DE3308215C2 - Expression, Processing und Sekretion von heterologem Protein durch Hefe - Google Patents
Expression, Processing und Sekretion von heterologem Protein durch HefeInfo
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- Y10S930/14—Lymphokine; related peptides
- Y10S930/142—Interferon
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
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Description
Die Erfindung betrifft allgemein das Gebiet der
rekombinaten DNA-Technik unter Verwendung von
Hefewirtssystemen und Expresionsträgern, die Expression,
Processing und Sekretion von heterologem Protein als
diskretem Produkt bewirken.
Insbesondere betrifft die Erfindung ein Verfahren zur
Herstellung von für einen Hefeorganismus heterologem
Protein gemäß Anspruch 1, die nach diesem Verfahren
erhaltenen Proteine der Ansprüche 2 bis 5, die Hefeorganismus-
Zellkulturen der Ansprüche 6 bis 8, das
Zellkulturmedium von Anspruch 9 und die Hefeexpressionsträger
der Ansprüche 10 bis 13.
Erfindungsgemäß ist es erstmals möglich, ein Protein, das
für einen Hefewirt normalerweise heterolog ist, in
brauchbaren Mengen aus dem die Hefekultur tragenden Medium
zu gewinnen, nachdem es durch den Hefeorganismus auf eine
Art und Weise, die die Produktion in nativer Zellumgebung
nachahmt, exprimiert, verarbeitet (Processing) und
sekretiert worden ist. Somit beruht die Erfindung auf der
erfolgreichen Manipulation von Expressionsträgern und
Hefewirt, so daß es zu einer Synthese von normalerweise
durch den Hefewirt nicht gebildetem
Protein kommt und insbesondere der Hefewirt so reguliert wird,
daß er das gebildete Protein in den Sekretionsweg abgibt.
Somit ist die Erfindung auf Mittel und Verfahren gerichtet, mit
Hilfe derer brauchbare Mengen von heterologem Protein aus dem
Medium einer Hefekultur gewonnen werden können, wobei die Hefekultur
lebensfähige Zellen enthält, die Expressionsträger mit
einem Gehalt an das Protein kodierender DNA beherbergen. Ein
erheblicher Vorteil der Erfindung besteht darin, daß wertvolles,
diskretes Proteinprodukt im Zellkulturmedium erhalten
werden kann und eine Lysis der Zellen zur Gewinnung des Produkts,
das bisher nur aus dem Zellinhalt und häufig nicht in
reifer Form zugänglich war, erübrigt.
Aus Nature 293, Seiten 717-722 ist humanes LeIF-D, erhalten
durch Expression in Saccharomyces cerevisiae, bekannt.
Veröffentlichungen und andere Materialien, die der vorliegenden
Erfindung als Stand der Technik und als technischer Hintergrund
zugrunde liegen und die teilweise für die praktische Durchführung
der Erfindung zusätzliche Erläuterungen geben, sind
mit Nummern gekennzeichnet und in der beigefügten Bibliographie
aufgeführt.
Hefeorganismen transportieren natürlicherweise eine kleine
Anzahl von bestimmten homologen Proteinen zur und gelegentlich
durch die Plasmamembran als wesentlichen Beitrag zum Wachstum
der Zelloberfläche und zum Zellstoffwechsel. Zellknospen als
Reproduktionsstellen zur Bildung von Tochterzellen benötigen
zusätzliche Proteine zur Bildung von Zellwand und Plasmamembran
sowie für den Stoffwechsel. Einige dieser Proteine müssen
zunächst ihren Weg zur Funktionsstelle finden. Daher wird
angenommen, daß ein Sekretionsweg existiert (1). Bestimmte,
bei den vorstehenden Verfahren beteiligte homologe Proteine
werden durch Translation im endoplasmatischen Reticulum gebildet.
Bei homologen Proteinen handelt es sich um solche Proteine, die
normalerweise durch die Hefespezies gebildet werden und für
deren Lebensfähigkeit erforderlich sind. Nach der Bildung wandern
sie durch enzymatischen Transfer zum Golgi-Apparat, von
dort innerhalb der Vesikel zu den Plasmamembranen, wo sich
einige assoziieren oder in gewissem Umfang in den Raum zwischen
der Plasmamembran und der Zellwand eindringen. Eine
kleine Anzahl von homologen Proteinen scheint vollständig durch
die Zellwand nach außen transportiert zu werden, z. B. der
α-Faktor und das Killer-Toxin (2, 3).
Die Knospenregion der Zellen scheint die Anziehungsstelle für die
Vesikel zu sein. Durch ihr Verschmelzen mit der inneren Oberfläche
der Knospe tragen sie zum Gesamtwachstum der Plasmamembran
und vermutlich der Zellwand bei (4, 5, 6). Diese Theorie
liefert keinen Beweis dafür, daß die Sekretion oder Wanderung
von Proteinen durch die Membran tatsächlich erfolgt.
In ähnlicher Weise ist es noch umstritten, ob die Glycosylierung
des Proteins den sogenannten Sekretionsprozeß unterstützen
kann oder an diesem beteiligt ist. Ferner nimmt man
definitionsgemäß an, daß "sekretierte" Proteine ein Signalpräpeptid
aufweisen, von dem postuliert wird, daß es mit dem
Transportprozeß oder dem Einverleibungsprozeß an der Membranoberfläche
assoziiert ist. Die eventuelle Funktion derartiger
Modifikationen des reifen Proteins beim Sekretionsprozeß
und die Gesamtrolle des Sekretionswegs beim Oberflächenwachstum
sind Spekulationen, die eines sicheren Beweises
entbehren.
Es wurde angenommen, daß die rekombinante DNA-Technik einen
wertvollen Beitrag bei der Beantwortung der offenen Fragen
über den Sekretionsprozeß bei Hefeorganismen geben könnte und,
sofern ihre Anwendbarkeit gegeben ist, derartige und andere
Organismen befähigen könnte, endogen reichliche Mengen an
heterologen Polypeptidprodukten zu bilden (vgl. beispielsweise
7 bis 17) wodurch eine entsprechende Manipulation des
Hefewirts erreicht werden könnte, daß er zur Sekretion von
heterologem Protein in diskreter, reifer Form veranlaßt
werden könnte.
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, für einen Hefeorganismus
heterologe Proteine als Produkt von Expression,
Processing und Sekretion durch Hefe herzustellen.
Die Lösung dieser Aufgabe erfolgt gemäß dem Gegenstand der
Patentansprüche.
Die Erfindung beruht auf dem Befund, daß Hefeorganismen dazu
veranlaßt werden können, Protein, das normalerweise für den
Hefeorganismus heterolog ist und für dessen Lebensfähigkeit
nicht notwendig ist, zu exprimieren, zu verarbeiten (Processing)
und zu sekretieren, so daß das Protein aus dem Medium, in
dem die lebensfähigen produzierenden Hefezellen vorhanden sind,
in diskreter Form erhalten werden kann, ohne daß es von unerwünschten
Polypeptidpräsequenzen und anderen Expressionsartefakten
begleitet ist. Geeignete Hefezellen in einer lebensfähigen
Kultur werden mit Expressionsträgern transformiert,
die ein heterologes Protein und ein heterologes Signalpolypeptid
kodierende DNA beherbergen. Bei der Expression des Proteins
zusammen mit dem heterologen Signalpolypeptid wird das
reife Expressionsprodukt dem Processing unterworfen und das
reife heterologe Protein in das Medium der Zellkultur transportiert.
Das Produkt läßt sich relativ leicht aus dem Medium
entfernen, ohne daß es erforderlich ist, unerwünschte
Präsequenzen und andere Expressionsartefakte zu entfernen, z. B.
Methionin, das an die normalerweise erste N-terminale Aminosäure
gebunden ist, was eine Expressionsfolge des AUG-translationalen
Startsignalcodons ist. Somit läßt sich das Medium
in einer Form erhalten, die im wesentlichen frei von lebensfähigen
oder zerstörten (d. h. lysierten oder anderweitig aufgebrochenen)
Zellen ist und die aufgrund ihres Gehalts am gewünschten
Produkt leicht zu weiteren Reinigungsverfahren eingesetzt
werden kann. Dieses Produkt ist nach entsprechender
Reinigung einsatzbereit für den beabsichtigen Verwendungszweck,
z. B. kann Humanleukozyteninterferon beim Menschen
als Antivirus- und/oder Antitumormittel eingesetzt werden
(vgl. allgemein 7 bis 17).
Unter dem hier verwendeten Ausdruck "heterologes Protein" ist
ein Protein zu verstehen, das normalerweise von einem Hefeorganismus
nicht gebildet wird oder für dessen Lebensfähigkeit
nicht erforderlich ist. Mit diesem Ausdruck ist die funktionelle
Insertion einer ein derartiges Protein kodierendes DNA
mittels rekombinanter DNA-Technik in einen Expressionsträger,
der wiederum zur Transformation eines Hefeorganismus-Wirts
verwendet wird, zu verstehen. Die funktionelle Insertion von
DNA bedeutet die Insertion von DNA, die das heterologe Protein
und die Präsequenz kodiert, in einen Expressionsvektor
unter Kontrolle von die Expression dirigierenden Promotorsystemen.
Beispiele für derartige heterologe Proteine sind
Hormone, wie menschliches Wachstumshormon, Rinderwachstumshormon,
Lymphokine, Enzyme, Interferone, wie
Humanfibroblasteninterferon, Humanimmuninterferon und Human-
und Hybridleukozyteninterferon, virale Antigene
oder Immunogene, z. B. Maul- und Klauenseuche-Antigene,
Grippeantigenprotein, Hepatitiskern- und -oberflächenantigene,
sowie verschiedene andere Polypeptide, wie
Humanserumalbumin, Humaninsulin und verschiedene Glycoproteine.
Die Ausdrücke "heterologe Präsequenz" oder
"heterologes Signalpolypeptid" beziehen sich auf Polypeptide,
die normalerweise von einem Hefesystem nicht gebildet oder
verwendet werden und von dem Signalpolypeptid selektiert werden
können, das für das in Frage stehende heterologe Protein
oder andere heterologe (Signal)-Polypeptide, die mit dem in
Frage stehenden heterologen Protein funktionell verknüpft
sind, nativ ist.
Der Ausdruck "Sekretion" bedeutet den Transport des Produkts
durch die Plasmamembran und zumindest in die Zellwand oder
durch die Zellwand des Hefeorganismus hindurch in das die Zellkultur
tragende Medium. In diesem Zusammenhang ist darauf hinzuweisen,
daß in einigen Fällen das "sekretierte" Produkt sich
mit der Zellwand assoziiert und somit möglicherweise ein unterschiedliches
Reinigungsverfahren oder eine Modifikation der
Struktur und der Funktion des Hefewirts erforderlich macht.
Unter dem Ausdruck "Processing" (Verarbeiten) ist die
zelluläre Spaltung des Signalpolypeptids vom reifen Protein
zu verstehen, so daß ein Protein frei von fremdem Peptid in
sogenannter diskreter, reifer Form gebildet wird. Der Ausdruck
"fremdes Peptid" umfaßt, wie vorstehend erwähnt, Peptide, die
durch Expressionsartefakte entstehen und beispielsweise Methionin
enthalten. Das Processing ermöglicht eine unbedeutende
Spaltung des Signalpolypeptids an einer Stelle, die nicht in
desaktivierender Weise nahe am präzisen Vereinigungspunkt des
Signalpolypeptids mit dem reifen Protein ist.
Fig. 1 zeigt einen Vergleich der Aminosäuresequenz des Signalpräpeptids
von humanem IFN-α1 (pre D), IFN-α2 (pre A), IFN-α-
1,2 (pre D/A), IFN-γ (pre γ) und IFN-β (pre β). Die unterstrichenen
Aminosäuren geben die Unterschiede in den Aminosäuresequenzen
von pre A und pre D wieder. Die DdeI-Stelle
gibt die Verknüpfung der D- und A-Präsequenzen bei der Herstellung
der Hybrid-pre-D/A-Präsequenz an.
Fig. 2 ist ein Diagramm des Hefeexpressionsplasmids YEpIPT,
das hier als allgemeiner Träger zur Expression verschiedener
Geninserts verwendet wird. Die Abbildung zeigt einige der
Restriktionsstellen und verschiedene interessierende Bereiche.
Fig. 3 zeigt den Aufbau eines EcoRI-Fragments mit einem Gehalt
an pre-plus IFN-α1-Gen zur direkten Expression von IFN-α1 in
Hefe.
Fig. 4 zeigt den Aufbau eines EcoRI-Fragments mit einem Gehalts
an reifem IFN-α2-Gen zur direkten Expression in Hefe.
Fig. 5 zeigt den Aufbau eines EcoRI-Fragments mit einem Gehalt
an pre-plus IFN-α2-Gen mit der kodierenden Sequenz der ersten
14 Aminosäuren in der Präsequenz von pre-IFN-α1 zur direkten
Expression von IFN-α2 in Hefe.
Fig. 6 zeigt den Aufbau eines EcoRI-Fragments mit einem Gehalt
an pre-plus IFN-γ-Gen mit 70 bp (Basenpaaren) der Leader-
Sequenz, die dem Initiations-ATG-Codon zur Expression von
IFN-γ in Hefe vorhergeht.
Fig. 7 zeigt den Aufbau eines EcoRI-Fragments mit einem Gehalt
an pre-plus IFN-γ-Gen für die direkte Expression von IFN-γ
in Hefe.
Fig. 8 faßt sämtliche Bauteile zusammen, die bei der praktischen
Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens im Verlauf
von Expression, Processing und Sekretion verschiedener
IFN-Gene in Hefe verwendet werden.
Fig. 9 zeigt eine Wachstumskurve von a) YEp1PT-LeIFA1/pep4-3
und b) YEp1PT-preLeIFA53t/pep4-3, gemessen durch die Absorption
bei 660 mµ. Die Medien werden für a) und b) auf ihre
Interferonaktivität unter Anwendung eines Bioassay untersucht.
Die angegebene Zeit bezieht sich auf Stunden Wachstumsdauer bei
30°C.
Fig. 10A zeigt eine Wachstumskurve für einen 5 Liter-Fermentationsansatz
von YEp1PT-preLeIFA53t/pep4-3. (•) bedeutet die Absorption
bei 660 mµ und (o) Millionen Einheiten Interferonaktivität
innerhalb der Zellen pro Liter.
Fig. 10B gibt die gleiche Wachstumskurve wie in Fig. 10A wieder,
wobei die Aktivität der Medien angegeben ist.
Fig. 11 stellt ein Elutionsprofil von Medien pre D/A LeIF von
einer monoklonalen Antikörpersäule dar.
Fig. 12 gibt den HPLC-Nachweis des Peak A-Interferonpools von
der monoklonalen Antikörpersäule wieder.
Fig. 13 zeigt das Ergebnis der Aminosäuresequenzierung des
nach HPLC-Reinigung erhaltenen Produkts.
Fig. 14 stellt die verschiedenen Bauteile dar, die
hier zur Bildung von menschlichem Wachstumshormon (HGH) verwendet
werden.
Fig. A erläutert schematisch die Restriktionskarte des 3,1 kbp
HindIII-Inserts von Vektor pB1, aus dem der PGK-Promotor isoliert
wurde. Es ist die Insertion einer EcoRI-Stelle und einer
XbaI-Stelle in der 5′-flankierenden DNA des PGK-Gens angegeben.
Fig. B erläutert die 5′-flankierende Sequenz und die ursprüngliche
kodierende Sequenz für das PGK-Gen vor Insertion einer
XbaI- und EcoRI-Stelle.
Fig. C erläutert schematisch Techniken, die zur Insertion einer
XbaI-Stelle in Position-8 im PGK-Promotor und zur Isolation
eines 39 bp-Fragments der 5′-flankierenden Sequenz von PGK, die
dieses XbaI-Ende und ein Sau3A-Ende enthält, verwendet wurden.
Fig. D erläutert schematisch den Aufbau eines 300 bp-Fragments,
das das vorstehende 39 bp-Fragment, zusätzlich die PGK-5′-
flankierende Sequenz (265 bp) von PvuI bis Sau3A (vgl. Fig. A)
und eine XbaI-benachbarte EcoRI-Stelle enthält.
Fig. E erläutert schematisch den Aufbau des 1500 bp-PGK-Promotorfragments
(HindIII/EcoRI), das neben dem gemäß Fig. 4 aufgebauten
Fragment ein 1300 bp-HindIII- bis PvuI-Fragment von
der PGK-5′-flankierende Sequenz (vgl. Fig. A) enthält.
Nachstehend wird die Erfindung näher erläutert.
Sämtliche DNA-Restriktions- und -Stoffwechselenzyme
wurden unter den Bedingungen und mit
den Puffern eingesetzt, die von den Herstellern angegeben werden.
DNA-Linker wurden
nach üblichen Verfahren hergestellt.
Die Reinigung von kovalent geschlossenen zirkulären Plasmid-
DNAs aus E. coli (18) und die Transformation von E. coli (19)
wurden nach bekannten Verfahren durchgeführt. E. coli-Miniscreens
entsprachen (20). Die Transformation von Hefe wurde gemäß (21)
durchgeführt, jedoch unter Berücksichtigung der nachstehenden
Modifikationen. 200 ml Zellen mit 2×10⁷ Zellen/ml wurden verwendet
und durch Zentrifugieren mit 25 ml H₂O gewaschen. Diese
Zellen wurden mit 10 ml 1 m Sorbit, 25 millimolarer EDTA (pH-Wert
8) und 50 millimolar Dithiothreit 10 Minuten bei 30°C behandelt
und anschließend mit 10 ml 1 m Sorbit gewaschen. Die pelletisierten
Zellen wurden sodann vorsichtig in 10 ml SCE (1 m Sorbit,
0,1 m Natriumcitrat, pH-Wert 5,8 und 0,01 m EDTA) resuspendiert
und bei 30°C mit 200 µg Zymolase 60 000
behandelt. Die Sphäroplastenbildung wurde bis zu 80 Prozent
durch Zusatz von 100 µl der Suspension zu 0,9 ml 10prozentigem
SDS und Messen der Absorption bei 800 mµ durchgeführt, wobei
eine Verdünnung der Zellen vor Zusatz des Enzyms als
0 Prozent-Standard (Lysis im 10prozentigen SDS führt
zu einem Abfall der Absorption bei 800 mµ) verwendet wurde.
Die Zellen wurden sodann 3mal mit 10 ml 1 m Sorbit gewaschen.
Die Zellen lassen sich mehrere Tage bei 0°C in Sorbit lagern.
Die Zellen wurden sodann 1 mal mit 1 m Sorbit, 10 millimolar
CaCl₂ und 10 millimolar Tris-HCl (pH-Wert 7,4) gewaschen und
sodann in 1 ml dieser Lösung resuspendiert. 5 bis 15 µg gereinigte
Plasmid-DNA oder 20 µl von E. coli abgeleitete Miniscreen-DNA
(2/5 der Plasmid-DNA von 5 ml stationärer, in LB
gezüchteter E. coli-Kultur) wurden sodann zugesetzt und vorsichtig
15 Minuten mit 100 µl der resuspendierten Zellen vermischt.
Anschließend wurde 1 ml einer Lösung mit einem Gehalt
an 20 Prozent (Gew./Vol.) Polyäthylenglykol 4000, 10
millimolar CaCl₂ und 10 millimolar Tris-HCl (pH-Wert 7,5) unter
15minütigem vorsichtigem Vermischen zugesetzt. Die Zellen
wurden hierauf abzentrifugiert und vorsichtig in 200 µl SOS
(1 m Sorbit, 33,5 Prozent (Vol./Vol.) YEPD-Brühe und 6,5 millimolar
CaCl₂) resuspendiert und 20 Minuten bei 30°C inkubiert.
100 µl dieser Suspension wurden sodann auf eine Petrischale mit
einem Gehalt an 20 ml Bodenagar (182 g Sorbit, 20 g Glucose,
6,7 g YNB und 30 g Agar pro 1 Liter H₂O) gebracht und
mit 10 ml Deckagar von 50°C (gleiche Zusammensetzung wie das
Bodenagar, aber mit 1 ml Adenin (1,2 mg/ml), 1 ml Uracil (2,4 mg/ml)
und 1 ml-trp-Ausscheidegemisch (-trp drop-out mix) pro
50 ml Bodenagar bedeckt. Das -trp-Ausscheidegemisch enthält pro 100 ml
H₂O folgende Aminosäuren: 0,2 g arg, 0,1 g his, 0,6 g ile, 0,6 g
leu, 0,4 g lys, 0,1 g met, 0,6 g phe, 0,5 g thr. Diese Trp⁺-
Selektion führt zu 10³ bis 10⁴ Hefetransformanten pro 1 mg
Plasmid-DNA.
Hefeplasmid wurde aus Hefe durch Züchten voon 15 ml Hefe
zur stationären Phase (A₆₆₀=5-6) in YNB+CAA (vgl. den nachstehenden
Abschnitt "Stämme und Medien"), durch Sphäroplastenbildung
gemäß dem vorstehenden Vefahren, durch Pelletisieren
der Zellen und unter Verwendung des E. coli-Miniscreenverfahrens
(ohne Lysozym) gemäß (20) erhalten.
Die Stabilität von Plasmiden in Hefe wurde durch Zellverdünnung
während des selektiven Wachstums in YNB+CAA und Ausstreichen
auf YEPD-Platten (nicht-selektiv) bestimmt. Nach 2tägigem
Wachstum bei 30°C wurden diese Platten auf YNB-CAA-Platten
replikaplattiert (Trp⁺-Selektion). Die prozentuale Plasmidstabilität
wurde folgendermaßen berechnet: Anzahl der Kolonien
mit nicht-selektivem Wachstums minus Anzahl der Kolonien die
nicht selektiv wachsen, dividiert durch die Anzahl der Kolonien
mit nicht-selektivem Wachstum, multipliziert mit 100.
E. coli K-12 Stamm 294 (ATCC Nr. 31 446) (22) wurde sämtliche
anderen bakteriellen Transformationen verwendet. Die Hefestämme
pep4-3 (20B-12, d trp1 pep4-3) (23) und GM3C-2 (α, leu2-3,
leu 2-112, trp 1-1, his 4-519, cyc 1-1, cyp 3-1) (24) wurden
für Hefetransformation verwendet. Die Hefestämme 20B-12 und
GM3C-2 sind ohne Beschränkungen bei der American Type Culture
Collection unter den ATCC Nummern 20 626 und 20 625 am 5. März
1982 hinterlegt worden. Es können verschiedene Hefestämme verwendet
werden; vgl. Lodder et al., The Yeasts, A Taxonomic
Study, North-Holland Publ. Co., Amsterdam. In ähnlicher Weise
können verschiedene Medien verwendet werden; vgl. Difco Manual
of Dehydrated Culture Media und Reagents für Microbiological
and Clinical Laboratory Procedures, 9. Aufl. Difco Laboratories,
Inc., Detroit, Michigan (1953).
LB entsprach der Beschreibung von Miller (25) unter Zugabe von
20 µg/ml Ampicillin nach Autoklavisierung und Kühlung
der Medien. Die Hefe wurde auf folgenden Meedien gezüchtet:
YEPD mit einem Gehalt an 1 Prozent Hefeextrakt, 2 Prozent Pepton
und 2 Prozent Glucose±3 Prozent Difco-Agar. YNB-CAA mit einem
Gehalt an 6,7 g Hefestickstoffbase (ohne Aminosäuren) (YNB),
10 mg Adenin, 10 mg Uracil, 5 g Difco-Casaminsäuren
(CAA), 20 g Glucose±30 g Agar pro 1 Liter (zur Trp⁺-Selektion
verwendet).
Einzelne Kolonien von Hefestämmen YEpIPT-preLeIF-A 53t/pep4-3
und YEpIPT-LeIF-A 1/pep4-3 wurden 7 Stunden bei 30°C in 100 ml
YNB+CAA bis zu einem A₆₆₀-Wert von etwa 1,1 gezüchtet. 100 ml
dieser Kulturen wurde mit YNB+CAA auf 1 Liter verdünnt, wodurch
man eine Lösung mit A₆₆₀ von 0,1 erhielt. Diese 1 Liter-
Kulturen wurden sodann bei 30°C gezüchtet. 10 ml Aliquotanteile
wurden in regelmäßigen Abständen zur Messung der optischen
Dichte, der Interferonbildung und der Sekretion entnommen.
Zur Bestimmung wurden die 10 ml-Aliquotanteile jeweils 15 Minuten
bei 7000 U/min in einem Sorval RC3B zentrifugiert. Der Überstand
(Medien) wurde ohne Verdünnung bestimmt. Die Zellen wurden
in 0,4 ml 7 m Guanidin-HCl mit einem Gehalt an einem gleichen
Volumen an Glasperlen resuspendiert und 2 Minuten bei hoher
Geschwindigkeit gerührt. Das Lysat der Zellen wurde sodann in
PBS/BSA (150 millimolar NaCl, 20 millimolar Natriumphosphat
(pH-Wert 7,9) und 0,5 Prozent Rinderserumalbumin) zur Durchführung
des Bioassay verdünnt.
Die Interferonbestimmung von Hefeextrakten wurde durch Vergleich
mit Interferonstandards anhand der Hemmung des cytopathischen
Effekts (CPE) durchgeführt (26). Die Hefeextrakte
wurden folgendermaßen hergestellt: 10 ml-Kulturen wurden in
YNB+CAA bis zum Erreichen von A₆₆₀ ∼ 1-2 gezüchtet. Die Zellen
wurden abzentrifugiert, in 3 ml 1,2 m Sorbit, 10 millimolar
KH₂PO₄, pH-Wert 6,8 und 1 Prozent Zymolase 60 000 resuspendiert
und sodann 30 Minuten bei 30°C inkubiert (bis zu 90 Prozent
Seroplastenbildung). Die Sphäroplasten wurden 10 Minuten bei
3000 g pelletisiert und sodann in 150 µl 7 m Guanidin-Hydrochlorid
(GHCl)+1 millimolar Phenylmethylsulfonylfluorid
(PMSF) resuspendiert. Die Extrakte wurden unmittelbar vor der
Bestimmung auf das 20- bis 100fache in PBS/BSA-Puffer (20 millimolar
NaH₂PO₄, pH-Wert 7,4, 150 millimolar CaCl, 0,5 Prozent
BSA) verdünnt. Eine andere Möglichkeit bestand darin, 10 ml
Zellen mit dem gleichen A₆₆₀-Wert zu pelletisieren und in
0,4 ml 7 m GHCl in einem Eppendorf-Reaktionsgefäß (Fassungsvermögen
1,5 ml), in dem sich etwa 0,4 ml Glasperlen (0,45 bis
0,5 mm befanden, zu resuspendieren.
Die Gefäße wurden 2mal 2 Minuten bei höchster Geschwindigkeit
gerüttelt, wobei sie sich auf Eis befanden. Die Extrakte
wurden 0,5 Minuten in einer Eppendorf-Zentrifuge zentrifugiert
und in PBS/BSA-Puffer auf die vorstehend beschriebene
Weise verdünnt. Die Bioassays wurden mit MDBK-Zellen (26) auf
LeIF A, LeIF D und die Vorformen durchgeführt. Bei Hela-Zellen
(26) wurde eine Bestimmung auf IFN-γ und preIFN-γ vorgenommen.
Eine einzelne Kolonie des Hefestamms YEpIPT-preLeIF-A 53t/
pep4-3 wurde bei 30°C in 500 ml YNB+CAA bis zu einem A₆₆₀-Wert
von 2,4 gezüchtet. 500 ml dieser Kultur wurden mit YNB+CAA
auf 5 Liter auf einen A₆₆₀-Wert von 0,21 verdünnt. Die erhaltene
5 Liter-Kultur wurde bei 30°C bis zu einem A₆₆₀-Wert
von 4 gezüchtet. Dann wurde die 5-Liter-Kultur durch 10minütige
Zentrifugation bei 7000 U/min geerntet. 10 ml-Aliquotanteile
wurden in regelmäßigen Abständen während der Fermentation
zur Messung von optischer Dichte, Interferonbildung und Sekretion
entnommen. Vor der Bestimmung wurden die einzelnen
Aliquoatanteile 5 Minuten zur Abtrennung der Zellen von den
Medien in einer Kühlzentrifuge zentrifugiert. Das Medium und
die Zellen wurden auf die vorstehend beschriebene Weise untersucht
(vgl. Fig. 9, 10A und 10B).
Die Medien wurden auf ein Endvolumen von 200 ml eingeengt und
sodann gegen tris/cys/EDTA, pH-Wert 8,0, auf einer 1000 Dalton-
Ultrafiltrationsmembran in einem Amicon-
Dünnkanalgerät diafiltriert. Das zurückgehaltene
Produkt (200 ml) wurde über eine 1,5 ml-Immunoaffinitätssäule
mit einem Gehalt an monoklonalem Antikörper gegen LeIF-A, kovalent
gebunden an Affigel 10 mit einer Strömungsgeschwindigkeit
von 15 ml/Stunde gegeben. Mehr als 80 Prozent
der Interferonaktivität der ursprünglichen Lösung waren an
der Säule gebunden. Sodann wurde eine Strömungsgeschwindigkeit
von 40 ml/Stunde angelegt. Nach der zweiten Anwendung befanden
sich etwa 7 Prozent der ursprünglichen Interferonaktivität
im durchströmenden Produkt. Die Säule wurde sodann mit
0,2 m NaCl in tris/cys/EDTA, pH-Wert 8,0 gewaschen. Etwa 1,7
Prozent der Aktivität wurde während dieses Waschvorgangs
eluiert.
Der Großteil der Interferonaktivität (etwa 50 Prozent der
ursprünglichen Aktivität) wurde sodann von der Säule mit
51,5 ml entionisiertem Wasser vom pH-Wert 5,5 eluiert. Die
Säule wurde schließlich mit 22,5 ml 0,2 m Essigsäure gewaschen,
um verbleibendes Protein zu eluieren. Es wurden etwa 8 Prozent
der ursprünglichen Aktivität eluiert. Anschließend an
die Elution mit Essigsäure wurde die Säule mit tris/cys/EDTA,
pH-Wert 8,0, wieder äquilibriert. Fraktionen von 2,25 bis 4,5 ml
wurden während der Waschvorgänge mit Wasser, Essigsäure und
tris/cys/EDTA aufgefangen (Fig. 11). Die Fraktionen Nr. 1 bis
7 wurden vereinigt und zur Trockne lyophilisiert. Der Rückstand
wurde in 200 µl 0,1prozentiger Trifluoressigsäure
(TFA), pH-Wert 2,55, gelöst und durch HPLC an einer Synchropak
RP-P-Säule weiter gereinigt. Die Säule wurde mit einer
Strömungsgeschwindigkeit von 1 ml/min mit einem linearen Gradienten
von 0 bis 100 Prozent Acetonitril in 0,1 Prozent TFA,
pH-Wert 2,5, eluiert. Fraktionen von 1 ml wurden aufgefangen
und auf die vorstehend beschriebene Weise nach Verdünnung in
PBS/BSA untersucht. Eine gereinigte Probe von 2,5 µg IFN-A
wurde zur Kontrolle auch chromatographiert (Fig. 12). Die
Interferonaktivität wurde von der Säule als einzelner Peak,
zentriert um Fraktion 39, eluiert. Diese Fraktion wurde zur
Trockne lyophilisiert. Der Rückstand wurde der Sequenzanalyse
unterzogen.
Die Sequenzanalyse beruhte auf dem Edman-Abbau (27). Die Probe
wurde in den Becher eines "spinning cup sequencer"
gegeben. Polybrene (Poly-N,N,N¹N¹-tetramethyl-N-trimethylen
hexamethylendiammoniumdiacetat) wurde als Träger im Becher verwendet
(28). Das Sequenzgerät wurde mit einer Kältefalle
und einigen Programmänderungen zur Verminderung von Hintergrundpeaks
modifiziert. Als Reagentien
wurden 0,1 m Quadrolpuffer, Phenylisothiocyanat
und Heptafluorbuttersäure verwendet.
Eine Modifikation betraf auch die automatische Umwandlung der
2-Anilino-5-thiazolinonderivate in der aus dem Sequenziergerät
extrahierten Form. Das 1-Chlorbutan wurde in einem
Pierce Reacti-Vial gesammelt und unter Stickstoff getrocknet.
Anschließend wurde 25prozentige Trifluoressigsäure (TFA) in
Wasser zum 2-Anilino-5-thiazolinon gegeben. Zu dessen Umwandlung
in das 3-Phenyl-2-thiohydantion (PTH-Derivat) wurde 10 Minuten
auf 20°C erwärmt. Der PTH-Aminosäurerest wurde sodann
automatisch in 50prozentigem Acetonitril in Wasser gelöst
und in einen Hochdruck-Flüssigkeitschromatographen umgekehrter
Phase injiziert. Jede PTH-Aminosäure wurde sodann
durch Vergleich mit den Retentionszeiten eines Standardgemisches,
das in die Konversionsampulle eingeführt und gemäß
einem Zyklus des Sequenziergeräts behandelt wurde, identifiziert.
Die Ergebnisse sind in Fig. 13 zusammengestellt und
nachstehend erläutert.
Die Proteine wurden zuerst der Elektrophorese an einem Poly
acrylamidplattengel in Gegenwart von Natriumdodecylsulfat
(46, 47) unterworfen, dann elektrophoretisch auf Nitrocellulosepapier
(S+S BA 85) übertragen und sodann immunologisch auf
HGH identifiziert. Die Transfervorrichtung (Elektroblot)
wurde nach kurzem Waschen
des Gels und des Nitrocellulosepapiers mit einem Transferpuffer
mit einem Gehalt an 25 millimolar Tris, 192 millimolar
Glycin, pH-Wert 8,4, zusammengebaut. Die Übertragung wurde
1 1/2 Stunden bei 400 mA durchgeführt, wonach der Blot in
50 millimolar Tris, pH-Wert 7,4, 0,15 m NaCl, 5 millimolar
EDTA, 0,25 Prozent Gelatine (Gew./Vol.), 0,05 Prozent NP-40
gebracht wurde und mäßig über Nacht bewegt wurde. Eine entsprechende
Verdünnung von Kaninchen-anti-human-HGH-Antiserum
wurde mit dem Blot und NP-40/Gelatinepuffer (typischerweise
100 µl/cm²) in einen Kunststoffbeutel gebracht und 2 Stunden
unter mäßigem Schwenken bei Raumtemperatur inkubiert. Der
Blot wurde kurz mit H₂O und anschließend 1 Stunde mit NP-40/
Gelatine gewaschen und mit [¹²⁵J] Protein A,
das in NP-40/Gelatinepuffer verdünnt war, markiert,
wobei es 1 Stunde bei Raumtemperatur unter mäßigem Schwenken
in einem Kunststoffbeutel belassen wurde. Nach mehrmaligem
Waschen mit H₂O wurde der Blot in Cellophan eingehüllt und
über Nacht in eine Kassette mit X-Omat-AR-Film mit
einem Verstärkungsfilter bei -70°C belassen.
Polyacrylamidgele mit einem Gehalt an Protein wurden gemäß
dem Verfahren von Oakley et al. (41) gefärbt.
Aufgrund der kürzlich erfolgen Isolierung von cDNAs mit einem
Gehalt an Genen für Leukozyten (7), Fibroblasten (10) und
Immuninterferonen (30) - der jüngsten Entwicklung von Hefe als
Expressionssystem für heterologe Gene (14) -, wurde es möglich,
die Expression von heterologen Genen mit einem Gehalt an kodierenden
Bereichen für Signalpeptidsequenzen in Hefe zu
testen.
Fig. 1 zeigt die Signalsequenzen für 5 verschiedene Interferone.
Diese aminoterminalen Sequenzen erleichtern vermutlich die
Sekretion von Interferonproteinen aus Säugetierzellen. Während
des Verfahrens wird die Signalsequenz durch spezifische Proteasespaltung
zwischen der Position -1 und +1 entfernt, wodurch
man das als reife Form von Interferon bekannte Produkt
erhält. Diese Sequenzen haben allgemeine Eigenschaften von
anderen Sekretionssignalsequenzen (31). Sie sind alle sehr
hydrophob, haben etwa die gleiche Länge wie andere Signale
und weisen eine kleine Aminosäure links von der Spaltungsstelle
auf. Obgleich preLeIFA, preLeIFD und preIFN-γ alle
zwischen Glycin und Cystein spalten, stellt dies keine allgemeine
Regel für andere Säugetiersignale dar, wie durch preIFN-β
belegt.
Tatsächlich gibt es unter verschiedenen Organismen oder innerhalb
des gleichen Organismus keine übereinstimmende Signalsequenz.
Es gibt auch keine übereinstimmende Sequenz an der
Spaltungsstelle zwischen der Signalsequenz und der reifen Form
des Proteinprodukts.
Daher war es sehr interessant, die Expression dieser Präinterferone
in Hefe zu untersuchen und festzustellen, ob diese
heterologen Proteine aus Hefe sekretiert werden und wie der
Processingvorgang bei diesen Proteinen beschaffen ist. Obgleich
Hefe ein eukaryontischer Organismus ist wie Säugetierzellen
und obgleich Hefe offensichtlich einen Sektretionsweg
aufweist, der in vielerlei Hinsicht höheren Eukarionten entspricht
(1, 32) handelt es sich um einen sehr primitiven Eukaryonten,
so daß die richtige Funktion und der Processingvorgang
dieser Genprodukte eine weitgehende Konservierung des Prozesses
zwischen Hefezellen und Säugetierzellen während der
Evolution, deren Ergebnisse keinesfalls offensichtlich sind,
erforderlich machen würde.
Informationen über den Aufbau eines Plasmids für die Expression
eines heterologen Gens in Hefe wurden veröffentlicht (14).
Das in der vorliegenden Arbeit verwendete Plasmid ist in Fig. 2
dargestellt. Dieses Plasmid enthält einen Teil von pBR322 (33)
mit dem Ampicillinresistenz-(ApR)-Gen und dem E. coli-Ursprung
(origin) der Replikation für Selektion und stabiles Wachstum
in E. coli (als Zwischenprodukt zwischen dem in vitro-Aufbau
und der Transformation von Hefe verwendet). Das Plasmid enthält
auch das TRP1-Gen an einem EcoRI-bis Pst1-Fragment, das
vom Chromosom III von Hefe stammt (34-36). Dieses Gen erlaubt
eine Selektion in trp1--Hefe und kann somit zur Isolation
von Hefezellen mit einem Gehalt des Plasmids und zur
Aufrechterhaltung des Plasmids verwendet werden. Ferner enthält
das Plasmid eine Hefe-Ursprungsstelle an einem 2,0 kbp-Fragment
von endogener Hefe-2µ-Plasmid-DNA (37). Dieser Ursprung erlaubt
eine autonome Replikation der DNA in Hefe und die Aufrechterhaltung
als Plasmid.
Die andere Hauptkomponente des Systems ist das Hefe-3-Phosphoglycerat-
kinase-(PGK)-Promotorfragment, das von der Transkription
nahe der einzigen EcoRI-Stelle im Plasmid stammt
(die andere EcoRI-Stelle wurde durch Auffüllen der Restriktionsstelle
unter Verwendung von E. coli-DNA-Polymerase I
(Klenow) unter anschließender Ligation des stumpfen Endes
entfernt).
Die Isolierung des 3-Phosphoglycerat-kinase-(PGK)-Gens wurde
bereits früher erörtert (37a) wie auch der Aufbau des 1,6 kbp-
Promotorfragments (vgl. unten). Ein Hind III/Bgl II-Fragment
vom Hefe-TRP 1-Genbereich (34-36) von Chromosom III wurde als
Konverter von Hind III bis Bgl II zur Ligation mit der Bam HI-
Stelle von pBR322 verwendet, um das Plasmid gegegn Tetracyclin
empfindlich (TcS) zu machen. Ferner ist zu erwähnen, daß das
2,0 kbp-Fragment von 2 µ-DNA eine andere Funktion insoweit
ausübt, als es ein Transkriptions-Terminations/Polyadenylierungssignal
enthält, das normalerweise das Terminationssignal
für das "Able"-Gen im 2 µ-Plasmid darstellt (37). Ein derartiger
Bereich scheint für eine gute Expression wesentlich
zu sein. Geninserts von EcoRI-Fragmenten in der richtigen
Orientierung können als Protein exprimiert werden, wenn der
Vektor in Hefe gebracht wird.
Das Hefeexpressionsplasmid YEpIPT enthält eine einzige EcoRI-
Restriktionsstelle. Eine Insertion eines fremden Gens in diese
einzige EcoRI-Stelle führt zur Expression dieses Gens unter
der Kontrolle von Hefe-Phosphoglycerat-kinase-(PGK)-Promotor.
Ein zweckmäßiger Weg zur Insertion der verschiedenen Interferongene
in die EcoRI-Stelle dieses Hefeplasmids besteht in
der Bereitstellung von DNA-Fragmenten mit EcoRI-Stellen, die
das Initiatioskodon und das Terminationskodon der verschiedenen
Interferogene flankieren. Hier wird der Aufbau von derartigen
EcoRI-Fragmenten für die Expression von Interferongenen
beschrieben. Es ist wichtig, Konverter für EcoRI am 3′-
Ende des Gens zu verwenden, so daß diese nicht die Transkription
beenden, sondern eine Transkription bis zum 2 µ-Terminator
ermöglichen.
Der Aufbau einer EcoRI-Stelle unmittelbar vor dem ATG-Initiationskodon
für reifes IFN-α1-Gen (14, 17), reifes IFN-α2-Gen
(7), reifes IFN-β-Gen (10) und reifes IFN-γ-Gen (30) wurde
beschrieben.
Die DNA-Restriktionsanalyse zeigt, daß eine EcoRI-Stelle vorhanden
ist, die zweckmäßigerweise im 3′-nicht-kodierenden
Bereich des cDNAKlons von IFN-α1 liegt (8), so daß eine
Verdauung des Plasmids pLeIFD3 (17) mit EcoRI ein 583 bp-EcoRI-
Fragment erzeugt, das das gesamte IFN-α1-Gen enthält.
Fig. 3 zeigt den Aufbau eines EcoRI-Fragments mit einem Gehalt
am pre-IFN-α1-Gen. Eine HaeIII-Stelle befindet sich
zwischen der ersten und zweiten Aminosäure von pre-IFN-α1 (8).
Ein partiell mit HaeIII verdautes 254 bp-Fragment, das sich von
dieser HaeIII-Stelle zur BglII-Stelle in der Mitte des kodierenden
Bereichs erstrecktt, wurde isoliert. Ein selbst-komplementäres
synthetisches Oligonucleotid 5′-CCATGAATTCATGG-3′ wurde
stumpfendig mit dem 254 bp-HaeIII-BglII-Fragment ligiert, um
eine EcoRI-Stelle vor dem ATG-Initiationskodon zu erzeugen.
Ein 264 bp-EcoRI-BglII-Fragment wurde dann durch Verdauen des
Ligationsgemisches mit EcoRI und BglII isoliert. Dieses EcoRI-
BglII-Fragment, das die Fronthälfte des preIFN-α1-Gens enthält,
wurde sodann mit der rückwärtigen Hälfte des pre-IFN-α1-
Gens, einem 372 bp-BglII-EcoRI-Fragment, isoliert nach Verdauung
des IFN-α1-cDNA-Klons mit BglII und EcoRI, verknüpft. Das
EcoRI-Fragment, das das gesamte pre-IFN-α1-Gen enthält, wurde
sodann durch Verdauen des Ligationsgemisches mit EcoRI und
Isolieren eines 636 bp-Fragments erzeugt.
Fig. 4 zeigt den Aufbau eines EcoRI-Fragments mit einem Gehalt
an reifem IFN-α2-Gen. Ein 876 bp-EcoRI-PstI-Fragment, das das
reife IFN-α2-Gen mit einer EcoRI-Stelle unmittelbar vor dem
ATG-Initiationskodon und mit 400 bp des 3′-nicht-kodierenden,
vom cDNA-Klon abgeleiteten Bereich enthält, wurde durch Verdauen
des Plasmids pLeIFA25 (7) mit EcoRI und PstI isoliert.
Das PstI-Ende dieses 876 bp-Fragments wurde sodann unter Verwendung
eines Adaptorfragments in eine EcoRI-Stelle verwandelt.
Dieses 978 bp-Adaptorfragment enthält eine interne EcoRI-Stelle
und weist an beiden Enden PstI-Stellen auf. 230 bp dieses Fragments,
das sich von einem Pst-Ende zur EcoRI-Stelle erstreckt,
leiten sich vom Hefeplasmid 2 µ-DNA ab (37). 748 bp des Fragmentrestes,
der sich von der EcoRI-Stelle zum anderen PstI-Ende
erstreckt, leiten sich vom bakteriellen Plasmid pBR322 ab (Das
gesamte Fragment ist von YEp13 abgeleitet (37b)). Eine Ligation
dieses Adaptorfragments an das 876 bp-EcoRI-PstI-Fragment, das
das reife IFN-α2-Gen enthält, unter anschließender Verdauung
mit EcoRI ergibt ein 1096 bp-Fragment, das das reife IFN-α2-Gen
mit EcoRI-Stellen an beiden Enden enthält.
Fig. 5 zeigt den Aufbau eines EcoRI-Fragments, das das pre-IFN-α2-
Gen enthält. Die Restriktionsanalyse ergibt eine gemeinsame
DdeI-Stelle, die zwischen der 14. und 15. Aminosäure in der
Präsequenz beider pre-IFN-α1- und α2-Gene vorhanden ist. Eine
Ligation des 44 bp-EcoRI-DdeI-Fragments, das vom das pre-IFN-α1-
Gen kodierenden EcoRI-Fragment abgeleitet ist, mit dem 900 bp-
DdeI-PstI-Fragment, das vom cDNA-Klon von IFN-α2 abgeleitet
ist, unter anschließender Verdauung mit EcoRI und PstI ergibt
ein 944-Fragment. Dieses 944 bp-EcoRI-PstI-Fragment enthält die
kodierende Sequenz für die ersten 14 Aminosäuren im von IFN-α1
abgeleiteten Präpeptid, die kodierende Sequenz des restlichen
Präpeptids und des gesamten, reifen, von IFN-α2 abgeleiteten
Proteins. Das PstI-Ende dieses 944 bp-Fragments wurde sodann
unter Verwendung des Adaptorfragments wie im Fall des Aufbaus
eines EcoRI-Fragments für reifes IFN-α2 in eine EcoRI-Stelle
umgewandelt.
Fig. 6 zeigt den Aufbau eines EcoRI-Fragments, das das preIFN-
γ-Gen mit einer 70 bp-Leader-Sequenz,
die dem Initiationskodon ATG vorausgeht, enthält. Durch Digestion
(Verdauung) des IFN-γ-cDNA-Klons (30) erzeugt man ein
842 bp-Sau3A-Fragment mit 60 bp der 5′-flankierenden Sequenz,
der gesamten kodierenden Sequenz von pre-IFN-γ und 290 bp der
3′-nicht-kodierenden Sequenz. Dieses Sau3A-Fragment wurde sodann
in einen mit BamHI verdauten Vektor pUC7, einem Plasmidgegenstück
der einsträngigen Phage M13mp⁷ (38), geklont. Das
Plasmid pUC7 wurde von pBR322 abgeleitet, indem man zunächst
das 2067 bp-EcoRI-PvuII-Fragment, das das Tetracyclinresistenzgen
enthält, entfernte und dann ein 425 bp-HaeII-Fragment vom
Phagen-M13-Derivat mP7 (38) in die HaeII-Stelle des erhaltenen
Plasmids in Position 2352 (bezogen auf die pBR322-Zählung)
einsetzte. Das HaeII-Fragment von mp7 enthält den n-terminalen
kodierenden Bereich des E. coli-lacZ-Gens, in das eine Multirestriktionsenzym-
Klonierungsstelle der Sequenz zwischen die
4. und 5. Aminosäurereste von β-Galactosidase eingesetzt wurde.
Die Insertion eines fremden DNA-Fragments in diese klonierenden
Stellen unterbricht die Kontinuität zwischen dem lac-Promotor
und dem lacZ-Gen, wodurch der Phenotyp von JM83, das mit dem
Plasmid von lac⁺ zu lac- transformiert ist, verändert wird.
Da 2 EcoRI-stellen als Flanken der BamHI-Stellen in der Multi
restriktionsklonierungsstelle von pUC7 vorhanden sind, würde
eine Digestion des das 842 bp-Sau3A-Inserts enthaltenden Plasmids
mit EcoRI eine 862 bp-Fragment ergeben, das die gesamte
pre-IFN-γ-Sequenz flankiert durch EcoRI-Stellen enthält.
Eine Digestion des Plasmids pIFN-γtrp48 (30) mit EcoRI und
BglI erzeugt ein 689 bpo-Fragment mit einem dem ATG-Initiationskodon
vorausgehende EcoRI-Ende, die gesamte kodierende Sequenz
von reifem IFN-γ und 210 bp der nicht-kodierenden Sequenz.
Das BglI-Ende wurde sodann in ein EcoRI-Ende umgewandelt,
indem es der Ligation mit einem 29 bp-BglI-EcoRI-Adaptor, der
vom vorstehend beschriebenen pre-IFN-γ-EcoRI-Fragment abgeleitet
war, unterworfen wurde. Eine anschließende Digestion
des Ligationsgemisches mit EcoRI ergibt sodann ein 718 bp-EcoRI-
Fragment mit einem Gehalt an reifem IFN-γ-Gen.
Fig. 7 zeigt den Aufbau eines EcoRI-Fragments, das das pre-IFN-
γ-Gen mit einem EcoRI-Ende und die dem ATG-Initiationskodon
vorausgehende Sequenz AAA enthält. Das EcoRI-Fragment, das
das vorstehende pre-IFN-γ-Gen enthält, wurde mit EcoRI und
MboII verdaut, um ein 184 bp-Fragment zu erzeugen. Dieses Fragment,
das den Frontteil des pre-IFN-γ-Gens enthält, wurde
wärmedenaturiert und mit einem 5′-kinasebehandelten synthetischen
Oligonucleotid 5′-pATGAAATATACA, das die ersten 4 Aminosäuren
des pre-IFN-γ-Gens kodiert, verschweißt (10). Mit
dem unteren Strang des EcoRI-MboII-Fragments als Matrize und
dem Oligonucleotid als Primer wurde das Klenow-Fragment von
E. coli-DNA-Polymerase zur Synthese des oberen Stranges und zur
Entfernung des 3′-vorstehenden Endes vom unteren Strang verwendet.
Das erhaltene 178 bp-stumpfendige Fragment, das sich vom ATG-
Initiationskodon zur ersten weiter unten gelegenen MboII-Stelle
erstreckt, wurde sodann mit einem selbst-komplementären
5′-TTTGAATTCAAA-3′-EcoRI-Linker verknüpft. Durch Digestion des
Ligationsgemisches mit EcoRI und DdeI erhält man ein 165 bp-
EcoRI-DdeI-Fragment, das den Frontteil des pre-IFN-γ-Gens enthält.
Das gesamte Gen wurde dann zusammengebaut, indem man das
600 bp-DdeI-EcoRI-Fragment, das den rückwärtigen Teil des IFN-
γ-Gens enthält, und den 3′-nicht-kodierenden Bereich verknüpfte.
Das Ligationsgemisch wurde sodann mit EcoRI verdaut, wodurch
ein 765 bp-EcoRI-Fragment, das das gesamte pre-IFN-γ-Gen enthält,
entstand. Eine Zusammenfassung sämtlicher dieser EcoRI-
Fragmentbauteile (I bis IX) ist in Fig. 8 gegeben. Alle diese
Bauteile wurden für Expressions- und Sekretionsversuche unter
Verwendung von Hefe in den Vektor YEpIPT (Fig. 2) gebracht.
Nachdem die EcoRI-Fragmentgene von Fig. 8 in YEpIPT (Fig. 2)
gebracht, auf ihre Orientierung geprüft und unter
Verwendung von Trp⁺-Komplementierung in Hefe eingeführt waren,
wurden die diese Plasmide enthaltende Hefen auf Interferon
untersucht, wobei der Test aufgrund des zytopathischen Effekts
(CPE) (26) (Bioassay) an Extrakten, freigesetztem Zellwandmaterial
und Medien angewandt wurde. Die Interferontests wurden
in drei unterschiedlichen Bereichen
der Hefekultur durchgeführt. Die Versuchsergebnisse sind in
Tabelle I zusammengestellt.
Der erste Bereich ist innerhalb der Zelle. Diese Fraktion wird
gemessen, indem man nach Entfernen der Zellwand einen Zellextrakt
herstellt und die nicht-selektierte Interferonaktivität
bestimmt. Bei den anderen Bereichen handelt es sich um die
Medien (von Hefezellen vollständig abgetrenntes Material) und
die von den Zellen nach Zellwandentfernung unter Verwendung
von Zymolase freigesetzte Aktivität (sekrektiertes, aber nichtkovalent
in der Zellwand festgehaltenes Material). Die Medienfraktion
und die nach Entfernung der Zellwand freigesetzte
Fraktion stellen das gesamte sekretierte Material dar. Werden
die Zellwände nicht entfernt (vgl. Methoden) so umfaßt die
Aktivität innerhalb der Zellen auch die sekretierte Aktivität,
die an den Zellwänden haftet.
Es ist festzuhalten, daß in Tabelle I (pre D/A) LeIFA ein reifes
LeIFA-Gen mit einer hybriden Signalpeptidsequenz (vgl. Fig. 1
und 8) ist. Dieser Aufbau wurde früher erörtert; zusammenfassend
wird darauf hingewiesen, daß er unter Verwendung der DdeI-Restriktionsstelle,
die sowohl preLeIFD und preLeIFA gemeinsam
ist, aufgebaut wurde. Fig. 1 zeigt diese DdeI-Stelle an der
Aminosäure-10. Die unterstrichenen Aminosäuren zeigen die Unterschiede
zwischen der Aminosäuresequenz von preLeIFD und preLeIFA.
Das Hybrid (pre D/A) LeIFA entspricht mehr preD als preA.
Reife LeIFA- und LeIFD-Gene (Bauteile I und III) werden in der
Hefe in Konzentrationen von 1,0 Prozent des gesamten Zellproteins
exprimiert (Konzentrationen von 2,0 Prozent wurden ebenfalls
beobachtet). Die falschen Orientierungen dieser Gene oder
die pre-Gene exprimieren nicht. Für diese beiden Gene sowie für
das reife IFN-α-Gen erfolgt keine Sekretion.
Werden jedoch Präsequenzen an diesen Genen verwendet, so finden
sich alle drei Proteinprodukte in den Medien als sekretierte
Produkte. Konzentrationen in der Höhe von 8 Prozent der Gesamtaktivität
wurden in Medien von (pre D/A) LeIFA bei A₆₆₀=3-4
beobachtet. Es ist festzuhalten, daß alle diese Plasmide in
95 Prozent der Zellen einer Kultur, die unter Trp⁺-selektivem
Druck gezüchtet werden, vorhanden sind, was die Anwesenheit
eines autonomen Replikationsplasmids bestätigt.
Zwei Interferon bildende Hefen wurden zur weiteren Charakterisierung
untersucht. Es handelt sich um YEp1PT-preLeIFA35t/pep4-3
und YEp1PT-LeIFA1/pep4-3. Die erste enthält 2 Kopien des Bauteils
IV (Fig. 8) in der EcoRI-Stelle von YEp1PT und führt zu
Aktivität innerhalb der Zelle, in der Zellwand und außerhalb
der Zelle (Medien). Dieses Zweikopiengen (in Tandemstellung - beide
in Orientierung für geeignete Expression), das das Plasmid
enthält, wurde anstelle des Einzelkopiebauteils verwendet, da
es in den Medien gelegentlich zu höheren Interferonaktivitäten
führt. Pep 4-3-Hefe wurde verwendet, da sie stark verringerte
intrazelluläre und extrazelluläre Proteaseaktivitäten aufweist
(23), was von Vorteil für die Bildung von nicht-abgebautem
Protein (Interferon) aus den Medien sein kann.
Die letztgenannte Hefe enthält das Bauteil III (Fig. 8) in
YEp1PT und exprimiert reifes LeIFA innerhalb der Zellen, sekretiert
aber nicht.
Fig. 9 erläutert eine Wachstumskurve dieser beiden Hefestämme
in YNB+CAA (Trp⁺-selektives Wachstum). die logarithmische Phase
setzt sich bis zu einer Absorption bei 660 µm von 3-4 fort.
Dann beginnt die stationäre Phase. Beide Kurven sind im wesentlichen
identisch, was darauf schließen läßt, daß die
Bildung der beiden unterschiedlichen Proteine [LeIFA und
pre D/A) LeIFA] das Wachstum oder die Lebensfähigkeit der Hefe
nicht beeinflußt. Bioassays wurden zu verschiedenen Zeitpunkten
während des Zellwachstums an den Medien durchgeführt, um die
Abhängigkeit der Wachstumskurve von der Interferonbildung in
den Medien durch diese beiden Stämme zu untersuchen. Aus diesen
Ergebnissen geht hervor, daß die Präsequenz an LeIFA eine
Freisetzung von Interferonaktivität in die Medien verursacht.
Ohne diese Sequenz wird im wesentlichen keine Aktivität freigesetzt.
Es ergibt sich auch, daß die Aktivitätsspiegel in
den Medien nahe der stationären Phase ein Maximum erreichen.
Um die Natur des Sekrektionsverfahrens für (pre D/A) LeIFA in
Hefemedien zu bestimmen, war es erforderlich, das Proteinprodukt
aus den Medien zu reinigen. Ist Hefe zur Sekretion des Proteins
in der Lage, so schneidet sie vermutlich während des
Sekretionsverfahrens das aminoterminale Ende irgendwie ab, wie
es bei Säugetierzellen normalerweise mit pre-Interferonprotein
der Fall ist. Um die Natur dieses Processing zu bestimmen,
wurden folgende Untersuchungen durchgeführt:
Fig. 10A zeigt die Interferonaktivität innerhalb der Zellwand
und in der Zelle während des gleichen Fermentationsvorgangs.
Diese Extraktionsschritte wurden durch Pelletisieren unter anschließender
Behandlung mit Glasperlen in 7 m GHCl durchgeführt,
so daß die Aktivität sowohl das intrazelluläre als auch das
innerhalb der Zellwand befindliche Material umfaßt. Diese
Aktivität umfaßt bei A₆₆₀ µm von 1,5 bis 2,0 ein Maximum von
etwa 25×10⁶ U/Liter, was darauf schließen läßt, daß die
intrazelluläre Interferonbildung anders wie beim extrazellulären
Material in der logarithmischen Phase vor Erreichen der
stationären Phase endet. Somit werden etwa 8 Prozent der Aktivität
frei in die Medien sekretiert. Jedoch kann sich auch
hier wieder ebenso viel Aktivität in der Zellwand befinden
(vgl. Tabelle I). Die Extraktmaterialien enthalten den Großteil
des intrazellulären Interferons. Dieses Material wird
zur Zeit gereinigt, um festzustellen, ob es einem Processing
unterworfen worden ist oder nicht.
Fig. 10B eine Wachstumskurve für eine 5 Liter-Fermentation
von YEp1PT-preLeIFA53t/pep4-3 in YNB+CAA. Am Ende der
Fermentation findet man durch MDBK-Tests eine Interferonaktivität
von etwa 2,0×10⁶ U/Liter. Wiederum wird die maximale
Bildung in der stationären Phase festgestellt. Es ist festzuhalten,
daß das Interferonprodukt in diesen Medien sehr stabil
ist, selbst wenn nach Erreichen der stationären Phase noch
weitere 24 Stunden bei 30°C geschüttelt wird. Diese Medien
werden für weitere Reinigungsschritte eingesetzt.
Die Medien von YEp1PT-preLeIFA53t/pep4-3 wurden zunächst ultrafiltriert.
Das Konzentrat wurde auf eine Säule mit einem Gehalt
an einem monoklonalen Antikörper gegen reifes LeIFA aufgesetzt.
Nach Waschen mit 0,2 m NaCl in tris/cys/EDTA, pH-Wert
8,0 wurde das Interferon mit H₂O (pH-Wert 5,5), wie in Fig. 11
gezeigt, eluiert. Der eluierte Peak A (der Pfeil bedeutet
das Aufsetzen von H₂O) wurde dabei erhalten. Er repräsentiert
50 Prozent der auf die Säule aufgesetzten Aktivität. Der Peak
A wurde vereinigt, wie durch die Klammer angegeben ist, und
für die weitere Reinigung eingesetzt. Durch Elution mit 0,2 m
Essigsäure erhielt man den Peak B (der Pfeil bedeutet die
Stelle des Pufferwechsels). Die Stelle C gibt den Punkt an,
an dem der ursprüngliche Waschpuffer angewendet wurde.
Die dem Peak A entsprechenden Fraktionen wurden zur Trockne
lyophilisiert und anschließend mittels HPLC (vgl. Methoden)
untersucht. Fig. 12 erläutert die Ergebnisse dieses Versuchs.
Eine 2,5 µg-Probe von gereinigtem LeIF A (aus E. coli) wurde
dann separat zur Kontrolle eingesetzt. Sowohl der Standard
als auch (pre D/A) LeIF A (oder preLeIF A) weisen identische
Retentionszeiten auf, wie aus der Figur hervorgeht. Diese
Ergebnisse zeigen, daß das Interferon aus diesen Medien dem
Processing unterworfen ist, da preLeIF A eine stark abweichende
Retentionszeit aufweist. Die punktierte Fraktion dieses HPLC-Versuchs
wurde sodann für die Proteinsequenzierung verwendet.
Fig. 13 zeigt teilweise die Ergebnisse der Sequenzierung des
gereinigten Interferaons. Die obere Sequenz ist die für (pre
D/A) LeIF A erwartete Sequenz, wenn kein Processing erfolgt.
Die normale Spaltungsstelle dieses Interferons, die vermutlich
durch Säugetierzellen erkannt wird, ist gezeigt.
Die Proteinsequenz wurde interpretiert, indem man die PTH-Aminosäure,
die bei jedem korrespondierenden Edman-Zyklus zunahm,
und im folgenden Zyklus abnahm, feststellte. PTH-Aminosäuren,
die normalerweise geringe Ausbeuten ergeben (cys, ser, thr, arg,
his) wurden angenommen, wenn kein Anstieg der anderen PTH-Aminosäuren
festgestellt wurde. Die Menge in mg wurde ermittelt,
indem man die Flächen des interpretierten Restes mit der Fläche
eines Standardgemisches von PTH-Aminosäuren, die dem gleichen
HPLC-Versuch unterworfen wurden, verglich. Ein interner
Standard von Norleucin wurde in jedes Chromatogramm eingeführt,
um festzustellen, daß die Retentionszeiten reproduzierbar
waren.
Fig. 13 zeigt die Ergebnisse der Proteinsequenzierung für gereinigtes
(pre D/A) LeIF A. Die zu erwartende Sequenz, wenn
kein Processing erfolgte, und die noramle Spaltungsstelle dieses
Präinterferons in Säugetierzellen sind ebenfalls angegeben.
Zwei unabhängige Sequenzuntersuchungen wurden an zwei unterschiedlichen,
aus Zellen und Medien gereinigten Proben durchgeführt.
Fig. 13 zeigt, daß der Großteil des Interferons im
Medium richtig verarbeitet wurde (64 Prozent), daß aber auch
eine andere Form (36 Prozent) vorhanden ist, die 3 zusätzliche
Präsequenzaminosäuren enthielt. Das intrazelluläre Interferon
enthielt ebenfalls diese beiden Formen, aber in geringfügig
abweichenden Mengenverhältnissen, sowie ferner eine dritte
Form mit einem Gehalt an 8 Präsequenzaminosäuren. Die volle
Präsequenzlänge wurde nie beobachtet, was darauf schließen
läßt, daß Hefe das gesamte pre-IFN in gleicher Weise
verarbeitet.
Es ist möglich, daß die dem Processing unterworfene Form, die
3 Präsequenzaminosäuren enthält, auf die Hybridnatur der pre D/A-Signalsequenz
zurückzuführen ist. Daher wurde auch das Processing
von nicht-hybridem (pre D) LeIF D untersucht. Pre D
unterscheidet sich von pre D/A nur in der Aminosäurestellung
-2 (leu anstelle von val). Bei Untersuchung des Processings
bei aus dem Medium gereinigten pre IFN-α1 wurden wieder sowohl
die +1 als auch die -3-Formen beobachtet (Fig. 13). Jedoch war
im Medium auch eine untergeordnete Spezies als -14-Form vorhanden,
die für (pre D/A) LeIF A nicht beobachtet wurde.
Um die Sekretion von heterologen Proteinen aus S. cerevisiae
zu untersuchen, wurden Plasmide für die in vivo-Transkription
der Gene für verschiedene reife Interferone (IFNs) und verschiedene
pre IFNs aufgebaut. Immer wenn die kodierenden Sequenzen
für hydrophobe Signalpeptide vorhanden waren, konnte
IFN-antivirale Aktivität aus den Wirtszellen und dem Kulturmedium
gewonnen werden, während das gesamte IFN, dessen Synthese
durch reife IFN-Gene dirigiert wurde, innerhalb der
Zellen verblieb. Es wurde versucht, die Erfordernisse für die
Sekretion durch Bereitstellung von Bauteilen zu untersuchen,
bei denen das Interferongen mit seinen eigenen natürlichen
Signalsequenzen, wie in (pre D) LeIF D oder mit einer Hybridsignalfrequenz,
bezeichnet als eine Zusammensetzung von 2 IFN-α-Spezies,
wie in (pre D/A) LeIF A, versehen wurde. Während im
allgemeinen die Hefezellen, die diese Bauteile beherbergten,
IFN in das Kulturmedium sekretierten, unterschied sich die
Aktivitätsmenge innerhalb der Stämme. Auch die gereinigte und
sequenzierte IFN-Spezies zeigte Unterschiede.
Drei Formen von nicht-sekretiertem Interferon, die 90 Prozent
des gesamten exprimierten Interferons darstellen, wurden aus
Zellen, die das (pre D/A) LeIF A-Gen beherbergen, gereinigt.
Eine Form (33 Prozent) war richtig verarbeitet (+1, Fig. 13),
eine zweite Form (55 Prozent) enthielt 3 zusätzliche Aminosäuren
(-3, Fig. 13) und eine dritte Form (11 Prozent) enthielt
8 zusätzliche Aminosäuren (-8). Die letztgenannte Form
wurde im Medium nicht festgestellt, während IFN mit voller
Präsequenzlänge in den Zellen oder Medien nie beobachtet wurde.
Anstelle der für die Züchtung von (pre D/A) LeIF A-Hefe verwendeten
Schüttelflasche wurde (pre D) LeIF D-exprimierende
Hefe in einem 10 Liter fassenden Fermenter bis zu einem A₅₅₀-Wert
von 60 gezüchtet.
Bei Untersuchung des Processings von (pre D) LeIF D, das aus
dem Medium gereinigt worden war (Reinigung wie bei pre D/A
LeIF A) wurden sowohl die +1- als auch -3-Formen beobachtet
(Fig. 13). Eine weitere untergeordnete Spezies war ferner im
Medium als -14-Form vorhanden. Es gab keine Anzeichen für
eine Zellysis in der Kultur, wie durch SDS-Gelelektrophorese
des Mediumproteins im Vergleich mit zellulären Proteinen
festgestellt wurde. Interessanterweise wurde für LeIF D bei
sehr hoher Wachstumsdichte ein sehr hoher prozentualer Anteil
(30 Prozent) der Sekretion in das Medium beobachtet. Hochdichte
Fermentationen von (pre D/A) LeIF A exprimierender Hefe
zeigen ebenfalls diese höhere prozentuale Sekretion.
Hefe scheint sowohl sekretiertes als auch nicht-sekretiertes
Interferon dem Processing zu unterwerfen. Der Anteil der
sekretierten Aktivität hängt vom Wachstumsstadium der Zellen
ab, wobei maximale Prozentanteile in der stationären Phase in
Schüttelkolben und am Ende der hochdichten Fermentationen (30
Prozent in Medien) auftreten.
Die Hefe mit einem Gehalt an diesen beiden Plasmiden, die für
die vorstehenden Untersuchungen eingesetzt worden war, wurde
durch Wiedergewinnung der Plasmide aus d er Hefe weiter untersucht.
Dies wurde durch Isolierung der Plasmid-DNA aus Hefeextrakt
durch Transformation von E. coli, anschließende Miniscreen-DNA-Präparation
und Restriktionsanalyse der Plasmid-DNAs
durchgeführt. Einige aus E. coli isolierte Plasmid-DNAs wurden
für beide Hefetypen charakterisiert. In sämtlichen Fällen
enthielten die Plasmide die erwartete Restriktionssequenz, was
die Anwesenheit der Präsequenz am (pre D/A) LeIF A enthaltenden
Plasmid und dessen Fehlen an Plasmid mit einem Gehalt an reifem
LeIF A bestätigt.
300 µg pB1 (37a) wurden gründlich mit HindIII in 500 µl
Reaktionsvolumen verdaut und anschließend der Elektrophorese
an 1-prozentigem Agarosegel aus präparativer Agarose
unterworfen. Das 3,1 kb HindIII-Insert wurde aus dem mit Ethidium
gefärbten Gel geschnitten, der Elektroelution (39) unterworfen,
2 mal mit gleichen Volumina an mit Puffer gesättigtem
Phenol und Chloroform extrahiert und sodann mit Äthanol gefällt.
Portionen des resuspendierten DNA-Fragments wurden aufgeteilt
und mit einer Gruppe von verschiedenen Restriktionsenzymen
Restriktionsschnitten unterworfen, wodurch man die in
Fig. A wiedergegebene partielle Restriktionskarte erhielt.
30 µg des gereinigten 3,1 kb-Inserts wurden mit Sau3A geschnitten
und sodann auf einem 6prozentigen Acrylamidgel laufengelassen.
Die Fragmente, entsprechend den 265 bp und 141 bp, wurden
auf die vorstehend genannte Weise separat durch Elektroelution
gereinigt. Jedes DNA-Fragment wurde sodann der DNA-Sequenzanalyse
(39) unterworfen.
Ein Teil dieser DNA-Sequenz ist in Fig. B angegeben. Die Aminosäuren,
entsprechend den N-terminalen Aminosäuren des PGK-Strukturgens,
sind oberhalb der DNA-Sequenz aufgeführt.
Ein synthetisches Oligonucleotid mit der Sequenz 5′ATTTGTTGTAAA3′
wurde nach üblichen Methoden (40) synthetisiert. 100 ng dieses
Primers wurden am 5′-Ende unter Verwendung von 10 Einheiten
T4-Polynucleotid-kinase in 20 µl Reaktionsmedium, das ferner
200 µ Ci [γ³²-P] ATP enthielt, markiert. Diese markierte Primerlösung
wurde in einer Primer-Reparatur-Reaktion verwendet, die
als erste Stufe in einem mehrstufigen Verfahren angewandt wurde,
um eine EcoRI-Restriktionsstelle in die PGK 5′-flankierende
DNA unmittelbar vor der PGK-Strukturgensequenz zu bringen. Dieses
mehrstufige Verfahren ist nachstehend erläutert.
100 µg pB1 wurden vollständig mit HaeIII verdaut und sodann auf
einem 6prozentigen Polyacrylamidgel laufengelassen. Die oberste
Bande des mit Ethidium gefärbten Gels (den PGK-Promotorbereich
enthaltend) wurde auf die vorstehend erläuterte Weise durch Elektroelution
isoliert. Dieses 1200 bp HaeIII-Stück von DNA wurde
der Restriktion mit HindIII unterworfen und sodann auf einem
6prozentigen Acrylamidgel laufengelassen. Die 650 bp-Bande
wurde durch Elektroelution isoliert. 5 µg DNA wurden isoliert.
Dieses 650 bp HaeIII-bisHindII-Stück von DNA wurde in 20 µl
dIH₂O resuspendiert und sodann mit 20 µl der vorstehend beschriebenen
phosphorylierten Primerlösung vermischt. Das Gemisch
wurde 1 mal mit Phenol/Chloroform extrahiert und sodann
mit Äthanol gefällt. Die getrocknete DNA wurde in 50 µl H₂O
resuspendiert und sodann 7 Minuten in einem siedenden Wasserbad
erwärmt. Diese Lösung wurde dann rasch (10 bis 20 Sekunden)
in einem Trockeneis/Äthanol-Bad gekühlt und dann in ein Eis/Wasser-Bad
übertragen. Diese Lösung wurde mit 50 µl einer Lösung
mit einem Gehalt an folgenden Bestandteilen versetzt:
10 µl 10X DNA Polymerase I-Puffer (Boehringer Mannheim), 10 µl
einer vorher hergestellten Lösung, die jeweils 2,5 millimolar
an den einzelnen Desoxynucleosidtriphosphaten (dATP, dTTP,
dGTP und dCTP) ist, 25 µl dIH₂O und 5 Einheiten DNA-Polymerase I,
Klenow-Fragment. Das 100 µl umfassende Reaktionsgemisch wurde
4 Stunden bei 37°C inkubiert. Die Lösung wurde sodann 1 mal
mit Phenol/Chloroform extrahiert, mit Äthanol gefällt, durch
Lyophilisation getrocknet und schließlich mit 10 Einheiten
Sau3A gründlich der Restriktion unterworfen. Diese Lösung wurde
sodann auf einem 6prozentigen Acrylamidgel laufengelassen.
Die in der Größe 39 bp entsprtechende Bande wurde aus dem Gel
geschnitten und sodann auf die vorstehend geschilderte Weise
durch Elektroelution isoliert. Diese 39 bp-Bande weist ein
stumpfes Ende und ein Sau3A-kohäsives Ende auf. Dieses Fragment
wurde in einen modifizierten pFIFtrp69-Vektor (10) geklont.
10 µg an pFIFtrp69 wurden mit XbaI linearisiert, 1 mal mit
Phenol/Choroform extrahiert und sodann mit Äthanol gefällt.
Das XbaI-kohäsive Ende wurde unter Verwendung von DNA-Polymerase
I-Klenow-Fragment in einem 50 µl umfassenden Reaktionsmedium
mit einem Gehalt an 250 millimolar der einzelnen Nucleosidtriphosphate
gefüllt. Diese DNA wurde mit BaHI geschnitten
und anschließend auf einem 6prozentigen Acrylamid laufengelassen.
Das Vektorfragment wurde vom Gel durch Elektroelution
isoliert und sodann in 20 µl dIH₂O resuspendiert. 20 ng dieses
Vektors wurden mit 20 ng des vorstehend synthetisierten 39 bp-Fragments
4 Stunden bei Raaumtemperatur der Ligation unterworfen.
1/5 des Ligationsgemisches wurde verwendet, um Ampicillinresistenz
(auf LB +20 µg/ml amp-Platten) auf E. coli Stamm 294
zu transformieren. Plasmide aus d en Transformanten wurden durch
ein Raschsichtungsverfahren (20) untersucht. Ein Plasmid, pPGK-39
(Fig. C) wurde für die Sequenzanalyse ausgewählt. 20 µg dieses
Plasmids wurden mit XbaI verdaut, mit Äthanol gefällt und
sodann mit 1000 Einheiten bakterieller alkalischer Phosphatase
45 Minuten bei 668°C behandelt. Die DNA wurde 3 mal mit Phenol/Chloroform
extrahiert und sodann mit Äthanol gefällt. Die dephosphorylierten
Enden wurden sodann in einem 20 µl umfassenden
Reaktionsgemisch mit einem Gehalt an 200 µ Ci [δ³²-P] ATP und
10 Einheiten T₄-Polynucleotid-kinase markiert. Das Plasmid wurde
mit SalI geschnitten und auf einem 6prozentigen Acrylamidgel
laufengelassen. Die markierte Insertbande wurde aus
dem Gel isoliert und durch chemischen Abbau sequenziert (39).
Die DNA-Sequenz am 3′-Ende dieses Promotorstücks entsprach den
Erwartungen.
25 µg PGK-39 (Fig. C) wurden gleichzeitig mit SalI und XbaI
(jeweils 5 Einheiten) verdaut und anschließend der Elektrophorese
an einem 6prozentigen Gel unterworfen. Die 390 bp-Bande,
die das 39 bp-Promotorstück enthielt, wurde durch Elektroelution
isoliert. Die resuspendierte DNA wurde der Restriktion
mit Sau3A unterworfen und sodann der Elektrophorese an
einem 8prozentigen Acrylamidgel unterzogen. Die 39 bp PGK-Promotorbande
wurde durch Elektroelution isoliert. Diese DNA
enthielt 39 bp am 5′-Ende des PGK-Promotors an einem Sau3A-bis
XbaI-Fragment.
25 µg pB1 wurden der Restriktion mit PvuI und KpnI unterworfen
und anschließend der Elektrophorese an einem 6prozentigen
Gel unterzogen. Die 0,8 kbp-Bande von DNA wurde durch Elektroelution
isoliert und sodann mit Sau3A der Restriktion und anschließend
der Elektrophorese an einem 6prozentigen Gel unterworfen.
Die 265 bp-Bande aus dem PGK-Promotor (Fig. A) wurde
durch Elektroelution isoliert.
Diese DNA wurde sodann mit dem 39 bp-Promotorfragment (vgl. oben)
2 Stunden bei Raumtemperatur verknüpft. Das Ligationsgemisch
wurde der Restriktion mit XbaI und PvuI unterworfen und sodann
der Elektrophorese an einem 6prozentigen Acrylamidgel
unterzogen. Das 312 bp Xba-bis-PvuI-Restriktionsfragment wurde
durch Elektroelution isoliert, anschließend zu einem Ligationsgemisch
mit einem Gehalt an 200 ng pBR322 (33) (vorher
isoliert unter Weglassen des 162 PvuI-bis-PstI-Restriktionsfragments)
und 200 ng XbaI-bis-PstI LeIFA-cDNA-Gen (vorher
isoliert aus 20 µg pLEIFtrpA) gegeben. Dieses Ligationsgemisch
mit 3 Faktoren wurde zur Transformation von E. coli Stamm 294
zur Verleihung von Tetracyclinresistenz verwendet. Transformantenkolonien
wurden einem Miniscreening unterworfen. Eine
der Kolonien, pPGK-300, wurde isoliert. Sie wies 304 bp PGK-5′-flankierende
DNA, verschmolzen mit dem LeIFA-Gen in einem Vektor
auf der Basis von pBR322 auf. Das 5′-Ende des LeIFA-Gens weist
folgende Sequenz auf: 5′-CTAGAAATTC 3′, so daß das Verschmelzen
der XbaI-Stelle aus dem PGK-Promotorfragment in diese Sequenz
die Addition einer EcoRI-Stelle an die XbaI-Stelle ermöglicht.
pPGK-300 enthält somit einen Teil des PGK-Promotors, isoliert
in einem PvuI-bis-EcoRI-Fragment.
10 µg pBI wurden mit PvuI und EcoRI verdaut und an einem 6prozentigen
Acrylamidgel laufengelassen. Die 1,3 kbp PvuI-bis-EcoRI-DNA-Bande
aus der PGK 5′-flankierenden DNA wurde durch
Elektroelution isoliert. 10 µg des pPGK-300 wurden mit EcoRI
und PvuI verdaut. Nach Elektrophorese des Verdauungsgemisches
an einem 6prozentigen Gel wurde das 312 bp-Promotorfragment
durch Elektroelution isoliert. 5 µg pFRL4 wurden mit EcoRI
geschnitten, mit Äthanol gefällt und sodann 45 Minuten mit
bakterieller alkalischer Phosphatase bei 68°C behandelt. Nach
3maliger Behandlung der DNA mit Phenol/Chloroform, Fällung
mit Äthanol und Resuspendierung in 20 ml dIH₂O wurden 200 ng
des Vektors mit 100 ng 312 bp EcoRI-bis-PvuI-DNA aus pPGK-300
und 100 ng EcoRI-bis-PvuI-DNA aus pB1 verknüpft. Das Ligationsgemisch
wurde zur Transformation von E. coli Stamm 294
zur Verleihung von Ampicillinresistenz verwendet. Aus einer
der ApR-Kolonien wurde pPGK-1500 erhalten. Dieses Plasmid
enthält das 1500 bp PGK-Promotorfragment als ein EcoRI-bis-EcoRI-
oder HindIII-bis-EcoRI-Stück von DNA.
Die Bauteile A bis E von Fig. 14 wurden in Vektoren mit entsprechenden
Stellen eingebaut. Beim Bauteil A wurde eine synthetische
DNA hergestellt, um die DNA-Sequenz zu Beginn der
preHGH-cDNA (42) von der Hpa II-Stelle unter Bildung eines
EcoRI in Front des ATG-Translationsstarts zu verdoppeln. Das
HpaII-bis-PstI-Fragment wurde aus preHGH cDNA (42) erhalten.
Dieses Fragment mit der synthetischen DNA wurde mit einem
EcoRI-bis-PstI-Vektor (pHGH 207-1, EcoRI-bis-PstI-Fragment,
das einen Teil des ApR-Gens enthält, entfernt und beide Seiten
nach Klenow-Füllung religiert, um beide Seiten zu entfernen),
der die PstI-bis-SmaI-Stelle von HGH cDNA (43) erhält, verknüpft,
um das Bauteil A zu erhalten. Das Bauteil B wurde aus
einem Plasmid mit einem Gehalt am reifen HGH-Gen, das vorher
für die direkte Expression mit einem Gehalt an 23 Aminosäuren
der synthetischen kodierenden Sequenz am NH₂-terminalen Ende
aufgehakt worden ist, hergestellt. Ein Plasmid mit einem Gehalt
an diesem Gen wurde mit PvuII im HGH-Gen und BamHI im
TcR-Gen geschnitten. Das große Fragment mit einem Gehalt am
Großteil des Gens wurde sodann mit synthetischer DNA, die das
Ende des HGH-Gens (TAG) dupliziert und eine HindIII-Stelle
schafft, verknüpft. Die HindIII-Stelle wurde mit dem HindIII/BamHI-Fragment
von pBR322 als der dritte Faktor einer Verknüpfung
mit 3 Faktoren verknüpft, wodurch man ein Plasmid mit
einem Gehalt am Bauteil B erhielt.
A und B wurden sodann gemäß Fig. 14 zu Bauteil C vereinigt.
C wurde weiter unter Bildung von D modifiziert, wo die HindIII-Stelle
in eine EcoRI-Stelle verwandelt war. Das so erhaltene
EcoRI-Stück wurde in die EcoRI-Stelle des Hefeexpressionsplasmids
YEpIPT zur Expression des preHGH-Gens in Hefe eingesetzt.
Das Bauteil E wurde ebenfalls unter Verwendung des bei D eingesetzten
Konverters hergestellt, um ein reifes Interferongen
(ohne Sekretionssignalfrequenz) an einem EcoRI-Fragment zur
Expression in YEpIPT zu erhalten.
Das mHGH-Bauteil (E) in YEpIPT wurde in den Stamm pep4-3 trp1
(20B-12) gebracht. Extrakte unter Verwendung von Glasperlen
wurden gemäß der vorstehend geschilderten Methodik hergestellt.
Jedoch wurden die Glasperlen zu 10 ml pelletisierten Zellen
mit 0,5 ml 0,1prozentigem SDS gegeben. Verdünnungen wurden in
Pferdeserum durchgeführt. RIA-Tests erfolgten gemäß (44).
RIA ergab, daß HGH in einer Menge von etwa 0,5 Prozent des
gesamten Hefeproteins bei A₆₆₀ an 1,0 (0,5 mg/Liter/A₆₆₀) exprimiert
wurde. Im Medium wurde kein HGH nachgewiesen.
Das preHGH-Bauteil (D) in YEpIPT wurde ebenfalls in Hefe eingebracht.
Zellen und Medium wurden auf HGH getestet. Ein geringerer
Expressionsgrad wurde in den Zellen (0,08 mg/Liter/A₆₆₀)
festgestellt, entsprechend 0,08 Prozent des gesamten
Hefeproteins. Somit beträgt der Expressionsgrad etwa 1/6 der
Expression von reifem HGH, ein Ergebnis, das starke Ähnlichkeit
mit dem Ergebnis bei Leukozyteninterferon zeigt. Jedoch ist
dieser Vergleich möglicherweise nicht angebracht, da die Kodonverwendung
von reifem HGH (44) sich für 23 Aminosäuren von den
gleichen Aminosäuren für preHGH unterscheidet. Dieser Unterschied
kann zum unterschiedlichen Expressionsgrad der beiden
Produkte führen (45). 10 Prozent oder 8 µg/Liter/(A₆₆₀=1)
des in der Zelle exprimierten Anteils finden sich im Medium
von preHGH exprimierender Hefe. In einem 10 Liter-Fermenter
bei A₅₅₀=85 erfolgt ebenfalls eine etwa 10prozentige Sekretion
mit 1 mg/Liter HGH in den Medien.
Ein Vergleich des HGH-Proteins in der Zell mit dem außerhalb
der Zelle wurde mit dem vorstehend erläuterten Western-Blottingverfahren
durchgeführt. Die Ergebnisse zeigen ein
Medium hochdichtter Fermentierung (A₅₅₀=85) von preHGH exprimierender
Hefe. Eine einzige Bande entsprechend der Größe von
reifem HGH, ist vorhanden. Diese Bande entspricht 1 bis 2 Prozent
des Hefe-Mediumproteins.
Wird dieses Medium-HGH durch Antikörperaffinitätschromatographie
und HPLC, wie bei den Interferonen, gereinigt,
so zeigt die NH₂-terminale Sequenzierung, daß es sich
bei nahezu 100 Prozent des HGH um reifes HGH handelt (die Sequenzierung
wurde für 10 Reste durchgeführt), wie teilweise
in Fig. 13 gezeigt ist. Somit wird das gesamte Medium HGH
genau dem Processing unterworfen, wie es bei menschlichen
Zellen der Fall ist.
Literaturliste
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Claims (13)
1. Verfahren zur Herstellung von für einen Hefeorganismus
heterologem Protein als Produkt von Expression,
Processing und Sekretion durch Hefe, dadurch
gekennzeichnet, daß man einen Hefeorganismus mit einem
Expressionsträger transformiert, der funktionell DNA
beherbergt, die das Protein und ein heterologes
Signalpolypeptid kodiert, eine Kultur des
transformierten Organismus herstellt, die Kultur
züchtet und das heterologe Protein aus dem
Kulturmedium gewinnt.
2. Protein, das frei ist von Polypeptid-Präsequenzen und
zusätzlichem N-terminalem Methionin, erhalten durch
Transformieren eines Hefeorganismus mit einem
Expressionsträger, der funktionell DNA beherbergt, die
das Protein und ein heterologes Signalpolypeptid
kodiert, Herstellen einer Kultur des transformierten
Organismus, Züchten der Kultur und Gewinnen des
heterologen Proteins aus dem Kulturmedium.
3. Protein nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß
es sich um Humaninterferon handelt.
4. Protein nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß
es sich um Humanleukozyteninterferon handelt.
5. Protein nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß
es sich um Humanleukozyteninterferon A oder D handelt.
6. Hefeorganismuszellkultur, die zur Bildung eines zum
Hefeorganismus heterologen Proteins in der Lage ist,
enthaltend
1) lebensfähige Hefezellen, die mit einem Expressionsträger transformiert sind, der funktionell DNA beherbergt, die dieses Protein und ein heterologes Signalpolypeptid kodiert, und
2) ein diese Zellkultur tragendes Medium, wobei das Medium dieses Protein als ein Produkt von Expression, Processing und Sekretion durch diesen Hefeorganismus enthält.
1) lebensfähige Hefezellen, die mit einem Expressionsträger transformiert sind, der funktionell DNA beherbergt, die dieses Protein und ein heterologes Signalpolypeptid kodiert, und
2) ein diese Zellkultur tragendes Medium, wobei das Medium dieses Protein als ein Produkt von Expression, Processing und Sekretion durch diesen Hefeorganismus enthält.
7. Zellkultur nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet,
daß es sich bei dem Hefeorganismus um Saccharomyces
cerevisiae handelt.
8. Zellkultur nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet,
daß es sich bei dem heterologen Signalpolypeptid um
ein Hybrid des für dieses Protein nativen Signals und
eines zweiten heterologen Signalpolypeptids handelt.
9. Medium einer Hefeorganismuszellkultur nach Anspruch 6,
das im wesentlichen frei von lebensfähigen oder
zertrümmerten Hefezellen ist und ein zum
Hefeorganismus heterologes Protein als ein Produkt von
Expression, Processing und Sekretion durch diesen
Hefeorganismus enthält.
10. Hefeexpressionsträger YEp1PT, der funktionell DNA
beherbergt, die ein zum Hefeorganismus heterologes
Protein kodiert, mit der in Fig. 2 angegebenen
Struktur, wobei Fig. 2 Bestandteil dieses Anspruchs
ist.
11. Expressionsträger nach Anspruch 10, dadurch
gekennzeichnet, daß er zusätzlich DNA beherbergt, die
ein heterologes Signalpolypeptid im translationalen
Leseraster mit der das heterologe Protein kodierenden
DNA kodiert.
12. Expressionsträger nach Anspruch 11, dadurch
gekennzeichnet, daß es sich bei dem heterologen
Signalpolypeptid um ein Hybrid des für das Protein
nativen Signals und eines zweiten heterologen
Signalpolypeptids handelt.
13. Expressionsträger nach Anspruch 11, der funktionell
DNA beherbergt, die Humanleukozyten-D/A-Signalpolypeptid
im translationalen Leseraster mit Humanleukozyteninterferon
A nach Anspruch 5 kodiert.
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