DE4226971A1

DE4226971A1 - Modifizierte Pilzzellen und Verfahren zur Herstellung rekombinanter Produkte

Info

Publication number: DE4226971A1
Application number: DE4226971A
Authority: DE
Inventors: Widmar Prof Dr Tanner; Sabine Dr Strahl-Bolsinger
Original assignee: STRAHL BOLSINGER SABINE DR
Current assignee: Novozymes Biopharma DK AS
Priority date: 1992-08-14
Filing date: 1992-08-14
Publication date: 1994-02-17
Anticipated expiration: 2012-08-15
Also published as: NO950534D0; WO1994004687A1; NO320349B1; ATE245701T1; EP0658203B1; JP3630424B2; ZA935915B; FI950628A; ES2203619T3; DE4244915C2; EP0658203A1; AU679935B2; DE69333112D1; JPH08500975A; DE4226971C2; FI121075B; US5714377A; CA2140894A1; DE69333112T2; NO950534L

Description

Diese Erfindung betrifft verbesserte Pilzzellen und Verfahren zur Herstellung rekombinanter Produkte in verbesserter Qualität und hohen Ausbeuten. Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung Pilzzellen, die in ihren DNA-Sequenzen spezifische Modifikationen aufweisen, die wenigstens zu einer verringerten Fähigkeit der Pilzzellen zur O-Glykosylierung von homologen und/oder heterologen Proteinen führen, sowie die Verwendung dieser Zellen als Wirtszellen zur Herstellung von hohen Ausbeuten rekombinanter Produkte.

Die Entwicklung der DNA-Rekombinations-Technik hat die Herstellung fremder Proteine in solchen Wirtszellen möglich gemacht, in die für diese Produkte codierende exogene DNA- Sequenzen eingeführt worden sind. Die Vorteile dieser Technologie bestehen darin, daß Produkte in hohen Ausbeuten, in hochgereinigter Form und ohne Risiko einer Verunreinigung, wie z. B. einer viralen Verunreinigung (AIDS, Hepatitis B usw.), erzeugt werden können. Diese Rekombinations-Techniken werden zur Herstellung rekombinanter Proteine in prokaryotischen und auch in eukaryotischen Wirtszellen häufig eingesetzt. Prokaryotische Wirtszellen umfassen E. coli [Nagata et al., Nature 284 (1980) 316; EP 1929], Bacillus subtilis [Saunders et al., J. Bacteriol. 169 (1987) 2917], Streptomyces, Corynebacterium (EP 433 117). Eukaryotische Wirtszellen umfassen pflanzliche Zellen, tierische Zellen und Pilzzellen.

Die Herstellung rekombinanter Produkte in großen Mengen durch diese Techniken ist jedoch immer noch begrenzt, dies ist auf Probleme bei der Expressionseffizienz dieser exogenen DNA-Sequenzen zurückzuführen und beruht außerdem auf der Instabilität von Vektoren und auf dem intrazellulären Abbau der rekombinanten Produkte durch die Wirtszellen, in denen sie hergestellt werden. Hinsichtlich der Expressionseffizienz sind Versuche unternommen worden, starke Promotoren zu isolieren, die zu einer gesteigerten Expression von exogenen DNA-Sequenzen führen und auf diese Weise die Herstellung von rekombinanten Produkten steigern. Außerdem sind verschiedene Systeme entwickelt worden, um die Stabilität der Vektoren in den Wirtszellen zu erhöhen, wobei am häufigsten die Insertion eines Antibiotikaresistenz-Gens in den Vektor verwendet wird, wodurch die rekombinanten Wirtszellen in Selektivmedium überleben und wachsen können. Bezüglich des intrazellulären Abbaus sind mehrere mutante Zellen beschrieben worden, die keine oder eine verminderte Proteaseaktivität aufweisen, wodurch die Fähigkeit dieser Zellen zum Abbau rekombinanter Produkte begrenzt wird.

Die Herstellung rekombinanter Produkte in großen Mengen und ihre pharmazeutische Anwendung wird jedoch noch durch weitere Probleme eingeschränkt. Eines dieser Probleme kommt durch die Tatsache zustande, daß sich rekombinant hergestellte Produkte häufig von ihrem natürlichen Gegenstück unterscheiden. Beispielsweise besitzen bakterielle Wirtszellen nicht alle posttranslationalen Mechanismen, die für die Reifung von Säugerpolypeptiden erforderlich sind. Demgemäß sind die in Bakterien hergestellten Säugerpolypeptide häufig unreif und nicht richtig gefaltet. Außerdem führen bakterielle Wirtszellen im allgemeinen ein weiteres N-terminales Methionin in die Pro dukte ein.

Die in heterologen eukaryotischen Wirten hergestellten rekombinanten Produkte unterscheiden sich von ihren natürlich vorkommenden Gegenstücken üblicherweise in ihrem Glykosylierungsgehalt. Dies kann die Gegenwart gegenüber der Abwesenheit einer beliebigen Kohlenhydratstruktur, die Stellung der Kohlenhydratstruktur auf dem Produkt und auch die Art des Kohlenhydrates betreffen. Insbesondere ist gezeigt worden, daß die aus Hefe stammenden rekombinanten Produkte im Vergleich zu ihren natürlichen Gegenstücken häufig zusätzliche unnatürliche O-Glykane tragen. Beispielsweise ist gezeigt worden, daß der menschliche insulinähnliche Serum-Wachstumsfaktor I (IGF-I) nicht glykosyliert ist, seine in S. cerevisiae hergestellte rekombinante Form dagegen O-glykosyliert, genauer gesagt O- mannosyliert ist [Hard et al., FEBS Letters 248 (1989) 111]. Auf gleiche Art und Weise ist gezeigt worden, daß menschlicher Thrombozyten-abgeleiteter Wachstumsfaktor (PDGF) und menschlicher GM-CSF unnatürliche O- Mannosylstrukturen aufweisen, wenn sie in S. cerevisiae hergestellt wurden [Biomedic. Environ. Mass Spectrometry 19 (1990) 665; BIO/TECHNOLOGY 5 (1987) 831]. Diese abnorme O- Gylkosylierung wird durch wichtige Unterschiede zwischen den Glykosylierungsmechanismen von Säugerzellen (menschlichen Zellen) und denjenigen anderer eukaryotischer Zellen, wie z. B. Hefen, verursacht. In diesem Zusammenhang ist beob achtet worden, daß die O-Glykosylierung in Pilzzellen (ein schließlich Hefen und filamentösen Pilzen) in einer ähn lichen und unüblichen Art und Weise vor sich geht, die bisher in keinem anderen Organismus beobachtet worden ist.

Das Auftreten dieser unerwünschten O-Glykosylierung auf den aus Pilzen stammenden rekombinanten Produkten stellt bei der Arzneimittelherstellung einen wichtigen Nachteil dieser Technologie dar.

Der erste Grund besteht darin, daß pilzspezifische Gly kane neue immunologische Determinanten auf ein Protein ein führen können und ein Glykoprotein mit solchen unnatürlichen Kohlenhydraten daher bei der Verabreichung an Menschen antigen sein kann. In diesem Zusammenhang ist beispielsweise bekannt, daß die meisten Menschen Antikörper besitzen, die gegen N-gebundene Hefe-Mannanketten gerichtet sind [Feizi und Childs, Biochem. J. 245 (1987) 1].

Ein weiterer Grund besteht darin, daß Proteine ohne passende Kohlenhydratstrukturen auch veränderte pharmakokinetische Eigenschaften aufweisen können. Es ist gezeigt worden, daß Kohlenhydratstrukturen von Glykoproteinen die in vivo-Clearance-Rate, die für die Bestimmung der Wirksamkeit eines Arzneimittels wesentlich ist, beeinflussen und an deren Definition beteiligt sind. Genauer gesagt ist auf der Oberfläche von Leberendothelzellen und residenten Makrophagen ein Mannose- Rezeptor identifiziert worden, der offensichtlich ein Mittel zur Eliminierung von Glykoproteinen, die Oligosaccharide vom Mannosetyp aufweisen, darstellt [Stahl, Cell. Mol. Biol. 2 (1990) 317]. Daher kann das Vorliegen von unnatürlichen zu sätzlichen Mannosestrukturen auf einem Protein dessen Clea rance-Rate erhöhen und auf diese Weise dessen Plasma-Halb wertszeit verringern.

Noch ein weiterer Grund besteht darin, daß sich die biologische Aktivität eines Glykoproteins mit seinem Kohlen hydratgehalt, mit der Stellung und der Art der Kohlenhydrate wie gezeigt ändert. Beispielsweise ist gezeigt worden, daß die biologischen Eigenschaften von rekombinantem menschli chem EPO [Takeuchi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 (1989) 7819) und rekombinantem menschlichem tPA [Parekh et al., Biochemistry 28 (1989) 7644] durch die Glykosylierung beeinträchtigt werden.

Aus den vorstehend erwähnten Gründen geht hervor, daß die immunologischen, biologischen und pharmakokinetischen Eigenschaften der aus Pilzen stammenden rekombinanten Produkte durch die unnatürliche O-Glykosylierung ernsthaft beeinträchtigt werden können, wodurch gegebenenfalls verhindert wird, daß diese Produkte für die therapeutische Anwendung beim Menschen weiterentwickelt werden können.

Die vorliegende Erfindung löst das vorstehend beschrie bene Problem der abnormen O-Glykosylierung durch Bereitstel lung von modifizierten Pilzzellen, die in ihren DNA- Sequenzen (eine) genetische Modifikation(en) aufweisen, die wenigstens zu einer verringerten Fähigkeit der Pilzzellen zur O-Glykosylierung von nativen oder fremden Proteinen führt (führen).

Der Anmelder hat jetzt gefunden, daß es möglich ist, genetisch modifizierte Pilzzellen zu erhalten, die eine ver ringerte Fähigkeit zur O-Glykosylierung aufweisen, die noch lebensfähig sind und unter industriellen Fermentationsbedin gungen gute Wachstumseigenschaften zeigen. Unerwarteterweise hat der Anmelder außerdem gezeigt, daß die genetischen Modifikationen nicht die Stabilität der Pilzzellen beeinträchtigen, wenn diese mit exogener DNA transformiert werden. Die modifizierten Pilzzellen der vorliegenden Erfindung können vorzugsweise als Wirtszellen zur Herstellung qualitativ hochwertiger rekombinanter Produkte, die weniger oder keine unerwünschten O-Glykane aufweisen, verwendet werden.

Eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Bereit stellung einer Pilzzelle, die in ihren DNA-Sequenzen (eine) genetische Modifikation(en) aufweist, die wenigstens zu einer verringerten Fähigkeit der Pilzzelle zur O-Glykosylie rung führt (führen).

Die erfindungsgemäße Pilzzelle kann aus filamentösen Pilzen und Hefen ausgewählt werden. Arten filamentöser Pilze, die in der vorliegenden Erfindung beispielsweise gemeint sind, sind Aspergillus, Trichoderma, Mucor, Neurospora, Fusarium und dgl. Beispiele für Hefearten umfassen Kluyveromyces, Saccharomyces, Pichia, Hansenula, Candida, Schizosaccharomyces und dgl. Stärker bevorzugte Arten sind die Arten aus der Gruppe Kluyveromyces, Saccharomyces, Pichia, Hansenula und Candida und noch stärker bevorzugt Kluyveromyces und Saccharomyces. Stämme von Kluyveromyces, die bevorzugte Ausführungsformen dieser Erfindung darstellen, umfassen beispielsweise K. lactis, K. fragilis, K. waltii, K. drosophilarum und dgl. Ein bevor zugter Stamm von Saccharomyces ist S. cerevisiae.

In der erfindungsgemäßen Bedeutung steht genetische Modifikation vorzugsweise für eine beliebige Suppression, Substitution, Deletion oder Addition einer oder mehrerer Basen oder eines Fragmentes der Pilzzell-DNA-Sequenzen. Solche genetischen Modifikationen können in vitro (direkt auf isolierter DNA) oder in situ, z. B. durch gentechnische Verfahren oder indem die Pilzzellen mutagenen Agentien ausgesetzt werden, erhalten werden. Mutagene Agentien umfassen z. B. physikalische Agentien, wie z. B. energiereiche Strahlen (Röntgenstrahlen, γ-Strahlen, UV usw.), oder chemische Agentien, die befähigt sind, mit verschiedenen funktionellen DNA-Gruppen zu reagieren, wie z. B. alkylierende Mittel (EMS, NQO usw.), bisalkylierende Mittel, intercalierende Mittel usw. Genetische Modifikationen können auch durch genetische Disruption, z. B. gemäß dem von Rothstein et al. [Meth. Enzymol. 1994 (1991), 281-301] beschriebenen Verfahren, erhalten werden. Gemäß diesem Verfahren wird ein Teil oder die Gesamtheit eines Gens mittels homologer Rekombination durch eine in vitro-modi fizierte Version ersetzt.

Genetische Modifikationen können auch durch eine belie bige mutative Insertion in DNA-Sequenzen, wie z. B. Transpo sons, Phagen usw., erhalten werden.

Außerdem ist bekannt, daß bestimmte Modifikationen, wie z. B. Punktmutationen, durch zelluläre Mechanismen revertiert oder abgeschwächt werden können. Solche Modifikationen stellen möglicherweise nicht die nützlichsten Formen modifi zierter Pilzzellen dieser Erfindung bereit, da ihre phänotypischen Eigenschaften möglicherweise nicht sehr stabil sind. Die vorliegende Erfindung stellt auch ein Verfahren zur Herstellung modifizierter Pilzzellen bereit, in denen die Modifikationen (und daher die phänotypischen Eigenschaften) während der Segregation stabil und/oder nicht-revertierend und/oder nicht durchlässig sind. Solche modifizierten Pilzzellen sind als Wirte für die Produktion rekombinanter Produkte besonders bevorzugt.

Eine bevorzugte Ausführungsform der Erfindung ist demgemäß eine Pilzzelle, die (eine) genetische Modifikation(en) aufweist, die während der Segregation stabil und/oder nicht-revertierend und/oder nicht durchlässig ist (sind). Diese Modifikationen werden im allgemeinen durch Deletion(en) oder Disruption(en) erhalten.

Die genetische(n) Modifikation(en) der erfin dungsgemäßen Pilzzellen kann (können) entweder in einer codierenden Region der DNA-Sequenzen der Zelle oder in einer Region liegen, die für die Expression und/oder die tran skriptionale Regulation eines Gens verantwortlich ist oder daran beteiligt ist. Insbesondere beeinträchtigt (beeinträchtigen) die Modifikation(en) im allgemeinen die codierende Region oder die Region, die für die Expression und/oder die transkriptionale Regulation eines Gens oder mehrerer Gene verantwortlich ist oder daran beteiligt ist, dessen (deren) Expressionsprodukte Enzyme des O-Gly kosylierungs-Stoffwechselweges sind.

Die verringerte Fähigkeit der erfindungsgemäßen Pilz zellen, Proteine zu O-glykosylieren, kann daher durch die Herstellung von inaktiven Enzymen, bedingt durch Verän derungen in Struktur und/oder Konformation, die Herstellung von Enzymen mit veränderten biologischen Eigenschaften, die fehlende Herstellung der Enzyme oder die Herstellung der Enzyme in geringen Mengen verursacht werden.

Der O-Glykosylierungs-Stoffwechselweg der Pilzzellen umfaßt die Anheftung eines ersten Mannosylrestes an die Hydroxylgruppe von Seryl- und/oder Threonylaminosäureresten von Proteinen oder Peptiden und sodann die Erweiterung auf O-gebundene Di- und Oligosaccharide durch weitere Hinzufügungen von Mannosylresten. Der erste Mannosylrest wird im endoplasmatischen Retikulum von Dolichol- Monophosphat-Mannose (Dol-P-Man) auf das Protein übertragen, die folgenden Mannosylreste werden von GPD-Man im Golgi- Apparat überführt. Im Gegensatz dazu verläuft die O-Glykosy lierung bei höheren eukaryotischen (nicht-Pilz-) Zellen nach einem anderen Mechanismus, wobei der erste Schritt in der kovalenten Anheftung von N-Acetylgalactosamin an Seryl- oder Threonylaminosäurereste besteht, an dieser ersten Umsetzung kein Lipid-gekuppelter Oligosaccharid-Donor beteiligt ist, der erste Schritt im Golgi-Apparat stattfindet, andere Koh lenhydratstrukturen vorliegen usw.

In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung weisen die modifizierten Pilzzellen die genetische(n) Modifikation(en) mindestens in einem Gen auf, dessen Expressionsprodukt bei der Anheftung eines Mannosylrestes an die Hydroxylgruppe von Seryl- oder Threonylaminosäureresten beteiligt ist.

In einer stärker bevorzugten Ausführungsform der Erfin dung weisen die modifizierten Pilzzellen die genetische(n) Modifikation(en) wenigstens in einem Gen auf, dessen Expres sionsprodukt an der Übertragung eines Mannosylrestes vom Dol-P-Man-Vorläufer auf die Hydroxylgruppe von Seryl- oder Threonylaminosäureresten beteiligt ist.

Noch stärker bevorzugt stellt eines dieser Gene das Gen, das die Dol-P-Man : Protein (Ser/Thr)-Mannosyl- Transferase [DPM2] codiert, deren Sequenz in Fig. 4 dargestellt ist, oder ein die gleiche Aktivität codierendes, nachstehend definiertes homologes Gen dar.

Zusätzlich zu (einer) Modifikation(en) in einem Gen, das bei der Anheftung des Mannosylrestes an die Hydroxylgruppe von Seryl- oder Threonylaminosäureresten beteiligt ist, können erfindungsgemäße Pilzzellen auch (eine) Modifikation(en) in den Genen aufweisen, die an den weiteren Hinzufügungen von Mannosylresten, die zu Di- oder Oligosacchariden führen, oder an der Synthese des Mannosyl reste-Donors (Dol-P-Man) beteiligt sind.

Spezifische Beispiele solcher Pilzzellen werden in den Beispielen beschrieben.

Eine weitere Aufgabe der Erfindung ist die Bereitstellung einer Pilzzelle wie vorstehend beschrieben, in die eine exogene DNA-Sequenz eingeführt worden ist.

In der erfindungsgemäßen Bedeutung ist die exogene DNA- Sequenz so gemeint, daß sie eine beliebige DNA-Sequenz ein schließt, die ein Gen oder mehrere Gene umfaßt, das (die) ein gewünschtes Protein codiert (codieren), das in der Zelle exprimiert und/oder sezerniert wird. Eine solche DNA-Sequenz kann eine komplementäre DNA-Sequenz (cDNA), eine künstliche DNA-Sequenz, eine genomische DNA-Sequenz, eine Hybrid-DNA- Sequenz oder eine synthetische oder halbsynthetische DNA- Sequenz sein, die sich in einer Expressionskassette befindet, welche eine Synthese der Proteine in den Pilzzellen ermöglicht. Die Expressionskassette umfaßt vor zugsweise eine Transkriptions- und Translationsinitiations region, die zum 5′-Ende der Sequenz, die das (die) ge wünschte(n) Protein(e) codiert, fusioniert ist, wodurch die Transkription und Translation der Sequenz gesteuert und gegebenenfalls reguliert wird. Die Auswahl dieser Regionen kann abhängig von der verwendeten Pilzzelle unterschiedlich sein. Im allgemeinen werden diese Sequenzen aus Promotoren und/oder Terminatoren ausgewählt, die von Pilzzellgenen und, bei geplanter Expression in Hefewirten, von Hefegenen abgeleitet sind. Von speziellem Interesse sind bestimmte Promotor- und/oder Terminatorregionen, die von glyko lytischen Genen aus Pilzzellen abgeleitet sind, wobei die Gene z. B. für Hefen Phosphoglycerat-Kinase (PGK), Glycerin aldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase (GDP), Enolasen (ENO) oder Alkohol-Dehydrogenasen (ADH) und für filamentöse Pilze Triosephosphat-Isomerase (tpi) codieren. Die Promotor und/oder Terminatorregionen können auch von anderen, stark exprimierten Genen abgeleitet sein, wie z. B. für Hefen dem Lactase-Gen (LAC4), dem Säure-Phosphatase-Gen (PHO5), dem Alkoholoxidase-Gen (AOX) oder dem Methanoloxidase-Gen (MOX) und für filamentöse Pilze dem Cellobiohydrolase-Gen (CBHI), dem Alkoholdehydrogenase-Gen (alcA, alcC), dem Glucoamylase- Gen (GAM) oder dem Acetamidase-Gen (amds) und dgl. Diese Transkriptions- und Translationsinitiationsregionen können weiter modifiziert werden, z. B. durch in vitro-Mutagenese, durch Einführung von zusätzlichen Kontrollelementen oder synthetischen Sequenzen oder durch Deletionen. Beispielsweise können transkriptionsregulierende Elemente, wie z. B. das sogenannte UAS, das von einem anderen Promotor stammt, verwendet werden, um Hybridpromotoren zu konstru ieren, die eine Trennung der Wachstumsphase der Pilz zellkultur von der Phase der Expression der das (die) ge wünschte(n) Protein(e) codierenden Sequenz(en) ermöglichen. Außerdem kann eine in der geplanten Pilzzelle funktionelle Transkriptions- und Translationsterminationsregion an das 3′-Ende der codierenden Sequenz gestellt werden. Zusätzlich kann am N-Terminus der Proteinsequenz ein(e) Signalpeptid (Prä-Sequenz) eingeführt werden, wodurch das sich bildende Protein in den sekretorischen Stoffwechselweg der verwendeten Pilzzelle geleitet wird. Diese Prä-Sequenz kann der natürlichen Prä-Sequenz des Proteins entsprechen, sofern dieses Protein in der Natur sezerniert wird, oder sie kann einen anderen Ursprung haben, z. B. kann sie aus einem anderen Gen erhalten werden oder auch künstlich sein.

Die exogene DNA-Sequenz ist vorzugsweise Teil eines Vektors, der sich entweder autonom in der verwendeten Pilzzelle repliziert oder sich in deren eigene DNA-Sequenzen (Chromosom) integriert. Autonom replizierende Vektoren können autonom replizierende Sequenzen enthalten, die von der chromosomalen DNA der Pilzzelle (ARS) oder von natürlich vorkommenden Pilzzellplasmiden, wie z. B. pGKI-1 [de Louvencourt et al., J. Bacteriol. 154 (1982) 737], pKD1 (EP 241 435), 2 µm Plasmid [Broach., Cell 28 (1982) 203-204) und dgl., abgeleitet sind. Integrierende Vektoren enthalten üblicherweise Sequenzen, die zu Regionen des Pilzzellchromo soms homolog sind und die nach Einführung in die Zelle die Integration durch in vivo-Rekombination ermöglichen. In einer spezifischen Ausführungsform der Erfindung entsprechen die homologen Sequenzen der zu modifizierenden Region des Chromosoms in der Pilzzelle, wodurch ein einstufiger Modifikations-Integrations-Mechanismus ermöglicht wird. Die Integration kann auch als nicht-homologe Rekombination stattfinden.

Die exogene DNA-Sequenz kann durch eine beliebige, auf dem Fachgebiet bekannte Technik, beispielsweise durch DNA- Rekombinations-Techniken, genetische Kreuzungen, Protoplastenfusionen usw., in die Pilzzelle eingeführt werden. Hinsichtlich DNA-Rekombinations-Techniken können Transformation, Elektroporation oder eine beliebige andere, in der Literatur beschriebene Technik verwendet werden. Insbesondere kann, sofern die Pilzzelle eine Hefezelle ist, die Transformation nach den Verfahren von Ito et al. [J. Bacteriol. 153 (1983) 163], Durrens et al. [Curr. Genet. 18 (1990) 7] oder nach dem in EP 361 991 beschriebenen Verfahren durchgeführt werden. Elektroporation kann gemäß Karube et al. [FEBS Letters 182 (1985) 90] durchgeführt werden.

Die erfindungsgemäßen Pilzzellen können vorzugsweise als Wirtszellen zur Herstellung von rekombinanten Produkten, wie z. B. heterologen Proteinen von pharmazeutischem und/oder landwirtschaftlichem Interesse, verwendet werden. Die erfin dungsgemäßen Pilzzellen sind besonders vorteilhaft, da sie die Herstellung und/oder Sekretion von qualitativ hochwer tigen Produkten ermöglichen und wegen ihrer genetischen Modifikationen die mitotische oder genetische Stabilität der Produktexpressionsvektoren nicht beeinträchtigen. Die erfin dungsgemäßen Zellen sind besonders für die Herstellung von Proteinen geeignet, die beim Menschen therapeutisch angewendet werden und die einer O-Glykosylierung durch die Wirtszelle zugänglich sind.

Demgemäß ist eine weitere Aufgabe der Erfindung die Bereitstellung eines Verfahrens zur Herstellung von rekombi nanten Produkten, wobei eine wie vorstehend definierte Pilz zelle unter Bedingungen gezüchtet wird, unter denen die exo gene DNA-Sequenz exprimiert und das Produkt erhalten wird. In einer bevorzugten Ausführungsform wird das Produkt in das Kulturmedium sezerniert. In einer anderen bevorzugten Ausführungsform ist das Produkt einer O-Glykosylierung durch die Wirtszelle zugänglich.

Die folgenden Proteine werden als Beispiele für heterologe Proteine angeführt, die mit den erfindungsgemäßen Pilzzellen hergestellt werden können: Enzyme (wie z. B. Superoxid-Dismutase, Katalase, Amylasen, Lipasen, Amidasen, Chymosin usw., oder ein beliebiges Fragment oder Derivat davon), Blutderivate (wie z. B. menschliches Serum-Albumin, Alpha- oder Beta-Globin, Faktor VIII, Faktor IX, van Willebrand-Faktor, Fibronectin, Alpha-1-Antitrypsin usw., oder ein beliebiges Fragment oder Derivat davon), Insulin und seine Varianten, Lymphokine [wie z. B. Interleukine, Interferone, koloniestimulierende Faktoren (G-CSF, GM-CSF, M-CSF usw.), TNF, TRF usw., oder ein beliebiges Fragment oder Derivat davon], Wachstumsfaktoren (wie z. B. Wachstumshormon, Erythropoietin, FGF, EGF, PDGF, TGF usw., oder ein beliebiges Fragment oder Derivat davon), Apolipoproteine, antigene Polypeptide zur Herstellung von Impfstoffen (Hepatitis, Cytomegalovirus, Eppstein-Barr, Herpes usw.) oder ein beliebiges Fusionspolypeptid, wie z. B. Fusionen, umfassend einen aktiven Anteil, der an einen stabilisierenden Anteil gebunden ist.

Eine weitere Aufgabe der Erfindung ist die Bereitstel lung eines DNA-Fragmentes, das für ein Enzym codiert, das bei der Anheftung von Mannosylresten an die Hydroxylgruppe von Seryl- oder Threonylaminosäureresten von Proteinen beteiligt ist. Der Anmelder hat erstmals DNA-Fragmente bereitgestellt, die für solche Enzyme codieren. Stärker bevorzugt umfassen die DNA-Fragmente das Dol-P-Man : Protein (Ser/Thr) Mannosyl-Transferase-Gen, dessen Sequenz in Fig. 4 dargestellt ist, ein beliebiges homologes Gen, Derivat oder Fragment davon.

In der erfindungsgemäßen Bedeutung steht homologes Gen für ein beliebiges anderes Gen einer beliebigen Pilzzelle, das für ein Enzym codiert, das die erforderliche Aktivität aufweist. Die anderen Gene können beispielsweise folgendermaßen hergestellt werden: Komplementierung einer mutanten Pilzzelle, der die Aktivität fehlt, mit DNA, die aus einer Pilzzelle hergestellt wurde, die zur Aktivität befähigt ist, Selektion der Transformanten, welche die Aktivität nun aufweisen, und Isolierung der eingefügten DNA- Sequenz. Diese anderen Gene können auch aus DNA-Bibliotheken durch Hybridisierung mit (einer) Sonde(n), welche die Gesamtheit oder einen Teil der in Fig. 4 dargestellten Sequenz umfaßt (umfassen), isoliert werden. In dieser Hinsicht besteht eine Aufgabe dieser Erfindung auch in der Verwendung der bereitgestellten DNA-Fragmente oder eines beliebigen Teils davon als Hybridisierungssonde(n) oder für die Komplementierung mutanter Phänotypen, um aus Pilzzellen homologe Gene zu erhalten.

Der Begriff Derivat bedeutet ein beliebiges anderes DNA-Fragment, das durch (eine) beliebige genetische und/oder chemische Modifikation(en) der vorstehend erwähnten Gene hergestellt wird. Die genetische(n) und/oder chemische(n) Modifikation(en) kann (können) eine beliebige Suppression, Substitution, Deletion oder Addition von einer Base oder mehreren Basen oder von einer Region der Gene sein, wodurch bei Transformation in eine Pilzwirtszelle entweder eine erhöhte Enzymaktivität oder die gleiche Aktivität oder eine verminderte oder keine Enzymaktivität erhalten wird.

Legenden der Figuren

Fig. 1 Restriktionskarte der Plasmide pDM3, pMT4 und pMT1.

Fig. 2 Subclonierung von Plasmid pDM3.

Fig. 3 Strategie der Sequenzierung des DPM2-Gens.

Fig. 4A Nucleotidsequenz des DPM2-Gens (SEQ ID Nr. 1).

Fig. 4B Aminosäuresequenz des DPM2-Gens (SEQ ID Nr. 2).

Fig. 5 Konstruktion und Restriktionskarte von pMT1.1/URA3.

Fig. 6 O-Glykosylierungsaktivität von S. cerevisiae WT. (Tabelle A) und MT (Tabelle B)

Beispiele Beispiel 1 Isolierung einer hochgereinigten Mannosyltransferase aus S. cerevisiae und Erzeugung von Peptiden

Die Mannosyltransferase-Aktivität wurde aus ganzen Hefemembranen solubilisiert und gemäß Strahl-Bolsinger und Tanner [Eur. J. Biochem. 196 (1991) 185] auf Hydroxylapatit gereinigt. Sodann mußte das Protein durch (NH₄)₂SO₄-Fällung weiter angereichert werden, worauf eine weitere Reinigung mittels Affinitätschromatographie folgte. Anschließend wurde das eluierte Material auf SDS/PAGE aufgetrennt. Die resultierende 92 kDa-Bande wurde aus dem Gel herausgeschnitten. Durch Trypsin-Spaltung (im Gel) wurden mehrere nichtüberlappende Peptide erhalten, welche den Entwurf von Sonden ermöglichten.

E.1.1. (NH₄)₂SO₄-Fällung

100 ml von Fraktionen der Hydroxylapatit-Säule, die Mannosyltransferase-Aktivität enthielten, wurden mit (NH₄)₂SO₄ bis zu einer Endkonzentration von 30% (Gew./Vol.) gemischt und eine Stunde in einem Eis/Salz-Bad leicht gerührt. Das Gemisch wurde 30 Minuten zentrifugiert (8000 × g). Das resultierende Pellet wurde in 8 ml AB-Puffer [10 mM Tris/HCl, pH 7,5, 15% Glycerin (Vol.-%), 0,1% Lubrol (Vol.-%), 150 mM NaCl] resuspendiert und eine Stunde gegen den gleichen Puffer dialysiert. Lagerung: -20°C.

E.1.2. Affinitätschromatographie E.1.2.1. Herstellung der Affinitätschromatographie-Säule

0,5 g gefriergetrocknetes Pulver von Protein A- Sepharose Cl 4B wurden in 10 ml 100 mM NaPi, pH 7,0, 15 Minuten gequollen und über ein gesintertes Glasfilter (G3) mit 200 ml des gleichen Puffers gewaschen. Protein A- Sepharose Cl 4B wurde in 100 mM NaPi, pH 7,0, äquilibriert. Etwa 3 bis 6 ml Anti-Mannosyltransferase-Serum wurden zwei Stunden gegen 1 l NaPi (100 mM), pH 7,0, dialysiert. Das dialysierte Serum wurde mit dem Säulenmaterial 16 Stunden bei 4°C inkubiert. Das Serum wurde unter Verwendung eines gesinterten Glasfilters (G3) entfernt. Das Säulenmaterial wurde zweimal mit 10 ml 100 mM NaPi, pH 8,5, gewaschen und in 50 ml des gleichen Puffers resuspendiert.

Für die kovalente Kupplung wurden 0,75 mg/ml Dimethyl suberimidat hinzugefügt. Der pH-Wert wurde durch Zusatz von 5 bis 6 Tropfen 1 M NaOH auf 8,5 eingestellt. Das Material wurde eine Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Ein zweites Mal wurde Dimethylsuberimidat hinzugefügt und der pH-Wert mit 1 M NaOH auf 8,5 eingestellt. Das Säulenmaterial wurde auf einem gesinterten Glasfilter (G3) nacheinander mit folgenden Lösungen gewaschen:

a) 50 ml 100 mM NaPi, pH 8,0,
b) 25 ml 100 mM NaPi, pH 8,0, 3 M Ammoniumrhodanid
c) 100 ml 100 mM NaPi, pH 8,0.

Das Material wurde gewaschen und in AB-Puffer äquilibriert.

E.1.2.2. Reinigung des 92 kDa-Proteins

8 ml des mit (NH₄)₂SO₄ gefällten und dialysierten Pro teins (E.1.1.) wurden mit dem Material der Affinitätssäule (E.1.2.1.) 16 Stunden bei 4°C unter leichtem Schütteln inku biert. Eine Säule (2 cm × 0,5 cm) wurde gefüllt und mit 15 ml AB-Puffer gewaschen. Die Säule wurde mit 100 mM Glycin/HCl, pH 3,0, 0,05% Lubrol (Vol.-%) und 15% Glycerin (Vol.-%) eluiert. Fraktionen zu 0,9 ml wurden gesammelt und sofort mit 1 M Tris (15 µl/0,9 ml Fraktion) neutralisiert.

Zum Nachweis des 92 kDa-Proteins wurden 40 µl von jeder eluierten Fraktion durch SDS-PAGE und Western-Blot-Analysen wie beschrieben (Strahl-Bolsinger und Tanner, 1991) unter sucht. Die das 92 kDa-Protein enthaltenden Fraktionen (Fraktion 2 bis 6) wurden vereinigt und mittels Mikrokonzen tratoren (Centricon/Amicon) durch Zentrifugation bei 5000 × g auf 100 µl eingeengt. 0,9 ml 98% Ethanol wurden hinzugefügt und das Protein 16 Stunden bei -20°C gefällt. Das ausgefällte Protein wurde 30 Minuten bei 10 000 × g abzentrifugiert.

E.1.3. SDS-PAGE

Das ausgefällte Protein (E.1.2.2.) wurde in 150 µl SDS- Probenpuffer (0,07 M Na₂CO₃, 0,07% β-EtSH, 2% SDS, 12% Saccharose, 0,07% Bromphenolblau) resuspendiert. Die SDS- Gelelektrophorese gemäß Lämmli und Favre [J. Mol. Biol. 80 (1973) 575] wurde bei 50 bis 70 V unter Verwendung der BIORAD-Mini-Protean-Zelle durchgeführt. Proteinstandards: HMW-Standards/Gibco BRL.

Protein wurde durch Färbung mit 0,05% Coomassie R250 (Gew./Vol.), 25% Isopropanol (Vol.-%), 10% Essigsäure (Vol.-%) und Entfärbung in 7,5% Essigsäure (Vol.-%) nachgewiesen.

E.1.4. Trypsinspaltung und Entwurf von Oligonucleotiden

Nach der SDS-PAGE (E.1.3.) wurde die 92 kDa- Proteinbande ausgeschnitten (etwa 10 µg Protein). Das Gelfragment wurde in kleine Stücke geschnitten und dreimal 30 Minuten in 5 ml 50% Methanol/10% Essigsäure und einmal 30 Minuten in 5 ml 50% Methanol geschüttelt. Das Gel wurde 3 Stunden gefriergetrocknet. Eine Trypsinspaltung wurde in 0,3 ml 0,2 M Ammoniumhydrogencarbonat/2 µg Trypsin 16 Stunden bei 37°C durchgeführt. Der Überstand wurde entfernt. Die Elution der Peptide wurde dreimal eine Stunde bei 37°C in 0,2 ml 0,2 M Ammoniumhydrogencarbonat und einmal eine Stunde bei 37°C in 0,2 ml 0,2 M Ammoniumhydrogencarbonat/30% Acetonitril durchgeführt. Das eluierte Material wurde vereinigt, gefriergetrocknet und in 0,2 ml 1 M Guanidinium- Hydrochlorid/50 mM Tris/HCl, pH 7,5, gelöst. Die Peptide wurden unter Verwendung einer in 0,13% Trifluoressigsäure äquilibrierten Umkehrphasen-RP18-Säule aufgetrennt. Die Peptide wurden mit Acetonitril (0 bis 70%) eluiert. Bis zu 40 verschiedene Proteinpeaks konnten nachgewiesen werden. Fünf der Hauptpeaks wurden mittels automatischer Se quenzanalyse nach Edman sequenziert [G. Allen in: Sequencing of Proteins and Peptides. Laboratory Techniques in Biochem. and Mol. Biol. 9, Hrsg.: Burdon, R. H. & Knippenberg, P. H., Elsevier (1989)]. Von den hierbei erhaltenen Sequenzen eigneten sich drei zum Entwerfen von Oligonucleotiden, sie sind in der nachstehenden Tabelle 1 dargestellt.

Tabelle 1

Auf der Grundlage dieser Sequenzen wurden die Oligo nucleotide A bis C chemisch synthetisiert, wobei die Codon- Anwendung von S. cerevisiae verwendet wurde [Guthrie und Abelson, in: The molecular biology of the yeast Saccharomyces, Hrsg.: J. N. Strathern, E. W. Jones, J. R. Broach (1982)]. Die Oligonucleotide A bis C weisen die nachstehenden Kennzeichen auf:

Oligonucleotid A:
Peak: 23
Aminosäuresequenz: G F D G D A
Oligodesoxynucleotid: 5′-G^T/_CGTCACCGTCGAANCC-3′
8-fach degeneriert, codierender Strang, 17 Nucleotide

Oligonucleotid B:
Peak: 34
Aminosäuresequenz: E P H V Y E
DNA-Sequenz: 5′-^C/_TTCGTAGAC^G/_ATG^A/_TGG^T/_CTC-3′
16-fach degeneriert, codierender Strang, 18 Nucleotide

Oligonucleotid C:
Peak: 15
Aminosäuresequenz: I S Y K P A S F I S K
DNA-Sequenz: 5′-ATTTC^T/_ATA^T/_CAA^A/_GCC^A/_TGCTTC^T/_ATT^T/_AAAA-3′
128-fach degeneriert, codierender Strang, 33 Nucleotide

Beispiel 2 Absuchen einer Plasmid-Bibliothek von genomischer Hefe-DNA

Die chemisch synthetisierten Oligodesoxynucleotide A bis C (E.1.4.) wurden verwendet, um die Plasmidbibliothek von genomischer Hefe-DNA-pCS19 [Sengstag und Hinnen, Nucl. Acids Res. 15 (1987) 233] abzusuchen. Diese Bibliothek wurde hergestellt, indem genomische Hefe-DNA mit Sau3A partiell gespalten und in die BclI-Restriktionsstelle des Vektors pCS19 cloniert wurde.

E.2.1. Markierung von Oligodesoxynucleotiden

Die Oligonucleotide A bis C wurden durch die Kinase reaktion markiert, die gemäß Maniatis et al., durchgeführt wurde [T. Maniatis, J. Sambrook, E. F. Fritsch (1989) Molecular cloning: A Laboratory manual, C.S.H. Press]. 40 pMol Oligodesoxynucleotid wurden unter Verwendung von 50 µCi [γ³²P]-ATP markiert. Freie radioaktive Nucleotide wurden unter Verwendung von "NUC Trap Push Columns" (Stratagene) gemäß der Gebrauchsanweisung des Herstellers entfernt.

E.2.2. Absuchen der Bibliothek

Die DNA-Bibliothek (4992 verschiedene Einzelkolonien) wurde von Mikrotiterplatten auf Nitrocellulose übertragen. Die Koloniehybridisierung wurde gemäß Grundstein und Hogness [PNAS 72 (1975) 3961] unter den folgenden Bedingungen durchgeführt:

- Vorhybridisierung: Die Filter wurden bei 44°C in 200 ml 5 × Denhardt, 6 × NET, 0,1% SDS (Gew./Vol.) und 0,1 mg/ml Lachssperma-DNA mindestens 4 Stunden inkubiert (5 × Denhardt: 0,1% Ficoll, 0,1% Polyvinylpyrrolidon, 0,1% BSA; 6 × NET: 0,9 M NaCl, 90 mM Tris-HCl, pH 8,3, 6 mM EDTA, pH 8,0).
- Hybridisierung: Die Filter wurden bei 44°C in 100 ml 5 × Denhardt, 6 × NET, 0,1% SDS (Gew./Vol.), 0,1 mg/ml Lachssperma-DNA und den markierten Oligodesoxynucleotiden A und B (jeweils 40 pMol) inkubiert. Die Hybridisierung wurde 16 Stunden lang durchgeführt.
- Waschbedingungen: Die Filter wurden dreimal in 50 ml 6 × SSC, 0,1% SDS (Gew./Vol.) bei 0°C 15 Minuten gewaschen.

Zum Nachweis positiver Kolonien wurden die Filter 16 Stunden bei -70°C mit Röntgenfilmen in Kontakt gebracht. Unter diesen Bedingungen konnten 12 positiv reagierende Clone identifiziert werden.

Beispiel 3 Southern-Analyse der 12 positiven Clone

Die 12 positiven Clone wurden im Southern-Blotting unter Verwendung von 3 verschiedenen Oligodesoxynucleotiden analysiert. Diese Analyse führte zur Identifizierung eines positiven Clons, der mit allen drei Oligonucleotiden reagierte. Dieser Clon wurde pDM3 genannt.

Die 12 positiven Clone wurden in 5 ml LB-Medium, das mit Ampicillin angereichert war, gezüchtet und ihre DNA gemäß dem Verfahren von Birnbaum und Doly [Nucl. Acids. Res. 7 (1979) 1513] isoliert.

1/10 jeder isolierten Plasmid-DNA (Plasmide: pDM1 bis pDM12) wurde mit den Restriktionsenzymen EcoRI-XhoI (jeweils 5 E), 1 × "one phor all"-Puffer (Pharmacia) in einem Gesamt volumen von 20 µl eine Stunde bei 37°C gespalten. Die DNA- Fragmente wurden auf einem 1% Agarosegel aufgetrennt und gemäß Maniatis et al. (1989) auf Nitrocellulose geblottet. Die Southern-Analyse wurde unter Verwendung von Oligo-A und -B und unter den gleichen Bedingungen durchgeführt, die für das Absuchen der Bibliothek beschrieben werden. Die Hybridisierungstemperatur für Oligo-A betrug 48°C und für Oligo-B 42°C. Die Clone 1, 2, 3, 5, 6, 7 und 11 reagierten mit beiden Oligodesoxynucleotiden positiv. Diese sieben Clone wurden durch Southern Blot-Analyse weiter analysiert. Hierzu wurden drei identische Blots hergestellt, in denen die DNA der Clone 1, 2, 3, 5, 6, 7 und 11 mit EcoRI-XhoI gespalten und wie beschrieben auf Nitrocellulose geblottet wurde. Die Blots 1, 2 und 3 wurden in 20 ml 5 × Denhardt, 6 × NET, 0,1% SDS (Gew./Vol.) und 0,1 mg/ml Lachssperma-DNA bei 50°C vier Stunden vorhybridisiert. Sodann wurde jeder Blot in 10 ml 5 × Denhardt, 6 × NET, 0,1% SDS (Gew./ Vol.), 0,1 mg/ml Lachssperma-DNA und 40 pMol markierten Oligo nucleotiden 16 Stunden hybridisiert. Die Hybridisierungs temperatur ist in der nachstehenden Tabelle 2 angegeben. Gewaschen wurde bei jeder Temperatur 10 Minuten in 50 ml 2 × SSC, 0,1% SDS (Gew./Vol.).

Tabelle 2

Clon 3 war der einzige Clon, der mit Oligo-A, -B und -C reagierte. Der Clon wurde pDM3 genannt und weiter analysiert.

Beispiel 4 Analyse von pDM3 E.4.1. Methoden E.4.1.1. Spaltung mit Restriktionsendonucleasen

Die analytische Spaltung mit Endonucleasen wurde in 1 × "one phor all"-Puffer (Pharmacia), 0,2 bis 0,5 µg DNA, 1 bis 5 E Restriktionsenzym in einem Gesamtvolumen von 20 µl eine Stunde bei 37°C durchgeführt.

Die präparative Spaltung wurde in einem Gesamtvolumen von 40 bis 80 µl mit 1 bis 10 µg DNA, 5 bis 20 µl Re striktionsenzym und 1 × "one phor all"-Puffer zwei Stunden bei 37°C durchgeführt.

E.4.1.2. DNA-Gelelektrophorese

Die Trennung von DNA-Fragmenten wurde gemäß Maniatis et al. (1989) durchgeführt.

E.4.1.3. Isolierung von DNA-Fragmenten

Nach der Trennung wurden die DNA-Fragmente mit dem "Gene clean Kit" (Stratagene) gemäß der Gebrauchsanweisung des Herstellers isoliert.

E.4.1.4. Behandlung mit alkalischer Phosphatase

DNA-Fragmente wurden mit alkalischer Phosphatase gemäß Maniatis et al. (1989) dephosphoryliert.

E.4.1.5. Ligierung

DNA-Fragmente wurden in 1 × T4-Ligierungspuffer (50 mM Tris/HCl, pH 7,5, 10 mM MgCl₂, 5 mM DTT, 1 mM ATP) mit 1 E T4-DNA-Ligase (Gesamtvolumen 10 bis 15 µl) ligiert. Das molare DNA-Verhältnis von Vektor : Insertion betrug 1 : 4 oder 1 : 8. Die absolute Menge DNA war 20 bis 50 ng.
Inkubationszeit: 16 Stunden bei 14°C oder 5 Stunden bei 25°C.

E.4.1.6. Transformation von E. coli

Kompetente E.coli-DH5α-Zellen wurden gemäß Hanahan [J. Mol. Biol. 166 (1983) 557] hergestellt. Die Transformation wurde wie von Maniatis et al. (1989) beschrieben durchge führt.

E.4.1.7. Herstellung von DNA

Plasmid-DNA wurde gemäß Birnbaum und Doly (a.a.O.) hergestellt.

E.4.1.8. Southern-Blot-Analyse

Die Southern-Blot-Analyse wurde unter Anwendung der gleichen Bedingungen wie in E.3. beschrieben durchgeführt.

E.4.1.9. DNA-Sequenzanalyse

Die DNA-Sequenzierung wurde nach dem Verfahren von Sanger et al. [PNAS 74 (1977) 5463] durchgeführt. Nur Plasmid-DNA wurde sequenziert. T7-DNA-Polymerase- Sequenzierungs-Kit (Pharmacia) wurde verwendet; das radioaktive Nucleotid war [α-³⁵S]-dATP (spez. Akt. 600 Ci/mMol).

E.4.2. Identifizierung des offenen Leserasters

Dieses Beispiel beschreibt eine Restriktionsanalyse von pDM3, die Identifizierung von verschiedenen, durch die Oligonucleotide-A, -B oder -C erkannten DNA-Fragmenten und deren Subclonierung. Die Sequenzierung dieser Subclone ermöglichte die Identifizierung eines offenen Leserasters (ORF).

E.4.2.1. Subclonierung von pDM3-DNA-Fragmenten, die mit Oligo-A, -B oder -C hybridisierten

pDM3-DNA wurde mit EcoRI, XhoI und EcoRI-XhoI gespalten. Die Southern-Blot-Analyse wurde unter Verwendung von Oligo-A, -B oder -C als Sonde durchgeführt.

Oligo-A erkennt ein 3,0 kB-EcoRI-Fragment, Oligo-B und -C erkennen ein 1,1 kB-EcoRI-XhoI-Fragment. Das 3,0 kB- EcoRI-Fragment wurde in pUC19 (linearisiert mit EcoRI und dephosphoryliert) subcloniert. Das 1,1 kB-EcoRI-XhoI- Fragment wurde in pUC18 (linearisiert mit EcoRI-SalI und dephosphoryliert) subcloniert. Die richtigen Subclone wurden durch Restriktionsanalysen und Southern-Blot-Analysen unter Verwendung von Oligo-A oder -B bzw. -C identifiziert.

Der 3,0 kB-EcoRI-Subclon wurde mit pMT4 und der 1,1 kB- EcoRI-XhoI-Subclon mit pMT1 bezeichnet. Die weitere Restrik tionsanalyse von pMT4 und pMT1 wurde unter Verwendung mehrerer verschiedener Restriktionsendonucleasen (z. B. PstI, HindIII und BglII) durchgeführt. Die Southern-Blot-Analyse unter Verwendung von Oligo-A oder -B/-C wurde durchgeführt, um die genaue Region eines möglichen ORF zu bestimmen.

Die Restriktionskarten von pDM3, pMT4 und pMT1 sind in Fig. 1 dargestellt.

E.4.2.2. Sequenzanalysen

Von beiden Enden wurden die DNA-Insertionen der Plasmide pMT4 und pMT1 sequenziert, wobei der universelle und reverse Primer verwendet wurde, der nahe dem Polylinker von pUC19/pUC18 bindet. Auch Oligo-A, -B und -C wurden als sequenzierende Primer verwendet. Die Sequenzierungsdaten führten zu einem ORF von etwa 400 Bp auf beiden Seiten der Insertion von pMT1. Auch pMT4 zeigte bei Sequenzierung mit dem reversen Primer ein ORF von etwa 200 Bp. Unter Verwendung dieser Sequenzierungsdaten konnte eine Aminosäuresequenz hergeleitet werden. Diese Aminosäuresequenz zeigte Peptidsequenzen, die aus der Peptidanalyse des 92 kDa-Proteins bekannt sind (Peptide wurden gefunden, die den Peaks 15, 23, 34 entsprachen). Anhand dieser Daten konnte die 5′/3′-Ausrichtung des Gens vorausgesagt werden.

Mehrere andere Subclone wurden konstruiert und sequen ziert, wobei die universellen und reversen Primer von pUC18/19 verwendet wurden (Fig. 2).

Außerdem wurden zur Sequenzierung die nachstehenden Oligodesoxynucleotide verwendet:

Diese Oligonucleotide stellen Teile der neu sequen zierten DNA-Fragmente dar.

Zur Sequenzierung des 5′-Bereichs des Gens wurden ExoIII/Mung-Bohnen-Deletionen des Vektors pMT4 erzeugt. pMT4 wurde unter Verwendung von SphI linearisiert (3′- Überlappung). Sodann wurde das Plasmid unter Verwendung von BamHI gespalten (5′ -Überlappung). Die ExonucleaseIII- Deletion wurde gemäß Roberts und Lauer [Meth. Enzymol. 68 (1979) 473], Henikoff [Meth. Enzymol. 155 (1987) 156] durchgeführt. Überlappende Enden wurden durch Mung-Bohnen- Nuclease entfernt. Die resultierenden Plasmide wurden durch Restriktionsanalyse unter Verwendung von HindIII und EcoRI analysiert.

Sequenzanalysen der Clone wurden unter Verwendung des reversen Primers von pUC19 durchgeführt. Die Sequenzstrategie ist in Fig. 3 dargestellt. Sequenzdaten sind in Fig. 4 dargestellt.

Beispiel 5 Northern-Blot-Analyse: Identifizierung von mRNA, die für Mannosyltransferase codiert E.5.1. Verfahren E.5.1.1. Isolierung von RNA

Die gesamte RNA wurde aus dem Hefestamm SEY2101 (Mat a, ade2-1, leu2-3, 112, ura3-52) [Emr et al., PNAS 80 (1983) 7080] gemäß Domdey et al. [Cell 39 (1984) 611] isoliert.

E.5.1.2. Northern-Blotting

Die gesamte RNA wurde unter Verwendung eines Formaldehyd-Agarosegels aufgetrennt und wie von Maniatis et al. (1989) beschrieben auf Nitrocellulose geblottet.

E.5.1.3. Die Ziel-DNA

Die 1,1 kB-Insertion von pMT1 wurde durch EcoRI-PstI- Spaltung isoliert. Das Fragment wurde mit dem "Gene clean Kit" (Stratagene) gereinigt.

200 ng des DNA-Fragmentes wurden mit [α-³²P]-dCTP (50 µCi) markiert, wobei das "Megaprime" Markierungskit (Amersham) gemäß Gebrauchsanweisung des Herstellers verwendet wurde.

E.5.2. Ergebnisse

Das Nitrocellulosefilter wurde 2 Stunden bei 42°C in 20 ml 5 × Denhardt, 2 × SSC, 0,1% SDS (Gew./Vol.), 50% Formamid (Vol./Vol.) und 0,1 mg/ml Lachssperma-DNA vorhybridisiert. Die Hybridisierung wurde bei 42°C 16 Stunden in 10 ml 1 × Denhardt, 2 × SSC, 0,1% SDS (Gew./Vol.), 50% Formamid (Vol./Vol.), 0,1 mg/ml Lachssperma-DNA und 200 µg [α-³²P]-dCTP- markiertem 1,1 kB-EcoRI-PstI-Fragment von pMT1 durchgeführt. Gewaschen wurde zweimal bei Raumtemperatur und zweimal bei 50°C in 50 ml 0,1 × SSC, 0,1% SDS (Gew./Vol.) Die Hybridisierung der Sonde wurde durch Röntgenfilm-Exposition nachgewiesen (-70°C, 16 Stunden). Eine einzige mRNA in einer Größe von 3 kB wurde nachgewiesen.

Dieses Verfahren kann von Fachleuten mit anderen Sonden, die von der Sequenz von Fig. 4 abgeleitet werden, und mit RNA aus anderen Quellen (anderen Pilzzellen) einfach wiederholt werden.

Beispiel 6 Herstellung einer S. cerevisiae-Zelle, der die O-Glykosylierungsaktivität fehlt

Eine S. cerevisiae-Zelle, der die O-Glykosylierungs aktivität fehlt, wurde durch Gendisruption, durch Insertion des URA3-Gens in die HindIII-Restriktionsstelle des identifizierten ORF an Bp 1595 der codierenden Sequenz hergestellt.

E.6.1. Konstruktion des für die Gendisruption verwendeten Plasmides

Die 1,1 kB-Insertion von pMT1 wurde als EcoRI-PstI- Fragment isoliert und in einen pUC18-Vektor (EcoRI/PstI- linearisiert, dephosphoryliert, ohne HindIII- Restriktionsstelle im Polylinker) subcloniert. Der resultierende Vektor wurde mit pMT1.1 bezeichnet.

pMT1.1 wurde mit HindIII linearisiert und dephosphory liert. Das 1,1 kB-HindIII-Fragment von YEp24 [Julius et al., Cell 37 (1984) 1075], enthaltend das UHA3-Gen von S. cerevi siae, wurde isoliert und in den mit HindIII linearisierten, dephosphorylierten Vektor pMT1.1 subcloniert. Clone wurden durch Restriktionsanalysen identifiziert und mit pMT1.1/URA3 bezeichnet (Fig. 5).

pMT1.1/URA3 besitzt die DPM2-codierende Sequenz von 0,24 kB, die eine Seite des URA3-Gens flankiert, und DPM2- codierende Sequenz von 0,86 kB, die die andere Seite flankiert. CsCl-DNA von pMT1.1/URA3 wurde gemäß Maniatis et al. (1989) hergestellt.

E.6.2. Transformation von Hefe

40 µg CsCl-DNA von pMT1.1/URA3 wurden mit SphI/EcoRI gespalten. Um festzustellen, ob die Spaltung vollständig verlaufen ist, wurde ein Teil der gespaltenen DNA auf einem DNA-Agarosegel analysiert. Sodann wurden die Spaltprodukte mit Phenol behandelt und die DNA mit 98% EtOH ausgefällt (Maniatis et al., 1989). Die DNA wurde in 10 µl TE, pH 8,0, gelöst.

S. cerevisiae-Stämme SEY2101/2102 (Mat a/α, ura3-52, leu2-3, 112) (Emr et al., a.a.O.) und SEY2101 (Mat a, ura3- 52, leu2-3, 112, ade2-1) wurden mit 5 µl des mit EcoRI/SphI gespaltenen Vektors pMT1.1/URA3 gemäß dem Verfahren von Ito et al. [J. Bacteriol. 153 (1983) 163] transformiert.

SEY2101/2102-Transformanten wurden auf Minimalmedien + Leu selektiert; Sey 2101-Transformanten wurden auf Minimal medien + Leu + Ade selektiert.

Nach 3 bis 4 Tagen bei 30°C konnten die Transformanten herausgegriffen und ein zweites Mal auf den gleichen Medien plattiert werden.

E.6.3. Southern-Blotting der genomischen DNA der Transformanten

Genomische DNA von drei haploiden Transformanten und Wildtypzellen wurde wie von Hoffmann und Winston [Gene 57 (1987) 267] beschrieben isoliert. 1 µg der genomischen DNA wurde mit XhoI/EcoRI gespalten, auf einem Agarosegel getrennt und wie von Maniatis et al. (1989) beschrieben auf Nitrocellulose geblottet.

Der Blot wurde in 20 ml 5 × Denhardt, 2 × SSC, 0,1% SDS (Gew./Vol.), 0,1 mg/ml Lachssperma-DNA und 50% Formamid (Gew./ Vol.) 4 Stunden bei 42°C vorhybridisiert.

Die Hybridisierung wurde in 10 ml der gleichen Lösung unter Zusatz von 200 ng [α-³²P]dCTP-markiertem 1,1 kB-EcoRI/ PstI-Fragment von pMT1.1 (vgl. E.5.1.3.) 16 Stunden bei 42°C durchgeführt. Gewaschen wurde zweimal bei Raumtemperatur in 50 ml 2 × SSC, 0,1% SDS (Gew./Vol.) und zweimal bei 68°C in 50 ml 1 × SSC, 0,1% SDS (Gew./Vol.). Signale wurden durch Röntgenfilme nachgewiesen. Wildtypzellen zeigten ein einziges Signal bei 1,1 kB, welches für das EcoRI/XhoI- Fragment ohne URA3-Insertion steht. In disruptierten Zellen fehlte dieses Signal. An dessen Stelle wurde durch die 1,1 kB-Sonde ein neues 2,2 kB-Fragment erkannt, welches das 1,1 kB-EcoRI/XhoI-Fragment, das die 1,1 kB-URA3-Insertion trug, darstellte.

Beispiel 7 Charakterisierung der Mutante E.7.1. Wachstum

SEY2101 Wildtypzellen wurden entweder auf YPD (Hefeex trakt 10 g/l, Pepton 10 g/l, Dextrose 20 g/l) oder auf Mini malmedium + Ade + Leu + Ura gezüchtet. Mutante SEY2101- DPM2 :: URA3-Zellen wurden entweder auf YPD oder auf Minimal medium + Ade + Leu gezüchtet. Die Zellen wurden bei 30°C in einem Wasserbadschüttler gezüchtet. OD578 wurde alle 30 Minuten nach Beschallung der Zellen gemessen. Die Wildtypzellen und die mutanten Zellen zeigen auf beiden Medien ein fast identisches Wachstum, die mutanten Zellen kleben jedoch in einigen Fällen aneinander. Trotzdem können solche Zellen durch Beschallung (30 Sekunden, Beschallung Wasserbad) einfach getrennt werden. Die Wachstumseigenschaften dieser Zellen sind nachstehend zusammengestellt:

Generationszeit:
WT: 99 Minuten
MT: 93 Minuten

Zellzahl:
WT: 1 OD=1,9×10⁷
MT: 1 OD=1,9×10⁷

Verdopplungsrate:
WT: 0,61/h
MT: 0,65/h

In einer logarithmisch wachsenden Kultur bilden 54,7% der Wildtypzellen und 56% der mutanten Zellen Sproßzellen. Nach 24stündigem Wachstum auf YPD erreichten Wildtypzellen eine OD578 von 11,4 und mutante Zellen von 12,3.

E.7.2. In vitro-Mannosyltransferase-Aktivität und Western-Blotting E.7.2.1. Herstellung von Rohmembranen

SEY2101 wurde in 100 ml Minimalmedium + Ade + Leu + Ura bis zu einer OD578 von 0,5 gezüchtet. SEY2101 DPM2 :: URA3 wurde in 100 ml Minimalmedium + Ade + Leu bis zu einer OD578 von 0,5 gezüchtet.

Von jedem Stamm wurden zwei Präparate hergestellt. Die Arbeitsgänge wurden auf Eis durchgeführt, alle Puffer hatten 4°C. 40 OD Zellen wurden zentrifugiert und in 25 ml TMA (50 mM Tris/HCl, pH 7,5, 7,5 mM MgCl₂) gewaschen. Die Zellen wurden in 100 µl TMA resuspendiert und in ein Violax- Röhrchen überführt. 0,3 g Glasperlen wurden hinzugefügt und die Zellen auf einem Vortex viermal 30 Sekunden lang aufge brochen (Kühlung auf Eis in den Intervallen zwischen dem Aufbrechen). Das Extrakt wurde mit einer Pasteurpipette von den Glasperlen abgesaugt. Die Glasperlen wurden dreimal mit 250 µl TMA gewaschen. Alle Waschlösungen wurden in einem Eppendorf-Becher gesammelt. Die Lösung wurde 15 Sekunden zentrifugiert (10 000 × g). Der Überstand wurde entfernt und das Pellet in 40 µl TMA resuspendiert (1 OD = 1 µl).

E.7.2.2. Mannosyltransferase-Test (in vitro)

1 und 5 µl Rohmembranen (E.7.2.1.) wurden wie von Strahl-Bolsinger und Tanner (1991) beschrieben auf Enzymaktivität getestet. Zwei parallele Proben aus Wildtypzellen und mutanten Zellen wurden gemessen. Die Mittelwerte dieser zwei unabhängigen Messungen sind dargestellt.

Im Gegensatz zu Wildtypzellen zeigen mutante Zellen keine in vitro-Mannosyltransferase-Aktivität.

E.7.2.3. Western-Blot-Analyse

Membranen (1 µl aus E.7.2.1.) wurden in 20 µl SDS- Probenpuffer eine Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Sodann wurden SDS-PAGE und Western-Blotting wie von Strahl- Bolsinger und Tanner (1991) beschrieben durchgeführt. Zum Antikörpernachweis wurde das Peroxidase-ECL-Kit (Amersham) gemäß der Gebrauchsanweisung des Herstellers verwendet. Antikörper gegen das 92 kDa-Protein reagieren spezifisch mit einem 92 kDa-Protein von Wildtypmembranen. In mutanten Membranen fehlt dieses 92 kDa-Signal.

E.7.3. In vivo-O-Glycosylierung

Um die in vivo-Glykosylierung zu untersuchen, wurden Wildtypzellen und mutante Zellen in Gegenwart von [³H]- Mannose gezüchtet. Anschließend wurde eine aus Zellwand plus Rohmembranen bestehende Fraktion isoliert und O- glykosyliertes Material durch β-Eliminierung freigesetzt.

E.7.3.1. Behandlung mit [³H]-Mannose

Wildtypzellen und mutante Zellen wurden über Nacht in Minimalmedium, das als einzige Kohlenstoffquelle Saccharose enthielt, gezüchtet. 7,5 OD der Kultur (ED578 = 1 bis 2) wurden zentrifugiert und mit 5 ml H₂O (vorgewärmt auf 30°C) gewaschen. Die Zellen wurden in 5 ml YP/0,5% Saccharose/250 µCi [H³]-Mannose in einem Wasserbadschüttler zwei Stunden bei 30°C gezüchtet.

E.7.3.2. Isolierung der aus Zellwand und Rohmembranen bestehenden Fraktion

5 OD der mit [H³)-Mannose behandelten Zellen wurden zentrifugiert und dreimal mit 1 ml TMA gewaschen. Die Zellen wurden in 200 µl TMA resuspendiert und wie in E.7.2.1. mit Glasperlen aufgebrochen (eine 10 µl-Probe wurde zum Zählen der Radioaktivität verwendet, die dem gesamten Einbau entsprach).

Anschließend wurde der Extrakt 15 Minuten zentrifugiert (10 000 × g) und der Überstand entfernt (eine 100 µl-Probe wurde zum Zählen der Radioaktivität verwendet, die dem löslichen Material entsprach).

E.7.3.3. β-Eliminierung

Das Pellet wurde in 1 ml 0,1 N NaOH resuspendiert (eine 10 µl-Probe wurde zum Zählen der Radioaktivität verwendet, die dem Material vor der β-Eliminierung entsprach). Die Inkubation wurde 24 Stunden bei 30°C durchgeführt.

E.7.3.4. Analyse von β-eliminiertem Material

β-Eliminiertes Material wurde über eine Dowex 50WS8/H⁺- Säule (0,5 cm × 6 cm) entsalzt. Die Säule war mit 0,5 M Man nose gesättigt und in H₂O äquilibriert. Die Probe der ß- Eliminierung wurde auf die Säule aufgetragen und mit 1,5 ml H₂O durchgewaschen. Der Durchfluß wurde gesammelt (eine 100 µl-Probe wurde verwendet, um die Radioaktivität zu zählen, die dem β-eliminierten Material entsprach) und in der Speed- Vac auf 10 µl eingeengt. Eine Dünnschichtchromatographie auf Kieselgel 60 (Merck) in Aceton : Butanol : H₂O 70 : 15 : 15 wurde durchgeführt. Standards: Mannose, Saccharose, Stachyose, Raffinose. Der Chromatographie-Durchlauf wurde einmal wiederholt. Die Zucker wurden mit 0,5 g KMnO₄ in 100 ml 1 N NaOH nachgewiesen. Die Radioaktivität wurde mit einem Dünnschichtscanner (Berthold) nachgewiesen (vgl. Fig. 6).

Mutante Zellen zeigen im Vergleich zu Wildtypzellen eine verringerte Glykosylierung. Die O-Glykosylierung in mutanten Zellen ist etwa 40 bis 50% niedriger als in Wildtypzellen.

Claims

1. Pilzzellen, die in ihren DNA-Sequenzen (eine) genetische Modifikation(en) aufweisen, die wenigstens zu einer ver ringerten Fähigkeit der Pilzzellen zur O-Glykosylierung führt (führen).

2. Pilzzelle nach Anspruch 1, wobei die Modifikation(en) beliebige Suppression, Substitution, Deletion, Addition, Disruption und/oder mutative Insertion umfaßt (umfas sen).

3. Pilzzelle nach Anspruch 2, wobei die Modifikation(en) während der Segregation stabil und/oder nicht-revertie rend und/oder nicht durchlässig ist (sind).

4. Pilzzelle nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei sich die Modifikation(en) in einer oder mehreren codierenden Regionen der DNA-Sequenzen der Zelle (befindet) befin den.

5. Pilzzelle nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei sich die Modifikation(en) in einer oder mehreren Regionen (befindet) befinden, die für die Expression und/oder transkriptionale Regulation eines Gens verantwortlich oder daran beteiligt sind.

6. Pilzzelle nach Anspruch 4 oder 5, wobei das Expressions produkt des Gens ein Enzym des O-Glykosylierungs-Stoff wechselwegs ist.

7. Pilzzelle nach Anspruch 6, wobei die verringerte Fähig keit zur O-Glykosylierung durch die Herstellung inakti ver Enzyme, die Herstellung von Enzymen mit veränderten biologischen Eigenschaften, die fehlende Herstellung der Enzyme oder die Herstellung der Enzyme in geringen Men gen verursacht wird.

8. Pilzzelle nach Anspruch 6, wobei das Expressionsprodukt des Gens bei der Anheftung von Mannosylresten an die Hy droxylgruppe von Seryl- oder Threonylaminosäureresten beteiligt ist.

9. Pilzzelle nach Anspruch 8, wobei das Expressionsprodukt des Gens an der Übertragung von Mannosylresten des Dol- P-Man-Donors auf die Hydroxylgruppe von Seryl- oder Threonylaminosäureresten beteiligt ist.

10. Pilzzelle nach Anspruch 9, wobei das Gen das Gen ist, das die Dol-P-Man : Protein (Ser/Thr) Mannosyltransferase [DPM2] codiert und die Sequenz die in Fig. 4 abgebil dete Sequenz aufweist oder ein beliebiges homologes Gen ist, das für die gleiche Aktivität codiert.

11. Pilzzelle nach einem der Ansprüche 8 bis 10, die außer dem (eine) Modifikation(en) in einem oder mehreren Genen umfaßt, die an weiteren Hinzufügungen von Mannosylresten oder an der Synthese des Mannosylreste-Donors (Dol-P- Man) beteiligt ist (sind).

12. Pilzzelle nach einem der Ansprüche 1 bis 11, in die eine exogene DNA-Sequenz eingeführt wurde.

13. Pilzzelle nach Anspruch 12, wobei die exogene DNA-Se quenz ein oder mehrere Gene umfaßt, das (die) ein in dieser Zelle exprimiertes und/oder sezerniertes er wünschtes Protein codiert (codieren).

14. Pilzzelle nach Anspruch 13, wobei sich die DNA-Sequenz in einer Expressionskassette befindet, die eine zum 5′- Ende der DNA-Sequenz, die das (die) gewünschte(n) Pro tein(e) codiert, fusionierte Transkriptions- und Trans lationsinitiationsregion umfaßt.

15. Pilzzelle nach Anspruch 14, wobei die Transkriptions- und Translationsinitiationsregion aus Promotoren ausge wählt wird, die von Genen aus Pilzzellen abgeleitet sind.

16. Pilzzelle nach Anspruch 14, wobei die Expressionskas sette weiterhin am 3′-Ende der DNA-Sequenz, die das (die) gewünschte(n) Protein(e) codiert, eine Transkrip tions- und Translationsterminationsregion umfaßt.

17. Pilzzelle nach Anspruch 14, wobei die Expressionskas sette weiterhin am N-Terminus der erwünschten Proteinse quenz ein(e) Signalpeptid (Prä-Sequenz) umfaßt, die das sich bildende Protein in den sekretorischen Stoffwech selweg der Pilzzelle leitet.

18. Pilzzelle nach einem der Ansprüche 12 bis 17, wobei die exogene DNA-Sequenz Teil eines Vektors ist, der sich entweder autonom in der Pilzzelle repliziert oder sich in dessen eigene DNA-Sequenzen (Chromosom) integriert.

19. Pilzzelle nach einem der Ansprüche 1 bis 18, wobei diese aus filamentösen Pilzen und Hefen ausgewählt wird.

20. Pilzzelle nach Anspruch 19, wobei die filamentösen Pilze ausgewählt werden aus der Gruppe bestehend aus Aspergil lus, Trichoderma, Mucor, Neurospora und Fusarium.

21. Pilzzelle nach Anspruch 19, wobei die Hefe ausgewählt wird aus der Gruppe bestehend aus Kluyveromyces, Saccharomyces, Pichia, Hansenula, Candida und Schizo saccharomyces.

22. Pilzzelle nach Anspruch 21, wobei die Hefe ausgewählt wird aus der Gruppe bestehend aus Kluyveromyces, Saccharomyces, Pichia, Hansenula und Candida und vor zugsweise aus Kluyveromyces und Saccharomyces.

23. Verfahren zur Herstellung von rekombinanten Produkten, wobei eine Pilzzelle nach einem der Ansprüche 12 bis 22 unter Bedingungen gezüchtet wird, unter denen die exo gene DNA-Sequenz exprimiert und das Produkt gewonnen wird.

24. Verfahren nach Anspruch 23, wobei das Produkt in das Kulturmedium sezerniert wird.

25. Verfahren nach Anspruch 23 oder 24, wobei das Produkt einer O-Glykosylierung durch die Pilzzelle zugänglich ist.

26. DNA-Fragment, das für ein Enzym codiert, das bei der An heftung von Mannosylresten an die Hydroxylgruppe von Seryl- oder Threonylaminosäureresten von Proteinen be teiligt ist.

27. DNA-Fragment nach Anspruch 26, umfassend das Dol-P- Man : Protein (Ser/Thr)-Mannosyltransferasegen, dessen Se quenz in Fig. 4 dargestellt ist, oder ein beliebiges Fragment oder Derivat davon.

28. Verwendung eines DNA-Fragments nach Anspruch 26 oder 27 oder eines beliebigen Teils davon als Hybridisierungs sonde(n) oder für die Komplementierung mutanter Phänoty pen, um aus Pilzzellen homologe Gene zu erhalten.