DE3020528C2 - - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft die in den Ansprüchen 1 bis 8 angegebenen Plasmide und deren Herstellung gemäß den Ansprüchen 9 bis 14.

Der genetische Gehalt der meisten Organismen liegt in Form von DNS vor. Diese genetische Information wird durch eine komplexe Reihe von Reaktionen ausgedrückt, die die Transcription der DNS in RNS und die anschließende Umwandlung (Translation) der RNS in Protein einschließen.

In Bakterienzellen sind Transcription und Translation eng verknüpft. Die Menge eines gegebenen Proteins wird durch den Umfang der stattfindenden Transcription geregelt. Das Trytophan-Operon und seine Regelung und Kontrolle ist ein gutes Beispiel hierfür. Bakterien synthetisieren Trypthophan durch eine Reihe von biochemischen Reaktionen, an denen fünf Enzyme beteiligt sind. Die genetische Information zur Bildung dieser Enzyme ist so organisiert, daß die einzelnen Gene im Genom aufeinanderfolgen und alle von einer einzigen Stelle, dem Operator, gesteuert werden. Die Regulierung der Transcription verläuft nach einem Rückkopplungsprinzip, d. h., in Gegenwart von Tryptophan ist das Operon blockiert oder unterdrückt, während es in Abwesenheit von Tryptophan wieder freigelassen wird. Im freigelassenen Zustand wird Transcription am Promoter (einem Bereich von DNS nahe dem Operator mit hoher Affinität zu RNS-Polymerase) ausgelöst; sie verläuft über den Operator in die Strukturgene des Operons.

Eukaryotische DNS-Fragmente können bekanntlich in bakterielle Plasmide eingefügt werden (siehe beispielsweise Roychoudhury, R., et al., Nucleic Acids Research, 3 [1976], 863-877) und R. H. Scheller et al., Science, 196 [1977], 177-180). Es ist jedoch offensichtlich, daß eingeführte eukaryotische Promotersequenzen von Bakterienzellen, beispielsweise von E. coli-RNS-Polymerase, in vivo schlecht erkannt werden. Zwar wurde berichtet, daß es möglich war, Bakterienmutationen durch DNS- Fragmente aus Hefe zu ergänzen, jedoch war das Ausmaß, in dem das geklonte Gen ausgedrückt wurde, gering, so daß langsam wachsende Bakterien gebildet wurden (siehe beispielsweise J. Carbon et al., Recombinant Molecules: Impact on Science and Society [1977], 355-378, Raven Press, New York).

Ebenso fand die Transcription von geklonter Mäuse- Mitochondrien-DNS in E. coli vom falschen Strang aus statt (siehe beispielsweise W. M. Brown et al., "Cell", 7 [1976], 517-530).

Die Erfindung umfaßt ein Plasmid mit einer Einfügungsstelle für ein eukaryotisches DNS-Fragment in Nachbarstellung zu einem bakteriellen trp-Promoter und hinter (downstream) einer prokaryotischen Ribosomenbindungsstelle und einem Initiatorkodon in einer solchen Weise, daß der bakterielle trp-Promoter die Transkription und Translation eines eingefügten DNS-Fragments reguliert und steuert.

Die Plasmide gemäß der Erfindung werden im allgemeinen ebenfalls in dem der Einfügungsstelle unmittelbar folgenden Bereich mit dem Gen für Tetracyclin- Resistenz vorgesehen, so daß nach der Einfügung der gewählten DNS an der Einfügungsstelle die durch den Promoter gesteuerte Transcription und Translation der eingefügten DNS, in einfacher Weise bestätigt werden kann, da, wenn sie stattgefunden hat, die Tetracyclin- Resistenz erhalten bleibt und - in den meisten Fällen -, wenn sie nicht stattgefunden hat, die Tetracyclin- Resistenz zerstört ist.

Ein solches Plasmid kann nach einem Verfahren hergestellt werden, das darin besteht, daß man einen Wildstamm von E. coli mit Restriktionsendonuclease Hind III digeriert, das hierbei erhaltene Fragment mit dem linearen Molekül verbindet, das durch die Restriktion des Plasmids pBR322 mit der Restriktionsendonuclease Hind III erhalten worden ist, trp ○ E ∇ 1 E. coli mit dem erhaltenen Plasmid transformiert und diejenigen Kolonien von E. coli auswählt, die Resistenz oder Empfindlichkeit gegen Tetracyclin und Tryptophan-Komplementierung zeigen.

Als Beispiel der Plasmide gemäß der Erfindung sei das Plasmid genannt, dessen Eigenschaften schematisch in Fig. 1 dargestellt sind, nämlich eine Moleküllänge von 6750 bp, eine Hind III-Stelle, ein Bam HI-Stelle bei 346 bp von der Hind III-Stelle, eine Sal I-Stelle bei 275 bp von der Bam HI-Stelle, eine Hpa I-Stelle bei 4230 bp von der Sal I-Stelle und 1950 bp von der Hind an jedem Ende des eingefügten Hinf I-Fragments aus dem ursprünglichen pEH5.

Um sicherzustellen, daß die eingefügte DNS dem Tryptophan- Promoter benachbart ist, ist es notwendig, daß die Hind III-Stelle oberhalb (stromaufwärts) des Tryptophan- Promoters entfernt wird. Dies kann erreicht werden durch Restriktion des Plasmids pWT101 mit der Restriktionsendonuclease Eco RI, Digestion mit Exonuclease III und S1, Behandlung mit DNS-Polymerase I (zur Füllung etwaiger asymmetrischer Enden, die durch S1-Nuclease-Digestion gebildet worden sind) und Verknüpfen der freien Enden des Plasmids unter Bildung eines hier als pWT111 bezeichneten Derivats von pWT101, das nur eine Hind III-Stelle, und zwar stromabwärts vom trp- Promoter aufweist.

Die Erfindung umfaßt demgemäß außerdem ein Plasmid pWT111, das so ausgebildet ist, daß es eingefügte DNS an der Hind III-Stelle aufnimmt, wobei die DNS erhalten wird, die unter dem direkten Einfluß des trp-Promoters steht. Kopieren und Übertragen der eingefügten DNS lassen sich leicht bestätigen, da das Plasmid nach (downstream) dem eingefügten Fragment das Gen für Tetracyclin-Resistenz enthält, so daß das Kopieren durch die eingefügte DNS über das tet-r-Gen weiter verläuft, das Tetracyclin-Resistenz erzeugt, die nicht erzeugt wird, wenn die Transkription über die eingefügte DNS nicht stattfindet.

In Abhängigkeit von der Natur des DNS-Fragments, dessen Einfügung gewünscht wird, ist es notwendig, richtige Phaseneinstellung im Plasmid, die derjenigen der einzufügenden DNS gleicht, sicherzustellen. So enthält durch umgekehrte (reverse) Transkription aus m-RNS gebildete doppelsträngige c-DNS, wenn sie vollständig ist, normalerweise eine Länge von Nucleotiden III-Stelle, und das Plasmid hat den trp-Promoter, das E-Gen und einen Teil des D-Gens in dem Teil von 1950 bp, der sich zwischen der Hpa I-Stelle und der Hind III- Stelle erstreckt, und das Gen für Ampicillin-Resistenz in dem Teil von 4800 bp zwischen der Hind III-Stelle und der Hpa I-Stelle.

Wiederum als Beispiel sei nachstehend ein Verfahren zur Herstellung dieses hier als pEH5 bezeichneten Plasmids beschrieben.

a) Isolierung des Hind III-TrpE-Fragments

Dieses Fragment kann entweder durch Hind III- (EC3.1.23.21)-Digestion von DNS aus den meisten Stämmen von E. coli, z. B. E. coli-Stamm W3110, oder durch Hind III-Digestion des Plasmids pRH1/trpE erhalten werden. pRH1 selbst wurde durch Eco RI-(EC3.1.4.32)- Digestion von E. coli-Plasmiden pDS1118 und pML2, Verbinden der hierbei erhaltenen Fragmente und Auswahl hinsichtlich Resistenz gegen Ampicillin und Kanamycin erhalten. Hind III-Digestion von pRHI und Verbinden mit Hind III-digerierter DNS vom Stamm E. coli W3110 und anschließende Umwandlung in den Stamm W3110 trp ○ E ∇ 1 und Kultivierung in Abwesenheit von Tryptophan ergab pRH1/trpE.

b) Klonen des Hind III-trpE-Fragments

Das in der vorstehend beschriebenen Weise erhaltene Fragment Hind III trpE wurde an ein Fragment, das durch Hind III-Restriktion des Plasmids pBR322 erhalten worden war (siehe beispielsweise F. Bolivar et al., "Gene", 2 [1977], 95-113), kovalent gebunden. Die gebundene DNS wurde zur Umwandlung von E. coli W3110 trp ○ E ∇ 1 verwendet, und Kolonien wurden für Resistenz gegen Ampicillin und Tryptophan-Ergänzung ausgewählt. Es zeigte sich, daß die erhaltenen Plasmide in Abhängigkeit von der Orientierung der Fragmente während des Verbindens zu zwei Typen gehörten. Diese beiden Plasmide, die hier als pEH3 und pEH4 bezeichnet werden, sind in Fig. 2 bzw. Fig. 3 dargestellt. Das Plasmid pEH3 wurde auf der Grundlage seiner Resistenz gegen Tetracyclin ausgewählt und für die nächste Stufe der Herstellung der Plasmide gemäß der Erfindung verwendet. Das Plasmid pEH3 hat die folgenden Kennzahlen:
Moleküllänge 9866 bp: eine Hind III-Stelle; eine Bam I-Stelle 346 bp von Hind III; eine Sal I-Stelle 275 bp von der Bam-I-Stelle und eine Eco RI-Stelle 3709 bp von Sal I; eine zweite Hind III-Stelle 31 bp von Eco RI; eine Hpa I-Stelle 305 bp von der zweiten Hind III-Stelle; eine zweite Hpa I- Stelle 3250 bp von der ersten Hpa I-Stelle und 1950 bp von der ersten Hind III-Stelle; das Plasmid enthält den trp- Promoter, das E-Gen und einen Teil des D-Gens in dem Teil von 1950 bp zwischen der zweiten Hpa I- und der ersten Hind III-Stelle; das Gen für Resistenz gegen Tetracyclin folgt unmittelbar der ersten Hind III-Stelle, und das Gen für Ampicillin-Resistenz liegt im Teil 3709 bp zwischen der Sal I- und der Eco RI-Stelle.

c) Entfernung der der Eco RI-Stelle in pEH3 nächstliegenden Hind III-Stelle

pEH3 wurde mit Eco RI digeriert, wobei lineare Moleküle gebildet wurden, die mit Exonuclease III (EC 3.1.4.27) und dann mit S1-Nuclease (EC 3.1.4.-) zur Entfernung der in 5′-Stellung herausragenden Enden und zur Bildung stumpfer Enden digeriert wurden. Dann wurden die linearen Moleküle mit T4-induzierter DNS-Ligase (EC 6.5.1.1) verbunden, und das hierbei erhaltene Plasmid wurde zur Umwandlung des Stamms trp ○ E ∇ 1 verwendet und für trp-Ergänzung und Ampicillin-Resistenz ausgewählt, wobei das als pEH5 bezeichnete (in Fig. 1 dargestellte) Plasmid gemäß der Erfindung erhalten wurde.

Das Plasmid pEH4 hat die folgenden Eigenschaften und Kennzahlen:
Moleküllänge 9866 bp; eine Bam I-Stelle 346 bp von der Hind III-Stelle; eine Sal I-Stelle 275 bp von Bam I; eine Eco RI-Stelle 3709 bp von der Sal I-Stelle; eine zweite Hind III-Stelle 31 bp von der Eco RI-Stelle; eine Hpa I-Stelle 1950 bp von der zweiten Hind III-Stelle; eine zweite Hpa I-Stelle 3250 bp von der ersten Hpa I-Stelle und 305 bp von der ersten Hind III-Stelle. Das Plasmid enthält den trp-Promoter, das E-Gen und einen Teil des D-Gens in dem Teil von 1950 bp zwischen der zweiten Hind III-Stelle und der ersten Hpa I-Stelle; das Gen für Tetracyclin-Resistenz folgt unmittelbar der ersten Hind III-Stelle, und das Gen für Ampicillin-Resistenz liegt in dem Teil von 3709 bp zwischen der Sal I-Stelle und der Eco RI-Stelle. Das Plasmid wird als pEH4 bezeichnet. pEH4 kann in ähnlicher Weise wie pEH3 hergestellt werden, außer daß die Auswahl auf der Grundlage seiner Tetracyclin- Empfindlichkeit erfolgt.

Wie bereits erwähnt, liegt ein besonderer Nutzen der Plasmide gemäß der Erfindung darin, daß sie eine eindeutig definierte Stelle aufweisen, die sich für die Einführung eines gewünschten eukaryotischen DNS-Fragments eignet, und daß die Plasmide eine solche Struktur haben, daß die Transcription der eingeführten DNS durch den trp-Promoter, in Verbindung mit der defiierten Einführungsstelle, beispielsweise der Hind III-Stelle des Plasmids pEH5 (in Fig. 1 dargestellt), gesteuert und reguliert wird. Dieses Plasmid stellt daher ein wertvolles endgültiges Zwischenprodukt dar, aus dem Plasmide, an deren Einführungsstelle, beispielsweise an der Hind III-Stelle, genetische Information in Form von in geeigneter Weise modifizierter DNS, die darauf abgestellt ist, ein gewünschtes Polypeptidprodukt zu bilden, eingeführt worden ist, hergestellt werden können.

Die Herstellung der erforderlichen DNS, ihre Modifizierung zur Einführung und die Einfügungsmethoden sowie die anschließenden Verfahren zur Herstellung von Proteinen sind allgemein bekannt und werden nachstehend kurz als Beispiele beschrieben.

1) Bildung der einzufügenden DNS

DNS für die Einfügung kann nach verschiedenen Methoden gebildet werden. Beispielsweise können Oligonucleotide verschiedener Länge nach bekannten Verfahren hergestellt werden (siehe beispielsweise Hsiung et al., "Nucleic Acids Research, 6 [1979], 1371-1385).

Mehrere Oligonucleotide können als Folge ihrer spezifischen Basenpaarungseigenschaften zu längeren doppelsträngigen Molekülen zusammengesetzt werden. Die dieses Molekül bildenden Oligonucleotide können durch das Enzym DNS-Ligase verbunden werden.

Als Alternative können DNS-Moleküle mit der gewünschten genetischen Spezifität durch Verwendung des Enzyms umgekehrte (reverse) Transcriptase unter Verwendung von RNS mit der gewünschten Spezifität als Matrize oder Schablone synthetisiert werden. Die RNS kann aus Zellen nach bekannten Methoden isoliert werden.

2) Vorbereitung der DNS für die Einfügung

Die DNS kann für die Einfügung in das Plasmid nach einer Vielzahl von Methoden modifiziert werden. Beispielsweise kann DNS, die in der vorstehend beschriebenen Weise hergestellt worden ist, am 3′-Terminus jedes Doppelstrangs mit Hilfe des Enzyms Terminaltransferase (EC 2.7.7.31) verlängert werden, wobei eine homopolymere einsträngige Verlängerung gebildet wird. Der 3′-Terminus des Hind III-digerierten Plasmids kann in ähnlicher Weise verlängert werden. Wenn die Verlängerung der gebildeten DNS (dA)_n und des Plasmids (dT)_n ist oder umgekehrt oder wenn die Verlängerung der gebildeten DNS (dG)_n und die des Plasmids (dC)_n ist oder umgekehrt, können die DNS für die Einfügung und das Plasmid durch diese einsträngigen Verlängerungen so hybridisiert werden, daß kreisrunde Moleküle gebildet werden, in denen die gebildete DNS an der Hind III-Stelle des Plasmids eingefügt ist. Solche Plasmide können verwendet werden, um Zellen von E. coli und nach bekannten Methoden ausgewählte Kolonien der Transformantien umzuwandeln (siehe beispielsweise D. Glover, New Techniques in Biophysics and Cell Biology (herausgegeben von R. H. Pain und B. J. Smith, 8 [1976], 125-145, Wiley, New York). Als Alternative können die Enden der in der vorstehend beschriebenen Weise hergestellten DNS mit dem Enzym DNS-Ligase zu kurzen doppelsträngigen DNS-Molekülen verbunden werden (Hind III-Bindeglieder (linkers), die die vom Restriktionsenzym Hind III erkannte Sequenz enthalten. Durch Digerierung dieser Moleküle mit diesem Enzym anschließend an die Verknüpfung (Ligation) werden Hind III-Termini an den Enden der vorbereiteten DNS gebildet. Die vorbereitete DNS kann dann anschließend an die Digerierung mit Hind III nach bekannten Methoden in das Plasmid eingefügt werden.

3) Herstellung des Peptids

Die bekannten Arbeitsmechanismen bakterieller Promoter führen zusammen mit den vorstehenden Daten zu der Schlußfolgerung, daß bei offenem Operator das Kopieren vom Promoter von trpE und trpD über die Hind III-Stelle und in Bereiche des Genoms jenseits der Hind III-Stelle erfolgt. Die Übertragung des Transkritionsprodukts ergibt ein mit dem D-Gen verknüpftes Durchlese-Polypeptid (falls nicht ein Terminationskodon in die Einfügung einverleibt ist). Das gebildete Polypeptid kann nach bekannten Methoden identifiziert werden, beispielsweise durch Übertragen des Plasmids auf einen Stamm, der Minizellen bildet (siehe beispielsweise R. B. Meagher, "Cell", 10 [1977], 521-536), in denen die Polypeptidprodukte von Plasmidgenomen leicht zu unterscheiden sind, oder durch immunologische Methoden (siehe beispielsweise S. Broome und W. Gilbert, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75 [1978], 2746-2749).

Das Durchlese-Polypeptid kann nach bekannten Methoden gereinigt und das gewünschte Polypeptidprodukt durch Digestion des Polypeptids mit Hilfe spezieller chemischer oder enzymatischer Mittel gebildet werden.

Das Plasmid pEH5 gemäß der Erfindung kann auch als Quelle von DNS verwendet werden, aus der eine weitere Reihe von Plasmidvektoren, die sog. "pWT"-Reihe, aufgebaut werden kann.

Das Plasmid pEH5 kann mit der Restriktions-Endonuclease Hinf I (EC 3.1.23.22) behandelt werden, wobei daraus ein Fragment von etwa 497 bp erhalten wird, das den kompletten Tryptophanpromoter, die führende Sequenz (Leader Sequenz) und die ersten sieben Aminosäuren des trpE enthält. Das so erhaltene Hinf I-Fragment kann dann in die Hind III-Stelle des bekannten Plasmids pBR322 geklont werden. Dieses Klonen kann vorgenommen werden, indem die Hinf I-Enden des Fragments mit DNS- Polyerase I (EC.2.7.7.7) behandelt und die DNS-gefüllten Hinf I-Fragmente der Einwirkung von Hind III-Bindegliedern (linkers) in Gegenwart von DNS-Ligase und Hind III-Restriktions-Endonuclease in dieser Reihenfolge unterworfen werden, wobei das Fragment mit den "klebrigen Enden" Hind III erhalten wird.

Anschließend kann das Hinf I-Fragment in das Plasmid pBR322 durch Hind III-Restriktion des pBR322 und Verbinden des begrenzten Plasmids mit dem Hinf I-Fragment geklont werden.

Das Hinf I-Fragment wird in die Hind III-Stelle von pBR322 in einer der vorstehend im Zusammenhang mit pEH3 und 4 beschriebenen beiden Orientierungen eingefügt. Eine dieser Orientierungen, bei denen der trp-Promoter in Richtung der tet-Gene kopiert wird, wird durch Restriktionsenzym-Analyse einzelner Klone ausgewählt. (Die Sequenz von pBR322 ist bekannt; siehe beispielsweise J. G. Sutcliffe, Cold Spring Harbor Symposium on Quantitative Biology, XLII [1978], 77-90. Die Sequenz des trp-Promoter/Operator ist ebenfalls bekannt; siehe beispielsweise G. N. Bennett et al., J. Mol. Biol., 121 [1978], 113-137, und F. Lee et al., J. Mol. Biol., 121 [1978], 193-217.)

Das erhaltene Plasmid wird hier als pWT101 bezeichnet; seine Struktur ist in Fig. 4 dargestellt. Dieses Plasmid hat die folgenden Eigenschaften und Kennzahlen:
Moleküllänge 4874 bp; eine Eco RI-Stelle; eine Hind III- Stelle 31 pb von der Eco RI-Stelle; eine Hpa I-Stelle 313 bp von der Hind III-Stelle; eine zweite Hind III- Stelle 199 bp von der Hpa I-Stelle; eine Bam I-Stelle 346 bp von der zweiten Hind III-Stelle; eine Sal I- Stelle 275 bp von der Bam I-Stelle; eine Pst I-Stelle 2958 bp von der Sal I-Stelle und 752 bp von der Eco RI- Stelle; das Gen für Tetracyclin-Resistenz erstreckt sich vom Bereich der Hpa I-Stelle bis über die Sal I- Stelle hinaus; das Gen für Ampicillin-Resistenz im Bereich der Pst I-Stelle und des geklonten Teils des trp-Operons umfaßt den Bereich zwischen dem Promoter und dem ersten Teil des E-Gens zwischen der Hpa I-Stelle und der zweiten Hind III-Stelle.

Auf Grund seiner vorstehend beschriebenen Bildung hat das Plasmid pWT101 zwei Hind III-Stellen, und zwar eine als führenden Bereich vor der Proteinsequenz. Aus diesem Grunde wird die Umwandlung des Proteins als Teil eines verschmolzenen Polypeptids in einem Plasmid, z. B. pWT111 (an der Hind III-Stelle geklont), von der Zahl der Nucleotide im Leader abhängig, d. h., unvollständige umgekehrte Transkription kann die Leadersequenz reduzieren und so den Leserahmen verändern. Aus diesem Grunde ist der Aufbau von Expressionsplasmiden, die für alle drei Leserahmen zu übersetzen vermögen, wichtig.

Das Plasmid pWT111 gestattet die Übersetzung von an der Hind III-Stelle eingefügter DNS als verschmolzenes Polypeptid nur in einem Leserahmen (dies gilt nicht, wenn die eingefügte DNS ihre eigene funktionelle Ribosomenbindungsstelle hat). Die Übertragung beginnt mit den ersten sieben Aminosäuren von trpE, gefolgt von zwei Aminosäuren aus der Hind III-Linker-DNS und würde dann in die eingefügte Sequenz weiter fortschreiten. Wenn keine Stopkodone in dieser Sequenz vorhanden wären, würde die Translation am ersten Stopkodon im Tetracyclinbereich enden.

Die Nucleotidsequenz über die Hind III-Stelle von pBR322 zeigt, daß für pWT111 das erste Stopkodon 26 Nucleotide hinter (downstream) der Hind III-Stelle liegt.

Zur Änderung der Phaseneinstellung von der Hind III-Stelle des pWT111 kann das Plasmid mit Hind III begrenzt werden, die 5′-Verlängerungen können mit DNS- Polymerase I gefüllt und die Hind III-Linker-DNS verbunden werden. Begrenzung (Restriktion) mit Hind III zur Entfernung von überschüssigem Bindeglied und Bildung "klebriger Enden" und erneutes Verbinden ergibt "pWT121". Durch diese Maßnahme werden 14 bp DNS angefügt und der Leserahmen von der neuen Hind III- Stelle aus (die alte Stelle ist nun unvollständig) um plus ein Nucleotid verändert.

Der dritte Leserahmen, d. h. pWT111 plus 2 Nucleotide, wurde durch Wiederholung der gleichen Reihe von Reaktionen an pWT121 erhalten. Das hierbei erhaltene Plasmid wird als "pWT131" bezeichnet.

Die Struktur der Plasmide pWT111, pWT121 und pWT131 ist in Fig. 5 dargestellt. Die Struktur kann weiter wie folgt definiert werden:

p-WT111
Moleküllänge 4823 bp; eine Hpa I-Stelle; eine Hind III- Stelle 199 bp von der Hpa I-Stelle; eine Bam I-Stelle 346 bp von der Hind III-Stelle; eine Sal I-Stelle 275 bp von der Bam I-Stelle; eine Pst I-Stelle 2958 bp von der Sal I-Stelle und 1045 bp von der Hpa I-Stelle; das Gen für Tetracyclin-Resistenz erstreckt sich vom Bereich der Hpa I-Stelle bis über die Sal I-Stelle hinaus; das Gen für Ampicillin-Resistenz im Bereich der Pst I-Stelle und des geklonten Teils des trp- Operons umfaßt den Bereich zwischen dem Promoter und dem ersten Teil des E-Gens zwischen den Hpa I- und Hind III-Stellen.

pWT121
Moleküllänge 4837 bp; eine Hpa I-Stelle; eine Hind III- Stelle 206 bp von der Hpa I-Stelle; eine Bam I-Stelle 353 bp von der Hind III-Stelle; im übrigen wie pWT111.

pWT131
Moleküllänge 4851 bp; eine Hpa I-Stelle; eine Hind III- Stelle 213 bp von der Hpa I-Stelle; eine Bam I-Stelle 360 bp von der Hind III-Stelle; im übrigen wie pWT111.

Rings um die Hind III-Stelle von pWT111, 121 und 131 liegen die folgenden Sequenzen vor:

(Der Einfachheit halber zeigen die vorstehenden Sequenzen nur einen Strang der DNS.)

Die Wirksamkeit der Plasmide pWT111, 121 und 131 als Vektoren für eingefügte DNS veranschaulichen die Ergebnisse, die durch Einfügung eines synthetischen Geflügelpestvirus- Gens (FPV) (siehe beispielsweise britische Patentanmeldung 80 10 777, und Emtage et. al., Nature, 283 [1980], 171-174) in pWT121, in diesem Fall das Plasmid mit richtiger Phase, erhalten wurden.

Das vorstehend genannte synthetische FPV-Gen kann wie folgt in pWT121 geklont werden:

Das Plasmid pWT121 wurde mit Hind III begrenzt und mit alkalischer Phosphatase (EC 3.1.3.1) behandelt, um die 5′-Phosphatgruppen zu entfernen. Hind III-Bindeglieder wurden mit den Enden des synthetischen FPV-Gens verbunden, das dann mit Hind III-Restriktions-Endonuclease zur Bildung klebriger Hind III-Enden behandelt wurde. Das in dieser Weise behandelte Geflügelpestvirus-Gen und das der Restriktion mit Hind III unterworfene pWT121 wurden dann verknüpft, wobei das Plasmid pWT121/FPV erhalten wurde. Es ist auch möglich, das synthetische FPV-Gen in pBR322 zu klonen und dann in bekannter Weise in pWT121 zu überführen.

Die allgemeine Struktur des Plasmids pWT121/FPV ist in Fig. 6 dargestellt. Die Struktur kann weiter wie folgt definiert werden:
Moleküllänge 6532 bp; eine Hind III-Stelle; eine Sma I- Stelle 365 bp von der Hind-III-Stelle; eine Eco RI- Stelle 910 bp von der Sma I-Stelle; eine zweite Hind III-Stelle 460 bp von der Eco RI-Stelle; eine Bam HI- Stelle 353 bp von der zweiten Hind III-Stelle; eine Sal I-Stelle 275 bp von der Bam HI-Stelle; eine Pst I- Stelle 2958 bp von der Sal I-Stelle; eine Hpa I-Stelle 1045 bp von der Pst I-Stelle und 206 bp von der ersten Hind III-Stelle; das synthetische FPV-Gen in dem Teil 1735 bp zwischen der ersten und der zweiten Hind III- Stelle; das Gen für Tetracyclin-Resistenz erstreckt sich von der zweiten Hind III-Stelle bis jenseits der Bam HI-Stelle, und das Gen für Ampicillin-Resistenz liegt im Bereich der Pst I-Stelle.

In Abhängigkeit von der Orientierung des FPV-Gens erwies sich das Plasmid als Tetracylin-resistent (wie in Fig. 6 dargestellt) oder, mit dem FPV-Gen in umgekehrter Orientierung, als Tetracyclin-empfindlich.

Umgewandelte Kolonien von E. coli, die die pWT121/FPV- Plasmide mit dem Hämagglutinin (HA)-Gen jeweils in einer Orientierung enthielten, wurden für FPV-HA-Antigen dem Screening unterworfen. Es wurde gefunden, daß Tetracyclin-resistente Kolonien FPV-HA-Antigen ausdrückten, eine Bestätigung der richtigen Einfügung des synthetischen FPV-Gens. Die Kolonien mit dem FPV-Gen in der in Fig. 6 dargestellten Orientierung zeigten Tetracyclin-Resistenz, und die Kolonien mit umgekehrter Orientierung waren Tetracyclin-empfindlich. Im ersteren Fall erfolgte die Expression des HA-Antigens unter trp-Regulierung.

Die FPV-HA-Antigen-Expression kann wie folgt bestätigt werden:

Kolonien von E. coli, die das vorstehend beschriebene Tetracyclin-resistente pWT121/FPV-Plasmid enthielten, wurden dem Screening zur Auswahl des FPV-HA-Antigens unter Anwendung einer immunologischen Festphasenmethode unterworfen (siehe beispielsweise S. Broome und W. Gilbert, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75 [1978], 2746- 2749). Kurz gesagt, kleine Kulturen einzelner Kolonien wurden gezüchtet, isoliert und unter Verwendung von Lysozym und des nichtionogenen Tensids "Triton X-100" (Isooctylphenoxypolyäthoxyäthanol) lysiert.

Etwa vorhandene HA-Sequenzen wurden an ein mit FPV-HA- spezifischem IgG beschichtetes Polystyrolrohr gebunden. Das gebundene Antigen wurde dann mit ¹²⁵I-IgG von hoher spezifischer Aktivität spezifisch markiert.

Immunreaktivität wurde in allen Kolonien, in die ein FPV-HA-Gen eingefügt war, nachgewiesen. Die Kolonien, die nur das ursprüngliche pWT121-Plasmid enthielten, zeigten keine Aktivität (siehe die folgende Tabelle).

Radioimmuntest von FPV-HA in Lysaten von Bakterien, die pWT121/FPV-Plasmide enthalten

Wie bereits erwähnt, wurde Immunreaktivität in allen Kolonien nachgewiesen, die ein eingefügtes FPV-HA-Gen (A) enthielten. Die Kolonien, die nur das ursprüngliche pWT121-Plasmid enthielten, zeigten keine Akivität.

Im Falle der sog. pWT-Reihe von Expressionsplasmiden besteht ebenso wie bei pBR322 die Möglichkeit, daß diese normalerweise Mobilisations-minus (mob⁻)-Plasmide unter geeigneten Bedingungen mobilisiert (d. h. von einem Bakterium auf ein anderes übertragen) werden können. Kürzlich wurde nachgewiesen (siehe beispielsweise A. J. Twigg und D. J. Sherratt, Nature, 283 [1980], 216-218), daß, obwohl die DNS-Kodierung für die Proteine mit Col El-Mobilität bei pBR322 fehlt, dieses Protein dennoch Mobilität durch Transkomplementation induzieren kann, wenn es in der gleichen Zelle an einem verträglichen Plasmid wie Col K verbunden ist.

Es wurde gezeigt, daß die Stelle der Bindung des Mobilitätsproteins (bzw. der Proteine) an die Plasmid-DNS die sog. "nic-Stelle" oder "transfer origin" ist (siehe beispielsweise G. J. Warren et al., Nature, 274 [1978], 259-261). In pBR322 beispielsweise liegt diese Stelle im 622 bp Hae II-B-Fragment. Mutationen im Mobilitätsgen sind mob⁻. Sie können jedoch unter der Ausnahme eines trans-wirkenden Proteins durch mob⁺ Col E- Derivate oder verwandte Plasmide ergänzt werden.

(Plasmide vom Col El-Typ sind nicht-konjugativ, werden jedoch mobilisiert, wenn ein Geschlechtsfaktor, z. B. ein F′- oder R-Faktor, in die Zelle eingeführt wird. Die Mobilisierung eines Plasmids, das nic⁺, aber mob⁻ ist, z. B. pBR322, erfordert daher die Anwesenheit von zwei anderen Plasmiden, nämlich eines Geschlechtsfaktors und eines verträglichen Plasmids vom Col El-Typ, das mob⁺ ist.)

Die nic-Stelle ist speziell für die Mobilisierung erforderlich, und Plasmide, denen diese Stelle fehlt, können nicht ergänzt werden.

Obwohl somit pBR322 und die Plasmide der pWT-Reihe nicht alle Mobilitätsgene enthalten, enthalten sie sämtlich die nic-Stelle und können somit zur Erteilung der Mobilität ergänzt werden. Um sicherere, nicht-mobile Vektoren herzustellen, ist es zweckäßig, die nic-Stelle zu entfernen. Dies kann beispielsweise durch Entfernung eines Hae II-Fragments erreicht werden.

Die nic-Stelle kann aus den Plasmiden pWT111, 121 und 131 wie folgt entfernt werden:

Eine Betrachtung der Hae II-Restriktionskarten der vorstehend genannten Plasmide ziegt, daß nur zwei Fragmente (B und H) entfernt werden können und dennoch die Ampicillin- und Tetracyclin-Gene, den Tryptophanpromoter und das Original der Kopie zurücklassen. In diesem Zusammenhang wird auf Fig. 13 verwiesen.

Das Fragment B ist 622 bp und das Fragment H ist 83 bp. Daher fehlt den nic⁻-Plasmiden (minus B und H) 705 bp. Dies muß natürlich bei der Charakterisierung der nic⁻- Derivate der vorstehend genannten Plasmide berücksichtigt werden. Beispielsweise liegt in pWT111 (nic⁻) die Pst I-Stelle 2253 bp von der Sal I-Stelle.

Die nic⁻-Derivate von pWT111, 121 und 131 werden als pWT211, 221 bzw. 231 bezeichnet.

Die erste Stufe bei dieser als Beispiel beschriebenen Entfernungsmethode besteht darin, daß das Plasmid teilweise so digeriert wird, daß jedes Molekül im Durchschnitt zwei- oder dreimal gespalten wird. Die Spaltstücke werden dann unter Verwendung von T₄- DNS-Ligase wieder verbunden, und die verbundene DNS wird in E. coli K12, z. B. HB101, transformiert. Die Transformanten werden auf Ampicillin und Tetracyclin unter Verwendung von Minimal-Agarplatten ausgewählt, um trp- Transkription zu induzieren und Tetracyclin-Resistenz sicherzustellen.

Die erhaltenen Kolonien enthalten die rezirkularisierten Ausgangsplasmide sowie Beispiele, denen ein oder beide Hae II-Fragmente fehlen. Die letzteren können durch Screening einzelner Kolonien und Suchen nach Plasmiden, die kleiner sind als das Ausgangsplasmid, identifiziert werden. Voraussichtliche nic⁻-Derivate können durch Restriktionsenzym-Analyse von gereinigter Plasmid-DNS bestätigt werden.

Anstatt das vorstehend als Beispiele beschriebene Verfahren unter Anwendung teilweiser Restriktionen anzuwenden, die das Screening von vielleicht Hunderten von Kolonien erfordern, ist es im allgemeinen einfacher, die nic⁻-Derivate in der in Fig. 14 dargestellten Weise aufzubauen.

Kurz gesagt, die pWT-Plasmide werden der Restriktion mit Pst I und Bam HI unterworfen, und Banden, die den trp p/o- Bereich enthalten, werden von Polyacrylamidgelen isoliert. Das Plasmid pAT153 (nic⁻) wird der Restriktion mit Pst I und Bam HI unterworfen, und die Bande von 2531 bp wird von einem Polyacrylamidgel isoliert. Die erstgenannten Banden werden einzelnen mit der letztgenannten Bande unter Verwendung von T₄-DNS-Ligase verbunden, und das verbundene Material wird zur Transformierung von E. coli HB101 verwendet. DNS aus Einzelkolonien kann isoliert und ihre Struktur durch Restriktionsenzym-Analyse bestätigt werden, z. B. Hae II-Teilstücke (von pAT153, pWT-Reihe und pWT-(nic⁻)-Reihe.

Mit anderen Worten, die nic⁻-Derivate können aufgebaut werden durch Substitution des Bereichs in den pWT-Plasmiden, der durch die Pst I- und Bam HI-Stellen, die das Original der Kopie enthalten, und die nic-Stelle gebunden ist, mit dem entsprechenden Bereich aus pAT153, der ein Entfernungsderivat von pBR322 ist und dem das 622 bp Hae II-B-Fragment fehlt, und dem benachbarten Fragment 83 bp Hae II H.

Die Erfindung wird durch die nachstehend beschriebenen Versuche weiter erläutert.

Herstellung von pEH3, pEH4 und pEH5

Kulturen von E. coli K12, Stamm HB101 (siehe beispielsweise H. Boyer et al., J. Mol. Biol., 41 [1969], 459-472), die das Plasmid pBR322 enthielten, wurden entweder in L-Medium oder in M9-Salze, Glucose und Casaminosäuren enthaltendem Medium gezüchtet (siehe beispielsweise J. H. Miller, Experimente in Molecular Genetics, Anhang 1, Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y. [1972], 431-435). Bei einem A₆₀₀-Wert von 0,6 wurde Chloramphenicol den Plasmidkulturen bis zu einer Endkonzentration von 150 µg/ ml zugesetzt, worauf weitere 16 Stunden bei 37°C bebrütet wurde. DNS wurde von den Zell-Lysen durch Zentrifugieren in CsCl/Äthidiumbromid-Gradienten isoliert (siehe beispielsweise L. Katz et al., J. Bacteriol., 114 [1973], 577-591, und Wensik et al., Cell, 3 [1974], 315-325). Die DNS-Banden wurden durch seitliches Anstechen mit einer 1-ml-Injektionsspritze mit 16 G-Nadel unter Bestrahlung mit UV-Licht von 366 nm Wellenlänge entfernt. Das Äthidiumbromid wurde durch Durchleiten durch das saure Kationenaustauscherharz der Handelsbezeichnung "Dowex AG50" entfernt.

Alle DNS-Lösungen wurden gegen TE-Puffer (10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 7,5) zur Entfernung von überschüssigem CsCl dialysiert, durch Ausfällung mit Äthanol eingeengt und bei -70°C aufbewahrt. Das erhaltene DNS-Gemisch wurde mit Hind III wie folgt grenzdigeriert:

2 µg PBR322 wurden mit 5 Einheiten Hind III in einem Puffer inkubiert, der 50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 50 mM NaCl, 10 mM MgCl₂, 5 mM β-Mercaptoäthanol und 2 mM Dithiothreit enthielt. Die Inkubation wurde 90 Minuten bei 37°C in einem Volumen von 40 µl vorgenommen. Die Reaktion wurde dann beendet, indem 5 Minuten bei 65°C inkubiert wurde.

Isolierung des Fragments Hind III trpE

20 µg pRH1/trpE wurden mit Hind III grenzdigeriert, der Elektrophorese an 1%igen Agarosegelen unterworfen, worauf die Bande, die lineares trpE enthielt, entfernt wurde. Das trpE-Fragment wurde aus der Gelscheibe durch Elektrophorese in einen Dialysenbeutel isoliert und anschließend mit Phenol extrahiert und mit Äthanol gefällt.

Ligation

Die Ligase-Inkubationen enthielten 0,2 µg des trpE- Fragments, 0,4 µg des mit Hind III begrenzten pBR322 und 0,1 Einheit T₄-Polynucleotid-Ligase pro 20 µl Reaktionspuffer. Das Reaktionsgemisch wurde 4 Stunden bei 16°C inkubiert.

Umwandlung (Transformation)

0,01 µg der angeknüpften DNS wurden zur Umwandlung des Stamms E. coli W3110 trp ○ E ∇ 1 verwendet.

Gegen Ampicillin-resistente Rekombinanten, die zur Ergänzung dieser trpE⁻-Zellen fähig waren, wurden ausgewählt. 1,2×10⁴ amp-r-Kolonien, die in Abwesenheit von Tryptophan wachsen konnten, wurden pro µg Plasmid-DNS erhalten.

Fünfzig dieser Kolonien wurden willkürlich ausgewählt und unter Verwendung von Zahnstochern auf Minimal-Agarplatten (siehe beispielsweise J. H. Miller, loc. cit.), die 100 µg/ml Ampicillin und 12,5 µg Tetracyclin enthielten, übertragen. Von den 50 Kolonien wuchsen 31 nach Bebrütung über Nacht, ein Zeichen für die Anwesenheit von Tetracyclin-resistentem Protein in dieser Population.

Plasmid-DNS wurde von repräsentativen Kolonien der Tetracyclin-empfindlichen und -resistenten Gruppen isoliert, und die Hind III-Fragmentgruppierungen wurden durch Gel-Elektrophorese an 1%igen Agarosegelen analysiert. Die Plasmid-DNS von allen Ampicillin-resistenten trp⁺-Klonen enthielten die ursprüngliche pBR322-DNS von Mr 2,8×10⁶ (4,361 kb) und das E. coli-Hind III-trpE- Fragment von Mr 3,5×10⁶ (5,350 kb). Die gebildeten Plasmide wurden den folgenden weiteren Behandlungen unterworfen, um ihre Struktur zu bestätigen.

Orientierung des trpE-Fragments

Eine Folge des erneuten Verbindens von Hind III-Spaltstücken von pBR322 mit dem trpE-Fragment besteht darin, daß das trpE-Fragment in einer von zwei verschiedenen Orientierungen eingefügt werden kann. Es kann so sein, daß die Transkription vom trp-Promoter über das tet-Gen des Plasmids oder vom tet-Gen hinweg verläuft. Die Orientierung des tet-resistenten Plasmids (pEF3) und des tet-empfindlichen Plasmids (pEH4) wurde im Licht (siehe beispielsweise M. E. Bennett et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 73 [1976], 2351-2355) vorhandener Hpa I-Stellen im trpE-Fragment und Bam HI-Stellen in pBR322 bestimmt (siehe beispielsweise F. Bolivar et al., loc. cit.). Fig. 7 veranschaulicht die Ergebnisse von Grenzdigestionen von Plasmiden pBR322, pEH3 und pEH4 mit entweder Hind III, Hpa I (EC 3.1.23.23), Bam HI (EC 3.1.23.6) oder einer Kombination dieser Enzyme.

Fig. 7 veranschaulicht ein Agarosegel und zeigt die Restriktions-Endonucleasestellen für Hpa I, Hind III und Bam HI in pEH3 und pEH4 und die Orientierung der geklonten trpE-DNS in diesen Plasmiden.

Die Spuren a bis j enthalten die folgenden DNS mit Größen in Kilobasenpaaren (kb): (a) PM2-DNS mit Hind III als Größenmarkierer digeriert. Sichtbar sind die Banden 1 bis 6 mit den Größen 5,4, 2,35, 1,05, 0,475, 0,45 bzw. 0,27 kb. (j) λc.I857,S7-DNS mit Hind III als Größenmarkierer digeriert. Sichtbar sind die Banden A bis G mit den Größen 21,79, 9,38, 6,30, 4,20, 2,38, 2,11 bzw. 0,47 kb. (b) Supergedrillte pBR322-DNS. (c) pBR322 mit Hpa I inkubiert. (d) pEH3 mit Hind III digeriert. (e) pEH3 mit Hind III und Hpa I digeriert. Größe der Banden 4,3, 3,25, 1,95 und 0,30 kb. (f) pBR322 mit Bam HI digeriert. (g) pEH3 mit Bam HI digeriert. (h) pEH4 mit Bam HI und Hpa I digeriert. Die kompletten Fragmente der Digestion haben Größen von 5,7, 3,25 und 0,67 kb. (i) pEH3 mit Bam HI und Hpa I digeriert. Die kompletten Fragmente der Digestion haben Größen von 4,3, 3,25 und 2,4 kb. Es sind keine Hpa I-Stellen in pBR322 (vgl. die Streifen b und c) und keine Bam HI-Stellen in trpE vorhanden (vgl. Bahnen f und g). Bei Restriktion mit Hind III allein ergibt pEH3 sowie auch pEH4 lineare pBR322- und trpE-Fragmente (Bahn d). Doppelte Digestionsspaltstücke von pEH3 und pEH4 mit Hind III und Hpa I ergeben ebenfalls identische Profile (Bahn e). In diesem Fall wird lineares pBR322 (4,365 kb) zusammen mit drei anderen Fragmenten von 3250, 1950 und 305 bp regeneriert. Da pBR322 keine Hpa I-Targets aufweist (siehe beispielsweise F. Bolivar et al., loc. cit.), wird geschlossen, daß zwei Hpa I-Targets im trpE-Fragment vorhanden sind. Das eine wurde bereits angegeben; es liegt im Promoterbereich (siehe beispielsweise M. E. Bennett et al., loc. cit.), während die zweite Stelle sich ungefähr 300 bp von einer der Hind III-Stellen befindet.

Doppeldigests mit Bam HI und Hpa I wurden verwendet, um die Orientierung des trpE-Fragments und die Lage der zweiten Hpa I-Stelle zu bestimmen. Die gebildeten Fragmente sind in der Bahn h für pEH4 und in der Bahn i für pEH3 gezeigt. Es ist eindeutig, daß diese Plasmide trpE-Fragmente in verschiedenen Orientierungen enthalten. Die Größe des kleinsten Fragments, das von pEH4 abgeleitet ist, läßt sich leichter aus den in Fig. 8 dargestellten Ergebnissen ermitteln. Diese Abbildung zeigt die durch Restriktionsdigests von pEH3, pEH4 und pBR322 mit Sal I (EC 3.1.23.27), Bam HI, Hpa I, Eco RI und Hind III abgeleiteten kleinen Fragmente.

(Fig. 8 veranschaulichen ein 5%iges Acrylamidgel und zeigt niedrigmolekulare DNS-Fragmente aus pBR322, pEH3 und pEH4 nach Digestion mit Hpa I-, Bam HI-, Hind III- und Sal I-Restriktionsendonucleasen. Die Spuren a bis i enthalten Desoxyribonucleinsäuren mit Größen in Basenpaaren (bp): (a, i) PM2-DNS mit Hind III als Größenmarkierer digeriert. Die Banden 1 bis 7 hasben die folgenden Größen: 5400, 2350, 1050, 475, 450, 270 bzw. 110 bp. (b) pEH3 mit Bam HI und Hpa I digeriert. (c) pEH4 mit Bam HI und Hpa I digeriert. Die kleinste Bande wird mit 640 bp geschätzt. (d) pEH3 mit Hind III und Hpa I digeriert. Die kleinste Bande mit 295 bp bestimmt. (e) pBR322 mit Bam HI und Sal I digeriert. Die kleinste Bande mit 275 bp bestimmt. (f) pBR322 mit Hind III und Sal I digeriert. Die kleinste Bande mit 620 bp bestimmt. (g) pBR322 mit Bam HI und Hind III digeriert. Die kleinste Bande mit 350 bp bestimmt. (h) pBR322 mit Eco RI und Hind III digeriert. Die kleinste Bande mit 25 bp bestimmt.)

Aus den vorstehend genannten Ergebnissen wurden die in Fig. 2 und Fig. 3 dargestellten Restriktionsdiagramme für pEH3 und pEH4 angefertigt. Die Tatsache, daß die zweite Hpa I-Stelle "stromaufwärts" vom trp-Promoter liegt, liegen die bekannten Größen des trpE-Proteins, der Anthranilatsynthetase und des trpD-Genfragments zugrunde, die im Hind III-trpE-Fragment enthalten sind. Anthranilatsynthese ist ein Protein von 60 000 Dalton (siehe beispielsweise J. Ito et al., J. Bacteriol., 97 [1969], 725- 733) (etwa 500 Aminosäuren), während nur etwea ¹/₆ des trpD-Proteingens (entsprechend etwa 275 pb) durch dieses Hind III-Fragment spezifiziert ist (siehe beispielsweise A. S. Hopkins et al., J. Mol. Biol., 107 [1976], 549-569). Eine DNS-Länge von ungefähr 1800 bp ist somit erforderlich, um diese Polypeptide zu spezifizieren. Zusätzlich sind 162 Basen in der Leadersequenz am 5′-Ende von trp mRNS und weitere 11 Basen vom Beginn der trp m-RNS zum Hpa I- Target im trp-Promoter vorhanden (siehe beispielsweise F. Lee et al., J. Mol. Biol., 121 [1978], 193-217). Diese insgesamt 1948 bp zwischen Hpa I und Hind II sind in guter Übereinstimmung mit dem Hpa I-Hind III-Abstand von 1950 bp, der durch Gelanalyse ermittelt wurde, und im Einklang mit der Schlußfolgerung, daß die zweite Hpa I-Stelle "stromaufwärts" vom trp-Promoter liegt.

Regulierung der Tetracyclinempfindlichkeit vom trp-Promoter

Ordnet man das kleine Hpa I-Hind III-Fragment "stromaufwärts" vom trp-Promoter an, so zeigt sich zweifelsfrei, daß in der Tetracyclin-resistenten Gruppe von Plasmiden (pEH3) die Transkription vom trp-Promoter zum Tetracyclin- Gen hin gerichtet ist, während im Tetracyclin-empfindlichen Plasmid (pEH4) das Entgegengesetzte der Fall ist.

Auf dieser Grundlage wäre zu erwarten, daß das Ausdrücken des Tetracyclingens in pEH3 vom trp-Promoter reguliert und gesteuert wird und daß eine etwaige Einführung in die Hind III-Stelle von pBR322 den Tetracyclinpromoter zerstört.

Dies wurde getestet durch Prüfung der Tetracyclin- Resistenz von pEH3 enthaltendem E. coli, das in Gegenwart und Abwesenheit von Tryptophan, d. h. unter Bedingungen gezüchtet wurde, unter denen die trp-Gene entweder gebunden oder freigelassen werden sollten. Das Plasmid pEH3 im Stamm W3110 trp ○ E ∇ 1 wurde auf einem Medium gezüchtet, das M9-Salze, Glucose, Casaminosäuren und 5 µg/ml Tetracyclin enthielt. Bei einem A₆₀₀-Wert von 0,05 wurde die Kultur geteilt. Zu einer Hälfte wurden 200 µg/ml Tryptophan gegeben. Nach Inkubation für eine weitere Stunde wurden die Zellen verdünnt und auf Agarplatten gegeben, die steigende Konzentrationen Tetracyclin enthielten. Die für 1 Stunde auf 200 µg/ml Tryptophan gezüchteten Zellen wurden auf Minimal-Agarplatten, die mit Tryptophan ergänzt waren, gezüchtet.

Die Ergebnisse dieser Reihe von Versuchen sind in Fig. 9 dargestellt.

(Fig. 9 veranschaulicht den Wirkungsgrad des Plattierens des Stamms trp ○ E ∇ 1 und seiner Derivate auf steigende Tetracyclinkonzentrationen. Kulturen des Stamms trp ○ E ∇ 1, der die genannten Plasmide enthielt, wurden in definierten Medien gezüchtet und in der nachstehend beschriebenen Weise behandelt. Die Überlebensrate in % wurde relativ zur entsprechenden Platte, die kein Tetracyclin enthielt, bestimmt. Platten, die 80 bis 400 Kolonien enthielten, wurden zur Bestimmung der Überlebenden in % verwendet. Die folgenden Tetracyclinkonzentrationen, die 50% der Zellen abzutöten vermögen, bestimmt durch den Kolonie-Test (EOP 50%), wurden aus der Abbildung gemessen: 12 µg/ml für plasmidfreie Zellen; 4,5 µg/ml für pEH4 enthaltende Zellen; 23 µg/ml für pEH3 enthaltende Zellen, die mit 200 µg/ml Tryptophan vorinkubiert waren; 56 µg/ml für pEH3 enthaltende Zellen, die ohne Tryptophan gezüchtet worden waren). Die Anwesenheit von Tryptophan im Medium verursachte eine 2,5fache Verringerung der durch pEH3 vermittelten Resistenz gegen Tetracyclin. Ähnliche Versuche mit pEH4 und mit plasmidfreiem W3110 trp p ○ E ∇ 1 (wobei das Anfangs-Kulturmedium kein Tetracyclin enthielt) ergaben, daß diese Bakterien für sehr niedrige Konzentrationen von Tetracyclin empfindlich waren.

Die der Eco RI-Stelle von pEH3 nächstliegende Hind III- Stelle wurde wie folgt entfernt, um das Plasmid pEH5 zu bilden:

20 µg des in der vorstehend beschriebenen Weise hergestellten pEH3 wurden mit Eco RI digeriert, an perlförmigem vernetztem Dextrangel der Handelsbezeichnung "Sephadex G-50" in 50 mM NaCl/0,1% SDS (Gew./Vol.) gelfiltriert, und der ausgeschlossene DNS-Peak wurde durch Ausfällung mit Äthanol eingeengt und in Wasser gelöst.

Das mit linearem Eco RI digerierte pEH3 wurde mit Exonuclease III bei 20°C digeriert. Das Gemisch enthielt 10 µg lineares Plasmid, 60 mM Tris pH 8, 0,66 mM MgCl₂, 4 mM Dithiothreit und 40 Einheiten von Exonuclease III in einem Gesamtvolumen von 200 µl. 100 µl aliquote Teile (5 µg) wurden nach 5 und 10 Minuten entfernt, mit Phenol und Chloroform extrahiert und mit Äthanol gefällt.

Das mit Exonuclease III behandelte Plasmid (5 µg) wurde zur Bildung stumpfer Enden 15 Minuten bei 30°C mit S1-Nuclease in einem Volumen von 100 µl behandelt. Das Reaktionsgemisch enthielt 150 mM NaCl, 25 mM Natriumacetat pH 4,6, 0,1 mM ZnSO₄, DNS und 2,5 Einheiten S1-Nuclease. Nach der Inkubation wurde das Gemisch mit Phenol und Chloroform extrahiert und dann mit Äthanol gefällt. 3 µg der mit S1 digerierten DNS wurden in einem Endvolumen von 10 µl mit 1 µl T₄-DWS-Ligase (0,8 Einheiten) 16 Stunden bei 15°C und dann 24 Stunden bei 4°C verbunden.

(Fig. 10 veranschaulicht ein 1%iges Agarosegel und zeigt die Entfernung von Hind III- und Hpa I-Stellen aus pEH3.)

Die Spuren a bis i enthalten die folgenden Desoxyribonucleinsäuren mit Größen in Kilobasenpaaren (kb): (a, i) λcI857,S7 mit Hind III als Größenmarkierer digeriert. Die Banden A bis F mit Größen von 21,79, 9,38, 6,30 bzw. 4,20 kb waren in Agarose sichtbar. (b) pEH3 mit Hind III digeriert; (c) pEH3 mit Sal I digeriert; (d) zusammengegossene Kolonien mit Hind III digeriert; (e) pEH5 mit Hind III digeriert; (f) pEH505 mit Hind III digeriert; (g) pEH5 mit Hpa I digeriert; (h) pEH505 mit Hpa I digeriert.

Herstellung von Plasmiden der pWT-Reihe Bakterien und Plasmide

Die verwendeten Bakterienstämme waren Escherichia coli K12-Derivate; HB101 F⁻ pro leu thi lac Y str^r rk⁻ mk⁻ Endo 1⁻ rec A⁻ & ED8689 trpR⁻rk⁻mg⁺.

Nährmedien und Transformation

Die Kultivierung erfolgte in Medien, die M9-Salze, Glucose und Casaminosäuren enthielten (siehe beispielsweise J. H. Miller, loc. cit.), für die Herstellung von Plasmid-DNS und die Testung auf Tetracyclin-Empfindlichkeit. Für Plasmid enthaltende Stämme wurden Antibiotika in geeigneter Konzentration zugesetzt. Die für die Transformation zu verwendenden Zellen wurden in L-Nährmedium gezüchtet.

Während der gesamten Testung auf Empfindlichkeit für Tetracyclin wurden die Zellen auf M9-Salze, Glucose und Casaminosäuren enthaltende Minimal-Agarplatten plattiert, die, wo angegeben, mit Tetracyclin (0 bis 80 µg/ml), 3β-Indolacrylsäure (20 µg/ml) oder Tryptophan (100 µg/ml) ergänzt waren.

Die Transformation erfolgte nach dem Protokoll von Glover (loc. cit.). Die Zellen wurden entweder auf Nähragar Nr. 2, das mit Ampicillin (100 µg/ml) ergänzt war, oder auf M9-Salze, Glucose und Casaminosäuren enthaltende Minimal- Agarplatten, die mit Ampicillin (100 µg/ml) oder Tetracyclin (10 µg/ml) ergänzt waren, plattiert.

Herstellung von Plasmid-DNS

Die Herstellung der Plasmid-DNS erfolgte entweder in der vorstehend für pEH5 beschriebenen Weise oder durch Extraktionen der geklärten Lysate mit Phenol/Chloroform, anschließende Ausfällung der DNS mit Isopropanol und abschließende erneute Suspendierung in TE-Puffer (10 mM Tris-HCl pH 7,5 1 mM EDTA).

Enzymreaktionen Restriktions-Endonuclease-Digestionen

DNS-Restriktionsdigestionen wurden entweder in einem salzreichen oder salzarmen Puffersystem 2 Stunden bei 37°C durchgeführt, wobei das Volumen des Reaktionsgemisches von 10 bis 200 µl und die Menge des zugesetzten Enzyms von 1 bis 20 Einheiten pro µg Plasmid-DNS variierten. Bam Hi-, Eco RI-, Hha I- (EC 3.1.23.19), Hind III- und Pst I- (EC 3.1.23.31) Digestionen wurden in 10 mM Tris-HCl pH 7,5, 10 mM MgCl₂, 50 mM NaCl, 1 mM Dithiothreit und 100 µg/ml Gelatine durchgeführt. Für Hpa I-Digestionen unterschied sich das Reaktionsgemisch nur darin, daß 50 mM NaCl durch 5 mM NaCl ersetzt wurden. Hinf I arbeitete in beiden Reaktionsgemischen gleich gut.

Wenn Plasmid-DNS, die nicht nach dem Cäsiumchlorid/Äthidiumbromid- Verfahren hergestellt worden war, digeriert wurde, enthielt das Reaktionsgemisch auch Ribonuclease vom Typ I-A (zur Entfernung von etwaiger DNSase-Aktivität 10 Minuten bei 95°C wärmebehandelt) in einer Menge von 50 µg/ml, um die RNS zu entfernen, die bei der Reinigung gleichzeitig mit der DNS ausgefällt wurde.

Alle Reaktionen wurden beendet, indem 5 Minuten auf 65°C erhitzt wurde.

Verbindungen

Kohäsive Endverbindungen wurden bei Volumina von 10 bis 20 µl in 50 mM Tris-HCl pH 7,8, 10 mM MgCl₂, 20 mM Dithiothreit, 1 mM ATP unter Verwendung von 0,01 bis 0,2 Einheiten Ligase für 0,5 bis 3 µg DNS vorgenommen. Die Reaktionsgemische wurden über Nacht bei 15°C inkubiert. Für Verbindungen von stumpfen Enden wurde das gleiche Reaktionsgemisch verwendet, jedoch wurde die Ligase auf 0,2 bis 0,6 Einheiten für 1 bis 3 µg DNS und die Inkubationstemperatur auf 25°C erhöht.

Füllung von 5′-Verlängerungen mit DNS- Polymerase I

0,5 bis 3,5 µg DNS wurden Polymerase-gefüllt in 50 mM Tris-HCl pH 7,8, 10 mM MgCl₂, 1 mM β-Mercaptoäthanol, je 0,1 mM dATP, dCTP, dGTP, dTTP in einem Volumen von 50 µl unter Verwendung von 0,25 bis 1,5 Einheiten Polymerase. Das Gemisch wurde 10 Minuten bei 10°C inkubiert, worauf ein aliquoter Teil direkt zur Verbindung stumpfer Enden verwendet oder das Ganze mit Phenol/Chloroform extrahiert und dann mit Äthanol gefällt werden konnte.

Polynucleotid-Kinasebehandlung von Hind III-linker-DNS

2,5 µg Decamer-Hind III-Bindeglied wurden der Kinasebehandlung für 60 Minuten bei 37°C mit 10 Einheiten Kinase in 25 mM Tris-HCl pH 7,8, 5 mM MgCl₂, 0,125 mM ATP, 25 µg/ml Rinderserumalbumin unterworfen. Die 5′-Termini wurden ferner durch Zusatz von 100 µCi [γ-³²P] ATP (3000 Ci/mMol) zum Reaktionsgemisch markiert. Die Reaktion wurde durch Zusatz von SDS zu 0,1% (Gew./Vol.) und EDTA zu 10 mM beendet und das ganze an einer 30×0,7 cm großen Säule des Ionenaustauschers der Handelsbezeichnung "Sephadex G-50" (SF), der in 50 mM NaCl/0,1% SDS (Gew./ Vol.) äquilibriert war, chromatographiert. Die ausgeschlossenen Fraktionen wurden vereinigt, mit Äthanol gefällt und erneut in Wasser bis 50 µg/ml suspendiert.

Behandlung von pBR322 mit Restriktion an Hind III mit bakterieller alkalischer Phosphatase: 5 bis 10 µg linearisiertes pBR322 in 20 mM Tris-HCl pH 7,5, 0,1% (Gew./Vol.) SDS wurden mit 5 µg bakterieller alkalischer Phosphatase 60 Minuten bei 37°C behandelt. Das Gemisch wurde dann mit Phenol/Chloroform extrahiert und die DNS mit Äthanol ausgefällt.

Digestion von mit Eco RI begrenztem pWT101 mit Exonuclease III und S1-Nuclease

Die angewandten Bedingungen waren die gleichen, wie sie für die Entfernung der Hind III-Stelle in pEH3 beschrieben wurden, außer daß aliquote Teile (3,33 µg) nach 1, 3 und 5 Minuten Digestion mit Exonuclease III entfernt wurden.

Herstellung von Gelproben aus ganzen Zell-Lysaten

Für "Ganzzellenlysis"-Agarosegele wurde eine repräsentative Probe von Plasmid enthaltenden Zellen von der Kulturplatte unter Verwendung einer sterilen Kunsttoffschleife abgestreift und erneut in 200 µl Agarose-Elektrophoresepuffer suspendiert. Zur Suspension wurden 50 µl "Ficoll"- Puffer (5% Gew./Vol.) SDS, 10% (Gew./Vol.) Ficoll (Copolymerisat von Saccharose und Epichlorhydrin) und 0,06% (Gew./Vol.) Bromphenolblau) gegeben. Das Gemisch wurde 30 Minuten bei 65°C inkubiert, um die Zellen zu lysieren, und dann 1 Minute verwirbelt. Etwa 40 µl einer solchen Probe erwiesen sich als ausreichend für die Identifizierung des Plasmids. RNS, die mit der DNS vorhanden war, konnte entfernt werden, indem entweder Ribonuclease mit 50 µg/ml zur Probe gegeben und anschließend 30 Minuten bei 37°C inkubiert wurde oder indem die Probe direkt zu 1 µg/ml der Agarosegelmatrix gegeben wurde. Durch beide Methoden wird die RNS-Schmiere entfernt, die sonst auf dem Gel vorhanden sein würde.

Gel-Elektrophorese

Agarosegele (20×15×0,5 cm) mit der Zusammensetzung 0,8 bis 1,4% wurden unter üblichen Bedingungen behandelt. Die Gele wurden der Elektrophorese entweder über Nacht bei 40 V oder 3 Stunden bei 120 V unterworfen und dann gefärbt und photographiert.

Acrylamidgele (20×15×0,15 cm) der Zusammensetzung 5 bis 10% wurden verwendet, um kleine Restriktionsfragmente zu identifizieren. Anfärben und Photographieren wurden in der gleichen Weise wie bei den Agarosegelen vorgenommen.

Isolierung des Tryptophanpromoter-Operator-Hinf I- Fragments und Anfügen des Hind III-Bindegliedes

6 µg pEH5 wurden der Restriktion an Hinf I und der Elektrophorese an einem 5%igen (Gew./Vol.) Acrylamidgel unterworfen, worauf der 497-bp-Hinf I-Tryptophanpromoter- Operator und die mitwandernde pBR322-Bande vom Gel abgeschnitten wurden und die DNS in bekannter Weise extrahiert wurde.

Die Hinf I-Enden wurden dann mit DNS-Polymerase I gefüllt und Hind III-Bindeglieder durch Stumpfend-Verbindung im Verhältnis von 50 Bindegliedfragmenten pro Hinf I- Fragment an sie angesetzt (dies verringert die Möglichkeit der Selbstbindung von Hinf I-Fragmenten). Klebrige Enden wurden durch Restriktion des Gemisches mit Hind III gebildet; die DNS wurde mit Äthanol ausgefällt und erneut in 50 µl 50 mM NaCl und 0,1% (Gew./Vol.) SDS auspendiert. Das Ganze wurde an einer 50×0,7 cm großen Säule des Ionenaustauschers "G150 Sephadex" (vorher mit 50 mM NaCl und 0,1% (Gew./Vol.) SDS ins Gleichgewicht gebracht) chromatographiert. Der ausgeschlossene Peak wurde zusammengegossen, und die DNS wurde mit Äthanol ausgefällt.

Aufbau von pWT101

Die vollständige Sequenz von E. coli-Tryptophanpromoter, Operator und Leader und die ersten sieben Aminosäuren von trpE sind auf einem Hinf I-Fragment von etwa 497 bp, das in pEH5 vorhanden ist, enthalten. Das Hinf I-Fragment mit 497 bp wurde in die Hind III-Stelle von pBR322 mit Hilfe von Decamer-Hind III-linker-DNS geklont. Die Durchführung dieser Maßnahme bedeutete, daß die Hinf I-Enden zuerst mit DNS-Polymerase I gefüllt werden mußten, um die Bindeglied- DNS anfügen zu können. Das Fragment wurde dann mit Hind III-Schnitt pBR322, der mit bakterieller Alkaliphosphatase behandelt worden war, verbunden und das Gemisch zur Umwandlung von E. coli HB101 unter Anwendung einer Auswahl mit Hilfe von Nähragar-Ampicillin verwendet. Insgesamt 582 Kolonien wurden aus der Umwandlung erhalten.

Durch Klonen in die Hind III-Stelle von pBR322 wird der Tetracyclin-Promoter inaktiviert, wodurch ein etwaiger Transformant Tetracyclin-empfindlich gemacht wird, wenn nicht das geklonte Stück seinen eigenen Promoter hat, der in die Tetracyclin-Gene umschreibt. Da das Hinf I-Fragment den Tryptophan-Promoter-Operator-Bereich enthält, sollten Transformanten, die in Plasmid mit dem in richtiger Orientierung geklonten Fragment enthalten, d. h. zum Tetracyclinpromoter hin transkribieren, resistent gegen Tetracyclin sein. Um dies zu testen, wurden 48 willkürlich von den Ampicillin-Transformationsplatten gewählte Kolonien auf M9-Salze und Casaminosäuren enthaltende Minimal- Agarplatten, die mit Tetracyclin (10 µg/ml) ergänzt worden waren, herausgestochen. Hiervon erwiesen sich elf als Tetracyclin-resistent. Dies ist die erwartete Zahl, da mit zwei anwesenden Fragmenten die Möglichkeit, die richtige Orientierung zu erhalten, eine von vier betrug. Die Anwesenheit von eingefügter DNS wurde auch bestätigt, indem Kolonien von beiden Gruppen von Platten entnommen und gegen eine pBR322-Kontrolle unter Verwendung ganzzelliger Agarose-Gele getestet wurden. Nach diesen Methoden wurden gegen Ampicillin und gegen Ampicillin und Tetracyclin resistente Kolonien isoliert, die Plasmide mit eingefügter DNS enthielten. Plasmid-Desoxyribonucleinsäuren wurden aus einer Anzahl dieser Kolonien für die Restriktions-Endonuclease-Analyse hergestellt.

Fig. 11 veranschaulicht die Herstellung und Charakterisierung von pWT101 und kann wie folgt ausgewertet werden:

• a) pEH5 mit Hinf I und Hpa I digeriert;
• b) pEH5 mit Hinf I allein digeriert;
• c) pWT101 mit Hind III digeriert;
• d) pWT101 mit Hind III und Hpa I digeriert.

Aufbau von pWT111 Entfernung der dem Tryptophan-Promoter distalen Hind III-Stelle

Die distale Hind III-Stelle wurde durch Spaltung mit Eco RI und anschließender Entfernung von DNS durch Digestion mit Exonuclease III und S1-Nuclease entfernt. Eine Behandlungsstufe mit DNS-Polymerase I wurde vor dem Verbinden ebenfalls einbezogen, um etwaige asymmetrische Enden, die nach der Digestion mit S1- Nuclease verblieben, auszufüllen.

Digestionszeiten von 1, 3 und 5 Minuten wurden gewählt. Die drei DNS-Gemische nach der Restriktion mit Eco RI, Digestion mit Exonuclease III (1, 3 und 5 Minuten), Ausfüllung mit DNS-Polymerase I und Verbindung der stumpfen Enden wurden verwendet, um HB101-Zellen umzuwandeln. Eine doppelte antibiotische Auswahl wurde durch Plattieren auf M9-Salze und Casaminosäuren enthaltende Minimal-Agarplatten, die mit Ampicillin und Tetracyclin ergänzt waren, getroffen. Die doppelte Auswahl stellte sicher, daß die β-Lactamase- und Tetracyclin-Gene intakt bleiben.

Zur weiteren Charakterisierung der wahrscheinlichen entfernenden Plasmide wurden je zwei Transformanten aus den nach 1 und 5 Minuten erhaltenen Fraktionen und vier aus der nach 3 Minuten erhaltenen Fraktion ausgewählt.

Charakterisierung der entfernenden Plasmide

Keines der acht Plasmide bildet ein Fragment mit 512 bp, wenn es mit Hind III abgeschnitten wird, und alle wandern zu einer Lage oberhalb des Fragments aus 4,36 kb von pWT101 nach Restriktion mit Hind III. Alle Plasmide wurden doppelt mit Hpa I und Pst I digeriert und bildeten so zwei Fragmente, wobei das kleinere dieser Fragmente den in Frage kommenden Bereich überspannt (den Bereich um die Eco RI-Stelle in pWT101). Die Größen der in pWT101 gebildeten Fragmente betragen 3777 und 1096 bp. Eine Prüfung veranschaulicht eindeutig die Tatsache, daß das letztgenannte Fragment in jedem Fall entfernt worden war, während das erstere, wie erwartet, unverändert geblieben war. Die Mengen von entfernter DNS reichen von 51 bp in pWT111 (Digestion für 1 Minute mit Exonuclease III) bis 361 bp pWT118 (Digestion mit Exonuclease III für 5 Minuten).

Da aus pWT111 die geringste Menge DNS entfernt worden war und der Tetracyclin-Wirkungsgrad von Plattierungsergebnissen zeigt, daß es bei der Transkription vom Tryptophan-Promoter ebenso wirksam ist wie pWT101, wurde es als Hind III-Klonungsvehikel gewählt, das für die Änderung der Translationsphase zu verwenden ist.

Aufbau von pWT121

Um die Phaseneinstellung von der Hind III-Stelle von pWT111 zu verändern, wurde die 5′-Verlängerung mit DNS-Polymerase I ausgefüllt und an Hind III-Linker-DNS gebunden, der Restriktion mit Hind III unterworfen, um überschüssiges Bindeglied zu entfernen und klebrige Enden zu bilden und dann erneut gebunden. Hierdurch wurden 14 bp von DNS zugefügt und der Leserahmen von der neuen Hind III-Stelle (die alte Stelle ist nun unvollständig) um plus ein Nucleotid verändert.

Aufbau von pWT131

Der dritte Leserahmen, d. h. pWT111 plus 2 Nucleotide, wurde durch Wiederholung der gleichen Reihe von Reaktionen an diesem phasenveränderten Plasmid erhalten. Diese Plasmide würden ebenso wie pWT111 kleine Polypeptide bilden, die beim Beginn von trpE anfangen und an den Stopkodonen (in jedem Fall verschiedene), die den Tetracyclin- Genen vorausgehen, enden. Auf Grund der Veränderungen im Leserahmen haben jedoch die Polypeptide sämtlich verschiedene C-endständige Aminosäuresequenzen, obwohl die N-entständigen Aminosäuresequenzen die gleichen sind.

Fig. 12 veranschaulicht die Veränderungen, die während der Phasenänderung von pWT111 zu pWT131 stattfinden. Diese Abbildung kann wie folgt gedeutet werden:

• a) pWT111 mit Hha I digeriert;
• b) pWT121 mit Hha I digeriert;
• c) pWT131 mit Hha I digeriert.

Herstelung von pWT121/FPV und Testung der Gen-Expression des FPV-HA-Antigens

10 µg pWT121 wurden mit Hind III grenzdigeriert. Die erhaltenen 5′-endständigen Phosphate der Vektoren wurden durch Behandlung mit 20 µg bakterieller Alkaliphosphatase für 30 Minuten bei 37°C bei einer 25-µl-Inkubation, die 20 mM Tris-HCl pH 7,5 und 0,1% (Gew./Vol.) SDS enthielt, entfernt. Nach Extraktion mit Phenol und Fällung mit Äthanol wurden 0,2 µg DNS an etwa 40 ng FPV-HA-Gen in einer 20-µl-Inkubation gebunden, die 50 mM Tris-HCl pH 7,5, 10 mM MgCl₂, 20 mM Dithiothreit (DTT), 1 mM ATP und 0,02 Einheiten T₄-DNS-Ligase enthielt. Nach Inkubation über Nacht bei 15°C wurden die Gemische mit TCM (10 mM Tris-HCl pH 7,5, 10 mM CaCl₂, 10 mM MgCl₂) auf 100 ml verdünnt und zum Transfer von mit 200 µl CaCl₂ behandeltem E. coli K12 HB101 nach einer bekannten Methode verwendet. Die nach 16stündigem Züchten bei 37°C auf L-Agar plus 100 µg/ml Carbenicillin (Pyopen, α-Carboxybenzylpenicillin) vorhandenen Transformanten wurden auf Resistenz gegen Tetracyclin getestet, indem sie auf Agarplatten, die M9-Salze, Glucose und Casaminosäuren plus Carbenicillin und Tetracyclin (10 µg/ml) enthielten, aufgebracht wurden.

Testung der Gen-Expression

Flüssige Kulturen (5 ml) einzelner Kolonien wurden in M9-Medium gezüchtet, das, wo angegeben, mit β-Indolacrylsäure (20 µg/ml) oder Tryptophan (100 µg/ml) ergänzt war. Die Zellen wurden durch Zentrifugieren isoliert, in 0,3 ml kalter 25% (Gew./Vol.) Saccharose/50 mM Tris pH 8 suspendiert und mit 0,1 ml Lysozym (10 mg/ml) inkubiert. In Abständen von 5 Minuten wurden 0,1 ml 0,5 M EDTA und dann 0,5 ml eisgekühlte "Triton"-Lösung zugesetzt. (Die "Triton"-Lösung enthält 60 mM EDTA, 50 mM Tris pH 8 und 0,1% [Vol./Vol.] "Triton X-100".) Dieses Lysat wurde ohne weitere Behandlung zu Antigen-Testung verwendet.

Die HA-Antigen-Tests wurden in Kulturröhrchen aus Polystyrol unter Anwendung einer Antikörper- Sandwich-Methode durchgeführt. Kaninchen-Anti-FPV HA wurde vor dem Gebrauch durch Fällung mit Ammoniumsulfat und Chromatographie an DEAE-Cellulose gereinigt und mit ¹²⁵J markiert. Die Röhrchen wurden 10 Minuten bei Raumtemperatur mit 50 µl 0,2 M NaHCO₃ pH 9, das 60 µg/ml gereinigtes, nicht markiertes IgG enthielt, abgedeckt, dreimal mit aliquoten Teilen von je 1 ml Waschpulver gewaschen und dann bei Raumtemperatur entweder mit bekannten Mengen (0,5-5 ng) zerrissenem FPV oder mit den bakteriellen Lysaten inkubiert. Nach 2 Stunden wurden die Röhrchen viermal mit aliquoten Teilen von je 1 ml Waschpuffer gewaschen und abschließend 16 Stunden bei 4°C mit 50 µl Waschpuffer, der 200 000 cpm ¹²⁵J-Anti-HA enthielt, inkubiert. Die Röhrchen wurden erneut gewaschen und in einem Packard-γ-Zähler gezählt. Das vorhandene Antigen wurde aus Standardkurven, die die an die Menge von vorhandenem FPV gebundene Radioaktivität betrafen, quantitativ bestimmt.

Herstellung von nic⁻-Derivaten

Durch Restriktion der drei phasenveränderten pWT-Plasmide und pAT153 sowohl mit Bam HI als auch Pt I werden zwei Fragmente aus jedem Plasmid gebildet. Dies ist in Fig. 14 veranschaulicht.

pAT153 bildet Fragmente von 1129 bp und 2529 bp, wobei das letztere größere Fragment das Original enthält, jedoch die nic-Stelle aus ihm entfernt worden ist.

Die pWT-Plasmide bilden sämtlich das gleiche 3233-bp- Fragment, das das Original und die nic-Stelle enthält, aber verschiedene kleinere Fragmente, die die trp-Kontrollelemente enthalten; die Unterschiede ergeben sich aus den Phasenwechsel-Veränderungen an der Hind III-Stelle.

Die Plasmide wurden der Restriktion mit Pst I und Bam HI und der Elektrophorese an einem 3,5%igen Acrylamidgel unterworfen. Die Banden pAT153 2529 bp, pWT111 1590 bp, pWT121 1604 bp und pWT131 1618 bp wurden ausgeschnitten und aus dem Acrylamid isoliert. Die pAT153-Bande wurde dann unabhängig an die drei pWT-Banden gebunden, und die Ligationsgemische wurden zur Transformation von E. coli- HB101-Zellen durch Selektion auf Nähr-Agar, das Carbenicillin in einer Menge von 100 µg/ml enthielt, verwendet. Da das pAT153153-Fragment nicht in der Lage ist, von sich aus Resistenz gegen Ampicillin und Tetracyclin zu verleihen und den pWT-Fragmenten ein Original fehlt, stellt die Auswahl auf Carbenicillin sicher, daß die erhaltenen rekombinierenden Moleküle diese beiden Fragmente enthalten müssen. Plasmid-Desoxyribonucleinsäuren wurden aus einer Anzahl der Kolonien hergestellt, die auf den Transformationsplatten wachsen, und diese wurden zur Bestätigung der Anwesenheit der gewünschten Plasmide durch Restriktionsanalyse verwendet.

Die folgenden Enzym-Digestionen wurden durchgeführt:
Pst I- und Bam HI-Digestion zur Bildung der gebundenen Fragmente: In Fig. 15 sind die Spuren b, c und d Digests von nic⁻-Derivaten von pWT131, 121 bzw. 111. Die Spur a ist ein Digest von pWT131 und die Spur e ein Digest von pAT153. Wie aus dem Gel ersichtlich ist, haben alle drei nic⁻-trp-Plasmide das pAT153-Fragment von 2529 bp erworben, jedoch halten sie dennoch die ursprünglichen trp-Kontrollfragmente zurück.

Hind III-Digestion zum Nachweis, daß die trp-p/o-kontrolierte Expressionsstelle noch funktionell ist: In Fig. 16 sind die Spuren a, b, c und d Digests von pWT231, 221, 211 bzw. 131. Alle drei nic⁻-Derivate unterliegen der Restriktion mit Hind III und sind als Folge des Fehlens der beiden Hae II-Fragmente kleiner als pWT131.

Hae II-Digestion zum Nachweis, daß die Hae II-B- und -H- Fragmente aus dem pBR322-Bereich der Plasmide fehlen: In Fig. 17 sind die Spuren a bis f Digests von pBR322, pAT153, pWT231, 221, 211 bzw. 131. Allen vier nic⁻- Plasmiden (Spuren b bis e) fehlen zwei Hae II-Fragmente, nämlich das Hae II-B-Fragment von 622 bp und das Hae II-H-Fragment von 82 kp von pBR322.

Claims (14)

1. Plasmid mit einer Einfügungsstelle für ein eukaryotisches DNS-Fragment in Nachbarstellung zu einem bakteriellen trp-Promoter und hinter einer prokaryotischen Ribosomenbindungsstelle und einem Initiatorkodon in einer solchen Weise, daß der bakterielle trp-Promoter die Transkription und Translation eines eingefügten DNS-Fragments reguliert und steuert.

2. Plasmid nach Anspruch 1, gekennzeichnet durch eine Moleküllänge von 9866 bp; eine Bam I-Stelle 346 bp von der Hind III-Stelle; eine Sal I-Stelle 275 bp von der Bam I- Stelle; eine Eco RI-Stelle 3709 bp von der Sal I-Stelle; eine zweite Hind III-Stelle 31 bp von der Eco RI-Stelle; eine Hpa I-Stelle 305 bp von der zweiten Hind III-Stelle; eine zweite Hpa I-Stelle 3250 bp von der ersten Hpa I- Stelle und 1950 bp von der ersten Hind III-Stelle, wobei das Plasmid den trp-Promoter, das E-Gen und einen Teil des D-Gens in dem Teil von 1950 bp zwischen der zweiten Hpa I-Stelle und der ersten Hind III-Stelle enthält; das Gen für Tetracyclin-Resistenz unmittelbar der ersten Hind III-Stelle folgt und das Gen für Ampicillinresistenz im Teil von 3709 bp zwischen der Sal I-Stelle und der Eco-RI-Stelle liegt und das Plasmid als pEH3 bezeichnet wird.

3. Plasmid nach Anspruch 1, gekennzeichnet durch eine Moleküllänge von 9866 bp; eine Bam I-Stelle 346 bp von der Hind III-Stelle; eine Sal I-Stelle 275 bp von der Bam I-Stelle; eine Eco-RI-Stelle 3709 bp von der Sal I- Stelle; eine zweite Hind III-Stelle 31 bp von der Eco RI-Stelle; eine Hpa I-Stelle 1950 bp von der zweiten Hind III-Stelle; eine zweite Hpa I-Stelle 3250 bp von der ersten Hpa I-Stelle und 305 bp von der ersten Hind III-Stelle, wobei das Plasmid den trp-Promoter, das E-Gen und einen Teil des D-Gens in dem Teil von 1950 bp zwischen der zweiten Hind III-Stelle und der ersten Hpa I-Stelle enthält; das Gen für Tetracyclin- Resistenz unmittelbar der ersten Hind III-Stelle folgt und das Gen für Ampicillin-Resistenz in dem Teil von 3709 bp zwischen der Sal I- und der Eco RI-Stelle liegt und das Plasmid als pEH4 bezeichnet wird.

4. Plasmid nach Anspruch 1, gekennzeichnet durch eine Moleküllänge von 6750 bp; eine Hind III-Stelle; eine Bam HI- Stelle 346 bp von der Hind III-Stelle; eine Sal I-Stelle 275 bp von der Bam HI-Stelle; eine Hpa I-Stelle 4230 bp von der Sal I-Stelle und 1950 bp von der Hind III-Stelle, wobei das Plasmid den trp-Promoter, das E-Gen und einen Teil des D-Gens in dem Teil von 1950 bp enthält, der sich zwischen der Hpa I-Stelle und der Hind III- Stelle erstreckt, und das Gen für Ampicillin-Resistenz in dem Teil von 4800 bp zwischen der Hind III-Stelle und der Hpa I-Stelle liegt und das Plasmid als pEH5 bezeichnet wird.

5. Plasmid nach Anspruch 1, gekennzeichnet durch eine Moleküllänge von 4874 bp; eine Eco RI-Stelle; eine Hind III-Stelle 31 bp von der Eco RI-Stelle; eine Hpa I-Stelle 313 bp von der Hind III-Stelle; eine zweite Hind III-Stelle 199 bp von der Hpa I-Stelle; eine Bam I-Stelle 346 bp von der zweiten Hind III-Stelle; eine Sal I-Stelle 275 bp von der Bam I-Stelle; eine Pst I-Stelle 2958 bp von der Sal I-Stelle und 752 bp von der Eco RI-Stelle, wobei sich das Gen für Tetracyclin- Resistenz vom Bereich der Hpa I-Stelle bis jenseits der Sal I-Stelle erstreckt; das Gen für Ampicillin-Resistenz im Bereich der Pst I-Stelle liegt und der geklonte Teil des trp-Operons den Bereich zwischen dem Promoter und dem ersten Teil des E-Gens zwischen der Hpa I-Stelle und der zweiten Hind III- Stelle umfaßt und das Plasmid als pWT101 bezeichnet wird.

6. Plasmid nach Anspruch 1, gekennzeichnet durch eine Moleküllänge von 4823 bp; eine Hpa I-Stelle; eine Hind III-Stelle 199 bp von der Hpa I-Stelle; eine Bam I-Stelle 346 bp von der Hind III-Stelle; eine Sal I-Stelle 275 bp von der Bam I-Stelle; eine Pst I-Stelle 2958 bp von der Sal I-Stelle und 1045 bp von der Hpa I-Stelle; wobei das Gen für Tetracyclin-Resistenz sich vom Bereich der Hpa I-Stelle bis jenseits der Sal I-Stelle erstreckt; das Gen für Ampicillin-Resistenz im Bereich der Pst I-Stelle und des geklonten Teils des trp-Operons den Bereich zwischen dem Promoter und dem ersten Teil des E-Gens zwischen der Hpa I-Stelle und der Hind III- Stelle umfaßt, und das Plasmid als pWT111 bezeichnet wird.

7. Plasmid nach Anspruch 1, gekennzeichnet durch eine Moleküllänge von 4837 bp; eine Hpa I-Stelle; eine Hind III-Stelle 206 bp von der Hpa I-Stelle; eine Bam I- Stelle 353 bp von der Hind III-Stelle; eine Sal I-Stelle 275 bp von der Bam I-Stelle; eine Pst I-Stelle 2958 bp von der Sal I-Stelle und 1045 bp von der Hpa I-Stelle, wobei das Gen für Tetracyclin-Resistenz sich vom Bereich der Hpa I-Stelle bis jenseits der Sal I-Stelle erstreckt; das Gen für Ampicillin-Resistenz im Bereich der Pst I- Stelle und des geklonten Teils des trp-Operons den Bereich zwischen dem Promoter und dem ersten Teil des E-Gens zwischen der Hpa I-Stelle und der Hind III-Stelle umfaßt und das Plasmid als pWT121 bezeichnet wird und die Phaseneinstellung um 1 bp gegenüber pWT111 geändert ist.

8. Plasmid nach Anspruch 1, gekennzeichnet durch eine Moleküllänge von 4851 bp; eine Hpa I-Stelle; eine Hind III-Stelle 213 bp von der Hpa I-Stelle; eine Bam I-Stelle 360 bp von der Hind III-Stelle; eine Sal I-Stelle 275 bp von der Bam I-Stelle; eine Pst I-Stelle 2958 bp von der Sal I-Stelle und 1045 bp von der Hpa I-Stelle, wobei das Gen für Tetracyclin-Resistenz sich vom Bereich der Hpa I-Stelle bis jenseits der Sal I-Stelle erstreckt; das Gen für Ampicillin-Resistenz im Bereich der Pst I-Stelle und dem geklonten Teil des trp-Operons dem Bereich zwischen dem Promoter und dem ersten Teil des E-Gens zwischen der Hpa I-Stelle und der Hind III- Stelle umfaßt und das Plasmid als pWT131 bezeichnet wird und die Phaseneinstellung um 2 bp gegenüber pWT111 geändert ist.

9. Verfahren zur Herstellung eines Plasmids nach Anspruch 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet, daß man einen Wildstamm von E. coli mit Restriktionsendonuclease Hind III digeriert, das hierbei erhaltene Fragment mit dem linearen Molekül verbindet, das durch die Restriktion des Plasmids pBR322 mit der Restriktionsendonuclease Hind III erhalten worden ist, trp ○ E ∇ 1 E. coli mit dem erhaltenen Plasmid transformiert und diejenigen Kolonien von E. coli auswählt, die Resistenz gegen oder Empfindlichkeit für Tetracyclin und Tryptophan-Komplementierung zeigen.

10. Verfahren zur Herstellung von pEH5 nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß man pEH3 mit Restriktions-Endonuclease Eco RI behandelt, das lineare Molekül mit Exonulcease III und S1-Nuclease digeriert, mit DNS-Polymerase I behandelt, das lineare Molekül mit DNS-Ligase verbindet, trp ○ E ∇ 1 E. coli mit dem erhaltenen Plasmid umwandelt und diejenigen Kolonien auswählt, die Tryptophan-Ergänzung und Ampicillin- Resistenz zeigen, um das Plasmid pEH5 zu erhalten.

11. Verfahren zur Herstellung von pWT101 nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß man Restriktion von pEH5 mit Restriktions-Endonuclease Hinf I vornimmt und hierbei ein Fragment enthält, das den vollständigen Tryptophan-Promoter enthält, und das Fragment in die Hind III-Stelle des Plasmids pBR322 klont, indem man die Hinf I-Enden des Fragments mit DNS-Polymerase I behandelt, das Fragment mit Hind III-Bindegliedern in Gegenwart von DNS-Ligase behandelt, das angeknüpfte Molekül mit Hind III-Restriktions-Endonuclease behandelt und hierbei ein lineares Molekül mit klebrigen Hind III-Enden bildet, das lineare Molekül in die Hind III-Stelle des Plasmids pBR322 einbindet, E. coli K12 HB101 mit den erhaltenen Plasmiden transformiert und diejenigen Kolonien von E. coli auswählt, die Resistenz gegen Ampicillin zeigen, und hierbei das Plasmid pWT101 erhält.

12. Verfahren zur Herstellung von pWT111 nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß man Restriktion von pWT101 mit Restriktions-Endonuclease Eco RI vornimmt, das lineare Moleküle mit Exonuclease III und S1-Nuclease digeriert, mit DNS-Polymerase I behandelt, das lineare Molekül wieder einbindet, E. coli K12 HB101 mit den erhaltenen Plasmiden transformiert und diejenigen Kolonien von E. coli auswählt, die Resistenz gegen Ampicillin zeigen, wobei man das Plasmid pWT111 erhält.

13. Verfahren zur Herstellung von pWT121 gemäß Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß man Restriktion von pWT111 mit Restriktions-Endonuclease Hind III vornimmt, das lineare Molekül mit DNS-Polymerase I behandelt, mit Hind III-linker-DNS einbindet, eine Restriktion mit Restriktions-Endonulcease Hind III vornimmt, das lineare Molekül wieder einbindet, E. coli K12 HB101 mit den erhaltenen Plasmiden transformiert und diejenigen Kolonien von E. coli auswählt, die Resistenz gegen Ampicillin zeigen, wobei man das Plasmid pWT121 erhält.

14. Verfahren zur Herstellung von pWT131 gemäß Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß man Restriktion von pWT121 mit Restriktions-Endonuclease Hind III vornimmt, das lineare Molekül mit DNS-Polymerase I behandelt, mit Hind III-linker-DNS verbindet, Restriktion mit Restriktions-Endonuclease Hind III vornimmt, das lineare Molekül wieder einbindet, E. coli K12 HB101 mit den erhaltenen Plasmiden transformiert, diejenigen Kolonien von E. coli auswählt, die Resistenz gegen Ampicillin zeigen, und hierbei das Plasmid pWT131 erhält.