DE3050722C2

DE3050722C2 -

Info

Publication number: DE3050722C2
Application number: DE3050722A
Authority: DE
Inventors: David V. Goeddel; Herbert L. Burlingame Calif. Us Heyneker
Original assignee: Genentech Inc
Current assignee: Genentech Inc
Priority date: 1979-07-05
Filing date: 1980-06-24
Publication date: 1987-09-24
Also published as: RO93374A; JPH0612996B2; DD210071A5; FR2460330B1; US4601980A; NO167673B; AU533697B2; ATE82324T1; CS250655B2; FR2518572A1; EP0022242A3; NZ201312A; DK251490D0; ES493149A0; HK87584A; NL930114I2; AR244341A1; MY8500764A; IE801214L; PH19814A

Description

Genetische Expression

Die DNA (Desoxyribonucleinsäure), aus der Gene bestehen, enthält sowohl Protein codierende oder "Struktur"-Gene als auch Kontrollregionen, welche die Expression ihrer Information dadurch vermitteln, daß sie Bereiche (sites) für die DNA-Polymerase-Bindung, Information für ribosomale Binde stellen usw. bereitstellen. Codierendes Protein wird von der korrespondierenden DNA innerhalb des Organismus durch einen vielstufigen Prozeß exprimiert, wobei:

1. das Enzym RNA-Polymerase in der Kontrollregion (im folgenden "Promoter" genannt) aktiviert wird und sich an den Struktur-Genen entlang arbeitet, wobei deren codierte Information in Boten- (Messenger)-Ribonucleinsäure (mRNA) transkribiert wird, bis die Transkription bei einem oder mehreren "Stop"-Codons beendet wird;
2. die mRNA-Botschaft an den Ribosomen in ein Protein translatiert wird, für dessen Amonosäuresequenz das Gen codiert, beginnend bei einem "Start"- Signal für die Translation, überwiegend einem ATG (das in "f-Methionin" translatiert wird).

In Übereinstimmung mit dem genetischen Code, spezifiziert die DNA jede Aminosäure durch ein Triplet oder "Codon" von drei benachbarten Nucleotiden, die einzeln ausgewählt werden aus Adenosin, Thymidin, Cytidin und Guanin, die im folgenden A, T, C oder G genannt werden. Diese treten in dem codierenden Strang oder der codierenden Sequenz einer Doppelstrang-("Duplex")-DNA auf, dessen bleibender oder "komplementärer" Strang aus Nucleotiden ("Basen") gebildet wird, die mit den ihnen komplementären Basen in codierenden Strang Wasserstoffbrückenbindungen eingehen. A ist komplementär zu T und C komplementär zu G. Die bisher beschriebenen und weitere Erkenntnisse, die sich auf den Hintergrund der Erfindung beziehen, sind ausführlich diskutiert in Benjamin Lewin, Gene Expression 1, 2 (1974) und 3 (1977), John Wiley und Sons, N.Y.

Schneiden und Verbinden von DNA

Es stehen eine Anzahl von Techniken für DNA-Rekombination zur Verfügung, nach denen aneinander angrenzende Enden separater DNA-Fragmente auf die eine oder andere Weise geschnitten werden, um das Verbinden zu erleichtern. Das Verbinden geschieht durch Bildung von Phosphodiesterbindungen zwischen aneinandergrenzenden Nucleotiden, meistens durch die Wirkung eines Enzyms, einer T4 DNA-Ligase. Auf diese Weise können stumpfe Enden direkt miteinander verbunden werden. Alternativ dazu sind Fragmente mit komplementären Einzelsträngen an ihren aneinandergrenzenden Enden vorteilhaft, da durch die Wasserstoffbrückenbindungen die jeweiligen Enden in die Position für die anschließende Verbindung gebracht werden. Solche Einzelstränge, als cohäsive Enden bezeichnet, können dadurch gebildet werden, daß man an stumpfe Enden unter Verwendung einer terminalen Transferase Nucleotide anhängt, und manchmal einfach dadurch, daß ein Strang eines stumpfen Endes mit einem Enzym wie λ-Exonuclease abgeknabbert wird. Meistens jedoch verwendet man Restriktions endonucleasen (im folgenden "Restriktionsenzyme"), die Phosphodiesterbindungen in und im Bereich von spezifischen Nucleotidsequenzen, die eine Länge von etwa 4 bis 6 Basenpaaren haben ("Restriktionserkennungsstelle"), schneiden. Es sind sehr viele Restriktionsenzyme und ihre Erkennungsstellen bekannt. Siehe z. B. R. J. Roberts, CRC Critical Reviews in Biochemistry, 123 (Nov. 1976). Viele davon machen versetzte Schnitte, wodurch kurze komplementäre Einzelstrangsequenzen an den Enden eines an sich doppel strängigen Fragments entstehen. Als komplementäre Sequenzen können die überstehenden oder "cohäsiven" Enden durch Basenpaarung rekombinieren. Wenn zwei unterschiedliche Moleküle mit diesen Enzymen geschnitten werden, entsteht durch kreuzweise Paarung der komplementären Einzelstränge ein neues DNA-Molekül. Durch die Verwendung von Ligase, das die an den Verschmelzungspunkten bleibenden Einzelstrangbrüche heilt, erhalten die neuen DNA-Moleküle eine feste kovalente Bindung. Restriktionsenzyme, die an geschnittener doppelsträngiger DNA "stumpfe" Enden hinterlassen, erlauben eine Rekombination mit anderen stumpfendigen Sequenzen durch beispielsweise T4-Ligase.

Clonierende Vektoren und rekombinante DNA

Für den vorliegenden Zweck wird folgendes "clonierender Vektor" genannt: ein nichtchromsomales Stück einer doppel strängigen DNA, das ein intaktes Replikon enthält, so daß der Vektor repliziert werden kann, wenn er in einen einzelligen Organismus ("Mikrobe") durch Transformation gebracht wird. Ein auf diese Weise transformierter Organismus wird "Transformante" genannt. Derzeit sind die clonierenden Vektoren, die üblicherweise verwendet werden, von Viren und Bakterien abgeleitet und sind überwiegend Ringe von bakterieller DNA, genannt "Plasmide".

Die Fortschritte in der Biochemie haben in den letzten Jahren zur Konstruktion von "rekombinanten" clonierenden Vektoren geführt, die beispielsweise aus einem Plasmid, das exogene DNA enthält, bestehen. In besonderen Beispielen kann die Rekombinante "heterologe" DNA einschließen, wobei damit eine DNA gemeint ist, die für Polypeptide codiert, die normalerweise nicht durch den Organismus hergestellt werden, welcher empfindlich ist für die Transformation durch den rekombinanten Vektor. Es werden somit Plasmide mit Restriktionsenzymen geschnitten, um lineare DNA zur Verfügung zu stellen, die verbindbare Enden hat. Diese werden an ein exogenes Gen gebunden, das ebenfalls verbindbare Enden aufweist, um ein biologisch funktionierendes Teil zur Verfügung zu stellen, das ein intaktes Replikon und eine phänotypische Eigenschaft aufweist, die benützt werden kann, um Transformanten zu selektieren. Das rekombinante Teil wird durch Transformation in einen Mikroorganismus überführt, und die Transformante wird isoliert und geclont. Das Ziel ist, große Population zu erhalten, die Kopien des exogenen Gens enthalten, und in besonderen Fällen ist das Ziel die Expression des Proteins, für welches das Gen codiert. Über die hiermit verbundene Technologie und deren mögliche Anwendung ist in extenso berichtet in Miles International Symposium Series 10: Recombinant Molecules: Impact on Science and Society, Beers und Bosseff, eds., Raven Press, N.Y. (1977).

Expression von rekombinanter DNA

Neben der Verwendung von clonierenden Vektoren, um den Vorrat von Genen durch Replikation zu vergrößern, hat es Versuche gegeben, einige davon erfolgreich, tatsächlich eine Expression der Proteine zu erhalten, für die die Gene codieren. In einem ersten derartigen Versuch wurde ein Gen für das Hirnhormon Somatostatin unter dem Einfluß des lac-Promoters in einem E. coli Bakterium exprimiert (K. Itakura et al., Science 198, 1056 (1977)). Kürzlich gelang auf die gleiche Weise die Expression der A- und B-Kette des menschlichen Insulins, die zusammengefügt das Hormon bilden (D. V. Goeddel et al., Proc. Nat. Acad. Sci., USA 76, 106 (1979)). In jedem Fall wurden die Gene vollständig durch Synthese konstruiert. In jedem Fall würden offensichtlich proteolytische Enzyme innerhalb der Zelle das gewünschte Produkt abbauen, wodurch dessen Herstellung in konjugierter Form nötig ist, d. h. als Tandem mit einem anderen Protein, das das gewünschte Produkt durch Kompartimentierung schützt und das außerhalb der Zelle abgeschnitten werden kann, um das angestrebte Produkt zu erhalten. Diese Arbeit ist in den folgenden veröffentlichten englischen Patentschriften beschrieben: GB 20 07 675 A; GB 20 07 670 A; GB 20 07 676 A; GB 20 08 123 A.

Während sich der Weg über synthetische Gene in den bisher diskutierten, verschiedenen Fällen als zweckmäßig erwiesen hat, zeigten sich wirkliche Schwierigkeiten für den Fall von sehr viel größeren Proteinprodukten, z. B. Wachs tumshormonen, Interferon usw., deren Gene in korrespondierender Weise komplexer und weniger geeignet für eine leichte Synthese waren. Gleichzeitig wäre es wünschenswert, derartige Produkte ohne die Begleitung durch konjugierendes Protein zu exprimieren, da die Notwendigkeit von deren Expression die Verwertung von Material erfordert, das innerhalb des Organismus besser für die Konstruktion des angestrebten Produkts verwendet werden könnte.

In anderen Arbeiten ist die Expression von Genen versucht worden, die nicht durch organische Synthese erhalten wurden, sondern durch reverse Transkription von korrespondierender Messenger-RNA, die aus Gewebe gereinigt wurde. Dieser Versuch ist mit zwei Problemen behaftet. Erstens kann die reverse Transkriptase die Transkription von der mRNA kurz vor der Fertigstellung der cDNA für die komplette, gewünschte Amonosäuresequenz beenden. So haben beispielsweise Villa-Komaroff et al. eine cDNA für Ratten- Proinsulin erhalten, dem die ersten drei Aminosäuren des Insulinvorläufers fehlten (Proc. Nat. Acad. Sci., USA 75, 3727 (1978)). Weiterhin hat die reverse Transkription von mRNA für Polypeptide, die in Vorläuferform exprimiert werden, eine cDNA für den Vorläufer ergeben, statt des bioaktiven Proteins, das man erhält, wenn in einer eukaryo tischen Zelle Führersequenzen (im folgenden Leader-Sequenzen) enzymatisch abgetrennt werden. Bisher ist keine Bakterien zelle aufgezeigt worden, die diese Fähigkeiten hätte, so daß das mRNA-Transkript eher die Expression von Produkten ergeben hat, die die Leader-Sequenz der Vorläuferform enthalten, als das bioaktive Protein selbst (Villa-Komaroff, a. a. O. (Ratten-Proinsulin); P. H. Seeburg et al., Nature 276, 795 (1978) (Rattenwachstumshormon)).

Schließlich haben vergangene Versuche durch andere zur bakteriellen Expression menschlicher Hormone (oder deren Vorläufern) von mRNA-Transkripten gelegentlich nur zur Produktion des konjugierten Proteins geführt, das offen sichtlich nicht dem extrazellulären Schneiden zugänglich ist, z. B. Villa-Komaroff, a.a.O. (Penicillinase-Proinsulin); Seeburg, a.a.O. (β-Lactamase-Wachstumshormon).

Menschliches Wachstumshormon

Menschliches Wachstumshormon ("HGH") wird abgesondert in der menschlichen Hypophyse. Es besteht aus 191 Aminosäuren und ist, mit einem Molekulargewicht von etwa 21.500, mehr als dreimal so groß wie Insulin. Bis zur vorliegenden Erfindung konnte menschliches Wachstumshormon nur arbeits aufwendig aus einem sehr limitierten Angebot gewonnen werden - der Hypophyse aus menschlichen Leichen. Die daraus folgende Knappheit dieser Substanz hat ihre Anwendung bei der Behandlung von durch Funktionsstörung der Hypophyse verursachten hypophysären Zwergenwuchs begrenzt, und sogar hier wird aufgrund zuverlässiger Schätzungen vermutet, daß vom Menschen abgeleitetes HGH nur in einer solchen Menge erhalten werden kann, daß nicht mehr als 50% der Betroffenen damit behandelt werden können.

Zusammengefaßt besteht daher eine Notwendigkeit für neue Methoden, um HGH in großen Mengen herzustellen. Diese Notwendigkeit ist besonders akut in dem Fall, weil HGH zu groß ist, um organische Synthese zuzulassen. Die Expression von Säugetierhormonen von mRNA-Transskripten hat die Aussicht eröffnet, die Schwierigkeiten, die dem synthetischen Versuch anhaften, zu umgehen, andererseits jedoch bis heute lediglich die mikrobielle Produktion von bioinaktiven Konjugaten erlaubt, von denen die gewünschten Hormone nicht brauchbar getrennt werden können.

Die Erfindung stellt die erste Möglichkeit dar, mit der ein medizinisch signifikantes Polypeptidhormon, menschliches Wachstumshormon, nämlich bakteriell exprimiert wird, wobei sowohl die intrazelluläre Proteolyse als auch die Notwendigkeit der Kompartimentierung der bioaktiven Form mit Fremdprotein bis zum extrazellulären Schneiden vermieden wird. Der mikrobielle Ursprung für menschliches Wachstumshormon, ermöglicht durch die Erfindung, bietet vorerst einen reichen Vorrat des Hormons für die Behandlung von Zwergenwuchs, zusammen mit anderen Anwendungsmöglichkeiten, die bisher jenseits der Kapazität der Hormone lagen, die aus Geweben zu erhalten waren, einschließlich diffusem Magenbluten, Pseudoarthrose, der Therapie von Brandwunden, Wundheilung, Dystrophy und der Heilung von Knochenbrüchen.

Die Art, auf welche diese und andere Ziele und Vorteile der Erfindung erreicht werden können, wird aus der folgenden Spezialbeschreibung verständlich sowie aus den beigefügten Zeichnungen. Es zeigen:

Fig. 1 das Syntheseschema für die Konstruktion eines Genfragments, das für die ersten 24 Aminosäuren des menschlichen Wachstumshormons codiert, zusammen mit dem Startsignal ATG und Bindegliedern, die beim Clonen verwendet werden. Die Pfeile im codierenden oder oberen Strang ("U") und in dem komplementären oder unteren Strang ("L") bezeichnen die Oligonucleotide, die miteinander verbunden wurden, um das gezeigte Fragment zu bilden;

Fig. 2 die Verbindungen der "U"- und "L"-Oligonucleotiden, für die Bildung des Genfragments aus Fig. 1, und dessen Insertion in ein Plasmid als clonierendem Vektor;

Fig. 3 die DNA-Sequenz (nur der codierende Strang) eines HaeIII-Restriktionsenzymfragments eines Hypophysen-mRNA- Transkripts, mit den numerierten Aminosäuren des menschlichen Wachstumshormons, für das sie codieren. Schlüsselrestriktionserkennungsstellen sind bezeichnet, ebenso DNA (auf "Stop" folgende) für nicht translatierte mRNA;

Fig. 4 die Konstruktion eines clonierenden Vektors für ein Genfragment, das für die Aminosäuren des menschlichen Wachstumshormons codiert, welches nicht synthetisch erhalten wurde, und die Konstruktion dieses Genfragments als komplementäre DNA durch reverse Transkription von mRNA, die aus der Hypophyse menschlichen Ursprungs isoliert wurde;

Fig. 5 die Konstruktion eines Plasmids, das in Bakterien zur Expression des menschlichen Wachstumshormons fähig ist, beginnend mit den Plasmiden der Fig. 2 und 3.

Der generelle Weg der Erfindung ist die Kombination mehrerer Genfragmente im einem einzigen clonierenden Vektor, wobei diese Genfragmente in Kombination für die Expression des gewünschten Produkts codieren. Von den Genfragmenten ist mindestens eines ein cDNA-Fragment, das durch reverse Transkription von mRNA abgeleitet ist, welche aus Gewebe isoliert wurde, wie durch die Methode nach A. Ullrich et al., Science 196, 1313 (1977). Die cDNA stellt einen wesentlichen Bestandteil, vorzugsweise mindestens eine Mehrheit der Codons für das gewünschte Produkt zur Verfügung, während restliche Teile des Gens synthetisch erhalten werden. Die synthetischen und die mRNA-Transkriptfragmente werden getrennt geclont, um ausreichende Mengen für den Einsatz in dem späteren Kombinationsschritt zur Verfügung zu stellen.

Eine Vielzahl von Überlegungen beeinflußt die Verteilung der Codons für das Endprodukt, z. B. zwischen synthetischer und cDNA, ganz besonders die DNA-Sequenz der komplementären DNA, wie es beschrieben ist in dem Verfahren nach Maxam und Gilbert, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 74, 560 (1977). Komplementäre DNA, die durch reverse Transkription erhalten wird, wird auf unveränderliche Weise Codons für mindestens eine Carboxyl-Endgruppe des gewünschten Produkts enthalten, ebenso wie andere, stromabwärts von einem oder mehreren Trans lations-Stopsignalen, benachbart zum Carboxylende liegende Codons für nicht translatierte mRNA. Die Anwesenheit von DNA für nicht translatierte RNA ist weitgehend unerheblich, obwohl übermäßig verlängerte Sequenzen dieser Art z. B. durch Schneiden mit Restriktionsenzymen entfernt werden können, um zellulären Material zu erhalten, das für die Replikation und Expression der DNA für das angestrebte Produkt benötigt wird. In besonderen Fällen wird die cDNA Codons für die vollständige, gewünschte Aminosäuresequenz enthalten, ebenso wie fremde Codons stromaufwärts vom Aminoende des angestrebten Produkts. Zum Beispiel werden viele, wenn nicht alle, Polypeptidhormone in einer Vorläuferform exprimiert mit Leader- oder Signalsequenzen für ein Protein, das beispielsweise beim Transport zur Zellwand beteiligt ist. Während der Expression von eukaryotischen Zellen werden diese Sequenzen enzymatisch beseitigt, so daß das Hormon in seiner freien, bioaktiven Form in den periplasmatischen Raum eindringt. Man kann sich jedoch nicht darauf verlassen, daß mikrobielle Zellen diese Funktion ausführen, und es ist folglich wünschenswert, Sequenzen, die für solche Signale oder Leader-Sequenzen codieren, vom mRNA-Transkript zu entfernen. Im Verlauf dieses Entfernungsvorgangs geht auch das Translations- Startsignal verloren, und nahezu immer werden ebenso einige Codons für das angestrebte Produkt entfernt. Die synthetische Komponente des quasi-synthetischen Genprodukts der Erfindung ersetzt diese letztgenannten Codons, ebenso stellt sie ein neues Translations-Startsignal zur Verfügung, wobei der Vektor, in dem sich das Hybridgen letztlich entwickeln wird, selbst keinen günstig gelegenen Start aufweist.

Das Eliminieren der Leader-Sequenz aus Wachstumshormon-cDNA wird begünstigt durch das Zurverfügungstellen einer Restriktions erkennungsstelle innerhalb des das Wachstumshormon codierenden Teils des Gens. Die Erfindung kann nichtsdestotrotz auch ohne das Zurverfügungstellen einer solchen Erkennungsstelle durchgeführt werden, oder in jedem Fall ohne Rücksicht auf die Erhältlichkeit einer Restriktionserkennungsstelle, die ausreichend nahe am Aminoende des gewünschten Polypeptids liegt, um die Notwendigkeit für eine umfangreiche Synthese der Genkomponente zu vermeiden, die nicht von mRNA abgeleitet ist. In jeder cDNA, die für das gewünschte Polypeptid und eine Leader- oder andere bioinaktivierende Sequenz codiert, wird sich daher die Grenze zwischen den Codons der letzteren und denen des reifen Polypeptids an der Aminosäuresequenz des reifen Polypeptids zeigen. Man kann einfach in die Gene verdauen, die für das Peptid der Wahl codieren, und so die ungewünschten Leader- oder andere Sequenzen entfernen. Wenn daher beispielsweise eine cDNA folgender Struktur gegeben ist:

wobei der Endpunkt der Verdauung durch einen Pfeil bezeichnet ist, kann eine Reaktionsbedingung für eine Exonuclease-Verdauung gewählt werden, um die obere Sequenzen "a" und "b" zu entfernen, wonach eine S1-Nuclease- Verdauung automatisch die unteren Sequenzen "c" und "d" eliminiert. Alternativ dazu und präziser kann man DNA- Polymerase-Verdauung in Gegenwart von Desoxynucleotid triphosphaten ("d(A,T,C,G)TP") einsetzen. Im obengenannten Beispiel wird daher DNA-Polymerase in der Gegenwart von dGTP die Sequenz "c" entfernen (und bei "G" anhalten), daraufhin wird S1-Nuclease "a" verdauen; DNA-Polymerase in Gegenwart von dTTP wird "d" entfernen ( und bei "T" anhalten) und S1-Nuclease wird dann "d" herausschneiden usw. Siehe allgemein A. Kornberg, DNA Synthesis, S. 87-88, W.H. Freeman und Co., San Francisco (1974).

Vorzugsweise kann man ganz einfach eine Restriktionserkennungs stelle an einem passenden Punkt innerhalb des Bereichs der cDNA, die für das gewünschte Produkt codiert, konstruieren, durch Anwendung der "unpassenden" (mismatch) Reparatursynthesetechnik von A. Razin et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA 75, 4268 (1978). Bei dieser Technik können eine oder mehrere Basen in eine bestehende DNA-Sequenz substituiert werden, wobei Primer verwendet werden, die den unpassenden Substituenten enthalten. Mindestens sieben palindromartige 4-Basenpaarsequenzen werden selektiv durch bekannte Restriktionsenzyme erkannt, das sind AGCT (AluI), CCGG (HpaII), CGCG (ThaI), GATC (Sau3A), GCGC (Hha), GGCC (HaeIII), und TCGA (TaqI). Wenn die cDNA-Sequenz eine Sequenz enthält, die sich von einer derartigen Erkennungstelle in nur einer einzigen Base unterscheidet, was statistisch sehr wahrscheinlich ist, ist mit der Reparatur synthese eine replizierte cDNA zu erhalten, die die geeignete, substituierte Base enthält und damit die gewünschte Restriktionserkennungsstelle. Durch einen Schnitt wird die DNA vom unerwünschten Leader entfernt, wonach durch Synthese die Codons wieder angefügt werden, die für die Expression des kompletten Polypeptids benötigt werden. Zum Beispiel:

Es ist natürlich offensichtlich, daß längere Restriktions erkennungsstellen auf ähnliche Weise eingesetzt werden können, wo das erwünscht ist, oder daß durch sukzessive Reparatur 4-Basenpaar-Restriktionserkennungsstellen gebildet werden können, wo lediglich 2 Basen gemeinsam mit der Erkennungs stelle am gewünschten Punkt erscheinen usw.

Aus dem bisher Geschilderten ist ersichtlich, daß die Erfindung folgende wesentlichen Eigenschaften aufweist:

- Es wird ein mRNA-Transkript verwendet, das für einen wesentlichen Bestandteil der angestrebten Aminosäuresequenz des Polypeptids codiert, das jedoch, falls es alleine exprimiert wird, ein vom angestrebten Produkt verschiedenes Polypeptid produzieren würde, entweder kleiner oder größer als das angestrebte Produkt;
- Protein codierende Codons für andere als solche Aminosäuren, die im angestrebten Produkt enthalten sind werden, falls vorhanden, entfernt;
- organische Synthese liefert ein Fragment oder Fragmente, die für den Rest der gewünschten Sequenz codieren; und
- das mRNA-Transkript und das (die) synthetische(n) Fragment(e) werden zusammengefügt und in einen einen Promotor enthaltenden clonierenden Vektor eingefügt, damit entweder das angestrebte Produkt ohne fremdes, konjugiertes Protein, oder das angestrebte Produkt konjugiert mit, aber spezifisch abtrennbar von Fremdprotein repliziert und exprimiert wird.

Das Produkt der Expression wird natürlich in jedem Fall mit der Aminosäure beginnen, für die das Translations- Startsignal codiert (für den Fall von ATG, f-Methionin). Man kann erwarten, daß diese Aminosäure intrazellulär entfernt wird, oder jedenfalls die Bioaktivität des resultierenden Produkts im wesentlichen unbeeinflußt läßt.

Im folgenden wird die Erfindung erläutert, bei der ein quasi-synthetisches Gen, das für menschliches Wachstumshormon codiert, konstruiert, geclont und miktrobiell exprimiert wird.

Konstruktion und Expression eines clonierenden Vektors für menschliches Wachstumshormon 1. Clonieren des Hae-III-Fragments des mRNA-Transkripts (Fig. 3 und 4)

Polyadenylierte mRNA für menschliches Wachstumshormon (HGH) wurde aus hypophysäres Wachstumshormon produzierenden Tumoren gewonnen nach dem Verfahren von A. Ullrich et al., Science 196, 1313 (1977). 1,5 µg von Doppelstrang-("ds") -cDNA wird präpariert aus 5µg dieser RNA, im wesentlichen wie beschrieben bei Wickens et al., J. Biol. Chem. 253, 2483 (1978), mit der Ausnahme, daß die RNA-Polymerase "Klenow-Fragment", (H. Klenow, Proc, Nat. Acad. Sci. USA 65, 168 (1970)) für die DNA-Polymerase I in der Zweit-Strangsynthese eingesetzt wurde. Das Restriktions muster von HGH ist derartig, daß HaeIII-Restriktionserkennungs stellen in der 3′ nichtcodierenden Region und in der Sequenz, die für die Aminosäuren 23 und 24 des HGH codieren, vorhanden sind, wie gezeigt in Fig. 3. Eine Behandlung der ds-HGH-cDNA mit HaeIII gibt ein DNA-Fragment von 551 Basen paaren ("bp"), die für die Aminosäuren 24 bis 91 des HGH codieren. 90 ng der cDNA wird mit HaeIII behandelt, in einen 8%igen Polyacrylamid-Gel einer Elektrophorese unterworfen und die Region bei 550 bp eluiert. Man erhält annnähernd 1 ng cDNA.

pBR322, hergestellt nach F. Bolivar et al., Gene 2 (1977) 95-113, wird als clonierender Vektor für die cDNA ausgewählt. pBR322 ist vollständig charakterisiert, (J. G. Sutcliffe, Cold Spring Harbor Symposium 43, 70 (1978)), ist ein mit zahlreichen Kopien (multicopy) replizierendes Plasmid, das sowohl Ampicillin- als auch Tetracyclin- Resistenz aufweist, die auf den Einfluß der korrespon dierenden Gene ("Ap^R" bzw. "Tc^R" in Fig. 4) zurückzuführen sind, wobei das Plasmid Erkennungsstellen für die Restriktions enzyme PstI, EcoRI und HindIII enthält, wie in der Figur gezeigt.

Die Schneideprodukte von HaeIII und PstI haben stumpfe Enden. Es kann folglich das GC-Anhängeverfahren nach Chang A.C.Y. et al., Nature 275, 617 (1978) angewendet werden, um die stumpfendigen Produkte der PstI-Schnitte von pBR322 mit der HaeIII-Verdauung des mRNA-Transkripts zu verbinden, so daß das cDNA-Fragment in die PstI-Erkennungsstelle von pBR322 eingefügt wird, und zwar in der Weise, daß die HaeIII-Restriktionserkennungsstellen (GG↓CC) auf der cDNA und die PstI-Restriktionserkennungsstellen (CTGCA↓G) an jedem Ende des eingeschobenen Teils wieder hergestellt werden.

Es wird also terminale Desoxynucleotid-Transferase (TdT) verwendet, um annähernd 20 dC-Reste an das 3′-Ende anzufügen, wie bereits früher beschrieben, Chang A.Y.C., a.a.O. Auf ähnliche Weise werden an das 3′-Ende von 60 ng PstI-behandeltem pBR322 etwa 10 dG-Reste angehängt. Das Verschmelzen der dC-ergänzten ds-cDNA mit der dG-ergänzten Vektor-DNA wird in 130 µl von 10 mM Tris-HCl (pH 7,5) 100 mM NaCl und 0,25 mM EDTA durchgeführt. Die Mischung wird auf 70° erhitzt, langsam (12 Stunden) auf 37°C abgekühlt, und schließlich auf 20°C (6 Stunden) abgekühlt, ehe es zum Transformieren von E. coli x1776 verwendet wird. Eine DNA-Sequenzanalyse des Plasmids pHGH31 nach der Methode von Maxam und Gilbert, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 74, 560 (1977), nach dem Clonen des Plasmids in x1776, stimmte in den Codons für die Aminosäuren 24 bis 191 des HGH überein, wie in Fig. 3 gezeigt.

Der Stamm E. coli K-12 x1776 hat den Genotyp F^- tonA53, dapD8, minA1, supE42, Δ 40(gal-uvrB), λ ^-, minB2, rfb-2, nalA25, oms-2, thyA57*, metC65, oms-1, Δ 29(bioH-asd), cycB2, cycA1, hsdR2. x1776 wurde vom National Institutes of Health als ein EK2 Wirts-Vektor-System bescheinigt.

x1776 hat ein obligates Bedürfnis für Diaminopimelinsäure (DAP) und kann nicht die Mukopolysaccharidcolansäure synthetisieren. Die Zelle unterliegt daher dem DAP-Mangeltod in all den Kulturmedien, in denen DAP begrenzt ist, jedoch genügend Nährsubstanz vorhanden ist, um den zellulären Stoffwechsel und das zelluläre Wachstum aufrechtzuerhalten. Der Stamm ist Thymin- oder Thymidin-bedürftig und unterliegt dem Thymin-Mangeltod mit Abbau der DNA, wenn Thymin und Thymidin in der Umgebung fehlen, jedoch genügend Nährsubstrate vorhanden sind, um die Stoffwechselaktivität aufrechtzuerhalten. x1776 ist hochgradig empfindlich gegen Galle und ist daher unfähig zu überleben, d. h. unfähig, eine Passage durch den Intestinaltrakt von Ratten zu überleben. x1776 ist hochgradig empfindlich gegen Detergentien, Antibiotika, Arzneimittel und Chemikalien. x1776 kann weder die Dunkelreparatur noch die Photo-Reaktivierung von UV- induzierten Schäden durchführen und ist daher um mehrere Größenordnungen empfindlicher gegen Sonnenlicht als der Wildtypstamm von E. coli. x1776 ist resistent gegen viele transduzierende Phagen und läßt bei der Konjogation nur mangelhaft die genetische Übertragung von vielen verschiedenen Typen von bei der Konjugation beteiligten Plasmiden zu, was auf die Anwesenheit von verschiedenen Mutationen zurückzuführen ist. x1776 ist resistent gegen Nalidixinsäure, Cycloserin und Trimethoprim. Diese Substanzen können daher dem Medium zugegeben werden, um das Überprüfen des Stamms zu ermöglichen und eine Transformation von Kontaminanten während der Transformation auszuschließen.

x1776 wächst mit einer Generationszeit von etwa 50 Min. sowohl in L-Nährmedium (L-broth) als auch Penassay-Medium (Penassay broth), wenn dieses mit 100 µg DAP/ml und 4 µg Thymidin/ml supplementiert wird und erreicht eine Enddichte von 8-10 x 10⁸ Zellen/ml in der stationären Phase. Vorsichtiges, kreisförmiges Hin- und Herschütteln für eine Zeitspanne von 1 bis 2 Minuten suspendiert die Zellen vollständig bei Erhalt der Lebensfähigkeit von 100%. Zusätzliche Details bezüglich x1776 sind zu finden bei R. Curtis et al., Molecular Cloning of Reconginant DNA, 99-177, Scott und Werner, eds., Academic Press (N.Y. 1977). x1776 wurde ohne Einschränkungen bei der Hinterlegungsstelle American Type Culture Collection am 3. Juli 1979 unter der Nummer ATCC 31537 hinterlegt.

2. Konstruktion und Clonieren des synthetischen Genfragments (Fig. 1 und 2)

Es ist Teil der Strategie für die Konstruktion des HGH- quasi-synthetischen Gens, daß ein synthetisches Fragment konstruiert wird, das stumpfendige Restriktionsschneidestellen aufweist, die an den Punkten sitzen, an denen an das Fragment das mRNA-Transkript angeknüpft werden soll. Das synthetische Gen für die ersten 24 Aminosäuren des HGH enthält daher, wie in Fig. 1 gezeigt, eine auf die Aminosäure 23 folgende HaeIII-Schneideerkennungsstelle. Das distale Ende des synthetischen Fragments wird mit einem Verbindungselement (im folgenden "Linker") versehen, das die Verschmelzung mit einem Einzelstrangende erlaubt, das durch Restriktionsschnitte in dem Plasmid erhalten wird, in das das mRNA-Transkript und das synthetische Fragment letztlich eingebaut werden sollen.

Wie in Fig. 1 gezeigt, haben die 5′-Enden des doppel strängigen Fragments einzelsträngige cohäsive Enden für die EcoRI- und HindIII-Restriktionsendonucleasen, um die Plasmid-Konstruktion zu erleichtern. Das Codon für Methionin am linken Ende stellt eine Erkennungsstelle für die Initiation der Translation zur Verfügung. Es werden zwölf verschiedene Oligonucleotide, die in ihrer Größe von undekamer bis hexadekamer variieren, synthetisiert, und zwar nach dem bewährten Phosphotriester-Verfahren nach Crea, R. Proc. Na. Acad. Sci. USA 75, 5765 (1978). Diese Oligonucleotide, U₁ bis U₆ und L₁ bis L₆ sind durch Pfeile bezeichnet.

10 µg Substanz U₂ einschließlich U₆ und L₂ einschließlich L₆ werden unter Verwendung der T4-Polynucleotidkinase ( γ³²-P)ATP phosphoryliert, und zwar nach dem veröffentlichten Verfahren von Goeddel, D.V. et al. Proc. Nat. Acad. Sci. USA 76, 106 (1979).

Es werden drei getrennte T4-Ligase-katalysierte Reaktionen durchgeführt: 10 µg des 5′-OH-Fragments U₁ werden mit phosphoryliertem U₂, L₅ und L₆ vereint; phosphoryliertes U₃, U₄, L₃ und L₄ werden vereint; weiterhin werden 10 µg des 5′-OH-Fragments L₁ mit phosphoryliertem L₂, U₅ und U₆ vereint. Diese Verknüpfungen werden bei 4°C für sechs Stunden durchgeführt in einem Medium, das 300 µl von 20 mM Tris-HCl (pH 7,5), 10 mM MgCl₂, 10 µM Dithiothreitol und 0,5 mM ATP enthält, wobei 100 Einheiten T4-Ligase verwendet werden. Die drei Verknüpfungsmischungen werden dann vereint, 100 Einheiten T4-Ligase zugegeben, worauf man die Reaktion 12 Stunden lang bei 20°C ablaufen läßt. Die Mischung wird dann mit Äthanol ausgefällt und auf einem 10%igen Polyacrylamid-Gel einer Elektrophorese unterworfen. Die Bande, die bis zur 84 Basenpaar-Stelle gewandert ist, wird aus dem Gel herausgeschnitten und eluiert. pBR322 (1 µg) wird mit EcoRI und HindIII behandelt, das große Fragment durch Gel-Elektrophorese isoliert und mit der synthetischen DNA verknüpft. Diese Mischung wird verwendet um den Stamm E. coli K-12 294 (end A, thi^-, hsr^-, hsm_k⁺) zu transformieren. Der Stamm 294 wurde am 30. Oktober 1978 bei der Hinterlegungsstelle American Type Culture Collection unter der Nummer ATCC 31446 ohne Einschränkungen hinterlegt. Eine Sequenzanalyse nach der Maxam und Gilbert-Technik, a.a.O., bei der EcoRI - HindIII- Insertion von einem Plasmid pHGH3 einer Transformante bestätigte das in Fig. 1 dargestellte.

3. Konstruktion eines Plasmids für die bakterielle Expression von HGH (Fig. 5)

Mit dem synthetischen Fragment in pHGH3 und dem mRNA- Transkript in pHGH31 wird ein zur Replikaton fähiges Plasmid konstruiert, das beide Fragmente enthält, wobei das Expressionsplasmid pGH6 verwendet wird, wie in Fig. 5 gezeigt. Das Expressionsplasmid, das einen lac-Promoter als Tandem enthält, wurde zuerst folgendermaßen konstruiert. Ein 285 Basenpaare langes EcoRI-Fragment, das zwei 95 Basen paare lange UV5-lac-Promoter-Fragmente enthält, welche durch ein 95 Basenpaar langes, heterologes DNA-Fragment abgetrennt wurden, wird aus dem Plasmid pKB268 isoliert, siehe K. Backmann et al., Cell. Vol. 13, 65-71 (1978). Das 285 bp-Fragment wird in die EcoRI-Erkennungsstelle von pBR322 eingesetzt und ein Clon pGH1 isoliert, in dem die Promoter auf das Gen für Tetracyclin-Resistenz hin und in richtiger Lesephase mit diesem orientiert sind. Die distal zu dem letztgenannten Gen gelegene EcoRI- Erkennungsstelle wird durch teilweise EcoRI-Verdauung zerstört, die resultierenden einzelsträngigen EcoRI-Enden mit DNA-Polymerase I repariert und das Plasmid durch stumpf endige Verbindung wieder in Ringform gebracht. Das resultierende Plasmid, pGH6, enthält eine einzige EcoRI-Erkennungs stelle, die passend liegt im Hinblick auf das Promoter-System, in das das komplette Gen für HGH einge baut werden kann.

Um das synthetische Fragment für die Vereinigung mit dem RNA-Transkript fertigzustellen, werden 10 µg von pHGH3 mit EcoRI- und HaeIII-Restriktionsendonucleasen geschnitten und das 77 Basenpaare-Fragment, das die codierenden Sequenzen für die HGH-Aminosäuren 1 bis 23 enthält, wird aus einem 8%igen Polyacrylamid-Gel isoliert.

Als nächstes wird das Plasmid pHGH31 (5 µg) mit HaeIII geschnitten. Die 551 bp HGH-Sequenz und ein mitgewandertes 540 bp HaeIII-Fragment von pBR322 werden durch Gel- Elektrophorese gereinigt. Eine anschließende Behandlung mit XmaI schneidet nur die HGH-Sequenz, wobei 39 Basenpaare von der 3′-nichtcodierenden Region entfernt werden. Das resultierende 512 bp-Fragment wird von dem 540 bp pBR322- HaeIII-Stück durch Elektrophores in einem 6%igen Polyacrylamid-Gel getrennt. 0,3 µg des 77 bp EcoRI-HaeIII- Fragments werden mit T4-Ligase in einer 16 µl Reaktion 14 Stunden lang bei 4°C polymerisiert. Die Mischung wird dann für 5 Minuten (5′) auf 70°C erhitzt, um die Ligase zu inaktivieren, anschließend mit EcoRI behandelt (um Fragmente zu schneiden, die aufgrund ihrer EcoRI-Erkennungs stellen dimerisiert haben), weiterhin mit SmaI behandelt (um XmaI-Dimere zu schneiden), wodurch ein 591 bp-Fragment mit einem EcoRI-Ende, das cohäsiv ist, und einem SmaI-Ende, das stumpf ist, erhalten wird. Nach der Reinigung auf einem 6%igen Polyacrylamid-Gel erhält man annähernd 30 ng dieses Fragments. Es sollte bemerkt werden, daß das Expressions plasmid pGH6 keine XmaI-Erkennungsstelle enthält. SmaI erkennt jedoch die gleiche Erkennungsstelle wie XmaI, aber schneidet genau durch die Mitte, so daß stumpfe Enden erhalten werden. Das SmaI-geschnittene Ende des Fragments, das von gHGH31 abgeleitet ist, kann folglich stumpfendig an pHGH6 gebunden werden.

Das Expressionsplasmid pGH6, das den lac-UV5-Promoter in Tandemform enthält, wir sukzessive mit HindIII, Nuclease S1 und EcoRI behandelt und durch Gel-Elektrophorese gereinigt. 50 ng des resultierenden Vektors, der ein cohäsives EcoRI- Ende und ein stumpfes Ende aufweist, wird mit 10 ng der 591 bp HGH-DNA verbunden. Diese Veringungsmischung wird verwendet, um E. coli x1776 zu transformieren. Die Kolonien werden durch Wachstum auf Tetracyclin (12,5 µg/ml) selektiert. Es ist bemerkenswert, daß die Insertion des hybriden HGH-Gens in pGH6 den Promotor für die Tetracyclin-Resistenz zerstört, daß jedoch der Tandem-lac-Promoter das Durchlesen der Strukturgene für Tetracyclin-Resistenz erlaubt und auf diese Weise die Selektionscharakteristik erhalten bleibt. Es wurden annähernd 400 Transformatoren erhalten. Mit der Grunstein-Hogness-Methode, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 72, 3961 (1975), wurden durch Filterhybridisierung 12 Kolonien identifiziert, die die HGH-Sequenz enthalten. Die aus drei dieser Kolonien isolierten Plasmide ergaben das erwartete Restriktionsmuster, wenn sie mit HaeIII, PvuII und PstI geschnitten wurden. Von einem Clon, pHGH107, wurde die DNA- Sequenz bestimmt.

Menschliches Wachstumshormon, das von Transformanten produziert wird, kann ohne weiteres durch direkten Radioimmunoassay nachgewiesen werden, welcher aus Verdünnungsreihen des Überstands lysierter Zellen durchgeführt wird, unter Verwendung von Phadebas HGH PRIST kid.

Um aufzuzeigen, daß die HGH-Expression unter der Kontrolle des lac-Promoters steht, wir pHGH107 in einen E. coli-Stamm D1210 (lac+(i ^QO+z⁺y +)), einem Stamm, der den lac-Repressor überproduziert, transformiert. Bis zur Zugabe des Induktors IPTG (Isopropylthiogalactosidolipoid) kann keine nennenswerte Menge von HGH-Expression nachgewiesen werden.

Ein Entfernen der EcoRI-Erkennungsstelle in pHGH107 hätte zur Folge, daß das ATG-Startsignal von den Codons der Ansatz stelle für die Ribosomen des lac-Promoters den gleichen Abstand hätte, den diese Codons natürlicherweise vom Start signal für b-Galactosidase haben. Um festzustellen, ob die Expression durch Nachahmung dieses natürlichen Abstands zu steigern ist, wurde pHGH107 in pHGH107-1 überführt, indem das erstere Plasmid mit EcoRI geöffnet wurde, die entstehenden Einzelstrangenden mit S1-Endonuclease verdaut wurden und das Plasmid durch Verbinden der stumpfen Enden mit T4-Ligase wieder in Ringform überführt wurde. Obwohl sich zeigte, daß das erhaltene Plasmid in ähnlicher Weise zur Expression von HGH fähig war, produzierte es jedoch HGH überraschenderweise in geringerem Umfang als pHGH107, wie durch direkten Radioimmunoassay gezeigt werden konnte.

Für den Fachmann ist offensichtlich, daß die vorliegende Erfindung nicht auf die bisher geschilderte, bevorzugte Ausführungsform beschränkt ist, sondern ausschließlich auf den Schutzbereich der Patentansprüche. Andere Abänderungen als die hier beschriebenen sind möglich, sei es die Wahl des Promoter-Systems, des Elternplasmids, oder sonstigem. Andere, für die vorliegende Erfindung anwendbare Promoter-Systeme bestehen beispielsweise aus dem Lambda-Promoter, dem Arabinose-Operon (phi80 dara) oder dem Colicin-E1-, Galactose-, alkalische Phosphatase- oder Tryptophan-Promoter. Wirts organismen für die bakterielle Expression können ausgewählt werden beispielsweise aus der Familie der Enterobacteriaceae, z. B. die Stämme Escherichia coli und Salmonella; aus der Familie der Bacilaceae, z. B. Bacillus subtilis; weiterhin Pneumococcus; Streptococcus und Haemophilus influenzae. Natürlich wird die Wahl des Organismus das Niveau der physikalischen Beherrschung des Clonens und der Expression beeinflussen, welche nur unter Einhaltung der Richtlinien für rekombinante DNA des National Institutes of Health, 43 Fed. Reg 60,080 (1978) durchgeführt werden sollen.

Für die Arbeit der vorliegenden Erfindung im Labormaßstab eignet sich der Stamm E. coli x1776 besonders gut; es könnte sich jedoch zeigen, daß für die industrielle Herstellung im großem Maßstab der Stamm weniger geeignet ist, und zwar aufgrund der ihm eigenen Schwächen, die absichtlich aus biologischen Sicherheitsgründen eingebracht wurden. Mit einer angemessenen Höhe an physikalischer Beherrschung eher als biologischer, können für die Arbeit im großen Maßstab auch solche Organismen wie E. coli K-12 Stamm 294, a.a.O., und E. coli Stamm RR1, Genotyp Pro^- Leu^- Thi^-R_B-recA⁺Str^r Lac y^- verwendet werden. E. coli RR1 wurde durch Paarung aus dem Stamm E. coli HB101 (H.W. Boyer et al., J. Mol.Bio. (1969) 41 459-472) mit dem Stamm E. coli K-12, Stamm KL16 als Hfr-Donor erhalten. Siehe auch J.H. Miller, Experiments in Molecular Genetics (Cold Spring Harbor, New York, 1972). Eine Kultur von E. coli RR1 wurde am 30. Oktober 1978 bei der American Type Culture Collection ohne Einschränkung bezüglich der Zugänglichkeit unter der Nummer ATCC 31343 hinterlegt. Auf ähnliche Weise wurde eine Kultur von x1776 am 3. Juli 1979 bei der American Type Culture Collection unter der Nummer ATCC 31537 hinterlegt. Am 3. Juli 1979 wurden bei der American Type Culture Collection weiterhin hinterlegt: Plasmid pHGH107 (ATCC 40011); Plasmid pGH6 (ATCC 40012); der Stamm x1776, der mit pHGH107 transformiert wurde (ATCC 31538) und E. coli K12 Stamm 294, transformiert mit pGH6 (ATCC 31539).

Mit dem erfindungsgemäßen Plasmid transformierte Mikro organismen können für die in industriellem Maßstab durchgeführte fermentative Produktion von menschlichem Wachstumshormon eingesetzt werden, wodurch ein Produkt in solchen Mengen und für Anwendungsgebiete erhalten wird, wie es bisher unerreichbar war. Beispielsweise können transformierte E. coli- Kulturen gezüchtet werden in wäßrigem Medium in einem Stahl- oder einem anderen Fermentationsgefäß, auf übliche Weise belüftet und geschüttelt, in wäßrigem Medium bei beispielsweise 37°C und nahezu neutralem pH (beispielsweise pH 7+ 0,3), ergänzt mit geeigneten Nährsubstraten, beispielsweise Kohlenhydrat oder Glycerin, Stickstoff quellen, wie Ammoniumsulfat, Kaliumquellen, wie Kaliumphosphat, Spurenelementen, Magnesiumsulfat und ähnlichem. Transformante Organismen weisen vorzugsweise eine oder mehrere Selektionscharakteristiken auf, beispielsweise Antibiotika-Resistenz, so daß ein Selektionsdruck ausgeübt werden kann, um konkurrierendes Wachstum von Wildtyp E. coli zu behindern. Für den Fall eines gegen Ampicillin oder Tetracyclin resistenten Organismus kann beispielsweise das Antibiotikum zum Fermentationsmedium gegeben werden, so daß Wildtyp-Organismen ausselektiert werden, die nicht gegen diese Antibiotika resistent sind.

Nachdem vollständig fermentiert wurde, wird die bakterielle Suspension zentrifugiert oder die Zellmasse auf andere Weise aus der Kulturbrühe gesammelt, daraufhin mit physikalischen oder chemischen Mitteln lysiert. Die Zelltrümmer werden vom Überstand getrennt und das lösliche Wachstumshormon isoliert und gereinigt.

Menschliches Wachstumshormon kann aus Bakterienextrakt gereinigt werden, indem man eine der folgenden Methoden oder eine Kombination dieser anwendet: (1) Polyäthylimin-Fraktio nierung; (2) Gel-Filtrierungs-Chromatographie auf Sephacryl S-200; (3) Ionenaustausch-Chromatographie auf Biorex-70 Harz oder CM Sephadex; (4) Ammoniumsulfat und/oder pH- Fraktionierung; und (5) Affinitäts-Chromatographie, wobei Anitkörper-Harze verwendet werden, die aus anti-HGH IgG hergestellt werden, welches aus immunosensitivierten Tieren oder Hybridgeweben (Hybridomas) isoliert wurde; das Hormon wird unter sauren oder mild danaturierenden Bedingungen herausgelöst.

Claims

1. Bakterielles, sich replizierendes Plasmid, das in einem transformierten Bakterium zur Expression von menschlichem Wachstumshormon fähig ist, welchem kein fremdes, konjugiertes Protein anhängt.

2. Plasmid nach Anspruch 1, dessen für menschliches Wachs tumshormon codierendes Gen als wesentlichen Bestandteil cDNA oder Replikationsprodukte von dieser enthält.

3. Plasmid nach Anspruch 2, das eine Resistenz gegen mindestens ein Antibiotikum aufweist.

4. Plasmid nach Anspruch 3, dem der tet-Promotor fehlt, und das trotzdem Tetracyclinresistenz aufweist.

5. Plasmid nach Anspruch 4, in dem das für das menschliche Wachstumshormon codierende Gen unter der Kontrolle eines lac-Promotors in Tandem-Struktur ist.

6. Plasmid pHGH107.

7. Plasmid pHGH107-1.

8. Plasmid nach Anspruch 1, das in transformierten E. coli- Bakterien fähig ist zur Expression der Aminosäuresequenz der Aminosäuren 1-191 des menschlichen Wachstumshormons, der die Aminosäure f-Methionin vorangestellt ist.