DD251789A5 - Verfahren zur Herstellung von Rekombinanten Pferde- und Hunde-Interferonen - Google Patents
Verfahren zur Herstellung von Rekombinanten Pferde- und Hunde-InterferonenInfo
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Abstract
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung von rekombinanten Pferde- und Hunde-Interferonen sowie die Interferone selbst. Beim erfindungsgemaessen Verfahren wird ein Wirtsorganismus, der z. B. die fuer die Pferde- oder Hunde-Interferone codierte Sequenz enthaelt oder eine Saeugetierzelle darstellt, mit genetischen Informationen, codierend fuer Pferde- oder Hunde-Interferone, transformiert, wobei die codierte Sequenz in einem Expressionsvektor, wie einem Expressionsplasmid, z. B. pAH52, enthalten ist, und diese Information zur Produktion dieses Pferde- oder Hunde-Interferons im Wirtsorganismus exprimiert. Das erhaltene Produkt wird auf die Gewinnung von Pferde- oder Hunde-Interferon weiterverarbeitet. Durch Reinigungs- und Isolationsschritte werden die gewuenschten Interferone erhalten. Die erfindungsgemaess erhaltenen Interferone werden in pharmazeutischen Praeparaten zur Antitumorbehandlung oder antiviraler Behandlung eingesetzt.
Description
Hierzu 28 Zeichnungen
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung von rekombinanten Pferde- und Hunde-Interferonen.
Interferone sind Proteine, die von eukaryotischen Zellen nach Virus-Infektion oder anderen Stimulationen sekretiert werden und ihrerseits die Zellen vor Virusinfektionen schützen können. Mittlerweile sind vier Klassen an Interferonen bekannt; bezeichnet werden sie mit Interferon-alpha, lnterferon-beta,lnterferon-omega und Interferon-gamma (abgekürzt: IFN-a, IFN-j3, IFN-ω und IFN-y). Sie unterscheiden sich in ihrem Aufbau und in ihren Wirkungen. So können Interferone regulierend die Zellen des Immunsystems oder auch die Differenzierung von Zellen und das Wachstum von Tumoren beeinflussen.
Lange Zeit war angenommen worden, daß die Interferone speziesspezifisch wirken. In-vitro-Versuche zeigten jedoch, daß IFN-Präparate von Rindern eine antivirale Wirkung beim Affen und beim Menschen auslösen können (32). Diese Speziesinteraktivität hängt möglicherweise mit der mehr oder weniger großen Homologie der Gene bzw. der Proteine zusammen; aufgrund der geringen Mengen an tierischen Interferonen konnte diese Annahme nicht überprüft werden.
Trotz der festgestellten Speziesinteraktivitäten sind Nebenwirkungen wie Antigenitäten bei der Anwendung speziesfremder Interferone zu erwarten, die für eine Therapie nicht zu tolerieren sind.
Da andererseits jedoch die Nutz-oder Haustierhaltung einen bedeutenden wirtschaftlichen Wert darstellt, besteht ein Bedarf an Interferonen für die verschiedenen Spezies, die der Veterinärmediziner anwenden kann.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung von rekombinanten Pferde- und Hunde-Interferonen sowie die Interferone selbst.
Interferone sind Proteine, die von eukaryotischen Zellen nach Virusinfektion oder anderen Stimulationen sekretiert werden und ihrerseits die Zellen vor Virusinfektionen schützen können. Mittlerweile sind vier Klassen an Interferonen bekannt; bezeichnet werden sie mit Interferon-alpha, Interferon-beta, Interferon-omega und Interferon-gamma (abgekürzt: IFN-a, IFN-/3, IFN-ω und IFN-7). Sie unterscheiden sich in ihrem Aufbau und in ihren Wirkungen. So können Interferone regulierend die Zellen des Immunsystems oder auch die Differenzierung von Zellen und das Wachstum von Tumoren beeinflussen.
Lange Zeit war angenommen worden, daß die Interferone speziesspezifisch wirken. In-vitro-Versuche zeigten jedoch, daß IFN-Präparate von Rindern eine antivirale Wirkung beim Affen und beim Menschen auslösen können (32). Diese Speziesinteraktivität hängt möglicherweise mit der mehr oder weniger großen Homologie der Gene bzw. der Proteine zusammen; aufgrund der geringen Mengen an tierischen Interferonen konnte diese Annahme nicht überprüft werden.
Trotz der festgestellten Speziesinteraktivitäten sind Nebenwirkungen wie Antigenitäten bei der Anwendung speziesfremder Interferone zu erwarten, die für eine Therapie nicht zu tolerieren sind.
Da andererseits jedoch die Nutz-und Haustierhaltung einen bedeutenden wirtschaftlichen Wert darstellt, besteht ein Bedarf an Interferonen für die verschiedenen Spezies, die der Veterinärmediziner anwenden kann.
Hochgereinigtes Tierinterferon der verschiedenen Spezies würde darüber hinaus die willkommene Gelegenheit bieten, die Wirkmechanismen für Interferone zu untersuchen, um zu Modell-vorstellungen zu kommen, die auf den Menschen zu übertragen
Die ersten Untersuchungen mit tierischen Interferonen wurden mit Präparationen aus natürlichem Zellmaterial durchgeführt; Ausbeute und Reinheit der nach diesem Verfahren hergestellten Interferone lassen sie als ungeeignet für die Herstellung von Arzneimitteln erscheinen.
Durch die Entwicklung der rekombinanten DNA-Technik ist es möglich, von Mikroorganismen heterologe Proteine produzieren zu lassen. So hergestellt wurden beispielsweise auch Human-Interferone (Hu-IFN); seit neuestem auch ein Rinder-alpha- und ein Rinder-beta-Interferon.
Ziel'der Erfindung ist es, ein Verfahren zu entwickeln, nach dem tierische Interferone hergestellt werden können, die für die Herstellung von Arzneimitteln geeignet sind.
Der Erfindung liegt die Auf gäbe zug runde, ein Verfahren zur Herstellu ng neuer Pferde-und Hunde-lnterferone(EqlFN und Ca IFN) und ihre gegebenenfalls N-glykosilierten Derivate zu entwickeln, außerdem die für diese Interferone codierenden Gensequenzen ebenso wie rekombinante Moleküle, die diese Sequenzen enthalten; Expressions-Vektoren wie Plasmide, mit den Sequenzen als Inserts und verschiedene Wirtsorganismen oder Kulturen, die die Herstellung der Pferde-Interferone ermöglichen, zu schaffen und insbesondere Pferde-Interferone und die sie codierenden Sequenzen der nachfolgenden Formeln:
1 | Asp | Leu | Pro | CJl | Thr | His | Ser | Leu | 10 | Asn | Thr | Arg | VaI | 15 |
Cys | GAC | CTG | CCT | His | ACC | CAT | AGC | CTG | GIy | AAC | ACA | AGG | GTC | Leu |
TGT | CAC | GGC | TTG | |||||||||||
Leu | Leu | GIy | 20 | Met | Arg | Arg | Me | 25 | Pro | Phe | Ser | Cys | 30 | |
Met | CTC | CTG | GGG | Gin | ATG | AGG | AGA | ATC | Ser | CCC | TTC | TCC | TGC | Leu |
ATG | CAA | TCC | CTG | |||||||||||
Asp | Arg | Asn | 35 | Phe | GIy | Phe | Pro | 40 | GIu | VaI | Phe | Asp | 45 | |
Lys | GAC | AGA | AAT | Asp | TTT | GGA | TTC | CCC | GIn | GAG | GTG | TTT | GAC | GIy |
AAG | GAC | CAG | GGC | |||||||||||
Gin | Phe | Arg | 50 | Pro | Gin | AIa | He | 55 | AIa | VaI | His | GIu | 60 | |
Asn | CAG | TTC | CGG | Lys | CCT | CAA | GCC | ATC | Ser | GCG | GTC | CAT | GAG | Thr |
AAC | AAG | TCT | ACG | |||||||||||
Gin | GIn | Me | 65 | His | Leu | Phe | Ser | 70 | Asp | GIy | Ser | Ser | 75 | |
Me | CAA | CAG | ATC | Phe | CAC | CTC | TTC | AGC | Thr | GAC | GGC | TCG | ' TCT | AIa |
ATC | TTC | ACA | GCC | |||||||||||
Trp | Asp | GIu | 80 | Leu | Leu | Asp | Lys | 85 | Tyr | Thr | GIy | Leu | 90 | |
Ala | TGG | GAC | GAG | Ser | CTC | CTA | GAC | AAA | Leu | TAC | ACT | GGA | CTC | Tyr |
GCC | AGC | CTC | TAT | |||||||||||
Gin | Leu | Thr | 95 | Leu | GIu | AIa | Cys | 100 | Ser | Gin | GIu | VaI | 105 | |
Gin | CAG | CTG | ACT | GIu | CTG | GAA | GCC | TGT | Leu | AGC | CAG | GAG | GTG | GIy |
CAG | GAG | CTG | GGG | |||||||||||
GIu | GIu | Thr | 110 | Leu | Met | Asn | GIu | 115 | Ser | Leu | Leu | AIa | 120 | |
VaI | GAA | GAG | ACG | Pro | CTG | ATG | AAC | GAG | Asp | TCC | CTG | CTG | GCT | VaI |
GTG | CCC | GAC | GTG | |||||||||||
Arg | Tyr | Phe | 125 | Arg | Me | AIa | Leu | 130 | Leu | GIn | GIu | Lys | 135 | |
Arg | AGA | TAC | TTC | GIn | AGA | ATC | GTC | CTC | Tyr | CTG | CAA | GAG | AAG | Lys |
AGG | CAA | TAT | AAA | |||||||||||
Ser | Pro | Cys | 140 | Trp | GIu | Me | VaI | 145 | AIa | GIu | lie | Met | 150 | |
Tyr | AGC | CCT | TGT | AIa | TGG | GAG | ATC | GTC | Arg | GCA | GAA | ATC | ATG | Arg |
TAC | GCC | AGA | AGA | |||||||||||
Phe | Ser | Ser | 155 | Thr | Asn | Leu | Pro | 160 | Ser | + | 165 | |||
Ser | TTC | TCT | TCA | Ser | ACA | AAC | TTG | CCG | GIn | AGT | TAA, | |||
TCC | TCC | CAG | Formell | |||||||||||
1 | Asp | Leu | Pro | CJl | Thr | His | Ser | Leu | 10 | Asn | Thr | Arg | VaI | 15 |
Cys | GAC | CTG | CCT | His | ACC | CAT | AGC | CTG | GIy | AAC | ACA | AGG | GTC | Leu |
TGT- | CAC | GGC | TTG | |||||||||||
Leu | Leu | GIy | 20 | Met | Arg | Arg | Me | 25 | Pro | Phe | Ser | Cys | 30 | |
Met | CTC | CTG | GGA | Gin | ATG | AGG | AGA | ATC | Ser | CCC | TTC | TCC | TGC | Leu |
ATG | CAA | TCC | CTG | |||||||||||
Asp | Arg | Asn | 35 | Phe | GIy | Phe | Pro | 40 | GIu · | VaI | Phe | Asp | 45 | |
Lys | GAC | AGA | AAT | Asp | TTT | GGA | TTC | CCC | GIn | GAG | GTG | TTT | GAC | GIy |
AAG | GAC | CAG | GGC | |||||||||||
Gin | Phe | Arg | 50 | Pro | Gin | AIa | Me | 55 | AIa | VaI | His | GIu | 60 | |
Asn | CAG | TTC | CGG | Lys | CCT | CAA | GCC | ATC | Ser | GCG | GTC | CAT | GAG | Thr |
AAC | AAG | TCC | ACG | |||||||||||
GIn | GIn | Me | 65 | His | Leu | Phe | Ser | 70 | Asp | GIy | Ser | -3- | Ser | Asn | 251 789 | |
CAA | CAG | ATC | Phe | CAC | CTC | TTC | AGC | Thr | GAC | GGC | TCG | AGC | AAT | 75 | ||
Me | TTC | ACA | Ser | AIa | ||||||||||||
ATC | Trp | Asp | GIu | 80 | Leu | Leu | Asp | Lys | 85 | Tyr | Thr . | GIy | TCT | Pro | GIn | GCT |
TGG | GAC | GAG | Ser | CTC | CTA | GAC | AAG | Leu | TAC | ACT | GGA | CCT | CAA | 90 | ||
Ala | AGC | CTC | Leu | 'Tyr | ||||||||||||
GCC | GIn | Leu | Th r | 95 | Leu | GIu | AIa | Cys | 100 | Ser | Gin | GIu | CTC | GIu | He | TAT |
CAG | CTG | ACT | GIu | CTG | GAA | GCC | TGT | Leu | AGC | CAG | GAG | GAG | ATT | 105 | ||
Gin | GAG | CTG | VaI | GIy | ||||||||||||
CAG | GIu | GIu | Th r | 110 | Leu | Met | Asn | GIu | 115 | Ser | Leu | Leu | GTG | VaI | Me | GGG |
GAA | GAG | ACG | Pro | CTG | ATG | AAC | GAG | Asp | TCC | CTG | CTG | GTC | ATC | 120 | ||
VaI | CCC | GAC | AIa | VaI | ||||||||||||
GTG | Arg | Tyr | Phe | 125 | Arg | lie | AIa | Leu | 130 | Leu | GIn | GIu | GCT | Asn | Phe | GTG |
AGA | TAC | TTC | Gin | AGA | ATC | GTC | CTC | Tyr | CTG | CAA | GAG | AAT | TTC | 135 | ||
Arg | CAA | TAT | Lys | Lys | ||||||||||||
AGG | Ser | Pro | Cys | 140 | Trp | GIu | Me | VaI | 145 | AIa | GIu | He | AAG | Leu | VaI | AAA |
AGC | CCT | TGT | Ala | TGG | GAG | ATC | GTC | Arg | GCA | GAA | ATC | CTT | GTG | 150 | ||
Tyr | GCC | AGA | Met | Arg | ||||||||||||
TAC | Phe | Ser | Ser | 155 | Thr | Asn | Leu | GIn | 160 | Ser | + | ATG | GIu | GIu | AGA | |
TTC | TCT | TCA | Ser | ACA | AAC | TTG | CAG | GIn | AGT | TAA, | GAG | GAA | 165 | |||
Cys | TCC | CAG | ||||||||||||||
TGC | He | Leu | ||||||||||||||
Asn | Tyr | Asp | 5 | Leu | Arg | Ser | GIn | 10 | Arg | Ser | Formel Il | ATT | CTG | |||
AAC | TAT | GAC | Leu | ' CTT | CGG | TCC | CAA | Leu | AGA | AGC | 15 | |||||
VaI | TTG | CTA | Lys | AIa | Ser· | |||||||||||
GTG | Cys | Leu | Met | 20 | Leu | Arg | GIn | Leu | 25 | GIy | AIa | AAG | GCC | TCA | ||
TGT | CTG | ATG | Leu | CTG | CGG | CAG | TTG | Asn | GGA | GCC | 30 | |||||
Ala | CTC | AAT | GIu | Met | Arg | |||||||||||
GCA | Pro | GIu | Asp | 35 | Met | Asn | Phe | GIn | 40 | Pro | GIu | GAA | ATG | CGT | ||
CCC | GAG | GAC | Thr | ATG | AAC | TTC | CAG | VaI | CCT | GAG | 45 | |||||
Cys | ACA | GTC | Leu | GIn | GIu | |||||||||||
TGC | AIa | GIn | Gin | 35 | Gin | Lys | GIu | Asp | 55 | AIa | Leu · | GAG | ||||
GCA | CAG | CAG | Phe | CAG | AAG | GAG | GAT | AIa | GCA | TTG | 60 | |||||
Gin | TTC | GCT | Tyr | |||||||||||||
CAA | Met | Leu | Gin | 65 | Thr | Trp· | Arg | He | 70 | Arg | Arg | TAT | ||||
ATG | CTC | CAG | His | ACC | TGG | CGT | ATT | Phe | AGA | AGA | 75 | |||||
GIu | CAC | TTC | AIa | |||||||||||||
GAG | Th r | GIy | Trp | 80 | GIu | Thr | Me | VaI | 85 | Asn | Leu | GCT | ||||
ACT | GGC | TGG | Asn | GAG . | ACC | ATC | GTT | Lys | AAC | CTC | 90 | |||||
Ser | AAT | AAG | GIu | |||||||||||||
AGC | His | Leu | Gin | 95 | Asp | Arg | Leu | GIu | 100 | Asn | Leu | GAA | ||||
CAT | CTG | CAG | Met | GAC | CGT | CTG | GAG | Thr | AAC | CTG | 105 | |||||
VaI | ATG | ACA | lie | |||||||||||||
GTC | GIu | GIu | GIu | 110 | Ser | Thr | Trp | GIy | 115 | Thr | Thr | ATA | ||||
GAG | GAG | GAA | Ser | TCC | ACC | TGG | GGA | Asn | ACA | ACC | 120 | |||||
Met | AGC | AAC | Arg | |||||||||||||
ATG | Lys | Lys | Tyr | 125 | GIy | Arg | He | Ser | 130 | Tyr | Leu | CGC | ||||
AAG | AAA | TAC | Tyr | GGA | AGG | ATC | TCG | GIn | TAC | CTG | 135 | |||||
Leu | TAC | CAG | Lys | |||||||||||||
CTG | Tyr | Ser | His | 140 | Ala | Trp | Thr | VaI | 145 | GIn | AIa | AAG | ||||
TAC | AGC | CAC | Cys | GCC | TGG | ACA | GTG | VaI | CAA | GCG | 150 | |||||
Lys | TGT | GTC | Leu | |||||||||||||
AAG | Asn | Leu | Ala | 155 | Leu | Asn | GIv | Leu | 160 | Asp | Tvr | CTC | ||||
Phe | Thr | 165 | ||||||||||||||
Arg | Asn + | |||||||||||||||
AGG AAC TTG GCC TTC CTT AAC GGA CTC ACA GAT TAC CTC CAA AAC
Formel III
und | Asp | Leu | Pro | 5 | Ser | Leu | Asp | Leu | 10 | Lys | GIn | GIu | Thr | 15 |
1 | GAC | CTG | CCT | AIa | AGC | CTT | GAC | TTG | Arg | AAG | CAG | GAG | ACC | Leu |
Cys | GCG | AGA | CTC | |||||||||||
TGC | VaI | Leu | His | 20 | Met | GIu | Thr | He | 25 | Pro | Pro | Ser | Cys | 30. |
GTT | CTG | CAC | GIn | ATG | GAG | ACA | ATC | Ser | CCT | CCT | TCC | TGT | Leu | |
Arg | CAG | TCT | CTG | |||||||||||
AGA | His | Arg | Thr | 35 | Phe. | Arg | Phe | Pro | 40 | GIu | GIn | Leu | Asp | 45 |
Asp | GIn | GIy | ||||||||||||
Lys | ||||||||||||||
AAG CAC AGG ACA GAC TTC AGG TTC CCC CAG GAG CAG CTG GAT GGC
Gin | Phe | Pro | 50 | Ala | GIn | AIa | Th r | 55 . | VaI | Leu | GIn | GIu | 60 | |
Arg | CAG | TTC | CCA | GIu | GCC | CAG | GCC | ACG | Ser | GTC | CTC | CAG | GAG | Met |
AGG | GAG | TCT | ATG | |||||||||||
Gin | GIn | He | 65 | Ser | Leu | Phe | His | 70 | GIu | Arg | Ser | Ser | 75 | |
Leu | CAG | CAG | ATC | VaI | AGC | CTC | TTC | CAC | Thr | GAG | CGC | TCG | TCT | AIa |
CTC | GTC | ACA | GCT | |||||||||||
Trp | As η | Th r | 80 | Leu | Leu | Asp | Arg | 85 | Leu | AIa | GIy | Leu | 90 | |
AIa | TGG | AAC | ACG | Th r | CTG | CTG | GAC | CGA | Leu | CTC | GCG | GGA | CTC | His |
GCC | ACT | CTC | CAT | |||||||||||
Gin | Leu | GIu | 95 | Leu | As η | Th r | Cys | 100 | Asp | GIu | GIn | Thr | 105 | |
Gin | CAG | CTG | GAA | Asp | CTC | AAC | ACC | TGC | Leu | GAT | GAG | CAG | ACA | GIy |
CAG | GAC | TTG | GGA | |||||||||||
GIu | GIu | Ser | 110 | Leu | GIy | Th r | VaI | 115 | Pro | Thr | Leu | AIa | 120 | |
GIu | GAA | GAA | TCC | Ala | CTG | GGA | ACT | GTG | GIy | CCT | ACA | CTG | GCC | VaI |
GAG | GCC | GGC | GTG | |||||||||||
Arg | Tyr | Phe | 125 | Arg | Me | Arg | Leu | 130 | Leu | Thr | GIu | Lys | 135 | |
Lys | AGG | TAC | TTC | Arg | AGA | ATC | CGT | CTG | Tyr | CTG | ACA | GAG | AAG | Lys |
AAG | AGG | TAC | AAA | |||||||||||
Ser | Asp | Cys | 140 | Trp | GIu | Me | VaI | 145 | VaI | Asp | He | Met | 150 | |
Tyr | AGT | GAC | TGT | Ala | TGG | GAG | ATT | GTC | Arg | GTG | GAC | ATC | ATG | Arg |
TAC | GCC | AGA | AGA | |||||||||||
Phe | Ser | Ser | 155 | AIa | Asn | Leu | GIn | 160 | Arg | Leu | GIy | Met | 165 | |
Ser | TTC | TCT | TCA | Ser | GCA | AAC | CTG | CAA | GIy | AGG | TTA | GGA | ATG | Arg |
TCC | TCA | GGA | AAG | |||||||||||
GIy | Asp | Leu | 170 | Ser | Pro | + | 175 | 180 | ||||||
Asp | GIy | |||||||||||||
GAT GGA GAC CTG GGG TCA CCT TGA
Formel IV sowie das Hundeinterferon und die sie codierende Sequenz der nachfolgenden Formel:
1 | His | Leu | Pro | CJl | Thr. | His | GIy | Leu | 10 | Asn | Trp | Arg | VaI | 15 |
Cys | CAC | CTG | CCC | Asp | ACC | CAC | GGC | CTG | Arg | AAC | TGG | AGG | GTC | Leu |
TGC | GAC | CGC | CTG | |||||||||||
Leu | Leu | GIy | 20 · | Met | Arg | Arg | Leu | 25 | Ala | 'GIy | Ser | Cys | 30 | |
Thr | CTC | CTG | GGA | Gin | ATG | AGG | AGA | CTC | Ser | GCC | GGC | TCT | TGT | Asp |
ACG | CAG | TCC | GAC | |||||||||||
Tyr | Thr | Asn | 35 | Phe | AIa | Phe | Pro | 40 | GIu | Leu | Phe | Asp | 45 | |
His | TAC | ACC | AAT | Asp | TTT | GCC | TTC | CCC | Lys | GAG | CTG | TTT | GAT | GIy |
CAC | GAC | AAG | GGC | |||||||||||
Arg | Leu | Gfn ^ | 50 | AIa | GIn | AIa | Leu | 55 | VaI | VaI | His | VaI | 60 | |
Gin | CGG | CTC | CAG | GIu | GCG | CAG | GCC | CTC | Ser | GTG | GTC | CAC | GTG | Met |
CAG | GAG | TCT | ATG | |||||||||||
GIn .. | Lys | VaI I | 65 | His | Leu | Phe | Cys | 70 | Asp | Thr | Ser | Ser | 75 | |
Thr | CAG | AAG | GTC . | Phe | CAC | CTC | TTC | TGC | Pro | GAC | ACG | TCC | TCT | AIa |
ACC | TTC | CCG | GCT | |||||||||||
Trp | Asn ! | Met | 80 | Leu | Leu | GIu | GIu | 85 | Cys | Ser | GIy | Leu | -90 | |
Pro | TGG | AAC | ATG | Thr | CTC | CTG | GAG | GAA | Leu | TGC | TCG | GGG | CTC | Ser |
CCT | ACT | CTG | TCT | |||||||||||
GIn | Leu | Asp | 95 | Leu | GIu | AIa | Cys | 100 | Leu | Gin | GIu | AIa | 105 | |
GIu | CAG | CTG | GAT | Asp | CTG | GAG | GCC | TGT | Pro | CTG | GAG | GAG | GCG | GIy |
GAG | GAC | CCC | GGG | |||||||||||
AIa | GIu | Thr | 110 | Leu | Met | His | GIu | 115 | Ser | Thr | Leu | Arg | 120 | |
Leu | GCC | GAG | ACC | Pro | CTC | ATG | CAT | GAG | Asp | TCC | ACC | CTG | AGG | Thr |
CTG | CCC | GAC | ACC | |||||||||||
Phe | GIn | Arg | 125 | Ser | Leu | Tyr | Leu. | 130 | Asp | Arg | Asn | His | 135 | |
Tyr | TTC | CAA | AGG | Me | TCC | CTC | TAC | CTG | Gin | GAC | AGG | AAC | CAC | Ser |
TAC | ATC | GAA | AGC | |||||||||||
Cys | AIa | Trp | 140 | Met | VaI | Arg | AIa | 145 | Me | GIy | Arg | Ser | 150 | |
Pro | TGT | GCC | TGG | GIu | ATG | GTC | CGA | GCA | GIu | ATC | GGG | AGA | TCC | Phe |
CCG | GAG | GAA | TTC | |||||||||||
Ser | Ser | Thr | 155 | Leu | GIn | GIu | Arg | 160 | Arg | Arg | Arg | Lys | 165 | |
Phe | TCC | TCG | ACA | Me | TTG | CAA | GAA | AGA | Me | AGG | AGG | AGG | AAA | + |
TTC | ATC | Formel V | ACT | TGA | ||||||||||
Die Aufgabe der Erfindung wurde dadurch gelöst, daß man hochmolekulare DNA aus dem Gewebe der genannten Tiere, vorzugsweise aus der Leber, nach einem modifizierten Verfahren gemäß BMn und Stafford (18) isolierte und mit Hilfe spezieller Endonucleasen statistisch fragmentierte. Die so erhaltenen unterschiedlich großen Fragmente wurden nach der Größe fraktioniert, vorzugsweise zur Bildung von 10 bis 23kb Fragmenten, um in einem Vektor, beispielsweise in einem Lambda-Vektor, geklont zu werden. Anschließend wurden diese Vektoren in einem Bakterium, vorzugsweise E.coli, vermehrt. Die Pferde-DNA wurde mit Hilfe derfür reifes Humaninterferon-alpha2ARG codierenden DNA und dem für humanes /3lnterferon codierenden cDNA unter nicht stringenten Bedingungen gescreent.
Die Hunde-DNA wurde mit Hilfe derfür reifes Hurnaninterferon-alpha2ARG codierenden DNA unter nicht stringenten Bedingungen gescreent.
Durch die niedrige Stringenz wurden auch Klone erfaßt, die in ihren Sequenzen erhebliche Unterschiede zu dem HulFN-alpha- , 2Arg bzw. HulFN-/3 aufweisen.
Bei der Untersuchung der Pferde-DNA mit dem humanen alpha-Gen wurden wie bei Rindern, Schweinen und Menschen durch Southern-Analyse mehrere Banden festgestellt, so daß man davon ausgehen kann, daß es auch beim Pferd eine Klasse von alpha-lnterferongenen geben muß.
Von den hybridisierenden Rekombinanten wurde Phagen DNA hergestellt, und von den resultierenden Klonen Eq-alpha 1 Eq-beta 6 wurden Restriktionskarten erstellt (Fig.2 und 3). Weiterhin wurden zwei mit der humanen IFN-Probe hybridisierende Lambda-Klone, Eq-alpha 16 und Eq-alpha 20 erhalten. Ein 3,2 kb Hind Ill-Fragment aus dem Klon Eq-alpha 1, ein 4,5 kb Pvull-Fragment des Klons Eq-beta6, ein 3,3kb EcoRI-Fragment des Klons Eq-alpha 16 bzw. ein 2,2kb EcoRI-Fragment des Klons Eq-alpha20 wurden in einem Vektor, beispielsweise pUC9, subkloniert und anschließend in einen Wirtsorganismus, beispielsweise E.coli JM 101, transformiert. Die Isolierung der korrekten Phenotypen ergab die Plasmide pAH50, pAH60, pRH63 bzw. pRH61,dieals Inserts die fr die Pferde-Interferone codierenden Sequenzen enthalten. Die Restriktionskarten für pRH63 sind in Figur 9 abgebildet.
Die Inserts der Plasmide wurden nach der Dideoxy-Methode von Sanger (23) nach dem „Shotgun-Verfahren" sequenziert. Die Teilsequenzen dieser Inserts wurden mit Hilfe eines modifizierten Computerprogrammes zu einer Totalsequenz vereint (Fig. 4,8, 10 und 12).
Der längste offene Leseraster für das Eq-IFN-alpha-Gen aus dem Klon Eq-alpha 1 codiert ein Polypeptid mit 184 Aminosäuren. Beachtenswert ist die signifikante Homologie zu bekannten alpha-Interferonen anderer Spezies. Wie bei den humanen, bovinen und murinen alpha-Interferonen besteht dieses Pferde-alpha-Interferon aus einem hydrophoben Signalpeptid mit 23 Aminosäuren, das einem reifen Protein mit überraschenderweise nur 161 Aminosäuren vorausgeht (Eq-IFN-alpha1). Vier Cysteinreste an den Stellen 1, 29, 99 und 139 sind zwischen den Spezies Pferd, Rind, Maus, Ratte und Mensch exakt erhalten (Fig.7). Die Verkürzung dieses Pferde-alpha-Interferons auf 161 Aminosäuren dürfte durch die Deletion einer Base nach der 159 Aminosäure bewirkt worden sein, ohne die die Transkription bis zur 166. Aminosäure, bis zum Stopcodon TGA weitergeschrieben worden wäre.
Dieser Befund weist darauf hin, daß die Polypeptidkette für reifes Pferde-Interferon-alphai eine Länge von 161 Aminosäuren haben kann, daß jedoch auch andere Formen mit bis zu 166 Aminosäuren existieren können. Auch diese Peptide sind selbstverständlich Gegenstand dervorliegenden Erfindung.
Überraschenderweise zeigte sich beim paarweisen Vergleich der Aminosäuresequenzen, daß das Pferde-Interferon-alpha 1 zu den menschlichen alpha-Interferonen eine größere Homologie aufweist (71-77%) als zu den Rinder- (57-67%), Ratten- (61 %) oder Maus-alpha-interferonen (54-59%) (Fig. 5). Die Homologie zwischen den verschiedenen alpha-Interferonen einer Gattung ist deutlich größer als zwischen denen verschiedener Spezies (z.B. Mensch 77-100%, Rind 91-99%). Der längste offene Leseraster für das Eq-IFN-alpha-Gen aus dem Klon Eq-alpha 6 codiert ebenfalls ein Polypeptid mit 184 Aminosäuren (Signalpeptid 23 Aminosäuren, reifes Protein 161 Aminosäuren).
Die DNA-Sequenz des Klons pRH63 ist in der proteinkodierenden Region sehr ähnlich der des Klons pAH50, was für die Expression des Genes ausgenutzt werden kann (siehe Beispiel M; Fig. 11 und 15). Das Interferon aus klon pRH63 wurde aufgrund der hohen Homologie mit Eq-IFN-alpha1 (aus Klon pAH50) Eq-IFN-alpha2 benannt. Reifes Eq-IFN-alpha 2 weist gegenüber Eq-IFN-alpha 1 nur zwei unterschiedliche Aminosäurereste am C-terminalen Ende auf, wobei sich durch den Austausch an Position 151 Ser-Cys in Ep-IFN-alpha 2 ein fünfter Cysteinrest an einer bisher bei keinem anderen Interferon beobachteten Position befindet (siehe Fig. 19).
Ansonsten trifft das für das Eq-IFN-alpha 1 Gesagte auch auf das Eq-IFN-alpha 2 zu!
Das DNA-Fragment des Eq-alpha20 enthält die codierende Sequenz für ein Protein mit 172 Aminosäuren und ein hydrophobes Signalpeptid mit 23 Aminosäuren. Art Position 78—80 des reifen Proteins befindet sich eine potentielle N-Glycosilierungsstelle Asn-Thr-Thr, die genau der von Eq-IFN-ß, Hu-IFN-/3, Mu-IFN-/3, Mu-IFN-alpha 1,2,4,5,6 entspricht (Fig. 19). Die Proteinsequenzen in dieser Abbildung wurden so angeordnet, daß die größtmögliche Homologie zwischen den einzelnen Interferonen erreicht wurde. Zum Vergleich von IFN-alpha und IFN-ß Sequenzen wurden letztere um 3 Aminosäuren verschoben und eine Lücke eingeführt. Der paarweise Vergleich der Aminosäuresequenzen in Fig. 20 erfolgte ausgehend von dieser Anordnung über die längste gemeinsame Länge der Proteine.
Aus den Abbildungen 19 und 20 geht hervor, daß das von der DNA-Sequenz des Klones pRH63 codierte Protein mit den Typ I Interferonen verwandt ist (alpha- und /3-!FN). Die Charakteristika von 172 Aminosäuren, Glykosilierungsstelle an Position 78 und der etwa gleich großen Homologie der Interferone dieser Klasse zwischen verschiedenen Spezies (Mensch, Rind, Pferd) wie zwischen diesen längeren Interferonen und den alpha-Interferonen innerhalb einer Gattung, sowie die unterschiedlichen Sätze von hybridisierenden DNA-Fragmenten mit alpha-lnterferon und Proben aus dem Klon pRH63 (Fig. 18) lassen die Annahme zu, daß das Insert des Klons pRH63 einer neuen Klasse von Typ I Interferonen angehört, welche als Interferon-omega bezeichnet wird (33). Diese Bezeichnung ist weniger verwirrend als die von Capon et al. (34) verwendete: Typ I, Klasse Il Interferon, welche zur Verwechslung mit Typ Il Interferon (IFN-gamma) führen könnte.
Die Sequenz des Pferde-beta-Interferons wurde analog der des alpha bestimmt. Der längste offene Leseraster für das beta-IFN-Gen codiert für ein Polypeptid mit 186 Aminosäuren, wobei auch in diesem Fall die Homologie zu bekannten beta-lnterferonen anderer Spezies zu beobachten ist. Wie bei dem humanen, den 3 bovinen und den murinen beta-lnterferonen weist das Pferdebeta-Interferon ein hydrophobes Signalpeptid mit 21 Aminosäuren auf.
Überraschenderweise zeigte sich auch beim beta-lnterferon beim paarweisen Vergleich der Aminosäuresequenzen, daß das Pferde-beta-lnterferon zu dem menschlichen beta-lnterferon eine größere Homologie aufweist (59%) als zu den Rinder- (50— 55%)oderMaus-beta-lnterferonen (44%) (Fig.6).
Andererseits, trotz der überraschend hohen Homologie Pferd/Mensch-beta-lnterferon, fehlt wie bei den drei bovinen beta-Interferonen die im humanen beta-lnterferon an Position 119 stehende Aminosäure auch im Pferde-beta-lnterferon!
Das Pferde-beta-lnterferon trägt zwei potentielle N-Glykosylierungsstellen: an Position 80 des reifen Proteins (ASN-GLU-THR, genau wie beim humanen und Maus-beta-lnterferon) und an Position 115 (ASN-THR-THR). Beiden bovinen beta-lnterferonen sind zwei mögliche N-Glykosylierungsstellen an Position 110 (ASN-PHE-THR bzw. ASN-SER-PHE) und 152 (ASN-VAL-SER bzw.
ASN-PHE-SER) lokalisiert.
Wie beim Rind und beim Menschen sind die 3 Cysteinreste exakt erhalten geblieben (Position 17,31 und 140 bzw. 141 beim Menschen).
Bei der Untersuchung der Hünde-DNA mit dem humanem-alpha-Gen wurden wie bei Rindern, Schweinen und Menschen ebenfalls mehrere Banden festgestellt, so daß man davon ausgehen kann, daß es auch beim Hund eine Klasse von alpha-Interferongenen geben muß.
Von den hybridisierenden Rekombinanten wurde Phagen DNA hergestellt und von dem resultierenden Klon Ca alpha 11-2 wurde eine Restriktionskarte erstellt (Fig. 22). Ein 3,7kb Smal Fragment und ein 2,4kbSmal Fragment dieses Klons wurden in einem Vektor, bespielsweise pUC9, subkloniert und anschließend in einen Mikroorganismus, beispielsweise E.coli JM101 transformiert. Die Isolierung der korrekten Phenotypen ergab zwei Plasmide pAH2 und PAH4, die als Inserts die für die Hunde-Interferone codierenden Sequenzen enthalten.
Die Inserts dieser Plasmide wurden nach der Dideoxy-Methode von Sanger (23) nach dem „Shotgun-Verfahren" sequenziert. Die Teilsequenzen dieser Inserts wurden mit Hilfe eines modifizierten Computerprogrammeszu einer Totalsequenz vereint (Fig. 24
Überraschenderweise codiert der längste offene Leseraster beider Plasmidsequenzen für vollkommen identische Polypeptide mit 187 Aminosäuren. Beachtenswert ist die signifikante Homologie zu bekannten alpha-lnterferonen anderer Spezies. Die proteincodierenden Sequenzen sind exakt gleich; 170 Basen der 5'-nichttranslatierten Region unterscheiden sich nur durch 3 Nukleotide (1,8%) (vgl.28). Wie bei den humanen, bovinen und murinen alpha-lnterferonen besteht das Hunde-alpha-Interferon aus einem hydrophoben Signalpeptid mit 23 Aminosäuren, das einem reifen Protein mit überraschenderweise nur 161 Aminosäuren vorausgeht. Verglichen mit den Proteinsequenzen anderer beschriebener alpha-lnterferongene fehlen dem Hunde-alpha-lnterferon zwei Aminosäuren an Position 119 und 120 des reifen Proteins (Fig. 26).
Überraschenderweise weist reifes Hunde-alpha-lnterferon als einziges bisher bekannteß alpha-lnterferon 6 Cysteinreste auf; möglich sind also drei intramolekulare Disulfidbrücken!
Vier dieser Cysteinreste an den Stellen 1, 29, 99 und 139 sind zwischen den Spezies Hund, Rind, Maus, Ratte und Mensch exakt erhalten. Das Cystein an Position 86 ist zwischen CalFN-alpha1,CalFN-alpha2 MulFN-alpha1,MulFN-alpha2, RalFN-alpha.und HulFN-alpha D konserviert.
Überraschenderweise besitzt das Hunde-alpha-lnterferon zwei potentielle N-Glycosylierungsstellen, und zwar an den Positionen 78 (ASN-MET-THR) und 133 (ASN-HIS-SER). Die Glycosyiierungsstelle an Position 78 entspricht der im MulFN-alpha 1 und 2 (ASN-ALA-THR); sie entspricht auch der Glycosyiierungsstelle der beta-Interference von Mensch und Maus an Position 80
(ASN-GLU-THR)! '
Ein paarweiser Vergleich der Aminosäuresequenzen ergab, daß das Hunde-alpha-lnterferon zum menschlichen alpha-lnterferon eine Homologie von 52-72%, zu den Rinder-alpha-lnterferonen von 54—55%, zu den Ratten-alpha-lnterferonen von 50% und zu den Maus-alpha-lnterferonen von 48-51 % zeigt (Fig. 27).
An dieser Stelle sei erwähnt, daß es sich bei den erfindungsgemäßen Interferonen nicht nur um die reifen Interferone, die im einzelnen beschrieben sind, handelt, sondern ebenfalls um jedwede Modifikation dieser Polypeptide, die die Pferde/Hunde-lFN-Aktivität nicht wesentlich verändert. Diese Modifikationen beinhalten z. B. Verkürzung des Moleküls z. B. am N- oder C-terminalen Ende, Austausch von Aminosäuren durch andere Reste, chemische oder biochemische Bindungen des Moleküls an andere Moleküle, die inert oder aktiv sind. Bei den letztgenannten Modifikationen kann es sich beispielsweise um Hybridmoleküle aus einem oder mehreren erfindungsgemäßen Interferonen und/oder bekannten a-oder/3-lnterferonen handeln.
Gegenstand der Erfindung sind daher nicht nur Gen-Sequenzen, die spezifisch für die erfindungsgemäßen Interferone codieren, sondern ebenfalls Modifikationen, die leicht und routinemäßig durch Mutation, Abbau, Transposition oder Addition erhalten werden können. Jede Sequenz, die für die erfindungsgemäßen Interferone codiert (d. h. die das biologische Aktivitätsspektrum aufweist, das hier beschrieben ist) und im Vergleich mit den gezeigten degeneriert ist, ist ebenfalls eingeschlossen; Fachleute auf diesem Gebiet sind in der Lage, DNA-Sequenzen der codierenden Regionen zu degenerieren. Ebenso ist jede Sequenz, die für ein Polypeptid mit dem Aktivifätsspektrum der erfindungsgemäßen Interferone codiert, und die mit den gezeigten Sequenzen (oder Teilen davon) unter stringenten Bedingungen hybridisiert (beispielsweise Bedingungen, die für mehr als 85%, bevorzugt mehr als 90%, Homologie selektieren) beinhaltet.
Die Hybridisierungen werden in 6 x SSC/5 = Denhardts Lösung/0,1 % SDS bei 65°C durchgeführt. Der Grad der Stringenz wird im Waschschritt festgelegt. So sind für eine Selektionierung auf DNA-Sequenzen mit ca. 85% oder mehr Homologie die Bedingungen 0,2 χ SSC/0,01 %, SDS/65°C und für eine Selektionierung auf DNA-Sequenzen mit ca. 90% oder mehr Homologie die Bedingungen 0,1 x SSC/0,01 % SDS/65°C geeignet.
Erfindungsgemäße Interferon-Gene können unter Bedingungen in jeden Organismus eingebracht werden, die zu hohen Ausbeuten führen. Geeignete Wirte und Vektoren sind dem Fachmann bestens bekannt; als Beispiel sei auf die EP-A-0.093.619 hingewiesen.
Insbesondere sind Prokaryoten für die Expression bevorzugt, beispielsweise E.coli K12, Stamm 294 (ATCC Nr. 31446) oder E.coli XI776 (ATCC Nr.31.537). Ebenso wie die vorerwähnten Stämme können auch E.coli W 3110 (F", Lambda", Prototroph, ATCC Nr.27325), Bazillen wie Bacillus subtilis, und andere Enterobacteriaceae, wie Salmonella typhimurium oder Serratia marcescens und verschiedene Pseudomonaden verwendet werden.
Im allgemeinen können Plasmid-Vektoren, die Replikon und Kontrollsequenzen, die aus Spezies stammen, die kompatibel mit den Wirtszellen sind, enthalten, in Verbindung mit diesen Wirten verwendet werden. Der Vektor trägt üblicherweise neben einer Replikationsstelle Erkennungssequenzen, die es ermöglichen, die transformierten Zellen phenotypisch zu selektieren. Zum Beispiel wird E.coli üblicherweise mit pBR322 transformiert, ein Plasmid, das aus E.coli Spezies stammt [Bolivar, et al., Gene 2,
95 (1977)]. pBR322 enthält Gene für Ampicillin- und Tetracylin-Resistenz und liefert damit einfache Mittel, transformierte Zellen zu identifizieren. Das pBR322-Plasmid oder auch andere Plasmide müssen außerdem von sich aus Promotoren enthalten oder müssen dahingehend so modifiziert sein, daß sie Promotoren enthalten, die vom mikrobiellen Organismus zur Expression ihrer eigenen Proteine verwendet werden können. Die Promotoren, die am häufigsten bei der Herstellung rekombinanter DNA verwendet werden, beinhalten die Beta-Lactamase (Penicillinase) und Lactose-Promotor-Systeme [Chang et al., Nature 275,615 (1978); Itakura et a|., Science 198,1056(1977); Goeddel et al., Nature 281, 544 (1979)] und Tryptophan(trp) Promotor-Systeme [Goeddel et al., Nucleic Acids Res. 8,4057 (1980); EP-A-0.036.776). Während die erwähnten die gebräuchlichsten Promotoren sind, sind darüber hinaus auch andere mikrobielle Promotoren entwickelt und benutzt worden. Die Gen-Sequenz für die erfindungsgemäßen Interferone kann beispielsweise unter der Kontrolle des Leftward-Promotors des Bakteriophagen Lambda (Pl) eingesetzt werden. Dieser Promotor ist einer der als besonders stark bekannten Promotoren, der steuerbar ist. Die Steuerung wird möglich durch den Lambda-Repressor, von dem benachbarte Restriktionsschnittstellen bekannt sind. Ein temperaturempfindliches AIIeI dieses Repressor-Gens kann in einem Vektor, der eine vollständige IFN-omega-Sequenz enthält, eingeführt werden. Wird die Temperatur auf 42°C erhöht, wird der Repressor inaktiviert und der Promotor bis zu seiner maximalen Konzentration exprimiert. Die Summe der mRNA, die unter diesen Bedingungen produziert wird, sollte ausreichend sein, um eine Zelle zu erhalten, die unter ihren neuen synthetischen Ribonukleinsäuren ungefähr 10% enthält, die von dem PL-Promotor stammt. Auf diese Weise ist es möglich, eine Clon-Bank zu etablieren, in der eine funktionell IFN-Sequenz in Nachbarschaft zu einer Ribosom-Bindungsstelle in variierenden Abständen zu dem Lambda-PL-Promotor plaziert wird. Diese Klone können dann überprüft und der mit der höchsten Ausbeute selektiert werden.
Die Expression und Translation einer Sequenz codierend für die erfindungsgemäßen Proteine kann auch unter Kontrolle anderer Regulationssysteme, die als „homolog" zu dem Organismus in seiner untransformierten Form gelten können, ablaufen. So enthält z. B. chromosomale DNA von einem Lactose-abhängigen E.coli ein Lactose oder Lac-Operon, der durch Ausschüttung des Enzyms Beta-Galacto-sidase den Lactose-Abbau ermöglicht.
Die Lac-Kontrollelemente können aus dem Bacteriophagen Lambda-plac5, der infektiös für E.coli ist, erhalten werden. Das Lac-Operon des Phagen kann durch Transduktion aus derselben Bakterien-Spezies stammen. Regulationssysteme, die bei dem erfindungsgemäßen Verfahren Verwendung finden können, können aus plasmidischer DNA stammen, die dem Organismus eigen ist. Das Lac-Promotor-Operator-System kann durch IPTG induziert werden.
Andere Promotor-Operator-Systeme oder Teile hiervon können genausogut verwendet werden: beispielsweise Arabinose-Operator, Colicine Ei-Operator, Galactose-Operator, alkalischer Phosphatase-Operator, trp-Operator, Xylose-A-Operator, tac-Promotoru.ä.
Zusätzlich zu Prokaryoten können auch eukaryotische Mikroorganismen, wie Hefekulturen verwendet werden Saccharomyces cerevisiae ist die am meisten verwendete unter den eukaryotischen Mikroorganismen, obwohl eine Anzahl anderer Spezies allgemein erhältlich ist. Zur Expression in Saccharomyces wird beispielsweise das Plasmid YRp7 [Stinchcomb et al. Natur 282, 39(1979); Kingsmanetal.,Gene7,141 (1979); Tschumperet al., Gene 10,157 (1980)] und das Plasmid YEp 13 [Bwach et al., Gene 8,121-133 (1979)] üblicherweise verwendet. Das Plasmid YRp7 enthält das TRPI-Gen, das eine Selektionierungsmarkierung für eine Hefemutante, die unfähig ist, in tryptophanfreiem Medium zu wachsen, bereitstellt; beispielsweise ATCC Nr.44076. Das Vorhandensein desTRPI-Schadens als Charakteristikum des Hefe-Wirts Genoms stellt dann ein wirksames Hilfsmittel dar, um Transformation nachzuweisen, indem ohne Tryptophan kultiviert wird. Ganz ähnlich verhält es sich bei dem Plasmid YEpI 3, das das Hefe-Gen LEU 2, das zur Ergänzung einer LEU-2-minus-Mutante verwendet werden kann, enthält. Geeignete Promotor-Sequenzen für Hefe-Vektoren beinhalten die 5'-flankierende Region der Gene des ADH I [Ammerer G., Methods of Enzymology 101,192-201 (1983)],3-Phosphoglycerate-Kinase[Hitzeman et al., J.Biol.Chem.255, 2073 (1980)] oder andere glykolytische Enzyme [Kawaski und Fraenkel, BBRC 108,1107-1112 (1982)] wie Enolase, Glycerinaldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase, Hexokinase, Pyruvat-Decarboxylase, Phosphofructokinase, Glucose-6-Phosphat-lsomerase, Phosphoglucose-Isornerase und -Glucokinase. Bei der Konzentration geeigneter Expressionsplasmide können die mit diesen Genen assoziierten Terminationssequenzen ebenfalls in den Expressions-Vektor am 3'-Ende der zu exprimierenden Sequenz eingesetzt werden, um Polyadenylierung und Termination der mRNA vorzusehen.
Andere Promotoren, die zudem noch den Vorteil der durch Wachstumsbedingungen kontrollierten Transkription besitzen, sind die Promotor-Regionen der Gene für Alkohol-Dehydrogenase-2, Isocytochrom C, Saure-Phosphatase abbauende Enzyme, die mit dem Stickstoff-Metabolismus gekoppelt sind, die oben erwähnte Glycerinaldehyd-3-Phosphat-Dehydrogenase und Enzyme, die für die Verarbeitung von Maltose und Galaktose verantwortlich sind. Promotoren, die durch den Hefe Mating Typ Locus reguliert werden, beispielsweise Promotoren der Gene BARI, MFaI, STE2, STE3, STE5 können bei temperaturregulierten Systemen durch die Verwendung von temperaturabhängigen sir Mutationen eingesetzt werden. [Rhine, PH.D. in Thesis, University of Oregon, Eugene, Oregon (1979), Herskowitz and Oshima,The Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces, part 1,181-209 (1981), Cold Spring Harbor Laboratory]. Diese Mutationen beeinflussen die Expression der ruhenden Mating Typ Kassetten von Hefen und dadurch indirekt die Matint Typ abhängigen Promotoren. Generell ist jedoch jeder Plasmid Vektor, der einen Hefe-kompatiblen Promotor, originäre Replikations- und Terminationssequenzen enthält, geeignet. Zusätzlich zu Mikroorganismen sind Kulturen multizellulärer Organismen ebenfalls geeignete Wirtsorganismen. Im Prinzip ist jede dieser Kulturen einsetzbar, ob von Wirbeltier- oder wirbellosen Tierkulturen. Größtes Interesse besteht jedoch an Wirbeltier-Zellen, so daß die Vermehrung von Wirbeltierzellen in Kultur (Gewebe-Kultur) in den letzten Jahren zu einer routinemäßigen Methode wurde (Tissue, Culture, Academic Press, Kruse and Patterson, Editors [1973]). Beispielesoich nützlicher Wirtszel linien sind VERO- und HeLa-Zellen, Hamster-Eierstock (CHO)-Zellen und WI38, BHK, COS-7 und MDCK-Zellinien. Expressionsvektoren für diese Zellen enthalten üblicherweise (wenn nötig) eine Replikationsstelle, einen Promotor, der vor dem zu exprimierenden Gen lokalisiert ist, gemeinsam mit jeder notwendigen Ribosomenbindungsstelle, RNA-Splicing-Stelle, Polyadenylierungsstelle und transkriptioneile Terminations-Sequenzen.
Bei der Verwendung von Säugetierzellen werden die Kontrollfunktionen auf den Expressions-Vektoren oftmals aus viralem Material vorgesehen. Beispielsweise stammen die üblicherweise verwendeten Promotoren aus Polyoma Adenovirus 2, und besonders häufig aus Simian Virus 40 (SV 40). Die frühen und spaten Endpromotoren des SV 40 sind besonders nützlich, da beide leicht aus dem Virus als Fragment zu erhalten sind, das auch noch die virale Replikationsstelle des SV 40 enthält. (Fiers et al., Nature 273,133 [1978]). Auch können kleinere oder größere Fragmente des SV 40 verwendet werden, vorausgesetzt, sie enthalten die annähernd 250 bp lange Sequenz, die von der Hind HI-Schnittstelle bis zur Bg11-Schnittstelle in der viralen Replikationsstelle reicht. Außerdem ist es ebenfalls möglich und oft empfehlenswert, Promotor- oder Kontroll-Sequenzen zu verwenden, die normalerweise mit den gewünschten Gensequenzen verknüpft sind, vorausgesetzt, diese Kontroll-Sequenzen sind kompatibel zu den Wirtszellsystemen.
Eine Replikationsstelle kann entweder durch entsprechende Vektorkonstruktion vorgesehen werden, um eine exogene Stelle einzubauen, beispielsweise aus SV40 oder anderen viralen Quellen (z. B. Polyoma, Adeno, VSV, PBV, etc.) oder kann durch die chromosomalen Replikationsmechanismen der Wirtszelle vorgesehen werden. Wird der Vektor in das Wirtszellenchromosom integriert, reicht die zuletztgenannte Maßnahme meistens aus.
Die Gene können jedoch vorzugsweise in einem Expressions-Plasmid pER103 (E.Rastl-Dworkin et al., Gene 21, 237-248 [1983] und EP-A-0.115-613 — hinterlegt bei der DSM unter der Nummer DSM 2773 am 20. Dezember 1983) oder auch indem Plasmid parpER33 (EP-A-0.115-613) exprimiert werden, da diese Vektoren alle Regulationselemente enthalten, die zu einer hohen Expressionsrate der klonierten Gene führen.
Ausgehend von dem Expressionsplasmid parpER33 wurde die für die erhöhte Plasmidstabilität in E.coli verantwortliche „par"-Sequenz und die Tryptophan Promoter-Operator-Sequenz samt der künstlichen ribosomalen Bindungsstelle in den Plasmidvektor pAT 153 eingesetzt pAT 153 ist ein verkürztes Derivat des Plamides pBR322, dem ein Abschnitt fehlt, der für die Mobilisierung von DNA notwendig ist (36).
Die Vorgangsweise der Hersteilung von Plasmid parpATER 103 ist in Fig. 13 dargestellt. Das Plasmid parpER 33 wurde mit Hindlll vollständig und mit EcoRi partiell geschnitten, das entstandene 0,47 kb lange DNA-Fragment von einem Agarosegel isoliert und gereinigt und mit EcoRI und Hindlll zweifach geschnittenem pAT153 ligiert. Ein nach Transformation von E.coli HB101 erhaltenes Plasmid der gewünschten Struktur, die man durch Verdauung mit verschiedenen Restriktionsenzymen bestimmte, wurde parpATER 103 benannt. Dieses Plasmid enthält den Replikationsursprung und das Ampicillin-Resistenzgen von Plasmid pAT 153, sowie die für die Stabilisierung in E.coli wirksame par-Sequenz und für die effiziente Expression von Genen verwendbare Tryptophan-Promoter-Operator-Region und ribosomale Bindungsstelle.
Die Herstellung der Expressionsplasmide pAH52, pAH52/2 und pAH 53 sowie deren Vorstufen ist in Fig. 14 dargestellt. Zur Herstellung der Expressionsplasmide wurde das Plasmid pAH 50 und Hindll verdaut und das 4,2 kb lange DNA-Fragment, das das gesamte EqlFN-a1-Gen enthält, isoliert und gereinigt. Die Enden des Hindll-Fragmentes wurden mit Sphl-Linkern versehen. Anschließend wurde die DNA mit Sphl verdaut, mit Phenol und Chloroform extrahiert und mit Äthanol ausgefällt. Die DNA wurde mit Ligasezirkularisiert und E.coli HB101 transfomiert. Ein Plasmid der gewünschten Struktur erhielt die Bezeichnung pAH51. Es enthält das EqlFN-a1-Gen mit einer verkürzten 3'-nichttranslatierten Region und einer zusätzlichen Sphl-Schnittstelle.
Um in der Endkonstruktion die DNA-Sequenz für das reife Pferde-a-lnterferon in der richtigen Distanz mit der Promotersequenz zu verbinden, wurde von einem 0,4kb langen DNA-Fragment ausgegangen, das aus mit Pvull geschnittenem Plasmid pAH 50 isoliert wurde. Synthetisches 15mer Oligonukleotid mit der Sequenz ö'-TGTGACCTGCCTCAC wurde mit Polynukleotid-Kinase kinasiert. Es enthält die Sequenz, diefür die ersten 5Aminosäuren des reifen EqlFN-a1 aus Klon pAH 50 codiert. Das 15mer wurde mit dem 0,4 kbPvull-Fragment gemischt, der DNA-Doppelstrang denaturiert. Der an den Einzelstrang gebundene Oligonukleotid-Primer wurde mit dem Klenow-Fragment verlängert. Um einen eventuell verbliebenen 3'-Überhang sicher zu entfernen, wurde die DNA anschlißend mit T4 DNA-Polymerase inkubiert. Die entstandene DNA mit geraden Enden wurde mit Phenol und Chloroform extrahiert und ausgefällt. An dieses DNA-Stück wurde ein Gemisch zweier kinasierter, zueinander komplementärer Oligonukleotide: 12mer 5'-AGCTTAaAGATG, 8mer 5'-CATCTTTA (europärische Patentanmeldung No.83112812.9) ligiert, das eine Hindlll-Schnittstelle und das Translationsstartcodon ATG erzeugt. Beide Oligonukleotide wurden mit Ligase an das DNA-Fragment ligiert. Nach Inaktivierung des Enzyms wurde die erhaltene DNA mit Hindlll und BgIIII geschnitten und DNA-Fragmente von etwa 190 bp Länge isoliert und gereinigt. Das erhaltene DNA-Fragment wurde mit Hindlll und BgIII doppelt geschnittenem pAH51-Vektor ligiert und E.coli HB101 transformiert. Von 65 erhaltene Kolonien wurde aus 4 Plasmiden, die das gewünschte Restriktionsmuster aufwiesen, ein Hindlll/BamHI DNA-Fragment isoliert und mit der Sanger-Methode sequentiell, wobei zwei Klone genau die gewünschte Sequenz enthielten. Ein solches Plasmid wurde pAH51/2 benannt. Dieses enthält die Sequenz für reifes EqlFN-a1 mit vorangestelltem Translationsstartcodon ATG und Hindlll-Schnittstelle.
Zur Herstellung der Expressionsplasmide pAH52 und pAH 52/2 wurde das Plasmid pAH51/2 mit Sphl und Hindlll zweifach geschnitten, das entstehende 1,0 kb lange DNA-Fragment von einem Agarosegel isoliert und mit Hindlll und Sphl doppelt geschnittenem Plasmid parpATER 103 ligiert. Ein nach Transformation von E.coli HB101 erhaltenes Plasmid der gewünschten Struktur wurde pAH 52 benannt. Es enthält alle für eine induzierbare Expression von reifem EqlFN-a1 notwendigen Informationen. In analoger Weise wurde aus mit Hindlll und BamHI doppelt geschnittenem pAH51/2 und mit Hindlll/BamHI geschnittenem parpATER 103 des Plasmid pAH 52/2 hergestellt. Dieses Expressionsplasmid ist etwa 0,2 kb größer als pAH 52 und weist zusätzlich eine singuläre BamHI-Schnittstelle auf.
Ein wesentlich verkleinertes Expressionsplasmid zur Herstellung von reifem EqlFN-a1 in E.coli, in dem Tryptophan-Promoter, Interferongen, Ampicillin-Resistenzgen und Replikationsursprung in einer Richtung orientiert sind, wurde aus den Plasmiden pAH52 und pBR322 hergestellt: pAH53. pAH 52 wurde mit Sphl und EcoRI geschnitten, die Enzyme bei 7O0C inaktiviert und die DNA-Enden nach Zusatz von dATP, dGTP, dCTP, dTTP mit Klenow-Fragment stumpf gemacht. Die DNA-Fragmente wurden auf einem Agarosegel nach der Größe fraktioniert und ein 1,1 kb langes Stück isoliert, das Promoter und Interferongen enthält. pBR 322 wurde mit EcoRI und Pvull doppelt verdaut, die Enden wie oben beschrieben mit Klenow-Fragment begradigt und anschließend mit Kalbsdarmphosphatase dephosphoryliert. Ein DNA-Fragment von 2,4kb Länge wurde von einem Agarosegel isoliert. Die beiden so erhaltenen DNA-Stücke wurden mitT4DNA-Ligase verknüpft und E.coli HB101 transfomiert. Ein so erhaltenes Plasmid, in dem zwei EcoRI-Erkennungsstellen geschaffen wurden erhielt die Bezeichnung pAH53. Aufgrund der hohen Homologie der Gene für EqlFN-a1 (pAH50) und EglFN-a2 (pRH63, Fig. 11) ist es möglich, aus dem Expressionsplasmid pAH52/2 und dem Lambda-Subklon pRH63ein Expressionsplasmid für EqlFN-a2 herzustellen (Fig. 15). Da bis zur gemeinsamen Bglll-Stelle im für reifes Interferon codierenden Bereich nur zwei Basenunterschiede bestehen, die jedoch aufgrund des degenerierten Aminosäurecodes keinen Aminosäureunterschied bewirken, kann der erste Teil des Gens für EqlFN-a1 im Expressionsplasmid pAH 52/2 auch für die Expression von EqlFN-o:2 verwendet werden. pRH 63 wurde mit BgIII und BamHI zweifach geschnitten und das entstehende DNA-Fragment von 1,0 kb Länge, das die codierende Sequenz für EqlFN-a2 ab der 64. Aminosäure enthält, von einem Agarosegel isoliert. pAH 52/2 wurde ebenfalls mit BgIII und BamHI geschnitten, die Enden mit Kalbsdarmphosphatase dephosphoryliert und das größere der zwei entstehenden DNA-Fragmente von einem Agarosegel gewonnen. Dieses DNA-Stück enthält den Plasmidvektoranteil, den Promoter und die codierende Sequenz für die ersten 63 Aminosäuren des reifen Interferons. Die beiden beschriebenen DNA-Fragmente wurden mit Ligase verknüpft und E.coli HB101 transformiert. Ein so erhaltenes Plasmid, welches das Insert in der korrekten Orientierung enthält (mit BamHI und BgIII schneidbar!) wurde pAH55 benannt. Dieses Plasmid ermöglicht die Expression von reifem EqlFN-a2 in E.coli.
-a- CO I /O3
Für die Herstellung eines^xpressionsplasmides für EqlFN-/3 wurde zunächst das Pferde-DNA-lnsert aus Plasmid pAH 60 am 3'-Ende verkürzt und dieses in weiterer Folge so manipuliert, daß ein reifes EqlFN-/3 Protein von einem bakteriellen Promoter exprimiertwird. Die Vorgangsweise ist in Fig. 16 schematisch dargestellt. pAH 60 wurde mit HgiAI geschnitten. Nach Inaktivierung des Enzyms wurden die 3'überhängenden DNA-Enden mit T 4 DNA-Polymerase (Zugabe von dATP, dGTP, dCTP, dTTP) begradigt. An die stumpfen Enden wurden Sphl-Linkerligiert und die erhaltene DNA mit Sphl und Hindill geschnitten. Ein entstandenes DNA-Fragment von 1,85kb Länge wurde von einem Agarosegel isoliert und mit Hindlll und Sphl doppelt geschnittenem Plasmid parpATER103 ligiert. Ein nach Transformation von E.coli HB101 erhaltener Klon mit dem gewünschten Plasmid wu rdepAH 61 benannt. Dieses Plasmid stellt eine Zwischenstufe für die weitere Konstruktion des Expressionsplasmides dar. pAH61 wurde mit BamHI und Sail zweifach geschnitten und ein entstandenes 1,3 bk langes DNA-Fragment von einem Agarosegel isoliert, gereinigt und mit BamHI/Sall doppelt verdauter M13 mp9 Phagen-DNA ligiert. Nach Transformation von E.coli JM101 konnte von einem rekombinanten Μ IS-Phagen^M 13pAH61) einzeisträngige Phagen-DNA gewonnen werden. Diese Einzelstrang-DNA wurde mit konasiertem 15mer Oligonukleotid 5'GTGAACTATGACTTG gemischt, auf 950C erhitzt und langsam auf Raumtemperatur abgekühlt. Das Oligonukleotid bindet genau ab der ersten Base der Sequenz des reifen ß-Interferons. Die Zweitstrangsynthese an der Einzelstrangvorlage, ausgehend vom 15mer-Primer wurde nach Zugabe von dATP, dGTP,dCTP, .
dTTP und Klenow-Fragment durchgeführt. Die DNA wurde extrahiert und ausgefällt. Verbliebene, einzeisträngige DNÄ-Abschηitte wurden mitS1-Nuklease verdaut. An die durch diese Behandlung stumpfendig gemachte DNA wurde das Gemisch der 12mer und 8mer Oligonukleotide 5'-AGCTTAAAGATG und 5'-CATCTTTA anligiert und die entstandene DNA mit Hindlll und Sphl geschnitten. Ein DNA-Fragment der gewünschten Länge von 1,1 kb wurde von einem Agarosegel isoliert und mit Hindlll/ Sphl doppelt geschnittenem Plasmid parpATER 103 ligiert. Nach Transformation von E.coli HB101 wurden 54 Kolonien erhalten. Von 9 daraus isolierten Plasmid-DNAs wurde ein 1,3kb langes EcoRI/Sall Fragment isoliert und mit der Sanger-Methode sequentiell. Ein daraus ermitteltes Plasmid mit der gewünschten Sequenz wurde pAH 62 benannt. Dieses Plasmid ermöglicht die effiziente Expression von reifem EqlFN-0 Protein in E.coli. Ein Plasmid das eine Deletion der ersten Base (G) des reifen /3-IFN Genes trägt, wurde pAH62deltaGI benannt. Dieses Plasmid erlaubt die Expression eines am Amino-Terminus verkürzten /3-IFN durch Translationsstart am nächstfolgenden ATG (entspricht Aminosäure 19 des reifen /3-IFN), das überraschenderweise antivirale Aktivität, wenn auch deutlich weniger, verglichen mit dem unverkürzten Protein, aufweist.
Zum Nachweis der Expression der Interfernoaktivität durch E.coli HB101, die das Plasmid pAH 52, pAH 52/2, pAH 53, pAH 55 oder pAH62 enthalten, wurden die Bakterien nach der Inkubation in einem geeigneten Kulturmedium aufgebrochen und der Überstand nach Sterilfiltration auf Interferonaktivität in einem Assay, der den cytopathischen Effekt (CPE) von VSV oder EMCV mißt, getestet. Verwendet wurden dazu NBL-6-Zellen (ATCC CCL 57, Pferdehaut-Epidermis-Zeilen), die mit Vesicular-Stomatitis-Virus (VSV) infiziert worden waren, und/oder A549 (ATCC CCL185, humane Lungencarcinom-Zelli.nie), die mit Encephalomyocarditis Virus (EMCV) infiziert worden waren. Die Ergebnisse sind im Beispiel 0 aufgelistet. Der Nachweis der exprimierten Pferde-Interferone wurde durch Markierung der Proteine in Maxizellen erbracht. Plasmidcodierte Proteine können durch Verwendung der Maxizelltechnik (37) selektiv in vivo markiert werden. Der E.coli Stamm CSR 603 (CGSC J5830) (F", thr-1, leuB6, proA2, phr-1, recA1, argE3, thi-1, uvrA6, ara-14, lacY1, galK2, xyl-5, mtl-l, gyrA98 (nalA98), rpsL31, tsx-33, λ", supE44,) besitzt keine Mechanismen für die Reparatur von durch UV-Bestrahlung entstandene Schäden der DNA. Durch Bestrahlung mit einer geeigneten UV-Strahlendosis wird das bakterielle Chromosom zerstört, einige der wesentlich kleineren und in mehreren Kopien pro Zelle vorhandenen Plasmid-DNAs bleiben dagegen funktionell. Nach Abtöten aller nicht geschädigten, sich vermehrenden Zellen durch das Antibiotikum D-Cycloserin und Aufbrauchen der endogenen mRNA werden in den verbleibenden Zellen nur noch am Plasmid codierte Gene transkribiert und translatiert und die gebildeten Proteine können durch Einbau von 35S-Methionin radioaktiv markiert und nachgewiesen werden. E.coli CSR603 wurde nach üblichen Verfahren mit den Expressionsplasmiden transformiert und auf ampicillinhaltigen Agarplatten auf transformierte Bakterien selektioniert. Die Präparation der Maxizellen und das Markieren der Proteine erfolgte nach einer Vorschrift von A. Sanear (37). In Fig. 17 ist das Autoradiogramm des getrockneten Geles dargestellt. Als Molekulargewichtsstandard wurde ein 14C-methyliertes Proteingemisch (Amersham) verwendet. Als Kontrollen wurden das Plasmid pER 103, das nur den Promoter ohne Interferongen enthält, und das Plasmid pER21/1 eingesetzt, welches zwei Kopien des humanen IFN-2arg Genes enthält. Die Proteinbanden bei etwa 18 kd sind die von den Plasmiden exprimierten Interferone.
Zum Nachweis der Gesamtanzahl von Sequenzen im Pferdegenom, welche hohe Homologie mit Interferongenen der Klasse IFN-a, IFN-/3 bzw. IFN-omega aufweisen, wurden hochmolekulare Pferde-DNA mit dem entsprechenden Restriktionsenzym vollständig verdaut und diese geschnittene DNA nach der Größe aufgetrennt. Nach Southern-Transfer auf Nitrozellulosefilter, Denaturieren und Fixieren der DNA wurde jedes Filter mit nicktranslatierter Probe hybridisiert. Als Probe für EqIFN- wurden ein 1,0kb langes Hindlll/Sphl-Fragment aus Plasmid pAH 52,für EqlFN-/3ein 1,1 kb langes Hindlll/Sphl-Fragment aus Plasmid pAH62 verwendet, welches jeweils die codierende Sequenz für das gesamte reife Interferon enthält. Als Probe für EqlFN-omega wurde das 2,1 kb EcoRI-lnsert aus Plasmid pRH 61 eingesetzt. Die Filter wurden anschließend unter stringenten Bedingungen gewaschen, daß keine Kreuzhybridisierung zwischen diesen 3 Interferonsequenzen eintritt: Die Autoradiographie erfolgte auf DuPont Cronex X-ray Film unter Verwendung von Kodak Lanex-Regular Verstärkerfolie 7 Tage bei -80°C. Das Ergebnis ist in Figur 18 gezeigt. Es zeigte überraschenderweise, daß im Pferdegenom mindestens 7 Gene der IFN-a Klasse, mindestens 2 Gene der IFN-/3 Klasse und mindestens;8 Gene der IFN-omega Klasse vorhanden sind.
Zur Herstellung des Expressionsplasmides pRH 100 wurde das Plasmid pER 103 (Eva Dworkin-Rastl et al., Gene 21 [1983] 237-248, EP-A-0.115-613) mit der Restriktionsendonuklease Hindlll linearisiert und die 5'terminalen Phosphatreste wurden entfernt.
Diese Plasmid-DNA wurde mit den phosphorylierten Oligonukleotiden d(AGCTTAAAGATGAGCT) und d(CATCTTTA) gemischt und ligiert. Die Ligasereaktion wurde mit der Restriktionsendonuklease Sacl verdaut und durch Zugabe von T4-PNK ligiert. Die Oligonukleotide wurden analog der in der EP-A-0.115-613 beschriebenen Methode hergestellt. Kompetenter E.coli Hb 101 wurde mit dieser Ligasereaktion versetzt und inkubiert.
Von den entstandenen'Bakterienkolonien wurden 12 willkürlich ausgesucht und daraus im Mikromaßstab die Plasmide isoliert (Birnboim und DoIy, Nucl. Acids Res. 7 [1979] 1513-1523). Die resultierende DNA wurde mit der Restriktionsendonuklease Sacl geschnitten und die DNA auf einem Agarosegel (1 %, 1 χ TBE-Puffer) aufgetrennt. Die Wanderung der DNA als lineares Molekül der Größe von etwa 4400 bp bestätigte die Einführung einer Sacl-Erkennungsstelle in das Plasmid. Eines dieser Plasmide wurde willkürlich ausgesucht. Mit der DNA aus der dazugehörigen Minipräparation wurde nochmals E.coli HB101 transformiert. Von
den resultierenden transformierten Bakterien wurde eine Kolonie ausgewählt und in größerem Maßstab angezüchtet. Das daraus isolierte Plasmid wurde mit den restriktionsendonukleasen EcoR! und BamHI geschnitten, die DNA auf einem 1%igen Agarosegel aufgetrennt, und das kleinere Fragment aus dem Gel durch Elektroelution isoliert. Dieses etwa 460bp lange EcoRI-BamHI DNA-Fragment wurde nach Sänger sequentiert (F. Sanger et al., Proc. Natl. Acad. Sei. [1977] 5463-5467). Das dermaßen analysierte Plasmid wurde pRH 100 genannt.
Zur Herstellung des Expressionsplasmides pAH4/2 wurde das Plasmid pRH 100 vollständig mit der Restriktionsendonuklease BamHI geschnitten und anschließend wurden mit Kalbsdarm-Phophatase (CIP) die 5'terminalen Phosphatreste entfernt. Das Plasmid pAH4 wurde mit BamHI verdaut und ein 0,6 kb langes DNA-Fragment, das die gesamte codierende Sequenz für CalFN-alpha 1 enthält, isoliert und gereinigt.
Dieses 0,6kb DNA-Fragment wurde mit der mit BamHI linearisierten pRH 100 Vektor-DNA ligiert; kompetenter E.coli HB101 wurde transformiert und auf LB-Agar ausgestrichen.
Von den entstandenen Bakterienkolonien wurden im Mikromaßstab Plasmide isoliert und durch Restriktionsanalyse mit verschiedenen Enzymen charakterisiert. Ein Plasmid, das Interferongen und Tryptophanpromotor in derselben Orientierung enthielt, wurde pAH 104 benannt (Figur 28). Dieses Plasmid stellt eine Zwischenstufe für die Herstellung des entgültigen Expressionsplasmides für reifes CalFN-Alphai dar.
Das 0,6kb lange BamHI Fragment aus dem Plasmid pAH4wurde mit synthetischem Oligonukleotid (5'TGCCACCTGCCCGAC), hergestellt analog EP-A-0.115-613, gemischt. Das 15mer Oligonukleotid enthält die codierende Sequenz für die N-terminalen 5 Aminosäuren des reifen Hunde alpha-lnterferons. Die DNA-Lösung wurde erhitzt und anschließend abgekühlt, wobei das in hohem Überschuß vorhandene Oligonukleotid an die komplementäre Stelle des DNA-Einzelstranges bindet. Anschließend erfolgte die Zweitstrangsynthese, ausgehend vom gebundenen Oligonukleotidprimer. Die verbliebenen, einzelsträngigen DNA-Abschnitte wurden mit S1 Nuklease entfernt. Die erhaltene DNA wurde verdaut und anschließend elektrophoretisch aufgetrennt. DNA-Fragmente einer Länge von etwa 300db wurden isoliert und gereinigt. Das Plasmid pAH 104 wurde verdaut und mit Klenow Polymerase inkubiert, um die DNA-Enden stumpf zu machen. Die erhaltene DNA wurde partiell geschnitten, die DNA elektrophoretisch aufgetrennt und Fragmente einer Länge von 4,3kb isoliert und gereinigt.
Die erhaltene DNA wurde mit dem zuvor beschriebenen 0,3 kb langen DNA-Fragment ligiert. Mit dieser Ligasereaktion wurde E.coli HB101 transformiert und auf amipicillinhaltigem LB-Agar plattiert.
Die entstandenen Bakterienkolonien wurden auffrische Agarplatten und im Duplikat auf Nitrozellulosefilter, die auf Agarplatten aufgelegt waren, übertragen. Nach Inkubation wurden die Bakterien nach einer Vorschrift von Grundstein und Hogness (M. Grundstein & D. Hogness, Proc. Natl. Acad. Sei. USA [1975] 72, 3961) lysiertund die DNA nach Denaturierung an die Nitrozellulose gebunden. Die Zellbruchstücke wurden entfernt. Die Filter wurden anschließend mit 32p markiertem Oligodesoxynukleotid d(TGCCACCTGCCCGAC) hybridisiert.
Die Filter wurden auf Kodak X-omat S Röntgenfilm unter Verwendung von Kodak X-omat Regular Verstärkerfolien bei -800C exponiert. Von Bakterienkolonien, die im Autoradiogramm ein positives Hybridisierungssignal lieferten, wurde durch ein Minipräparationsverfahren Plasmid-DNA isoliert. Die Plasmide wurden mit Hindlll und BamHI vollständig geschnitten. Nach elektrophoretischer Auftrennung in einem Agarosegel wurden 0,5kb lange Restriktionsfragmente isoliert und der DNA-Sequenzanalyse nach Sanger zugeführt.
Ein Plasmid, das die gewünschte Struktur aufwies, wurde pAH4/2 benannt. Es ermöglichte die Expression von reifem CalFN-alpha in E.coli.
Zur Herstellung des Plasmides pAH 4/3 wurde das für die bakterielle Expression von CalFN-alpha 1 manipulierte Gen aus dem Plasmid pAH4/2 in einem modifizierten Plasmidvektor parpATER 103 subkloniert, das eine höhere Kopienzahl pro Zelle und erhöhte Plasmidstabilität aufweist. DasO,5kb lange Hindlll/BamHI Fragment von pAH4/2 wurde mit Hindlll und BamHI geschnittenem und gelgereinigtem Plasmidvektor parpATER 103 ligiert. Kompetenter E.coli HB101 wurde mit der Ligasereaktion transformiert und plattiert.
Von den entstandenen Bakterienkolonien wurden 6 willkürlich ausgesucht und daraus im Mikromaßstab die Plasmide isoliert. Ein Plasmid, das nach Restriktionsanalyse mit verschiedenen Restriktionsendonukleasen die gewünschte Struktur aufwies, wurde pAH4/3 benannt.
Zum Nachweis der Expression der Interferonaktivität durch E.coli HB101, die das Plasmid pAH4/2 oder pAH4/3 enthalten, wurden die Bakterien nach der Inkubation in einem geeigneten Kulturmedium aufgebrochen und der Überstand nach Sterilfiltration auf Interferonaktivität in einem Assay, der den cytophatischen Effekt (CPE) von VSV mißt, getestet. Verwendet wurden dazu A-72 Zellen (ATCC CRL1542, caninerTomor), die mit Vesicular-Stomatitis-Virus (VSV) infiziert worden waren. Die Ergebnisse sind im Beispiel K aufgelistet.
Zum Nachweis der Gesamtzahl von Sequenzen im Hundegenom, die hohe Homologie mit Interferongenen der Klasse IFN-alpha und IFN-omega aufweisen, wurde hochmolelulare Hunde-DNA mit den entsprechenden Restriktionsenzymen vollständig verdaut und geschnittene DNA nach der Größe aufgetrennt.
Nach Southern Transfer auf Nitrozellulosefilter, Denaturieren und Fixieren der DNA wurde jedes Filter mit nicktranslatierter DNA-Probe hybridisiert.
Als Probe für CalFN-alpha wurde ein 0,6kb langes BamHI Fragment aus Plasmid pAH 4 verwendet, das die gesamte'codierende Sequenz für das Interferon enthält. Als Probe für EqlFNq-omega wurde das 2,1 kbEcoRI-lnsert des Plasmides pRH 61 eingesetzt. Die hybridisierten Filter wurden anschließend unter stringenten Bedingungen gewaschen. Die Autoradiographie erfolgte auf DuPont Cronex X-ray Film unter Verwendung von Kodak Lanex-Regular Verstärkerfolie 7 Tage bei -800C. Das Autoradiogramm (Figur 9) zeigt, daß im Hundegenom außer den beiden, für identische alpha-lnterferone codierenden Gene keine weiteren Sequenzen nachweisbar sind, die mit CalFN-alpha 1 einen ähnlich hohen Homologiegrad aufweisen, wie er bei anderen Spezies innerhalb einer Interferonklasse auftritt. Mit der DNA für EqlFN-omega ist unter weniger stringenten Bedingungen mindestens ein Gen nachweisbar, das unterschiedlich von den beschriebenen alpha-lnterferonen des Hundes ist.
Transformation der Zellen mit den Vehikeln kann durch eine Vielzahl an Verfahren erreicht werden. Beispielsweise kann sie durch Kalzium erfolgen, wobei entweder die Zellen in Magnesium gewaschen und die DNA den in Kalzium suspendierten Zellen zugegeben oder die Zellen einem Kopräzipitat von DNA und Kalziumphosphat ausgesetzt werden. Bei nachfolgender Genexpression werden die Zellen auf Medien übertragen, die für transformierte Zellen selektieren.
Nach erfolgterTransformation des Wirtes, Expression des Gens und Fermentation oder Zellkultivierung unter Bedingungen, bei denen die erfindungsgemäßen Proteine exprimiert wird, kann das Produkt üblicherweise durch bekannte chromatographische Trennmethoden extrahiert werden, um so ein Material zu erhalten, das die Proteine mit oder ohne Leader und Tailing-Sequenzen enthält. Die erfindungsgemäßen Interferone können mit einer Leader-Sequenz am N-Terminus exprimiert werden (Pre-IFN), die von einigen Wirtszellen entfernt werden kann. Wenn nicht, so ist eine Abspaltung des Leader-Polypeptids (wenn vorhanden) erforderlich, um reifes IFN zu erhalten. Alternativ kann der IFN Klon so modifiziert werden, daß das reife Protein im Mikroorganismus direkt statt des Pro-IFN produziert wird. Für diesen Fall kann die Precursor-Sequenz des Hefe-Mating-Pheromons MF-alpha-1 verwendet werden, um eine korrekte „Reifung" des fusionierten Proteins und die Ausscheidung der Produkte in das Wachstumsmedium oder den periplasmischen Raum zu gewährleisten. Die DNA-Sequenz für funktionelles oder reifes IFN kann mit MF-alpha-1 an der vermuteten kathepsinähnlichen Schnittstelle (nach Lys-Arg) an Position 256 vom Initiationäcodon ATG aus (Kurjan, Herskowitz, Cell 30,933-943 [1982]) verbunden sein.
Basierend auf ihrem biologischen Wirkungsspektrum sind die neuen, erfindungsgemäßen Interferone verwendbar für jede Art der Behandlung, für die auch die bekannten Interferone eingesetzt werden. Diese beinhalten beispielsweise Herpes, Rhinovirus, EquineVCanine-Abortion-Virus, verschiedene Krebsarten und ähnliches. Die neuen Interferone können alleine oder in Kombination mit anderen bekannten Interferonen oder biologisch aktiven Produkten eingesetzt werden, beispielsweise mit IFN-alpha, IL-2, anderen Immun-Modulatoren und ähnlichen.
Die erfindungsgemäßen Interferone können parenteral verabreicht werden in Fällen, in denen Antitumor oder antivirale Behandlung erforderlich ist, und in Fällen, in denen sich immunosuppressive Eigenschaften zeigen. Dosierung und Dosierungsrate können ähnlich denen sein, die zur Zeit bei klinischen Untersuchungen für IFN-a-Materialien gelten, z. B. ca. (1 - 10) χ 106 Einheiten täglich, und bei Präparaten, die zu mehr als 1% rein sind, bis zu beispielsweise 5 x 107Einheitentäglich. Beispielsweise können für eine zweckmäßige Dosierungsform bei einem im wesentlichen homogenen, bakteriell produzierten erfindungsgemäßen IFN, bei parenteraler Verwendung 3mg IFN-omega in 25ml 5%igem tierischem Serum Albumin, vorzugsweise Pferde/Hunde Serum Albumin, gelöst werden. Diese Lösung wird dann durch ein bakteriologisches Filter gegeben und die gefilterte Lösung aseptisch auf 100 Fläschchen verteilt, von dem jedes 6 χ 106 Einheiten reines IFN zurparenteralen Applikation geeignet, enthält. Die Gläschen werden vor Verwendung vorzugsweise in der Kälte (-2O0C) aufbewahrt. Die erfindungsgemäßen Substanzen können in bekannter Weise formuliert werden, um pharmazeutisch verwendbare Mittel zu erhalten, wobei das erfindungsgemäße Polypeptid mit einer pharmazeutischen, akzeptablen Trägersubstanz vermischt wird. Gebräuchliche Trägerstoffe und ihre Formulierung sind bei E.W.Martin in Remingtom's Pharmaceutical Sciences beschrieben, worauf ausdrücklich Bezug genommen wird. Die erfindungsgemäßen Interferone werden mit einer angemessenen Menge des Trägerstoffes vermischt, um geeignete pharmazeutische Mittel zu schaffen, die für eine effektive Anwendung beim Empfänger (Patienten) geeignet sind. Bevorzugt wird eine parenterale Applikation vorgenommen. Mit Hilfe der vorliegenden Erfindung ist es also erstmals möglich, Pferde- und Hunde-Interferone und die sie codierenden Gensequenzen zu erhalten. Gegenstand der nach der erfindungsgemäßen Lehre erhaltenen Substanzen sind im einzelnen Proteine: Pferde-alpha-lnterferone, im wesentlichen frei von anderen Proteinen tierischer Herkunft.
— in im wesentlichen reiner Form,
— frei von nativer Glykosylierung,
— ein Leader-Peptid enthaltend,
— eine Aminosäuresequenz nach Formel I oder Il oder biologisch aktive Varianten dieser Sequenzen enthaltend,
— nach dem erfindungsgemäßen Verfahren herstellbar
Pferde-omega-lnterferone, im wesentlichen frei von anderen Proteinen tierischer Herkunft.
— in im wesentlichen reiner Form,
— frei von nativer Glykosylierung,
— ein Leader-Peptid enthaltend,
— eine Aminosäuresequenz nach Formel III oder biologisch aktive Varianten dieser Sequenzen enthaltend,
— nach dem erfindungsgemäßen Verfahren herstellbar
Pferde-beta-lnterferone, im wesentlichen frei von anderen Proteinen tierischer Herkunft.
— in im wesentlichen reiner Form,
— frei von nativer Glykosylierung.
— ein Leader-Peptid enthaltend.
— eine Aminosäuresequenz nach Formel IV oder biologisch aktive Varianten dieser Sequenzen enthaltend.
— nach dem erfindungsgemäßen Verfahren herstellbar
Hunde-alpha-lnterferone, im wesentlichen frei von anderen Proteinen.tierischer Herkunft.
— in im wesentlichen reiner Form.
— frei von nativer Glykosylierung.
— ein Leader-Peptid enthaltend.
— eine Aminosäuresequenz nach Formel V oder biologisch aktive Varianten dieser Sequenzen enthaltend
— nach dem erfindungsgemäßen Verfahren herstellbar
DNA-Seqeuenzen:
— für EqlFN-alpha codierende Sequenzen.
— für EqlNF-alpha codierende Sequenzen oder degenerierte Variationen dieser Sequenzen, die in die Hindlll Schnittstelle des Plasmides pUC9 eingefügt sind.
— dasPlasmid pAH50.
— dasPlasmid pRH63.
— für EqlFN-alpha codierende Sequenzen oder degenrierte Variationen dieser Sequenzen, die unter stringenten Bedingungen, die eine Homologie größer als 85%, vorzugsweise größer als 95%, erkennen lassen, mit den Inserts der Plasmide pAH 50 oder pRH63 hybridisieren.
— für EqlFN-alpha codierende Sequenzen oder degenerierte Variationen dieser Sequenzen, die in einem Expressionsvektor enthalten sind, der in Mikroorganismen, vorzugsweise in Prokaryoten oder Eukaryoten, und in Säugetierzellen replizierbar ist.
— die DNA-Sequenz nach Formel I oder Il oder degenerierte Variationen dieser Sequenzen.
— für EqlFN-omega codierende Sequenzen.
— für EqlFN-omega codierende Sequenzen oder degenerierte Variationen dieser Sequenzen, die in die EcoRI Schnittstelle des Plasmides pUC9 eingefügt sind.
— dasPlasmid pRH61.
— für EqlFN-omega codierende Sequenzen oder degenerierte Variationen dieser Sequenzen, die unter stringenten Bedingungen, die eine Homologie größer als 85%, vorzugsweise größer als 95%, erkennen lassen, mit den Inserts des Plasmides pRH61 hybridisieren.
— für EqlFN-omega codierende Sequenzen oder degenerierte Variationen dieser Sequenzen, die in einem Expressionsvektor enthalten sind, der in Mikroorganismen, vorzugsweise in Prokaryoten oder Eukaryoten, und in Säugetierzellen replizierbar ist.
— die DNA-Sequenz nach Formel III oder degenerierte Variationen dieser Sequenz.
— für EqlFN-beta codierende Sequenzen.
— für EqlFN-beta codierende Sequenzen oder degenerierte Variationen dieser Sequenzen, die in die Hind IM Schnittstelle des Plasmides pAH 60 eingefügt sind.
— dasPlasmidpAH60.
— für EqlFN-beta codierende Sequenzen oder degenerierte Variationen dieser Sequenzen,.die unter stringenten Bedingungen, die eine Homologie größer als 85%, vorzugsweise größer als 95%, erkennen lassen, mit den Inserts des Plasmides pAH 60 hybridisieren.
— für EqlFN-beta codierende Sequenzen oder degenerierte Variationen dieser Sequenzen, die in einem Expressionsvektor enthalten sind, der in Mikroorganismen, vorzugsweise in Prokaryoten oder Eukaryoten, und in Säugetierzellen replizierbar ist.
— die DNA-Sequenz nach Formel IV oder degenerierte Variationen dieser Sequenz.
— für CalFN-alpha codierende Sequenzen.
— für CalFN-alpha codierende Sequenzen oder degenerierte Variationen dieser Sequenzen, die in die Hindlll Schnittstelle des Plasmides pAH 2 oder pAH 4 eingefügt sind.
— dasPlasmidpAH2.
— das Plasmid pAH4.
— für CalFN-alpha codierende Sequenzen oder degenerierte Variationen dieser Sequenzen, die unter stringenten Bedingungen, die eine Homologie größer als 85%, vorzugsweise größer als 95%, erkennen lassen, mit den Inserts der Piasmide pAH 2 oder pAH 4 hybridisieren.
— für CalFN-alpha codierende Sequenzen oder degenerierte Variationen dieser Sequenzen , die in einem Expressionsvektor enthalten sind, der in Mikroorganismen, vorzugsweise in Prokaryoten oder Eukaryoten und in Säugetierzellen replizierbar ist.
— die DNA-Sequenz nach Formel V oder degenerierte Variationen dieser Sequenz, transformierte Wirtsorganismen:
— die die für EqlFN-alpha, -omega oder -beta oder die für CalFN-alpha codierenden genetischen Informationen enthalten, vorzugsweise Prokaryoten, Eukaryoten oder Säugetierzellen, insbesondere E.coli der E.coli JM101.
— die die genetischen Sequenzen für die erfindungsgemäßen Proteine in einem in den Wirtsorganismen replizierbaren Vektor enthalten.
Plasmide:
— Plasmid pAH51, dadurch gekennzeichnet, daß ein 4,2kb.langes DNA-Fragment des mit Hindll geschnittenen Plasmides pAH 50, mit Sphl-Linkern versehen und nach Schneiden mit Sphl zirkularisiert ist.
— Plasmid pAH51/2, dadurch gekennzeichnet, daß es in der Hindlll/Bglll-Schnittstelle des Plasmides pAH51 anstelle des plasmideigenen, längeren Fragmentesein Fragment enthält, das aus dem 0,4kb langen Pvull Fragment des Plasmides pAH50 erhalten wurde, nachdem in Gegenwart des 15-mer Oligonukleotid-Primers
5TGTGACCTGCCTCAc denaturiert, mit Klenow-Fragment verlängert, der Oligonukleotidkomplex
6AGCTTAAAGATg 3ATTTCTAC
anligiert und mit Hindlll und BgIII geschnitten worden war.
— Expressionsplasmid parpATER103, dadurch gekennzeichnet, daß in die EcoRI/Hindlll-Schnittstelle des Plasmides pAT153 ein 0,47 kb langes DNA-Fragment des mit EcoRI partiell und mit Hindlll vollständig geschnittenen Plasmides parpER33 eingefügt ist.
— Expressionsplasmid pAH 52/2, dadurch gekennzeichnet, daß in die Hindlll/BamHI-Schnittstelle des Plasmides parpATER 103 anstelle des plasmideigenen, kürzeren Fragmentes das 1,0kb lange Hindlll/BamHI-Fragment des Plasmides pAH51/2 eingefügt ist.
— Expressionsplasmid pAH52, dadurch gekennzeichnet, daß in die Hindlll/Sphl-Schnittstelle des Plämides parpATER 103 anstelle des plasmideigenen, kürzeren Fragmentes das Hindlll/Sphl-Fragment des Plasmides pAH51/2 eingefügt ist.
— Expressionsplasmid pAH53, dadurch gekennzeichnet, daß das mit Klenow-Fragment begradigte und dephosphorylierte 2,4kb lange EcoRI/Pvull-Fragment aus pBR322 mit einem, mit Klenow-Fragment begradigtem, 1,1 kb langem EcoRI/Sphl-Fragment des Plasmides pAH 52 verknüpft ist.
— Expressionsplasmid pAH 55, dadurch gekennzeichnet, daß das Plasmid pAH 52/2 anstelle des plasmideigenen, kürzeren Bglll/BamHI-Fragmentes das 0,1 kb lange Bglll/BamHI-Fragment des Plasmides pRH 63 aufweist.
— Plasmid pAH61, dadurch gekennzeichnet, daß in die Hindlll/Sphl-Schnittstelle des Plasmides parpATER 103 anstelle des plasmideigenen, kürzeren Fragmentes ein 1,85kb langes DNA-Fragment des mit HgiAI geschnittenen Plasmides pAH 60, das mit T4-DNA Polymerase begradigt, mit Sphl-Linkern versehen und anschließend mit Hindlll und Sphl geschnitten wurde, eingefügt ist.
— M 13pAH61, dadurch gekennzeichnet, daß das 1,3kb lange BamHI/Sall-Fragment des Plasmides pAH61 mit BamHI/Sall doppelt verdauter M 13mp9-Phagen-DNA verknüpft ist.
— Expressionsplasmid pAH62, dadurch gekennzeichnet, daß ein mit Hilfe des 15-mer
51GTGAACTATGACTTg doppelsträngig gemachtes, mit S1 Nuklease behandeltes, mit dem Oligonukleotidkomplex
5'AGCTTAAAGATG
3ATTTCTAC
ligiertes und mit Hindlll und Sphl geschnittenes Fragment des M 13pAH61 in die Hindlll/Sphl-Schnittstelle des Plasmides parpATER 103 anstelle des plasmideigenen, kürzeren Fragmentes eingefügt ist.
— Expressionsplasmid pRH 100, dadurch gekennzeichnet, daß in die Hindlll-Schnittstelle des Plasmides pER 103 der Oligonukleotidkomplex ·.. .
51AGCTTAAAGATGAGCTCATCTTTa 31ATTTCTACTCGAGTAGAAATTCGa
eingefügt ist.
— Plasmid pAH 104, dadurch gekennzeichnet, daß es in der BamHI-Schnittstelle des Plasmides pRH 100 die codierende Sequenz für das CalFN-alpha 1 enthält.
— Expressionsplasmid pAH4/2, dadurch gekennzeichnet, daß in die stumpfendig gemachte Sacl-Schnittstelle des Plasmides pAH 104 die codierende Sequenz für das reife CalFN-alpha 1 eingefügt ist.
— Expressionsplasmid pAH 4/3, dadurch gekennzeichnet, daß das 0,5 kb lange Hindlll/BamHI Fragment des Plasmides pAH 4/2 in die Hindlll/BamHI-Schnittstelle des Plasmides parpATER 103 eingefügt ist.
Außerdem werden Verfahren zur Herstellung dieser Plasmide beschrieben:
— Verfahren zur Herstellung des Plasmides pAH 51, dadurch gekennzeichnet, daß das Plasmid pAH 50 mittels Hindll geschnitten, das 4,2 kb lange Fragment mit Sphl-Linkem versehen wird, anschließend mit Sphl geschnitten und mit DNA-Ligase zirkularisiert wird und das so erhaltene Plasmid zur Replikation in E.coli HB101 transformiert und kultiviert wird.
— Verfahren zur Herstellung des Plasmides pAH 1/2, dadurch gekennzeichnet, daß das Plasmid pAH50 mit Pvull geschnitten wird, dasO,4kb lange Fragment in Gegenwart des 15-mer Oligonukleotid-Primers
5'TGTGACCTGCCTCAC
. denaturiert, der an den Einzelstrang gebundene Primer mit Klenow-Fragment verlängert, ein möglicher 3'-Überhang entfernt, der Oligonukleotidkomplex
5'AGCTTAAAGATG 3ATTTCTAC
anligiert wird, das erhaltene DNA-Fragment nach Restrikionsendonukleaseverdauung mit Hindlll und BgIII in die Hindlll/Bglll-Schnittstelle des Plasmides pAH 51 anstelle des plasmideigenen, längeren Fragmentes eingefügt wird und das so erhaltene Plasmid zur Replikation in E.coli HB101 transformiert und kultiviert wird.
— Verfahren zur Herstellung des Plasmides parpATER 103, dadurch gekennzeichnet, daß in das durch Restriktionsendonukleaseverdauung mitEcoRI und Hindlll linearisierte Plasmid pAT153ein 0,47 kb langes Fragment des mit Hindlll vollständig, mit EcoRI partiell geschnittenen Plasmides parpER33 mittels Ligasereaktion eingefügt wird und das so erhaltene Plasmid zur Replikation in E.coli HB101 transformiert und kultiviert wird.
— Verfahren zur Herstellung des Expressionsplasmides pAH52/2, dadurch gekennzeichnet, daß in die Hindlll/BamHI-Schnittstelle des Plasmides parpATER 103 anstelle des plasmideigenen, kürzeren Fragmentes das 1,0kb lange Hindlll/BamHI-Fragment des Plasmides pAH 51/2 eingefügt wird und das so erhaltene Plasmid zur Replikation in E.coli HB101 transformiert und kultiviert wird.
— Verfahren zur Herstellung des Expressionsplasmides pAH 52, dadurch gekennzeichnet, daß in die Hindlll/Sphl-Schnittstelle des Plasmides parpATER103 anstelle des plasmideigenen, kürzeren Fragmentes das Hindlll/Sphl-Fragment des Plasmides pAH 51/2 eingefügt wird und das so erhaltene Plasmid zur Replikation in E.coli HB101 transformiert und kultiviert wird.
— Verfahren zur Herstellung des Expressionsplasmides pAH 53, dadurch gekennzeichnet, daß das mit Klenow-Fragment begradigte und dephosphorylierte2,4kb lange EcoRI/Pvull-Fragment aus pBR322 mit einem, mit Klenow-Fragment begradigtem 1,1 kb langem EcoRI/Sphl-Fragment des Plasmides pAH 52 verknüpft wird und das so erhaltene Plasmid zur Repükation in E.coli HB101 transformiert und kultiviert wird.
— Verfahren zur Herstellung des Expressionsplasmides pAH 55, dadurch gekennzeichnet, daß in das Plasmid pAH 52/2 anstelle des plasmideigenen, kürzeren Bglll/BamHI-Fragmentes das 1,0kb lange Bglll/BamHI-Fragment des Plasmides pRH 63 eingefügt wird und das so erhaltene Plasmid zur Replikation in E.coli HB101 transformiert und kultiviert wird.
— Verfahren zur Herstellung des Plasmides pAH 61, dadurch gekennzeichnet, daß in die Hindlll/Sphl-Schnittstelle des Plasmides parpATER 103 anstelle des plasmideigenen, kürzeren Fragmentes ein 1,85 kb langes DNA-Fragment des mit HgiAI geschnittenen Plasmides pAH 60, das mit T4-DNA Polymerase begradigt, mit Sphl-Linkern versehen und anschließend mit Hindlll und Sphl geschnitten wird, eingefügt wird und das so erhaltene Plasmid zur Replikation in E.coli HB101 transformiert und kultiviert wird.
— Verfahren zur Herstellung des M 13pAH 61, dadurch gekennzeichnet, daß das 1,3kb lange BamHI/Sall-Fragment des Plasmides pAH61 mit BamHI/Sall doppelt verdauter M13mp9-Phagen-DNA verknüpft wird und zur Replikation in E.coli HB101 transformiert und kuJtiviert wird.
___ ^eppg|^ren zur Herstellung des Expressionsplasmides pAH62, dadurch gekennzeichnet, daß ein mit Hilfe des 15-mer
5OTGAACTATGACTTg doppelsträngig gemachtes, mit S 1-Nuklease behandeltes, mit dem Oligonukleotidkomplex
5'AGCTTAAAGATG 3'ATTTCTAC
ligiertes und mit Hindill und Sphl geschnittenes Fragment des M 13pAH 61 in die Hindlll/Sphl-Schnittstelle des Plasmides parpATER 103 anstelle des plasmideigenen, kürzeren Fragmentes eingefügt wird und das so erhaltene Plasmid zur Replikation in E.coli HB101 transformiert und kultiviert wird.
— Verfahren zur Herstellung des Plasmides pAH 4/2, dadurch gekennzeichnet, daß in die stumpfendig gemachte Sacl Schnittstelle des Plasmides pAH 104 die für das reife CalFN-alpha 1 codierende Sequenz eingefügt wird und das so erhaltene Plasmid zur Replikation in E.coli HB101 transformiert und kultiviert wird. '
— Verfahren zur Herstellung des Plasmides pAH4/2, dadurch gekennzeichnet, daß das 0,6kb lange BamHI-Fragment des Plasmides pAH4mitdem Oligonukleotidprimer
5TGCCACCTGCCCGAc
verbunden wird, die Zweitstrangssynthese mit Hilfe des Klenow Fragmentes durchgeführt wird, die verbliebenen Einzelstränge mit S 1-Nuklease entfernt wird, die DNA mit Pstl geschnitten wird und mit dem 4,3 kb langen Fragment des Plasmides pAH104, das nach partiellem Pstl-Verdau des mit Klenow Polymerase stumpfendig gemachten Sacl-Fragmentes erhalten wird, mit Hilfe von DNA Ligase ligiert wird.
— Verfahren zur Herstellung des Expressionsplasmides pRH 100, dadurch gekennzeichnet, daß das Plasmid pER 103 mittels Hindill linearisiert, mit dem Oligonukieotidkomplex
5AGCTTAAAGATGAGCTCATCTTTa 3ATTTCTACTCGAGTAGAAATTCGa
ligiert, die Ligasereaktion mit Sacl verdaut und anschließend zirkularisiert wird und das so erhaltene Plasmid zur Replikation in E.coli HB101 transformiert und kultiviert wird.
— Verfahren zur Herstellung des Expressionsplasmides pAH4/3, dadurch gekennzeichnet, daß in die Hindlll/BamHI-Schnittstelledes Plasmides parpATER 103 das 0,5 kb lange Hindlll/BamHI Fragment des Plasmides pAH 4/2 eingefügt wird und das so erhaltene Plasmid zur Replikation in E.coli HB101 transformiert und kultiviert wird.
Gegenstand der Erfindung sind ebenfalls Verfahren zur Herstellung der erfindungsgemäßen Proteine:
— Verfahren zur Herstellung von EqlFN-alpha, -beta, -omega oder CalFN-alpha, dadurch gekennzeichnet, daß
a) ein Wirtsorganismus, vorzugsweise ein Prokaryot, Eukaryot oder eine Säugetierzelle, insbesondere E.coli oder Saccharomyces cerevisiae, mit genetischen Informationen, codierend für EqlFN-alpha, -beta, -omega oder CalFN-alpha, vorzugsweise mit den für die erfindungsgemäßen Proteine codierenden Sequenzen aus den Plasmiden pAH50, pAH62, pRH63, pRH 61, pAH 60, pAH 2 oder pAH 4 oder den mit diesen Plasmiden unter stringenten Bedingungen, die eine Homologie größer als 85%, vorzugsweise größer als 90%, erkennen lassen, hybridisierende Sequenzen, insbesondere Sequenzen gemäß einer der Formeln I bis V oder degenerierten Variationen dieser Sequenzen transformiert.
b) die codierende Sequenz in einem Expressionsvektor, vorzugsweise in einem der Expressionsvektoren pAH52, pAH52/2, pAH 53, pAH 55, pAH 62, pAH4/2 oder pAH4/3 enthalten ist und diese Information zur Produktion des EqlFN-alpha, -beta, -omega oder CalFN-alpha im Wirtsorganismus exprimiert und
c) das Interferon EqlFN-alpha, -beta, -omega oder CalFN-alpha, vorzugsweise ein Interferon gemäß einer der Formeln I bis V, isoliert und gereinigt wird.
Weiterhin ist die Verwendung der erfindungsgemäßen Proteine zur therapeutischen Behandlung sowie Mittel für die therapeutische Behandlung, die neben pharmazeutisch inerten Trägerstoffen eine wirksame Menge an diesen Proteinen enthalten, Gegenstand der Erfindung.
Die folgenden Beispiele, die die Erfindung nicht eingrenzen sollen, beschreiben die Erfindung unter Bezugnahme auf die Zeichnungen im Detail.
Es zeigen: v
Fig. 1: das Auftreten von mehreren Banden als Beweis für eine Familie von alpha-lnterferongenen bei Pferden; Fig.2 und 3: Restriktionskarten der Klone Eq-alpha 1, Eq-alpha 16, Eq-alpha 20 undEq-beta 6; Fig. 4; 8; 10; 12; 24; 25: Totalsequenzen von Inserts verschiedener rekombinanter Phagen mittels Computerprogramm; Fig. 5; 6 und 7: Vergleich verschiedener Interferone;
Fig.9: Restriktionskarten für pRH61 und pRH 63;
Fig. 11: Darstellung der DNA-Sequenz des Klons pRH63;
Fig. 13: die Herstellung des Plasmides parpATER 103;
Fig. 14: die Herstellung der Plasmide pAH52, pAH52/2 und pAH 53 sowie deren Vorstufen;
Fig. 15: die Herstellung des Plasmides EqlFN-a2; · , .
Fig. 16: die Herstellung des Plasmides EqlFN-ß;
Fig. 17: das Autodiagramm des getrockneten Gels beim Nachweis der exprimierten Pferde-Interferone;
Fig. 18: das Autodiagramm zum Nachweis der Anzahl von Sequenzen im Pferdegenom; Fig. 19 und 20: den Aufbau des DNA-Fragments des Eq-alpha20;
Fig.21: den Aufbau der a-lnterferongene bei Hunden;
Fig.22: die Restriktionskarte des Ca-alpha-11-2-Klons;
Fig.23: den Aufbau des Smal-Fragment-Subklon von Ca-alpha 11-2;
Fig.26: Vergleich verschiedener Proteinsequenzen von a-lnterferongenen;
Fig. 27: Vergleich verschiedener «-Interferone;
Fig.28: Restriktionsanalyse des Plasmides pAH 104.
Materialien
Die Ausgangsmaterialien wurden teilweise käuflich erworben, teilweise stammten sie vom EMBL in Heidelberg. E.coli JM101, pUC8, pUC9, M 13mp8 und M 13mp9 stammten von den Bethesda Research Laboratories, die E.coli-Stämme mit dem Suppressorfaktorsup F, beispielsweise E.coli NM 526,538 und 539 und der Vektor Iambda-EMBL3 oder 3 A stammten von EMBL, sind jedoch teilweise auch bei der Firma Stehelin/Basel (Schweiz) erhältlich.
Gefrorenes Gewebe, z.B. Pferdeleber wurde in flüssigem Stickstoff zu feinem Pulver zermahlen und in 0,5 M EDTA, 1OmM Tris-Hcl pH 8,0,0,5% SDS, 0,1 mg/ml Proteinase K {20 ml/g Gewebe) 3 Stunden bei 55°C inkubiert. Die erhaltene, viskose Lösung wurde durch einen Phenolextraktion und 3malige Extraktion mit Phenol/Chloroform/Isoamylalkohol (25/24/I VoI) von Protein befreit, gegen 50mMTris-HCI pH8,0,1OmM EDTA, 1OmM NaCI dialysiert und die DNA mit 2 Volumina Äthanol ausgefällt. Nach vollständiger Trocknung im Vakuum wurde die DNA in TE-Puffer (10 mM Tris-HCI pH 8,0,1mM EDTA) bei 4°C in Lösung gebracht und mit 1,273g CsCI/ml Lösung 62 Stunden mit40000UpM bei 20°Czentrifugiert (Sorvall 50Ti-Robor). Der CsCI-Gradient wurde ausgetropft, die DNA enthaltenden Fraktionen gegen TE-Puffer dialysiert und die DNA anschließend mit 2 Volumina Äthanol gefällt, mit 70%igem Äthanol gewaschen, getrocknet und wieder in TE-Puffer gelöst (4°C).
Das fertige DNA-Präparat war frei von RNA und länger als 50 kb (durch Elektrophorese an einem 0,45%igen Agarosegel bestimmt).
Zweimal 50/u.g Pferde-DNA wurden mit 1,6 Einheiten Sau3A in 450/nl Reaktionsmedium (1OmM Tris-HCI pH7,5,1OmM MgCI2 1 mM Dithiothreitol) bei 37°C inkubiert. Nach 15, 25 und 40 Minuten wurden 150μΙ Aliquots entnommen und mit 15mM EDTA versetzt und durch lOminütiges Erwärmen auf 700C die Reaktion gestoppt. Nach Zusatz von 0,3 M NaAcetat pH 6,0, wurde die DNA mit 2,5 Volumina Äthanol gefällt. Nach dem Wiederauflösen in TE-Puffer wurde die DNA auf einem 0,45%igen Agarosegel in TBE-Puffer (10,8g/l Tris, 5,5g/l Borsäure, 0,93g/l (Na2EDTA) bei ca. 1 V/cm über Nacht elektrophoretisch der Größe nach getrennt. Anhand von Größenmarkern (mit EcoRI und Hindlll doppelverdaute und mit Hindill verdaute Lambda-DNA) wurde das Gelstück mit DNA einer Länge von 10-23 kb herausgeschnitten, die DNA aus dem Gel in einen Dialysenschlauch 3 Stunden bei 300 V elektroeluiert (Puffer 0,1 χ TBE), auf einer Elutip-D-Säule (Schleicherund Schüll) gemäß der Verwendungsvorschrift gereinigt und anschließend mit Äthanol gefällt.'
Um die Selbstligation von Pferde-DNA-Fragmenten zu verhindern, was einerseits zu artifiziellen Hybriden von Pferde-DNA-Sequenzen, andererseits zu zu großen und damit nicht mehr in Lambda-Phagen verpackbaren DNA-Stücken führen kann, wurden die größenfraktionierten Pferde-DNA-Stücke dephosphoryliert.
Dazu wurde die DNA in 140μ.Ι Reaktionsmedium (5OmM Tris-HCI pH 9,5,1,OmM MgCI2,0,1 mMZnAcetat, 1 mMSpermidin) mit 5 Einheiten Bovine Intestinal Phosphatase 30 Minuten bei 370C inkubiert, weitere 5 Einheiten Enzym zugegeben und 30 Minuten inkubiert. Nach Zugabe von EDTA auf 25 mM Endkonzentration wurde die DNA einmal mit Phenol/Chloroform/Isoamylalkohol (25/24/1 VoI), 2mal mit Chloroform/Isoamylalkohol (24/1 VoI) und 3mal mit Diäthyläther extrahiert, mit Äthanol gefällt, getrocknet und in 0,1 χ TE-Puffer gelöst.
Diedephosphorylierten, 10—23 kb Pferde-DNA-Fragmente wurden in einem lambda-Vektor, beispielsweise Lambda-EMBL3oder -3A (3) mit G-A-T-C kohäsiven Enden, durch Entfernung des internen BamHI-Fragmentes der Phagen-DNA gewonnen, geklont.
Der Vektor wurde in einem E.coli Stamm mit dem Suppressorfaktor sup F. beispielsweise E.coli NM 526, 538 oder 539 (3), in LB-Brühe (20) mit 5 mM MgSO4 gezüchtet, mit Polyäthylenglykol gefällt und durch 2malige CsCI-Dichtegradientenzentrifugation (0,71 g CsCI/ml Lösung, 40 Stunden 45000UpM, 200C) gereinigt. Nach Dialyse gegen TE-Puffer wurde die Phagen-DNA durch 2malige Extraktion mit Phenol/Chloroform/lsoamylalkohol (25/24/1 VoI) und 2malige Extraktion mit Chloroform/ Isoamylalkohol (24/1 VoI) von Protein befreit und durch Äthanolfällung aufkonzentriert.
Zur Gewinnung der Endfragmente von EMBL3A wurden 50/u,g Phagen-DNA 2 Stunden bei 370C in 450μ,Ι Reaktionsmedium (1 OmMTris-HCI pH7,5,1OmMMgCI2,1 mM Dithiothreitol) vollständig mit BamHI verdaut, mit 15mM EDTA10 Minuten, bei 700C die Reaktion gestoppt und die DNA mit Äthanol gefällt.
Zur Vermeidung der Religation wurde das Mittelfragment mit EcoRI nachgeschnitten und das wegfallende Oligonukleotid mittels Isopropanolfällung entfernt.
Die BamHI-verdaute Lambda-DNA wurde hierzu 2 Stunden bei 370C in 450μ\ 1OmM Tris-HCI pH7,5,10OmM NaCI, 1OmM MgCI2 mit EcoRI vollständig verdaut und die Reaktion durch Zusatz von 15mM EDTA und lOminütiges Erwärmen auf 700C gestoppt.
Nach Zusatz von NaAcetat zu einer Endkonzentration von 0,3 M wurden die 3 großen DNA-Fragmente mit 0,6 Volumina Isopropanol 15 Minuten bei 00C gefällt, 2mal mit 0,45 M NaAcetat/0,6 Volumina Isopropanol und 1mal mit 0,3M NaAcetat/2,5 Volumina Äthanol gewaschen und in 15/xl 0,1 x TE-Puffer gelöst. Die BamHI/EcoRI-Linker bleiben bei dieser Prozedur in Lösung.
Die EMBL3A Fragmente (8^g) wurden mit ca. 5μg 10-23 kb Pferde-DNA und 10 Einheiten T4-DNA-Ligase (NEN) vereinigt und über Nacht bei 14°C und einen Tag bei 4°C in 50μΙ Ligationsmedium (66mM Tris-HCI pH7,2, 0,1 M NaCI, 1OmM MgCI2,1 mM EDTA, 5mM Dithiothreitol, 0,5 mM ATP) inkubiert. Das ligierte DNA-Gemisch wurde mittels eines in vitro-Lambda-Verpackungssystems (27) in reife Lambda-Phagenpartikel gepackt.
Die Komponenten dieses Systems, d.h. Ultraschallextrakt (SE), Gefrier-Auftau-Lysat (FTL), Puffer Ml und A wurden gemäß (27) hergestellt. 10μΙ Aliquots des ligierten DNA-Gemisches wurden 2 Minuten bei Raumtemperatur mit 25μΙ SE inkubiert, das ebenso wie FTL 30 Minuten aus Eis aufgetaut worden war, mit 100μΙ FTL versetzt und 60 Minuten bei Raumtemperatur weiterinkubiert. Das Packungsgemisch wurde mit 150/xl Lambda-Diiuent (10OmM Tris-HCI pH7,5,1OmM MgSO4 1 mM EDTA) verdünnt und bei 4°C gelagert.
Ein kleiner Anteil der gepackten Lambda-Phagen wurde am E.coli Stamm NM 528 SupF titriert. Ingesamt ergab das Verfahren etwa 1 x 106unabhängigePferde-DNA-Rekombinanten. Der Rest des verpackten Materials wurde durch Plattieren auf NM 528 in einer Dichte von 30000 plaquebildenden Einheiten (pfu) pro 13,5cm LB/MgSO4-Agar-Platte vervielfacht.
Zur Identifizierung der rekombinanten Phagen, die Hundeinterferongene beinhalten, wurde die durch Southem-Blots (17) nachgewiesene Nukleotidhomologie mit radioaktiv markierten Human-IFN-alpha-Genen ausgenützt. Hierzu wurden je 1Oyu,g hochmolekulare Pferde-DNA vollständig mit EcoRl bzw. Hindill verdaut, auf 0,8%igem Agarosegel elektrophoretisch aufgetrennt und auf Nitrocellulosefilter übertragen. Aus einem aus dem Expressionsplasmid pER33 (14) stammenden 845 bp Hindlll-Fragment, das den gesamten proteincodierenden Bereich für reifes Humaninterferon-alpha2ARG enthält, wurde nach üblichen Verfahren (25) ein p-32-markiertes DNA-Stück hergestellt.
Für das Screening nach equinenbeta-lnterferongenen wurde wie oben aus einem 363 bp Pst 1-BgIII Fragment eines für humanes beta-lnterferon codierenden cDNA-Klons P1 F12 (15) eine radioaktiv markierte DNA-Probe hergestellt. Diese Probe codiert für die Aminosäure 48-166 des reifen ^-Interferons.
Die Nitrocellulosefilter wurden 7 Stunden bei 65°C in 5 x SSPE (0,9 M NaCI, 5OmM NaH2PO4,5 mM EDTA, pH 7,4), 5 x Denhardt-Lösuang (0,1 % Ficoll, 0,1 % Polyvinylpyrrolidon, 0,1 % Rinderserumalbumin), 0,1 % SDS, 20mg/ml Lachssperma-DNA prähybridisiert und anschließend mit 13 χ 106cpm der markierten Probe in dergleichen Lösung, jedoch ohne Lachssperma-DNA, hybridisiert. Nach Inkubation bei 65°C über Nacht wurden die Filter 4mal 1 bis 1,5 Stunden in 3 χ SSC (0,45 M NaCI, 45 mM NaCitrat), 0,1 % SDS bei 650C gewaschen und 7 Tage auf Kodak X-omat S-Röntgenfilm mit Kodak Regular Verstärkerfolien exponiert (Fig. 1). Das Auftreten von mehreren Banden beweist eine Familie von alpha-lnterferongenen bei Pferden, wie sie bei Rindern, Schweinen und Menschen früher nachgewiesen wurden.
Für das Screening der Interferongene in der Pferde-DNA-Bibliothek wurden daher die gleichen Hybridisierbedingungen angewandt.
600000 rekombinante Lambda-Phagen wurden auf E.coli NM 528 in einer Dichte von 30000 pfu/13,5cm Platte plattiert. Vierfache Nitrocellulosereplikas wurden von jeder Platte nach dem Verfahren von Benton und Davis (19) hergestellt. Nach 2 Stunden Backen bei 80°C wurden die Filter 1,5 Stunden bei 650C in IM NaCI, 1OmM Tris-HCI pH 8,0,0,1% SDS gewaschen, über Nacht wie oben beschrieben, prähybridisiert und je 2 Filterrepiikas von jeder Platte 24 Stunden mit 1,5 χ 10scpm radioktiver alpha-Interferon-Probe bzw. 1 χ 10ecpm /3-lnterferon-Probe pro Filter hybridisiert. Nach 3mal wiederholtem Screening wurden 8 Pferde-alpha-lnterferon-Klone und 6 Pferde-beta-lnterferon-Klone erhalten, die positive Hybridisierungssignale ergaben.
"E) Charakterisierung der rekombinanten Phagen
Von 7 mit humanem alpha-IFN und 3 mit humanem /3-IFN hybridisierenden Rekombinanten wurden Phagen-DNA hergestellt. Die DNAs wurden mit EcoRl, BamHI, Hindlll, Pstl, BgIII, Sail, Smal verdaut und in einem 0,8%igen Agarosegel elektrophoretisch aufgetrennt. Die Größe der hybridisierenden Fragmente wurde nach dem Southern-Verfahren bestimmt. Die Position der Restriktionsstellen innerhalb des Lambda-Inserts wurde mittels einer Methode von Rackwitz et al. (4) nach partiellem Restriktionsverdau der Lambda-DNA, Markierung der rechten bzw. linken kohäsiven Enden der Lambda-Arme mit synthetischen, P-32-markierten Oligonukleotiden und Elektrophorese in 0,45%igen Agarosegelen bestimmt. Die daraus erhaltenen Restriktionskarten der Klone Eq-alphal, Eq-alpha 16, Eq-alpha20 und Eq-beta6sind in Fig. 2, 3 und 9 dargestellt.
Ein Restriktionsfragment des Klons Eq-alpha 1, das mit dem humanen alpha-lnterferon-Marker hybridisiert hatte, wurde in die Mehrfachrestriktionsenzym-Klonierungsstelle des pBR322-Derivates pUC9 subkloniert. Die Insertion eines fremden DNA-Fragmentes führt zu einer Unterbrechung des lacz-Genes der/3-Galaktosidase und verändert damit den Phänotyp des mit dem Plasmid transformierten E.coli Stammes JM ΙΟΙ von Iac+ zu Iac—. Aufgrund der nicht funktionierenden /3-Galaktosidase kann mit lsopropylthiogalaktosid (IPTG) induzierter JMIOI das farblose Substratanalog ö-Brom^-chlor-S-indolyl-ß-D-galactosid (BCIG) nicht zum blauen Farbstoff spalten. Bakterienkolonien mit lac-Phänotyp können daher an der weißen Farbe erkannt werden. Ein 3,2 kb Hindlll-Fragment aus dem Klon Eq-alphar I wurde aus einem Agarosegel eluiert, auf einer Elutip-D-Säule gereinigt und in etwa 10fach molarem Überschuß mit40ng mit Smal geschnittenem und dephosphoryliertem pUC9-Vektor ligiert, in E.coli JMIOI transformiert und mit LBTop-Agar mit 0,2 mg/ml BCIG, 0,17 mg/ml IPTG und 0,1 mg/ml Ampicillin ausgegossen. Weiße Kolonien wurden in 5ml LB-Brühe mit 0,1 mg/ml Ampicillin über Nacht bei 37°C hochgezüchtet und nach dem eingesetzten Fragment mit einem Plasmid-Minipräparationsverfahren (25) gescreent. Ein so erhaltenes Plasmid wurde pAH 50 benannt.
Das 3,2 kb Hindlll-lnsert von pAH 50 (3,2 kb Hindlll-Fragment Subklon von Eq-alpha I, Fig. 3) würde nach der Dideoxy-Methode von Sanger (23) nach dem Shotgun-Verfahren sequenziert, 60^m pAH 50 Plasmid-DNA wurden vollständig mit Hind III verdaut, das 3,2kb Fragment aus einem 1%igen Agarosegel isoliert und wie oben beschrieben gereinigt.
15/*g dieses Fragments wurden in 100 μ,Ι Ligationsmedium mit 14 Einheiten T4-DNA-Ligase über Nacht bei 14°C und weitere4 Tage bei 4°C mit sich selbst ligiert. Diese ligierte DNA wurde in einem Eisbäd mit Ultraschall in 20-Sekunden-Pulsen, insgesamt 100-140 Sekunden, in kleine Stücke zerteilt. Die DNA-Enden wurden 2 Stunden bei 140C in 250μΙ Reaktionsmedium (5OmM Tris-HCI pH7,5,1OmM MgCI2, ImM Dithiothreitol, 0,5 mg/ml 'Rinderserumalbumin je 0,1 mM dATP, dGTP, dCTP, dTTP) mit 15 ' Einheiten des großen Fragmentes der E.coli Polymerase I (Klenow Fragment) repariert. Nach Konzentrierung durch Äthanolfällung wurde die so vorbehandelte DNA auf einem 1%igen Agarosegel aufgetrennt und DNA-Fragmente in einem Größenbereich von 0,35-1,0kb isoliert und gereinigt. Die Fragmente wurden in etwa 10fach molarem Überschuß mit der mit Smal geschnittenen und dephosphorylierten, replikativen Form von Bakteriophage M13mp8 (22) ligtertund E.coli JMIOI transformiert. Die Einzelstrang-DNA der so erhaltenen, rekombinanten Phagen wurde isoliert und nach Binden eines synthetischen Oligonukleotides die Zweitstrangsynthese in 4 Einzelreaktionen mit dem Klenow Fragment der E.coli DNA-Polymerase I durchgeführt.
Die Sequenzen der Inserts der verschiedenen rekombinanten Phagen wurden mit Hilfe eines von C. Pieler modifizierten Computerprogrammes von Staden (24) zu einer Totalsequenz vereint, die in Fig. 4 dargestellt ist.
H) Subklonierung des Pferde-/3-lnterferon-Gens
FilrdieSubklonierung des im Lambda-Klon Eq-beta6 identifizierten Pferde-/3-lnterferongens wurde analog wie bei F) vorgegangen. Ein 4,5kb Pvull-Fragment, das mit der humanen /3-lnterferonprobe hybridisierte, wurde isoliert, gereinigt und in die Smal Restriktionsstelle des Plasmides pUC9 mit glatten Enden ligiert und E.coli JM101 transformiert. EinTransformant mit gewünschtem Insert (pAH 60) wurde großgezüchtet und das Plasmid mittels Southern-Analyse genauer charakterisiert. Die erhaltene Restriktionskarte ist in Fig.3 dargestellt. Das 2,5kb Hindlll-Fragment wurde analog G) nach der Dideoxy-Methode von Sanger sequentiell. Die in Fig. 8 dargestellte Gesamtsequenz des 2,5kb Fragmentes wurde aus 52 Einzelsequenzen zusammengesetzt.
I) Subklonierung und Sequenzierung des Pferde-Interferon-Genes aus Klon Eq-a16 Ein 3,3kb langes EcoRI Restriktionsfragment aus dem Lambda-Klon Eq-a16, das mit einem humanen a-IFN-Marker hybridisiert hatte (siehe Beispiel D, E), wurde in die EcoRI-Stelledes Plasmides pUC9subkloniert. Ein erhaltenes Plasmid wurde pRH63 benannt. Anhand einer erstellten Restriktionskarte (Fig.9) wurden definierte Restriktionsfragmente gerichtet in M I3-Phagen subkloniert und nach der Sanger-Methode die DNA-Sequenz bestimmt (Fig. 10).
J) Subklonierung und Sequenzierung des Pferde-Interferon-Genes aus Klon Eq-a20 Ein 2,2kb langes EcoRI-Fragment des Lambda-Klons Eq-a20, das schwach mit der humanen a-IFN Probe hybridisiert hatte, wurde in die EcoRI-Stelle des Plasmids pUC9 subkloniert. Ein erhaltener Klon wurde pRH 61 benannt (Fig.9). Das gesamte 2,2 kb EcoRI-lnsert wurde isoliert und nach dem Shotgun-Verfahren mit der Sanger-Methode (Beispiel G) die DNA-Sequenz bestimmt (Fig.12).
Ausgehend von dem Expressionsplasmid parpER33 wurde die für die erhöhte Plasmidstabilität in E.coli verantwortliche „par"-Sequenz und die Tryptophan Promoter-Operator-Sequenz samt der künstlichen ribosomalen Bindungsstelle in den PläsmidvektorpAT153 (Amersham) eingesetzt. pAT153 ist ein verkürztes Derivat des Plasmides pBR322, dem ein Abschnitt fehlt, der für die Mobilisierung von DNA notwendig ist (36).
Die Vorgangsweise der Herstellung von Plasmid parpATER 103 ist in Fig. 13 dargestellt. Das Plasmid parpER33 wurde mit Hindlll vollständig und niit EcoRI partiell geschnitten, das entstandene 0,47 kb lange DNA-Fragment von einem Agarosegel isoliert und gereinigt und mit EcoRI und Hindlll zweifach geschnittenem pAT153 ligiert. Ein nach Transformation von E.coli HB101 erhaltenes Plasmid der gewünschten Struktur, die man durch Verdauung mit verschiedenen Restriktionsenzymen bestimmte, wurde parpATER 103 benannt.
L) Direkte Expression von reifem EqlFN-a1 in E.coli
Die Herstellung der Expressionsplasmide pAH 52, pAH 52/2 und pAH 53 sowie deren Vorstufen ist in Fig. 14 dargestellt. 20/xg des Plasmides pAH 50 (Beispiel F) wurden mit 30 Einheiten Hindll (Boehringer Mannheim) verdaut und das 4,2kb lange DNA-Fragment, welches das gesamte EqlFN-a1 Gen enthält, von einem Agarosegel mit DE 81-Papier (Whatman) isoliert und gereinigt. Dazu wird nach Auftrennung der DNA-Fragmente im Agarosegel vor und hinter die zu isolierende DNA-Bande ein Schlitz geschnitten, in den ein Streifen DE81-Papier gesteckt wird. Die Elektrophorese wird weitergeführt, bis das gewünschte DNA-Fragment vollständig an dem vorderen DE81-Streifen gebunden ist. Der hintere DE81-Streifen verhindert eine Verunreinigung durch größere DNA-Fragmente. Das DE81-Papier mit dem gebundenen DNA-Fragment wird zweimal 5 Minuten in 400μ\ Niedrigsalz-Puffer (0,2 M NaCI, 25 mM Tris-HCI pH 8,0,1 mM EDTA) gewaschen und anschließend die DNA zweimal 10 Minuten mit 200μ\ Hochsalz-Puffer (1 M NaCI, 25mM Tris-HCI pH8,0,1 mM EDTA) vom DE81-Papier eluiert und mit 1 ml Äthanol ausgefällt. Die Enden des Hindll-Fragmentes wurden mit Sphl-Linkem versehen. Dazu wurden 0,2^g Sphl-Linker (Worthington) mit 2 Einheiten Polynukleotid-Kinase in 10/xl Reaktionsmedium 45 Minuten bei 37°C inkubiert (7OmM Tris-HCI pH7,6,1OmM MgCI2,1 mM ATP, 5mM Dithiothreit). Die kinasierten Sphl-Linker und das Hindll-Fragment wurden mit 8 Einheiten T4-DNA-Ligase 20 Stunden bei 4°C ligiert. Anschließend wurde das Enzym bei 700C inaktiviert und die DNA mit 30 Einheiten Sphl in einem Gesamtvolumen von 100μΙ verdaut, mit Phenol und Chloroform extrahiert und mit Äthanol ausgefällt. Die DNA wurde mit Ligase zirkularisiert und E.coli HB101 transformiert. Ein Plasmid der gewünschten Struktur erhielt die Bezeichnung pAH51. Es enthält dasEqlFN-a1-Gen mit einer verkürzten 3'-nichttranslatierten Region und einer zusätzlichen Sphl-Schnittstelle. Um in der Endkonstruktion die DNA-Sequenz für das reife Pferde-a-lnterferon in der richtigen Distanz mit der Promotersequenz zu verbinden, wurde von einem 0,4 kb langen DNA-Fragment ausgegangen, das aus 20μg mit Pvull geschnittenem Plasmid pAH 50 isoliert wurde. 1 nmol synthetisches 15mer Oligonukieotid mit der Sequenz 5'-TGTGACCTGCCTCAC wurde mit Polynukleotid-Kinase kinasiert. Es enthält die Sequenz, welche für die ersten 5 Aminosäuren des reifen EqlFN-a1 aus Klon pAH 50 codiert. Das 15mer wurde mit etwa 7pmol des 0,4kb Pvull-Fragmentes gemischt und in einem Gesamtvolumen von 34μ.Ι fünf Minuten gekocht, um den DNA-Doppelstrang zu denaturieren. Nach Abkühlen wurde der an den Einzelstrang gebundene Oligonukleotid-Primerin70/^l Reaktionsmedium (5OmM Tris-HCI pH7,2,1OmM MgSO4, 0,1 mM Dithiothreit, öO^g/ml Rinderserumalbumin, je 1 mM dATP, dGPT, dCTP, dTTP) mit 30 Einheiten Klenow-Fragment 3 Stunden bei 37°C verlängert. Um einen eventuell verblieben 3'-Überhang sicher zu entfernen wurde die DNA anschließend mit 16 Einheiten T4 DNA-Polymerase 20 Minuten bei 37°C in 120R/j,l Reaktionsmedium inkubiert (33 mM Tris-Acetat pH7,9, 66mM KAc, 1OmM Mg(Ac)2, 0,5mM Dithiothreit, 0,1 mg/ml Rinderserumalbumin, je 1 mM dATP, dGTP, dCTP, dTTP). Die entstandene DNA mit geraden Enden wurde mit Phenol und Chloroform extrahiert und mit 0,45 M NaAcetat und 0,6 Volumsteilen 2-Propanol 15 Minuten bei 00C ausgefällt. An dieses DNA-Stück wurde ein Gemisch zweier kinasierter, zueinander komplementärer Oligonukleotide: 12mer 5'-AGCTTAAAGATG, 8mer 5'-GATCTTTA ligiert, das eine Hindlll-Schnittstelle und das Translationsstratcodon ATG erzeugt. Je 1 nmol dieser zwei Oligonukleotide wurde in 20μΙ mit 14 Einheiten Ligase 40 Stunden bei 4°C an das DNA-Fragment ligiert. Nach Inaktivierung des Enzyms bei 70°C wurde die erhaltene DN in 100μ,Ι mit 80 Einheiten Hindlll und 20 Einheiten BgIIi geschnitten und DNA-Fragmente von etwa 190bp Länge aus einem 2%igen Agarosegel mit DE81-Papier isoliert und gereinigt. Das erhaltene DNA-Fragment wurde mit etwa 50ng mit Hindlll und BgIII doppelt geschnittenem pAH 51 -Vektor ligiert und E.coli HB101 transformiert. Von 65 erhaltenen Kolonien wurde aus 4 Plasmiden, die das gewünschte Restriktionsmuster aufwiesen, ein Hindlll/BamHI DNA-Fragment isoliert und mit der Sanger-Methode sequenziert, wobei zwei Klone genau die gewünschte Sequenz enthielten. Ein solches Plasmid wurde pAH51/2 benannt. Dieses enthält die Sequenz für reifes EqlFN-a1 mit vorangestelltem Translationsstartcodon ATG und Hindlll-Schnittstelle.
20/xg Plasmid pAH 51/2 wurden mit Sphl und Hindlll zweifach geschnitten, das entstehende 1,0kb lange DNA-Fragment von einem Agarosegel isoliert und mit 40ng Hindlll und Sphl doppelt geschnittenem Plasmid parpATER103 (Beispiel K) ligiert. Ein nach Transformation von E.coli HB101 erhaltenes Plasmid der gewünschten Struktur wurde pAH52 benannt. Es enthält alle für eine induzierbare Expression von reifem EqlFN-<*1 notwendigen Informationen. In analoger Weise wurde aus mit Hindlll und BamHI doppelt geschnittenem pAH51/2 und mit Hindlll/BamHI geschnittenem parpATER103 das Plasmid pAH52/2 hergestellt. Dieses Expressionsplasmid ist etwa 0,2 kb größer als pAH52 und weist zusätzlich einesinguläre BamHI-Schnittstelleauf.
Ein wesentlich verkleinertes Expressionsplasmid zur Herstellung von reifem EqlFN-a1 in E.coli, in dem Tryptophan-Promoter, Interferongen, Ampicillin-Resistenzgen und Replikationsursprung in einer Richtung orientiert sind, wurde aus den Plasmiden pAH52 und pBR322 hergestellt. K^g pAH 52 wurden mit Sphl und EcoRI geschnitten, die Enzyme bei 70°C inaktiviert und die DNA-Enden nach Zusatz von je 0,15 mM dATP, dGTP, dCTP, dTTP mit Klenow-Fragment 1 Stunde bei 22°C stumpf gemacht. Die DNA-Fragmente wurden auf einem Agarosegel nach der Größe fraktioniert und ein 1,1 kb langes Stück isoliert, das Promoter und Interferongen enthält, 10^g pBR322 Plasmid wurde mit EcoRI und Pvull doppelt verdaut, die Enden wie oben beschrieben mit Klenow-Fragment begradigt und anschließend mit Kalbsdarmphosphatase dephosphoryliert. Ein DNA-Fragment von 2,4kb Länge wurde von einem Agarosegel isoliert. Die beiden so erhaltenen DNA-Stücke wurden mit T4 DNA-Ligase verknüpft und E.coli HB101 transformiert. Ein so erhaltenes Plasmid, in dem zwei EcoRI-Erkennungsstellen geschaffen wurden, erhielt die Bezeichnung pAH53.
M) Herstellung eines Expressionsplasmides für EqlFN-a 2 (pAH 55)
Aufgrund der hohen Homologie der Gene für EqlFN-a1 (pAH50) und EqllFN-a2 (pRH63, Fig. 11) ist es möglich, aus dem Expressionsplasmid pAH52/2 (Beispiel L) und dem Lambda-Subklon pRH63 ein Expressionsplasmid für EqlFN-a2 herzustellen (Fig. 15). 20/j.g pRH 63 Plasmid wurden mit BgIII und BamHI zweifach geschnitten und das entstehende DNA-Fragment von 1,0 kb Länge, das die codierende Sequenz für EqlFN-a2 ab der 64. Aminosäure enthält von einem Agarosegel isoliert. 10μg des Plasmides pAH52/2 wurde ebenfalls mit BgIII und BamHI geschnitten, die Enden mit Kalbsdarmphosphates dephosphoryliert und das größere der zwei entstehenden DNA-Fragmente von einem Agarosegel gewonnen. Dieses DNA-Stück enthält den Plasmidvektoranteil, den Promoter und die codierende Sequenz für die ersten 63 Aminosäuren des reifen Interferons. Die beiden beschriebenen DNA-Fragmente wurden mit Ligase verknüpft und E.coli HB101 transformiert. Ein so erhaltenes Plasmid, welches das Insert in der korrekten Orientierung enthält (mit BamHI und BgIII schneidbar!) wurde pAH 55 benannt. Dieses Plasmid ermöglicht die Expression von reifem EqlFN-a2 in E.coli.
N) Herstellung eines Expressionsplasmides für reifes EqlFN-/3 (pAH 62)
Die Vorgangsweise ist in Fig. 16 schematisch dargestellt, 30^g pAH 60 Plasmid wurden mit 30 Einheiten HgiAI in 150μ.Ι Volumen geschnitten. Nach Inaktivierung des Enzyms bei 700C wurden die 3'überhängenden DNA-Enden mit 7 Einheiten T4 DNA-Polymerase (Zugabe von je 1 mM dATP, dGTP, dCTP, dTTP) 30 Minuten bei 37°C begradigt. An die stumpfen Enden wurden Sphl-Linker ligiert (siehe Beispiel L) und die erhaltene DNA mit Sphl und Hindlll geschnitten. Ein entstandenes DNA-Fragment von 1,85kb Länge wurde von einem Agarosegel isoliert und mit 50ng mit Hindlll und Sphl doppelt geschnittenem Plasmid parpATER103 (Beispiel K) ligiert. Ein nach Transformation von E.coli HB101 erhaltener Klon mit dem gewünschten Plasmid wurde pAH 61 benannt. Dieses Plasmid stellt eine Zwischenstufe für die weitere Konstruktion des Expressionsplasmides dar. 20/ng Plasmid pAH61 wurden mit BamHI und Sail zweifach geschnitten und ein entstandenes 1,3 kb langes DNA-Fragment von einem Agarosegel isoliert, gereinigt und mit BamHI/Sall doppelt verdauter M13mp9 Phagen-DNA ligiert. Nach Transformation von E.coli JM 101 konnte von einem rekombinanten M 13-Phagen (M 13 pAH 61) einzelsträngige Phagen-DNA gewonnen werden. 3pmol dieser Einzelstrang-DNA wurden mit38pmol kinasiertem 15mer Oligonukleotid 5'GTGAACTATGACTTg in 50μ.Ι 2OmM TrisHCIpH8,0,1OmM MgCI2 gemischt, auf 95°C erhitzt und langsam auf Raumtemperatur abgekühlt. Das Oligonukleotid bindet genau ab der ersten Base der Sequenz des reifen/3-lnterferons. Die Zweitstrangsynthese an der Einzelstrang vorlage, ausgehend vom 15mer-Primer wurde in 100μΙ Volumen nach Zugabe von je 3 mM dATP, dGTP, dCTP, dTTP und 15 Einheiten Klenow-Fragment 1 Stunde bei 22°C durchgeführt. Nach Zusatz von 2OmM EDTA wurde die DNA mit Phenol und Chloroform extrahiert und mit Äthanol ausgefällt.
Verbliebene, einzelsträngige DNA-Abschnitte wurden mit 150 Einheiten S1-Nuklease (Sigma) ίη400μΙ Reaktionsmischung 2 Stunden bei 14°C verdaut (4mM Zn(Ac)2,3OmM NaAC, 25OmM NaCI, 5% Glycerin, pH4,6). Die Reaktion wurde durch Zugabe von EDTA und Extraktion mit Phenol und Chloroform gestoppt und die DNA mit Äthanol ausgefällt. An die durch diese Behandlung stumpfendig gemachte DNA wurde wie in Beispiel H das Gemisch der 12mer und 8mer Oligonukleotide δ'-AGCTTAAAGATG und 5'-CATCTTTA anligiert und die entstandene DNA mit Hindlll und Sphl geschnitten. Ein DNA-Fragment der gewünschten Länge von 1,1 kb wurde von einem Agarosegel isoliert und mit Hindlll/Sphl doppelt geschnittenem Plasmid parpATER 103 ligiert. Nach Transformation von E.coli HB101 wurden 54 Kolonien erhalten. Von 9 daraus isolierten Plasmid-DNAs wurde ein 1,3kb langes EcoRI/Sall Fragment isoliert und mit der Sanger-Methode sequenziert. Ein daraus ermitteltes Plasmid mit der gewünschten Sequenz wurde pAH 62 benannt. Dieses Plasmid ermöglicht die effiziente Expression von reifem EqlFN-/3 Protein in E.coli. Ein Plasmid, d^s eine Deletion der ersten Base (G) des reifen /3-IFN Genes trägt, wurde pAH 62 delta G 1 benannt. Dieses Plasmid erlaubt die Expression eines am Amino-Terminus verkürzten /3-IFN durch Translationsstart am nächstfolgenden ATG (entspricht Aminosäure 19 des reifen /3-IFN), das überraschenderweise antivirale Aktivität, wenn auch deutlich weniger, verglichen mit dem unverkürzten Protein, aufweist (siehe Beispiel O).
100ml Bakterienkultur werden bei 37°C unter kräftigem Schütteln bis zur unten angegebenen optischen Dichte bei 600nm in folgendem tryptophanfreiem Medium inkubiert (Angaben pro Liter Medium): 10g (NH4J2PO4,3,5g KH2PO4pH7,3 mit NaOH, 0,5g NaCI, 21g Casaminosäure (sauer hydrolysiert), 11 g Glucose, 1 mM MgSO4,0,1 mM CaCI2,1 mgThiamin-HCI,20mg L-Cystein, 20mg 3-ß-lndolacrylsäure (IAA, Induktor für das Tryptophan-Operon), optionsweise 50-100mg Ampicillin. Anschließend werden die Bakterien durch Zentrifugieren 5 Minuten bei 4000UpM pelletiert, mit 1/10 des Kulturvolumens eiskaltem 5OmM Tris-HCI pH 8,0, 3OmM NaCI suspendiert und unter Eiskühlung zweimal 30 Sekunden mittels Ultraschallsonde (2OkHz, 100 Watt) aufgebrochen. Die Zelltrümmer werden 10 Minuten bei 10 000UpM (40C) entfernt und der Überstand nach Sterilfiltration auf Interferonaktivität in einem Assay, der den cytopathischne Effekt (CPE) von Vesicular Stomatitis Virus (VSV) oder Encephalomyocarditis Virus (EMCV) mißt, getestet.
Testsystem: NBL-6 Zellen (ATCC CCL 57, Pferdehaut-Epidermis-Zellen)/VSV A549 (ATCC CCL 185, humane Lungencarcinom-ZellinieJ/EMCV
IFN-Aktivität (Einheiten/l Kultur) NBL-6/VSV A549/EMV
E/l IE/I
1,8 χ 106 5,2 χ 104
2,0x106 " 7,6x104
1,8 X | 106 | 6,2 x | 104 |
1,2 X | 106 | 9,Ox | 104 |
1,1 X | 109 | < | 103 |
4,5 X | 105 | < | 103 |
5,2 χ | 102 | 2,6 χ | 104 |
HB 101 mit
Plasmid OD60onm
pAH 52"~ 4,2
pAH52/2 "~"~ 6,0
pAH 53 5,7
pAH 55 5,7
pAH 62 t. 3,0
pAH62deltaG1C 2,1 HS 12{HulFN-a2 C Standard)
Der Titer auf A459-Zellen wurde mit human-lnterferonstandard auf internationale Einheiten normiert.
Plasmidcodierte Proteine können durch Verwendung der Maxizelltechnik (37) selektiv in vivo markiert werden. E.coli CSR 603 wurde nach üblichen Verfahren mit den Expressionsplasmiden transformiert und auf Ampicillin-haltigen Agarplatten auf transformierte Bakterien selektioniert. Die Präparation der Maxizellen und das Markieren der Proteine erfolgte nach einer Vorschrift von A.Sancar (37). Die Zellen wurden in 15 ml Medium (siehe Beispiel O) ohne Indolacrylsäure bei37°C bis zu einer OD6oonm = 0,5 gezüchtet und 10ml dieser Kultur in einer Petrischale 5 Sekunden aus 50cm Entfernung mit einer UV-Germicid-Lampe (15 Watt) unter Schwenken bestrahlt und eine Stunde bei 370C weiterinkubiert. Die Kulturen wurden mit lOO^g/ml D-Dycloserin versetzt und 14 Stunden bei 370C inkubiert und die Bakterien anschließend durch Zentrifugation geerntet. Die Zellen wurden zweimal mit 5ml Hershey-Salzlösung gewaschen, in 5ml Hershey Medium mit20/u,g/ml Indocrylsäure suspendiert und 2 Stunden bei 37 0C inkubiert. Zu jeder Kultur wurden 5;u.Ci/ml 35S-Methionin (1 000 Ci/mMol) zugesetzt und eine . Stunde bei 37°C geschüttelt. Die Zellen wurden geerntet in SDS- und 2-Mercaptoethanol-haltigem Elektrophorese-Probenpuffer lysiert und die Proteine auf einem 15%igen Polyacrylamidgel aufgetrennt.
Hershey-Salzlösung (pro Liter):
5,4g NaCI
3,OgKCI
1,IgNH4CI
15 mg CaCI2-2 H2O
0,2 g MgCI2-6 H2O
0,2 mg FeCI3-6 H2O
87 mg KH2PO4
12,1 gTris+-HCI pH7,4
Hershey Medium (pro 100 ml) Hershey-Salzlösung): 2 ml 20% Glucose
0,5 ml 2%Threonin
1,0 ml 1% Leucin
1,0 ml 2% Prolin
1,0 ml 2% Arginin
0,1 ml 2%Thiamin
In Fig. 17 ist das Autoradiogramm des getrockneten Geles nach 2 Tagen Exponierung auf DuPontCronexX-ray Film unter Verwendung einer Kodak Lanex-Regular Verstärkerfolie bei —800C dargestellt. Als Molekulargewichtsstandard wurde ein 14C-methyliertes Proteingemisch (Amersham) verwendet. Als Kontrolle wurden das Plasmid pER103, das nur den Promoter ohne Interferongen enthält, und das Plasmid pER21/1 eingesetzt, welches zwei Kopien des humanen IFN-a2arg Genes enthält. Die Proteinbanden bei etwa 18kd sind die von den Plasmiden exprimierten Interferone.
Q) Nachweis von mit EqlFN-a, EqlFN-/3 und EqlFN-omega hybridisierenden Sequenzen in genomischer Pferde-DNA Zum Nachweis der Gesamtanzahl von Sequenzen im Pferdegenom, welche hohe Homologie mit Interferongenen der Klassen IFN-α, IFN-/3 bzw. IFN-omega aufweisen, wurde wie folgt vorgegangen. 30^g hochmolekulare Pferde-DNA (Beispiel A) wurden mit 100 Einheiten des entsprechenden Restriktionsenzyms in 300μ\ Reaktionsvolumen vollständig verdaut und jeweils 10^g dieser geschnittenen DNA pro Spur auf einem 0,8%igen Agarosegel nach der Größe aufgetrennt.
Nach Southern-Transfer auf Nitrozellulosefilter, Denaturieren und Fixieren der DNA wurde jedes Filter mit etwa 6 χ 10ecpm nicktranslatierter Probe hybridisiert (17 Stunden bei 650C, 5x SSPE, 5x Denhardt-Lösung, 0,1 % SDS, 20/ug/l denaturierte Lachssperma-DNA). Als Probe für EqlFN-a wurde ein 1,0kb langes Hindlll/Sphl-Fragment aus Plasmid pAH52, für EqlFN-0 ein 1,1 kb langes Hindlll/Sphl-Fragment aus Plasmid pAH62 verwendet, welches jeweils die codierende Sequenz für das gesamte reife Interferon enthält. Als Probe für EqlFN-omega wurde das 2,1 kb EcoRI-lnsert aus Plasmid pRH 61 eingesetzt. Die Filter wurden anschließend unter stringenten Bedingungen gewaschen, daß keine Kreuzhybridisierung zwischen diesen 3 Interferonsequenzen eintritt: 4mal45 Minuten bei 65°CmitO,3x SSC (45mM NaCI,4,5mM Na3Citrat), 0,1 % SDS. Die Autoradiographie erfolgte auf DuPontCronexX-ray Film unter Verwendung von Kodak Lanex-Regular Verstärkerfolie 7 Tage bei
Legende zu Figur 18:
Spaltenbezeichnung: M = Größenmarker (Lambda χ EcoRI/Hindlll)
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1) Isolierung von Hunde-DNA
Gefrorenes Gewebe, z. B. Hundeleber, wurde in flüssigem Stickstoff zu feinem Pulver zermahlen und in 0,5 M EDTA, 1OmM Tris-HCI pH8,0,0,5% SDS, 0,1 mg/ml Proteinase K (20 ml/g Gewebe) 3 Stunden bei 55°C inkubiert. Die erhaltene, viskose Lösung wurde durch eine Phenolextraktion und 3malige Extraktion mit Phenol/Chloroform/Isoamylalkohol (25/24/I VoI) von Protein befreit, gegen 5OmM Tris-HCI pH8,0,1OmM EDTA, 1OmM NaCI dialysiert und die DNA mit 2 Volumina Äthanol ausgefällt. Nach vollständiger Trocknung im Vakuum wurde die DNA in TE-Puffer (1 OmM Tris-HCI pH 8,0,1mM EDTA) bei 4°C in Lösung gebracht und mit 1,273g CsCl/ml Lösung 62 Stunden mit 40.000UpM bei 20°Czentrifugiert (Sorvall 50Ti-Rotor). Der CsCI-Gradient wurde ausgetropft, die DNA enthaltenden Fraktionen gegen TE-Puffer dialysiert und die DNA anschließend mit 2 Volumina Äthanol gefällt, mit 70%igem Äthanol gewaschen, getrocknet und wieder in TE-Puffer gelöst (4CC).
Das fertige DNA-Präparat war frei von RNA und langer als 50 kb (durch Elektrophorese an einem 0,45%igen Agarosegel bestimmt).
2) Partielle Endonuklease Verdauung und Größenfraktionierung von Hunde-DNA
Zweimal 50/j,g Hunde-DNA wurden mit 2,0 Einheiten Sau 3 A in 450μΙ Reaktionsmedium (1OmM Tris-HCI pH 7,5,1OmM MgC112, 1 mM Dithiothreitol) bei 37CC inkubiert. Nach 40 und 60 Minuten wurden 225μΙ Aliquots entnommen und mit 15mM EDTA versetzt und durch lOminütiges Erwärmen auf 70°Cdie Reaktion gestoppt. Nach Zusatz von 0,3 M NaAcetat pH 6,0 wurde die DNA mit 2,5 Volumina Äthanol gefällt. Nach dem Wiederauflösen in TE-Puffer wurde die DNA auf einem 0,45%igen Agarosegel inTBE-Puffer10,8g/ITris, 5,5g/l Borsäure, 0,93g/l (Na2EDTA) bei ca. 1 V/cm über Nacht elektrophoretisch der Größe nach getrennt. Anhand von Größenmarkern (mit EcoRI und Hindlll doppelverdaute und mit Hindlll verdaute Lambda-DNA) wurde das Gelstück mit DNA einer Länge von 10-23 kb herausgeschnitten, die DNA aus dem Gel in einen Dialysenschlauch 3 Stunden bei 300 V elektroeluiert (Puffer 0,1 x TBE), auf einer Elutip-D-Säule (Schleicherund Schul!) gemäß der Verwendungsvorschrift gereinigt und anschließend mit Äthanol gefällt.
Um die Selbstligation von Hunde-DNA-Fragmenten zu verhindern, was einerseits zu artifiziellen Hybriden von Hunde-DNA-Sequenzen, andererseits zu zu großen und damit nicht mehr in Labda-Phagen verpackbaren DNA-Stücken führen kann, wurden die größenfraktionierten Hunde-DNA-Stücke dephosphoryliert.
Dazu wurde die DNA in 140/xl Reaktionsmedium (5OmM Tris-HCI pH9,5,1 mM MgCI2,0,1 mM ZnAcetat, 1 mM Spermidin) mit 5 Einheiten Bovine Intestinal Phosphatase 30 Minuten 370C inkubiert, weitere 5 Einheiten Enzym zugegeben und 30 Minuten inkubiert. Nach Zugabe von EDTA auf 25mM Endkonzentration wurde die DNA einmal mit Phenol/Chloroform/Isoamylalkohol (25/24/1 VoI) 2mal mit Chloroform/Isoamylalkohol (24/1 VoI) und 3mal mit Diäthyläther extrahiert, mit Äthanol gefällt, getrocknet und in 0,1 χ TE-Puffer gelöst.
3) Aufbau der Hundegenom-DNA-Bibliothek
Die dephosphorylierten, 10-30kb Hunde-DNA-Fragmente wurden in einem lambda-Vektor, beispielsweise Lambda-EMBL3 oder -3A (3) mit G-A-T-C kohäsiven Enden, durch Entfernung des internen BamHI-Fragmentes der Phagen-DNA gewonnen, geklont.
Der Vektor wurde in einem E.coli Stamm mit dem Suppressorfaktor sup F, beispielsweise E.coli NM 526, 538 oder 539 (3), in LB-Brühe (20) mit 5mM MgSO4 gezüchtet, mit Polyäthylenglykol gefällt und durch 2malige CsCI-Dichtegradientenzentrifugation (0,71 g CsCl/ml Lösung. 40 Stunden 45.000UpM. 200C) gereinigt. Nach Dialyse gegen TE-Puffer wurde die Phagen-DNA durch 2malige Extraktion mit Phenol/Chloroform/Isoamylalkohol (25/24/1 VoI) und 2malige Extraktion mit Chloroform/ Isoamylalkohol (24/1 VoI) von Protein befreit und durch Äthanolfällung aufkonzentriert.
Zur Gewinnung der Endfragmente von EMBL3A wurden 50/ng Phagen-DNA 2 Stunden bei 37°C in 450/xl Reaktionsmedium (1 OmM Tris-HCI pH7,5,1OmMMgCI2,1 mM Dithiothreitol) vollständig mit BamHI verdaut, mit 15mM EDTA10 Minuten bei 7O0C die Reaktion gestoppt und die DNA mit Äthanol gefällt.
Zur Vermeidung der Religation wurde das Mittelfragment mit EcoRI nachgeschnitten und das wegfallende Oligonukleotid mittels Isopropanolfällung entfernt.
Die BamHI-verdaute Lambda-DNA wurde hierzu 2 Stunden bei 370C in 450 μΙ 1OmM Tris-HCI pH7,5,10OmM NaCI, 1OmM MgCI2 mit EcoRI vollständig verdaut und die Reaktion durch Zusatz von 15mM EDTA und lOminütiges Erwärmen auf 7O0C gestoppt.
Nach Zusatz von NaAcetat zu einer Endkonzentration von 0,3 M wurden die 3 großen DNA-Fragmente mit 0,6 Volumina Isopropanol 15 Minuten bei 00C gefällt, 2mal mit 0,45 M NaAcetat/0,6 Volumina Isopropanol und 1mal mit 0,3M NaAcetat/2,5 Volumina Äthanol gewaschen und in 15μ.Ι 0,1 x TE-Puffer gelöst. Die BamHI/EcoRI-Linker bleiben bei dieser Prozedur in Lösung.
Die EMBL3A Fragmente (8^g) wurden mit ca. 5/xg 10-23kb Hunde-DNA und 10 Einheiten T4-DNA-Ligase (NEN) vereinigt und über Nacht bei 14°C und einen Tag bei 40C in 50μΙ Ligationsmedium (66mM Tris-HCI pH7,2,0,1 M NaCI, 1OmM MgCI2,1 mM EDTA, 5mM Dithiothreitol, 0,5mM ATP) inkubiert. Das ligierte DNA-Gemisch wurde mittels eines in vitro-Lambda-Verpackungssystems (27) in reife Lambda-Phagenpartikel gepackt.
Die Komponenten dieses Systems, d.h. Ultraschallextrakt (SE), Gefrier-Auftau-Lysat (FTL), Puffer Ml und A wurden gemäß (27) hergestellt. 10μ.Ι Aliquotsdes ligierten DNA-Gemisches wurden 2 Minuten bei Raumtemperatur mit 25μ.Ι SE inkubiert, das ebenso wie FTL 30 Minuten aus Eis aufgetaut worden;war, mit 100/xl FTL versetzt und 60 Minuten bei Raumtemperatur weiterinkubiert. Das Packungsgemisch wurde mit 150μΙ Lambda-Diluent (10OmM Tris-HCI pH7,5,1OmM MgSo4I mM EDTA) verdünnt und bei 4°C gelagert.
Ein kleiner Anteil der gepackten Lambda-Phagen wurde am E.coli Stamm NM 528 SupF titriert. Insgesamt ergab das Verfahren etwa 1 χ 106 unabhängige Hunde-DNA-Rekombinanten. Der Rest des verpackten Materials wurde durch Plattieren auf NM 528 in einer Dichte von 30000 plaquebildenden Einheiten (pfu) pro 13,5cm LB/MgSCvAgar-Platte vervielfacht.
4) Screening der Hunde-Genbibliothek für Interferongene
Zur Identifizierung der rekombinanten Phagen, die Hundeinterferongene beinhalten, wurden die durch Southern-Blots (17) nachgewiesene Nukleotidhomologie mit radioaktiv markierten Human-IFN-alpha-Genen ausgenützt. Hierzu wurden je 10/xg hochmolekulare Hunde-DNA vollständig mit EcoRI bzw. Hindlll verdaut, auf 0,8%igem Agarosegel elektrophoretisch aufgetrennt und auf Nitrocellulosefilter übertragen. Aus einem aus dem Expressionsplasmid pER33 (14) stammenden 845bp Hindlll-Fragment, das den gesamten proteincodierenden Bereich für reifes Humaninterferon-aplha 2ARG enthält, wurde nach üblichen Verfahren (25) ein P-23-markiertes DNA-Stück hergestellt.
DieNitrocellulosefilterwurden7Stundenbei65°Cin5 x SSPE (0,9 M NaCI, 5OmM NaH2PO4,5mM EDTA, pH7,"3), 5 x Denhardt-Lösung (0,1 % Ficoll, 0,1 % Polyvinylpyrrolidon, 0,1 % Rinderserumalbumin), 0,1 % SDS, 20mg/ml Lachssperma-DNA prähybridisiert und anschließend mit 13 x 106cpm der markierten Probe in der gleichen Lösung, jedoch ohne Lachssperma-DNA, hybridisiert. Nach Inkubation bei 650C über Nacht wurden die Filter 4mal 1 bis 1,5 Stunden in 3 x SSC (0,45NaCI, 45 mM NaCitrat), 0,1 % SDS bei 65°C gewaschen und 7 Tage auf Kodak X-omat S-Röntgenfilm mit Kodak Regular Verstärkerfolien exponiert (Fig. 21). Das Auftreten von mehreren Banden beweist eine Familie von alpha-lnterferongenen bei Hunden, wie sie bei Rindern, Schweinen und Menschen früher nachgewiesen wurde.
Für das Screening der Interferongene in der Hunde-DNA-Bibliothek wurden daher die gleichen Hybridisierbedingungen angewandt.
1 000000 rekombinante Lambda-Phagen wurden auf E.coli NM 528 in einer Dichte von 30000pfu/13,5cm Platte plattiert. Zweifache Nitrocellulosereplikas wurden von jeder Platte nach dem Verfahren von Benton und Davis (19) hergestellt. Nach 2 Stunden Backen bei 800C wurden die Filter 1,5 Stunden bei 650C in 1 M NaCI, 1OmM Tris-HCI pH 8,0, 0,1 % SDS gewaschen, über Nacht wie oben beschrieben, prähybridisiert und 24 Stunden mit 1,5 x 106cpm radioaktiver alpha-lnterferon-Probe pro Filter hybridisiert. Nach 3mal wiederholtem Screening wurden.9 Hunde-alpha-lnterferon-Klone erhalten, die positive Hybridisierungssignale ergaben.
5) Charakterisierung der Rekombinantenphagen
Von 9 mit humanem alpha-IFN hybridisierenden Rekombinanten wurde Phagen-DNA hergestellt. Die DNAs wurden mit EcoRI, BamHI, Hindlll, Pstl, BgIII, Sail, Smal verdaut und in einem 0,8%igen Agarosegel elektrophoretisch aufgetrennt. Die Größe der hybridisierenden Fragmente wurde nach dem Southern-Verfahren bestimmt. Die Position der Restriktionsstellen innerhalb des Lambda-Inserts wurde mittels einer Methode von Rackwitz et al. (4) nach partiellem Restriktionsverdau der Lambda-DNA, Markierung der rechten bzw. linken kohäsiven Enden der Lambda-Arme mit synthetischen, P-32-markierten Oligonukleotiden und Elektrophorese in 0,45%igen Agarosegelen bestimmt. Die daraus erhaltene Restriktionskarte des Klones Ca-alpha-11 -2 ist in Fig.22 dargestellt.
6) Subklonierung der Hundeinterferon-alpha-Gene
Zwei Restriktionsfragmente des Klons Ca-alphall-2, die mit dem humanen alpha-lnterferon-Marker hybridisiert hatten, wurden in die Mehrfachrestriktionsenzym-Klonierungsstelle des pBR322-Derivates pUC9 subkloniert. Die Insertion eines fremden DNA-Fragments führt zu einer Unterbrechung des Iac z-Genes der /3-Galaktosidase und verändert damit den Phänotyp des mit dem Plasmid transformierten E.coli Stammes JM101 von Iac+ zu Iac-, Aufgrund der nicht funktionierenden /3-Glaktrosidase kann mit Isopropylthiogalaktosid (IPTG) induzierter JM101 das farblose Substratanalog S-Brom^-chlor-S-indolyl-ß-D-galactosid (BCIG) nicht zum blauen Farbstoff spalten. Bakterienkolonien mit lac-Phänotyp können daher an der weißen Farbe erkannt werden.
Ein 3,7 kb Smal-Fragment aus dem Klon Ca-alphall-2 wurde aus einem Agarosegel eluiert, auf einer Elutip-D-Säule gereinigt und in etwa 10fach molarem Überschuß mit40ng mit Smal geschnittenem und dephosphoryliertem pUC9-Vektor ligiert, in E.coli JM101 transformiert und mit LB Top-Agar mit 0,2 mg/ml BCIG, 0,17 mg/ml IPTG und 0,1 mg/ml Ampicillin ausgegossen. Weiße Kolonien wurden in 5ml LB-Brühe mit 0,1 mg/ml Ampicillin über Nacht bei 370C hochgezüchtet und nach dem eingesetzten Fragment mit einem Plasmid-Minipräparationsverfahren (25) gescreent. Ein so erhaltenes Plasmid wurde pAH 2 benannt. In gleicherweise wurde ein 2,4 kb Smal-Fragment aus demselben Lambda-Klon in pUC 9 subkloniert. Das erhaltene Plasmid wurde pAH4 benannt.
7) DNA-Sequenz von Hunde alpha-lnterferon-Genen aus Klon Ca-alphall-2
Das 1,7kb Hindlll-Insert von pAH2 (3,7kb Smal-Fragment Subklon von Ca-alphall-2, Fig.23) wurde nach der Dideoxy-Methode von Sanger (23) nach dem Shotgun-Verfahren sequenziert. 60^tg pAH 2 Plasmid-DNA wurde vollständig mit Hindlll verdaut, das 1,7kb Fragment aus einem 1%igen Agarosegel isoliert und wie oben beschrieben gereinigt.
15μg dieses Fragments wurden in 100μΙ Ligationsmediüm mit 14 Einheiten T4-DNA-Ligase über Nacht bei 14°C und weitere 4 Tage bei 4°C mit sich selbst ligiert. Diese ligierte DNA wurde in einem Eisbad mit Ultraschall in 20 Sekunden Pulsen, insgesamt 100-140 Sekunden, in kleine Stücke zerteilt. Die DNA-Enden wurden 2 Stunden bei 14°Cin 250μ.Ι Reaktionsmedium (5OmM Tris-HCI pH7,5,1OmM MgCI2,1 mM Dithiothreitol, 0,5mg/ml Rinderserumalbumin je 0,1 mM dATP, dGTP, dCTP, dTTP) mit 15 Einheiten des großen Fragmentes der E.coli Polymerase I (Klenow Fragment) repariert. Nach Konzentrierung durch Äthanolfällung wurde die so vorbehandelte DNA auf einem-1%igen Agarosegel aufgetrennt und DNA-Fragmente in einem Größenbereich von 0,35-1. Okb isoliert und gereinigt. Die Fragmente wurden in etwa 10fach molarem Überschuß mit der mit Smal geschnittenen und dephosphorylierten, replikativen Form von Bakteriophage M 13mp8 (22) ligiert und E.coli JM101 transformiert. Die Einzelstrang-DNA der so erhaltenen, rekombinanten Phagen wurde isoliert und nach Binden eines synthetischen Oligonukleotides die Zweitstrangsynthese in 4 Einzelreaktionen mit dem Klenow Fragment der E.coli DNA-Polymerase I durchgeführt.
Die Sequenzen der Inserts der verschiedenen rekombinanten Phagen wurden mit Hilfe eines von C. Pieler modifizierten Computerprogrammes von Staden (24) zu einer Totalsequenz vereint, die in Fig. 24 dargestellt ist.
Vollkommen analog wurde ein 1,9 kb Hind Ill-Fragment aus dem Plasmid paH4 (2,4kb Smal-Subklon aus Ca-alphall-2, Fig. 23) sequenziert (Fig. 25).
8) Konstruktion von Expressionsplasmid pRH 100
Alle Enzymreaktionen wurden unter den von den Herstellern angegebenen Bedingungen durchgeführt.
7>g Plasmid pER103(Eva Dworkin-Rastl et al., Gene 21 [1983] 237-248, EP-A-0.115-613) wurden in 50μΙ Reaktionsmedium mit der Restriktionsendonuklease Hindlll linearisiert. Nach einer einstündigen Inkubation bei 37°C wurden 50μ,Ι 2 χ CIP-Puffer zugesetzt (2 χ CIP-Puffer = 20mMTris, pH = 9,2, 0,2 mM EDTA). Durch Zugabe von 2 Einheiten alkalischer Phosphatase aus Kälberdarm (CIP) wurden die 5'terminalen Phosphatreste entfernt; inkubiert wurde bei 45°C 30 Minuten lang. Die Reaktion wurde durch Zugabe,von4^l 0,5 EDTA-Lösung sowie Zugabe von 10μ.Ι 1 MTris, pH = 8,0 Lösung gestoppt. Die Proteine wurden durch zweimalige Phenol- und einmalige Phenol-/Chloroformextraktion entfernt. Die DNA wurde aus der wäßrigen Phase nach Zugabe von 0,1 vol 3 M Natriumacetatlösung pH = 5,5 und 250μ\ Äthanol ausgefällt, das DNA-Präzipitat nach Zentrifugieren
einmal mit 70%iger Äthanollösung gewaschen. Die DNA wurde getrocknet, und das Pellet anschließend in 20/xlTE-Puffer dOmMTrispH = 8,0,1 mM EDTA) gelöst.
Jeweils 1 μg der synthetisch hergestellten Oligodesoxynukleotide d(AGCTTAAAGATGAGCT) und d(CATCTTTA) wurden in je 10μ.Ι Reaktionslösung unter Zugabe von 10 Einheiten T4-PNK (Polynukleotidkinase) sowie 1 mM rATP phosphoryliert. Die Reaktion fand bei 37°C statt und dauerte 45 Minuten. Die Reaktion wurde durch lOminütiges Erhitzen auf 70°C abgebrochen. Jeweils 5μ\ der Plasmidlösung und der phosphorylierten Oligonukleotide wurden gemischt und 5 Minuten auf 7O0C erwärmt. Danach wurde die Lösung auf 00C abgekühlt, 2μ,110 χ Ligasepuffer (50OmM Tris, pH = 7,5), 10OmM MgCI2 20OmM DTT (Dithiothreit), 1 mM rATP, 500/u.G/ml BSA (Rinderserumalbumin), sowie 2μΙ Wasser und 10 Einheiten T4-DNA Ligase zugesetzt. Die Reaktion dauerte 40 Stunden und wurde bei 4°C durchgeführt. Sie wurde durch lOminütiges Erhitzen auf 700C abgebrochen.
2μ\ dieser Ligasereaktion wurden in insgesamt 30μΙ Lösung mit 10 Einheiten der Restriktionsendonuklease Sacl (New England Biolabs) 3 Stunden bei 370C verdaut. Die Reaktion wurde durch lOminütiges Erhitzen auf 7O0C abgebrochen. 5μΙ dieser Reaktionsmischung wurden in insgesamt 30μ.Ι durch Zugabe von 10 Einheiten T4-PNK bei 140C 16 Stunden lang ligiert. 200μΙ kompetenter E. coli Hb 101 wurden mit 10/xl dieser Ligasereaktion versetzt. Die Bakterien wurden 45 Minuten auf Eis gehalten und anschließend 2 Minuten auf 420C erwärmt, um die DNA-Aufnahme zu ermöglichen. Anschließend wurde die Bakteriensuspension wieder bei O0C 10 Minuten inkubiert. Abschließend wurden die transformierten Bakterien auf einem LB-Agar, der 50/xg/ml Ampicillin enthielt, ausgestrichen.
Von den entstandenen Bakterienkolonien wurden 12 willkürlich ausgesucht und daraus im Mikromaßstab die Plasmide isoliert (Birnboim und DoIy, Nucl. Acids Res. 7 [1979] 1513-1523). Die resultierende DNA wurde mit der Restriktionsendonuklease Sacl geschnitten und die DNA auf einem Agarosegel (1 %, 1 χ TBE-Puffer) aufgetrennt. Die Wanderung der DNA als lineares Molekül der Größe von etwa 4400 bp bestätigte die Einführung einer Sacl-Erkennungsstelle in das Plasmid. Eines dieser Plasmide wurde willkürlich ausgesucht. Mit der DNA aus der dazugehörigen Minipräparation wurde nochmals E. coli HB101 transformiert. Von den resultierenden transformierten Bakterien wurde eine Kolonie ausgewählt und in größerem Maßstab angezüchtet. Das daraus isolierte Plasmid wurde mit den Restriktionsendonukleasen EcoRI und BamHI geschnitten, die DNA auf einem 1%igen Agarosegel aufgetrennt, und das kleinere Fragment aus dem Gel durch Elektroelution isoliert. Dieses etwa 460bp lange EcoRI-BamHI DNA-Fragment wurde nach Sanger sequenziert. (F. Sanger et al., Proc. Natl. Acad. Sei. [1977] 5463-5467). Das dermaßen analysierte Plasmid wurde pRH 100 genannt.
9) Direkte Expression von reifem CalFN-alphal in E. coli
Die Vorgangsweise für die Konstruktion des Expressionsplasmides pAH 4/2 für reifes CalFN-alphal ist schematisch in Figur 28 dargestellt.
5;ug Plasmid pRHIOO wurden vollständig mit der Restriktionsendonuklease BamHI geschnitten und anschließend mit Kalbsdarm-Phosphatase (CIP) die 5'terminalen Phosphatreste entfernt.
30μχ) Plasmid pAH4 (siehe Beispiel 6) wurden mit BamHI verdaut. Nach elektrophoretischer Auftrennung der DNA in einem Agarosegel wurden DNA-Fragmente einer Länge von 0,6 kb, die die gesamte codierende Sequenz für CalFN-alphal enthalten, aus dem Gel isoliert und gereinigt.
Etwa 1/zg dieser 0,6kb DNA-Fragmente wurde mit 25 ng geschnittener pRH 100 Vektor-DNA in 10μ,Ι Ligationsmedium (66 mM Tris-HCI pH7,2, 0,1 M NaCI, 1OmM MgCI2,1 mM EDTA, 5mM Dithiotreit, 0,5mM ATP) mit 10 Einheiten T4-DNA Ligase bei 140C 24 Stunden ligiert. Kompetenter E. coli HB101 wurde mit5/xl dieser Ligasereaktion transformiert und auf LB-Agar, der50^.g/ml Ampicillin enthielt, ausgestrichen.
Von den entstandenen Bakterienkolonien wurden im Mikromaßstab Plasmide isoliert und durch Restriktionsanalyse mit verschiedenen Enzymen charakterisiert. Ein Plasmid, das Interferongen und Tryptophanpromoter in derselben Orientierung enthielt, wurde pAH 104 benannt (Figur 28). Dieses Plasmid stellt eine Zwischenstufe für die Herstellung des endgültigen Expressionsplasmides für reifes CalFN-alphal dar.
Etwa 7pmol des 0,6kb langen BamHI Fragments aus dem Plasmid pAH4 wurden mit 1 nmol synthetischem Oligodesoxynukleotid (d(TGCCACCTGCCCGAC) gemischt, das zuvor am 5'Ende mittels T4 Polynukleotid Kinase mit einer Phosphatgruppe versehen wurde, und mit Wasser auf 34μ,Ι Gesamtvolumen gebracht. Das 15mer Oligonukleotid enthält die codierende Sequenz für die N-terminalen 5 Aminosäuren des reifen Hunde-alpha-lnterferons. Die DNA-Lösung wurde 5 Minuten auf 100"C erhitzt und anschließend abgekühlt, wobei das in hohem Überschuß vorhandene Oligonukleotid an die komplementäre Stelle des DNA^Einzelstranges bindet.
Die Zweitstrangsynthese ausgehend vom gebundenen Oligonukleotidprimer erfolgte in 70/xl Reaktionsmedium (5OmM Tris-HCI pH7,5,1OmM MgCI2,1 mM Dithiothreit, 0,5mg/ml Rinderserumalbumin, je 1 mM dATP, dGTP, dCTP, dTTP) mit 35 Einheiten Klenow Fragment der E. coli DNA Polymerase I 90 Minuten bei 22°C. Die Reaktion wurdedurch Zugabe von 2OmM EDTA gestoppt und die Proteine durch Phenol/Chloroformextraktion entfernt. Die DNA wurde nach Zugabe von 0,1 VoI 3 M Natriumazetatlösung pH 6 mit Äthanol ausgefällt und mit 70%igem Äthanol gewaschen.
Die verbliebenen, einzelsträngigen DNA-Abschnitte wurden mit S1 Nuklease entfernt. Dazu wurde das getrocknete DNA-Pellet ίη300μΙ S1-Reaktionspuffer(4mM Zn(Ac)2, 3OmM NaAc, 25OmM NaCI, 5% Glyzerin, pH4,6) gelöst und mit 150 Einheiten S1 Nuklease (Sigma) 2 Stunden bei 140C inkubiert. Die Reaktion wurde durch Zugabe von 2OmM EDTA abgebrochen. Die Proteine wurden durch Extraktion mit Phenol und Chloroform entfernt. Nach Zugabe von 0,15VoI 3M Natriumazetatlösung und 0,6VoI Isopropanol wurde die DNA bei O0C aus derwäßrigen Phase ausgefällt und mit70%Äthanol gewaschen. Die erhaltene DNA wurde mit 60 Einheiten Pstl 2,5 Stunden bei 37°C verdaut und anschließend elektrophoretisch in einem 2%igen Agarosegel aufgetrennt. DNA-Fragmente einer Länge von etwa 300 bp wurden isoliert und gereinigt. 30μg Plasmid pAH 104 wurden mit 50 Einheiten Sacl 2 Stunden bei 37°C verdaut und das Enzym 10 Minuten bei 700C inaktiviert, nach Zusatz von je 0,5mM aller vier Desoxynukleotide und 30 Einheiten Klenow Polymerase wurde 60 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert, um die DNA-Enden stumpf zu machen. Die Proteine wurden durch Extraktion mit Phenol und Chloroform entfernt und die DNA mit Äthanol ausgefällt. Die erhaltene DNA wurde mit 20 Einheiten Pstl 40 Minuten bei37°C partiell geschnitten und die Reaktion durch Zusatz von 2OmM EDTA abgebrochen. Die DNA wurde elektrophoretisch in einem Agarosegel aufgetrennt und Fragmente einer Länge von 4,3kb isoliert und gereinigt.
Die erhaltene DNA wurde mit dem zuvor beschriebenen 0,3kb langen DNA-Fragment in 10μΙ LigationsmediummitiO Einheiten T4-DNALigase 20 Stunden bei 14°C ligiert. Mit dieser Ligasereaktion wurde E. coli HB101 transformiert und auf Ampicillinhaltigem LB-Agar plattiert.
Die entstandenen Bakterienkolonien wurden auffrische Agarplatten und im Duplikat auf Nitrozellulosefilter, die auf Agarplatten aufgelegt waren, übertragen. Nach Inkubation bei 37°C wurden die Bakterien nach einer Vorschrift von Grunstein und Hogness (M.Grunstein & D. Hogness, Proc. Natl. Acad. Sei USA [1975] 72, 3961- ) lysiert und die DNA nach Denaturierung an die
Nitrozellulose gebunden. Die Zellbruchstücke wurden durch 16stündige Inkubation bei 65°C in einer Vorwaschlösung (1 M NaCI, 5OmMTrIs-HC11 pH 8,0,1 mM EDTA, 0,1 %SDS) entfernt. Die Filter wurden anschließend in 10 ml Hybridisierlösung (0,9 M NaCI, 9OmM Tris-HCI pH7,5, 6mm EDTA, 0,1 % SDS, 0,1 μ9/πιΙ tRNA aus E. coli (Sigma) mit 2 x 107cpm mit 32P markiertem Oligodesoxynukleotid d(TGCCACCTGCCCGAC) 3 Stunden bei 47°C hybridisiert. 18pmol Oligonukleotid wurden mit 18pmol Iy32P]ATP (3000Ci/mmol, Amersham) in 20μ1 Kinasierungspuffer (7OmM Tris-HCI pH7,6,1OmM MgCI2, 5mM Dithiothreit) mit 10 Einheiten T4-polynukleotidkinase (BRL) 45 Minuten bei 37°C inkubiert. Die Reaktion wurde durch Zugabe von 25mM EDTA gestoppt und die nicht eingebaute Radioaktivität durch Ausschlußchromatographie über eine 1 ml Biogel P6-DG (Biorad) Säule abgetrennt.
Die Filter wurden 4mal 30 Minuten bei 47°C gewaschen. Die Waschlösung entsprach der Hybridisierlösung ohne Zusatz von tRNA. Die Filter wurden auf Kodak X-omat S Röntgenfilm unter Verwendung von Kodak X-omat Regular Verstärkerfolien bei -8O0C exponiert. Von Bakterienkolonien, die im Autoradiogramm ein positives Hybridisierungssignal lieferten, wurde durch ein Minipräparationsverfahren Plasmid-DNA isoliert. Die Plasmide wurden mit Hind III und BamHI vollständig geschnitten. Nach elektrophoretischer Auftrennung in einem Agarosegel wurden 0,5kb lange Restriktionsfragmente isoliert und der DNA-Sequenzanalyse nach Sanger zugeführt.
Ein Plasmid, das die gewünschte Struktur aufwies, wurde pAH4/2 benannt. Es ermöglichte die Expression von reifem CalFN-alphal in E. coli.
10) Herstellung des Plasmides pAH4/3
Das für die bakterielle Expression von CalFN-alphal manipulierte Gen aus dem Plasmid pAH4/2 (Beispiel 9) wurde in einem modifizierten PlasmidvektorparpATER103 (Beispiel K) subkloniert, welcher eine höhere Kopienzahl pro Zelle und erhöhte Plasmidstabilität aufweist.
Etwa 0,5μ9 des 0,5 kb langen Hindlll/BamHI Fragmentes von pAH4/2 (Beispiel 9) wurde mit 25 ng, mit Hindill und BamHI geschnittenem und gelgereinigtem Plasmidvektor parpATER103 in 10μΙ Ligationsmedium mit 5 Einheiten T4-DNALigase 3 Stunden bei 22°C inkubiert. Kompetenter E. coli HB101 wurde mit 5μΙ dieser Ligasereaktion transformiert und auf LB-Agar mit 50μg/ml Ampicillin plattetiert.
Von den entstandenen Bakterienkolonien wurden 6 willkürlich ausgesucht und daraus im Mikromaßstab die Plasmide isoliert.
Ein Plasmid, das nach Restriktionsanalyse mit verschiedenen Restriktionsendonukleasen die gewünschte Struktur aufwies, wurde pAH4/3 benannt.
11) Expression der Interferonaktivität durch E. coli HB101 enthaltend das Plasmid pAH4/2 oder pAH4/3
100ml Bakterienkultur wurden bei 37°C unter kräftigem Schütteln bis zur unten angegebenen optischen Dichte bei 600nm in folgendem tryptotphanfreiem Medium inkubiert (Angaben pro Liter Medium): 10g (NH4J2PO4, 3,5g KH2PO4pH7,3 mit NaOH, 0,5g NaCI, 21 g Casaminosäuren (sauer hydrolysiert), 11 g Glucose, 1 mM MgSO4, 0,1 mM CaCI2,1 mg Thiamin-HCI, 20 mg L-Cystein,20mg 3-/3-lndolacrylsäure IAA, Induktor für das Tryptophan-Operon), optionsweise 50-100 mg Ampicillin. Anschließend wurden die Bakterien durch Zentrifugieren 5 Minuten bei 4000UpM pelletiert, mit Viodes Kulturvolumens eiskaltem 5OmM Tris-HCI pH8,0, 3OmM NaCI suspendiert und unter Eiskühlung zweimal 30 Sekunden mittels Ultraschallsonde (2OkHZ, 100 Watt) aufgebrochen. Die Zelltrümmer wurden 10 Minuten bei 10000UpM (4°C) entfernt und der Überstand nach Sterilfiltration auf Interferonaktivität in einem Assay getestet, der die Reduktion des cytophatischen Effekts (CPE) von Vesicular Virus (VSV) mißt.
Testsystem: A-72 (ATCC CRL1542) caninerTumor/Vesicular Stomatitis Virus
Plasmid OD6oonm IFN-Einheiten/1 Bakterienkultur
PAH 4/2 4,2 3,2x105
pAH4/3 3,2 3,0x105
12) Nachweis von mit CalFN-alphal und EqlFN-omega hybridisierenden Sequenzen in genomischer Hunde-DNA
Zum Nachweis der Gesamtzahl von Sequenzen im Hundegenom, die hohe Homologie mit Interferongenen der Klasse IFN-alpha, bzw. IFN-omega aufweisen, wurde folgendermaßen vorgegangen:
20μg hochmolekulare Hunde-DNA (Beispiel 1) wurden mit 60 Einheiten des entsprechenden Restriktionsenzyms in 200μΙ Reaktionsvolumen vollständig verdaut und jeweils 10μg dieser geschnittenen DNA pro Spur auf einem 0,8%igen Agarosegel nach der Größe aufgetrennt. Nach Southern-Transfer auf Nitrozellulosefilter, Denaturieren und Fixieren der DNA wurde jedes Filter mit etwa 6 x 106cpm nicktranslatierter DNA-Probe hybridisiert (17 Stunden bei 65°C, 5 x SSPE, 5 χ Denhardt-Lösung, 0,1 % SDS, 20μg/ml denaturierte Lachssperma-DNA, siehe Beispiel 4).
Als Probe für CalFN-alpha wurde ein 0,6kb langes BamHI Fragment aus Plasmid pAH4 verwendet, das die gesamte codierende Sequenz für das Interferon enthält. Als Probe für EqlFN-omega wurde das 2,1 kb EcoRI Insert aus Plasmid pRH61 eingesetzt. Das mit CalFN-alphal hybridisierte Filter wurde anschließend unter stringenten Bedingungen gewaschen, 4mal 45 Minuten bei 65°CmitO,3 x SSC(45mM NaCI, 4,5 mM Na3Citrat), 0,1 % SDS. Das mit EqlFN-omega hybridisierte Filter wurde bei 65°C mit 2 x SSC(0,3M NaCI, 3OmM Na3Citrat), 0,1 % SDS gewaschen, 4mal 45 Minuten bei 65°C mit 0,3 x SSC(45mM NaCI,4,5mM Na3Citrat), 0,1%SDS. Das mit EqlFN-omega hybridisierte Filterwurde bei 65°Cmit2 χ SSC(0,3M NaCl,3OmM Na3Citrat), 0,1 % SDS gewaschen. Die Autoradiographie erfolgte auf DuPont Cronex X-ray film unter Verwendung von Kodak Lanex-Regular Verstärkerfolie 7 Tage bei-8O0C.
Das Autoradiogramm (Figur 9) zeigt, daß im Hundegenom außer den beiden, für identische alpha-lnterferone codierenden Gene keine weiteren Sequenzen nachweisbar sind, die mit CalFN-alphal einen ähnlich hohen Homologiegrad aufweisen, wie er bei anderen Spezies innerhalb einer Interferonklasse auftritt. Mit der DNA eines equinen omega-lnterferongenes ist unter etwas weniger stringenten Bedingungen mindestens ein Gen nachweisbar, das unterschiedlich von den beschriebenen alpha-Interferonen des Hundes ist.
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Claims (1)
- Verfahren zur Herstellung von EqlFN-alpha, -beta, -omega oder CalFN-alpha, dadurch gekennzeichnet, daßa) ein Wirtsorganismus, vorzugsweise ein Prokaryot, Eukaryot oder eine Säugetierzelle, insbesondere E. coli oder Saccaromyces cerevisiae mit genetischen Informationen, codierend für EqlFN-alpha, -beta, -omega oder CalFN-alpha, vorzugsweise mit den für die erfindungsgemäßen Proteine codierenden Sequenzen aus den Plasmiden pAH 50, pAH 62, pRH 63, pRH 61, pAH 60, pAH 2 oder pAH4 oder den mit diesen Plasmiden unter stringenten Bedingungen, die eine Homologie größer als 85%, vorzugsweise größer als 90%, erkennen lassen, hybridisierenden Sequenzen, insbesondere Sequenzen gemäß einer der Formeln I bis V oder degenerierten Variationen dieser Sequenzen transformiert,b) die codierende Sequenz in einem Expressionsvektor, vorzugsweise in einem der Expressionsvektoren pAH 52, pAH 52/2, pAH 53, pAH 55, pAH 62, pAH 4/2 oder pAH 4/3 enthalten ist und diese Information zur Produktion des EqlFN-alpha, -beta, -omega oder CalFN-alpha im Wirtsorganismus exprimiert undc) das Interferon EqlFN-alpha, -beta, -omega oder CalFN-alpha, vorzugsweise ein Interferon gemäß einer der Formeln I bis V isoliert und gereinigt wird.
Family
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