DD264706A5

DD264706A5 - Verfahren zur Herstellung von Polypeptiden (Pferde-Interforon-Gamma)

Info

Publication number: DD264706A5
Authority: DD
Publication date: 1989-02-08

Abstract

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung von Polypeptid (Pferde-Interferon-Gamma equines Interferon-Gamma, EqIFN-g), DNA-Sequenzen, die dieses Polypeptid codieren, geeignete Vektoren und Wirtsorganismen, die diese DNA-Sequenzen enthalten sowie das EqIFN-g selbst. Gegenstand der Erfindung sind weiterhin DNA-Teilsequenzen, die Polypeptide codieren, die sich strukturell von dem natuerlichen EqIFN-g Polypeptid unterscheiden. Interferone koennen regulierend die Zellen des Immunsystems oder auch die Differenzierung von Zellen und das Wachstum von Tumoren beeinflussen und finden als Pharmazeutika Verwendung.

Description

Verfahren zur Herstellung von Polypeptidon (Pferde-Inter feron-Gamma)

Anwendungsgebiet der Erfindung

Gegenstand dor vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung von Polypeptiden (Pferde-Interferon-Gamma equines Interf eron-Gamma» EqIFN- Tf ), DNA-Sequenzen, die dieses Polypept.ld codieren, geeignete Vektoren und Wirtsorganisnen, die diese DNA-Sequenzen enthalten sowie das EqIFN-f selbst. Gegenstand der Erfindung sind weiterhin DNA-Teilsequenzen, die Polypeptide codieren, die sir^u, strukturell von dem natürlichen EqIFN-J* Polypaptid unterscheiden. Beschrieben wird außerdem die Verwendung der Proteine als Pharmazeutika.

Charakteristik des bekannten Standes der Technik

Interferone sind Proteine, die von eukaryotischen Zellen nach Virus Infektionen oder anderen Stimulationen sekretiert werden und ihrerseits die Zellen vor Virusinfektionen schützen können. Drei Klassen von Interferonen sind mittlerweile bekannt: bezeichnet werden sie mit Interforon-(X- Interferon-ß und Interferon-JT (abgekürzt IFN- <X , IFN-ß und IFN-Jf). Sie unterscheiden sich in ihrem Aufbau und in ihren Wirkungen. So können Interferone regulierend die Zellen des Immunsystems, oder auch die Differenzierung von Zellen und das Wachstum von Tumoren beeinflussen.

F. Wheelock entdeckte 1965 ein Polypeptid, das bestimmte Zellen vor Virusinfektionen schützte (Science 149, 310 (1965). Polypeptide mit diesen Eigenschaften werd3n Immuninterferon, TypII-Interferon, Interferon-Gfcsmirn odar IFN-¹/¹ bezeichnet, obwohl es sich hierbei um ein zur Kla^yc- der Lymphokine zählendes Polypeptid handelt. Neben dem h-utvan- Interferon-f sind bisher bekannt geworden, bovinos-, murines- und Ratten-Interferon-Y" . Alle bisher bekannt gewordenen γ -Interferone liegen in cjlykosilierter Ροητ. vor, wobei die Glykosilierung jedoch keinen fciinfluß auf die biologische Aktivität ausübt (Keller et al., ü. Biol. Chem. 258, 8010 (1983)).

Lange Zeit war angenommen worden, daß die Interferone speziaspezifisch wirken. In vitro-Versuche zeigten jedoch, daß IFN-Präparate von Rindern eine antivirale Wirkung beim Affen und beim Menschen auslösen können (Tovey, M.G. et al. 3. Gen. Virol 36, 341-344 (1977). Diese Speziesinteraktivität hängt möglicherweise mit der mehr oder weniger großen Homologie der Gene bzw. der Proteine zusammen: aufgrund der geringen Mengen an tierischen Interferonen konnte diese Annahme nicht überprüft werden.

Trotz der festgestellten Speziesinteraktivität sind Nebenwirkungen wie Antigenitäten bei der Anwendung speziesfreitirier Interferone zu beobachten, die für eine Therapie nicht zu tolerieren sind.

Oa andererseits jedoch die Nutz- und Haustierhaltung einen bedeutenden wirtschaftlichen Wert darstellt, besteht ein Bedarf an Interferonen für die verschiedenen Spezies, die der Veterinärmediziner anwenden kann.

- 3 - ZCV JOC

Hoch gereinigtes Tierinterferon der verschiedenen Spozies würde darüber hinaus die willkommene Gelegenheit bieten» die Wirkmechani9men für Interferone zu untersuchen, um zu Modellvorstellungon zu kommen, die auf den Menschen zu über· tragon sind.

Die ersten Untersuchungen mit tierischen Interferonen wurden nit Präparationen aus natürlichem Zellmaterial durchgeführt ; Ausbeule und Reinheit der nach cKesem Verfahren hergestellten Interferone lassen sie als ungeeignet für die Herstellung von Arzneimitteln erscheinen.

Durch die Entwicklung der rekombinaten DNA-Technik ist es möglich, von Mikroorganismen heterologe Proteine produzieren zu lassen. So hergestellt wurden beispielsweise auch Human-Interferone (Hu-IFN); seit neuestem auch verschiedene nicht-humane Interferone.

Ziel der Erfindung

Durch das erfindungsgemäße Verfahren wird ein Polypeptid (Pferde-Interferon-Gamma, EqIFN-J* ) in reiner Form und mit hoher Ausbeute bereitgestellt.

Darlegung des Wesens der Erfindung

Eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung war es, das Polypeptid (Pferde-Interferon-γ ) auf gentechnologischem Weg herzustellen und die dafür erforderlichen DNA-Sequenzen bereitzustellen.

Gelöst wurde diese Aufgabe erfindungegemäß durch die Anwendung dor sogenannten Sondentechnik. AI3 Sonde wurde eine von dem humenen "f -Interferon abgeleitete, litoraturbekannto DNA-Sequenz verwendet (G~ay und Goeddel; Nature 298 , 859-863 (1982)),

Ebensogut sind jedoch auch Teil- oder vollständige Sequenzen der anderen JT -Interferone als Sonden geeignet. Als Ausgangsmaterial bei der Suche diente eine aus normalem Lebergewebe des Pferdes stammende DNA-Bibliothek. Erstmals konnte hierdurch das für EqIFN-]f codierende Gen mit den flankierenden Bereichen der nachfolgenden Formel I isoliert werden:

foe

GGATC 5

CCArAAGAATGGCACGGGTGGGCATAATGGGTCTGTCTCATCGTCAAAAGACCCAAGGAG 6 5

TTGAAAGGAAACTCTAACTAGAACACCAAAATGCCACAAAACCATAGTTATTAATACAAA 125

CTAACTAGCATCTGTGCCTATCTGTCACCATCTCATCTGAAAAAACTTGTGAAAATACGT 185

AATCCTGATGAGACTTCAATTAGGTATAAAAACCAGCCCCAGAAGGCGAGGCAGTACACT 24S

CTTCTGATCGCCGGTAGGGCAGCTATTAGAA?! AGAAAGATCAOCTGAGGUCTTGGGACCT 305

GATCAGCTTAGTACAGAAGTGACTGCTTT CAACTACTTAGGCCTAACTCTCTCCGAAACA 3 65

-20 -IS 10

Met Asu Tyr Thr Ser Plie lie Leu Ala Phe Gin Lou eye Ala lie

ATG AAT TAT ACA AGT TlT ATC TTG GCT TTT CAG CTG TGT GCG ATT 410

-5 -11 5 10

Leu GIy Ser Ser Thr Tyu Tyr Cye Gin Ala AIa Phe Phe Lys GIu

TTG GGT TCT TCT ACC TAT T?\C TGC CAG GCC GCG TTT TTT AAA GAA 455

15

He GIu Asn Leu Lys GIu Tyr Phe ATA GAA AAC CTA AAG GAA TAT TTT GTAAGTATGACCTTTTAATAATACTTAC 507

₍ INTRONl

TTGTGGTTGAAATGACTGAACGTTGTCTTGGAGTTGGATCTCTGATAGGCTGTCCTCTCT 567

ACTCCACAGTCATCTTGAGAAGACTGGGTGTTATTTTCTCTGTTTGTTGACTGGATGAGT 6 27

TTTTCTTTTTTTTACTAAATGATCTAGATATTGCTTTAACCCTCTGCTCAATTTGCTATA 687

GAGACTTAGAGAGGGTTCATGAATCTTCCAAAAGATGGGCTTAACAGGTTTATAAAGCAT 747

AGTGAAGTTGACAATTTTGTGGTGAGAAGCCACTGAATTGTGATAAGTCAAGTAGTGTGG 807

ACATTGAAAAAATGACTAGCTATTAGTTTCTAACTTCTCAGGTTACTATGATGGTGACAA 867

TAAAAGGTCAAGATTAGCATTAAAATGGTAATCTGAAATAATTGATCAGTTAAAGAAGGC 9 27

. GCTGTCCTGAAAGGTTTGGCTGAAAAAAAATCACTTTCAGGTGTTTTCCTCCAAAAAATG 987

ATTTTAAAATCTTACTGCCCCGTTTGTGTTAGCTGTGAAGTACTCTGGAACTCAGTCAAT 1047

TGCTGAGATTTTGTACGAGTTATAAGCTGGCTTATATTTAAAAAATTTTTTTGTTTTTGT 1107

TTTATGAGTTTCTTTTAAAATGTTATTTATGGTTAATTAAAATAGTTTTTGCATTTTAAA 1167

TATTTTATTATTTGTCCAAAATTTAGCTATTTTAATTATAGTTOG/tfSCTCTCTTTTAGAG 1227

CTGACATAAGACCATAGGGGAGGCACAGATAGATGTGATGGAGCCCTGTACCAGACGGGG 1287

GCAGTATCTTATAGTGGGTTGCCTTTGCTGATCTTTTTACTAGACTTGAAATTATTTGCT 1347

TTTCCTTCCTATGGTTATTTGGGACTATTGAAGTATCACCAGCCCTGTTGAGTTCATCTG 1407

, TAATATTGTAATTCAAGGGTTACACTAGAAAATAAGAAAGCTAAAACAGCACGATAATCT 14 67

TTGGCTACATCCAACACAATAGCTTTTGGGAATACTTATTGTTAGAACTAAACftGAGGGT 15 27

s TGAAAAGAAAATCAGTGAATACTGTCAGCATCTGAGTTCAATAAAACGTGAAGTACATTT 1587

20

Asn AIa

TTAGGGCAATTCATGGACTAATTGTAAACCAAGTTTTCCTTCCTTTTTCAG AAC GCA 1.644

25 30 35

Arg Aen Pro Asp VaI GIy Asp GIy GIy Pro 'ueu Phe Leu Asp Tie

AGA AAC CCA GAT GTA GGG GAT GGT GGG CCT CTT TTC CTG GAT ATC 1689

5a ZCVWG -

40 T N T R O N 2

Leu Lye Αβη Trp Lye GIu

TTG AAG AAC TGG AAA GAC GTAAGCTAAGTATTTCCATTTGGTTGATTTTCCTGT 17 43 TGCTTATTTTCTGGTGGATGAATTCACACCAACCTCTCTTTGTGCTCTTTTCTCCCTAG 1a 0 2

45 50 55

Aep Ser Aep Lye Lyp- He He Gin Ser Gin Tie VaI Ser Phe Tyr GAT AGT GAC AAA AAA ATA ATT CAG AGC CAA ATC GTC TCC TTC TAC 1847

60 65 70

Phe Lye Leu Phe GIu Aen L&u Lye Asp Αβη Gin VaI He Gin Lye TTC AAA CTC TTT GAA AAC TTG AAA GAT AAC CAG GTC ATT CAA AAO 189 2

75 80 85

Ser Met Asp Thr He Lye GIu Asp Leu Phe VaI Lys Phe Phe Αβη AGC ATG GAC ACC ATC AAG GAG GAC CTG TTC GTT AAG TTC TTT AAC 19 37

90 95 100

Ser Ser Thr Ser Lys Leu GIu Asp Phe Gin Lye Leu He Gin He AGC AGC ACC AGC AAG CTG GAA OAC TTC CAA AAG CTG ATT CAG ATT 198 2

INTRON Pro

CCG GTGAGGAGATCTTAATTCTTTCTTTGGTTTCATTACAGAGGTTCTTGCAAAGTGCT 20Al

TACGTCCCAGAAAGTAGAAATGAACTATGAAATGAACCCGTGGCCAAAACTCCTCCTTCC 2101

TAATTCCATTTGTGCTTTGAGAGACTTTGCTAAGTCAGTATGGGAATCATTTAAATTTGT 2161

GATTTGGGGAAATGCTGGCACTATGACTACTGCACAAAGGCAGGTGAAGGGACAAATCCA 2 221

GTGAGGAGGGGGCAGTGAAGAAGTGGAGGGGAGTCTGGAGAAGCAGGTCTCTCCTTGCCC 2 281

CTTGTTCGTGAGATGAAATCCTCCTGCTTTGGATGGGAGGCTGCGTGTCTTGGTGGAAAG 2341

AGCAGTGGGAGGAGOOAGAAGATTTGTGCTCCTCCCAGCTCAGCCACCAAGAAACTGTGA 2401

CCTCAGATGAATCACAGGCCTGGCTGGGGCTCAGTTTCCTCATCTTAAAAGAGGCCTATT 2461

GGGTTCACTAAAATTTCTATGATCTTCTTTGCTCTAT/t ATCCTACAATTCTGTGGACAGA 2521

ΆAATGAAATGAGGTAGGAGAAAGAAATAGCCTTTGAAGAGGTTCTTGGGCA TTCCACTGC 2581

OAGGCTCTGGTCAACCTTCATACTCTGCAGCCCAAGAAGAGGCAAGACCATTTGTCTGTT 2641

TTTGGAAATGCAAATAGGCGGCATTTATACCTCACGAAAGAACTGTTCTGTCAACTTTTG 2701

GATACTGGGCTATCTTGGCTGGAGAAATCCTTAGGCTCCCAAACTTTCTCTCATGAAATT 2761

GTCTTGAGTCTTTAAATTTATGGCTTCTCGAAGCTGAGAOATAACTTTAAGCATAAAOAC 28 21

AAATTACATTTTCCAACATTTTGTCTAAGAGACAAAGACCTCCACATGCCTTTGGGTTTG 2881

GCCTGGATCTAAATGGGCTTGAATGAGAAGGGGAGGGTGTTGTTATGACTATGTTTAGAA 2941

GAGAAAACAGAGGTTTGGAGAGGTTAAGTGGCTGGTTCAAAGTCAGAGTTATTGCACACA 3001

CAGOATTCOAACCCATATGTTTTGTCCCTCCACTTTAGGOTTCTTTTCGCTACATAATTT 3061

TGAGAATTCTGTACCAGTCAATTTAAGGATGTGTGATGTTCCCCATCCTATTACAGCACA 3121

ACCAGCAATTTAATTATAATTTTAGTCTTAACTGCTGAAGAAAGCAGCATTACATATTAA 3181

GCTAACATATTCCTGGTGAAAGCAACTTTTTCAAAGGAATATTTrTATTTTCATGGACCA 3 241

TGACAGTAGCACAGCCTyATGGCTTGTATGCCTGAAACTAATTTTUCTGTTTTCTTTCCC 3 301

105 110 115

VaI Asn Asp Leu Lye VaI Gin Acg Lys Ala He Ser GIu Leu

AATAG GTA AAT OAT CTG AAG GTC CAG CGC ΛΑΑ GCA ATA AGT GAA CTC 3 348

120 125 130

He Lye VaI Met Asn Asp lieu Ser Pro Lys Ala Asn Leu Arg Lys ATC AAA GTG ATG AAT OAT CTG TCG CCC AAA GCT AAC CTG AGG AAG

5b

135 140 145

Arg Lye Acg Ser Gin Ann Pro Phe Arg GIy Arg Arg Ala T.eu Gin

CGG AAG AGG AGT CAG AAT CCA TTT CGA GGC CGG AGA GCG TTG CAA 3 4 38

TAG TGGTCATCCTGCCTGCAATATTTGAATTTTTAAATCTAAATCTATTTATTAATATT 3 497

TAATATTTTACATTATTTATATGGGGAATATATTTTTAAACTCATCAAAGTATTTATAAT 3 557

AGCAACTTTTATGTAATGAAAATGGGTATCTATTAATATATATATTATTTATAATTCCTG 3 617

TATGGTGTGACTATTTCACTTGACCCTTTTTTTTCTGACCAACTAGGCAAGATTATGTGA 3 677

TTACAAGGCTTTAACTCAGGGGCCAACTAGGGAGTGGSTAGCCGACCTACCAAGACCCTG 3737

TGAGCTGTGTGTTTATTTCCCTCAATGATACAATGAACACTTATAAAGGAAAGGAGGGCC 3797

TCCAGTCACTGCCTGTTGGAGAACATGTCTGCATTGTGAGCCACTGCTTAATGGCATGTC 3 8 57

AAACCACGCTTGAATGTGTCAGATGATAGGGCTTGTCCCCTGATAAAGCTTAGTATCTCC 3 917

TCTCATGCCTAGTGCTTCAGAATATTGTTGACAACTGTGACTGCACCCAAATGGAAAGTA 3 977

ATTTATTTGTTTAoTTTACCAATATTTAATAAATATGAATAAAGTATAATTTCATAACTA 4 0 37

TTTATGCTGCGTCCGGCTTTTTCTAAGTGAGGACTGGGGTAAATGAACTACAAACTAATG 4097

AATCAGTAAGAGGGAACTCGTTTTTAGCGGTGGAAATCTTAGCTGGATTAAGCCCCATGA 4]5 7

AACGTGGTATTTCTCTCCACTGGAGATTTGTTGGCTACTACTCCTCCATGTAGCAGCTCT 4 217

TTATCTTTCCAAAATATAAATTTAATTATGTCACCATTTACTTCAGAGCTTCTGCGATGG 4 277

AAAGTAGTTCAAATAGTTTAGCTTAGCACACAAAGCTTTGTTTCTCCCTCCTCCCTCAAC 4 3 J 7

TCTGCACTGVGCTCTTCATCTTGGTGTCCCCACGTCCTCTGTCCACTTCGGGCAAACCAC 4 3 97

CGGGAATGTCAVGGTGAGGGTGAGCTCTAGGGAGAGAGGGCTGGATTAGAATTTCGGCCC 4457

CACCATTACCAGTAGTATGACCTTTAATGAATTACTTGTATTCTCTAAGCTCCAGTTTCC 4 517

TCATCTGACACAAGAGAATAATTGTGCCTAAAATTGTGGTGAGAGTTTGTTCTTTCACTC 4 577

AAGAAGTGTTTACTGGAGCATCCACTAGTTGCCTAGTGCTGTTCTAGGCACTTGAGATAC 4 6 37

ATTTGTGAACAAAATAGTCAAGGATCC 4 6 64

ZG¹I

Bemerkenswert ist, daß EqIFN-γ ebenso wie alle bisher bekannt gewordenen γ-Interferone im jeweiligen Organimus von einem Gen codiert wird, das große Sequenzen aufweist, die das Strukturgen unterbrechen: die Gene bestehen aus Exons und Introns, wobei nur die Exons für das Protein codieren. Die Introns können nur von bestimmten Systemen, beispielsweise von Systemen in Säugetierzellen, verstanden werden. Für andere Systeme beispielsweise in E.coli, sind DNA-Sequenzen, die Introns enthalten, nicht zu verwenden.

Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung war es daher, eine für EqIFN-γ codierende intron-freie DNA-Sequenz bereitzustellen.

Die Lösung dieser Aufgabe ist prinzipiell auf zwei Wegen möglich,

1. Auf dem Weg vom Zellkern, in dem die Transkription stattfindet, in das Cytoplasma werden die Introns ausgeschnitten und durch Spleißen der Exon-RNA-Fragmente entsteht die mRNA des eukaryotischen Proteins. Diese mRNA läßt sich mit einem Enzym, der Reversen Transcriptase in eine DNA umkopieren, die als "copy-DNA" (cDNA) bezeichnet wird.

15 10 15

TAT TAC T6C CA6 GCC GCG TTT TTT AAA 6AA ATA GAA AAC CTA AAG

20 25 30

GAA TAT TTT AAC GCA AGA AAC CCA GAT GTA GGG GAT GGT GGG CCT

35 40 45

CTT TTC CTG GAT ATC TTG AAG AAC TGG AAA GAG GAT AGT GAC AAA

50 55 60

AAA ATA ATT CAG AGC CAA ATC GTC TCC TTC TAC TTC AAA CTC TTT

65 70 75

GAA AAC TTG AAA GAT AAC CA6 GTC ATT CAA AAG AGC ATG GAC ACC

80 85 90

ATC AAG GAG GAC CTG TTC GTT AAG TTC TTT AAC AGC AGC ACC AGC

95 100 ' 105

AAG CTG GAA GAC TTC CAA AAG CTG ATT CAG AFT CCG GTA AAT GAT

HO 115 120

CTG AAG GTC CAG CGC AAA GCA ATA AGT GAA CTC ATC AAA GTG ATG

125 130 135

AAT GAT CTG TCG CCC AAA GCT AAC CTG AGG AAG CGG AAG AGG AGT

140 145

CAG AAT CCA TTT CGA GGC CGG AGA GCG TTG CAA TA6

Formel 11

Diese intron-freie DNA kann dann in geeignete Plasmide inseriert werden, die dann zusammen mit geeigneten Wirtsorganisraen, beispielsweise E.ooli, zur Produktion von eukaryotischen Proteinen im vorliegenden Fall von EqIFN-γ verwendet werden können. Nachteilig kann sich bei dieser Vorgehensweise die Degeneration des genetischen Codes auswirken. Diese Degeneration führt nämlich dazu, daß verschiedene Organismen für dieselben Aminosäuren unterschiedliche Codons verwenden. Bei nicht optimaler Anpassung der verwendeten DNA kann es daher zu einer verschlechterten Expression eines eukaryotischen Proteins in einem prokaryotischen System kommen.

2. Die andere Möglichkeit, eine intron-freie DNA Sequenz für ein eukaryotisches Gen zu erhalten, besteht darin, bei Kenntnis der chromosomalen DNA-Sequenz eine intron-freie DNA-Sequenz chemisch zu synthetisieren.

Als besonders geeignet zur Lösung der erfindungsgemäßen Aufgabe erwies sich die DNA-Sequenz gemäß Formel III

-I₁ 5 10

AT6 TAC IAC TGC CA6 6CT GCT TTC TTT AAA GAA ATC GAA AAC CTG AAA

20 ?5

GAA TAC TTC AAC GCT CGT AAC CCA GAC GTT GGT GAC GGT GGT CCG

35 40 45

CTG TTC CTG GAC ATC CTG AAA AAC TGG AAA GAA GAC TCT GAC AAA

50 55 60

AAG ATC ATC CAG TCT CAG ATC GTT TCT TTC TAC TTC AAA CTG TTC

65 70 75

GAA AAC CTG AAA GAC AAC CAG GTT ATC CAG AAA TCG ATG GAC ACT

80 85 90

ATC AAA GAA GAT CTG TTC GTT AAA TTC TTC AAC TCG TCG ACT TCT

95 100 105

AAA CTG GAA GAC TTC CAG AAA CTG ATC CAG ATC CCA GTT AAC GAC

110 115 120

CTG AAA GTT CAG CGT AAG GCT ATC TCT GAA CTG ATC AAA GTT ATG

125 130 135

AAC GAC CTG TCT CCA AAA GCT AAC CTG CGT AAA CGT AAA CGT TCT

140 145

CAG AAC CCA TTC CGT 6GT CGT CGT GCT CTT CAb TAA

Formel III

die nach an sich bekannten Verfahren hergestellt werden kann.

16 verschiedene Oligonukleotide wurden in zwei Varianten synthetisiert. Die erste vollständige Variante codiert für reifes Eq-IFN-γ mit 146 Aminosäuren plus Startmethionin (Formel III), die zweite für ein am Amino-Terminus um 3 Aminosäuren verkürztes Polypeptid plus Startmethionin.

-11 5 10

ATG CA6 GCT GCT TTC TTT AAA GAA ATC GAA AAC CTG AAA GAA TAC TTC

20 25 30

AAC GCT CGT AAC CCA GAC GTT GGT GAC GGT GGT CCG CTG TTC CTG

35 40 45

GAC ATC CTG AAA AAC TGG AAA GAA GAC TCT GAC AAA AAG ATC ATC

50 55 60

CAG TCT CAG ATC GTT TCT TTC TAC TTC AAA CTG TTC GAA AAC CTG

65 70 75

ΑΛΑ GAC AAC CAG GTT ATC CAG AAA TCG ATG GAC ACT ATC AAA GAA

80 85 90

GAT CTG TTC GTt AAA TTC TTO AAC TCG TCG ACT TCT AAA CTG GAA

95 100 105

GAC TTC CAG AAA CTG ATC CAG ATC CCA GTT AAC GAC .CTG AAA GTT

110 115 120

CAG CGT AAG GCT ATC TCT GAA CTG ATC AAA GTT ATG AAC GAC CTG

125 130 135

TCT CCA AAA GCT AAC CTG CGT AAA CGT AAA CGT TCT CA6 AAC CCA

140 143

TTC CGT GGT CGT CGT GCT CTT CAG TAA

Formel IHa

Beide Varianten lassen sich leicht dadurch modifizieren, daß man anstelle des für Methionin codierenden ATG eine für ein hydrophobes Signalpeptid codierende Sequenz, beispielsweise der Formel IV anknüpft.

ATG AAT TAT ACA AGT TTT ATC TTG GCT TTT CAG CTG TGT GCG ATT TTG GGT TCT TCT ACC

Formel IV

Durch eine solche Signalsequenz wird in bestimmten Wirtsorganismen die Sekretion des gewünschten Polypeptids aus dem Cytoplasma bewirkt. Hierbei wird das Protein prozessiert und das Signalpeptid abgespalten; man erhält das reife Protein. Zellen von Wirtsorganismen, z.B. E.coli, die nicht in der Lage sind, Polypeptide, die die Signalpeptidsequenz enthalten, zu prozessieren, müssen aufgeschlossen werden um das "unreife" Polypeptid zu isolieren. Auch diese "unreifen" EqlFN-y's mit vollständigen oder unvollständigen Signalpeptideequenzen sind Gegenstand der vorliegenden Erfindung.

Das Startmethionin läßt sich durch an sich bekannte Verfahren beispielsweise mit CNBr oder CNCl abtrennen um reifes EqIFN-γ zu erhalten.

Diese DNA-Sequenz codiert für EqIFN-γ, enthält jedoch ausschließlich solche Codons, die in von E.coli hoch exprimierten, zelleigenen Genen verwendet werden (Gouy und Gautier, Nucl. Acids Res. 10.. 7055 (1982)).

Eine Aufgabe der vorliegenden'Erfindung bestand weiterhin darin, erstmals das EgIFN-γ in homogener, reiner Form bereitzustellen.

Wie bereits erwähnt, ist die Isolierung und Reinigung des EqIFN-γ aus natürlichem Zellmaterial nicht geeignet, diese Aufgabe zufriedenstellend zu lösen. Erfindungsgemäß werden daher die DNA-Sequenzen gemäß Formel II, III und IHa zur Lösung dieser Aufgabe verwendet. Diese Sequenzen werden, mit entsprechenden Kontrollsequenzen versehen, in geeignete Vektoren eingebaut und damit transformierte geeignete Wirtsorganismen oder Wirtszellkulturen kultiviert. Die gebildeten Polypeptide werden nach an sich bekannten Verfahren isoliert und gereinigt.

ίο

Die erhaltenen Polypeptide entsprechen der nachfolgenden Formel:

15 10 15

Tyr Tyr Cys Gin Ala AIa Phe Phe Lys GIu lie GIu Asn Leu Lys

20 25 30

GIu Tyr Phe Asn AIa Arg Asn Pro Asp VaI G'.y Asp GIy GIy Pro

35 40 45

Leu Phe Leu Asp He Leu Lys Asn Trp Lys GIu Asp Ser As₁D Lys

50 . 55 60

Lys lie lie Gin Ser Gin Me VaI Ser Phe Tyr Phe Lys Leu Phe

65 70 75

GIu Asn Leu Lys Asp Asn Gin VaI lie Gin Lys Ser Met Asp Thr

80 ·. 85 90

lie Lys GIu Asp Leu Phe val Lys Phe Phe Asn Ser Ser Thr Ser

95 100 105

Lys Leu GIu Asp Phe GIn Lys Leu lie Gin He Pro VaI Asn Asp

110 115 120

Leu Lys VaI GIn Arg Lys Ala He Ser 61u Leu He Lys VaI Met

125 130 135

Asn Asp Leu Ser Pro Lys AIa Asn Leu Arg Lys Arg Lys Arg Ser

140 145

GIn Asn Pro Phe Arg GIy Arg Arg AIa Leu GIn "**

Formel V

Gin Ala AIa Phe Phe Lys GIu lie GIu Asn Leu Lys GIu Tyr Phe Asn AIa Arg Asn Pro Asp VaI GIy Asp GIy 61y Pro Leu Phe Leu Asp He Leu Lys Asn Trp Lys GIu Asp Ser Asp Lys Lys He lie Gin Ser Gin He VaI Ser Phe Tyr Phe Lys Leu Phe GIu Asn Leu Lys Asp Asn Gin VaI He GIn Lys Ssr Met Asp Thr He Lys GIu Asp Leu Phe VaI Lys Phe Phe Asn Ser Ser Thr Ser Lys Leu GIu Asp Phe GIn Lys Leu He Gin lie Pro VaI Asn Asp Leu Lys Val GIn Arg Lys Ala He Ser GIu Leu He Lys VaI Met Asn Asp Leu Ser Pro Lys AIa Asn Leu Arg Lys Arg Lys Arg Ser GIn Asn Pro Phe Arg GIy ^Arg Arg AIa Leu GIn **·

Formel Ja

ii

Bei Verwendung dec chromosomalen Sequenz (Formel II) erhält man nach Transformation von Säugetierzellen das EqIFN-γ in der natürlich vorkommenden, glykosylierten Form (authentisches EqIFN-γ).

Die Sequenzen gemäß Formel II, III bzw. IHa sind besonders geeignet bei der Herstellung des EqIFN-γ'ε in Mikroorganismen, insbesondere bei der Herstellung des EqIFN-γ'β in E.coli, wobei das Polypetid in nicht-glykosylierter Form exprimiert wird.

Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung bestand darin, Modifikationen des natürlichen EqIFN-γ'β bereitzustellen.

Modifikationen eines Proteins kann man herstellen, indem beispielsweise entweder das Protein derivatisiert oder durch Enzymverdau fragmentiert wird oder die das Protein codierende DNA-Sequenz durch Deletion oder Fragmentierung modifiziert und diese Sequenz in einem geeigneten Wirtsorganismus zur Expression gebracht wird.

Erfindungsgemäß werden die für Modifikationen des EqIFN-γ codierenden DNA-Sequenzen chemisch synthetisiert. Um eine einfache Manipulation des Gens für Veränderungen einzelner Abschnitte möglich zu machen, werden in die vollständige DNA-Sequenz mehrere singuläre Restriktionsenzym-Schnittstellen eingebaut.

Weitere modifizierte Formen des EqlFN-Y's erhält man erfindungsgemäß dadurch, daß die verschiedenen Oligonukleotide allein oder in verschiedenen Kombinationen, mit den entsprechenden Kontrollsequenzen versehen in geeignete Vektoren eingebaut werden, damit transformierte Wirtsorganismen kultiviert und die gebildeten Proteine isoliert und gereinigt werden.

Zur Lösung der gestellten Aufgaben wurde hochmolekulare DNA aus einem Gewebe von Pferden, vorzugsweise aus der Leber, nach einem modifizierten Verfahren gemäß Blin und Stafford (Blin, N.; Stafford, P..W. Nucl. Acids Res. (1976), 3. 2303-2308) isoliert und mit Hilfe spezieller Endonucleasen statistisch fragmentiert. Die so erhaltenen unterschiedlich großen Fragmente wurden nach der Größe fraktioniert, vorzugsweise zur Bildung von 10-23 kb Fragmenten, um in einem Vektor, beispielsweise in einem Lambda-Vektor beispielsweise Lambda EMBL3A geklont zu werden. Anschließend wurden diese Vektoren nach Transformation in eimen Wirtsorganismus, beispielsweise E.coli, vermehrt. Diese equine DNA-Bibliothek wurde mit Hilfe einer humanen gamma-Interferon "probe" unter nicht stringenten Hybridisierungsbedir.gungen durchsucht. Die niedrige Stringenz ermöglicht das Auffinden von DNA Sequenzen, die Unterschiode zu der ".probe" aufweisen.

Sie kann entweder durch Verdauung literaturbekannter Plasmide mit Hilfe von Restriktionsenzymen oder durch chemische Synthese mittels an sich bekannter Oligonukleotidsyntheseverfahren hergestellt werden. Diese "probe" weist die für HuIFN-γ kodierende Sequenz auf. Fünf Lambda Klone konnten identifiziert werden, die positive Hybridisierungssignale ergaben.

Aus diesen isolierten rekombinanten Phagen wurde nach üblichen Methoden die DNA gereinigt. Die Phagen-DNAs wurden nach Verdauung mit verschiedenen Restriktionsenzymen und nachfolgender Southern-Analyse (Southern, J.Mol. Biol. 98: 503-517, 1975) durch Hybridisierung mit der HuIFN-γ "probe" charakterisiert. Ein singulüres hybridisierendes 4,6 kb langes BamHI Fragment des Klons Lambda Eq-y2 wurde isoliert und in die BamHI Schnittstelle des- Plasmids pUC9 (Vieira und Messing, Gene 19: 259-268, 1982) geklont.

13

Nach Transformation von E.coli beispielsweise JMlOl. wurde aus- erhaltenen Kolonien in einem Minipräparationsverfahren (Birnboim und DoIy, Nucl. Acids Res. 7: 1513-1523, 1979) Plasmid-DNA hergestellt und durch Verdauung mit Restriktionsenzymen charakterisiert. Ein Plasmid mit dem gewünschten BamHI Insert wurde pAHlll benannt. Die Ränder des BamHI Inserts von Plasmid pAHlll wurden nach Einbringung in die M13mp8 bzw. M13mp9 Vektoren (Vieira und Messing, Gene 19, 259-268, 1982) nach der Didösoxy-Methode sequenziert (Sanger et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 74: 5463-5467, 1977). Ein Sequenzvergleich mit dem humanen gamma-Interferon-Gen (Gray und Goeddel, Nature 298: 859-863, 1982) zeigte hohe Homologie mit den nichtkodierenden 5'- und 3'-Regionen. Daraus wurde geschlossen, daß das vollständige EqIFN-γ Gen isoliert, wurde.

Das 4,6 kb lange BamHI Insert von Plasmid pAHlll wurde· nach der Didesoxy-Methode vollständig sequenziert. Die Gesamtsequenz des BamHI-Fragmeni:s wurde durch Kombination von Teilsequenzen von M13-Subklonen ermittelt, die durch gerichtete Klonierung von Restriktionsfragmenten (EcoRI, Hindlll, Pstl, Pstl-Bglll, HindIII-BamHI) in entsprechend geschnittene M13mp8 oder M13mp9 Vektoren erhalten wurden. Weitere Teilsequenzen wurden erhalten, indem das 2,0 kb lange BamHI-Bglll Fragment, bzw. das 2,0 kb lange Pstl Fragment nach der "Shotgun-Methode" in den M13mp8 Vektor geklont wurde.

Die erhaltenen Teilsequenzen wurden mittels eines Computerprogrammes zu der 4664 bp langen Totalsequenz vereint, die in Fig, 1 dargestellt ist.

Durch computerunterstützte Analyse der offenen Leserahmen und Vergleich mit gamma-Interfe_„ngenen anderer Spezies (Gray und Goeddel, Nature 298: 859-863; Gray und Goeddel, Proc. Natl.Acad.Sci.USA 80: 5842-5846, 1983; Dijkema et al., EMBO J. 4: 761-767, 1985; Cerretti et al., J. Immunology 136: 4561-4564, 1986) wurde der proteinkodierende Bereich des equinen gamma-Interferongens ermittelt. Die proteinkodierende Region ist durch drei Introns unterbrochen, wobei im ersten Exon das 20 Aminosäuren lange, hydrophobe Signalpeptid und 18 Aminosäuren des reifen EqIFN-γ Polypeptides kodiert sind (Basen 366-479). Das zweite Exon kodiert für die Aminosäuren 19-41 (Basen 1639-1707), das dritte Exon kodiert für'die Aminosäuren 42-102 (Basen 1803-1985), das vierte Exon kodiert den Carboxy-Terminus mit den Aminosäuren 103-146 (Basen 3307-3441). An den Positionen 4010 und 4020 befinden sich zwei Signalsequenzen (AATAAA) für die Polyadenylierung der mRNA. An den Positionen 86-88 des reifen EqIFN-γ Polypeptides befindet sich die einzige potentielle N-Glykosylierungsstelle (ASN-Ser-Ser), welche mit der zweiten N-Glykosylierungsstelle des bovinen gamma-Interferons (Asn-Gly-Ser) zusammenfällt (Fig. 2). Das reife EqIFN-γ Polypeptid enthält überraschenderweise nur einen einzigen Cypteinrest an Position 3, wobei in Analogie zu den natürlichen humanen und murinen gamma-Interferonen wahrscheinlich die ersten drei amino-terminalen Aminosäuren (in diesem Fall Tyr-Tyr-Cys) im Körper proteolytisch abgespalten werden.

Um rekombinantes EqIFN-γ in seiner reifen Form in Escherichia coli zu exprimieren, wurde ein synthetisches Gen aus Oligonukleotiden konstruiert. Es kodiert für dieselbe Aminosäuresequenz wie das natürliche EqIFN-γ Gen, enthält jedoch ausschließlich solche Codons für die einzelnen Aminosäuren, die in von E.coli hoch exprimierten, zelleigenen Genen verwendet werden (Gouy und Gautier, Nucl. Acids Res. lü: 7055-7074, 1982). Zusätzlich wurden mehrere singuläre

Restriktionsenzym-Schnittstellen eingebaut, die eine einfache Manipulation des Gens für die Veränderung einzelner Abschnitte möglich macht. Das synthetische Gen für EqIFN--γ wurde in zwei Varianten aus insgesamt 16 verschiedenen Oligonukleotiden konstruiert. Die orste Variante kodiert für reifes EqIFN-γ mit 146 Aminosäuren plus Start-Methionin, die zweite Form für ein am Amino-Terminus um 3 Aminosäuren (Tyr-Tyr-Cys) verkürztes Polypeptid plus Startmethionin, wie es vermutlich im natürlichen Organismus auftreten dürfte.

Die Struktur des synthetischen EqIFN-γ Gens ist in Fig. 3 dargestellt. Die für die Herstellung verwendeten Oligonukleotide wurden mit Hilfe eines Applied Biosyetems Model 381A DNA-Synthesizer synthetisiert, durch Elektrophorese gereinigt und entsalzt. Die in Fig. 3 gekennzeichneten Oligonukleotide haben folgende Struktur:

¹⁶

EG-I 5'-TACTACT6CC AGGCTGCHT CTTTAAAGAA ATC6AAAACC T6AAA6AATA

CTTCAACGCT CG-3' EG-2 5'-HGAAGTAH CTTTCAGGTT TTCGAHTCT HAAAGAAAG CAGCCfGGCA

GTAGTA-3' EG-3 5'-TAACCCAGaC GTTGGTGAC6 6TGGTCC6CT GTTCCT66AC ATCCTGAAAA

ACTG6AAAGA A6ACTCTG-3' EG-4 5'-HCHTCCAG THHCA66A TGTCCA66AA CAGC66ACCA CC6TCACCAA

C6TCT6G6H AC6A6CG-3' EG-5 5'-ACAAAAA6AT CATCCAGTCT CAGATCGHT CTHCTACTT CAAACTGHC

GAAAACCTGA AAGACAACC *'3' EG-6 5'-THCAGGTH TCGAACAGTT T6AAGTAGAA AGAAACGATC TGA6ACTGGA

TGATCTTHT 6TCA6AGTC-3' EG-7 5'-AGGHATCCA GAAATCGATG 6ACACTATCA AAGAAGATCT 6HCGTTAAA

HCTTCAACT CG-3' EG-8 5'-TC6AC6A6H GAAGAATTTA A(GAACAGAT CHCHTGAT AGTGTCCATC

GATTTCTGGA TAACCTGGTT GTC-3¹ EG-9 5'-TCGACTTCTa AACTGGAAGA CTTCCAGAAA CTGATCCA6A TCCCAGHAA

CGACCTGAAA-3' €6-10 5'-6CTGAACHT CAG6TCGTTA ACT66GATCT GGATCAGTH CT6GAA6TCT

TCCAGTTTAG AAG- 3' Ε6-Π 5'-GHCAGCGTA AGGCTATCTC TGAACTGATC AAAGHAT6A AC6ACCTGTC

TCCAAAAGCT AA-3' EG-12 5'-CGCAGGHAG CTHTGGAGA CAGGTCGTTC ATAACTTTGA TCAGTTCAGA

6ATA6CCTTA C-3' EG-13 5'-CCTGCGTAAA CGTAAACGTT CTCAGAACCC ATTCCGTGGT CGTCGTGCTC

HCAGTAAG-3' EG-14 5'-GATCCTTACT GAAGAGCAC6 ACGACCACGG A/iTGGGTTCT GAGAACGHT

ACGTTTA-3'

EG-15 5'-CAGGCTGCH TCTTTAAAGA AATCGAAAAC CTGAAAGAAT ACTTCAACGC TCG-3' EG-16 5'-HGMGTATT CTHCAG3TT TTCGATHCT TTAAAGAAAG CAGCCTG-3'

17 ZCt/?0C

Der Zusammenbau des synthetischen EqIFN-γ Gens erfolgte in zwei Abschnitten. Der erste Teil des Gens wurde mit Hilfe der acht Oligonukleotide EG-I bis EG-8 bis zur Sail Schnittstelle hergestellt, die zweite Hälfte des Gens aus den sechs Oligonukleotideii EG-9 bis EG-14 von der Sail Schnittstelle bis zur BamHI Schnittstelle. Für die am Amino-Terminus um drei Aminosäuren verkürzte Form des EqIFN-γ wurden statt der Oligonukleotide EG-I und EG-2 die Oligonukleotide EG-15 und EG-16 verwendet.

Gegenstand der Erfindung sind nicht nur Gen-Sequenzen, die spezifisch für die erfindungsgemäßen Interferone codieren, sondern ebenfalls Modifikationen, die leicht und routinemäßig durch Mutation, Abbau, Transposition oder Addition erhalten werden können. Jede Sequenz, die für die erfindungsgemäßen Interferone codiert (d.h. die das biologische Aktivitätsspektrum aufweist, das hier beschrieben ist) und im Vergleich mit den gezeigten degeneriert ist, ist ebenfalls eingeschlossen; Fachleute auf diesem Gebiet sind in der Lage, DNA-Sequenzen der codierenden Regionen zu degenerieren. Ebenso ist jede Sequenz, die für ein Polypeptid mit dem Aktivitätsspektrum der erfindungsgemäßen Interferone codiert, und die mit den gezeigten Sequenzen (oder Teilen davon) unter stringenten Bedingungen hybridisiert (beispielsweise Bedingungen, die für mehr als 85 %, bevorzugt mehr als 90 % Homologie selektieren) beinhaltet.

Die Hybridisieirungen werden in 6xSSC/5x Denhardt's Lösung/0,1% SDS bei 65°C durchgeführt. Der Grad dar Stringenz wird im t-Mschschritt festgelegt. So sind für eine Selektionierung auf DNA-Sequenzen mit ca. 85 % oder mehr Homologie die Bedingungen 0,2xSSC/0,01% i?DS/65°C und für eine Selektionierung auf DNA-Sequenzen r.it ca. 90 % oder mehr Homologie die Bedingungen 0,Ix SSC/0,01% SDS 65°C geeignet.

Erfindungsgemäße Interferon-Gene können unter Bedingungen in jeden Organismus eingebracht werden, die zu hohen Ausbeuten führen. Geeignete Wirte und Vektoren sind dem Fachmann bestens bekannt; als Beispiel sei auf die EP-A-O.093.619 hingewiesen.

Insbesondere sind Prokaryoten für die Expression bevorzugt, beispielsweise E. coli K 12, Stamm 294 (ATCC Nr. 31 446) oder E. coli X1776 (ATCC Nr. 31.537). Ebenso wie die vorerwähnten Stämme können auch E. coli W 3110 (F , Lambda , Prototroph, ATCC Nc. 27325), Bazillen wie Bacillus subtilis, und andere Enterobacteriaoeae, wie Salmonella typhimurium oder Serratia marcescens und verschiedene Pseudomonaden verwendet werden.

Im allgemeinen können Plasmid-Vektoren, die Kontrollsequenzen, die aus Spezies stammen, die kompatibel mit den Wirtszellen sind, enthalten, in Verbindung mit diesen Wirten verwendet werden. Der Vektor trägt üblicher- weise neben einer Replikationsstelle Erkennungssequenzen, die es ermöglichen, die transformierten Zellen phenotypisch zu selektieren. Zum Beispiel wird E. coli üblicherweise mit pBR322 transformiert, ein Plasmid, das aus E. coli Spezies stammt (Bolivar, et al., Gene 2, 95 (1977)). PBR322 enthält Gene für Ampicillin- und Tetracyclin-Resistenz und bietet damit die Möglichkeit, transformierte Zellen zu identifizieren. Das pBR322-Plasmid oder auch andere Plasmide müssen außerdem von sich aus Promotoren enthalten oder müssen mit Promotoren versehen wurden, die vom mikrobiellen Organismus zur Expression ihrer eigenen Proteine verwendet werden können. Die Promotoren, die am häufigsten bei der Herstellung rekombinanter DNA verwendet worden, beinhalten die Beta-Lactamase-iPenicillinase) und Lactose-Promotor-Syeteme (Chang et al., Nature 275, 615 (1978); Itakura et al., Science !£8., 1056 (1977); Goeddel et al., Nature 281, 544 (1979)) und Tryptophan(trp) Promotor- Systeme (Goeddtl et al., Nucleic Ac,ids Res. 8.,

4057 (1980); EP-A-O,036.776). Neben diesen besonders gebräuchlichen Promotoren sind auch andere mikrobielle Promotoren entwickelt und benutzt worden. Die Gen-Sequenz für die erfindungsgemäßen Interferone kann beispielsweise unter der Kontrolle des Leftward-Promotors des Bakteriophagen Lambda (P ) eingesetzt werden. Dieser

Promotor ist ein besonders effektiver steuerbarer Promotor. Die Steuerung wird möglich durch den Lambda-Repressor, von dem benachbarte Restriktionsschnittstellen bekannt sind. Ein temperaturempfindliches Allel dieses Repressor-Gens kann in einen Vektor, der eine EqlFN-y-Sequenz enthält, eingefügt werden. Wird die Temperatur auf 42°C erhöht, wird der Repressor inaktiviert und der Promotor aktiviert. Durch die Verwendung dieses Systems ist es möglich, eine Clon-Bank zu etablieren, in der eine funktionelle IFN-Sequenz in Nachbarschaft zu einer Ribosom-Bindungsstelle in variierenden Abständen zu dem Lambda-P.-Promotor plaziert wird. Diese Klone können dann überprüft und der mit der höchsten Ausbeute selektiert werden.

Die Expression und Translation einer Sequenz codierend für die erfindungsgemäßen Proteine kann auch unter Kontrolle anderer Regulationssysteme, die als "homolog" zu dem Organismus in seiner untransformierten Form gelten können, ablaufen. So enthält z.B. chromosomale DNA von einem Lactose-abhängigen E.coli ein Lactose oder Lac-Operon, das durch Ausschüttung des Enzyms Beta-Galactosidase den Lactose-Abbau ermöglicht.

Die Lac-Kontrolleleiiiente können aus dem Bacteriophagen Lambda-placS, der infektiös für E. coli ist, erhalten werdon. Das Lac-Operon des Phagen kann durch Transduktion aus der- selben Bakterien-Spezies stammen.

Regulationssysteme, die bei dem erfindungsgemäßen Verfahren Verwendung finden können, können auch aus plasmidischer DNA stammen, die dem Organismus eigen ist. Das Lac-Promotor-Operator-System kann durch IPTG induziert werden.

Andere Promotor-Operator-Systeme oder Teile hiervon können genausoqut verwendet werden: beispielsweise Arabinose-Operator, Colicine E -Operator, Galactose-Operator, alkalischer Phosphatase-Operator, trp-Operator, Xylose-A-Operator, tac-Promotor u.a..

Zusätzlich zu Prokaryoten können auch eukaryotische Mikroorganismen, wie Hofekulturen verwendet werden. Saccharomyces cerevisiae ist die am meisten verwendete von den eukaryotischen Mikroorganismen, obwohl eine Anzahl anderer Spezies allgemein erhältlich ist. Zur Expression in Saccharomyces wird beispielsweise das Plasmid YRp7 (Stinchcomb et al. Natur £82., 39 (1979)? Kingsraan et al., Gene 7, 141 (1979); Tschumper et al., Gene IjO, 157 (1980)) und das Plasmid YEpl3 (Bwach et al., Gene 8., 121-133 (1979)) verwendet. Das Plasmid YRp7 enthält das TRPJL-Gen, das eine Selektionierungsmarkierung für eine Hefemutante, die unfähig ist, in trypthophanfreiem Medium zu wachsen, bereitstellt; beispielsweise ATCC Nr. 44076.

Das Vorhandensein des TRPl Schadens als Charakteristikum des Hefe-Wirts Genoms stellt dann ein wirksames Hilfsmittel dar, um Transformation nachzuweisen, wenn ohne Tryptophan kultiviert wird. Ganz ähnlich verhält es sich bei dem Plasmid YEpl3, das das Hefe-Gen LEU 2, das zur Ergänzung einer LEU-2-minus-Mutante verwendet werden kann, enthält. Geeignete Promotor-Sequenzen für Hefe Vektoren beinhalten die 5'-flankierende Region der Gene des ADH I (Ammerer G., Methods of Enzymology 101, 192-201 (1983)),

21 ICq70¹C

3-Phosphoglycerate-Kinase (Hitzeman et al., J. Biol. Chem. 255, 2073 (1980)) oder andere glykolytische Enzyme (Kawaski und Fraenkel, BBRC 106., 1107-11.12 (1982)) wie Enolase, Glycerinaldehyd-S-phosphat-Dehydrogenase, Hexokinase, Pyruvat-Decarboxylasc, Phosphofructokinase, Glucose-6-Phosphat-Isomerase, Phosphoglucose-Isomerase und Glucokinase. Bei der Konstruktion geeigneter Expressionsplasmide können die mit diesen Genen assoziierten Terminationssequenzen ebenfalls in den Expressions-Vektor am 3'-Ende der zu exprimierenden Sequenz eingesetzt werden, um Polyadenylierung und Termination der mRNA zu ermöglichen.

Andere Promotoren, die zudem noch den Vorteil der durch Wachstumsbedingungen kontrollierten Transkription besitzen, sind die Promotor-Regionen der Gene für Alkohol-Dehydrogenase-2, Isocytochrom C, Saure-Phosphatase, abbauende Enzyme, die mit dem Stickstoff-Metabolismus gekoppelt sind, die oben erwähnte Glycerinaldehyd-3-Phosphat-Dehydrogenase und Enzyme, die für die.Verarbeitung von Maltose und Galaktose verantwortlich sind. Promotoren, die durch den Hefe Mating Typ Locus reguliert werden, beispielsweise Promotoren der Gene BARI, MFaI, STE2, STE3, STE5 können bei temperaturregulierten Systemen durch die Verwendung von temperaturabhängigen sir Mutationen eingesetzt werden. (Rhine Ph.D. Thesis, University of Oregon, Eugene, Oregon (1979), Herskowitz and Oshima, The Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces, part I, 181-209 (1981), Cold Spring Harbor Laboratory). Diese Mutationen beeinflussen die Expression der ruhenden Mating-Typ Kassetten von Hefen und dadurch indirekt die Mating-Typ abhängigen Promotoren. Generell ist jedoch jeder Plasmid Vektor, der einen Hefe-kompatiblen Promotor, originäre Replikations- und Terminationssequenzen enthält, geeignet.

Zusätzlich zu Mikroorganismen sind Kulturen multizellulärer Organismen ebenfalls geeignete Wirtsorganismen. Im Prinzip ist jede dieser Kulturen einsetzbar, ob von Wirbeltier- oder wirbellosen Tierkulturen. Größtes Interesse besteht jedoch an Wirbeltier-Zellen, so daß die Vermehrung von Wirbeltierzellen in Kultur (Gewebe-Kultur) in den letzten Jahren zu einer routinemäßigen Methode wurde (Tissue Culture, Academic Press, Kruse and Patterson, Editors (1973)). Beispiele solch nützlicher Wirtszellinien sind VERO- und HeLa-Zellen, CHO-Zellen und WI38, BHK, COS-7 und MDCK-Zellinien. Expressionsvektoren für diese Zellen enthalten üblicherweise (wenn nötig) einen Replikationsstartpunkt, einen Promotor, der vor dem zu exprimierenden Gen lokalisiert ist, gemeinsam mit allen notwendigen Ribosomenbindungsstellen, RNA-Splicing-Stelle, Polyadenylierungsstelle und transkriptionelle Terminations-Sequenzen.

Bei der Verwendung in Säugetierzellen stammen die Kontrollfunktionen .auf den Expressions-Vektoren oftmals aus viralera Material. Beispielsweise stammen die üblicherweise verwendeten Promotoren aus Polyoma Adenovirus 2, und besonders häufig aus Simian Virus 40 (SV 40). Die frühen und späten Endpromotoren des SV 40 sind besonders nützlich, da beide leicht aus dem Virus als Fragment zu erhalten sind, das auch noch die virale Replikationsstelle des SV 40 enthält. (Fiers et al., Nature 221. 113 (1978)). Auch können kleinere oder größere Fragmente des SV 40 verwendet werden, vorausgesetzt, sie enthalten die annähernd 250 bp lange Sequenz, die von der Hindlll Schnittstelle bis zur BgII Schnittstelle in dem viralen Replikationsstartpunkt reicht. Außerdem ist es ebenfalls möglich und oft empfehlenswert, Promotor- oder Kontroll-Sequenzen zu verwenden, die normalerweise mit den gewünschten Gensequenzen verknüpft sind, vorausgesetzt, diese Kontroll-Sequenzen sind kompatibel zu den Wirtsze.llsystemen.

Ein Replikationsstartpunkt kann entweder durch entsprechende Vektorkonstruktion vorgesehen werden, um einen exogenen Startpunkt einzubauen, beispielsweise aus SV 40 oder anderen viralen Quellen (z.B. Polyoma, Adeno, VSV, PBV, etc.) oder kann durch die chromosomalen Replikationsmechanismen der Wirtszelle vorgesehen werden. Wird der Vektor in das Wirtszellen- Chromosom integriert, reicht die zuletztgenannte Maßnahme meistens aus.

Vorzugsweise können die erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen auch in dem Expressionsplasmid pEPiC3 (E. Rastl-Dworkin et al., Gene 21, 237-248 (1983) und EP-A-O.115-613 - hinterlegt bei der DSM unter der Nummer DSM 2773 am 20. Dezember 1983), in cem Plasmid parpER33 (EP-A-O.115-613) oder dem Plasmid μΡΗΙΟΟ exprimiert werden, da diese Vektoren alle Regulationselemente enthalten, die zu einer hohen Expressionsrate der klonierten Gene führen. Erfindungsgemäß wird als Expressionsvektor für das synthetische EqIFN-γ Gen das Plasmid pRHIOO verwende:, das den regulierbaren Tryptophanpromotor aus Serratia marcescens und eine artifizielle Ribosomenbindungsstelle enthält. Zur Herstellung dea Expressionsplasmidee pRHIOO wurde das Plasmid pER103 (Eva Dworkin-Rastl et al., Gene 21 (1983) 237-248, EP-A-O.115-613) mit der Restriktionsendonuklease Hinälll linearisiert und die 5'terminalen Phosphatreste wurden entfernt.

Diese Plasmid-DNA wurde mit den phosphorylierten Oligonukleotiden d(AGCTTAAAOATGAGCT) und d(CATCTTTA) gemischt und ligiert. Die Ligasereaktion wurde mit der Restriktionsendonukleaso Sacl verdaut und durch Zugabe von T4-PNK ligiert. Die Oligonukleotide wurden analog der in der EP-A-O.115-613 beschriebenen Methode hergestellt. Kompetenter E.coli HBlOl wurde mit dieser Ligasereaktion versetzt und inkubiert. Von den entstandenen

Bakterienkolonien wurden 12 willkürlich ausgesucht und daraus im Mikromaßstab die Plasmide isoliert (Birnboim und DoIy, Nucl. Acids Res. 7 (1979) Ü513-1523). Die resultierende DNA wurde mit der Restriktionsendonukiease Sacl geschnitten und die DNA auf einem Agarosegel (1%, Ix TEE-Puffer) aufgetrennt. Die Wanderung der DNA als lineares Molekül der Größe von etwa 4.400 bp bestätigte die Einführung einer Sacl-Erkennungsstelle in das Plasmid. Eines dieser Plasmide wurde willkürlich ausgesucht. Mit der DNA aus der dazugehörigen Minipräparation wurde nochmals E.coli HBlOl transformiert. Von den resultierenden transformierten Bakterien wurde eine Kolonie ausgewählt und in größerem Maßstab angezüchtet. Das daraus isolierte Plasmid wurde mit den Restriktionsendonukleasen EcoRI und BamHI geschnitten, die DNA auf einem l%i.gem-Agaroeegel aufgetrennt, und das · kleinere Fragment aus dem Gel durch Elektrcelution isoliert. Dieses etwa 460 bp lange EcoRI-BamHI DNA-Fragment wurde nach Sanger sequenziert. (F. Sanger et al., Proc. Natl. Acad. Sei. (1977) 546?-^467). Das dermaßen analysierte Plasmid wurde pRHIOO genannt.

Das Plasmid wurde mit Sacl vollständig geschnitten und die Überhängenden DNA-Enden wurden durch Behandlung mit Klenow-Fragment (Amersham) in Gegenwart aller vie;: Desoxynukleotidtriphosphate begradigt. Die Reaktion wird durch Phenol/Chloroform-Extraktion gestoppt und die DNA durch Äthanolfällung konzentriert. Durch diese Behandlung entsteht im Anschluß an den Tryptophanpromotor ein stumpfes DNA-Ende, das mit dem Translationsstartcodon "ATG" endet. Die linearisierte Plasmid-DNA wird mit BamHI nachgeschnitten und der Vektoranteil isoliert.

Der so vorbereitete pRHIOO Plasmid-Vektor wird mit den ligierten Oligonukleotiden EG-I bis EG-8 und EG-9 bis EG-14 gemischt und in Ligationspuffer mit T4 DNA-Ligase inkubiert. Kompetent

gemachter E.coli, vorzugsweise JMlOl, wird mit diesem Ligationsgemisch transformiert und über Nacht inkubiert. Von den erhaltenen Transformanten wird im Minipräparationsverfahren Plasmid-DNA isoliert und durch Restriktionsanalyse und Sequenzierung des Hindlll-BamHI Inserts die Struktur ermittelt. Ein Plasmid der gewünschten Struktur für die Expression von reifem EqIFN-γ wird pEqG-YYCl benannt.

In völlig analoger Weise werden die Oligonukleotide EG-15,J,6 EG-3 bis EG-8 und EG-9 bis KG-14 in den pRHIOO Vektor geklont, um das um drei Aminosäuren verkürzte EqIFN-γ zu erhalten. Ein Plasmid der gewünschten Struktur wird pEqG-QAAl benannt.

Transformation der Zellen mit den Vehikeln kann durch eine Vielzahl an Verfahren erreicht werden. Beispielsweise kann sie durch Kalzium erfolgen, wobei entweder die Zellen in Ma- gnesium gewaschen und die DNA den in Kalzium suspendierten Zellen zugegeben oder die Zellen einem Kopräzipitat von DNA und Kalziumphosphat ausgesetzt werden. Bei nachfolgender Genexpression werden die Zellen auf Medien übertragen, die für transformierte Zellen selektieren.

Zum Nachweis der Expression der Incerferonaktivität durch E.coli JMlOl, die das Plasmid pEqG-YYCl oder pEqG-QAAl enthalten, werden die Bakterien nach der Inkubation in einem geeigneten Kulturmedium aufgebrochen und der überstand nach Sterilfiltration auf Interferonaktivität in einem Assay, der den cytopathischen Effekt (CPE) von VSV oder EMCV mißt, getestet. Verwendet werden dazu NBL-6 Zellen (ATCC CCL 57, Pferdehaut-Epidermis-Zellen), die mit Vesicular-Stomatitis-Virus (VSV) infiziert worden waren und/oder A549 (ATCC CCL185, humane Lungencarcinom-Zellinie) die mit Encephalomyocarditis Virus (EMCV) infiziert worden waren.

Der Nachweis der exprimierten Pferde-Interferone wird durch Markierung der Proteine in Maxizellen erbracht. Plasmidcodierte Proteine können durch Verwendung der Maxizelltechnik (Sancar, A. et al., J. Bacteriol, 112, 692-693 (1979) selektiv in vivo markiert werden. Der E.coli Stamm CSR603 (CGSC 5830) besitzt keine Mechanismen für die Reparatur von durch UV-Bestrahlung entstandene Schäden der DNA. Durch Bestrahlung mit einer geeigneten UV-Strahlendosis wird das bakterielle Chromosom zerstört, einige der wesentlich kleineren und in mehreren Kopien pro Zelle vorhandenen Plasmid-DNAs bleiben dagegen funktionell. Nach Abtöten aller nicht geschädigten, eich vermehrenden Zellen durch das Antibiotikum D-Cycloserin und Aufbrauchen der endogenen mRNA werden in den verbleibenden Zellen nur noch am Plasmid codierte Gene transkribiert und translatiert. Die gebildeten Proteine können durch Einbau von S-Methionin radioaktiv markiert und nachgewiesen werden. E.coli CSR603 wird nach üblichen Verfahren mit den Expresßionsplasmiden transformiert und auf ampicillinhaltigen Agarplatten auf transformierte Bakterien selektioniert. Die Präparation der Maxizellen und das Markieren der Proteine erfolgt nach der Vorschrift von A. Sancar. Ale Molekulargewichtestandard wird ein

C-methyliertee Proteingemisch (Amersham) verwendet. Als

Kontrollen werden das Plasmid pER103, das nur den Promotor ohne Interferongen enthält und das Plasmid pER21/l eingesetzt, das zwei Kopien des humanen IFN-ot2arg Genes enthält.

Zur Charakterisierung der erfindungegemäßen Produkte sind die bekannten biologischen und immunologischen Assaye für Interferone geeignet. Da sowohl IFN-a, -fi und γ die in den PFU- und CPE-Assays festzustellende antivirale Eigenschaft eigen ist, wird zur Unterscheidung des erfindungsgemäßen EqlFN-y's von EqlFN-a und/oder -ß- die unterschiedliche Antigenität der Interferone ausgenutzt.

Die erfindungsgemäßen Polypeptide werden nicht durch Antiseren gegen EgIFN-a und/oder EqlFN-ß neutralisiert. Als weiteres Unterscheidungekriterium ist die Säurelabilität der erfindungsgemäßen Polypeptide, sowie die Sensitivität auf Natriumdodecylßulfat (SDS) geeignet. Sowohl die Inkubation mit 0,2%iger SDS-Löeung als auch die Inkubation der Polypeptide bei pH2 über einige Stunden bei 4°C führt zu einem fa3t völligen Verlust der antiviralen Aktivität. EqlFN-o und EqIFN-ß- sind unter gleichen Bedingungen stabil.

Zum Nachweis der Gesamtanzahl von Sequenzen im Pferdegenom, die hohe Homologie mit dem Interferongen aufweisen, wird hochmolekulare Pferde-DNA mit den entsprechenden Restriktionsenzymen vollständig verdaut und diese geschnittene DNA nach der Größe aufgetrennt. Nach Southern-Transfer auf Nitrozellulosefilter, denatuieren und fixieren der DNA wird jed«s Filter mit nicktranslatierter Probe hybridisiert. Ais Probe für EqIFN-γ wird ein Fragment aus dem Plasmid pEqG-YYCl verwendet, das die codierende Sequenz für das gesamte reife Interferon enthält. Die Filter werden anschließend unter stringenten Bedingungen gewaschen. Die Autoradiographie erfolgt auf DuPont Cronex X-ray Film unter Verwendung von Kodak Lanex-Regular Verstärkerfolie 7 Tage bei -80⁰C. ι

Nach erfolgter Transformation des Wirtes, Expression des Gens und Fermentation oder Zellkultivierung unter Bedingungen, bei denen die erfindungsgemäßen Proteine exprimiert wird, kann das Produkt üblicherweise durch bekannte chromatographische Trennmethoden extrahiert werden, um so ein Material zu erhalten, das die Proteine mit oder ohne Loader und Tailing-Sequenzen enthält. Die erfindungsgemäßen Interferone können mit einer Leader-Sequenz am N-Terminus exprimiert werden (Pre-IFN), die von einigen Wirtszellen entfernt werden kann. Wenn nicht, so ist. eine Abspaltung des Loader-Polypeptids (wenn vorhanden) erforderlich, um reifes

IFN zu erhalten. Alternativ kann der IFN Klon so modifiziert werden, daß das reife Protein im Mikroorganismus direkt statt des Pre-IFN produziert wird. Für diesen Fall kann die Precursor-Sequenz des Hefe-Mating-Pheromons MF-alpha-1 verwendet werden, um eine korrekte "Reifung" des fusionierten Proteins und die Ausscheidung der Produkte in das Wachstumsmedium oder den periplasmischen Raum zu gewährleisten. Die DNA-Sequenz für funktionelles oder reifes IFN kann mit MF-alpha-1 an der vermuteten kathepsinähnlichen Schnittstelle (nach Lys-Arg) an Position 256 vom Initiationscodon ATG aus (Kurjan, Herskowitz, Cell 20., 933-943 (1982)) verbunden sein.

Ein Verfahren, nach dem EqIFN-γ z.B. aus Bakterien gereinigt werden kann, ist in dem folgenden allgemeinen Schema beschrieben.

1. Extraktion der Zellen in einem Lysepuffer (etwa pH 8) von hoher Leitfähigkeit mittels Passage durch einen Homogenisator bei hohem Druck; Abkühlen des Abströme in einem Eisbad.

2. Ausfällung der DNA durch Zugabe .von Polyethylenimin unter Rühren z.B. bei 4⁰C.

3. pH-Ausfällung der bakteriellen Proteine, wobei wiederum EqIFN-γ in Lösung bleibt.

4. Abzentrifugieren der Feststoffe bei 4°C.

5. Konzentrieren des Überstands (nach erneuter Einstellung des pH) z.B. durch Ultrafiltration.

6. Dialyse des Konzentrats gegen einen Puffer von niedriger Leitfähigkeit.

²⁹ /&9/0C

7. Abzentrifugieren der Feststoffe, wobei EqIFN-γ in Lösung bleibt.

8. Ionenaustauschchromatographie an Carboxymethylcellulose, Elution mit einem Gradienten an zunehmend3r Ionenstärke.

9. Chromatographie an Calciumphosphat-Gel und Elution mit einem Gradienten an zunehmender Ionenstärke.

10. Ionenaustauschchromatographie an Carboxymethylcellulose unter schwach denaturierenden Bedingungen und Elution mit einem Gradienten an zunehmender Ionenstärke.

11. Abtrennung durch Gelfiltrationschromatographie.

Das genannte Verfahren ermöglicht Materialausbeuten mit einer Reinheit von mehr als 95%.

An dieser Stelle sei erwähnt, daß es eich bei den erfindungsgemäßen Interferonen nicht nur um die Interferone, die im einzelnen beschrieben, sind, handelt, sondern ebenfalls um jedwede Modifikation dieser Polypeptide, die die Pferde-y-IFN-Aktivität nicht wesentlich verändert. Diese Modifikationen beinhalten z.B. Verkürzung des Moleküls z.B am N- oder C-terminalen Ende, Austausch von Aminosäuren durch andere Reste, chemische oder biochemische Bindungen des Moleküls an andere Moleküle, die inert oder aktiv sind. Bei den letztgenannten Modifikationen kann es eich beispielsweise um Hybridmoleküle aus einem oder mehreren erfindungsgemäßen Interferonen und/oder bekannten α- oder ß-Interferonen handeln.

Basierend auf ihrem biologischen Wirkungsspektrum sind die neuen, erfindungsgemäßen Interferone verwendbar für jede Art der Behandlung für die auch die bekannten Interferone eingesetzt werden. Diese beinhalten beispielsweise Herpes, Rhinovirus, Fiuine-Abortion-Virus, verschiedene Krebsarten und ähnliches. Die neuen Interferone können alleine oder in Kombination mit anderen bekannten Interferonen oder biologisch aktiven Produkten eingesetzt werden, beispielsweise mit iFN-alpha, IL-2, anderen Immun-Modulatoren und ähnlichen.

Die erfindungsgemäßen Interferone können parenteral verabreicht werden in Fällen, in denen Antitumor oder antivirale Behandlung erforderlich ist und in Fällen, in denen eich immunosuppressive Eigenschaften zeigen. Dosierung und Doßierungerate können ähnlich denen sein, die zur Zeit bei klinischen Untersuchungen für IFN-Materialien gelten z.B. ca. (1-10) χ 10 Einheiten täglich und bei Präparaten, die zu mehr als 1 % rein sind, bis zu beispielsweise 5 χ 10 Einheiten täglich.

Beispielsweise können für eine zweckmäßige Dosierungsform bei einem im wesentlichen homogenen, bakteriell produzierten erfindungsgemäßen IFN, bei parenteraler Verwendung 3 mg EqIFN-γ in 25 ml 5%igem tierischem Serum Albumin vorzugsweise Pferde/Hunde Serum Albumin gelöst werden. Diese Lösung wird dann durch ein bakteriologisches Filter gegeben und die gefilterte Lösung aseptisch auf 100 Fläschchen verteilt, von dem jedes 6 χ 10 Einheiten reines IFN zur parenteralen Applikation geeignet, enthält. Die Gläschen werden vor Verwendung vorzugsweise in der Kälte (-20⁰C) aufbewahrt. Die erfindungsgemäßen Substanzen können in bekannter Weise formuliert werden, um pharmazeutisch verwendbare Mittel zu erhalten, wobei das erfindungsgemäße Polypeptid mit einer pharmazeutischen, akzeptablen Trägersubstanz vermischt wird. Gebräuchliche Trägecstoffe und ihre Formulierung sind bei E.W. Martin in Remington's Pharmaceutical Sciences beschrieben, worauf ausdrücklich Bezug genommen wird. Die erfindungsgemäßen Interferone werden mit einer angemessenen Menge des Trägerstoffes vermischt, um geeignete pharmazeutische Mittel zu schaffen, die für eine effektive Anwendung beim Empfänger (Patienten) geeignet, sind. Bevorzugt wird eine parenterale Applikation vorgenommen.

Die vorliegende Erfindung betrifft weiterhin monoklonale Antikörper gegen die erfindungsgemäßen Polypeptide, Hybridomazellen, die solche Antikörper produzieren und Verfahren zu ihrer Herstellung. Bevorzugt sind Hybridomazellinien und die von diesen ausgeschiedenen monoklonalen Antikörper, die spezifisch mit EqlFN-gamma reagieren. Das Verfahren zur Herstellung von solchen monoklonaler Antikörpern ist dadurch gekennzeichnet, daß man Kleinsäugetiere, beispielsweise Kaninchen oder Mäuse mit den erfindungsgemäßen Polypeptiden immunisiert, B-Lymphozyten derart immunisierter Tiere mit Myelomazellen fusioniert, die

gebildeten Hybridomazellen kloniert, dann in vitro oder durch Injektion in Mäusen kultiviert und aus den Kulturen Antikörper isoliert.

Pie Erfindung betrifft ferner Immuno-Affinitätschromatographie-Säulen und Test-Kits für Immuncassays, die diese Antikörper enthalten.

Nach dem erfindungsgemäßen Verfahren werden Mäuse, z.B. Balb/c-Mäuse, auf an sich bekannte Weise immunisiert. In einer bevorzugten Ausführungsform werden die erfindungsgemäßen Polypeptide etwa wöchentlich oder auch in größeren Abständen während mehreren Wochen, beispielsweise bis 12 Wochen, injiziert, bis sich eine genügende Zahl Antikörper-produzierender B-Lymphozyten gebildet hat.

B-Lymphozyten enthaltende Organe, z. B. Milz.sellen, der immunisierten Mäuse werden entnommen und mit solchen Myelomazellen fusioniert, die aufgrund einer Mutation in einem selektiven Kulturmedium nicht wachsen. Solche Myelomazellen sind bekannt und sind beispielsweise jene mit der Bezeichnung X63-Ag8, X63-Ag8.6.5.3, MPC-Il, NSl-Ag4/l, MOPC-21 NS/1 oder SP 2/0. In einer bevorzugten Ausführungsiorm werden Milzzellen immunisierter Mäuse mit Myelomazellen der Zeil-Linie X63-Ag8.6.5.3 fusioniert. Die Fusion wird nach an sich belcannten Verfahren durch Mischen der B-Lymphczyten und der Myelomazellen unter Zugabe eines Zellfusionsagens, wie ^olyethylenglykol, Sendai-Virus, Calciumchlorid oder Lysolecithin durchgeführt. Vorzugsweise wird in Gegenwart von Polyethylenglykol, beispielsweise mit einem Molekulargewicht zwischen 1000 und 4000, fusioniert. Nach der Fusion werden die entstandenen Hybride nach einem an sich, bekannten Verfahren in einem selektiven Kulturmedium, das mit Hypoxanthin, Aminopteri ι und

Thymidin (HAT-Medium) komplementiert ist, kultiviert. Nicht fusionierte Myalomazellen können in diesem Medium nicht wachsen und sterben ebenso wie normale Lymphozyten.

Die überstände der Hybridoma-Kulturen können mit an sich bekannten Verfahren auf ihren Gehalt an spezifischen Antikörpern geprüft werden, beispielsweise mit Radio-Immunoassay oder Agglutinierung. Die Hybridomazellen, die Antikörper der gewünschten Spezifität produzieren, werden aus dem aus der Fusionierung hervorgegangenen Gemisch verschiedenster Hybridomazellen durch Klonieren herausselektioniert. Dazu werden nach einem an ßich bekannten Verfahren, das "limiting dilution" genannt wird, vuituren ausgehend von einer einsigen wachsenden Zelle angesetzt.

Zur Massenproduktion werden die Hybridoma-Zellklone, die Antikörper der gewünschten Spezifität produzieren, entweder in an sich bekannten Medien in vitro kultiviert oder zur Vermehrung in Mäuse injiziert. In einer bevorzugten Ausführungsform werden Hybridomazellen in mit Pristan vorbehandelte Mäuse injiziert, Aszites-Flüssigkeit entnommen und daraus durch Fällung mit Ammoniumsulfat-Lösung Antikörper isoliert.

Die mit Hilfe dieser Hybridomazellen gewonnenen spezifischen Antikörper können auf an sich bekannte Weise für die Herstellung von Immuno-Affinitätschromatographie-Säulen verwendet werden. In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird ein geeignetes Trägermaterial (suspendiert in einer Pufferlösung) mit einer Antikörper-Lösung versetzt, ungebundene Anteile werden anschließend ausgewaschen und unbesetzte Stellen des Trägermaterials blockiert.

Die Antikörper können auch in der Therapie verwendet werden.

Die mit Hilfe der Hybridomazellen gewonnenen spezifischen Antikörper können auf an sich bekannte Weise für die Herstellung von Test-Kits verwendet werden. Diese Test-Kits können auf verschiedenen Methoden beruhen, beispielsweise auf Radio-Immuno-Assay, Latex-Agglutinierung, Tüpfel-Tests, Kompetitive oder Sandwich-Radio-Immunoassay, Enzym-Immunoassay, Immuno-Fluoreszenz oder immunochemischen Enzym-Tests.

IOC,

35

Gegenstand der Erfindung im einzelnen sind: Polypeptide in im wesentlichen reiner Form

- mit den biologischen und immunologischen Eigenschaften von Pf erde-Interf sron-^amma (EqlPN-pamma) ;

- im wesentlichen frei von anderen Proteinen tierischer Herkunft ;

- frei von nativer Glykosylie rung;

- die Aminosäure Methionin vor der 1. Aminosäure des N-Terminus aufweisend;

- ein leader-I-eptid enthaltend;

- die Aminosäuresequenz

15 10 15

Tyr Tyr Cys Gin Ala AIa Phe Phe Lys GIu lie GIu Asn Leu Lys

20 25 30

GIu Tyr Phe Asn AIa Arg Asn Pro Asp VaI GIy Asp GIy GIy Pro

35 40 45

Leu Phe Leu Asp He Leu Lys Asn Trp Lys GIu Asp Ser Asp Lys

50 55 60

Lys lie lie Gin Ser Gin lie VaI Ser Phe Tyr Phe Lys Leu Phe

65 70 75

GIu Asn Leu Lys Asp Asn Gin VaI He GIn Lys Ser Met Asp Thr

80 85 90

lie Lys GIu Asp Leu Phe Val Lys Phe Phe Asn Ser SPr Thr Ser

95 100 105

Lys Leu GIu Asp Phe GIn Lys Leu lie Gin Me Pro VaI Asn Asp

110 U5 120

Leu Lys VaI GIn Arg Lys Ala He Ser GIu Leu He Lys VaI Met

125 130 135

Asn Asp Leu Ser Pro Lys AIa Asn Leu Arg Lys Arg Lys Arg Ser

140 145

GIn Asn fro Phe Arg GIy Ar«j Arg AIa Leu GIn "··

36

oder

Gin Ala Ala Phe Phe Lys GIu lie GIu Asn Leu Lys GIu Tyr Phe Asn Ala Arg Asn Pro Asp VeI GIy Asp GIy 61y Pro Leu Phe Leu Asp He Leu Lys Asn Trp Lys GIu Asp Ser Asp Lys Lys lie He Gin Ser Gin He VaI Ser Phe Tyr Phe Lys Leu Phe GIu Asn Leu Lys Asp Asn Gin VaI lie Gin Lys Ser Met Asp Thr

lie Lys GIu Asp Leu Phe VaI Lys Phe Phe Asn Ser Ser Thr Ser

Lys Ltu 61u Asp Phe Gin Lys Leu He Gin lie Pro VaI Asn Asp Leu Lys VdI Gin Arg Lys Ala He Ser GIu Leu He Lys VaI Met Asn Asp Leu Ser Pro Lys Ala Asn Leu Arg Lys Arg Lys Arg Ser GIn Asn Pro Phe Arg GIy Arg Arg AId Leu GIn ***

enthaltend .

DHA-MoIeRiIe, codierend:

- für ein Polypeptid mit den biologischen und immunologischen Eigenschaften des EqIPN-gamma;

- für ein Polypeptid wie oben angegeben;

- für reifes En.IPM-gamma. DtfA-tfoleküle.

- das vollständige, natürliche Gen für EalPN -die Ku'Kleotide

_?7

ATG AAT TAT ACA AGT TTT ATC TTG GCT TTT CAG CTG TGT GCG ATT TTG GGT TCT TCT ACC TAT TAC TGC CAG GCC GCG TTT TTT AAA GAA

1 NTRON 1

ata gaa aac cta aag gaa tat ttt gtaagtatgaccttttaataatacttac ttgtggttgaaatgactgaacgttgtcttggagttggatctctgataggctgtcctctct actccacagtcatcttgagaagactgggtgttattttctctgtttgttgactggatgagt ttttcttttttttactaaatgatctagatattgctttaaccctctgctcaatttgctata gagacttagagagggttcatgaatcttccaaaagatgggcttaacaggtttataaagcat agtgaagttgacaattttgtggtgagaagccactgaattgtgataagtcaagtagtgtgg acattgaaaaaatgactagctattagtttctaacttctcaggttactatgatggtgacaa taaaaggtcaagattagcattaaaatggtaatctgaaataattgatcagttaaagaaggc gctgtcctgaaaggtttcsgctgaaaaaaaatcactttcaggtgttttcctccaaaaaatg attttaaaatcttactgccccgtttgtgttagctgtgaagtactctggaactcagtcaat tgctgagattttgtacgagttataagctggcttatatttaaaaäatttttttgtttttgt tttatgagtttcttttaaaatgttatttatggttaattaaaatagtttttgcattttaaa tattttattatttgtccaaaatttagctattttaattatagttggagctctcttttagag

ctgacataagaccatagcjggaggcacagatagatgtgatggagccctgtaccagacgggg gcagtatcttatagtgggttgcctttgctgatctttttactagacttgaaattatttgct tttccttcctatggttatttgggactattgaagtatcaccagccctgttgagttcatctg taatattgtaattcaagggttacactagaaaataagaaagctaaaacagcacgataatct ttggctacatcjaacacaatagcttttgggaatacttattgttagaactaaacagagggt tgaaaagaaaatcagtgaatactgtcagcatctgagttcaataaaacgtgaagtacattt

ttagggcaattcatggactaattgtaaaccaagttttccttcctttttcag aac gca aga aac cca gat gta ggg gat ggt ggg cct ctt ttc ctg gat atc

1 NTRON 2-

TTG AAG AAC TGG AAA GAG GTAAGCTAAGTATTTCCATTTGGTTGATTTTCCTGT

ZdVfOC,

TTC AAA CTC TTT GAA AAC TTG AAA GAT AAC CAG GTC ATT CAA AAG

AGC ATG GAC ACC ATC AAG GAG GAC CTG TTC GTT AAG TTC TTT AAC

AGC AGC ACC AGC AAG CTG GAA GAC TTC CAA AAG CTG ATT CAG ATT

_ TNTRON "\ - _ _ _ _

CCG GTGAGGAGATCTTAATTCTTTCTTTGGTTTCATTACAGAGGTTCTTGCAAAGTGCt TACGTCCCAGAAAGTAGAAATGAACTATGAAATOAACCCGTGGCCAAAACTCCTCCTTCc TAATTCCATTTGTGCTTTGAGAGACTTTGCTAAGTCAGTATGGGAATCATTTAAATTTGt GATTTGGGGAAATGCTGGCACf ATGACTACTGCACAAAGGCAGGTGAAGGGACAAATCCA GTGAGGAGGOGGCAGTGAAGAAGTGGAGGGGAGTCTGGAGAAGCAGGTCTCTCCTTGCCc

CTTGTTCGTGAGATGAAATCCTCCTGCTTTGGATGGGAGGCTGCGTGTCTTGGTGGAAAg AGCAGTGGGAGGAGGGAGAAGATTTGTGCfCCTCCCAGCTCAGCCACCAAGAAACTGTGA CCTCAGATGAATCACAGGCCTGGCTGGGGCTCAGTTTCCTCATCTTAAAAGAGGCCTATt GGGTTCACTAAAATTTCTATGATCTTCTTTGCTCTATAATCCTACAATTCTGTGGACAGa AAATGAAATGAGGTAGGAGAAAGAAATAGCCTTTGAAGAGGTTCTTGGGCATTCCACTGc CAGGCTCTGGTCAACCTTCATACTCTGCAGCCCAAGAAG^GGCAAGACCATTTGTCTGTT TTTGGAAATGCAAATAGGCGGCATTTATACCTCACGAAAGAACTGTTCTGTCAACTTTTg GATACTGGGCTATCTTGGCTGGAGAAATCCTTAGGCTCCCAAACTTTCTCTCATGAAATt GTCTTGAGTCTTTAAATTTATGGCTTCTCGAAGCTGAGAGATAACTTTAAGCATAAAGAc AAATTACATTTTCCAACATTTTGTCTAAGAGACAAAGACCTCCACATGCCTTTGGGTTTg GCCTGGATCTAAATGGGCTTGAATGAGAAGGGGAGGGTGTTGTTATGACTATGTTTAGAa GAGAAAACAGAGGTTTGGAGAGGTTAAGTGGCTGGTTCAAAGTCAGAGTTATTGCACACa CAGGATTCGAACCCATATGTTTTGTCCCTCCACTTTAGGGTTCT7TTCGCTACATAATTT TGAGAATTCTGTACCAGTCAATTTAAGGATGTGTGATGTTCCCCATCCTATTACAGCACa ACCAGCAATTTAATTATAATTTTAGTCTTAACTGCTGAAGAAAGCAGCATTACATATTAa GCTAACATATTCCTGGTGAAAGCAACTTTTTCAAAGGAATATTTCTATTTTCATGGACCa TGACAGTAGCACAGCCTGATGGCTTGTATGCCTGAAACTAATTTTGCTGTTTTCTTTCCc

AATAG GTA AAT GAT CTG AAG GTC CAG CGC AAA GCA ATA AGT GAA CTC ATC AAA GTG ATG AAT GAT CTG TCG CCC AAA GCT AAC CTG AGG AAG CGG AAG AGG AGT CAG AAT CCA TTT CGA GGC CGG AGA GCG TTG CAA

TAG

oder

TAT TAC TGC CAG GCC GCG TTT TTT AAA GAA 1 NTRON 1

ata gaa aac cta aag gaa tat ttt gtaagtatgaccttttaataata3ttac ttgtggttgaaatgactgaacgttgtcttggagttggatctctgataggctgtcctctct actccacagtcatcttgagaagactgggtgttattttctctgtttgttgactggatgagt ttttcttttttttactaaatgatctagatattgctttaaccctctgctcaatttgctata gagacttagagagggttcatgaatcttccaaaagatgggcttaacaggtttataaagcat AGTGAAGTTGACAATTTTorGGTGAGAAGCCACTGAATTGTGATAAGTCAAGTAGTGTGG acattgaaaaaatgactagctattagtttctaacttctcaggttactatgatggtgacaa taaaaggtcaagattagcattaaaatggtaatctgaaataattgatcagttaaagaaggc gctgtcctgaaaggtttggctgaaaaaaaatcactttcaggtgttttcctccaaaaaatg attttaaaatcttactgccccgtttgtgttagctgtgaagtactctggaactcagtcaat tgctgagattttgtacgagttataagctggcttatatttaaaaaatttttttgtttttgt tttatgagtttcttttaaaatgttatttatggttaattaaaatagtttttgcattttaaa tattttattatttgtccaaaatttagctattttaattatagttggagctctcttttagag ctgacataagaccataggggaggcacagatagatgtgatggagccctgtaccagacgggg gcagtatcttatagtgggttgcctttgctgatctttttactagacttgaaattatttgct tttccttcctatggttatttgggactattgaagtatcaccagccctgttgagttcatctg taatattgtaattcaagggttacactagaaaataagaaagctaaaacagcacgataatct ttggctacatccaacacaatagcttttgggaatacttattgttagaactaaacagagggt tgaaaagaaaatcagtgaatactgtcagcatctgagttcaataaaacgtgaagtacattt

1 NTRON 2-

TTG AAG AAC TGG AAA GAG GTAAGCTAAGTATTTCCATTTGGTTGATTTTCCTGT

AGC AGC ACC AGC AAG CTG GAA GAC TTC CAA AAG CTG ATT CAG ATT

1 NTRON 3 .

CCG GTGAGGAGATCTTAATTCTTTCTTTGGTTTCATTACAGAGGTTCTTGCAAAGTGCT TACGTCCCAGAAAGTAGAAATGAACTATGAAATGAACCCGTGGCCAAAACTCCTCCTTCC TAATTCCATTTGTGCTTTGAGAGACTTTGCTAAGTCAGTATGGGAATCATTTAAATTTGT GATTTGGGGAAATGCTGGCACTATGACTACTGCACAAAGGCAGGTGAAGGGACAAATCCA GTGAGGAGGGGGCAGTGAAGAAGTGGAGGGGAGTCTGGAGAAGCAGGTCTCTCCTTGCCC CTTGTTCGTGAGATGAAATCCTCCTGCTTTGGATGGGAGGCTGCGTGTCTTGGTGGAAAG SGCAGTGGGAGGAGGGAGAAGATTTGTGCTCCTCCCAGCTCAGCCACCAAGAAACTGTGA CCTCAGATGAATCACAGGCCTGGCTGGGGCTCAGTTTCCTCATCTTAAAAGAGGCCTATT GGGTTCACTAAAATTTCTATGATCTTCTTTGCTCTATAATCCTACAATTCTGTGGACAGA AAATGAAATGAGGTAGGAGAAAGAAATAGCCTTTGAAGAGGTTCTTGGGCATTCCACTGC CAGGCTCTGGTCAACCTTCATACTCTGCAGCCCAAGAAGAGGCAAGACCATTTGTCTGTT TTTGGAAATGCAAATAGGCGGCATTTATACCTCACGAAAGAACTGTTCTGTCAACTTTTG GATACTGGGCTATCTTGGCTGGAGAAATCCTTAGGCTCCCAAACTTTCTCTCATGAAATT GTCTTGAGTCTTTAAATTTATGGCTTCTCGAAGCTGAGAGATAACTTTAAGCATAAAGAC AAATTACATTTTCCAACATTTTGTCTAAGAGACAAAGACCTCCACATGCCTTTGGGTTTG GCCTGGATCTAAATGGGCTTGAATGAGAAGGGGAGGGTGTTGTTATGACTATGTTTAGAA GAGAAAACAGAGGTTTGGAGAGGTTAAGTGGCTGGTTCAAAGTCAGAGTTATTGCACACA CAGGATTCGAACCCATATGTTTTGTCCCTCCACTTTAGGGTTCTTTTCGCTACATAATTT TGAGAATTCTGTACCAGTCAATTTAAGGATGTGTGATGTTCCCCATCCTATTACAGCACA ACCAGCAATTTAATTATAATTTTAOTCTTAACTGCTGAAGAAAGCAGCATTACATATTAA GCTAACATATTCCTGGTGAAAGCAACTTTTTCAAAGGAATATTTCTATTTTCATGGACCA TGACAGTAGCACAGCCTGATGGCTTGTATGCCTGAAACTAATTTTGCTGTTTTCTTTCCC

* * * TAG

oaer

15 10 15

TAT TAC T6C CAG GCC GCG TTT TTT AAA GAA ATA GAA AAC CTA AAG

20 25 30

GAA TAT TTT AAC GCA AGA AAC CCA GAT GTA GGG GAT GGT GGG CCT

35 40 45

CTT TTC CTG GAT ATC TTG AA6 AAC T6G AAA GAG GAT AGT GAC AAA

50 55 60

AAA ATA ATT CAG AGC CAA ATC GTC TCC TTC TAC TTC AAA CTC TTT

65 70 75

GAA AAC TTG AAA GAT AAC CA6 GTC ATT CAA AAG AGC AT6 6AC ACC

80 85 90

ATC AAG 6AG GAC CTG TTC GTT AAG TTC TTT AAC AGC AGC ACC AGC

95 100 105

AAG CTG GAA GAC TTC CAA AAG CTG ATT CAG ATT CCG 6TA AAT GAT

110 115 120

CTG AAG GTC CAG CGC AAA GCA ATA AGT GAA CTC ATC AAA GTG ATG

1?5 130 135

AAT GAT CTG TCG CCC AAA GCT AAC CTG AGG AAG CGG AAG AGG AGT

140 145

CAG AAT CCA TTT CGA GGC CGG AGA GCG TTG CAA TAG

oaer

-11 5 10

ATG TAC TAC TGC CAG GCT GCT TTC TTT AAA GAA ATC GAA AAC CTG AAA

20 25 30

GAA TAC TTC AAC GCT CGT AAC CCA GAC GTT GGT ÜAC GGT GGT CCG

35 40 45

CTG TTC CTe. GAC ATC CTG AAA AAC TGG AAA GAA GAC TCT GAC AAA

50 55 60

AAG ATC ATC CAG TCT CAG ATC GTT TCT TTC TAC TTC AAA CTG TTC

65 70 75

GAA AAC CTG AAA GAC AAC CAG GTT ATC CAG AAA TCG ATG GAC ACT

80, 85 90

ATC AAA GAA GAT CTG TTC GTT AAA TTC TTC AAC TCG TCG ACT TCT

95 100 105

AAA CTG GAA GAC TTC CAG AAA CTG ATC CAG ATC CCA GTT AAC GAC

110 115 120

CTG AAA GTT CAG CGT AAG GCT ATC TCT GAA CTG ATC AAA GTT ATG

125 130 135

AAC GAC CTG ^TCT CCA AAA GCT AAC CTG CGT AAA CGT AAA CST TCT

140 145

CAG AAC CCm TTC CGT GGT CGT CGT GCT CTT CAG ΓΑΑ

42 ZGV IOC

oder

-11 5 10 ATG CAG GCT GCT TTC TTT AAA GAA ATC GAA AAC CTG AAA GAA TAC TTC

20 25 30

AAC GCT CGT AAC CCA GAC GTT GGT GAC GGT GGT CCG CTG TTC CTG

35 40 45

GAC ATC CTG AAA AAC TG6 AAA GAA 6AC TCT GAC AAA AAG ATC ATC

50 55 60

CAG TCT CAG ATC 6ΤΓ TCT TTC TAC TTC AAA CTG TTC GAA AAC CTG

65 70 75

AAA GAC AAC CAG GTT ATC CAG AAA TCG ATG GAC ACT ATC AAA GAA

80 85 90

GAT CTG TTC GTt AAA TTC TTC AAC TCG TCG ACT TCT AAA CTG GAA

95 100 105

GAC TTC CAG AAA CTG ATC CAG ATC CCA GTT AAC GAC .CTG AAA GTT

110 115 120

CAG CGT AAG GCT ATC TCT GAA CTG ATC AAA GTT ATG AAC GAC CTG

125 130 135

TCT CCA AAA GCT AAC CTG CGT AAA CGT AAA CGT TCT CAG AAC CCA

140 143

TTC CGT GGT CGT CGT GCT CTT CAG. TAA

gegebenenfalls zusätzlich die Leader-Sequenz

ATG AAT TAT ACA A6T ITT ATC TTG GCT TTT CAG CTG TGT 6CG A^TT TTG GGT TCT TCT ACC

oder ATG enthaltend,

- aie mit einem eier obengenannten DNA-Moleküle unter Bedingungen, die eine Homologie größer als 85 %, vorzugsweise großer als 90$ erkennen lassen, hybridisieren, wobei diete DNA-MoleIdle natürlichen, synthetischen oder halbsynthetischen Ursprungs sein können und mit diesen DNA-M öle kü len durch Mutation, Kukleotid-Substitutionen, Nukleotid-leletionen, Nukleotid-Insertionen und Inversionen von Mukleotiden verwandt sein können und für Polypeptide mit der biologischen und immunologischen Aktivität von EqlFH-gamma codieren.

DNA-MoIeMiIe: die Nukleotide

EG-I 5'-TACTACTGCc AGGCTGCTTT CTTTAAAGAA ATCGAAAACC ^t6AAAGAATA CTTCAACGCT CG-3'

oaer

EG-2 S'-TTGAAGTATT CTTTCAGGTT TTCGATTTCT TTAAAGAAAG CAGCCTGGCA GTAGTA-3'

oder

EG-3 S'-TAACCCAGAC GTTGGTGAC6 6TGGTCC6CT GTTCCTGGAC ATCCTGAAAA ACTGGAAAGA AGACTCTG-S¹

oder

EG-4 5'-TTCnTCCAG ΓΓΤΤΚΑ66Α TGTCCAGGAA CAGC66ACCA CCGTCACCAA CGTCTGGGn ACGAGCG-3'

oaer

EG-5 δ'-ACAAAAAGAT CATCCAGTCT CAGATCGTTT CTTTCTACTT CAAACTGTTC GAAAACCTGA AAGACAACC-3'

oder

EG-6 δ'-ΤΤΤΰΑαβΤΤΤ TCGAACAGTT TGAAGTAGAA A6AAACGATC TGAGACTGGA TGATCTTTTT GTCAGAGTC-3'

oaer

EG-7 S'-AGGTTAir.CA GAAATCGATG GACACTATCA AAGMGATCT GTTCGTTAAA TTCTTCAACl CG-3'

oaer

EG-8 5'-TCSACGAGTf GAAGAATTTA ACGAACAGAT CTTCHTGAT AGTGTCCATC GATTTCTG6A TAACCT6ÜTT GTC-3¹

oaer

EG-9 5'-TCGACTTCTa AACTGGAAGA CTTCCAGAAA CTGATCCAGA TCCCAGTTAA CGACCTGAAA-S'

oder

£G-10 5'-GCTGAACTTT CAG6TCGTTA ACTG6GATCT GGATCAGTTT CTGGAAGTCT TCCAGTTTA6 AAG-3'

oder

EG-11 5'-GTTCAGCGTA AGCCTATCTC TGAACTGATC AAAGTTATGA ACGACCTGTC TCCAAAAGCT AA-3'

oder

EG-12 5'-CGCAGGTTAg CTTTTGGAGA CAGGTCGTTC ATAACTTTGA TCAGTTCAGA GATAGCCTTA C-3'

45

oder

EG-13 S'-CCTGCGTAAA CGTAAACGTT CTCAGAACCC ATTCCGTGGT CGTCGTGCTC TTCAGTAAG-3'

oaer

EG-14 S'-GATCCTTACT GAAGAGC/CG ACGACCACGG AATG6GTTCT 6AGAACGTTT ACGTTTA-3'

oder

EG-15 5'-CAGGCTGCn TCTTTAAA6A AATCGAAAAC CTGAAAGAAT ACTTCAACGC TCG-3¹

oaer

EG-Ni 5'-TT6AAGTATT CTTTCAGGTT TTCGATTTCT TTAAAGAAAG CAGCCTG-3'

enthaltend, codierend fir Teilbereiche des EqIFN-gamma und die von diesen DNA-Moleteilen codierten Polypeotide;

- die mit einem der obengenannten DNA-Moleküle unter Bedingungen, die eine Homologie größer als 85 #, vorzugsweise größer als 90$ erkennen lassen, hybridisieren, wobei diese DNA -Holekule na+urlichen, synthetischen oder halbsynthetischen Ursürungs sein können und mit diesen DNA-Molekü len durch Mutation, Nukleotid-Substitutionen, Nukleotid-Eeletionen, Nukleotid-Insertionen und Inversionen von Nukleotiden verwandt sein können und die fir Teilbereiche des EqlFM-gamma codieren, sowie die von diesen DNA-4¹IoIeIcJ. len codierten Polypeptide.

Rekombinante DNA-Mole Kille, beisOielsweise Vektoren, vorzugsweise Plasmide, die:

- ein fur ein obenerwähntes Polypeptid codierendes Insert;

- ein obenerwähntes DNA-Molekül;

- ein obenerwähntes DMA-Molekül in funktioneller Verbindung mit einer Expressionskontrollsequenz enthalten, in Mikroorganismen, wie Prokaryoten, beispielsweise E.coli, Eukaryoten, beispielsweise Saccharomyces cerevi3iae und Siugetierzellen, beisioielsweise Pferdezellen replizierbar;

mindestens zwei der als EG-i bis EG-I6 bezeichneten DNA-MolekUle in beliebiger Kombination miteinander verknüpft in funktioneller Verbindung mit einer Expressionskontrollsequenz enthalten, in Mikroorganismen, wie Prokaryoten, beispielsweise E.coli, Eukaryoten, beispielsweise Saccharomyces cerevisiae und Siugetierzellen, beispielsweise Pferdezellen replizierbar.

Rekombinante DNA-M öle kü. Ie , wie die Plasmide pAH111, pRH281/5, pRH282/5. pGiM, pöN3, pON2O, pEq.G-QAA2 oder pEq.G~QAA3.

V/irtsorganismen, mit einem der obenerwähnten rekombinanten DMA-Moleküle transformiert, beispielsweise ProKaryoten, vorzugsweise E.coli, insbesondere E.coli JM101 oder HB101, Eukaryoten, beispielsweise Saccharomyces cerevisiae oder Säugetierzellinien, vorzugsweise Pferdezellinien.

Verfahren zur Herstellung erfindungsgemäßer Polyoeotide, wobei

a) geeignete Wirtsorganismen, beispielsweise die obenerwähnten, mit genetischen Informationen, codierend flir die erfindungsgemäßen Polypeptide, vorzugsweise mit aen obenerwähnten rekombinanten DNA-Molekulen transformiert,

b) die Information zur Produktion der erfindungsgemäßen Folypeütide im V/irtsOrganismus exnrimiert unci

47 IGV ?0G

c) die erfindungsgemäßen Polypeptide isoliert werden. Polypeptide, die nach diesen Verfahren herstellbar sind.

Verwendung der erfindungsgertuißen Polypeptide zur therapeutischen Behandlung und/oder zur Immunisierung oder zur Herstellung pharmazeutischer Präparate.

Mittel für die therapeutische Behandlung, beispielsweise von / Pferden, dadurch gekennzeichnet, daß es neben pharmazeutisch inerten Trägerstoffen eine wirksame Menge eines der erfindungsgemäßen FolyOeptide enthält.

Verfahren zur Hi-rstellung von monolilonalen Antikörpern gegen die erfindungsgemäßen Polypeptide, dadurch gekennzeichnet, daß Wirtstiere mit «>inem der Polypeptide immunisiert, B-Lymphozyten dieser Wirtstiere mit Myelomzellen fusioniert, die die monoklonalen Antikörper ausscheidenden Hybrid-Zellinien subkloniert und ijn vitro oder in. vivo kultiviert werden.

Hybrid-Zellinien, die monoklonale Antikörper gegen eines der erfindungsgemäöen Polypeptide sezernioren.

Monoklonale Antikörper die spezifisch die Wirkung der erfindungsgemäßen Polypeptide ganz oder teilweise neutralisieren oder spezifisch an eines der besagten Polypeptide binden.

Verwendung der monoklonalen Antikörper zur Therapie und/oder zur qualitativen und/oder quantitativen Bestimmung eines der erfindunysgemäßen Polypeptide.

ZC

Verwendung der obengenannten monoklonalen Antikörper zur Reinigung einen der erfindungsgemäßen Polypeptide.

Test Kit zur Bestimmung erfindungsgemäßer Polypeptide, obengenannte monoklonale Antikörper enthaltend.

Legende zu den Figuren:

Figur 1: DNA-Sequenz des 4664 bp langen BamHI-Fragments aus Lambda Eq-y2. Die codierte Aminosäuresequenz und die Lage der Introns ist angegeben. Negativ numerierte Aminosäuren zeigen das hydrophobe signalpeptid an. Die einzige potentielle N-Glykosylierungsstelle des reifen EqIFN-γ an Position 86-88 ist unterstrichen. Die für die Bindung der RNA-Polymerase wichtigen Sequenzen CCATC und TATAAAA sind unterstrichen, ebenso zwei Signalsequenzen für die Polyadenylierung der mRNA (AATAAA).

Figur 2: Vergleich der Aminosäuresequenzen vor.

gamma-Interferonen verschiedener Spezies. Die mit vorangestelltem "S" numerierten Aminosäuren geben das Signalpeptid an. Die "Consensus"-Sequenz zeigt in Großbuchstaben jene Aminosäuren, die in allen gamma-Interferonen identisch, in Kleinbuchstaben die Aminosäuren, die in mehr als 75% der gamma-Int.erferone vorkommen.

Figur 3: Schematiache Darstellung der für dio Totalsynthese des Pferde gamma-Interferon Gens verwendeten Oligonukleotide. Die Länge der einzelnen Oligonukleotide, sowie deren Numerierung ist angegeben.

Restriktionsschnittstellen, die innerhalb des synthetischen Gens nur ein einziges Mal auftreten, sind numeriert.

?OC

Figur 4: Vergleich der codierenden Sequenzen für reifes EqIFN-γ des natürlichen Gene (eq) und des synthetischen (syn), für die Expression in E.coli optimierten Gens. Sich unterscheidende Basen sind mit einem stern markiert.

Figur 5: Tabelle für die verwendeten Codone für reifes EqIFN-γ. Am linken Rand ist die erste Base, in der Mitte die zweite Base und am rechten Rand die dritte Base des Codone angegeben. Die Tabelle zeigt die Anzahl der verwendeten Codons für die jeweilige Aminosäure im natürlichen Gen, sowie ii> Klammern die des synthetischen Gens.

Figur 6: Konstruktion des Expressionsplasmides pRHIOO. Figur 7: Konstruktion und Restriktionskarte des pGN20.

Die folgenden B θ iy ρ ^Is₁? die die Erfiudung nicht elrtgronaon sollen, beschreiben die Er f indium, im Detail).

Materialien

Die Ausganggmatorialien wurden teilweies käuflich erworben, teilweise stammten sie vom BMBL in Heidelberg, E.GoIi JMlOl, pU09 und M13mp8 stammten von den Bethesda Research Laboratories, die E«ooli Stämme mit dem Suppreasorfaktor sup F, beispielsweise lä.coli NM526, 538 und 539 und der Vektor lambda~EMBL3 oder 3A stammten vom BMBL und sind auch bei der Firma Stehelin/Basel (Schweiz) erhältlich»

1, Isolierung von Pferde-DNA

Gefrorenes Gewebe, z. B. Pferdeleber wurde in flüssigem Stickstoff zu feinem Pulver zermahlen und in 0,5M EDTA, 10 mM TrIa-HOl pH 8,0, 0,5 % SDS, 0,1 mg/ml Proteinase K (20 ml/g Gewebe) 3 Stunden bei 55 ⁰O inkubiert. Die erhaltene, viskose Lösung wurde duroh eine Phenolextraktion und 3~malige Extraktion mit Phenol/Ohloroform/ Isoamylalkohol (25/24/1 VoI) von Protein befreit, gegen 50 mM Tris-HOl pH 8,0, 1OmM EDTA, 1OmM NaOl dialyalert und die DNA mit 2 Volumina Äthanol ausgefällt» Nach vollständiger Trocknung im Vakuum wurde dlο DNA in TB-Puffer (10 mM Tris-HOl pH 8,0, 1mM EDTA) bei 4 ⁰O in Lösung gebracht und mit 1,273 g OaOl/ml Lösung 62 Stunden mit 40,000 UpM bei 20 ⁰O zentrifugiert (Sorvall 50Ti-Rotor)· Der OsGl-Gradient wurde ausgetroyft, die DNA enthaltenden Fraktionen gegen TE~Puffer dialysiert und die DNA anschließend mit 2 Volumina Äthanol gefällt, mit 70%igem Äthanol gewaschen,göfcrooknet und wieder in TE-Puffer gelöst (4 ⁰O),

Das fertige DNA-Präparat war frei von RNA und länger als

52

50 kb (durch Elektrophorese an einem 0,45%igem Agaroseyal bestimmt),.

Partielle Endonukleaso Verdauung unr* Gro'ßenf raktionierunq von Pferde-DNA

Zweimal 50ug Pferde-DNA wurden mit 1,6 Einheiten Sau3A in 450μ1 Reaktionsmedium (10 mM Tris-HCl pH 7,5, 10 mM MgCl, ImM Dithiothreitol) bei 37°C inkubiert. Nach 15, 25 und 40 Minuten wurden 150 μΐ Aliquote entnommen und mit 15mM EDTA versetzt. Durch lOminütiges Erwärmen auf 70°C wurde die Reaktion gestoppt. Nach Zusatz von 0,3M NaAcetat pH6,0 wurde die DNA mit 2,5 Volumina Äthanol gefällt. Nach dem Wiederauflösen in TE-Puffer wurde die DNA auf einem 0,45%igen Agarosegel in TBE-Puffer (10,8g/l Tris, 5,5g/l Borsäure, 0,93g/l Na EDTA) bei ca. 1 V/cm über Nacht elektrophoretisch der Größe nach getrennt. Anhand von Größenmarkern (mit EcoRI und Hindlll doppelverdaute und mit Hindin verdaute Lambda-DNA) wurde das Gelstück mit DNA einer Länge von 10-23kb herausgeschnitten, die DNA aus dem Gel in ei:aen Dialysenschlauch 3 Stunden bei 300V elektroeluiert (Puffer 0,1 χ TBE), auf einer Elutip-D-Säule (Schleicher und Schüll) gemäß der Verwendungsvorschrift gereinigt und anschließend mit Äthanol gafällt.

Um die Selbstligation von Pferde-DNA-Fragmenten zu verhindern, was einerseits zu artifiziellen Hybriden von Pferde-DNA-Sequenzen, andererseits zu zu großen und damit nicht mehr in Lambda-Phagen verpackbaren DNA-Stücken führen kann, wurden die größenfraktionierten Pferde-DNA-Stücke dephosphoryliert.

53

L-Hisu wurde die DNA in :;.·!0μ1 Reaktionsmedium (50 mM Tc-is-HCl pH 9,5, 1OmM MgCl,, 0,1 mM ZnAcetat, 1 mM Spermidin) tuit 5 Einheiten Bovine Intestinal Phosphates« 30 Minuten 37°C \nkubiert, weitere 5 Einheiten Enzym zugegeben und 30 Minuted inkubiert. Nach Zugabe von EDTA auf 25mM Endkop.v:entration wurde die DNA einmal mit Phenol/Chloroform/isoamylalkohol (25/24/1 VoI). 2-mal mit Chloroform/Isoamylalkohol (24/1 VoI) und 3-mal mit. Diäthyläther extrahiert mit Äthanol gefällt, getrocknet und in 0,1 χ TE-Puffer gelöst.

3. Aufbau der Pferdegenom-DNA-Bibliothek

Die dephosphorylierten 10-23kb Pferde-DNA-Fragmente wurden in einem Lambda-Vektor, beispielsweise Lavnbda-EMBL3 oder -3A (Frischauf, A.M. et al. J. Mol. Biol., 170, 827-842 (1983)) mit G-A-T-C kohäsiven Enden, durch Entfernung des internen BamHI-Fragmentes der Phagen-DNA gewonnen, geklont.

Der Vektor wurde in einem E.coli Stamm mit Suppreseorfaktor sup F, beispielsweise E.coli NM526, oder 539 (Frischauf, A.M. et al. J. Mol. Biol., 170, 827-842 (1983)), in LB-Brühe (Miller; Experiments in Molecular Genetics; Cold Spring Harbor Lab. Cold Spring Harbor, New York) mit 5mM MgSO₄ gezüchtet, mit Polyethylenglykol gefällt und durch 2-malige CsCl-Dichtegradientenzentrifugation (0,71 g CsCl/ml Lösung, 40 Stunden 45.000 UpM, 20⁰C) gereinigt. Nach Dialyse gegen TE-Puffer wurde die Phagen-DNA durch 2-malige Extraktion mit Phenol/Chloroform/Isoamyalkohol (25/24/1 VoI) und 2-malige Extraktion mit Chloroform/Isoamylalkohol (24/1 VoI) von Protein befreit und durch Äthanolfällung aufkonzentriert.

Zur Gewinnung döt Endfragmente von EMBL3A wurden Phagen-DNA 2 Stunden bei 37°c in 450μ1 Reaktionsmedium (10 mM Tris-HCl pH 7,5, 10 mM MgCl₂, 1 mM Dithiothreitol) vollständig mit BamHI verdaut, mit 15mM EI)TA 10 Minuten bei 70⁰C die Reaktion gestoppt und die DNA mit Äthanol gefällt.

Zur Vermeidung der Religation wurde das Mittelfragment mit EcoRI nachgeschnitten und das wegfallende Oligonukeotid mittels Isopropanolfällung entfernt.

Die BamHI-verdaute Lambda-DNA wurde hierzu 2 Stunden bei 37°C in 450μ1 1OrM Tris-HCl pH 7,5 100 mM NaCl, 10 mM MgCl mit EcoRI vollständig verdaut und die Reaktion durch Zusatz von 15mM EDTA und lOminütiges Erwärmen auf 70⁰C gestoppt. Nach Zusatz von NaAcetat zu einer Endkonzentration von 0,3M wurden die 3 großen DNA-Fragmente mit 0,6 Volumina Isopropanol 15 Minuten bei 0⁰C gefällt, 2-mal mit 0,45M NaAcef.at/0,6 Volumina Isopropanol und 1-mal mit 0,3M NaAcetat/2,5 Volumina Äthanol gewaschen und in 15μ1 Ο,ΐχ TE-Puffer gelöst. Die BamHI/EcoRI-Linker bleiben bei dieser Prozedur in Lösung. Die EMBL3A Fragmente (8ug) wurden mit ca. 5ug 10-23kb Pferde-DNA und 10 Einheiten T4-DNA-Ligase (NEN) vereinigt und über Nacht bei 14°C und einen Tag bei 4°C in 50μ1 Ligationsmedium (66mM Tris-HCl pH 7,2, O,1M NaCl, 1OmM MgCl₀, ImM EDTA_f 5mM Dithiothreitol, 0,5mM ATP) inkubiert. Das ligierte DNA-Gemisch wurde mittels eines in vitro-Lambda-Verpackungssystems (Scalenghe, F. et al; Chromosoma, 8.2, 205-216 (1981)) in reife Lambda-Phagenpartikel gepackt.

Die Komponenten dieses Systems, d.h. Ultraschallextrakt (SE), Gefrier-Auftau-Lysat (FTL), Puffer Ml und A wurden gemäß (Scalenghe, F. et al; Chromosoma, 8J_-, 205-216 (1981)) hergestellt. ΙΟμΙ Aliquote des ligierten DNA-Gemisches wurden 2 Minuten bei Raumtemperatur mit

25]a1 SE inkubiert, das ebenso wie FTL 30 Minuten aus Eis aufgetaut worden war, mit ΙΟΟμΙ FTL versetzt und 60 Minuten bei Raumtemperatur weiterinkubiert Das Packungsgemisch wurde mit 150μ1 Lambda-Diluent (100 mM Tris-HCl pH 7,5, lumM MgSO₄ ImM EDTA) verdünnt und bei 4³C gelagert.

Klonanq und Sequenzierung des Gens für Pferde qamma-Interferon (EgIFN-Y)

A. Isolierung eines vollständigen EqIFN-γ Gen Klons

Die equin- DNA-Bibliothek wurde zur Infektion des E.coli Stammes NM528 (supF) verwendet. Eine über Nacht in LB-Nährlösung (10 g/l Tirypton, 5 g/l Hefe Extrakt, 10 g/l NaCL, pH 7,4) mit 0,2% Maltose gewachsene Bakterienkultur wurde in 10 mM MgSO. auf eine optische Dichte (600 nm) von 2,0 eingestellt. Je 0,5 ml dieser Suspension wurden mit 50.000 pfu (plaquebildende Einheiten) Lambda-Phagen der DNA-Bibliothek infiziert und mit oiner LB-Weichagarschicht auf LB-Agar-Platten mit 10 mM MgSO. (13,5 cm Durchmesser) verteilt. Insgesamt wurden 1,5x10 rekombinante Lambda-Phagen gescreent. Nach Bebrüten über Nacht bei 37⁰C wurden von den Phagen jeder Platte zweifache Replikas auf Nitrozellulose hergestellt (Benton und Davis, Science 196:180-182, 1977). Nach Denaturieren der Phagen-DNA (1 min in 0,5 N NaOH, 1,5 M NaCl), Neutralisieren (2-mal 3 min in 0,5 M Tris-HCl pH 7,5, 1,5 M NaCl) und Spülen (1 min in 2xSSC, IxSSC, 0,15 M NaCl, 15 mM NaCitrat) wurden die Filter an der Luft getrocknet und die DNA durch 2-stündiges Backen bei 80⁰C fixiert. Die Filter wurden über Nacht bei 65⁰C in einer Lösung von 1,5 M NaCl, 10 mM Tris-Hcl pH 8,0, 0,1% SDS gewaschen und 4 bis 6 Stunden bei 65°C vorhybridisiert (Hybridisierlösung:

0,9 M NaCX, 50 mM NaH PO , pH 7,4, 5 mM EDTA, 0,1% Ficoll, 0,1% Polyvinylpyrrolidon, 0,1% Riuderserumalbumin, 0,1% SDS, 20 mg/ml beschallte und denatuierte Lachssperma-DNA).

Die Hybridisierung erfolgte in einte frischen Löaung mit 10* epic, pro Filter einer nach üblichen Methoden radioaktiv markierten HuIFN-γ "prohd",- 20 stunden bei 65⁰C. Die Filter wurden unter nicht stringenten Bedingungen in 3XSSC, 0,1% SDS bei 6S⁰C gewaschen, getrocknet und autoradiographiert. Nach drei D'.irchgängun von Plaque-Reinigung konnten 5 Lambda Klone identifiziert werden, die positive Hybridisierungssignal ·» ergaben.

Aus diesen isolierten rekombinant.en Phagen wurde nach üblichen Methoden (Maniatis et al., ibid.) die DNA gereinigt. Die Phagen-DNAs wurden nach Verdauung mit verschiedenen Restriktionsenzymen und nachfolgender Southern-Analyse (Southern, J.Mol. Biol. 98: 503-517, 1975) durch Hybridieierung mit der HuIFN-γ "probe" charakterisiert. Ein singuläres hybridisierendes 4,6 kb langes BamHI Fragment des Klone Lambda Ες-γ2 wurde isoliert und in die BamHI Schnittstelle des Plasmids pUC9 (Vieira und Messing, Gene 19: 259-268, 1982) geklont. Nach Transformation von E.coli JMlOl wurde aus erhaltenen Kolonien in einem Minipräparationsverfahren (Birnboim und DoIy, NUCl. Acids Res. 7: 1513-1523, 1979) Plasmid-DNA hergestellt und durch Verdauung mit Restriktionsenzymen charakterisiert. Ein Plasmid mit dem gewünschten BamHI Insert wurde pAHlll benannt. Die Ränder des BamHI Inserts von Plasmid paHlll wurden nach Einbringung in die M13mp8 bzw. M13mp9 Vektoren

(Vieira und Messing, Gene 19, 259-268, 1982) nach der Didesoxy-Msthode sequenziert (Sanger et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 74: 5463-5467, 1977). Ein Sequenzvergleich mit dem humanen gamma-Interferon-Gen (Gray und Goeddel,

Nature 298: 859-863, 1982) zeigt« hohe Homologie mit den n^chtkodierenden V- und 3'-Regionen. Daraus wurde geschlossen, daß das vollständige EqIFN-γ Gen isoliert wurde.

B. SequenzieLü'.g <'es Pferde gdmma-Interferongens aus Klon Lambda Ες-γ2

Das 4,6 kb lange BamHI Inssxt von Plaemid pAHlll wurde nach der Didesoxy-Methode vollständig sequenziert. Die Gesamtsequenz des BamHI-Fragments wurde durch Kombination von Teilsequenzen von M13-Subklonen ermittelt, die durch gerichtete Klonierung von Restriktionsfragmenten (EcoRI, HindXII, Pßtl, Pstl-Bglll, Hindlll-BamHI) in entsprechend geschnittene M13mp8 oder M13mp9 Vektoren erhalten wurden. Weitere Teilsequenzen wurden erhalten, indem das 2,0 kb lang«! BamHI-Bglll Fragment, bzw. das 2,0 kb lange Pstl Fragment nach der "Shotgun-Methode" in den M13mp8 Vektor geklont wurde. Die beiden DNA-Fragmente wurden durch Ultraschall in kleinere Stücke zerteilt, die DNA-Enden durch Inkubation mit E.coli DNA-Polymerase I (Klenow-Fragment) in Gegenwart von je 0,1 mM aller vier

Desoxynukleotidtriphosphate abgestumpft (Reaktionspuffer: mM Tris-HCl pH 7,5, 10 mM MgCl , 1 mM Dithiothreit, 0,5 mg/ml Rinderserumalbumin: 1 h bei 25°C). Nach Größenfraktionierung in einem Agarosegel wurden DNA-Fragmente einer Länge von etwa 0,4 - 1,0 kb isoliert und in die Smal Schnittstelle des M13mp8-Vektors ligiert. Die erhaltenen Teilsequenzen wurden mittels eines Computerprogrammes zu der 4664 bp langen Totalsequenz vereint, die in Fig, I dargestellt ist.

Durch computerunterstützte Analyse der offenen Leserahmen und Vergleich mit von gamma-Interferongenen anderer Spezies (Gray und Goeddel, Nature 298: 859-863; Gray und Goeddel,

se

/OC

Proo. Natl.Acad.Sri.USA 80: 5342-5846, 1983; Dijkema et al., EMBO J. 4: 761-767, 1985; Cerretti et al., J. Immunology 136: 4561-4564, 1986) wurde der proteinkodierende Bereich des equinen gamma-.ntorferongens ermittelt. Die proteinkodiarendc Roflion ist durch drei Introns unterbrochen, wobei im ersten Exon das 20 Aminosäuren lange, hydrophobe Signalpeptid und ?-8 Aminosäuren des reifen EqIFN-γ Polypeptides kodiert sind (Basen 366-479). Das zweite Exon kodiert für die Aminosäuren 19-41 (Basen 1639-1707), 4as dritte Exon kodiert für die Aminosäuren 42-102 (Basen 1803-1985), das vierte Exon kodiert den Carboxy-Terminus mit den Aminosäuren 103-146 (Basen 3307-3441). An den Positionen 4010 und 4020 befinden sich zwei Signalsequenzen (AATAAA) für die Polyadenylierung der mRNA. An den Positionen 86-88 des reifen EqIFN-γ Polypeptides befindet sich die einzige potentielle N-Glykosylierungsetelle (ASN-Ser-Ser), welche mit der zweiten N-Glykosylierungsstelle des bovinen gamma-Interferons (Asn-Gly-Ser) zusammenfällt (Fig. 2). Das reife EqIFN-γ Polypeptid enthält überraschenderweise nur einen einzigen Cysteinrest an Position 3, wobei in Analogie zu den natürlichen humanen und murinen gamma-Interferonen wahrscheinlich die ersten drei amino-terminalen Aminosäuren (in diesem Fall Tyr-Tyr-Cys) im Organismus protoolytisch abgespalten werden.

5. Herstellung eines synthetischen Gens für reifes EqIFN-γ

Um rekombinantes EqIFN-γ in seiner reifen Form in Escherichia coli zu exprimieren, wurde ein synthetisches Gen aus Oligonukleotiden konstruiert. Es kodiert für dieselbe Aminosäuresequenz wie das natürliche EqIFN-γ Gen, enthält

jedoch ausschließlich solche Codons für die einzelnen Aminosäuren, die in von E.ooli hoch exprimierten, zeU.eigenen Genen verwendet werden (Gouy und Gautier, Nucl. Acida Res. 10: 7055-7074, 1982). Zusätzlich wurden-mehrere singuläre RostriktionBenzym-ScimJttstellen eingebaut, die eine einfache Manipulation des Gens für die Veränderung einzelner Abschnitte möglich macht. Das synthetische Gen für EqIFN-γ wurde in zwei Varianten auF insgesamt 16 verschiedenen Oligonukleotiden konstruiert. Die erste Variante kodiert für reifes EqIFN-γ mit 146 Aminosäuren plus Start-Methionin, die zweite Form für ein am Amino-Terminus um 3 Aminosäuren (Tyr-Tyr-Cys) verkürztes Polypeptid plus Startmethionin, wie es vermutlich im natürlichen Organismus auftreten dürfte.

Die Struktur des synthetischen EqIFNy Gene ist in Fig. 3 dargestellt. Die für die Herstellung verwendeten Oligonukleotide wurden mit Hilfe eines Applied Biosystems Model 381A DNA-Synthesizer synthetisiert, durch Elektrophorese in denaturierenden 12%-igen Polyacrylamidgelen (7 M Harnstoff) gereinigt und mittels Ausechlußchromatographie über Sephadex G-25 (Pharmacia) entsalzt.

Zusammenbau der Oligonukleotide zum synthetischen EqIFN-γ Gen

Der Zusammenbau des synthetischen EqIFN-γ Gens erfolgte in zwei Abschnitten. Der erste Teil des Gens wurde mit Hilfe der acht Oligonukleotide EG-I bis EG-8 bis zur Sail Schnittstelle hergestellt, die zweite Hälfte des Gens aus den sechs Oligonukleotiden EG-9 bis EG-14 von der Sail Schnittstelle bis zur BamHI Schnittstelle. Für die am Amino-Terminus um drei Aminosäuren verkürzte Form des EqIFN-γ wurden statt der Oligonukleotide EG-I und EG-2 die Oligonukleotide EG-15 und EG-16 verwendet.

Die zueinander komplementären Oligonukleotide wurden jeweils paarweise am 5'-Ende phosphoryliert. Jeweils 100 pMol der beiden Oligonukleotide (z.B. EG-3 und EG-4, bzw. EG-5 und EG-6 UKW.) wurden in 9 ul Kinase-Puffer (7-OmM Tris-HCl pH 7,6, 10 mM MgCl₂, 5mM Dithiothreit), 2nCi [γ"³²Ρ]ΑΤΡ (Amersham) mit 10 Einheiten T4-Polynukleotidkinase (New England Biolabs) 10 min bei 37°C inkubiert, 1 μΐ einer 10 mM ATP-Lösung zugefügt und weitere 50 min bei 37°C inkubiert. Die Reaktion wurde durch 10-minütiges Erhitzen auf 95°C gestoppt. Um die spätere Verknüpfung der DNA-Enden zu verhindern, wurden die Oligonukleotide EG-I, EG-1'5, EG-9 und EG-14 nicht phosphoryliert. Sie wurden erst nach inaktivierung der Polynukleotidkinase mit dem jeweils komplementären Oligonukleotid gemischt, 5 min auf 95°C erhitzt und auf Raumtemperatur abgekühlt.

Die Mischungen der Oligcnukleotide EG-1+2 (bzw. in einem zweiten Ansatz EG-15+16), EG-3+4, EG-5+6 und EG-7+8 wurden vereinigt, mit 1 μΐ 5 M NaCl versetzt, 5 min auf 70⁰C erhitzt und auf Raumtemperatur abgekühlt. Zu dieser Lösung wurden 5μ1 10 mM ATP, 2 μΐ Dithiothreit, 1,5 μΐ 1Ox Ligationspuffer (0,66 M Tris-HCl pH 7,2, IM NaCl, 100 mM MgCl₂, 10 mM EDTA, 50 mM Dithiothreit) und 80 Einheiten T4 DNA-Ligase (New England Biolabs) zugesetzt und 48 Stunden bei 4°C inkubiert. Der Verlauf der Ligase-Reaktion wurde durch gelelektrophoretische Auftrennung der DNA-Fragmente eines kleinen Reaktionsanteils in einem 5%-igen, nicht denaturierenden Polyacrylamidgel und anschließender Autoradiographie verfolgt. In gleicher Weise wurden die sechs Oligonukleotide EG-9 bis EG-14 miteinander verknüpft. Die Reaktion wurde durch Phenol/Chloroform-Extraktion gestoppt und die DNA durch Äthanolfällung wiedergewonnen.

D 1

6. Konstruktion des Expreesionsplasmides pRH 100

Alle Enzymreaktionen wurden unter den von den Herstellern angegebenen Bedingungen durchgeführt,.

7 ug Plasmid pER103 (Eva Dworkin-Rastl et al., Gene 21 (1983) 237-248, EP-A-O.115-613) wurden in 50 μΐ Reaktionsmedium mit der Restriktionsendonukleasc Hindlll linearisiert. Nach einer einstündigen Inkubation bei 37°C wurden 50 μΐ 2x CIP-Puffer zugesetzt (2x CIP-Puffer = 20 mM Tr is, pH=9,2, 0,2 mM EDTA). Durch Zugabe von 2 Einheiten alkalischer Phosphatase aus Kälberdarm (CIP) wurden die 5'terminalen Phosphatreste entfernt; inkubiert wurde bei 45⁰C 30 Minuten lang. Die Reaktion wurde durch Zugabe von μΐ 0,5 mM EDTA-Lösung sowie Zugabe von 10 μ], IM Tris, pH=8,0 Lösung gestonpt. Die Proteine wurden durch zweimalige Phenol- und einmalige Phenol-/Chloroformextraktion entfernt. Die DNA wurde aus der wäßrigen Phase nach Zugabe von 0,1 vol 3M Natriumacetatlösung pH=5,5 und 250 μΐ Äthanol ausgefällt, das DNA-Präzipitat nach Zentrifugieren einmal mit 70%-iger Äthanollösung gewaschen. Die DNA wurde getrocknet, und das Pellet anschließend in 20 μΐ TE-Puffer (10 mM Tris pH=8,0, 1 mM EDTA) gelöst.

Jeweils 1 μg der synthetisch hergestellten Oligonukleotide d(AGCTTAAAGATGAGCT) und d(CATCTTTA) wurden in je 10 μΐ Reaktionslösung unter Zugabe von 10 Einheiten T4-PNK (Polynukleotidkinase) sowie 1 mM rATP phosphoryliert. Die Reaktion fand bei 37°C statt und dauerte 45 Minuten. Die Reaktion wurde durch 10-minütiges Erhitzen auf 70⁰C abgebrochen.

Jeweils 5 μΐ der Plasmidlösung und der phosphorylierten Oligonukleotide wurden gemischt und 5 Minuten auf 7O⁰C erwärmt. Danach wurde die Lösung auf

O⁰C abgekühlt, 2 μΐ 1Ox Ligasepuffer (500 mM Tr.is, pH=7,5), 100 mM MgCl 200 mM DTT (Dithiothreit), 1 mM rATP, 500 ug/ml BSA (Rinderserumalbumin), sowie 2 μΐ Wasser und 10 Einheiten T4-DNA Ligase zugesetzt. Die Reaktion dauerte 40 Stunden und wurde bei 4°c durchgeführt. Sie wurde durch 10-minütiges Erhitzen auf 70⁰C abgebrochen.

2 μΐ dieser Ligaseraaktion wurden in insgesamt 30 μΐ Lösung mit 10 Einheiten der Restriktionsendonuklease Sacl (New England Biolabs) 3 Stunden bei 37°C verdaut. Die Reaktion wurde durch 10-minütiges Erhitzen auf 7O⁰C abgebrochen. 5 ul dieser Reaktionsmiuchung wurden in insgesamt 30 μΐ durch Zugabe von 10 Einheiten T4-PNK bei 14°C 16 Stunden lang ligiert.

200 μΐ kompetenter E.coli HbIOl wurden mit 10 μΐ dieser Ligasereaktion versetzt. Die Bakterien wurden Minuten auf Eis gehalten und anschließend 2 Minuten auf 42°C erwärmt, um die DNA-Aufnahme zu ermöglichen. Anschließend wurde d:le Bakteriensuspension wieder bei 0⁰C 10 Minuten inkubisrt. Abschließend wurden die transformierten Bakterien auf einem LB-Agar, der 50 μg/ml Ampicillin enthielt, ausgestrichen.

Von den entstandenen Bakterienkolonien wurden 12 willkürlich ausgesucht und daraus im Mikromaßstab die Plasmide isoliert (Birnboim und DoIy, Nucl. Acids Res. (1979) 1513-1523). Die resultierende DNA wurde mic der Restriktionsendonuklease Sacl geschnitten und die DNA auf einem Agarosegel (1%, Ix TBE-Puffer) aufgetrennt. Die Wanderung der DNA als lineares Molekül der Größe von etwa 4.400 bp bestätigte die Einführung einer Sacl-Erkennungsstelle in das Plasmid. Eines dieser Plasmide wurde willkürlich ausgesucht. Mit der DNA aus

der dazugehörigen Minipräparation wurde nochmals E.coli HBlOl transformiert. Von den resultierenden transformierten Bakterien wurde eine Kolonie ausgewählt und in größerem Maßstab ange2üchtet. Das darauu isolierte Plasmid wurde mit den

Restriktionsendonukleasen EcoRI und BamHI geschnitten, die DNA auf einem 1%-igem Agarosegel aufgetrennt, und das kleinere Fragment aus dem Gel durch Elekcroelution isoliert. Dieses etwa 460 bp lange EcoRI-BamHI DNA-Fragment wurde nach Sanger sequenziert (F. Sanger et al., Proo.Natl.Acad. Sei. (1977) 5463-5467). Das dermaßen analysierte Plasmid wurde pRHIOO genannt.

7. Einbringung des synthetischen EgIFN-Ύ Gens in das Expressionsplasmid pRHlOO

10 ug Plaemid pÄHlOG werden in 100 μΐ

Reaktionspuffer mit Sacl vollständig geschnitten und das Enzym durch 10-minütiges Erhitzen auf 7O⁰C inaktiviert. Die überhängenden DNA-Enden werden durch Behandlung mit Klenow-Fragment (Amersham) in Gegenwart von je 10 μΜ aller vier Desoxynukleotidtriphosphate begradigt (30 min, 25°C). Die Reaktion wird durch Phenol/Chloroform-Extraktion gestoppt und die DNA durch Äthanolfällung konzentriert. Durch diese Behandlung entsteht im Anschluß an den Tryptophanpromotor ein stumpfes DNA-Ende, das mit dem Translationsstartcodon "ATG" endet. Die linearisierte Plasmid-DNA wird mit BamHI nachgeschnitten und der Vektoeanteil nach elektrophoretischer Auftrennung aus einem Agarosegel isoliert.

50 ng des wie beschrieben vorbereiteten pRHIOO Plaemid-Vektors werden mit 20 pMol der ligierten Oligonukleotide EG-I bis EG-8 und EG-9 bis EG-14

gemischt und in 10 μΐ Ligationspuffer (66 mM Tris-HCl pH 7,2, 100 mM NaCl, 10 mM MgCl , ImM EDTA, 5 mM Dithiothreit, 1 mM ATP) mit einer Einheit T4 DNA-Ligase (Boehringer Mannheim) 24 h bei 14°C inkubiert. Durch Behandlung mit Kalziumchlorid kompetent gemachter E.coli JMlOl wird mit diesem Ligationsgemisch transformiert und über Nacht bei 37°C inkubiert. Von den erhaltenen Traneformanten wird im Minipräparationeverfahren Plasmid-DNA isoliert und durch Restriktionsanalyse und Sequenzierung des Hindlll-BamHl Inserts die Struktur ermittelt. Ein Plasmid der gewünschten Struktur für die Expression von reifem EqIFN-γ wird pEqG-YYCl benannt. In völlig analoger Weise werden die Oligonukleotide EG-15,16 EG-3 bis EG-8 und EG~9 bis EG-14 io den pRHIOO Vektor geklont, um das um drei Aminosäuren verkürzte EqIFN-γ zu erhalten. Ein Plasmid der gewünschten Struktur wird pEqG-QAAl benannt.

8. Expression der Interferonaktivität durch E.coli JMlOl. das Plasmid pEq-YYCl oder pEqG-OAAl enthaltend

100 ml Bakterienkultur werden bei 37°C unter kräftigem Schütteln in folgendem tryptophanfreiem Medium inkubiert (Angaben pro Liter Medium): 10 g (NH ) PO , 3,5 g KH PO pH 7,3 mit NaOH, 0,5 g NaCl, 21 g Casaminosäuren (sauer hydrolisiert), 11 g Glucose, 1 mM MgSO , ü,l mM CaCl , 1 mg Thiamin-HCl, 20 mg L-Cystein, 20 mg 3-ß-Indolacrylsäure (IAA, Induktor für das Tryptophan-Operon), optionsweise 50-100 mg Ampicillin. Anschließend werden die Bakterien durch Zentrifugieren 5 Minuten bei 4000 UpM pelletiert, mit 1/10 des Kulturvoiumens eiskaltem 50 mM Tris-HCl pH 8,0, 30 mM NaCl suspendiert und unter Eiskühlung zweimal 30 Sekunden mittels

Ultraschallsonde (20 kHz, 100 Watt) aufgebrochen. Die Zelltrümmer werden 10 Minuten bei 10,000 UpM (4°C) entfernt und der überstand nach Sterilfiltration auf •Interferonaktivität in einem Aseay, der den cytophatischen Effekt (CPE) von Vesicular Stomatitis Virus (VSV) oder Encephalomyocarditis Virus (EMCV) mißt, getestet.

Test system: NBL-6 Zellen (ATCC CCL 57, Pferdehaut-

Epidermis-Zellen)/VSV A549 (ATCC CCL 185, humane Lungencarcinom-Zellinie)/EMCV

Der Titer auf A 549-Zellen wird mit human-Interferonstandard auf internationale Einheiten normiert.

9. Nachweis der exprimierten Pferde-Interferone durch Markierung der Proteine in Maxizellen

Plasmidcodierte Proteine können durch Verwendung der Maxizelltechnik selektiv in vivo markiert werden. E.coli CSR603 wird nach üblichem Verfahren mit den Expressionsplasmiden transformiert und auf Ampicillin-haltigen Agarplatten auf transformierte Bakterien selektioniert. Die Präparation der Maxizellen und das Markieren der Proteine erfolgt nach einer Vorschrift von A. Sancar (a.a.O.). Die Zellen werden in 15 ml Medium (siehe Beispiel 8) ohne Indolacryleäure bei 37°C bis zu einer OD,-- =0,5 gezüchtet und 10 ml

oOOnm

dieser Kultur in einer Petrischale 5 Sekunden aus 50 cm Entfernung mit einer UV-Germicid-Lampe (15 Watt) unter Schwenken bestrahlt und eine Stunde bei 37°C weiterinkubiert. Die Kulturen werden mit 100 ug/ml D-Cycloserin versetzt, 14 Stunden bei 37°C inkubiert und die Bakterien anschließend durch Zentrifugation

66 Uf tot

geerntet. Die. Zellen werden zweimal mit 5 ml Hershey-Salzlösung gewaschen, in 5 ml Hershey Medium mit 20 ug/ml Indocrylsäure suspendiert und 2 Stunden bei

37°C inkubiert. Zu jeder Kultur werden 5 iiCi/ml

35

S-Methionin (1000 Ci/mMol) zugesetzt und eine Stunc'e

bei 37°C geschüttelt. Die Zellen werden geerntet in SDS- und 2-Mercaptoethanol-haltigem Elektrophorese-Probenpuffer lysiert und die Proteine auf einem 15%-igem Polyacrylamidgel aufgetrennt.

Hershey-Salzlösung (pro Liter) Hershey Medium (pro ?.00ml

Hershey-SaIzlösung)

5,4 g NaCl 3,0g KCl 1,1 g NH₄Cl 15mg CaCl .2EO 0,2 g MgCl .6H O 0,2 mg FeCl .6HO

87 mg KH ρο_λ 2 4

12,1 g Tris-HCl pH 7,4

Ein Autoradiogramm des getrockneten Gelee wird nach 2 Tagen Exponierung auf i)uPont cronex x-ray Film unter Verwendung einer Kodak Lanex-Regular Verstärkerfolie bei -80⁰C dargestellt. Als Molekulargewichtsstandard wird

14 ein C-methyliertes Proteingemisch (Amersham)

verwendet. Als Kontrollen dienen das Plaemid pEP.103, das nur den Promotor ohne Interferongen enthält und das Plasmid pER21/l, das zwei Kopien des humanen IFM-a2arg Genes enthält.

2	ml	20%	Glucose
0,5	ml	2%	Threonin
1,0	ml	1%	Leucin
1,0	ml	2%	Prolin
1,0	ml	2%	Arginin
0,1	ml	0,	1% Thiamin

10. Nachweis von mit EqIFN-γ hybridisierenden Sequenzen iη genomischer Pferde-DNA

Zum Nachweis der Gesamtanzahl von Sequenzen im Pferdegenom, die hohe Homologie mit dem Interferongen SqIFN-Y aufweisen, wird wie folgt vorgegangen. 30 ug hochmolekulare Pferde--DNA (Beispiel 1) werden mit 100 Einheiten des entsprechenden Restriktionsenzym in 300 μΐ Reaktionsvolumen vollständig verdaut und jeweils 10 ug dieser geschnittenen DNA pro Spur auf einem 0,8%igem Agarosegel nach der Größe aufgetrennt.

Nach Southern-Transfer auf Nitrozellulosefilter, Denaturieren und Fixieren der DNA wird jedes Filter mit etwa 6x10 cpm radioaktiv markierter "probe" hybridisiert (17 Stunden bei 65°C, 5x SSC, 5x Denhardt-Lösung, 0,1% SDS, 20 ug/mi denaturierte Lachssperma-DNA). Als "probe" für EqIFN-γ wird ein Fragment aus dem Plasmid pEqG-YYCl verwendet, das die codierende Sequenz für das gesamte reife Interferon enthält. Die Filter werden anschließend unter stringenten Bedingungen gewaschen: 4mal 45 Minuten bei 65°C mit 0,3x SSC (45 mM NaCl, 4,5 mM Na Citrat), 0,1% SDS. Die Autoradiographie erfolgt auf DuPont Cronex X-ray Film unter Verwendung von Kodak Lanex-Regular · Verstärkerfolie 7 Tage bei -80⁰C.

11. Expression von equinem Interferon-qamma (QAA) in E.coli HB101/pEqG-QAA2 und HB101/pEqG-OAA3.

Um zu einer verbesserten Expression zu gelangen, wurden a) verbesserte Expressionsvektoren und b) eine verbesserte ribosomale Bindungsstelle verwendet. Die verbesserten Expressionsvektoren basieren auf dem trp-Promotor aus Serratia marcescens (Sma), der in der -35 Region an die Konsenus -35 Region durch einen

₆₈ ZCV10&

Basenaustausch angeglichen ist (pRH281), bzw. auf einem Hyb.rid-trp Promotor, der die erste A/T-reiche Region des' Eschetichia coli (Eco) bzw. die zweite A/T-reiche Region plus Promotor von Sma besitzt (pRH282, S. It.oh, Gene (1966), 29-3fi). Als ribosomale Bindungsstelle wurde jene des E.coli Enterotoxin II verwendet.

a) PRH281/5

Folgende Oligonukleotide wurden mittels eines Applied Biosystems DNA Synthesizer 381A hergestellt:

Trp-lt 5'-AATTaACGOTG-S¹ Trp-3t 5'-ATCGCTAAAACATTGTGCAAAAAGAGGaTTaACATTGCCTTCGCGAACCA

OTTAACTAQTACAC/ "* 3' Tjtp-6s B j -AGTTCACaeCYCQAGACGCrfAAOaAGflTTTAATATGAGCTCflAATTCAT-a»

Trp-4' 5'-CGTGAACTTGTGTACTAGTTAACTGGTTCaCOAAaaCAATGTCAACCCT

CTTTTTGCACAATGTT-S' Trp-e J 6'-CGATGAATTCGAGCTCATATTAAACCTCCTTACCaTCTCaAGC-S·

Je 100 pMol Oligonukleotide Trp-2 bis Trp-5 wurden separat in 10 μΐ phosphoryliert. Trp-1 und -2, Trp--3 und -4 sowie Trp-5 und -6 wurden durch Aufkochen und langsames Abkühlen hybridisiert. Die Oligonukleotidpaarlösungen wurden vereint und durch Zusatz von T4-DNA Ligase ligiert. 3 ug pAT153 wurde mit EcoRI und CIaI doppelt geschnitten. Nach Reinigung des großen Fragmentes wurde dieses mit ca. 20 pMol Oligonukleotiden versetzt und ligiert. Die DNA wurde anschließend in E.coli HBlOl transformiert und die Plasmide einiger resultierender Kolonien isoliert. Das den Promotor enthaltende Pst-Hindlll Fragment wurde

₆₉ ZM-tot

sequenziert. Nach Bestätigung der gewünschten Sequenz wurde ein Plasmid ausgewählt und mit pRH281/5 bezeichnet.

Die Sequenz des Promotorteiles lautet:

-35

5'-GAATTGACGCTGATCGCTAAAACATTGTGCAAAAAGAGGGTTaACATTGG J' -CTTAACTGGGACTAGCGATTTTGTAACACGTTTTTCTCCCAACTGTAACG

-10 ITranekriptionvaturt

CTTCaCGAACCAGTTAACTAGTACACAAGTTCACGGCTCGAGACGGTAAG GAAGCaCTTGGTCAATTGATCATGTGTTCAAGTGCCaAGCTCTGCCATTC

RBO Sstl SooKI CIaI GAGGTTTAATATGAGCTCGAATTCATCGaT-3' CTCCAAATTATACTCaAaCTTAACITAGCTA-5^:

Die Vorteile des neuen Expressionsvektors sind:

1) optimale -35 Region im trp-Sma Promotor

2) singuläre Xhol-Stelle vor der ribosomalen Bindungsstelle (RBS) erlaubt den Austausch der RBS gegen eine andere

3) Dss Expreseionsplasmid enthält einen Tranelationsstart ATG im Abstand von 5 Nukleotiden nach dec RBS

₇₀ ZC 9 70 (,

4) Das G dieees ATQ¹β ist die erste Base der Sstl-Erkennungssequenz (GAGCTC). Durch Schnitt mit Sstl und anschließender Erzeugung eines geraden Endes steht ein Expressionsvektor mit einem TranslationsBtart-ATG zur Verfügung, an das ein fremdes Gen beginnend mit der ersten Base des Leserahmens anligiert werden kann.

5) Die Verbindung RBS-ATG enthält kein G oder C

6) Durch die Wahl der Oligonukleotidesequenz am 5'Ende wurde die ursprüngliche EcoRI Schnittstelle zerstört. Dadurch kann am 3'Ende des Promotors eine Multiklonierstelle bestehend aus Sstl, EcoRI, CIaI und Hindlll (bereits im pAT153 Anteil) erzeugt werden.

b) PRH282/5

Auf gleiche Weise wurde der Expressionsvektor pRH282/5 zusammengebaut. Die Oligonukleotide Trp 1 und Trp2 wurden durch die Oligonukleotide Trp-7 und Trp-8 ersetzt:

Trp-7ι 6'-AATTQOCCQTTCTÜQATAATaTTTTTTaCQCCGACATOATOATOCT-3· Trp-Θs 6'-TTAacaATCAGCATGATGATOTGGGCaOAAAAAACATTATGCAOAACaaaC-a'

₇₁

Die Sequenz dee Promotorteils in pRH282/5 lautet

ß'-GAATTaOCOaTTCTaeATAATGTTTTTTaCGCCGACATCATCATGCTGAT 3'-CTTAACGGGCAAGACCTATTACAAAAAACGCGQCTGTAGTAGTACGACTA

CGCTAAAACATTGTGCAAAAAGAGGaTTGACATTGCCTTCGCGAAGCAGT GCGATTTTGTAACACGTTTTTCTCCCAACTGTAACGGAAGCGCTTGGTOA

Xhol

-10 ITranakriptionaatart RBS TAACTAGTACACAAGTTCACGGCTCGAGACGGTAAGGAGGTTTAATATGA ATTGATCATGTGTTCAAGTGCCaAaCTCTGCCATTCCTCCAAATTATACT

SetZ EooRZ CIaI GCTCGAATTCATCGAT-S' COAGCTTAAGTAGCTA-S'

c)pGNl

1 ug pUC18 wurde mit BamHI und SaII doppelt geschnitten. Aue 10 ug EqG-QAAl wurde ebenfalls durch BamHI-Sall Doppelschnitt die zweite Hälfte dee synthetischen Pferde-Gamma-Interferon Gens isoliert und dephosphoryliert. Ca. 20 ng Vektor wurden mit 100 ng Insert ligiert und die DNA in E.coli JMlOl transformiert. Das Plasmid einer Kolonie wurde mittels Restriktionsenzymverdau geprüft und mit pGNl bezeichnet, d) pGW3

₇₂ J6 970ά

Die erste Hälfte des synthetischen Gens wurde zusammen mit der ribosomalen Bindungsstelle aus Oligonukleotiden zusammengesetzt:

EqO-J: 6·-AOCTTCCCTCGAGAGGTTGAGGTGATTTATGCAGGCTGCTTTCTTTAAAO

AAATCaAAAAOCTQAAAaAATACTTOAACOCTCOTAACCCAQACaTTOaT-3 Eq.a-21 6' -GACGGTaOTCCGCTGTTCCTGGACATCCTGAAAAACTGGAAAGAAGACTC

TGACAAAAAGATCATCCAGTCTCAG-3' RqQ-3 j 6 · -ATCOTTTOTTTCTACTTCAAAOTGTTCOAAAACCTGAAAaACAAOOAQQT

TATCCAGAAATCGATGGAOAOTATCAAAGAAaATCTOTTCGTTAAATTCT

TOAACTOGTCGACTCCG-S · Eq.G-4: 5'-AATTCGGAaTGGACGAGTTGAAGAATTTAACaAACAGATCTTCTTTGATA

OTaTCOATCaATTTOTGeATAACOTGGTTaTCTTTCAQGTTTTCaAACAG

TTTGAAGTAGAAAGAAACaATCTGAaACTG-S' EqG-O: 6·-GATaATOTTTTTGTCAaAGTCTTCTTTCaWTTTTTCAGOATaTCCAGGA

ACAGCGGACOAOCGTCACCAAOGTC-S' -e 5 δ · -TGOGTTACGAqCQTTOAAeTATTCTTTOAIlöTTTTCCATTTCTTTAAAOA

AAGCAGCCTäCATAAATCACCTCAACCTCTCGAGGOA-S'

Jeweils 50 pMol der Oligonukleotiäe wurden phosphoryliertf und zwar: EqG-2 zusammen mit EqG-5 in 7 μΐ, EqG-3 und EqG-8 allein in je 8 ul. Die Kinasereaktion wurde durch Erhitzen auf 100⁰C gestoppt

Zu EqG-3 wurden 50 pMol EqG-4 (IuI) und zu EqG-8 50 pMol EqG-I (1 μΐ) zugesetzt. Die Lösungen wurden nochmals auf 100⁰C erhitzt und langsam abgekühlt. Die Oligonukleotidpaarlösungen wurden vereint und mit T4-DNA Ligase in insgesamt 30 ul ligiert, 2 ug pUC18 wurden mit EcoRI und Hindlll doppelt geschnitten, der Vektorteil gelgereinigt und in 50 ul Wasser gelöst. 40 ng Vektor und ca. 2 pMol ligierte Oligonukleotide wurden in 10 ul ligiert und die DNA anschließend in E. coli JMlOl tranformiert.

Das EcoRI-Hindlll Insert einiger resultierender Plasmide wurde in M13mp9 umkloniert und die Sequenz Überprüft. Ein Plasmid mit der erwarteten Sequenz wurde ausgewählt und mit pGN3 bezeichnet.

e) pGN20

Ca 3 ug pGNl bzw. pGN3 wurden mit Hindlll und SaIT doppelt: geschnitten. Das Insert des pGN3 und der Vektor/2. Hälfte des Eq-gamma-Interferon Gene aus p wurden gelgereinigt. 0,2 ug pGN3 wurden mit ca. 0,0b ug pGN3-Insert ligiert und die DNA in E.coli JMlOl transformiert. Das Plasmid eines resultierenden Klons wurde nach überprüfung des Restriktionsmusters ausgewählt und mit pGN20 bezeichnet.

f) pEqG-QAA2 bzw. pEqG-QAA3

Aus ca. 10 ug pGN20 wurde das XhoI-EccRI Insert, das das synthetische Pferde-gamma-Interferon Gen zusammen mit der ribosomalen Bindungsstelle des E.coli Enterotoxin II (CH. Lee et al., Infect. Immun. 42 (1983), 264-268; S.L. Moseley et al., Infect. Immun. (1983), 1.167-1.174)) enthält, isoliert. pRH281/5 bzw. pRH282/S wurden mit Xhol und EcoRI doppelt geschnitten. 20 ng Vektor wurden mit 20 ng Insert ligiert, und die DNA in E. coli HBlOl transformiert. Einige Kolonien wurden ausgewählt, die Plasmide isoliert und durch Restriktionsanalyse überprüft. Jeweils ein Plasmid wurde ausgewählt und mit pEqG-QAA2 (Vektor: pRH281/5) bzw. pEqG-QAA3 (Vektor: pRH282/5) bezeichnet.

74

g) Lysattest auf Interferon-gamma Aktivität

Eine über Nacht Kultur von E.coli HB101/pEqG-QAA2 bzw. HBlO1./pEqG-QAA3 wurde 1:100 mit LB/Amp verdünnt (LB: lOg/1 Trypton, 5g/l Hefeextrakt, 5g/l NaCl, 50 mg/1 Ampicillin) und weiter bei 37°C inkubiert. Bei Erreichen einer optischen Dichte (600nm) von 0,3 wurde 50 mg/1 Indolacrylßäure zugesetzt, und die Kultur weitere zwei Stunden bei 37°C inkubiert. Die Bakterien wurden abzentrifugiert und mittels Ultraschall aufgebrochen. Der steril filtrierte überstand wurde auf NBL-6 Zellen (ATCC CCL 57) auf gamma-Interferonaktivität getestet, wobei Vesicular Stomatitis Virus (VSV) als Virus eingesetzt wurde. Die Lysate beider transformierter Bakterienkluturen (E. coli HB101/pEqG-QAA2 bzw. HB101/pEqG--QAA3) zeigten etwa 0,1 bis 1 Million Einheiten/ml Interf ei:onaktivität. Zur Kontrolle wurde ein identisch hergestelltes E.coli HB101/pRH281 Lysat getestet. Diese« Kontrollysat zeigte weniger als 100 Einheiten/ml.

-Ϊ0- C

EqIFN-gamma (Lambda Eq- 2 BamHI-fcagment)

GGATC 5

CCACAAGAATGGCACGGGTGGGCATAATGGGTCTGTCTCATCGTCAAAAGACCCAAGGAG 65

TTGAAAGGAAACTCTAACTACAACACCAAAATGCCACAAAACCATAGTTATTAATACAAA 125

CTAACTAGCATCTGTGCCTATCTGTCACCATCTCATCTGAAAAAACTTGTGAAAATACGT 185

AATCCTGATGAGACTTCAATTAGGTATAAAAACCAGCCCCAGAAGGCGAGGCAGTACACT 245

CTTCTGATCGCCGGTAGGGCAGCTATTAGAAAAGAAAGATCAGCTGAGGCCTTGGGACCT 305

GATCAGCTTAGTACAGAAGTGACTGCTTTCAACTACTTAGGCCTAACTCTCTCCGAAACA 3 65

-20 -15 -10

Met Αβη Tyr Thr Ser Phe lie Leu Ala Phe Gin Leu Cys Ala Tie

ATG AAT TAT ACA AGT TTT ATC TTG GCT TTT CAG CTG TGT GCG ATT 410

-5 -11 5 10

Leu GIy Ser Sec Thr Tyr Tyr Cys Gin Ala AIa Phe Phe Lys GIu

TTG GGT TCT TCT ACC TAT TAC TGC CAG GCC GCG TTT TTT AAA GAA 4 55

lie GIu Αβη Lou Lye GIu Tyr Phe

ATA GAA AAC CTA AAG GAA TAT TTT GTi₁AGTATGACCTTTTAATAATACTTAC 507

INTRON 1

TTGTGGTTGAAATGACTGAACGTTGTCTTGGAGTTGGATCTCTGATAGGCTGTCCTCTCT 567

ACTCCACAGTCATCTTGAGAAGACTGGGTGTTATTTTCTCTGTTTGTTGACTGGATGAGT 6 27

TTTTCTTTTTTTTACTAAATGATCTAGATATTGCTTTAACCCTCTGCTCAATTTGCTATA 6 θ 7

GAGACTTAGAGAGGGTTCATGAATCTTCCAAAAGATGGGCTTAACAGGTTTATAAAGCAT 747

AGTGAAGTTGACAATTTTGTGGTGAGAAGCCACTGAATTGTGATAAGTCAAGTAGTGTGG 807

ACATTGAAAAAATGACTAGCTATTAGTTTCTAACTTCTCAGGTTACTATGATGGTGACAA 867

TAAAAGGTCAA(JATTAGCATTnAAATGGTAATCTGAAATAATTGATCAGTTAAAGAAGGC 927

GCTGTCCTGAAAGGTTTGGCTGAAAAAAAATCACTTTCAGGTGTTTTCCTCCAAAAAATG 987

ATTTTAAAATCVTACTGCCCCGTTTGTGTTAGCTGTGAAGTACTCTGGAACTCAGTCAAT 1047

TGCTGAGATTTTGTACGAGTTATAAGCTGGCTTATATTTAAAAAATTTTTTTGTTTTTGT 1107

TTTATGAGTTTCTTTTAAAATGTTATTTATGGTTAATTAAAATAGTTTTTGCATTTTAAA 1167

TATTTTATTATTTGTCCAAAATTTAGCTATTTTAATTATAGTTGGAGCTCTCTTTTAGAG 1227

CTGACATAAGACCATAGGGGAGGCACAGATAGATGTGATGGAGCCCTGTACCAGACGGGG 1287

GCAGTATCTTATAGTGGGTTGCCTTTGCTGATCTTTTTACTAGACTTGAAATTATTTGCT 1347

TTTCCTTCCTATGGTTATTTGGGACTATTGAAGTATCACCAGCCCTGTTGAGTTCATCTG 1407

TAATATTGTAATTCAAGGGTTACACTAGAAAATAAGAAAGCTAAAACAGCACGATAATCT 14 67

TTGGCTACATCCAACACAATAGCTTTTGGGAATACTTATTGTTAGAACTAAACAGAGGGT 15 27

TGAAAAGAAAATCAGTGAATACTGTCAGCATCTGAGTTCAATAAAACGTGAAGTACATTT 1587

20

Αβη Ala

TTAGGGCAATTCATGGACTAATTGTAAACCAAGTTTTCCTTCCTTTTTCAG AAC GCA 1644

25 30 35

Arg Αβη Pro Αβρ VaI GIy Asp GIy GIy Pro Leu Phe Leu Aep Tie

AOA AAC CCA GAT GTA GGG GAT GGT GGG CCT CTT TTC CTG GAT ATC 1689

Fin. la

40 INTRON2

Leu Lys Asn Trp Lye GIu

TTG AAG AAC TGG AAA GAG GTAAGCTAAGTATTTCCATTTGGTTGATTTTCCTGT 1743

TGCTTATTTTCTGGTGGATGAATTCACACCAACCTCTCTTTGTGCTCTTTTCTCCCTAG 1802

45 50 55

Asp Ser Asp Lys Lys He. Tie Gin Ser Gin Tie VaI Sec Phe Tyr

GAT AGT GAC AAA AAA ATA ATT CAG AGC CAA ATC GTC TCC TTC TAC 1847

60 65 70

Phe Lye Leu Phe GIu Asn Leu Lys Asp Asn Gin VaI Tie Gin Lys

TTC AAA CTC TTT GAA AAC TTG AAA GAT AAC CAG GTC ATT CAA AAG 18 9 2

75 80 85

Ser Met Asp Thr He Lys GIu Asp Leu Phe VaI Lys Phe Phe Asn

AGC ATG GAC ACC ATC AAG GAG GAC CTG TTC GTT AAG TTC TTT AAC 1937

90 95 100

Ser Ser Thr Ser Lys Leu GIu Asp Phe Gin Lys Leu He Gin He

AGC AGC ACC AGC AAG CTG GAA GAC TTC CAA AAG CTG ATT CAG ATT 198 2

INTRON Pro

CCG GTGAGGAGATCTTAATTCTT'fCTTTGGTTTCATTACAGAGGTTCTTGCAAAGTGCT 2041

TACGTCCCAGAAAGTAGAAATGAACTATGAAATGAACCCGTGGCCAAAACTCCTCCTTCC 2101

TAATTCCATTTGTGCTTTGAGAGACTTTGCTAAGTCAGTATGGGAATCATTTAAATTTGT 2161

GATTTGGGGAAATGCTGGCACTATGACTACTGCACAAAGGCAGGTGAAGGGACAAATCCA 2221

GTGAGGAGGGGGCAGTGAAGAAGTGGAGGGGAGTCTGGAGAAGCAGGTCTCTCCTTGCCC 2281

CTTGTTCGTGAGATGAAATCCTCCTGCTTTGGATGGGAGGCTGCGTGTCTTGGTGGAAAG 2341

AGCAGTGGGAGGACGGAGAAGATTTGTGCTCCTCCCAGCTCAGCCACCAAGAAACTGTGA 2401

CCTCAGATGAATCACAGGCCTGGCTGGGGCTCAGTTTCCTCATCTTAAAAGAGGCCTATT 2461

GGGTTCACTAAAATTTCTATGATCTTCTTTGCTCTATAATCCTACAATTCTGTGGACAGA 2521

AAATGAAATGAGGTAGGAGAAAGAAATAGCCTTTGAAGAGGTTCTTGGGCATTCCACTGC 2581

CAGGCTCTGGTCAACCTTCATACTCTGCAGCCCAAGAAGAGGCAAGACCATTTGTCTGTT 2641

TTTGGAAATGCAAATAGGCGGCATTTATACCTCACGAAAGAACTGTTCTGTCAACTTTTG 2701

GATACTGGGCTATCTTGGCTGGAGAAATCCTTAGGCTCCCAAACTTTCTCTCATGAAATT 2761

GTCTTGAGTCTTTAAATTTATGGCTTCTCGAAGCTGAGAGATAACTTTAAGCATAAAGAC 28 21

AAATTACATTTTCCAACATTTTGTCTAAGAGACAAAGACCTCCACATGCCTTTGGGTTTG 2881

GCCTGGATCTAAATGGGCTTGAATGAGAAGGGGAGGGTGTTGTTATGACTATGTTTAGAA 2941

GAGAAAACAGAGGTTTGGAGAGGTTAAGTGGCTGGTTCAAAGTCAGAGTTATTGCACACA 3001

CAGGATTCGAACCCATATGTTTTGTCCCTCCACTTTAGGGTTCTTTTCGCTACATAATTT 3061

TGAGAATTCTGTACCAGTCAATTTAAGGATGTGTGATGTTCCCCATCCTATTACAGCACA 3121

ACCAGCAATTTAATTATAATTTTAGTCTTAACTGCTGAAGAAAGCAGCATTACATATTAA 3181

GCTAACATATTCCTGGTGAAAGCAACTTTTTCAAAGGAATATTTCTATTTTCATGGACCA 3 241

TGACAGTAGCACAGCCTGATGGCTTGTATGCCTGAAACTAATTTTGCTGTTTTCTTTCCC 3 301

105 HO 115

VaI Asn Asp Leu Lys VaI Gin Arg Lys Ala He Ser GIu Leu

AATAG GTA AAT GAT CTG AAG GTC CAG CGC AAA GCA ATA AGT GAA CTC 3 34 8

120 125 130

He Lye VaI Met Asn Asp Leu Ser Pro Lye Ala Asn Leu Arg Lys

ATC AAA GTG ATG AAT GAT CTG TCG CCC AAA GCT AAC CTG AGG AAG 3 393

Fig. Ib

-ro- Co

EqIFN-gamma (Lambda Eq- 2 BamHI-fcagment)

GGATC 5

CCACAAGAATGGCACGGGTGGGCATAATGGGTCTGTCTCATCGTCAAAAGACCCAAGGAG 6 5

TTGAAAGGAAACTCTAACTACAACACCAAAATGCCACAAAACCATAGTTATTAATACAAA 125

CTAACTAGCATCTGTGCCTATCTGTCACCATCTCATCTGAAAAAACTTGTGAAAATACGT 18 5

AATCCTGATGAGACTTCAATTAGGTATAAAAACCAGCCCCAGAAGGCGAGGCAGTACACT 245

CTTCTGATCGCCGGTAGGGCAGCTATTAGAAAAGAAAGATCAGCTGAGGCCTTGGGACCT 305

GATCAGCTTAGTACAGAAGTGACTGCTTTCAACTACTTAGGCCTAACTCTCTCCGAAACA 3 65

-20 -15 -10

Met Asn Tyr Thr Sec Phe lie Leu Ala Phe Gin Leu Cye Ala Tie

ATG AAT TAT ACA AGT TTT ATC TTG GCT TTT CAG CTG TGT GCG ATT 410

-5 -11 5 10

Leu GIy Ser Sec The Tyc Tyc Cys Gin Ala AIa Phe Phe Lys GIu

TTG GGT TCT TCT ACC TAT TAC TGC CAG GCC GCG TTT TTT AAA GAA 455

lie GIu Asn Leu Lye GIu Tyc Phe

ATA GAA AAC CTA AAG GAA TAT TTT GTAAGTATGACCTTTTAATAATACTTAC 507

INTRON 1

TTGTGGTTGAAATGACTGAACGTTGTCTTGGAGTTGGATCTCTGATAGGCTGTCCTCTCT 567

ACTCCACAGTCATCTTGAGAAGACTGGGTGTTATTTTCTCTGTTTGTTGACTGGATGAGT 6 27

TTTTCTTTTTTTTACTAAATGATCTAGATATTGCTTTAACCCTCTGCTCAATTTGCTATA 687

GAGACTTAGAGAGGGTTCATGAATCTTCCAAAAGATGGGCTTAACAGGTTTATAAAGCAT 747

AGTGAAGTTGACAATTTTGTGGTGAGAAGCCACTGAATTGTGATAAGTCAAGTAGTGTGG 907

ACATTGAAAAAiVTGACTAGCTATTAGTTTCTAACTTCTCAGGTTACTATGATGGTGACAA 867

TAAAAGGTCAA(IATTAGCATTAAAATGGTAATCTGAAATAATTGATCAGTTAAAGAAGGc 9 27

GCTGTCCTGAAAGGTTTGGCTGAAAAAAAATCACTTTCAGGTGTTTTCCTCCAAAAAATG 987

ATTTTAAAATCVTACTGCCCCGTTTGTGTTAGCTGTGAAGTACTCTGGAACTCAGTCAAT 1047

TGCTGAGATTTTGTACGAGTTATAAGCTGGCTTATATTTAAAAAATTTTTTTGTTTTTGT 1107

TTTATGAGTTTCTTTTAAAATGTTATTTATGGTTAATTAAAATAGTTTTTGCATTTTAAA 1167

TATTTTATTATTTGTCCAAAATTTAGCTATTTTAATTATAGTTGGAGCTCTCTTTTAGAG 1227

CTGACATAAGACCATAGGGGAGGCACAGATAGATGTGATGGAGCCCTGTACCAGACGGGG 1287

GCAGTATCTTATAGTGGGTTGCCTTTGCTGATCTTTTTACTAGACTTGAAATTATTTGCT 1347

TTTCCTTCCTATCGTTATTTGGGACTATTGAAGTATCACCAGCCCTGTTGAGTTCATCTG 1407

TAATATTGTAATTCAAGGGTTACACTAGAAAATAAGAAAGCTAAAACAGCACGATAATCT 1467

TTGGCTACATCCAACACAATAGCTTTTGGGAATACTTATTGTTAGAACTAAACAGAGGGT 1527

TGAAAAGAAAATCAGTGAATACTGTCAGCATCTGAGTTCAATAAAACGTGAAGTACATTT 1587

20

Asn AIa

TTAGGGCAATTCATGGACT7\ATTGTAAACCAAGTTTTCCTTCCTTTTTCAG AAC GCA 1644

25 30 35

Acg Asn Pro Asp VaI GIy Asp GIy GIy Pco Leu Phe Leu Asp Tie

AGA AAC CCA GAT GTA GGG GAT GGT GGG CCT CTT TTC CTG GAT ATC 1689

Fig. la

40 I N T R O N 2:

Leu Lye Asn Trp Lys GIu

TTG AAG AAC TGG AAA GAG GTAAGCTAAGTATTTCCATTTGGTTGATTTTCCTGT 1743

TGCTTATTTTCTGGTGGATGAATTCACACCAACCTCTCTTTGTGCTCTTTTCTCCCTAG 1802

45 50 55

Asp Set Asp Lys Lys He. Tie GIn Ser Gin Tie VaI Ser Phe Tyr

GAT AGT GAC AAA AAA ATA ATT CAG AGC CAA ATC GTC TCC TTC TAC 1847

60 65 70

Phe Lys Leu Phe GIu Asn Leu Lys Asp Asn Gin VaI He GIn Lys

TTC AAA CTC TTT GAA AAC TTG AAA GAT AAC CAG GTC ATT CAA AAG 189 2

75 80 85

Ser Met Asp Thr He Lys GIu Asp Leu Phe VaI Lys Phe Phe Asn

AGC ATG GAC ACC ATC AAG GAG GAC CTG TTC GTT AAG TTC TTT AAC 1937

90 95 100

Ser Ser Thr Ser Lys Leu GIu Asp Phe GIn Lys Leu Tie Gin He

AGC AGC ACC AGC AAG CTG GAA GAC TTC CAA AAG CTG ATT CAG ATT 198 2

INTRON Pro

CCG GTGAGGAGATCTTAATTCTTTCTTTGGTTTCATTACAGAGGTTCTTGCAAAGTGCT 2041

TACGTCCCAGAAAGTAGAAATGAACTATGAAATGAACCCGTGGCCAAAACTCCTCCTTCC 2101

TA ATTCC ATTTGTGCTTTG AG AGACTTTGCi¹A AGTCAGTAI¹GGGAATCATTTAA ATTTGT 2161

GATTTGGGGAAATGCTGGCACTATGACTACTGCACAAAuGCAGGTGAAGGGACAAATCCA 2 221

GTGAGGAGGGGGCAGTGAAGAAGTGGAGGGGAGTCTGGAGAAGCAGGTCTCTCCTTGCCC 2281

CTTGTTCGTGAGATGAAATCCTCCTGCTTTGGATGGGAGGCTGCGTGTCTTGGTGGAAAG 2341

AGCAGTGGGAGGACGGAGAAGATTTGTGCTCCTCCCAGCTCAGCCACCAAGAAACTGTGA 2401

CCTCAGATGAATCACAGGCCTGGCTGGGGCTCAGTTTCCTCATCTTAAAAGAGGCCTATT 2461

GGITTCACTAAAATTTCTATGATCTTCTTTGCTCTATAATCCTACAATTCTGTGGACAGA 25 21

AAATGAAATGAGGTAGGAGAAAGAAATAGCCTTTGAAGAGGTTCTTGGGCATTCCACTGC 2581

CAGGCTCTGGTCAACCTTCATACTCTGCAGCCCAAGAAGAGGCAAGACCATTTGTCTGTT 2641

TTTGGAAATGCAAATAGGCGGCATTTATACCTCACGAAAGAACTGTTCTGTCAACTTTTG 2701

GATACTGGGCTATCTTGGCTGGAGAAATCCTTAGGCTCCCAAACTTTCTCTCATGAAATT 2761

GTCTTGAGTCTTTAAATTTATGGCTTCTCGAAGCTGAGAGATAACTTTAAGCATAAAGAC 28 21

AAATTACATTTTCCAACATTTTGTCTAAGAGACAAAGACCTCCACATGCCTTTGGGTTTG 2881

GCCTGGATCTAAATGGGCTTGAATGAGAAGGGGAGGGTGTTGTTATGACTATGTTTAGAA 2941

GAGAAAACAGAGGTTTGGAGAGGTTAAGTGGCTGGTTCAAAGTCAGAGTTATTGCACACA 3001

CAGGATTCGAACCCATATGTTTTGTCCCTCCACTTTAGGGTTCTTTTCGCTACATAATTT 3061

TGAGAATTCTGTACCAGTCAATTTAAGGATGTGTGATGTTCCCCATCCTATTACAGCACA 31.21

ACCAGCAATTTAATTATAATTTTAGTCTTAACTOCTGAAGAAAGCAGCATTACATATTAA 3181

GCTAACATATTCCTGGTGAAAGCAACTTTTTCAAAGGAATATTTCIATTTTCATGGACCA 3 241

TGACAGTAGCACAGCCTGATGGCTTGTATGCCTGAAACTAATTTTGCTGTTTTCTTTCCC 3 301

105 HO 115

VaI Asn Asp Leu Lye VaI GIn Arg Lys Ala He Ser GIu Leu

AATAG GTA AAT GAT CTG AAG GTC CAG CGC AAA GCA ATA AGT GAA CTC 3 348

120 125 130

He Lye VaI Met Asn Asp Leu Ser Pro Lys AIa Asn Leu Arg Lys

ATC AAA GTG ATG AAT GAT CTG TCG CCC AAA GCT AAC CTG AGG AAG 3 393

Fig. Ib

IGV7

135 140 145

Arg Lys Arg Ser Gin Asn Pro Phe Arg GIy Arg Arg Ala r.eu Gin

CGG AAG AGG AGT CAG AAT CCA TTT CGA GGC CGG AGA GCG TTG CAA 3438

TAG TGGTCATCCTGCCTGCAATATTTGAATTTTTAAATCTAAATCTATTTATTAATATT 3497

TAATATTTTACATTATTTATATGGGGAATATATTTTTAAACTCATCAAAGTATTTATAAT 3557

AGCAACTTTTATGTAATGAAAATGGGTATCTATTAATATATATATTATTTATAATTCCTG 3 617

TATGGTGTGACTATTTCACTTGACCCTTTTTTTTCTGACCAACTAGGCAAGATTATGTGA 3 677

TTACAAGGCTTTAACTCAGGGGCCAACTAGGGAGTGGGTAGCCGACCTACCAAGACCCTG 3737

TGAGCTGTGTGTTTATTTCCCTCAATGATACAATGAACACTTATAAAGGAAAGGAGGGCC 3797

TCCAGTCACTGCCTGTTGGAGAACATGTCTGCATTGTGAGCCACTGCTTAATGGCATGTC 3857

AAACCACGCTTGAATGTGTCAGATGATAGGGCTTGTCCCCTGATAAAGCTTAGTATCTCC 3917

TCTCATGCCTAGTGCTTCAGAATATTGTTGACAACTGTGACTGCACCCAAATGGAAAGTA 3 977

ATTTATTTGTTTAGTTTACCAATATTTAATAAATATGAATAAAGTATAATTTCATAACTA 4 037

TTTATGCTGCGTCCGGCTTTTTCTAAGTGAGGACTGGGGTAAATGAACTACAAACTAATG 4097

AATCAGTAAGAGGGAACTCGTTTTTAGCGGTGGAAATCTTAGCTGGATTAAGCCCCATGA 4157

AACGTGGTATTTCTCTCCACTGGAGATTTGTTGGCTACTACTCCTCCATGTAGCAGCTCT 4 217

TTATCTTTCCAAAATATAAATTTAATTATGTCACCATTTACTTCAGAGCTTCTGCGATGG 4 277

AAAGTAGTTCAAATAGTTTAGCTTAGCACACAAAGCTTTGTTTCTCCCTCCTCCCTCAAC 4 337

TCTGCACTGTGCTCTTCATCTTGGTGTCCCCACGTCCTCTGTCCACTTCGGGCAAACCAC 4 397

CGGGAATGTCATGGTGAGGGTGAGCTCTAGGGAGAGAGGGCTGGATTAGAATTTCGGCCC 4457

CACCATTACCAGTAGTATGACCTTTAATGAATTACTTGTATTCTCTAAGCTCCAGTTTCC 4 517

TCATCTGACACAAGAGAATAATTGTGCCTAAAATTGTGGTGAGAGTTTGTTCTTTCACTC 4 577

AAGAAGTGTTTACTGGAGCATCCACTAGTTGCCTAGTGCTGTTCTAGGCACTTGAGATAC 4637

ATTTGTGAACAAAATAGTCAAGGATCC 4 664

Fig. Ir:

GAMMA-INTERFERON

Sl

SlO

S20

MUMAN MKYTSYILAFQLCIVLGSLG

t-.yUINE MNYTSFILAFQLCAILGSST

iiÜV.'KE MKYTSYFLALLLCGLLGFSG

HURlNE MNATHCILALQLFLMAV-SG

HAT MSATRRVLVLQLCLMAL-SG

CYCQDPYVKE YYCQAAFFKE SYGQGQFFRE CYCHGTVIES CYCQGTLIES

2ü

AENLKKYFNA IENLKEYFNA IENLKEYFNA LESLNNYFNS LESLKNYFNS

30

GHSDVADNGT RNPDVGDGGP SSPDVAK6GP SGIDV-EEKS SSMDAMEGKS

40

LFLGILKNWK LFLDiLKNWK

lfsdilknwk lfloiwrnwq llldiwrnwq

50

eesdrkimqs edsdkkiiqs

DESOKKIiQS

kdgdmkilqs kdgntkiles

60

QIVSFYFKLF QIVSFYFKLF QIVSFYFKLF QIISFYLRLF QIISFYLRLF

KNFKDDQSIQ ENLKDNQVIQ ENLKDNQVIQ EVLKDNQAIS EVLKDNQAIS

. ONSENSUS M--T---La--LC Sg -Ycq -E-Lk-YFN Dv^ LfldI--NW d-KI-qS QI-SFY--LF e-lKDnQ-I-

MUMAN ti QUINE »UV INE MURINE KAT

80 90 100 110 120 130 140 150

1 I I I I 1 I I

KSVETIKEDM NVKFFNSNKK KRODFEKLTfJ YSVTDLNVQR KAIHELIQVM AELSPAAKTG KRKP.SQMLFR GRRAFQ KSMDTIKEDL FVKFFNSSTS KLEDFQKLIQ IPVNDLKVQI? KAISELIKVM NDLSPKANLR KRKRSQNPFR GRRALQ RSMDlIKQDM FQKFLNGSSE KLEDFKKLIQ IPVDDLQIQR KAINELIKVM NDLSPKSNLR KRKRSQNLFR GRRASM NNISVIESHL ITTFFSNSKA KKDAFMSIAK FEVNNPQVQR QAFNELIRVV HQLLPESSLR KRKRSRC NNISVIESHL ITNFFSNSKA KKDAFMSIAK FEVNNPQIQH KAVNELIRVI HQLSPESSLR KRKRSRC

CUNSENSUS

1 Ff-S-- K---F --V Qr kA--ELI-V LsP—Ir KRKRS---FR GRRA--

15 10 15

Tyr Tyr Cye Gin AIn Ala Phe Phe Lye GIu lie GXj Asn Leu Lye GIu Tyr

I ( Ib)

5'- TAC TAC TGC CAG GCT GCT TTC TTT AAA GAA ATC BAA AAC CTG AAA GAA TAC 3'- ATG ATG ACG GTC CGA CGA AAG AAA TTT CTT TAG CTT TTG GAC TTT CTT ATG

I ( 16)

I , (2)

Anal 11

20 25 30 35

Phe Asn Ala Arg Αβη Pro Asp VaI GIy Asp GIy CiIy Pro Leu Phe Leu Asp lie

( ι) 1 I ( 3)

TTC AAC GCT CGT AAC CCA GAC GTT GGT GAC GGT COT CCG CTG TTC CIG GAC AIC AAG TTG CGA GCA TTG GGT CTG CAA CCA CTG CCA COA GGC GAC AAG GAC CTG TAG

_(16) α ι (4) —:

-(2) -4 Avail

40 45 50

Leu Lyg Asn Trp Lye GIu Asp 5er Asp Ly9 Lye lie lie Gin 5er Gin lie VaI

( 3) 1 I ( 5)

CTG AAA AAC TGG AAA GAA GAC TCT GAC AAA AAG ATC ATC CAG TCT CAG ATC GTT GAC TTT TTG ACC TTT CTT CTG AGA CTG TTT TTC TAG TAG GTC AGA GTC TAG CAA (4) 1 I (6)

55 60 65 VO

Scr Phe Tyr Phe Lye Leu Phe GIu Αβη Leu Lye Αβρ Aen Gin VaI lie Gin Lys

( 5) 1 I , ( 7)

TCT TTC TAC TTC AAA CTG TTC GAA AAC CTG AAA GAC AAC CAG GTT ATC CAG AAA AGA AAG ATG AAG TTT GAC AAG CTT TTG GAC TTT CTG TTG GTC CAA TAG GTC TTT (6) 1 I (Θ)

75 ΘΟ Θ5

Ser Met Asp Thr lie Lye GIu Asp Leu Phe Ve). Lye Phe Phe Asn öer Ber Thr

(?) : 1 MS)-

TCG ATG GAC ACT ATC AAA GAA GAT CTG TTC GTT AAA TTC TTC AAC TCG fCG ACT AGC TAC CTG TGA TAG TTT CTT CTA GAC AAG CAA TTT AAG AAG TTG AGC AGC TGA

__ ( Θ) 1 M 10)

CJIoI

BaIIl

Sail

90 95 100 105

Ber Lye Leu GIu Aep Ph« Gin Lye Leu lie Gin Ils Pro VaI Asn Asp Leu Lys

( 9) 1

TCT AAA CTG GAA GAC TTC CAG ΛΑΑ CTG ATC CAG ATC CCA GTT AAC GAC CTG AAA AGA TTT GAC CTT CTG AAG GTC TTT GAC TAG GTC T/>3 GGT CAA TTG CTG GAC TTT „ t \n\

—————— *—' V ' W/ ™

110 115 120 125

Gin Ar_ Lys Ale He Ser GIu Leu He Lye VeI Met Asn Asp Leu Ser Pro

( 1 1)

GTT CAG CGT AAG GCT ATC TCT GAA CTG ATC AAA OTT ATG AAC GAC CTG TCT CCA CAA GTC GCA TTC CGA TAG AGA CTT GAC TAG TTT CAA TAC TTG CTG GAC AGA GGi —(10) 1 I ( 12)

130 135 140

Lys Ale Asn Leu Arg Lys Arg Lye Arg Ser GIn Aan Pro Hhe Arg GIy Arg Arg

-4 11) 1 I ( 1 3)

AAA GCT AAC CTG CGT AAA CGT AAA CGT TCT CAG AAC CCA TTC CGT GGT CGT CGT TTT CGA TTG GAC GCA TTT GCA TTT GCA AGA GTC TTG GGT AAG GCA CCA GCA GCA ( 12) 1 I 1 14)

145

Ale Leu GIn «»*

( ^ 3 j I

GCT CTT CAG TAA C? -3' CGA GAA GTC ATT CCTAG -5'

BamMI

442 446

Fig. 3

i 'j Ii) IL-

Tyr Tyr Cys Gin Ala Ala Phe Pne Lys GIu He GIu Asn Leu Lys GIu Tyr Phe

eq TAT TAC TGC CAG GCC GCG TTT TTT AAA GAA ATA GAA AAC CTA AAG GAA TAT TTT w * * * * * * * *

syn TAC TAC TGC CAG GCT GCT TTC TTT AAA GAA ATC GAA AAC CTG AAA GAA TAC TTC

20 25 30 35

Asn Ala Arg Asn Pro Asp VaI GIy Asp GIy GIy Pro Leu Phe Leu Asp He Leu

eq AAC GCA AGA AAC CCA GAT GTA GGG GAT GGT GGG CCT CTT TTC CTG GAT ATC TTG

syn AAC GCT CGT AAC CCA GAC GTT G3T GAC GGT GGT CCG CTG TTC CTG GAC AVo CTG

40 45 50

Lys Asn Trp Lys GIu Asp Ser Asp Lys Lys lie lie Gin Ser Gin lie VaI Ser

eq AAG AAC TGG AAA GAG GAT AGT GAC AAA AAA ATA ATT CAG AGC CAA ATC GTC TCC

syn AAA AAC TGG AAA GAA GAC TCT GAC AAA AAG ATC ATC CAG TCT CAG ATC GTT TCT

55 60 65 70

Phe Tyr Phe Lys Leu Phe GIu Asn Leu Lys Asp Asn Gin VaI lie Gin Lys Ser eq TTC TAC TTC AAA CTC TTT GAA AAC TTG AAA GAT AAC CAG GTC ATT CAA AAG AGC

syn TTC TAC TTC AAA CTG TTC GAA AAC CTG AAA GAC AAC CAG GTT ATC CAG AAA TCG

75 80 85 90

Met Asp Thr lie Lys Glu Asp Leu Phe VaI Lys Phe Phe Asn Ser Ser Thr Ser

eq ATG GAC ACC ATC AAG GAG GAC CTG TTC GTT AAG TTC TH AAC AGC AGC ACC AGC

syn ATG GAC ACT ATC AAA GAA GAT CTG TTC GTT AAA TTC TTC AAC TCG TCG ACT TCT

95 100 105

Lys Leu GIu Asp Phe 61 η Lys Leu He Gin He Pro VaI Asn Asp Leu Lys VaI

eq AAG CTG GAA (sAC TTC CAA AAG CTG ATT CAG ATT CCG GTA AAT. GAT CTG AAG GTC

syn AAA CTG GAA GAC TTC CAG AAA CTG ATC CAG ATC CCA GTT AAC GAC CTG AAA GTT

110 115 120

Gin Arg Lys Ala lie Ser GIu Leu lie Lys VaI Met Asn Asp Leu Ser Pro Lys

eq CAG CGC AAA GCA ATA AGT GAA CTC ATC AAA GTG ATG AAT GAT CTG TCG CCC AAA

syn CAG CGT AAG GCT ATC TCT GAA CTG ATC AAA GTT ATG AAC GAC CTG TCT CCA AAA

130 135 140

AIa Asn Leu Arg Lys Arg Lys Arg Ser GIn Asn Pro Phe Arg GIy Arg Arg AIa

eq GCT AAC CTG AGG AAG CGG AAG AGG AGT CAG AAT CCA TTT CGA GGC CGG AGA GCG

syn GCT AAC CTG CGT AAA CGT AAA CGT TCT CAG AAC CCA TTC CGT GGT CGT CGT GCT

	145	GIn	***
	Leu	CAA	TAG
eq	TTG	*	*
	* *	CAG	TAA
syn	CTT

Fig.

Codon Verwendung von reifem EqlFN-gamroa: natürliches Gen

(synthetisches Gen)

	6	T	Phe	0	C	Ser	2	A	Tyr	0	G	Cys	T
	6	( υ	Phe	1	(7)	Ser	2	( 0)	Tyr	1	(0)	Cys	C
T	O		Leu	0	(0)	Ser	0	( 4)	STOP	0	(1)	STOP	A
	3	( O)	Leu	1	(0)	Ser	1	( 1)	STOP	1	(0)	Trp	G
	1	( 0)	Leu	1	(3)	Pro	0	( 0)	H1S	0	(1)	Arg	T
	2	( υ	Leu	1	(0)	Pro	0	( 0)	H1S	. 1	(8)	Arg	C
C	1	( 0)	Leu	2	(0)	Pro	4	( 0)	GIn	1	(0)	Arg	A
	7	( O)	Leu	1	(4)	Pro	6	( 0)	Gin	2	(0)	Arg	G
	4	(13)	He	0	(1)	Thr	3	(10)	Asn	3	(0)	Ser	T
	4	( 0)	He	2	(2)	Thr	8	( 0)	Asn	5	(0)	Ser	C
A	3		He	0	(0)	Thr	9		Lys	2	(0)	Arg	A
	2	( 0)	Met	0	(0)	Thr	10	(17)	Lys	2	(0)	Arg	G
	1	( 2)	Val	1	(0)	AIa	7	( 2)	Asp	1	(0)	GIy	T
	3	( 7)	Val	1	(6)	AIa	4	( 1)	Asp	1	(4)	GIy	C
G	2	( 0)	VaI	2	(0)	AIa	6	(10)	GiU	0	(0)	61 y	A
	1	( 0)	Val	2	(0)	AIa	2	( 8)	GiU	2	(0)	GIy	G
	( 0)		(0)		( 0)		(0)

Fig. 5

1*1

χ Hind IS"

MO

μ H in β/Μ * Soll

4.

Insert

t-4

31

H EiIFNt

ρβΝ 20

Taj. 7

Claims

- rs - ZG γ 70(,

. 1 NTRON 2-

TTG AAG MC TGG AAA GAG GTMGCTMGTATTTCCATTTGGTTGATTTTCCTGT

TGCTTATTTTCTGGTGGATGMTTCACACCMCCTCTCTTTGTGCTCTTTTCTCCCTAG

enthält, wobei R*

ATG AAT TAT ACA AGT TTT ATO TTG ^CT TTT CAG CTG TGT GCG ATT TTG GGT TCT TCV ACC TAT,

ATG TAT oder TAT,

R²

ATG AAT TAT ACA AGT TTT ATC TTG GCT TTT CAG CTG TGT GCG ATT TTG GGT TCT TCT ACC CAG,

ATG CAG oder CAG,

bedeutet, daß es für ein oder mehrere Tripletts andere Tripletts enthält, die für dieselbe Aminosäure codieren, daß es komplementäre Nukleotide enthält oder daß es die aus diesen Komplementen zusammengesetzte Doppelstrang-DNA ist.

1. Verfahren z-ir Herstellung der Polypeptide (Pferde-Interv eror.-üamma), dadurch gekennzeichnet« daß

o) sin geeigneter "Virtsorganismus, vorzugsweioe ein Wirtevrganisi.us, mit ^e.isfiechen Informationen; coriierarid für dieso Polypeptide, vorzugsweise mit rekombinanten CNA-Mo "ι. e !< O.'-. j,¹ ι transformierte

b) der transformierte Wirtsorganismus in einem geeigneten Kulturmedium kultiviert und

c) das besagte Polypeptid isoliert wird.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß ein Polypeptid in im wesentlichon reiner Form, hergestellt wird, das die biologischen und immunologischen Eigenschaften von EqlFN-gamma aufweist und gegebenenfalls frei von nativer Glykosilierung vorliegt«
3. Verfahren nach Anspruch l_f dadurch gekennzeichnet, daß das Polypeptid die Aminosäuresequenz der Formel

X Gin Ala AIa Phe Phe Lys GIu lie GIu Asn Leu Lys GIu Tyr Phe Asn Ala Arg Asn Pro Asp VaI GIy Asp Gly Gly Pro

Leu Phe Leu Asp lie Leu Lys Asn Trp Lye Glu Asp Ser Asp Lys

Lys Ι3.Θ lie Gin Ser Gin lie VaI Ser Phe Tyr Phe Lys Leu Phe

Glu Asn Leu Lys Aep Asn Gin VaI He Gin Lys Ser Met Asp Thr

He Lys Glu Asp Leu Phe VaI Lys Phe Phe Asn Ser Ser Ihr Ser

Lys Leu Glu Asp Phe Gin Lys Leu He Gin He Pro VaI Asn Asp

Leu Lys VaI Gin Arg Lys Ala He Ser Glu Leu He Lys VaI Met

Asn Asp Leu Ser Pro Lys Ala Asn Leu Arg Lys Arg Lys Arg Ser Gin Asn Pro Phe Arg Gly Arg Arg AIa Leu Gin

enthält, wobei

X für Was8ürs-,;of V, Leader Tyr Tyr Cys-, Loader-, Met Tyr Tyr Cya-, H-'i'yr Tyr Cys- oder Met- steht.
4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Polypeptid von DNA-Mc J ^kCsIa codiert wird.
5. Verfohren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, day DNA-Molekül die Nukleotide

R¹ TAC TGC CAG GCC GCG TTT TTT AAA

_ 1 \\ ·,- R ο N 1

ΑΓΑ ÜAA AAC CTA AAG GAA TAT TTT G1AAGTATGACCTTITAATAATACTTAC ttgtgüttgaaatgactgaacgttgtcttggagttggatctctgataggctotcctctct actccacagtcatcttgagaagactgggtgttattttctctgtttgttgaotggatgagt ttttcttttttttactaaatgatctagatattgctttmccctctgctcaatttgctata gagacttagagagggttcatgaatcttccaaaagatgggcttaacaggtttataaagcat agtgaagttgacaattttgtggtgagaagccactgaattgtgataagtcaagtagtgtgg acattgaamaatgactagctattagtttotaacttctcaggttactatgatggtgacaa TAAMGGTCAAGATTAGCATTAAAATGGTAA. i'CTGAMTAATTGATCAGTTAMGAAGGC gctgtcctgaaaggtttggctgaaaaaaaatcactttcaggtgttttcctccaaaa^atg attttaaaatcttactgccccgtttgtgttagctgtgaagtactctggaactcagtcaat tgctgagattttgtacgagttatmgctggcttatatttmmaatttttttgtttttgt tttatgagtttcttttmaatgttatttatggttaattaaaatagtttttgcattttam tattttattatttgtccaaaatttagctattttaattatagttggagctctcttttagag ctgacataagaccataggggaggcacagatagatgtgatggagccctgtaccagacgggg gcagtatcttatagtgggttgcctttgctgatctttttactagacttgamttatttgct tttccttcctatggttatttgggactattgmgtatcaccagccctgttgagttcatctg taatattgtmttcaagggttacactagaamtaagamgctmaacagcacgataatct ttggctacatccaacacmtagcttttgggaatacttattgttagmctmacagagggt tgaamgaamtcagtgmtactgtcagcatctgagttcaataaaacgtgmgtacattt

ttagggcaattcatggactmttgtmaccaagttttccttcctttttcag aac gca aga mc cca gat gta ggg gat ggt ggg cct ctt ttc ctg gat atc
6. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß ein DNA-Molakül mit einem DNA-Molekül nach einem der Ansprüche 4 bis 5 unter Bedingungen, die eine Homologie größer als 85 %, vorzugsweise größer als 90 % erkennen lassen, hybridisiert, wobei dieses DNA-Molekül natürlichen synthetischen oder halbsynthetischen Ursprungs sein kann und mit dem DNA-Molekül nach einem der Ansprüche bis 4 Mutation, Nukleotid-Substitutionen, Nukleotid-Deletionen, Nukelotid-Insertionen und Inversionen von Nukleotiden verwandt sein kann und für ein Polyppptid mit der biologischen und immunologischen Aktivität von EqlFN-gamma codiert.

-79-
7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnete daß das DNA-Molekül der Formel EGl, EG2, EG3, EG4, EG5, EG6, EG7, EG8, EG9, EGlO₁ EGIl₄ EG12, EG13, EG14, EG15 oder EG16 entspricht, daß mindestens zwoi dieser DNA-Moleküle in beliebiger Kombination miteinander verknüpft sind oder daß ein oder mehrere Tripletts durch £<ndere i'ripletts ersetzt sind, die für dieselbe Aminosäure codieren.
8. Verfahren nach Anspruch 1» dadurch gekennzeichnet, daß das rekombinante DNA-Molekül ein DNA-Molekül nach einem der Ansprüche 4 bis 7 enthält oder daß es das Plasmid pAHlll ist.
9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß das rekombinante DNA-Molekül enthaltene DNA-Molekül in funktioneller Verknüpfung mit einer Expressionskontrollsequenz steht und daß es in Mikroorganismen, vorzugsweise in Prokaryoten und Eukarycten, insbesondere in E.coli und Saccharomyces cerevisiae oder in Säugetierzellen, insbesondere in Pferdezellen replizierbar ist oder daß es das Plasmid pEqG-QAAl, pEqG-QAA2 oder pEqG-QAA3 ist.
.10. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Wirtsorganismus mit einem rekombinanten DNA-Molekül nach einem der Ansprüche 8 oder 9 transformiert ist, wobei er vorzugsweise ein Prokaryot, insbesondere E.coli, besonders bevorzugt, E.coli OMlOl oder HBlOl, ein Eukaryot oder eine säugetierzellinie, insbesondere eine Pferdezellinie ist.

/ Stift w 2tt'tU