DD159782A5 - Verfahren zur herstellung eines eine immunologische oder biologische aktivitaet von humanleukozyten-interferon aufweisendes polypeptids - Google Patents

Abstract

DNA-Sequenzen, Rekombinat-DNA-Molekuele und mit ihnen transformierte Wirte, die Polypeptide erzeugen, die eine biologische oder immunologische Aktivitaet wie Human-Interferon zeigen, die fuer diese Polypeptide kodierenden Gene und Methoden zur Herstellung und Verwendung dieser Molekuele, Wirte, Gene und Polypeptide. Die DNA-Sequenzen sind dadurch gekennzeichnet, dass sie fuer ein biologische oder immunologische Aktivitaet von Human-Interferon aufweisendes Polypeptid kodieren. In entsprechenden Wirten ermoeglichen diese DNA-Sequenzen und Rekombinat-DNA-Molekuele die Erzeugung und Identifikation von Genen und Polypeptiden, die eine biologische oder immunologische Aktivitaet von Human-Interferon aufweisen, und ihre Verwendung in Mittel gegen Viren, Tumore und Krebs.

Description

14 326 56

6884

Anwendungsgebiet

Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Herstellung eines eine immunologische oder biologische Aktivität von Humanleukozyten-Interferon aufweisenden Polypeptide, das ein nützliches Mittel gegen Viren, Tumore und Krebs ist*

jCTiarakteristik^ der bekannten technischen^ Lösungenr In der vorliegenden Anmeldung wird die in Hatura, 286, S, 2421 (10. Juli 1980) veröffentlichte Interferon-Nomenklatur verwendet· Diese Nomenklatur ersetzt die in den früheren Anmeldungen, gegenüber denen die vorliegende Anmeldung Priorität hat, angewandte. Zum Beispiel wird IP jetzt als IM und Leukozyten-Interferon jetzt als IM-jObezeichnet. .

Bekanntlich gibt es zwei Klassen von Interferones ("IM")· Interferone der Klasse I sind kleine säurebeständige. (Glyco)-Proteine, durch die.Zellen gegenüber Virusinfektionen resistent werden (A. Isaacs und J. Lindenmann, "Virus Interference Ι· The Interferon" (Viren-Interferenz I. Das Interferon) PrO₁C^₁₁ Royal, Soc_i?i ,Ser»B>, 147, S. 258-267· (1957) und W.E. Stev/art, II. The Interferon System, Springer-Verlag (1979) (anschließend J' System"). Obwohl sie bis zu einem ge-

226884 8 ,-*-

ö

wissen.Grade zellspezifisch sind (The Interferon System, S.

125 - 145) sind Ii¹Ne nicht virusspezifisch. Stattdessen schützen IFNe Zellen gegenüber einem breiten Spektrum von Viren.

Human-Interferone ("HuIFlT") sind in drei Gruppen & ,/? und γ eingeteilt worden. HuIFH- ti oder Leukozyten-Interferon wird in Leukozytenzellen des Menschen und zusammen mit geringfügigen Mengen von HuIFlT-/? (Fibroblast-Interferon) in Lymphoblastoidzellen erzeugt. HuIFN-'tx. ist bis zur Homogenität gereinigt und charakterisiert worden (z. B. M. Rubenstein, u.a., "Human Leukocyte Interferon: Production, Purification To Homogeneity And Initial Characterization" (Humanleukozyten-Interferon: Herstellung, Reinigung bis zur Homogenität und anfängliche Charakterisierung), Proc. Hatl. Acad. Sei. USA, 76, · S. 640 - 644 (1979)).

In bezug auf die Größe ist es heterogen, was vermutlich auf die Kohlenhydratkomponente zurückzuführen ist. Es sind zwei Komponenten beschrieben worden, eine mit einer relativen Molekülmasse von 21 000 bis 22 000 und die andere von 15 000 bis 18 000. Von der Komponente mit der geringeren .relativen Molekülmasse ist berichtet worden, daß sie eine nichtglycosylierte Form darstellt. Von der kleineren Form von HuIFN-(Vi ist auch berichtet worden, daß sie den größten Teil oder ihre gesamte HuIFN- ^-Aktivität beibehält (W. E. Stewart, II u.a., "Effect Of Glycosylation'Inhibitors On The Production And Properties Of Human Leukocyte Interferon" (Einfluß von GIycosylierungs-Inhibitoren auf die Erzeugung und die Eigenschaften von Humanleukozyten-Interferon),' Virology, 97, S. 473 476 (1979)). Ein Teil der Aminosäuresequenz von HuIFIT-^ von Lymphoblastoidzellen und ihre Aminosäurezusammensetzung sind beschrieben worden' (K.C. Zoon, u,a.., "Amino Terminal Seauenee

226 884 8.-3- '

Of The.Major Component Of Human Lymphoblastoid Interferon" (Aminoterminalsequenz der. Hauptkomponente von Humanlymphoblastoid-Interferon), Science, 2O7, S.. 527 - 528 (I98O) und Μ», Hunkapiller und L. Hood, persönliche Veröffentlichung

Es wurde auch behauptet, daß HuIFI?-oi in mehreren verschiedenen Formen existiert, z. B. Britische Patentanmeldung 2.O357.296A, Diese Formen scheinen sich strukturell und physiologisch von einander zu unterscheiden. Für diese Formen von HuIFW-M ist keine anerkannte Nomenklatur festgelegt worden. Daher wird in der vorliegenden Anmeldung jede Form durch eine Zahl nach der allgemeinen HuIFE- K. -Bezeichnung gekennzeichnet, d. h. HuIFlT- n 1 oder HuIFN- u. $. -

HuIFN- oc kann wie viele Humanproteine polymorph sein. Daher können Zellen von bestimmten Individuen HuIPTT--^-Spezies innerhalb der allgemeineren HuIFTT- u -Gruppe oder Formen innerhalb dieser Gruppe bilden, die physiologisch ähnlich, strukturell aber etwas anders als die Gruppe oder Form' sind, von der sie ein Teil sind. Es können daher, obwohl die Protein-'struktur eines HuIFTT- ^ im allgemeinen gut definiert sein kann bestimmte Individuen ein HuIFW- ^ erzeugen, das. eine leichte Abwandlung"davon ist, wobei diese allelische Variation wahrscheinlich weniger stark ausgeprägt ist als die Differenz zwischen den verschiedenen Formen von HuIFTT-#.

HuIFTT ist gewöhnlich in normalen oder gesunden Zellen nicht nachweisbar (The Interferon System, S. 55 <- 57), Stattdessen wird das Protein infolge der Einwirkung eines IFTT-Induk tors auf die Zelle erzeugt. IFTT-Induktoren sind im allgemeinen Viren, können aber auch Nicht-Virus-Verhalten zeigen, wie natürliche oder synthetische doppelstränsiR-e RITA,

2 2688

Mikroben, mikrobiologische Produkte und verschiedene chemische Mittel. Zahlreiche Versuche sind unternommen worden, um Vorteile aus diesen Ivicht-Viren-Induktoren in der Weise zu ziehen, daß Humanzellen dadurch gegen VirusInfektionen resistent werden (S. Baron und F. Dianzani (Herausg.), Texas Reports On Biolog;? And Medicine, 35 ("Texas Reports"), S. 528 540 (1977)). Diese Versuche waren nicht sehr erfolgreich. Dafür wird jetzt die Verwendung von exogenem HuIFH selbst bevorzugt.

Die Interferontherapie gegen Virus-, Tumor- und Krebserkrankungen ist mit unterschiedlichen Dosismengen und unter verschiedenen Arten der Verabreichung durchgeführt,worden (The Interferon System, S. 3Ο5 - 32I }. Zum Beispiel wurde Interferon wirksam oral durch Inokulation — intravenös, intramuskulär, intranasal, intradermal und subkutan — und in Form von Augentropfen, Salben und Sprays verabreicht. Es wird ge-

h η

wohnlich ein- bis dreimal täglich in Mengen von 10 bis 10' Einheiten verabreicht. Der. Umfang der Therapie ist vom Fatienten und dem behandelten Zustand abhängig. Zum Beispiel werden Virusinfektionen normalerweise durch tägliche Dosen oder zweimal täglich verabreichte Dosen über einen Zeitraum von mehreren Tagen bis zu zwei Wochen behandelt, und Tumore und Krebs v/erden gewöhnlich durch tägliche oder mehrfache tägliche Dosen über mehrere Monate oder Jahre behandelt. Die wirksamste Therapie muß selbstverständlich für einen bestimmten Patienten von dem behandelnden Arzt bestimmt werden, der so gut bekannte Fak~ toren wie Verlauf der "Erkrankung,.vorhergehende Therapie und die Reaktion des Patienten auf Interferon bei der Wahl einer Verabreichungsart und der Dosismenge berücksichtigen wird.

Als Antivirusmittel wurde HuIFN zur Behandlung folgender

226884

Erkrankungen verwendet: Infektionen der Atemwege (Texas Reports, -S. 486 - 496), Herpes simplex Keratitis (Texas Reports, S. 497 - 5°0), akuter hämorrhagischer Konjunktivitis (Texas Reports, S. 501 - 510),"Virazellen-Zoster (Texas Reports, S. 5II - 515)» Zytomegalovirus-Infektion (Texas Reports, S.5I6 - 522) und Hepatitis B (Texas Reports, S. 516 - 522). Siehe auch The Interferon Sfrstem, S. 3O7 - 319. Die Verwendung von IFTT in größerem Umfang als Antivirusmittel macht jedoch größere Mengen von IS¹N erforderlich ,als bisher zur Verfügung standen.

HuIPIT hat neben seiner Antivirus-Wirkung noch andere Wirkungen. Beispielsweise wirkt es dem Koloniestimulierungsfaktor entgegen, inhibiert das Wachstum von hämopoitischen Koloniebildungszellen und stört die normale Differenzierung von Granulocyt- und Makrophagen-Vorläufern (Texas Reports, S. 3^3 - JH9). Es inhibiert auch Erythroid-Differentiation in DMSO-behandelten Friend-Leukämlezellen (Texas- Reports, S. 420 - 428). HuI??, kann auch eine Rolle bei der Regulierung der Immunreaktion spielen. Je nach der Menge und der Verabreichuhgszeit hinsichtlich des Antigens kann HuIFN-^ immunopotenzierend und immuno-.; " suppressiv in vivo und in vitro sein (Texas Reports, S. 357 369)· Außerdem konnte beobachtet werden, daß speziell sensibilisierte Lyraphozyten HuIFTT-oc nach Kontakt mit Antigen erzeugen Ein solches antigen-induziertes HuIFT?-^. könnte daher ein Regulator für die Immunreaktion sein und die zirkulierenden Antiger spiegel und die Expression von Zellimmunität beeinflussen (Texas Reports, S. 37O - 374). Es ist auch bekannt, daß HuIFH die Aktivität von Killerlymphozyten und die von Antikörpern abhängige, zell-mittelbare Zytotoxizität verstärken kann. (R. R. Herberman, u. a., "Augmentation By Interferon Of Human Natural und Antibody. Dependent Cell-Mediated. Cytotoxicity" (Durch Inter

zell-mittelbare Zytotoxizität bei Menschen), TTature_t 277, S. 221 - 223 (1979);-P. Beverley und D. Knight, "Killing Comes Naturally" (Töten komffit natürlich), Fature, 278, S. -120 (1979); Texas Reports, S. 375 - 380). Wahrscheinlich sind beide Spezies' an dem immunologischen Angriff auf Tumorzellen beteiligt. '

Außer seiner Verwendung als Antivirusmittel bei Menschen findet HuIFN daher auch potentielle Verwendung in der Antitumorund Antikrebstherapie (The Interferon System, S. - 321). Es ist jetzt bekannt, daß IFHe das Wachstum vieler Klassen von Tumoren bei vielen Tieren beeinträchtigen (The Interferon System, S. 292 - 304). Sie scheinen wie auch andere Antitumormittel am wirksamsten zu sein, wenn sie gegen kleine Tumore angewandt werden. Die Antitumorwirkungen von Tier-IFN sind von der Dosierung und der Zeit abhängig, sie wurden aber bei unter toxischen Mengen liegenden Konzentrationen demonstriert. Daher waren zahlreiche Untersuchungen und klinische. Versuche auf die Antitumor- und Ant-ikrebseigenschaften von IFITen gerichtet und werden in dieser Richtung fortgesetzt. Dazu gehört die Behandlung verschiedener bösartiger Erkrankungen wie Osteosarkom, akute Myeloidleukämie, multiples Myeolom und Hodgkinsche Krankheit (Texas Reports, S. 429 - 435). Außerdem wurde kürzlich nachgewiesen, daß HuIFF ,lokale Tumorregression verursacht, wenn es.in subkutane Tumorknoten bei an Melanom- und Brustkarzinom erkrankten Patienten injiziert wird (T. Nemoto, u.a., "Human Interferone And Intra-Iesional Therapy of Melanoma and Breast Carcinoma" (Hiimaninterferone und Intralesional-Therapie'von Melanom- und Brustkarzinom), Amer. Assoc. For Cancer Research, Abs. Ur. 994, S. 246 (1979)). Wenn auch die Ergebnisse dieser klinischen Versucherecht

ermutigend sind, wurde die'Anwendung von IFM gegen Tumor θ und Krebs durch den Mangel an einer ausreichenden Bereitstellung von gereinigten! IFiI stark behindert.

"Heute wird HuIFiF-^ entweder von in Gewebekultur gezüchteten menschlichen Zellen oder durch von Blutspendern gesammelten HumanIeukozyten erzeugt. 2,6 χ 1θ" IU rohes HuIFH-^ sollen aus 800 1 gezüchteten Namalva-Zellen gewonnen worden sein (P.J. Bridgen, u.a., supra). In sehr großen Blutzentren,

z. B» dem Finnischen Hot-Kreuz-Zentrum in Helsinki, Finnland,

11

beträgt die !Produktionskapazität etwa 10 IU rohes HuIFF- _x jährlich. Da die Dosis praktisch 3.x 10 ¹^ je Patient und Tag beträgt, sind diese Quellen nicht ausreichend, um die praktisch benötigten Mengen von HuIFN-&: zur Verfugung zu stellen. Daher ist die Herstellung von HuIFTT- vt mit Hilfe anderer Verfahren wünschenswert. Da die spezifische Aktivität von IFN-&< hoch ist, sie liegt in der Größenordnung νοηΛ,Ο χ 10 bis ίο" IU/mg, ist die für praktische Anwendungsfälle gebrauchte Menge von HuIFTT-^ gering. Zum Beispiel wurden 100 Gramm reines HuIFTT-<>< zwischen 3 und 30 Millionen Dosierungen ergeben. Kürzliche Fortschritte auf dem Gebiet der Molekularbiologie haben es möglich gemacht, DEA-Kodierung für spezifische nicht-bakterielle eukaryotische Proteine in Bakterienzellen einzuführen. Im allgemeinen umfaßt.die Konstruktion derartiger Rekombinant-DNA-Moleküle mit DNA, allerdings nicht durch chemische Synthese gewonnener, die Schritte, daß eine einsträn· gige DITA-Kopie (cDNA) einer gereinigten Messenger-RHACmRFA)-Template für das verlangte Protein erzeugt wird; die cDHa in doppelstränige DHA umgewandelt wird; die DIiA mit einer passenden Stelle in einem entsprechenden Cloningvehikel zur Bildung eines Eekombinant-DNA-Moleküls verknüpft wird und ein entspre-

chender Wirt Mt dem' Bekombinant-DT\^TA-Molekül transformiert wird. Durch eine derartige Transformation kann der Wirt das verlangte Protein erzeugen.·

Verschiedene nicht-bakterielle Proteine und Gene sind in E. coil unter Anwendung der Rekombinant-DITA-Technologie gewonnen worden. Dazu ge.hören ein Protein, das Ratten-Proinsulin-Antigendeterminanten aufweist (L. Villa-Komaroff, u.a., ¹¹A Bacterial Clone Synthesizing Proinsulin" (Ein bakterielles Clonesynthetisierendes Proinsulin), Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 75j S. 5727 - 5731 (1978)), Rattenwachstumshormon (P.H. Seeburg, u.a., "Synthesis of Growth Hormone By Bacteria" (Synthese von Wachstumhormon durch Bakterien), Nature, 276, S. 795 - 798. (1978)),'Mäuse-Dihydrofolat-Eeduktase (A.C.Y. Chang, u.a., "Phenotypic Expression In E. coli Of A DITA Sequence Coding For Mouse Dihydrofolate Eeductase" (Phenotypische Expression einer für Mäuse-Dihydrofolat-Reduktase kodierenden DFA-Sequenz), Mature, 275, S. 617 - 624 (1978), Human-Somatostatin (K. Itakura, u.a., "Expression In Sscherichia coll Of A Chemically Synthesized Gene For The Hormon Somatostatin" (Expression eines chemisch synthetisierten Gens für das Hormon Somatostatin in Escherichia coli), Science, 198, S. IO56 - 1063 (1977); Europäische Patentanmeldungen 0.001.929, 0.001.95Ο und O.OOI.93I und verwandte Anmeldungen in anderen Ländern), und die A- und B-Polypeptidketten von Humaninsulin (D.7. Goeddel, u.a., "Expression In Sscherichia coli Of Chemically Synthesized Genes For Human Insulin" (Expression von chemisch synthetisierten Genen für Huraaninsulin in Escherichia coli), Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 76, S. 106 - 110 (T979) und die europäischen und verwandten Patentschriften (sapra). Antigene' von Human-Hepatitis-B-Yirus (CJ. Burrell, u.a., "Expression In Escherichia

coli; Of Hepatitis B Virus DIiA Sequences Cloned In .Plasmid pBH3>22" (Expression von in Plasmid pBRj522 geclonten Hepatitis-B-Virus-DNA-Sequenzen in Escherichia coli). Nature , 279, S. 43 - 47/1979) und M. Pasek u.a., "Hepatitis B Virus Genes And Their Expression In E. coli" (Hepatitis-B-Virusgene und' ihre Expression in E. coli), Nature, 282, S. 575 - 579 (1979)) Humanwachstumshormon (D. V₄ Goeddel, u.a. ^Direct Expression In Escherichia coli Of A DMA Sequence Coding For Human Growth Hormone" (Direkte Expression einer für Huraanwachstumshormon kodierenden DNA-Sequenz in Escherichia coli) ITature _t 281, S. 544 - 551 (1979)), SV40-t-Antigen (T.M. Roberts, u.a,, "%nthesis Of Simian Virus 40 t Antigen In Escherichia coli" (Synthese von Affenvirus 40-t-Antigen in Escherichia coli); Proc. 'ffatl. Acad. Sei. USA, 76, S. 5596 - 5600 (1979)) und Humanfibroplast-Interferon (HuIi¹N-/?) (T. Taniguchi, u.a., "Construction And Identification Of A Bacterial Plasmid Containing *The Human Fibroplast Interferon Gene Sequence" (Konstruktion und-Identifikation eines Bakterienplasmids, das die Human-Fibroplast-Interferon-Gen-Sequenz enthält), Proc. Japan, ' Acad., 55y Ser. B, S. 464 - 469 (1979) zusammen mit einer persönlichen Veröffentlichung 1980).

Keiner dieser Sekombinant-DFA-Prozesse betrifft jedoch die Synthese von HuIi¹N-Oi , wie es in der Erfindung der Fall ist. Mit diesem Problem befaßt sich die Erfindung. Seine lösung wird jedoch nicht, wie es bei den oben beschriebenen Rekombinant-DNA-Scheoiata der Fall war, durch die Verfügbarkeit der Sequenzinformation, die zur Erzeugung eines synthetischens Gens (z.B. Somatostatin)'erforderlich ist, oder eines Zelltyps oder Virus, der reich an einer bestimmten DNA-Sequenz ist (z.B. Hepatitis-Vi'rus-Antigen, oder von mRNA-Spezies (z.-B.

2 26 3 8

Wl 55/Wr t

Ratteninsulin), die die Herstellung und Identifikation von' Bakterienclonen ermöglichen, die die verlangte Hybrid-DNA enthalten, oder eines Systems, das die Auswahl von E. coli-' Wirten erlaubt, die das verlangte Protein ausprägen (z. B. Mäuse-Dihydrofolat-Reduktase) erleichtert. Auch der Bericht über ein Plasmid, das eine DNA-Sequenz enthalten soll, die von einer PoIy(A)-EWA zu einer mRNA hybridisiert, wobei die mRNA HuIFH-/?>-Aktivität in Oocyten erzeugt (z. B. Fibroplast-Interferon), hilft wenig. Und bei der in der Erfindung vorgeschlagenen Lösung handelt es sich nicht um den einleuchtenden Vorschlag der Forschungs-Veröffentliehung Wr. 183O9> S. 361 (197.9) für die Herstellung von reiner oder, im wesentlichen reiner HuIFN- j/ mRNA vor dem Cloning des HuIFN- κ -G-ens.

Schließlich sollte man beachten, daß diei-Selektion einer DNA-Sequenz oder die Konstruktion eines Rekombinant-DNA-Moleküls, das von PoIyA-BNA zu einer mRNA hybridisiert, wobei die mRNA HuIFN-Aktivität in Oocyten erzeugt, nicht ausreicht, um zu demonstrieren, daß die DHA-Sequenz oder der' Hybrid-Insert des Rekombinant-DM-Moleküls'HuIFN entspricht. Stattdessen kann nur die Erzeugung eines Polypeptide, das eine immunologische oder biologische Aktivität von HuIFlT zeigt, tatsäch- lieh demonstrieren, daß die gewählte DNA-Sequenz oder das konstruierte Rekombinant-DNA-Molekül dem HuIFN entspricht. Viel wichtiger ist noch, daß die DNA-Sequenz, das Rekombinant-DNA-McKLekül oder mit ihnen verwandte Sequenzen erst nach dem Nachweis von HuIFN-Aktivität· zur Selektion anderer Sequenzen, die HuIFN gemäß der Erfindung entsprechen, herangezogen werden dürfen.

Aus der vorstehenden Beschreibung wird daher deutlich, daß das Pr-oblern der Erzeugung von HuIFN-&£. mit Hilfe der

2 26 884 8 -n-

Rekombinant-DNA-Technologie ein ganz anderes ist als das der oben beschriebenen Prozesse· Hier muß eine bestimmte DNA-Sequenz mit unbekannter Struktur - die für die Expression von HuIFHWv-in einem entsprechenden'Wirt ko- ' diert - in einem äußerst komplizierten Gemisch von DM-Sequenzen gefunden und von diesem getrennt wenden, damit sie bei der Herstellung von HuIFN-otverwendet werden kann. Dieses Lokalisierungs- und Trennungsproblem v/ird noch durch die überaus geringe Konzentration der verlangten DUA-Sequenz in dem komplizierten Gemisch und den Mangel an einer wirksamen Möglichkeit zur raschen Analyse der vielen DNA-Sequenzen des Gemische für die Selektion und Trennung der verlangten -Sequenz vergrößert·

,Ziel der Erfindung;

Durch die Erfindung wird es möglich, Polyp'eptid(e), die eine immunologische oder biologische Aktivität von HuII¹N-CJtaufweisen, für die Verwendung in Antivirus-, Antitumor- und Antikrebsmitteln und' -methoden zu gewinnen. Die. Erfindung ermöglicht die Herstellung dieser Polypeptide in Mengen und mit Hilfe von Methoden, die bisher nicht zur Verfügung standen.

Darlegung des Wesens der Erfindung:

Das Wesen der Erfindung besteht darin, daß DNA-Sequenzen, die für die Expression von HuIEIT- in einem entsprechenden Wirt kodieren, lokalisiert und abgetrennt werden und dadurch DNA-Sequenzen, Rekombinant-DNA-Holeküle und Methoden zur Verfügung gestellt v/erden, mit deren Hilfe ein Wirt transformiert wird; damit er ein Polypeptid erzeugt, das eine immunologische oder biolo- _λ gische Aktivität von Humaleukozyten-Iriterferon aufweist, wobei für das Verfahren zur Herstellung eines Rekombinant-DNA-Molekühls in dieser Anmeldung kein Patentschutz beaNsprucht wird. Wie aus der folgenden Beschreibung deutlich v/erden wird, sind die erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen und .Rekombinant-DNA-Moleküle in der Lage, die

~-:__— -η-τ — xjj

226 88 4

eine immunologische oder biologische Aktivität von HuIFN-* aufweist, in einem entsprechenden Wirt zu bestimmen. Die Replikation dieser DNA-Sequenzen und Rekombinant-DNA-Moleküle in einem entsprechenden Wirt ermöglicht auch die Erzeugung von für diese Polypeptide kodierenden Genen in großen Mengen. Die Molekülstruktur und die Eigenschaften dieser Polypeptide und Gene können leicht ermittelt werden. Die Polypeptide und Gene sind entweder in der im Wirt erzeugten Form oder nach entsprechender Derivatisierung oder Modifizierung für Zusammensetzungen und Methoden zum Nachweis und zur Verbesserung der Herstellung dieser Produkte selbst und für die Verwendung in Antivirus-, Antitumor- und Antikrebsmitteln und -methoden von Nutzen. . '

Dieser Prozeß weicht .daher von den dem bisherigen Stand der Technik entsprechenden und oben genannten Prozessen insofern ab, als dieser Prozeß im Gegensatz zu den genannten bisherigen Prozessen.die Erzeugung und Selektion von DHA-Sequenzen und Rekombinant-DNA-Molekülen umfaßt, die entsprechende DEFA-Sequenzen enthalten, die für mindestens ein Polypeptid, das eine immunologische oder biologische Aktivität von HuIFN-oC aufweist, kodieren.

Aus dem Vorstehenden wird deutlich, daß ein grundlegender Aspekt der Erfindung die Schaffung einer DNA-Sequenz ist, die dadurch gekennzeichnet ist, daß sie für ein Polypeptid, das eine immunologische oder biologische Aktivität von HuIFF aufweist, kodiert und aus der Gruppe ausgewählt wurde, bestehend aus den DNA-Inserts von Z-pBR322(Pst)/HcIF-4c. Z-pBR322 (Pst)/HcIF-2h, Z-pBB322(Pst)/HcIF-SH35, Z-pBR322(Pst)/HcIF-SN42, Z-pKT287(Pst)/HcIF-2h-AH6, DNA-Sequenzen, die zu einem der vorstehend genannten DNA-Inserts hybridisieren, DNA-Sequenzen,

ι J?/^ υ

gleich aus welcher Quelle stammend, einschließlich natürlicher, synthetischer oder halbsynthetischer Quellen, verwandt durch Mutation, einschließlich einfacher oder mehrfacher, Basensubstitutionen, Deletionen, Insertionen und Inversionen mit einer der vorstehenden DNA-Sequenzen o'der einem der Inserts, und DNA-Sequenzen, die Sequenzen von Codons aufweisen, die bei Expression für ein Polypeptid kodieren, das eine ähnliche immunologische oder biologische Aktivität wie ein bei Expression der Codons einer der vorstehenden DM-Sequenzen und Inserts dafür kodiertes Polypeptid aufweist, und daß diese Sequenzen.die Herstellung von Interferon und interferonartigen Polypeptiden in Wirten erlauben. Ausführ ungsb.ei spiel: .

In den Zeichnungen stellen dar: . ·

Hg. 1 eine schernatische Darstellung einer Ausführungsform eines erfindungsgemäßen Prozesses zur Herstellung eines Geraischs von Rekombinant-D?TA-Molekülen, von-denen einige durch eingefügte DNA-Sequenzen gekennzeichnet sind, die für erfindungsgemäße Polypeptide kodieren;

Fig. 2 eine schematische Darstellung des erfindungsgemäßen Initial-Clon-Screening-Prozesses;

Fig. 3 eine schematische Darstellung einer Ausführungsform eines Clon-Screening-Prozesses unter Verwendung von er-, findungsgemäß hergestellten DNA-Sequenzen»

KLg. 4- eine Restriktionskarte eines der erflndungsgemäßen Clone, wobei die absolute Position'jeder Restriktionsstelie in diesem Clo.n nicht angegeben ist;

Fig. 8 bis 10 geben absolutere Positionen dieser Sestriktionsstellen an.

? l'rl>;v iT/A-l.·

Fig. 5 eine schematische Darstellung des Prozesses zur Bestimmung der Orientierung eines DNA-Inserts in einem erfindung'sgemäßen Bekombinant-DNA-Molekül;

Fig. 6 die Partial-Mucieotid-Sequenz eines erfindungsgemäß nützlichen Cloningvehikels; ' ·

Fig. 7 die Ergebnisse einer Fraktionierung mit Sephadex G-100 von Obenstehendem, das aus einer erfindungsgemäßeη Bakterienkultur hergestellt wurde;

Fig. 8 bis 10 die Fucleotid-Sequenz eines DM-Inserts für ein erfindungsgemäßes Rekombinant-DNA-Molekül. Die Sequenz ist von dem ITucleotid, das dem PoIyG 5'-Schweif folgt, bis zu dem Nucleotid vor den PolyA-Residuen und PoIyC 3>'-Schweifen numeriert. Die Nucleotide 57 ~ 125 stellen eine Signalsequenz dar, und die Nucleotide 126 - 626 stellen das "reife" Interferon und das Terminatorcodon dar. Die Aminosäuresequenz der Signalsequenz ist über ihrer TTucleotidsequenz in Kleinbuchstaben und die Aminosäuresequenz des "reifen" Interferons über ihrer Tnicleotidsequenz in Großbuchstaben angegeben. Verschiedene Bestriktions-Endonuclease-Erkennungsstellen in diesem Gen sind gleichfalls in den Fig. 8 bis 10 angegeben, wobei diese Stellen absoluter lokalisiert sind als die in Fig. 4 gezeigten;

Fig. 11 ein schematischer Vergleich der Bestriktionskarten zweier DITA-Inserts von erfindungsgemäßen Eekombinant-DNA-Molekülen; '· -·-·

Fig. 12 bis 16 die B'ucleotidsequenzen von zwei DKA-Inserts von erfindungsgemäßen Bekombinant-DWA-T'/Iolekülen. Die Sequenzen sind von dem ITucleotid, das dem PoIyG 5'-Schweif folgt, bis zu dem TTucleotid vor den PolyA-Besiduen und den PoIyC 3'-Schweifen numeriert. Die Aminosäuresequenz der Signalsequens für jeden dieser Inserts ist über ihrer jeweiligen ITucleotid-

2268 8k

sequenz in Kleinbuchstaben und die Aminosäuresequenz des •^:~ "reifen" Interferons über, ihrer Nucleotidsequenz in Großbuchstaben angegeben; .

,Fig. 17 eine Partialrestriktionskarte von Z-pER322(Pst)/ HcIF-II-206 und die zur Bestimmung der Nucleotidsequenz des in Fig. 12 bis 16 dargestellten Hif-II-206-Fragmentes angewandte Sequenzierungsstrategie; .

Fig. 18 Partiairestriktionskarten einer Reihe von Hybrid phagen* die zu dem Hif-2h-Fragment hybridisieren; Fig. 19 eine Partialrestriktionskarte des Hybridinserts

O ' . " . '

von Z~pBR322Pst/BchrIF~35HB t* und die zur Bestimmung seiner Fucleotidsequenz angewandte Sequenzierungsstrategie;

Fig. 20 - 23 die Hucleotidsequenz des HehrIF-35HBa; -Frag ments und der davon abgeleiteten Aminosäuresequenz;

Fig. 24- Partialverknüpfungskarten für HuIFN-o< verwandte Gene. Die Pfeile bezeichnen Eegionen, die mit induzierter Leu kozyten-Po Iy(A)-RTTA R-Schleifen bilden. Der gestrichelte Kasten (chr-16) bezeichnet die Sequenz, die durch Löschexperimente gestört wurde, aber durch R-Schleifen-Einzeichnen nicht aufgedeckt wurde;

Fig. 25 eine schematische Darstellung der Konstruktion

'.' ' /

von Plasmid C8-IFT?-*1;

Fig. 26 eine schematische Darstellung der Konstruktion von Plasmid LAC-AUG (tf.2);

Fig. 27 die Rekonstruktion des AUG-Initiierungs-Godons und des CTS-Initial-Codons in der Konstruktion von LAC-AIXi (te 2);

Fig. 28 eine schematische Darstellung der Konstruktion

von Plasmid C8-IFW*2 und der Hybridmoleküle I₁ II, III und t ·

IY;

4155/Wrt

' Fig. 29 - 32 Darstellungen der TTucleotidsequenz und der dadurch für IFN-'oc4b kodierten Aminosäuresequenz und ihre Signalsequenz.

Zum besseren Verständnis der hier dargelegten Erfindung folgt eine ausführliche Beschreibung.

In der Beschreibung werden folgende -Bezeichnungen verwendet:

TTucleotid - Eine Monomereinheit von DHA oder RNA, bestehend aus einer Zuckerkomponente (Pentose), einem Phosphat und einer stickstoffhaltigen heterozyklischen Base. Die Base ist über den Glyeosidkohlenstoff (1^a Kohlenstoff der Pentose) mit der .Zuckerkomponente verknüpft. Diese Kombination einer Base und eines Zuckers wird als Eucleotid bezeichnet. Jedes Nucleotid ist durch seine Base gekennzeichnet. Die vier DM-Basen sind Adenin (^HA^M), Guanin ("G"), Cytosin C¹¹C") und Thy mi n ("T"). Die vier HITA-Basen sind A, G, G und Uracil (¹¹U").

DHA-Sequenz - Eine lineare Reihe von Nucleotiden-, die miteinander durch Phosphordiesterbindungen zwischen den J' und 5'-Kohlenstoffen benachbarter Pentosen verbunden sind.

Codon - Eine D!TA-Sequenz von drei "Nucleotiden (ein Tri-.plett), die durch mRTTA eine Aminosäure, ein Translations-Initiierungssignal oder ein Translations-Terrainationssignal kodiert. Beispielsweise kodieren die Kucleotid-Tripletts TTA, TTG, CTT, CTC, CTA und CTG für das Arainosäureleucin ("Leu"), TAG, TAA und TGA sind Translations-Terminationssignale und ATG ist ein Translations-Initiierungssignal.

Orientierungssystem· (reading frame) - Die Gruppierung von -Codons während der Translation von mSFA in Aminosäuresequenzen. Während.der Translation muß das richtige Orientierungssystem beibehalten werden. Zum'Beispiel kann die

226 884 8

' Sequenz GCTGGTTGT'AAG in drei Orientierungssysteme oder Phasen übersetzt werden, von denen jede eine andere Aminosäuresequenz ergibt: .

GCT GGT TGT Mh-Ala-GJLy-Cys-Lys ^G CTG GT^ GTA AG—Ieu~Val-Val GC TGG TTG TAA G—Trp-L«u-(Stop)

Polypeptid - Eine lineare Eeihe von Aminosäuren, die miteinander durch Peptidbindungen zwischen den χ-Amino- und Carboxygruppeη benachbarter Aminosäuren verbunden sind.

Genom - Die gesamte DTIA einer Zelle, oder eines Virus. Es

ν.-' ·

enthält unter anderem die für die Polypeptide der Substanz kodierenden Strukturgene sowie Operator-, Promotor- und Ribosom-. binde- und -Wechselwirkungssequenzen, einschließlich Sequenzen wie die Shine-Dalgarno-Sequenzen.

Struktur gen - Eine DlTA-Sequenz, die durch ihre Templateoder Messenger-RTTA ("rnRHA") eine Sequenz von Aminosäuren, die für ein spezifisches Polypeptid charakteristisch sind, kodiert

Transcription - Der Prozeß der Erzeugung von rnßlTA von einem Strukturgen.

Translation - Der Prozeß der Erzeugung eines Polypeptids von mRWA.

Expression - Der Prozeß, den ein Strukturgen zur Erzeugung eines Polypeptids durchläuft. Er ist eine Kombination von Transcription und Translation·. .

Plasmid - Eine nicht-chrömosome, doppe lsträngige DTTA-Sequenz, die ein intaktes "Replicon" aufweist, so daß sich das Plasmid in.einer'Wirtszelle repliziert. Wenn das Plasmid in einem einzelligen Organismus vorhanden ist, können die Charakteristika dieses Organismus infolge der DNA des Plasmids verändert oder transformiert werden. Zum Beispiel transformiert

2 26 8B4

ο/rc

ein- Plasmid, welches aas Gen für Tetracyclin-Besistenz (Tet ) trägt, eine Zelle, die vorher gegenüber Tetracyclin sensistiv war, in eine Zelle, die dagegen resistent ist. Eine durch ein Plasmid transformierte Zelle wird als "Transformant" bezeichnet.

Phage oder Bacteriophage - Bakterienviren, von denen viele aus in eine Proteinhülle oder einen Proteincoat-eingekapselten DM-Sequenzen bestehen ("Capsid").

Cloningvehikel - Ein Plasmid, eine Phagen-DITA oder andere DTTA-Sequenzen, die sich in einer'Wirtszelle replizieren können, die durch eine oder eine geringe Anzahl von Endonuclease-Erkennungsstellen gekennzeichnet sind, an denen derartige DTTA-Sequenzen in einer Vorbestimmbaren Weise abgebrochen werden können, ohne daß sich daraus der "Verlust einer wesentlichen biologischen Funktion der DNA ergibt, z. B. Eeplikation, Erzeugung von Coat-Proteinen oder Verlust von Promotor- oder Bin destellen, und. die eine Markierungssubstanz "enthalten., die sich zur Verwendung bei der Identifikation transformierter Zellen eignet, z. B. Tetracyclin-Resistenz oder Ampicillin-Hesistenz. Ein Cloningvehikel wird auch oft als Vektor bezeichnet. ·

Cloning - Der Prozeß zur Gewinnung einer Population von Organismen oder DUA-Sequenzen, die von einem derartigen Organismus oder einer derartigen Sequenz durch asexuelle Vermehrung stammen.

Rekombinant-DWA-Molekül. oder Hybrid-DFA - Ein Molekül, bestehend aus Segmenten von BEA von verschiedenen Genomen, die außerhalb lebender Zellen hintereinander vereinigt wurden und die Fähigkeit besitzen, einige Wirtszellen zu infizieren.und darin festgehalten werden können.' * _

9 W 55/Wr t

Expressions-Koritr öl !-Sequenz - Eine Sequenz von Nucleotiden, die die Expression von Strukturgenen kontrolliert und reguliert, wenn sie operativ mit diesen Genen verknüpft ist. Sie enthalten das lac-System, das tnp-Systern, Hauptoperator- und -promotorregionen von Phage Λ , die Kontrollregion von fd-Coat-Frotein und andere Sequenzen, von· denen bekannt ist,, daß sie die Expression von Genen prokaryotischer und eukaryotischer Zellen und deren Viren kontrollieren.

In Fig. 1 wurde eine schematische Darstellung einer Ausführungsform eines Prozesses für die Herstellung eines Gemischs von Eekombinant-DwA-Molekülen gezeigt, von denen einige durch eingefügte DNA-Sequenzen gekennzeichnet sind, die für ein Polypeptid kodieren, das eine immunologische oder biologische Aktivität von Humanleukozyten-Interferon aufweist. Darstellung; von PoIy(A)-RNA, die Humaninterferon-mRlA enthält (IFW-

Humanleukozyten wurden 5 Stunden lang bei 37 ⁰C mit Sendai-Viren induziert und extrahiert", um ein PoIy(A)-RNA-Gemisch zu gewinnen, das Humanleukozyten-Interferon-mRNA ("HuIFN- tfmRNA") enthält. Die Induktion erfolgte nach dem Cantell-Verfahren (The Interferon System, S. I3O - I3I und darin angeführte Literatur). Das Poly(A)-RNA-Gemisch ist in Fig. 1 ohne Berücksichtigung seiner tatsächlichen Proportionen dargestellt. Induzierte Leukozyten wurden geerntet,und

10 Zellen wurden erneut in 1 1 einer Lösung suspendiert,

die 8 g NaCl, 0,2 g ¹KCl, 1,1-5 g Na₂HPO₄₀H₂O und 0,2

in 1 1 Wasser gelöst ("PBS") enthielt, und langsam unter kräftigem Rühren zu 17 1 20 mM Tri-HCl (pH-Wert 7,5)> EDTA ("TE-Puffer"), 2·% Natriuradodecylsulfat '("SDS") in einem cjO-l-Scheidetrichter gegeben. Selbst-dige'rierte Pronase

(Calbiocbem) wurde zu 200 /ug/ml ,gegeben, und die Lösung wurde 1 h'lang bei. Raumtemperatur gerührt. 10 Zählungseinheiten/Minute ("cpm") von ^I-Globin-mRNA wurden als Markierungssubstanz zur Gewinnung der PoIy(A)-BNA und zur Steue-, rung des mRNA-Abbaus während nachfolgender Schritte zugesetzt. 2 M Tri-HCl (pH-Wert 9) .v/urde in einer 1/20 des Gesamtvolumens entsprechenden Menge ("1/20 VoI") zügegeben, und das Geraisch wurde unter kräftigem Eühren 10 Minuten lang mit 15 1 redestilliertem Phenol extrahiert. Ss wurden 3 1 Chloroform zugegeben, und das Gemisch wurde 5 fflin lang gerührt, lach JO min zur Phasentrennung wurde die wäßrige Phase entfernt und erneut mit Phenol und'Chloroform extrahiert. Die resultierende wäßrige Phase, insgesamt 19,1 1, wurde mit 60 g SDS vereinigt. Mit -1/10 VoI 3 M Natriumacetat (pH-Wert 5,5) und 2 VoI Äthanol wurden.Nucleinsäuren aus der wäßrigen Phase ausgefällt.

Nach Aufbewahrung über Nacht bei -20 C wurde das faserige Nucleinsäurepräzipitat durch Filtration durch ein Plaste-Teesieb entfernt. Dieses Material wurde anschließend' mit 200 ml ΤΙΤΕ-(50 mM Tri-HCl (pH-?/ert 7,5), 100 rnM NaCl, 5 mM EDTA), das 0,5 % SDS enthielt, gerührt. Es löste sich anschließend durch die Zugabe von weiteren 350 ml dieser Lösung auf. Das nichtfaserige Präzipitat wurde durch .15 min Zentrifugieren in 1-1-Sorvall-Fiaschen in einer Sorvall-Zentrifuge BC-3 mit 5OOO U/min gesammelt und in 3M> ml TKD., das 0,5 % BDS enthielt, gelöst. Die beiden TNS-Iösungen wurden zusammengenommen, dreimal mit 1 VoI Phenol, dreimal mit 1/2 VoI Äther und dreimal mit 1 VoI Äther extrahiert. Die Gev/innung von BNA aus der wäßrigen Phase ergab insgesamt 775 mg, ?/ie durch das Absorptionsvermögen bei 260 nm gemessen wurde.

Die Isolation des Poly(A)-HHA-Gemischs wurde durch wiederholte

Chargenabsorption mit Oligo(dT)~Cellulose (Typ 7, P-L Biocbemicals, Inc.) erreicht, 2,7 g Oligo(dT)-Cellulose wurden zu 5UOmI gegeben, d. h. etwa zur Hälfte der RNA-enthaltenen, ,oben'beschriebenen Lösung. Nach einstündigem Rühren bei Raumtemperatur zur Herbeiführung der Adsorption der PoIy(A)-HNA' durch Oligo(dT)-Cellulose wurden die Cellulose und das Gemisch der an sie gebundenen mRNAn durch Zentrifugieren gesammelt und einmal mit 50 ml TNE und ein zweites Mal mit 15 ml TRE gewaschen. Die gebundene PoIy(A)-RNA wurde danach durch fünf aufeinanderfolgende Waschungen mit 2 ml-HgO eluiert. Die Ausbeute betrug 860 ,ug PoIy(A)-RIA, wie anhand der optischen s Dichte gemessen wurde (Präparat A). Die von der ersten Adsorption überstehende RNA-Lösung wurde zwei weiteren Adsorptionszyklen unterzogen, die den' oben beschriebenen genau entsprachen. Die zweite und die dritte Adsorption ergaben 600 ^ug bzw. 170 /UgRNA, und diese wurden zusammengenommen (Präparat i ' RITA wurde hinsichtlich HuII¹N- <x mRNA durch Injektion in

Xenopus laevis Oocyten analysiert (The Interferon" System, S. . 93 - 95): RNA wurde in I5 mM Tri-HCl (pH-Wert 7,5), 88 mM NaCl ("TNK Puffer") bis zu einer Konzentration von etwa 1 mg/ml gelöst. Fünfzig nl dieser Lösung wurden in jede der 5O Oo.cyten injiziert.'Die Oocyten wurden über Nacht bei Raumtemperatur in Barth-Substrat inkubiert (Gurdon, J. Embryol and Exper. Mori 20, S. 401 - 414 (1968) und Barth, J. Smbryol and Exper.-Morph 7, S. 210 - 222 (1959))· Die inkubierten Obcyten wurden anschließend abgespült und mit einer Pasteur-Pipette in einem 1,5-ml-Eppendorf-Zentrifugenglas in 0,5 ml Triglycocoll-Puffer (pH-Wert 8,9) homogenisiert. Das Geraisch wurde 2 min lang in einer Eppendorf-Zentrifuge zentrifugiert, und das Obenstehende wurde abgezogen und bei -20 ⁰C zur Analyse eins^fror^n. Dta

£ O Q Q H Q -^ 914155/22/rt

IPIT- oi -Aktivität .wurde mit Hilfe der von H.Strander und K. Cantell in "Production Of Interferon By Human Leukocytes In Vitro" (Herstellung von Interferon durch Humanleukozyten in vitro), Ann. Med.. Exp. Fenn., 44,-S. 265 - 273 (1966) beschriebenen Plaque-Seduktions-Änalyse bestimmt. Eine Einheit IFF-^ reduziert Virus-Plaques um 5^ %· Die Potenz von einem IFiT- &<:-Präparat wird im Verhältnis zum Human-Bezugs-HuIFH-Ai 69/19 angegeben-(Internationales Symposium über Standardisierung von Interferon und Interferon-Induktoren, 1969). Alternativ wurde die Analyse auf der Basis der Reduktion des cytopathischen "Effektes durchgeführt,.und zwar im wesentlichen wie von W.E. Stewart, II und S.E. Sulkin in "Interferon Production In Hamsters Experimentally Infected With Rabies Virus" (Interferonerzeugung in experimentell mit Tollwutviren infizierten Hamstern), Proc. Soc. Sxp. Biol. Med., 123, S. 65O - 653 (1966) beschrieben, nur mit dem Unterschied, daß Human-CCL-23-Zellen verwendet wurden und der Immunitätstest mit Mengo-Viren vorgenommen würde. Die üocyten-Sx'trakte hatten 3OO IU. IFN-K? -Aktivität je _/ug injizierte RTTA. Bei späteren Analysen dauerte die Inkubation von injizierten Oocyten 48 Stunden, und es wurde nur das Inkubationsmedium analysiert, da der größte Teil des Interferons von den Oocyten ausgeschieden wird..(A. Cqlman und J. Morser, "Export Of Proteins From Oocytes Of Xeno.pus laevis" (Abgabe von Proteinen aus Oocyten von Xenopus laevis), Cell, 17, S. 517 - 526 (1979)) Zur weiteren Reinigung der PoIy(A)-RFA. wurde ausreichend 0,5 M Äthylendiamintetraessigsäure ('"EDTA") zu dem PoIy(A)-EITA-Präparat A gegeben, um die Konzentration auf 5 roM EDTA zu'bringen. Die resultierende Lösung wurde zweimal mit einem gleichen Volumen von mit TTIE gesättigtem Phenol und fünfmal

226884 .8

mit einem gleichen Volumen Äther extrahiert. Sie wurde.danach durch eine 0,1-tnl-Säule von Bio-Rad-Chelex-100 geleitet, 9O s lang bei 100 ⁰C gehalten und auf 13 ml eines 5 bis 23, %igen Saccharosegradienten'aufgebracht, der 5O mM Tri-HCL (pH-7/ert 7,5), 1 mM EDTA, 0,2 M'NaOl enthielt. 10 000 cpra von 5^l-terminal- P-markierten DNA-Fragmenten, die durch gleichzeitige Digerierung von pBR322 mit Restriktionsenzymen Hindlll und Psti erzeugt-worden waren (New England Biolabs), wurden als Größenmarkierer· zugesetzt. Das Zentrifugieren erfolgte bei 10 ⁰C 16 Stunden lang in einem SW4'O Rotor mit 35 000 U/min Es wurden Fraktionen (0,6 ml) mit einem ISCO-Gradientenkollektor von 1 ral/min gesammelt. Die !Fraktionen wurden wie oben beschrieben hinsichtlich HuIFTT- t< mRNA analysiert, und ihre

7.0

Position in bezug auf die P-DNA-Markierer wurde zur späteren Bezugnahme notiert. Bei anschließenden Zentrifugierungen wurden HuIFF- oi mRNA-haItige Fraktionen im "Verhältnis zu den Markierern identifiziert. Die Fraktionen mit HuIFTT- or mt?!TA-Aktivität enthielten 80 ,ug PoIy(A)-RWA. Sie wurden mit 2 VoI TNS, das 0,5 % SDS und 0,02 % Polyvinylsulfat enthielt (bei späteren Präparaten wurde auf Polyvinylsulfat verzichtet), ver· mischt und auf eine 5O-/ul-Oligo(dT)-Cellulosesäule aufgegeben Nach dem Waschen der Säule,wie oben beschrieben,wurden 40 /Ug des RlA-Gemischs durch 4 Waschen mit 0,6 ml sterilem destillie: tem Wasser eluiert. Nach der Ithanolpräzipitation wurde die RNA bis auf 1 mg/ml in 0,5 mM EDTA gelöst.

Wie oben beschrieben, wurde eine Analyse der-HuIFN- ocmRNA-Aktivität mit einer Portion des Poly(Ä)-RNA-Präzipitats vorgenommen. Es hatte eine spezifische Aktivität von 36ΟΟ IU Interferon//Ug indizierte RNA. Daher wies die PoIy(A)-RNA durch den Saccharosegradienten eine etwa 10-fache Anreicherung

26884 8

in bezug auf HuI3?N-oiroSNA auf. Bei einem anschließenden ähnlichen Präparat wurde eine etwa 40-fache Anreicherung erzielt. Präparat B wurde ähnlich gereinigt, und da es eine ähnliche spezifische Aktivität wie Präparat A hatte, wurden beide vereinigt.

An dieser Stelle sollte man sich im klaren sein, daß selbst das von dem Saccharosegradienten gewonnene PoIy(A)-RlTA-Produkt eine sehr große Anzahl verschiedener BiRT¹TAn enthält. Bis auf die für IFN-t* spezifische iriRNA sind die anderen mRNAn unerwünschte Verunreinigungsstoffe (51g. 1). Leider verhalten sich diese Verunreinigungs-RNAn während des übrigen erfindungsgemäßen Cloning-Prozesses ähnlich wie HuIFM-^mRTTA. Ihr Vorhandensein in der PoIy(A)-RNA wird daher im fertigen Präparat zu einer großen Anzahl unerwünschter. Bakterienclone führen, die Gene enthalten, die für andere Polypeptide als für 13J¹N-^ kodieren. Diese Verunreinigung wirft komplizierte Screeningproblerne bei der Isolierung der verlangten HjTT-**: -Hybridclone auf. Im Falle von IFN-^ wird das Screeningproblem noch durch den Mangel an einer genügend gereinigten Probe von HuIFN-^mRNA oder RIiA oder Teilen davon erschwert, die als Screening-Sonde für die Identifikation der erwünschten Clone dienen soll. Daher ist. der Screening-Prozeß für die IFl- o( -Glone sehr zeitaufwendig und schwierig. Da nur von einem sehr geringen Prozentanteil IPI- o^-Glone selbst zu erwarten ist, daß sie IFN-* in einer biologisch aktiven oder immunologisch aktiven Form verwirklichen, ist die Isolierung eines aktiven Clons mit einem Screening-Prozeß zu vergleichen, bei dem "die Nadel im Heuhaufen gesucht wird".

Zum Glück kann man die Rekombinant-DWA-Technologie zur Gewinnung einer gereinigten Probe von HuIFlT-^mRlTA oder

2268 84 8

^9W55/25/r\

oder eines Teiles davon anwenden. Diese gereinigte niRNA'oder cDWA kann, zum raschen Screening sehr großer Mengen von Bakterienclonen verwendet werden, so daß dadurch die Wahrscheinlichkeit der Isolierung eines Clons, '"der IFSF-« in einer aktiven Form verwirklicht, erhöht wird. Synthese von cDM-Gemisch, das HuIPH-*L cDTTA enthält.

Die mit -IFN-^mBWA angereicherte PoIy(A)-RNA (Präparat A+3 wurde als Template für die Herstellung von einsträngiger Komplementär-RHA (cDNA) verwendet (Mg. 1) (siehe A. Efstratiadis, u.a., "Full Length And Discrete Partial Reve^-rse Transcripts Of Globin And Chorion iriRFAs" (Revers-Transkripte voller länge und in einzelnen Teilen' von Globin- und Chorion-mRNAn), Cell, 4, S.-367 - 378 (1975) und darin angeführte Literatur). Das, 800-,ul~Reaktionsgemisch enthielt 4-0 mM Tri-HCl (pH-Wert 7,5), 30 mM HaCl, 5 mM MgCl₂, 0,5 mM DTT (Cal-Biochem), 20 yug/ml Oligo(dT) 12-18 (P & L Biochemicals), 5 mM dGTP (Schwarz), dCTP (Laevosan) und dTTP (Sigma), 5 mM ⁵²P-dATP (ITSH, spezifische Aktivität 100 000 cpm/nMol), 60 /Ug/ml PoIy(A)-RHA und 280 Einheiten Vogel-Myeloblastosis-Virus (AW)-Reverstranscriptase (ein Geschenk von Life Science, Inc., St. Petersburg, Florida). Fach einstündiger Inkubation bei 37 C wurden 0,5 M EDTA und 20 % SDS (rekristallisiert) zu 10 mM SDTA und 0,1 % SDS gegeben. Das Gemisch wurde mit 1 "VoI Phenol (destilliert) extrahiert.) Die Phenolphase wurde mit 200 ,ul.200 mM Tri-HCl (pH-Wert 7»5), 1 mM EDTA und 0,1 % SDS gewaschen, und die wäßrigen Phasen wurden zusammengenommen. .,Diese wurden mit einem gleichen Volumen A'ther (Fluka, anälysenrein) extrahiert und auf einer 0,5-ml-Säule von Sephadex- G-100 in TEE chromatographiert.· Fraktionen von 0,1 ml wurden-bei 0,3 ml/min gesammelt.

L I D Ο ö 4

-ώΌ

gemessen) wurden zusammengenommen, und 3 M Fatriumacetat wurden zu 0,3 M gegeben. Die. Nucleinsäuren wurden mit 2,5 VoI Äthanol ausgefällt. Wach Aufbewahrung .über TTacht bei -20 ⁰C wurden die Proben zentrifugiert,und das Obenstehende wurde verworfen. Das Präzipitat wurde in 180 ,ul destilliertem Wasser gelöst und in ein silikonisiertes Eppendorf-Glas übertragen. Es wurden 20 ,ul 5 M ITaOH zugesetzt, und das Gemisch wurde 40 min lang bei Raumtemperatur stehen gelassen. Ss wurden 20 /Ul 5 M Natriumacetat,. 100 /ul destilliertes Wasser und 500 /ul Ithanol zugegeben. Each Kühlen über Hacht bei -20 ⁰G wurde das resultierende Präzipitat durch 20 min Zentrifugieren bei 0 ⁰C mit einer Kraft, die gleich der 10.000 fachen Schwerkraft (10 000 xg) war, gesammelt. Die Ausbeute an einsträngiger cDITA betrug 10 /Ug. ·

Es ist wiederum selbstverständlich, daß es sich bei dem oben hergestellten einsträngigen cDTTA-Produkt in Wirklichkeit um ein kompliziertes Geraisch einer großen Anzahl verschiedener cDNAn handelt, die von den entsprechenden, in dem FoIy(A)-. •R Tv A-Ge mi sch'-vorhandenen mRTTAn transcribiert wurden (Fig. 1). I¹TUr sehr wenige dieser cDKFAn sind IFTJ-^ verwandt, d.h. HuIFlT- ίΧ-cDWAn. Ein weiterer Faktor trägt noch zur Komplizierung des cDITA-Gemischs bei - gewöhnlich wird nicht jede mRTTA-Spezies des Poly(A)-ETTA-Gemischs vollständig transcribiert. .Stattdessen kann der TranscriptionsprozeB bei jeder mRITA-Spezies aufhören, bevor das Ende der mRNA erreicht ist. Ss können daher die vielfältigsten cDTTA-Spezies von jeder mRNA-Spezies erzeugt werden (in Fig. 1 nicht dargestellt). Jede Spezies wird sich in dem anschließenden Cloningprozeß mehr oder weniger ähnlich verhalten, so daß Bakterienclone erzeugt werden, die Bekombinant-DTTA-Moleküle enthalten, die nur ein

'L LX) Q υ ·+ y

Fragment des Gens -für ein bestimmtes Protein aufweisen. Die .' :- Anwesenheit dieser fragmenthaltigen Clone kompliziert den endgültigen Clon-Screeningprozeß noch mehr.

.Die Größen der einzelnen .einsträngigen cDTTAn wurden durch Elektrophorese einer kleinen Aliquote auf einem alkalischen 2 %igen Agarosegel unter Verwendung von 3O mM NaOH, 2 mM EDTA als Elektrolyten bestimmt (M. W. McDonell, u.a., "Analysis Of Restriction Fragments Of T? DNA And Determination Of Molecular Weights By Electrophoresis Γη Neutral And Alkaline Gels" (Ana-r lyse von Restriktionsfragmenten von T7-DNA und Bestimmung der

relativen Molekülmassen durch Elektrophorese in neutralen und alkalischen Gelen), J. Mol. Biol., 110, S. 119 - 146 (1977)). Die ^²P-CDNA hatte eine Länge von 600 bis 1000 Nucleotiden in bezug auf einsträngige Globin-cDNA, und ^ P-markierte DNA-Fragmente wurden als Größenmarkierer verwendet. Darstellung von doppelsträngiger cDNA

Aus der einsträngigen cDNA kann doppelsträngige durch Behandlung mit DNA-PoIymerase I gemacht werden (T. Maniatis, u.a, "Amplification And Characterization Of α f-Globin Gene Synthe- \ J si-zed In Vitro" (Verstärkung und Charakterisierung eines in vitro synthetisierten /-Globin-Gens), Cell, 8, S. 163 - 182 (1976). Die ausgefällte einsträngige cDNA von oben wurde in 200/Ul H₂O gelöst, 2 min lang auf IOO ⁰C gehalten und inkubiert in 5OO /ul 0,1 M durch Hitze denaturiertem Kaliumphosphatpuffer (pH-Wert 6,9), 10 mM MgCl₂, 1OmMDTT (CaIbiochem), 1 mM von je dATP (Merck), dGTP·(Schwarz) und dCTP (Laevosan), 1 mM %-dTTP (TIEN, spezifische Aktivität 100 000 cpm/nMol) und 150 Einheiten/ml E.coli DNA-Polymerase I (Boehringer-Mannheim) Nach 6,5 h bei 15 ⁰C v/urden 0,5 M EDTA und 20 % SDS zu 10 mM EDTA und 0,1 % SDS gegeben. Das Gemisch wurde anschließend

£ £Ό Ο Ό

mit. 5ΟΟ /Ul Phenol extrahiert, und die Phenolphase wurde mit 25Ο _/U1 20 mM Tri-HCl (pH-Wert 7,5), 5 mM EDTA ("TE~Puffer") reextrahiert. Die beiden wäßrigen.Phasen wurden zusammengenommen und auf einer 5-ml-Säule von Sephadex G-100 unter den gleichen oben beschriebenen Bedingungen chroraatographiert. Zu 0,3 M wurde Natriumacetat (3 M) gegeben, .und 2,5 "VoI Äthanol wurden zum Ausfällen der DNA eingemischt. Insgesamt wurden 13 /Ug DHA gewonnen.

Die DiTA wurde mit Nuclease S₁ behandelt,^hergestellt nach der Methode von R.C. Wiegand, u.a., "Specificity Of The S₁ Nuclease From Aspergillus oryzal" (Spezifität der S^-lTuklease von Asper,Filius or^zal), J. Bio!. Chem. _t 250, S. 8848 - 8855 (1975). Die ausgefällte DNA wurde in 25O .xti. S₁-Puffer (0,2 M NaCl), 50 mM Watriumace.tat (pH-Wert 4,5) .und 10 mM Zinksulfat) gelöst und 30 min lang auf 37 C gehalten. 1,5 /Ul S₁-Enzym (11 Einheiten/ /ul) wurden zugegeben, und das Gemisch wurde 3O min lang bei 37 ⁰C inkubiert. SDS und-EDTA wurden zu 0,1 % SDS und 5 mM EDTA gegeben, und -das Gemisch .wurde mit 25Ο /ul Phenol extrahiert. Die Phenolphase wurde mit 100 ,ul TS-Puffer gewaschen. Die wäßrigen Phasen wurden zusammengenommen und auf einer Säule von Sephadex G-100 (Pharmacia.) in TITS chromatographiert; bei 0,3 ml/min wurden 0,1-ml-5raktionen gesammelt, und die Cerenkov-Strahlung jeder Fraktion wurde bestimmt. "Mach der Ausfällung mit Äthanol und "Matriumacetat wie .· oben wurden 8 /ug doppelsträngige cDNA gewonnen.

Bs muß wieder darauf hingewiesen werden, daß es sich bei der oben erzeugten doppelsträngigen cDNA um ein Gemisch einer großen Anzahl von cDTTAn und Fragmenten davon handelt, von denen nur sehr wenige HuIFTT-qCcDT'A oder deren Fragmrente sind (Fig.1).

Cloning; von doppe !strang! ger DTTA

Eine große Vielzahl von Wirt-Cloningvehikel-Kombinationen kann für das Cloning der wie oben beschrieben hergestellten, doppelsträngigen cDM verwendet werden. Zum Beispiel ,können nützliche Cloningvehikel aus Segmenten von Chromosomen-, fticht-chromosomen- und synthetischen DM-Sequenzen bestehen, wie verschiedenen bekannten Bakterienplasmiden, z. -B. Plasmider von E. coli einschließlich col 5l,pCR1, ρΒϊ?322 und ihre Derivate, breiteren Wirtsbereich-Plasmiden, z. B. RP4, Phagen-DTTA, ζ-. B.. den zahlreichen Derivaten von'PhageA , ^z· ^. -TTM 989, unc Vektoren,' die von Kombinationen von Plasma den und Phagen-DHAn abgeleitet sind, wie Piasmiden, die zur Verwendung von Phagen-. DHA oder anderen Expressions-Kontroll-Sequenzen modifiziert wurden, oder Hefeplasmiden" wie dem 2 /U-Plasmid oder Derivaten davon. Brauchbare Wirte können Bakterienwirte wie Stämme.von S. coli, z. 3. E. coli HB 101, 5. coli-Xl776, E. coli X2282, £« coli MR01 und Stämme von Pseudomonas, Bacillus subtilis, ' Bacillus stearothermophilus und anderen Bazillen,· Hefearten und andere Fungi, Tier- und Pflanzenwirte v/i β Tier-( einschließlich Human-).oder Pflanzenzellen in Kultur oder andere Wirte umfassen. Natürlich werden nicht alle Wirt-Vektor-Kombinationen gleich wirksam sein. Die entsprechende Selektion der Wirt-Cloningvehike!-Kombination kann von Fachleuten nach Berücksichtigung der oben erläuterten Prinzipien vorgenommen werden, ohni vom Geltungsbereich der Erfindung abzuweichen.

Außerdem können-in jedem spezifischen Cloningvehikel verschiedene Stellen für die Insertion der doppelsträngigen DFA ausgewählt werden. Diese Stellen werden nor maler v/eise durch di Restriki;i'®ns -Endonuclease, die diese abbricht, bezeichnet. Beispielsweise liegt in pBB322 die Pstl-Stelle in dem Gen für

yg-Lactamase zwischen den TTucleotid-Tripletts, die für die Aminosäuren 181 und 182 dieses Proteins kodieren. Biese Stelle wurde von Villa-Komaroff ,· u.a., supra, bei seiner Synthese von Protein, das Ratten-Froinsulin-Antigen-Determinanten auf-, weist, verwendet. Eine der beiden Hindll-Endonuclease-Erkennungsstellen liegt zwischen den für die Aminosäuren 101 und 102 kodierenden Tripletts und einer' der zahlreichen-Tag-Stellen an dem für Aminosäure 45 von /^-Lactamase in pBR3>22 kodierenden Triplett. In ähnlicher Weise liegen die EcoRI-Stelle und die PvuII-Stelle in diesem Plasmid außerhalb irgendeiner Codierungsregion, wobei die EcoR I-Stelle zwischen den für Resistenz gegenüber Tetracyclin bzw. Ampicillin kodierenden Genen liegt. Diese Stelle wurden von. Itafcura, u.a.'sowie Goeddel, u.a. in ihren Rekombinant-Syntheseschemata, supra, verwendet. Diese Stellen sind durch den Fachmann leicht auszumachen. Es ist natürlich verständlich, daß ein erfindungsgemäß nützliches Cloningvehikel keine Restriktions-Sndonuclease· Stelle für die Insertion des gewählten DHA-Fragmentes haben muß.. Stattdessen könnte das Vehikel durch andere Maßnahmen mit dem Fragment verknüpft werden.

Der Vektor oder das Cloningvehikel, und vor allem die darin für die Anfügung des. gewählten DiTA-Fragmentes zur Bildung eines Rekombinant-DTTA-Moleküls gewählte Stelle werden durch die verschiedensten Faktoren bestimmt, z.B. die Anzahl der auf ein bestimmtes Restriktionsenzym ansprechenden Stellen, die Größe des zu verwirklichenden Iroteins, die Suszeptibilität des verlangten Froteins gegenüber proteolytischem Abbau durch Wirtzellenenzyme, Kontamination des Proteins, das durch Wirtzellenproteine, 'die während der Reinigung schwer zu entfernen sind,- zu verwirklichen ist, Express ionschar akter· istika,

lit) Ö Ö 4 ö

wie die. lage von Initiator- und Terminator-Codons in bezug '"" auf Vektorsequenzen, und andere vom Fachmann erkannte Fakto-• ren. Die Wahl eines Vektors und einer Insertionsstelle für ein bestimmtes Gen wird durch eine Ausgewogenheit dieser Paktoren bestimmt, wobei nicht alle Selektionen für einen be- · stimmten Fall gleich wirksam sind.

Wenn auch mehrere Methoden im Fachgebiet für die Insertion fremder DNA in ein Cloningvehikel oder einen Vektor zur Bildung eines Eekombinant-DNA-Moleküls bekannt" sind, 1st die für eine erste erfindungsgemäße Konstruktion bevorzugte Me^v' thode die von Villa-Komaroff, u.a., supra beschriebene und in Fig. 1 gezeigte. Diese Methode ist durch Digerieren des Plasmids (vor allem von pBB322) mit dem Sestriktionsenzym, · das für die zur Insertion gewählte Stelle typisch ist (vor allem Pst I), und Zugabe von dGMP-Schweifen zu den Termini durch Terminaltransferase gekennzeichnet. dGMP-Schweife werden zu den 5'~Tertnini des abgebrochenen Plasmids zur Regenerierung der Psti-StelIe hinzugefügt und ermöglichen die Verknüpfung mit einem cDNA Fragment, das die komplementären Schwel : i fe'trägt. In ähnlicher Weise wird die doppelsträngige cDITA durch die Zugabe von dCMP-Schweifen zu den 3'-Termini verlängert, um dre Verknüpfung mit dem geschweiften Plasmid zu ermöglichen. Das geschweifte Plasmid und die cDHA werden anschließend zur Insertion der cDNA in die entsprechende Stelle des Plasmids und zur Zirkularisierung der Hybrid-DFA verstärkt (annealed), wobei der komplementäre Charakter der Schweife ihre Kohäsion erlaubt (Fig. -1")· Das resultierende Bekombinant-DKA-Molekül trägt jetzt ein Gen an der gewählten Restriktionsstelle (Fig. 1).

Natürlich eignen sich auch andere bekannte Methoden der

2 26-8 8 4

-5k-

Insertion von DNA-Sequenzen in Cloningvehikel zur Bildung yon Rekombinant-DNA-Molekülen im Eahmen der Erfindung ebenso gut. Diese umfassen zum Beispiel direkte Ligation, synthetische Linker, Exonuclease- und ¹Po Iy m erase-verknüpfte Reparaturreaktionen mit anschließender Ligation oder Extension des DNA-Stranges mit DNA-PoIymer.ase und einer entsprechenden einsträngigen Template mit anschließender Ligation.

Ss ist natürlich zu beachten, daß die an der gewählten Stelle des Cloningvehikels eingefügten Nucleotid-Sequenzen oder das eingefügte cDFA-iragment Nucleotide umfassen können, die kein Teil des tatsächlichen Struktur gens für das verlangte Polypeptid'sind, oder daß sie nur ein !fragment des vollständigen Strukturgens für das verlangte Protein enthalten können. Auf welche Weise die DNA-Sequenz auch eingefügt wird, erforderlich ist dafür lediglich, daß ein transformierter Wirt ein Polypeptid erzeugen wird, das eine biologische oder immunologische Aktivität von HuIPN-o< hat, oder daß die DNA-Sequenz selbst als Hybridisierungssonde zur Selektion von'Clonen nützlich ist, die DNA-Sequenzen enthalten, die für die Erzeugung von Polypeptiden mit einer immunologischen oder biologischen Aktivität von HuIS¹N- κ brauchbar sind.

Das Cloningvehikel oder der. das fremde Gen enthaltende Vektor wird zur Transformation eines Wirtes verwendet, so daß der Wirt das Protein öder einen Teil davon, für den die Hybrid-DNA-kodiert, verwirklichen kann. Die Selektion eines passenden Wirtes wird auch durch eine Reihe von Faktoren bestimmt, die im Fachgebiet bekannt sind. Dazugehören beispielsweise Verträglichkeit mit dem gewählten Vektor, Toxizität von durch das Hybridplasmid kodierten Proteinen, leichte Rückgewinnung des verlangten Proteins, Expressionscharakteristika, Biosi-

226 88 4 8 ~^{33S ;}.·^914155/i5/rt -'

cherhe-it und Kosten. Es muß ein Gleichgewicht zwischen. diesen Faktoren unter dem Gesichtspunkt gesucht werden, daß möglicherweise nicht alle Wirte gleich wirksam für die Expression eines bestimmten,Rekombinant-DTTA-Moleküls sind. .

Bei der vorgestellten Synthese ist das bevorzugte Ini-' tial-Cloningvehikel das Bakterienplasmid pBR322 und die bevorzugte Initial-Hestriktions-^ndonucleaser-Stelle darin ist die Pstl-Stelle (Fig. 1). Das Plasmid ist ein kleines (relative Molekülmasse etwa 2,6 Megadalton) Plasmid, das Resistenzgene gegenüber den Antibiotika Ampicillin (Amp) und Tetracyclin (Tet) trägt. Das Plasmid ist ausführlich charakterisiert worden (F. Bolivar, u.a., "Construction And Characterization Of New Cloning Vehicles II. A Multi-Purpose Cloning System" (Konstruktion und Charakterisierung neuer Cloningvehikel II. Ein Mehrzweck-Cloning-System), Gene, S. 95 -113 (1977)» J.G. Sutcliffe, "pBK322 Restriction Map Derived From The DHA Sequence: Accurate DTTA Size Markers Up To 4361. Nucleotide Pair Long" (pBR322-Restriktionskarte, abgeleitet von der DHA-Sequen Genaue DTvA-Größenmarkierer bis zu 4361 T^Tucleotid-Paare lang), Nucleic Acids Research, 5, S. 2721- 2728 (1978)). Die Insertion des DWA-Froduktes in diese Stelle schafft eine große Anzahl von B"akterienclonen, von denen jedes eines der DlA-Gene oder Fragmente davon enthält, die in dem zuvor zubereiteten DHA-Prοdukt vorhanden sind. Wieder werden nur einige wenige dieser Clone das Gen für IFN-o< oder Fragmente davon enthalten (Fig. 1). Der bevorzugte Wirt für das erfind-ungsgemäße Initial-Cloning ist S. coli HB 1Q1."Andere Versuche wurden ^mi-t; 5. coli X1776 durchgeführt, einem in der GB-PS 1.516.458 beschriebenen 'Wirt, der bei der American Type Culture Collection, Rockville Maryland, USAι unter der Bezeichnung ATCC

2 2 Ö b 8 4 8 "³^ > .91^-155/3Vrt

Kr. 31244- hinterlegt wurde.

1-<· Darstellung von Pstl-gespaltenem, dGMP-verläng;ertem pB5322 Plasmid pBRJ22 (20 ,ug) wurde mit 21 Einheiten Pstl-Endonuclease (!IiS Port on Downs oder Hew England Biolabs) in I5O yul- 10 mM Tri-HCl (pH-Wert 7,5), 6 mM MgCl₂, 5° mM TTaCl-, 6 mM 2-Mercaptoäthanol,. 200 mg//ul Binders er umalbumin ("BSA") (Calbiochem) digeriert. Nach 2 h bei 37 ⁰G wurde das Gemisch mit" 1 VoI Phenol-Chloroform (1:1) und.1 VoI Ither extrahiert und mit Äthanol ausgefällt. .

Die Zugabe von homopolymeren dGMP-Schweifen (Fig. 1) durch Terminal-Desoxynucleotid-Transferase (TdT) (gereinigt nach P.J. Bollum "Deoxynucleotide Polymerizing Enzymes Irom Calf Thyraus Gland" (Desoxynucleotid-Polymerisierungs-Enzyme von' Kalbs-Thymusdrüse) in Methods in Enzymology, (L. Grossmann und K. Mpldave, Herausg.), Academic Press, New York, 128, S. 59I - 611 (1968)) erfolgte in einem Beaktionsvolumen von 328 /Ul, das 100 mM Hatriumcacodylat (pH-Wert 7»2), 10 mM IMaH₂PO^, 5 mM MgCl₂, 1 mM dGTP, 50 /ug/yul^SA und 3 bis 6'Einheiten TdT (wie oben gereinigt) je /Ug DTTA enthielt. Die Inkubation dauerte 20 min bei 37 ⁰C EDTA wurde zu 10 mM gegeben und das Gemisch wie oben extrahiert und 2 Tage lang gegen TITE-Puffer dialysiert.

2. Darstellung von dCPM-verlängerter DWA Döppelsträngige DlTA wurae mit dCMP-Residuen nach Standardverfahren verlängert (z.B. Villa-Komaroff, u.a., supra). I5O ng der oben beschriebenen doppelsträngigencDilA wurden in 8 /Ul 100 mM latriumcacodylat (pH-Y/ert 7,2), 2,5 mM CoCl₂, 5OyUgAuI BSA, 0,1 mM dCTP, das 3 bis 6 Einheiten gereinigtes TdT ^e / WA enthielt, 8 min lang bei 27 ⁰C inkubiert und dann bei -2O ⁰C einsefrorea. .Wie vorher handelt es sich' bei äe>v dCMP-

226884

verlängerten DWA um ein Geraisch verschiedener Spezies, von denen nur sehr wenige IFTT-ν er wan dt sind (Fig. 1).

3. Darstellung; von mit Oa⁺* behandelten. E. coll X1776 Eine einzige* Kolonie von E. coli X1776 wurde in 100 ml Tryptonmedium (G. Weissmann und W. Boll, "Seduction Of Possible Hazari In The Preparation Of Recombinant Plasmid DTTA" (Verminderung möglicher Gefahren bei der Herstellung von Rekombinant-Plasmid-DNA), Wat ure, 261, S. 428 - 429 (1976), ergänzt durch 100 yug/ml Diaminopimelinsäure (Koch-Light Laboratories), 10 /ug/ml Kalidixinsäure (Calbiochem) und 10 ,ug/ml Tetrac^cli (Achromycin, American Cyanamid) inokuliert..Die Kultur wurde bei 37 C' bis zu einer scheinbaren optischen Dichte von 0,6 bei 65O nm (OD^cq) (gemessen mit. einem Beckman Spektrophotömeter DB) gezüchtet und 3O min lang in Eis abgeschreckt. Die Kultur wurde anschließend mit 4000 U/min in einem ausschwingenden Sorvall-Rotor H4 sedimentiert, die Zellen wurden mit 50 ml· 10 mirTTaCl gewaschen, durch Zentrifugieren repelletisier und in 20 ml 100 mM CaCIp resuspendiert. Die Suspension wurde 30 min lang in Eis gekühlt, durch Zentrifugieren pelletisiert und in 4 ml 100 m¥ CaCl₂ resuspendiert und für den Gebrauch . über Wacht auf Eis aufbewahrt. E. coli HB101 wurden für die Transformationen nach der Methode von M. Mandel und A. Higa "Calcium Dependent Bacteriophage DTTA Infection" (CaIciunabhängige Bakteriophagen-DTTA-Infekt ion), J. Mol. Bi öl., 53, S. - 162 (I97O) hergestellt. Aliquoten (0,5-ml) wurden bei -70 ⁰C gefroren gehalten und behielten ihre Aktivität mindestens 3 Monate.

4. Verstärken von dGHP-verlängertem. pB5322 und dCMP-verlänger t er DTTA

PatI-crfiST>a"l t(=>rii=>n ηΉΕ'}?? und

tj Ό 4 ö '""

der· geschweiften cDNA erfolgte nach der Beschreibung von J. Van den Berg,·u.a., "Comparison Of Cloned Babbit And Mouse /3-Globin Genes Showing Strong Evolutionary Divergence Of Two Homologous Pairs Of Introns" (Vergleich von geclonten Ratten- und Mäuse-/^~ Globingenen, die starke evolutionäre Divergenz zweier homologer Intronpaare zeigen), Fature,' 276, S. 37 44 (1978). 8 ng des dCMP-verlängerten DM-Produktes wurden mit 22 ng dGMP-verlängertem, Pst!-gespaltenem ρΒί?322 in 50 /Ul TlCE-Pu ff er gemischt. Die Inkubation erfolgte für 4 aufeinanderfolgende 1-h-Stufen bei 65 ^PC, 46 ⁰O, 37 ⁰C und 20 ⁰C.

Ss wurden 20.^uI 100 mlvT Tri-HCl, (pH-Wert 7,5), 100 mM 100^mM MgCl₂ und 50 ,ul TFS-Puffer zugesetzt, und das Gemisch wurde 20 min lang auf Sis. gekühlt.

Das Produkt ist natürlich ein umfassendes Gemisch von verschiedenen Eekombinant-DM-Molelcülen und einigen Cloningve.hikeln ohne eingefügte DFΑ-Sequenzen. Jedes E ekotnb in an t -DM-Molekül enthält jedoch ein cDHA-Segment an der Pstl-Stelle. Jedes derartige cDITA-Segment kann ein Gen oder ein Fragment davon- aufweisen. Wur sehr wenige der cDlIA-Segmente kodieren für' IFN oder einen Teil davon (Fig. 1). Die größere Mehrheit kodiert für eines der anderen Proteine oder Teile davon, deren mRNAn ein Teil der für den erfindungsgemäßen Prozeß verwendeten PoIy(A)-DITA waren (Fig. 1). ' 5· Transfektion von E. coli X1776 mit den verstärkten Hybrid- ' plasmiden

Die Transfektion von· S. coli X1776 mit dem Gemisch von Bekom- binant-DTTA-^olekülen- erfolgte nach der Beschreibung von J. Van den Berg, u.a., supra, P3-Behältereinrichtungen wurden für den Transfektionsprozeß und alle anschließenden Schritte verwendet^ in denen die resultierenden ti¹ an sf or mi er te η Bakte-

I ΙΌÖ Ö4 Ö

rien behandelt wurden. Die verstärkten pBR322-Bekombinant-DlTA-Mo lekiile wurden zu 100 ,ul Ga⁺⁺-behandelten E.coli X1776, die zuvor zubereitet worden waren, gegeben, und das Gemisch wurde 20 min in Eis gekühlt., 10 min lang auf 20 ⁰C gehalten, und 0,6 ml Trypton-Medium wurden zugesetzt. Das Gemisch wurde auf 2 wie oben vorbereiteten Tryptonmedium-Agarplatten verteilt. Der Wirkungsgrad der Transfektion betrug 3,3- x 1° Kolonien je /Ug verstärkte pBS322-Transfektions-DlTA; ursprüngliches pER322 ergab 3 χ 10⁶ Kolonien je yug.

Da Plasmid pBH322 das Gen für Tetracyclin-Resistehz enthält, vermehren sich Έ?. coli Wirte, die mit einem Plasmid, dessen Gen intakt ist, transformiert wurden, in Kulturen, die dieses Antibiotikum enthalten, mit Ausnahme derjenigen Bakterien, die nicht auf diese Weise transformiert worden sind. Daher ermöglicht die Vermehrung in einer Tetracyclin enthaltenden Kultur die Selektion von Wirten, die mit einem Rekombinant· DM-Molekül oder einem rezyklisierten Vektor transformiert wurden. . · . . ·

Nach 48 h bei 37 C wurden einzelne Kulturen entnommen und in 100 ,ul Tryptonmedium (vorbereitet wie oben) in den Vertiefungen von Mikrotiterplatten (Dynatech) suspendiert. Fach Inkubation bei 37 ⁰C über Nacht wurden 100 ,ul Glycerin in jede Vertiefung eingemischt. Die Platten wurden bei -20 C aufbewahrt, und es wurde eine Sammlung von 100 000 einzelnen Clonen transformierter "E. coli XI776 zusammengestellt. ; Diese 100 000 Clone enthalten eine Vielzahl.von Hekombinant-DlTA-Molekülen, die vollständige- oder teilweise Kopien des Gemische von mRlTAn in dem PoIy(A)-KITA-Präparat von IPIT-erzeugenden Leukozyten sind (Pig. 2). Die Mehrzahl von ihnen wird nur ein einziges ßekombinant-D^A-Molekül enthalten. Hur

sehr wenige dieser Rekorabinant-DKA.-Moleküle sind IFN verwandt. Daher müssen die Clone einem Screeningprozeß unterzogen werden, um die IFM-yerwandten Clone von den anderen zu trennen. Screeningprozeß für einen HuIRl?-^ cDNA enthaltenden Clon.

Es gibt verschiedene Möglichkeiten für das Screening von Bakterienclonen, die Humanleukozyten-Interferon-cDM enthalten (¹¹HuIFlT-OdCDlSrA"). Diese umfassen beispielsweise- RlJA-Se Ie ktions-Hybridisierung (Alwine, u.a., infra), Differentialhyhridisierung (T.P. St. John .und B.W. Davis, "Isolation Of Galactose-Inducible DIA-Sequencei Irοm Saccharomyces Cerevisiae By Differential Plaque Filter Hybridisation" (Isolierung von durch Galaktose induzierbaren DNA-Sequenzen von Saccharomyces Cerevisiae durch Differential-Plaque-Filterhybridisierung), Cell, '16, S. 443 - 4-52 (1979); Hoeijmakers, u.a. infra), Hybridisierung mit einer synthetischen Sonde (B. Noyes, u.a., "Detection And Partial !Sequence Analysis Of Gastrin mRTTA By Using An üligodeoxynucleotid Probe"' (Nachweis und Partial-Sequenz-Analyse-von Magen-mR.liA unter Anwendung einer Oligodesoxynucleotid-Sonde), Proc. Watl. Acad. Sei. USA, 76, S. 177P 1774 (1979)) oder Screening hinsichtlich von Clonen, die das verlangte Protein erzeugen, durch immunologische (L. Villa-Komaroff, u.a., supra) oder biologische (A.C.Y. Chang, u.a., _supra) Analysen. Tüs wurde die EKA-Selektions-Hybridisierung gewählt, da sie die zweckmäßigste-und erfolgreichste Methode für Primärscreening von Clonen ist, die IFTT-^ cDlTA enthalten. &* R^A-Selektipns-Hybridisierungs-Analyse 1. Übersicht über die Initialanalyse;

. In Fig. 2 ist zu sehen, daß Rekombinant-DKA von einer Kultur eines ü-emischs von 512 Clonen aus der oben genannten Sammlung von Clonen (zwei Gemische von 2 in Fig. 2 gezeigten

mJ t

Clonen) isoliert wurde (Schritt A). Der Grund für die Wahl dieser Chargengröße wird anschließend erklärt. Die Rekombirant-DNA-Moleküle wurden gespalten, denaturiert und zu leukozyten-PoIy(A)-RiTA hybridisiert, die IFH-^mPJTA enthielt, die '-wie zuvor hergestellt worden war (Schritt 3). Alle Rekombi-· nant~DNA-Molekül~Poly(A)-RHA~Hybriden wurden von der nicht hybridisierten PoIy(A)-RWA getrennt (Schritt C). Die PoIy(A)-BUA wurde von den Hybriden zurückgewonnen und gereinigt (Schritt D). Die gewonnene RM wurde hinsichtlich IFTT-^mRFFA-Aktivität wie oben analysiert (Schritt E). Wenn, und nur dann, wenn das Gemisch von Rekombinant-DTTA-Molekülen ein Rekombi-· nant-DITA-Molekül enthält, das eine eingefügte ITucleotid-Se-

. quenζ aufweist, die in der PoIy(A)-RTTA unter harten Hybrid!-' sierungsbedingungen zu IFlT-mRiTA hybridisieren kann, wird die von diesem Hybrid freigesetzte iriRTTA die Bildung von IFTT-/j< in Oocyten herbeiführen, da von einem beliebigen anderen Rekombinant-DHA-Molekül-Poly(A)-R17A-Hybrid freigesetzte mSTTA nicht IFiT-p< verwandt ist.. Wenn eine Gruppe von 5-12 Clonen eine positive Reaktion ergaben, wurden die Clone zu 8 Gruppen von 64 zusammengefaßt, und jede Gruppe wurde wie zuvor analysiert. Dieser Prozeß wurde fortgesetzt, bis ein einziger dieser Analyse entsprechender Clon identifiziert war.

Es gibt keine Gewähr, daß die Rekombinant-DHA-Moleküle und der damit transformierte Bakterienclon, die auf diese Weise identifiziert wurden, die vollständige IFTT-^ cDITA-Sequenz ν IFN- ^ enthalten oder gar,daß die DNA-Sequenz tatsächlich für IFF- c< kodiert. Die Rekombinant-DJTA-Moleküle werden jedoch vermutlich ausgedehnte TJucleotid-Sequenzen enthalten, die komplementär in bezug auf die IFH-oi.mRTTA-Kodierungsse-' quenz sind. Daher 'kann das Rekombinant-DTTA-Molekül zumin-

dest als Quelle für eine Sonde zum raschen Screening anderer Rekombinant-DHA-Moleküle und mit ihnen transformierter Clone verwendet werden, um weitere Gruppen von Clonen zu identifizieren, die eine authentische und vollständige IFlT- ^-ITucleotid-Kodierungssequenz enthalten können. 2. Theoretische Überlegungen . ' ·

Die Bedingungen für die Hybridisierung (Schritt B) sind kritisch. Die absoluten Konzentrationen und das Verhältnis von Rekombinant-BNA-Molekül und PoIy(A)-RTJA müssen so gewählt werden, daß dabei die Reaktionsgeschwindigkeit und die Stöchiometrie Berücksichtigung finden. Die richtige Wahl ist schwer zu treffen, da der Anteil von" IFlT- KmRIlA in der PoIy(A)-RNA nicht bekannt ist. Zur Sicherung von gesteuerter und entsprechender Kinetik wurde die Hybridisierung'unter Bedingungen vorgenommen, bei denen die Konzentration von DlTA-Sequenzen von den Rekombinant-DTTA-Molekülen-höher lag als die geschätzte IM- & mRITA-Konzentration.. In einem Gemisch von 512 möglichen verschiedenen Rekombinant-DlTA-Molekülen wird eine IFlT- ti verwandte DiTA-Sequenz ("IFTT-^R-DlTA") entweder nicht vorkommen (das ergibt eine negative Analyse).oder sie wird höchstens etwa 1/512 der Rekombinant-DM-Moleküle ausmachen. Die Konzentration des Rekombinant-DlTA-Molekül-Gemischs und daher die Konzentration der IFF-^R-DlTA, wenn vorhanden, kann daher bei dem Hybridisierungsschritt eingestellt werden, damit ausreichende Hybridisierungsgeschwindigkeiten gewährleistet sind. Darüber hinaus raoß die Menge der IFlT-- <*R-DNA in dem Reaktionsgemisch· so aasreichend sein, daß genügend IFTT-cx' mRHA von der PoIy(A)-RlTA gebunden wird, um den Nachweis von IFW-£^ nach der Injektion in Oocyten der mRllA.*, die aus dem Beko.mbinant-DlTA-Molekül-Pbly(A)-RlTA-Hybrid gewonnen wurde, ·

Ö ö 4 8 '^Hi" ' ..yi4-i55Ai/rt

Für den Nachweis von I FIT-^ mit Hilfe der bekannten Analysen sollte seine Konzentration 100 IU/ml oder mehr betragen. Da 0,5-ml-Aliquoten für Wiedex'holungsbestimmungen gebraucht werden, sollten $0 IU in den Qocyten erzeugt werden. Die zuvor verwendete, von induzierten Leukozyten erzeugte PoIy(A)-NA erzeugt bei der Injektion von 1 /Ug in Oocyten etwa 50° IU Daher muß mindestens 0,1 ,ug PoIy(A)-RUA injiziert werden, damit die benötigten 5^ IU erzeugt werden. Modellversuche mit Kaninchen-Globin-mRNA und Kaninchen-/^ -Globin-cDNA-Clonen,

• 1?5 haben ergeben, daß die Gesamtgewinnung von ^I-Globin-mRKA in der Oocyte im Vergleich zu der dem Hybrid.isierungsgemisch zugesetzten ^I-Globin-mRNA etwa 10 % betrug und die Gewinnung von mRNA-Aktivität etwa 5 %· Daher sollten mindestens ' 0,1/0,05 = 2 /Ug Leukozyten-PoIy(A)-RWA für die Hybridisierungsanalyse verwendet werden. Zur Einhaltung einer adäquaten Sicherheitsgrenze wurden 12 /Ug PoIy(A)-BKA je Analyse verwendet. '

Zur Berechnung, wieviel DTTA von den Rekombinänt-DKA-Molekülen zur Bindung der ·IiFiT-* mRTTA in 12 /Ug PoIy(A)-RTfA gebraucht wird, wurde der iFTT-cx: mRTTA-Gehalt von PoIy(A)-RNA ermittelt. Ein /Ug PoIy(A)-RNA erzeugt 5OO IU IF. Die spezifische Aktivität von IFN-^ liegt z?/ischen 2 χ 10⁸ bis 10⁹ IU/mg Protein. 5°0 IU von IFN- ^ entsprechen daher zwischen 5OO/2 χ 10⁸ = 2,5 χ 1O*"⁶ mg· (2,5 rig) und 5OO/IO⁹ = 5 χ lO^mg (0,5 ng) Interferon.

Die Beziehung zwischen der in eine Oocyte injizierten Menge ;IFTT-^ raRNA und der erzeugten Menge IFN-^ ist unbekannt. Im Falle von /3-Globin-mRNA werden etwa 30 Moleküle Protein je Molekül mRTTA je Stunde erzeugt; dieser Wert beträgt für /t -Globin etwa 6 (J.B. Gurdon. u.a... "Message Stabil!tv In

Injected Frog Oocytes: long Life Of Mammalian And Messages" (Informationsstabilität in injizierten Frosch-Oocyten: Länge lebensdauer von Säugetier-.und /3-Globin-Informatlonen), J. Mol. Biol., 80, S. 539 -551 (1973)). Hiramt man ' einen durchschnittlichen Wert von 20 für IPH-pt , eine relat-ive Molekülmasse von 18 000 für IFlT-^ und eine relative Molekülmasse von 33O 000 für IFlT-eC mR ITA an, dann müßten 26 mg (18 OOO/33O 000 χ 20 χ 24) IPI-*. in 24 Stunden je mg injizierte IFH-ixniRftTA erzeugt werden. Wenn die spezifische Aktivität von LBW-* 2 χ 10⁸/mg (2 χ 10? IU/ng) beträgt, dann wird 1 ng IFlT-^mRITA 26 χ 2 χ 10² = 5,2 χ 10⁵ IU IFN-od ergeben. Wäre die spezifische Aktivität lOVmg (10^ IU/ng), dann betrüge die erzeugte Menge IPN-^ 2,6 χ 10 IU. Da 1 /Ug L.eukozyten-Poly( A)-RlTA unter -den oben angenommenen Bedingungen 5OO IU Tm-oL ergibt, würde die Konzentration von IFTT-od.mRM in 1 /Ug PoIy(A)-RHA zwischen 0,1 ng und 0,02 ng betragen_;und der'Anteil von IFET-^mRHA in Leukozyten-Poly(A)-RWA würde zwischen 1:10. 000.und 1:50 000 liegen. Daher enthalten 12 /Ug PoIy(A)-RlTA etwa 1,2 ng bis 0,2 ng' IETT-^mRFA.

Sollte das Translationsverhältnis der IFE-pcmRNA in den Ooc.yten um eine Größenordnung niedriger sein als der Durchschnitt für Globin-mRHA, dann würde der IPlT-,/mRIA-GehaIt der PoIy(A)-RITA das Zehnfache des oben berechneten betragen oder 'zwischen 1:1 000 bis 1:5 ⁰⁰° liegen. Und 12 /Ug PoIy(A)-RlTA würden dann 12 ng bis 2 ng IPlT-cKmRIA enthalten. Sollte das Translationsverhältnis der IPlT-^mRNA in den Oocyten dagegen um eine Größenordnung höher sein als "der Durchschnitt für Globin-mRHA, dann läge der IFET-pi ihRHA-Gehalt der PoIy(A)-RlTA um das 10-fache niedriger als oben berechnet, oder er würde zwischen etwa 1:100 000 und .1:500000. liegen, und 12* /Ug

2 26.8 b A . ö _t -«- r :--

PoIy(A)-ETTA würden dann 0,1 ng bis 0,02 ng IFIT-^mBTTA enthalten.

Plasmid pBR3>22 hat 4361 b.p. (Basenpaare). Die vollständige - cDHA von IFTT- ^ mETTA würde etwa 800 bis 1000 b.p. zu pBR;522 bei der Bildung von pBS322-IFTT-o^ cDTTÄ bis zu einer · Gesamtmenge von etwa 5200 bis 5400 b.p. addieren. Seine relative Molekülmasse würde somit etwa das 12-fache (2·χ 5200/800) gegenüber der von IFTT-^mBTTA alleine betragen. Um die IFF-zu binden, die nach der obigen Berechnung in den für die Analyse gebrauchten 12 /Ug PoIy(A)-ETTA- vorhanden sein muß', wird daher eine Menge von Bekombinant-DTTA-Wolekülen gebraucht, die gleich der 12-fachen Menge der IFTT-^mBTTA ist (stöchiometrische Menge). . .

Da der IFTT-\cwRTTA-Gehalt der zur "Herstellung der Rekombinant-DITA-Moleküle verwendeten PoIy(A)-DTTA gegenüber der von roher PoIy(A)-BITA um das 10-bis 40-fache erhöht worden war, müßte die Gruppe der 512 Clone 10-bis 40mal mehr Clone, die die verlangte.'IFIT-^ mBTTA enthalten, haben als oben berechnet wurde.

" Wenn IFTT-^mETTA 1 Teil in 1000 der rohen PoIy(A)-ETTA ist, dann enthalten 12 /Ug PoIy(A)-BTTA 12 ng IFTT-^mRTTA, und die stöchiometrische Menge von IFTT-^ cDTTA-Plasmid beträgt dann 144 ng. Da eine Gruppe von 5^2 Clonen mindestens 5 wit IFTT-oCcDHA-Inserts enthalten wird·, beträgt die erforderliche Menge an gesamter Hybridpiasnrid-DTTA 14,8 /Ug (144 χ 512/5 χ 10"⁵). Wenn IFTT-^mENA 1 Teil in'10 000 ist, dann enthalten 12 /Ug PoIy(A)-ETTA 1,2 ng IFTT-<xmBTTA,' und die erforderliche Menge IFTT- κcDTTA-Plasmid- ist dann'14,4 ng. Sine Gruppe von 512 Clonen wird 0 oder 1 IFIT-^cDTTA-Insert enthalten, so daß die erforderliche 'Menge an gesamter Hybridplasmid-DTTA 7,4

(14,4 χ 512 χ 1O~⁵) beträgt. Wenn IFW- κifiIA 1 Teil in ' 100 000 ist, dann ist die erforderliche Menge an gesamter Hybridplasmid-DTTA 0,74 /ug (1,44 χ 512 χ 10"⁵). Um sicherzustellen, daß die Hybridisierungsreaktion anter.Bedingungen mit DTTA-Überschuß (d.h. Überschuß von Rekombinant-DTTA im Verhältnis zu PoIy(A)-BKA) abläuft, wurden-20 ,ug des Gemische (etwa ein 1,4 bis 30-facher Überschuß) für die Analyse gewählt. ' . ·

Die Hybridisierung muß unter Bedingungen durchgeführt werden, die garantieren, (a) daß der hybridisierte Teil von PoIy(A)-RlTA intakt und in einer biologisch aktiven Form zurückgewonnen wird, (b) daß die nicht-spezifische BTTA-mRT-TA-Assoziation verhindert wird, und (c) daß die Hybridisierungsreaktion bis zu einer Vollständigkeit von mindestens 75 % erfolgt. Diese Bedingungen können vermutlich am besten durch Hybridisierung in 80 % Formamid, 0,4 M TTaCl (J. Casey und H. Davidson, "Rates Of Formation And Thermal Stability Of REA: DlTA And DNAtDTTA Duplexes At High Concentrations Of !Or-

. mamide" (Bildungsgeschwindigkeiten und Wärmebeständigkeit von RTTAtDTTA und DNA:DTTA Duplexen bei hohen Konzentrationen von

. Formamid), Nucleic Acids Res., 4, S. 1539 - 1552 (1977)) erreicht werden. In dieser Lösung kann die Hybridisierung bei etwa 40 C durchgeführt werden (und es sind nicht die 60 bis ' 70 ⁰C erforderlich, wie wenn auf Formamid verzichtet wird). Niedrigere-Temperaturen werden bevorzugt, um eine Schädigung der PoIy(A)-RTTA möglichst gering zu halten. Bs wurde eine Hybridisier ungstemperatur von 56 .C-im vorliegenden Fall gewählt. Diese liegt etwa 3 unter der T^y₂- (J. Casey und TT. Davidson, supra) und etwa 10 - 13⁰ unter t /., (Hamaguchi & Geidusfrek, J. Amer. Chem. Soc, 84, S. 1329). Bei dieser

2Zü ö ö

rt ι jiji -tv¹/

Temperatur dürfte daher die Hybridisierung von Sequenzen mit weniger als etwa-8? % Homologie nicht möglich sein, da eine Abweichung von .1 % die --η/ρ- um 1 senkt (T.F. Bonner, u.a., "Seduction In The Bate Of DNA Reassociation By Sequenze Divergence " (Verringerung der. Geschwindigkeit der RHA-Reassoziierung durch Sequenz-Divergenz), J. Mol. Biol., 81, S. 123 - 135 (1973)).

Bei der vorliegenden Hybridisierung ist die Selbst-Hybridisierung von DNA-fein ernsthaftes Problem, da das Gemisch der verwendeten DlTAn aus dem gleichen Vektor (pBR322) und den verschiedensten -cDNA-Inserts besteht. Daher .wird es sich bei den meisten DHA-Sequenzen um Heteroduplexe handeln, in denen die Inserts zur Hybridisierung zu PoIy(A)-RHA zur Verfugung stehen. Wegen topologischer Begrenzungen ist es 'sehr unwahrscheinlich, daß komplementäre cDHA-Inserts, die Teil verschiedener Duplexe sind, sich gegenseitig beeinflussen. Auf jeden Fall wird die DTTA: DHA-Re as soziier ung unter den angewandten. Reaktionsbedingungen auf ein Mindestmaß beschränkt (J·. Casey und N. Davidson, supra).

Zur Bestimmung der für eine mindestens 75 %ige Reaktion erforderlichen Hybridisierungszeit wurde eine Geschwindigkeitsgleichung zweiter Ordnung herangezogeni

Co-- So + Ro (1 - Λ

(1 - JL) Co

t=- - : 22 = 3.9 h

k_R (Co - Ro)

worin bedeuten: · ·

- R = Molare Wucleotid-Konzentration von hybridisierter I Co = Molare Nucleotid-Konzentration von zu hybridisieren - der Anfangs-DNA ... '·'·.

L O Ο ö 4 ö "^Yör * 914155/Wrt

Eo = Molare. Fucleotid-Konzentration von zu hybridisierender Anfangs-S F A

kg = Geschwindigkeitskonstante für die ETTA-DTT A-Hybri disierung " . . .

t = Zeit (s)

und JL- =0,75 (75 % vollständige Eeaktion) ο k_R = 472 (kg = 1/12 k_d (J. Cäsey und H. Davidson,, supra)

worin bedeuten: .· ...

k, = Geschwindigkeitskonstante zweiter Ordnung für DI¹TA unter den gewählten Hybridisierungsbedingungen und' k_d = 1,7 x 10⁵ χ L^1/2 χ TT""¹ (J.E. Hutton und

J.G. Wetmur, "Eenaturation Of Bacteriophage $ ' X174 DTTA-B TTA-Hyb rid: ETTA Length Effect And TTucleation Bate Constant" (Eenaturierung von Bakteriophage (9X174 DTTA-ETTA-Hybrid: BMA-Längeneffekt und Geschwindigkeitskonstante der TTucleation), J. Mol. Biol., 77, S. 495 - 500 (I973)). L= 9OO (Kettenlänge in b.p.j etwa 9OO sind in

dem vollen 15¹TT-C^ cDTTA-Insert vorhanden) TT = 9OO (Komplexität von b.p. der Hybridkette;

hier beträgt die Komplexität 900, da sich die 9OO Nucleotide der. IFTT-^triRTTA mit den komplementären 9OO Nucleotiden des IPTT- ^ cDTTA-Inserts

verknüpfen).

—7

Co = 2,5 x 10 ' (Auf der Basis einer 40 yul Lösung, die die zuvor bestimmten 20 /ug der für die Analyse zu verwendenden Eekombinant-DNA-Moleküle enthält, wieder unter der Voraussetzung, daß der IFTT~ cDTJA-Insert 1/12 eines Hekombinant-DiTA-Moleküles

2 Zb B b 4

ist und in mindestens 1 der 512 Clone vorkommen wird, und Zuordnung von 662 als durchschnittliche relative Molekülmasse eines DIMA-Basenpaares) · .

So = 8,7 x 1.0 (Auf der Basis einer 40 /ul Lösung, die die zuvor bestimmten 12 /Ug der für die Analyse zu verwendenden PoIy(A)-RNA enthält, wieder unter der Annahme, daß die PoIy(A)-RM 1:10 000. Teile IFlM- ^mRΈΑ enthält (den großen Überschuß von DTTA vorausgesetzt, wird ein anderer Anteil we-, nig Einfluß auf die Hybridisierungsgeschwindigkeit haben), und Zuordnung von 34-3 als durchschnittliche relative Molekülmasse eines Ribo-' nucleotide von RiIA) 3· Ausführung der Initialanalyse

Schritt A - Herstellung; und Spaltung des Reko.mbinant-DITA-Molekül-Gemischs ' .

Die verlangte Anzahl von Bakterienclonen wurde auf wie oben vorbereitete Tryptonmedium-Agarplatten inokuliert, indem auf sie eine Aliquote von jeder Mikrotiterquelle mit Hilfe eines mechanischen Gerätes übertragen wurde. Fach einer Inkubation bei 37 C hatte jeder Clon zu einer Kolonie von einigen mm Durchmesser geführt. Alle Kolonien wurden von den Platten abgewaschen und vereinigt und ergaben ein Inokulum, das zum Inokulieren von 1 1 wie oben vorbereitetem Tryptonmedium in einem 2-1-Erlenmeyerkolben verwendet wurde. Die Kultur wurde bei 37 C bis zu einer scheinbaren OD^cq von·etwa 0,8 (visuell beurteilt) geschüttelt. Ein Volumen vorbereitetes Tryptonmedium und Chloramphenicol bis 170 /Ug/ml wurden zu der Kultur gegeben, die weitere 16 Stunden lang bei 37 ⁰C c-^hü

226 88 4

Es wurden 20 ml Chloroform zugesetzt, and die Kultur wurde' erneut 10 min lang bei 37 ⁰C geschüttelt, um die Bakterien zu töten (C. Weissmann und W. Boll, supra). Die Kultur wurde von dem Chloroform dekantiert, und die Zellen v/urden durch Zentrifugieren (Sorvall Rotor GS3) von 15 min Dauer mit 6000 U/min und bei 4 ⁰C geerntet. Je.1 Liter Präparat wurden etwa 1 bis 2 g Zellen gewonnen. Die Zellen wurden in 3O ml 20 mM Tri-HCl (pH-Wert 7,5) suspendiert, 20 min lang mit 5OOO U/min und bei 4.⁰C zentrifugiert (Sorvall-SW-Rotor) und in 30 ml 50 mM Tri-HCl (pH-Wert 7,5) resuspendiert. Es wurden 0,25 VoI-Lysozym-Iiösung (10 mg/ml in-50 mM Tri-HCl (pH-. Wert 7j5)) zugegeben, und nach dem Kühlen über einen Zeitraum von 10 min bei 0 ⁰C wurden 0,33 VoI (auf der Basis des YoI. der ur-sprünglichen 50 mM Tri-HCl-Kultur-Stispension) 0,5 M EDTA (pH-Wert 8,0) vorsichtig ohne Schütteln eingemischt; !fach weiteren 10 min bei 0 C wurde 1/16 VoI (wieder auf der Basis des ursprünglichen Volumens) 2.%iges Triton'X-100 zugesetzt. Fach 60 min wurde die Probe 60 min läng mit 10 000 U/min bei 0 C in einem Sorvall-SW-Eotor zentrifugiert. Das Obenstehende wurde in ein Becherglas mit einem Magnetrührwerk übertragen, und es wurde 3 M FaOH unter Rühren zugegeben, bis bei 20 ⁰C ein pH-Wert von 12,5 erreicht war, wozu eine Glaselektrode und ein pH-Wertmesser von Orion Research, Modell 601, der mit Beckman-pH-10-Carbonatpuffer-Standard (TTr. 35O5) standardisiert worden war, verwendet wurden. Fach 10 min Rühren bei 20 C wurde der pH-Wert auf .8,5 eingestellt. Fach weiterem dreiminütigem Rühren wurden 1/9 VoI 5 M FaCl und 1 VoI Phenol (destilliert und mit 9,5 M F_aCi äquilibriert) zugegeben, und das kräftige Rühren wurde 5 min lang fortgesetzt. Die Phasen wurden durch 10 m±O dauerndes Zentrifugieren (GSA

-US-

Rotor).mit 10 000 U/rain und bei 0 ⁰C getrennt. Das Obenste-' biende, das Form-1-I)TTA (zirkuläre doppelsträngige DITA) enthielt, 'wurde vorsichtig von der Zwischenphase (die einsträngige-DNA enthält) entfernt und dreimal mit Chloroform extrahiert. (Phenol muß' bei diesen] Schritt weitgebend entfernt sein). Die Forra-I-DNA-Fraktion wird diejenigen Rekombinant-DNA-Moleküle enthalten (pBR322-cDHA.-Insert), die ursprünglich zum Transformieren derjenigen Wirtszellen verwendet wurden, die einen Teil der für die Analyse gewählten 5^2 Clone bilden.

Pankreas-RNAase A (5 mg/ml, vorgewärmt 10 min lang bei 85 ⁰C) wurde zu Form-1-DN^-A bis zu einer Konzentration von 20 /Ug/ml gegeben und das Gemisch 60 min lang bei 37 C inkubiert. Es wurde 1/5 VoI 5 M HaCl zugesetzt, und das Gemisch wurde mit 3° %igem Polyäthylenglycol 6000 (Union Carbide,

20 min lang bei 120 C autoklavenbehandelt) auf eine Endkonzentration von 7,5 % PEG eingestellt. Nach 2 bis 16 h bei -10⁰C wurde das Präzipitat in einem Sorvall-SlV-Hotor in 20 min mit 8000 U/min und bei 0 ⁰C gesammelt, in 0,0-75 M NaCl, 0,0075 M Natriumeitrat bis zu einem Absorptionsvermögen von •20 bei 260 nm gelöst und auf 0,5 % SDS eingestellt. Die Lösung wurde 30 min lang bei 37 C mit 0,5 mg/ml Pronase (selbstdigeriert bei 20 mg/ml, 2 h bei 37 ⁰C) inkubiert und dreimal mit 1 VoI destilliertem Phenol und zweimal mit 1 YoI Chloroform extrahiert. Die Probe (bis zu 2 ml einer 1 mg/ml DNA-Iösung) wurde durch einen 5. bis 23 %igen Saccharosegradienten in 50 mM Tri-HCl (pH-Wert 7,5Ϊ_Χ 1 mM SDTA 15 h lang mit

21 000 U/min und bei 15 C unter Verwendung eines Seckman-Hotors SW 27 zentrifugiert. Es -wurden Fraktionen gesammelt, und die ODp^₀ wurde verfolgt. DNA-haltige Fraktionen wurden zusammengenommen, und die DNA wurde mit Batriumacetat und

V V·

Äthanol ausgefällt. 20 bis 100 /ug des Form-I-Dl\^TA,~Gemischs' wurden durch Zentrifugieren zurückgewonnen.

Zwanzig /Ug gereinigte For m-I-DNA Wurden in I5O /Ul 10 mM Tri-HCl (pH-Wert 7,5)₅ .6 mM MgCl₂, 5O mM NaCl, 6 mM 2-Mercaptoäthanol, 200 ,ug/ml BSA oder Gelatine und 20 Einheiten HindIII (Hew England Biolabs) digeriert, Das Hindlll-·. Restriktionsenzym spaltet die Forra-I-DTTA an einer Stelle innerhalb der p3H322-Eomponente. (Es' ist unwahrscheinlich, daß die cDITA-Komponente auch gespalten wird, wenn es a.ber der Fall 1st, -würde die Analyse nicht wesentlich dadurch beeinflußt werden). Nach 2 h bei 37 °C wurde eine Aliquote (1 %) mit Hilfe der Elektrophorese durch ein 1 %iges Agarosegel in 50 inM Triacetat (pH-Wert 7,8), 2 mM EDTA 1 h lang bei 5° oA analysiert, um festzustellen, ob die Digestion vollständig erfolgte. War die Digestion nicht vollständig, wurde mehr Hindlll zugesetzt und die Inkubation 2 h lang weitergeführt. Wenn die Form—I-D^A vollständig zu. linearen Molekülen-umgewandelt worden war, wurden Ironase (Calbiochem), EDTA und SDS bis 0,5 mg/ml, 10 mM bzw. 0,5 % zugegeben·. Fach 3>0 min bei 37 ⁰C wurde die Lösung mit 30 yUl Phenol-Chloroform (1:1) extrahiert. Die organische Phase wurde mit 5O ,ul 20 mM Tri-HCl (pH-Wert 7.,5), 1 mM EDTA gewaschen, und die zusammengenommenen wäßrigen Phasen, wurden dreimal mit A'ther extrahiert, durch eine 0,1-ml-Chelex-Säule filtriert,, in einem in EDTA gekochten Pyrex-Glas gesammelt und mit 1/10 YoI 3 M iTatriumacetat und 2,5 VoI Äthanol ausgefällt. Fach Abstehen über Facht bei f-20 C wurde die DiTA'durch Zentrifugieren gesammelt. Schritt 3 - Hybridisier uns der DTTA mit PoIy(A)-RFA

Es wurden zwei Hybridisierungsgemische hergestellt. -Gemisch I enthielt 4 .ul 10-fach konsentriei-ten Kybridisierungs-

puffer (4 M NaOl), 0,1 PIMJjS (pH-Wert 6,4, 1,4-Piperazindiäthansulfonsäure, Sigma), 5° mM EDTA, 0,5 ,ul (etwa 5 ng

-^I-Globin-mRNA (5OOO cpm) -und 6 /Ul induzierte Leukozyten-PoIy(A)-RTTA (2 /Ug/,ul), eine Menge, .die ausreichte, um 6000 IU M¹I¹I bei der Injektion in Oocyten zu erzeugen. Gemisch II enthielt 10 ,ug der Hindlll-digerierten Form-I-DM von oben und 0,1 ,ug Pstl-digeriertes Z-pBR322(H3)/Ec/tf G-4,13 (ein pBH322-Derivat, das die /?-Globinsequenz in der Hindlll-Stelle enthält) (Mantei, u.a., "Rabbit /?-globin mRTTA Production In Mouse L Gelles Transformed With Cloned Babbit '/ί-globin Chromosomal DITA" (Kaninchen-/^ -Globin-mSTTA-Srzeugung in mit geclonter Kanincheny^ -Globin-Chromosomen-DNA transforrmierten Mäuse-L-Zellen), TTature, 281, S. 40 - 46 (1979)). Die ¹²⁵I-GlObin-mRWA in Gemisch I und die /?-Globin-DHA in Gemisch II dienen als interne positive Kontrollen für die Hybridisier ungsanalyse. Beide Gemische wurden in einem Stickst off gasstrom getrocknet. 40 ,\xl 80 %iges Formamid wurden zu dem Rückstand von Gemisch II gegeben, und die Lösung wurde 10 min lang bei 100 ⁰C denaturiert und rasch in Eis abgeschreckt. Die denaturierte Lösung wurde zum Lösen des Rückstandes von Gemisch I verwendet, und die resultierende Lösung wurde 4 h lang bei 56 C.inkubiert

Schritt C - Abtrennung von hybridisierter PoIy(A)-RM-DM von nicht hybridisierter PoIy(A)-RHA. .

lach der Verdünnung auf 1 ml mit kaltem 0,9 M ITaCl,

. 0,09 M Hatriumcitrat und Formamid (100 %±g) zu 4 Vo1% wurde die Lösung mit' 0,5 ml/min durch ein 'Ultrafilter (Porengröße 0,45 /um) filtriert, wobei das Filter vorher auf seine Fähigkeit hin, RNA-DTL4-Hybriden zurückzuhalten, geprüft worden war, da nicht alle vom Hersteller bezogenen Filter gleich wirksam

7 h RK L H -SJL-

Schritt D - Reinigung ,von hybridisierter

Das obige Filter mit daran haftenden Poly(A)-RIlA-Hybriden wurde 10 min lang in 1 ml 0,15. M HaCl, 0,015 ^v Natrium-, citrat, 0,5 %-SDS bei 37 ⁰G getaucht, mit 50 mM Tri-HCl ; (pH-Wert 7,5.), 10 mM MgCl₂, 2 mM CaCl₂ gespült und in 0,6 ml frischen Puffer gegeben, Nach der Zugabe von 5 /ul mit Jodacetat behandelter DWAase (5 mg/ml) (S.B. Zimmermann und G. Sandeen, Anal. Biochem, 14, S. 269 (1966); P.A. Price,, u.a. "Alkylation Of A Histidine Residue At The Active Site Of Bovine Pancreatic Deoxyribonuclease" (Alkylierung eines Histiäinrückstandes an der aktiven Stelle von Eind.er-Pankreas-Desoxyribonuclease), J. Biol. Chern., 244, S. 924 - 932 (19.69)). wurde das Filter 10 min lang bei 37. C. inkubiert.

Das Filter wurde entfernt und die Lösung mit 1 VoI Phenol und 1 Vol..A'ther extrahiert und durch eine 0,1-ml-Chelex-Säule geleitet. 5 /Ug Träger-RNA (gereinigte Hefe-R SFA) wurden au der Lösung gegeben, und die RM wurde mit TTatriumacetat und Äthanol ausgefällt. Das Präzipitat wurde durch Zentrifugieren mit 10 000 xg gesammelt, in 100 ,ul 1 mM EDTA gelöst, 90 s lang auf 100 ⁰C gehalten, und es wurden TiTE und SDS zu 2 χ TKS und 0,5 % SDS zugegeben. Die RNA wurde..auf einer. 100-yul Säule von Oligo(dT)-Cellulose adsorbiert, durch vier Waschen mit 0,3 ml destilliertem Wasser eluiert und rait ITatriumacetat und Äthanol ausgefällt. TTach 16 h bei -20. ⁰C wurde die ausgefällte RiTA durch Zentrifugieren abgetrennt und in 2 /Ul TFK-Puffer gelöst

Schritt S - Bestimmung der ΓΡΪΓ-^mRTfA-Aktivität

Die Poly(A)-SM-Lösung von oben wurde in 40 Oocyten injiziert (etwa 5O nl ge Oocyte). Die Oocyten wurden 24 bis 48 Stunden-lang bei 23 ⁰C inkubiert, homogenisiert und

zentrifugiert (oder das Inkubationsmedium wurde zurückgewonnen) und,wie oben für IFN-^ beschrieben,analysiert. 4. Anschließende Analyse - Hybridisierung: zu filter-gebunden er

Die meisten anschließenden Analysen eines Rekombinant-DNA-Moleküls von einem einzigen Clon wurden mit an DBM- oder DPT-Papier gebundener DHA durchgeführt, da die Analysenbedingungen nicht mehr kritisch waren und die Analyse zweckmäßiger ist.' DPT-Papier ergab niedrigere Hintergrundwerte und vmrde vorzugsweise verwendet. DBM-Papier wurde nach Beschreibung hergestellt (J.C. Alwine, u.a., "Method For Detection Of Specific RMs In. Agarose Gels By Transfer To Diazobenzyl Osymethyl-Paper And Hybridization With DIA Probes" (Methode zum" Nachweis' spezifischer RNAn in Agarosegels durch übertragung auf Diazobenzyloxymethyl-Papier und Hybridisierung mit DHA-Sonden), Proc. Hatl. Acad. Sei. USA, 14, S. 5350 - 5354 (1977)) APT-Papier wurde nach einer Verfahrens?/eise von B. Seed (Persönliche Veröffentlichung) hergestellt: Bogen von Whatman--Papier 540 (2O g) wurden 16 h lang bei 20 ⁰C mit einem Gemisch von 70 ml 0,5 M HaOH, 2 mg/ml UaBH₄ und 30 ml 1,4-Butandioldiglycidyläther bewegt. Das Papier wurde anschließend in eine lösung von 10 ml 2-Aminothiophenol in 40 ml Aceton übertragen und 10 h lang bewegt. Das Papier wurde gründlich mit Aceton, 0,1 Έ HCl,.H₃O, 0,1 Έ HCl, H₃O gewaschen und getrocknei AHO-Papier wurde zu DPT-Papier diazotiert, wie es für die Umwandlung von ABM-zu DBM-Papier beschrieben wird'(Alwine, u.a., supra). ·

DiTA (bis zu 15 /^g) wurde an 5O mm diatoziertes ABM-(DBM-) oder diazotiertes APT- (DFT-) Papier gebunden, wie von J-H.J. Hoeirimakßrs. u.a. "The Isolation Of Plasmid Containing:

DNA Complementary To Messenger ENA For Variant Surface Glycoproteins Of Trypanosoma Brucei" (Die Isolierung von Plasmidenj die zu Messenger-RNA komplementäre DTTA enthalten, für Variant-Oberflächen-Glycoproteine von Trypanosoma Brucei), Gene, im Druck, 19S0) beschrieben, und anschließend erläutert wird.

Hybrid-Plasmid-DNA wurde mit Endonuclease-Pstl digeriert, mit 5OO yug Pronase je ml, 0,5 % SDS, und 10 mM BDTA 30 rain lang bei 37 ⁰C behandelt, mit Phenol und Äther extrahiert, durch eine 0,1-ml-Chelex-Säule geleitet und mit Äthanol ausgefällt. Die hitse-denaturierte DNA (bis zu 5 /U-g» mit einer geringen Menge von * P-DNA, zugesetzt als Tracer) .wurde über Nacht bei 0 ⁰C mit 1 cm² DBM- oder DPT-Papier in 200 yul 25 mM Kaliumphosphatpuffer (pH-Wert 6,5) inkubiert. Die Filter wurden . dreimal 5 min lang bei Raumtemperatur mit 5° 'mM Kaliumphosphatpuffer (pH-Wert 6,5)} 1 %igem Glycin und dreimal mit 99 f°igern rekristallisiertem Formamid gewaschen.· Auf eine weitere Inkubationszeit van 2 min mit 99 %igem Formamid 'bei 68 ⁰C. folgten drei Wäschen in 5>0 P^M Kaliumphosphatpuffer (pH-Wert 6,5) bei 20 ⁰C-und zwei Y/äschen von 10 min in 0,4 M NaOH bei 37 ⁰C. Etwa 40 bis 60 % der Radioaktivität blieb auf den Filtern erhalten. Die Filter wurden 3h lang bei 38 ⁰C in'Vor-Hybridisierungsmedium A, das durch 1 %iges Glycin ergänzt worden war, wobei 330 yul je Filter verwendet 7mrden, inkubiert. Medium A enthält 5O % Formamid, 5 χ SSC, 0,04 % Polyvinylpyrrolidon, 0,04 % Ficol (Pharmacia). 0,1 % SDS, 25 yUg PoIy(A) (P & L) und 100 ,ug Hefe-RNA-(BDH, sechsmal mit Phenol extrahiert und aus Äthanol.ausgefällt).· Die Filter wurden zweimal in Medium A ge.waschen und anschließend 16 h lang bei 38 ⁰C mit PoIy(A)-RNA,wie angegeben,(gewöhnlich 5 bis 8 /Ug) in*Medium A unter Paraffihöl hybridisiert. Die RNA wurde wie folgt zugegeben:

22 b 8 b 4 ΰ "⁵⁵~

914155/55/rt

Ein nasses DNA-Filter wurde abgetupft und in eine sterile Petri-Schale gelegt, 20 bis 4-0 ,ul der ENA-Lösung wurden auf dieses Filter pipettiert, und ein aweites Filter (entweder - ein Duplikat oder eine Kontrolle) wurde oben darauf gelegt, und dieses Gebilde wurde mit einem sterilen Paraffinö'l be- · deckt. ITach der Hybridisierung wurden die Filter nacheinander in Medium A (zweimal), in einer Lösung, die 1 χ SSC, 0,2 % SDS, 1mM ED¹TA enthielt (jje dreimal 10 min lang bei 20 ⁰C), Medium A (2 h lang bei 58 ⁰C) und in 5O %igem Formamid, .5 χ SSC,0,1 % SDS (dreimal 10 min lang bei 20 ⁰C) gewaschen. Hybridisierte RT¹TA wurde durch einminütiges Halten bei 100 ⁰C in 200 ^uI 10 raM Tri-HCl (pH-Wert 7,4), 1 mM EDTA und 0,1 % SDS eluiert. Der Eluierungsschritt wurde zweimal wiederholt, die Eluate' wurden zusammengenommen, und die RIA wurde mit Äthanol nach der Zugabe von 2 yug Hefe-RITA (wie oben beschrieben gereinigt) ausgefällt. Das gewaschene Pellet wurde im Vakuum getrocknet, in 3 /ul H^O gelöst und in Oocyten injiziert. Die IFW- tf-Aktivität wurde -wie oben beurteilt

5· Ergebnisse der RFA-Selektions-H^bridisierungs-Analyse

Die Analysen von 8 Gruppen von 512 Clonen.(d.h, der Gruppen T, Y, *j, K, ., 0, C und Tt ) waren negativ. Die Analysen von 4 Gruppen von 512 Clone η (d.h. der Gruppen I, (f , Ti'und Λ waren positiv, wenn auch nicht ständig. Die positiven Analysen werden in der folgenden Form wiedergegeben: IU/ml von IFÜT-^, erzeugt von der von Poly(A)-RTTA-DNA-Hybrdd freigesetzten RHA (Analyse der Kontroilhybridisierung unter Verwendung von Z-pBR222(H3)/Rc/£ G-4',13, supra); die Analysen, in denen die Versuchsergebnisse höher als die Hintergrundkontrolle sind, sind unterbewertet.

914155/56/rt

Gruppe ·

• I " < 60 (<60); 110

+ 35 (<35) S 20 (<

^ 110 (^110); 200 ( λ <60 ( <60); 60- (< 20); <11Ο(<11Ο); <M10 (< 110)

Gruppe λ wurde in 8 Untergruppen von 64 Clonen unterteilt und wie vorher hybridisiert und analysiert. Die Untergruppen führ ten zu folgenden, in der gleichen Form wie oben wiedergegebenen Ergebnissen:

Untergruppe lU/ml .

A-I 4 35 (<35); <35 ( <35)

λ.- II 1J2 C^ 30) S ^45 ( <·45)

λ -III 22^ (.^35); 2S C ^30); 2SCO°)i §00 (<T30);

λ	- IV.	<	35	(	<35)
Λ	- ν	<	35	(	Ο5>
λ	- VI		35	(	<35)
λ	-· VII	<	35	(	<35)
Λ	- VIII		(	<35)

( <25)

Untergruppe Λ-ΙΙΙ wurde in 8 Posten von 8 Clonen unterteilt und hybridisiert und analysiert; Posten . . IU/ml

Λ- III-1 . ^20(^20).; < 20 (60); ^ ( <r" ^O) Λ-ΙΙΙ-2 . £35 (;O5).I. OO .(<30); 150 (<20);.600

(^35); HO (60) .

Λ-ΙΙΙ-3 ' <^·25 ( <25)ί <30 ( <30)

λ - III-4 i2 ( <30); <20 ( < 2Q); < 20 (60)

λ- ΙΠ-5 30(?) (<35); < 20 (<20); <135 (60)

λ -. Ill-6 " ^30 ( c 30); < 20 (<2θ)

26 8 8 4 8 -^Sf- ' 914155/5V/rt

Λ ~ Hl-7 . £ 30 ( ^ 20)

λ— Ii 1-8 ^30 ( c20)

Da das erste positive Ergebnis bei dem Posten λ.-HI-4 erzielt wurde, wurden die einzelnen Kolonien dieses Postens (bezeichnet A bis H) hybridisiert und analysiert: a_- III-4-B <^35^X ( ^35); ^20.(60)

λ - III-4-0 35 (60.)j 60^x ( C35); 111* (<\11); 11^X (

20 ( <20) (^x Bei dieser Analyse wurde die DBM-Papier-Methode, angewandt)

Somit -enthält Clon Λ-ΙΙΙ-4-C ein Rekombinant-DNA-Molekül, das IFlT- oC irtRNA hybridisieren kann.

Das Rekombinant-DNA-Molekül in diesem Clon wird mit Z_TpBR322(Pst)/HcIF-4C ("Hif-40"·) bezeichnet und der es enthaltende Bakterienstamm als: Ξ. coil. X1776 (Z-pBK322(Pst)/HcIF 4°) ("E. coli Hif-4C"). Diese Nomenklatur besagt, daß das Sekombinant-DHTA-Molekül aus Zürich (Z) stammt und das Plasmid pBR322 ist, das an der Pstl-Stelle eine HIFF-KcDEA (¹¹HcIF") enthält; das betreffende Rekorabinant-DFA-Molekül ist dabei von Clon A-HW-C abgeleitet ("4C"). Reclonin.g; und Charakterisierung von Z-p3R322(Pst)/HcIF-4C

Da Primärclone von transformierten Zellen gelegentlich mehr als eine Spezies von Rekombinant-DMA-Molekül enthalten (Efstratiadis, u.a., "The Primary Structure Of Rabbit /2-globin iriRiTA As Determined From Cloned DNA" (Die Primär struktur von Kaninchen-^?-Globin-mRNA nach der Bestimmung von geclonter DNA), Cell, 10, S. 571 - 585 (1?77)), wurde Hif-4C von Ξ. coli XI776 (Hif-4C)-Clonen isoliert und wie oben beschrieben gereinigt. Proben von Hif-4C und p3Rj522 wurden mit Pstl digeriert und mit Hilfe der Elektrophorese auf einem 1 %igen Agarosesel analysiert. Hif-4C R

der Mobilität von Pst-gespaltenem pBB322, das andere mit einer etwa 320 b.p. entsprechenden Mobilität.

"35. coli HB101 WUrUe₇WIe- oben beschrieben_/mit der isolierten Hif-4C transformiert. Sechs Clone von tetracyclin-resistenten transformierten Bakterien wurden gewählt, kleine Kulturen hergestellt, und Form-T-DTTA wurde gereinigt und mit Hilfe von Pstl-Spaltung und Agarosege!-Elektrophorese wie oben analysiert. Alle Proben zeigten Spaltungsmuster, die mit Hif—'+C identisch waren. Eines dieser reclonten Hekombinant-DM-Moleküle wurden als Z-pBR322(Pst)/HcIF-4C ("Hif-4c") bezeichnet und für weitere Versuche verv/endet. Das "c" in. Kleinschrift bezeichnet -ein reclontes DMA-Molekül.

Zur-Bestimmung der Fähigkeit von Hif-4c und seines cDNA-Inserts, zu IFK-^mRKA zu hybridisieren, wurde Hif-4c (115 /Ug) bis zur Vollständigkeit mit 125 Einheiten von Pstl digeriert, mit Phenol' und Chloroform extrahiert und mit 'Äthanol_;wie oben beschrieben-,ausgefällt. Eine Aliquote (10 /Ug) wurde 5'-terminal markiert (um als Tracer bei nachfolgenden Schritten dienen zu können), indem sie in 100 ,ul 50, mM Tri-HCl (pH-Wert 7,5) gelöst, durch eine 0,1-ml-Chelex-IOO-Säule geleitet und 1 h lang bei 65 ⁰C mit 0,6 Einheiten alkalischer Bakterienphosphatase behandelt wurde. Zehnfach konzentriertes TNS (40 /Ul) wurde zugesetzt und die Lösung dreimal mit .1 VoI Phenol und dreimal mit 1 VoI Chloroform extrahiert. Die DlTA wurde mit 2 VoI Äthanol bei -20 ⁰C über Nacht ausgefällt und durch Zentrifugieren gesammelt. Zur weiteren Reinigung wurde die Probe in 0,5 ml TIA auf .0,25 ml DEAE-Cellulose (Whatman, DE52, vorgewaschen mit 2 ml I5O iaM NaCl, 5O mM Tri-HCl ·(pH-Wert 7,5), 2.mM EDTA) ("BST-Puffer ¹O adsorbiert, mit 2 ml TTET-Puffer gewaschen, mit 0,4 ml 1,5 M MGl., 20 mM

Tri-HCl (pH-Wert 7,5), 2 mM.EDTA eluiert und wie oben mit Äthanol ausgefällt. Die D-M wurde mit f-$ ²P-ATP (Spezifische Aktivität etwa 5OOO Ci/mMol) und .Polynucleotidkinase (A.M. Maxam und.W. Gilbert, "A New .Method For Sequencing DHA" (Eine neue Methode zur Sequenzierung von DUA), Proc. Hatl. ' Acad. Sei. USA, 74, S. 56O - 564 (1977)) inkubiert und durch Chromatographie auf einer 3-ml-Säule von Sephadex-G5° in TEE gereinigt. Me eluierten Fraktionen wurden zusammengenommen und die * P-DNA mit Äthanol wie oben ausgefällt; Ausbeute et-

wa 10' dpm.

Die unmarkierte Pstl-gespaltene Hif-4c-DNA (90 /Ug) wurde mit 6 χ 10-⁵ dpm der obigen ^ P-markierten, Pstl-gespaltenen Hif-4c-DTTA vermischt und durch ein 2 %iges horizontales Agarosegel von 10 χ 20 χ 0,7 'cm in 5O mM Triacetatpuffer (pH-Wert 7,8) unter Anwendung eines 2,5-cm-Sehlitzes der "Slektrophorese unterzogen. Ein Röntgenfilm wurde auf das Gel gebracht und die Positron des 320-bp-Pragmentes bestimmt. Der das radioaktive Band enthaltende Gelstreifen (1,3 χ 10 dpm)' wurde herausgeschnitten, durch Auspressen aus einer 2-ml-Plastspritze zerkleinert und über Nacht bei 4 0 durch Rühren mit einer dem zehnfachen Gelvolumen entsprechenden Menge von iHST-Puffer extrahiert. Die DHA wurde auf einer 0,1-ml-Hydroxyapatit-Säule (vorgewaschen mit 1 ml ITET-Puf if er) adsorbiert. Die Säule wurde mit 1 ml 0,1 M Kaliumphosphatpuffer (pH-Wert 7,5) gewaschen' und die ΏΈΑ mit 0,2 ml 1 M Kaliumphosphatpuffer '(pH-Wert 7_t3) eluiert. Das Eluat wurde mit sterilem destilliertem Wasser sehnfach verdünnt und die DFA auf DEAE adsorbiert und daraus eluiert und wie oben beschrieben mit Äthanol ausgefällt. Diese D^A wird als "Hiff4c-Fragment" bezeichnet. Das Hif-4c-Fragment (120 ng) wurde.wie oben beschrieben, an

914155/Wrt

i ·

DPT-Papier (0,5 χ 0,5 cm) gebunden. Als Kontrolle wurden 120 ng'/i-Globin-cDlTA-Fragment mit HindIII von dem Hybridplasmid Z-pBH322(H3)Rc/^G-4,13 ausgeschnitten (F. Meyer, u.a., "Transposition Of AT~linked, Cloned DiTA !rom One Vector To Another" (Transposition von AT-verknüpfter, geclonter DFA von einem Vektor" zu einem anderen), Experimentia, 35» S. 972 (1979)» W. Mantei, u.a., supra) und in ähnlicher Form behandelt. Die Hybridisierung von Duplikatfilter-n zu PoIy(A)-KlA (in 20 /Ul), das Waschen der Filter und die Rück gewinnung von RT-TA aus den Filtern erfolgten nach obiger Beschreibung, liach der Injektion in Oocyten kannten folgende IFH-^-Aktivitäten ermittelt werden:

Menge von Hybridisie-Leukozyten- rungszeit PoIy(A)-BM⁺ '

DNA-Fr agment

IFH-^-Aktivitat (IU/ral) (Duplikat -Analyse)

Hif-4c

2,5 2,5 7,5 7,5

16 h 16 ti 16 h 16 h

5 h

250; 100

. 4; 1 3000; 1000

· 4; 3O 100Oj 1000 10; 1

HiM-c -^-Globin-cDHA

Hif-4c . 7^

/*-Globin-cDlTA 7,5

+ "I /Ug dieser ΒΪΤΑ ergab 4600 IU/ml ++ Oocyten-Obenstehendes nach 48 h Inkubation, analysiert durch Reduktion des cytopathischen Effektes (W.E. Stewart,

II und S.E. Sulkin, supra)

Somit erhält Hif-4c einen Insert, der zu IFTC-^mRiTA hybridisieren kann. ' ·

2 20 00 4

Identifizierung; von Glonen von E. coli, die zu dem Insert in Hif-4c kreuzhybridisierende Rekombinant-D'NA-Moleküle enthalten

Da der cDJJA-Insert in dem Bekombinant-DNA-Molekül Hif-4c ,nur etwa 3,20 b«p. hatte oder ein Drittel der geschätzten Größe von IFN-κnßNA aufwies, wurde das oben beschriebene gereinigte Hif-4c-Pragment als Sonde für die Auswahl, von Bakterienclonen, die Bekombinant-DHA-Moleküle mit verwandten Hybrid-DNA-Inserts, enthalten, verwendet (Pig. 3)«

Die die oben beschriebene Untergruppe λ -IH bildenden 64 Bakterienclone wurden auf eine Ultrafilter-Membran (8 cm Durchmesser) .aufgetragen, auf eine Agarplatte (mit Diamino- . pimelinsäure, Nalidixinsäure und Tetracyclin wie oben vorbereitet) gelegt und 24 h lang bei 37 ⁰C inkubiert. Das Filter wurde auf einen 0,75-ral-Tröpfen von 0,5 M TTaOH gelegt und nach 2 bis 3 min auf ein Papierhandtuch zur Entfernung von überschüssiger Flüssigkeit übertragen; der-Schritt ?/urde wiederholt.. Das Filter wurde unter Anwendung von 1'M Tri-HCl (pH-Wert 7,5) neutralisiert, mit 1,5 M TTaCl - 0,5 m Tri-HCl (pH-Wert 7,4) in einer ähnlichen Weise wie oben gewaschen und luftgetrocknet. Das Filter wurde in 0,3 M NaCl eingetaucht, luftgetrocknet und 2 h lang unter Vakuum auf 80 C gehalten.

Hif-4c Pst-Fragment (30 ng) wurde durch' Einschnitttranslation ^²P-markiert (A.J. Jeffreys und K.A. Flavell, "The Babbit /£-Globin Gene Contains A Large Insert In The Coding Sequence" (Das Kaninchen-/f-Globin-Gen enthält einen großen Insert in der Kodierungssequenz), Cell, 12, ^s· 1097 - 1108 (1977)), wobei /<*-³²P. dATP und ^ -³²P dCTP (spezifische Aktivität je 40 Ci/mMol) verwendet wurden. Das die. Λ-IH-Eolonien tragende Filter wurde in 4 χ SET (SET ist 0,15* M TTaCl, 30.mM Tri-HCl (pH-Wert 8,0), 1 mM 3DTA), · 0;1 % (Masse/Vol) Ficoll.

0,1 % Polyvinylpyrrolidin, 0,1 Masse%/Vol BSA, 0,5 % SDS und 200 /ug/ml denaturierter, fragmentierter Lachssamen-DNA 7 h

ο 5

lang bei 68 C vorhybridisiert und.mit 2 χ iO^y cpm von ^²P-markiertem Hif-4c-Fragment in 4 ζ SET, 0,02 Masse%/Vol Ficoll, 0,02 % Polyvinylpyrrolidin, 0,02 Masse%/Vol BSA, 0,5 % SDS und 200 ,ug/ml denaturierter und fragmentierter Lachssamen-DlTA 16 h lang bei 68 ⁰C hybridisiert. Das Filter wurde bei Raumtemperatur mit SET - 0,5 %-SDS gespült, mit 2 χ SET - 0,5 % SDS 5 k lang bei 68 0 gewaschen, wobei die Lösung einmal erneuert wurde, sowie mit 3 inM Trizma-Base 4 h lang bei Raumtemperatur gewaschen, wobei die Lösung einmal erneuert ¥/urde. Nach dem Trocknen des Filters wurde ein Röntgenfilm auf dem Filter 80 h lang unter.Verwendung eines Schirmes belichtet. Drei Kolonien ergaben eine starke positive Reaktion, und zwar λ-ΙΙΙ-7Β, λ-ΙΙΙ-2Η und λ-III-4c, und zwei Kolonien eine schwache, und zwar λ-ΙΙΙ-ΐΕ, A-IIT-3D.

Es wurden kleine Kulturen von den Hif-4c-verwandten Clo~ nen gebildet, ForTn-I-DTTA wurde gereinigt, mit Pstl gespalten und mit Hilfe der Agarosegel-llektrophorese wie oben beschrieben analysiert. Alle Form-I-DWAn ergaben ein großes Fragment (Plasmid pBR322-Kompcnente) und ein kleines (Hybridinsert). Das Rekombinant-Dl'A-Molekül von λ-ΙΙΙ-2Η gab den größten Insert frei, und zwar etwa 900 b.p. Dieses R e ko mb in ant-D^TA-Mo Iekül wurde als Z-pBR322(Pst)/HcIF-2H (»Hif-2H«) bezeichnet und sein Insert als ⁿHif-2H-Fragraent^M.

Hif-2H wurde auf seine Fähigkeit hin getestet, IFTT- öcmSTTA zu binden, indem es nach obiger Beschreibung an DPT-Papier (4 /tig/100 mm²) gebunden und sd PoIy(A)-SFA (.0,3 /Ug//Ul) 16 h lang hybridisiert und die IFN- t<:mRTU-Aktivität bestimmt wurde: - · .

X L U-U U H U^ -V^" W" 9Wfe/63/rt ;

DM-Probe . IFN- *-Aktivität (IU/ml)⁺

Hif-2H '· 25O + 5O (Mittelwert von 4- Bestim- -_:

mungen).

Z~pBR322(H3)/Rc/G-4-,13 30 (Mittelwert von 2 Bestimmungen.) pBR322 20

+ Durch Reduzierung des cytophatisehen, Effektes analysiert. Hif-2H wurde wie für Hif-4-c beschrieben recloned und als Hif-2h bezeichnet.

In einem weiteren Versuch wurde eine zusätzliche Gruppe von Έ. coli Clonen, die Rekombinant-DITA-Moleküle enthielten, vorbereitet,' und zu dem markierten Hif-4-c-Fragment hybridisierende Kolonien wurden identifiziert. Um eine hohe Ausbeute von Plasmiden mit langen cDNA-Inserts zu garantieren, wurde ein Teil der doppelsträngigen ^ P-markieTten LeukozytencDHA, die enzymatisch von Leukozyten-Poly(A)-RNA hergestellt worden war (das gleiche cDHA-Präparat "wie oben beschrieben) nach der Größe' fraktioniert, indem sie durch einen Saccharosedichtegradienten zentrifugiert wurde, wobei die gleiche für das Zentrifugieren der PoIy(A)-R^A beschriebene "Verfahrensweise angewandt wurde. Die Fraktionen, die die cDTTA mit einer · Sedimentationsgeschwindigkeit, die einem 600-b.p.-DMA-Fragment oder einem größeren entspricht, enthielten, wurden zusammengenommen, und. die cDM wurd.e nach der Äthanolausfällung zurückgewonnen. Die cDNA wurde mit dCMP-Residuen verlängert, zu dGMP-verlängertera. PstI-gespaltenem -pBR322 hybridisiert, und die Hybrid-DITA wurde zur· Transformation von E. coli wie' •zuvor verwendet, nur' mif dem Unterschied, daß S. coli HB101 eingesetzt wurden. Die Bakterien wurden auf Ultrafilter mit einem Durchmesser von-8 cm verteilt, auf Tryptonmedium-Agar-(flip ΊΟ ,ηρ·/τη1 'DfltrflC-wr.iin Arrhhi «1 t;p>rt^ P-phr.inht nrtri

vermehrt, bis kleine'Kolonien erschienen. Sin Kopie-Filter wurde angefertigt, indem ein frisches feuchtes Ultrafilter auf das die.Kolonie tragende Euter gedrückt, abgezogen und mit der Oberseite nach oben auf eine. Agarplatte, die 4,4- % Glycerin enthielt, gelegt und inkubiert wurde, bis kleine Kolonien erschienen. Dieses Kolonien tragende Filter wurde mit einem weiteren Ultrafilter bedeckt, bei ~55 C-eingefroren und aufbewahrt (D. Hanahan und M. Meselson, "A Protocol For High Density Piasmid Screening" (Sin Protokoll für Plasmid-Screening hoher Dichte), September 1978, persönliche Mitteilung). Es wurden achtzehn Filter, die insgesamt etwa 5OOO Kolonien trugen, vorbereitet. Eine Kopie jedes Filters wurde für die Hybridisierung zu dem. P-markierten, Psti- ausgeschnittenen Hif-4-c-DTTA-Fragment genau nach der oben erfolgten Beschreibung verwendet. Etwa I85 positive Kolonien wurden auf einem Autoradiogramm identifiziert, auf Ultrafiltern recloned und erneut durch Hybridisierung identifiziert, 95 Clone, die am stärksten auf die Hybridisier ung reagierten, wurden als Z-pBH322(Pst)/HcIF-SH bis SN95 bezeichnet und.zu weiteren Untersuchungen verwendet.

Vorausgesetzt, daß Hif-2h die Fähigkeit hat, ein eine immunologische oder biologische.Aktivität von HuIFH aufweisendes Polypeptid zu erzeugen (infra), dann ist selbstverständlich klar, daß' dieses Hif-2h und .andere'damit verwandte DlTA-Sequenz en, z. B. Hif-4c, für diese Methode des Clon-Scr.eening und ebenso gut für andere Clone eingesetzt werden kann, die DIlA-Sequenz en enthalten, die aus der Eekombinant-DFA-Technologie, Synthese, natürlichen'Quellen oder einer Kombination davon stammen, oder für Clone, die DTTA--Sequenzen enthalten, die mit einer der obigen DIA-Sequenzen durch Mutation,

£ L D Ö

einschließlich einfacher und mehrfacher, Basensubstitutionen, .Insertionen, Inversionen oder Deletionen verwandt sind, um andere DITA-Sequenzen und Clone auszuwählen, die gleichfalls für HuIFlT kodieren, Daher lieg'en derartige DWA-Sequenzen und ihre Identifizierung auch im Rahmen der Erfindung (z. B. infra). Es ist ebenfalls selbstverständlich, daß D1?A-Ssquen~ zen,* die'durch die obigen DTTA-Sequenzen nicht ausgewählt wurden, die jedoch.infolge ihrer Anordnung von Nucleotiden bei Expression für die Polypeptide kodieren, die durch die Expression der obigen DTIA-Sequenzen kodiert wurden, auch im Rahmen der Erfindung liegen

Weitere Charakterisierung; von Hif-2h-DNA-Insert

Wie' oben beschrieben, enthält dasBekombinant-DTTA-Mole-•kül Hif-2h einen Insert von etwa 9OO b.p. und hybridisiert zu Humanleukozyten-Interferon-mRM· Es wurden die folgenden zusätzlichen Charakteristika bestimmt.

1. Hybrid-arretierte Translation

V/erin mRl^TA zu einer geclonten, komplementären cDTTA" hybridisiert wird, wird die Translation der mRWA inhibiert, doch durch .Wärmedenaturierung des Hybrids wird translatierbare mRTTA freigesetzt (B.M. Paterson, u.a., "Structural Gene Identification And Mapping By D!TA-mR?7A Hybrid-Arrested Cell-Free Translation" (Struktur-Gen-Identifizierung und Einordnung durch DNA-mRBA hybrid-arretierte zellfreie Translation), Proc. Hatl. Acad. Sei. USA, 74, S. 4370 - 4374 (1977)). 2,2 /Ug Pstl-gespaltenes Hif-2h, und als Kontrolle 2 /Ug Hindlllgespaltenes Z-pBR322(H3)/Rc/iG-4,13 ("Hc/?G") wurden in 10 ^u 80 Yol%/Yol entionisiertem Formamid - 20 mM PIPES-Puffer (pH-Wert 6,4) 10 min·lang bei 80 ⁰C denaturiert,'Die Lösung wurde in ein Eppendorf-Glas gegeben-, in das Leukozyten-

.914155/66/rt

PoIy(A)-RNA (5 /Ug), HaCl (4 /uMol) und EDTA (10 nMol) .eingefüllt worden waren. Das-Gemisch wurde unter einer Paraffinschicht' 7 b lang auf 48 ⁰G gehalten, gekühlt und mit 200 ul H₀O verdünnt. Die beiden Proben wurden in gleiche. Teile ge-

teilt, und je eine wurde JO's lang auf 100 ⁰C gehalten. Die " TIu c Ie insäur en wurden mit Äthanol ausgefällt, in 3 /Ul H₂O gelöst und in bezug auf IFF-#mRlA-Aktivität in Oöcyten wie oben analysiert.

Le-PoIy(A)- ' :

DWA RNA-Einsatz Behandlung IFTÜT-

Hif-2h (1.1 /Ug) 2,5 /Ug ' hybridisiert 400

Hif-2h (1.1 yug) 2,5 /Ug hybridisiert und

denaturiert 2000 . ·

Rc/g (1 /Ug) " 2,5 /Ug hybridisiert 3000

Ec/?G (il /Ug) 2,5 /Ug hybridisiert und

denaturiert J5000

Hif-2h (0.5 /ug) . 1 /Ug keine 2000

- . 1 /Ug keine .·' 3000

- 1 /Ug keine 2000

+ Das Oocytenmedium wurde nach 48 h mit Hilfe der Methode zur Inhibition des cytopathischen Effektes analysiert.

Daher-inhibierte Hif-2h, wenn es mit VoIy(A)-S!TA hybridisiert wurde, die Translation der IFW-p-CmRTTA in der PoIy(A)-SEA; nach Denaturierung des Hybrids war die IFK^--^mRlTA wieder translatierbar. Dieser Versuch bestätigt, daß Hif-2h Sequenzen enthält¹, die in bezug a"uf IFlT-c<mSNA komplementär sind. · '

2. Analyse durch Eestriktions-Enzym-Spaltung und Bestim- -mung von TTucleotid/Aminosäure-Sequenzen und. Restriktionskarte. Es wurden Digerierungen von Hif-2h mit verschiedenen Sestrik-

. <fL> L·-

<u ι

tionsenzyinen (New England Biolab) durchgeführt und die resultierenden Produkte mit.Hilfe der Agarosegel-Elektrophorese analysiert. Die unterstrichenen Ecagmente sind nicht jeweils, in pBR322 und Hif-2h vorhanden. Restriktionsenzym " ffcagraentgrößen

Hif-2h^T'^r PBR322

Psti EcoRI

+ 20, 1426, 3820

4361

EcoHI + BgIII EcoRI + PstI

Bspl

. 4260 ·

209, 676, 748

P1

Mb oll

921, 587, 5^0, 504, 457, 434, 2 χ 231,

+14 iragmente 200 bp

1616, 884 und andere

4361 nicht gespalten

4361 ' 748, 3611

587,540, . 504, 457* 434, 262, . 234

+14 Fragmente 200 bp

nicht ermittelt

⁺⁺ Obwohl hier intern konsistent, wird die absolute Größe dieser Fragmente am besten unter Bezugnahme auf Fig. 8-10 an-¹ ' gegeben·

⁺⁺⁺Von Sutcliffe (supra)

Außerdem wurde 5'-terminal ^v P-markiertes Pstl-gespaltenes HIf-2h mit verschiedenen Bestriktionsenzymen gespalten, und die Größen der radioaktiven Iragmente, die von dem cDHA-Insert in diesem Rekombinant-DTTA-Molekül abgeleitet wurden, wurden bestimmt:

1 ? h H H A H -«*- Y . 9i4-i55/6S/r-G

Bestriktionsenzym . f P-Fragmente .

EcoRI 676, 2Ο9

HindIII keine Spaltung

BspT ' · 799, 86

HpaII keine Spaltung

Hbal . keine Spaltung

BaraHI . . keine- Spaltung

Hinf 210, 62

BgIII . 545, 340

⁺Obwohl hier intern konsistent, wird die absolute Größe dieser Fragmente am besten unter Bezugnahme auf Fig. 8—10 angegeben. . ' -

Aus diesen Daten wurde eine Kestriktionskarte von Hif-2h angefertigt (Fig. 4-). Die Karte ist hinsichtlich der absoluten Lage der Stellen nicht endgültig und ist möglicherweise in bezug auf MboII-Stellen innerhalb des Inserts unvollständig. ITur die am dichtesten an dem Insert liegenden Stellen sind innerhalb der pBR322-Komponente angegeben. Der Pfeil gibt die Orientierung des IFlT- ^cDM-Kodierungsstranges an.

Obwohl die tatsächliche Struktur des Hif-2h~Fragmentes oder anderer Inserts in erfindungsgemäßen CTonen oder der Aminosäure-Sequenz oder Struktur der davon kodierten Polypep-.tide vom Fachmann nicht gebraucht.werden, um dia hier beschriebene und beanspruchte Erfindung zu .verwirklichen und anzuwenden, wurden die obigen Daten und die Eestriktionskarte in die ursprüngliche Anmeldung als die beste zur'Verfügung stehende Information über die Struktur des Fragmentes zum Zeitpunkt -der Sinreichung der ursprünglichen Anmeldung aufgenommen. Wie zu -erwarten war (supra, S. 9, Zeilen 27 - 29), sind die und dif? Hsstriktionskarte des Hi£~2h-Pragraentes unter

Anwendung allgemein bekannter Techniken der NucIeοtid-Sequenzierung und der Bestriktionsanalyse seitdem verbessert worden. Zum Beispiel A.M. Maxam und W. Gilbert, "A Few Method For Sequencing DHA" (Eine neue Methode zur Sequenzierung von 'DlU), PrQc. Katl. Acad. Sei. USA ₁ 74, S. 560·- 564 (1977). Plasmid-DttA wurde nach Methode B hergestellt (H.M. Wilkie, u.a. "Hybrid Plasmids Containing An Active Thymidine Kinase Gene Of Herpes Simplex Virus I" (Hybridplasmide,, die ein aktives Thymidin-Kinase-Gen von Herpes Simplex Virus I enthalten), ₍ Nucleic Acids Research, 7, S. 859 - -877 (1979)) und durch verschiedene Restriktionsenzyme im wesentlichen nach der Empfehlung des Herstellers eingeschränkt, nur daß das Binderseruraalbumxn in den Enzympuffer.n durch 200 /ug/ml Gelatine ersetzt wurde. (EcoRI war ein Geschenk von W. BoIl,.Bspl von A. Kiss, und andere Enzyme wurden von New England Biolabs bezogen).

Eingeschränkte DiTA (20 /Ug) wurde.mit Phenol extrahiert, mit Äthanol ausgefällt, in 0,05 M ¹ETi-HCl (pH-Wert 8) gelöst und über eine kleine Säule von Chelex-100 geleitet, Fragmente mit abschließenden oder 5'-überhängenden Enden wurden durch Behandlung mit 0,2 Einheiten alkalischer Kalbs-Intestinalphosphatase (Boehringer) je pMol DlA-5¹-Enden in 20O^- ,ul 0,05 M Tri-HCi (pH-Wert 8) über 60 min bei 37 ⁰C dephosphoryliert. Das Enzym wurde' durch einstündiges Halten bei 65 ⁰C inakti- ' viert. Für DNA-Fragmente mit 3'-überhängenden Enden wurde alkalische Bakterienphosphatase (Worthington) wie beschrieben henutzt (a.m. Maxam₄und W. Gilbert, supra), nur wurde eine Inkubationszeit von 3P miji bei 65 ⁰C gewählt. Die dephosphorylierte DiLi wurde durch Adsorption an DE A3-Cellulose und Eluierung daraus gereinigt (W. Muller u.a., "Site-Directed Mutagenesis ΪΈ DlU: Generation Of Point Mutations In Cloned-

B-Giobin Complementary DM At The Positions Corresponding To Amino Acids 121-123" (Stellen-gerichtete Mutagenese bei der DITA: Erzeugung von Spitzenmutationen in geclonter B-Globin-Kompletnentär-D^A an. den den Aminosäuren 121-123 entsprechenden Stellen), J. Mol. Biol._f 124-, S. 34-3 - 358 (I978))oder der Polyacrylamidge!-Elektrophorese bei Bedarf unterzogen (siehe unten). Aus einem Polyacrylamid- (oder Agarose)-Gel in 0,15 M NaCl₁ 0,05 M Tri-HCl (pH-Wert 8) zurückgewonnene Fragmente wurden auf einer 0,1~ml-Hydroxyapatit (Biorad HTP)-Säule adsörbiert, viermal mit 1 ml 0,1 M Kaliumphosphatpuffer (pH-Wert 7) gewaschen und mit 0,3 ml 1 M Kaliumphosphatpuffer (pH-Wert .· 7) eluiert. Die lösung wurde zehnfach verdünnt und die DKA auf DEAS-Cellulose adsorbiert und wie beschrieben.zurückgewonnen (W. Muller, u.a., supra). ·.'.-,

. Tfach der Ithanolpräzipitation wurde die DNA 5'-terminal mit /V-⁵²P? ATP (12 - 34- /UCi je pMol" DNA 5'-Enden) und Poly- * nucleotidkinase (!lew England Siolabs oäer P-L Biochemicals Inc.) im wesentlichen nach der Beschreibung von A.M.-Maxam und W. Gilbert, supra, markiert, nur wurde die W.k vor der Kinasereaktion nicht denaturiert. Spezifische Aktivitäten von 1 1,5 /uCi /"^%7-Phosphat je pMol DM 5'-Enden wurden gewonnen.

Zur Sequenzierung .wurden markierte Fragmente mit einem •zweiten Restriktionsenzym gespalten und die Produkte durch Elektrophorese durch ein 5 %iges Polyacrylamidgel in Triborat-EDTA-Püffer getrennt. Die verlangten Fragmente wurden von dem Gel extrahiert und gereinigt (Müller, u.a., supra). Die verschiedenen Fragmente fixe die Sequenzierung wurden wie folgt zubereitet (die Zahl gibt die nominelle Fragtnentkettenlänge in Basenpaaren an., die· markierte Stelle ist durch ein Sternchen gekennzeichnet): ' ·

(1) Spaltung, von Hif-2h mit Bspl, Isolierung von BspI-232 und BspI-BspI-94-9 durch 5-%-FOlyacrylamidgel-Elektrophorese in Loening's Puffer (U.E. Loening "The !Fraction Of High Molecular Weight Ribonucleic Acid By Polyacrylamid-Gel Electrophoneses" (Die lraktion yon Sibonucleinsäure mit hoher relativer Molekülnrasse durch Polyacrylamid-Gel-Elektrophorese), J. Biochem., S. 102 (1967));

(2) Spaltung von Hif-2h mit BspT, Markierung, Spaltung mit PstI, Isolierung von BspI⁺ -PstI-83 und Bsp ⁺ -Pst1-827;

(3) Spaltung von Hif-2h mit BgJ.II, Markierung, Spaltung mit Pstl, Isolierung von B₂IH⁺-PStI-JJG und Bgin⁺-PstI-57O;

Spaltung von Hif-2h mit Mboll, Markierung, Digerierung mit PstJ und Hindll (zur Abspaltung eines störenden 350 bp pBR322-Fragmentes), Isolierung, von Mb ο H⁺ -Ps 11 -519 und MbOlI⁺~Pst-351;

(5) Spaltung von IIif-2h mit EcoRI, Markierung, Spaltung mit Pstl, Isolierung.von ScORI⁺-Pstl-708 und ScORI⁺-PstI-198;

(G) Spaltung von Hif-2h mit Pstl, Markierung, Spaltung mit BgIII,. Isolierung von PstI⁺-BgIII-570 und PstI⁺-BgIII-336;

(7) Spaltung von Hif-2h mit Avail, Markierung, Spaltung mit Pstl und BgIII, Isolierung von AvaII⁺ -PstI-186 und

AvaII⁺-BglII-147; ·

(8) Spaltung von Hif-2h mit PyuII, Markierung, Spaltung mit Pstl und.BgIII, Isolierung von PvulI⁺ -Psti-486.

Die Fragmente v/urden .gemäß der Methode von A.M, Maxam und W. Gilbert,- supra, mit den in Protokollen, die von den gleichen Verfassern im September 1978 vorgelegt wurden, beschriebenen Modifikationen abgebaut. Die Produkte wurden auf 12 %igen Polyacrylamidgelen mit den Abmessungen 0,1 χ 25 x . (Acriylamid/iiiacrylamid = 18/1) in. 50 mM Triborat, 1 mM SDTA

(pH-Wert 8,3) in Versuchen von 2, 8, 18 und 26 h bei 900 V mit einem nachfolgenden Versuch von 6 h bei 700 V fraktioniert. Die besten Ergebnisse wurden erzielt, wenn die Gele 2 bis 3 Tage vor der Verwendung bei Raumtemperatur gehalten wurden.

Jede Dehnung des cDHA-Inserts wurde von beiden Strängen sequenziert,. und jede Restriktionsstelle, die als markierter Terminus diente, wurde unter Verwendung eines sie überspannenden Fragmentes sequenziert. Die auf diese Weise gewonnene Uucleotidsequenz ist in den Fig. 8 bis 10 wiedergegeben. Wie zu erwarten war, sind die Positionen der verschiedenen Eestriktionsstellen in diesem Insert absoluter lokalisiert als d^e durch die Kestriktionsenzymspaltung allein bestimmten und in Fig. 4- angegebenen. ' .

In den Fig. 8 bis 10 wird der heteropolymere Teil des Inserts von 23G-Residuen an dem 5^l-"^nde und durch 7 A Residuen (die wahrscheinlich den Poly(A)-Terminus der mRTTA reflektieren) gefolgt von 15C Residuen am 3'-ι'©*¹ minus flankiert. Zur Bezugnahme ist der Insert von dem ersten, dem dG-Schweif· folgenden iiucleotid bis zum letzten ]?ucleotid vor den PoIyA-Sesiduen numeriert. Ein ATG-Initiierungs-Triplett in Position 57-59 und "ein TAA-Terminations-Triplett an Position 624-626 definieren ein nicht durch ITonsens-Codons' unterbrochenes Orientierungssystem. Die beiden ' andere'n Orientierungssysteme in dieser Region des Inserts enthalten 18 bzw. 12 ITonsens-Oodons. 'Dar üb er hi na us befinden sich die einzigen anderen· »Sequenzen, d.h. in verschiedenen Orientierungssystemen, die von einem ATG oder GTG und einem Terminationssignal flankiert sind, die für ein Polypeptid von 25 Aminosäuren, oder mehr kodieren, zwischen den Nucleotiden 226 und .304,. 640 und 778 -bzw. 683 und 743.

O -U-. ι 91^/+^/l55/73/rt

Daher enthält die Segion zwischen den Nucleotiden 57 und 626 höchstwahrscheinlich die NucleotidseqUenz des Hif~2h-Irag~ mentes, die für ein Polypeptid kodiert, das eine biologische ./oder immunologische Aktivität von IFF-* gemäß der Erfindung aufweist. Man sollte sich jedoch darüber im klaren sein, daß von PoIyA-SIA mit Hilfe der üblichen Methoden geclonter cDBA (A. Efstratiadis, u.a., supra) 5~'Terminal-Nucleoti'de fehlen und sie sogar künstliche Sequenzen enthalten kann (E,I. Richard u.a., "Molecular Cloning And Sequence Analysis Of Adult Chicker B-Globin cDNA" (Molekülcloning und Sequenzanalyse von B-GlobincDNA erwachsener Kücken) Nucleic Acids Research, 7, S. 1137 1146 (1979)). Ss ist daher nicht sicher, ob das an den Fucleo-' tiden 57- 59 liegende ATG tatsächlich das erste "ATG authen-.tischer mRNA ist. Für die Zwecke der folgenden Beschreibung wird jedoch angenommen, daß das ATG an den Nucleotiden 57 ~ 59 das erste' ATG authentischer mRKA ist.

Vergleicht man das durch diese Region des Inserts kodierte Polypeptid mit jener Sequenz von 35 Amino^Terminal-Aminosäuren von authentischem Humanlymphoblastoid-Interferon .—SerAspLeuProGlnThrHisSerLeuGlyAsnArgArgAlaLeuIleLeuLeuAlaGln-MetGlyArglleSerLeuPheSerCysLeuLysAspArgHisAsp—, bestimmt von K.O. Zoon u.a., supra und M. Hun.kapiller und L. Hood, supra, so hat es den Anschein, als ob das gewählte Orientierungs-•system richtig ist und die Nucleotide 57 - 12'²I- für eine Signalsequenz kodieren können, die der für das "reife" Polypeptid kodierenden Nucleotidsequenz vorausgeht, weil die 'Übereinstimmung der veröffentlichten Sequenz mit der bestimmten Sequenz (von der 24. Aminosäure an auf?/ärts) eine ausgedehnte Koinzidenz zeigt (d.h. 26 von 35 Aminosäuren). · In eukaryotischen mSKAn ist das erste AUG-Triplett von

dem 5^f-Terminus im allgemeinen die Initiierungssteile für die Iroteinsynthese (M. Kozak, "How Do Eukaryotic Ribosomes Select Initiation Regions in Messenger RTlA" (Wie wählen eukaryotische Ribosomen Initiierungsregioneft in Messenger-RTv^TA), Cell, 1.5, S. 1109. - 1125 (1978))/Das Codon in dem Hif-2h-Eragment, das der ersten Aminosäure- von Lymphoblastoid-Interferon entspricht, ist 22 Codons vom ersten AUG (und 14 Codcns vom zweiten) entfernt, was darauf hindeutet, daß der für Interferon kodierenden Sequenz eine Sequenz vorausgehen kann₅ die ein ßignalpeptid von 23 (oder weniger wahrscheinlich 15) Aminosäuren bestimmt. Die längere der mutmaßlichen Signa.lsequenzen enthält eine ununterbrochene Serie von 11 hydrophoben Aminosäuren (und die kürzere eine von 6 hydrophoben. Aminosäuren). Die An_ Sammlung hydrophober Eesiduen ist für Signalsequenzen charakteristisch (siehe B.D. Davis und P.C. Tai, "The Mechanism Of Protein Secretion Across Membranes" (Der Mechanismus der Proteinsegregation an Membranen), Nature* 283, S. 4-33 - 4-38 (1980)).

Die offensichtlich "reifem" IFN-£-PoIypeptid entsprechende Hucleotidsequenz umfaßt 498 Nucleotide, die für 166 Aminosäuren kodieren. Angenommen, es findet keine Carboxyterminal-Umsetzung statt, dann beträgt die relative Molekülmasse von Interferon-Polypeptid 19388. Die Grundzusammensetzung der Kodierungssequenz beträgt 50 % GC. Die Codonanwendung innerhalb der Interferon-Kodierungssequenz steht in vertretbarer Übereinstimmung mit der für Säugetier-mRlAn im allgemeinen zusammengestellten (R. Grantham, u.a., "Codon Catalog. Usage And The Genome Hypothesis" (Codonkataloganwendung und die Genom-Hypothese), TTucleic Acids Research', S₃ S. 49 - 62 (1980)), Alle beobachteten Abweichungen könnte man der geringen er~ faßten Anzahl zuschreiben.

ΊΙ ö. ö b

y i'-i-i Jj/ (Ji λ <

Die Struktur des in Fig. 8-10 für das Hif-2h-Pragment gezeigten Polypeptide berücksichtigt natürlich keinerlei-Modifikationen des Polypeptide, die durch seine Wechselwirkung mit in vivo Enzymen, z.B. Glycosolation, hervorgerufen werden. Daher sollte man beachten, daß diese Struktur möglicherweise nicht mit in vivo erzeugtem IFIT- ^ übereinstimmt, daß sie jedoch sehr, ähnliche, wenn nicht identische biologisc-he und immunologische Eigenschaften hat. Diese Struktur schließt auch keineswegs die Wahrscheinlichkeit aus, daß andere Modifikationen wie Mutationen, einschließlich einfacher oder mehrfacher, Basensubstitutionen, Deletionen, Insertionen oder Inversionen oder chemische Derivatisierungen dieser Struktur nicht Verbindungen erzeugen würden, die IFiT-^-Aktivität aufweisen.

3. Bestimmung des Plus-Stranges der eingefügten IFlT- ei-cD? Der DNA-Strang, der die gleiche Sequenz wie die mRNA hat, wird als. Plus-Strang bezeichnet und sein Komplement als Minus-Strang Der- Plus-Strang des' IFN ^cDHA-Inserts wurde wie in Fig. 5 dargestellt identifiziert. Hif-2h-DFA wurde mit dem Restriktionsenzym BgJLII gespalten, die Termini mit ^ P-Phosphat markiert (wie oben für Pstl-gespaltene Termini beschrieben), und die DM mit Psti digeriert, um längere (5^5 b.p. (57° b.p. wie in der oben erläuterten verfeinerten Analyse bestimmt)) und kürzere 34-0 b.p. (336 b.p. wie in der oben erläuterten verfeinerten Analyse bestimmt) radioaktive Fragmente zu erhalten. Diese Fragmente wurden denaturiert und zu PoIy(A)-RiTA von induzierten Leukozyten in 80 %igem Formamid,-0,4 M ITaCl hybridisiert, d.h. unter Bedingungen, bei denen keine DFA-DNA-Reassoζiierung erfolgt (supra). Die Nucleinsäuren wurden mit Nuelease Sl digeriert, die alle einsträngigen Nucleinsäuren abbaut, vor alle]

die nicht-hybridisierte ^²P-DiTA, und die Produkte wurden in einem PoIyaerylamidge1 getrennt (H.F. Weaver und C. Weissmann, "Mapping Of RUA By A Modification Of The Berk-Sharp Procedure" (Kartierung von RTTA durch eine Modifizierung des Berk-Sharp-Verfahrens), Nucleic Acids Research, 7, S. 1175 - 1193 (1979)). lin Autoradiogramm zeigte, aaß> nur das kürzere ÜTucleotid-Fragment hybridisiert und durch die PoIy(A)-SiTA geschützt worden war, wobei der 5'-markierte kürzere TTucleotidstrang als der Minus-Strang identifiziert wurde. Die Orientierung des Plus-Stranges entspricht daher der Darstellung in Fig. 4 und Fig. 5 (rechte Seite).

4. Demonstration, daß PoIy(A)-RlTA von nicht-induzierten Humanleukozyten nicht zu Hif-2h-D"FÄ hybridisiert Es wurde ein dem im vorhergehenden Abschnitt beschriebenen identisches Experiment durchgeführt, jedoch stammte die PoIy(A)-HTTA von nicht-induzierten Humanleukozyten, die nach dem' gleichen Verfahren wie im Falle der Sendai-Virus-induzierten Leukozyten hergestellt worden waren. Es wurde keine nachweisbare Menge von markierter DWA geschützt. Im Vergleich mit den Ergebnissen das vorhergehenden Abschnitts enthält die PoIy(A)-HTTA von nicht-induzierten Zellen weniger als etwa 1/20 der Menge mRTTA, die zu Hif-2h hybridisierbar ist, als die von induzierten Zellen stammende PoIy(A)-RTTA. Synthese eines Polypeptids mit Interferon-Aktivität durch E. coli, das mit Z~p35322(Pst)/HcIg-4c verwandte Rekombi-'nant-D^A-Moleküle enthalt

Die Pstl-Stelle von pBR322 liegt" innerhalb des fi -Lactamase (Penicillinase)-Gens. Daher kann, wenn ein kodierendes DTTA-Segment (z.B. eine cDEA, die das gesamte oder einen Teil eines Gens enthält) in die Position in der richtigen Orien-

tierung und dem richtigen Orientierungssystera eingesetzt wird, ein verschmolzenes Protein resultieren. Das Protein würde aus dem Amino-Terminal-Anteil von /tf-Lactamase und der anschliessenden Aminosäuresequenz, für"die die eingefügte DM-Sequenz kodiert, bestehen (L. Villa-Komaroff, u.a., supra). Wenn das eingefügte DTTA-Segment eine'DNA-Sequenz, umfaßt, die ihr eingenes Initiierungssignal enthält, und eine Sequenz hat, die ihr mit einem Terminationssignal in Phase mit der /^-Lactamase-Sequenz vorausgeht, können Termination und ße-Initiierung beim zweiten Initiierungssignal erfolgen, und es kann ein nicht-verschmolzenes, aktives Protein entstehen (A.C.Y. Chang, u.a., supra). Um sicherzustellen, daß der mit Hif-4-c verwandte . DHA-Insert zur Expression innerhalb des /f-Lactamase-Gens in das richtige Orientierungs-system eingefügt wurde, wurde eine Gruppe von Derivaten von pBRj522, und zwar pKT279, pKT280 und pKT287 (hergestellt von K. Talmadge, persönliche "Veröffentlichung, 1979) verwendet. Jedes dieser Derivate weist eine Pstl-Stelle auf, die so angeordnet ist, daß ein in dieser Stelle gebundener DNA-Insert in einem anderen Orientierungssystem von einem Insert an der Pstl-Stelle der anderen Derivate der Gruppe liegen wird (Pig. 6). Daher gestattet die Gruppe die Insertion von DNA in das /f-Lactamase-Gen in allen drei Orientierungssystemen. Der Pstl-abgeschnittene Insert von Hif-2h wurde.wie für das Fragment Hif-4cbeschrieben_/hergestellt. Das Hif-2h Pst-Pragment (10 ng) würde mit Pstl-gespaltenem pBR^22, pKT279, PKT280 oder pKT287 (lO'.ng in jedem PaIl)-in 20 ^uI 10,mfÄ Tri-HCl (pH-Wert 7,5), 6 mM.MgGl₂, 100 mM HaCl, 6 mM ^-Mercaptoäthanol, 200 /Ug/ml Gelatine und 0,1 mM ATP vermischt und 16 h lang bei 10 ⁰C mit 0,1 Einheiten T^-DHA-Ligase (Hew England 'Biolabs) inkubiert. Die resultierenden

Rekombinant-DTTA-Moleküle werden als Z-pEB322(Pst)/HcIF~2h,' Z-pKT279(Pst)/HciF-2h, Z-pKT280(Pst)/HcIF-2h und Z-pKT287 (Pst)/HcIF-2h bezeichnet. E. coli H3101 wurde mit jedem dieser Sekorabinant-DM-Moleldile transformiert, und transformierte Kolonien wurden wie zuvor beschrieben auf Tetracyclin enthaltenden Agar-Platten ausgewählt. Da gegenüber Tetracyclin . resistente Clone von transformierten Bakterien auch den rezyklisierten Vektor enthalten können, wurden Bakterienkolonien von jeder Gruppe auf Ultrafiltern gezüchtet, und zu * P-markierten Hif-4c-Pragment hybridisierende Kolonien wurden wie oben'beschrieben identifiziert und ausgewählt. Diese Stämme wurden wie folgt bezeichnet:

Ξ. coli HB1O1 (Z-pBK322(Pst)/HcIP-2h-AHl) bis (-AH3); E. cöli HB1O1 (Z-pET279(Pst)/HcIF^h-AHl) bis. (-AH8); E. coli H3101 (Z-pKT280(Pst)/HclF~2h~AHl) bis (-AHS)j 3. coli HB101 (Z-pET287(Pst)/HcIP-2h-AHl) bis (~AH8)j

Extrakte -von einigen der oben genannten Stämme sowie einiger der Stämme Z-pB3322(Pst)/HcIF-STT1 bis 95 wurden auf IPlT- * ~ Aktivität hin getestet. Bakterien wurden in Trypton-Medium bis zur stationären Phase gezüchtet, geerntet, mit 1/20 YoI (be- · . zogen auf das YoI der Kultur) 50 mM Tri~HCl (pH-Tiert 8), 30 mM· TTaCl gewaschen und eingefroren. Fach dem Auftauen wurden die Zellen.wieder in dem unten angegebenen Volumen.des vorhergehenden Puffers suspendiert,, und .Lysozym ?/urde bis 1 mg/ml zugesetzt. Fach 60 min bei O ⁰C wurden die Suspensionen eingefroren (in eine"m Bad von Äthanol .und Trockeneis) und fünfmal (bei 3? ⁰G) aufgetaut und 10 min lang mit 12 000 U/min in einem Sorvall-Sotor GSA zentrifugiert. In einigen Fällen wur- de ein Teil der überstehenden Flüssigkeit (S3*0) weiter mit 100 000 XK in einem Smnco Eotor/ Typ 65, zentrifugiert, und

2-26 884 ö

\-j-jt

IFTT- (K -Aktivitä¹ (lU/ml)

die überstehenden Flüssigkeiten (SIOO) wurden zurückgewonnen. Diese Überstehenden wurden auf IFTT- <<-Aktivität hin durch eine Analyse hinsichtlich der-Reduktion des cytopathischen Effektes ausgesondert (Bsp. 1). -Die eine positive Reaktion in Beispiel 1 zeigenden Kolonien wurden erneut analysiert, sowie auch 49 Clone von der oben beschriebenen Gruppe Z-pBR-3'22/HcIF-SIT-1 bis SN-95 in einer geringeren'Verdünnung (Bsp; 2). Herkunft des Extraktes: ' · . _

E. coli HB 101, transformiert durch: Bsp. 1⁺ Präparat

Z-pBR322(Pst)/HclF-2h S3O

Z-pBR322(Pst)/HclF-2h-AH-1 bis 3 Z-pKT279(Ps,t)/HcIF-2h-AH-1 bis 7 Z-pKT279(Pst)/HcIF-2h-AH-8 Z-pKT280(Pst)/HcIF-2h-AH-2,6,7 Z-pKT280(Pst)/HclF-2h-AH-1,3,4,5 Z-pKT287(Pst)/HcIF-2h-AH-1,2,3,4,5,8 S3O

Z-pKT287(Pst)/HcIF-2h-AH-6,7 S3O

Herkunft des Extraktes: E. coli HB 101, transformiert durch:

positiv

positiv

positiv

Bsp. 2⁺* Z-pKT279/HcIF-2h-AH-8 Z-pKT280/HclF-2h-AH-1,3,4,5, Z-pKT287/HclF-2h-AH-6 und 7 Z-pBR322(Pst)/HcI]?-SM-4,5,7,9

10,11,13, bis 16

Z-pBR322(Pst)/HcIF~3I!T-18 bis 22,

24,25,27,.

Präparat S3O und SIOO S3O und SIOO S30 und SI 00

S3O

30 bis 34 S30

Z-pBR322(Pst)/HcIF-STi-38 bis 41,

. 43 bis 48

S3O

XJt) rs— oi — Akt; 1 ν 1 üa (IU/ml)

3OO 3OO 3OO

neg. ( '

neg. (^10) neg. (< 10)

2 2b ob A ö .-*" ^9W

2-pBS322(Pst)/HcIF-STT-1 bis 3,6,

8,12,17, . . _Λ

23, 26 S30 10

Z-pBB322(Pst)/HcIF-SN-28,29,36,

37,49' S30 10

Z-pBR322(Pst)/HcIF-SiT-35>2 · S3O ' 200 ' '

⁺ Bsp. 1: Bei 1:150 endgültiger Verdünnung analysierte Extrakte.

⁺⁺Bsp. 2: Bei 1:6 endgültiger Verdünnung analysierte Extrakte. Einige der aktiveren Erzeuger von oben wurden ausführlicher untersucht. Es wurden Kulturen bis zur spaten logphase ,(scheinbare ⁰DgCQ etwa 0,9)⁺ gezüchtet und die Zellen wie oben in I/5O des Kulturvolumens lysiert. Es wurden die folgenden Aktivitäten ermittelt, wobei Z-pBR322(Pst)/HclF-SK32 als negative Kontrolle verwendet wurde:

Herkunft desjtetrafctesj ' / IFN- ^-Aktivität⁺⁺

E. coll HB 101, transformiert durch; (IU/ml)

Präparat (Dupl.-Analyse)

Z-pKT279(Pst)/HcIF-2h-AH8 S3O, SIOO 100; 3OO

Z-pKT280(Pst)/HcIF-2h-AH3 S3O, SIOO 1000; 1000

Z-pKT287(Pst)/HcIF-2h-AH6 S30, SIOO 200; 200

Z-pBH322(Pst)/HclF-STT35 S3O, SIOO 1000; 1000

Z-pBR322(Pst)/HcIF-STT42 " S30, S100 3OO; 100

Z-pB5322(Pst)/HcIF-SB32 S3O, S100 0; 0

⁺ Dreitausend Liter oder größere Kulturen von IFIi- ^ können ohne Verlust von IFIT-Aktivität gezüchtet werden. ⁺⁺Es ist zu beachten, daß die oben genannte Expression die Interferon-Erzeugung durch Gene unter. Steuerung der Penicillinase-Expressions-Kontroll-Sequenz widerspiegeln kann.

Es sei vermerkt, daß das tatsächlich durch diese Stänraie erzeugte Protein strukturell nicht analysiert worden ist, um zu oh AR mi f: aninnRäiir'PTi. γΙί'ο ιπί t: TTi¹W yri r*h-k

J I⁴+ I JJJ O i/ Χ"

Signalsequenz von 'IFF erzeugt worden-ist. Jedoch welches Protein auch erzeugt wurde, es zeigt eine immunologische oder biologische Aktivität von IH¹TT. Daher wird das Protein als nützlich bezeichnet. Besonders wichtig ist es, daß die Aktivität des Proteins zeigt, daß es sich bei der dafür kodierenden DNA-Sequenz um eine mit'HuIFTT-^ verwandte DT^TA-Sequenz handelt. Es liegt daher im Bereich des Fachgebietes, die DHA-Sequenz nach der hier erfolgten Demonstration zur Wahl anderer,, gleicher HuIFTT-κ verwandter DNA-Sequenz en zu verwenden und die Grundlage für andere Konstruktionen zu schaffen, die reifes Interferon oder andere Varianten davon verwirklichen oder die Ausbeute an dem betreffenden verwirklichten Protein verbessern * . .' ' ·

Die Erzeugungsmenge eines Proteins wird durch zwei Hauptfaktoren bestimmt: Die Anzahl von Kopien seines Gens innerhalb der Zelle und den Wirkungsgrad,mit dem die Transcription und Translation dieser Genkopien erfolgt. Der Wirkungsgrad der Transcription und der Translation (die zusammen die Expression darstellen) ist seinerseits von TTucleotidsequenzen abhängig, 'die normalerweise vor der verlangten Kodierungssequenz sitzen. Diese TTucleotidsequenzen oder Expressionskontrollsequenzen definieren unter anderem die Stelle, an der BITA-Plymerase zur Initiierung der .Transcription wirksam ist (die Promotorsequenz) und an der sich Eibosomen zur Initiierung der Translation binden und mit der mRTTA (dem Transcriptionsprodukt) in Wechselwirkung treten. !licht alle derartigen Expressionskontrollsequenzen funktionieren mit dem gleichen Wirkungsgrad. Es empfiehlt sich daher, die spezifischen Kodierungssequenzen für das verlangte Protein von ihren benachbar~ ten TTucleotidsequenzen zu trennen und sie stattdessen mit

anderen bekannten Expressionskontrollsequenzen zu verschmelzen, so daß höhere Expressionsgrade möglich sind. Wenn das erfolgt ist, kann das neu gebildete DlTA-Fragment in ein MuI-- : tikopie-Plasmid oder ein Bakteriophagenderivat eingefügt, werden, um die Anzahl von Genkopien innerhalb der Zelle zu erhöhen und dadurch die Ausbeute an ausgeprägtem Protein, weiter zu verbessern. . ·

Es können verschiedene Expressionskontrollsequenzen wie oben, beschrieben verwendet werden. Diese umfassen die Operator-, Promotor- und Sibosombinde- und Wechselwirkungssequenzen (einschließlich von Sequenzen wie die Shine-Dalgarno-Sequenzen) des Lactose-Operon von E. coIi ("das Iac System"), die entsprechenden Sequenzen des Tryptophan-Synthetase-Sy-· stems von E. coli ("das tr-p System"), die Haupt operator- und -promotorregionen von Phage λ (Oj^x, u^cl ^ß^ß^» ^{öie ΚθηΪΓ}°11~ region des Phagen fd Coat-Proteins oder andere Sequenzen_} die die Expression von Genen von prokaryotischen oder eukaryotischen Zellen und deren Viren steuern. Zur Verbesserung der Erzeugung eines bestimmten Polypeptids in einem angemessenen 'Wirt, kann' das für jenes Polypeptid kodierende Gen daher wie vorher erzeugt werden und von einem dieses enthaltenden Hekombinant-DlA-IvIolekül entfernt werden und wieder in ein Eekombinant-DWA-Molekül dichter an seine frühere Expressionskontrol3_- sequenz eingesetzt oder unter die Kontrolle einer der obigen Expressionskontrollsequenzen gestellt werden. Derartige Methoden sind im Fachgebiet bekannt.

Weitere Erhöhungen der Zellausb'eute der verlangten Produkte hängen von einer Erhöhung der Anzahl von Genen ab, die in der Zelle verwendet werden können. Für Irläuterungszwecke wird das dadurch erreicht, daß in der eben beschriebenen Weise

226884

erzeugte Bekombinant-DTTA-Moleküle in die gemäßigte Bakteriöphage λ. (ITM989) eingesetzt werden, am einfachsten durch Digerieren des P'lasraids mit einem Bes.triktionsenzym, um ein lineares Moleküi zu erhalten, das dann mit einem eingeschränkten Phagen λ -Cloningvehikel (z.B. des Typs, der von I.E. Murray, u.a. beschrieben wurde "Lambdoid Phages That Simplify The Recovery Of in Vitro Becombinants" (Lambdaartige Phagen, . die die Gewinnung von in vitro Rekombinanten erleichtern), Molec, gen. Genet., I.5O, S. 53 - 61 (1977) und TT..E. Murray, u.a.,. "Molecular Cloning Of The DHA'Ligase Gene Stora Bacteriophage T4-"· (Molekülcloning des DHA-Ligase-Gens von Bakte- riophage T4), J. Mol. Biol., 132, S. "493 - 505 (1979) und dem durch Inkubation mit D17A-Ligase erzeugten Bekornbinant-DWA- . Molekül vermischt wird. Die verlangte Be.kombinant-Phage wird dann wie vorher selektiert und zur Lysogenisierung eines Wirts st amme s von "5. coli verwendet.

Besonders· nützliche A~Cloning.vehikel enthalten eine temperatur empfindliche. Mutation in dem B'epressionsgen _οΙ und suppressible Mutationen in Gen _S, deren Produkt für die Lysis der Wirtszelle wichtig ist, und Gen E, dessen Produkt das Hauptcapsidprotein des Virus ist. Mit diesem System werden die lysogenen Zellen bei 32 C gezüchtet und dann auf 45 ⁰C erhitzt,- um die Excission der Prophage zu induzieren. Längeres •Züchten bei 37 O führt zu hohen Erzeugungsmengen des Proteins das innerhalb der Zellen zurückgehalten wird, da diese nicht in der normalen Weise durch Phagengenprodukte lysiert werden, und da der Phagengeninsert nicht eingekapselt ist, bleibt er für -weitere Transcriptionen verfügbar. Durch künstliche Lysis der Zellen wird dann das "erwünschte. Produkt in hoher Ausbeute freigesetzt. '

4 |f ^^w"> 914155/84/rt

Bei einem früheren Bemühen, die Ausbeute an Polypeptide das eine biologische oder immunologische Aktivität von Humanleukozyten-Interferon aufweist und -von Wirten erzeugt wurde, die mit Z-pSR522(Pst)/HcIF-SN55 nach den oben beschriebenen "Verfahren transformiert wurden, wurde eine Restriktionskarte des DIiA-Inserts in dem Hybrid bestimmt. Diese Kartierung ergab, daß H±f-SN35 im Vergleich zu Hif-2h eine PstI-Stelle, die das 3'-Snde der Sequenz flankiert, fehlte, daß ein Teil der Signalsequenz fehlte (bis zu-und einschließlich Codon 7), und die Avall-Stelle in der Signalsequenz durch eine Bspl-Stel-Ie ersetzt worden war. Daher ist Hif-SJTJ5> vermutlich eine polymorphe oder allelische Variante von Hif-2h.

Das Plasraid Hif-SF55 wurde mit Pgtl geöffnet, und der resultierende DNA-Strang wurde an beiden Enden unter Anwendung von Standard ν erfahre η zurückgezogen und das LAC-AJüi-liragment (infra) darin eingefügt und das Plasmid wieder geschlossen. Bs wurde die tatsächliche Struktur des als Z-p3R322(Pst)/HcIP« S1?35-AHI£ identifizierten modifizierten Plasmids und die Aminosäuresequenz am Aminoterminalende des in S. coli erzeugten Proteins bestimmt. Die Hucleotidsequenz dieser Konstruktion ergibt,· daß das LAC-AIu-Iragment eine Aminosäure von der ersten Aminosäure von IPW- ^ 1(SN35) entfernt angefügt worden war. Die Aminosäuresequenz, des Arainoterminalabschnittes des i-ⁿ Έ. coli ausgeprägten Proteins erbrachte, daß ein verschmolzenes Protein mit sechs zur IFF- oC 1(ST!j55)-Sequenz verschmolzenen Aminosäuren erzeugt worden war. Jedoch erzeugen mit dem modifizierten Plasraid transformierte Wirte etwa lOOmal mehr PoIypeptid, das eine biologische oder immunologische Aktivität von Huraanleukozyten-Interferon aufweist,- im Vergleich zu mit unmodifiaififtem Ζ-τ>ΗΒ322(Pst)/EcIP-Slf55 transformierten Wirten.

j-j/ a j/

. In Fig. 2-5 wird ein anderer Versuch zur Verbesserung der Ausbeute von Polypeptid, das eine immunologische oder biologische Aktivität von Humanleukozyten-Interferon zeigt und durch mit Z-pBR322(Pst)/HcIF-SN35 (SI35 in Fig. 25) transfor-'mierte Wirte erzeugt wurde, dargestellt. Das Hybridplasmid wurde unter Anwendung von Standardv er fahren mit Bspl (einem Geschenk von Dr. Kiss) gespalten. Kach Wärmeentaktivierung (65 ⁰C, 30 min) des Restriktionsenzyms wurde das Gemisch auf 50 mM Tri-HCl (pH-Wert 8) eingestellt und erhitzt (37 °C,

min). Nach der Extraktion mit Phenol und -Äther wurde das größte, IcDlTA-Eragment auf Tieftemperatur-Gelierungs-Agarose (0,8 %) isoliert, und HindIII-Linker wurden angefügt. Das modifizierte Fragment wurde dann mit HindIII-gespaltenem Plasmid HS-pBR322 (Sco)/lacU?5-15O ("LAC-15Q")* (einem Geschenk von W. Schaller) durch Verschmelzen der fragmenthaltigen Gelstücke (etwa 20 ,ul jeweils) bei 65 ⁰C, Kühlen auf 37 ⁰C und Zugabe von 20 U T4. DTTA-Ligase je /al vereinigt. ITach 16 h bei 15 ⁰O erfolgte die Ligation in dem erstarrten Gel (H-. Lehrach, persönliche Mitteilung 1980). Mn Zehntel Volumen 100 mM Tri-HCl (pH-Wert 7,5)1 100 mM CaCl₂, 100 mM wurden zu der Probe gegeben, und diese wurde 5 min lang

auf 65 ⁰C gehalten und auf 37 ⁰C abgekühlt, Die Proben wurden anschließend zum Transformieren von mit Ca⁺ behandelten B. co.li HB101 verwendet, bei 0 ⁰C 20 min lang inkubiert, 1 min lang auf 42.⁰C erhitzt und 10 min lang auf 20 ⁰G gehalten. ITach der Zugabe von 1. Mol Tryptonmedium wurden die Proben

⁺Dieses Plasmid enthält das lac-Prömotor HaeIII-2"02 bp-Fragment (W.Gilbert, u.a., !'Lactose Operator Sequences And The Action C Lac Repressor" (Laktose-Operätorsequenzen und die Wirkung von Lac-Repressor) in Protein Li .grand Interactions, H. Sund und G. Blauer, Herausg, (Berlin, Walter de Gruyter),* S. 193 ~ 2Q2 unc K. Backman, u.a.^ "Maximising Gene "Expression On A Plasmid Using Recombination In Vitro" (iviaximierung der Genexpression

L Q ^ ^ " i ' .9W55/86/rt

60 rain -lang bei 37 ⁰C inkubiert und auf Ampicillin enthaltenden Agarplatten ausgebreitet. Plasmid-DWA wurde wie vorher von diesen Kulturen abgetrennt, und das Hybridplasmid, das den IFIT- κ 1 -Insert mit seinem das 'LAC-Fr agment berührenden 5'-Ende .enthält, durch Bestriktionsanalyse identifiziert. Das Piasmid wurde anschließend mit EcoRI unter Anwendung herkömmlicher Verfahren gespalten und mit Sxonuclease BAL-31 (0,06 U/ml, 2 bis 4 min bei JO C) digeriert, um den überhängenden EcoBI-Schweif des LAC-Fragmentes zu entfernen und das ^-Galactosidase-Kodierungssegment zu verkürzen.'

Um zu gevv'älirleisten, daß das behandelte Plasmid die vollständige IFN-od1-Kodierungssequenz enthielt, wurde das Plasmid dann mit BgIII unter Anwendung herkömmlicher Verfahren gespalten, wie vorher behandelt,'und das größte Fragment wurde auf Agarosegel (0,8 fo) abgetrennt. Dieses Fragment wurde dann mit einem Bs^I-BgIII-Fragment von Z-pBR322(Pst)/HcIF-S!T35 kombiniert und das resultierende Hybridplasmid zum Transform!eren von B. coli HR101 wie vorher verwendet. Die transformierten Kolonien v/urden einem Screeningprozeß in bezug auf IFN-Aktivität unterzogen, und ein Olon mit einem hohen Grad an IFl-Aktivität wurde ausgewählt, dieser Clon wurde als _E. coli HB101 (C8-IFTT- eCi) bezeichnet und sein Hybridplasraid als CS-IFH- ^1.

Die DNA-Sequenz-Analyse von C8-IFN- ^1 ergab, daß die dem Initiator-Triplett folgende Kodierungssequenz die ersten sieben Aminosäuren von /2-Galactösidase, einen durch Fusion erzeugten Pro-Residue, Aminosäuren 16 bis 23 der IFiI-^1 -Signalsequenz und die IFN-^ <<1 (Sijf?)-Sequenz bestimmte . Ij?.

Minizellenstämme (DS410), die mit Eybridplasmid 08-IFN-c<i transformiert vmrden, erzeugen etwa 50 Millionen Einheiten je Liter oder etwa '.25Q0mäl mehr Polj/peptid, das eine immunolo-

£ £, U Q U *♦ . U? ϊ . — -.— ,

gische oder biologische Aktivität von HuIFK aufweist, im Vergleich zu mit unmodifiziertem Z-pBR322(I^>st)/Hif-SF35 transformierten Minizellen. Aminosäuresequenzierung des durch Plasmid 08-IFN-κί1 erzeugten Polypeptids bestätigt, daß es sich bei dem Produkt um" ein verschmolzenes Protein mit sieben Aminosäuren von /f-Galactosidase, einer durch die Fusion erzeugten Aminosäure und den Aminosäuren 16 bis 23 der mit IFN-&1 verschmolzenen IFE-ck1-Signalsequenz handelt.

Weitere Beispiele verschiedener Konstruktionen zur Verbesserung der Proteinausbeuten gemäß der Erfindung werden in Verbindung mit anderen Formen von IFW-e< diskutiert (infra). Eigenschaften von Interferon-Aktivität, erzeugt durch mit 'Hybridplasmiden transformierten E,. coli .

1. Sensibilität von IFTT- txirAktivität gegenüber Trypsin

50-/Ul-Proben von authentischem HuIFH-^ (spezifische Aktivität 1,2 χ 10⁶ U/mg; <?0 U) und die oben beschriebenen SlUO-Extrakte von .E. coli HB101 (Z-pKT287(Pst)/HcIF-2h-AH6) (ⁿHif~287~6-Extrakte") (200 U/ml, 10 U) und von 5, coli H3101 (Z-pBR322(Pst)/HcIF-S135)(ⁿHif-35~Sxtrakte") (1000 U/min; ' 50 U) wurden mit verschiedenen Trypsin-Mengen 3^Ü min lang bei 37 C, wie unten angegeben, inkubiert. Da die S100-5xtrakte ei· nen hohen Proteingehalt haben, während es bei dem HuIFTT-6< nicht der Fall ist, wurde ein Gemisch von HuIFTT- t< und dem Xontroll-SiOO-Extrakt Hif-32 parallel getestet: IFIT-^Aktivi" IFN- o<. Prä-parat Trypsin (/Ug) (Einheiten

Ki (50 Einheiten in 5O /ül "

Hif-32 SiüO-Extrakt) . ' 0 ' 5O

0,1 50

· 1 50

.10 5

50 0

Hif-287-6 &1üO-ü;xtrakt 0 I5

(10 Einheiten) · 0,1 I5

• 1 . * 5

ΊΟ Α

9 W

Daher ist das IFIT-o^ der Extrakte gegenüber Trypsin empfindlich und somit ein !Protein.

Hif-35 SlOO-Extrakt (50 Einheiten) 0 3O

. 0,1 20

1 20

10 2

50 0

2. Verhalten bei der Chromatographie auf -Sephadex G-100

Der Extrakt Hif-35 O ml) und der SlOO-Extrakt von E. coli HB101 (Z~pBR322(Pst)/HcIF-SB32)("Hif-32-Extrakte") wurden auf einer 32-ml-Säule von Sephadex G-100 bei 4 0 in einem 5° mM Kaliumphosphatpuffer (pH-Wert 7,4) chromatographiert. Cytochrom.c (0,2 mg) wurde als interner Markierer zugegeben. Die Durchflußgeschwindigkeit betrug 2 ml/h, und es wurden 1,O-ml-Fraktionen gesammelt. Es wurden das Absorptionsvermögen bei 280 nm und 4Ö5 nm (Cytochrom c)'.und die IFM-«- Aktivität bestimmt. Wie aus Mg. 7 hervorgeht, wurde die IFiT-{*-Aktivität von Hif-35-Extrakten·vor Cytochrom c mit einem k^-Wert-von etwa 0,4-5 eluiert. Daher lag die scheinbare relative Molekülmasse der Substanz zwischen etwa 20 000 und JO 00O⁺, in den Iraktionen von Kontrollextrakt Hif-32 wurde keine .Aktivität nachgewiesen.

3. Inhibition der Interferon-Aktivität von Hif-35 und Hif-287-6 durch Antikörper gegen Humanleukozyten-Interferon

HuIFF-* (spezifische Aktivität, 1,2 χ 10⁶ IU/mg) und' die Hif-35/Hif-287-6-Extrakte wurden mit verschiedenen Verdünnungen von Schaf-Anti s er um gegen HuIFN-t< (Herst. K. Cantell, 24. Februar 1976, spezifische Aktivität 4-50 000 Einhei-.ten/ml) in -100 ,ul Modifiziertem Eagles Medium '(ITEM) mit 10 % Kalbsserum 3O min lang bei 37 ⁰C inkubiert, und 4-5 ,ul

⁺ Die durch Fucleotidr-Sequenzierung und unter der Annahme, daß keine Carbbxyterminalumsetsung erfolgt, ermittelte relative "Molekülniasse beträgt 19 388.'

688 4 8 :-"T

wurden auf IFN- *-Aktivität hin mit Hilfe der Analyse der Reduktion des cytopathischen Effektes untersucht. (Der Antikörper selbst verursachte keinen cytopathischen Effekt):

ΙΡϊΓ-.6ί Präparat	Ant i"-Le uko zy te ri-	Rest	5 _
(Einheiten)	.Interferon-Antikörper.	IPlT-* Aktiviti	15* 15 < 0,1 ·< 0,1 15 15
	(Einheiten)	(IU)	ill
Έ ""(1O) ,	O . - 0,18 ' 9
Hif-35-Extrakt Hif-287-6-Extrakt	450 O - 0,18 9 45Ο . - O 0,18 Q
kein	45Ο O 450 .

Um zu zeigen, daß die. Wirkung des Antikörpers nicht auf einen unspezifischen Effekt zurückzuführen war, wie proteolytischen Abbau, wurde ein ähnlicher Versuch mit dem Mäuse-Interferon-System.durchgeführt:

IFN-Präparat " . Anti-Leukozyten- IEIi-Aktivität

(Einheiten) · Interferon-Antikörper (Einheiten/ml)

(Einheiten/ml) Mäuse-System

Muse-Präparat 4500 100

(100 Einheiten) 9O 100

18 100

Somit inhibieren, gegen HuIF?¹- κ gerichtete Antikörper speziell die IETT-^-Aktivität von Polypeptiden, die in mit verschiedenen Eekombinant-DITA-Molekülen transformierten E. cöli erzeugt wurden., die die HcIE-2h-Df¹TA-Sequenz enthalten. Die scheinbar geringere Affinität des Antikörpers gegenüber ^^em ifr E. -coIi erzeugten IEiT-o< kann strukturelle Unterschiede zwischen dem letzteren und dem natürlichen HuIEH-^ wider-σ-η-ίοίτοΐνι <7 "R . r!oQ T?oh 1 an Aar> P.nvh D h ν ΓΪ T> .q t: — TCf) m T η Π ο Π t:« . Ύον —

handensein von Signalsequenz oder Fasion mit einem Teil der β-Lactamase-Sequ.enz.

4. Verringerte Aktivität von Hif-35 und Hif-287-6-Extrakten bei Hausezellen

Human-CCL23-Zeilen oder Mäuse-£929-Ze'llen wurden mit E, coli-Extrakten behandelt, HuIFN-* (Herst. K. Cantell, spezifische Aktivität 1,2 χ 10 Einheiten/mg) oder Mäuse-IF (1.1.H.-Standard) wurde mit Viren -zusammengebracht (Mengo-Viren bei Humanzellen und VSV im Falle von Mäusezellen), und die IFH-c<-Aktivität wurde durch die Analyse der Beduktion des cy~ topathischen-Effektes bestimmt: Zugabe IFN-Aktivität (Einheiten/ml)

Mäuse-Interferon (120 Einheiten/ml) Hif-35-Extrakte

Hif-287-6-Sxtrakte

HuIFiT-* (100 Einheiteii/ml) HuIFlT-oc (1000· Einheiten/ml)

Diese Ergebnisse zeigen, daß Hif-35- und Hif-28?-6-Extrakte eine Schutzwirkung bei Humanzellen ausüben und nur eine geringe Wirkung (-ΊΟ %) bei Musezellen zeigen, wie.es typisch für Human-Interferon ist.

5. Wirkung, auf einige Zellfunktionen

Extrakte von E. coli HB101 (Z-pBH322(Pst)/Hif-SB35-AHL6) 'wurden mit authentischem IFIT hinsichtlich ihrer "Wirkung auf einige Zellfunktionen verglichen. Das von E. coli gewonnene IFIT- ^ zeigte die folgenden Eigenschaften von natürlichem IFTf-ei : (1)'es verstärkt'die natürliche Abtötungsaktivität von Humanlymphοzyten; (2) es verstärkt antikörperabhängige . zell-mittelbare Gytotaxizität; (3) -es unterdrückt antigerimitOfrenitiduzifirtfi ifiukozvtfinTni oTatiOnsi nhihi ti or?: i3nd

Humati-System	Mäuse-System
	120
100	13
1000	120
30	4
300	40
100	4
1000	•40

Z/ '/ — ^w

(4) es.inhibiert die Vermehrung von IFF-sensitiven Burkitt-Lymphoma-Zellen. Diese Eigenschaften sind Anzeichen für Aktivität des von E. coli synthetisiertem IFF-* 1 gegenüber Humantumoren und Humankrebs. 6. Aktivität von IFF- pi ' ohne Aminoterminalsequenzen

IFlT-K ohne Aminoterminalsequenzen wurde gleichfalls in E. coli erzeugt, und von ihm wurde nachgewiesen, daß es mit IFF-Aktivität übereinstimmende-Aktivität zeigt.

Zur Konstruktion des entsprechenden Rekombinant-DFA-Moleküls wurde Plasmid Hif-2h (supra) teilweise mit BcoRI und BamHI digeriert, und das die IFIT-(X 1~Kodierungssequenz enthaltende Fragment wurde auf Agarösegel abgetrennt und mit der ITicht-IFlT-oCi-Kodierungssequenz kombiniert, die von einer . EcoRI/BamHI-Sestriktion von Plasmid Hif-SF35 gewonnen wurde, das keine Pstl-Stelle neben dem 3'-Ende des Hybridinserts enthält, wie es bei Hif~2h der Fall ist (supra)» Das resultierende Plasmid wurde der Restriktion mit Pstl/Bgll zur Entfernung eines Abschnittes des Aminoterminalteiles der IFTT-κ 1-Kodierungssequenz unterzogen. Eingesetzt an seine Stelle wurde eine Reihe von IFF-^1-Fragmenten, die.durch Digerieren von Plasmid Hif-2h mit PvuII, Behandlung mit Bal-Sxonuclease, An-. fügen von Pstl-Linkern und Restriktion mit BgIII hergestellt worden waren. Die resultierenden Plasmide enthielten somit eine Reihe von IFF-οζ1-Kodierungssequenzen, denen verschiedene Abschnitte ihrer Aminoterminalsequenzen fehlten. Eines davon (Plasmjd 2H-M8) wurde mit Pstl' digeriert und seine Fucleotidsequenz bestimmt. Die Sequenzierung-ergab, daß das Plasmid 2H-M8 verschiedene nucleotide zwischen der Pst-Steile und dem ersten Codon (CIS) von IF?!-(k.1 enthielt. Daher wurde das Pstl-digerierte Plasmid 2H-M8 mit T^-Polynuclease/dATP, SI

Exonuclease behandelt und mit ,Sail digeriert. Durch diese 'Verfahrensweise entstand' eine Seihe' von Fragmenten, deren IFiT-#: 1 -Kodierungssequenzen .Abschnitte ihres Aminoterminalendes fehlten. Diese Fragmente, wurden danach LAC-Ko η tr o lie unterstellt, indem sie operativ mit einem GUA-LAC-Fragment verknüpft wurden, das von Plasmid Lac3V8 durch Digerierung mit EcoEI, Behandlung mit Exonuclease SI und Digerieren mit Sail gewonnen ?<rorden war. Die resultierende Eeihe von Plasmiden hatte daher IFN-c<1-Kodierungssequenzen, denen verschiedene Abschnitte ihrer Aminoterminalenden fehlten,' die in''Gegenzeigerrichtung über ein AUG an einem den LAC-Promotor enthaltenden Fragment angefügt waren, s

Einige dieser Plasmide wurden sequenziert. Eines b:egann an der fünften .Aminosäure von IFTT-ν Λ und eines an der zehnten'Aminosäure von-ΙΡϋΓ-οΜ. In E. coli Minizellen (DS410) erzeugten diese beiden Plasmide Polypeptide, die IFTT-Aktivität aufwiesen. Daher ist nicht das gesamte IFF-o<.1 -Protein für IFi¹J-Aktivität erforderlich. .

Identifikation von Clonen von S. coli, die Bekombinant-DHA-

• Moleküle enthalten, deren. D^-KA-Inserts schwach zu dem Insert in Hif-4-c kreuzhybridisieren, und eine andere Hestriktionskarte haben als das Hif-2h-Fragment

Der Vergleich der ersten 35 Aminosäuren von authentischem

. Xymphoblastoid-Interferon (Zoon, u.a., supra,- und M. Hunkapiller und L. Hood, supra) mit der von Hif-2h-Eragment abgeleiteten Sequenz ergibt. 9 Unterschiede. In-allen Fällen konnten die Codons für die unterschiedlichen Aminosäuren durch Ein-Basen-Veränderungen in Beziehung gebracht ,werden. Die ArainOsäurezusammensetzamgen, die direkt für authentisches Lympboblastoid-Interferon.einerseits bestimmt'und andererseits

-J-J ι

von der Sequenz des Hif-2h-Fragmentes abgeleitet wurden, •zeigen,auch hinsichtlich' ihres Gehaltes an GIy, Fro, Cys und Met ganz erhebliche Unterschiede. Diese Unterschiede sind viel zu groß, als daß sie. einfach durch Polymer phismus erklärt werden könnten. Sie reflektieren stattdessen höchstwahrscheinlich das Vorhandensein von mindestens, zwei nicht-allelischen Genen, da der Grad der Divergenz .der beiden Proteine (26 % Fehlanpassung) ähnlich dem ist zwischen beispielsweise Human- und Schaf-B-Globin (23 % Fehlanpassung). Daher wurden die Clone, die schwache Hybridisierung zu Fragment Hif-4-c zeigten und früher identifiziert worden waren (supr-a)_t untersucht, und es wurde ein Clon E. coli HB101 (Z-pBB322(Pst)/HcIP-II-206) identifiziert.

Das Hybridplasmid Z-pBR322(Pst)/HcIF-II-206 ("HcIF-II-206") dieses Clons und sein DHl-Insert "Hif-II-206-Fragment" hybridisieren schwach zu Hif-4c- und Hif-2h-Fragment. Mit ' Plasmid Hif-II-206 transformierte E. coli erzeugen Polypeptide, die eine biologische oder immunologische Aktivität von HuIS¹N-(X aufweisen. Das Hif-II-206-Fragment hat eine Restriktionskarte, die sich von der für das Hif-2h-Fragment bestimmten unterscheidet. Ein Vergleich der beiden Sestriktionskarten ist in Fig. 11 enthalten. Auch hier konnte die absolute lage der Restriktionsstellen in dem Hif-II-206-Fragment nicht durch Hestriktionskartierung alleine bestimmt·werden. Die Sequenzierung der Nucleotidsequenz dieses Inserts erlaubt jedoch unter Anwendung der oben beschriebenen Standardverfahfen eine absolutere Bestimmung dieser- Stellen. Infolge der Unterschiede in der Sestriktionskarte des Hif-II-206-Fragmentes im Vergleich zu dem Hif-2h-Fragment wird dagegen klar, daß die Interferongene der beiden Inserts unterschiedliche

ITucleotidsequenzen haben.

In den Fig. 12 bis 16 -werden die Tiucleotidsequenzen der eingefügten DHA-Sequenz — Hif-II-206-Fragment — von KuI-tur-HcIF-G und die eingefügte T)UfA-Sequenz — Hif-2h-7Fragment — von Kultur-HcIF-E (infra), die kürzlich bestimmt wurden, und die entsprechenden Aminosäuresequenzen von durch diese ITucleotidsequenzen dafür kodierten Proteinen gezeigt. Die Nucleotid-Sequenz des Hif-II~206-Fragmentes — das Pstl-Fragment (790 bp) der Plasmid-DTiA, das unter Anwendung der Verfahrensweise von Methode 3 nach der. Beschreibung von IT.M. Wilkie, u.a., TTucl. Acids Bes./ 7, S. 859 -877 (1979) von Kultur-HcIF-G-isoliert worden war — wurde unter Anwendung des Standardverfahrens von A.M. Maxam und W., Gilbert, supra, bestimmt. Die angewandte'Sequenzierungsstrategie ist in Fig. 17 gezeigt.

Eingeschnürte DTTA (gewöhnlich etwa 10 /Ug) wurde 5'-terminal wie von TT.. Mantel u.a., Gene, 10. S. 1 - 10 (I98O) beschrieben, markiert. Markierte Fragmente wurden mit einem zweiten. Eestriktionsenzym gespalten, die Produkte'·wurden durch Elektrophorese durch ein 5 %iges Polyacrylamidgel in Triborat-SDTA-Puffer (A.C. Peacock· und C.W. Dingman, Bioch.., 6, S. 1818. - 1827 (1967)) getrennt, aus dem Gel extrahiert und nach der Beschreibung von W. Muller, u.a., J. Mol. Biol. _{ 124, S. 3^3 - 358 (1978) gereinigt.

• · Für Fig. 17 wurden die verschiedenen Fragmente für die Sequenzierung wie folgt vorbereitet:

25 und 26 — Spaltung von Hif-II-206 mit PstI, Markierung, Spaltung 'mit BgIII, Isolierung' eines PStI^4--BgIII-Eeagment.es (257 bp) ("25") und eines PstI⁺-BgIII-Fragmentes (279 bp) ("26"); · .

21, 22«und 23 — Spaltung von Hif-II-206 mit Pvull,

-j \-r

Markierung, Spaltung mit BgIII, Isolierung eines Pv iragmentes (88 bp) ("21")., eines PVuII⁺-B^lII-Eragmentes (176 bp) ("22") und eines PvuI⁺-B_glII-Eragmentes (214 bp) ("23");

11, 12, 13, und 14 — Spaltung von Hif-II-2p6 mit BgIII₁ Markierung, Spaltung mit Pstl, Isolierung eines BRlII⁺ -PstI-Fragmentes (279 bp) ("14"), und eines komigrigierenden Gemischs eines BgIH⁺ -Pst!-Fragmentes und eines BgIII⁺-BgIII⁺- Fragmentes. Spaltung des G-emischs mit Pyu.II und Isolierung eines B^II⁺-PStI-Fragmentes (275 bp) ("13"), eines BgIU⁺- PvuII-Pragmentes (176 bp) ("12") und eines BgIII⁺-Pvull-Iragmentes (88 bp) ("11").

271, 27U, 41, 43, 44 und 45 — Spaltung von Hif-II-206 mit Hinfl, Markierung, Isolierung von Vorlaufer-Fragmenten: HJr^fI⁺ -HJnJI⁺ (II3 bp) ("27Pⁿ), HinfI⁺ -HinfI⁺ (146 bp) ("28P") Hinfl⁺-Hinfl⁺ (159 bp) ("3OP"), Hinfl⁺ -Hinfl⁺ (397 bp) ("31P") und -HiIIfI⁺THinfI⁺ .(1522 bp) ("32P"). Spaltung von 28P mit MbjoII und Isolierung eines Fragmentes HinfI⁺-iv1boII (112 bp)

("41"). Spaltung von 3OP mit MbοII und Isolierung eines iragmentes HinfI⁺-MboII (126 bp) ("43").. Spaltung von 3IP mit Pstl und Isolierung eines Fragmentes Hinfl⁺ -Pstl (I5I bp) ("44").. Spaltung von 32P mit Pstl und Isolierung eines Fragmentes Hinfl⁺-Pstl (139 bp) ("45"). Strangtrennung von 27P zur Gewinnung von zwei Strängen ("27U" und "27L").

Alle Segmente bis auf 27U und 27^ wurden an beiden'Strängen und über die Hestriktionsstellen, die als Ausgangspunkt für die Sequenzierung dienten, mit Ausnahme der BgIII-Stelle an Position 185, sequenziert.

Aus einem Vergleich der durch die beiden Inserts kodierten Aminosäuresequenz geht hervor, daß das Hif~II-2Ö6-Frag-

ment für ein interferonartiges Protein kodiert, das eine Aminosäure weniger hat als das Hif-2h-!fragment (Aminosäure 44 (Asp), die in Hif-2h vorhanden ist, fehlt in Hif-II-206). Darüberhinaus sind 10 % der ITucleotid-Positionen und 17 % der abgeleiteten Aminosäureresiduen der beiden Fragmente unterschiedlich. . .

Wenn man außerdem einen Vergleich mit den 35 für den Aminoterminus von Lymphoblastoid-Interferon bestimmten Aminosäuren vornimmt (K.C. Zoon, u.a., Science, 207, S. 527 528 (1980)), so kodiert der Insert Hif-II-206 für ein Protein, das in 5 Sesiduen von den von Zoon u.a. supra, bestimmten 35 Aminosäureresiduen abweicht. Daher muß es mindestens drei verschiedene IFN-Gene des Leukozyten-Typs (#-Typ) geben .— Hif-2h-Fragment, Hif-II-206-Prägment und.das für Zoons IFIT kodierende Gen. In Übereinstimmung mit der kürzlich für Interferon vorgeschlagenen Nomenklatur werden anschließend die durch diese Gene kodierten Proteine wie folgt· identifi-

ziert:	Protein
IFTJ-Ge η-Ursprung	IETT- ^ 1
Hif-2h	IFlT- Bi 2
Hif-II-206
IFiT von Lymphoblastoidzellen	. IFTT- χ3
(Zoon, u.a., supra)	/1 und IF
Die Unterschiede zwischen IFlT- c

xT- *c 2 werden

auch durch ihre variierenden Aktivitäten bei Human-CCI.23- und Einderembryo-TTieren-(3EK)-Zellen verdeutlicht:

£ LOGO

Extrakt ' Relative IFW-Aktivität*

Hif-Ii-206 (IFiT-* 2)

CCL23	BSIC	Verhältnis
1,7	1,0	1,7:1
0,05	1,0	1:20

Daher ist die¹ Aktivität von IFET-oC Ί bei Humanzellen etwa 30mal schwächer als die von -IFTJ-*; 2. Doch sind beide etwa gleich aktiv bei Rinderzellen. Daher können IFNe neben ihrer Anwendung als Mittel gegen Viren, Tumore oder Krebs bei Menschen auch wertvoll für die Behandlung dieser Erkrankungen bei Rindern sein. Beispielsweise könnten Präparate· von HuIFiT- cxC in einer üblichen Weise (supra) zur Behandlung von FMDV und anderen allgemein bekannten Virusinfektionen von Rindern verwendet werden. Das gilt vor allem für IFN-o^T, da seine Aktivität in Rinderzellen etwa 20mal stärker ist als seine Aktivität in Humanzellen.

Wegen der verbesserten Ausbeute, die bei IFlT-^ 1 mit Konstruktions-C8 (supra) erzielt wurde, wurde eine ähnliche Konstruktion für IETT-^2 vorgenommen. Z-pBR322(Pst)/Hif-II-206 wurde vollständig mit Bspl und teilweise mit PvuII (bei P1) (Fig. 28) gespalten, und das 867bp-Fragment wurde

* E.coil H3101, die das Hybridpiasmid enthielten, wurden in Tryptonmedium unter Schütteln bis zu einer OD55O von etwa

1 bis 2 vermehrt. Die Zellen wurden geerntet,« gewogen, erneut in I/IOO oder I/2O des ursprünglichen Kulturνblumens suspendiert und nach der Lysozym-Gefrier-Tau-Methode lysiert (S. Nagata, u.a.,'.Nature, 284, S. 3I6 - 320 (I98O). Die 3-30 Obenstehenden wurden durch CFE-Reduktionsanalyse in Mikrotiterplatten getestet. Extrakte von Kon.tro.ilzeIlen waren negativ ( <Ί I.U./ml), HuTTian-CCL23-ZelIen und Rinder-Embryo-' TTieren-(BEK)-Zellen (FLOW) wurden in ΜΞΜ-10 %. Fetalkalbsse-

• rura gezüchtet. Die Einwirkung der IFW-haltigen Extrakte dauerte 24 h. Die Zellen wurden mit einer entsprechenden Verdünnung von Mengovirus zusammengebracht und 24 h später gefärbt. Werte wurden visuell in bezug auf das teilweise gereinigte Leukozyten-IFN (Präparat PIF, ein Geschenk von

K. Cantell) mit bekanntem Titer geschätzt. Dieses Präparat war etwa 3roal so aktiv bei Huraanzellen im Gegensatz zu Rinderzellen.

Der Vergleich der Restriktionskarten von Hif-SI?35 und Hif-2h

aus 6 %igem Polyacrylamidgel isoliert. Dieses Fragment wurde danach mit einem 259O-bp-PvuII-Fragment von C8-IPM-i^1 vereinigt"¹"·. Das resultierende Hybridplasmid wurde zum Transformieren von E. coli HB1O1 verwendet, und die Clone wurden auf IFU-Aktivität hin ausgesondert. Ein eine hohe Aktivität aufweisender Clon wurde gewählt und als E. coli HB1O1 (C8-IFH-c/2) bezeichnet. / · '

DHA-Sequenzierung von Hybridplasmid 08-IFlT-(^ 2 ergab, daß es wie C8-IFF-<>< 1 eine dem Initiator-Triplett folgende Kodierungssequenz hatte, die die ersten sieben Aminosäuren von y^-Galactosidase bestimmte, einen Pro-Redidue, der durch die Fusion erzeugt wurde, sowie die Aminosäuren 16 bis 23 der -f^ 2-Signalsequenz. Daher kann möglicherweise wieder ein -o<2 enthaltendes verschmolzenes Protein ausgeprägt werden.

Mit diesem Plasmid transformierte Minizellen ergaben.100 bis 200 Millionen Einheiten je 1 IFIT oder 20 000 bis 40 OOOfach höhere Ausbeuten von IFTT-^.2 als Minizellen, die mit unmodifiziertem Z-pBR322(Pst)/Hif-11-206 transformiert wurden.

Ein Vergleich der relativen Ausbeuten an Ca-IFM^ 1 (/v50x 1t£ Si nh e it e n/Liter) und CB-IFu- ö62 (^100 bis 200 Millionen Einheiten je Liter) ist zunächst überraschend, da von IFH-(>/2 nachgewiesen wurde, daß es etwa ^Otnal aktiver als ΓΕΉ-κΊ bei Humanzellen ist (supra). Eine quantitative Analyse der Menge der beiden Proteine, die durch mit den beiden C8-Plasmiden transformierte Minizellen erzeugt wurden, ergab jedocti, daß in CS-IFM-^ 1 etwa 5 bis 6mal mehr Protein als in C8-IF17-C/.2' erzeugt worden war. 'Daher waren die auf der Grundlage von IFN-Aktivität gemessenen Ausbeuten durch die

⁺C8-IFFoC1 hat drei PvuII-Sestriktionssteilen (Fig. 28). Das 2590-bp-Fragment ist zwischen P^j und P^ *

84 ΰ

viel größere Menge von im Falle von C8-IFTT-^1 erzeugtem Protein verfälscht.

In Fig. 26 wird eine andere Konstruktion bei einem Versuch, die Ausbeute an IFF-»:2 "zu erhöhen, dargestellt. Zu-; . nächst wurde, ein Fxpressionsplasmid, das das LAC AIu-Pragment enthielt, durch Restriktion des bekannten lac-Promotors mit AIuI hergestellt, und das Fragment wie (für einen Terminus) in Fig. 27 gezeigt mit "Eco5!-Linkern (hergestellt durch gemeinschaftliche Forschung) verlängert. Das verlängerte Fragment wurde anschließend in pSS322 an der "ScoRI-Steile eingefügt, und ein kleines EcoSI-ScoRi-Fragment aus der Konstruktion ausgeschlossen. Das resultierende Plasmid, in Fig. 26. mit 404 bezeichnet, würde mit HindiII und PvuII für die Insertion des IFTT- κ 2 enthaltenden Fragmentes gespalten. Dieses IFU-6i2-Fragment wurde durch teilweise Sau$A-Restriktion von Z-pBB322(Pst)/HcIF-II-206 ("206" in Fig. 26), Ausdehnung des SauJ A-Fragment es mit Hindlll-Linkern (Fig. 27)'und Spaltung ^m^ ?^sP^ hergestellt. Fach der Insertion dieses Fragmentes in das Hindll-PvuH-gespaltene Flasmid 404 wurde das resultierende Plasmid der !Restriktion rait HindIII und "FcoBi unterzogen, .mit SI-TTuc lease behandelt, um den LAC-Promotor naher an das IF2?-^ 2-Gen heranzubringen, und religiert. Bei dieser als Plasmid LAC-AUG(& 2) identifizierten Konstruktion steht 'die IFlI-cx: 2 -DM- Sequenz unter der Kontrolle des LAC-Pr omotors. Außerdem folgt die IFW-o<,2-Sequenz unmittelbar dem Initiierungs-AUG-Codon dieses Proraotors (siehe Fig. 27). Daher wird zumindest ein Teil des durch diese Plasmide erzeugten IFTTs reifes IFTT sein, z.B. 'IFTT'ohne irgendwelche Aminosäuren von der Signalsequenz. In Minizellen betrug die Ausbeute von mit Plasmid LAC-AUG( #2) -gewonnenem IFTT- κ2

5> bis 10 Millionen Einheiten je Liter. . .

...' Eine andere, auf ähnlichen YerknüpfungsPrinzipien beruhende IFlJ- te2-Konstruktion wurde ebenfalls hergestellt. Hierbei wurde die Penicillinase-Expres'sions-Kontrollsequenz von pBB322 über ein AUG-Initiator-Codon mit dem IFTT-^2-Gen'von" Hif-II-206 verbunden"⁵". Dieses Plasmid, das bei der Transformation von Wirtszellen als /?-lac-AUG( o<r2)·bezeichnet wurde, ermöglicht die Erzeugung von IFlT- c<2 ohne Fusion mit anderen Proteinsequenzen. In Minizellen sind Ausbeuten von 50 bis 100 Millionen Einheiten je Liter erreicht worden. Dieses Plasmid ist das zur Verwendung in Übereinstimmung mit der Erfindung am meisten bevorzugte Plasmid.. Es wird auch für die An-.wandung mit den anderen hier offenbarten IFTT- <*-Genen bevorzugt. Der erfindungsgemäß bevorzugte Wirt ist E. coli DS4-1O (ara azide TonA Iac y Tsx rain a min b gal Λ xgl Schritt" ). Dieser Stamm wurde zusammen mit einem Beispiel des bevorzugten Plasmids /S-lac-AUG( ti 2) als HcIF-K hinterlegt.

Andere Konstruktionen unter Verwendung verschiedener Promotorsequenzen, Sibosombindungsstellen, Shine-Dalgarno-Sequenzen und DEFA-Sequenzen zwischen.dem Promotor und dem

Diese Konstruktion könnte am .wirksamsten durch Partialdigerierung von pBR322 mit üfljoll, Behandlung mit SI, Anfügen von EcoRI-Linkern wie zuvor und Wiedereinsetzen des Fragmentes in die EcoRI-Stelle von pBF-322 und Ausschließen einer EcoHI-. Stelle hergestellt-werden. Das resultierende Plasmid (""/^-lac-. AUG-Plasmid^M) könnte dann mit einem SI-behandelten (milden) HindiII-Linker-Bspi-Fragment von 206, das oben beschrieben .wurde, kombiniert werden. l'^Tach der Spaltung mit ScoHI-und Behandlung mit SI und Phosphatase.wird das Expressionsplasmid • z³-lac-AUG( Y-2) isoliert. Konstruktionen mit anderen Genen könnten in. einer ähnlichen-Weise vorgenommen werden, indem einfach das konstruierte /^-lac-AÜG-'p'lasmid für die Insertion anderer Gene oder Konstruktionen' verwendet wird, oder noch besser, indem die Sau3A-Stelle in Plasmid /4-lac-AUG( <Ό2) selbst herangezogen wird.

I / JL

AUG-Initiator-Codon und unter Verwendung verschiedener hier beschriebener -Ii¹F- c<-Gene können gleichfalls unter Heran-Ziehung ähnlicher Methoden und Prinzipien konstruiert v/erden. Diese Konstruktionen sind natürlich durch die Erfindung mit 'erfaßt und liegen innerhalb ihres Geltungsbereichs. Hybrid-Moleküle von IFN-<*1 und IFF-* 2

Es ist eine Anzahl von Hybridmolekülen von IFlT- ^ 1 und IFE^-- {<2 konstruiert worden. Überraschenderweise haben diese Hybridkonstruktionen quantitativ unterschiedliche Eigenschaften und Aktivitäten im Vergleich mit ihren Stammformen'. — IPF-oii oder OT-κ2. .

In Fig. 28 wird eine schematische Darstellung der Konstruktion von vier dieser .Hybridmoleküle gezeigt. Der Einfachheit halber sind diese- Hybridmoleküle· als- Plasmide I, II, III und IV bezeichnet. Bei diesen Konstruktionen wurden Digerierungen mit Sestriktionsenzymen (von Biolabs bezogen, mit Ausnahme von 3spl, einem. Geschenk von Dr; Kiss) im wesentlichen nach den "Empfehlungen der Lieferanten durchgeführt. Partial-DFA-Spaltungen wurden mit verringerten Enzymmengen vorgenommen. Fach Wärmeinaktivierung (65 ⁰C, 30 min) des Restriktionsenzyms wurden die Proben auf 50 rnM Tri-HCl (pH-Wert 8) eingestellt, und wenn erforderlich, wurde, alkalische Kalbs-Intestinalphosphatase (Boehringen) (1 VoI ge /Ug DE^-A) zugesetzt. Fach 3° min bei 37 ⁰C wurden die Proben mit Phenol und Äther extrahiert. In den meisten Fallen wurden die DNA-Fragmente auf Tieftemperatur-Gelier-Agarose (0,8 %) abgetrennt. Für die Ligation wurde das Gelstückchen (etwa 20 /ul jeweils) enthaltende Fragment bei 65 G geschmolzen, auf 37 ⁰C gekühlt, und es wurden 20 U T4-D1TA -Ligase je /Ul zugegeben. Das Gemisch wurde 16 h lang bei 15⁰G gehalten, und die

8 4 Ö ~^40Z~ ' 914155/102/rt

Idgation erfolgte.in dem verfestigten Gel (H. Xehrach, persönliche Mi tt ei lung, 19SO)/ Ein Zehntel Volumen von 100 mM Tri-HCl (pH-Wert 7,5), 100 mM.CaCIg₁ 100 mM MgCl₂ wurde zugesetzt, die Probe 5 min lang auf 65 · C gehalten und auf : 37 ⁰C abgekühlt. Die Proben wurden anschließend zu mit Gabehandelten Minizellen gegeben, 20 min lang bei 0 C inkubiert, 1 min lang auf 42 ⁰C und 10 min lang auf 20 ⁰C gehalten, und 1 ml Tryptonmedium wurde zugegeben.. TTach einer Inkubationszeit von 60 min bei 37 -C wurden die Kulturen auf die entsprechenden Antibiotika enthaltende Agarplatten verteilt. Alle diese Plasmide wurden durch TTucleotid-Sequenzanalyse an der Verbindungsstelle in der IPN-Sequenz'charakterisiert. .... ·

.Hybridmolekül Ϊ, .ein #d-1(PvuII) o<-2-Hybrid, wurde durch teilweise Spaltung von 08-1EN-K. 1 (supra) (C8-<k1 .in. Eig. 28) mit PvuII konstruiert, dephosphoryliert, gespalten mit Pstl, und das PstI-PvuII(P_o)-1346~bp-Eragment wurde isoliert. Die-

—— _~— ^ ^

ses' Irag^raent wurde mit einem 2135-bp-PstI(a)-Pvu,II(Pp)-5ragment vereinigt, das durch vollständige Spaltung von C8-IPTT-(CS-c<2 in Pig. 28) mit PvuII und teilweise Spaltung

mit Pstl hergestellt worden war.

• Hybridmolekül II, ein .e^-1(-SgIII)c<.~2-Hybrid, wurde durch Spaltung von Hybridmolekül I mit BgIII hergestellt. ITach der Dephosphorylierung wurde das große BgIII Iragment isoliert und mit dem kleinen Bglll-IJragaient von C8-IPTT- bC2 vereinigt. Nach dem Cloning wurde das Hybridplasmid, das das kleine Bglll-Fragment in. der richtigen Orientierung aufwies, durch Restriktionsanalyse charakterisiert.

Hybridmolekül III, ein o6-2-(PvuII) i<:-1-Hybrid, wurde

vnn fiR-TWI— Oii 1 mit Pv-ίίΙΙ. Denhosriho-

£Ό Q Q *4 Q

rylierung, Spaltung mit Aval und Isolierung der 1686-bp-PvUlI(P₂)-Aval- und 3 233-b P-PvUJI(P₁)-AvaI-Fragmente kon- struiert. Diese Fragmente wurden anschließend mit dem 3°0-bp-FvuII(P₁)--PvuII(P₂)-Fragment von HclF-II-206 (su£ra) (S1T2.Ö6 in Fig. 28) vereinigt, und das das kleine PvuII-Frag-ment enthaltende Plasmid wurde durch Analysieren von transformierten Έ. coIi Stämmen auf, IFH-^-Aktivität hin identifiziert.

. Hybridmolekül IY, ein <x -2(BgIII) χ-1-Hybrid, wurde durch Spaltung von C8-IFlT-o< 1 mit BgIII und Aval konstruiert, und das 1776-bp-Fragment wurde isoliert. Dieses Fragment wurde anschließend mit dem 354-3-bp-BglII-Aval-Fragment . von Hybridmolekül III vereinigt.

Die biologischen Aktivitäten der verschiedenen Interferonspezies in bezug zueinander wurden gleichfalls bestimmt. Kulturen von mit den verschiedenen Plasmiden transformierten 'Minizellen (DS4-10) wurden gezüchtet und die Bakterien durch Zentrifugieren geern.tet, mit PBS gewaschen,· in PBS suspendiert (etwa 1/20 des Originalvolumens), 60 min lang bei O ⁰C mit 1 mg/ml Lysozym, 10 mM EDTA inkubiert, viermal gefrostet-aufgetaut, durch fünfmaliges Hindurchleiten durch eine Spritze geschert und durch Zentrifugieren gespalten.

Die Aktivitäten bei Human-, Mäuse-, Meerschweinehen- und Rinderzellen waren wie folgt:·

Protein-Quelle Human (!Em) ' . Belative IFN-Aktivität

Binder (BEK) Mäuse (L) "Meerschweincfaei

CS-IFFr cc2 .1 T 0,01 0,03

C8-XFK-rf1 0,03 1 " . 0,3 0,03

Hybrid I " .0,001- 1 0,003-0,008 0,003-0,01

Hybrid II 0,001 . 1 0,001 0,01

Hybrid III 1 . 1 ' " 1 0,3

Hybrid TY 0,1 Λ ' 2 0,1 -0,005

negative Kontrolle — ' — -— —

"Überraschenderweise haben alle-diese !interferone etwa die gleiche Aktivität bei Rinderzellen, jedoch haben ZFTT-^ 1 und die beiden Hybrid-IFlTe (I und II), die die Aminoterminalkomponente von IFN-o<1 haben, etwa eine um das 10- bis 1000-· fache'geringere Aktivität .bei Humanzellen als IFlT-<<2 und die beiden Hybrid-IFITe (III.und IV), die die Aminoterminalkomponente von IFN- ei2 aufweisen. Es ist noch auffälliger, daß die beiden Hybrid-IFNe (I und II) mit dem Aminoterminalteil von IFiT- ot 1 eine um mehr als das Zehnfache geringere .Aktivität bei Humanzellen haben als IFF- o<.1 selbst. Jedoch eine der Hybriden (III) mit dem Aminoterminalteil von IFTT- ^2 hat etwa die gleiche Aktivität bei Humanzellen wie IFTT-Identifikation von Chromosom^enen in bezus; auf

Eine Sammlung von Hybridphagen,' die von Fragmenten von .Human-Fötus-Chromosomen-DTTA stammten, die durch teilweise Spaltung mit Haelll und AIuI -erzeugt und mit TpcoB!-Linkern •zu ACharon-^A-Armen vereinigt worden waren, wurde von B.M. Lawn, u.a., Cell", 15, S. 1157 - 1174 <1978) hergestellt. Diese Gen-Bank wurde einem "in-situ" Screening-Verfahren unterzogen (W.D. Benton und B.W. Davis, Science, 196, S. 180 - 1S2 (I977); T. Maniatis, u.a., .Cell, 15, S. 687 - 7^1

226884 ö

~4(ß-

(1978)), wobei als Sonde der von pB3322(Pst)/Hif-2h abgeschnittene * P-inarkierte IFE- «.IcDFA-Iηsert verwendet wurde. Durch wiederholte Plaque-Seinigung wurden sechzehn positive Hybri/äisierungs-Phagenclone von 240 000 Plaques isoliert (T. Maniatis, u.a., supra). Zehn der Hybrid-Phagen-OTA-Prä-' parate wurden mit Hindlll, Tacl, Hhal, 3§jHI, EcoRI bzw. ISgIII gespalten, und die durch Elektrophorese auf e'inem Agarosegel getrennten Fragmente wurden auf eine Millipore-Membran. übertragen (S.M. Southern, J. Mol. Biol., 98, S. 5Ο3 517 (1975)) und mit dem ⁵²P-markierten Hif-2h-cDlA-Insert hybridisiert. In Fig. 18 sind die Ergebnisse in Form von Par— tialrestriktionskarten und verschiedenen Tabellen zusanimengestellt. Wie dort gezeigt wird, wurden für jedes Hybrid-Phagen-DlTA-Präparat mindestens einige charakteristische Restriktionsstellen festgelegt und die Region(en), die zu der IFl- #1-Gen-Sonde hybridisieren, dargestellt (schwarzer Pfeil)"¹", .< Aus den Fig. -18 und 24 ist zu entnehmen, daß die Clone chr~5 und chr-26 DIIA-Segmente darstellen können, die über einen großen Teil ihrer länge überlappen, da sie mehrere ScoBI- und HindiII-Fragmente gemeinsam aufweisen. Außerdem können der Hybridisierungsäbschnitt von chr-1 und einer der Hybridisierungsabschnitte von chr-10 die gleichen sein, weil die Hindlll-Hindlll- und ScoRI-EcoSI-Fragmente, die mit der Hif-2H-Sonde hybridisieren, die gleiche länge haben (3»2 kb bzw. 0,95 kb). Es hat auch den Anschein, als ob der "rechte" Hybridisier ungsab schnitt von chr-16 (in Fig. 18 mit "r" markiert] mit dem Hybridisierungsabschnitt von chr-35f obwohl er in der anderen Richtung orientiert isf, insofern identisch sein könnte

Die schattierte Fläche bei chr-16 in Fig. 18 und 24 stellt eine Sequenz dar,· die schwach zu Hif^b-cDTCA hybridisiert, aber kein B-LocOin.cr τ,ρΛ £?t.

als jeder der beiden Clone ein 1,4kbBj^II-BgIII-Fr agment und ein 2kbEcoRI-1i)coHI-Fragment ergibt, die mit der Hif-2h-cDITA-Sonde hybridisieren. Wahrscheinlich überlappen deswegen die ehr-16-und chr«-35-Inserts. · ·

Man könnte daher annehmen, daß die 13 Hybridisierungsabschnitte der 11 Hybrid-Chromosomen-DITAn in weniger als 10 verschiedenen Klassen liegen — chr-1., chr-3, ehr-12, chr-13, ehr-1.6 (links, in Fig. 18 als "1" markiert), chr-26, chr~30, chr-35> chr-19 and chr-27.

In Fig. 24 werden die Überlappung von chr-1, chr-3. chr-10 und chr-26 und die von chr-16 und chr-35 gezeigt.

Die obigen Angaben lassen vermuten, daß das Genom eines bestimmten Menschen nicht weniger als 10 verschiedene DTTA-Sequenzen, die zu Hif-2h kreuzhybridisieren, enthält. Diese Schlußfolgerung wird durch die Tatsache erhärtet, daß der Abschnitt von Sequenzen mit Hif-2h-verwandtem Fragment, das in der Clonbank nachgewiesen wurde, etwa 1:16 000 beträgt. Himmt man einen Wert von 3. x 10 bp für das Humangenom Haploid an, dann ist der erwartete Wert für eine einzige Genkopie mit · ' einer durchschnittlichen DM-Fragment-Größe von. 16 kb (dem durchschnittlichen Wert der untersuchten Clone) etwa 1:190 000. Daher ist Sie Häufigkeit von Hif-2h~verwandten Fragmenten mal größer als für ein einziges Gen erwartet.

Bei einem Vergleich dieser Angaben, zu dem Lawn, u.a., (supra) ein Screening von 300- 000 Plaques von der gleichen Gen-Bank mit einer /^-Globin-cDNÄ-Sonde vornahmen, wurden nur 2 positive Clone identifiziert —.wobei der erwartete Wert 1,6:p00 000 war. Daher können 10 bis'15 einzelne Chromosomen-D!?A-Segmente in dem Humangenom vorhanden sein, die zu dem Hif-2h-Fragment od'er IFF- << 1 cDlTA kreuzhybridisieren.

LL OOO^Q "" .· Γ ;^yit+

Weitere Charakterisierung von Hif-chr35

Hur zur Erläuterung wurde die Hybridisierungssequenz von chr-35 ("Hif-chr 35") weiter charakterisiert. Es soll damit gesagt sein, daß die Hyb'ridisierungsabschnitte der zuvor beschriebenen Chromosomen-Hybridphagen in ähnlicher Weise charakterisiert und behandelt werden könnten, ohne daß vom Geltungsbereich der Erfindung abgewichen würde·"

Der Hybridisierungsabschnitt von chr-35 (^lfHif-chr35^H) (und das rechte Segment von Hif-chr16, mit dem es höchstwahrscheinlich identisch ist, supra) ist der einzige hybridisierende Chromosomen-DNA-Abschnitt mit einer B^lII-Stelle. Oa Ii¹N- iO und IFN-tf 2-cDNAn 1 bzw. 2 Bglll-Stellen innerhalb ihrer Kodierungssequenz haben, ist es wahrscheinlich, daß · Hif-chr35 ein Gegenstück zu einem der beiden vorher geclonten Interferon-Gene ist. Die starke Hybridisierung von Hifchr35 zu dem 3'-terminal Hif-2h-cDEA-I<ragraent (das nur die 3^f-llicht-Kodierungsregion enthält) im Vergleich mit der schwächeren Hybridisierung der anderen der Chromosomen-DMn zu dieser Sonde, bestätigt eine mögliche Übereinstimmung .von Hlf-chr35 und Hif~2h (F. Kafatos, u.a., Proc. llatl, Acad. Sei. USA, 74, S. 5618 - 5622 (1977)).

Zur weiteren Analyse des Hif-cbr35-^'agmentes wurde ein 'Hindll-BamHI-Eragment von chr35 abgetrennt. Dieses Fragment (3,4 kb) enthält den Hybridisierungsabschnitt (^ftHif-chr35") von chr-35· Dieses Fragment wurde in die Pstl-Stelle von pBR322 subgeclont, wofür das allgemein bekannte dC-dG-Tailing-Verfahren (L. Yilla-Eomaroff, u.a., supra) angewandt wurde ^un<^ S. coIi HB101 mit dem resultierenden Rekombinant-DTTA-Molekül unter Anwendung allgemein bekannter Verfahren transformiert wurden (z.B.' S. TTagata, u.a., TTature, 284, S. 316 -

y »ι- ·•»• /

Clone dieser Transformanten wurden durch in situ Koloniehybridisier ung mit dem ^²P-markierten Hif-2h~Fragment (supra) einem Screening unterzogen_ (ι). Hanahan und M. Mesel^son> GeKie, 10, s. 63 - 67 (198O)) und Plasmid DITA — 3-pBR322 (Pst)/HcttrIF~35H3 ^HHchrIF-35HB" — war die von. den.positiven Clonen abgetrennte (ΪΤ.Μ. Wilkie, u.a., Nucleic Acids Bes., 7, S. 859 - 877 (1979), Methode B). Die Orientierung des Hybridinserts ^MHchrIF-35HB-Fragment" in dem Plasmid in bezug auf das /3-Lactamase-Gen von pBE322 wurde durch EcoRI-Spaltung und Bemessen der resultierenden Fragmente bestimmt. Der Insert, der so orientiert wurde, daß er mit dem von /3-Lactamase übereinstimmte, wurde mit (X bezeichnet und die entgegengesetzte Orientierung mit/4 ...

Kulturen dieser positiven Clone wurden· bis- zu einer scheinbaren ODg₁-Q = 0,8 vermehrt und die Bakterien geerntet und mit Hilfe der Lysozym-Gefrier-Tau-Methode, die bei S. ÜJagata, u.a. supra, beschrieben wird, lysiert. Sieben der 10 untersuchten Clöne zeigten IFlJ- *c -Aktivitäten -von 75 bis 5OO Einheiten/g Zellen (Analyse der Reduktion des cytopathi~ sehen Effektes).

Der DIA-Insert eines dieser sieben IFTT-erzeugenden Clone

— .Ε. coli HB101 (Z-pBr322(Pst)/HchrIF-35HB <χ) — wurde weiter durch Restriktionsanalyse und Fucleotidsequenzbestimmung charakterisiert. Pläsmid-DliA (HehrIF-3.5HB oC) 'wurde von dem Clon wie oben beschrieben hergestellt, und die Restriktionsstellen wurden durch Smith-Birnstiel-Kartierung bestimmt (H.0. Smith und M.L. Birnstiel, Fuel. Acids, Bes.__t 3, S. 2387

- 2398 (1976)): HchrIF-35HBf< wurde 'mit EcoBI digeriert, an den 5'-Termini markiert und. mit BgIII digeriert (und mit Pstl, um das unerwünschte- Fragment von etwa 1 kb zu spalten).

Die 1,04 kb lcoBI-BgIII (3'proximal)' und die 0,96kb ffcoKI-BgIII (5^T proximal) Fragmente wurden durch Agarosegel-Elektrophorese nach der Beschreibung von A.C. Peacock und C.W, Dingman, Biochemistry, 6, S. 1818- 1827 (1967) isoliert. Beide Fragmente wurden 'teilweise mit Hinfl," Bspl, bzw. MboII gespalten und die Produkte auf einem 1 %igen Agarosegel in Triacetat-Puffer (pH-Wert 7,8), der 1 /Ug/ml ithidiumbromid enthielt, getrennt, lach dem Färben wurden die radioaktiven Bänder durch Autor adiographie betrachtet. Die BstlTI- und HgiAI-Stelien wurden ähnlich an dem-1,04kb (3'proximal) Fragment bestimmt. Die Ergebnisse der Analyse sind in Fig. 19 zu sehen.

Für die Bestimmung der ?!ucleotidsequenz wurde HchrIF-. ' 35H3 «<· mit verschiedenen Restriktionsenzymen gespalten, die Produkte wurden durch Elektrophorese durch ein 5 %iges PoIyacrylamidgel in Triborat-SDTA-Puffer (A.C. Peacock und CW. Dingman, SUj)Ta) getrennt und von dem Gel extrahiert und,wie von W. Müller,' u.a., J. ^qI. Biol. , 124, S. 3^3 --358 (1978) beschriebe^ gereinigt.

· Die angewandte Sequenzierungsstrategie ist in Fig. 19 wiedergegeben und wird wie folgt beschrieben:

. 1 und-2 — Spaltung von HchrIF-35HB e< mit BgIII,. Markierung, Spaltung mit Sco3I und PstI und Isolierung eines .'BgIII⁺-ScORI-Fragmentes (68P bp) ("1") und eines BgIII⁺-ScQBI-Fragmentes (360 bp) -<"2"); ·

3 und 4 — Spaltung von Hehr 11-35HB* mit EcoRI, Markierung, Spaltung mit Bspl und Isolierung eines EcOSI⁺-B₁SoI-Fragmentes (680 bp) ("3") und eines ScoRI⁺-Bs_p_I-Fragmentes (880 bp ("4");'

5, 6, 7 und 8· — Spaltung von HchrIF~35H3χ mit PvuII,

9141 ;^/'Π u/r

Markierung, Spaltung mit BgIII und BcoRI und Isolierung von PjmII⁺-ScoBI~Fragment (780 bp) ("5"), eines :PjmII⁺-B£lII~Fragmentes"(2i5 bp) ("6"), eines Fy_uII⁺~BglII-iragmentes (90 bp) ("?"') und eines PvUlI⁺-EcoHI-Eraginentes (290 bp).("8");

9 und 10 — Spaltung von HchrIF-35HB«. mit ScoRI, Isolierung durch Elektrophorese mit 1 %igem Agarosegel in Triborat-"EDTA-Puffer eines 1300-bp-EcoRI-EcoHI-Iragmentes, weitere Spaltung mit Hinfl und Isolierung eines HinfI-Hinfl-Frag· mentes (4^0 bp) und eines. Hi^fI-Hinfl-Fragmentes (180 bp). Markierung des größeren Hinfl-Hinfl-Iragraentes und Spaltung mit ^¹IbOlI ermöglichte die Isolierung eines Hinfl' -MboII-Fragmentes (190 bp) ("9"). Markierung des kürzeren Hinfl-Hinfl-Fragmentes und Spaltung mit Avail ermöglichte die Isolierung eines'Hinf^-Avall-Fragmentes (15O bp) ("10");

11 — Spaltung von'HchrlF-J^HB χ mit MboII, Markierung, Spaltung mit BgI11 und Isolierung eines TJo01I⁺ -BgIII-Eragmentes (465 bp) ("11"); .

• 12, 13 und 14 — Spaltung von'HchrlF-35H3tf 'mit Bspl und BgIII, Isolierung durch Agarose-131ektropb.orese_/wie oben_y eines i200-bp-Bs_Ol-BglII-Eragmentes und (a) Spaltung mit HgiAI, Markierung, Spaltung mit Mb£ll und Isolierung eines HsiAl⁺-MboII-5ragmentes (3OO bp) ("12") und eines H£iAI⁺- MboII-Eragmentes (360 bp) ("13"), oder (b) Spaltung mit BstWI, Markierung, Spaltung mit ΈοοΗΙ und Isolierung eines BstTTI⁺-EcoEI-Eragmentes (380 bp) ("14"). '

Die verschiedenen Fragmente wurden mit Hilfe der Maxam-Gilbert-Methode (supra) sequenziert. 'Alle Fragmente wurden an beiden Strängen und über den Hestriktionsstellen, die als Ursprung für die Sequenzierung dienten, sequenziert.

Bin Vergleich der Hucleotidsequenz der Kodierungsregion

LL Ό Ο-ö ^

c und der von Hif-2h (Kodierungsregion) (Fig. 8 bis 10"im.Vergleich zu Fig. 20 bis 23) ergibt, daß sie identisch sind. Vor allem überrascht, daß es keine Anzeichen für das Vorhandensein von Introns innerhalb der Kodierungssequenz des HehrIF-35HB ^-Fragmentes, d.h. zwischen der Hinfl-Stelle in der 5^f-ß>icht~Kodierungsregion und der EcoRI-Stelle in der 3'-rücht-Kodierungsregion, gibt·. So konnte kein Intron in der reifer IFlT-KmRUA entsprechenden Chromosomensequenz nachgewiesen v/erden. Weitere Charakterisierung; von Hif-ch'r 26 und Hif-ehr 3

Me Gene· enthaltenden Segmente von ehr-3 und chr-26, die aufgrund von Heteroduplex-Analyse identisch zu sein scheinen, aber sich in .mindestens einer BgIII-Bestriktionsstelle unterscheiden, wurden mit Hilfe" der Nucleotidsequehzierung untersucht. Es wurden fünf Kucleotid-Differenzen in 725 Basenpaaren gefunden. Nur zwei davon treten- in den Kodierungssequenzen auf. Da nicht nur die Gene, sondern mindestens 3,5 ihnen vorausgehende.Kbp und 6,0 folgendemKbp einen perfekten Heteroduplex bildeten und infolge der verhältnismäßig geringen Sequenzdivergenz, die nur 2 Aminosäureveränderungen umfaßt, sieht es so aus, als ob Hif-chr3 und Hif-chr26 allelische Formen des gleichen Gens wären. Diese werden als IFF-*<i4-a (Hif-chr3) und .IE¹TT-K4b: (Hif-chr26) bezeichnet. Die Fucleotidsequenz und die entsprechende Aminosäuresequenz von IFI!-^4b, die durch herkömmliche, oben beschriebene Sequenzierungstechniken bestimmt wurden, sind in den Fig.. 29 bis 32 wiedergegeben.

.Ein Vergleich der Fig. 29 bis 32 mit den Fig. 8 bis 10, 12 bis 16 und 20 bis 23 ergibt, daß die durch "jede dieser. Sequenzen kodierten Proteine voneinander in etwa 15 % ihrer

K X /ι rl ~ ''~ .: -. ' !7ITOP/' «2/

Besiduen abweichen« Diese Divergenz ist typisch für Produkte von nicht-allelischen G.enen, die sich vor 20 bis 9° Millionen Jahren auseinander entwickelt haben. Expression von Hif~chr35 in Mäusezellen '' ...

Plasmid Z-pBS322(Pst)/HchrIP-35HB^ (jsup,ra) wurde als Quelle eines Hif-chr35*-S*agmentes für die Expression in Mäusezellen verwendet. Das Plasmid wurde der Restriktion mit Pstl unterzogen und mit 5'-Exonuclease behandelt, um die 5'~dG-Schweife zu entfernen. Dieses Fragment wurde dann in ein 5'-äG-geschweiftes Kp_nl-Iragmenf eines Plasmids^eingesetzt, das durch Vereinigen der BamHI-BamHI-ffragmente von pBR322 und Polynoma-DUA hergestellt'worden war. Der resultierende Vektor wurde zum 'transformieren von Mäuse-3T3-Zellen · unter Anwendung der Calc.iumphosphat-Technik'verwendet (W. Mantei, u.a., Hature, 281, S. 40 - 46 (1979)). Diese transformierten Zellen werden der Einfachheit halber als Mäuse-3T3 (Polynoma-Hif-chr35) bezeichnet. !lach 20 bis 40 Stunden ergaben Analysen eine IPH-od-Aktivität von 300 Einheiten/ml IEfT-*< bei Humanzellen und etwa 3000 Einheiten/ml Ii¹N-^ bei Rinderzellen.

Man sollte aber beachten, daß bei den in den Pig. 8 bis 10, 12 bis "16, 20 bis 23 und 29 bis 32 dargestellten TTucleotidsequenzen keinerlei Modifikationen in bezug auf die Wucleotidsequenzen berücksichtigt sind, -wie z.B. Mutation, einschließlich einfacher oder multipler, .Basensubstitutionen, Insertionen, Inversionen oder Deletionen, die bereits erfolgt sein können oder die anschließend .angev/andt werden könnten. Außerdem ist bei der Sequenz auch die mögliche Substitution anderer Codone nicht berücksichtigt worden, die für die gleiche Aminosäure kodieren wie das in diesen Mg. dargestellte

2 2 b b b 4

'/ I

Codon. Daher sollte man beachten, daß solche modifizierten 'Sequenzen als Kode für Polypeptide, die eine immunologische _: oder'biologische Aktivität von IFl¹T- # aufweisen, auch im Sahraen der Erfindung liegen. · · - .

Außerdem ist' zu beachten, daß die in den Fig. 8_: bis 10, 12 bis 16, 20 bis 23 und 29 bis 32 dargestellten Aminosäuresequenzen keinerlei Modifikationen· zu den Polypeptiden berücksichtigen, -die durch deren Wechselwirkung mit in vivo oder in vitro Mitteln, z.B. in vivo Gylcosolationsenzymen, hervorgerufen wurden. Daher ist verständlich, daß Fragmente und Derivate dieser Polypeptide, die eine immunologische oder biologische Aktivität von IFIT-o< aufweisen, ebenfalls im Geltungsbereich der Erfindung liegen«

.Erzeugung von Polypeptiden, die eine immunologische oder biologische Aktivität von Interferon in Bakterienwirten aufweisen

Da durch die Analyse der Reduktion des cytopäthischen Effektes (V/.S. Stewart II und S.E. Sulkin, S. B. Proc. Soc." Exp. 3iol. Med., 123, S. 650 - 653 (1966)) winzig« Mengen von IFF — weniger als ein aktives Molekül je Bakterienzelle — nachgewiesen werden können, wurden mit den zuvor beschriebenen zehn Hybrid-λ-Phagen infizierte Lysate von E. coil HB101 auf das. Vorhandensein von IP¹? hin untersucht. Sieben der elf Phagen (alle bis auf chr-10-, chr-12, chr-19 und chr-27) ergaben Lysate, die von 3 bis 5^ Einheiten/ml reichende IFTT-Aktivität enthielten. Im Falle von chr-10 und chr-12'.prägten die hybridisierenden (zu Hif-2h) Hlndlll-Hindlll oder EcoEI-EcoRI-Fragmente, die in die Pstl-Ste-lle von pB5233₇wie oben beschriebe^ subgeclont waren, IiPTT- ^ -Aktivität in E. coli aus. Da man annimmt,. daß 5. coli nicht in der Lage sind, . mKNA aufzuspalten (0. Mercereau-Puijalon und P. Kourilsky,

Nature,. 279, S. 647 - 649 (1979)), enthalten diese Chromosoraengene sehr wahrscheinlich keine Introns in ihrer Kodierungsregion. ·

Abschließende Schlußfolger

Es wurde eine Gruppe von Rekombinant-Dltä-Molekülen isoliert, die cDITa enthielten, die von PoIy(A)-RM von mit Sendai-Viren behandelten (induzierten)' Humanleukozyten-hergestellt worden war, von denen Vertreter die folgenden Eigenschaften haben:

(1) Sie hybridisieren zu PoIy(A)-SM von induzierten, aber nicht von nicht-induzierten Humanleukozyten;

(2) Sie hybridisieren zu IFR-KmRNA, ?/ie aufgrund ihrer Fähigkeit, diese ΚίΤΑ aus einem Gemisch von HHAn zu selektieren, und ihrer Fähigkeit, (reversibel) die Translation von Inter feron-mR ITA in der Hybrid-arretierten Translations analyse zu inhibieren, gezeigt wird.

(3) E. coli, die verschiedene Glieder der Gruppe enthalten, erzeugen eine Verbindung mit den folgenden "Hligenschaften:

(a) Sie ist gegenüber Trypsin sensitiv;

(b) sie weist IW-«^-Aktivität in einem Humanzellensystem und nur leichte Aktivität in einem Mäusezellensystem auf;

(c). sie hat eine relative. Molekülmasse zwischen 20 000 und 30 000 (19 388 auf der Basis der Hucleotidsequenzierung der Fig. 8 bis TO);

Cd) die IFH-<£-Aktivität wird spezifisch durch Antikörper gegen Humanleukosyten-Interferon inhibiert.

(4) Die DiTA-Inserts der erfindungsgemäßen Hybridplasmide sind neben ihrer Fähigkeit zur Selektion von IFW-^mSFA aus einem Gemisch von BHAn in der Lage, IM-^DiTA aus einem aus verschiedenen Quellen stammendem Gemisch, einschließlich

LL

cDTTAn, .und von Hybrid-Phagen-Genbänken von Chromosomen-DTTA auszuwählen.

(5) Ss gibt eine Anzahl verschiedener Chromosomengene für IPW-et . Es ist unerwartet,- daß diesen Genen Introns feh-

len und sie die direkte Impression von Interferon und interferonartigen Polypeptiden in entsprechenden Wirten ermöglichen.

(6) Mindestens drei der lucleotidsequenzen der. DHA-Inserts dieser Sekombinant-DJTA-Moleküle sind verschieden und deuten auf das Vorhandensein von mindestens drei nicht-allelischen Genen für IFTJ-^ hin. · ,

(7) Die durch diese drei ITucleotidsequenzen kodierten Proteine unterscheiden sich von den 35 Aminosäuren, die von authentischen Lymphoblastoid-Interferon bestimmt wurden. . '

(8) Hybridproteine, die für verschiedene Kombinationen von IFTT-s^-Gensegmenten hergestellt wurden, zeigen quantitativ andere Eigenschaften als jedes andere oder ihre Stammformen und Proteine mit zusätzlichen Aminosäuren, die mit IFTT-^ verschmolzen sind, oder Proteine, die IFIT- o< enthalten, ohne daß ein Teil ihrer Aminoterminalsequenz IFTT-Aktivität ' aufweist,-

Diese Eigenschaften demonstrieren, daß die erfindungsgemäß beschriebenen Eekombinant-DFA-Moleküle mindestens einen Teil der EOdierungssequenz für Humanleukozyten-Interferon enthalten und daß einige dieser Plasmide in F;. coil zur "Expression eines Polypeptids mit einer immunologischen oder biologischen Aktivität von Humanleukozyten-Interferon führen. Es dürfte auch klar sein, daß die hier offenbarten Polypeptide fragmentiert, modifiziert oder-defivatisiert werden können, wie es auf dem Fachgebiet der Jtroteine allgemein bekannt ist, ohne daß vom Inhalt oder der Offenbarung der Erfindung ab ge-

wichen wird. ' ' .

Mikroorganismen und nach den hier beschriebenen Prozessen hergestellte Rekombinant-DTTA-Moleküle sind durch Kulturen vertreten, die in der Kultürensammlung der Deutschen ; Sammlung von. Mikroorganismen in Göttingen, Westdeutschland, am 7. Januar I98O hinterlegt und als HcIF-A bis E identifiziert wurden:

A: E. coli HB101 (Z-pBH522(Pst)/HcIF-4c) . .

B: E. coli HB101 (Z-pBI?322(Pst)/HcIP-2h) Gi S. coli HB101 (Z-pBB322(Pst)/HcIF-SN55)' D: E. coli HB101 (Z-p3S322(Pst)/HcIP-STT42) . . ~®:< E. coli HB101 (Z-pK0)287(Pst)/HcII^l-2h-AH6) ·

Diese Kulturen erhielten die Zugangsnunraern DSM 1699 bis i7O3· Außerdem sind Mikroorganismen und durch die hier beschriebenen Prozesse hergestellte Hekombinant-DIiA-Moleküle in der Kulturensammlung der American Type Culture Collection,' Rockville, Maryland, am 27. März 1980 hinterlegt und als HicIP-G bis H identifiziert und mit den ATGC-Zugatigsnummerη 3/633 bzw. 3/634 versehen worden: ^G: 3. coli HB101 (Z-pBE322(Pst)/HcIP-11-206) ^H: E. coli HB101 (Z-pBR322(Pst)/HcIF-SM35-AHI6)

Andere.durch die hier beschriebenen Prozesse hergestellte Mikroorganismen sind durch Kulturen vertreten, die in der Kulturensammlung der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen in Göttingen, Westdeutschland, am 1. Oktober I98O hinterlegt und als Hchr,IP-A bis J identifiziert und mit den Zugangsnummern DSI! 191.4 - 1923 versehen wurden:

A. subgeclontes HindlU-Fragment von chr3 in g^jpoll HB101;

B. subgeclontes Ec_oBI-Fragment von ehr 12 in E. coli HB101;

C. subgeclontes Hindlll-Itaginent von cbr 12 in Έ. coli HB101;

226884 .ö

D. subgeclontes EcoRI-Fragment von ehr 13 in "S. coli HB101; Β·.· subgeclontes EcoRI-fragment von ehr 23 in E. coli H31O1;

F. subgeclontes Hind,III-Fragment von ehr 23 in E. coli HB101;

G. .,subgeclontes E_coE I-Fragment von ehr 26 in E. coli HB101; H. subgeclontes Hindlll-Eragment von ehr 26 in E. coli ΗΒ1ΟΊ; I* subgeclontes Hindlll/BamHI-Fragment von ehr 35 in E. coli

HB101; J. subgeclontes BamHI-Sragment von ehr 35 in Ξ» coli HB101

Schließlich werden nach den beschriebenen Prozessen hergestellte MikrοOrganismen durch Kulturen vertreten, die in der American.Type Culture Collection, Rockville, Maryland, am 15. Dezember 1980 hinterlegt und als HchrlF-K bis HehrIF-Q .und HcIF-I bis HcIF-K identifiziert und mit den ATTC-Zugangsnummern .31760 HehrIF-K.

31761 HehrIF-L .

31762 HchrlF-M "

31763 HehrIF-IT '

31764 HehrIF-O

31765 HehrIF-P

31766 HehrIF-Q

31767 HcIF-I

31768 HcIF-J

31769 HcIF-K . ' '

versehen wurden.

K. subgeclontes T_ac-Tac-Fragment von ehr 23 in E, coli HB101; L. subgeclontes Bglll-Bglll-Pragraent von ehr 101 in Ej. coli

HS101;

M. subgeclontes Hindlll-Hindlll-Fragment von ehr 1Or in

E.....coli HB101;" . .

N. subgeclontes BgIII-E^lII-Fragmewf von ehr 26 in Ξ. coli

HBI01 j .

0. subgeclontes Hindlll-Hindlll-Fragment'von ehr 30 in

E. coli HB101 ;

P. subgeclontes BgIII-Tac-Fragment von ehr 13 in -E. coli HB101; Q. subgeclontes BgIII-Tac-Fragment von ehr 16 1 in E. coli ¹ HBIOi. ' ·

HcIF-I: E. coli DS4-10 (GS-IFlT- _K2} . .

^HcIF-J: ]g. coli DS4-10 (LAC-AUG( ot2)) HcIF-E: E. coli DS^iO (/S-Iac.-AÜG( ^ 2))

Wenn auch oben eine Reihe von Ausführungsformen der Erfindung vorgelegt worden sind, so ist klar, daß die Grundkonstruktion verändert werden kann, um andere Ausführungs-formen mit Hilfe .der erfindungsgemäßen Prozesse und Zusammensetzungen zu schaffen. Daher ist vorgesehen, daß der Geltungsbereich der Erfindung durch die angefügten Ansprüche und weniger durch die spezifischen Ausführungsformen,· die oben a.nhand von Beispielen erläutert wurden, festgelegt wird. ·

Claims (2)

Erfindungsanspruch: .

1. Verfahren zur Herstellung eines eine immunologische oder biologische Aktivität von Humanleukozyten-Interferon aufweisenden Polypeptids, gekennzeichnet durch die Schritte, daß ein Wirt gezüchtet wird, der durch ein Rekombinant~ -DNA-Molekül transformiert wurde,; das eine aus der Gruppe bestehend aus einem lac-System, einem /C-lac-System, einem trp-System, Hauptoperator- und Promotorregionen von Pha^e /\ , der Kontrollregion von fd-Coatprotein ausgewählte Expressions-Kontroll-Sequenz hat, und andere Sequenzen, die die Expression von Genen prokaryotischer oder eukaryotischer Zellen und deren Viren steuern, operativ mit einer DNA-Sequenz verbunden sind, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus den DNA-Inserts von Z-pBR322(Pst)/HcIF-4c, •Z-pBR322(Pst)/HcIF-2h, Z~pBR322(Pst)/HcIE'~£N35, Z-pBR322' (Pst)/HcIF-SN42, Z-pKT287(Pst)/HcIB^>-2h-AH6, DNA-Sequenzen, die zu einem der vorstehenden DNA-Inserts hybridisiere^ DNA-Sequenzen, gleich aus welcher Quelle stammend, einschließlich natürlicher, synthetischer oder halb-synthetischer Quellen, verwandt durch Mutation, einschließlich einfacher oder mehrfacher, Basensubstitutionen,. Deletionen, Insertionen und Inversionen mit einer der vorstehenden DNA- -Sequenzen oder Inserts, und DNA-Sequenzen, die Sequenzen von Oodons ausweisen, die bei Expression für ein Polypeptid kodieren, das ähnliche immunologische oder biologische Aktivität wie ein bei Expression der Codons einer der vorstehenden DNA-Sequenzen und Inserts dafür kodiertes Polypeptid aufweist·

2· Verfahren nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß die zu dem DNA-Insert hybridisierende DNA-Sequenz ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus den DNA-Inserts

von Z-pBR322(Pst)/HcI2¹~II-206 oder Z~pBR322(Pst)/HcIF-SN35-AHL6, DNA-Sequenzen, die zu einem, der vorstehenden DNA-Inserts hybridisieren, DNA-Sequenzen, gleich aus welcher' Quelle stammend, einschließlich natürlicher, synthetischer oder halb-synthetischer Quellen, verwandt durch Mutation, einschließlich einfacher oder mehrfacher, Basensubstitutionen, Deletionen, Insertionen und Inversionen mit einer der vorstehenden DNA-Sequenzen oder Inserts, und DNA-Sequenzen, die Sequenzen von Codons umfasseni die bei Expression für ein Polypeptid kodieren, das ähnliche immunologische oder biologische Aktivität wie ein bei Expression· der Codons einer der vorstehenden DNA-Sequenzen und Inserts dafür kodiertes Polypeptid aufweist.

3. Verfahren nach Punkt 1 oder 2, gekennzeichnet dadurch, daß die zu dem DNA-Insert hybridisierende DM-Sequenz ausgewählt ist der Gruppe bestehend aus Hif-chr1, Hif-chr3, Hif-chr12, Hif~chr13, Hif-chr16-i, Hif-chr26, Hif-chr30, Hif-chr35s DNA-Sequenzen, die zu einer der vorstehenden DNA-ßequenzen hybridisieren, DNA-~Sequenzen, gleich aus welcher Quelle stammend, einschließlich natürlicher, synthetischer oder halb-synthetischer Quellen, verwandt durch Mutation, einschließlich einfacher oder mehrfacher, Basensubstitutionen, Deletionen, Insertionen und Inversionen mit einer der vorstehenden DNA-Sequenzen, und DNA-Sequenzen, die Sequenzen von Codons aufweisen, die bei Expression für ein Polypeptid mit ähnlicher immunologischer oder biologischer Aktivität wie ein bei Expi^ession einer der vorstehenden DNA~Sequenzen dafür kodiertes Polypeptid kodieren.

Ill

22688 4 8 - »

4·. Verfahren nach Punkt 1 oder 2, gekennzeichnet dadurch, daß die zu dem DNA-Insert hybridisierende DNA-Sequenz ausgev/ählt ist aus der Gruppe bestehend aus Hif-chr19» Hif-chr27, DNA-Sequenzen, die zu einer der vorstehenden DNA-Sequenzen hybridisieren, DNA-Sequenzen, gleich aus welcher Quelle stammend, einschließlich natürlicher, synthetischer oder halb-synthetischer Quellen, verwandt durch Mutation, einschließlich einfacher oder mehrfacher, Basensubstitutionen, Deletionen, Insertionen und Inversionen mit einer der vorstehenden DNA-Sequenzen, und DNA-Sequenzen, die Sequenzen von Codons aufweisen, die bei Expression für ein Polypeptid mit ähnlicher immunologischer oder biologischer Aktivität wie ein bei Expression einer der vorstehenden DNA-Sequenzen dafür.kodiertes Polypeptid kodieren· ' . '

5. Verfahren nach einem der Punkte" 1 bis 4, gekennzeichnet dadurch, daß die DNA-Sequenz ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus DNA-Sequenzen.der Formel:.

atggcctcgccctttgctttactgatggtcctggtggtgctcagctgcaagtcaa gctgctctctgggctgtgatctccctgagacccacagcctggataacaggaggac cttgatgctcctggcacaaatgagcagaatctctccttcctcctgtctgatggac agacatgactttggatttocccaggaggagtttgatggcaacoagttcoagaagg7.

ctocagocatctctgtcctgcatgagctgatccagoagatcttoaacctctttao caoaaaagattcatctgctgcttgggatgaggacctcctagacaaattotgcacc gaactotaccagcagctgaatgacttggaagoctgtgtgatgcaggaggagaggg tgggagaaactoccctgatgaatgoggaotccatcttggotgtgaagaaataott cogaagaatcaotctctatotgacagagaagaaataoagooctigtgcctgggag gttgtcagagcagaaatcatgagatcotctctttatcaaoaaaottgcaagaaag ATTAAGGAGGAAGGAATAAV TGTGATCTCCOTGAGACOCACAGCOTGGATAA CAGGAGGACCTTGATGCTCOTGGCAOiIAATGAGCAGAATCTOTCCTTCCTCCTGT CTGATGGACAGAOATGACTTTGGATTTCCCCAGGAGGAGTTTGATGGCAACCAGT

AU

TGCAGAAGGCTCGAGGCATGTCTGTCCTCCATGAGGTGATCCAGCAGATCTTCAA
CCTCTTTACCACAAAAGATTCATCTGGTGCTTGGGATGAGGACCTCCTAGACAAA'
TTCTGCACCGAACTCTACCAGGAGCTGAATGAOTTGGAAGOCTGTGTGATGCAGG
AGGAGAGGGTGGGAGAAACTGGGCTGATGAATGCGGACTCCATCTTGGCTGTGAA
GAAATAGTTCCGMGAATCACTCTCTATCTGAOAGAGAAGAAATACAGCGCTTGT
GCCTGGGAGGTTGTCAGAGGAGAMTGATGAGATCCCTCTCTTTATCMCAMGT
TGCMGAMGATTMGGAGGMGGMTM und Fragmenten und Derivaten davon, wobei die Fragmente und Derivate für eine
immunologische oder biologische Aktivität von TPN-'x
aufweisende Polypeptide kodieren·

6» Verfahren nach einem der Punkte 1 bis 4·, gekennzeichnet dadurch, daß die DNA-Sequenz ausgewählt ist aus der
Gruppe bestehend aus DNA-Sequenzen der Formel:
TTACTGGTGGCOCTCGTGGTGCTCAGCTGOAA-GTCMGCTGCTGTGTGGGCTGTGAt ctgcctcamcocacagoctgggtagcaggaggaccttgatgctcctggcacagatg aggagmtctctcttttotoctgottgmggacagacatgaotttggatttccocag gaggagtttggcmcgagttccaamgggtgamccatocctgtcgtccatgagatg atocagcagatcttcmtotcttcagcacamggactgatctggtggttgggatgag agcotcctagaoamttotacactgmctotacoagcagotgmtgacctggmgoc tgtgtgatacagggggtgggggtgacagagactoccctgatgmggaggagtccatt ctgggtgtgaggamtacttccamgmtgactctctatctgamgagmgamtao agoccttgtgcctgggaggttgtcagagoagamtcatgagatctttttctttgtca acamcidtgcmgaaagtttmgmgtmggaatga, tgtgat ctgcot oamcc cacagogtgggtagoaggaggaccttgatgctcotggcacagatgaggagmtctct cttttctcctgottgmggacagaoatgactttggatttcggcaggaggagtttggc mccagttcgaamggctgamccatcggtgtcctccatgagatgatooagoagatc ttcmtgtcttcagoacamggaotoatctgctgctrgggatgagacoctcotagao amttgtacactgmctctaocagoagctgmtgacctggmgcctgtgtgatacag ggggtgggggtgaoagagactcccctgatgmggaggactocattctggctgtgagg aaatacttccamgaatcactctgtatctgmagagmgamtaoagcocttgsgoc tgggaggttgtcagagoagamtcatgagatctttttctttgtomcamcttgom GMAGTTTMGMGTMGGMTGA und Fragmenten und Derivaten

226884 8-T-

davon, wobei die Fragmente und Derivate für eine immunologische oder biologische Aktivität von IPN- oC aufweisende Polypeptide kodieren*

7· Verfahren nach einem der Punkte 1 bis 4-, gekennzeichnet dadurch, daß die DHA-Se q.uenz ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus DNA-Sequenzen der Formal:

aoxigccctgtggttttctttaotgatggocgtgotggtgctcagctacaaatccato tgttctctgggctgtgatctgcctoagacccaoagcctgggtaataggaggaccttg ATAOTCOTGOAACAMTGGGAAGAATCTCTCATTTCTCCTGCCTGAAGGACAGAOAT GATTTCGGATTOCCOGAGGAGGAGTTTGATGGCOAOCAGTTCCAGAAGACTCAAGCC ATCTCTGTCCTCCATGAGATGATCCAGCAGAOCTTOAATCTCTTCAGCACAGAGGAO TOATOTGCTGCTTGGGAACAGAGCCTCCTAGAAAAATTTTCCACTGAAOTTTACOAG CAACTGAATGACOTGGAAGOATGTGTGATACAGGAGGT-TGGGGTGGAAGAGACTCOO CTGATGAATGTGGACTOOATCCTGGCTGTGAGGAAATAOTTCCAAAGAATCAGTCTT TATCrAACAGAGAGAAGAAATAOAGCCOTTGTGCCTGGGAGGTTGTAiiAAAAGATTA AGGAGGAAGGATTGA, TGTGATCTGCOTOAGACOOAOAGCCTGGGTAäTAGGAGG accttgatactoctgcaagaaatgggaagaatctctcatttctcctgcctgaaggao agacatgatttcggattooocgaggaggagtttgatggccaccagttccagaagact caagcoatctctgtcctcoatgagatgatccagoagacottcaatctcttoagoaca gaggactcatctgctgcttgggaacagagcctootagaaaaattttogaotgaactt taooagoaactgaatgacctggaagcatgtgtgataoaggaggttggggtggaagag aotcocctgatgaatotggaotccatcctggctgtgaggaaatacttccaaagaatc actctttatctaacagagaagaaatacagcocttgtgcotgggaggttgtoagagca gaaatcatgagatccotctcgttttcaacaaaottgcaaaaaagattaaggaggaag.

GATTGA und.Fragmenten und Derivaten davon, wobei die Fragmente und Derivate für eine immunologische oder biologische Aktivität von IFN-^ aufweisende Polypeptide kodieren·

26 88 4

8, Verfahren nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß das Bekornbinant-DNA-Molekül aus der C8~IFE~ö< 1, 08-IPN LAC-AUG (<X 2) und y^-lac-AUG. (</2) umfassenden Gruppe aus~ gewählt ist»

9· Verfahren nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß das erzeugte Polypeptid aus der IFN-oC!, IFN- d 2_?
und IFN- «ν4b umfassenden Gruppe ausgewählt .ist.

10. Verfahren nach Punkt 9* gekennzeichnet dadurch, daß das Polypeptid ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Polypeptiden der For&eli .

MetAlaSerProPheAlaLeuLeuMetValLeuValValLejiSerOysljysSerSer CysSerLe uGlyCy sAspLe uJProGluThrHisSerLe uAspAsnArgArgThrLe u Me tLe uLe uAlaGlnlvle tSerArglleS erProSerSe rOysLe uMe t AspArgHis AspPheGlyPheProGlnGluGluPheAspGlyAsnGlnPheGlnLysAlaProAla IleSerValLeuEisGluLeuIleGlnGlnllePheAsnLeuPheThrThrLysAsp . SerSerAlaAlaTrpAspGluAspLeuLeuAspIjysPheCysThrGluLeuTyrGln GlnlieuAsnAspLeuGluAlaCJysVallietGlnGluGluArgValGlyGluThrPro LeuIletAsnAlaAspSerlleLeuAlaValLysLysTyrPheArgArglleThrLeu TyrLeuThrGluLysLysTyrSerProGysAlaTrpGluYalValArgAlaGluIle MetArgSerLeuSerLeuSerThrAsnLeuGlnGluArgLeuArgArgLysGlu,

' CysAspLeuProGluThrHisSerLeuAspAsnArgArgThrLeuivIetLeuLeuAla GlnlnetSerArglleSerProSerSerCysLeuIiietAspArgHisAspPheGlyPhe ProGlnGluGluPheAspGlyAsnGlnPheGlnLysAlaProAlalleSerYalLeu ' HisGluLeuIleGinGlnllePheAsnleuPheThrThrLysAspSerSerAlaAla TrpAspGluAspLeuLeuAspLysPheOysThrGluLeuTyrGlnGlnLeuAsnAsp

' LeuGluAlaÖysYaiaietGlnGluGluArgValGlyGluThrProLeuiletAsnAla AspSerlleLeuAlaYalLysLysTyrPheArgArglleThrLeuTyrLeuThrGlu LysLysTyrSerProCysAlaTrpGluValValArgAlaGluIleMetArgSerLeu SerLeuSerThrAsnLeuGlnGluArgLeuArgArgLysGlu und Poly-

226884

peptiden, gleich aus welcher Quelle stammend, verwandt
mit einem der vorstehenden Polypeptide durch Mutation,
einschließlich einfacher oder mehrfacher, Basensubstitutionen, Deletionen, Insertionen und Inversionen der für
sie kodierenden DNA-Sequenzen· . · " .

11c Verfahren nach Punkt 9» gekennzeichnet dadurch, daß das Polypeptid ausgewählt ist der Gruppe bestehend aus
Polypeptiden der Formel: ,

Le uLe uValAlaLe uLeuValLe uSerCysLysSerSerCysSerValGlyCysAsp Le uProGlnThrHisSerLe uGlySerArgArgThrLe uMe tLe uLe .uAlaGlnMe t ArgArglleSerLe uPheSerOysLe uLysAspArgHisAspPheGlyPheProGln GluGluPheGlyAsnGlnPheGlnLysAlaGluThrlleProYalLeuHisGluliet IleGlnGlnllePheAsnLeuPheSerThrLysAspSerSerAlaAlaTrpAspGlu ThrLe uLe uAspLy sPheTyrThrGluLe uTy rGlnGlnLe uilsnAspLe uGluAla OysYallleGlnGlyYalGlyYalThrGluThrProLeuIvIetLysGluAspSerlle LeuAlaValArgLysTyrPheGlnArgIleThrLeuO}yrLeuLysGluLysLysTyr SerProCysAlaTrpGluYalValArgAlaGluIleMetArgSerPheSerLeuSer ThrAsnLeuGlnGluSerLeuArgSerLysGlu, · CysAspLeuProGlnThrHis SerLe uGlyS erArgArgThrLe uMe tLe uLe uAlaGlnlae t ArgArglIeSerLe u PheSerCysLeuLysAspArgHisAspPheGlyPheProGlnGluGluPheGlyAsn GlnPheGlnLysAlaGluThrlleProYalLeuHisGluMetlleGlnGlnllePhe AsnLeuPheSer!ThrLysAspSerSerAlaAla5?rpAspGluThrLeuLeuAspLys FneTyrThrGluLe uTyrGlnGlnLe uAsnAspLe uGluAlaCysYallleGlnGly ValGlyValThrGluShrProLeuIiietlysGluAspSerlleLeuAlaYalArgLys TyrPheGlnArglleOlhrLeuTyrLeuLysGluLysLysTyrSerProCysAlaTrp GluValYalArgAlaGluIleMetArgSerPheSerLeuSerThrAsnLeuGlnGlu SerLeuArgSerLysGlu und Polypeptiden, gleich aus welcher Quelle stammend, verwandt mit einem'der vorstehenden Polypeptide durch Mutation, einschließlich, einfacher oder
mehrfacher, Basensubstitutionen, Deletionen, Insertionen und Inversionen der für sie kodierenden D!A-Sequenzen·

12. Verfahren nacht Punkt 9» gekennzeichnet; dadurch, daß das Polypeptid ausgewählt; ist aus der Gruppe bestehend aus Polypeptiden'der i?ormel: ' ·

MetAlaLeuSerPheSerLeuLeuliietAlaValLeuYalLeuSerTyrLysSerlle OysSerLeuGlyGysÄspLeuProGlnThrHisSerLeuGlyAsnArgArgThrLeu IleLeuLeuGlnGlnMetGlyArglleSerHisPheSerOysLeuLysAspArgHis AspPheGlyPheProGluGluGluPheAspGlyHisGlnPheGlnLysThrGlnAla IleSerValLeuKisGluIifietlleGlnGlnThrPheÄsnLeuPheSerThrGluAsp SerSerAlaAlaTrpGlüGlnSerLeuLeuGluLysPheSerThrGluLeuTyrGln GInLeuAsnAspLeuGluAlaCysVallleGlnGluValGlyValGluGluThrPro LeuMetAsnValAspSerlleLeuAlaYalArgLysTyrPheGlnArglleThrLeu TyrLeuThrGluLysLysTyrSerProOysAlaTrpGluYalYalArgAlaGluIle MetArgSerLeuSerPheSerihrAsnLeuGlnLysArgLeuArgArgLysAsp, C/ysAspLeuProGlnThrHisSerLeuGlyAsnArgArgThrLeuIleLeuLeuGln Gln&ietGlyArglleSerHisPheSerCysLeuLysAspArgHisAspPheGlyPhe ProGluGluGluPheAspGlyHisGlnPheGlnLysThrGlnAlalleSerValLeu HisGluIiletlleGlnGlnThrPheAsnLeuPheSerThrGluAspSerSerAlaAla"! TrpGluGlnSerLeuLeuGluLysPheSerThrGluLeuTyrGlnGlnLeuAsnAsp Le uGluAlaCysYallleGlnGluYalGlyValGluGluCDhrProLe \Mz tAsnVal AspSerlleLe uAlaYalArgLysTyrPheGlnArglleThrLe uTyrLeuThrGlu LysLysTyrSerProOysAlaTrpGluYalYalArgAlaGluIIeMetArgSerLeu SerPheSerlhrAsnLeuGlnLysArgLeuArgArgLysAsp und Polypeptiden, gleich aus welcher Quelle stammend, verwandt mit einem der vorstehenden Polypeptide, durch Mutation, einschließlich einfacher oder mehrfacher, Basensubstitutionen, Deletionen, Insertionen und Inversionen der für die kodierenden DNA-Sequenzen.

13. Verfahren nach einem der Punkt 1 bis 12, gekennzeichnet dadurch, daß der nicht-transformierte Wirt-aus der Stämme von B. coli, Pseudomonas, Bacillus subtilis,

2 2688 4 8 -ΐ-

Bacillus steapothermophilus und andere Bazillen, Hefen, Fungi, tierische und pflanzliche Wirte, sowie Humangewebezellen umfassenden Gruppe ausgewählt ist.

Seiten Zeidinungen