DE3336586A1

DE3336586A1 - Neuer expressionsvektor

Info

Publication number: DE3336586A1
Application number: DE19833336586
Authority: DE
Inventors: Seiga Sagamihara Kanagawa Itho; Tatsunari Nishi; Moriyuki Machida Tokyo Sato; Haruo Tokyo Sugano; Tadatsugu Taniguchi
Original assignee: Japanese Foundation for Cancer Research; Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd
Current assignee: Japanese Foundation for Cancer Research; KH Neochem Co Ltd
Priority date: 1982-10-08
Filing date: 1983-10-07
Publication date: 1984-04-12
Also published as: EP0121569A1; EP0121569A4; IL69926A; AU575301B2; IL69926A0; IT8368033A0; DK280084D0; AU1942183A; EP0121569B1; ES526324A0; IT1160124B; NO842296L; ES8504249A1; DK280084A

Description

Die Erfindung betrifft einen neuen Plasmid-Expressionsvektor, ein Verfahren zu seiner Herstellung und seine Verwendung. Gegenstand der Erfindung ist ein Expressionsvektor/ der die genetische Information, die für die Initiation von Transkription und Translation erforderlich ist, und "das Startcodon für die Translation (ATG öler GTG) enthält, und., der wirksam ein eingebautes, für ein Polypeptid kodierendes DNS-Fragment zur Expression bringt. Zur Erfindung gehört auch ein Verfahren zur Herstellung eines solchen Expressionsvektors

und seine Verwendung.
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In den letzten Jahren hat die DNS-Rekombinant-Forschung und -Technologie große Fortschritte gemacht und ihre industrielle Anwendung hat begonnen. Es wurden Verfahren entwickelt, bei denen ein fremdes Gen in einen Plasmidvektor eingebaut wurde und ein Polypeptid, für "das das fremde Gen kodiert, in einem Wirtsorganismus in wirkungsvoller Weise erzeugt wurde. Zur Expression von fremden Genen in Wirtsorganismen, wie Escherichia coli, wurden verschiedene Verfahren entwickelt. Zur Erhöhung der Transkriptionsrate wurden beispielsweise das lac-Promotorsystem und das trp-Promotorsystem verwendet. Dies sind Promotorsysteme,welche die für den Transkriptionsstart erforderliche genetische Information enthalten. Außerdem wurde zur Erhöhung der Translationsrate eine DNS-Rekombinante konstruiert, in der der Abstand zwischen der Ribosomen-Bindungsstelle und dem Startcodon (hauptsächlich ATG) eingestellt ist.

Das letztgenannte Verfahren hat den Nachteil, daß zur Einstellung des Abstands zwischen der Ribosomen-Bindungsstelle

und dem Startcodon die Verwendung einer besonderen "synthetischen DNS" als Bindeglied zum Einbau eines fremden Gens nach dem Anbinden des Startcodons ATG in Leserichtung

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nach dem Promotor, die Verwendung von DNS-Modifizierungsenzymen, wie DNS-Polymerase I, Nuclease S1 und Nuclease BAL-31, oder die Verwendung von "santhetischer DNS" mit einer besonderen Basensequenz erforderlich ist.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, einen Plasmid-Expressionsvektor bereitzustellen, der den genannten Nachteil der bekannten Plasmidvektoren nicht aufweist. Diese Aufgabe wird durch einen Plasmidvektor gelöst, der die Sequenz ATG an einer geeigneten Stelle in Leserichtung nach der Shine-Dalgarno-Sequenz (abgekürzt "SD-Sequenz") aufweist, und der an dieser Stelle spaltbar ist, wobei die Sequenz ATG erhalten bleibt.

Die Erfindung betrifft somit den in den Patentansprüchen genannten Gegenstand.

Der Expressionsvektor der Erfindung enthält einen Promotor, der die für den Transkriptionsstart erforderliche genetische Information umfaßt, ein Startcodon für die Translation (ATG oder GTG), das sich an einer geeigneten Stelle in Leserichtung nach der Ribosomen-Bindungsstelle (SD-Sequenz im ' Fall von Escherichia coli) befindet und die für den Translationsstart erforderliche genetische Information enthält, und nach dem Start-

codon eine Erkennungssequenz für ein Restriktionsenzym, wie Sphl, EcoRV, Kpnl oder Sacl, die nach der Spaltung mit dem Restriktionsenzym als 3'-überstehendes Ende verbleibt.

Die Erfindung wird nun anhand der Zeichnung näher erläutert. Figur 1 ist eine schematische Darstellung eines der Vektoren der Erfindung, in dem das Translations-Startcodon ATG und die Sphl-Schnittstelle (GCATGC) überlappen. Figur 2 zeigt die für den Vektor der Erfindung geeigneten Restriktionsmuster.

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Figur 3 zeigt das Verfahren zum Einbau eines fremden Gens in den Vektor der Erfindung unter Verwendung von DNS-Polymerase I und Klenow-Fragment.

Figur 4 zeigt das Verfahren für den Einbau eines fremden Gens in den Vektor der Erfindung unter Verwendung von terminaler Transferase.

Figur 5 zeigt das Verfahren für die Konstruktion des Plasmids pKYPIOO. In der Zeichnung bezeichnet J. das Plasmid pKYPIO, 2_ das den trp-Promotor enthaltende DNS-Fragment mit etwa 180 Basenpaaren (bp) / _3_ das den trp-Promotor enthaltende DNS-Fragment mit etwa 100 bp, _4 den Xhol-Linker, _5 das Plasmid pBR322, §_ ein DNS-Fragment von pBR322 und 7_ das Plasmid pKYPIOO.

Figur 6 zeigt das Verfahren für die Konstruktion des Plasmids pTrS3. In der Zeichnung bezeichnet 8^ das Plasmid pKYPIOO, 9_ das Fragment von pKYPIOO mit etwa 3/82 Kb, IjO die doppelsträngige DNS, die durch Synapsis von zwei synthetischen Oligonucleotiden erzeugt wird und Y\_ das Plasmid pTrS3.

Figur 7 zeigt das Verfahren für die Konstruktion von pKYP-5 Figur 8 zeigt das Verfahren für die Konstruktion von pKYP-10 Figur 9 zeigt das Verfahren für die Konstruktion von pFJ-123 Figur 10 zeigt das Verfahren für die Konstruktion von pFM-9 Figur 11 (A) zeigt das Verfahren für die Konstruktion von

pKYP-11 und (B) die Struktur von pKYP12. Figur 12 zeigt das Verfahren für die Konstruktion von pLE-3.

Im Expressionsvektor der Erfindung können alle bekannten Promotorsequenzen mit Promotoraktivität verwendet werden. Vorzugsweise wird der Promotor des Lactoseoperons, des Tryptophanoperons und des Operons der alkalischen Phosphatase verwendet. Als Startcodon für die Translation werden ATG oder GTG verwendet. Translation ist möglich, wenn der Abstand zwisehen der SD-Sequenz und dem Startcodon 2 bis 20 Basenpaare beträgt. Die Erkennungssequenz für ein Restriktionsenzym

nach dem Startcodon, die als 3'-überstehendes Ende verbleiben soll, wird aus folgenden Möglichkeiten ausgewählt. ATGCATGC, wobei das Startcodon ATG und die Erkennungssequenz für Sphl überlappen; ATGATATC, wobei ATG und die Erkennungssequenz für EcoRV überlappen; ATGGTACC, wobei ATG und die Erkennungssequenz für Kpnl überlappen; ATGAGCTC, wobei ATG und die Erkennungssequenz für Sacl überlappen.

Der Vektor, in dem das Startcodon ATG und die Erkennungsstelle für Sphl (GCATGC) überlappen, wird als Beispiel für , einen Vektor mit der vorstehend angegebenen Struktur erläutert. Die Strukturen des Promotors und der Umgebung der SD-Sequenz sind schematisch in Figur 1 dargestellt. Die Spaltmuster für die Restriktionsenzyme Sphl, EcoRV, Kpnl und Sacl sind in Figur 2 dargestellt.

Die Konstruktion des Plasmidvektors der Erfindung wird nun im einzelnen unter Verwendung des Tryptophan-Promotors von Escherichia coli als Beispiel erläutert.

Erfindungsgemäß sind die für den Transkriptions- und Translationsstart erforderlichen genetischen Elemente nicht auf von Prokaryonten stammende begrenzt, sondern es können auch von Eukaryonten, wie Hefe oder höheren Organismen abgeleitete eingesetzt werden. Um das Verständnis zu erleichtern, wird die folgende Beschreibung jedoch hauptsächlich mit Bezug auf Escherichia coli vorgenommen, einem Proparyonten, bei dem der Transkriptions- und Translationsmechanismus bereits im Detail geklärt ist.

Als Quelle für die DNS, die den trp-Promotor enthält, wird das Plasmid pKYPIOO verwendet, das ein Derivat des einen trp-portable-Promotor (ein leicht zugängliches und·übertragbares DNS-Fragment, das den Promotor trägt) enthaltenden Plasraids pKYP10 ist (japanische Patentanmeldung Nr. 213 193/81) Die Verfahren zur Konstruktion von pKYiO und pKYPIOO sind in den nachstehenden Bezugsbeispielen 1 und 2 beschrieben. Das

Plasmid
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- 8 - . Ί

ρΚΥΡΙΟΟ 8 (j8 verweist auf die Ziffer in Figur 6; das gleiche gilt auch nachstehend für die unterstrichenen Zahlen) wird an der Clal-Schnittstelle geschnitten, die sich in Le-

gleich
serichtung/hinter der SD-Sequenz des trpL-Gens befindet; vgl. Figur 6. Dann wird pKYPIOO erneut an der Sphl-Schnittstelle geschnitten, die sich in Tetracyclinresistenzgen befindet. Das größere Plasmid-DNS-Fragment J3 wird durch Agarosegel-Elektrophorese gereinigt.

Getrennt davon werden zwei Oligonucleotide synthetisiert, die komplementäre, miteinander ligierbare Basensequenzen aufweisen. Dabei wird das DNS-Fragment 1_0 erhalten, das eine mit dem DNS-Fragment 9^ ligierbare Struktur und ein Startcodon für die Translation (ATG oder GTG) in geeignetem Abstand in Leserichtung nach der SD-Sequenz, und danach eine: Erkennungssequenz für ein Restriktionsenzym aufweist, die als 3'-überstehendes Ende . verbleiben soll. Das erhaltene DNS-Fragment wird mit dem gereinigten Plasmid-DNS-Fragment _9 ligiert. Dabei wird der gewünschte Expressionsvektor

1J_ erhalten.

Folgende Umsetzungsbedingungen sind für die Herstellung des rekombinanten Plasmids erforderlich.

nc

Der Verdau der DNS mit Restriktionsenzymen wird gewöhnlich durch Umsetzung von 0,1 bis 100 \iq DNS mit 0,1 bis 300 Einheiten, vorzugsweise 1 bis 3 Einheiten Restriktionsenzym pro 1 |ig DNS in einem Gemisch von 2 bis 200, vorzugsweise 10 bis 40 mM Tris-HCl (pH 6,0 bis 9,5, vorzugsweise 7,0 bis 8,0) ,1 bis 150 mM NaCl und 2 bis 20, vorzugsweise 5 bis 10 mM MgCl„ bei 18 bis 42, vorzugsweise 32 bis 38°C 15 Minuten bis 24 Stunden durchgeführt. Die Umsetzung wird gewöhnlich durch 5 bis 30 Minuten Erhitzen auf 55 bis 75,vorzugsweise 63 bis 70⁰C oder in einer anderen Ausführungsform durch Inaktivieren des Restriktionsenzyms mit einem Reagenz, wie Phenol und Diäthylpyrrocarbonat,abgebrochen. Die Oligo-

Γ - 9 - ^Π

1, nucleotide werden nach der Diathylphosphatmethode [H-G. Khorana und Mitarb., J. Mol. Biol., Bd. 72 (1972), S. 209], der Phosphotriestermethode [R. Crea und Mitarb., Proc. Natl. Acad. Sei., USA, Bd. 75 (1978), S. 5765] oder der Phosphitmethode [M.D. Matteucci und Mitarb., J. Am. Chem. Soc, Bd. 103 (1981), S. 3185] synthetisiert. Die Phosphorylierung des synthetisierten Oligonucleotids wird mit 0,1 bis 100 Einheiten T4-Polynucleotidkinase in einem Gemisch aus 2 bis 200, vorzugsweise 10 bis 70 mM Tris-HCl (pH 6,0 bis 9,5, vorzugsweise 7,0 bis 8,0) 3 bis 20, vorzugsweise 4 bis 10 mM MgCl₂ und 1 bis 10 mM Dithiothreitol bei 20 bis 40, vorzugsweise 35 bis 38⁰C 5 Minuten bis 2 Stunden durchgeführt. Die Ligation der DNS-Fragmente wird mit 0,1 bis 10 Einheiten T4 DNS-Ligase in einem Gemisch aus 2 bis 200, vorzugsweise 10 bis 70 mM Tris-HCl (pH 6,0 bis 9,5, vorzugsweise 7,0 bis 8,0),2 bis 20, vorzugsweise 5 bis 1OmM MgCl^, 0,1 bis 10, vorzugsweise 0,5 bis 2 mM ATP und 1 bis 50, vorzugsweise 5 bis 1OmM Dithiothreitol bei 1 bis 37, vorzugsweise 3 bis 20⁰C 15 Minuten bis 72 Stunden, vorzugsweise 2 bis 20 Stunden durchgeführt.

Der Plasmid-Expressionsvektor der Erfindung kann in der vorstehend beschriebenen Weise hergestellt werden. In einer anderen Ausführungsform ist es möglich, das synthetische Nucleotid zwischen Hindlll- _un(j Sphl-Schnittstellen statt zwischen den CIaI- und Sphl-Schnittstellen einzubauen. Falls eine Erkennungssequenz eines Restriktionsenzyms mit dem Startcodon für die Translation überlappt werden soll, die bei pKYPIOO nicht vorhanden ist (z.B. Kpnl:GGTACC und Sacl: GAGCTC) , werden zwei Oligonucleotidarten mit einer solchen Erkennungssequenz synthetisiert und zwischen der CIaI- oder Hindlll-Schnittstelle und der BamHI- oder Sall-Schnittstelle in pKYPIOO eingebaut.

Das Plasmid pKYPIOO ist ein Derivat von pKYPIO, welches seinerseits einen einen trp-Promotor enthaltendes Plasmid ist, das in der japanischen Patentanmeldung Nr. 213 193/81 beschrie-

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^Γ - 10 -

ben ist. Die Konstruktion von pKYPIOO wird ausgehend von pKYPIO wie folgt durchgeführt. Wie in Figur 5 dargestellt, wird das Plasmid pKYPIO _1_ mit Hhal verdaut und ein DNS-Fragment 2. mit etwa 180 bp, das den trp-Promotor enthält, wird durch Polyacrylamidgelelektrophorese gereinigt. Das DNS-Fragment 2 wird dann mit Escherichia coli DNS-Polymerase I und Klenow-Fragment behandelt, um das 3.'-überstehende Ende, das durch den Verdau mit Hhal entstanden ist, abzuschneiden und ein stumpfes Ende zu erhalten. Nach Verdau mit Hindlll wird das DNS-Fragment 3 mit etwa 100 bP, das den trp-Promotor enthält, durch Polyacrylamidgelelektrophorese gereinigt.

Getrennt davon wird Plasmid pBR322 5^ mit EcoRI verdaut und das erhaltene 'überstehende Ende durch Reparation mit Escherichia coli DNS-Polymerase I aufgefüllt. Nach Verdau mit Hindlll wird das größere Plasmid DNS-Fragment £ durch Agarosegelelektrophorese mit niedriger Geliertemperatur gereinigt, die nachstehend als LGT-AGE bezeichnet wird; vgl. Lars Wieslander, Analytical Biochemistry Bd. 98 (1979) ,

s. 305. Die gereinigten DNS-Fragmente 3 und (^ werden mit 5'-phosphoryliertem Xhol-Linker (pCCTCGAGG) j4 unter Verwendung von T4DNS-Ligase ligiert, wobei das Plasmid pKYPIOO 7_ erhalten wird.

zu der vorstehend beschriebenen Konstruktion des Vektors der Erfindung wird eine Schnittstelle benutzt, die sich in Leserichtung gleich hinter der SD-Sequenz befindet. Auch wenn eine solche Schnittstelle nicht vorhanden ist, kann jedoch der gewünschte Expressionsvektor hergestellt werden. Wird beispielsweise eine Schnittstelle benutzt, die sich in Leserichtung vor dem Promotor befindet, wird ein DNS-Fragment synthetisiert, das sowohl Promotor, als auch Ribosomen-Bindungsstelle und Startcodon für die Translation (ATG oder GTG) enthält und in ein Plasmid, wie pBR322 kloniert.

Der Tryptophan-Promotor von Escherichia coli kann durch andere Escherichia coli-Promotoren ersetzt werden. Im Fall

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der Verwendung anderer Wirtsorganismen als Escherichia coli zur Expression von fremden Genen wird ein für den entsprechenden Organismus geeigneter Promotor benutzt. Bei der Verwendung eines Promotors von einem anderen Organismus als
Escherichia coli muß die Basensequenz, die der Ribosomen-Bindungsstelle von Escherichia coli entspricht, durch eine Basensequenz ersetzt werden, die die genetische Information enthält, welche für den Translationsstart in den

anderen Organismus erforderlich ist.
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Der vorstehend erhaltene Expressionsvektor wird mit
Restriktionsenzymen, wie Sphl, EcoRV, Kpnl oder Sacl, geschnitten und zum Einbau eines Fremdgens gerade nach dem
Startcodon benutzt. Dies geschieht beispielsweise auf folgende Art:

(1) Das 3'-überstehende Ende wird unter Verwendung der 3'-^ 5' Exonucleaseaktivität von DNS-Polymerase I und
Klenow-Fragment in ein stumpfes Ende umgewandelt und anschließend wird das fremde Gen inseriert;'vgl.

Figur 3.

(2) Es kann auch an das 3'-überstehende Ende unter Verwendung von terminaler Desoxynucleotidyl-Transferase ein
Homopolymerisatblock (PolydA, PolydT, PolydG oder

PolydC) angehängt werden und dann das fremde Gen mit

einem zu dem vorstehend erwähnten komplementären Homo-

polymerisat-Block eingebaut werden; vgl. Figur 4.
Das fremde Gen kann wirksam durch Züchten eines die so
erhaltene Rekombinante enthaltende Wirtsorganismus

zur Expression gebracht werden.
30

Die vorstehende Beschreibung erfolgte im Hinblick auf
Escherichia coli, bei dem die molekularbiologischen Untersuchungen am weitesten fortgeschritten sind. Die Erfindung ist aber nicht auf die Verwendung von Escherichia coli
"

beschränkt, sondern läßt sich auch auf andere Prokaryonten als Escherichia coli oder Eukaryonten, wie Hefe und höhere

Organismen, anwenden. Das bedeutet, daß ein Plasinid-Expressionsvektor, der mit anderen Prokaryonten, wie Bacillus subtilis verwendbar ist, dadurch konstruiert werden kann, daß die Struktur in Leserichtung hinter dem Startcodon beibehalten, der Promotor und die Ribosomen-Bindungsstelle von Escherichia coli durch diejenigen des Prokaryonten ersetzt und die für die Replikation und Erhaltung des Plasmidvektors in dem Prokaryonten erforderliche genetische Information angefügt wird. Ferner kann, obwohl die Transkriptions- und Translationsmechanismen in Eukaryonten nicht im einzelnen geklärt sind, ein in Eukaryonten verwendbarer Plasmid-Expressionsvektor dadurch konstruiert werden, daß der Promotor von Escherichia coli durch einen eukaryotischen Promotor und die Ribosomen-Bindungsstelle von Escherichia coli durch die

^ genetischen Elemente für den Translationsstart ersetzt und die für die Replikation und Erhaltung des Plasmidvektors in Eukaryonten erforderlichen genetischen Elemente angefügt werden.

Die Beispiele erläutern die Erfindung.

Beispiel 1

Konstruktion des Plasmidvektors pTrS3 mit dem Translations-Startcodon ATG und einer Sphl-Schnittstelle in Leserichtung nach dem trp-Promotor und der Ribosomen-Bindungsstelle:

pTrS3 wird aus dem gemäß Bezugsbeispiel 2 konstruierten Plasmid pKYPIOO auf folgende Weise erhalten. Man läßt 5 ng Plasmid pKYPIOO 8> in 20 μΐ Reaktionslösung mit einem Gehalt von 10 iriM Tris-HCl (pH 7,5) , 7 mM MgCl₃ und 6 mM 2-Mercaptoäthanol 2 Stunden bei 37⁰C mit 5 Einheiten CIaI reagieren. Dann wird die Umsetzung durch 5 Minuten Erhitzen auf 65⁰C abgebrochen. Das Reaktionsgemisch wird mit 2 til 100 mM Tris-HCl (pH 7,5), 70 mM MgCl₃, 1,0 M NaCl, 60 mM 2-Mercaptoäthanol, 16 μΐ destilliertes Wasser und 7 Einheiten SpHI

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Γ

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versetzt. Man läßt das Gemisch weitere 2 Stunden bei 37°C reagieren. Sodann wird die Umsetzung durch 5 Minuten Erhitzen auf 65⁰C abgebrochen und das größere Plasmid-DNS-Fragment 9^ (etwa 3,82 Kb) durch LGT-AGE gereinigt.

Getrennt davon werden zwei Arten von Nucleotiden 5'-CGATAAGCTATGCATG-3' und 5'-CATAGCTTAt-S¹ nach der Phosphotriestermethode synthetisiert. Die beiden erhaltenen Oligonucleotide werden 5 '-phosphoryliert. Dann werden 20 μΐη von jedem der Oligonucleotide mit 10 mM Tris-HCl (pH 7,5), 100 mM NaCl und 1 mM EDTA vermischt. Das Gemisch wird 10 Minuten bei 65⁰C, dann 120 Minuten bei 37°C und 120 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert, um Synapsis zu erreichen. Die beiden DNS-Ketten werden dann wie nachstend verknüpft pCGATAAGCTATGCATG

TATTCGATACp

Die beiden Enden des erhaltenen DNS-Fragments können mit dem DNS-Fragment mit einzelsträngigen Enden ligiert werden, das durch den Verdau rait CIaI und Sphl erhalten wurde. Die Iigierte DNS erhält CIaI- und Sphl-Schnittsteilen. Die aus den beiden Oligonucleotiden verbundene DNS _1_9_ ^und das ^wi^e vorstehend gereinigte Plasmid-DNS-Fragment 9^ werden vermischt und mit T4 DNS-Ligase ligiert. Dazu werden jeweils 1 pM von

beiden Oligonucleotiden, pCGATAAGCTATGCATG und pCATAGCTTAT miteinander verbunden und dann mit etwa 0,15 ug des gereinigten Plasmid DNS-Fragments 9^ versetzt. Dann werden 0,5 Einheiten T4DNS-Ligase zugegeben und das Gemisch in 20 μΐ Reaktionslösung 16 Stunden bei 4°C umsetzen gelassen,

die 20 mM Tris-HCl (pH 7,6), 1OmM MgCl,, 1OmM Dithiothreitol und 0,5 mM ATP enthält.

Escherichia coli HB101 wird mit der erhaltenen Plasmid-Rekombinant-DNS transformiert. Aus den. erhaltenen, gegen

Ampicillin resistenten und gegen Tetracyclin empfindlichen

R S
Transformanten (Ap Tc ) werden die Plasmid-DNSen isoliert.

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] Diese Plasmid-DNSen werden mit EcoRI, Xhol und Pstl, sowie mit CIaI und Sphl zur Bestätigung der Struktur des gewünschten Plasmidvektors pTrS3 V\_ geschnitten. Nach dem Verfahren von Maxam und Gilbert, Proc Natl. Acad. Sei., Bd. 74 (1977), S. 560 wird außerdem festgestellt, daß die Basensequenz der DNS zwischen der CIaI und der Sphl-Schnittstelle von pTrS3 die Sequenz ATCGATAAGCTATGCATGC ist. Der Organismus Escherichia coli, der das Plasmid pTrS3 enthält, wurde bei Fermentation Research Institute , Agency of Industrial and Science Technology hinterlegt und erhielt die Bezeichnung Escherichia coli ITrS FERM P-6735.

Beispiel 2

Expression eines ß-Interferon (nachstehend als IFN-ß bezeichnet) -Derivates, in dem ein zusätzliches Methionin am N-terminalen Ende des IFN-ß gebunden ist:

Ein rekombinantes Plasmid, das bei der Expression ein IFN-ß-Derivat ergibt,, in dem ein zusätzliches Methionin vor dem N-terminalen Methionin an das IFN-ß gebunden ist, wird unter Verwendung des gemäß Beispiel 1 hergestellten Expressionsvektors pTrS3 in folgender Weise erhalten.

1 0 μg pTrS3 werden 2 Stunden bei 37 ⁰C mit 10 Einheiten Sphl in 40 ml Reaktions lösung mit einem Gehalt von 10 inM Tris-HCl (pH 7,5) , 50 mM NaCl, 7 mM MgCl₃ und 6mM 2-Mercaptoäthanol umgesetzt. Nach der Umsetzung wird das Reaktionsgemisch mit Phenol und Chloroform extrahiert. Danach wird eine Fällung mit Äthanol durchgeführt. Das ausgefällte DNS-Fragment wird in 40 ml eines Gemisches gelöst, das 50 mM Tris-HCl (pH 7,6), 7 mM MgCl₃, 10 mM 2-Mercaptoäthanol, 0,25 mM dATP, 0,25 mM dCTP, 0,25 mM dGTP und 0,25 mM dTTP enthält. Danach werden nacheinander vier Einhexten Escherichia coli DNS-Polymerase I und Klenow Fragment zugesetzt. Das Gemisch wird 2 Stunden bei 15°C reagie-

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20

ren gelassen. Nach der Umsetzung wird das Gemisch mit Phenol und Chloroform extrahiert. Danach wird eine Fällung mit Äthanol durchgeführt. Das ausgefällte DNS-Fragment wird wieder in 30 μΐ eines Gemisches gelöst, das 100 inM Tris-HCl (pH 7,5), 50 mM NaCl, 7 mM MgCl₃ und 6 mM 2-Mercaptoäthanol enthält. Nacheinander werden 16 Einheiten EcoRI zugegeben. Das Gemisch wird wieder 2 Stunden bei 37⁰C reagieren gelassen. Nach dem Verdau mit EcoRI wird das kleinere Plasmid DNS-Fragment (etwa 130 bp) durch LGT-AGE gereinigt

10

Dann werden 5 μg des Rekombinant-Plasmids pLE-3, das das IFN-ß-Gen trägt, 2 Stunden bei 37⁰C mit 10 Einheiten CIaI in 30 μΐ einer Reaktionslösung umgesetzt, die 1OmM Tris-HCl (pH 7,5) , 7 mM MgCl₃ und 6 mM 2-Mercaptoäthanol enthält.

pLE-3 hat um die Clal-Schnittstelle folgende Struktur:

CIaI

AAA
TTT

AAGG
TTCC

GT AT

CGATGAGCTAC

CATAGC

TACTCGATG

SD Met S er Tyr

Das Reaktionsgemisch wird mit Phenol und Chloroform extrahiert. Dann wird eine Fällung mit Äthanol durchgeführt.

Das ausgefällte DNS-Fragment wird in 30 μΐ eines Gemisches gelöst, das 50 mM Tris-HCl, 7 mM MgCl₃, 1OmM 2-Mercaptoäthanol, 0,25 mM dATP und 0,25 mM dTTP enthält. Nacheinander werden 12 Einheiten Escherichia coli DNS-Polymerase I zugegeben. Dann läßt man das Gemisch 30 Minuten bei 37⁰C reagieren.

Durch die Umsetzung wird das 5'-überstehende Ende, das durch den Verdau mit CIaI entstanden ist, durch die 5" -^ 3'-Exonucleaseaktivität der DNS-Polymerase in ein stumpfes Ende umgewandelt.

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^Γ -16-

CIaI

ATCGAT
TAGCTA

ATAT

T A T A

Bei der Umsetzung wird dATP und dTTP zugegeben, um einen Verdau des Endes der DNS in Richtung 3' -> 5' durch die 3¹ -> 5'-Exonucleaseaktivität der DNS-Polymerase I zu verhindern. Das vorstehend erwähnte stumpfe Ende wird 'in einem Verhältnis von 2 bis 20 % erhalten.

Sodann wird die Reaktionslösung mit Phenol und Chloroform ^ extrahiert. Dann wird eine Fällung mit Äthanol durchgeführt. Das ausgefällte DNS-Fragment wird in 30 μΐ eines Gemisches gelöst, das 100 mM Tris-HCl (pH 7,5), 50 mM NaCl, 7 mM MgCl_ und 6 mM 2-Mercaptoäthanol enthält. Danach werden 16 Einheiten EcoRI zugegeben und das Gemisch 2 Stunden bei 37⁰C reagieren gelassen.

Nach dem Verdau mit EcoRI wird das größere Plasmid-DNS-Fragment (etwa 5,1 Kb) durch LGT - AGE gereinigt. Der dabei erhaltene trp-Promotor, etwa 40 ng des DNS-Fragments mit etwa 130 bp, das die SD-Sequenz und das ATG-Codon enthält, und etwa 150 ng des DNS-Fragments mit etwa 5,1 Kb, das das IFN-ß-Gen enthält, werden 20 Stunden bei 4⁰C mit einer Einheit T4DNS-Ligase in 20 μΐ eines Gemisches aus 20 mM Tris-HCl (pH 7,6), 10 mM MgCl-, 10 mM Dithiothreitol und 0,5 mM ATP

umgesetzt.

Sodann wird Escherichia coli HB101 (H. Boyer und Mitarb., J. Molec. Biol., Bd. 41 (1969), S. 459) in üblicher Weise mit der so erhaltenen Rekombinant-Plasmid-DNS transformiert. Aus einer Ap Tc -Transformante wird die Plasmid-DNS pFJ-123 isoliert und in üblicher Weise gereinigt; vgl. Figur 9.

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Die Struktur von pFJ-123 wird durch Agarosegelelektrophorese nach Verdau mit den Restriktionsenzymen EcoRI, Xhol, Pstl und BamHI sowie CIaI bestimmt.

Der Stamm Escherichia coli HB101, der das Rekombinant-Plasmid pFJ-123 enthält, erhält die Bezeichnung IFJ-123. Die Interferonproduktivität von IFJ-123 wird in folgender Weise geprüft.

Der Stamm wird 18 Stunden bei 37⁰C in LG-Nährmedium mit einem Gehalt von 10 g/l Trypton, 5 g/l Hefeextrakt, 5 g/l NaCl und 1 g/l Glukose, das mit NaOH auf pH 7,2 eingestellt ist, gezüchtet. Danach werden 0,2 ml des Kulturmediums in 10 ml MCG-Medium (pH 7,2) überimpft, das 0,6 % Na₂HPO₄, 0,3 % KH₃PO , 0,5 % NaCl, 0,1 % NH₄Cl, 0,5 % Glukose, 0,5 % Casaminosäure, 1 mM MgSO. und 4 μg/ml Thiaminhydrochlorid enthält, und 4 bis 8 Stunden bei 30⁰C gezüchtet. Anschließend werden 10 Rg/ml Indol-Acrylsäure (nachstehend als "IAA" bezeichnet) das ein Induktor des Tryptophangens ist, zugesetzt und das Gemisch weitere 5 bis 12 Stunden gezüchtet.

Hierauf wird das Kulturmedium 10 Minuten bei 8000 U.p.M. zentrifugiert. Die geernteten Zellen werden mit einer Pufferlösung (pH 7,5) aus 30 mM Tris-HCl mit einem Gehalt von 30 mM NaCl gewaschen. Anschließend werden die gewaschenen Zellen in 1 ml der vorstehend genannten Pufferlösung suspendiert und mit 200 μg Lysozym und 5 μΐ 0,25 M EDTA (Äthylendiamintetraacetat) versetzt. Das Gemisch wird 30 Minunten bei 0⁰C stehengelassen. Zum Aufbrechen der Zellen wird das Einfrieren und Auftauen dreimal wiederholt. Die gebrochenen Zellen werden 30 Minuten bei 15 000 U.p.M. zentrifugiert. Der Überstand wird abgetrennt und das Interferon im überstand nach dem Verfahren von J.A. Armstrong, Appl. Microbiol., Bd. 21 (1971), S. 723 bis 725 unter Verwendung von Vesikular Stomatitis Virus und Wish C_ell aus

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-ie- ^π

menschlichem Amnion bestimmt. Der Stamm erzeugt 3x10 Ein heiten/1 Interferon.

Die SD-Sequenz und die Basensequenz um das ATG des Plasmids pFJ-123 im Stamm IFJ-123 haben nach der Bestimmung nach dem Verfahren von Maxam und Gilbert folgendes Aussehen:

AAG GGTATCGATAAGCTAT G ä T G SD

Der Stamm Escherichia coli IFJ-123, der das Plasmid pFJ-123 enthält, wurde bei Fermentation Research Institute, Agency of Industrial and Science Technology hinterlegt und erhielt ■J5 die Hinterlegungsnummer FERM P-6882.

Das vorstehend erläuterte Verfahren zur Herstellung von pFJ-123 ist in Figur 9 dargestellt.

Beispiel3

Expression eines IFN-ß-Derivats mit einer Deletion von N-terminalen Aminosäuren:

Rekombinant-Plasmide, die bei der Expression ein IFN-ß-Derivat ergeben, das eine Deletion von einigen N-terminalen Aminosäuren aufweist, werden unter Verwendung des in Beispiel 1 konstruierten Expressionsvektor pTrS3 auf folgende Weise erhalten.

15 μg pLE-3 werden 2 Stunden bei 37°C mit 20 Einheiten CIaI in 100 ml einer Reaktionslösung verdaut, die 10 mM Tris-HCl (pH 7,5), 7 mM MgCl₃ und 6 mM 2-Mercaptoäthanol enthält. Danach wird das Reaktionsgemisch mit Phenol und Chloroform extrahiert. Anschließend wird eine Fällung mit Äthanol durchgeführt. Das ausgefällte DNS-Fragment wird in 30 ml 10 mM Tris-HCl (pH 7,5) und 0,5 mM EDTA gelöst. Sodann wer-

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Γ "1

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den 6 μΐ der DNS-LÖsung mit einem Gehalt von etwa 3 ng DNS/ 13 μΐ destilliertes Wasser und 5 μΐ Pufferlösung mit einem Gehalt von 60 mM CaCl₂, 60 mM MgCl₃₇ 3 M NaCl, 100 mM Tris-HCl (pH 8,1) und 5 mM EDTA vermischt. Das Gemisch wird mit 0,5 Einheiten Exonuclease BAL31 versetzt und dann 3 Minuten bei 30⁰C reagieren gelassen um 1 bis 30 bp von den beiden Clal-Enden der DNS zu entfernen.

Danach wird die Umsetzung durch Extraktion mit Phenol und anschließend mit Chloroform abgebrochen und anschlieBend eine Fällung mit Äthanol durchgeführt. Das ausgefällte DNS-Fragment wird in 20 μΐ eines Gemisches aus 100 mM Tris-HCl (pH 7,5) , 50 mM NaCl, 7 mM MgCl₃ und 6 mM 2-Mercaptoäthanol gelöst und mit 8 Einheiten EcoRI versetzt. Sodann läßt man das Gemisch 2 Stunden bei 37⁰C reagieren. Nach dem Verdau mit EcoRI wird das größere Plasmid-DNS-Fragment von etwa 5,1 Kb durch LGT - AGE gereinigt.

Etwa 150 μg des so erhaltenen DNS-Fragments mit etwa 5,1 Kb, das das IFN-ß-Gen enthält, und etwa 40 ng des in Beispiel 2 hergestellten, den trp-Promotor, die SD-Sequenz und das ATG-Codon enthaltende DNS-Fragment mit etwa 130 bp werden mit einer Einheit T4DNS-Ligase in 20 μΐ einer Reaktionslösung ligiert, die 20 mM Tris-HCl (pH 7,6), 10 mM MgCl₃, 10 mM Dithiothreitol und 0,5 mM ATP enthält. Man läßt das Gemisch 20 Stunden bei 4⁰C reagieren.

Der Stamm Escherichia coli HB101 wird in üblicher Weise mit der so erhaltenen rekombinanten DNS transformiert. Aus den

R Ξ

erhaltenen Ap Tc -Transformanten werden die Plasmide isoliert und gereinigt. Eines der erhaltenen Plasmide erhält die Bezeichnung pFM-9; vgl. Figur 10.

Die Struktur des Plasmids pFM-9 wird durch Agarosegelelektrophorese nach Verdau mit den Restriktionsenzymen EcoRI, Xhol, Pstl, BamHI und CIaI bestimmt.

L J

Der Stamm Escherichia coli HB101, der das rekombinante Plasmid pFM-9 enthält, erhält die Bezeichnung IFM-9. Die Interferonproduktivität des Stammes IFM-9 wird wie in Beispiel 2 geprüft. Der Stamm erzeugt 8 χ 10 Einheiten/1 Interferon. Der Stamm wurde im Fermentation Research Institute, Agency of Industrial and Scientific Technology hinterlegt und erhielt die Bezeichnung Escherichia coli IFM-9 FERM P-6883.

Das Verfahren zur Herstellung des Plasmid pFJ-123 ist in Figur 9 dargestellt.

Die SD-Sequenz und die Basensequenz um das ATG-Codon des Plasmids pFM-9 in Escherichia coli IFM-9, bestimmt nach ^ dem Verfahren von Maxam und Gilbert, hat folgendes Aussehen.

AAGGG TATCGATAAG CTlAT GiG AT T C

SD

Es wurde bestätigt, daß das Plasmid pFM-9 das für IFN-ß kodierende Gen enthält, wobei fünf Aminosäuren (Ser Tyr Asn Leu Leu) nach der N-terminalen Aminosäure (Met) deletiert werden,

Bezugsbeispiel 1

Konstruktion des Plasmidvektors pKYPIO mit einem trp-Promotor: (a) Reinigung von Tryptophan-transduzierender Phagen-DNS:

Ein λρ^ρ Phage, /\ cl857trpED1 0 (nachstehend als"/ltrpED" bezeichnet) [G.F. Miazzari und Mitarb., J. Bacteriol., Bd. 133 (1978), S. 1457] wird im Stamm Escherichia coli JA 194 (F~, A", r_k~, ΐγ~, AtrpE5, Ieu6) (J. Carbon und Mitarb., Recombinant Molecules, S. 355 (1977), Raven Press) lysogeni-

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siert. Der erhaltene lysogene Stamm, JA 194 (λΐχρ ED) wird 30 Minuten bei 42 C gezüchtet, um Λ-trp ED Phagen zu induzieren und /VPhage-Lysat herzustellen. Die fcPhagen werden aus· dem PVPhagen-Lysat durch Caesiumchlorid-Gleichgewichts-Dichtegradientenzentrifugierung gemäß Yamakawa und Mitarb., "Chemicals of Nucleic Acids I" Tokyo Kagaku Doj in, S. 54 61 (1974) gereinigt. Anschließend werden die \-Phagen durch Behandlung mit Phenol und Chloroform nach dem Verfahren von Yamakawa und Mitarb., a.a.O., S. 62 - 65 weiter gereinigt.

(b) Klonierung des trp-Promotors in ein Plasmid

Die Klonierung des trp-Operons von der A-trp ED-Phagen-DNS wird auf folgende Weise durchgeführt. 8 μg ?\.trp ED-DNS werden 2 Stunden bei 37°C mit 16 Einheiten EcoRI und 16 Einheiten Hindlll in 20 mM Tris-HCl (pH 7,5), 75 mM NaCl, 10 inM MgCl_ und 5 mM Dithiothreitol verdaut. Getrennt davon wird 1 μg Plasmid pBR325-DNS mit 2 Einheiten EcoRI und 2 Einheiten Hindlll unter den gleichen Bedingungen verdaut (Endvolumen: 30 μΐ). Die Umsetzungen werden durch 5 Minuten Erhitzen auf 65°C abgebrochen. Dann werden 15 μΐ von jedem Verdau miteinander vermischt und das Gemisch mit 500 μΜ (Endkonzentration) ATP und 5 Einheiten T4 DNS-Ligase versetzt. Das Gemisch wird 18 Stunden bei 4°C umgesetzt.

Danach wird der Stamm Escherichia coli C600 SF (Cameron und Mitarb., Proc. Natl. Acad. Sei., Bd. 72 (1975), S. 3416) mit dem Plasmidgemisch nach dem Verfahren von S.N. Cohen und Mitarb., Proc. Natl. Acad. Sei., Bd. 69 (1972), S. 2110 transformiert. Es werden Transformanten selektioniert, die

TJ

· gegen Ampicillin resistent (Ap ), gegen Tetracyclin

R S

resistent (Tc ) und gegen Chloramphenicol empfindlich (Cm )

sind. Aus diesen Escherichia coli Transformanten werden die Plasmid-DNSen isoliert. Eine der Plasmid DNSen erhält die Bezeichnung pKYP-1.
35

^Γ - 22 -

Dieses Plasmid pKYP-1 wird mit Taql und EcoRI geschnitten und der Verdau durch Agarosegelelektrophorese gereinigt. Es wird ein DNS-Fragment mit 2,6 Kb (Kilobase) erhalten, das den Tryptophan-Promotor und die SD-Sequenz enthält. Das 2,6 Kb DNS-Fragment wird nach dem in Figur 7 dargestellten Verfahren in den bekannten Vektor pBR322 kloniert. Dafür werden 8 μg pBR322 60 Minuten bei 45°C mit 2 Einheiten Taql in 100 μΐ Reaktionsgemisch aus 1OmM Tris-HCl (pH 8,4), 6 mM MgCl₂, 100 niM NaCl und 6 mM 2-Mercaptoäthanol verdaut.

Nach dem teilweisen Verdau mit Taql wird der Verdau der LGT-AGE unterzogen, wobei ein gereinigtes DNS-Fragment mit 4,36 Kb erhalten wird. Etwa 1,5 |ig des DNS-Fragments werden dann 3 Stunden bei 37 C mit 3 Einheiten EcoRI vollständig verdaut. Etwa 1,0 |ig eines DNS-Fragments mit 4,33 Kb wird durch LGT-AGE gewonnen. Sodann werden 1 2 μg pKYP-1 DNS teilweise mit drei Einheiten Taql verdaut, etwa 2 μg des erhaltenen DNS-Fragments mit 8,5 Kb werden durch LGT-AGE gereinigt und die DNS nach dem gleichen Verfahren wie vorstehend beschrieben mit EcoRI vollständig verdaut. Dabei werden etwa 0,5 μg eines gereinigten DNS-Fragments mit 2,6 Kb erhalten. Anschließend werden 0,4 μg des so erhaltenen DNS-Fragments von pBR322 mit 4,33 Kb und 0,25 μg des DNS-Fragments von pKYP-1 mit 2,6 Kb zu 20 μΐ einer Reaktionslösung gegeben, die aus 20 mM Tris-HCl (pH 7,6) , 1OmM MgCl₂ und

10 mM Dithiothreitol besteht. Das Gemisch wird hierauf mit 0,5 mM ATP und 4 Einheiten T4DNS-Ligase versetzt. Die Umsetzung wird 18 Stunden bei 4 C durchgeführt.

Der Stamm Escherichia coli C600 SF8 wird mit der vorstehend

^ erhaltenen Plasmid-DNS transformiert. Aus dem Transforman-

R R

ten werden die Plasmide mit Ap und Tc isoliert. Die Plasmid-DNS wird mit 6 Restriktionsendonucleasen, nämlich EcoRI, Hindll, CIaI, Hpal, HincII und BamHI geschnitten, um die Plasmidstruktur zu analysieren. Das Plasmid erhält die Bezeichnung pKYP-5.

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^Γ - 23 - ^Ί

(c) Herstellung eines Portable-Promotors aus dem trp-Promotor

Der vorstehend beschriebene Plasmidvektor pKYP-5 eignet sich als Vektor zur Einführung von DNS, da er 1 bis 20 Basenpaare in Leserichtung nach SD-Sequenz eine CIaI- und eine Hindlll-Schnittstelle aufweist. Da in der pKYP-5-DNS neben der sich unmittelbar nach der SD-Sequenz befindenden Clal-Schnittstelle eine weitere Clal-Schnittstelle vorhanden ist und das Fragment mit dem trp-Promotor, das durch Schneiden der pKYP-5-DNS mit EcoRI und Hindlll erhalten wird, ein wenig zu groß ist, nämlich 2,65 Kb, wird das Plasmid pKYP-5 durch das in Figur 8 dargestellte Verfahren verbessert, wobei ein Plasmid mit einem DNS-Fragment erhalten wird, das einen kürzeren Tryptophan-Promotor enthält. Dazu wird die pKYP-5-DNS mit Hpall und Hindlll verdaut. Der Verdau wird gereinigt, wobei ein DNS-Fragment mit etwa 340 bp erhalten wird. Dieses Fragment wird in mit CIaI und Hindlll verdautes pBR322 eingebaut (vgl. Figur 6), wobei das Plasmid pKYP-10 erhalten wird. Die Struktur von pKYP-10 wurde nach Verdau mit EcoRI, CIaI, Hindlll und Hpal durch Agarosegelelektrophorese bestimmt.

(d) Verbindung von zwei oder mehr trp-Promotoren 25

Zur Konstruktion eines Plasmidvektors mit stärkerer Promotoraktivität werden zwei trp-Promotoren in den Vektor eingebaut. Dazu wird das DNS-Fragment mit etwa 340 bp, das den trp-Promotor enthält und das in vorstehender Stufe (c) beschrieben ist, in das mit CIaI und Hindlll verdaute Plasmid pKYP-10 eingebaut. Dabei wird das Plasmid pKYP-11 erhalten; vgl. Figur 11 (A). Das gleiche Verfahren wird zur Konstruktion des in Figur 11 (B) dargestellten Plasmids pKYP-12 wiederholt, in dem drei trp-Promotoren in der gleichen Orientierung verbunden sind. Die Struktur des Plasmids pKYP-12 wurde durch Verdau mit EcoRI, CIaI, Hindlll und Hpal bestätigt.

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Bezugsbeispiel· 2

Konstruktion des Piasmids pKYPIOO

Das Plasmid pKYPIOO ]_, das für die Konstruktion des Plasmidvektors der Erfindung günstiger ist, wird wie in Figur 5

eine

dargestelit aufgebaut. Ais Quelle für/den trp-Promotor enthaltende DNS wird das Plasmid pKYPiO 1_ (vgl. japanische Patentanmeldung 213 193/81, Figur 5) verwendet, das einen portable-trp-Promotor enthält.

50 μg Plasmid pKYPIO werden mit 50 Einheiten Hhal 2 Stunden bei 37°C in 100 μΐ Reaktionslösung verdaut, die 10 mM Tris-HCl (pH 7,5), 7 mM MgC 1_ und 6 mM 2-Mercaptoäthanol enthält.

Nach dem Verdau mit Hhal wird ein DNS-Fragment mit etwa 180 bp, das den trp-Promotor enthält, durch Gelelektrophorese an 5 % Polyacrylamid gereinigt (A.M. Maxam und Mitarb., Proc. Natl. Acad. Sei., Bd. 74 (1977), S. 560; nachstehend als "PAGE" bezeichnet). In der Reinigungsstufe werden infolge unvollständiger Reinigung durch PAGE auch zwei andere DNS-Fragmente außer der gewünschten DNS erhalten. Die gereinigten drei DNS-Fragmente (insgesamt etwa 4 μg) werden mit 8 Einheiten Escherichia coli DNS-Polymerase I und Klenow-Fragment 2 Stunden bei 15°C in 30 μΐ Reaktionslösung umsetzen gelassen, die 50 mM Tris-HCl (pH 7,6), 7 mM MgCl₀, 10 mM 2-Mercaptoäthanol, 0,25 mM dATP, 0,25 mM dCTP, o,25 mM dGTP und 0,25 mM dTTP enthält. Durch die Umsetzung wird das 3'-überstehende Ende, das durch den Verdau mit Hhal entstanden ist, durch die 3' -* 5'-Exonucleaseaktivität und die 5' 4 3'-Reparatur- und Syntheseaktivität von DNS-Polymerase I und Klenow-Fragment in ein stumpfes Ende umgewandelt. Danach wird die DNS-Polymerase I . Klenow Fragment durch 30 Minuten Erhitzen auf 72°C inaktiviert. Die NaCl-Konzentration wird mit 1M NaCl auf 50 mM eingestellt. Sodann wird das Gemisch mit 8 Einheiten Hindlll versetzt und 2 Stunden bei 37°C reagieren gelassen. Nach dem Verdau mit Hindlll wird ein DNS-Fragment mit etwa 100 bp isoliert, das den trp-Pro-

L . J

^Γ - 25 -

motor enthält, und durch PAGE gereinigt.

Getrennt davon werden 5 μg Plasmid pBR322 2 Stunden bei 37°C mit 8 Einheiten EcoRI in 20 ml einer Reaktionslösung verdaut, die 10 mM Tris-Hcl (pH 7,5), 50 mM NaCl, 7 mM MgCl₂ und 6 mM 2-Mercaptoäthanol enthält. Nach der Extraktion mit Phenol und Chloroform und der Fällung mit Äthanol wird das ausgefällte DNS-Fragment in 20 μΐ eines Gemisches aus 50 mM Tris-HCl (pH 7,6), 7 mM MgCl₃, 6 mM 2-Mercaptoäthanol, 0,25 mM dATP, 0,25 mM dCTP, 0,25 mM dGTP und 0,25 mM dTTP gelöst. Danach wird das Gemisch mit 8 Einheiten Escherichia coil DNS-Polymerase I und Klenow-Fragment versetzt. Man läßt das Gemisch 2 Stunden bei 15°C reagieren. Das durch den Verdau mit EcoRI entstandene 5'-überstehende Ende wird durch die Reparatur-Synthese-Aktivität der DNS-Polymerase I und des Klenow-Fragments in ein stumpfes Ende umgewandelt. Danach werden DNS-Polymerase I und Klenow-Fragment durch 30 Minuten Erhitzen auf 72⁰C inaktiviert und die NaCl-Konzentration mit 1M NaCl auf 50 mM eingestellt. Das Gemisch wird hierauf mit 8 Einheiten Hindlll versetzt und 2 Stunden bei 37⁰C reagieren gelassen. Nach dem Verdau mit Hindlll wird das größere Plasmid DNS-Fragment mit etwa 4,33 Kb durch LGT-AGE gereinigt.

Etwa 50 ng DNS-Fragment 3^ mit etwa 100 bp, das den so enthaltenen trp-Promotor enthält, etwa 0,2 μg DNS-Fragment £> mit etwa 4,33 Kb, abgeleitet von pBR322, und 50 ng 5'-phosphorylierter Xhol-Linker (pCCTCGAGG) werden mit einer Einheit T4DNS-Ligase 40 Stunden bei 4⁰C in 20 μΐ einer Reaktionslösung ligiert, die 20 mM Tris-HCl (pH 7,6), 10 mM MgCl₂, 10 mM Dithiothreitol und 0,5 mM ATP enthält. Sodann wird der Stamm Escherichia coIi HB101 mit der so erhaltenen rekombinanten Plasmid-DNS transformiert. Aus Ap Tc -Transformanten werden anschließend die Plasmid-DNSen isoliert und gereinigt. Diese Plasmid-DNSen werden mit 8 Restriktionsenzymen verdaut, nämlich mit EcoRI, Xhol,

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HindIII, HaeIII, CIaI, Taql und Rsal. Es wird das Plasmid ausgewählt, in dem das DNS-Fragment 3^ mit dem trp-Promotor mit etwa 100 bp und der Xhol-Linker £ kloniert sind. Dieses Plasmid erhält die Bezeichnung pKYPIOO T_.

Bezugsbeispiel 3

Konstruktion von pLE-3

Das Plasmid pTuIFNß-5, das in üblicher Weise aus dem Stamm ATCC 31879 isoliert wurde, wird mit HindIII verdaut. Der Verdau wird mit DNS-Polymerase I behandelt und einer Ligation unterzogen, wobei das in Figur 12 dargestellte Plasmid pTuIFNßH-5 erhalten wird. Das vom pTuIFNßH-5 erhaltene IFN-ß-Gen wird dann in das Plasmid pKYP-12 mit dem trp-Promotor kloniert. Dazu werden zwei μg ρΚΥΡ-12-DNS 2 Stunden bei 37 ⁰C mit 4 Einheiten CIaI in 30 μ.1 einer Pufferlösung (nachstehend als "Cla-Puffer" bezeichnet) verdaut, der aus 10 mM Tris-HCl (pH 7,5) , 6 inM MgCl₃ und 5 mM Dithiothreitol

besteht. Das Gemisch wird mit NaCl bis zu einer Endkonzentration von 100 mM versetzt und die Umsetzung 2 Stunden bei 37°C fortgeführt. Danach wird das Gemisch 5 Minuten auf 65⁰C erwärmt, um das Enzym zu inaktivieren und dann durch LGT-AGE gereinigt. Es werden 1,2 μ9 gereinigte DNS von etwa 5 Kb erhalten, die den trp-Promotor enthält.

Getrennt davon werden 15 pg pTuIFNßH-5-DNS mit CIaI und BamHI verdaut und wie vorstehend durch LGT-AGE gereinigt, wobei etwa 1 μg DNS-Fragment mit 1,1 Kb erhalten werden, das das IFN-ß-Gen enthält. Die beiden erhaltenen DNS-Fragmente, die in Figur 12 als 5 Kb und 1,1 Kb aufgeführt sind, werden mit einem Gemisch aus 20 mM Tris-HCl (pH 7,5) 6 mM MgCl₃, 5 mM Dithiothreitol und 500 mM ATP gelöst. Das Gemisch wird dann mit 4 Einheiten T4DNS-Ligase versetzt und 18 Stunden bei 4⁰C reagieren gelassen. Danach wird Escherichia coli HB101 mit dem Gemisch der so erhaltenen Rekombinanten in

U J

Γ" - 27 -

üblicher Weise transformiert. Aus einer Kultur der erhaltenen Ap -Kolonien werden die Plasmide gewonnen. Eines der Plasmide ist das in Figur 12 gezeigte pLE-3. Seine Struktur wurde nach Verdau der DNS mit CIaI, EcoRI, Hindlll und BamHI durch Agarose-Gelelektrophorese bestätigt. Nach dem Verfahren von Maxam und Gilbert,Proc. Natl. Acad. Sei., Bd. 74 (1977), S. 560 wird ferner bestätigt, daß die Basensequenz von der SD-Sequenz, AAGG, bis zum Startcodon ATG im Plasmid pLE-3 die Form ¹¹AAGGGTATCGATG" hat.

Der Stamm Escherichia coli, der das Plasmid pLE-3 enthält, wurde bei American Type Culture Collection hinterlegt und erhielt die Bezeichnung Escherichia coli ILE-3, ATCC 39010.

L J

Leerseite

Claims

VOSSlUS VOSSIUS -TAUCHNEFi -HEUNEMANN -RAUH

PATENTANVi/ÄLfE

SIEBERTSTRASSE A - 8OOO MÜNCHEN 86 ■ PHONE: (O89) 474075 CABLE: BENZOLPATENT MÖNCHEN -TELEX 5-29 45 3 VOPAT D 1

5 u.Z.: S 651 (Ra/kä) Case: 330-4

07. OKt, 1983

KYOWA HAKKO KOGYO CO., LTD.
und

JURIDICAL FOUNDATION, JAPANESE FOUNDATION FOR CANCER RESEARCH Tokyo/ Japan

" Neuer Expressionsvektor "
15

P atentansprüche

j 1. J Expressionsvektor mit einem Promotor, einer Ribosomen- ^-—' Bindungsstelle und einem Translations-Startcodon, dadurch gekennzeichnet, daß sich an diese Sequenzen eine Erkennungssequenz für ein Restriktionsenzym anschließt, die nach dem Schneiden mit dem Restriktionsenzym als 3'-überstehendes Ende verbleibt.
25
2. Vektor nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Startcodon ATG oder GTG ist.
3. Vektor nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß

das Restriktionsenzym Sphl, EcoRV, Kpnl oder Sacl ist.
4. Vektor nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß

sich der Promotor von einem .prdkaryotischeh Organismus ableitet.
5. Vektor nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß der Promotor ein trp-, Iac- oder ft-Phagen-Promotor von

^Γ π

Escherichia coli oder ein Promotor von Bacillus subtilis ist.
6. Vektor nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß sich Promotor, Ribosomen-Bindungsstelle und Transla-

tions-Startcodon von einem eukaryotischen'Organismus ableiten
7. Verfahren zur Expression eines fremden Gens, dadurch gekennzeichnet, daß man einen Expressionsvektor mit einem Promotor, einer Ribosomen-Bindungsstelle und einem Translations-Startcodon, an die sich eine Erkennungssequenz für ein Restriktionsenzym, die nach dem Schneiden mit dem Restriktionsenzym als 3'-überstehendes

Ende verbleibt, mit dem Restriktionsenzym schneidet, danach das 3'-überstehende Ende mit DNS-Polymerase I (Klenow-Fragment) oder T4DNS-Polymerase in ein stumpfes Ende umwandelt, das fremde Gen an das stumpfe Ende-anhängt, einen Wirtsorganismus mit der erhalten Rekombinant-DNS transformiert und die so erhaltene Transfor-

20

mante züchtet.
8. Verfahren zur Expression eines fremden Gens, dadurch gekennzeichnet, daß man einen Expressionsvektor mit einem Promotor, einer Ribosomen-Bindungs-

25

stelle und einem Translations-Startcodon, an die sich eine Erkennungssequenz für ein Restriktionsenzym anschließt, die nach dem Schneiden mit dem Restriktionsenzym als 3'-überstehendes Ende verbleibt, mit dem Restriktionsenzym schneidet, danach unter Verwendung

30

von terminaler Deoxynucleotidyl-Transferase einen Homopolymer isat-Block an das 3'-überstehende Ende-anfügt, das fremde Gen mit einem Homopolymerisat-Block, der zu dem genannten Homopolymerisat-Block komplementär ist, anfügt, einen Wirtsorganismus mit der erhaltenen Re-

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kombinant-DNS transformiert und die so erhaltene Transformante züchtet.
9. Verfahren nach Anspruch 7 oder 8, dadurch gekennzeichnet, daß das Startcodon ATG oder GTG ist.
10. Verfahren nach Anspruch 7 oder 8, dadurch gekennzeichnet, daß das Restriktionsenzym Sphl, EcoRV, Kpnl oder Sael ist.
11. Verfahren nach Anspruch 7 oder 8, dadurch gekennzeichnet, daß sich der Promotor von einem prokaryotischen Organismus ableitet
12. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß der Promotor ein trp-, Iac- oder λ -Phagen-Promotor

von Escherichia coli ist.
15
13. Verfahren nach Anspruch 7 oder 8, dadurch gekennzeichnet, daß sich Promotor, Ribosomen-Bindungsstelle und Translations-Startcodon von einem eukaryotisehen Organismus ableiten.
14. Mikroorganismus, dadurch gekennzeichnet, daß er einen Expressionsvektor nach Anspruch 1 enthält.
15. Escherichia coli ITrS3.
16. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß

das Fremdgen ein für Interferon oder ein Derivat davon codierendes Gen ist.

als Wirtsorganismus ein Escherichia coli-Stamm verwendet
17. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß als W

wird.
18. Escherichia coli IFJ-123,
19. Escherichia coli IFM-9.