CN103582650A - 用于制备具有改善性质的含Fc多肽的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及用于生产含Fc多肽的方法和组合物，所述含Fc多肽包含在Fc区的位置243、264、267和328上的突变。

Description

用于制备具有改善性质的含Fc多肽的方法
发明领域
本发明涉及用于产生作为人或动物治疗剂有用的糖基化蛋白质(糖蛋白)和具体的含Fc多肽的方法和组合物。
发明背景
单克隆抗体通常通过两个结合事件来实现其治疗益处。首先，抗体的可变结构域结合靶细胞上的特异性蛋白质。这随后为效应细胞的招募，所述效应细胞与抗体的恒定区(Fc)结合，且破坏与抗体结合的细胞。
抗体(或其他免疫治疗组合物)的效力取决于多重作用机制，包括由表达Fc受体(FcRs)的效应细胞介导的那些。Fc受体具有活化或抑制性功能作用，并且在其在效应细胞中的分布中不同。单核细胞、巨噬细胞和嗜中性粒细胞表达活化和抑制性FcRs两者，而自然杀伤(NK)细胞仅表达活化FcRIIIa。因此，抗体(或其他免疫治疗剂)可以接合各种Fc受体的程度对于临床结果是重要的。
抗体Fc结构域的氨基酸工程化和糖工程化是修饰抗体和其他免疫治疗剂的效应细胞功能的两种方法。参见例如，Chu等人，Molecular Immunology 45:3926-3933(2008)。
期望工程化得到包含改善性质的抗体或Fc融合蛋白。例如，期望工程化得到抗体或其他免疫治疗剂，其与Fcγ受体IIB(CD32B)结合，但不结合(或以减少的亲和力结合)Fcγ受体IIA(CD32A)和Fcγ受体IIIA(CD16A)和Fcγ受体I(CD64)。此类抗体的特征在于其效应子功能的缺乏(或显著降低)和抗炎性质的增加。
N-糖基化的存在不仅在抗体的效应子功能中起作用，N联寡糖的特定组成对于其最终功能也是重要的。例如，岩藻糖的缺乏或平分型N-乙酰葡糖胺的存在已与ADCC的效力正相关，Rothman(1989)，Umana等人，Nat. Biotech. 17: 176-180(1999)，Shields等人，J. Biol. Chem. 277: 26733-26740(2002)，和Shinkawa等人，J. Biol. Chem. 278: 3466-3473(2003)。还存在在Fc区中的唾液酸化与静脉内免疫球蛋白(IVIG)的抗炎性质正相关的证据。参见例如，Kaneko等人，Science，313: 670-673，2006；Nimmerjahn和Ravetch，J. Exp. Med.，204: 11-15，2007。
考虑到特异性N-糖基化在抗体功能和效力中的效用，用于修饰抗体的N联寡糖组成的方法和用于修饰抗体和其他免疫治疗剂的效应子功能的方法将是期望的。
酵母和其他真菌宿主是用于生成重组蛋白质的重要生产平台。酵母是真核生物，并且因此与高等真核生物共享共同的进化过程，包括在分泌途径中发生的许多翻译后修饰。糖工程化中的近期进展已导致具有遗传修饰的糖基化途径的酵母菌株巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)的细胞系，所述糖基化途径允许它们执行模拟在人中糖基化过程的一系列酶促反应。参见例如，描述用于在低等真核宿主细胞中产生重组糖蛋白的方法的美国专利号7,029,872、7,326,681和7,449,308，所述重组糖蛋白基本上等同于其人对应物。已证实了人样唾液酸化二天线复合N联聚糖，如由前述方法在巴斯德毕赤酵母中产生的那些，用于生产治疗性糖蛋白的效用。因此，用于进一步修饰或改善酵母例如巴斯德毕赤酵母中的抗体生产的方法将是期望的。
发明概述
本发明涉及包含在Fc区的氨基酸位置243、264、267和328上的突变的含Fc多肽，其中编号根据如Kabat中的EU指数。在一个实施方案中，在位置243上的突变选自：
Figure 410931DEST_PATH_IMAGE001
Figure 138191DEST_PATH_IMAGE002
；在位置264上的突变选自：
Figure 980245DEST_PATH_IMAGE003
Figure 375454DEST_PATH_IMAGE004
；在位置267上的突变选自：S267D、S267Y、S267T；并且在位置328上的突变选自：L328Y、L328W、L328H。在一个实施方案中，在位置243和264上的突变选自：F243A和V264A；F243Y和V264G；F243T和V264G；F243L和V264A；F243L和V264N；以及F243V和V264G。在一个实施方案中，突变是F243A、V264A、S267E和L328F。
在一个实施方案中，本发明的含Fc多肽是抗体或抗体片段。在一个实施方案中，本发明的含Fc多肽是包含SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:17的抗体片段。在另一个实施方案中，本发明的含Fc多肽是由SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:17组成(或基本上由其组成)的抗体片段。
在一个实施方案中，含Fc多肽是包含SEQ ID NO:4的重链氨基酸序列或其变体，和SEQ ID NO:2的轻链氨基酸序列或其变体的抗体。在另一个实施方案中，含Fc多肽是包含SEQ ID NO:11的重链氨基酸序列或其变体，和SEQ ID NO:10的轻链氨基酸序列或其变体的抗体。在另一个实施方案中，含Fc多肽是包含SEQ ID NO:12的重链氨基酸序列或其变体，和SEQ ID NO:13的轻链氨基酸序列或其变体的抗体。
在一些实施方案中，本发明的含Fc多肽包含含有唾液酸(包括NANA、NGNA、及其类似物和衍生物)的N-聚糖。在一个实施方案中，N-聚糖具有选自
Figure 2876DEST_PATH_IMAGE005
的结构。在一个实施方案中，本发明的含Fc多肽包含α-2,3和α-2,6连接的唾液酸的混合物。在另一个实施方案中，本发明的含Fc多肽仅包含α-2,6连接的唾液酸。在一个实施方案中，本发明的含Fc多肽包含α-2,6连接的唾液酸且不含可检测水平的α-2,3连接的唾液酸。在一个实施方案中，唾液酸是N-乙酰神经氨酸(NANA)或N-羟乙酰神经氨酸(NGNA)或其混合物。在另一个实施方案中，唾液酸是在唾液酸上的位置9上具有乙酰化的NANA或NGNA的类似物或衍生物。在一个实施方案中，在本发明的含Fc多肽上的N-聚糖包含NANA且不含NGNA。在一个实施方案中，在本发明的含Fc多肽上的N-聚糖包含α -2,6连接的NANA(且不含NGNA)。在一个实施方案中，本发明的含Fc多肽是包含唾液酸化的N-聚糖的抗体或抗体片段，所述唾液酸化的N-聚糖包含选自
Figure 825338DEST_PATH_IMAGE006
的结构，其中所述唾液酸残基经由α-2,6键。
在本发明的含Fc多肽上的N-聚糖可以任选包含岩藻糖。在一个实施方案中，在含Fc多肽上的N-聚糖将包含岩藻糖基化和非岩藻糖基化N-聚糖的混合物。在另一个实施方案中，在含Fc多肽上的N-聚糖缺乏岩藻糖。
在一个实施方案中，当与亲本含Fc多肽相比较时，本发明的含Fc多肽具有下述性质中的一种或多种：(i)减少的效应子功能；(ii)增加的抗炎性质；(iii)增加的与凝集素(例如CD22(Siglec 2))的结合；(iv)减少的与FcγRIIa的结合；(v)增加的与FcγRIIb的结合；(vi)减少的与FcγRIIIa的结合；和(vii)减少的与FcγRIIIb的结合。
在一个实施方案中，当与亲本含Fc多肽相比较时，本发明的含Fc多肽具有减少的效应子功能。在一个实施方案中，效应子功能是ADCC。在另一个实施方案中，效应子功能是CDC。在另一个实施方案中，效应子功能是ADCP。
在一个实施方案中，当与亲本含Fc多肽相比较时，本发明的含Fc多肽具有减少的ADCC活性。在另一个实施方案中，含Fc多肽具有ADCC活性中的至少100倍减少。在另一个实施方案中，含Fc多肽具有ADCC活性中的至少500倍减少。在另一个实施方案中，含Fc多肽具有ADCC活性中的至少1000倍减少。在一个实施方案中，含Fc多肽不具有可检测的ADCC活性。
在另一个实施方案中，当与亲本含Fc多肽相比较时，本发明的含Fc多肽具有减少的ADCP活性。在一个实施方案中，含Fc多肽不具有可检测的ADCP活性。
在另一个实施方案中，当与亲本含Fc多肽相比较时，本发明的含Fc多肽具有减少的CDC活性。在一个实施方案中，含Fc多肽具有CDC活性中的至少100倍减少。在一个实施方案中，含Fc多肽不具有可检测的CDC活性。
在一个实施方案中，当与亲本含Fc多肽相比较时，本发明的含Fc多肽具有下述性质：(i)减少的与FcγRIIa的结合；(ii)增加的与FcγRIIb的结合；(iii)减少的与FcγRIIIa的结合；和(iv)减少的与FcγRIIIb的结合。
在一个实施方案中，当与亲本含Fc多肽相比较时，本发明的含Fc多肽具有下述性质：(i)减少的与FcγRIIa的结合；(ii)增加的与FcγRIIb的结合；和(iii)减少的与FcγRIIIa的结合。
在一个实施方案中，本发明的含Fc多肽不具有可检测的与FcγRIIa、FcγRIIIa或FcγRIIIb的结合。在一个实施方案中，当使用ELISA测定检测此类结合时，本发明的含Fc多肽不具有可检测的与FcγRIIa、FcγRIIIa、FcγRIIIb的结合。
在一个实施方案中，当与亲本含Fc多肽相比较时，本发明的含Fc多肽以增加至少2倍的亲和力结合FcγRIIb。在一个实施方案中，当与亲本含Fc多肽相比较时，本发明的含Fc多肽以增加至少4倍的亲和力结合FcγRIIb。
在一个实施方案中，当与亲本含Fc多肽相比较时，本发明的含Fc多肽具有增加的抗炎性质。
在一个实施方案中，亲本含Fc多肽包含天然Fc区。在另一个实施方案中，亲本含Fc多肽包含F243A突变。在另一个实施方案中，亲本含Fc多肽包含V264A突变。在另一个实施方案中，亲本含Fc多肽包含F243A突变和V264A突变。
本发明还包含用于在宿主细胞中生产含Fc多肽的方法，其包括：(i)提供已经经过遗传工程化而产生含Fc多肽的宿主细胞，其中所述宿主细胞包含编码在Fc区的氨基酸位置243、264、267和328上的突变的核酸，其中编号根据如Kabat中的EU指数；(ii)在引起含Fc多肽表达的条件下培养宿主细胞；和(iii)从宿主细胞中分离含Fc多肽。在一个实施方案中，核酸编码下述：在位置243上的突变选自：
Figure DEST_PATH_IMAGE007
在位置264上的突变选自：
Figure 835517DEST_PATH_IMAGE010
Figure 828880DEST_PATH_IMAGE011
Figure 645527DEST_PATH_IMAGE012
在位置267上的突变选自：S267D、S267Y、S267T；并且在位置328上的突变选自：L328Y、L328W、L328H。在一个实施方案中，在位置243和264上的突变选自：F243A和V264A；F243Y和V264G；F243T和V264G；F243L和V264A；F243L和V264N；以及F243V和V264G。在一个实施方案中，核酸编码突变F243A、V264A、S267E和L328F。在一个实施方案中，本发明的含Fc多肽是抗体或抗体片段。
在一个实施方案中，本发明的含Fc多肽是包含SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:17的抗体片段。在另一个实施方案中，本发明的含Fc多肽是由SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:17组成(或基本上由其组成)的抗体片段。
在一个实施方案中，用于生产含Fc多肽的方法在哺乳动物细胞中执行。在另一个实施方案中，用于生产含Fc多肽的方法在植物细胞中执行。在另一个实施方案中，用于生产含Fc多肽的方法在细菌中执行。在另一个实施方案中，用于生产含Fc多肽的方法在昆虫细胞中执行。在另一个实施方案中，用于生产含Fc多肽的方法在低等真核细胞中执行。在另一个实施方案中，用于生产含Fc多肽的方法在酵母细胞中执行。在一个实施方案中，用于生产含Fc多肽的方法在巴斯德毕赤酵母中执行。
在一个实施方案中，通过请求保护的方法生产的含Fc多肽包含含有唾液酸(包括NANA、NGNA、及其类似物和衍生物)的N-聚糖。在一个实施方案中，通过请求保护的方法生产的含Fc多肽具有N-聚糖组成，其中在含Fc多肽上至少40摩尔%、70摩尔%或90摩尔%的N-聚糖是唾液酸化的(具有选自
Figure 382539DEST_PATH_IMAGE013
Figure 718973DEST_PATH_IMAGE014
的结构)。在一个实施方案中，通过请求保护的方法生产的含Fc多肽包含α-2,3和α-2,6连接的唾液酸的混合物。在另一个实施方案中，含Fc多肽仅包含α-2,6连接的唾液酸。在一个实施方案中，本发明的含Fc多肽包含α-2,6连接的唾液酸且不含可检测水平的α-2,3连接的唾液酸。在一个实施方案中，唾液酸是N-乙酰神经氨酸(NANA)或N-羟乙酰神经氨酸(NGNA)或其混合物。在另一个实施方案中，唾液酸是在唾液酸上的位置9上具有乙酰化的NANA或NGNA的类似物或衍生物。在一个实施方案中，通过请求保护的方法生产的含Fc多肽上的N-聚糖包含NANA且不含NGNA。在一个实施方案中，在本发明的含Fc多肽上的N-聚糖包含α-2,6连接的NANA(且不含NGNA)。
在一个实施方案中，本发明的含Fc多肽是包含唾液酸化的N-聚糖的抗体或抗体片段，所述唾液酸化的N-聚糖包含选自
Figure 148817DEST_PATH_IMAGE015
的结构，其中所述唾液酸残基经由α-2,6键。
通过请求保护的方法生产的含Fc多肽上的N-聚糖可以任选包含岩藻糖。在一个实施方案中，在通过请求保护的方法生产的含Fc多肽上的N-聚糖包含岩藻糖基化和非岩藻糖基化N-聚糖的混合物。在一个实施方案中，在通过请求保护的方法生产的含Fc多肽上的N-聚糖缺乏岩藻糖。
在一个实施方案中，通过请求保护的方法生产的含Fc多肽具有这样的N-聚糖组成，其中总唾液酸化的N-聚糖的量和百分比相对于亲本含Fc多肽是增加的。
在一些实施方案中，当与亲本含Fc多肽相比较时，通过请求保护的方法生产的含Fc多肽具有下述性质中的一种或多种：(i)减少的效应子功能；(ii)增加的抗炎性质；(iii)增加的与凝集素(例如CD22(Siglec 2))的结合；(iv)减少的与FcγRIIa的结合；(v)增加的与FcγRIIb的结合；(vi)减少的与FcγRIIIa的结合；和(vii)减少的与FcγRIIIb的结合。
在一个实施方案中，当与亲本含Fc多肽相比较时，通过请求保护的方法生产的含Fc多肽具有减少的效应子功能。在一个实施方案中，效应子功能是ADCC。在另一个实施方案中，效应子功能是CDC。在另一个实施方案中，效应子功能是ADCP。
在一个实施方案中，当与亲本含Fc多肽相比较时，本发明的含Fc多肽具有减少的ADCC活性。在另一个实施方案中，含Fc多肽具有ADCC活性中的至少100倍减少。在另一个实施方案中，含Fc多肽具有ADCC活性中的至少500倍减少。在另一个实施方案中，含Fc多肽具有ADCC活性中的至少1000倍减少。在一个实施方案中，含Fc多肽不具有可检测的ADCC活性。
在另一个实施方案中，当与亲本含Fc多肽相比较时，本发明的含Fc多肽具有减少的ADCP活性。在一个实施方案中，含Fc多肽不具有可检测的ADCP活性。
在另一个实施方案中，当与亲本含Fc多肽相比较时，通过请求保护的方法生产的含Fc多肽具有减少的CDC活性。在一个实施方案中，含Fc多肽具有CDC活性中的至少100倍减少。在一个实施方案中，含Fc多肽不具有可检测的CDC活性。
在一个实施方案中，当与亲本含Fc多肽相比较时，通过请求保护的方法生产的含Fc多肽具有下述性质：(i)减少的与FcγRIIa的结合；(ii)增加的与FcγRIIb的结合；(iii)减少的与FcγRIIIa的结合；和(v)减少的与FcγRIIIb的结合。
在一个实施方案中，当与亲本含Fc多肽相比较时，通过请求保护的方法生产的含Fc多肽具有下述性质：(i)减少的与FcγRIIa的结合；(ii)增加的与FcγRIIb的结合；和(iii)减少的与FcγRIIIa的结合。
在一个实施方案中，本发明的含Fc多肽不具有可检测的与FcγRIIa、FcγRIIIa或FcγRIIIb的结合。在一个实施方案中，当使用ELISA测定检测此类结合时，本发明的含Fc多肽不具有可检测的与FcγRIIa、FcγRIIIa或FcγRIIIb的结合。
在一个实施方案中，当与亲本含Fc多肽相比较时，本发明的含Fc多肽以增加至少2倍的亲和力结合FcγRIIb。在一个实施方案中，当与亲本含Fc多肽相比较时，本发明的含Fc多肽以增加至少4倍的亲和力结合FcγRIIb。
在一个实施方案中，相对于亲本含Fc多肽，通过请求保护的方法生产的含Fc多肽具有增加的抗炎性质。
在一个实施方案中，亲本含Fc多肽包含天然Fc区。在另一个实施方案中，亲本含Fc多肽包含F243A突变。在另一个实施方案中，亲本含Fc多肽包含V264A突变。在另一个实施方案中，亲本含Fc多肽包含F243A突变和V264A突变。
本发明还包含减少含Fc多肽的效应子功能的方法，其包括在亲本含Fc多肽的位置243、264、267和328上引入突变，其中当与亲本含Fc多肽相比较时，所述含Fc多肽具有降低的效应子功能，其中编号根据如Kabat中的EU指数。在一个实施方案中，含Fc多肽包含突变F243A、V264A、S267E和L328F。在一个实施方案中，效应子功能是ADCC。在另一个实施方案中，效应子功能是CDC。在另一个实施方案中，效应子功能是ADCP。在一个实施方案中，本发明的含Fc多肽是抗体或抗体片段。在一个实施方案中，含Fc多肽是包含SEQ ID NO:7的抗体片段。在另一个实施方案中，含Fc多肽是包含SEQ ID NO:8的抗体片段。在另一个实施方案中，含Fc多肽是包含SEQ ID NO:17的抗体片段。在另一个实施方案中，含Fc多肽是由SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:17组成(或基本上由其组成)的抗体片段。在一个实施方案中，本发明的含Fc多肽包含唾液酸化的N-聚糖，所述唾液酸化的N-聚糖包含选自
Figure 452760DEST_PATH_IMAGE016
Figure 727883DEST_PATH_IMAGE017
的结构，其中所述唾液酸残基经由α-2,6键连接。在一个实施方案中，亲本含Fc多肽包含天然Fc区。在另一个实施方案中，亲本含Fc多肽包含F243A突变。在另一个实施方案中，亲本含Fc多肽包含V264A突变。在另一个实施方案中，亲本含Fc多肽包含F243A突变和V264A突变。
本发明还包含增加含Fc多肽的抗炎性质的方法，其包括在亲本含Fc多肽的位置243、264、267和328上引入突变，其中编号根据如Kabat中的EU指数，其中当与亲本含Fc多肽相比较时，所述含Fc多肽具有增加的抗炎性质。在一个实施方案中，含Fc多肽包含突变F243A、V264A、S267E和L328F。在一个实施方案中，本发明的含Fc多肽是抗体或抗体片段。在一个实施方案中，含Fc多肽是与选自下述的抗原结合的抗体或其抗原结合片段：
Figure 181474DEST_PATH_IMAGE018
Figure 516640DEST_PATH_IMAGE019
Figure 245562DEST_PATH_IMAGE020
Figure 386693DEST_PATH_IMAGE021
或关于上述分子中的任何的受体。在一个实施方案中，含Fc多肽将与TNF-α结合。在另一个实施方案中，含Fc多肽将与Her2结合。在另一个实施方案中，含Fc多肽将与PCSK9结合。在一个实施方案中，本发明的含Fc多肽是包含SEQ ID NO:7的抗体片段。在另一个实施方案中，本发明的含Fc多肽是包含SEQ ID NO:8的抗体片段。在另一个实施方案中，本发明的含Fc多肽是包含SEQ ID NO:17的抗体片段。在另一个实施方案中，本发明的含Fc多肽是由SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:17组成(或基本上由其组成)的抗体片段。在一个实施方案中，本发明的含Fc多肽是包含唾液酸化的N-聚糖的抗体或抗体片段，所述唾液酸化的N-聚糖包含选自
Figure 884671DEST_PATH_IMAGE022
的结构，其中所述唾液酸残基经由α-2,6键连接。在一个实施方案中，亲本含Fc多肽包含天然Fc区。在另一个实施方案中，亲本含Fc多肽包含F243A突变。在另一个实施方案中，亲本含Fc多肽包含V264A突变。在另一个实施方案中，亲本含Fc多肽包含F243A突变和V264A突变。
本发明还包含增加含Fc多肽的抗炎性质的方法，其包括：选择在治疗炎症中有用的亲本含Fc多肽(例如与涉及炎症的抗原结合的抗体或免疫粘附素)，并且在Fc区的位置243、264、267和328上引入突变，其中编号根据如Kabat中的EU指数，其中当与亲本含Fc多肽相比较时，所述含Fc多肽具有增加的抗炎性质。在一个实施方案中，核酸编码突变F243A、V264A、S267E和L328F。在一个实施方案中，本发明的含Fc多肽是抗体或抗体片段。在一个实施方案中，含Fc多肽是与选自下述的抗原结合的抗体或其抗原结合片段：
Figure 469367DEST_PATH_IMAGE023
Figure 420005DEST_PATH_IMAGE024
Figure 364828DEST_PATH_IMAGE025
或关于上述分子中的任何的受体。在一个实施方案中，含Fc多肽将与TNF-α结合。在另一个实施方案中，含Fc多肽将与Her2结合。在另一个实施方案中，含Fc多肽将与PCSK9结合。在一个实施方案中，含Fc多肽是包含SEQ ID NO:7的抗体片段。在另一个实施方案中，含Fc多肽是包含SEQ ID NO:8的抗体片段。在另一个实施方案中，本发明的含Fc多肽是包含SEQ ID NO:17的抗体片段。在另一个实施方案中，含Fc多肽是由SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:17组成(或基本上由其组成)的抗体片段。在一个实施方案中，本发明的含Fc多肽是包含唾液酸化的N-聚糖的抗体或抗体片段，所述唾液酸化的N-聚糖包含选自
Figure 717312DEST_PATH_IMAGE026
Figure 472909DEST_PATH_IMAGE027
的结构，其中所述唾液酸残基经由α-2,6键连接。在一个实施方案中，亲本含Fc多肽包含天然Fc区。在另一个实施方案中，亲本含Fc多肽包含F243A突变。在另一个实施方案中，亲本含Fc多肽包含V264A突变。在另一个实施方案中，亲本含Fc多肽包含F243A突变和V264A突变。
本发明还包含治疗有此需要的受试者中的炎性状况的方法，其包括：给受试者施用治疗有效量的含Fc多肽，所述含Fc多肽包含在位置243、264、267和328上的突变，其中编号根据如Kabat中的EU指数。在一个实施方案中，含Fc多肽降低选自下述的基因的表达：
Figure 866347DEST_PATH_IMAGE030
。在一个实施方案中，含Fc多肽包含突变F243A、V264A、S267E和L328F。在一个实施方案中，含Fc多肽肠胃外施用。在一个实施方案中，含Fc多肽皮下施用。在一个实施方案中，含Fc多肽是抗体或其抗原结合片段。在一个实施方案中，含Fc多肽是在治疗炎性状况中有用的抗体或其抗原结合片段。在一个实施方案中，抗体或其抗原结合片段与选自下述的抗原结合：
Figure 979797DEST_PATH_IMAGE031
Figure 718077DEST_PATH_IMAGE032
或关于上述分子中的任何的受体。在一个实施方案中，含Fc多肽将与TNF-α结合。在另一个实施方案中，含Fc多肽将与Her2结合。在另一个实施方案中，含Fc多肽将与PCSK9结合。在一个实施方案中，含Fc多肽是包含SEQ ID NO:7的抗体片段。在另一个实施方案中，含Fc多肽是包含SEQ ID NO:8的抗体片段。在另一个实施方案中，本发明的含Fc多肽是包含SEQ ID NO:17的抗体片段。在另一个实施方案中，含Fc多肽是由SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:17组成(或基本上由其组成)的抗体片段。在一个实施方案中，本发明的含Fc多肽是包含唾液酸化的N-聚糖的抗体或抗体片段，所述唾液酸化的N-聚糖包含选自
Figure 66199DEST_PATH_IMAGE034
Figure 350549DEST_PATH_IMAGE035
的结构，其中所述唾液酸残基经由α-2,6键连接。
本文公开的另一个发明涉及包含含Fc多肽的药物组合物，其中在含Fc多肽上至少70%、至少80%或至少90%的N-聚糖包含选自
Figure 763076DEST_PATH_IMAGE036
Figure 601195DEST_PATH_IMAGE037
的寡糖结构，其中所述含Fc多肽包含在Fc区的氨基酸位置243、264、267和328上的突变，其中编号根据如Kabat中的EU指数。在一个实施方案中，突变是F243A、V264A、S267E和L328F。在一个实施方案中，唾液酸化的N-聚糖包含α-2,3和α-2,6连接的唾液酸的混合物。在另一个实施方案中，唾液酸化的N-聚糖仅包含α-2,6连接的唾液酸。在另一个实施方案中，唾液酸化的N-聚糖包含α-2,6连接的唾液酸且不含可检测水平的α-2,3连接的唾液酸。在一个实施方案中，唾液酸是N-乙酰神经氨酸(NANA)或N-羟乙酰神经氨酸(NGNA)或其混合物。在另一个实施方案中，唾液酸是在唾液酸上的位置9上具有乙酰化的NANA或NGNA的类似物或衍生物。在一个实施方案中，在含Fc多肽上的N-聚糖包含NANA且不含NGNA。在一个实施方案中，含Fc多肽是包含SEQ ID NO:7的抗体片段。在另一个实施方案中，含Fc多肽是包含SEQ ID NO:8的抗体片段。在另一个实施方案中，本发明的含Fc多肽是包含SEQ ID NO:17的抗体片段。在另一个实施方案中，含Fc多肽是由SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:17组成(或基本上由其组成)的抗体片段。在一个实施方案中，本发明的含Fc多肽是包含唾液酸化的N-聚糖的抗体或抗体片段，所述唾液酸化的N-聚糖包含选自
Figure 782777DEST_PATH_IMAGE038
Figure 34767DEST_PATH_IMAGE039
的结构，其中所述唾液酸残基经由α-2,6键连接。
本文公开的另一个发明涉及包含含Fc多肽的药物组合物，其中在含Fc多肽上至少70%、80%或90%的N-聚糖包含选自
Figure 934590DEST_PATH_IMAGE040
Figure 500700DEST_PATH_IMAGE041
的寡糖结构，其中所述唾液酸残基唯一地经由α -2,6键连接，其中所述N-聚糖缺乏岩藻糖，并且其中所述含Fc多肽包含在Fc区的氨基酸位置243、264、267和328上的突变，其中编号根据如Kabat中的EU指数。在一个实施方案中，突变是F243A、V264A、S267E和L328F。在一个实施方案中，唾液酸化的N-聚糖包含α-2,3和α-2,6连接的唾液酸的混合物。在另一个实施方案中，唾液酸化的N-聚糖仅包含α-2,6连接的唾液酸。在另一个实施方案中，唾液酸化的N-聚糖包含α-2,6连接的唾液酸且不含可检测水平的α-2,3连接的唾液酸。在一个实施方案中，唾液酸是N-乙酰神经氨酸(NANA)或N-羟乙酰神经氨酸(NGNA)或其混合物。在另一个实施方案中，唾液酸是在唾液酸上的位置9上具有乙酰化的NANA或NGNA的类似物或衍生物。在一个实施方案中，在含Fc多肽上的N-聚糖包含NANA且不含NGNA。在一个实施方案中，在本发明的含Fc多肽上的N-聚糖包含α-2,6连接的NANA(且不含NGNA)。在一个实施方案中，含Fc多肽是包含SEQ ID NO:7的抗体片段。在另一个实施方案中，含Fc多肽是包含SEQ ID NO:8的抗体片段。在另一个实施方案中，本发明的含Fc多肽是包含SEQ ID NO:17的抗体片段。在另一个实施方案中，含Fc多肽是由SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:17组成(或基本上由其组成)的抗体片段。
本发明还包括包含重链和轻链的含Fc多肽，其中所述重链包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列或其变体，并且所述轻链包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列或其变体，其中当与包含SEQ ID NO:1的重链氨基酸序列和SEQ ID NO:2的轻链氨基酸序列的抗体相比较时，所述变体包含下述性质中的一种或多种：(i)减少的效应子功能；(ii)增加的抗炎性质；(iii)增加的与凝集素(例如CD22(Siglec 2))的结合；(iv)减少的与FcγRIIa的结合；(v)增加的与FcγRIIb的结合；(vi)减少的与FcγRIIIa的结合；和(vii)减少的与FcγRIIIb的结合。在一个实施方案中，该变体包含最高达0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个保守或非保守氨基酸取代。在一个实施方案中，该变体包含与请求保护的序列至少75%、80%、85%、90%、95%、98%或99%的序列同一性。
本发明还包括包含重链和轻链的含Fc多肽，其中所述重链包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列或其变体，并且所述轻链包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列或其变体，其中当与包含SEQ ID NO:3的重链氨基酸序列和SEQ ID NO:2的轻链氨基酸序列的抗体相比较时，所述变体包含下述性质中的一种或多种：(i)减少的效应子功能；(ii)增加的抗炎性质；(iii)增加的与凝集素(例如CD22(Siglec 2))的结合；(iv)减少的与FcγRIIa的结合；(v)增加的与FcγRIIb的结合；(vi)减少的与FcγRIIIa的结合；和(vii)减少的与FcγRIIIb的结合。在一个实施方案中，该变体包含最高达0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个保守或非保守氨基酸取代。在一个实施方案中，该变体包含与请求保护的序列至少75%、80%、85%、90%、95%、98%或99%的序列同一性。
附图简述
图1是pGLY8068的图示，所述pGLY8068是用于抗体1F11 F243A/V264A/S267E/L328F的表达质粒。重链和轻链都在甲醇诱导型启动子AOX1的控制下。PpTrp2基因是应用于整合整个盒的基因座。除了在重链上的突变外，表达质粒结构对于野生型、双重突变蛋白(F243A/V264A)和四重突变蛋白(F243A/V264A/S267E/L328F)IF11表达质粒是相同的。
图2是来自SDS-PAGE分析的凝胶的图像，所述SDS-PAGE分析表征通过本文的材料与方法产生的非还原(NR)和还原(R)的抗体。泳道1含有在菌株YGLY25265中产生的抗体。泳道2含有在菌株YGLY25266中产生的抗体。泳道3含有在菌株YGLY25267中产生的抗体。泳道4含有在菌株YGLY25268中产生的抗体。泳道5含有在菌株YGLY25269中产生的抗体。泳道6含有在菌株YGLY23258中产生的抗体。泳道7含有在菌株GLY21351中产生的抗体。
图3-8是本发明的含Fc多肽的FcγR结合性质的图示。
图9显示了本发明的一些Fc多肽在鼠ITP模型中的效应。
发明详述
定义
当在本文中使用时，术语“G0”指不含半乳糖或岩藻糖的复合二天线寡糖，
Figure 615418DEST_PATH_IMAGE042
。
当在本文中使用时，术语“G1”指不含岩藻糖且含有一个半乳糖基残基的复合二天线寡糖，
Figure 975992DEST_PATH_IMAGE043
。
当在本文中使用时，术语“G2”指不含岩藻糖且含有两个半乳糖基残基的复合二天线寡糖，
Figure 425428DEST_PATH_IMAGE044
。
当在本文中使用时，术语“G0F”指含有核心岩藻糖且不含半乳糖的复合二天线寡糖，。
当在本文中使用时，术语“G1F”指含有核心岩藻糖和一个半乳糖基残基的复合二天线寡糖，。
当在本文中使用时，术语“G2F”指含有核心岩藻糖和两个半乳糖基残基的复合二天线寡糖，
Figure 295929DEST_PATH_IMAGE047
。
当在本文中使用时，术语“Man5”指如下显示的寡糖结构：
Figure 904765DEST_PATH_IMAGE048
如本文使用的，术语“M4”指寡糖Man4GlcNAc2。
如本文使用的，术语“M5”指寡糖Man5GlcNAc2。
如本文使用的，术语“A1”指寡糖
Figure 140574DEST_PATH_IMAGE049
。
如本文使用的，术语“A1H”指寡糖
Figure 151256DEST_PATH_IMAGE050
。
如本文使用的，术语“A2”指寡糖
Figure 932261DEST_PATH_IMAGE051
。
当在本文中使用时，术语“GFI 5.0”指糖工程化的巴斯德毕赤酵母菌株，其产生具有占优势的
Figure 28393DEST_PATH_IMAGE052
N-聚糖的糖蛋白。
当在本文中使用时，术语“GFI 6.0”指糖工程化的巴斯德毕赤酵母菌株，其产生具有占优势的
Figure 802314DEST_PATH_IMAGE053
N-聚糖的糖蛋白。
当在本文中使用时，术语“GS5.0”指N-糖基化结构。
当在本文中使用时，术语“GS5.5”指N-糖基化结构
Figure 616479DEST_PATH_IMAGE055
，当在已对其进行α 2,6唾液酸转移酶的糖工程化的巴斯德毕赤酵母菌株中生产时，其导致α 2,6-连接的唾液酸，并且当在已对其进行α 2,3唾液酸转移酶的糖工程化的巴斯德毕赤酵母菌株中生产时，其导致α 2,3-连接的唾液酸。
当在本文中使用时，术语“GS6.0”指N-糖基化结构
Figure 199907DEST_PATH_IMAGE056
，当在已对其进行α 2,6唾液酸转移酶的糖工程化的巴斯德毕赤酵母菌株中生产时，其导致α 2,6-连接的唾液酸，并且当在已对其进行α 2,3唾液酸转移酶的糖工程化的巴斯德毕赤酵母菌株中生产时，其导致α 2,3-连接的唾液酸。
当在本文中与巴斯德毕赤酵母菌株结合使用时，术语“野生型”或“wt”指未实施遗传修饰以控制糖基化的天然巴斯德毕赤酵母菌株。
当在本文中使用时，术语“抗体”指能够通过位于免疫球蛋白分子的可变区中的至少一个抗原识别位点与特异性抗原结合的免疫球蛋白分子。如本文使用的，该术语不仅包含完整的多克隆或单克隆抗体，其由四条多肽链即两对相同的多肽链组成，每对具有一条“轻”链(LC)(约25 kDa)和一条“重”链(HC)(约50-70kDa)，还包含其片段，例如Fab、Fab'、F(ab')2、Fv、单链(ScFv)、其突变体、包含抗体部分的融合蛋白、和任何其他修饰的免疫球蛋白分子构型，所述免疫球蛋白分子包含抗原识别位点和重链免疫球蛋白恒定区的CH2结构域的至少部分，所述至少部分包含CH2结构域的N联糖基化位点，或其变体。如本文使用的，该术语包括任何种类的抗体，例如分别的IgG(例如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4)、IgM、IgA、IgD和IgE。
当在本文中使用时，术语“CH2的共有序列”指含有N联糖基化位点的重链恒定区的CH2结构域的氨基酸序列，其衍生自在来自多种抗体的CH2结构域中发现的最常见的氨基酸序列。
术语“Fc区”用于定义免疫球蛋白重链的C末端区域。“Fc区”可以是天然序列Fc区或变体Fc区。尽管免疫球蛋白重链的Fc区的边界可能不同，但人IgG重链Fc区通常定义为从位置Cys226或Pro230上的氨基酸残基到其羧基末端的段。免疫球蛋白的Fc区包含两个恒定结构域，CH2和CH3，并且可以任选包含铰链区。在一个实施方案中，Fc区包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列。在一个实施方案中，Fc区包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列。在另一个实施方案中，本发明的含Fc多肽是包含SEQ ID NO:17的抗体片段。在另一个实施方案中，Fc区包含SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:8的氨基酸序列，和添加在3'末端上的赖氨酸(K)残基。Fc区含有在CH2结构域中的单个N联糖基化位点，其对应于抗体的全长重链的Asn297位点。
术语“含Fc多肽”指包含Fc区的多肽，例如抗体或免疫粘附素。这个术语包括包含Fc区或由Fc区组成(或基本上由其组成)的多肽。包含Fc区的多肽可以通过抗体的木瓜蛋白酶消化或重组DNA技术生成。
当在本文中使用时，术语“亲本抗体”、“亲本免疫球蛋白”或“亲本含Fc多肽”指缺乏本文公开的Fc区突变的抗体或含Fc多肽。亲本含Fc多肽可以包含天然序列Fc区或具有预先存在的氨基酸序列修饰的Fc区。天然序列Fc区包含与在自然界中发现的Fc区的氨基酸序列相同的氨基酸序列。天然序列Fc区包括天然序列人IgG1 Fc区、天然序列人IgG2 Fc区、天然序列人IgG3 Fc区和天然序列人IgG4 Fc区、以及其天然存在的变体。当用作比较物(comparator)时，亲本抗体或亲本含Fc多肽可以在任何细胞中表达。在一个实施方案中，亲本抗体或亲本含Fc多肽在与本发明的含Fc多肽相同的细胞中表达。
如本文使用的，术语“免疫粘附素”指定抗体样分子，其组合异源“粘附素”蛋白质(例如受体、配体或酶)的“结合结构域”与免疫球蛋白恒定结构域。结构上，免疫粘附素包含具有所需结合特异性的粘附素氨基酸序列与免疫球蛋白恒定结构域序列的融合物，所述粘附素氨基酸序列不同于抗体(即，是“异源的”)的抗原识别和结合位点(抗原组合位点)。如本文使用的，术语“配体结合结构域”指任何天然细胞表面受体或其保留相应天然受体的至少性质上的配体结合能力的任何区域或衍生物。在具体实施方案中，受体来自具有细胞外结构域的细胞表面多肽，所述细胞外结构域与免疫球蛋白超家族成员同源。并非免疫球蛋白超家族成员但仍由这个定义具体涵盖的其他受体是关于细胞因子的受体，并且特别是具有酪氨酸激酶活性的受体(受体酪氨酸激酶)、使哺乳动物易受所讨论病症的影响的红细胞生成素和神经生长因子成员。在一个实施方案中，所述病症是癌症。制备免疫粘附素的方法是本领域众所周知的。参见例如，WO00/42072。
称为“1F11”的抗体指具有实施例2中公开的氨基酸序列的人源化抗PCSK9抗体。
术语“Herceptin®”指也称为曲妥珠单抗(rastuzumab)的在CHO细胞中生产的商业抗Her2抗体。
当在本文中使用时，术语“Fc突变蛋白抗体”指包含本文所述的单Fc区突变蛋白或双重Fc区突变蛋白之一的抗体。
当在本文中使用时，术语“Fc突变蛋白”指其中已对Fc区作出一个或多个点突变的含Fc多肽。
当在本文中使用时，术语“Fc突变”指对含Fc多肽的Fc区作出的突变。此类突变的例子包括本文描述的F243A、V264A、S267E或L328F突变。
术语“F243A”指在抗体重链的Fc区的位置243上从F(野生型)到A的突变。术语“V264A”指在抗体重链的Fc区的位置264上从V(野生型)到A的突变。术语“S267E”指在抗体重链的Fc区的位置267上从S(野生型)到E的突变。术语“L328F”指在抗体重链的Fc区的位置328上从L(野生型)到F的突变。位置243、264、267和328代表根据EU编号系统在抗体重链的Fc区的CH2结构域中的氨基酸位置。
当在本文中使用时，术语“双重Fc突变蛋白”或“DM”指包含在Fc区的位置243和264上的突变的含Fc多肽。术语“F243A/V264A”指包含两个指定突变的双重Fc突变蛋白。
当在本文中使用时，术语“四重Fc突变蛋白”或“QM”指包含在抗体重链的Fc区的位置243、264、267和328上的突变的含Fc多肽。术语“F243A/V264A/S267E/L328F”指包含四个指定突变的四重Fc突变蛋白。
在本说明书和权利要求书全文中，免疫球蛋白重链或含Fc多肽中的残基编号是如Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，Public Health Service，National Institutes of Health，Bethesda，MD(1991)中的EU指数的那种，所述参考文献特别通过引用并入本文。“如Kabat中的EU指数”指人IgG1 EU抗体的残基编号。
如本文使用的，术语“效应子功能”指由抗体Fc区与Fc受体或配体的相互作用引起的生物化学事件。示例性“效应子功能”包括C1q结合；补体依赖性细胞毒性；Fc受体结合；抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)；吞噬作用；细胞表面受体(例如B细胞受体；BCR)的下调等。此类效应子功能可以使用本领域已知的多种测定进行评估。
当在本文中使用时，术语“糖工程化的巴斯德毕赤酵母”指已遗传改变而表达人样N-聚糖的巴斯德毕赤酵母菌株。例如，上文描述的GFI 5.0、GFI 5.5和GFI 6.0菌株。
当在本文中使用时，术语“N-聚糖”、“糖蛋白”和“糖形”指N联寡糖，例如通过天冬酰胺-N-乙酰葡糖胺键连接至多肽的天冬酰胺残基的那种。在糖蛋白上发现的占优势的糖是葡萄糖、半乳糖、甘露糖、岩藻糖、N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)、N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)和唾液酸(SA，包括NANA、NGNA及其衍生物和类似物，包括乙酰化NANA或乙酰化NGNA)。在糖工程化的巴斯德毕赤酵母中，唾液酸是唯一的N-乙酰神经氨酸(NANA) (Hamilton等人，Science 313(5792): 1441-1443(2006))。N-聚糖具有共同的戊糖核心Man3GlcNAc2，其中“Man”指甘露糖，“Glc”指葡萄糖，“NAc”指N-乙酰基，并且GlcNAc指N-乙酰葡糖胺。N-聚糖就包含外周糖(例如GlcNAc、半乳糖、岩藻糖和唾液酸)的分支(天线)数目而言不同，所述外周糖加入Man3GlcNAc2(“Man3”)核心结构中，所述核心结构也称为“三甘露糖核心”、“戊糖核心”或“寡甘露糖核心”。 N-聚糖根据其分支组成成分进行分类(例如高甘露糖，复合或杂合)。
如本文使用的，术语“唾液酸”或“SA”指唾液酸家族的任何成员，包括但不限于：N-乙酰神经氨酸(Neu5Ac或NANA)、N-羟乙酰神经氨酸(NGNA)及其任何类似物或衍生物(包括起于在唾液酸分子的任何位置上的乙酰化的那些)。唾液酸是关于一组约30种天然存在的酸性碳水化合物的通用名称，其是大量糖缀合物的必需组分。Schauer，Biochem. Society Transactions，11，270-271(1983)。唾液酸通常是寡糖的末端残基。N-乙酰神经氨酸(NANA)是最常见的唾液酸形式，并且N-羟乙酰神经氨酸(NGNA)是第二常见的形式。Schauer，Glycobiology，1，449-452(1991)。NGNA分布遍及动物界，并且根据物种和组织，通常构成显著部分的糖缀合物结合的唾液酸。特定物种例如鸡和人是例外的，因为他们在正常组织中缺乏NGNA。Corfield等人，Cell Biology Monographs，10，5-50(1982)。在人血清样品中，以NGNA形式的唾液酸百分比据报道为总唾液酸的0.01%。Schauer，"Sialic Acids as Antigenic Determinants of Complex Carbohydrates"，见于The Molecular Immunology of Complex Carbohydrates (Plenum Press，New York，1988)中。
如本文使用的，术语“人样N-聚糖”指非常类似于通过未经工程化的野生型人细胞产生的寡糖的N联寡糖。例如，野生型巴斯德毕赤酵母及其他低等真核细胞一般产生在N-糖基化位点上高甘露糖基化的蛋白质。本文描述的宿主细胞产生包含没有高甘露糖基化的人样N-聚糖的糖蛋白(例如抗体)。在一些实施方案中，本发明的宿主细胞能够产生具有杂合和/或复合N-聚糖的人样N-聚糖。由本发明的宿主细胞产生的特定糖蛋白上存在的特定类型的“人样”聚糖取决于在宿主细胞中实施的特定糖工程化步骤。
当在本文中使用时，术语“高甘露糖”型N-聚糖指具有五个或更多个甘露糖残基的N-聚糖。
当在本文中使用时，术语“复合”型N-聚糖指具有连接至“三甘露糖”核心的1,3 甘露糖臂的至少一个GlcNAc和连接至“三甘露糖”核心的1,6 甘露糖臂的至少一个GlcNAc的N-聚糖。复合N-聚糖也可以具有半乳糖(“Gal”)或N-乙酰半乳糖胺(“GalNAc”)残基，其任选由唾液酸或衍生物(例如“NANA”或“NeuAc”，其中“Neu”指神经氨酸，并且“Ac”指乙酰基)修饰。复合N-聚糖也可以具有链内取代，包含“平分型”GlcNAc和核心岩藻糖(“Fuc”)。作为例子，当N-聚糖包含在三甘露糖核心上的平分型GlcNAc时，该结构可以表示为Man3GlcNAc2(GlcNAc)或Man3GlcNAc3。当N-聚糖包含连接至三甘露糖核心的核心岩藻糖时，该结构可以表示为Man3GlcNAc2(Fuc)。复合N-聚糖也可以具有在“三甘露糖核心”上的多个天线，通常被称为“多天线聚糖”。
当在本文中使用时，术语“杂合” N-聚糖指具有在三甘露糖核心的1,3 甘露糖臂的末端上的至少一个GlcNAc和在三甘露糖核心的1,6 甘露糖臂上的零个或超过一个甘露糖的N-聚糖。
当提及糖蛋白制剂中存在的聚糖的“摩尔百分比”时，该术语意指当使用PNGase处理蛋白质制剂且随后通过不受糖形组成影响的方法定量时(例如用荧光标记例如2-氨基苯甲酰胺标记PNGase释放的聚糖合并物，且随后通过高效液相层析或毛细管电泳分离，且随后通过荧光强度定量聚糖)，在释放的N联寡糖合并物中存在的特定聚糖的摩尔百分比。例如，50摩尔百分比的
Figure 511940DEST_PATH_IMAGE057
意指50%释放的聚糖是
Figure 497213DEST_PATH_IMAGE058
，并且剩余50%由其他N联寡糖组成。
如本文使用的，术语“抗炎抗体”指预期用于治疗炎症的抗体。含Fc多肽的抗炎性质可以使用本领域已知的任何方法进行测量。在一个实施方案中，含Fc多肽的抗炎性质使用动物模型进行测量，例如Kaneko等人，Science 313:670-673(2006)，Anthony等人，Science 320:373-376(2008)和本文实施例20-21中所述的模型。在另一个实施方案中，含Fc多肽的抗炎性质通过测定与炎症相关的生物标记(包括但不限于：CRP、促炎细胞因子例如肿瘤坏死因子(TNF-α)、干扰素-γ、白细胞介素6(IL-6、IL-8、IL-10、趋化因子、凝结标记D-二聚体、sCD14、肠脂肪酸结合肽(IFABP)和透明质酸)水平进行测量。在一个实施方案中，含Fc多肽的抗炎性质通过使用本领域已知的方法测定C反应蛋白(CRP)水平进行测量。C反应蛋白水平中的降低指示含Fc多肽具有抗炎性质。
“保守修饰的变体”或“保守取代”指蛋白质中的氨基酸由具有相似特征(例如电荷、侧链大小、疏水性/亲水性、主链构象和刚性等)的其他氨基酸的取代，从而使得可以频繁作出所述改变，而不改变蛋白质的生物活性。本领域技术人员认识到一般而言，多肽的非必需区中的单个氨基酸取代基本上不改变生物活性(参见例如，Watson等人(1987)Molecular Biology of the Gene，The Benjamin/Cummings Pub. Co.，第224页(第4版))。此外，结构或功能相似的氨基酸的取代较不可能破坏生物活性。示例性保守取代在下文列出：
Figure 620021DEST_PATH_IMAGE059
Fc区中的免疫球蛋白G (IgG)的糖基化Asn297(根据EU编号系统)已显示是效应子途径的最佳识别和活化的必要条件，所述效应子途径包括抗体依赖性细胞的细胞毒性(ADCC)和补体依赖性细胞毒性(CDC)，Wright & Morrison，Trends in Biotechnology，15: 26-31(1997)，Tao & Morrison，J. Immunol.，143(8):2595-2601(1989)。这样，在IgG的恒定区中糖基化的工程化已变成用于开发治疗单克隆抗体(mAbs)的活跃研究领域。已确定在Asn297上的N联糖基化的存在对于免疫效应子功能测定中的mAb活性是关键的，所述免疫效应子功能包括ADCC，Rothman(1989)，Lifely等人，Glycobiology ，5:813-822(1995)，Umana(1999)，Shields(2002)，和Shinkawa(2003)，和补体依赖性细胞毒性(CDC)，Hodoniczky等人，Biotechnol. Prog. ，21(6): 1644-1652(2005)，和Jefferis等人，Chem. Immunol.，65: 111-128(1997)。对功能的这种作用已归于由糖基化Fc结构域采用的特定构象，其看起来在糖基化不存在时是缺乏的。更具体而言，在Fc CH2结构域中缺乏糖基化的IgG不与FcγR包括FcγRI、FcγRII和FcγRIII结合，Rothman(1989)。
不仅糖基化的存在看起来在抗体的效应子功能中起作用，N联寡糖的特定组成也是重要的。例如，岩藻糖的存在显示对体外FcγRIIIa结合和体外ADCC的显著作用，Rothman(1989)，和Li等人，Nat. Biotechnol. 24(2): 2100-215(2006)。通过哺乳动物细胞培养例如CHO或NS0产生的重组抗体含有占优势的岩藻糖基化的N联寡糖，Hossler等人，Biotechnology and Bioengineering， 95(5):946-960(2006)，Umana(1999)，和Jefferis等人，Biotechnol. Prog. 21:11-16(2005)。另外，存在Fc区中的唾液酸化可能对抗体赋予抗炎性质的证据。经过凝集素柱纯化以富集唾液酸化形式的静脉内免疫球蛋白(IVIG)显示局限于唾液酸化Fc片段的独特抗炎作用，并且与抑制性受体FcγRIIb的表达中的增加相关，Nimmerjahn和Ravetch.，J. Exp. Med. 204:11-15(2007)。
衍生自哺乳动物细胞系的抗体Fc区中的糖基化通常由糖形的异质混合物组成，其中占优势的形式一般由复合岩藻糖基化糖形(G0F、G1F和较小程度上的G2F)组成。导致不完全半乳糖转移至G0F结构的可能条件包括但不限于非最佳化的半乳糖转移工具，例如β-1,4半乳糖基转移酶和弱UDP-半乳糖转运到高尔基体内、亚最佳的细胞培养和蛋白质表达条件、和通过寡糖附近的氨基酸残基的立体阻碍。虽然这些条件各自可以调节末端半乳糖的最终程度，但认为后续唾液酸转移至Fc寡糖受到CH2结构域的闭合袋构型抑制。参见例如，Jefferis，R.，Nature Biotech.，24(10): 1230-1231，2006中的图1。如果没有正确的末端单糖，特别是半乳糖，或具有不足够的末端半乳糖基化形式，甚至在唾液酸转移酶的存在下生产时，产生能够充当治疗性蛋白质的唾液酸化形式的可能性也很低。人IgG-Fc糖形的蛋白质工程化和结构分析已显示糖基化概况受Fc构象影响，例如，发现当来自Fc袋的特定氨基酸(包括F241、F243、V264、D265和R301)突变为丙氨酸时，可以实现在衍生自CHO生产的IgG3的寡糖上增加的半乳糖和唾液酸水平。Lund等人，J. Immumol. 157(11); 49634969 (1996)。进一步显示特定突变对于分别用作关于FcγRI和C1q结合的替代标记的细胞介导的超氧化物生成和补体介导的红细胞裂解具有一些作用。
已报道酵母已遗传工程化而生产能够分泌具有高度均匀的糖基化的糖蛋白的宿主菌株。Choi等人，PNAS ， USA 100(9): 5022-5027(2003)描述了与真菌II型膜蛋白质前导序列文库组合使用的α 1,2甘露糖苷酶催化结构域和N-乙酰葡糖胺转移酶I催化结构域文库，以使催化结构域定位至分泌途径。以这种方式，分离在体内生产具有均匀的Man5GlcNAc2或GlcNAcMan5GlcNAc2 N-聚糖结构的糖蛋白的菌株。Hamilton等人，Science 313(5792): 1441-1443(2006)描述了在巴斯德毕赤酵母中生产的糖蛋白，红细胞生成素，的生产，作为具有占优势地由二唾液酸化聚糖结构
Figure 690745DEST_PATH_IMAGE060
和单唾液酸化的
Figure 744152DEST_PATH_IMAGE061
组成的聚糖组成。然而，由于图4中可见的，由于在抗体中相对低水平的末端半乳糖底物，在相似菌株中产生的抗体将具有显著较低的唾液酸化N-聚糖含量。近期已显示Fc寡糖的唾液酸化对治疗性静脉内γ球蛋白及其Fc片段赋予抗炎性质，Kaneko等人，Science 313(5787): 670-673(2006)，并且该抗炎活性依赖于唾液酸的α 2,6-连接的形式，而不是α 2,3形式，Anthony等人，Science，320: 373-376(2008)。
宿主生物和细胞系
本发明的含Fc多肽可以在任何宿主生物或细胞系中制备。在一个实施方案中，本发明的含Fc多肽在能够生产唾液酸化N-聚糖的宿主细胞中制备。
在一个实施方案中，本发明的含Fc多肽在哺乳动物细胞中制备，其中所述细胞内源地或通过遗传或过程操作产生含有末端α2-6和α2-3 唾液酸的混合物，或仅末端α2-6 唾液酸的糖蛋白。哺乳动物细胞在培养(组织培养)中的增殖已变成常规操作。有用的哺乳动物宿主细胞系的例子是通过SV40转化的猴肾CV1细胞系(COS-7，ATCC CRL 1651)；人胚肾细胞系(293细胞或用于在悬浮培养中生长的亚克隆的293细胞)；幼仓鼠肾细胞(BHK，ATCC CCL 10)；中国仓鼠卵巢细胞/-DHFR (CHO)；小鼠塞尔托利细胞(TM4)；猴肾细胞(CV1 ATCC CCL 70)；非洲绿猴肾细胞(VERO-76，ATCC CRL-1587)；人宫颈癌细胞(HELA，ATCC CCL 2)；犬肾细胞(MDCK，ATCC CCL 34)；布法罗大鼠肝细胞(BRL 3A，ATCC CRL 1442)；人肺细胞(W138，ATCC CCL 75)；人肝细胞(Hep G2，HB 8065)；小鼠乳房肿瘤(MMT 060562，ATCC CCL51)；TRI细胞；MRC 5细胞；FS4细胞；杂交瘤细胞系；NS0；SP2/0；和人肝细胞瘤系(Hep G2)。
在一个实施方案中，本发明的含Fc多肽可以在经工程化而生产唾液酸化N-聚糖的植物细胞中制备。参见例如Cox等人，Nature Biotechnology(2006)24，1591 - 1597(2006)和Castilho等人，J. Biol. Chem. 285(21): 15923-15930(2010)。
在一个实施方案中，本发明的含Fc多肽可以在经工程化而生产唾液酸化N-聚糖的昆虫细胞中制备。参见例如Harrison和Jarvis，Adv. Virus Res. 68:159-91(2006)。
在一个实施方案中，本发明的含Fc多肽可以在经工程化而生产唾液酸化N-聚糖的细菌细胞中制备。参见例如Lizak等人，Bioconjugate Chem. 22:488-496(2011)。
在一个实施方案中，本发明的含Fc多肽可以在低等真核宿主细胞或生物中制备。近期发展允许在低等真核宿主生物、酵母和丝状真菌例如巴斯德毕赤酵母中生产完全人源化的治疗剂，Gerngross等人，美国专利7,029,872和美国专利号7,449,308，其公开内容通过引用并入本文。还参见Jacobs等人，Nature Protocols 4(1):58-70(2009)。
由于降低的FcγR和C1q结合，本文描述的材料与方法可以用于生产重组糖基化抗体，当与亲本抗体相比较时，所述重组糖基化抗体具有降低的效应子功能。与在糖工程化的巴斯德毕赤酵母细胞中生产的缺乏特异性Fc突变的抗体或在保留其内源糖基化工具的巴斯德毕赤酵母宿主细胞中生产的抗体相比较，通过本发明的方法在巴斯德毕赤酵母中如此生产的抗体以高得率生产，具有降低的效应子功能，并且具有占优势种类的具有末端α 2,6-连接的唾液酸残基的糖蛋白。
在一个实施方案中，本发明的含Fc多肽在宿主细胞更优选酵母或丝状真菌宿主细胞中制备，所述宿主细胞已经工程化而生产具有占优势的包含末端唾液酸的N-聚糖的糖蛋白。在本发明的一个实施方案中，在用α 2,6唾液酸转移酶进行糖工程化的，不生产任何α 2,3连接的唾液酸的菌株中生产的占优势的N-聚糖是α 2,6连接形式的
Figure 646249DEST_PATH_IMAGE062
。在其他实施方案中，菌株经工程化而表达单独或与α 2,6,唾液酸转移酶组合的α 2,3唾液酸转移酶，导致作为占优势N-聚糖的α 2,3连接的唾液酸或α 2,6和α 2,3连接的唾液酸的组合。
待用于制备本发明的含Fc多肽的细胞系可以是任何细胞系，特别是具有生产一种或多种唾液酸化糖蛋白的能力的细胞系。本领域普通技术人员将认识到且理解本文描述的材料与方法并不限于在本文中作为例子提供的具体巴斯德毕赤酵母菌株，而是可以包括任何巴斯德毕赤酵母菌株或其他酵母或丝状真菌菌株，在所述菌株中生产具有一个或多个末端半乳糖的N-聚糖，例如Gal2GlcNAc2Man3。末端半乳糖充当用于生产α 2,6连接的唾液酸的底物，导致N-聚糖结构。合适菌株的例子在美国专利号7,029,872、US 2006-0286637和Hamilton等人，Science 313(5792): 1441-1443(2006)中描述，所述参考文献的描述并入本文，如同详尽阐述一样。
一般而言，低等真核生物例如酵母用于表达蛋白质，特别是糖蛋白，因为它们可以经济地培养，给出高产率，并且当适当修饰时，能够进行合适糖基化。酵母特别提供确定的遗传学，允许快速转化，测试的蛋白质定位策略和容易的基因敲除技术。合适的载体具有所需要的表达控制序列，例如启动子，包括3-磷酸甘油酸酯激酶或其他糖酵解酶，和复制起点，终止序列等。
虽然本发明已在本文中使用甲基营养型酵母巴斯德毕赤酵母进行证实，但其他有用的低等真核宿主细胞包括巴斯德毕赤酵母、芬兰毕赤酵母(Pichia finlandica)、喜海藻糖毕赤酵母(Pichia trehalophila)、Pichia koclamae、膜醭毕赤氏酵母(Pichia membranaefaciens)、小毕赤酵母(Pichia minuta) (Ogataea minuta、Pichia lindneri)、Pichia opuntiae、耐热毕赤酵母(Pichia thermotolerans)、柳毕赤酵母(Pichia salictaria)、栎毕赤酵母(Pichia guercuum)、皮杰普毕赤酵母(Pichia pijperi)、树干毕赤酵母(Pichia stiptis)、嗜甲醇毕赤酵母(Pichia methanolica)、毕赤酵母属物种(Pichia sp.)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、酵母属物种(Saccharomyces sp.)、多形汉逊酵母(Hansenula polymorpha)、克鲁维酵母属物种(Kluyveromyces sp.)、乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)、白色念珠菌(Candida albicans)、构巢曲霉(Aspergillus nidulans)、黑曲霉(Aspergillus niger)、米曲霉(Aspergillus oryzae)、里氏木霉(Trichoderma reesei)、Chrysosporiumi lucknowense、镰刀菌属物种(Fusarium sp.)、禾谷镰刀菌(Fusarium gramineum)、Fusarium venenatum、和粗糙链孢霉(Neurospora crassa)。多种酵母例如乳酸克鲁维酵母、巴斯德毕赤酵母、嗜甲醇毕赤酵母和多形汉逊酵母特别适合于细胞培养，因为它们能够生长至高细胞密度且分泌大量重组蛋白质。同样地，丝状真菌例如黑曲霉、镰刀菌属物种、粗糙链孢霉及其他可以用于在工业规模上生产本发明的糖蛋白。
低等真核生物特别是酵母和丝状真菌可以进行遗传修饰，从而使得它们表达其中糖基化模式是人样或人源化的糖蛋白。如上所述，如本文使用的术语“人样N-聚糖”指非常类似于通过未经工程化的野生型人细胞产生的寡糖的N联寡糖。在本发明的优选实施方案中，本发明的宿主细胞能够生产具有杂合和/或复合N-聚糖的人样糖蛋白；即“人样N糖基化”。在由本发明的宿主细胞产生的糖蛋白上占优势地存在的特定“人样”聚糖取决于执行的特定工程化步骤。以这种方式，可以产生其中特定的期望糖形在组合物中占优势的糖蛋白组合物。这可以通过消除所选内源糖基化酶和/或遗传工程化宿主细胞和/或供应外源酶以模拟全部或部分的哺乳动物糖基化途径来实现，如美国专利号7,449,308中所述。需要时，可以执行糖基化的另外遗传工程化，从而使得可以产生含或不含核心岩藻糖基化的糖蛋白。使用低等真核宿主细胞的进一步优点是，这些细胞能够生产高同质组成的糖蛋白，从而使得占优势的糖蛋白糖形可以作为大于组合物中30摩尔%的糖蛋白存在。在特定方面，占优势的糖形可以以大于组合物中存在的40摩尔%、50摩尔%、60摩尔%、70摩尔%的糖蛋白、和最优选地大于组合物中存在的80摩尔%的糖蛋白存在。
低等真核生物特别是酵母可以进行遗传修饰，从而使得它们表达其中糖基化模式是人样或人源化的糖蛋白。这可以通过消除所选内源糖基化酶和/或供应外源酶来实现，如由Gerngross等人，美国专利号7,449,308描述的。例如，可以选择或工程化宿主细胞，以耗尽α1,6-甘露糖基转移酶活性，否则该活性会将甘露糖残基添加到糖蛋白上的N-聚糖上。
在一个实施方案中，宿主细胞进一步包括α1,2-甘露糖苷酶催化结构域，其融合至通常不与该催化结构域结合且选择为将α1,2-甘露糖苷酶活性靶向至宿主细胞的ER或高尔基体的细胞靶向信号肽。重组糖蛋白通过宿主细胞的ER或高尔基体的通路产生包含Man5GlcNAc2糖形的重组糖蛋白，例如包含占优势的Man5GlcNAc2糖形的重组糖蛋白组合物。例如，美国专利号7,029,872和7,449,308以及美国公开专利申请号2005/0170452公开了能够生产包含Man5GlcNAc2糖形的糖蛋白的低等真核宿主细胞。
在进一步的实施方案中，刚刚上文所述的宿主细胞进一步包括GlcNAc转移酶I (GnT I)催化结构域，其融合至通常不与该催化结构域结合且选择为将GlcNAc转移酶I活性靶向至宿主细胞的ER或高尔基体的细胞靶向信号肽。重组糖蛋白通过宿主细胞的ER或高尔基体的通路产生包含GlcNAcMan5GlcNAc2糖形的重组糖蛋白，例如包含占优势的GlcNAcMan5GlcNAc2糖形的重组糖蛋白组合物。美国专利号7,029,872和7,449,308以及美国公开专利申请号2005/0170452公开了能够生产包含GlcNAcMan5GlcNAc2糖形的糖蛋白的低等真核宿主细胞。在上述细胞中生产的糖蛋白可以在体外用己糖胺酶处理，以产生包含Man5GlcNAc2糖形的重组糖蛋白。
在进一步的实施方案中，刚刚上文所述的宿主细胞进一步包括甘露糖苷酶II催化结构域，其融合至通常不与该催化结构域结合且选择为将甘露糖苷酶II活性靶向至宿主细胞的ER或高尔基体的细胞靶向信号肽。重组糖蛋白通过宿主细胞的ER或高尔基体的通路产生包含GlcNAcMan3GlcNAc2糖形的重组糖蛋白，例如包含占优势的GlcNAcMan3GlcNAc2糖形的重组糖蛋白组合物。美国专利号7,029,872和美国公开专利申请号2004/0230042公开了低等真核宿主细胞，其表达甘露糖苷酶II酶且能够生产具有占优势的GlcNAcMan3GlcNAc2糖形的糖蛋白。在上述细胞中生产的糖蛋白可以在体外用己糖胺酶处理，以产生包含Man3GlcNAc2糖形的重组糖蛋白。
在进一步的实施方案中，刚刚上文所述的宿主细胞进一步包括GlcNAc转移酶II (GnT II)催化结构域，其融合至通常不与该催化结构域结合且选择为将GlcNAc转移酶II活性靶向至宿主细胞的ER或高尔基体的细胞靶向信号肽。重组糖蛋白通过宿主细胞的ER或高尔基体的通路产生包含GlcNAc2Man3GlcNAc2糖形的重组糖蛋白，例如包含占优势的GlcNAc2Man3GlcNAc2糖形的重组糖蛋白组合物。美国专利号7,029,872和7,449,308以及美国公开专利申请号2005/0170452公开了能够生产包含GlcNAc2Man3GlcNAc2糖形的糖蛋白的低等真核宿主细胞。在上述细胞中生产的糖蛋白可以在体外用己糖胺酶处理，以产生包含Man3GlcNAc2糖形的重组糖蛋白。
在进一步的实施方案中，刚刚上文所述的宿主细胞进一步包括半乳糖基转移酶催化结构域，其融合至通常不与该催化结构域结合且选择为将半乳糖基转移酶活性靶向至宿主细胞的ER或高尔基体的细胞靶向信号肽。重组糖蛋白通过宿主细胞的ER或高尔基体的通路产生包含GalGlcNAc2Man3GlcNAc2或Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2糖形或其混合物的重组糖蛋白，例如包含占优势的GalGlcNAc2 Man3GlcNAc2糖形或Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2糖形或其混合物的重组糖蛋白组合物。美国专利号7,029,872和美国公开专利申请号2006/0040353公开了能够生产包含Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2糖形的糖蛋白的低等真核宿主细胞。在上文细胞中生产的糖蛋白可以在体外用半乳糖苷酶处理，以产生包含GlcNAc2Man3GlcNAc2糖形的重组糖蛋白，例如包含占优势的GlcNAc2Man3GlcNAc2糖形的重组糖蛋白组合物。
在进一步的实施方案中，刚刚上文所述的宿主细胞进一步包括唾液酸转移酶催化结构域，其融合至通常不与该催化结构域结合且选择为将唾液酸转移酶活性靶向至宿主细胞的ER或高尔基体的细胞靶向信号肽。在优选实施方案中，唾液酸转移酶是α2,6-唾液酸转移酶。重组糖蛋白通过宿主细胞的ER或高尔基体的通路产生包含占优势的糖形或
Figure 89497DEST_PATH_IMAGE065
糖形或其混合物的重组糖蛋白。对于低等真核宿主细胞例如酵母和丝状真菌，宿主细胞进一步包括用于提供用于转移至N-聚糖的CMP-唾液酸的工具是有用的。美国公开专利申请号2005/0260729公开了用于遗传工程化低等真核生物以具有CMP-唾液酸合成途径的方法，并且美国公开专利申请号2006/0286637公开了用于遗传工程化低等真核生物以生产唾液酸化糖蛋白的方法。为了增强唾液酸化的量，构建包括两个或更多个CMP-唾液酸合成途径拷贝或两个或更多个唾液酸转移酶拷贝的宿主细胞可以是有利的。在上文细胞中生产的糖蛋白可以在体外用神经氨酸酶处理，以产生包含占优势的
Figure 783783DEST_PATH_IMAGE066
糖形或
Figure 497661DEST_PATH_IMAGE067
糖形或其混合物的重组糖蛋白。
上文所述的宿主细胞中的任何一种都可以进一步包括选自GnT III、GnT IV、GnT V、GnT VI和GnT IX的一种或多种GlcNAc转移酶，以产生具有平分的(GnT III)和/或多天线的(GnT IV、V、VI和IX) N-聚糖结构的糖蛋白，例如美国公开专利申请号2005/0208617和2007/0037248中公开的。进一步地，上文所述的宿主细胞可以产生包含
Figure 542978DEST_PATH_IMAGE068
Figure 751236DEST_PATH_IMAGE069
的重组糖蛋白(例如抗体)，包括包含
Figure 300029DEST_PATH_IMAGE070
Figure 388071DEST_PATH_IMAGE071
或
Figure 717421DEST_PATH_IMAGE072
和
Figure 916321DEST_PATH_IMAGE073
Figure 129740DEST_PATH_IMAGE074
的组合的抗体。在一个实施方案中，重组糖蛋白将包含含有选自
Figure 388683DEST_PATH_IMAGE075
的结构且缺乏任何α2-3连接的SA的N-聚糖。
在进一步的实施方案中，产生具有占优势的GlcNAcMan5GlcNAc2 N-聚糖的糖蛋白的宿主细胞进一步包括半乳糖基转移酶催化结构域，其融合至通常不与该催化结构域结合且选择为将半乳糖基转移酶活性靶向至宿主细胞的ER或高尔基体的细胞靶向信号肽。重组糖蛋白通过宿主细胞的ER或高尔基体的通路产生包含占优势的GalGlcNAcMan5GlcNAc2糖形的重组糖蛋白。
在进一步的实施方案中，产生具有占优势的GalGlcNAcMan5GlcNAc2 N-聚糖的糖蛋白的刚刚上文所述的宿主细胞进一步包括唾液酸转移酶催化结构域，其融合至通常不与该催化结构域结合且选择为将靶向唾液酸转移酶活性靶向至宿主细胞的ER或高尔基体的细胞靶向信号肽。重组糖蛋白通过宿主细胞的ER或高尔基体的通路产生包含
Figure 942342DEST_PATH_IMAGE077
糖形(例如
Figure 278776DEST_PATH_IMAGE078
或
Figure 708620DEST_PATH_IMAGE079
或其混合物)的重组糖蛋白。
上文所述的宿主细胞中的任何都可以进一步包括一种或多种糖转运蛋白，例如UDP-GlcNAc转运蛋白(例如乳酸克鲁维酵母和小家鼠(Mus musculus) UDP-GlcNAc转运蛋白)、UDP-半乳糖转运蛋白(例如黑腹果蝇(Drosophila melanogaster) UDP-半乳糖转运蛋白)、和CMP-唾液酸转运蛋白(例如人唾液酸转运蛋白)。因为低等真核宿主细胞例如酵母和丝状真菌缺乏上述转运蛋白，所以优选将低等真核宿主细胞，例如酵母和丝状真菌，遗传工程化以包括上述转运蛋白。
进一步地，上文所述的宿主细胞中的任何都可以进一步操作，以增加N-聚糖占据。参见例如Gaulitzek等人，Biotechnol. Bioengin. 103:1164-1175(2009)；Jones等人，Biochim. Biospyhs. Acta 1726:121-137(2005)；WO2006/107990。在一个实施方案中，上文所述的宿主细胞中的任何都可以进一步工程化以包含编码异源单亚基寡糖基转移酶(例如利什曼原虫属物种(Leishmania sp.)STT3A蛋白质、STT3B蛋白质、STT3C蛋白质、STT3D蛋白质或其组合)的至少一种核酸分子，和编码异源糖蛋白的核酸分子，并且其中所述宿主细胞表达编码包含内源OTase复合物的蛋白质的内源宿主细胞基因。在一个实施方案中，上文所述的宿主细胞中的任何都可以进一步工程化以包含编码利什曼原虫属物种STT3D蛋白质的至少一种核酸分子，和编码异源糖蛋白的核酸分子，并且其中所述宿主细胞表达编码包含内源OTase复合物的蛋白质的内源宿主细胞基因。
宿主细胞进一步包括遗传工程化以产生糖蛋白的低等真核生物细胞(例如酵母例如巴斯德毕赤酵母)，所述糖蛋白不具有α-甘露糖苷酶-抗性N-聚糖。这可以通过缺失或破坏β-甘露糖基转移酶基因(例如BMT1、BMT2 、 BMT3和BMT4)中的一种或多种来实现(参见美国公开专利申请号2006/0211085)，和通过缺失或破坏磷酸甘露糖基转移酶基因PNO1和MNN4B中的一种或两种实现具有磷酸甘露糖残基的糖蛋白(参见例如美国专利号7,198,921和7,259,007)，其在进一步方面还可以包括缺失或破坏MNN4A基因。破坏包括使用干扰RNA、反义RNA等破坏编码特定酶的开放读码框，或破坏开放读码框的表达，或取消编码β-甘露糖基转移酶和/或磷酸甘露糖基转移酶中的一种或多种的RNAs的翻译。进一步地，通过添加化学抑制剂或通过细胞培养条件的修改，细胞可以产生具有α-甘露糖苷酶抗性N-聚糖的糖蛋白。这些宿主细胞可以如上所述进一步修饰，以产生特定N-聚糖结构。
宿主细胞进一步包括低等真核生物细胞(例如酵母例如巴斯德毕赤酵母)，其通过下述遗传修饰以控制糖蛋白的O-糖基化：缺失或破坏蛋白质O-甘露糖基转移酶(Dol-P-Man:蛋白质(Ser/Thr)甘露糖基转移酶基因)(PMTs)中的一种或多种(参见美国专利号5,714,377)，或如公开国际申请号WO 2007/061631中公开的在Pmtp抑制剂和/或α-甘露糖苷酶的存在下生长，或两者。破坏包括使用干扰RNA、反义RNA等破坏编码Pmtp的开放读码框，或破坏开放读码框的表达，或取消编码Pmtp中的一种或多种的RNAs的翻译。宿主细胞可以进一步包括经过修饰以产生特定N-聚糖结构的上述宿主细胞中的任何一种。
Pmtp抑制剂包括但不限于苯亚甲基噻唑烷二酮。可以使用的苯亚甲基噻唑烷二酮的例子是5-[[3,4-双(苯基甲氧基)苯基]亚甲基]-4-氧代-2-硫代-3-噻唑烷乙酸；5-[[3-(1-苯基乙氧基)-4-(2-苯基乙氧基)]苯基]亚甲基]-4-氧代-2-硫代-3-噻唑烷乙酸；和5-[[3-(1-苯基-2-羟基)乙氧基)-4-(2-苯基乙氧基)]苯基]亚甲基]-4-氧代-2-硫代-3-噻唑烷乙酸。
在特定实施方案中，减少、破坏或缺失至少一种内源PMT基因的功能或表达。例如，在特定实施方案中，减少、破坏或缺失选自PMT1、PMT2 、 PMT3 和 PMT4基因的至少一种内源PMT基因的功能或表达；或在一种或多种PMT抑制剂的存在下培养宿主细胞。在进一步的实施方案中，宿主细胞包括一种或多种PMT基因缺失或破坏，并且在一种或多种Pmtp抑制剂的存在下培养宿主细胞。在这些实施方案的特定方面，宿主细胞还表达分泌的α-1,2-甘露糖苷酶。
PMT缺失或破坏和/或Pmtp抑制剂通过减少O-糖基化占据，即通过减少糖基化的糖蛋白上的O-糖基化位点总数目，来控制O-糖基化。进一步添加细胞分泌的α-1,2-甘露糖苷酶通过减少糖蛋白上的O-聚糖的甘露糖链长来控制O-糖基化。因此，组合PMT缺失或破坏和/或Pmtp抑制剂与分泌的α-1,2-甘露糖苷酶的表达，通过减少占据和链长来控制O-糖基化。在特定情况下，凭经验确定PMT缺失或破坏、Pmtp抑制剂和α-1,2-甘露糖苷酶的特定组合，因为特定异源糖蛋白(例如Fabs和抗体)可以以不同有效程度表达且转运通过高尔基体，并且因此可能需要PMT缺失或破坏、Pmtp抑制剂和α-1,2-甘露糖苷酶的特定组合。在另一个方面，编码一种或多种内源甘露糖基转移酶的基因是缺失的。这个缺失可以与提供分泌的α-1,2-甘露糖苷酶和/或PMT抑制剂组合，或可以代替提供分泌的α-1,2-甘露糖苷酶和/或PMT抑制剂。
因此，O-糖基化的控制可以用于以更好的总产率或适当装配的糖蛋白的产率在本文公开的宿主细胞中生产特定糖蛋白。当整个抗体和Fab片段穿过分泌途径且转运至细胞表面时，O-糖基化的减少或消除看起来对所述整个抗体和Fab片段的装配和转运具有有利作用。因此，在其中O-糖基化受控制的细胞中，适当装配的抗体或Fab片段的产率增加超过在其中O-糖基化不受控制的宿主细胞中获得的产率。
为了减少或消除带有对α-甘露糖苷酶是抗性的β连接甘露糖残基的N-聚糖和O-聚糖的可能性，通过缺失或破坏β-甘露糖基转移酶基因(例如BMT1、BMT2 、 BMT3和BMT4)中的一种或多种(参见美国专利号7,465,577和美国专利号7,713,719)，将重组糖工程化的巴斯德毕赤酵母宿主细胞遗传工程化以消除具有α-甘露糖苷酶抗性N-聚糖的糖蛋白。BMT2与BMT1、BMT3和BMT4中的一种或多种的缺失或破坏也减少或消除可检测的与针对宿主细胞蛋白质的抗体的交叉反应性。
在一些情况下，糖蛋白的产率可以通过过表达编码哺乳动物或人伴侣蛋白的核酸分子，或用编码一种或多种哺乳动物或人伴侣蛋白的核酸分子替换编码一种或多种内源伴侣蛋白的基因得到改善。此外，哺乳动物或人伴侣蛋白在宿主细胞中的表达看起来也控制细胞中的O-糖基化。因此，本文进一步包括的是其中编码伴侣蛋白的至少一种内源基因的功能已减少或消除的宿主细胞，并且在宿主细胞中表达编码伴侣蛋白的至少一种哺乳动物或人同系物的载体。还包括的是在其中表达内源宿主细胞伴侣蛋白和哺乳动物或人伴侣蛋白的宿主细胞。在进一步方面，低等真核宿主细胞是酵母或丝状真菌宿主细胞。在其中引入人伴侣蛋白以改善产率且减少或控制重组蛋白质的O-糖基化的宿主细胞的伴侣蛋白的应用的例子已公开于公开的国际申请号WO 2009105357和WO2010019487(其公开内容通过引用并入本文)中。如上，进一步包括的是低等真核宿主细胞，其中除了如上所述用编码一种或多种哺乳动物或人伴侣蛋白的核酸分子替换编码一种或多种内源伴侣蛋白的基因，或过表达一种或多种哺乳动物或人伴侣蛋白之外，还减少、破坏或缺失编码蛋白质O-甘露糖基转移酶(PMT)蛋白质的至少一种内源基因的功能或表达。在特定实施方案中，减少、破坏或缺失选自PMT1、PMT2 、 PMT3 和 PMT4基因的至少一种内源PMT基因的功能。
此外，O-糖基化可以对抗体或Fab片段对于抗原的亲和力和/或亲合力具有作用。当用于生产抗体或Fab的最终宿主细胞与用于选择抗体的宿主细胞不同时，这可以是特别有意义的。例如，O-糖基化可能干扰抗体或Fab片段对于抗原的亲和力，因此在不同情况下可能对抗原具有高亲和力的抗体或Fab片段可能未得到鉴定，因为O-糖基化可能干扰抗体或Fab片段与抗原结合的能力。在其他情况下，对于抗原具有高亲合力的抗体或Fab片段可能未得到鉴定，因为O-糖基化干扰抗体或Fab片段对于抗原的亲合力。在前面两种情况下，当在哺乳动物细胞系中生产时可能特别有效的抗体或Fab片段可能未得到鉴定，因为用于鉴定且选择抗体或Fab片段的宿主细胞是另一种细胞类型，例如酵母或真菌细胞(例如巴斯德毕赤酵母宿主细胞)。众所周知的是酵母中的O-糖基化显著不同于哺乳动物细胞中的O-糖基化。当比较野生型酵母O-糖基化与哺乳动物中的粘蛋白型或营养不良聚糖(dystroglycan)型O-糖基化时，这是特别有关的。在特定情况下，O-糖基化可能增强抗体或Fab片段对于抗原的亲和力或亲合力，而不是干扰抗原结合。当生产宿主细胞不同于用于鉴定且选择抗体或Fab片段的宿主细胞时(例如鉴定和选择在酵母中完成，并且生产宿主是哺乳动物细胞)，这个效应是不期望的，因为在生产宿主中，O-糖基化不再是引起增强的对于抗原的亲和力或亲合力的类型。因此，控制O-糖基化可以允许使用本文的材料与方法，以基于抗体或Fab片段对于抗原的亲和力或亲合力，鉴定且选择对于特定抗原具有特异性的抗体或Fab片段，而不鉴定和选择受宿主细胞的O-糖基化系统影响的抗体或Fab片段。因此，控制O-糖基化进一步增强酵母或真菌宿主细胞鉴定且选择最终在哺乳动物细胞系中生产的抗体或Fab片段的有用性。
本领域普通技术人员将进一步欣赏和理解如何利用与其他巴斯德毕赤酵母和酵母细胞系组合的本文描述的材料与方法，所述其他巴斯德毕赤酵母和酵母细胞系已遗传工程化而产生特定N-聚糖或唾液酸化糖蛋白，例如但不限于上文描述的已遗传工程化而产生特定半乳糖基化或唾液酸化形式的宿主生物和细胞系。参见例如，US 2006-0286637，Production of Sialylated N-Glycans in Lower Eukaryotes，其中关于半乳糖摄取和作为碳源利用的途径已进行遗传修饰，其描述并入本文，如同详尽阐述一样。
另外，本文的方法可以用于在其他低等真核细胞系中生产上述重组含Fc多肽，所述其他低等真核细胞系已工程化而产生不具有α2,6唾液酸转移酶活性的人样和人糖蛋白。该方法还可以用于在真核细胞系中生产上述重组含Fc多肽，在所述真核细胞系中唾液酸化N-聚糖的生产是先天特征。
在含Fc多肽上的α2,3-和α2,6连接的唾液酸水平可以使用众所周知的技术进行测量，所述技术包括核磁共振(NMR)、正相高效液相层析(HPLC)和配有脉冲安培检测的高效阴离子交换层析(HPAEC-PAD)。
Fc突变蛋白的生物学性质
对于许多含Fc多肽，如通过降低的FcγR和C1q显示的，Idusogie等人，J. Immunology，164(8): 4178-84(2000)和Shields等人，J. Biol. Chem. ，276: 6591-6604(2001)，效应子功能中的缺乏或显著降低和增加的抗炎性质将是期望特征。
申请人已开发四重Fc突变蛋白F243A/V264A/S267E/L328F，其将产生具有上述所需特征的含Fc多肽。本文实施例包括用编码含Fc多肽的多核苷酸载体转化宿主细胞，所述含Fc多肽包含在Fc区的243、264、267和328位置上的突变，并且培养转化的宿主细胞以产生含Fc多肽。
含Fc多肽的生产
本发明的含Fc多肽可以根据本领域已知的适合于生成包含Fc区的多肽的任何方法进行制备。在一个实施方案中，含Fc多肽是抗体或抗体片段(包括但不限于包含抗体的Fc区、由抗体的Fc区组成、或基本上由抗体的Fc区组成的多肽)。在另一个实施方案中，含Fc多肽是免疫粘附素。制备抗体和抗体片段的方法是本领域众所周知的。将点突变引入多肽内的方法例如定点诱变也是本领域众所周知的。
在本文公开的实施例中，本文描述的含有共有CH2序列和Fc双重突变体的IgG1重链和轻链在两种不同的糖工程化的巴斯德毕赤酵母菌株中表达。如下文实施例中所述，重链和轻链基因序列都在甲醇诱导型启动子AOX1的控制下，并且掺入博来霉素(博莱霉素，Zeocin)选择标记。这个策略通过同源DNA重组将整个表达盒整合到Trp2基因座内。
通过蛋白A亲和层析和随后的Source 30S阳离子交换纯化步骤，从发酵肉汤中捕获分泌的抗体。纯化的抗体通过SDS-PAGE(图2)进行表征，以评估适当装配。如图2中可见，通过本文的材料与方法产生的抗体是适当装配的。
通过本文的材料与方法制备的多种抗体的抗原亲和力通过基于细胞的测定使用Biacore进行测定。如预期的，所有抗体，包括Fc突变蛋白，同样良好地与PCSK9抗原结合。
Fc突变蛋白的N-聚糖分析
对于许多糖蛋白，包括特定抗体，IgG Fc区的末端N联聚糖的唾液酸化是生产具有正确构象以赋予治疗活性的糖蛋白和抗体必需的。参见例如Anthony等人，Science ，320: 373-376(2008)，其中关于IVIG制剂，末端唾液酸化与抗炎活性相关。唾液酸化需要倒数第二个半乳糖的存在，唾液酸转移酶作用于该倒数第二个半乳糖以形成唾液酸化聚糖。因此，缺乏一个或多个末端半乳糖糖形的糖蛋白不能产生具有与抗炎活性相关的α2,6连接的唾液酸组成的抗体。
哺乳动物细胞具有对其糖蛋白唾液酸化的完全能力，然而，由于空间局限，在哺乳动物细胞培养物，例如CHO细胞中，生产的抗体具有甚至不完全的至其N297连接的聚糖的半乳糖转移。此外，由于进一步的空间障碍，来自哺乳动物细胞(例如CHO)的抗体的唾液酸化水平通常在其N297连接的聚糖上含有很少的唾液酸或不含唾液酸。在CHO细胞生产的情况下，当加入唾液酸时，它通过α2,3-键连接。CHO细胞不表达产生α2,6连接形式的唾液酸所需的α2,6唾液酸转移酶，所述α2,6连接形式的唾液酸已与抗炎活性相关(Lee等人，J. Biol. Chem. 264: 13848-13855(1989)。特异性α2,6唾液酸转移酶在CHO中的过表达可以引起α2,3连接的和α2,6连接的唾液酸的混合物(Bragonzi等人，BBA 1474:273-282(2000)；Biochem. Biophys. Res. Comm. 289: 243-249(2001))。
能够生产高水平的半乳糖基化非抗体蛋白质(例如红细胞生成素)的糖工程化的巴斯德毕赤酵母GFI5.0菌株(Hamilton等人，Science，313: 1441-1443(2006))，产生具有相对少量的末端半乳糖的抗体，末端半乳糖可以经过作用以形成α 2,6连接的唾液酸化形式。在此类巴斯德毕赤酵母菌株中生产的抗体一般具有包括糖形G0(60%)、G1(17%)、G2(4%)和Man5(8%)的组成。甚至在巴斯德毕赤酵母GFI6.0菌株中生产的抗体也具有相对低水平的α 2,6连接的唾液酸化形式，所述抗体具有包含和
Figure 287686DEST_PATH_IMAGE081
的聚糖组成。因此，与相同菌株中生产的非抗体蛋白质(例如红细胞生成素)相比较，在GFI 5.0和6.0菌株中生产的抗体具有水平低得多的半乳糖基化和唾液酸化。
来自GFI5.0菌株(YGLY21351)的巴斯德毕赤酵母野生型PCSK-9抗体(1F11)的糖形包括M4、G0、G1、M6、G2聚糖。来自GFI 6.0菌株(YGLY23258)的巴斯德毕赤酵母双重突变蛋白PCSK-9抗体(1F11 F243A/V264A)的糖形包括G0、M5、G1、G2、A1和A2聚糖。来自GFI 6.0菌株的巴斯德毕赤酵母1F11 F243A/V264A/S267E/L328F的糖形包括：A1、A1H和A2(YGLY25267)和G2、Man5、A1和A2(YGLY25269)。
Fc突变蛋白的FcγR结合
使用基于ELISA的测定，申请人比较关于商购可得的赫赛汀、野生型抗PCSK9抗体(1F11)、具有F243A/V243A突变的双重突变蛋白抗PCSK9(1F11)抗体、和具有F243A/V264A/S267E/L328F突变的四重突变蛋白抗PCSK9(1F11)抗体的Fcγ受体(FcγR)结合。如实施例中所示，与具有天然Fc区的抗体相比较，或与具有F243A/V264A双重突变的抗体相比较，Fc四重突变蛋白具有降低的与FcγRI、FcγRIIa和FcγRIIa的亲和力，和增加的与FcγRIIb的亲和力。
双重和四重突变蛋白都不结合FcγRIIa。
双重和四重突变蛋白都不结合FcγRIIIa-F158或FcγRIIIa-V158。
然而，四重突变蛋白具有增加的与FcγRIIb的结合，这是令人惊讶的，因为双重突变蛋白仅显示与这个受体的最小结合。
总之，这些数据暗示与抗体的双重突变蛋白或非突变蛋白(天然)形式相比较，四重Fc突变蛋白较不易于活化且招募免疫细胞，例如巨噬细胞、单核细胞和天然杀伤细胞。
生物学靶
应当指出，虽然在下述实施例中，申请人使用抗PCSK9抗体例示本发明的材料与方法，但本发明并不限于公开的抗体。本领域普通技术人员将认识到且理解本文的材料与方法可以用于产生任何含Fc多肽，对于所述含Fc多肽，期望增强的抗炎活性或降低的效应子功能的特征。应进一步指出不存在关于如此通过本发明产生的含Fc多肽或抗体类型的限制。含Fc多肽的Fc区可以来自IgA、IgD、IgE、IgG或IgM。在一个实施方案中，含Fc多肽的Fc区来自IgG，包括IgG1、IgG2、IgG3或IgG4。在一个实施方案中，含Fc多肽的Fc区来自IgG1。在具体实施方案中，通过本文的材料与方法生产的抗体或抗体片段可以是人源化、嵌合或人抗体。
在一些实施方案中，本发明的含Fc多肽将与涉及炎症的生物学靶结合。
在一些实施方案中，本发明的含Fc多肽将与促炎细胞因子结合。在一些实施方案中，本发明的含Fc多肽将与选自下述的分子结合：
Figure 79373DEST_PATH_IMAGE083
Figure 808295DEST_PATH_IMAGE084
或关于上述分子中的任何的受体。在一个实施方案中，本发明的含Fc多肽将与TNF-α结合。在另一个实施方案中，本发明的含Fc多肽将与Her2结合。在另一个实施方案中，本发明的含Fc多肽将与PCSK9结合。在另一个实施方案中，本发明的含Fc多肽将与TNFR结合。在另一个实施方案中，本发明的含Fc多肽将与LCAT结合。在另一个实施方案中，本发明的含Fc多肽将与TSLP结合。在另一个实施方案中，本发明的含Fc多肽将与PD-1结合。在另一个实施方案中，本发明的含Fc多肽将与IL-23结合。
在一些实施方案中，本发明的含Fc多肽对于选自自身免疫抗原、变应原、MHC分子或猕猴因子D抗原的抗原是特异性的。参见例如，通过引用并入本文的WO2010/10910的表1中列出的抗原。
增加抗炎性质或降低效应子功能/细胞毒性的方法
本发明还包含增加含Fc多肽的抗炎性质的方法，其包括：选择在治疗炎性状况中有用的亲本含Fc多肽(例如与涉及炎症的抗原结合的抗体或免疫粘附素)，并且在含Fc多肽的位置243、264、267和328上引入突变，其中编号根据如Kabat中的EU指数，其中当与亲本含Fc多肽相比较时，所述含Fc多肽具有增加的抗炎性质。在一个实施方案中，含Fc多肽包含突变F243A、V264A、S267E和L328F。在一个实施方案中，亲本含Fc多肽是与涉及炎症的抗原结合的抗体、抗体片段或免疫粘附素。在一个实施方案中，亲本含Fc多肽是已推向市场或处于用于治疗炎性状况的开发下的抗体、抗体片段或免疫粘附素。在另一个实施方案中，亲本含Fc多肽是选自下述的抗体：莫罗单抗-CD3(抗CD3受体抗体)、阿昔单抗(抗CD41 7E3抗体)、利妥昔单抗(抗CD20抗体)、达利珠单抗(抗CD25抗体)、巴利昔单抗(抗CD25抗体)、帕利珠单抗(抗RSV(呼吸道合胞病毒)抗体)、英夫利昔单抗(抗TNFα抗体)、曲妥珠单抗(抗Her2抗体)、吉妥珠单抗奥佐米星(抗CD33抗体)、阿仑珠单抗(抗CD52抗体)、替伊莫单抗tiuxeten (抗CD20抗体)、阿达木单抗(抗TNFα抗体)、奥马珠单抗(抗IgE抗体)、托西莫单抗-131I(抗CD20抗体的碘化衍生物)、依法珠单抗(抗CD11a抗体)、西妥昔单抗(抗EGF受体抗体)、戈利木单抗(抗TNFα抗体)、贝伐珠单抗(抗VEGF-A抗体)、那他珠单抗(抗α4 整联蛋白)、依法珠单抗(抗CD11a)、赛妥珠单抗(抗TNFα抗体)、托珠单抗(Tocilizamab，抗IL-6R)、优特克单抗(Ustenkinumab，抗IL-12/23)、阿仑单抗(抗CD52)和那他珠单抗(抗α4整联蛋白)及其变体。在另一个实施方案中，亲本含Fc多肽是选自下述的Fc融合蛋白：Arcalyst/列洛西普(IL1R-Fc融合物)、Orencia/阿巴西普(CTLA-4-Fc融合物)、Amevive/阿来法赛(LFA-3-Fc融合物)、阿那白滞素-Fc融合物 (IL-1Ra-Fc融合蛋白)、依那西普(TNFR-Fc融合蛋白)、FGF-21-Fc融合蛋白、GLP-1-Fc融合蛋白、RAGE-Fc融合蛋白、ActRIIA-Fc融合蛋白、ActRIIB-Fc融合蛋白、胰高血糖素-Fc融合蛋白、胃泌酸调节素(oxyntomodulin)-Fc-融合蛋白、GM-CSF-Fc融合蛋白、EPO-Fc融合蛋白、胰岛素-Fc融合蛋白、胰岛素原-Fc融合蛋白和胰岛素前体-Fc融合蛋白、及其类似物和变体。
本发明还包含减少含Fc多肽的效应子功能的方法，其包括在亲本含Fc多肽的位置243、264、267和328上引入突变，其中当与亲本含Fc多肽相比较时，所述含Fc多肽具有降低的效应子功能，其中编号根据如Kabat中的EU指数。在一个实施方案中，含Fc多肽包含突变F243A、V264A、S267E和L328F。在一个实施方案中，含Fc多肽是抗体或其抗原结合片段。在一个实施方案中，效应子功能是ADCC。在另一个实施方案中，效应子功能是CDC。
本发明还包含降低含Fc多肽的细胞毒性的方法，其包括：选择在治疗炎性状况中有用的，与涉及炎症的抗原结合的亲本含Fc多肽(例如与涉及炎症的抗原结合的抗体或免疫粘附素)，并且在含Fc多肽的位置243、264、267和328上引入突变，其中编号根据如Kabat中的EU指数，其中当与亲本含Fc多肽相比较时，含Fc多肽具有降低的细胞毒性。在一个实施方案中，含Fc多肽包含突变F243A、V264A、S267E和L328F。
在一个实施方案中，亲本含Fc多肽包含天然Fc区。在另一个实施方案中，亲本含Fc多肽包含F243A突变。在另一个实施方案中，亲本含Fc多肽包含V264A突变。在另一个实施方案中，亲本含Fc多肽包含F243A/V264A突变。
治疗方法
本发明还包含治疗有此需要的受试者中的炎性状况的方法，其包括：给受试者施用治疗有效量的含Fc多肽，所述含Fc多肽包含在位置243、264、267和328上的突变，其中编号根据如Kabat中的EU指数。在一个实施方案中，含Fc多肽包含突变F243A、V264A、S267E和L328F。在一个实施方案中，含Fc多肽是包含SEQ ID NO:7的抗体片段。在另一个实施方案中，含Fc多肽是包含SEQ ID NO:8的抗体片段。在另一个实施方案中，本发明的含Fc多肽是包含SEQ ID NO:17的抗体片段。在另一个实施方案中，含Fc多肽是由SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:17组成(或基本上由其组成)的抗体片段。本发明的含Fc多肽可以通过任何途径施用。在一个实施方案中，含Fc多肽肠胃外施用。在一个实施方案中，含Fc多肽皮下施用。
在一个实施方案中，炎性状况是不需要的炎性免疫反应。
在一个实施方案中，炎性状况是自身免疫疾病。在一个实施方案中，炎性状况将是多发性硬化。在一个实施方案中，炎性状况是全身性红斑狼疮。在一个实施方案中，炎性状况是I型糖尿病。
在一个实施方案中，炎性状况是原发性免疫缺陷综合征，包括先天性无丙种球蛋白血症和低丙种球蛋白血症、普通变异型免疫缺陷、重症联合免疫缺陷或Wiskott-Aldrich综合征。
在一个实施方案中，炎性状况是继发性免疫缺陷综合征，包括B细胞淋巴细胞白血病、HIV感染或同种异体骨髓移植。
在一个实施方案中，炎性状况是特发性血小板减少性紫癜。
在一个实施方案中，炎性状况是多发性骨髓瘤。
在一个实施方案中，炎性状况是格巴二氏综合征。
在一个实施方案中，炎性状况是川崎病。
在一个实施方案中，炎性状况是慢性炎性脱髓鞘多神经病(CIDP)。
在一个实施方案中，炎性状况是自身免疫性嗜中性粒细胞减少症。
在一个实施方案中，炎性状况是溶血性贫血。
在一个实施方案中，炎性状况是抗因子VIII自身免疫疾病。
在一个实施方案中，炎性状况是多病灶性神经病。
在一个实施方案中，炎性状况是系统性脉管炎(ANCA阳性)。
在一个实施方案中，炎性状况是多肌炎。
在一个实施方案中，炎性状况是皮肌炎。
在一个实施方案中，炎性状况是抗磷脂综合征。
在一个实施方案中，炎性状况是败血症综合征。
在一个实施方案中，炎性状况是移植物抗宿主病。
在一个实施方案中，炎性状况是过敏症。
在一个实施方案中，炎性状况是抗猕猴因子D反应。
在一个实施方案中，炎性状况是全身性红斑狼疮(SLU)。
在一个实施方案中，炎性状况是心血管系统的炎性状况。本发明的含Fc多肽可以用于治疗动脉粥样硬化、动脉粥样硬化性血栓形成、冠状动脉高血压、急性冠脉综合征和心力衰竭，所有这些都与炎症相关。
在一个实施方案中，炎性状况是中枢神经系统的炎性状况。在另一个实施方案中，炎性状况将是外周神经系统的炎性状况。例如，本发明的含Fc多肽可以用于治疗例如阿尔茨海默氏病、肌萎缩侧索硬化(又名ALS；葛雷克氏症)、缺血性脑损伤、朊病毒疾病和HIV相关痴呆。
在一个实施方案中，炎性状况是胃肠道的炎性状况。例如，本发明的含Fc多肽可以用于治疗炎性肠病症例如克罗恩氏病、溃疡性结肠炎、乳糜泻和肠易激综合征。
在一个实施方案中，炎性状况是牛皮癣，特应性皮炎，关节炎，包括类风湿性关节炎、骨关节炎和牛皮癣关节炎。
在一个实施方案中，炎性状况是类固醇依赖性特应性皮炎。
在一个实施方案中，炎性状况是恶病质。
可以使用本发明的含Fc多肽治疗的其他炎性病症的例子还包括：寻常痤疮、哮喘、自身免疫疾病、慢性前列腺炎、肾小球肾炎、超敏反应、盆腔炎性疾病、再灌注损伤、结节病、移植排斥、脉管炎、间质性膀胱炎和肌病。
在一个实施方案中，本发明的含Fc多肽将以1 - 100毫克/千克体重之间的剂量施用。在一个实施方案中，本发明的含Fc多肽将以0.001 - 10毫克/千克体重之间的剂量施用。在一个实施方案中，本发明的含Fc多肽将以0.001 - 0.1毫克/千克体重之间的剂量施用。在一个实施方案中，本发明的含Fc多肽将以0.001 - 0.01毫克/千克体重之间的剂量施用。
药物制剂
本发明还包括包含本发明的含Fc多肽和药学可接受的载体的药物制剂。
在一个实施方案中，本发明涉及包含含Fc多肽的药物组合物，其中含Fc多肽上的至少70%的N-聚糖包含选自
Figure 949426DEST_PATH_IMAGE085
的寡糖结构，其中所述含Fc多肽包含在Fc区的氨基酸位置243、264、267和328上的突变，其中编号根据如Kabat中的EU指数。在一个实施方案中，突变是F243A/V264A/S267E/L328F。在一个实施方案中，含Fc多肽是包含SEQ ID NO:7的抗体片段。在另一个实施方案中，含Fc多肽是包含SEQ ID NO:8的抗体片段。在另一个实施方案中，本发明的含Fc多肽是包含SEQ ID NO:17的抗体片段。在另一个实施方案中，含Fc多肽是由SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:17组成(或基本上由其组成)的抗体片段。在一个实施方案中，至少47摩尔%的N-聚糖具有结构
Figure 447403DEST_PATH_IMAGE086
。在一个实施方案中，唾液酸化N-聚糖中的唾液酸残基经由α-2,6键连接。在一个实施方案中，唾液酸化N-聚糖中的唾液酸残基经由α-2,6键连接，并且不存在可检测水平的α-2,3连接的唾液酸。在一个实施方案中，唾液酸化N-聚糖将不含N-羟乙酰神经氨酸(NGNA)。
如本文利用的，术语“药学可接受的”意指由联邦或州政府的管理机构批准或在美国药典或其他一般公认的药典中列出的，用于在动物中和更具体而言在人中使用的，不干扰一种或多种活性成分的生物活性的有效性的无毒材料。术语“载体”指与治疗剂一起施用的稀释剂、佐剂、赋形剂或媒介物，且包括但不限于此类无菌液体例如水和油。载体的特征将取决于施用途径。
治疗和诊断试剂的药物制剂可以通过与可接受的载体、赋形剂或稳定剂混合，以例如冻干粉末、浆料、水溶液或悬浮液的形式进行制备(参见例如
Figure 766520DEST_PATH_IMAGE087
Figure 982738DEST_PATH_IMAGE088
Figure 927560DEST_PATH_IMAGE089
。
施用模式可以改变。合适的施用途径包括经口、经直肠、经粘膜、肠、肠胃外；肌内、皮下、皮内、髓内、鞘内、直接心室内、静脉内、腹膜内、鼻内、眼内、吸入、吹入、局部、皮肤、经皮或动脉内。
在特定实施方案中，本发明的含Fc多肽可以通过侵入性途径，例如通过注射，进行施用(参见上文)。在本发明的一些实施方案中，本发明的含Fc多肽或其药物组合物静脉内、皮下、肌内、动脉内、关节内(例如在关节炎关节内)、瘤内或通过吸入、气溶胶递送进行施用。通过非侵入性途径(例如经口；例如在丸剂、胶囊或片剂中)的施用也在本发明的范围内。
在特定实施方案中，本发明的含Fc多肽可以通过侵入性途径例如通过注射进行施用(参见上文)。在本发明的一些实施方案中，本发明的含Fc多肽或其药物组合物静脉内、皮下、肌内、动脉内、关节内(例如在关节炎关节内)、瘤内或通过吸入、气溶胶递送进行施用。通过非侵入性途径(例如经口；例如在丸剂、胶囊或片剂中)的施用也在本发明的范围内。
组合物可以用本领域已知的医学装置进行施用。例如，本发明的药物组合物可以通过注射用皮下针，包括例如预装注射器或自动注射器，进行施用。
本发明的药物组合物也可以用无针皮下注射装置进行施用，例如公开于美国专利号
Figure 280044DEST_PATH_IMAGE090
Figure 32712DEST_PATH_IMAGE091
或
Figure 470647DEST_PATH_IMAGE092
中的装置。
本发明的药物组合物也可以通过输注施用。众所周知的施用药物组合物的植入物和模块形式的例子包括：美国专利号4,487,603，其公开了用于以控制速率分配药物的可植入微量输注泵；美国专利号4,447,233，其公开了用于以精确输注速率递送药物的药疗法输注泵；美国专利号4,447,224，其公开了用于连续药物递送的可变流动可植入输注器；美国专利号4,439,196，其公开了具有多室区室的渗透药物递送系统。许多其他此类植入物、递送系统和模块是本领域技术人员众所周知的。
可替代地，可以以局部而不是全身方式施用抗体，例如经由抗体的注射直接进入关节炎关节内，通常在储存或持续释放制剂中。此外，可以在靶向药物递送系统中施用抗体，例如在由组织特异性抗体包被的脂质体中，靶向例如关节炎关节或特征在于免疫病理学的病原体诱导的损伤。脂质体将靶向至受累组织且由受累组织选择性吸收。
施用方案取决于几个因素，包括治疗抗体的血清或组织周转率、症状水平、治疗抗体的免疫原性、和靶细胞在生物基质中的可接受性。优选地，施用方案递送足够的治疗抗体，以实现靶疾病状态中的改善，而且同时使不期望的副作用降到最低。相应地，递送的生物剂的量部分取决于特定治疗抗体和待治疗状况的严重性。选择治疗抗体的合适剂量的指导是可获得的(参见例如
Figure 891264DEST_PATH_IMAGE093
Figure 426150DEST_PATH_IMAGE094
Figure 274021DEST_PATH_IMAGE095
。
合适剂量的确定由临床医生作出，例如使用本领域已知或怀疑影响治疗的参数或因素作出。一般地，剂量以略微低于最佳剂量的量开始，并且其后它通过小增量增加，直至达到相对于任何负面副作用的所需或最佳效应。重要的诊断量度包括例如炎症症状的量度或产生的炎性细胞因子的水平。优选地，将使用的生物剂衍生自与靶向用于治疗的动物相同的物种，从而使对试剂的任何免疫应答降到最低。在人受试者的情况下，例如，嵌合、人源化和全人的含Fc多肽是优选的。
含Fc多肽可以通过连续输注或通过例如每天、1-7次/周、每周、每两周、每月、每两个月、每季度、每半年、每年等施用的剂量提供。剂量可以例如静脉内、皮下、局部、经口、经鼻、经直肠、肌内、大脑内、脊柱内或通过吸入提供。周总剂量一般是至少0.05 μg/kg体重，更一般至少
Figure 236609DEST_PATH_IMAGE097
在其他实施方案中，本发明的含Fc多肽在每周、每两周、“每4周”、每月、每两个月或每季度基础上，以10、20、50、80、100、200、500、1000或2500 mg/kg受试者皮下或静脉内施用。
如本文使用的，术语“治疗有效量”、“治疗有效剂量”和“有效量”指本发明的含Fc多肽的量，当单独或与另外的治疗剂组合施用于细胞、组织或受试者时，所述量有效引起疾病或状况的一种或多种症状或此类疾病或状况的进展中的可测量改善。治疗有效剂量进一步指足以导致症状的至少部分改善的含Fc多肽的量，例如有关医学状况的治疗、治愈、预防或改善，或此类状况的治疗、治愈、预防或改善的速率增加。当应用于单独施用的个别活性成分时，治疗有效剂量指那种单独的成分。当应用于组合时，治疗有效剂量指，无论是连续的还是同时的组合施用，导致疗效的活性成分的组合量。治疗剂的有效量将导致诊断量度或参数至少10%；通常至少20%；优选至少约30%；更优选至少40%，和最优选至少50%的改善。在其中主观量度用于评估疾病严重性的情况下，有效量还可以导致主观量度中的改善。
实施例1
菌株和试剂
大肠杆菌菌株TOP10或DH5α(Invitrogen，CA)用于重组DNA工作。限制性核酸内切酶、DNA修饰酶和PNGase F得自New England Biolabs，Ipswich，MA。寡核苷酸由Integrated DNA Technologies，Coralville，IA定购。
实施例2
IgG1 Fc突变蛋白和巴斯德毕赤酵母重组表达载体的构建
1F11 IgG1单克隆抗体的双重和四重Fc突变蛋白在巴斯德毕赤酵母中的制备使用下文列出的序列和方案执行。
A. 重链和轻链
用于制备野生型(亲本)1F11单克隆IgG1抗体的重链和轻链序列，分别为SEQ ID NOS: 1和2，如下所示。用于制备1F11双重突变蛋白抗体的重链序列在SEQ ID NO:3中显示。用于制备1F11四重突变蛋白抗体的重链序列在SEQ ID NO:4中显示。对于所有抗体的所有轻链序列是相同的。根据巴斯德毕赤酵母密码子使用，对重链和轻链进行密码子最佳化，并且由GenScript USA Inc. 860 Centennial Ave. Piscataway，NJ 08854.合成。
B. 信号序列
α-交配因子前结构域的信号序列通过PCR融合，在框内融合至轻或重链的5'末端。序列如上所述进行密码子最佳化。将Kozak序列AAACG加入甲硫氨酸的5'末端，并且将EcoR1位点加入Kozak序列前用于克隆目的。DNA序列(SEQ ID NO: 5)和氨基酸(SEQ ID NO: 6)翻译如下所示。
C. 用于表达IgG1和IgG1 Fc突变蛋白的重组质粒
IgG1及其突变蛋白的具有融合信号序列的重链和轻链分别克隆在巴斯德毕赤酵母AOX1启动子下并在酿酒酵母Cyc终止子前。完全重链和轻链的表达盒一起放入最终表达载体内。通过用Spe1将载体线性化并靶向整合到Trp2位点内，实现至巴斯德毕赤酵母内的基因组插入。
本文使用的质粒概括在下表1中给出。用于1F11四重Fc突变蛋白的最终表达质粒的图示在图1中显示。
表1
质粒 描述
pGLY9535 野生型IgG1表达质粒中的1F11
pGLY9543 IgG1 F243A/V264A双重突变蛋白表达质粒中的1F11
pGLY8068 IgG1 F243A/V264A/S267E/L328F 四重突变蛋白表达质粒中的1F11
实施例3
用于生产1F11及其Fc突变蛋白的糖工程化的毕赤酵母属GFI5.0和GFI6.0宿主
在本发明中应用两种不同的糖工程化的毕赤酵母属宿主，GFI5.0和GFI 6.0。遵循公开于Gerngross，US 7,029,872和Gerngross，US 7,449,308中的程序，可以构建对于遗传工程化低等真核宿主细胞有用的载体，从而使得它们能够表达具有以所需N-糖形作为占优势种类的所需多肽。根据Hamilton等人，Science，313: 1441-1443(2006)和Hamilton US 2006/0286637中所述的方法，由NRRL11430(美国典型培养物中心(ATCC)，P.O. Box 1549，Manassas，VA 20108，USA)工程化GFI 5.0和GFI6.0菌株。工程化的巴斯德毕赤酵母菌株GFI5.0能够生产具有末端半乳糖的双天线N-聚糖结构的蛋白质。本文使用的GFI5.0菌株YGLY17108的基因型如下：
Figure 910352DEST_PATH_IMAGE099
Figure 898348DEST_PATH_IMAGE101
。工程化的巴斯德毕赤酵母菌株GFI 6.0，YGLY17159的基因型如下：
Figure 79931DEST_PATH_IMAGE102
Figure 497323DEST_PATH_IMAGE104
。YGLY17159能够生产具有双天线N-聚糖结构的蛋白质，在所述双天线N-聚糖结构上末端α 2,6连接的唾液酸连接至半乳糖。
用于描述基因型的缩写是本领域技术人员通常已知且理解的，并且包括下述缩写：
ScSUC2 酿酒酵母转化酶
OCH1 α-1,6-甘露糖基转移酶
KlMNN2-2 乳酸克鲁维酵母UDP-GlcNAc转运蛋白
BMT1 β-甘露糖-转移(β-甘露糖消除)
BMT2 β-甘露糖-转移(β-甘露糖消除)
BMT3 β-甘露糖-转移(β-甘露糖消除)
BMT4 β-甘露糖-转移(β-甘露糖消除)
MNN4L1 MNN4-样1(电荷消除)
MmSLC35A3 UDP-GlcNAc转运蛋白的小鼠同系物
PNO1 N-聚糖的磷酸甘露糖基化(电荷消除)
MNN4 甘露糖基转移酶(电荷消除)
ScGAL10 UDP-葡萄糖 4-差向异构酶
XB33 融合至ScKRE2前导区的截短的HsGalT1
DmUGT UDP-半乳糖转运蛋白
KD53 融合至ScMNN2前导区的截短的DmMNSII
TC54 融合至ScMNN2前导区的截短的RnGNTII
NA10 融合至PpSEC12前导区的截短的HsGNTI
FB8 融合至ScSEC12前导区的截短的MmMNS1A
TrMDS1 分泌的里氏木霉MNS1
ADE1 N-琥珀酰-5-氨基咪唑-4-甲酰胺核糖核苷酸(SAICAR)合成酶
MmCST 小鼠CMP-唾液酸转运蛋白
HsGNE 人UDP-GlcNAc 2-差向异构酶/N-乙酰基甘露糖胺激酶
HsCSS 人CMP-唾液酸合酶
HsSPS 人N-乙酰神经氨酸-9-磷酸合酶
MmST6-33 融合至ScKRE2前导区的截短的小鼠α-2,6-唾液酸转移酶
LmSTT3d 来自硕大利什曼原虫(Leishmania major)的寡糖基转移酶的催化亚基。
实施例4
酵母转化和筛选
糖工程化的GFI5.0和GS6.0菌株在富含YPD的培养基(酵母提取物1%、蛋白胨2%和2%右旋糖)中生长，通过离心在对数期中收获，并且用冰冷的1 M山梨糖醇洗涤三次。使一至五μg Spe1消化的质粒与感受态酵母细胞混合，并且使用Bio-Rad Gene Pulser XcellTM(Bio-Rad，2000 Alfred Nobel Drive，Hercules，CA 94547)预设置的巴斯德毕赤酵母电穿孔程序进行电穿孔。在24℃下在复苏丰富培养基中一小时后，将细胞在含有300 μg/ml博莱霉素的最小右旋糖培养基(1.34%YNB、0.0004%生物素、2%右旋糖、1.5%琼脂)平板上铺平板，并且在24℃下孵育直至转化体出现。
为了筛选高滴度菌株，将96个转化体接种在缓冲甘油-复合培养基(BMGY)中，并且生长72小时，随后在缓冲甲醇-复合培养基(BMMY)中诱导24小时。抗体的分泌通过如下的蛋白A珠测定进行评估。将来自96孔板培养物的50微升上清液用50 mM Tris pH 8.5在非结合的96孔测定板中1:1稀释。对于每块96孔板，将2 ml磁性BioMag蛋白A悬浮液珠(Qiagen，Valencia，CA)置于保持在磁架中的管中。在2-3分钟后，当珠收集至管侧面时，将缓冲液倾出。将珠用等于原始体积的体积的洗涤缓冲液(100 mM Tris、150 mM NaCl，pH 7.0)洗涤三次，并且重悬浮于相同洗涤缓冲液中。将20 μl珠加入含有稀释样品的测定板的每个孔中。将板覆盖，轻轻涡旋且随后在室温下孵育1小时，同时每15分钟涡旋。在孵育后，将样品板放在磁性板上，所述磁性板诱导珠以收集到每个孔的一个侧面。在Biomek NX Liquid Handler(Beckman Coulter，Fullerton，CA)上，将来自板的上清液移至废物容器。随后将样品板从磁体中取出，并且将珠用100 μl洗涤缓冲液洗涤。将板再次置于磁体上，然后，通过抽吸去除洗涤缓冲液。将20 μl加样缓冲液(含有25 mM NEM的Invitrogen E-PAGE凝胶加样缓冲液(Pierce，Rockford，IL))加入每个孔中，并且将板轻轻涡旋。在Beckman Allegra 6离心机上以500 rpm离心后，将样品在99℃下孵育五分钟，并且随后在E-PAGE高通量预制凝胶(Invitrogen，Carlsbad，CA)上运行。将凝胶用凝胶染色液(0.5 g考马斯G250亮蓝、40%MeOH、7.5%乙酸)覆盖，在微波中加热35秒，并且随后在室温下孵育30分钟。凝胶在蒸馏水中脱色过夜。选择高滴度菌落用于实施例5中详细描述的进一步Sixfors发酵筛选。IgG1野生型和Fc突变蛋白生产菌株的概括在下表2中给出。
表2
Figure 63433DEST_PATH_IMAGE105
实施例5
在摇瓶中的抗体生产
菌株在具有300ml 2%BMGY培养基的500ml摇瓶中培养，并且在24℃下振荡3天。
用于摇瓶诱导的方案：将每个培养物的总体积(300ml)收集到falcon管中，并且以2500 rpm旋转5分钟。倾去上清液，并且将细胞团块在150ml 2%BMMY和360ul PMTi4(原液浓度0.65mg/ml)的最终体积中重悬浮。转移至新鲜的500ml摇瓶且在24℃下振荡2天。旋下经诱导的培养物且将上清液收集到新鲜的falcon管内。
分泌的抗体通过蛋白A柱使用GE Healthcare，STREAMLINE rProtein A(目录号17-1281-01)和BioRad poly-prep层析柱(10ml)(目录号731-1550)进行纯化。使用下述缓冲液：
· 洗涤缓冲液#1：20mM Tris pH 7.0，1M NaCl
· 洗涤缓冲液#2：20mM Tris pH 7.0
· 中和缓冲液：1M Tris pH 8.0- pH 9.0
· 洗脱缓冲液：100 mM或50 mM柠檬酸钠pH 3.0
· 清洁液：6M尿素水溶液。
纯化方案如下：
· 将500ul STREAMLINE rProtein A珠加入每个BioRad柱。珠应在20%乙醇中。珠浆料的组成应是50%珠、50%液体。
· 一旦蛋白A珠在柱中，它们就应用5mls洗涤缓冲液#2 洗涤(弃去流通物)
· 将10mls上清液加入BioRad柱中。在这个步骤期间，抗体将与蛋白A珠结合(弃去流通物)
· 通过将5mls洗涤缓冲液#1加入柱，洗掉不需要的过量蛋白质(弃去流通物)
· 通过加入5mls洗涤缓冲液#2 再次洗柱(弃去流通物)
· 将1ml中和缓冲液加入15ml蛋白质收集管中。
· 将BioRad柱置于15ml收集管中。
· 将3mls洗脱缓冲液加入BioRad柱。这将从蛋白A珠取出所需的抗体。
· 将洗脱的蛋白质收集在15ml蛋白质收集管中。
· 通过Bradford测定法来测定洗脱蛋白质的浓度(使用10ul蛋白质用于Bradford测定法)。
实施例6
通过HPLC 的N联聚糖分析
为了定量每个糖形的相对量，将N-糖苷酶F释放的聚糖用2-氨基联苯胺(2-AB)标记，并且通过HPLC分析，如Choi等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100: 5022-5027(2003)和Hamilton等人，Science313: 1441-1443(2006)中描述的。表2显示在GFI 6.0宿主中的双重突变蛋白和四重突变蛋白表达和在GFI 5.0宿主中的1F11 IgG1的聚糖概况。这些菌株在摇瓶中培养。结果显示于表2中。
表2. 1F11 IgG1、IgG1双重突变蛋白和IgG1四重突变蛋白的聚糖概况
Figure 912572DEST_PATH_IMAGE106
实施例7
FcγR结合测定
Fcγ受体结合测定如所述的(Shields,等人(2001)J. Biol. Chem. 276:6591-6604)执行，伴随较少改变。高蛋白质结合96孔板(Corning Costar)用100μL/孔的Fcγ受体PBS溶液以下述浓度包被：1μg/mL用于FcγRI(R&D Systems)和FcγRIIa(巴斯德毕赤酵母生产的)两者，2μg/mL用于FcγRIIb(巴斯德毕赤酵母生产的)，0.8μg/mL用于FcγRIIIa-F158，和0.4μg/mL用于FcγRIIIa-V158(两个都是巴斯德毕赤酵母生产的)。所有巴斯德毕赤酵母生产的受体都如所述的(Li,等人(2006)Nature Biotechnology 24:210-215)进行表达且纯化。加入FcγRI板中的单体抗体样品在测定稀释剂(1x PBS、1%BSA和0.05%Tween20)中连续稀释，并且将100μL/孔加入板中。对于剩余受体制备的抗体样品需要一小时与一半摩尔比例的缀合至用于检测的碱性磷酸酶的山羊抗人IgG F(ab')2 F(ab')2的二聚化步骤。这些二聚化的F(ab')2/抗体复合物也是系列稀释的，并且将100μL/孔加入剩余受体板中，并且所有板都在室温下孵育一小时。使用相同的山羊抗人IgG F(ab')2碱性磷酸酶缀合的F(ab')2检测FcγRI结合的样品抗体。在孵育18小时后，使用SuperPhos，4-MUP Fluorescence AP Substrate Detection System(Virolabs)，通过测量在340nm处的激发和在465nm处的发射来定量样品抗体结合。
结果显示于表3-7中。每个表格代表单个实验的结果。表3中呈现的数据的图示见于图3中。表4中呈现的数据的图示见于图4中。表5中呈现的数据的图示见于图5中。表6中呈现的数据的图示见于图6中。表7中呈现的数据的图示见于图7中。
表3. IC50比较表
Figure 538725DEST_PATH_IMAGE107
表4. IC50比较表
表5. IC50比较表
Figure 92383DEST_PATH_IMAGE109
表6. IC50比较表
Figure 82115DEST_PATH_IMAGE110
表7. IC50比较表
Figure 879170DEST_PATH_IMAGE111
表8概括当与在GS 5.0中生产的野生型亲本抗体相比较时，与多个受体的结合中的相对降低。这个数据也呈现于图8中。
表8.
实施例8
抗原亲和力测定
本发明的抗PCSK9抗体的结合亲和力在具有羧甲基化右旋糖酐(CM5，目录# BR-1006-68)芯片的Biacore T100仪器上进行测量，其中1x HBS-EP+(10mM HEPES、150mM NaCl、3mM EDTA和0.05%表面活性剂P20)作为运行缓冲液。根据Biacore Human Antibody Capture Kit(目录# BR-1008-39)，将CM5芯片在具有小鼠抗人IgG(Fc特异性的)的所有流动池上固定至~7000RU。抗PCSK9抗体在芯片上捕获至~500RU，随后为野生型人PCSK9从64.1nM到2.0nM的分析物注射。每个流动池在每次分析物注射之间用3M MgCl以10uL/分钟再生40秒。数据用Biacore T100 Evaluation Software使用1:1结合模型进行分析，使用至少5点浓度范围传感图。
如表9中所示，关于通过本文的材料与方法制备的多种抗PCSK9抗体的抗原亲和力是相似的。
表9.
Figure 723815DEST_PATH_IMAGE113
实施例9
另外的IgG1 Fc突变蛋白的构建、表达和表征
另外的Fc突变蛋白(表10)根据实施例2的方法进行构建。
表10.
Figure 547546DEST_PATH_IMAGE114
表10中所述含有Fc突变蛋白的表达载体转化到糖工程化的巴斯德毕赤酵母菌株YGLY22834(GFI6.0)中，所述菌株能够将α2,6 唾液酸添加到双天线的半乳糖基化聚糖(G2)上。使用的YGLY22834菌株的基因型如下：
Figure 515502DEST_PATH_IMAGE115
Figure 611634DEST_PATH_IMAGE116
Figure 119975DEST_PATH_IMAGE117
。
Fc突变蛋白抗体如实施例4-5中所示产生且纯化。
本文产生的Fc突变蛋白的糖基化通过如实施例6中所述的HPLC进行定量，并且结果显示于表11中。
表11. 表10中所述的Fc突变蛋白的聚糖概况
Figure 63792DEST_PATH_IMAGE118
这些Fc突变蛋白针对多个FcγRs的亲和力如实施例7中所述进行测量，并且结果显示于表12和13中。
鉴定为“抗TNF IgG1 GS5”的样品指在重组巴斯德毕赤酵母菌株GFI 5.0中生产的，包含SEQ ID NO:15的重链和SEQ ID NO:13的轻链的抗体。
鉴定为“1F11 IgG1 GS5.0”的样品指在重组巴斯德毕赤酵母菌株GFI 5.0中生产的，包含SEQ ID NO:1的重链和SEQ ID NO:2的轻链的抗体。
鉴定为“抗TNF DM”的样品指在重组巴斯德毕赤酵母菌株YGLY22834(GFI6.0)中生产的，包含SEQ ID NO:16的重链和SEQ ID NO:13的轻链的抗体。
鉴定为“1F11 DM”的样品指在重组巴斯德毕赤酵母菌株YGLY22834(GFI6.0)中生产的，包含SEQ ID NO:3的重链和SEQ ID NO:2的轻链的抗体。
鉴定为“人IgG Fc DM”或“hFC DM”的样品指根据上述方法，在重组巴斯德毕赤酵母菌株YGLY22834(GFI6.0)中生产的，包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列的多肽。
表12.
Figure 202649DEST_PATH_IMAGE119
n = 3
* 注–报道为大于 ~5000nM 的任何值都应解释为弱结合剂而不是依赖实际值，因为这些值显著地在测试浓度范围外。
表13.
Figure 848394DEST_PATH_IMAGE120
实施例10
Fc突变蛋白在免疫血小板减少症(“ITP”)模型中的效应
动物：十四(14)周龄C57BL/6雌性小鼠得自Taconic Farms。
模型诱导：在第0天时，将小鼠通过静脉内(iv)输注用表14中列出的试剂给药。在24小时后，用得自BD Biosystems的2 µg 抗CD41抗体(MWReg30)的iv给药诱导ITP。在ITP诱导后二十四(24)小时，使用ITP血细胞分析仪对全血样品进行血小板计数。
表14.
所有组n=4。
材料
鉴定为“hFC DM唾液酸化的”样品指在重组巴斯德毕赤酵母菌株YGLY22834(GFI6.0)中生产的包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列的多肽。
鉴定为“hFC DM去唾液酸化的”样品指在重组巴斯德毕赤酵母菌株YGLY22834 (GFI6.0)中生产的包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列的多肽，其随后在体外用神经氨酸酶处理，以产生去唾液酸化形式的具有末端半乳糖的蛋白质。
鉴定为“hFC QM唾液酸化的”样品指在重组巴斯德毕赤酵母菌株YGLY22834 (GFI6.0)中生产的包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列的多肽。
鉴定为“hFC QM去唾液酸化的”样品指在重组巴斯德毕赤酵母菌株YGLY22834 (GFI6.0)中生产的包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列的多肽，其随后在体外用神经氨酸酶处理，以产生去唾液酸化形式的具有末端半乳糖的蛋白质。
在所有情况下，巴斯德毕赤酵母菌株的培养在15 L玻璃生物反应器中执行。简言之，两个含有500 mL BSGY培养基(4%甘油、1%酵母提取物、2%大豆胨、100 mM磷酸钾缓冲液、pH 6.5、100 mM D-山梨糖醇、1.34%酵母氮源和4×10−5%生物素)的3 L带有挡板的种子烧瓶用在琼脂平板上生长的酵母块进行接种。烧瓶在24℃和180 rpm下孵育48小时，以确保当细胞以10%体积比转移至含有BSGY培养基的生物反应器时的指数生长。温度控制在24℃，pH用28%氢氧化铵控制在6.5，并且通过将气流速度固定在0.7 vvm和级联搅动，将溶解氧(dissolved oxygen，DO)在大气压和24℃下维持在20%饱和。起始40 g L− 1甘油的耗尽通过摄氧率(oxygen uptake rate，OUR，以mmol L− 1 h− 1表示)中的快速下降进行检测，并且随后为指数的50%甘油补料，以5.3 g L− 1 h− 1起始并且以0.08 h− 1的速率指数增加。在8小时的甘油分批补料期后，起始在氧限制环境下的甲醇诱导。将DO级联关闭，并且搅动设为460 rpm的给定值，以达到20-25 mmol/L/小时的OUR。在DO降低至小于1%后，首先递送100%甲醇的1%(w/v)推注冲击。所有后续甲醇1%(w/v)推注冲击通过指示甲醇耗尽的DO的快速增加而触发。
样品("hFC DM唾液酸化的"、"hFC DM去唾液酸化的"、"hFC QM唾液酸化的"和"hFC QM唾液酸化的")使用MabSelect(来自GE Healthcare Life Sciences)进行纯化。
"hFC DM唾液酸化的"和"hFC QM唾液酸化的"样品的N-聚糖分析通过HPLC进行测定，并且具有下述N-聚糖特征：
Figure 83383DEST_PATH_IMAGE122
GAMMAGARD得自Baxter Healthcare。
GAMMUNEX得自Talecris Biotherapeutics Inc。
样品“ITP对照”是得自BD Biosystems的抗CD41抗体(MWReg30)。
结果
获得的血小板值(K/ µL)在表15中列出且在图9中标绘。通过单向Anova分析，hFc DM唾液酸化的和hFc QM唾液酸化的显示统计上显著的免于ITP的保护。
Figure 206191DEST_PATH_IMAGE123
Figure 276915DEST_PATH_IMAGE124
Figure 392639DEST_PATH_IMAGE125
Figure 232419DEST_PATH_IMAGE126
Figure 523198DEST_PATH_IMAGE127
Figure 735054DEST_PATH_IMAGE129
虽然在本文中参考说明性实施方案描述了本发明，但应当理解本发明并不限于此。具有本领域普通技术且有权使用本文教导的人员将认识到在其范围内的另外改变和实施方案。
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Claims (21)

1.含Fc多肽，其包含在所述Fc区的氨基酸位置243、264、267和328上的突变，其中所述编号根据如Kabat中的EU指数。
2.权利要求1的含Fc多肽，其中所述突变是F243A、V264A、S267E和L328F。
3.权利要求1的含Fc多肽，其包含SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:17的氨基酸序列。
4.权利要求1的含Fc多肽，其中所述含Fc多肽是包含唾液酸化的N-聚糖的抗体或抗体片段，其中所述唾液酸化的N-聚糖中的唾液酸残基经由α-2,6键连接。
5.权利要求1的含Fc多肽，其中所述含Fc多肽是包含唾液酸化的N-聚糖的抗体或抗体片段，其中所述唾液酸化的N-聚糖包含选自SA(1-4)Gal(1-4)GlcNAc(2-4)Man3GlcNAc2或SAGalGlcNAcMan5GlcNAc2的结构，其中所述唾液酸残基经由α-2,6键连接。
6.权利要求1的含Fc多肽，其中当与亲本含Fc多肽相比较时，所述含Fc多肽具有下述性质中的一种或多种：
a) 减少的效应子功能；
b) 增加的抗炎性质；
c) 增加的与凝集素(例如CD22(Siglec 2))的结合；
d) 减少的与FcγRIIa的结合；
e) 增加的与FcγRIIb的结合；
f) 减少的与FcγRIIIa的结合；
g) 减少的与FcγRIIIb的结合。
7.用于在宿主细胞中生产含Fc多肽的方法，其包括：
a) 提供已遗传工程化以产生含Fc多肽的细胞，其中所述宿主细胞包含编码在所述Fc区的氨基酸位置243、264、267和328上的突变的核酸，其中所述编号根据如Kabat中的EU指数；
b) 在引起所述含Fc多肽表达的条件下培养所述宿主细胞；和
c) 从所述宿主细胞中分离所述含Fc多肽。
8.权利要求7的方法，其中所述核酸编码突变F243A、V264A、S267E和L328F。
9.权利要求7的方法，其中所述含Fc多肽包含SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:17的氨基酸序列。
10.权利要求7的方法，其中所述含Fc多肽是包含唾液酸化的N-聚糖的抗体或抗体片段，其中所述唾液酸化的N-聚糖经由α-2,6键连接。
11.权利要求10的方法，其中所述含Fc多肽具有这样的N-聚糖组成，其中总唾液酸化的N-聚糖的量和百分比相对于亲本含Fc多肽是增加的。
12.权利要求7的方法，其中所述含Fc多肽是包含唾液酸化的N-聚糖的抗体或抗体片段，其中所述唾液酸化的N-聚糖包含选自SA(1-4)Gal(1-4)GlcNAc(2-4)Man3GlcNAc2或SAGalGlcNAcMan5GlcNAc2的结构，其中所述唾液酸残基经由α-2,6键连接。
13.权利要求7的方法，其中当与亲本含Fc多肽相比较时，所述含Fc多肽具有下述性质中的至少一种：
a) 减少的效应子功能；
b) 增加的抗炎性质；
c) 增加的与凝集素(例如CD22(Siglec 2))的结合；
d) 减少的与FcγRIIa的结合；
e) 增加的与FcγRIIb的结合；
f) 减少的与FcγRIIIa的结合；和
g) 减少的与FcγRIIIb的结合。
14.增加含Fc多肽的抗炎性质或降低含Fc多肽的细胞毒性的方法，其包括在所述Fc区的位置243、264、267和328上引入突变，其中所述编号根据如Kabat中的EU指数；
其中当与亲本含Fc多肽相比较时，所述含Fc多肽具有增加的抗炎性质或降低的细胞毒性。
15.权利要求14的方法，其中所述突变是F243A、V264A、S267E和L328F。
16.权利要求14的方法，其中所述含Fc多肽包含SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:17的氨基酸序列。
17.权利要求14的方法，其中所述含Fc多肽是包含唾液酸化的N-聚糖的抗体或抗体片段，其中所述唾液酸化的N-聚糖包含选自SA(1-4)Gal(1-4)GlcNAc(2-4)Man3GlcNAc2或SAGalGlcNAcMan5GlcNAc2的结构，其中所述唾液酸残基经由α-2,6键连接。
18.治疗有此需要的受试者中的炎性状况的方法，其包括：给所述受试者施用治疗有效量的含Fc多肽，所述含Fc多肽包含在所述Fc区的位置243和264上的突变，其中所述编号根据如Kabat中的EU指数。
19.权利要求18的方法，其中所述突变是F243A、V264A、S267E和L328F。
20.权利要求18的方法，其中所述含Fc多肽包含SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:17的氨基酸序列。
21.权利要求18的方法，其中所述含Fc多肽是包含唾液酸化的N-聚糖的抗体或抗体片段，其中所述唾液酸化的N-聚糖包含选自SA(1-4)Gal(1-4)GlcNAc(2-4)Man3GlcNAc2或SAGalGlcNAcMan5GlcNAc2的结构，其中所述唾液酸残基经由α-2,6键连接。
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