AT393690B

AT393690B - Homogene, rekombinante immun-interferonfragmente

Info

Publication number: AT393690B
Application number: AT264487A
Authority: AT
Original assignee: Hoffmann La Roche
Priority date: 1987-10-08
Filing date: 1987-10-08
Publication date: 1991-11-25
Also published as: ATA264487A

Description

AT 393 690 B

Die vorliegende Erfindung betrifft homogene, rekombinante, menschliche Immun-Interferonfragmente, denen im Vergleich zum reifen, rekombinanten, menschlichen Immun-Interferon voller Länge 6 bis 11 Aminosäuren am C-Terminus fehlen. (Die Aminosäuresequenz des Immun-Interferons voller Länge ist in Fig. 1 dargestellt.) Die Erfindung betrifft auch replizierbare, mikrobielle Expressionsvektoren, die eine Nukleotidsequenz enthaltende für 5 ein solches rekombinantes Immun-Interferonfragment kodiert, mit diesem Expressionsvektoren transformierte Mikroorganismen und Verfahren zur Herstellung dieser Interferonfragmente und Mikroorganismen. Die Erfindung betrifft im weiteren Pharmazeutika, die eine oder mehrere dieser rekombinanten Immun-Interferonfragmente enthalten,unddie Verwendung dieserrekombinantenlmmun-InterferonfiagmenteundPharmazeutikazur Behandlung verschiedener Krankheiten. 10 Natürliches, menschliches Immun-Interferon (IFN-γ) wird bei mitogener Stimulierung von Lymphozyten er zeugt Es zeigt antivirale und anti-proliferative Wirkung, die aber bei pH 2 verloren geht Die aktive Form des Immun-Interferons ist vermutlich ein Multimer, sehr wahrscheinlich ein Dimer, Trimer oder Tetramer (Pestka et al., J. Biol. Chem. 25S» 4706-4709 [1983]).

Man fand, daß Immun-Interferon im menschlichen Genom in einem, ein 166 Aminosäure langes 15 Vorläuferpolypeptid kodierendes Gen verschlüsselt ist (Derynck et al., Nucleic Acid Res. 1£), 3605-3615 [1982]). Man nahm an, daß es durch posttranslationale Prozessierung in ein Polypeptid mit 146 Aminosäuren und einer Cys-Tyr-Cys-Gln-....N-terminalen Sequenz überführt wird.

Durch Verwendung von Methoden der DNA-Rekombinationstechnologie (z. B. Maniatis et al., „Molecular cloning - A laboratory manual“, Cold Spring Harbor Laboratory, 1982) wurden Expressionsvektoren, die für ein 20 rekombinantes, diese 146 Aminosäuren umfassendes Immun-Interferon kodieren, konstruiert. Bei Einführung dieser

Expressionsvektoren in einen mikrobiellen Wirt, werden rekombinante Immun-Interferonpolypeptide mit 147 Aminosäuren, nämlich den oben erwähnten 146 Aminosäuren sowieeinem zusätzlichenN-terminalen Methionin, synthetisiert. Das zusätzliche Methionin stammt vom Translationsstartsignal AUG der mRNA, das für die Aminosäure Methionin kodiert Im ursprünglichen menschlichen Gen ist dieses Translationsstartsignal vor dem 25 Signalpeptid gelegen. Während der posttranslationalen Prozessierung wird das Signalpeptid, zusammen mit dem vom Translationsstartsignal stammenden Methionin, abgespalten, was zu einem methioninfreien, reifen, 146 Aminosäure langen Immun-Interferon führt Prokaryotische Wirtszellen können das Signalpeptid vor dem menschlichen Immun-Interferonvorläuferpolypeptid nicht an der richtigen Stelle abspallen. Deshalb muß die im menschlichen Immun-Interferongen für das Signalpeptid kodierende Sequenz mittels gentechnischer Methoden 30 entfernt werden, damit das Immun-Interferon in reifer Form exprimiert werden kann. Das ATG-Kodon, genau vor der für das reife Polypeptid kodierenden Sequenz, hat das im rekombinanten, menschlichen Immun-Interferon vorhandene Methionin zur Folge. Trotz des zusätzlichen N-terminalen Methionins und der Tatsache, daß es nicht glykosyliert ist, zeigt das rekombinante Immun-Interferon antivirale und anti-proliferative Wirkung die pH 2 empfindlich ist und vergleichbar ist mit derjenigen des aus menschlichen Leukozyten isolierten Immun-Interferons 35 (Grav et al.. Nature295.503-508 Γ1982Β. SpäterzeigtenRinderknechtetal.. fJ. Biol. Chem.259.6790-6797 [1984]), daß das, aus induzierten menschlichen Lymphozyten aus dem peripheren Blut gereinigte, Immun-Interferon ein 143 Aminosäure langesPolypepdd ist, dem dieCys-Tyr-Cys-Sequenz fehlt und das einen Pyroglutaminsäurerestam N-Terminus hat Am C-Terminus wurde eine gewisse Heterogenität beobachtet. Nochmalige Klonierung des ursprünglichen,rekombinanten hnmun-Interferon-Gens führte zu Expressionsvektoren,diefürreifes,rekombinantes 40 Immun-Interferon kodieren, das diese 143 Aminosäuren umfaßt und über ein, wie oben dargelegt, zusätzliches Methionin am N-Terminus verfügt Ein Vergleich der biologischen Aktivitäten der rekombinanten, menschlichen Immun-Interferone mit oder ohne die Cys-Tyr-Cys-Sequenz zeigte, daß die Entfernung der Cys-Tyr-Cys-Sequenz zu einer zweifach höheren viralen Aktivität führt (EP-A2-146 354, veröffentlicht am 26.6.85). Darüberhinaus ist in der EP-A146 354 gezeigt daß Immun-Interferonfragmente, die durch begrenzte tryptische Spaltung von reifem, 45 rekombinantem, menschlichem Immun-Interferon erzeugt wurden, im Vergleich zu einer, aus einer Mischung von Interferonpolypeptiden (= Referenzmaterial) mit 139 bzw. 143 Aminosäuren (Verhältnis 98:2) bestehenden, rekombinanten Immun-Interferonpräparation verminderte antivirale Aktivität hatten. Zum Beispiel zeigte ein 131 Aminosäure langes Fragment dem 12 Aminosäuren am C-Terminus fehlen,40-50 % der spezifischen Aktivität des oben genannten Referenzmaterials. Fragmente, denen zusätzlich weitere 3 bzw. 6 Aminosäuren am C-Terminus 50 entfemtwordenwaren.diealso 129 bzw. 125 Aminosäure lang waren, hatten 6-9 bzw. 1 % der spezifischen Aktivität des Referenzmaterials. Daraus haben die Verfasser der oben genannten Veröffentlichung geschlossen, daß alle Fragmente, denen terminale Aminosäure fehlen, eine niederere antivirale Aktivität als das oben erwähnte Referenzmaterial oder das reife, rekombinante menschliche Immuninterferon mit 143 Aminosäuren, dem die Cys-iyr-Cys-Sequenz am N-Terminus fehlt, haben und daß die Aktivität umso niedriger wird, je mehr Aminosäuren 55 am C-Terminus fehlen. Es werden daher im Anspruch 3 der EP-A2-146 354 Immuninterferon-Fragmente mit 126 bis 142 Aminosäuren sowie das Immuninterferon voller Länge mit 143 Aminosäuren beansprucht, offensichtlich in der Annahme, daß diese alle eine Aktivität von mehr als 1 % im Vergleich zum oben genannten Referenzmaterial -2-

AT 393 690 B aufweisen. (Das Immun-Interferonfragment mit 125 Aminosäuren hat - wie erwähnt - 1 % Aktivität.)

Im Patentanspruch 20 der EP-A2-146 354 werden dann in einer Aufzählung die Immuninterferon-Fragmente mit einer Länge von 132 bis 139 Aminosäuren explizit beansprucht; wie aus der Rückbeziehung auf den Patentanspruch 15 hervorgeht, spekulieren die Verfasser der europäischen Patentanmeldung damit, daß diese Immuninterferon-5 Fragmente diesselben Eigenschaften wie natives Immuninterferon haben. Sie spekulieren offensichtlich deshalb damit, weil das Immuninterferon-Fragment mit 131 Aminosäuren40-50 % der spezifischen Aktivität der Mischung von Interferonpolypeptiden mit 139 bzw. 143 Aminosäuren (Verhältnis 98:2) aufweisen. MaW: Von den Immuninterferon-Fragmenten, die im Patentanspruch 20 aufgezählt sind, wurde nur ein einziges - nämlich das mit 139 Aminosäuren - tatsächlich hergestellt, und auch das nur in einer Mischung mit dem Immuninterferon voller 10 Länge. Was die anderen Immuninterferonfragmente betrifft, so handelt es sich dabei um eine reine Spekulation, um eine rein „papierene“ Offenbarung; es sind die Eigenschaften dieser Fragmente nicht bekannt, und es ist auch nicht möglichdieseFragmenteaufgmndderOffenbarungderEP-A2-146354herzustellen,diese Immuninterferonfragmente sind daher im patentrechtlichen Sinne neu. (Vgl. in diesem Zusammenhang die ständige österreichische Praxis, wonach in Patentanmeldungen Beispiele für erfindungsgemäße chemische Verbindungen, die nur aus einer 15 chemischen Formel bestehen, ersatzlos gestrichen werden, wenn nicht deren tatsächliche Herstellung z. B. durch Angabe des Schmelzpunktes belegt ist; denn die Angabe einer chemischen Formel allein kann die Neuheit des chemischen S toffes, der diese Formel hat, nicht treffen. Vergleiche in diesem Zusammenhang auch dieEntscheidung des Europäischen Patentamtes vom 26.3.1986, ABI. EPA 1/1987,5.)

Die wenigen tatsächlich hergestellten Immun-Interferonfragmente wurden nur durch begrenzte Trypsinspaltung 20 erzeugt. Trypsin katalysiert die Hydrolyse von Peptidbindungen, deren Carbonylgruppe von basischen Aminosäuren, üblicherweise Arginin oder Lysin, zur Verfügung gestellt wird. Die Aminosäure-Sequenz von Immun-Interferon enthält 20 Lysin- und 8 Argininreste. Die Anzahl der individuellen, durch Trypsin erzeugten Fragmente hängt von der Zugänglichkeit der Peptidbindung, die zur Erzeugung des Fragmentes geschnitten werden muß, ab. Nichtsdestoweniger führt begrenzte Protolyse zu einem großen Spektrum an Fragmenten, und die Reinigung eines 25 bestimmten Fragmentes aus einer solchen Mischung zur Homogenität ist sehr problematisch, insbesondere, da Polypeptide mit im wesentlichen gleicher Aminosäuresequenz, aber mit um wenige Aminosäuren unterschiedlicher Länge zu trennen wären. Unter diesen Umständen ist die Trennung mittels HPLC, wie sie in der EP-A2-146 354 beschrieben ist, zur Reinigung der hier exemplifizierten Immun-Interferonfragmente zur Homogenität, d. h. im wesentlichen frei von anderen, sich in der Größe davon unterscheidenden Interferonfragmenten, nicht geeignet. 30 Zudem können die erfindungsgemäßen Immun-Interferonfragmente, die übernicht-basischeC-terminale Aminosäuren wie Serin, Glutamin, Methionin, Leucin oder Phenylalanin verfügen, auf Grund der Spezifität von Trypsin nicht durch tryptische Spaltung erzeugt werden. Das mag der Grund dafür sein, daß nur die Herstellung von Immun-Interferonfragmenten mit 125,129,131 und 139 Aminosäuren, die entweder Lysin oder Arginin als C-terminale Aminosäuren haben, in den Beispielen der EP-A2-146 354 gezeigt ist Im Rahmen der vorliegenden Erfindung 35 wurden nun erstmals Immun-Interferonfragmente der eingangs genannten Art hergestellt, denen erfindungsgemäß 6 bis 11 Aminosäuren fehlen. Es handelt sich dabei also um rekombinante, menschliche Immun-Interferonfragmente mit 132 bis 137 Aminosäuren, gezähltab dem ersten Glutaminrest der auf Fig. 1 gezeigten Aminosäuresequenz, die zum ersten Mal in homogener Form unter Verwendung der in der vorliegenden Erfindung beschriebenen Methoden hergestellt wurden. Diese Fragmente sind als gezielte Auswahl gegenüber dem allgemeinen Bereich, der im 40 Patentanspruch 3 der EP-A2-0146354 beansprucht ist neu. Die im Patentanspruch 20 dieser EP-A2-0146354 angeführten Fragmente gehören - mit Ausnahme des letzten - im patentrechtlichen Sinn nichtzum Standder Technik, wie weiter oben bereits angeführt Überraschenderweise wurde gefunden, daß diese homogenen, rekombinanten Immun-Interferonfragmente über eine im Vergleich zum reifen rekombinanten Immun-Interferon voller Länge erhöhte spezifische antivirale Aktivität verfügen. Gleichermaßen wurde beobachtet daß die anderen für Immun-45 Interferon typischen, biologischen Aktivitäten bei den erfindungsgemäßen rekombinanten Immun-Interferon-fragmenten im Vergleich zum reifen rekombinanten Immun-Interferon erhöht sind. Die erfindungsgemäßen Immun-Interferonfragmente sinddaher auch erfinderisch. Pharmazeutika,welcheeinesodermehrere der erfindungsgemäßen rekombinantenlmmun-Interferonfragmenteendialten.könnenzur Behandlung verschiedener Krankheiten verwendet werden. Beispiele für solche Krankheiten sind: virale Infektionen, neoplastische Krankheiten oder rheumatische Arthritis.

Die vorliegende Erfindung stellt deshalb homogene, rekombinante Immun-Interferonfragmente, denen im Vergleich zum reifen, rekombinanten, menschlichen Immun-Interferon 6-11 Aminosäuren am C-Terminus fehlen, zur Verfügung. Genauer gesagt werden durch die Erfindung homogene, rekombinante Immun-Interferonfragmente mit der Aminosäuresequenz -3-

AT 393 690 B X-Y - Asp-Pro-Tyr-V al-Lys-Glu- Ala-Glu-Asn-Leu-Lys-Ly s-Tyr-Phe-Asn-Ala-Gly-His-Ser-Asp-Val-Ala-Asp-Asn-Gly-Thr-Leu-Phe-Leu-Gly-Ile-Leu-Lys-Asn-Trp-Lys-Glu-Glu-Ser-Asp-Arg-Lys-Ile-Met-Gln-Ser-Gln-Ile-Val-Ser-Phe-Tyr-Phe-Lys-Leu-Phe-Lys-Asn-Phe-Lys-Asp-Asp-Gln-Ser-Ile-Gln-Lys-Ser-Val-Glu-Thr-Ile-Lys-Glu-Asp-Met-Asn-Val-Lys-Phe-Phe-Asn-Ser-Asn-Lys-Lys-Lys-Arg-Asp-Asp-Phe-Glu-Lys-Leu-Thr-Asn-Tyr-Ser-Val-Thr-Asp-Leu-Asn-Val-Gln-Arg-Lys-Ala-Ile-His-Glu-Leu-Ile-Gln-Val-Met-Ala-Glu-Leu-Ser-Pro*Ala-Ala-Lys-Thr-Gly-Lys-Arg-Lys- Arg-Z, wobeientwederXfür MethiomnundYfürGlutaminoderXfür Wasserstoffund YfiirGlutamin oder Pyroglutaminsäure und Z für

Ser,

Ser-Gln,

Ser-Gln-Met,

Ser-Gln-Met-Leu,

Ser-Gln-Met-Leu-Phe oder Ser-Gln-Met-Leu-Phe-Arg steht, zur Verfügung gestellt

Diese homogenen, rekombinanten Immun-Interferonfragmente verfügen über eine deutlich höhere biologische Aktivität im Vergleich zu reifem, rekombinantem, menschlichem Immun-Interferon, d. h. zu einem rekombinanten Immun-Interferon voller Länge mit 143 Aminosäuren, das entweder Glutamin oder ein Pyroglutamat an Position 1 seiner Aminosäure-Sequenz hat. Ist die Aminosäure an Position 1 Glutamin kann das rekombinante Immun-Interferon über ein zusätzliches Methionin als 144-igste Aminosäure am N-Terminus verfügen. Das zusätzliche Methionin stammt von dem Translationsstartsignal AUG der mRNA, das, wie oben ausgeführt, für die Aminosäure Methionin kodiert In Expressionssystemen wie E. coli wird dieses Methionin nicht immer durch Prozessierung entfernt. Man fand, daß das zusätzliche N-terminale Methionin die biologische Aktivität der meisten rekombinanten Polypeptide nicht beeinträchtigt (Winnacker, in „Gene und Klone“, p. 255, VCH, Weinheim, Deutschland [1985]). Nach Entfernen des N-terminalen Methionins von rekombinantem Immun-Interferon oder seiner Fragmente kann das neu entstandene Glutamin zu Pyroglutamatcyclisieren, wobei man glaubt daß wiederum keine Beeinträchtigung der biologischen Aktivität erfolgt Die rekombinanten Immun-Interferonfragmente der vorliegenden Erfindung können als Multimere, bevorzugt als Dimere, Trimere oder Tetramere vorliegen.

Es wurde festgestellt, daß sie normalerweise unter nicht-denaturierenden Bedingungen als Dimere vorliegen, obwohl sie nicht glykosyliert sind und auch mangels Cysteinresten keine S-S-Briicken bilden können. Die Dimerisierung scheint auf nicht-kovalente Wechselwirkungen zuriickzufuhren zu sein. Es konnte experimentell gezeigtwerden,daß das Immun-InterferonfragmentIFN-Y-(-10)aufGelpermeationssäulen unter nicht-denaturierenden Bedingungen eine Mobilität aufweist wie ein Protein mit einem Molekulargewicht von ca. 30 bis 32 kDa.

Die rekombinanten Immun-Interferonfragmente der vorliegenden Erfindung können zur Herstellung von Pharmazeutika verwendet werden. Diese enthalten einen physiologisch verträglichen Träger sowie eine, im Vergleich zur Menge, reifem, rekombinantem, menschlichem Immun-Interferon, dienötig ist, um eineim wesentlichen gleiche antivirale Aktivität zu erhalten, deutlich geringere Menge von besagten Immun-Interferonfragmenten. SolchePharmazeutika sind nützlich zur Behandlungverschiedener Krankheiten. Esistklar, daß Aminosäureaustäusche, besonders solche einzelner Aminosäuren in den hierin offenbarten Immun-Interferonfragmenten, zu Varianten der rekombinanten Immun-Interferonfragmenteführenkönnen, welche über eine höhere spezifische Aktivität als reifes, rekombinantes, menschliches Immun-Interferon verfügen. Die Art und Weise, wie solche Aminosäureaustäusche an einem rekombinanten Polypeptid durchgefuhrt werden, ist bekannt Im allgemeinen Sinn umfaßt die vorliegende Erfindung alle rekombinanten Immun-Interferonfragmente, denen im Vergleich zu reifem, rekombinantem Immun-Interferon voller Länge 6 bis 11 Aminosäuren am C-Terminus fehlen oder Modifikationen und allelische Variante davon, wobei die Fragmente eine höhere biologische Aktivität als das reife rekombinante, menschliche Immun-Interferon voller Längeaufweisen. Die Erfindung stelltauchreplizierbare.mikrobielleExpressionsvektoren,die eine für ein rekombinantes Immun-Interferonfragment kodierende, Nukleotidsequenz enthalten, die in funktioneller Art und Weise an eine Expressionskontrollsequenz gebunden ist, und mit so einem Expressionsvektor transformierte Mikroorganismen zur Verfügung. Darüberhinaus stellt sie pharmazeutische Zusammensetzungen, die eines oder mehrere rekombinante Immun-Interferonfragmente und einen physiologisch verträglichen Träger enthalten, zur -4-

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Verfügung. Die Erfindung bezieht sich im weiteren auf Verfahren zur Herstellung rekombinanter Immun· Interferonfragmente mittels DNA-Rekombinationstechnik, auf Verfahren zur Herstellung eines mit einem, wieoben erwähnten, replikablen, mikrobiellen Expressionsvektor transformierten Mikroorganismus und auf Methoden zur Herstellung pharmazeutischer Zusammensetzungen, die solche rekombinante Immun-Interferonfragmente enthalten. Im weiteren bezieht sich die Erfindung auf die Verwendung dieser Interferonfragmente und der entsprechenden Pharmazeutika zur Behandlung verschiedener Krankheiten.

Die Verständlichkeit der vorliegenden Erfindung wird durch die Bezugnahme auf die folgende ausführliche Beschreibung erleichtert, insbesondere in Verbindung mit den begleitenden Abbildungen, in denen die folgenden Abkürzungen und Zeichen verwendet werden: B, E, H, S, Sa, Sc, X, Xb stehen für Schnittstellen der Restriktionsendonukleasen: BamHI, EcoRI, Hindin, SphI, Sali, Seal, Xhol und Xbal.

‘.I

In den Figuren 2,4 und 6 bis 9 werden Promotoren der Gene bla, lacl und neo dargestellt durch ; Terminatoren ribosomale Bindungsstellen der Gene bla, cat, neo und lacl werden dargestellt durch wie tp und TI weiden durch durch ]J dargestellt; das regulierbare Promotor/Operator-Element Ρ^5 X/q wird dar- dargestellt; die ribosomale Bindungsstelle RBSII, SphI wird durch gestellt; kodierende Regionen, die von dieser ribosomalen Bindungsstelle kontrolliert werden, sind dargestellt durch ^ ; Regionen, die zur Replikation der DNS (repl.) benötigt werden sind dargestellt durch *........ ^ und

Regionen die für Dihydrofolatreduktase (dhfr), Chloramphenicolacetyltransferase (cat)-, ß-Lactamase (bla)-, den lac-Repressor (lacl)-, Neomycinphosphotransferase (neo)- und Interferon-γ (ΙΕΝ-γ) kodieren sind dargestellt durch

Figur-!

Aminosäuresequenz und die sie kodierende Nukleotidsequenz des reifen, rekombinanten, menschlichen Immuninterferons (rIFN-γ), dem die Cys-Tyr-Cys-SequenzamN-Terminus fehlt. DieHinfl-Schnittstelle, die zur Herstellung der, die rekombinanten Immun-Interferonfragmente codierenden, DNA-Fragmente benutzt wurde, ist unterstrichen. Das vom prokaryotischen Translationsstartsignal stammende Methionin ist eingeklammert.

Figur 2

Schematische Darstellung des Plasmids pDS8/RBSÜ, SphI.

Figur 3

Nukleotidsequenz des Xho/Xbal-Fragmentes des Plasmids pDS8/RBSü, SphI, das das regulierbare Pro-motor/Operator-Element P^S^o» ribosomale Bindungsstelle RBSII, SphI, das dhfr-Gen, den Terminator tQ, das cat-Gen und den Terminator TI enthält. Die in Figur 2 bezeichneten Restriktionsendonukleaseschnittstellen sind überstrichen und die Region, dieunter der Kontrolle von RBSII, SphI steht und für ein Dihydrofolatreduktasepolypeptid kodiert ist unterstrichen. Zusätzlich dazu ist die pBR322 Einheit von pDS8/RBSH, SphI schematisch dargestellt, wobei die angegebenen Zahlen sich auf die pBR322-Nukleotidsequenz beziehen (J. G. Sutcliffe, Cold Spring Harbor, Symp. Quant. Biol. 42,77-90 [1979]).

Figur 4

Schematische Darstellung des Plasmids pDMI,l.

Figur 5 DNA-Sequenz des Plasmids pDM,l. Die in der Figur 4 angegebenen Restriktionsendonukleaseschnittstellen sind überstrichen und die für die Neomycinphosphotransferase (neo) und den lac-Repressor (lacl) kodierenden Regionen sind unterstrichen.

Figur 6

Schematische Darstellung des Aufbaus und der Isolierung des Fragmentes 1, das das Gen für reifes, rekombinantes, menschliches Immun-Interferon (rIFN-γ) enthält, ausgehend von dem Plasmid pRC23/IFI-900, das das, für ein rekombinantes, menschliches Interferon von 146 Aminosäuren, mit Cys-Tyr-Cys- als N-terminale Sequenz, -5-

AT 393 690 B kodierende Gen enthält

Einbau des Fragmentes 1 in pDS8/RBSII, SphI und der daraus resultierende VektorpGLS. In der schematischen Zeichnung von pGLS wird mit (S c) die Stelle angedeutet, an der das Fragment 1 mit der Seal-Schnittstelle im Plasmid pDS8/RBSII, SphI verbunden ist

Figur 8

Schematische Darstellung des Aufbaus der EcoRI-HindDI-Fragmente F(-6), F(-8) und F(-ll), die für den C-Terminus von drei verschiedenen, rekombinanten Immun-Interferonfragmenten kodieren, unter Verwendung eines Hinfl-Fragments von pGLS und der Hinfl-Hindm-Adaptoren A(-6), A(-8) und A(-ll). Die EcoRI-Hindlll-Fragmente F(-7), F(-9) und F(-10) wurden in ähnlicher Weise unter Verwendung der Hinfl-Hindm-Adaptoren

A(-7) AGTC AG ATGCTGTTTTA A

GTCTACGACAAAATTTCGA

A(-9) AGTCAGATGTAA

GTCTACATTTCGA

A(-10) AGTCAGTAA

GTCATTTCGA aufgebaut Die zur Beendigung der Translation wichtigen Kodons in der Sequenz sind unterstrichen.

Figur 9

Schematische Darstellung des Einbaus der Fragmente F(-6), F(-8) und F(-ll) in die EcoRI- und Hindm Schnittstellen vonpDS8/RBSII,SphI, wodurch die Plasmide pIFN-7(-6),pIFN-'y(-8)undpIFN-7(-ll)entstehen. Die Fragmente F(-7), F(-9) und F(-10) wurden in ähnlicher Weise eingebaut wodurch die Plasmide ρΙΡΝ-·γ(-7), pIFN-γ(-9) undpIFN-^-lO) entstanden.

Figur 10

Aminosäuresequenzen der Genprodukte rIFN-γ, IFN-y(-6), IFN-t(-7), IFN-t(-8), ΙΡΝ-γ(-9), IFN-y(-10) undlFN-7(-11), die durch die Expression von pGLS, pIFN-T(-6), pIFN-T(-7), ρΙΕΝ-τ(-8), pIFN-7(-9), pIFN-7(-10) und ρΙΕΝΓ-γ(-11) erhalten wurden. (130aa) steht für die 130 Aminosäuren von Position 1 bis Position 130 (siehe Figur 1). SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophoretische Analyse des reifen, menschlichen Immun-Interferons und der menschlichen Interferonfragmente. Die Spuren (a), (b), (c) und (d) (Figur 1 la, Teil A) und die Spuren (1) bis (9) (Figur 1 lb) zeigenLysatevonE. coliM15-Zellen,diepDMI,l sowieeinenderuntenangegebenenExpressionsvektoren enthalten.

Exoressionsvektor Figurlla Figur 11b pGLS-γ a 1,9 pIFN-T(-4) - 2 pIFN-T<-5) - 3 pEFN-T(-6) b 4 pIFN-7(-8) c 5 pIFN-7(-9) - 6 pIFN-T(-10) - 7 p!FN-T(-ll) d 8

Die Spuren (a), (b), (c) und (d) (Figur 1 la, Teil B) und die Spuren (10) bis (17) und (20) (Figur 1 lb) zeigen die gereinigten Interferonpolypeptide, die aus den in den Spuren (a), (b), (c) und (d) (Figur 1 la, Teil A) und (1) bis (9) (Figur 1 lb) gezeigten Lysaten gereinigt wurden. Die durch limitierte Proteolyse hergestellten menschlichen Immun-Interferonfragmente IFN-7(-14) und IFN-y(-I8) sind auf den entsprechenden Bahnen (18) und (19) gezeigt MW (Figur 11a) und M (Figur 1 lb) stehen für ein Gemisch von Markerproteinen (BIO-RAD Laboratories), das aus Proteinen mit Molekulargewichten von 14,4 kd, 21 ,5 kd, 31 kd, 45 kd, 66,2 kd und 92,5 kd (1 kd = 1000 Dalton) besteht. -6-

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Figur 12

Antivirale Aktivität in Beziehung zur C-terminalen Sequenz von IFN-γ. Die C-terminale Sequenz ist in dem von DayhofF et aL, („Altas of Protein Sequence and Structure“, M. O. Dayhoff, ed., Vol. 5. P· 17, Natl. Biomed. Res. Found., Silver Spring, Maryland, U.S.A., [1979]) beschriebenen Ein-Buchstabenkode auf der Abszisse angegeben. Die antiviralen Aktivitäten der, auf der Abszisse durch die Anzahl der, im Vergleich zu reifem, rekombinantem, menschlichem Immun-Interferon (charakterisiert durch „O“), C-terminal abgespaltenen Aminosäuren charakterisierten, rekombinanten Immun-Interferonfragmente, sind auf der Ordinate dargestellt. Jeder Punkt steht für den geometrischen Mittelwert von wenigstens sechs voneinander unabhängigen Bestimmungen. Balken markieren die entsprechenden Grenzen bis zu 95%-iger Zuverlässigkeit der Meßwerte.

Figur 13

Vergleich der antiviralen Aktivität, der Aktivierung von Makrophagen und des Rezeptorbindungsvermögens bezüglich derC-terminalen Sequenz von IFN-y(Einzelheiten entnehme man der Legende zuFigur 12und dem Text). Die Werte der antiviralen Aktivität, der Aktivierung von Makrophagen und des Rezeptorbindungsvermögens der Immun-Interferonfragmente in Beziehung zu den entsprechenden Werten von reifem, rekombinantem Immuninterferon, die willkürlich mit 1 festgelegt wurden, sind logarithmisch aufgetragen. Der absolute Wat der Aktivierung von Makrophagen durch reifes, rekombinantes Immun-Interferon beträgt 5 x 10^ E/mg.

In einer gemäß der vorliegenden Erfindung bevorzugten Art und Weise können rekombinante Immun-Interferonfragmente durch Auswahl eines passenden Plasmids, das eine Kopie des vollständigen menschlichen Immun-Interferongens oder einer allelischen Variante davon enthält, hergestellt werden. Translationsstopcodons können dann, in der für den C-Terminus von Immun-Interferon kodierenden Region des Gens, durch gezielte Mutagenese („site directed mutagenesis“), wie sie von Smith et al. (in „Genetic Engineering“ 2,1-32 [1981], J. K. Setlow, A. Hollaender eds., Plenum Press, New York) beschrieben ist, oder durch Entfernen eines passenden Restriktionsfragmentes aus dieser Region und dessen Ersatz durch ein synthetisches Stück DNA, das für den gewünschten C-Terminus des rekombinanten Immun-Interferonffagments kodiert, eingeführt werden. Bei der letzteren Methode werden bevorzugt zwei verschiedene Restriktionsendonukleasen verwendet, um das Ausgangsplasmid zu schneiden, damit zwei verschiedene, aneinander haftende Enden entstehen. Die synthetische DNA mit den überlappenden Enden kann dann gleich in der richtigen Orientierung eingepaßt werden. In einem nächsten Schritt kann die für das rekombinante Immun-Interferonfragment kodierende DNS-Sequenz, in einen replizieibaren,mikrobiellenExpressionsvektor,der einenReplikationsursprung,einenPromotor odereinenPromotor-Operator und eine, für eine ribosomale Bindungsstelle (BBS) kodierende Sequenz enthält, eingesetzt werden. Geeignete replizierbare Expressionsvektoren findet man in Maniatis et al. (supra) oder in den Beispielen der vorliegenden Erfindung. Bevorzugt sind replizierbare Expressionsvektoren, die eine, ein rekombinantes Immun-Interferonfragment kodierende, Nukleotidsequenz enthalten, die funktionell mit einer Expressionskontrollsequenz verbunden ist. Beispiele solcher Expiessionsvektoren sind pIFN-y(-6), pBFN-y(-7), ρΠ*Ν-γ(-8), ρΙΡΝ-γ(-9), pIFN-γ(-10) undpIFN-y(-l 1), in denen die für die rekombinanten Immun-Interferonfragmente kodierende Sequenz in den Expressionsvektor pDS8/RBSII, SphI (Figur 2) integriert ist. Der Expressionsvektor pDS8/RBSII, SphI wurde in E. coli M15 (pDMI,l), einem E. coli Stamm (E. coli DZ291), eingeführt, der mit dem den lac-Repressor codierenden Plasmid pDMI,l (Figur 4) transformiert ist Der daraus hervorgehende E. coli-Stamm M15 (pDS8/RBSÜ, SphI; pDMI,l) wurde am 6. August 1986 bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen (DSM) mit der Hinterlegungsnummer DSM 3809 hinterlegt Die Methoden zum Aufbau der Expressionsvektoren, die für die rekombinanten Immun-Interferonfragmente IFN-t(-6), ΙΡΝ-γ(-7), ΙΡΝ-γ(-8), IFN-y(-9), IFN-7(-10) und ΙΡΝ-γ(-11) kodieren, sind in den Beispielen ausführlich beschrieben. Ausgehend von diesen Beispielen ist es einem Durchschnittsfachmann durchaus möglich, Expressionsvektoren zu konstruieren, die fähig sind, die erfindungsgemäßen rekombinanten Immun-Interferonfragmente zu exprimieren. Die zur Expression rekombinanter Immun-Interferonfragmente befähigten replizierbaren Expressionsvektoren werden dann mittels da in den Beispielen oda der bei Maniatis et al. (supra) beschriebenen, spezifischen Verfahren in passoide Wirtsorganismen transformiot In Abhängigkeit von da verwendeten Wirtszelle können die rekombinanten Immun-Interferonfragmente glykosyliert sein oda nicht Bevorzugte Wirtsorganismen sind E. coli (Stamm M15 oda W3110 [ATCC No. 27325], Bacillus subtilis und weitoe mehr. Da meist bevorzugte Wirtsorganismus dieser Erfindung ist da oben erwähnte E. coli Stamm M15.

Sobald der zur Expression der Polypeptide der vorliegenden Erfindung befähigte Organismus hergestellt ist, kann das erfindungsgemäße Verfahren auf vaschiedenste Art und Weise, in Abhängigkeit von der Konstruktionsweise der Expressionsvektoren und den Wachstumseigenschaften des Wirts, durchgeführt werden. Da Wirtsorganismus wird typischerweise unter Bedingungen gezüchtet, die zur Erzeugung einer großen Menge von Zellen vorteilhaft sind. Hat sich eine große Anzahl von Zellen angesammelt, können geeignete Induktoren oder Derepressoren im Wachstumsmedium oder ein Temperaturwechsel die mit einer solchen DNS-Sequenz ausgestat- -7-

AT 393 690 B tete Kontrollsequenz aktivieren, was zur Transkription und Translation der kodierenden Sequenz führt In der vorliegenden Erfindung ist die Expression des für das rekombinante Immun-Interferonfragment kodierenden Gras durch den lac-Repressor inhibiert Wenn sich eine große Anzahl von Zellen angesammelt hat wird das Interferongen durch Zugabe von Isopropyl-ß-D-thiogalactopyranosid (IPTG) aktiviert. Das von der rekombinanten Zelle herge-5 stellte Protein kann durch Aufschluß der Zelle durch konventionelle, dem Fachmann wohlbekannte Mittel, freigesetzt werden. Die bestimmten, zum Aufschluß der Zelle benützten Mittel, sind abhängig vom verwendeten Wirtszelltyp. In dervorliegendenErfindungwerdendieZellen bevorzugt mitGuanidin-Hydrochloridaufgeschlossen.

Die erfindungsgemäßen homogenen, rekombinanten Immun-Interferonfragmente können mit jeder bekannten Methode gereinigt werden, z. B. durch Fällung mit Ammoniumsulfat, durch Dialyse zum Entfernen von Salzen (bei 10 normalen Bedingungen oder unter Vakuum), durch präparative, flachbettisoelektrische Fokusierung, durch Gelelektrophorese, durch chromatographische Methoden wie HPLC, Ionenaustauschchromatographie, Umkehr-phasen-Chromatographie, Gelfiltration, Affinitätschromatographie und so weiter oder durch Verwendung monoklonaler oder polyklonaler Antikörper. Wie man auf Grund von SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese oder Analyse mittels HPLC schließen kann, sind die erhaltenen homogenen, rekombinanten Immun-Interferonfragmente 15 im wesentlichen frei von anderen Proteinen.

Die rekombinanten Immun-Interferonfragmente können Dimere, Trimere oder Tetramere bilden, d. h., daß die gereinigten, rekombinanten Immun-Interferonfragmente als Kombinationen von zwei, drei oder vier solcher Fragmente vorliegen können. Die Art und Weise der Verknüpfung ist unklar.

Antivirale Aktivitäten der rekombinanten Immun-Interferonfragmente ΙΡΝ-γ(-6), ΙΕΝ-γ(-7), ΙΡΝ-τ(-8), IFN-γ-20 (-9),ΙΡΝ-γ(-10),ΙΡΝ-γ(-11) wurden mittelseinesbiologischenNachweisverfahrens,basierendauf der Verminderung des cytopathischen Effektes, wie es Rubinstein et al. (J. Virol. 22, 755-758 [1981]) beschrieben ist, bestimmt Menschliche Amnionzellen (FL-Zellen) und Sindbisvirus als Challenge-Virus wurden verwendet. Die Proben wurden bis auf etwa 1000 Einheiten/ml verdünnt und in Duplikaten auf Mikrotiterplatten titriert Eine Präparation von reifem, rekombinantem Immun-Interferon voller Länge (Nr. 85.20 SX-Pool) wurde als Bezugsstandard 25 verwendet. Sie wurde auf den NIH Human Interferon Gamma Referenzstandard, Nr. Gg 23-901-530 bezogen. Der NIH-Standard hatte einen Titer von 3.68 ± 0.34 logjQ Einheiten/Ampulle (n = 39).

Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle 1 zusammengefaßt Jeder Wert steht für das Mittel aus wenigstens 13 unabhängigen Bestimmungen. Geometrische Mittelwerte der Titer wurden in einem t-Test statistisch evaluiert. Unterschiede in der antiviralen Aktivität zwischen dem reifen, rekombinanten Immun-Interferon und den 30 rekombinanten Immun-Interferonfragmenten sind äußerst signifikant (P = 99 %). Der Unterschied zwischen dem Titer von IFN-y(-6) und dem von IFN-y(-l 1) ist auch äußerst signifikant Die Weite von ΙΡΝ-γ(-6) und ΙΕΝ-γ(-8) unterscheidensich in signifikanter Weise (P=95 %).Dieantivirale Aktivität von ΙΡΝ-γ(-8) undIFN-y(-l 1) sindjedoch nicht signifikant verschieden. 35 40

Tabelle 1

Spezifische antivirale Aktivität 9.5.10° E/mg 4.1.107 E/mg 5.9.107 E/mg 7.0.107 E/mg

Reifes, rekombinantes Immun-Interferon (rIFN-γ)

Rekombinantes Immun-Interferonfragment ΙΡΝ-7(-6)

Rekombinantes Immun-Interferonfragment IFN-7(-8)

Rekombinantes Immun-Interferonfragment IFN-^-l 1)

Um die erhöhte antivirale Aktivität besser studieren zu können, wurden weitere rekombinante Immun- 45 Interferonfragmente hergestellt Entweder wie oben beschrieben, z. B. IFN-'y^) und ΙΡΝ-γ(-5), oder durch limitierte

Proteolyse von reifem, rekombinantem Interferon voller Länge. So wurde zum Beispiel IFN-y(-14) durch Verwendung der „Arg C“-Protease aus der Speicheldrüse der Maus, die Proteine spezifisch auf der Carboxy-Seite von Arginin spaltet (Schenkein et al., Arch. Biochem. Biophys. 182.64-70 [1977]) hergestellt, während ΙΡΝ-γ(-18) unter Verwendung des fibrinolytischen Enzyms Plasmin hergestellt wurde. 50 Die spezifische antivirale Aktivität dieser Polypeptide wurde, wie oben beschrieben, bestimmt. Tabelle 2 und

Figur 12 zeigen, daß die rekombinanten Immun-Interferonfragmente ΙΡΝ-γ(-8), IFN-y(-9), ΙΡΝ-γ(-10) und IFN-γ-(-11) eine bedeutend höhere spezifische antivirale Aktivität zeigen als reifes, rekombinantes Immun-Interferon oder die durch limitierte Proteolyse erzeugten Immun-Interferonfragmente IFN-y(-14) und ΙΡΝ-^-Ιδ). -8- 55

AT 393 690 B

Mdte2

Spezifische Antivirale Aktivität (E/mg) (in Klammem Grenzwerte mit 95 %-iger Zuverlässigkeit) rIFN-γ 1.91 x 107 (1.36 x 107 - 2.67 x 10¾ IFN-t(-4) 2.88 x 107 (2.19 x 107 - 3.80 x 10Λ IFN-t(-5) 4.79 x 107 (3.54 x 107 - 6.47 x 107) ΙΡΝ-γ(-6) 3.39 x 107 (2.46 x 107 - 4.66 x IO7) 1ΡΝ-τ(-8) 7.08 x 107 (5.06 x 107 - 9.91 x IO7) IFN-T(-9) 9.33 x 107 (6.60 x 107 -1.32 x 10°) IFN-'K-IO) 8.32 x 107 (6.72 x 107 -1.03 x 10°) IFN-tf-l 1) 6.31 x 107 (4.99 x 107 - 7.97 x 107)

Die Immun-Interferonfragmente ΙΡΝ-γ(-8), ΙΡΝ-7(-9), ΙΡΝ-γί-ΙΟ) und ΙΡΝ-γί-Ι1) zeigten eine deutlich höhere antiproliferative Wirkung und gesteigerte immunregulatorische Aktivitäten.

Die antiproliferative Aktivität kann durch Messung der inhibitorischen Wirkung der verschiedenen Immun-Interferone auf den Einbau von radioaktiv markiertem Thymidin in zelluläre DNS bestimmt werden. Drei maligne Zellinien (U 937, BS 14, LLC 1) und eine normale Fibroblastenzellinie (AG 1523, Passage-Nr. 6-10) wurden verwendet. U 937 ist eine myelomonocystische Leukämiezellinie, BS 14 stammt von einem Patienten mit einem malignen Melanom und LLC 1 von einem Patienten mit Lungenkrebs. Die Zellen wurden in Kulturschalen mit 96 Vertiefungen in RPMI1640 mit 10 % fötalem Kälberserum, 1 % L-Glutamin (200 mM), 1 % Penicillin (100 E/ml)-Streptomycin (100 jjg/ml), 1 % MEM nichtessentielle Aminosäuren (lOOx) und 1 % Natriumpyruvat (100 mM) bei unterschiedlichen Zelldichten gemäß ihren individuellen Wachstumskurven, ausplattiert: 20Ό00 Zellen/ml für U 937 und AG 1523 und l'OOO Zellen/ml für BS 14 und LLC 1. Den Zellen wurde 24 Stunden Zeit gegeben anzuhaften. Reifes, rekombinantes Immun-Interferon (rIFN-γ) und Immun-Interferonfragment IFN-^-lO) wurden dann in die Vertiefungen gegeben. Platten für negative Kontrollen wurden nur mit Medium behandelt, während für diepositiven Kontrollen Adriamycin in einer Konzentration von 10'^ bis 10'^ M verwendet wurde. Zwei Tage später wurde %-Thymidin bis zu einer Endkonzentration von 1 pCi/Vertiefung zugegeben. Nach weitmen 18 Stunden Inkubation wurden die Zellen geerntet und der Einbau von Thymidin, wie bei Carr et al. (Cell Immunol. £, 21-29 [1972]) beschrieben, bestimmt. Es wurde gefunden, daß eine 14-fach geringere Menge an Immun-Interferonfragment IFN-y(-10) benötigt wird, um die gleiche antiproliferative Wirkung auf AG 1523 Zellen zu erreichen, wie mit reifem, iekombinantem Immun-Interferon (rIFN-γ). Gleichfalls wurde gefunden, daß eine 5-fach, 3-fach und 6-fach geringere Menge an ΙΕΝ-γ(-10) nötig ist, um die gleiche antiproliferative Aktivität wie von rIFN-yaufU937, BS 14 und LLC l-Zellen zu erhalten.

Immun-Interferon ist dafür bekannt, daß es verschiedene immunregulatorische Wirkungen vermittelt. Es scheint einer dermakrophagenstimulierenden Faktoren (MAF) zu sein. Die Aktivierung von Makrophagen wurde auf zwei verschiedene Weisen gemessen. Normale menschliche Makrophagen, die gemäß Talmadge et al. (Eur. J. Immunol. 16.1471-1477 [1986]) isoliert worden waren, wurden durch die verschiedenen, in der vorliegenden Anmeldung beschriebenen Formen von Immun-Interferon aktiviert Oxidation wurde in Form von vermehrter Freisetzung von Peroxidase, wie bei Pick et al. (J. Immunol Methods 4& 211-226 [1981]) beschrieben, gemessen, während die Induktion der baktericiden Aktivität der Makrophagen, wiebeiPeck et al.(J. Immunol. Methods £2,131-140 [1985]) beschrieben, gemessen wurde. Weil Immun-Interferon seine immunregulatorische Wirkung durch seine Bindung an Membranrezeptoren ausübt, sind die immunregulatorischen Aktivitäten abhängig von der Bindung des Immuninterferons an seinen Rezeptor. Die kompetitive Bindung von radioaktiv markiertem, reifem, rekombinantem Immun-Interferon und rekombinanten Immun-Interferonfragmenten (Kung, et al., Meth. in Enzymology JJ2,296-301 [1986]) an den Interferonrezeptor wurde, so wie von Rashidbaigi et al. (J. Biol. Chem. 260.8514-8519 [1985]) beschrieben, gemessen. Die Ergebnisse der oben erwähnten Experimente sind in Figur 13 zusammengefaßt. Zusätzlich zu der deutlich höheren, antiviralen Aktivität der Immun-Interferonfragmente ΙΕΝ-^-δ), IFN-y(-9), IFN-γ(-10) und IFN-^-ll) zeigten diese Immun-Interferonfragmente auch eine deutlich gesteigerte Aktivierung von Makrophagen und ein gesteigertes Rezeptorbindungsvermögen.

Wenn die neuen, rekombinanten Immun-Interferonfragmente mehrere Tage bei Raumtemperatur aufbewahrt werden, erzeugt dies keine neuen Signale im HPLC-Diagramm, wie dies in dem Fall des reifen, rekombinanten Immun-Interferons voller Länge beobachtet wurde. Deshalb sind diese Fragmente zusätzlich zu ihrer höheren Aktivität auch stabiler.

Die erfindungsgemäßen, gereinigten, rekombinanten Immun-Interferonfragmente oder deren Mischungen -9-

AT 393 690 B können zur Herstellung von pharmazeutischen Zusammensetzungen verwendet werden. Diese pharmazeutischen Zusammensetzungen enthalten neben einem physiologisch verträglichen Trägermaterial eine deutlich geringere Menge besagten oder besagter Interferonfragmente(s) wie an rekombinantem, menschlichem Immun-Interferon benötigt wird, um die im wesentlichen selbe antivirale Aktivität zu erhalten. Diese verminderte Menge beruht auf der deutlich höheren spezifischen, antiviralen Aktivität (in Einheiten/mg), die die rekombinanten Immun* Interferonfragmente zeigen (siehe Tabelle 1). Für die bevorzugten, erfindungsgemäßen, rekombinanten Immun-Interferonfragmente wurden diese verminderten Mengen unter Verwendung der Werte der spezifischöl antiviralen Aktivitäten aus Tabelle 1 berechnet Die verminderten Mengen betragen etwa: 23 % für das rekombinante Immun-Interferonfragment ΙΡΝ-γ(-6), 16 % für das rekombinante Immun-Interferonfragment ΙΡΝ-γ(-8) und 15 % für das rekombinante Immun-Interferonfragment ΙΡΝ-γ(-11) der Menge von reifem, rekombinantem Immun-Interferon (als 100 % gesetzt), die benötigt wird um dieselbe spezifische, antivirale Aktivität zu erhalten. ÄhnlicheErgebnissekann man unter Verwendung der Daten aus Tabelle 2 erhalten.

Diepharmazeutischen Zusammensetzungenkönnen in jeder üblichenForm wie a) in einerfestenForm zur oralen Anwendung wie Tabletten, Kapseln, Pillen, Puder, Granula und ähnlichem; b) einer flüssigen Form zur oralen Anwendung, wie Lösungen, Syrup, Suspensionen, Elixire und ähnlichem; c) Präparaten zur parenteralen Anwendung, wie sterileLösungen, Suspensionen oder Emulsionen; und d) Präparaten zu lokaler Anwendung wie Lösungen, Suspensionen, Salben, Cremes, Öle, mikronisierte Puder, Aerosole und ähnlichem, hergestellt werden. Die pharmazeutischen Präparate können sterilisiert sein und/oder Hilfsmittel wie Konservierungsstoffe, Stabilisatoren, Feuchthalter, Emulgatoren, Salze für sich ändernde osmotische Drucke und/oder Puffer enthalten.

Parenterale Dosierungsformen können Infusionen oder injizierbaren Flüssigkeiten sein, die intravenös oder intramuskulös injizierbar sind. Diese Präparate können auch andere medizinisch wirksame Substanzen enthalten. Zusätzliche Additiva wie Konservierungsstoffe, Stabilisatoren, Emulgatoren, Puffer und ähnliches können in Übereinstimmung mit der gängigen Praxis zur Herstellung pharmazeutischer Zusammensetzungen dazugegeben werden.

In Übereinstimmung mitdieser Erfindung können pharmazeutische Zusammensetzungen, dieeinrekombinantes Immun-Interferonfragment enthalten, zur Behandlung viraler Infektionen, neoplastischer Krankheiten odö> rheumatischer Arthritis eingesetzt werden.

Es kann in zur oralen, injizierbaren oder lokalen Anwendung geeigneter Zusammensetzung und Darreichungsform appliziert werden. Dosierungsmenge und -häufigkeit können analog denjenigen sein, die bei der klinischen Anwendung der bekannten Interferone verwendet weiden; typischerweise lOr Einheiten pro Tag. Die erfindungsgemäßen pharmazeutischöl Zusammensetzungen enthalten besagte, rekombinante Immun-Interferonfragmente zusammen mit einem dazu passenden, pharmazeutisch akzeptablen Trägermaterial. Jedes übliche Trägermaterial kann verwendet werden. Das Tiägermatöial kann organischer oder anorganisch-inerter Natur sein, passend zu enteraler, percutaner oder parenteraler Anwendung. Passende Tiägermaterialien sind Wasser, Gelatine, Gummi arabicum,Lactose,Stärke,Magnesiumstearat,Talk,Speiseöle,Polyalkylenglykole, Vaselineundähnliches. Im weiteren können die pharmazeutischen Präparate andere pharmazeutisch aktive Mittel enthalten. Zusätzliche Additive wie Aromastoffe, Konservierungsmittel, Stabilisatoren, Emulgatoren, Puffer und ähnliches könnöi in Übereinstimmung mit der gängigen Praxis pharmazeutischer Zusammensetzungen hinzugefügt werden.

Nachdem die Erfindung bis dahin allgemein beschrieben worden ist, wird dieselbe besser verständlich werden durch die einzelnen Beispiele, die hier zum Zwecke der Veranschaulichung und nicht zur Begrenzung aufgeführt sind.

Beispiel 1 A. Grundsätzliches pDS8/RBSQ, SphI wurde zur Expression des reifen, rekombinanten, menschlichen Immun-Interferons und der erfindungsgemäßen rekombinanten Immun-Interferonfragmente ausgewählt. Für eine wirkungsvolle Expression enthält der oben genannte Vektor als Expressionskontrollsequenz das regulierbare Promotor/Operator-Efement pN25x/o (Stüber et al., EMBO J. 2» 3143-3148 [1984]) und die ribosomale Bindungsstelle RBSII, SphI. Diese ribosomale Bindungsstelle wurde von der ribosomalen Bindungsstelle, die unter der Kontrolle des T5 E. coli-Phagenpromoters Pqjs steht, abgeleitet und mittels DNA-Synthese hergestellt (R. Gentz, Doktorarbeit, Universität Heidelberg, BRD [1984]). Auf Grund der hohen Wirksamkeit dieser Expressionssignale ist der oben erwähnte Vektor in E. coli nur dann stabil, wenn das Promotor/Operator-Element durch Bindung des lac-Repressors an die -10-

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Operatoreinheit von Ρ^25χ/ο rohBKfrückt wird. Der lac-Repressor wird von dem lacI-Gen kodiert.P^25Xy0 wild nur dann wirksam unterdrückt, wenn eine ausreichende Menge an Repressormolekülen vorhanden ist Deshalb wurde das lacl^-Allel verwendet das einen mutierten Promotor enthält was zu einer gesteigerten Expression des Repressorgens führt Das lacI^-Allel ist im Plasmid pDMI,l (Fig. 4) enthalten. Dieses Plasmid trägt zusätzlich zum lacI-Gen das neo-Gen, wodurch Resistenz gegen Kanamycin als selektivem Mark»* vermittelt wird. Das Plasmid pDMI,l ist vereinbar mit dem Expressionsvektor pDS8/RBSn, Sphl. Die E. coli Zellen, die mit auf pDS8/RBSII, SphI basierenden Expressionsvektoren zu transformieren sind, müssen pDMI, 1 enüialten, damit das Vorhandensein des Expressionsvektors gewährleistet ist Die Induktion der Expression in diesem System läßt sich leicht durch Zugabe von IPTG bei der gewünschten Zelldichte zum Medium erreichen. B. Plasmid nDSR/RBSH. Sphl

Der zwischen den Schnittstellen der Restriktionsendonukleasen Xbal und Xhol liegende Teil von pDS8/RBSU, Sphl (Figur 2), der die zur Replikation der DNS und der Stabilisierung des Plasmids in der Zelle benötigte Region, einschließlich des ganzen Gens der ß-Laktamase, das die Ampicillinresistenz liefert enthält, stammt von dem Plasmid pBR322 (Bolivar et al., Gene 2> 95-113 [1977]; Sutcliffe, supra). Der übrige Teil des Plasmids trägt das regulierbare Promotor/Operator-ElementPj^25X/0 (Stüber etal.,supra) gefolgt von der ribosomalenBindungsstelle RBSII, Sphl, die Teil eines EcoRI/BamHI Fragmentes ist, von der für die Dihydrofolatreduktase der Maus-AT-3000-Zellinie kodierenden Region (Chang et al.. Nature275.617-624 [1978]; Masters et al.. Gene21.59-63 [1983]), von dem Terminator tQ des E. coli Phagen Lambda (Schwarz et al. Nature272.410-414 [1978]), von dem promotorfreien Gen für Chloramphenicol-AcetvltransfeiasefMarcolietaL.FEBSLetters 110.11-14 Γ1980Ί1 und von dem Terminator TI des E. coli rmB-Operons (Brosius et al., J. Mol. Biol. 148.107-127 [1981]). C. Plasmid pDMI.1

Das Plasmid pDMI,l (Figur 4) trägt das Neomycin-Phosphotransferasegen des Transposons Tn5 (Beck et al., Gene 1£, 327-336 [1982]), das die Kanamycinresistenz beisteuert und das lacI-Gen (Farabaugh, Nature 274. 765-769 [1978]) mit der Promotormutation 1^ (Calos, Nature 224,762-765 [1978]), das für den lac-Repressor kodiert. Im weiteren enthältpDMI,l eineRegion des Plasmids pACYC184 (Changetal., J. Bacteriol.134.1141-1156 [1978]) mit der zur Replikation und zur Stabilisierung in E. Coli benötigten Information.

Beispiel 2

Aufbau des Plasmids pGLS. das fiir IFN-v kodiert A. Grundsätzliches

Unter Verwendung chemisch synthetisierter Oligonukleotide wurde das IFN-yGen an die ribosomale Bindungsstelle RBSII, Sphl (Figur 6) angepaßt. Das für IFN-y-kodierende Fragment wurde isoliert und in pDS8/RBSH, Sphl eingebaut, wodurch das Plasmid pGLS (Figur 7) entstand. B. Synthese der synthetischen Oligonukleotidfiagmente. die das IFN-v-Gen an RBSü. Sphl anoassen.

Die synthetischen Oligonukleotidfragmente sind in Figur 6 abgebildet. Die Oligonukleotidfragmente selbst wurden gleichzeitigauf einer Multisynthesemaschine,wiesieinderEP-Al-l81491 beschrieben ist, unter Verwendung von porösem Glas mit einheitlicher PorengrÖße („controlled poreglass“ CPG) als Phasenmaterial synthetisiert (Kiefer et al., Immunol. Meth. 2.,69-83 [1985]; Sproat et al., Tetrahedr. Lett 2ά> 5771-5774 [1983]; Adams etal., J. Am. Chem. Soc. 105.661-663 [1983]). Die lyophilisierten Oligonukleotide wurden während 1 Stunde bei 40 °C in Wasser gelöst und auf eine DNA-Konzentration von 100 nmol/ml eingestellt. 150 pmol jedes Oligonukleotids wurden in Gegenwart von 1 μΐ r^P]-ATP (2 pmol, 5000 Ci/mmol) in 10 μΐ 50 mM Tris/HCL (pH 8,5), 10 mM MgC^ 10 Minuten bei 37 °C mit 1 Einheit (E) T4-Polynukleoddkinase (Gibco-BRL, Basel) behandelt. Alle Reaktionen wurden durch Zugabe von 1 μΐ 5mM ATP und anschließendes 7minütiges Erhitzen der Proben auf 65 °C beendet. C. Aufbau und Reinigung des IFN-v kodierenden Fragmentes 1 4 pg Plasmid pRC23/IFI-900(EP-A299 084) mit einer DNA-Konzentration von400pg/ml wurden mit 10E Ndel in von Gibco-BRL in Basel gelieferten BRL-Basispuffer (50 mM Tris/HCl (pH 8), 10 mM MgC^, 50 mM NaCl) während 1 Stunde bei 37 °C in einem Gesamtvolumen von 20 μΐ geschnitten. Nach der Spaltung wurde die DNA einmal phenolextrahiert, einmal mit Ether behandelt, mit Ethanol gefällt und der Niederschlag während 2 Minuten in einer Vakuumzentrifuge (Speed-vac) getrocknet. Der Niederschlag wurde in T4-Ligasepuffer (50 mM Tris/HCl (pH 7,8), 10 mM MgC^, 10 mM DTT, 500 μΜ ATP) aufgelöst 25 pmol der phosphorylierten, den Sphl-Ndel-Adapter (1) (Figur 6) enthaltende Oligonukleotide wurden in 1 x Ligasepuffer zugegeben und das Endvolumen auf -11-

AT 393 690 B 25 μΐ eingestellt. Verknüpfungsreaktionen wurden während 3 Stunden bei 22 °C unter Verwendung von 1 μΐ DNS-Ligase (1 Weiß-Einheit, Boehringer, Mannheim) durchgefühlt Die Verknüpfungsreaktion wurde durch 7minütiges Erhitzen der Probe auf 65 °C beendet Die DNA wurde mit Ethanol gefällt, wie oben beschrieben getrocknet, in 50 |d Ncol-Reaktionspuffer (50 mM Tris/HCl (pH 8), 10 mM MgC^, 50 mM NaQ, 50 mM KCl) suspendiert, 10 E Ncol (BRL-Gibco, Basel) zugegeben und das Gemisch während 1 Stunde bei 37 °C inkubiert. Das Restriktionsenzym wurde durch 7minütiges Erhitzen der Probe auf 65 °C inaktiviert. Nach einer Phenolextraktion wurde die DNA gefällt und wie oben beschrieben getrocknet Der Niederschlag wurde in 20 μΐ Klenow-Puffer (50 mM Tris/HCl (pH 7,2), 10 mM MgSO^ 100 μΜ DTT) aufgelöst, und dATP, dGTP, dCTP und dTTP wurden bis zu einer Endkonzentration von 100 μΜ zugegeben (gesamtes Reduktionsvolumen 30 μΐ). Klenow-Enzym (1 Einheit Boehringer Mannheim) wurde zugegeben und die Probe während 1 Stunde bei 22 °C inkubiert Die Reaktion wurde durch Zugabe von 2 μΐ 0,25 M EDTA beendet Die Mischung wurde einmal mit Phenol extrahiert, und die DNA wurde wie oben beschrieben gefällt und in Sphl-Reaktionspuffer (50 mM Tris/HCl (pH 7,5), 6 mM MgC^, 50 mM NaCl, 6 mM 2-Mercaptoethanol) wieder aufgenommen. Nach Zugabe von 10 E SphI (BRL-Gibco, Basel) wurde die Probe während 1 Stunde bei 37 °C inkubiert Die Spaltung wurde durch 7minütiges Erhitzen bei 65 °C beendet und nachfolgend eine Phenolextraktion durchgeführt Die DNA wurde gefällt und wie oben beschrieben getrocknet

Der DNA-Niederschlag wurde in 10 μΐ Gelelektrophoreseprobenpuffer aufgelöst, und die DNA-Fragmente wurden auf einem 6%-igen Polyacrylamidgel in 0.5 x Tris-Acetat-Puffer (40 mM Tris/HCl (pH 7,8) 20 mM Natriumacetat, 2 mM EDTA) elektrophoretisch aufgetrennt. Nach Färbung mitEthidiumbromid (0.5 μΐ/ml) wurden die Banden unter einem UV-Licht von 300 nm sichtbar gemacht Die Bande mit der für das IFN-y-Gen kodierenden DNA wurde mit einem Skalpell aus dem Gel herausgeschnitten. Als Maker-DNA wurde Haein (Gibco-BRL, Basel) geschnittene 0X Phagen-DNA verwendet Das Gelstück wurde in eine Vertiefung von 4 auf 4 mm eines 0,7%-igen Agarosegels enthaltend TBE-Puffer (90 mM Tris-Borat, 90 mM Borsäure, 3 mM EDTA, pH 8.3) übertragen. Die Vertiefung wurde mit flüssiger 0.7%-iger Agarose in 1 x TBE versiegelt, um ein gleichmäßiges, elektrisches Feld zu gewährleisten. Vor der Probe wurde ein Stück einer NA45-Membran (Schleicher und Schüll, Dassel, BRD) eingefügt und die DNA wurde während 5 Minuten bei 300 V mittels Elektrophorese auf die Membran übertragen. Der Membranstreifen mit der DNA wurde dann mit destilliertem Wasser gewaschen und in ein Eppendorfgefäß mit 250 μΐ 1.5 M Lithiumacetat 50 mM Tris/HCl (pH 8.0), 10 mM EDTA übertragen. Die DNS wurde während 20 Minuten bei 65 °C unter gelegentlichem Schütteln eluiert Der Membranstreifen wurde aus dem Gefäß entfernt und die Probe wurde einmal mit 200 μΐ Phenol, das mit 1 M Tris/HCl (pH 8,0) gesättigt ist, extrahiert Nach 10-minütiger Zentrifugation der Proben bei 12000 rpm in einer Mikrozentrifuge wurde der Überstand mit der DNA entnommen. Die DNA wurde auf Trockeneis während 10 Minuten durch Zugabe von 20 μΐ 5 M Lithiumacetat und 440 μΐ Isopropanol gefällt Die DNS wurde während 10 Minuten bei 12000 rpm in einer Mikrozentrifuge sedimentiert. Der Niederschlag wurde mit 80%-igem Ethanol gewaschen, im Vakuum getrocknet und in 10 μΐ Puffer (10 mM Tris/HCl (pH 7.6), 1 mM EDTA) aufgelöst.

D. Herstellung des Plasmids dDSS/RBSüI. SphI 2 pmol des Plasmids pDS8/RBSII, SphI (400 pg/ml) wurden mit 10 E SphI in Basispuffer bei 37 °C in einem Volumen von 50 μΐ während einer Stunde gespalten. 1 E Seal wurde zugegeben und die Spaltung für weitere 30 Minuten fortgesetzt Nach der Spaltung wurde die Probe einmal phenolextrahiert, mit Ether behandelt gefällt und wie oben beschrieben getrocknet. Der Niederschlag wurde in 20 μΐ Puffer (50 mM Tris/HCl, pH 8) enthaltend 1 Einheit Kalbsdarmphosphatase (CIP, Boehringer, Mannheim) aufgelöst und während einer Stunde bei 37 °C inkubiert Nach der Hitzeinaktivierung des Enzyms und dem Entfernen der Proteine (siehe oben) wurde die DNA mitEthanol gefällt Nach Resuspendierung der DNA wurde das Scal/Sphl-Fragment von pDS8/RBSH, das Teile des cat-Gens, den Terminator TI, den Replikationsursprung, das bla-Gen, den Promotor P^25x/0 ^ die ribosomale Bindungsstelle RBSII, SphI enthält durch Elektrophorese in in einem 1%-igen Agarosegel aufgetrennt und elektrophoretisch auf NA45-Membranen übertragen, Nachfolgende Elution, Ethanolfällung und Resuspendierung in 100 μΐ TE-Puffer wurde wie oben beschrieben ausgeführt Etwa 1 pmol des Vektorfragmentes wurde erhalten. E. Zusammenbau des nGLS-Plasmids 2 μΐ Vektorfragment wurden mit 2 μΐ Fragment 1 -DNA in Ligase-Puffer (siehe oben), enthaltend 1 μΐ DNS-Ligase (1 Weiß-Einheit Boehringer Mannheim), in einem Gesamtvolumen von 20 μΐ verknüpft. Verknüpfungen wurden während 3 Stunden bei 22 °C durchgeführt Eine Kontroll-Verknüpfung ohne Fragment 1-DNA wurde parallel dazu durchgeführt Die Verknüpfungsreaktionen wurden durch 7minütiges Erhitzen der Proben auf 65 °C beendet. Die zur Transformation verwendeten, aufnahmebereiten E. coli M15-Zellen wurden nach der Methode von Morrison (Methods Enzymol. öS, 326-331 [1979]) hergestellt Die Verknüpfungsmischungen wurden zu 200 μΐ aufgetauten, aufnahmebereiten E. coli M15-Zellen gegeben, die das pDMI,l-Plasmid enthalten. Die Proben wurden 30 Minuten -12-

AT 393 690 B lang auf Eis gelegt und nachfolgend während 2 Minuten bei 42 °C inkubiert. Nach Zugabe von 0.5 ml LB-Medium wurden die Proben während 90 Minuten bei 37 °C im Wasserbad gehalten. Die Zellen wurden dann während 30 Sekunden bei 12.000 ipm in einer Mikrozentrifuge zentrifugiert. Die Überstände wurden verworfen, und die Niederschläge wurden in 100 μΐ LB-Medium suspendiert und auf 100 pg/ml Ampicillin und 25 pg/ml Kanamycin enthaltenden LB-Agarplatten ausplattiert. Die Platten wurden Ober Nacht bei 37 °C inkubiert. Nach Transformation der Kontroll-Verkniipfung wurden keine Transformanten erhalten. Verknüpfung mit Fragment 1 ergab etwa 200 Transformanten. Einzelne Kolonien wurden mit einem Zahnstocher herausgepickt, in ein Röhrchen mit 10 ml LB-Medium, enthaltend 100 pg/ml Ampicillin und 25 pg/ml Kanamycin, übertragen und während 12 Stunden bei 37 °C unter starkem Schütteln wachsen gelassen. DieZellen wurden 10 Minuten bei8000rpm zentrifugiert. Plasmid-DNS wurde nach der Methode von Bimboim et al., (Nucleic Acid Res. 2,1513-1523, [1979]) extrahiert.

Die schließlich erhaltenen Niederschläge wurden in 200 μΐ TE-Puffer aufgelöst. 4 μΐ wurden mit SphI und Xbal gespalten, um das Fragment mit dem IFN-y-Gen und dem Terminator TI freizusetzen. Alle analysierten DNA-Proben besaßen das Fragment der erwarteten Größe von 1 kb. Diese Plasmide wurden pGLS genannt F. Seouenzanalvse des in pGLS Monierten IFN-v-Gens

Um zu bestätigen, daß die richtige IFN-y-Sequenz in pGLS eingebaut ist wurde die doppelsträngige, zirkuläre Plasmid-DNS mittels eines mit [y- P]-ATP endmarkierten Starters sequenziert. Der Starter enthält die Nukleotide von Position 199-218 von pDS8/RBSII, SphI und endet deshalb 6 Nukleotide vor dem ATG der Sphl-Schnittstelle. 15plderisoliertenDNS (0.3 pmol) wurden mitEthanol gefällt undeinmalmit80%-igemEthanolgewaschen.Nachdem der Niederschlag 2 Minuten in einer Vakuumzentrifuge getrocknet worden war, wurde der Niederschlag in 8 μΐ 1/4 TE-Puffer aufgelöst. Nach Zugabe von 2 pmol des mit [γ-^PJ-ATP endmarkierten Starters wurden die Probat 5 Minuten auf 95 °C erhitzt und dann 5 Minuten in ein Wasserbad von 42 °C gestellt Zur Sequenzierung der Fragmente wurde im wesentlichen die von Sänger et al. (Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 21,5463-5467 [1977]) beschriebene Dideoxykettenabbruchsmethode verwendet außer daß, da der Primer radioaktiv markiert war, nicht markierte Deoxyribonukleotidtriphosphate (dXTPs) zur Verlängerangsreaktion verwendet wurden.

Die Sequenzdaten bewiesen, daß das Immun-Interferongen richtig in das Plasmid pGLS eingebaut worden war.

Beispiel 3

Aufbau der Plasmide pIFN--yf-6\ pIFN-v(-T). pIFN-vf-8F pIFN-v(-9\ pIFN-vt-lOl und pIFN-yf-ll). A. Grundsätzliches

Chemisch synthetisierte Oligonukleotide mit Translationsstopcodons an den gewünschtst Positionen wurden mit der einzigen Hinfl-Erkennungsstelle des INF-y-Gens (Figur 8) verbunden, was schließlich die Fragmente F(-6), F(-7), F(-8), F(-9), F(-10) und F(-l 1) ergab. Diese Fragmente wurden in pDS8/RBSII, SphI eingebaut wobei sich die Plasmide pIFN-y(-6), pIFN-y(-7), pIFN-y(-8), pIFN-y(-9), pIFN-y(-10) und pIFN-y(-l 1) (Figur 9) ergaben. B. Herstellung der Fragmente F(-6). Ff-7). Ff-8). Ff-9). Ff-10) und Ff-11), 3 pmol pGLS-Plasmid wurden mit 15 E HinfI (Figur 8) in Basispuffer bei 37 °C in einem Volumen von 50 μΐ während 1 Stunde gespalten. Nach Spaltung wurde das Restriktionsenzym durch 7minütige Inkubation bei 65 °C inaktiviert die Probe phenolextrahiert, mit Ether behandelt gefällt und wie oben beschrieben getrocknet Der Niederschlag wurde in 50 μΐ Ligase-Puffer aufgelöst. Die Oligonukleotide einschließlich der Adapter A(-6), A(-7), A(-8),A(-9),A(-10) und A(-ll)wurden, wiein Beispiel 2B beschrieben,synthetisiert lOOpmolderphosphorylierten Adapter wurden, jeweils zu 10 μΐ HinfI gespaltenem pGLS-Plasmid gegeben. Nach Zugabe des Ligase-Puffers und 1 Einheit T4-DNA-Ligase wurden die Verknüpfungen in einem Gesamtvolumen von 25 μΐ während 12 Stunden bei 22 °C durchgeführt. Die Reaktionen wurden durch 7minütiges Erhitzen der Proben auf 65 °C beendet Nach der Fällung mit Ethanol wurden die DNA-Niederschläge in Basispuffer resuspendiert und mit 15 E EcoRI und 20 E Hindin während2Stundenbei37°C in einem Volumen von 50plgespalten.NachHitzeinaktivierung,Phenolextraktion, Behandlung mit Ether und Ethanolfällung, wurden die Proben in 10 μΐ Gelladepuffer aufgelöst und mittels Elektrophorese auf einem 6%-igen Polyacrylamidgel aufgetrennt Die DNA-Banden wurden unter einem UV-Licht von300nm sichtbar gemacht. Die, die IFN-y-Gene enthaltenden, Banden wurden aus dem Gel geschnitten und, wie oben beschrieben, auf eine NA45-Membran mittels Elektrophorese übertragen. Die verwendete Marker-DNS war Haein gespaltene 0X-Phagen-DNS. Die DNA-Stücke wurden wie beschrieben eluiert und F(-6), F(-7), F(-8), F(-9),F(-10) bzw. F(-ll) genannt C. Herstellung von Plasmid pDS8/RBSn. Sohl

Wie in Figur 9 ausgeführt, wurden 2 pmol pDS8/RBSH, Sphl-Plasmid mit 10 E EcoRI und 10 E Hindin während 1 Stunde in einem Gesamtvolumen von 50 μΐ bei 37 °C gespalten. Nach Hitzeinaktivierung des Enzyms und -13-

AT 393 690 B

Ethanolfallung wurde der DNA-Niederschlag in 10 μΐ Gelladepuffer aufgelöst Nach Elektrophorese in einem 1%-igen Agarosegel wurde das den tQ-Terminator, das cat-Gen, den Tl-Terminator, den Replikationsursprang, das bla-Gen und den PN25* /0-Promotor enthaltende Fragment aus dem Gel geschnitten und wie beschrieben eluiert Der schließlich erhaltene DNA-Niederschlag wurde in 50 μΐ Ligase-Puffer aufgelösL D. Aufbau der Plasmide pIFN--vf-6). pIFN-y-71. nlFN-vT-Hl ο!ΡΝ-·ν(-9>. nlFN-M'-lOl und pIFN-vf-ll). 10 μΐ des Vektorfragments und die Hälfte der Menge jedes gereinigten, in Beispiel 3B erhaltenen Fragmentes F(-6), F(-7), F(-8), F(-9), F(-10) und F(-l 1) wurden nebeneinander mittels 1 Einheit T4-Ligase in einem Volumen von 20 μΐ während 3 Stunden bei 22 °C verknüpft Eine Kontrollverknüpfung ohne Fragment-DNS wurde parallel dazu durchgeführt. Die Verknüpfungsreaktionen wurden durch 7minütiges Erhitzen der Proben auf 65 °C beendet

Transformationen wurden so wie bei Morrison (supra) beschrieben unter Verwendung von E. coli M15-Zellen, die das Plasmid pDMI,l enthalten, durchgeführt. Die Zellen wurden, wie oben beschrieb«!, auf LB-Agarplatten mit 100 μΐ/ml Ampicillin und 25 μΐ/ml Kanamycin ausplattiert Die Platten wurden über Nacht bei 37 °C inkubiert

Wieerwartet wurden in den Kontrollverknüpfungen keine Transformanten erhalten. Da, wodie Vektor-DNA mit den Fragmenten verknüpft war, wurden 500-1000 Kolonien erhalten. Einzelne Kolonien wurden mit einem Zahnstocher herausgepickt und wie beschrieben in 10 ml LB-Medium wachsen gelassen. Plasmid-DNA wurde gemäß der Methode von Bimboim et al., (supra) extrahiert Die schließlich erhaltenen Niederschläge wurden in 200μΐ TE-Puffer aufgelöst. 4 μΐ der gereinigten DNA wurde mit2E EcoRI und 2E Hindin gespalten. Alle getesteten Klone setzten ein Fragment der erwarteten Größe von 450 bp frei.

Die das Fragment F(-6) enthaltenden Plasmide wurden ρΠ?Ν-γ(-6) genannt, während die Plasmide die F(-7), F(-8), F(-9), F(-10) und F(-ll) enthalten als ρΙΡΝ-γ(-7), ρΙΡΝ-γ(-8), ρΙΡΝ-γ(-9), pIFN-7(-10) undpIFN-7(-ll) bezeichnet wurden. Diese Plasmide sind Expressionsvektoren für die Gene die die rekombinanten Immun-Interferonfragmente ΙΡΝ-γ(-6), IFN-t(-7), ΙΡΝ-γ(-8), IFN-y(-9), ΙΡΝ-γ(-10) und ΙΡΝ-γ(-11) kodieren (Figur 10).

Beispiel 4

Expression von IFN-v-Genen in E. coli A. Grundsätzliches

Um zu zeigen, daß die modifizierten IFN-y-Gene in E. coli in einer großen Zahl exprimiert werden, wurden sie in E. coli M15 (pDMI,l), die mit ρΙΡΝ-γ(-6), ρΙΡΝ-γ(-7), ρΙΡΝ-^-δ), pIFN-^), pIFN-^-lO) oder ρΙΡΝ-γ(-11) transformiert sind, exprimiert und die gesamten, zellulären Proteine durch SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese analysiert. B. Herstellung von IFN-v-Proteinen in E. coli

Die das Plasmid pDMI.l enthaltendenE. coli M15-Zellen wurden mit pIFN-y(-6), pIFN-y(-7), ρΙΡΝ-γ(-8), pIFN-7(-9), pIFN-T(-10) oder ρΙΡΝ-γ(-11) und parallel dazu mit pGLS als Kontrolle transformiert. Die Transformanten wurden in 100 pg/ml Ampicillin und 25 pg/μΐ Kanamycin haltigem LB-Medium aufgezogen. Bei ein« optischen Dichte von etwa 0.7 bei 600 nm wurden die Kulturen mit IPTG (Endkonzentration 1 mM) induziert. Nach zusätzlichen 6 Stunden Inkubation wurden die Zellen durch Zentrifugation geerntet. C. Sichtbarmachung der in E. coli hergestellten Proteine

Zellen von 40 μΐ Kultur wurden in 3 % SDS, 3 % ß-Mercaptoethanol, 20 % Glycerin und 125 mM Tris/HCl (pH 6.8) enthaltendem Probenpuffer resuspendiert. Die Proben wurden 5 Minuten gekocht, auf Eis abgekühlt, 30 Sekunden bei 12000 x g zentrifugiert und gemäß dem vonLaemmli (Nature227.680-685, [1979]) beschriebenen Verfahren mittels eines SDS-Polyacrylamidgels (12.5 % Acrylamid, Verhältnis Acrylamid zu Bisacrylamid 30/0.8) aufgetrennt. Nach Färben der Proteine mitCoomassieBrilliant-BlauR-250 wurde der nichtgebundene Farbstoff vom Gel entfernt. Das Gel zeigte, daß die rekombinanten Immun-Interferonfragmente ΙΡΝ-γ(-6), IFN-·^), ΙΡΝ-τ(-8), IEN-Y(-9), IFN-rt-10) und IEN-tf-l 1) in E. coli in größerer Menge als das rekombinante, reife Immun-Interferon hergestellt werden, obwohl alle Proteine unter der Kontrolle der gleichen Expressionskontrollsequenz stehen.

Beispiel 5

Reinigung der rekombinanten Immun-Interferonfragmente

Alle rekombinanten Immun-Interferonfragmente wurden bis zur Homogenität nach der folgenden Methode gereinigt. RekombinanteE. coli-Zellen, dieeinenExpressionsvektor für ein rekombinantes Immun-Interferonfragment enthalten, wurden, wie oben beschrieben, gezüchtet Nach Induktion mit IPTG und zusätzlicher 6stündiger -14-

AT 393 690 B

Inkubation wurden die Zellen zentrifugiert (4000x g, 10 Minuten,4 °C). DerÜberstand wurde verworfen. DieZellen (100 g) wurden mit 7 M Guanidin-Hydrochlorid in 0.01 M Natriumboratpufferbei pH 8.0 (300 ml) aufgeschlossen. Die so erhaltene Suspension wurde 1 Stunde bei 4 °C gerührt Das gelöste, rekombinante Immun-Interferonfragment wurde von unlöslichen Partikeln durch Zentrifugation (10000 x g, 30 Minuten, 4 °C) abgetrennt. Der Überstand 5 wurde mit dem 10-fachen Volumen 0.15 M Natriumborat (pH 8.0) verdünnt und die restlichen Partikel durch Zentrifugation wie zuvor sedimentiert360g Silicagel 100 (Teilchengröße0.063-0.200mm) wurden zum Rohextrakt gegeben. Die Suspension wurde sorgfältig gerührt, um eine Sedimentation zu vermeiden. Nach einer Stunde wurde das Rühren beendet Nach Absetzen des Sediments wurde der Überstand verworfen und das Sediment in eine Säule übertragen. (Durchmess»: 5 cm, Länge 17.5 cm). Das Silicagel in der Säule wurde mit 1 M NaG in 0.01 M 10 Natriumborat (pH 8.0) gewaschen (Durchflußrate 6 ml/min). Das rekombinante Immun-Interferonffagment wurde mit 0.5 M Tetramethylammoniumchlorid und 0.7 M Ammoniumsulfat in 0.01 M Natriumboratpuffer (pH 8.0) (Durchflußrate: 6 ml/min) eluiert Das Eluat wurde sofort auf eine Phenyl-Sepharosesäule mit speziell hoher Durchflußrate (Durchmesser 5 cm, Länge 21 cm, Pharmacia, Prototypgel KK33904), die mit 0.5 M Tetramethylammoniumchlorid und 0.7 M Ammoniumsulfat in 0.01 M Natriumboratpuffer (pH 8.0) (Durchflußrate 15 6 ml/min) äquilibriert worden war, aufgetragen. Das rekombinante Immun-Interferonfragment befand sich im Eluat, während Proteasen von der Matrix gebunden werden. Die Säule wurde durch Waschen der Mattix mit 0.01 M Natriumboratpuffer (pH 8.0) wieder erneuert In einem nächsten Schritt wurde das von der Phenyl-Sepharosesäule ehiierte,rekombinanteImmun-Interferonfragmentaneinemit0.7MAmmoniumsulfatin0.01MNatriumboratpuffer (pH 8.0) äquilibrierte Phenyl-Sepharose CL-4B-Säule (Durchmesser 5 cm, Länge 21 cm,Pharmacia) adsorbiert Die 20 Säule wurde ausführlich gewaschen und das rekombinante Immun-Interferonfragment mit einem 4-stündigen, linearen Gradienten gegen 0.01 M Natriumboratpuffer (pH 8.0) eluiert Das Eluat wurde mit dem vierfachen Volumen Wasser verdünnt und auf eine, mit pyrogenfreiem 0.05 M Natriumphosphatpuffer (pH 6.0) äquilibrierte Fractogel TSK CM-650 (M)-Säule (Durchmesser 2.6 cm, Länge 18 cm, Merck) aufgetragen (Durchflußrate 4 ml/ min.) Das rekombinante Immun-Interferonfragment wurde mittels eines linearen NaCl-Gradienten von 0-0.6 M 25 NaG eluiert. Im letzten Reinigungsschritt wurde die das rekombinante Immun-Interferonfragment enthaltende Fraktion auf eine mit 0.05 M Natriumphosphatpuffer (pH 7.5) (pyrogenfrei) äquilibrierte Sephadex G-50 Superfein-Säule: (Durchmesser 5 cm, Länge 85 cm, Pharmacia) aufgetragen. Die Durchflußrate wurde auf 2 ml pro Minute eingestellt

Die so gereinigten Immun-Interferonfragmente waren gemäß analytischer RP-18 HPLC und SDS-30 Polyacrylamidgelelektrophorese homogen. Zur C-terminalen Aminosäureanalyse wurden die gereinigten Proteine mit Staphylococcus aureus V8-Protease gespalten. Die C-terminalen Peptide wurden mittels RP-18 HPLC isoliert, lyophilisiert in HCl hydrolysiert und einer Aminosäureanalyse unterzogen. Die »warteten Aminosäuren wurden im Hydrolysat gefunden.

Es stellte sich heraus, daß die rekombinanten Immun-Interferonfragmente nach steriler Filtration mehrere Mo-35 nate bei 4 °C Lagerung stabil sind. 40 45 50 -15- 55

Claims

AT 393 690 B PATENTANSPRÜCHE 1. Homogenes, rekombinantes Immun-Interferonfragment, dem im Vergleich zum reifen, rekombinanten, menschlichen Immun-Interferon voller Länge Aminosäuren am C-Terminus fehlen, dadurch gekennzeichnet, daß ihm 6 bis 11 Aminosäuren fehlen.
2. Homogenes, rekombinantes Immun-Interferonfragment nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es die Aminosäuresequenz X-Y-Asp-Pro-Tyr-Val-Lys-Glu-Ala-Glu-Asn-Leu-Lys-Lys-Tyr-Phe- Asn-Ala-Gly-His-Ser-Asp-Val-Ala-Asp-Asn-Gly-Thr-Leu-Phe-Leu- Gly-Ile-Leu-Lys-Asn-Trp-Lys-Glu-Glu-Ser-Asp-Arg-Lys-Ile-Met- Gln-Ser-Gln-Ile-Val-Ser-Phe-Tyr-Phe-Lys-Leu-Phe-Lys-Asn-Phe- Lys-Asp-Asp-Gln-Ser-Ile-Gln-Lys-Ser-Val-Glu-Thr-Ile-Lys-Glu- Asp-Met-Asn-Val-Lys-Phe-Phe-Asn-Ser-Asn-Lys-Lys-Lys-Arg-Asp- Asp-Phe-Glu*Lys-Leu-Thr-Asn-Tyr-Ser-Val-Thr-Asp-Leu-Asn-Val- Gln-Arg-Lys-Ala-Ile-His-Glu-Leu-Ile-Gln-Val-Met-Ala-Glu-Leu- Ser-Pro-Ala-Ala-Lys-Thr-Gly-Lys-Arg-Lys-Arg-Z aufweist, worin entweder X für Methionin und Y für Glutamin oder X für Wasserstoff und Y für Glutamin oder Pyroglutaminsäure und Z für Ser, Ser-Gln, Ser-Gln-Met, Ser-Gln-Met-Leu, Ser-Gln-Met-Leu-Phe oder Ser-Gln-Met-Leu-Phe-Arg steht.
3. Homogenes, rekombinantes Immun-Interferonfragment nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß es in Form eines Dimeren, Trimeren oder Tetrameren vorliegt.
4. Replizierbarer, mikrobieller Expressionsvektor, dadurch gekennzeichnet, daß er eine Nukleotidsequenz enthält, die für ein rekombinantes Immun-Interferonfragment nach einem der Ansprüche 1 bis 3 codiert und daß die Nukleotidsequenz operativ mit einer Expressions-Kontrollsequenz verbunden ist.
5. Replizierbarer, mikrobieller Expressionsvektor nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß er ein Plasmid aus der Gruppe ρΙΕΝ-γ(-6), ρΙΕΝ-^-δ) und ρΙΕΝ-γ(11) ist
6. Replizierbarer, mikrobieller Expressionsvektor nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß er ein Plasmid aus der Gruppe pIFN-y(-7), pIFN-y(-9) und pIFN-y(-10) ist
7. Mikroorganismus, dadurch gekennzeichnet, daß er mit einem replizierbaren, mikrobiellen Expressionsvektor gemäß einem der Ansprüche 4 bis 6 transformiert ist und daß er zur Expression eines rekombinanten Immun-Interferonfragmentes gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3 befähigt ist.
8. Verfahren zur Herstellung eines rekombinanten Immun-Interferonfragmentes gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Kultur eines Mikroorganismus, der mit einem replizierbaren, zur Expression des besagten Interferonfragmentes befähigten Expressionsvektors transformiert ist, hochwachsen läßt, das besagte Interferonfragment exprimiert und isoliert. -16- AT393690B
9. Verfahren zur Herstellung eines Mikroorganismus gemäß Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß ein Mikroorganismus mit einem replizierbaren, mikrobiellen Expressionsvektor gemäß einem der Ansprüche 4 bis 6 transformiert wird.
10. Pharmazeutische Zusammensetzungen, dadurch gekennzeichnet, daß sie eine oder mehrere rekombinante Interferonfragmente gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3 und ein physiologisch verträgliches Trägermaterial enthalten.
11. Pharmazeutische Zusammensetzungen gemäß Anspruch 10 zur parenteralen Applikation.
12. Pharmazeutische Zusammensetzungen gemäß Anspruch 10 zur topischen Applikation.
13. Pharmazeutische Zusammensetzungen gemäß Anspruch 10 zur intranasalen Applikation.
14. Verwendung eines rekombinanten Immun-Interferonfragmentes gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, oder einer pharmazeutischen Zusammensetzung gemäß Anspruch 10 zur Behandlung viraler Infektionen.
15. Verwendung eines rekombinanten Immun-Interferonfragmentes gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3 oder einer pharmazeutischen Zusammensetzung gemäß Anspruch 10 zur Behandlung neoplastischer Erkrankungen.
16. Verwendung eines rekombinanten Immun-Interferonfragmentes gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3 oder einer pharmazeutischen Zusammensetzung gemäß Anspruch 10 zur Behandlung rheumatischer Arthritis. Hiezu 16 Blatt Zeichnungen -17-