DD219212A5 - Verfahren zur herstellung eines rekombinanten dna-klonierungsvektors - Google Patents

Abstract

Verfahren zur Herstellung eines rekombinanten DNA-Klonierungsvektors zum Schutz eines Bakteriums gegenueber einem natuerlich vorkommenden Bakteriophagen, der eine doppelstraengige DNA enthaelt, welche eine Restriktionsstelle mit spezifischer Aktivitaet aufweist, das dadurch gekennzeichnet ist, dass man1) ein DNA-Segment, das Gene enthaelt, welchea) eine Modifikationsaktivitaet undb)eine mit a) verwandte Restriktionsaktivitaet mit der gleichen Spezifitaet wie die der Restriktionsstellekoordiniert und sequentiell exprimieren2)ein Replikon, das in diesem Bakterium funktionell ist, und3)ein Gen, das in diesem Bakterium ein funktionelles Polypeptid exprimiert,miteinander verknuepft.

Description

Vertreter: Patentanwaltsbüro Berlin . .

Titel der Erfindung:

Verfahren zur Hersteilung eines rekombinanten DNA-Klonierunqsvektors

Anwendungsgebiet der Erfindung: '

Iq-. . ' - ' -.

Die Erfindung« bezieht sich auf ein neues Verfahren zur Herstellung eines rekombinanten .DNA-Klonierungsvektors, der sich zum Schutz eines Bakteriums gegenüber einem natürlich vorkommenden Bakteriophagen verwenden läßt.

Charakteristik der bekannten technischen Lösungen:

Die rekombinante DNA-Technologie durch großtechnische Fermentation von Mikroorganismen, wie Escherichia coli, stellt eine immer bedeutender werdende Technik zur Herstellung der verschiedensten komplex aufgebauten Produkte dar. Mikroorganismen und somit auch-Bakterienkulturen neigen jedoch stets zu einer Infektion durch Phagen, und in einem solchen Fall kommt es gewöhnlich zu einem Kontakt, einer Adsorption und einer Reaktion der Viren oder Bakteriophagen mit der

2Q Membran der Wirtszelle. Die Adsorption erlaubt dem Phagen-· chromosom'oder Genmaterial einen Eintritt in die -Wirtszelle und¹ einen Beginn eines Prozesses, durch den die Zellmaschinerie des Wirts unterdrückt und praktisch ausschließlich zur Produktion neuer Phagen herangezogen wird. Die Wirts-

g_R zelle wird dabei mit -reifen Phagen gefüllt und erfährt dann gewöhnlich innerhalb von etwa 30 Minuten nach Beginn der ,Infektion eine Lyse. Die neu gebildeten Phagen sind natür-

• j

hoi-,bis oraktisch alle

3 :Sicn cer Areisiau:- wie·: ;aren Wirtszeilen zerstör

Zur Lösung des bei- einer großtechnischen Fermentation von Escherichia coil und anderen Bakterien durch Bakteriopha- gen auftretenden Problems sind bisher nur . sehr wenige andere Methoden beschrieben worden. Man weiß, daß eine Bakteriophageninfektion sogar unter äußerst aseptischen Bedingungen auftritt, wobei die einmal vorhandenen Bakteriophagen notorisch schwer zu eliminieren sind.,Eine solche EliiTiinierung ist zwar möglich, sie ist jedoch sehr 'JiT' c---e c je ^ u^ c ü.euer infolge d^s gs-™j_~ vsrou^d^nsn 7 -1 ~ 5 'j,f -

Die Ausnutzung der rekombinanten . DNA-Technologie- durch großtechnische Fermentation von Escherichia- coii ist- bisher durch da's oben erwähnte Problem einer Phageninfektioi

"ice Flora an Bakteriophagen oetroffen ist, ist in cer .Tat ein wesentlicher Faktor, der die Biosynthese der ge-Vf uT. Ξ C Πι. 6Π jt' 2Γ O G Li -K *»- 3 S £ Π ZT S u O IT ~ O G 3 2Γ S O CT ei H CT 3. Γ"; Ξ V £ ^T .Tl Z. ZVG¹S ^T "C Dieses Problem wird besonders kritisch während einer gro; teonnischen Fermentation.und kann zu einem"kostspieligen unc.jänen Verlust an Transfcrmantenpopulatiqnen von Eschi

reitsteiluno neuer und wohlfeiler· Mittel, durch'die sich Bakterientransformanten .gegenüber'natürlich vorkommenden Ea'xteriophacen wirksam schützen lassen. '.

:s zum Sc;

' - 3 - . .

fiseher Aktivität aufweist, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man ' ..·.'. ' ' >.' I)- ein DNA-Segment,' das Gene enthält,, welche .

a) eine Modifikationsaktivität und

. b) eine mit a) verwandte Restriktionsaktivität mit der gleichen S-pe.zifität wie die der 'Restriktionsstelie, koordiniert und.sequentiell exprimieren,

- 2) ein Replikon, das in diesem Bakterium funktionell ist,

' ' ι und . . '.

•3) ein Gen, das in diesem Bakterium ein funktionelles PoIy-

peptid exprimiert, .

miteinander verknüpft. '· ''

Die vorliegende Erfindung ist besonders wichtig, weil sie ·. das .Problem einer massiven Phageninfektion von'Bakterien-' kultüren löst, die rekombinante DNA enthalten. Dies ist vorteilhaft, da es nach einmal erfolgter Transformation einer rekombinantßn DNA, die für ein gewünschtes Produkt codiert, in eine Wirtsze.lle wünschenswert oder sogar wesent-

lieh ist, daß die Wirtszelle gegenüber einer Infektion durch Bakteriophagen geschützt ist. -Ein solcher Schutz ist entscheidend, weil Transformantenkulturen notorisch gegenüber Bakteriophagen suszeptibel sind, die nach erfolgter Infektion zu einer Lyse .der gesamten Population' führen. Die -Genexpression'eines Produkts ist jedoch .von den Wirtszellen, abhängig, welche so lange am Leben bleiben sollen, bis es zur gewünschten Biosynthese gekommen ist, so daß infizierte Kulturen über ein verringertes Produktionsvermögen verfugen. Durch die Erfindung wird es daher nun möglich, daß man Wirtszellen mit einem Restriktionssystem versieht, das Fremd-DNA verdaut/ die eine Hhall-Stelle enthält. Die Hhall-Stelle ist in den meisten natürlich' vorkommenden Viren zu finden, so daß die Erfindung gegenüber einer breiten Reihe störender Bakteriophagen wirksam ist. Sobald daher eine, Phagen-DNA· in eine erfindungsgemäß ausgerüstete Wirts-, zelle eintritt, verdaut die Hhall-Restriktionsendonuclease die DNA an den Hhall-Stellen und macht die Phaqen nicht-

_ 4 -

funktionell und harmlos. Auf diese Weise werden die bakteriellen Wirtszellen·vor .natürlich vorkommenden Bakteriophagen geschützt, so daß die Produktivität der Kultur gesichert ist. Dies ist nicht nur vorteilhaft, sondern stellt einen beachtlichen technischen Fortschritt dar.

Die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellten rekombinanten DNA-Klonierungsvektoren werden zum Schutz eines Bakteriums gegenüber einem natürlich vorkommenden Bakteriophagen angewandt, indem man ein solches Bakterium mit einem solchen rekombinanten DNA-Klonierüngsvektor transformiert, der aus .'...,. · , . 1 ·) einem DNA-Segment, das einem seichen' Bakteriuir; eine

Restriktiöns- und Erkennungsmodifikationsaktivität 15.- . verleiht, . ,

2) einem Replikon, das in diesem^;Bakterium funktionell

ist, und . .

.: . 3) einem Gen, das in diesem'Bakterium ein funktionelles Polypeptid exprimiert, : . ' '...

besteht, mit den Maßgaben, daß ti) der natürlich vorkommende Bacteriophage eine doppelsträngige DNA enthält, die eine Restriktionsstelle mit der gleichen Spezifität wie die dem Bakterium verliehene Restriktionsaktivität aufweist, : und (2) diese'Modifikationsaktivität in diesem Bakterium vor der Restriktionsaktivität exprimiert wird.

Im folgenden werden einige Ausdrücke definiert, die im Zusammenhang mit der Beschreibung der Erfindung verwendet werden: - . .; ·

' ·

' Funktionelles Polypeptid . ,

Hierbei' handelt es sich um ein gewi^nnbares bioaktives vollständig heterologes Polypeptid oder einen Polypeptidvorläufer, ein gewinnbares bioaktives Polypeptid, das ein heterologes Polypeptid und einen Teil oder ein Ganzes eines homologen Polypeptids enthält, ein gewinnbares bioaktives Fu-

' sionspolype'ptid, das ein₍ heterologes P.olypeptid und ein bioinaktivierendes homologes Polypeptid enthält, welches spezifisch 'gespalten werden kann, oder ein Polypeptid mit einer enzymatischen Funktion.

Verschmolzenes Genprodukt

Hierunter wird ein gewinnbares heterologes Polypeptid verstanden, das mit einem Teil oder Gesamten eines homologen ,λ Polypeptids verschmolzen ist.

Marker .

Hierbei handelt-es sich urn ein Gen oder eine Kombination

>

V- an Genen bekannter Funktion und Stellunc? an eineir, Chromo-

lö · -

som oder rekombinanten. DNA-Klonierungsvektor.

Trans formant . . ' . .' ' .

_ Hierbei handelt es sich um eine .Rezeptorwirtszelle, die ..

eine Transformation erfahren hat. . .

Sensitives Bakterium . ' ' T

Hierunter wird ein Bakterium verstanden, das bei'Wachsen- '

. "

lassen in Anwesenheit von Phagen infiziert wird. Restriktionsfragment

Hierunter versteht man irgendein lineares Teil oder Gesam-

tes- eines Plasmids, eines sonstigen Vektors oder einer .

Chromosomen-DNA, welche unter dem Einfluß von ein oder mehr Restriktionsenzymen gebildet werden,

.Insertionsisomeres

Hierbei handelt es sich um eines von zwei oder mehr möglichen rekombinanten DNA-Molekülen, äß.e, durch Insertion '

. - . . · -_ 6 -

eines DNA-Fragments an einer von zwei oder mehr kompatiblen Stellen der Rezeptor-DNA gebildet werden. ' .. -..

R-M-System ' ' '· ·' - , '"'. ' - ' '^! Hierunter versteht man ein Restriktioh-s- und Modifikationssystem. ; .- .

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Hierbei handelt es sich um den gegenüber Ampicillin resistenten Phenotyp. . ' '

ς ' . ..' . . ' Amp^w ; ; . . .

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. Hierbei handelt es sich-um-den gegenüber Ampicillin sensitiven Phenotyp. . ' .

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. Hierbei handelt es sich um den gegenüber Tetracyclin resis tenten Phenotyp. . . - ' . ',

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- ;... ' Hierbei handelt es sich um den gegenüber Tetracyclin sensitiven Phenotyp. ' ' >

-Das- H-hal I -Restriktions-Modi fixations -Sy ξ tem von Haemophi-QQ lus haemolyticus dient zur "beispielsmäßigen Erläuterung der Erfindung. Di« Gene, die das HhaII-R-M-System enthalten,, sind eng verknüpft und führen zur Synthese von HhaII-Re-

9 ζ 10 RL -0.2.1 G7 U

striktionsendonuclease und ferner auch einem Erkennungs- . Methylase-Enzym. Das Hhall-Restriktionsenz'ym erkennt und spaltet doppelsträngige DNA mit der Sequenz / die im folgenden als Hhall-Stelle bezeichnet wird, während das Erkennungsmodifikationssystem die Nucleotide methyliert, die die oben erwähnte Sequenz enthalten. Es ist für den Fachmann selbstverständlich, daß das Methylaseenzym-Modifikationssystem vor der Biosynthese des HhalI-Restriktionsenzyms exprimiert werden muß . Zellen, die das HhaII-R-M-System enthalten, sind hierdurch gegenüber einer Hhall-Digestion geschützt, ergeben jedoch eine Digestion von nichtmodifizierter doppelsträngiger Fremd-DNA, die die ·. Hhall-Stelle enthält. Das Hhall-R-M-System' ist daher zum Zwecke der beispielsmäßigen Erläuterung der Erfindung ideal. \

Insbesondere wird die vorliegende Erfindung beispielsmäßig erläutert durch Klonierung des. etwa 2,7 kb Psjtl-Restriktionsfragments des Plasmids pDI10.,in .das Plasmid ρΙΑ7Δ4Δΐ der Α-Kette von Insulin. Das Plasmid ρΙΑ7/\4Δ1 enthält, den ,Tryptophanpromotor von Escherichia coli, die Marker für eine Antibiotikumresistenz und ein Gen, das.ein verschmolzenes Genprodukt exprimiert, welches einen Teil des Escherichia coli K12 trp Ε-Proteins enthält, das mit der A-Polypeptidkette von Humaninsulin verschmolzen ist. Ein Restriktionsstellenplan und Funktionsplan des Plasmids ρΙΑ7Ζ\4Δΐ geht aus Fig. 1 der Zeichnung hervor.

Das etwa 2,7kb Pstl-Fragment des Plasmids pDHO enthält Gene für eine Restriktion und Modifikation mit der Spezifität von Hhall. Das Plasmid pDHO kann aus Escherichia coli K12'294/pDIlO isoliert werden, nämlich aus einem Stamm, der beim Northern Regional Research Laboratory, PeOria, Illinois,V.St.A. hinterlegt und Teil der dortigen ständigen Kulturensammlung ist. Dieser Stamm ist von dort als bevorzugte Quelle und als Reservoir für das Plasmid pDHO unter der Sammlungsnummer B-15097 ohne jegliche

1 Beschränkung frei beziehbar.

Das Symbol Δ bedeutet übereinkunftsgemäß eine Auslöschung. So'wird beispielsweise durch Hinweis auf ein Plasmid unter anschließender Angabe von ΔEcoRI-Xbal das Plasmid beschrieben, von welchem die Nucleotidsequenz/zwischen den . EcoRI- und_XbaI-Restriktionsenzymstellen durch Digestion mit diesen Enzymen entfernt worden ist. Der Einfachheit halber werden bestimmte Auslöschungen durch eine Zahl bezeichnet.-. Beginnend vom ersten Basenpaar (bp) der EcoRI Erkennungsstelle,· die. dem Gen für eine Tetracyclinresistenz im Stammplasmid pBR322 vorangeht, wird durch Δΐ daher eine Auslöschüng von bp 1 bis 30 (nämlich ΔEcoRI-Hindill), und somit eine Außerkraftsetzung des Tetracyclinpranotor/Operator-Systems bewirkt.Durch Δ2' wird eine Auslöschung von bp 1 bis 375 (nämlich AEcoRI-BamHI) bezeichnet und somit eine Entfernung von sowohl dem Tetracyclinpromotor/ Operator als auch eines Teils des Strukt.urgens, in welchem die Tetracyclinresistenz codiert ist. Mit Δ4 wird eine Auslöschung von bp.etwa 900 bis etwa 1500 vom trp-Operonfragment_bezeichnet, wodurch das Strukturgen für das trp-D-Polypeptid eliminiert wird.

Die Klonierung des das etwa 2,7kb Pstl-Hhall-R-M-Gen enthaltenden Restriktionsfragments des Plasmids pDIlO in das Plasmid ρΙΑ7Δ4Δΐ führt zu den neuen Plasmiden pPR26 und pPR27. Beide Plasmide schützen Bakterien,' wie-beispielsweise verschiedene Stämme von Escherichia coli, gegen eine Infektion vor natürlich vorkommenden Bakteriophagen. Ein Restriktionsstellenplan für jedes der Plasmide pPR26 und pPR2 7 geht aus Fig. 2 der Zeichnung hervor.

Zur weiteren beispielsmäßigen Erläuterung der vorliegenden Erfindung lassen sich auch die neuen Plasmide pPR28 und pPR1228 konstruieren. Die Plasmide pPR28 und pPR1228 ergeben sich durch Insertion des das etwa 2,7kb Ps_tI-Hha.il-R-M-Gen enthaltenden Restriktionsfragments des Plasmids pDIlO

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.1 in, das Plasmid ρΙΒ7Δ4ΔΪ. Das Plasmid ρΙΒ7Δ4Δ1 enthält den Tryptophanpromotor'von Escherichia coli, die Marker für die Antibiotikaresistenz und ein Gen, das ein verschmolzenes Genprodukt exprimiert, weiches einen Teil des Escherichia coli K12 trp-E-Proteins enthält, das mit der B-PoIypeptidkette von Humaninsulin verschmolzen ist. Auch die Plasmide pPR28 und pPR1228 schützen Bakterien, wie beispielsweise verschiedene Stämme von Escherichia coli, vor natürlich vorkommenden Bakteriophagen. Ein Restriktions-Stellenplan und ein Funktionsplan für das Plasmid ρΙΒ7Δ4Δ1 iund für jedes der Plasmide pPR28 und pPRl228 geht aus den Fig. 3 und 4 der Zeichnung hervor.

Durch Ligation des das etwa 6,2kb AvaI-BglII-HhaII-R-M-Gen enthaltenden Restriktionsfragments des Plasmids pPR2 7 ,und des etwa 2,3kb Aval-BgIII-Restriktionsfragments des Plasmids ρΗΙ7Δ4Δ1 ergibt sich das neue Plasmid pPR29. Das Plasmid ρΗΙ7Δ4Δ1 enthält den Tryptophanpromotor von Escherichia coli, die Marker für die Antibiotikumresistenz und sin Gen/, das ein verschmolzenes Genprodukt exprimiert, welches einen Teil, des Escherichia coli K12 trp-E-Proteins enthält, das mit dem Polypeptid,von Humanproinsulin verschmolzen ist. Das Plasmid pPR29 verleiht eine Restriktions und Modifikationsaktivität und schützt hierdurch Bakterien, wie beispielsweise verschiedene Stämme von Escherichia co-Ii, gegenüber einer Infektion durch natürlich vorkommende Bakteriophagen..Ein Restriktionsstellenplan und ein Funktionsplan für jedes der.Plasmide ρΗΙ7Δ4Δ1 und pPR29 geht aus den Fig. 5 und 6 der Zeichnung hervor. ·

Die Erfindung ist besonders vielseitig und läßt sich auf die Herstellung irgendeiner Substanz anwenden, deren Synthese entweder von einer DNA, die einen rekombinanten DNA-Klonierungsvektor enthält, oder von einem endogenen Stoff-' wechselweg bestimmt wird. Ein bevorzugter rekombinanter • DNA-Klonierungsvektor ist beispielsweise das Plasmid, obwohl selbstverständlich auch Bakteriophagen, Cosmide und sonstige Vektoren verwendet werden können. Erfindungsge-

· - ¹⁰ -

maß kann auch Gebrauch gemacht werden von Genen für irgendein Restriktions- und Modifikationssystem, sofern diese Gene so koordiniert exprimiert werden, daß die Modifika-· ^tionsfunktiön vor der Restriktionsfunktion exprimiert wird. Die Eignung der vorliegenden Erfindung ist unabhän-.' gig von Markern oder sonstigen Genen, die in den Klonierungsvektor kloniert sind, und die Erfindung kann daher angewandt werden auf rekombinante oder sonstige Stämme, die ein oder mehr in der Technik oder der Forschung eingesetzte Gene enthalten. .

Eine bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung macht von plasmidgetragenen Restriktions- und Modifika- . tionsgenen Gebrauch, die die Spezifität von Hhall zum ' Schutz von Bakterien vor natürlich vorkommenden Bakteriophagen haben. Zusätzlich können auch Gene für R-M-Systeme mit anderen Spezifitäten verwendet werden. Hierzu gehören beispielsweise Gene für das Pstl-R-M-System (Proc. Natl. Acad. Sei, USA 78(3) 1503 (1981)), das EcoRl-R-M-Systern (Fed. Proc. Fed. Am. Soc. Exp/Biol. 39, 1875 (1980) und ',- das Taql-R-M-System (Federation Proc. 41, 5427 (1982)). Gene für das Taql-R-M-Systern können in herkömmlicher Weise kloniert werden aus Thermus aquaticus YT-I (J.'. of Bacteriology 98(1),' 289 (1969), Typus stamm ATCC Nr,. 25104),. praktisch unter Anwendung der in Gene 3, 97 (1978) beschriebenen Methoden. Genauso wie beim HhaII-R-M-System müssen . auch die Modifikationsgene vor den Restriktionsgenen exprimiert werden. Die Verwendung der oben erwähnten Gene getrennt.oder in Kombination mit Genen „für das HhaII-System oder ein sonstiges R-M-System ergibt einen Schutz von Bakterien vor natürlich vorkommenden Bakteriophagen und liegt somit innerhalb des Rahmens der vorliegenden Erfindung. · .

Das vorliegende Verfahren zum Schutz von Bakterien vor natürlich vorkommenden Bakteriophagen kann auf Wirtszellen angewandt werden, die Vektoren enthalten, welche eine Viel-

fait brauchbarer Produkte exprimieren. Die R-M-Gene können zwar auf einem getrennten Vektor getragen werden, doch ist die Klonierung der R-M-Gene in ein Plasmid bevorzugt, das gleichzeitig ein Gen enthält, welches ,ein brauchbares Produkt exprimiert. Ein Gen, das ein brauchbares Polypeptid als Produkt exprimiert, kann ein natürlich vorkommendes, nicht natürlich vorkommendes oder zum Teil natürlich vorkommendes und zum Teil synthetisches oder nichtnatürlich vorkommendes Gen sein. Die Gene für ein R-M-System lassen

*^· sich vor allem in Plasmide klohieren, die ein Gen enthalten, das für folgendes codiert und folgende Produkte exprimiert: Humanpräproinsulin, Humanproinsulin, Α-Kette von Humaninsulin, B-Kette von Humaninsulin, Humanwachstumshormon, Nichthumanwachstumshormon, Rinderwachstumshormon, Nichthumaninsulin, Humaninterferon, Nichthumaninterferon, Virenantigen, Urokinase, irgendein Antibiotikumresistenz verleihendes Enzym, irgendein Peptidhormon, irgendein Peptidenzym oder irgendein sonstiges Peptid, das in der Forschung und Technik von Bedeutung ist. ... :

Bei den hierin beschriebenen speziellen Ausführungsformen der Erfindung werden Plasmidreplikationen und Expression von Polypeptidprodukten jeweils bestimmt von dem das Gen polA benötigenden Replikon von pMBl (Life Sei. 25, 80 7 bis 8-18 (1979)) und von dem trp-Promotor. Es lassen sich

ι· . '

auch andere Replikone und Promotoren verwenden, sofern sie im jeweiligen Bakterientransformanten, der geschützt werden soll, funktionell sind. Der Fachmann weiß- oder.kann leicht feststellen, welche- Replikone und Promotoren für eine Anwendung in einem bestimmten Bakterium bevorzugt sind. Zu Beispielen für andere Replikone gehören unter anderem Replikone von CoIEl, NRl, RK2, RK6, PSClOl, RPl, RP4, F und dergleichen unter. Einschluß von Bakteriophagen, die sich in Es'cherichia coli K12 replizieren. Zu Beispielen für andere Promotoren gehören'unter anderem der Promotor für das Bakteriophage \P_T , der Lipoproteinpromotor, der lac-Promotor, der Ribosomenprotein- oder RNA-Promotor

. '" . - 12 - · .·

und praktisch alle sonstigen .Promotoren*. Es liegt für den •Fachmann auf der Hand, daß sich in den das R-M-Gensystem enthaltenden erfindungsgemäßen Vektoren eine' Reihe von Replikonen und Promotoren konstruieren und verwenden läßt.

Escherichia coli ist infolge seines Reichtums an genetischer und biochemischer'Information ein für die Zwecke der vorliegenden Erfindung bequemer und-, bevorzugter. Bakterien-. wirt. Escherichia coli Kl2 ist ferner auch die Wirtsz.elle der Wahl für die Bioproduktion von Verbindungen durch rekombinante DNA-Technik, so daß die Anwendung der vorliegenden Erfindung auf Stämme dieses Organismus besonders zweckmäßig ist. Wie bereits oben erwähnt, traten bei einer großtechnischen Fermentation von Escherichia coli bisher immer Schwierigkeiten infolge einer Phageninfektion auf'.Dieses Problem wird nun durch die vorliegende Erfindung praktisch gelöst, so daß hierdurch die großtechnische Produktion biosynthetischer Produkte'möglich wird. .... .

Das erfindungsgemäße Verfahren ist nicht auf irgendeinen Genus, eine Art oder einen Stamm¹ beschränkt, sondern es .. läßt sich auf irgendwelche Mikroorganismen anwenden, in denen Gene für ein R-M-System kloniert werden können. So ist die Erfindung beispielsweise auf Prokaryo.nten allgemein und insbesondere auf Bakterien anwendbar, zu denen unter anderem gehören Escherichia coli, Escherichia coli K12,. Escherichia coli K12 294 (Proc. Nat. Acad. Sei. USA .76, 106 (1979)),Escherichia coli K12 RV308 (J.'Mol. Biol. 139, 147 (1980)),Escherichia coli K12 C600 (Bacteriol.

Rev. 3,6, 526 (1972)), Escherichia coli K12 "C600R,-M " (Proc.

K K

Nat. Acad. Sei. USA 71, 1Ό30 (1974)1, Escherichia coli Kl'2 HBlOl (Gene 2,- 75 (1977)), Escherichia coli K12 BE827 ATCC '31911, Bacillus, Bacillus subtilis, Bacillus thuringiensis, Bacillus megaterium,Staphylococcus, Streptococcus, Actinomyceten, Streptomyces, Agrobacterium, Serratia, Pseudomonas und irgendwelche sonstige Bakterien, die einer Infektion durch Bakteriophagen zugänglich sind und in de-

-13-nen Gene für ein R-M-System kloniert werden können.

Zu bevorzugten erfindungsgemäßen Klonierungsvektoren gehören die Plasmide pPR27, pPR28 und pPR29, und bevorzugte Transformanten sind unter anderem Escheriehia coli K12 RV308/pPR27, Escherichia coli K12 RV308/pPR28 und Escheriehia coli K12 RV308/pPR29. Diese und alle sonstigen Ausführungsformen der Erfindung haben das. gemeinsame Merkmal eines Schutzes von Bakterien gegenüber einer Infektion

^ durch natürlich vorkommende Bakteriophagen. Die Erfindung ermöglicht daher eine großtechnische Fermentation von Mikroorganismen, die rekombinante.DNA enthalten, ohne daß dabei ein maßgebliches Risiko einer Phageninfektion, einer Lyse und eines damit verbundenen Verlusts an Biosynthese-

vermögen besteht.

Ausführungsbeispiele .

Die Erfindung wird im folgenden anhand von Beispielen weiter erläutert. Darin werden, fails sich dies anbietet, sowohl Erklärungen als auch Beschreibungen der tatsächlichen Verfahren zum Aufbau der Erfindung angegeben.

Beispiel 1 Isolierung und.Herstellung des Plasmids pDIlO

Man löst etwa 1 μg Plasmid pDIlO DNA (isoliert aus Escherichia coli^K12 294/pDIlO, NRRL B-15097, unter praktischer Anwendung des in J. Mol. Biol. 36, 185 (1968) beschriebenen Isolxerungsv'erf ahrens) in TE-Puffer (1 mMol EDTA (Ethylendiamintetraacetat) und 10 mMol Tris-HCl, pH 7,8 bis zu einer Konzentration von etwa 20 pg/ml. Bei Escherichia coli K12 294 handelt es sich um einen R, M, -Wirt, so daß sich Plasrnid-DNA unter Methylierung gemäß der EcoK-Spezifität isolieren läßt. Man verdünnt etwa 5 μΐ der Lösung (die etwa 0,1 μg DNA enthält) auf 50 μΐ in SSC/10

. . - ,14 -

(SSC = Standard-Ko.chsalz-Citrat-Puf fer, wobei SSC/10 15 mMol NaCl und 1,5 mMol Natriumeitrat, pH 7 enthält). / Anschließend vermischt man etwa 25 μΐ der SSC/10-DNA-Lösung mit 50 μΐ einer leistungsfähigen Suspension von

Escherichia coli Kl2 C60.0R_k"M_k". . ^;

Unter Anwendung herkömmlicher Verfahren stellt man eine leistungsfähige Suspension von Escherichia coli K12 C600-' . R_V~M ~ her (Proc. Nat. Acad. Sei. USA 71, 1030 (1974)). Hiernach unterteilt man frische Übernachtkulturen in^ L-Brühe (Miller 1972, Experiments in Molecular Genetics, . Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, V.St.A.) in 1:10 Subkulturen in frischer L-Brühe und läßt diese dann 1 Stunde bei 37⁰C wachsen. Es werden

*° insgesamt 660 Klett-Einheiten an Zellen geerntet, mit 2,5 ml 150 millimolarem NaCl gewaschen/in 2,5 ml 150 millimolarem CaCl- suspendiert und 20 Minuten bei Raumtemperatur ; bebrütet. Die Zellen werden geerntet, in 0,5 ml einer "Lösung, aus 150 mMol CaCl-' und 10 % Glycerin'resuspendiert, 3 bis 5 Minuten auf Eis gekühlt und dann eingefroren·. Die Suspensionen der eingefrorenen leistungsfähigen Zellen werden bis zu ihrem Gebrauch in flüssigem Stickstoff aufbewahrt. Eine Konservierung und Aufbewahrung führt zu keiner Beeinträchtigung der Entwicklungsfähigkeit oder Häufigkeit der Transformation durch kovalent geschlossene kreisförmige Plasmid-DNA. Die Zellsuspension wird in einem Eisbad aufgetaut und zur Transformation mit einem halben Volumen an DNA vermischt. Das Transformationsgemisch wird 20 Minuten auf Eis abgekühlt, 1 Minute bei 42°C einem Warmeschock unterzogen, 10 Minuten auf Eis abgekühlt,, dann , mit 5,7 Volumina L-Brühe verdünnt und schließlich 90 Mi- nuten 'bei 37⁰C bebrütet.

Die Transformanten werden isoliert durch Wachsenlassen auf ,35 L-Agar, der Tetracyclin in einer Menge von 12,5 μg/ml enthält. Zum Nachweis der Tetracyclinresistenz und der Ampicillinsensitivität werden entsprechende Isolate unter-

Ί sucht, und diese Isolate stellen die gewünschten Transfor-. manten von Escherichia coli K12 C600R, M, /pDHO dar. Unter Verwendung geeigneter Kolonien isoliert man kovalen.t geschlossene kreisförmige DNA nach dem in J. Mol. Biol. 36, 185 (1968) beschriebenen Verfahren. Die Struktur des Plasmids wird durch kartographische Erfassung der Restriktionsstellen belegt.

Beispiel 2 \

ίο .· ' . ' ·

Konstruktion des Plasmids ρΙΑ7Δ4Δΐ A. Konstruktion des Plasmids pBRHtrp

Das Plasmid pGMl ' trägt den Tryptophanoperon von Escherichia coli, welcher die Auslöschung ALE1413 (J. Bacteriology 1457- .bis 1.466 (1-978)) enthält und exprimiert daher ein Fusionsprotein aus den ersten sechs Aminosäuren des trp-Führers und etwa dem letzten Drittel des trp-E-Polypeptids (das im folgenden als LE' bezeichnet wird) und auch das trp^-D-Polypeptid insgesamt, und dies alles unter der Steuerung durch das trp-Promotor-Operätor-System. Escherichia coli K12 W3110tna2trp-A102/pGMl ist bei der American Type Culture Collection (ATCC Nr. 31622) hinterlegt, und von diesem Stamm läßt sich pGMl in herkömmlicher Weise entfernen, so daß dieser bei den im folgenden beschriebenen Verfahren verwendet werden kann..

Man verdaut etwa 20 μg des Plasmids mit dem Restriktionsenzym Pv.uII, das das Plasmid an fünf Stellen spaltet. Die Genfragmente werden dann mit EcoRI-Linkern vereinigt (die aus einem selbstkomplementären Oligonucleotid mit der Sequenz pCATGAATTCATG bestehen), wodurch sich eine EcoRI-Spaltstelle für die spätere Klonierung in ein Plasmid ergibt, das eine EcoRI-Stelle enthält. Die aus pGMl erhaltenen 20 μφ an DNA-Fragmenten werden mit 10 Einheiten T.-DNA-Ligase in Anwesenheit von 200 pMol des in Stellung 5¹ phosphorylierten synthetischen Oligonucleotxds pCATGAATTCATG

und in 20 μΐ¹ T . -DNA-Ligase-Puf f er ( 20 mMol Tri.s, pH 7,6, 0,5 mMol ATP, 10 mMol MgCl₃, 5 mMol Dithiothreit) über. Nacht bei 4°C behandelt. Die Lösung wird dann 10 Minuten auf 70⁰C erwärmt, um die Ligation zu stoppen.' Die Linker werden durch Verdauung mit EcoRI abgespalten, und die erhaltenen Fragmente, die jetzt Eco_RI-Enden. aufweisen, werden durch Elektrophorese mit 5 %-igem Polyacrylamidgel (im folgenden als PAGE bezeichnet) aufgetrennt. Die drei größten Fragmente werden vom Gel isoliert, indem man das Ganze zuerst mit Ethidiumbromid anfärbt, die Stellung der Fragmente dann mit Ultraviolettlicht ermittelt und die interessierenden Teile schließlich vom Gel ausschneidet. Jedes Gelfragment gibt man zusammen mit 300 μΐ 0,IxTBE in einen Dialyseschlauch und unterzieht es einer.-Elektröphorese bei 100 V über eine Zeitdauer von 1 Stunde in 0,IxTBE-Puffer (der TBE-Puffer enthält 1.0,8 g Trisbase, 5,5 g Borsäure und.0,09 g Na₃EDTA in 1 Liter H₂O). Die wäßrige Lö- . sung wird vom Dialyseschlauch gesammelt, mit Phenol extrahiert, mit Chloroform extrahiert und mit Natriumchlorid

^Q auf eine Molarität von 0,2 eingestellt. Die DNA wird dann nach Fällungymit Ethanol in Wasser gewonnen., Das den trp-Promotor/Operator -enthaltende Ge'n mit klebrigen EcoRI-Enden wird durch das im folgenden beschriebene Verfahren identifiziert, das die Insertion von Fragmenten in ein gegen-

²^ über Tetracyclin sensitives Plasmid beinhaltet, das nach erfolgter Promotor/Operator-Insertion gegenüber Tetracyclin resistent. wird. Alle beschriebenen Isolierungen von DNA-Fragmenten werden durch die oben beschriebene PAGE '

unter nachfolgender Elektroelution durchgeführt. . '

B. Konstruktion des Plasmids pBRH trp, das unter der Steuerung durch den trp-Promotor-Operator eine Tetracyclinresistenz exprimiert, und Identifizierung sowie Amplifikation des oben unter Abschnitt A. isolierten und den trp-Promotor-Operator enthaltenden DNA-Fragments

Das Plasmid pBRHl (Nucleic Acids-Research 6, 3267 bis 3287

(1979) exprimiert eine Ampicillinresistenz und enthält das Gen für eine Tetracyclinresistenz, exprimiert diese Resistenz jedoch mangels einer Verbindung mit Promotor nicht. Das Plasmid.ist daher gegenüber Tetracyclin sensitiv- Durch Einführung eines Promotor-Öperator-Systems in die EcoRI-Stelle kann das Plasmid gegenüber Tetracyclin resistent gemacht werden.

Das Plasmid pBRHl wird mit EcoRI verdaut. Das Enzym wird durch Extraktion mit Phenol und anschließende Extraktion mit Chloroform entfernt, worauf die DNA nach Fällung mit Ethanol in Wasser gewonnen wird. Das erhaltene DNA-Molekül wird in getrennten Reaktionsgemischen mit jedem der drei gemäß obigem Beispiel 2A erhaltenen DNA-Fragmente vereinigt und in der oben beschriebenen Weise mit T.-DNA-Ligase verknüpft. Die im Reaktionsgemisch vorhandene DNA wird unter Anwendung üblicher Verfahren (Proc. Nat. Acad. Sei. USA 71, 3455 bis 3459 (1974)) zur Transformation leistungsfähiger Escherichla coli K12 294 verwendet, und die Bakterien werden dann auf LB-Platten (Miller 1972, Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, V.St .A. ) auf gezogen,, die 20 μg Ampicillin pro ml und 5 pg Tetracyclin pro ml enthalten.

. Man selektiert mehrere gegenüber Tetracyclin resistente Kolonien und isoliert die Plasmid-DNA, welche als pBR.H-trp bezeichnet wird. Die Anwesenheit, des gewünschten Fragments wird durch Restriktionsenzymanalyse bestätigt. Das Plasmid pBRH .trp exprimiert ß-Lactamase, verleiht ei'ne Resistenz gegenüber Ampicillin und enthält ein DNA-Fragment, das den trp-Promotor/Operator enthält. Das DNA-Fragment codiert ferner für ein erstes Protein (welches als LE¹ bezeichnet wird), bei dem.es sich um ein Verschmelzungsprodukt aus den ersten sechs Aminosäuren des trp-Führers und etwa dem letzten Drittel, des trp-E-Polypeptids handelt, für ein zweites Protein (das als D¹ bezeichnet wird), welches etwa der. ersten Hälfte des trp-D-Polypeptids entspricht, und

·' - 18 -

für ein drittes Protein, für das das Gen für die Tetracyclinresistenz codiert.

C.'Konstruktion des Plasmids ρΞΟΜ7Δ2

Das Plasmid pBRH-trp wird mit EcoRI-Restriktionsenzym verdaut und das »erhaltene·-Fragment vereinigt man nach Isolierung durch PAGE und Elektroelution mit dem mit EcoRI verdauten Plasmid pSOMll (Sei. 198, 1056 (1977), GB-OS 2 007 676A). Das Gemisch -wird mit T. -DNA-Ligase verknüpf t .· und die-erhaltene DNA in'der. vorher beschriebenen Weise in Escherichia coli K12 294 transformiert. Transformantenbakterien werden auf Ampicillin enthaltenden Platten selektiert, und die erhaltenen,gegenüber Ampicillin resistenten

Kolonien unterzieht man einem-Screening durch Koloniehybridisierung (Proc. Nat. Acad. Sei. USA 72, 3951 bis 3965 (1975))· Das den trp-Prömotor/Operator enthaltende Fragment, welches aus pBRH trp isoliert und dann mit P radioaktiv markiert worden ist,wird als Probe beim obigen Verfahren

verwendet. Mehrere Kolonien erweisen sich bei der Koloniehybridisierung als positiv und werden daher selektiert. Man isoliert die.Plasmid-DNA und bestimmt die Orientierung der inserierten Fragmente durch Restriktionsanalyse unter Verwendung der Enzyme BgIII und BamHI bei einer Doppelver- ° dauung. Man läßt Kolonien,· die das gewünschte Plasmid mit dem trp-P-romotor/Operator-Fragment in der geeigneten Orientierung enthalten, in LB-Medium (Miller 1972, Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold „ ' Spring Harbor, New York, V.St.A.) wachsen,- das 10 μg Ampi- ' cillin pro ml enthält. Das gewünschte Plasmid wird als pSOM7A2. bezeichnet und für die im folgenden beschriebenen nachfolgenden Konstruktionen verwendet. ,

. D. Konstruktion des Plasmids pTrp24

· ,

1. Konstruktion eines Genfragments, das Kodone für die Distalbereiche des LE'-Polypeptids mit BqIII- und EcoRI-

Restriktionsstellen, am 5'-Ende bzw. 3'-Ende des Codierungsstrangs enthält

Das Plasmid pSOM7A2 wird, mit HindiII verdaut und.dann einer Verdauung mit λ-Exonuclease (einer 5'- bis 3'-Exonuclease) unter solchen Bedingungen unterzogen, daß es hierdurch zu. einer. Verdauung nach der BgIII-Restriktionsstelle innerhalb des LE'-Codierungsbereichs kommt. Man löst etwa 20 μg Hindlll verdautes pSOM7A2 in Puffer (20 mMol Glycinpuffer, pH 9,6, 1 mMol MgCl_ und 1 mMol ß-Mercaptoethanol)-Das erhaltene Gemisch wird bei Raumtemperatur 60 Minuten mit 5 Einheiten λ-Exonuclease behandelt. Das Reaktionägemisch wird dann mit Phenol extrahiert, mit Chloroform ex- <

' ' -. ° »' '

trahiert und mit Ethanol gefällt. . .

· . '

Zur Bildung eines EcoRI-Rests am distalen Ende des LE¹-

3 2 ^: ' . Genfragments wird ein Primer pCCTGTGCATGAT unter Anwen-

dung der verbesserten Phosphotriester-Methode (Proc. Nat. Acad. Sei. USA 75, 5765 (1978)) synthetisiert und an das einzelsträngige Ende des LE'-Genfragments hybridisiert, das von der Verdauung mit λ-Exonuclease stammt. Zur Hybridisierung löst man 20 μg des mit λ-Exonuclease behandelten HindllI-Verdauungsprodukts des Plasmids pSOM7A2 in 20 μΐ HO und' vereinigt das Ganze mit 6 μΐ einer Lösung, die etwa 80 pMol des oben beschriebenen, in Stellung 5' phosphorylierten Oligonucleotids enthält. Das Synthese-' fragment wird an das 3 ' -Ende der LE'-Codierungss.equenz hybridisiert, und der zurückbleibende einzelsträngige Teil des LE'-Fragments wird mit Klenow-Polymerase I unter Verwendung von dATP, dTTP, dGTP und dCTP aufgefüllt. Bei KIe- .. now-Polymerase I handelt es sich um das Fragment, das sich durch proteolytische Spaltung von DNÄ-Polymerase I ergibt. Es enthält die 5' -» 3' -Polymeris'ationsaktivität und die 3' -* 5'-exonucleolytische Aktivität, nicht jedoch die 5' — 3'-exonucleolytische Aktivität des Stammenzyms (Kornberg, 1974, W.H. Freeman and Co., SFO, 98).

Hierzu wird das Reaktionsgem'isch auf 50°C erwärmt und lang-

sam auf 10⁰C abgekühlt, worauf man 4 μΐ Klenow-Enzym zugibt. Nach 15 Minuten langer Inkubation bei Raumtemperatur , und anschließender 30 Minuten langer Inkubation bei 37⁰C

. wird die Umsetzung durch Zugabe von 5 μΐ 0,25 molarer EDTA gestoppt. Das Reaktionsgemisch.-wird mit Phenol extrahiert,

' mit Chloroform extrahiert und mit Ethanol gefällt. Die DNA wird dann mit dem Restriktiohsenzym BgIXI gespalten, und die Fragmente werden durch PAGE abgetrennt. Ein'vom Gel

3 2

erhaltenes Autoradiogramm ergibt ein mit P markiertes

¹^ Fragment mit der erwarteten Länge von etwa 470 bp, das durch Elektroelution gewonnen wird. Dieses Fragment LE¹(d) hat einen BgIII-Terminus und ein stumpfes Ende, das mit dem Anfang des Primers zusammenfällt.

-2. Konstruktion des Plasmids pThal

Das Plasmid pTh&l wird konstruiert durch Insertion eines 'Synthesegens für Thymosina-1 in das Plasmid pBR322. Die . Synthe'se des für DNA codierenden' ThymosinCtl beinhaltet eine Synthese \und anschließende Ligation der 16 Oligonucleotide (T, bis T,_fi.) , die durch die doppelköpfigen Pfeile in Fig. 7 der.Zeichnung angegeben sind. Ein Met-Kodon ATG wird am N-Terminus inseriert und die 5'-Enden werden mit einzelsträngigen kohäsiven Termini versehen, um eine Verbindung mit Plasmiden -zu erleichtern, die mit EcoRI und BamHI gespaltet werden. Wie ohne weiteres erkennbar, erleichtert die J3g_lII-Stelle im Zentrum des Gens- die Analyse der? rekombinanten Plasmide. "

Die Oligodesoxyribonucleotide T₁ bis T,, werden nach der . i Ib

modifizierten Phosphotriester-Methode unter Verwendung vollständig geschützter Tridesoxyribonucleotid-Baublöcke ,synthetisiert (Science 198, 1055 (1977) und Proc. Nat. Acad. Sei. USA 75, 5765 (1978)). Die verschiedenen Oligodeaoxyribonucleotide gehen aus der folgenden Tabelle I hervor. .

TABELLE I

Synthetische Oligonucleotide für das Gen	Sequenz ·	von ThymosinCt-l	HPLC-Ana- lyse,Re- tentions- zeit (min)*
Verbindung	A-A-T-T-C-A-T-G-T-C	Länge	17,4
Tl	T-G-A-T-G-C-T-G-C-T-G-T-T-G-A	10	24,3
T2	T-A-C-T-T-C-T-T-C-T-G-A	15 ·	20,3
T3	G-A-T-T-A-C-T-A-C-T-A-A-A	12	22,0
T4	G-C-A-G-C-A-T-C-A-G-A-C-A-T-G	13	24,8
T5	G-A-A-G-T-A-T-C-A-A-C-A .	15	20,1
V '	A-G-T-A-A-T-C-T-C-A-G-A-A	12	22,6
T7	A-A-G-A-T-C-T-T-T-A-G-T	13	20,2
T8	G-A-T-C-T-T-A-A-G-G-A-G	12	20,4
T9	A-A-G-A-A-G-G-A-A-G-T-T	12	21,1
T 10	G-T-C-G-A-A-G-A-G-G-C-T	' 12	20,5
T 11	G-A-G-A-A-C-T-A-A-T-A-G	12	20,4
T 12	C-T-T-C-T-T-C-T-C-C-T-T	12	19,9
T 13	T-T-C-G-A-C-A-A-C-T-T-C	12	20,5 .
T 14	G-T-T-C-T-C-A-G-C-C-T-C	12	20,2
T 15	G-A-T-C-C-T-A-T-TrA	12	17,2
T16	10

Bei Raumtemperatur gemessen

•1 Die obige Synthese wird durch das folgende Verfahren zur Herstellung des Fragments T, ,. beispielsmäßig erläutert, das aus Fig. 8 der Zeichnung hervorgeht.. Die zur Synthese von T, j. verwendeten verschiedenen Nucleotidfragmente sind in dieser, Fig. 8 mit Ziffern bezeichnet. Die darin enthaltenen Abkürzungen haben folgende Bedeutungen: TPSTe = 2,4,6-Triisopropy!benzolsuIfonyltetrazol, BSA = Benzolsulfonsäure, TLC = Dünnschichtchromatographie, HPLC = Hochleistungsflussigkeitschromatdgraphie, DMT = 4,4'-Dimethoxytrityl, CE = 2-Cyanoethyl, R. = p-Chlorphenyl, Bz = Benzoyl, An = Anisoyl, iBu = Isobutyryl, Py = Pyridin, AcOH = Essigsäure und Et-.N = Triethylamin. · . ,

Die vollständig geschützten Tridesoxyribonucleotide 4 (85 mg, 0,05 mMol) und 2 (180 mg, 0,1 mMol.) werden an den

5'-Hydroxylgruppen durch Behandlung mit 2 %-iger BSA in . Gemischen aus 7 Volumenteilen Chloroform und 3 Volumentei- · 1en Methanol (10 ml bzw. 20 ml) über eine Zeitdauer von Minuten bei 0°C von den Schutzgruppen befreit. Die Umsetzungen werden durch Zugabe von gesättigtem wäßrigem Ammoniumbicarbonat (2 ml) gestoppt, worauf man mit Chloroform (25 ml) extrahiert und mit Wasser (zweimal je 10 ml) wäscht. Die' organischen Schichten werden getrocknet (Magnesiumsulfat), auf geringe Volumina (etwa 5 ml) eingeengt.

und durch Zusatz von Petrolether (Siedebereich 35 bis 60⁰C) gefällt. Die farblosen Niederschläge werden durch Zentrifugation gesammelt .und unter Vakuum in einem Exsikkator ge-.trocknet, wodurch man zu den Produkten 6. bzw. 8 gelangt-,, bei denen es sich au'fgrund einer TLC mit Sil-iciumdioxidgel (Merck 60 F254, Chloroform/Methanol, 9:1) um homogene Materialien handelt. .

Die Trimeren 1 und 3 (27 0 mg, 0,15 mMol bzw. 145 mg, 0,075 mMol) werden zur Umwandlung in ihre Phosphodiester (5 und 3'5 7) mit Gemischen aus einem Volumenteil Triethylamin, drei Volumenteilen Pyridin und einem Volumenteil Wasser (10 ml) während 25 Minuten bei Umgebungstemperatur behandelt. Die

Reagenzien werden auf einem Rotationsverdampfer entfernt und die Rückstände zur Trocknung wiederholt mit wasserfreiem Pyridin (dreimal je 10 ml) eingedampft. Das Trimere 8 (0,05 mMol) und das Trimere 7 vereinigt man mit TPSTe (50 mg, 0,015 mMol) in wasserfreiem Pyridin (3 ml) und beläßt das Reaktionsgemisch zwei Stunden unter Vakuum auf Raumtemperatur. Eine TLC-Änalyse zeigt, daß- 95 % des Trimeren 8 · in das hexamere Produkt überführt worden sind (wie sich durch Sichtbarmachung unter Detektion der DMT-Gruppe^Jer-

^Q gibt, indem man das Ganze mit 10 .%-iger wäßriger Schwefelsäure besprüht und auf 60°C erwärmt). Die Umsetzung wird durch Zugabe von Wasser (1 ml) unterbrochen und das Lösungsmittel unter verringertem Druck verdampft. Nach Entfernung des Pyridins durch gleichzeitige Verdampfungen mit.Toluol

!5 wird das Hexamere in der 5'-Stellung mit 2 %-iger BSA

18·ml) in der oben für die Trimeren 4 und 2 beschriebenen Weise von den Schutzgruppen befreit. Das Produkt 10 wird über eine mit Siliciumdioxidgel gefüllte Säule (Merck 60 H, 3,5 χ 5 cm) durch stufenweise Gradientenelution mit einem Gemisch aus Chloroform und Methanol (98 ': 2 bis 95 : 5,.

V/V) gereinigt. Die das Produkt 10 enthaltenden Fraktionen., werden zur Trockne eingedampft. .

In ähnlicher Weise kuppelt man auch das Trimere 5 an das Trimere 6 und reinigt das vollständig geschützte Produkt direkt über Siliciumdioxidgel. Diese Verbindung wird dann am 3'-Ende unter Verwendung eines Gemisches aus Triethylamin, Pyridin und Wasser in der oben beschriebenen Weise . von Schutzgruppen befreit, wodurch man zum Fragment 9 gelangt.

Die Hexameren 9 und 10 werden schließlich in wasserfreiem Pyridin (2 ml) mit TPSTe (75 mg, 0,225 mMol) als Kondensationsmittel gekuppelt. Nach beendeter Kupplungsreaktion (4 Stunden, Raumtemperatur) wird das Gemisch auf einem Rotationsverdampf er eingedampft und der Rückstand über Siliciumdioxidgel chromatographiert.. Durch Fällung mit .Petrol-

..- .. - 24- - . .

ether gelangt man zum Produkt 11 (160 mg),.das in der TLC homogen erscheint. Ein Teil der Verbindung 11 (20 mg) in Pyridin (0,5 ml) wird zur vollständigen Befreiung von Schutzgruppen zuerst mit.konzentriertem Ammoniumhydroxid (7 ml, 8 Stunden,. 6O⁰C) und dann in 80 %-iger Essigsäure (15 Minuten, Umgebungstemperatur) behandelt. Der nach Verdampfung der Essigsäure zurückbleibende feste Rückstand wird in 4 %-igem wäßrigem Ammoniumhydroxid (V/V, 4 ml) gelöst und die Lösung mit Ethylether (dreimal je 2 ml) extrahiert. Man engt die wäßrige Schicht auf ein Volumen von 1.bis 2 ml ein und unterzieht einen Teil hiervon zur Reinigung von 12 einer HPLC. Die Fraktionen, die dem über-. wiegenden Maximum entsprechen, werden zusammengefaßt (etwa - 2 O.D. „j..-Einheiten) und auf etwa 5 ml eingeengt. Das Endprodukt 12 wird über Biogel P-2 .(1,5 χ 100,cm) unter Elu- ·

tion.mit 20 %-igem wäßrigem Ethanol entsalzt, worauf man ' , das Eluat zur Trockne eindampft und den Rückstand wieder in Wasser (200 μ1·) suspendiert und so zu einer Lösung von A.L. =10 gelangt. Die" Sequenz, von 12 wird durch zweidimensionale Sequenzanalyse bestätigt. -

Aus den 16 synthetischen Oligonucleotiden wird das vollständige Gen von Thymosinal unter Anwendung von Methoden aufgebaut, wie sie im einzelnen bereits bekannt sind für Somatostatin (Science 198, 1056 (1977)), Insulin (Proc. , Nat: Acad. Sei. USA 76, 106 (1979)) und Wachstumshormon (Nature 281, 544 (1979)). Hierzu phosphoryliert man Mengen von jeweils 10 μq der Oligonucleotide T~ bis T_1ς quantita-

tiv mit /J- P/-ATP (New England' Nuclear) in Gegenwart von T₄-Polynucleotidkinase (Nature 281, 544 (1979)), wodurch man zu spezifischen Aktivitäten von etwa 1 Ci/mMol gelangt. Radiomarkierte Fragmente werden durch Gelelektrophorese unter Verwendung von 20 % Polyacrylamid und 7 molarem Harnstoff gereinigt, wobei Sequenzen der eluierten Fragmente durch zweidimensionale,Elektrophorese/Homöchromatographie (Nucleic Acids Res. 1, 331 (1974)) von Schneckerivenom-Teilverdauungsprodukten nachgewiesen werden. Die Fragmente T,

und-T₁, werden unphosphoryliert gehalten,, um eine unerwünschte Polymerisation während anschließender Ligations- verfahren möglichst gering zu halten. Diese Oligonucleotide (jeweils 2 μg) werden in vier Gruppen aus jeweils vier Fragmenten (siehe Fig. 9 der Zeichnung) durch T. DNA-Ligase. unter Anwendung bekannter-Verfahren verknüpft (Proc. Nat. Acad. Sei. USA 76,106 (1979)). Die Reaktionsprodukte werden durch Gelelektrophorese auf einem 15 %-igen PoIyacrylamidgel, das 7 molar an Harnstoff ist, gereinigt .

(Proc·. Nat. Acad. Sei. USA 71, 3455 (1977)). Die vier isolierten Produkte werden miteinander verknüpft, und das Reaktionsgemisch wird durch Gelelektrophorese mit 10 %-igem Polyacrylamid aufgetrennt. Eine DNA im Größenbereich des Gens von. Thymosinccl (90 bis- 105 Basenpaare) wird elektro-

.15 eluiert. < ,

Das Plasmid pBR3 22 (0,5 ^g) wird mit BamHI- und EcoRI-Restriktionsendonucleasen behandelt, und die Fragmente werden ^: durch Gelelektrophorese mit Polyacrylamid aufgetrennt?. Das größere Fragment-wird vom Gel durch Elektroelution gewonnen und dann mit/der. Synthese-DNA verknüpft (Nature 281, 544 (1979)). Mit diesem Gemisch transformiert man dann Escherichia coli K12 294. 5 % des Transformationsgemisches zieht man auf LB-Platten auf, die 20 ^g Ampicillin pro ml enthalten. Die dabei erhaltenen vier gegenüber Ampicillin resistenten Kolonien sind gegenüber Tetracyclin sensitiv, was auf eine Insertion in das Gen für die Tetracyclinresistenz hinweist. Eine Analyse der Plasmide aus diesen vier Kolonien zeigt, daß das Plasmid, welches als pThal bezeichnet wird, jeweils enthält (a) eine BIc[II-Stelle, die im pBR322 . selbst nicht zu finden ist, was auf die Anwesenheit des

. . Gens von Thymosin CtI hinweist, wie dies aus Fig. 7 hervorgeht, und (b) ein Fragment mit einer Größe von etwa 105 Basenpaaren, das durch BamHI/EcoRI-Spaltung gebildet wird.

Der Konstruktionsweg ,für das Plasmid pThal (nicht maßstabsgetreu) geht aus Fig. 9 der Zeichnung hervor, worin die starken Punkte die 5'-Phosphatgruppen angeben.

3. Reaktion des behandelten pThO-1- und LE'(d)-Fragments

Das' Plasmid pThal enthält ein Gen für eine Ampicillinresistenz und ein Strukturgen für Thymosin CLl, das an seinem · · 5'-Codierungsstrangende in eine EcoRI-Stelle und an seinem 3'-Ende in eine BamHI-S teile kloniert ist. Das Thymosi'ngen enthält auch noch eine Bglll-Stelle. Zur Bildung eines Plasmids, das zu einer Aufnahme des in obiger Weise hergestellten LE'(d)-Fragments befähigt ist, unterzieht man pThCtl zuerst einer Verdauung mit EcoRI und dann einer Reaktion mit Klenow-Polymerase I mit dTTP und dATP, um die EcoRI-Reste stumpf zu machen. Durch Verdauung des erhaltenen' Produkts mit BgIII entsteht ein lineares DNA-Fragment, das das Gen für.die Ampicillinresistenz enthält und an seinen entgegengesetzten Enden über einen klebrigen BgIIJ-Rest und ein. stumpfes Ende verfügt. Das erhaltene Produkt läßt sich durch Umsetzung mit dem LE'(d)-Fragment, das ein . . BgIII klebriges Ende und ein stumpfes Ende enthält, in Gegenwart von T.-Ligase unter Bildung des Plasmids pTrp24 rezirkulieren. Hierdurch wird an der Stelle, an der es zu einer stumpfendigen Ligation kömmt, eine EcoRI-Stelle ge- . bildet.

E. Konstruktion des Plasmids pSOM7A2A4

Durch aufeinanderfolgende Verdauung von pTrp24 mit.BgIII und EcoRI und nachfolgende PAGE sowie Elektroelution erhält man ein Fragment mit Kodonen für das LE'(d)-Polypep-. tid mit einem klebrigen Ende BgIII und einem- klebrigen Ende EcoRI benachbart zu seinem 3'-Codierungsterminus. Das LE¹(d)-Fragment läßt sich.in die Bglll-Stelle des Plasmids pSOM7A2 klonieren, wodurch ein LE'-Polypeptid/Somatostatin-Fusionsprotein gebildet wird, das unter der Steuerung durch den Tryptophanpromotor/Operator exprimiert wird. Dies erfordert (1) eine teilweise EcoRI-Verdauung von pSOM7A2 zur Abspaltung der EcoRI-Stelle, die·sich distal zum Tryptophanpromotor/Operator befindet, und (2) eine geeig-

nete Auswahl der Primersequenz, um so den Kodonleserahmen sauber beizubehalten- und eine EcoRI-Spaltstelle zu erzeugen. . .

5 2u diesem Zweck verdünnt man 16 μg Plasmid pSOM7A2 in 200 μΐ eines Puffers, der 20 mMol TrisipH 7,5), 5 mMol MgCl₃, 0,02 % NP40 als Detergens und 100 mMol NaCi enthält, und behandelt das Ganze mit 0,5 Einheiten EcoRI. Nach 15 Minuten langer Behandlung bei 37°C wird das Reaktionsgemisch zuerst mit Phenol extrahiert, dann mit Chloroform extrahiert, ferner mit Ethanol gefällt und schließlich mit BqIII verdaut. Das dabei erhaltene größere Fragment wird durch PAGE und anschließende Elektroelution isoliert. Dieses Fragment enthält die Kodone LE'(p) für das proximale Ende des LE'-Polypeptids, nämlich diejenigen, die vor der Bglll-Stelle liegen. Dieses Fragment wird dann an das obige LE¹(d)-Fragment in Anwesenheit von T.-DNA-Ligase geknüpft, wodurch man zum Plasmid pSOM7A2A4 gelangt, dessen anschließende Transformation in Escherichia coli 294 unter Steuerung durch den Tryptophanpromotor/Operator zu einer wirkungsvollen Produktion eines Fusionsproteins führt, das aus dem vollständig rekonstituierten LE-Polypeptid und aus Somatostatin besteht.

F. Konstruktion einer linearen DNA mit einem Pstl-Rest

am 3'-Ende und einem Bgll-Rest am 5'-Ende, unter An-, knüpfung eines Gens für eine Tetracyclinresistenz

Das Plasmid pBR322 wird mit Hindlll verdaut/ und die hervorstehenden Hindill-Enden unterzieht man einer Verdauung mit Si-Nuclease, Die Verdauung mit Sl-Nuclease erfordert eine Behandlung von 10 μg von mit Hindlll gespaltenem pBR322 in 30 μ1· Sl-Puffer (0,3 Mol NaCl, 1 mMol ZnCl₃, 25 mMol Natriumacetat, pH = 4,5) mit 300 Einheiten Sl-Nuclease über eine. Zeitdauer von 30 Minuten bei 15°C. Die Reaktion wird durch Zusatz von 1 μΐ 30X Sl-Nuclease-Stopplösung (0,8 Mol Trisbase, 50 mMol EDTA) unterbrochen. Das

' - 28 - ' .

Reaktionsgemisch wird zuerst- mit Phenol extrahiert, dann mit Chloroform extrahiert, weiter mit Ethanol gefällt und schließlich einer Verdauung mit EcoRI unterzogen, wie dies oben beschrieben wprden ist. Das nach PAGE und an-- ° schließender Elektroe'lution erhaltene. Fragment hat ein

klebriges EcoRI-Ende und ein stumpfes Ende, dessen Codierungsstrang mit dem Nucleotid Thymidin beginnt. Der*mit Sl verdaute .Hindi11-Rest, welcher mit Thymid'in beginnt, kann an einen mit Klenow-Polymerase I behandelten Bglll-Rest . 1Ό gebunden werden, wodurch nach Ligation wieder die BqIII-Restriktionsstelle gebildet wird.

.Das gemäß Beispiel 2C. hergestellte Plasmid pSOM7A2 wird daher mit BgIII verdaut, und die erhaltenen klebrigen · BqIII-Enden- werden durch Behandlung mit Klenow-Polymerase unter Verwendung aller vier Desoxynucleotidtriphosphate doppelsträngig gemacht. Durch- EcoRI-Spaltung des erhaltenen Produkts und anschließende PAGE sowie Elektroelution des kleinen Fragments gelangt·man zu einem linearen Stück an DNA, welches den Tryptophanpromotor/Operator und Kodone der proximalen LE¹-Sequenz vor der BgIII-StelIe enthält (LE'.(p)). Das Produkt hat. ein EcoRI-Ende und ein stumpfes' Ende, das von der Auffüllung der Bglll-Stelle herrührt. Die Bglll-Stelle wird durch Ligation des stumpfen Endes mit dem stumpfen Ende des.obigen mit Sl verdauten Hindlll-Fragments jedoch wieder hergestellt. Die beiden Fragmente

werden daher in Anwesenheit von T.-DNA-Ligase unter Bildung des rezirkularisierten Plasmids pHKYlO verknüpft, das durch Transformation in leistungsfähige Zellen von Escherichia coli 294 propagiert wird. Gegenüber Tetracyclin resistente Zellen,, die das rekombinante. Plasmid pHKYlO enthalten, werden selektiert, und die Plasmid-DNA wird extra-.-hiert. Durch Verdauung mit BgIII und Pstl und anschließende Isolierung des größeren Fragments durch PAGE und Elektroelution gelangt man zum gewünschten linearen Stück an DNA mit klebrigen Pstl- und Bglll-Enden. Das so aus pHKYlO hergestellte DNA-Fragment enthält den Replikationsstart-

_ 29 -

punkt und.eignet sich daher als eine Komponente bei der Konstruktion des Plasmids ρΙΑ7Δ4Δΐ, wo beide Gene, die für das trp LE'-Polypeptidfusionsprotein und die Tetracyclinresistenz codieren, durch den trp-Promotor/Operator ge-

steuert werden. ₍ .

G. Konstruktion linearer DNA mit dem trp-Promotor/Operator

Das nach Beispiel 2E. hergestellte Plasmid pSOM7A2A4 unterzieht man eirier Teilverdauung mit EcoRI und einer anschließenden Verdauung mit 'Pstl. Das erhaltene Fragment, welches den.trp-Promotor/Operator enthält, wird durch PAGE und anschließende Elektroelution isoliert. Eine Teilverdauung mit EcoRI ist zur Bildung eines Fragments notwendig, das , neben dem 5'-Ende des Somätostatingens gespalten wird, jedoch keine Spaltung an der EcoRI-Stelle erfährt-, die zwischen dem Gen für die Ampicillinresiste'nz und dem trp-Promotor/Operator liegt. Die Ampicillinresistenz, welche durch den P_s_tI-Schnitt in das Gen fur die Ampicillinresistenz verlorengegangen ist, kann durch Verknüpfung mit dem fertigen pHKYlO linearen. DNA-Derivat wieder hergestellt werden, das gemäß obigem Beispiel 2F. erzeugt worden ist.

H. Isolierung des Strukturgens für die Α-Kette von Insulin

Zur Herstellung, des Strukturgens für die Α-Kette von. Insulin unterzieht man das Plasmid pIAl, dessen Konstruktion in Proc. Nat. Acad. Sei. USA 76, 106 (1979) beschrieben wird, einer Verdauung mit EcoRI und BamHI. Das gewünschte Fragment wird durch PAGE und Elektroelution gereinigt und hat Termini EcoRI und BamHI. ' .

¹I. .Verknüpfung des Strukturgens für die Α-Kette von Insulin mit dem trp-Promotor/Operator und dem pHKYlO , : linearen DNA-Fragment,, das Termini Pstl und BgIII .hat

Man verknüpft das Strukturgen für die, Α-Kette von Insulin, das lineare DNA-Fragment, das den trp-Promotor/Operator . enthält (hergestellt gemäß Beispiel 2G.) und das pHKYlO lineare DNA-Fragment (hergestellt gemäß Beispiel 2F.) in der aus Fig. 1 hervorgehenden Orientierung miteinander, wodurch man zum gewünschten Plasmid ρΙΑ7Δ4Δΐ gelangt. Das Plasmid ρΙΑ7Δ4Δ1 läßt sich infolge der Wiederherstellung der Ampicillinresistenz und Tetracyclinresistenz ohne weiteres selektieren.

Beispiel 3

Konstruktion des ,Plasmids ρϊΒ7Δ4Δ1

Das gewünschte Plasmid wird, wie in Beispiel 2A.' bis I. -beschrieben konstruiert, wobei man bei der abschließenden Verknüpfung jedoch das Strukturgen für die B-Kette von Γη- sulin anstelle des Strukturgens'für die Α-Kette von Insulin verwendet. Das Strukturgen für' die B-Kette von Insulin erhält man durch EcoRI- und BamHI-Verdauung des Plasmids pIBl, dessen Konstruktion in Proc. Nat. Acad. Sei. USA 76, 106 (1979) beschrieben wird. Das den Code für die- B-Kette von Insulin tragende DNA-Fragment wird durch PAGE und Elektroelütion gereinigt und hat Termini EcoRI. und BamHI.

Das Plasmid ρΙΒ7Δ4Δ1 geht aus Fig. 3 der Zeichnung hervor, und läßt sich infolge der Wiederherstellung der Ampicillinresistenz und Tetracyclinresistenz ohne weiteres' selektieren . .

Beispiel -4

Konstruktion des Plasmids ρΗΙ7Δ4Δ1 .' ' .

Das Reaktipnsschema zur Konstruktion des Plasmids ρΗΙ7Δ4Δΐ geht aus Fig. 11 der Zeichnung hervor. ' ;

A.. . Konstruktion des Plasmids pSOM7A4Al

Die gewünschte Konstruktion verläuft analog wie diejenige von Beispiel 21. Hierzu unterzieht man daher das lineare DNA-Fragment, das den trp-Promotor/Op„erator (hergestellt gemäß Beispiel 2G.) und das pHKYlO lineare DNA-Fragment . (hergestellt gemäß B.eispiel 2F.) enthält, einer herkÖmmli-.

.15 chen Verknüpfung mit dem das,Somatostatingen enthaltenden EcoRI-BamHI-Restriktionsfragment des Plasmids pS-OMll. Das Plasmid pSOMll .kann praktisch .wie in Science 198, 1056 _χ (1977) und. GB-OS 2 007 676A beschrieben konstruiert wer- 'den. Das. gewünschte Plasmid pSOM7A4Al läßt sich infolge _:

der Wiederherstellung der Ampicillinresistenz ohne weiteres selektieren.

B.. Herstellung'des Synthesegens-, das für die 32 N-terminalen Aminosäuren von Proinsulin codiert

2-5 · ' ^: . . ' ' In einer ersten Stufe bei der Konstruktion eines Gens, das für die ersten 32 Aminosäuren von Proinsulin codiert, stellt man, eine ,Reihe von .18. Oligonucleotiden her, die in. der .folgenden Tabelle II angeführt sind. Die einzelnen Nucleotide werden durch die Buchstaben A, T, C oder G bezeichnet, die für die Basen Adenin, Thymin, Cytosin oder Guanin stehen, durch die sich die einzelnen Nucleotide voneinander unterscheiden. Die Nucleotidsequenz des schließlich konstruierten gesamten Gens geht aus Fig. 10. der Zeichnung hervor.' .

' · TABELLE II \

Synthetische Oligonucleotide für das Somatostatingen-

^ Verbindung . Sequenz

Hl * ' ' .. AATTCATGTT -

H2 CGTCAATCAGCA

H3 ' '. . ' CCTTTGTÖGTTC

H4 ; . TCACCTCGTTGA

H5 . . TTGACGAACATG

. H6 , ' CAAAGGTGCTGA

H7 . ' AGGTGAGAACCA

H8 : AGCTTCAACG

Bl ~ .AGCTTTGTAC

' B2 · CTTGTTTGCGGT

B3 ; . . , . GAACGTGGTTTC

B4. .·. . . TTCTACACTCCT

B5' , ".. . AAGACTCGCC

B6 . ' '. AACAAGGTACAA

B7 . ACGTTCACCGCA

B8 - GTAGAa'gAAACC

B9 . AGTCTTAGGAGT

BIO' . " ' GATCCGGCG

Die synthetischen Nucleotide sind in der Fig. 10 der Zeichnung zwischen Klammern und unterstrichen angegeben. Diese Nucleotide werden unter Anwendung der Triestermethode syn-. thetisiert, wie sie in Proc. Nat. Acad. Sei. USA 75, 5765: (1978), J. Biol. Chem. 250, 4592 (1975l· und J. Am. Chem.

Soo. 97, 7327 (1975) beschrieben wird. Einige der Nucleoti- ;. de werden zur/ Konstruktion eines Gens für die B-Kette von Humaninsulin verwendet, wie dies in Proc. Nat. Acad. Sei. USA 75, 5765 (1978) und Proc. Nat. Acad. Sei. USA 76, (1979) beschrieben ist. Zwei der Oligonucleotide (B5' und BIO¹) enthalten Hpall und die terminalen Restriktionsstellen BämHl und EcoRI. Diese terminalen Stellen sind beson^. ders gut zur Klonierurtg brauchbar.

- - 33 -

Die acht Oligonu.cleotide Hl bis Η·8 , die früher zur Konstruktion der linken Hälfte des Gens für die B-Kette von Humaninsulin· verwendet worden sind (Proc. Nat. Acad. Sei. USA 76, 106 (1979)), enthalten die Kodone für die Aminosäuren 1 bis 13 des Gens für die B-Kette und ferner auch eine Methionineinheit am N-Terminus. Die rechte Hälfte des Gens für die B-Kette wird konstruiert aus den Oligonucleotiden B₁, B₂,, B₃, B₄, B₅,,, B₆, B₇, Bg, B₉ und B₁₀, durch Verknüpfung unter Verwendung von T.-DNA-Ligase unter Anwen- dung des in Proc. Nat. Acad. Sei. USA 76; 106 (1979) beschriebenen Verfahrens. Das erhaltene Genfragment codiert für die Aminosäureeinheiten 14 bis 30 der B-Kette von Hu-₅maninsulin und für die erste Arginineinheit der Brückenkette. In die Gensequenz wird eine Restriktionsstelle HpaII im gleichen Leserahmen und in gleicher Stellung ein-. geführt wie die Stelle Hpall in das Gen für Humaninsulin. - Nach Reinigung des verknüpften Genfragments durch Gelelektrophorese mit Polyacrylamid und Elution der größten DNA-. Bande inseriert man das Fragment in das mit HindiII-BamHI gespaltene Plasmid pBR322. Das erhaltene Plasmid, welches als pB3 bezeichnet wird, wird durch Transformation in Escherichia coli K12 -294 (ATCC Nr. 31446) inseriert. Dieses Plasmid verleiht eine Resistenz gegenüber den Antibiotika Ampicillin und Tetracyclin und enthält die gewünschte Nucleotidsequenz gemäß einer Bestimmung nach der in· Proc. Natl. Acad. Sei. USA 74, 560 (1977) beschriebenen Methode. ·. .

Zwei Fragmente, nämlich ein 58 bp HindIII-BamHI-Fragment von pB3. und ein 46 bp EcoRI-HindiII-Fragment von pBHl

(Proc. Nat. Acad. Sei. USA 76, 106 (1979))· werden miteinander verknüpft, wodurch mah ein Fragment mit Termini EcoRI und BaitiHI erhält.. Dieses Fragment wird praktisch unter Anwendung des in Proc. Nat. Acad. Sei. USA 7 6, 106 3g (1979) beschriebenen Verfahrens in das mit EcoRI restriktierte Plasmid pBR322 ligiert. Das erhaltene Plasmid, welches als pIB3 bezeichnet wird, wird dann in Escherichia

coli Kl/2 294 kloniert. Nach herkömmlicher Amplifizierung und Isolierung verdaut man das Plasmid pIB3 mit den Restriktiönsenzymen EcoRI und Hpall und gelangt so zu einem synthetischen Genfragment (Fragment 1 in Fig. 11), das für die N-terminalen Proinsulinaminosäuren codiert, denen ein Methionin vorangeht. Das .Synthesegen wird in herkömmlicher Weise durch Gelelektrophorese mit Polyacrylamid isoliert.

C. Isolierung der cDNA, die für die 50 C-terminalen Aminosäuren von Humanproinsulin codiert ^;

Der schematische Ablauf zur Herstellung der gewünschten cDNA geht aus Fig. 12 der Zeichnung hervor. Hiernach wird das Decanucleotid pCCGGATCCGGTTT,_OT, das sowohl eine Er- ' kennungssequenz BamHI als auch einen 3'-Polythymidylsäuretrakt aus etwa 20 Resten enthält, synthetisiert und als Primer, reverser AMV-Transkriptase für die Synthese von cDNA verwendet, per Primer wird hergestellt unter Verwendung terminaler Desoxynucleotidyltransferase (Enzo Bio-

•20 chem, 200 Einheiten) mit 1 μΜοΙ des BamHI-Decanucleotids

-4

in einem Reaktionsvolumen von 0,6 ml, das 1,5 χ 10 μΜοΙ

TTP enthält. Die Reaktion wird bei 37°C über eine Zeitdauer von 1 Stunde.in dem in. Nature 275, 617 (1978) beschriebenen Puffersystem durchgeführt.

. ' · . . , · " -\

Das ferner benötigte Humaninsulinomagewebe stammt vom Institut für Diabetesforschung·, München, Bundesrepublik Deutschland.' Humaninsulinpmagewebe . ist selbs-tverständlich ohne weiteres erhältlich und kann auch von e-iner Reihe an-

so derer Bezugsquellen erhalten werden. Man isoliert PoIy-A-mRNA (2,5 ug·) des Humaninsulinomagev/ebes'praktisch unter Anwendung des in Science 196, 1313 ( 1977 )· beschriebenen Verfahrens und überführt dieses dann in doppelsträngige" cDNA praktisch nach dem aus J. Biol. Chem. 253, 2483

(1978) hervorgehenden Verfahren. Hierzu unterzieht man ein Reaktionsvolumen von 80 μΐ, das 15 nuMol Tris-HCl (pH 8,3 · bei 42°C), 21 mMol KCl, 8 mMol MgCl₃, 30 mMol ß-Mercapto-

ethanol, 2 mMol des Primers dCCGGATCCGGTT,_OT und 1 .mMol dNTPs enthält, einer Vorinkubation bei 0⁰C. Nach Zusatz reverser AMV-Transkriptase wird das Gemisch 15 Minuten bei 42°C inkubiert. Die erhaltene RNA/DNA wird dann.nach herkömmlichen Verfahren denaturiert. . '

'Der komplementäre cDNA-Strang wird in einem Reaktionsvolumen von 150 μΐ synthetisiert, das 25 mMol Tris-HCl (pH 8,3), 35 mMol KCl, 4 mMol MgCl₂, 15 mMol ß-Me.rcaptoethanol, 1 mMol

dNTPs und 9 Einheiten. DNA-Polymerase I (Klenow-Fragment) enthält. Das Gemisch wird zuerst 90 Minuten bei 15°C und dann 15 Stunden bei 4⁰C inkubiert. Anschließend führt man die Verdauung mit Sl-Nuclease über eine Zeitdauer von 2 Stunden bei 37⁰C unter Verwendung von 1000 Einheiten Sl-Nuclease (Miles Laboratories, Elkhart, Indiana, V.St.A.) praktisch unter Anwendung des in J. Biol. Chem. 25 3, 2483 (1-97-8) "beschriebenen Verfahrens durch. Die doppelsträngige cDNÄ (0,37 μg).unterzieht man einer Elektrophorese an einem 8 %-igen Polyacrylamidgel, wobei, die DNA-Fragmente, die größer als 500 bp sind, eluiert werden. Die· anschließende Addition der Oligodesoxycytidylsaurereste an die 3'-Enden der Fragmente erfolgt unter Verwendung von terminaler Des-. oxynucleotidyltransferase praktisch unter Anwendung des in Meth. Virol. 5, 180 (1971) beschriebenen Verfahrens. Die hierdurch erhaltenen und dC-endständigen cDNA-Fragmente . bindet man dann an pBR322, die zuerst mit Restriktionsenzym Pstl verdaut und dann mit endständigen Desoxyguanidyl-.säurefesten versehen worden ist, wozu man terminale. Desoxynucleotidyltrahsferase verwendet. Die erhaltenen Plasmide werden in Escherichia coli K12 294 transformiert und klo-, niert. Kolonien, die gegenüber Tetracyclin resistent sind, jedoch sensitiv sind gegenüber Ampicillin, werden isoliert und einem Screening auf Plasmide unterzogen, die drei Re- · striktionsstellen Pstl haben. Ein solches Restriktionsmuster weist auf das Gen für Proinsulin hin, und hierzu wird auf Science 208, 57 (1980) hingewiesen.

- 36 -

Ein Plasmid, nämlich das Plasmid pHI104, das·ein Insertionsstück aus 600 Basenpaaren enthält, ergibt das vorgesehene P_§_tl-Restriktionsmuster und enthält eine BamHI-Stelle zwischen dem 3'-PoIy-A und dem PoIy-GC, die während der cDNA-Herstellung eingeführt worden ist. Ein Teil der Nucleotidsequenz des Insertionsstücks geht aus Fig. 10 der Zeichnung hervor. Diese Sequenz unterscheidet sich etwas (ein AT-Paar (unterstrichen), ist durch ein GC-Paar ersetzt) von der Sequenz, über die in Science 208, 57 (1980) und in Nature 282, 525 (1979) berichtet wird, da die verwendete mRNA von einem Gewebe stammt, das von einem unterschiedlichen Individuum isoliert worden ist. / ·.· .

D. Aufbau eines Gens, das für Humanproinsulin codiert ..

. ;

* .' Das zum Aufbau eines für Humanproinsulin codierenden Gens angewandte Reaktionsschema geht aus Fig. 11 der_Zeichnung hervor. · . . '. . '

Das synthetische Gensegment, das für die ersten 31 Aminosäuren von Proinsulin codiert,,nämlich das Fragment 1-in . Fig. 11, wird ,gewonnen aus 50 ^g des Plasmids pIB3 unter Verwendung der oben beschriebenen Restriktionsendonucleasen EcoRI und Hpall.' Dieses Fragment enthält' ferner auch das Kodon ATG für Methionin anstelle der Vorsequenz von Präproinsulin. .

Das cDNA-Gensegment, das für die Aminosäuren 32 bis 86 und auch für. die Translationsstoppkodone und den^: 3'-untranslatierten Bereich der mRNA codiert, wird aus 40 μg Plasmid pHI104 gewonnen, indem man dieses Plasmid zuerst mit dem Restriktionsenzym BamHI und dann mit dem Restriktionsenzym Hpall behandelt. Die beiden Fragmente werden durch Gelelektrophorese mit Polyacrylamid"und anschließende Elektroelu-

35. tion isoliert. Die Genfragmente werden zur Verknüpfung mit T^-DNA-Ligase in 20 μΐ Ligasepuffer (Proc Nat. Acad. Sei. USA 76, 106 (1979)) 24 Stunden bei 4°C behandelt. Das· Ge-.

• - 3 7 -

misch wird mit 50 μΐ H_O verdünnt, worauf· man es in üblieher Weise mit Phenol sowie Chloroform extrahiert und dann mit Ethanol fällt. , . .

Die erhaltene DNA wird einer Behandlung mit den Restriktionsenzymen BamHI und EcoRI unterzogen, um hierdurch diese Stellen zu bilden und Genpolymere zu entfernen. Das so gebildete Proinsulingen wird durch Gelelektrophorese mit Polyacrylamid isoliert und dann unter Verwendung von T₄-

¹^ DNA-Ligase an mit EcoRI und BamHI verdautes Plasmid pBR322 ^: gebunden. Die erhaltene DNA wird in Escherichia coli Kl2 2 94 transformiert, worauf man die erhaltenen Kolonien einem Screening bezüglich einer Sensitivitat gegenüber Tetracyclin und einer Resistenz gegenüber Ampicillin unterzieht. Das aus einer solchen Kolonie·isolierte Plasmid pHI3 enthält das gewünschte Proinsulingen, das dann durch Nucleotidsequenzanalyse charakterisiert wird.

E.·/ Konstruktion eines Plasmids zur Expression eines chimeren Proteins, das Humanproinsulin enthält .

Das vollständige Humanproinsulingen, das das' N-terminale Kodon enthält, welches für Methionin codiert, wird aus dem Plasmid pHI3 durch Behandlung mit den.Restriktionsenzymen EcoRI und BamHI gewonnen. Das gewünschte Fragment wird durch Gelelektrophorese gereinigt und dann unter ,Verwendung von T.-DNA-Ligase mit dem mit Pstl-EcoRI teilverdauten Plasmid pSOM7,A4Al un.d dem größeren .der Ps_tI-.Bg_-III-Fragmente des Plasmids pHKYlO (hergestellt gemäß- Beispiel 2F.) verknüpft.

Das pSOM7Δ4Δ1-Fragment wird konstruiert durch Teilverdauung mit EcoRI und anschließende vollständige Verdauung mit Pstl. Das erhaltene Fragment, das den trp-Promotor/Operator enthält, wird durch.PAGE und anschließende Elektroelution isoliert. Die Teilverdauung mit EcoRI. ist zur Bildung eines Fragments notwendig, das neben dem 5'-Ende des Somato-

* statingens gespalten -wird, jedoch - nicht an der. EcoRI-Stelle zwischen dem Gen für die Ampicillinresistenz. und dem tpr-Promotor/Operator. Die Ampicillinresistenz, die durch" den Psti-Schnitt in das Gen für die Ampicillinresistenz verlorengegangen ist, läßt sich durch Verknüpfung mit dem fertigen pHKYlO linearen DNA-Derivat wieder herstellen, das nach obigem Beispiel 2F. gebildet wird.

Man verknüpft etwa 1 ^g des vollständigen Humanproinsulingens mit Enden EcoRI und BamHI, 4 ^g mit Pstl-EcoRI teilverdautes pSOM7A4Al-Fragment.und etwa 1 ^g Pstl-Bglll-Fragment von pHKYlO bei 4⁰C über eine Zeitdauer von 24 Stunden unter Verwendung von T.-DNA-Ligase in einem Liga-.tionspuffer miteinander. . " '

Das verknüpfte DNA-Gemisch wird in Escherichia c.oli K12 . .praktisch unter Anwehdung des in Proc. Nat. Acad. Sei. USA 76, 106 (1979) beschriebenen Verfahrens transformiert. Die Kolonien, die sowohl auf Ampicillin als auch auf Tetracy-'20 elin wachsen, werden selektiert, wobei sich durch SDS-GeI-elektrophorese mit Polyacrylamid nach dem in Meth. Virol. 5, 1-80 (1971) beschriebenen Verfahren ergibt, daß diese Kolonien das gewünschte Plasmid ρΗΙ7Δ4Δ1 enthalten und ein Protein mit einem Molekulargewicht exprimieren, das der . erwarteten Fusion trp LE'-Proirisulin· entspricht. Das Plasmid ρΗΙ7Δ4Δ1, das 'das oben erwähnte Protein exprimiert, wird in bezug auf die DNA-Sequenz und die Restriktionsstellen sowbhl.. durch das eingebaute Gen als :auch den Vektor vollständig charakterisiert. Das Plasmid ρΗΓ7Δ4Δ1 geht aus Fig. 5 der Zeichnung hervor und läßt sich infolge der wiederhergestellten Ampicillinresistenz und Tetracyclinresi- stenz ohne weiteres selektieren. ,

Beispiel5

;-'. Isolierung des etv/a 2,7kb P_s_t I-Fragments' von pDIlO

Das etwa 2, 7kb P_stI-Fragment des Plasmids pDIlO enthält Ge-

' · - 39 -

ne zur Restriktion und Modifikation mit der Spezifität von Hha.II. Man verdaut etwa 15 'μς kovalent geschlossenes zirkuläres pDHO, das aus Escherichia coli K12 294/pDIlO isoliert worden ist, bei 37⁰C vollständig mit dem Restrik-

'5 - ' ' ' '

tionsenzym Pstl. Das Reaktionsgemisch enthält etwa 35 μΐ pDHO-Lösung (hergestellt gemäß Beispiel 1), 15 μΐ IQX : ^: Pstl-Puffer (10 itiMol MgCl₂, 500 mMol (NH₄J₂SO₄ und 200 mMol Tris-HCl, pH 7 ,,5) , 15 μΐ Rinderserumalbumin (1 mg/ml), 77,5 μΐ H₂O und.17,5 μΐ Restriktionsenzym Pstl (eine New England Biolabs-Einheit pro μΐ). Die restriktierte DNA wird durch AGE (Agarosegelelektrophorese) in Gelen, die 0,8 % Agarose in TBE (10,8 g Tris-Base, 5,5 g Borsäure und 0,09 g Na-EDTA in 1 Liter H„O enthält) über eine Zeitdauer von 1,5 Stunden bei 220 Volt fraktioniert. ^ Die Bande werden durch Anfärbung mit Ethidiumbromid (0,5 μg/ml) und Beobachtung unter einem Ultraviolettlicht sichtbar gemacht'. Das gewünschte Fragment wird ausgeschnitten und eine Stunde,bei 150 Volt in TBE elektroeluiert. Die DNA wird an eine DEAE-Cellulosesäule (Whatman DE52) gebun-

^O den, die mit einem Aquilibrierungspuffer (0,1 Mol KCl.und .;. 10 mMol Tris-HCl, pH .7,8) äqui.libiert worden ist. Die. Sau- , Ie wird mit dem Aquilibrierungspuffer gewaschen und die DNA mit einem Elutionspuffer (1 Mol NaCl und 10 mMol Tris-HCl, pH 7,8) eluiert. Das Eluat wird mit H-O auf 'eine .

.. 0,35 molare Na -Ionenkonzentration eingestellt, worauf man die DNA durch Zugabe von 2 Volumina 100 %-igem Ethanol und Kühlen auf -2O⁰C über Nacht fällt. Der. gewünschte Nieder-, schlag wird durch Zentrifugation gesammelt, getrocknet und in TE gelöst. '

'. '

Beispiele

Isolierung von mit Pstl verdautem Plasmid ρΙΑ7Δ4Δ1

Man verdaut etwa 0,5 μg Plasmid ρΙΑ7Δ4Δ1, hergestellt gemäß Beispiel 2, über eine Zeitdauer von 3 Stunden bei 37⁰C mit dem Restriktionsenzym Pstl praktisch unter Anwendung ^

\ des in Beispiel 5 beschriebenen Verfahrens. Die restrik-'tierte DNA wird einmal mit Phenol und zweimal mit einem Ge-

' : misch aus Chloroform und Isoamylalkohol (24 : 1) unter Anwendung üblicher Verfahren extrahiert. Die Lösung .wird mit 0,1 Volumina 3 molarem Natriumacetat mit einem pH-Wert von 8 vermischt und durch Zusatz von 2,2 Volumina Ethanol und Abkühlen auf -20^üC über Nacht gefällt. Der gewünschte Niederschlag wird_durch Zentrifugation gesammelt, getrocknet und in TE gelöst. ' .

. . ^;

B e i s ρ i e 1 ... 7 ι

Isolierung des mit Pstl verdauten Plasmids ρΙΒ7Δ4Δΐ

Man verdaut etwa 0,5 μ-g Plasmid ρΙΒ7Δ4Δ1, hergestellt gemäß Beispiel 3, über eine Zeitdauer von 3 Stunden bei 37°C . mit dem Restriktionsenzym Pstl, praktisch unter Anwendung des in Beispiel 5 beschriebenen Verfahrens. Die restrikt'ierte DNA wird einmal mit Phenol und zweimal mit einem Gemischaus Chloroform und Isoamylalkohol (24 : 1) unter Anwendung üblicher Verfahren extrahiert. Die Lösung wird mit 0,1 Volumina 3 molarem Natriumacetat mit einem pH-Wert von . 8 vermischt und durch Zusatz von 2,2 Volumina 100 %-igem Ethanol und Abkühlen auf -20⁰C über Nacht 'gefällt..Der gewünschte Niederschlag wird durch Zentrifugation gesammelt, getrocknet und in TE gelöst. - ,

B e. i. s .p i e 1 8 , ...

/-

Verknüpfung des etwa 2,7kb Psti-Fragments des Plasmids pDIl.Q mit dem mit Pstl verdauten Plasmid. ρ!Α7Δ4Δΐ

Man vermischt etwa 0,2 μg von mit Pstl verdautem Plasmid ρΙΑ7Δ4Δ1 und 1,1 μg des etwa 2,7kb PsJtI-Fragments des Piasmids pDUO in 400 μΐ TE/10 (1 mMol Tris-HCl, pH 7,8, 0>l mMol Na₃EDTA). Nach Zugabe von 0,1 Volumina an 3 molarem Natriumacetat mit einem pH-Wert von 8 fällt man die DNA durch Zugabe von 2,2 Volumina 100 %-igem Ethanol und Ab-

, ; - 41 - - ' . ' .;

kühlen auf -20°C über.Nacht. Der' gewünschte Niederschlag wird durch Zentrifugation gesammelt und dann getrocknet. Die Verknüpfung wird in einem 3,3 μΐ Reaktionsvolumen . durchgeführt, das 2 μΐ DNA in HO, 0,6 μΐ 5X Kinase-Ligase-Puffer (50 mMol MgCl₂, 25 mMol Dithiothreit, 250 mMql "Tris-HCl, pH 7,8 und 25 %. Glycerin), 0,6 μΐ an 0,66 millimolarem ATP und 0,1 μΐ. T -DNA-Ligase (1, Einheit/μΐ) enthält. Das Reaktionsgemisch wird über Nacht bei 15 C inku-.'. biert. . ·

ίο ' .' . -. '

Beispiel 9 .

Verknüpfung des etwa 2, 7kb Pstl-Fragments des Plasmids .pDIlO mit dem mit Pstl verdauten Plasmid ρΙΒ7Δ4Δ1

' ' ^:

Die gewünschte Verknüpfung wird praktisch'wie in Beispiel

. .8 beschrieben durchgeführt, wobei hier jedoch das mit Pstl . verdaute Plasmid ρΙΒ7Δ4Δ1 anstelle des Plasmids ρΙΑ7Δ4Δ1 verwendet wird. Das Reaktionsgemisch wird über.Nacht bei 15⁰C inkubiert. _ .. . > -

Beispiel 10 ' .

, Konstruktion von Escherichia coli K12 RV308/pPR26 und 25 Escherichia'col'i·' Kl2 RV308/pPR27 und Isolierung der Pias-'. mide pPR2 6 und pPR27 ' . '

Man verdünnt etwa 0,1 μg. ligierte DNA, hergestellt gemäß Beispiel 8, auf ein Endvolumen von-5 0 μΐ mit- SSC/10. Die

3Q DNA wird dann praktisch unter Anwendung des in Beispiel 1 beschriebenen Transformationsverfahrens in leistungsfähige Escherichia coli K12 RV308 transformiert. Die gewünschten Transformanten von Escherichia coli K12 RV30.8/pPR2 6 und Escherichia coli.K12 RV308/pPR27 werden durch Wachsenlassen auf L-Agar isoliert, der Tetracyclin in einer Konzentration von 5 μg/ml enthält. Die Isolate werden zum Nachweis der Tetracyclinresistenz und Ampicillinsensitivitat entsprechend untersucht. Unter Verwendung geeigneter KoIo-

nien isoliert man dann kovalent geschlossene zirkuläre ' Plasmid-DNA praktisch unter Anwendung des in J. Mol. Blöl . .36, 185 (1968) beschriebenen Verfahrens. Die Struktur der Plasmide wird durch kartographische Ermittlung der Spaltstellen für Restriktionsendonuclease verifiziert. Man er-·· hält Plasmide mit zwei Orientierungen, da das in den Plasmiden .enthaltene 'etwa 2,7kb Ps ti-Restrikt ions fragment in einer von zwei Richtungen inseriert sein kann. Beim obigen Verfahren werden infolgedessen sowohl die Plasmide pPR26 und pPR27^rals auch ihre entsprechenden Transformanten isoliert. .'., . . . ". .

Beispiel 11- > .. v.,-^

Konstruktion von-Escherichia ccii Kl2 RV308/pPR2 8 und Escherichia coli Kl,2 RV308/pPRi228 und Isolierung der Plasmide pPR2 8 und pPR1228 ., -. ·,

Die.gewünschten Konstruktionen werden praktisch wie in Beispiel 10 beschrieben durchgeführt, wobei abweichend davon jedoch die nach Beispiel 9 hergestellte iigierte DNA ^f verwendet wird und nicht die DNA von Beispiel 8. Die gewünschten Transf ormanten von Escherichia coli K12 RV308/ pPR28· und Escherichia coli K1.2 RV308/pPR1228 werden isoliert,- und die Struktur der jeweiligen Plasmide wird durch kartographische Ermittlung der Spaltstellen für die Restriktionsendonuclease verifiziert.'Man erhält Plasmide mit zwei Orientierungen, da das in den Plasrniden enthaltene. etwa 2, 7kb Pstl-Restriktionsf raqment in einer von- zwei Richtungen inseriert sein kann. Beim obigen Verfahren werden infolgedessen sowohl die Plasmide pPR28 und pPR1228 als auch ihre entsprechenden Transf ormanten isoliert..

h Beispiel, 12 . '.' \'$^::^r-W^I

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- '.;·'.' ¹J »

Konstruktion von Escherichia coli Kl2 RV308/pPR29 und I-so-

lierung des Plasmids pPR29 ' ,

5. . " . , . ' ··.. . .' _; A.. Isolierung des etwa, 6,2kb Aval-BgI!!-Fragments des . Plasmids pPR27 ; ' ^w _:

Das Plasmid pPR27 enthält eine einzelne Bglll-Restriktionsstelle bei einer Koordinate von etwa 331. Basenpaaren und ,.' eine einzelne Aval-Stelle bei einer Koordinate von etwa 2334 Basenpaaren. Etwa.8 μ9 des PLasmids pPR27 (hergestellt gemäß Beispiel 10) unterzieht man einer vollständigen Verdauung bei 37⁰C in einem 150 μΐ Reaktionsgemisch, .

das 20 mMol Tris-HCl, pH 7,4, 30 mMol NaCl und 16 Einheiten AyaI-Restriktionsenzym (BRL, 2 Einheiten/μΐ) enthält. Nach Zusatz von 20 μΐ 1OX Bglll-Puffer (1 Mol Tris-HCl, pH 8,0, 50 mMol MgCl„ und 600 mMol NaCl), 25 μΐ H_O und 5 μΐ BgIII-Restriktionsenzym (New England Biolabs, 1,6 Einheiten/μΐ) inkubiert man das Reaktionsgemisch zuerst 60 Minuten bei 37⁰C und dann 5 Minuten bei 65⁰C. Die re- striktierte DNA wird durch AGE fraktioniert, worauf man das gewünschte etwa. 6, 2kb-Frägment in TE durch Elektroelution und durch DEAE-Cellulosechromatographie unter praktischer Anwendung des Verfahrens von Beispiel 5 gewinnt.

B. Isolierung des etwa 2,'3'kb Aval-Bglll-Fragments des Plasmids ρΗΙ7Δ4Δ1 ' , - .

30, Das Plasmid ρΗΙ7Δ4Δ1 enthält eine einzelne Bglll-Restrik-

tionsstelle bei einer Koordinate von, etwa ,331 bp und eine· '·· einzelne Aval-Stelle bei einer Koordinate von etwa 2614 bp. Etwa 15 μg Plasmid ρΗΙ7Δ4Δ1., hergestellt gemäß Beispiel 4, unterzieht man,einer vol1 ständigen^:Verdauung mit den Restriktionsenzymen Aval und BgIII unter praktischer Anwendung des Verfahrens des obigen Beispiels 12A. Die restriktierte DNA wird durch AÖE fraktioniert, worauf man das ge- ^: '' wünschte etwa 6, 2kb^Fragment in\TE durch Elektroelution

. _; . - 44 --.:

und durch DEAE-Cellulosechromatogrpahie unter praktischer Anwendung des· Verfahrens von Beispiel. 5 gewinnt.

C.' Verknüpfung des etwa 6,2kb Aval-BqIII-Fragments_>des ' ' '

, Plasmids pPR27 mit dem etwa 2,3kb Aval-BgJ₁II-Fragment des Plasmids ρΗΙ7Δ4Δ1

Man vermischt etwa 2,3 pg des etwa 6, 2kb AvaI-Bg_l_II-Fragments des Plasmids, pPR27 (hergestellt gemäß Beispiel 12A.) und etwa 0,85 μg des etwa 2,,3kb Aval-Bglll-Fragments von ρΗΙ7Δ4Δΐ (hergestellt gemäß Beispiel. Γ2Β.) miteinander in 570 μΐ TE und unterzieht das Ganze dann einer Fällung mit . Ethanol unter praktischer. Anwendung des in Beispiel 8 beschriebenen Verfahrens. Die gewonnene DNA verknüpft man in *5 einem 10,1 _,μ1 Reaktionsgemisch,, das 2 μΐ 5X Kinase-Ligase-Puffer, 2 μΐ an 0,66 millimolarem,ATP, 6·μΐ HO und 0,1 μΐ T.-DNA-Ligase (eine Einheit pro μΐ) enthält. Das'Reaktionsgemisch wird über Nacht bei 9°C inkubiert, worauf man die gewünschte DNA nach bekannten Verfahren gewinnt.

D., Konstruktion von Escherichia coli K12 RV308/pPR29. und Isolierung des, Plasmids pPR29

Die gewünschte Konstruktion wird praktisch wie in Beispiel ίο beschrieben durchgeführt, wobei man abweichend davon jedoch die nach Beispiel 12C. hergestellte ligierte DNA verwendet und nicht die DNA. von ,Beispiel 8. Das gewünschte-Escherichia coli K12 RV308/pPR29 wird isoliert, und die Struktur dieses Plasmids wird durch kartographische Erfassung der Spaltstellen für die Restriktionsendonuclease verifiziert. .

Beispiele für weitere Transformanten, die sich unter Anwendung der oben beschriebenen Verfahren konstruieren lassen, gehen aus der folgenden Tabelle III hervor.

- 45 ' TABELLE III _: '

Beispiele von.Transformanten

1. Escherichia coli K12 294/pPR26

.;^:' 2. Escherichia coli K12 294/pPR27 ^:

3. Escherichia coli K12 294/pPR28

".: 4. Escherichia coil K12 29.4/pPR1228

5. Escherichia coli K12 294/pPR29

¹⁽³ " 6: Escherichia coli K12/pPR27

7. Escherichia coli..K12 C600/pPR26

8. Escherichia coli K12 C600/pPR27

9. Escherichia coli K12- C600/pPR28 10. Escherichia coli Kl2 C600/pPR1228

11. Escherichia coli K12 C600/pPR29

12. Escherichia coli/pPR27

13. Escherichia coli K12 C600R, ~Mv~/pPR26

14. Escherichia coli K12 C600R_v~M, ~/pPR27

is. K.

... . - .15. Escherichia coli K12. C600R_k~M_k~/pPR2

16. Escherichiai coli K12 C600R_k~M_k~/pPR1228

17.. Escherichia coli Kl2 C600R_k~M_k~/pPR29

18. Escherichia coli K12/pPR28

19. Escherichia coli K12 HB101/pPR26, 20.^: Escherichia coli K12 HB101/pPR27 '

21. Escherichia coli -Kl2 HB101/pPR28

22. Escherichia coli K12 HB101/pPR1228

23_ Escherichia coli K12 HB101/pPR29

.24. Escherichia coli/pPR28 · '

. 25. Escherichia coli K12 BE827/pPR26 :

26. Escherichia coli Kl2 BE827/pPR27

27. Escherichia coli K12 BE827/pPR28

28. Escherichia coli K12 BE827/pPR1228

29. Escherichia coli K12 BE827/pPR29

30. Escherichia coli K12/pPR29 31. Escherichia coli/pPR29

Claims (5)

1. Patentansprüche:' '

   . 1. Verfahren zur Herstellung eines rekombi-anten DNA-Klonierungsvektors zum Schutz eines- Bak'teriums gegenüber .- einem natürlich vorkommenden Bakteriophagen, der eine doppelsträngige DNA enthält, welche eine Restriktionsstelle mit spezifischer Aktivität aufweist, dadurch . c e k e η : ζ e i c h η e t., daß man .
   1) ein DNA-Segment, das Gene enthält, weiche G a) eine Modifikationsaktivität und ' .

   b) eine rr.it a) verwandte Restriktions-aktivität mir der

   gleichen Spezifität wie die der Restriktionstelle, koordiniert unc seoüentieli excrirr.ie.ren, 2} ein Replikon-, das in diesem« Bakteriu" funktionell ist,

   3) ein Gen, das in diesem Bakterium ein funktionell== F peptid exprimi.ert, ., - . '

   miteinander verknüpft.

   η . η -

   2C 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch ' g.e k z- e i c h net, daß man das DNA-Segment, das- Repiikon und das Gen in Form eines Piasmids miteinander verknüpft.

   .3. . Verfahren nach Anspruch ,1 oder 2, dadurch c e k e η η ζ e i c -h ri e t ,daß das DNA-S e'cment eir.e Pstl -R? striktionsaktivität und Modif ikatior.saktivität, eine EccRI-Restriktionsaktivität und Modifikafionsäktivität, eine Hhall-Restriktionsaktivitat und Modifikationsaktivität oder eine Taql-Restriktionsaktivität und Modifikationsaktivität verleiht. . .

   4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch g e k e η η zeichnet , daß das DNA-Segment, das. eine Hnall-Re- ^; striktionsaktivität und .'Modif ikatior.saktivität verleiht, das etwa 2,7kb Pjstl-Restrikticnsfracrr.ent des Piasmids pDIlG ist. · . .

   .„ ^; _ - ι

   . ^

   f5. Verfahren nach Anspruch 1, 3 oder 4, -dadurch ge-' ·. k e r. η ζ e i c h η e t ,. daß der rekornbinante DNA-Klonie-.rungsvektor das das pclA-Gen benörigende ρΜΞ 1-Repl ikor., CoIEl -Reel ikon , NRl-Reoiikon, RK2-Reolikcn , RKS-ReDl ikon ,.

   ' ' * ·

   pSClOl-Replikon, RPl-Repiikon, RP4-Replikon, F-Replikon oder ein Replikon eines Bakteriophagen enthält¹,' das in Escherichia coli K12 repliziert. »' ,
2. 6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch ce k e η η zei'chnet, daß das Replikon das das polA-Gen. benöticende DKBi-ReDlikon ist.

   c ε -
3. 7. Verfahren nach Anspruch d oder 6, dadurch k e η η "ζ e ic h net, daß der rekoir.binante DNA -K lon ie-· ^x ^ rungsvektor ein Gen enthält, das Hurranpropräirisülir., Hu-ar.prcinsulin, die Α-Kette vor. Humaninsulin, die E-Kerte von- Humaninsul in , Humanwachstuirishorinon , "Nichthuirianwachsturr.snormon, Rinderwachstumshcrmon, Nichthumaninsulin, Humaninter-· feron, Nichthumaninterferon, Virenantigen, Urokinase, ein eine Antibiotikaresistenz verleihendes Enzym, irgendein Peptidhormon oder irgendein Peptiäenzy-iri ent-häl~.

   8'. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis ; zur Herstellung des Plasmids DPR26 oder des Plasmids p?R27, dadurch gekennzeichnet, daß man das etwa 2 ,7kb Psti-Restriktionsf ragment des Piasmids pE: mit "Pstl verdaute Plasmid dIA7£,4£\1 bindet.
4. 9.' Verfahren nach einem der Ansprüche 2· 'bis 1 zur Her-, stellung des Plasmids pPR28 oder des Plasmids pPR122S, dadurch gekennzeichnet , daß man das etwa 2,7kb Pstl-Restriktionsfragment des Plasmids pDIIC mit der mit Pstl verdauten Plasir.id ρϊ57^4Δΐ verknÜDft.
5. 10. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis ,· stellung des Plasmids pPR29, dadurch ge k e η η -

   zur Her

   ?^iiiu 02CC7

   ζ" e i c h η e t , daß man das etwa 2,6kb Aval-Balll-Fragment von p?R27 mit dem etwa -2,3kb Aval-BqII!-Fragment de: Plasmids- ρΗΙ7Δ4Δ1 verknüpft.

   . - Hierzu 12 Blatt Zeichnungen -