component ligator mixture was used to transform E. coli strain 294 into a tetracycline resistant strain. Transmitted clones were subjected to mini-screening (44) and one of the colonies, PGK-300 was isolated as having 304 bp PGK 5'flange DNA fused to the LelF A gene in the pBR322 main vector. The 5'-end of the LelF A gene has the following sequence: 5 '- CTAGAATTC-3'. Thus, the fusion of the XbdI site from the PGK promoter fragment in this sequence makes it possible to add an EcoR1 site to the Xbal site.
Така pPGK - 300 съдържа част от PGK промотора, изолиран в Pvul - to EcoRl фрагмента.Thus, the pPGK - 300 contains part of the PGK promoter isolated in the Pvul - to EcoR1 fragment.
3. Конструиране на 1500 bp EcoRI - to - EcoRI PGK промоторен фрагмент pg pBl се разгражда c Pvul и EcoRI и се пропуска през 6 процентен акриламиден гел. 1.3 kb Pvul - to - EcoRI ивицата ДНК от PGK 5' фланкиращата ДНК се изолира посредством електроелуиране. 10 pg pPGK300 се разгражда с coRI и Pvul и 312 bp промоторният фрагмент се изолира чрез електроелуация след електрофореза на разградената смес в 6 процентен акриламиден гел. 5 pg от pFRL4 се срязва с EcoRI, преципитира се с етанол и се третира с бактериална алкална фосфатаза при 68°С за 45 минути. След три екстракции на ДНК с фенол/хлороформ, преципитиране с етанол и ресуспендиране в 20 ml Н2 О, 200 ng от вектора се лигатират със 100 ng от 312 bp EcoRI - to - Pvul ДНК от pPGK - 300 и 100 ng EcoRI - to - Pvul ДНК от pBl. Лигаторната смес се използва за трансформиране на Е. coli щам 294 в ампицилиново резистентен. Един от получените трансформанти е pPGK 1500. Този плазмид съдържа 1500 bp PGK промоторен фрагмент като EcoRI to - EcoRI или Hindlll - to - EcoRI част от ДНК.3. Construction of 1500 bp EcoRI-to-EcoRI PGK promoter fragment pg pBl was digested with Pvul and EcoRI and passed through a 6 percent acrylamide gel. The 1.3 kb Pvul-to-EcoRI strip of DNA from the PGK 5 'flanking DNA was isolated by electroelution. 10 pg pPGK300 was digested with coRI and Pvul and the 312 bp promoter fragment was isolated by electroelution after electrophoresis of the digested mixture in 6 percent acrylamide gel. 5 pg of pFRL4 was cut with EcoRI, precipitated with ethanol and treated with bacterial alkaline phosphatase at 68 ° C for 45 minutes. After three phenol / chloroform DNA extractions, ethanol precipitation and resuspension in 20 ml of H 2 O, 200 ng of the vector were ligated with 100 ng of 312 bp EcoRI-to-Pvul DNA from pPGK-300 and 100 ng EcoRI-to - Pvul DNA from pBl. The ligator mixture was used to transform E. coli strain 294 into ampicillin resistant. One of the transformants obtained is pPGK 1500. This plasmid contains a 1500 bp PGK promoter fragment such as the EcoRI to-EcoRI or HindIII-to-EcoRI portion of DNA.
pg pPGK - 1500 се разграждат напълно с Clal и EcoRI след коетоpg pPGK - 1500 are completely degraded with Clal and EcoRI then
разградената смес се подлага на електофореза върху 6 процентен акриламиден гел. фрагментът с размер 900 Ьр, съдържащ PGK промотора^се изолира чрез електроелуиране. 10 pg pIFN - γ trp 48 се разгражда напълно сthe digested mixture was electrophoresed on a 6 percent acrylamide gel. The 900 bp fragment containing the PGK promoter was isolated by electroelution. 10 pg pIFN - γ trp 48 degrades completely with
EcoRI и HincII и се подлага на електрофореза върху 6 процентен акриламиден гел. Ивицата от 900 Ьр, съдържаща директно експресируемата IFN- γ сДНК ? се изолира от гела чрез електроелуиране.EcoRI and HincII and electrophoresed on a 6 percent acrylamide gel. A 900 bp band containing the directly expressed IFN-γ cDNA ? is isolated from the gel by electroelution.
Дрождевият експресионен вектор се изолира в трифакторна реакция чрез лигатиране заедно на PGK промоторният фрагмент ( в Clal - to - EcoRI част), делетираният pFRM - 31 и изолираната по- горе IFN- γ ДНК. Реакционната смес се инкубира на 14°С за 12 часа, след което се използва за трансормиране на Е. coli щам 294 в ампицилиново резистентен. Трансформантите се анализират за присъствие на действително конструиран експресионен плазмид , pPGK - IFN- γ (фиг. 16). Плазмидите, съдържащи експресионни системи се използват за трансформиране на сферопласти на дрождевия щам RH218 в триптофаново прототрофен при култивиране върху агар в отсъствие на триптофан. След това тези рекомбинантни дрожди се изпитват за присъствие на рекомбинантен човешки интерферон.The yeast expression vector was isolated in a three-factor reaction by ligation together of the PGK promoter fragment (in the Clal-to-EcoRI moiety), the deletion pFRM-31 and IFN-γ DNA isolated above. The reaction mixture was incubated at 14 ° C for 12 hours, then used to transmit E. coli strain 294 into ampicillin-resistant. Transformants were assayed for the presence of a truly engineered expression plasmid, pPGK - IFN-γ (Fig. 16). Plasmids containing expression systems are used to transform spheroplasts of the yeast strain RH218 into tryptophan prototrophic when cultured on agar in the absence of tryptophan. These recombinant yeasts are then tested for the presence of recombinant human interferon.
Дрождевите екстракти се получават по следният начин : 10 милилитрови култури се отглеждат в YNB+CAA до достигане на Α660ξ 1-2, събират се чрез центрофугиране и след това се ресуспендират в 500 μΐ PBS буфер (20 mM NaH, РО4, pH = 7.4, 150 mM NaCI). Добавя се еднакво количество стъклени топчета и сместа след това се бърка за 2'. Екстрактите се завъртат 30 секунде при 14000 грт и супернатантите се отстраняват : Интерфероновата активност в супернатантата се определя като 16 000 единици/ml посредством сравняване с IFN- а стандарт с помощта на СРЕ инхибиторни проби.Yeast extracts were obtained as follows: 10 ml cultures were grown in YNB + CAA to reach Α 660 ξ 1-2, collected by centrifugation and then resuspended in 500 μΐ PBS buffer (20 mM NaH, PO 4 , pH = 7.4, 150 mM NaCl). An equal amount of glass beads were added and the mixture was then stirred for 2 '. The extracts were rotated for 30 seconds at 14,000 rpm and the supernatants removed: Interferon activity in the supernatant was determined to be 16,000 units / ml by comparison with the IFN-α standard using CPE inhibitory samples.
М. Конструиране на клетъчно културален вектор pSVy69M. Construction of the cell culture vector pSVy69
Hindlll-PvuII фрагментът, състоящ се от 342 двойки бази и обхващащ SV40 източника, се превръща в един EcoRl сайт рестрикционен свързващ фрагмент. Hindlll сайта се превръща чрез добавяне на синтетичен олигомер (5' dAGCTGAATTC), a PvuII сайта се превръща чрез свързване на слепите краища запълнени в EcoRl сайта с помощта на полимераза I ( Klenow fragment) . Полученият в резултат EcoRl фрагментсе инсертира в EcoRl сайта от pML-1 (28). Плазмид със SV40 късен промотор, ориентиран нагоре от amp* гена по- нататък се модифицира чрез отстраняване на EcoRl сайта, който е най-близо до amp* гена на pML- 1 (28).The HindIII-PvuII fragment consisting of 342 base pairs and encompassing the SV40 source is converted into an EcoR1 site restriction binding fragment. The HindIII site is transformed by the addition of a synthetic oligomer (5 'dAGCTGAATTC), and the PvuII site is transformed by binding the blind ends filled into the EcoR1 site using polymerase I (Klenow fragment). The resulting EcoR1 fragment was inserted into the EcoR1 site by pML-1 (28). The SV40 late promoter plasmid upstream of the amp * gene was further modified by deletion of the EcoR1 site closest to the pML-1 amp * gene (28).
Изолира се Hpal- Bglll фрагмента от клонираната HBV ДНК, състоящ се от 1023 двойки бази (60)^ и Hpal сайта от вируса на хепатит В (HBV) се превръща при един EcoRI сайт със синтетичен олигомер (5' dGCGAATTCGC). Този EcoRI - Bglll свързан фрагмент се клонира директно в EcoRI- BamHI сайтове от плазмида, описан по-горе, носещ източника на SV40.The Hpal-Bglll fragment from the cloned HBV DNA consisting of 1023 base pairs (60) was isolated and the Hpal site from the hepatitis B virus (HBV) converted to one EcoRI site with a synthetic oligomer (5 'dGCGAATTCGC). This EcoRI-Bglll binding fragment was cloned directly into EcoRI-BamHI sites from the plasmid described above carrying the SV40 source.
В останалия EcoRI сайт се инсертира IFN-y ген върху 1250 двойки бази PstI фрагмент на р69 след превръщане на PstI краищата в EcoRI краища.Изолирани са клонове, в които SV40 късният промотор предшевства структурния ген на IFN- у. Получените в резултат плазмиди след това се въвеждат в клетки на тъканни култури (29) с помощта на DEAEдекстрановата техника (61) модифицирана така, че трансфекцията в присъствие на DEAE- декстран се провежда за 8 часа. Клетъчната среда се сменя на всеки 2-3 дни. Всеки ден се взимат по 200 микролитра за изследване. Типичният добив възлиза на 50-100 единици/ml за пробите, взети три или четири дни след началото на трансфекцията.The remaining EcoRI site inserts the IFN-γ gene on 1250 base pairs of the PstI fragment of p69 after converting the PstI ends into EcoRI ends. Isolated clones in which the SV40 late promoter precedes the IFN-γ structural gene. The resulting plasmids are then introduced into tissue culture cells (29) using the DEAExtran technique (61) modified so that transfection in the presence of DEAE-dextran is carried out for 8 hours. The cell medium was changed every 2-3 days. 200 microliters are taken daily for examination. Typical yields are 50-100 units / ml for samples taken three or four days after the start of transfection.
В продукта на трансфекция отсъства CYS-TYR-CYS N-крайна част на рекомбинантният човеки имунен интерферон (сравни фиг. 5), подкрепяйки появяването на сигнално пептидно разграждане при CYS-GLN връзката (амино киселини 3 и 4 на фиг. 5), така че зрелият олипептид фактически се състои от 143 амино киселини.The transfection product lacks the CYS-TYR-CYS N-terminal portion of recombinant human immune interferon (compare Fig. 5), supporting the emergence of signal peptide degradation at the CYS-GLN junction (amino acids 3 and 4 in Fig. 5), that the mature olipeptide actually consists of 143 amino acids.
N. Частично пречистване на des-CYS-TYR-CYS рекомбинантен човешки имунен интерферонN. Partial purification of des-CYS-TYR-CYS recombinant human immune interferon
За получаване на по-голямо количество от des-CYS-TYR-CYS рекомбинантен човешки имунен интерферон пресен монослой от COS-7 клетки от десет 10 cm плаки се трансектират с общо 30 pg pDLIF в 110 misTo obtain more des-CYS-TYR-CYS recombinant human immune interferon fresh monolayer of COS-7 cells from ten 10 cm plates were transected with a total of 30 pg pDLIF at 110 mis
DEAE-Dextran 500 000 MW, 0.05M Tris pH 7.5 в DMEM). След 16 часа при 37°C, плаките се промиват с DMEM. Към всяка плака се добавят 15 mis прясна DMEM, заместена с 10 процента f.b.s., 2mM глутамин, 50 μ/ml пеницилин G и 50 mg/ml стрептомицин. На следващия ден средата се замества с DMEM, свободен от серум. Прясна среда се добавя всеки ден. Събраната среда се пази на 4°С до следващото изпитване или свързване с CPG. Установено е, че фракциите от 3-4 дневни трансфекционни проби съдържат по същество цялата активност.DEAE-Dextran 500,000 MW, 0.05M Tris pH 7.5 in DMEM). After 16 hours at 37 ° C, the plates were washed with DMEM. To each plate were added 15 mis fresh DMEM substituted with 10 percent f.b.s., 2mM glutamine, 50 μ / ml penicillin G and 50 mg / ml streptomycin. The next day, the medium was replaced with serum-free DMEM. Fresh medium is added daily. The collected medium was kept at 4 ° C until the next test or binding to CPG. It has been found that fractions of 3-4 day transfection samples contain essentially all the activity.
0.5 g CPG ( Electronucleics, CPG 350, размер на порите 120/200 ) се добавят към 100 ml клетъчна супернатанта и сместа се разбърква за 3 часа при 4°С. След кратко центрофуиране в настолна центрофуга топчетата се поставят в колона и внимателно се промиват с 20 mM NaPO4 IM NaCl 0.1 процента β- меркаптоетанол pH 7.2. Активността след това се елуира със същия буфер, съдържащ 30 процента етиленгликол, последвано от понататъшно елуиране с горния буфер, съдържащ 50 процента етиленгликол. По същества цялата активност се свързва с CPG. 75 процента от елуираната активност е установена във фракциите, елуирани с 30 процента етиленгликол. Тези фракции се отливат и се разреждат с 20 mM NaPO4 IM NaCl pH 7.2 до крайна концентрация от 10 процента етиленгликол и директно се прилагат към 10 ml Con A Sefarosa ( Pharmacia) колона. След старателно промиване с 20 mM NaPO4 IM NaCl pH 7.2 активността се елуирас 20 mM NaPO4 1М NaCl 0.2М а- метил- D- манозид. Съществено количество от активността (55 процента) не се свързва с лектин. 45 процента от активността се елуира с аметил-D- манозид.0.5 g of CPG (Electronucleics, CPG 350, pore size 120/200) were added to 100 ml of cell supernatant and the mixture was stirred for 3 hours at 4 ° C. After brief centrifugation in a table centrifuge, the beads were placed in a column and gently washed with 20 mM NaPO 4 IM NaCl 0.1 percent β-mercaptoethanol pH 7.2. The activity was then eluted with the same buffer containing 30 percent ethylene glycol, followed by further elution with the above buffer containing 50 percent ethylene glycol. In essence, all activity is associated with CPG. 75 percent of the eluted activity was detected in the fractions eluted with 30 percent ethylene glycol. These fractions were poured and diluted with 20 mM NaPO 4 IM NaCl pH 7.2 to a final concentration of 10 percent ethylene glycol and directly applied to a 10 ml Con A Sefarosa (Pharmacia) column. After thorough washing with 20 mM NaPO 4 IM NaCl pH 7.2, the activity was eluted with 20 mM NaPO 4 1M NaCl 0.2M α-methyl-D-mannoside. A significant amount of activity (55 percent) did not bind to lectin. 45 percent of the activity was eluted with amethyl-D-mannoside.
ФАРМАЦЕВТИЧНИ СЪСТАВИPHARMACEUTICAL COMPOSITIONS
Съединенията съгласно настоящето изобретение могат да бъдат формулирани съгласно известни методи за получаване на фармацевтично приложими състави, в които човешкият имунен интерферон е комбиниран в смес с подходящи във фармацевтично отношение носещи средства. Подходящи средства и техните форми са описани в Remington's Pharmaceutical Sciences от E.W. Martin, вкючена в литературната справка. Такива състави съдържат ефективно количество от интерфероновия протеин, заедно с подходящо количество средства за приготвяне на фармацевтично подходящи състави, удобни за въвеждане у пациента.The compounds of the present invention can be formulated according to known methods for the preparation of pharmaceutically applicable compositions in which human immune interferon is combined with a mixture of pharmaceutically acceptable carriers. Suitable agents and their forms are described in Remington's Pharmaceutical Sciences by E.W. Martin, included in the reference. Such compositions comprise an effective amount of interferon protein, together with an appropriate amount of agents for the preparation of pharmaceutically suitable compositions suitable for administration to the patient.
А. Парентерално въвежданеA. Parenteral administration
Човешкият имунен интерферон от изобретението може да бъде въвеждан арентерално у пациенти, нуждаещи се от антитуморно или антивирусно лечение, както и у такива с имуносупресивни състояния. Дозите и количествата им могат да бъдат такива, каквито се използват напоследък при клинични изследвания на други човешки интерфери, като напр. около (ΙΙΟ) х 106 единици дневно, и в случаите на материали с чистота по-висока от 1 процент, или до 1 процент, до 50 χ 106 дневно. Дозите на IFN - γ могат даThe human immune interferon of the invention can be administered orally to patients requiring antitumor or antiviral treatment, as well as to those with immunosuppressive conditions. Doses and amounts thereof may be those used recently in clinical studies of other human interferons, such as e.g. about (ΙΙΟ) x 10 6 units per day, and in the case of materials with a purity greater than 1 percent, or up to 1 percent, up to 50 χ 10 6 per day. Doses of IFN - γ can
бъдат повишени за по-гол^м ефект благодарение на липсата по същество на човешки протеини различни от ΙΙΝ-γ, които протеини в получени от човека материали могат да индуцират същински противоположен ефект.are enhanced for greater effect by the lack of substantially human proteins other than ΙΙΝ-γ, which proteins in human-derived materials can induce a substantially opposite effect.
Като пример за подходящи дози за хомогенен по същество IFN-γ за парентерална форма на приложение, 3 mg IFN-γ със специфична активност от, напр. 2х108 U/mg се разтварят в 25 ml 5N серумен албумин (човешки) USP, разтворът се прекарва през бактериологичен филтър и полученият филтриран разтвор се разпределя асептично в 100 епруветки, всяка от които съдържаща 6 χ 106 единици чист интерферон, подходящ за арентерално въвеждане. Епруветките се съхраняват за предпочитане на студено (-20°С ) до употреба.As an example of suitable doses for substantially homogeneous IFN-γ for parenteral administration, 3 mg IFN-γ with specific activity of, e.g. 2 x 10 8 U / mg was dissolved in 25 ml 5N serum albumin (human) USP, the solution was passed through a bacteriological filter and the resulting filtered solution was aseptically distributed into 100 tubes, each containing 6 χ 10 6 units of pure interferon suitable for parenteral administration. introduction. The tubes are preferably stored cold (-20 ° C) until use.
ДАННИ ОТ БИОЛОГИЧНИ ИЗСЛЕДВАНИЯDATA FROM BIOLOGICAL RESEARCH
А. Охарактеризиране на антивирусната активностA. Characterization of antiviral activity
За неутрализиране на антителата, пробите се неутрализират;ако е необходимо, до концентрация 500 - 1000 единици/ml с PBS - BSA. Еднакви обеми от пробата се инкубират за 2-12 часа при 4° при серийни разреждания на плъши античовешки лимфоцити, фибробласти или имуноинтерферонов антисерум. Анти- IFN- а и β са получени от National Institut of Allergy and Infectious Diseases. Анти- IFN- у се получава c помощта на автентичен IFN-γ (520 процента чистота), пречистени от стимулирани лимфоцити от периферна кръв. Пробите се центрофугират 3 минути при 12 ОООх g за 3 мин преди изследването. За тестуване на pH стабилността, пробите се довеждат до pH 2 чрез добавяне на IN НС1, инкубират се за 2-12 часа при 4° и се неутрализират чрез добавяне на 1 N NaOH преди изпитването. За тестуване на чувствителността на натриев додецилсулфат (SDS), пробите се инкубират с еднакъв обем от 0.2 процента SDS за 2-12 часа при 4°С преди изпитването.To neutralize the antibodies, the samples were neutralized ; if necessary, to a concentration of 500 - 1000 units / ml with PBS - BSA. Equal volumes of the sample were incubated for 2-12 hours at 4 ° at serial dilutions of rat anti-human lymphocytes, fibroblasts or immunointerferon antiserum. Anti-IFN-? And β were obtained from the National Institute of Allergy and Infectious Diseases. Anti-IFN-γ was obtained using authentic IFN-γ (520 percent purity) purified from stimulated peripheral blood lymphocytes. Samples were centrifuged for 3 minutes at 12 LLC x g for 3 minutes before testing. For pH stability testing, the samples were brought to pH 2 by the addition of 1N HCl, incubated for 2-12 hours at 4 ° and neutralized by the addition of 1 N NaOH before testing. For sodium dodecyl sulfate (SDS) sensitivity testing, samples were incubated with an equal volume of 0.2 percent SDS for 2-12 hours at 4 ° C before testing.
В. Охарактеризиране на IFN- у , получени от Е. coli и COS-7 клетки Антивирусна актиВност ( единици/ ml)B. Characterization of IFN-? Derived from E. coli and COS-7 cells Antiviral activity (units / ml)
Третиране IFN-a нетретирани 375 pH 2 375Treatment of IFN-a untreated 375 pH 2 375
Е. coliE. coli
Таблицата показва характерното поведение на IFN-α, β и γ стандарти след различни третирания. Интерфероновата активност, получена от Е. coli W3110/pIFN-y trp 48 и от COS-7/pSVy69 е киселинно-чувствителна, SDSчувствителна и се неутрализира от антитела срещу IFN-a или β. Тези данни потвърждават, че продуктите получени с тези системи са имуно интерферони и че сДНК инсертите на плазмид р69 кодира IFN- у.The table shows the characteristic behavior of IFN-α, β and γ standards after various treatments. The interferon activity obtained from E. coli W3110 / pIFN-γ trp 48 and from COS-7 / pSVy69 is acid-sensitive, SDS-sensitive and neutralized by antibodies against IFN-α or β. These data confirm that the products obtained with these systems are immune interferons and that the cDNA inserts of plasmid p69 encode IFN-γ.
Имуноинтерфероновият протеин от изобретението е определен чрез определяне на ДНК гена и дедуктивното съгласуване на амино киселинните виж фиг. 5. Става ясно, че за този специален интерферон съществуват природни алелни варианции, проявяващи се от един индивид в друг . Тези вариации могат да бъдат демонстрирани чрез (една) амино киселинна разлика (ки) в цялата последователност или чрез делеции, замествания, инсерции, инверсии или добавяния на (една) амино киселина (и) в посочената последователност. Всички подобни алелни вариации са включени в рамките на обхвата на изобретението.The immunointerferon protein of the invention was determined by determining the DNA gene and the deductive coordination of amino acids, see FIG. 5. It is clear that for this particular interferon there are natural allelic variants manifested from one individual to another. These variations can be demonstrated by (one) amino acid difference (s) in the entire sequence or by deletions, substitutions, insertions, inversions or additions of (one) amino acid (s) to said sequence. All such allelic variations are included within the scope of the invention.
Представените предпочитани варианти на изпълнение следва да се приемат като създадени само да илюстрират настоящето изобретение, без да го ограничават повече от законния му обхват съобразно изложените по-долу патентни претенции.The preferred embodiments presented should be construed as merely intended to illustrate the present invention, without limiting it beyond its legal scope, in accordance with the claims set forth below.
Claims (61)
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US07/574,375 US5096705A (en) | 1981-10-19 | 1990-07-31 | Human immune interferon |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
BG60888B2 true BG60888B2 (en) | 1996-05-31 |
Family
ID=24295848
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
BG098388A BG60888B2 (en) | 1990-07-31 | 1994-01-20 | Human immune interferon |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
BG (1) | BG60888B2 (en) |
-
1994
- 1994-01-20 BG BG098388A patent/BG60888B2/en unknown
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US4929554A (en) | Human immune interferon | |
US5096705A (en) | Human immune interferon | |
US5582824A (en) | Recombinant DES-CYS-TYR-CYS human immune interferon | |
AU594045B2 (en) | Recombinant colony stimulating factor-1 | |
US4588585A (en) | Human recombinant cysteine depleted interferon-β muteins | |
WO1988003173A2 (en) | New forms of colony stimulating factor-1 | |
EP0271824B1 (en) | Horse gamma interferon | |
JPH08187088A (en) | Animal interferon | |
BG60888B2 (en) | Human immune interferon | |
BG60889B2 (en) | Human immune interferon | |
BG60890B2 (en) | Human immune interferon | |
BG61060B2 (en) | Human immune inteferon | |
BG60939B2 (en) | Human immune interferon | |
HRP950157A2 (en) | Polypeptide with human interferon (ifn-gamma) characteristics | |
PH26492A (en) | Recombinant human immune interferon | |
NZ214261A (en) | Human immune interferon: production by recombinant dna technology | |
DD264706A5 (en) | Process for the preparation of polypeptides (horse-interforon-gamma) |