DE3513470A1 - Gentechnologische herstellung von rinder-ifn(alpha) - Google Patents

Description

Es wurde gefunden, daß sich von verschiedenen Zellen gebildete Interferone in ihren physikalisch-chemxschen, serologischen und funktionellen Eigenschaften unterscheiden. Gemäß ihrer antigenen Spezifität werden menschliche

Interferone heute in drei Klassen eingeteilt, nämlich α-, ß- und γ-Interferon. Maus-Interferone lassen sich ähnlich klassifizieren.

Um wirtschaftliche Einbußen durch Viruserkrankungen bei 25'" Rindern einzugrenzen, ist es wichtig, ein antivirales

Mittel mit einem breiten WirkungsSpektrum bereitzustellen. In gewissen Situationen wird eine hohe Sterblichkeit beobachtet, nämlich wenn Tiere transportiert oder in eine neue Umgebung überführt werden, in der sie mit neuen 30 viralen Infektionen in Berührung kommen. Die prophylaktische oder therapeutische Verwendung von Rinderinterferonen ist unter diesen Umständen anscheinend ideal.

Die Rinderinterferone (BoIFN) wurden bislang im Gegensatz 35 zu den Interferonen von Mensch und Maus nicht ausführlich untersucht. BoIFN's sind wahrscheinlich ein wirkungsvolles

Mittel zur Vorbeugung von Rindererkrankungen, die durch Viren übertragen werden, wie Maul- und Klauenseuche, infektiöse Rinder-Rhinotracheitis, Pseudorabies, Bluetongue und neonatale Rinder-Diarrhoe.

Bei in-vitro Tests zeigten BoIFN-Präparate eine antivirale Wirkung gegen einige diese Erkrankungen verursachende Viren; vgl. A. Goossens et al., Ann. Met. Vet. 127, S. (1983).

α-Interferone sind eine Familie verwandter Proteine, die von über einem Dutzend unterschiedlicher Gene codiert werden. Dies wurde bereits für Maus und Mensch gezeigt und wird nun von uns auch für Rinder gezeigt; vgl. D.U. Goeddel et al., Nature 290, S. 20 (1981); S. Nagata et al., Nature 287, S. 401 (1980) ,-Shaw et al., Nucl. Acid. Res. 11, S. (1983), Wilson et al., J. MoI. Biol. 166, S. 457 (1983). Die IFNa-Gene haben eine hohe Sequenzhomologie und sind sogar während der Evolution konserviert geblieben. Deshalb wird angenommen, daß in vivo die differentielle Bildung

geeigneter Interferone erforderlich ist für eine erfolgreiche Abwehrreaktion beim Menschen auf spezifische virale Infektionen, immunologische Interferenzen und neoplastische Erkrankungen.
25"

Das größte Hindernis bei der klinischen Auswertung bestimmter α-Interferon - Präparat-Kombinationen ist die Schwierigkeit große Mengen des gereinigten Interferons jedes der Interferon-Typen zu erhalten. Gentechnologische Verfahren stellen Werkzeuge zur Konstruktion einer verläßlichen Quelle für die Herstellung eines individuellen Interferon-a-Proteins dar. Diese Verfahren gestatten es , die genetische Information jedes Interferons zu isolieren, nämlich durch direkte Manipulation des Genoms oder seiner Transkriptionsprodukte oder durch chemische Synthese der vollständigen IFNa-codierenden Sequenz, und diese Information in prokaryontischen oder eukaryontischen

1 Zellen zu clonieren. Weitere Manipulationen dieser individuellen Interferonsequenzen in Verbindung mit geeigneten Expressionssignalen (Transkriptions- und Translations-Signale) führen zu hohen Ausbeuten bei der Herstellung der

clonierten Interferone.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zu Grunde, eine Quelle zur Herstellung unterschiedlicher neuer Rinder-Interferona-Proteine und im wesentlichen reine Formen der auf diese 10 Weise hergestellten Interferon-a-Proteine zur Verfügung

zu stellen.
Die Isolierung, Clonierung und Expression des Rinder-Interferon-a-Gens umfaßt die folgenden Schritte:

a) Konstruktion einer Rindergenbank mit /u Phagen-Vektoren: 1. Isolierung, Reinigung und partielle Spaltung der Rinder-DNA aus Rinder-Geweben, wie der Leber; Isolierung von 12 - 20 kb großen DNA-Fragmenten;

2. Herstellung von Λ DNA-Vektor-Armen, wie AL47.1-Armen und Ligierung der Arme mit den fraktionierten Rinder-DNA-Fragmenten,

3. Verpacken und Amplifikation der _f\ -Hybride zur Herstellung einer Rinder-Genbank,

b) Isolierung von BoIFN-a-Genen;

1. Herstellung spezifischer Sondenmoleküle für BoIFN-a-..-Gene:

Isolierung von HuIFN-a-cDNA-Sequenzen, die den gesamten Genbereich umfassen und radioaktive Markierung dieser DNA-Sondenmoleküle.

2. Bestimmung der Bedingungen beim Absuchen der Genbank

30 mit einer HuIFN-a-Probe durch Hybridisierung von Rinder-Genom-Blots mit dem Sondenmolekül.

3. Absuchen der Genbank durch in situ-Hybridisierung.

4. Plaqueanreicherung positiver Clone und Isolierung von Λ-Phagen-Hybrid-DNA,

5. Restriktionskartierung der λ-Hybrid-Clone und Lagebestimmung der zum HuIFN-a homologen DNA-Bereiche.

1 c) Sequenzanalyse der BoIFNcx-Gene.

d) Subclonierung BoIFNa-Gene zur Expression in heterologen Systemen, wie Bakterien oder eukaryontischen Zellen.

1. Fragmentierung der ft-Hybrid-DNA-Sequenzen mittels Restriktionsenzymen. Isolierung von BoIFNa-codierenden Sequenzen.

2. Herstellung von Expressionsvektoren und synthetischen Oligonucleotiden zur Konstruktion von DNA-Molekülen zur Expression des BoIFN-a-Polypeptids in vivo mit hoher Ausbeute.

e) Herstellung und Reinigung von BoIFN-a und seinen Derivaten.

^g Die Gesamt-DNA wird aus Rinderzellen, z.B. aus Leber, Plazenta- oder Thymus-Zellen extrahiert. Die DNA wird aus den Zellen durch Extraktionsverfahren, beispielsweise unter Verwendung von Phenol, gewonnen. Die DNA wird statistisch entweder mechanisch oder durch Spaltung mit Restriktionsenzymen fragmentiert. Die partiell gespaltene oder gescherte DNA wird fraktioniert, z.B. durch Saccharose-Dichtegradienten-Zentrifugation oder Gelelektrophorese, um Fragmente der erforderliche Größe zu erhalten. Zur Konstruktion einer Genbank werden diese

2g... Fragmente in Clonierungsvektoren inseriert.

Die Wahl des Vektors wird durch verschiedene Faktoren beeinflußt, zu denen die Art der zu inserierenden Fremd-DNA gehört, der Typ der verwendeten Restriktionsendonuclease, das Erfordernis der Expression der inserierten DNA-Sequenz

QQ und die Wahl des Wirtsorganismus. Allgemein verwendete Vektoren sind Cosmide, Bakteriophagen oder Plasmide, die eine Reihe von gut verwendbaren Restriktionsendonuclease-Erkennungsstellen tragen und ein Merkmal zur Identifizierung von Bakterien, die das rekombinante DNA-Molekül

Qg tragen, beinhalten. Virale Vektoren haben den Vorteil, daß sie Zellen mit hoher Ausbeute infizieren und sich

— '8 —

I schnell vermehren. Ein weiterer einzigartiger Vorteil der Phagen-Vektoren ist, daß ihre DNA vollständig in das Viruspartikel verpackt wird und daß die Fremd-DNA deshalb sehr leicht gelagert und amplifiziert werden kann.

Die letztere Eigenschaft ist sehr vorteilhaft, wenn man mit einer Genbank arbeiten muß, die mehr als 1 Million verschiedener Clone enthält.

Die Genome der gesamten Familie der ^. -Phagen sind so

jQ strukturiert, daß ihr mittleres Drittel (=Speichersegment) Gene enthält, die für das lytische Wachstum nicht benötigt werden.

Die wichtigen rechten und linken Enden des Phagen werden als rechter und linker Arm bezeichnet. Die unwichtigen

^₅ Sequenzen können mit verschiedenen Restriktionsenzymen abgeschnitten werden. Diese Clonierungsvektoren gestatten die Insertion von 15 bis 20 kb Fremd-DNA zwischen die Phagenarme. In der Praxis wird die DNA des <\-Phagen-Vektors zunächst mit einem Restriktionsenzym behandelt,

2Q worauf die Arme von dem mittleren "Speichersegment" abgetrennt werden. Die isolierten Arme werden dann an die gewünschte chromosomale DNA ligiert. In Abhängigkeit vom verwendeten Vektor werden verschiedene Präparationsverfahren zur Gewinnung der Arme durchgeführt. Die Saccharose-Dichte-Gradienten-Zentrifugation hat sich als besonders zweckmäßig erwiesen und wird bei den vorliegenden Versuchen angewendet.

Der Clonierung des Hybrid-Phagen liegt das in vitro-„Q Verpackungssystem zugrunde; vgl. B. Hohn, J. Mol. Biol. 98 (1975), S. 93. Die in vitro verpackte DNA wurde in E. coli-Zellen vermehrt, wodurch die Phagengenbank erhalten wurde, die das gesamte Genom repräsentiert. Verschiedene solcher Genbanken wurden amplifiziert und als Quelle zur ge Isolierung der Rinder-Gene verwendet. Um ein einzelnes Gen aus einer Genbank eukaryontischer DNA zu isolieren

q
(Genomgröße 3 χ 10 bp) muß man mehr als 100 000 Clone

untersuchen, wenn die Durchschnittsgröße der eukaryontischen Insertion mehr als 20 kb ist. Ein Absuchverfahren, das die Handhabung solch großer Clonmengen gestattet, ist die in situ-Hybridisierung. Dazu benötigt man jedoch ein Segment-spezifisches Sondenmolekül für das gewünschte Gen. Nachdem nichts über die Rinder-Interferon-Sequenz bekannt war, wurden im vorliegenden Fall menschliche IFNa-Sequenzen, die in an sich bekannter Weise cloniert worden waren, verwendet, um die Rindergenbank nach BoIFN-a-Genen abzu- -^q suchen. Vor der Verwendung der HuIFN-Sequenzen als Sondenmoleküle für die Rindergenbank wurde mit genomischen Blots bestätigt, daß die HuIFN-Sequenz spezifisch mit Rinder-DNA hybridisiert.

j^g Rekombinante ί^-Clone, die mit dem HuIFN-a-Sondenmolekül hybridisieren, werden isoliert und vermehrt, und ihre DNA wird mit Restriktions-Enzym-Spaltungen und Southern Blots analysiert, um die zur HuIFN-a-DNA homologen Regionen zu lokalisieren. Die ausführliche Restrik-

2Q tionsenzym-Analyse dieses DNA-Bereichs gestattet die weitere genetische Manipulation des BoIFN-a-Gens. 13 Clone, die spezifisch mit dem HuIFN-a-Sondenmolekül hybridisieren, wurden bislang identifiziert. Diese repräsentieren mindestens fünf verschiedene Mitglieder der BoIFN-cc-Gen-

25-- familie. Vier davon wurden weiter analysiert und ihre vollständige DNA-Sequenz wurde ermittelt; vgl. Tabellen 1 bis 4.

Um die biologische Aktivität des BoIFN-a zu bestimmen, QQ kann ein leistungsfähiger Expressionsvektor zur Herstellung des BoIFN-a-Polypeptids oder des reifen met-IFN-Polypeptids verwendet werden.

Zur wirkungsvollen Expression der BoIFN-a-Gene in Bakterien wurden Plasmide konstruiert, die leistungsfähige ge Transkriptions-Promotoren, wie den Iac-, den trp-, den

^l P₁. - oder den ^. P -Promotor, in Verbindung mit natürlichen

oder synthetische, bakterielle leistungsfähige. Translations-Initiations-Signale und geeignete codierende- Sequenzen aufweisen, die möglicherweise zur

Herstellung des Met-IFN-Polypeptids führen. 5

Die BoIFNct-Gene können ebenso zur leistungsfähigen Expression in eukaryontisehen Zellen umgebaut werden, wobei sie mit den natürlichen Signalpeptid-codierenden Sequenzen cloniert werden, die in vivo prozessiert werden, wobei das authentische natürliche IFNa-Polypeptid hergestellt wird.

Außerdem können die BoIFNa-Sequenzen so umgebaut werden, daß von der bakteriellen oder eukaryontischen Zelle ein Fusionspolypeptid hergestellt und dieses Fusionspolypeptid durch die Zellen oder in vitro weiter prozessiert wird, wobei das authentische natürliche IFN-a-Polypeptid anfällt.

20 3OIFN-0C kann in einem eukaryontischen oder prokaryontisehen Träger in Abhängigkeit vom speziell konstruierten Expressions-Regulations-System hergestellt werden.

Beispielsweise kann die Expression in Prokaryonten mit dem trp-Transkriptions-Promotor durch Kontrolle der Tryptophan-25 Konzentration im Wachstumsmedium induziert werden. Andererseits kann die Herstellung auch konstitutiv verlaufen, entweder durch Einführung in einen trp-Repressor-defizienten Stamm oder durch Konstruktion unter Verwendung einer

trp-Operator-konstitutiven Mutante. 30

Das Wachstum unter den vorstehend erläuterten geeigneten Bedingungen

führt zur Akkumulation des durch genetische Manipulation konstruierten BoIFNa-Polypeptids. Der IFN-Extraktionsschritt hängt davon ab, ob das Produkt extra- oder intrazellulär anfällt. Im letzteren Fall beinhalten die Verfahren die Zerstörung der Zellmembran mit Enzymen, Detergen-

tien oder durch mechanische Kräfte. Das Reinigungsverfahren beruht auf den physikalisch-chemischen, immunologischen und biologischen Eigenschaften des BoIFNa, z.B. Beständigkeit bei niedrigem pH gegen Detergentien, Molekulargewicht von 18 000, Bindung an poly- oder monoclonale homologe Antikörper oder an IFNa-Rezeptoren und antivirale Aktivität.

Durch Kombination von Extraktion und differentieller Ausfällung mit Größen- und Affinitäts-Chromatographieverfahren wurde bakteriell hergestelltes BoIFNa bis zur hohen spezifischen Aktivität gereinigt. Die gereinigten IFNa-Präparate zeigten eine antivirale Wirksamkeit gegenüber einem breiten Spektrum verschiedener eukaryontischer Zellen (von Iς menschlichen Zellen bis zu Zellen niederer Säuger). BoIFNa hat aber eine besonders hohe Aktivität in Rinderzellen.

Die Figuren zeigen:

Figur 1: Konstruktions-Schema eines rekombinanten Plas^{mids zur} Expression eines BoIFN-aC-Fusionspoly-

peptids.

A) Verfahrensschritt bei der Insertion von Rinder-IFNQCC-Seguenzen in den trp-Express ions vektor pSE2: Der offene Balken zeigt das 360 bp trp-

25"" E.coli-Protiotor-Fragment . mit den ersten 6 Codons von trpL. Der schraffierte Balken zeigt 525 bp der codierenden Sequenz von BoIFN-O(C. Die Insertion des Rinder-DNA-PvuII-Smal-Fragmentes in die aufgefüllte EcoRI-Spaltstelle von pSE2

30 ergibt die EcoRI-Spaltstelle.

B) N-terminale Sequenzen des Fusionspolypeptids trpL-BoIFN-aC (f-BoIFN-aCC) .

1 Figur 2: Konstruktion von pBC-3 zur Expression von reifem Met-BoIFN-3i£·.

Die schraffierten Bereiche zeigen die codierende ¹ Region des reifen BoIFN-cCC Die schwarzen BaI-5 ken repräsentieren die Signalpeptid-Sequenzen.

Die Beispiele erläutern die Erfindung.

Beispiel 1 Isolierung hochmolekularer DNA aus Kälberleber

DNA zur Herstellung der Genbank wurde aus der Leber einer frisch geschlachteten Holstein-Friesland-Kuh gewonnen.

Die DNA wurde im wesentlichen nach Blin & Stafford gewonnen; vgl. Nucleic. Acid. 5es. 3 (1976), S. 9. 50 g gefrorenes Gewebe wurden in flüssigem Stickstoff in einem Mixer zu feinem Pulver vermählen. Das Pulver wurde nach und nach zu einer Lösung aus 400 ml Phenol und 400 ml Extraktionspuffer zugegeben (2OmM Tris-HCl, pH 7,6, 0,5 % SDS, 1,0 M NaCl, 1mM EDTA). Das Gemisch wurde auf einem Magnetrührer 30 Minuten gerührt und dann 10 Minuten bei 4000 Upm in einem Sorvall GSA-Rotor zentrifugiert.

25" Die wäßrige Phase wurde mit Phenol und dann mit Äther in einem Scheidetrichter reextrahiert.

Die DNA-Präparation wurde in einen Dialyseschlauch überführt und DNase-freie RNase wurde bis zu einer Endkonzentration vom 50 ng/ml zugefügt. Die Dialyse wurde bei Raum-

QQ temperatur über Nacht gegen 10 Liter 20 mM Tris-HCl, pH 7,6, 10 mM NaCl und 1 mM EDTA durchgeführt. EDTA (50 mM Endkonzentration), SDS (0,5 % Endkonzentration) und Proteinase K (100 μg/ml Endkonzentration) wurden zur DNA-Lösung zugegeben und es wurde 3 Stunden bei 37 C in-

kubiert.

- 13 Die DNA wurde zweimal mit Phenol extrahiert, mit Äthanol gefällt und in 10 mM Tris-HCl, pH 7,6, 1 mM EDTA (TE-Puffer) resuspendiert.

5 Beispiel2

Gewinnung von 16 kb großen DITA-Fragmenten auspartiell gespaltener Kälberleber-DNA

16 kb große Rinder-DNA-Fragmente wurden durch partielle Spaltung der DNA mit hohem Molekulargewicht mit dem Restriktionsenzym Sau 3A erhalten.

Das Enzym erkennt die 4 bp lange Sequenz GATC und bildet ein 4 bp langes überstehendes Ende. Das GATC-Ende ist homo-

15 log zu dem durch das PestrilcfcLonsenzym Bairßl erzeugten Ende.

BamHI wird später verwendet werden, um den linken und den rechten Arm des Vektors AL47.1 zu erhalten, die an die Rinder-DNA ligiert werden. 400 ^g hochmolekularer Kälberleber-DNA wurden mit 100 Einheiten Sau3A gespalten. Nach einstündiger Inkubation bei 37 C wurde die Reaktion durch Zugabe von Phenol gestoppt. Die DNA wurde zweimal mit Phenol/Chloroform extrahiert, mit Äthanol gefällt und in TE-Puffer gelöst.
Zur Fraktionierung wurde die gespaltene DNA 10 Minuten bei

25'""68⁰C erhitzt, dann auf 20⁰C abgeschreckt und auf einen Saccharosegradienten, 38 ml, 10 bis 40 %, in 1M NaCl, 20 mM Tris-HCl, pH 8,0 und 5 mM EDTA,aufgeschichtet. Die

Zentrifugation wurde bei 26 000 Upm in einem Beckman

SW 27-Rotor 24 Stunden bei 20⁰C durchgeführt. Es wurc 0,5 ml Fraktionen gesaircnelt und jeweils 10 μΐ Proben durch

Elektrophorese auf einem 0,8prozentigen Agarose-Gel analysiert. Gemäß der Elektrophorese wurden Gradientenfraktionen mit DNA-Fragmenten der Größe von 12 bis 18 kb vereinigt.

An dieser Stelle wurde festgestellt, daß es unmöglich ist, die DNA auszufällen. Es ergab sich, daß dazu sowohl Dialyse

als auch ein Konzentrationsschritt erforderlich sind. Die Dialyse wurde gegen 4 Liter TE-Puffer über Nacht durchgeführt. Die Konzentration wurde durch Chromatographie auf DEAE-Cellulose erzielt. Dialysefraktionen (8 ml) wurden auf eine 0,3 ml enthaltende DE-52-Säule, äguilibriert mit 0,1M NaCl, 0,01M Tris-HCl, pH 7,6, aufgetragen. Die Säule wurde dann mit mehreren Säulenvolumina Äquilibrierungspuffer gewaschen. Die gebundene DNA wurde dann mit 6,5 M Harnstoff, 1M NaCl und 10 mM Tris-HCl, pH 7,6, eluiert. 0,5 ml Fraktionen wurden gesammelt und die DNA-enthaltenden Fraktionen wurden vereinigt, gefällt und im Vakuum getrocknet.

Getrocknete Pellets der hochmolekularen DNA waren schwer zu lösen. Das vollständige Wiederauflösen in TE-Puffer mit

15 einer Konzentration von 1 μg/μl wurde durch 4stündige Inkubation bei Raumtemperatur erzielt. 400 ug chromosomaler Leber-DNA ergaben 60 p,g gereinigte 12-18 kb große DNA-Fragmente.

Beispiel 3 20

Herstellung von DNA des Bakteriophagen \L 47.1

Der Bakteriophage ^\.L47, hergestellt von Leonen und Brammar, Gene 10 (1980), S. 249, wurde als Clonierungs-

25' vektor zur Konstruktion der Genbank verwendet. Aus einer Phagensuspension mit 10 CsCl-gereinigten Partikeln wurde DNA isoliert. Das CsCl wurde durch zweimalige Dialyse der Dispersion gegen ein 1000-faches Volumen 50 mil Tris-HCl pH 8,0, 10 mM NaCl und 10 mM MgCl₂ entfernt.

30 Nach 2 Stunden wurden die Phagen aus dem Dialyseschlauch herausgenommen,· EDTA (Endkonzentration 20 mM) , SDS (Endkonzentration 0,5 %) sowie Proteinase K (50 μg/ml) wurden zugegeben und das Gemisch wurde 1 Stunde bei 65 C inkubiert. Danach wurde aufeinanderfolgend mit Phenol,

Phenol/Chloroform und Chloroform extrahiert.

- 15 ^ Beispiel4

Herstellung der " Λ Arme"

Zunächst muß bei den Λ-Bakteriophagen-Vektoren das mittlere "Speichersegment" ihres Genoms entfernt werden, damit die 15 bis 20 kb lange Fremd-DNA aufgenommen werden kann. Dieses Verfahren wird im allgemeinen als "Herstellung der Arme" bezeichnet. Im Fall vonÄL47 wird dies durch Spaltung der Phagen-DNA mit dem Restriktionsenzym BamHI und Zentrifugation der gespaltenen Phagen durch einen Saccharosedichtegradienten erzielt. Bei der Spaltung werden 3 Fragmente erhalten:
Ein 23,5 kb Fragment, das dem linken Armen entspricht, ein

jg 10,5 kb Fragment, das dem rechten Arm entspricht, sowie ein 6,6 kb "Speicherfragment".

Die qualitative Trennung der Arme vom Speicherfragment wurde einmal durch aneinanderlagern des rechten und des linken Arms des Vektors mittels der kohäsiven Enden erleichtert.

Die Aneinanderlagerung erfolgte dabei unter Bedingungen, unter denen sich die durch die Restriktions-Spa'ltung geschaffenen Enden nicht aneinanderlagern. Dabei wird noch vor der Saccharose-Dichtegradienten-Trennung ein 34 kb-Fragment gebildet. Zusätzlich wird das Speicher-Fragment weiter

25-· in seiner Größe reduziert. Dazu werden Enzyme verwendet, die lediglich dieses Fragment spalten. Im Fall von (\L47.1 wurden die Restriktionsenzyme Xhol und Sail verwendet. Dabei entstanden Fragmente, die kleiner als 4,3 kb sind. Im einzelnen wurde das genannte Verfahren folgendermaßen

gO durchgeführt:

150 ug Bacteriophagen-DNA wurden mit einem dreifachen Überschuß von BamHI gespalten. Nachdem die BamHI-Spaltung vollständig war, wurde die DNA mit Sail und Xhol behandelt. Die gespaltene DNA wurde zweimal mit Phenol/Chloroform extrahiert, Äthanol-gefällt und mit einer Konzentration von 150 μg/ml wieder in TE-Puffer aufgenommen. Um die rechten und linken Arme aneinander zu lagern, wurde MgCl₂ mit einer

— 1 ο —

I Konzentration von 10 itiM zugefügt und das Präparat

1 Stunde bei 42°C inkubiert. Die gespaltene und aneinandergelagerte DNA wurde auf einen Saccharosegradienten (38 ml, 10 bis 40 %) geschichtet. Der Puffer war 20 mM Tris-HCl, pH 7,6, 1 M NaCl und 5 mM EDTA. Auf einen Gradienten wurden nicht mehr als 60 μg DNA aufgetragen. Die Zentrifugation wurde in einem SW 27-Rotor bei 26 000 üpm 24 Stunden bei 15°C durchgeführt. 0,5 ml Fraktionen wurden gesammelt und 20 μΐ Proben jeder Fraktion wurden durch Gelelektro-

^q phorese analysiert. Die Fraktionen mit äquimolaren Mengen des linken und rechten Arms wurden vereinigt, dialysiert
und wie vorstehend für die gespaltene Kälberleber-DNA beschrieben konzentriert.
Drei Gradienten , beladen mit je 50 μg gespaltener DNA, er-

25 gaben 45 ug gereinigte Arme.

Beispiel 5 Ligierung, Verpackung und Amplifizierung

10 μg der Arme wurden an 2,5 μg Insertion in einem Gesamtvolumen von 100 μΐ in Gegenwart von 60 mM Tris-HCl, pH 8,0, 10 mM MgCl₂, 1 mM ATP, 15 mM DTT und 1000 Einheiten T4-Ligase (N.E. Biolabs) ligiert.

25- Die Reaktion wurde in 2 Stufen ausgeführt. Erst wurden die Arme mit Tris-Puffer und MgCl- vermischt und 1 Stunde bei 42°C zur Aneinanderlagerung der kohäsiven Enden des ^V-Phagen inkubiert. Dann wurden ATP, DTT, Rinder-DNA und Ligase zugegeben und die Reaktion wurde 16 Stunden bei

O₀ 14°C inkubiert.

Es wurde ein ft-Verpackungsgemisch verwendet, das im wesentlichen nach dem Verfahren von B. Hohn hergestellt wurde; vgl. Methods in Enzymology 68 (1979) ,. S. 299. 1 μg ligierte DNA ergab 7x10 pfu. Zur Herstellung einer

Ot- vollständigen Genbank wurden 4 μg ligierte DNA verwendet, wodurch sich eine Primärgenbank mit 2,8 χ 10 Phagen ergab.

-j Die Genbank kann durch Vermehren der Bacteriophagen in üblichen Sicherheitsstärmen auf NZCYM-Platten (1 % NZ-Amin, 0,5 % Hefeextrakt, 0,1 % Casaminosäuren, 0,2 % MgSO. und 1 % Agar)

amplifiziert werden. Im vorliegenden Fall wurde E. coli K12 LE392 verwendet. Aliquots des Verpackungsgemisches mit rekombinanten Bacteriophagen wurden mit den Bakterien vermischt und 20 Minuten bei 37 C inkubiert. Geschmolzener Deck-Agar (NZCYM + 0,5 % Agar) wurde zugegeben und die Suspension auf 150 mm Platten mit NZCYM-Agar ausplattiert. Jede Platte wurde mit 7 ml Deck-Agar mit jeweils 17 000 rekombinanten Bacteriophagen und 0,2 ml Wirtsbakterien überschichtet. Gleichzeitig wurden verschiedene Sätze zu je 30 Platten hergestellt. Insgesamt wurden 150 Platten verwendet, um die Genbank zu amplifizieren.

15 Die Platten wurden 9 Stunden bei 37°C inkubiert.

Um die Bacteriophagen zu sammeln, wurde der Deck-Agar der einzelnen Platten in einem sterilen Behälter vereinigt. Chloroform wurde zugegeben zu einem Endvolumen von 5 % und die Lysate wurden 15 Minuten bei Raumtemperatur unter ge-

^^υ legentlichem Schütteln inkubiert. Die Suspension wurde dann über Nacht bei 4°C stehengelassen um die Elution der Bacteriophagen zu ermöglichen. Zelldebris und Agar wurden dann durch 15minütige Zentrifugation bei 4°C entfernt.

Die Gesamtzahl von Bacteriophagen in der amplifizierten Gen-

95 ■ 1 2

bank betrug etwa 8 χ 10 pfu. Dies bedeutet eine Amplifi-

kation von 2,5 χ 10 gegenüber der Primär-Genbank.

• Die Genbank wurde bei der Deutschen Sammlung für Mikroorganismen, Göttingen, Grisebachstrasse 8, unter der Hinterlegungsnummer DSM 3297 und beim Israel Institute for Biological Research, P.O. Box 19, Ness-Ziona, Israel, unter der Hinterlegungsnummer BG-X-1 hinterlegt. Der Stamm E. coli LE392 wurde bei der Deutschen Sammlung für Mikroorganismen unter der Hinterlegunsnummer DSM 3293 hinterlegt.

Beispiel6 Bestimmung der Bedingungen für die Hybridisierung zwischen

HuIFNa-Gen und Rinder-Sequenzen
5

Um zu bestimmen ob HuIFNa-Sequenzen zur Analyse der Rinder-Genbank verwendet werden können, wurden genomische Rinder-DNA-Blots sowie verschiedene markierte Fragmente des im rekombinanten Plasmid pNIZ131 clonierten HuIFNaJI-Gens ¹^ hergestellt. Dazu wurden aus dem Plasmid pNIZ131 mit dem Restriktionsenzym Sau 3A vier Fragmente des HuIFNaJI-Gens zu 177, 207, 270 und 515 Basenpaaren herausgespalten, isoliert,

durch Nick-Translation mit [α- P]-dATP markiert und unter verschiedenen Hybridisierungsbedingungen mit den genomischen Rinder-Blots hybridisiert.

Mit dem Fragment Sau3A 177 (dieses Fragment überstreicht den N-terminalen Bereich der codierenden Region) wurden scharfe Banden gefunden. Daher wurde dieses Fragment als Sondenmolekül für das Absuchen der Genbank verwendet.

20 Das Plasmid pNIZ131 in E. coli LE392 wurde beim Israel Institute for Biological Research unter der Hinterlegungsnummer 1-9 und bei der Deutschen Sammlumg für Mikroorganismen unter der Hinterlegungsnummer DSM 3294 hinterlegt.

Beispiel 7 Absuchen der Genbank nach Interferon-Sequenzen

Die Genbank wurde auf 150 mm Petrischalen mit einer Konzentration von 30 000 Bacteriophagen pro Platte ausplattiert.

30 Platten wurden verwendet, wobei jede Platte folgendermaßen hergestellt wurde: 50 μΐ Bacteriophagensuspension wurden mit 0,2 ml einer E.coli LE 392 Übernachtkultur vermischt und 20 Minuten bei 37⁰C inkubiert. Dann wurden 7 ml Deckagarose (0,7 % Agar in NZYCM-Medium) zugegeben und das Gemisch wurde auf einer vorgetrockneten NZYCM + t,5 % Agar-Platte ausplattiert.

Die Platten wurden bei 37°C inkubiert, bis die Plaques einen Durchmesser von 1 mm erreicht hatten (etwa 7 Stunden) und wurden dann 1 Stunde bei 4°C abgeschreckt, um den Deckagar zu verfestigen.

Die Plagues wurden auf runde Nitrocellulosefilter überführt. Dazu wurden die Filter auf den Softagar 10 Minuten

aufgelegt. Die Filter wurden dann abgehoben und mit einer Denatürierungslösung bestehend aus 1,5 M NaCl und 0,5 M NaOH 30 Sekunden lang benetzt. Die Filter wurden dann weitere 30 Sekunden in die Lösung eingetaucht und in eine Neutralisierungslösung überführt (1,5M NaCl, 0,5 M Tris-HCl, pH8, 5 Minuten). Die Filter wurden in 2 χ SSC gespült, bei Raumtemperatur getrocknet und 2 Stunden bei 80⁰C unter vermindertem Druck gebacken.

Die Filter wurden zunächst sorgfältig in 6 x SSC und dann in eine Schale mit 300 ml Waschlösung überführt (50 mM Tris-HCl, pH 8,0, 1 M NaCl, 1 mM EDTA, 0,1 % SDS) und unter ständigem Schütteln bei 42°C inkubiert. Nach 2 Stunden wurden die Filter wieder herausgenommen und in eine Schale mit 100 ml Prähybridisierungs-Lösung überführt (50 % deionisiertes Formamid, 5 χ Denhardt's-Lösung, 6 χ SSC, 0,5 % SDS und 100 μg/ml denaturierte Lachsspermien-DNA).
Die Prähybridisierung wurde 4 Stunden durchgeführt. Danach

25' wurde hitzedenaturierte P-markierte Sondenmolekül-DNA (Sau3A 177-Fragment) direkt in die Prähybridisierungs-Lösung zugegeben. Nach 48 Stunden Hybridisierung bei 42 C wurden die Filter in 2x SSC, 0,1 % SDS gewaschen. Das Waschverfahren bestand aus drei 15minütigen Waschvor-

30 gangen bei Raumtemperatur sowie einem nachfolgenden 1,5-Stunden Waschgang bei 42 C.

Die Filter wurden getrocknet und zur Belichtung eines Röntgenfilms verwendet. 13 Hybridisierungssignale wurden identifiziert.

phagen entsprechend jedem Hybridisi»irungssignal wurden ausplattiert und wieder mit dem 177 bp Sondenmolekül hybridisiert. Auf dieser Stufe wurde ermittelt, daß die Clone 105, 116 und

120 weniger stark als die Clone 103, 107, 108, 111, 115 und 118 hybridisierten. Die übrigen Clone hybridisierten nicht mehr mit dem Sondenmolekül. Die Clone, die wieder hybridisierten wurden weiter angereichert. Die A DNA wurde isoliert und mit den Restriktionsenzymen BamHI, Hindlll und EcoR I gespalten, auf einen Nitrocellulosefilter geblotet und nochmals mit dem HuIFNa 177 bp-Sondenmolekül sowie mit den HuIFNa-270- und 515 bp-Sondenmolekülen hybridisiert. Es ist wahrscheinlich, daß jeder Clon, der mit allen drei Sondenmolekülen hybridisiert ,eine BoIFNa-Sequenz trägt.

Von 9 getesteten Clonen hybridisierten 6 mit allen drei Sondenmolekülen. Clone, die weder mit dem 270 bp-Sondenmolekül noch dem 515 bp- Sondenmolekül hybridisierten, waren dieselben wie die, die mit dem 177 bp-Sondenmolekül beim ersten Absuchen der Genbank schwach hybridisierten. Folglich ist es wahrscheinlich, daß die Clone 103, 107, 108, 111, 115 und 118 einen wesentlichen Teil der BoIFNa-Sequenzen tragen.

Beispiele

LagebeStimmung der Interferon-Sequenzen auf der 7v~Hybrid DNA

Durch Mehrfachspaltungen mit den Restriktionsenzymen Hind III, BamH I, EcoR I und Sal I wurden Restriktionskarten der Clone 103, 107, 108, 111, 115 und 118 erstellt.

Aus diesen Restriktionskarten geht hervor, daß die Clone 115 und 118 überlappende Bereiche auf den Rinderchromosomen repräsentieren.

Um die Lage der BoIFN-Sequenzen zu ermitteln, wurden Blots von jedem der mit den vorstehend beschriebenen Restriktionsenzymen gespaltenen Clone getrennt mit jedem der drei verschiedenen Sau3A-Sondenmoleküle von HuIFNa hybridisiert

¹ (177 bp, 270 bp und 515 bp).Insgesamt geht aus den

Restriktionsspaltungen und Hybridisierungsexperimenten hervor, daß sich im Rinder-Genom mindestens 5 verschiedene IFNa-Gene befinden.

Die Clone 103, 107, 108 und 115 wurden weiter charakterisiert. Es wurden DNA-Fragmente isoliert, die den gesamten hybridisierenden Bereich jedes dieser Clone tragen, in der Hind Ill-Spaltstelle des Plasmids pBR322 subcloniert und anschließend nach Maxam und Gilbert sequenziert; vgl. Proc, Natl. Äcad. Sei. USA 74 (1977), S. 560. Plasmide, die die interessierende genomische Insertion tragen,wurden mit geeigneten Restriktionsenzymen gespalten. Die DNA-

32 —

Fragmente wurden mit [a- P ]-Deoxynucleotiden unter Verwendung des großen Fragments der E.coli DNA-Polymerase I 15

radioaktiv markiert.

Die Gene der Clone 103, 108, 115 und 107 wurden als BoIFN-aA, BoIFN-cxB, BoIFN-aC und BoIFN-aD bezeichnet. Die Sequenz des Gens BoIFN-aA ist in Tabelle 1 abgebildet. Die

Sequenz des Gens BoIFN-aB ist in Tabelle 2, die Sequenz des 20

Gens BoIFN-aC in Tabelle 3 und die Sequenz des Gens

BoIFN-otD ist in Tabelle 4 abgebildet. Die 4 Sequenzen enthalten ein offenes Leseraster mit 570 Basenpaaren, das für 189 Aminosäuren codiert. Die ,.ersten 23 Aminosäuren der potentiellen Polypeptide bilden das Signalpeptid, das für IFNot-Moleküle charakteristisch ist. Die potentiellen reifen Proteine sind sehr nahe miteinander verwandt (Tabelle 5). Ihre Aminosäuresequenz ist stark konserviert und weist eine durchschnittliche Homologie von 93 % auf. Alle 4 Polypeptide ähneln menschlichen IFNa's. Die Homologie zwischen der potentiellen Aminosäuresequenz des BoIFN und der Consensus-Sequenz der menschlichen IFNa's beträgt größenordnungsmäßig 65 %; vgl. D.U. Goeddel et al., Nature 290 (1981), S. 20.

Beispiel 9 Herstellung von Expressionsvektoren

um zu zeigen, daß die BoIFNcc-Gene biologische Aktivität aufweisen, war es erforderlich dieses Protein herzustellen. Deshalb wurden gut funktionierende Expressions-Vektoren zur Herstellung des IFNa-Polypeptids konstruiert.

Hier wird die Verwendung eines solchen Vektors, nämlich pSE2, beschrieben. In diesem sind E.coli trp-Sequenzen als Expressionskontrollelemente eingebaut. Dieses trp-Promotor-Plasmid gehört zu einer Familie von trp-Expressionsvektoren, die bereits bekannt sind; vgl. Rose Shafferman, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 78 (1981), S. 6670; Shafferman et al., J. Mol. Biol. 161, S. 57; Grosfeld et al., M.G.G. 195 (1984), S. 358.

pSE2 hat eine einzige EcoRl Spaltstelle innerhalb des Codons der trp L-Region. pSE2 wurde mit EcoR I gespalten. Die überstehenden Enden wurden mit dem großen Fragment der DNA-Polymerase I aufgefüllt. Diese DNA wurde an das PvuII - Sma I-Fragment des Clons 115 ligiert. Dieses Fragment enthält den gesamten codierenden Bereich für das

reife BoIFN-o-c sowie 24 bp, die für einen Teil des Signal-25-

peptids codieren. Plasmide, die das BoIFN-dC-DNA-Fragment

in der geeigneten Orientierung enthalten/wurden isoliert und analysiert um richtige Fusionsprodukte zwischen trp L-Sequenzen und Rinder-IFN-Sequenzen zu gewährleisten. Das

erhaltene Plasmid wurde pBC-1 genannt (Figur 1). 30

Verschiedene trp-Expressions-Vektoren wurden verwendet, z.B. pHG5 (Grosfeld et al., M.G.G. 195 (1984), S. 358), um ein reifes Met-IFN-a-Polypeptid herzustellen. Besonders günstig war dabei die einzige CIa I-Spaltstelle in oHG5 und die Fnu4HI-Spaltstelle an Position 154 der BoIFN-äC-Sequenz; vgl. Figur 2.

351 3A70

Plasmide, die die verschiedenen BoIFN-Derivate tragen, wie die, die das ifet-reifes BoIFN tragen, wie pBC-3 (Fig. 2) wurden zur Transformation verschiedener E.coli-Stämme verwendet .
5

Das Plasmid pHG5 in E. coli C600 und das Plasmid pSE2 in E.

coli LE392 wurden beim Israel Institute for Biological Research unter der Hinterlegungsnummer AS56 und AS211 sowie bei der Deutschen Sammlung für Mikroorganismen unter der Hinterlegungs- - nummer DSM 3296 und DSM 3295 hinterlegt.

Beispiel 10 Herstellung und Reinigung eines BoIFN-aC-Poiypeptid-

Derivats
15

Es wird die Herstellung und die Reinigung von BoIFN-aC-Polypeptidderivaten beschrieben, die von pBC-1 oder pBC-3 codiert werden.

E. coli LE392 Zellen, die pBC-1 oder pBC-3 tragen, wurden

20 8

bis zu einer Dichte von 8x10 Zellen/ml in L-Medium gezüchtet, das mit 0,5 % K₂HPO₄ und 0,2 % KH₃PO₄ angereichert

war.

Das BoIFN-aC-enthaltende Bakterienextrakt wurde 60 Minuten

bei 28 000 üpm in einem R-30-Beckman-Rotor zentrifugiert 25" ,

und der überstand wurde abgenommen. Die Proteine wurden mit 7,5 % TCA gefällt. Der Niederschlag wurde in 0,1 M K-Phosphatpuffer, pH 8,0, resuspendiert und die nicht löslichen Proteine wurden durch Zentrifugation entfernt. Der

klare überstand wurde zur monoclonalen Affinitätschromato-30

graphie direkt auf eine Säule aufgetragen. Eine im Handel erhältliche Säule (Serono Diagnostic Nr. 23-4), die monoclonale Antikörper gegen HulFN-a (34) enthält, erwies sich als geeignet zur Reinigung von BoIFN-aC. Nach dem Aufbringen des klaren Überstandes wurde die Säule mit mehreren Volumina 0,3 M NaCl in 0,1 M Kalium-Phosphat-Puffer, pH 8,0, gewaschen und das IFN wurde mit 0,3 M NaCl in

0,1 M Acetat-Puffer, pH 2,4, eluiert. Die Kapazität der Säule beträgt 5x10 Einheiten BoIFN pro ml Säulenmaterial. Eine 200-fache Reinigung wurde mit 50prozentiger Ausbeute erzielt. Die spezifische Aktivität des auf diese

Weise erhaltenen Präparats betrug etwa 2 χ 10 Einheiten/mg Protein. Das BoIFN-aC-Präparat ist aufgrund der SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese anscheinend homogen.

Beispiel 11 10

Charakterisierung des genetechnologisch hergestellten BoIFHa-Produkts

Das gereinigte BoIFNa-Polypeptid-Derivat wurde auf seine biologische antivirale Aktivität mit dem CPE-Verfahren unter Verwendung von VSV als infektiösem Agens ausgetestet.
Die Testswurden mit den folgenden Zellen ausgeführt:

Mensch: HeLa und FS11

Affe: Vero

Rind: MDBK und EBtr

Nagetiere: L929 und BHK

Bei den Rinder-Zellinien wurde eine ausgeprägte virale 25' Aktivität beobachtet.

Natürlich können für diesen Test auch ähnliche menschliche Zellen, Affenzellen, Rinderzellen oder Nagetierzellen verwendet werden, die dem Fachmann bekannt sind.

Immunologische Eigenschaften:

Die antivirale Aktivität des bakteriellen IFNa wurde durch anti-Human-IFN-a- oder anti-Human-IFN-ß-Antikörper neutralisiert. Es wurde jedoch gezeigt, daß

35 BoIFN-aC antigene Determinanten mit den HuIFNa's gemeinsam hat. Dazu wurden Bindungsexperimente mit immobilisierten anti-Human-a-Interferon-Antikörpern durchgeführt.

- 25 ¹ Physikalisch-chemische Eigenschaften:

a. Stabil bis pH 2 für 2 Stunden bei 37°C.

b. Stabil bis zu einer SDS-Konzentration von 0,1 % bei
einer Halbwertszeit von mehr als 5 Stunden.

c. Das IFNa-Polypeptid wandert auf SDS-Polyacrylamid-Gelen an einer Stelle, die einem Molekulargewicht
von ungefähr 18 000 entspricht.

Die folgenden Tabellen geben die DNA-Sequenzen an, die
für die erfindungsgemäßen Produkte codieren und beschreiben außerdem die Zusammensetzung der erfindungsgemäßen
Rinder-Interferon-Typen:

¹⁵ Tabelle I:

Nucleotidsequenz des BoIFN-cxA-Gens und die entsprechende Aminosäure-Sequenz von pre-BoIFN-aA und von reifem
BoIFN-aA. Im reifen Met-BoIFN-aA geht dem Cys-Codon ein Methionin-Codon voraus (an der mit dem schwarzen Dreieck

gekennzeichneten Position).

Tabelle II;

Nucleotidsequenz des BoIFN-aB-Gens und die entsprechende

Aminosäuresequenz von pre-BoIFN-aB und von reifem

BoIFN-aß. Im reifem Met-BoIFN-cxB geht dem Cys-Codon ein ' Methionin-Codon voraus (an der mit dem schwarzen Dreieck

gekennzeichneten Position).

Tabelle III:

Nucleotidsequenz des BoIFN-aC-Gens und die entsprechende Aminosäuresequenz von pre BoIFN-aC und von reifem
BoIFN-aC. Im reifem Met-BoIFN-aC geht dem Cys-Codon ein Methionin-Codon voraus (an der mit dem schwarzen Dreieck

gekennzeichneten Position).

_ 26 _

Tabelle IV:

Nucleotidsequenz des BoIFN-aD-Gens und die entsprechende Aminosäuresequenz von pre-BoIFN-ctD und von reifem BoIFN-aD. Im reifen Met-BoIFN-cxD geht dem Cys-Codon ein Methionin-Codon voraus (an der mit dem schwarzen Dreieck gekennzeichneten Position).
Tabelle V:

Zeigt einen Vergleich der Aminosäuresequenz von BoIFN-aA, -cxB,-aC sowie -aD. Die Sequenz des reifen BoIFN beginnt bei Aminosäure 1 (Cys) während die des pre-BoIFN zusätzlich ein 23 Aminosäuren-langes Signalpeptid trägt (Die Zahlenangaben bei den Aminosäuren des Signalpeptids sind durch "S" gekennzeichnet). Bei diesem Sequenzvergleich werden nur Abweichungen von der Aminosäuresequenz von BoIFN-aC gezeigt.

CTGAAGGAAGGTCTTCAGAGAACCTAGAGAGCAGGTTCACAGAGTCACCCACCTCACCAG

GCCAAAGCATCTGCAAGGTCCCCGATGGCCCCAGCCTGGTCCTTCCTGCTATCCCTGTTG

MetAlaPrOAlaTrpSerPheLeuLeuSerLeuLeu

ctgctcagctgcAacgccatctgctctctgggttgccacctgcctcacacccacagcctg LeuLeuSerCysAsnAlalleCysSerLeuGlyCysHi sLeuProHisThrH i sSerLeu

GCCAACAGGAGGGTCCTGATGCTCCTGCAACAACTGAGAAGGGTCTCCCCTTCCTCCTGC AlaAsnArgArgValLeuttetLeuLewGlnGlnLeuArgArgyalSerProSerSerCys

CTGCAGGACAGAAATGACTTCGAATTCCTCCAGGAGGCTCTGGGTGGCAGCCAGTTGCAG LeuGlnAspArgAsnAspPheGluPheLeuGlnGluAlaLeuGlyGlySerGlnLeuGln

AAGGCTCAAGCCATCTCTGTGCTCCACGAGGTGACCCAGCACACCTTCCAGCTCTTCAGC LysAlaGlnAlalleSerValLeuHisGluValThrGlnHisThrPheGlnLeuPheSer

ACAGAGGGCTCGCCCGCCACGTGGGACAAGAGCCTCCTGGACAAGCTACGCGCTGCGCTG ThrGluGlySerProAlaThrTrpAspLysSerLeuLeuAspLysLeuArgAlaAlaLeu

GATCAGCAGCTCACTGACCTGCAAGCCTGTCTGACGCAGGAGGAGGGGCTGCGAGGGGCT AspGlnGlnLeuThrAspLeuGlnAlaCysLeuThrGlnGluGluGlyLeuArgGlyAta

CCCCTGCTCAAGGAGGACTCCAGCCTGGCTGTGAGGAAATACTTCCACAGACTCACTCTC ProLeuLeuLysGluAspSerSerLeuAlaValArgLysTyrPheHi sArgLeuThrLeu

TATCTGCAAGAGAAGAGACACAGCCCTTGTGCCTGGGAGGTTGTCAGAGCAGAAGTCATG TyrLeuGlnGluLysArgH isSerProCysAlaTrpGluValVaIArgAIaGIuVaI riet

AGAGCCTTCTCTTCCTCAACAAACTTGCAGGAGAGTTTCAGGAGAAAGGACTGACACACA ArgAlaPheSerSerSerThrAsnLewGlnGluSerPheArgArgLysAspENDi

CCTGGTCCAACACGGAAA .

(D

(D

co

TGAACCCATTTGGAGAGTGCAAGCTGAAACGCAAAAACAAAAGT

AGAAAACAAGAGGGAACTTTCACAAAGTGGAAACCATGGGCTCCTATTtAAGACACAGGC CTGAAGGAAGGTCTTCAGAGAATCTAGAGAGCAGGTTCACAGAGTCACCCACCGCCCGAG

gccaaagcctotgcaaggtccccgatggccccagcctggtccttcctcctagccctgctg

PletAlaPraAlaTrpSerPheLeuLeuAlaLeuLeu

CTGCTCAGCTGCAACGCCATCTGCTCTTTGGGTTGCCACCTGCCTCACACCCACAGCCTG LeuLeuSerCysAsnAlalleCysSerLeuGlyCysH i sLeuProH i sThrH i sSerLeu

CCCAACAGGAGGGTCCTGACACTCCTGCGACAACTGAGGAGGGTCTCCCCTTCCTCCTGC F'roAsnArgArgValLeuThrLeuLeuArgGlnLeuArgArgyalSerF'roSerSerCys

CTGCAGGACAGAAATGACTTTGCATTCCCCCAGGAGGCGCTGGGTGGCAGCCAGTTGCAG LfeuGlnAspArgAsnAspPheAlaPheProGlnGluAlaLeuGlyGlySerGlnLeuGln

AAGGCTCAAGCCATCTCTGTGCTCCACGAGGTCACCCAGCACACCTTCCAGCTCTTCAGC LysAlaGlnAlalleSerValLeuHi sGluValThrGlnHisThrPheGlnLeuPheSer

ACAGAGGGCTCGGCCACTACGTGGGACGAGAGCCTCCTGGACAAGCTCCACGCTGCACTG ThrGluGlySerAlaThrThrTrpAspGluSerLeuLeuAspLysLeuHi sAlaAlaLeu

GATCAGCAGCTGACTGACCTGCAAGCCTGTCTGAGGCAGGAGGAGGGGCTGCGAGGGGCT AspGlnGlnLeuThrAspLeuGlnAlaCysLeuArgGlnGluGluGlyLeuArgGlyAla

CCCCTGCTCAAGGAGGGTTCCAGCCTGGCTGTGAGGAAATACTTCCACAGACTCACTCTC ProLeuLeuLysGluGlySerSerLeuAlaValArgLysTyrPheHi sArgLeuThrLeu

TATCTGCAAGAGAAGAGACACAGCCCTTGTGCCTGGGAGGTTGTCAGAGCAGAAGTCATG TyrLeuGlnGluLysArgHi sSerProCysAlaTrpGluValValArgAlaGluValliet

AGAGCCTTCTCTTCTTCAACAAACTTGCAGGAGAAATTCAGGAGAAAGGACTGACACACA ArgAlaPheSerSerSerThrAsnLeuGlnGluLysPheArgArQLysAspEND: .

CCTGGTTCAACATGGAAA

AGAAAGCAAGAGGGAACTTTCAGAAAATGGAAACCATGGGCTCCTATTTAACACACAGGC CTGAAGGAAGGTCTTCAGAGAACCTAGAAAGCAGGTTCACAGAGTCACCCACCTCCCCAG

GCCACAGCATCJGCAAGGTCCCCAATGGCCCCAGCCTGGTCCTTCCGCCTGGCCCTGCTG

.' MetAlaProAlaTrpSerPheArgLeuAlaLeuLeu

CTGCTCAGCTGCAATGCCATCTGCTCTCTGGGCTGCCACCTGCCTCACACCCACAGCCTG LeuLeuSerCysAsnAlalleCysSerLeuGlyCysHi sLeuProHi sThrH i sSerLeu

GCCAACAGGAGGGTCCTGATGCTCCTGGGACAACTGAGGAGGGTCTCCCCTTCCTCCTGC AlaAsnArgArgyalLeulietLeuLäuGlyGlnLeuArgArgValSerProSerSerCys

CTGCAGGACAGAAATGACTTTGCATTCCCCCAGGAGGCGCTGGGTGGCAGCCAGTTGCAG LeuGlnAspArgAsnAspPheAlaPheProGlnGluAlaLeuGlyGlySerGlnLeuGln

AAGGCTCAAGCCATCTCTGTGCTCCACGAGGTGACCCAGCACACCTTCCAGCTTTTCAGC LysAlaGlnAlalleSerValLeuHi sGluValThrGlnH i sThrPheGlnLeuPheSer

ACAGAGGGCTCGGCCACCATGTGGGATGAGAGCCTCCTGGACAAGCTCCGCGATGCACTG Thr GI uG I y Ser AI aThr Me t.Tr ρ A spGluSerLeuLeu A spLysLeu Arg Asp AI aLeu

GATCAGCAGCTCACTGACCTGCAATTCTGTCTGAGGCAGGAGGAGGAGCTGCAAGGAGCT AspG1nGXnLeuThrAspLeuGInPheCysLeuArgGInGIuGIuGluLeuGInGIyAIa

CCCCTGCTCAAGGAGGACTCCAGCCTGGCTGTGAGGAAATACTTCCACAGACTCACTCTC ProLeuLeuLysGluAspSerSerLeuAlaValArgLysTyrPheHi sArgLeuThrLeu

TATCTGCAAGAGAAGAGACACAGCCCTTGTGCCTGGGAGGTTGTCAGAGCACAAGTCATG TyrLeuGlnGluLysArgH isSerProCysAlaTrpGluValVaIArgAlaGlnValfiet

AGAGCCTTCTCTTCCTCAACAAACTTGCAGGAGAGTTTCAGGAGAAAGGACTGACACACA ArgAlaPheSerSerSerThrAsnLeuGlnGluSerPheArgArgLysAspEND'

CCTGGTTCAACACGGAAATGATTCTCATGGACCAACAGACCACACTTCCTCCTGCGCfGC CATGTGGAAGATTCATTTCTGCTGTCATCAGGCACTGAACTGAATCAATTTGTTAAATGA

AGAAAGCAAGAGGGAACTTTCAGAAAATGGAAACCATGÜACTCCTATTTAAGACACAGAC CTGAAGGAAGG7CTTCAGAGAACCTAGAAAGCAGGTTCACAGAGTCACCCACCGCCCCAG

GCCACAGCCACTTCAAGGTCCCCGATGGCCCCAGCCTGGTCCCTCCTCCTGGCTCTGCTG

MetAlaProAlaTrpSerLeuLeuLeuAlaLeuLeu

CTGCTCAGCTGCAACGCCATCTGCTCTCTGGGCTGCCACCTGCCTCACTCCCACAGCCTG LeuLeuSerCysAsnAlalleCysSerLeuGlyCysH i sLeuProHisSerHisSerLeu

gccaagaggagagtcctgacactcctgcgacaactgaggagggtctccccttcctcctgc AlaLysArgArgValLeuThrLeuLeuArgGlnLeuArgArgyaISerProSerSerCys

CTGCAGGÄCAGAAATGACTTCGCATTCCCCCAGGAGGCGCTGGGTGGCAGCCAGTTGCAG LeuGlnAspArgAsnAspPheAtaPheProGlnGluAlaLeuGlyGlySerClnLeuGln

AAGGCTCAAGCCATCTCTGTACTCCACGAGGTGACCCAACACACCTTCCAGCTTTCCAGC LysAlaGlnAlalleSerUalLeuHisGluValThrGlnHi sThrPheGlnLeuSerSer

ACAGAGGGCTCGGCCGCTGTGTGGGATGAGAGCCTCCTGGACAAGCTCCGCACTGCACTG ThrG I uG 1 y Ser AI a AI a Va 1 TrpAspG I uSerLeuLeuAspLy stleu A»~gTh»~A I aLeu

GATCAGCAGCTCACTGACCTGCAAGCCTGTCTGAGGCAGGAGGAGGGGCTGCCAGGGGCT AspGlnGlnLeuThrAspLeuGf-nAlaCysLeMArgGlnGluGluGlyLeuPnoGlyAla

CCCCTGCTCAAGGAGGACTCCAGCCTGGCTGTGAGGAAATACTTCCACAGACTCACTCTC ProLeuLeuLysGluAspSerSerLeuAlaValArgLysTyrPheHi sArgLeuThrLeu

TATCTGCAAGAGAAGAGACACAGCCCTTGTGCCTGGGAGGTTGTCAGAGCACAAGTCATG TyrLeuGlnGluLysArgHisSerProCysAlaTrpGluyalValArgAlaGlnValMet

agagccttctcttcctcaacaaacttgcaggagagattcaggagaaaggactgacacaca

ArgAlaPheSerSerSerThrAsnLeuGlnGluArgPheArgArgLysAapEND
CCTGGTTCAACACGGAAATGATTCTCACGGACCAACAGACCACACTTCCTCCTGCGCTGC

CATGTGGAAGACTCATTTCTGCTGTCATCAGGCACTGAACTGAATCAATfTGTTAATGGT

tr

(D

(D H

co '■: ■

Tabelle V

Sl , S20 1 20 40

BoIFN- C MAPAWSFRULLLLSCNAICSLGCHLPHTHSLANRRVLMLLGQLRRVSPSSCLQDRNOFAFPQ BoIFN- ALS Q EL

BoIFN- B L PTR

BoIFN- D LL SKTR

60 80 100

BoIFN- C EALGGSQLQKAQAISVLHEYTQHTFQLFSTEGSATMWDESLLDKLRDALDQQLTDLQFCLRQE BoIFN- A PAT K A AT

BoIFN- B T HA A

BoIFN- D . S AV T A

120 140 160

Bo IFN- C EELQGAPLLKEDSSUVRKYFHRLTLYLQEKRHSPCAWEVVRAQVMRAFSSSTNLQESFRRKD

BoIFN- AGR E

BoIFN- BGRG E K

BoIFN- DGP R

Claims (15)

Patentansprüche 15

1. Gentechnologisch hergestelltes, im wesentlichen reines Rinder-IFNa/gekennzeichnet durch

folgende Parameter:

Schutz vor Rinder-Zellen gegen Virusinfektionen; Bindung an immobilisierte anti-HuIFN-Antikörper; mindestens 2 Stunden stabil bei pH 2;

stabil bei einer SDS-Konzentration von 0,1 % mit einer

Halbwertszeit von mehr als 5 Stunden;

Wanderung auf SDS-Polyacrylamid-Gelen an einer Stelle, ²⁵ die einem Molekulargewicht von etwa 18 000 entspricht.

2. Gentechnologisch hergestelltes, im wesentlichen reines Rinder-IFNoC nach Anspruch 1 als pre-IFN-oA, pre-IF.N-aB, pre-IFN-aC,

pre-IFN-aD, mat-IFN-aA, mat-IFN-aB, mat-IFN-aC, mat-IFN-aD, Met-mat-IFN-aA, Met-mat-IFN-aB,

Met-mat-IFN-aC oder Met-mat-IFN-aD, wobei mat das reife Interferon kennzeichnet und Met Methionin bedeutet.

3. pre-BoIFN-αΑ, pre-BoIFN-aB, pre-BoIFN-aC und

35 pre-BoIFN-aD nach Anspruch 2 mit Aminosäure-Sequenzen gemäß Tabelle 1 bis 5.

ORIGINAL INSPECTED

4. Reifes BoIFN-αΑ, BoIFN-αΒ, BoIFN-aC und BoIFN-aD

nach Anspruch 2 mit der in den Tabellen 1 bis 5 abgebildeten und beim schwarzen Dreieck bzw. an der Position 1 beginnenden Aminosäure-Sequenz.

5. Reifes Met-EoIFN-aA, Met-BoIFN-aB, Met-BoIFN-aC und Met-BoIFN-aD nach Anspruch 2 mit der in den Tabellen 1 bis 4 abgebildeten und beim schwarzen Dreieck beginnenden Aminosäure-Sequenz, das am Amino-Terminus jeweils einen

zusätzlichen Methionin-Rest trägt.

6. Doppelsträngiges DNA-Molekül enthaltend eine DNA-Sequenz, die für BoIFN-αΑ, BoIFN-αΒ, BoIFN-aC oder BoIFN-aD codiert.

7. Doppelsträngiges DNA-Molekül nach Anspruch 6 mit einer DNA-Sequenz gemäß Tabelle 1 bis 4.

8. Doppelsträngiges DNA-Molekül, das für BoIFN-αΑ, BoIFN-αΒ, BoIFN-aC oder BoIFN-aD codiert.

9. Doppelsträngiges DNA-Molekül nach Anspruch 8 mit einer für den codierenden Bereich angegebenen DNA-Sequenz gemäß Tabelle 1 bis 4.

10. Rekombinanter Vektor, enthaltend eine DNA-Sequenz, die für ein Rinder-IFNa mit einer Aminosäure-Sequenz nach Anspruch 3 bis 5 codiert.

11. Rekombinanter Vektor, enthaltend eine DNA-Sequenz nach Anspruch 6 bis 9.

12. Rekombinanter Vektor, enthaltend eine DNA-Sequenz, die komplementär zu einer m-RNA für Rinder-IFNa ist. 35

13. Transformierte Wirtszelle, enthaltend ein DNA-Molekül gemäß einem der Ansprüche 6 bis 12.

14. Verfahren zur Identifizierung einer Rinder-IFNa-DNA-Sequenz, dadurch gekennzeichnet, daß man ein markiertes
menschliches IFNa-JI-Fragment folgender DNA-Sequenz

_. ι ATC aC CGG TCC TTt TCT TU CTC ATC CCC CTC CTC CTA CTC'

» ■

ACC TAC AAA TCC AlC TCC TCT CTC GCC TCT CAT CTG CCT CAC ACC CAC ACC CTG CGT AAT AGG ACG CCC TTG AU 10

CTC CTG CCA CAA ATC GGA AGA ATC TCT CCT TTC TCC TCC TTG AAC GAC AGA CAT GAA TTC AGA TTC CCG GAG GAG

GAG TTT CAT CCC CAC CAG TTC CAG AAG ACT CAA CCC ATC TCT CTC CTC CAT CAG ATG ATC CAG CAG ACC TTC AAT

CTC TTC AGC AU GAG .GAC TCA TCT GCT GCT TCG CAA CAG AGC CTC CTA GAA AAA TTT TCC ACT GAA CTT TAC CAG

CAA CTC AAT GAC CTC GAA CCA TCT GTC ATA CAG GAG Γ,ΤΤ GGG GTG GAA GAG ACT CCC CTG ATG AAT GAG GAC TTC

ATC CTC CCT GTG AGC AAA TAC TTC CAA AGA ATC ACT CTT TAT CTA ACA GAG AAG AAA TAC AGC CCT TGT CCC TGG 20

CAC GTT CTC ACA CCA GAA ATC ATG AGA TCC TTC TCT TTT Ta ACA AAC TTG AAA AAA GGA TTA ACC AGG AAG CAT

mit einer Rinder-DNA hybridisiert, die in einer eukaryonti-25"" sehen Zelle oder in einem rekombinanten Vektor enthalten ist oder daraus isoliert wurde, und daß man die hybridisierenden Clone oder ihre DNA isoliert.

15. Verfahren zur Herstellung von BoIFN-aA, BoIFN-aB,
BoIFN-aC oder BoIFN-aD, dadurch gekennzeichnet, daß man
eine Wirtszelle nach Anspruch 13 unter Kulturbedingungen
züchtet, die die Expression der für das entsprechende
Rinder-IFNa codierenden DNA-Sequenz gestatten, und daß
man das entstandene Interferon isoliert.

SAD ORIGINAL