TW201817745A - 具有促進抗原清除之ＦｃＲｎ結合域的治療性抗原結合分子 - Google Patents

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Abstract

本發明提供：於中性pH對於Fc新生兒受體(FcRn)具有增強的親和性之經改質FcRn結合域；包含上述FcRn結合域之抗原結合分子，其具有低免疫原性、高安定性以及僅形成少數凝集物；於中性或酸性pH具有增加的FcRn結合活性而於中性pH對於預存在之抗藥物抗體無增加的結合活性之經改質之抗原結合分子；上述抗原結合分子用於改良抗原結合分子媒介之抗原攝入至細胞的用途；上述抗原分子用於減少特定抗原之血漿濃度的用途；上述經改質之FcRn結合域用於增加抗原對可於其降解之前結合之單一抗原結合分子的總數的用途；上述經改質FcRn結合域用於改良抗原結合分子之藥物動力學的用途；用於降低對於預存在之抗藥抗體的結合活性的方法；以及用於製造上述抗原結合分子的方法。

Description

具有促進抗原清除之FcRn結合域的治療性抗原結合分子
本發明關於於中性pH對於Fc新生兒受體(FcRn)具有增強的親和性之經改質FcRn結合域；包含上述FcRn結合域之抗原結合分子，其具有低免疫原性、高安定性以及僅形成少數凝集物；於中性或酸性pH具有增加的FcRn結合活性而於中性pH對於預存在之抗藥物抗體無增加的結合活性之經改質之抗原結合分子；上述抗原結合分子用於改良抗原結合分子媒介之抗原攝入至細胞的用途；上述抗原分子用於減少特定抗原之血漿濃度的用途；上述經改質之FcRn結合域用於增加抗原對可於其降解之前結合之單一抗原結合分子的總數的用途；上述經改質之FcRn結合域用於改良抗原結合分子之藥物動力學的用途；用於降低對於預存在之抗藥抗體的結合活性的方法；以及用於製造上述抗原結合分子的方法。
由於血漿中的高安定性以及少的副作用，為數增加中的抗體使用作為醫藥。標靶抗原之傳統抗體於注射後，結合患者血漿中的抗原，然後安定地持續呈抗體-抗原複合物之 形式直至降解。雖然典型的抗體一般具有長的半衰期(1至3週)，然而抗原具有少於一日的相對短的半衰期。具有抗體之複合物中的抗原因此相較於抗原單獨具有顯著較長的半衰期。結果，於傳統抗體注射後，抗原濃度傾向增加。該等案例已被報導於標靶各種可溶抗原之抗體，該等抗原例如IL-6(J Immunotoxicol.2005,3,131-9.(NPL 1))、β澱粉樣蛋白(MAbs.2010 Sep-Oct；2(5)：576-88(NPL 2))、MCP-1(ARTHRITIS & RHEUMATISM 2006,54,2387-92(NPL 3))、鐵調素(AAPS J.2010,12(4)：646-57.(NPL 4))及sIL-6受體(Blood.2008 Nov 15；112(10)：3959-64.(NPL 5))。受體已被描述由抗體投藥時之基線增加約10至1000倍(取決於抗原而定)之總血漿抗原濃度。
由於該等總血漿抗原濃度的增加非所欲者，已開發藉由治療性抗體用以移除抗原的方案。該些方案之一為使用對於新生兒Fc受體之IgG(FcRn)具有增加的結合親和性之pH-依賴性抗原結合抗體以快速地設置抗原(參照，例如PCT申請案PCT/JP2011/001888(PTL 1))。該FcRn為被發現於許多細胞之膜的蛋白質。於中性pH對FcRn具有增加的結合或性之抗體將於細胞表面結合FcRn，藉此具有抗體之該受體將於囊泡中內化至細胞中。由於囊泡內部的pH逐漸降低，抗原將由pH-依賴性抗原結合抗體解離，起因於其在酸性的低親和性。然後經解離的抗原降解而FcRn與所結合抗體於降解前循環回至細胞表面。因此，於中性pH對於FcRn具有增加的結合活性之pH-依賴性抗原結合抗體可用於自血漿移除抗原以及降低其於 血漿之濃度。
先前的研究已顯示Fc-工程學以於酸性pH增加對FcRn的結合親和性亦可改良內體循環效率以及抗體的藥物動力學。例如，M252Y/S254T/T256E(YTE)變異體(J Biol Chem,2006,281：23514-23524.(NPL 6))、M428L/N434S(LS)變異體(Nat Biotechnol,201028：157-159.(NPL 7))、T250Q/M428L(J Immunol.2006,176(1)：346-56.(NPL 8))及N434H變異體(Clinical Pharmacology & Therapeutics(2011)89(2)：283-290.(NPL 9))相對於天然的IgG1顯示半衰期的改良。
然而，該等取代亦具有改變抗體性質的風險，該等性質例如抗體安定性、免疫原性、凝聚行為與對於預先存在之抗體(例如類風濕性因子)的結合親和性，對於治療性抗體的開發為重要者。因此，本發明之主要目標係提供經改質FcRn結合域，其不僅增加抗體之清除也符合開發治療性抗原-結合分子的標準。該等開發標準特別地為高安定性、低免疫原性、低凝聚百分比及對於預先存在之抗藥物抗體(ADA)之低結合親和性。
相關於本發明之先前技術文獻示於下文。所有文獻皆以參考方式併入本文。
[先前文獻] [專利文獻]
[PTL 1] PCT/JP2011/00188(WO/2011/122011), ANTIGEN-BINDING MOLECULES THAT PROMOTE ANTIGEN CLEARANCE
[非專利文獻]
[NPL 1] Martin PL, Cornacoff J, Prabhakar U, Lohr T, Treacy G, Sutherland JE, Hersey S, Martin E; Reviews Preclinical Safety and Immune-Modulating Effects of Therapeutic單株抗體to Interleukin-6 and Tumor Necrosis Factor-α in Cynomolgus Macaques; J Immunotoxicol. 2005, 3, 131-9
[NPL 2] Davda JP, Hansen RJ.; Properties of a general PK/PD model of抗體-ligand interactions for therapeutic抗體that bind to soluble endogenous targets; MAbs. 2010 Sep-Oct; 2(5): 576-88.
[NPL 3] Haringman JJ, Gerlag DM, Smeets TJ, Baeten D, van den Bosch F, Bresnihan B, Breedveld FC, Dinant HJ, Legay F, Gram H, Loetscher P, Schmouder R, Woodworth T, Tak PP.; A randomized controlled trial with an抗-CCL2(抗-monocyte chemotactic protein 1)單株antibody in patients with rheumatoid arthritis; ARTHRITIS and RHEUMATISM 2006, 54,2387-92.
[NPL 4] Xiao JJ, Krzyzanski W, Wang YM, Li H, Rose MJ, Ma M, Wu Y, Hinkle B, Perez-Ruixo JJ.; Pharmacokinetics of anti-hepcidin單株antibody Ab 12B9m and hepcidin in cynomolgus monkeys.; AAPS J. 2010, 12(4), 646-57.)
[NPL 5] Nishimoto N, Terao K, Mima T, Nakahara H, Takagi N, Kakehi T.; Mechanisms and pathologic significances in increase in serum interleukin-6(IL-6) and soluble IL-6受體after administration of an anti-IL-6受體antibody, tocilizumab, in patients with rheumatoid arthritis and Castleman disease; Blood. 2008 Nov 15; 112(10): 3959-64.
[NPL 6] J Biol Chem, 2006, 281: 23514-23524
[NPL 7] Nat Biotechnol, 2010 28: 157-159
[NPL 8] J Immunol. 2006, 176(1): 346-56
[NPL 9] Clinical Pharmacology & Therapeutics(2011) 89(2): 283-290
本發明係由上述條件的觀點思考。本發明的目的係提供將改質的FcRn-結合域，其於中性pH對於FcRn具有增強的親和性；包含該FcRn-結合域之抗原結合分子，其中該抗原-結合分子具有低免疫原性、高安定性且僅形成少數凝聚物；經改質的抗原-結合分子，於中性或酸性pH具有增加的FcRn-結合活性而於中性pH對於預先存在的抗藥物抗體具有增加的結合活性；抗原-結合分子的用途，用以改良抗原-結合分子媒介之抗原攝入細胞；抗原-結合分子的用途，用以降低特定抗原之血漿濃度；經改質FcRn-結合域之用途，用以增加於其降解之前可結合之單一抗原-結合分子之抗原總數；經改質FcRn-結合域之用途，用以改良抗原-結合分子之藥物動力學；以及用以製造抗原-結合分子的方法。
本發明對於經改質FcRn-結合域進行詳細研究，該域於中性pH對於FcRn具有增強的親和性，以及對於抗原-結合分子進行詳細研究，該抗原-結合分子包含該FcRn-結合域，其具有低免疫原性、高安定性且僅形成少數凝聚物。其結果，本發明人發現於FcRn-結核域特定位置之取代，於中性pH增加對FcRn的親和性而無實質上地增加免疫原性、無實質上地降低安定性及/或無實質上地增加高分子量物種的比例。
再者，本發明人對於經改質FcRn-結合域進行詳細研究，該節和域於中性pH或酸性pH對於FcRn具有增強的親和性而對於預先存在之抗藥物抗體無顯著增加的結合活性，以及對於包含該FcRn-結合域之抗原結合分子進行詳細研究。其結果，本發明人發現於FcRn-結合域特定位置之取代，於中性pH降低對於預先存在抗藥物抗體的親和性而無實質上地降低FcRn-結合活性。
具體地，本發明係關於下述者：
[1]一種抗原-結合分子，包含經改質FcRn結合域，其中該經改質FcRn結合域包含於選自下列所成群組之一個或多個位置之胺基酸取代：EU238、EU250、EU252、EU254、EU255、EU258、EU286、EU307、EU308、EU309、EU311、EU315、EU428、EU433、EU434及EU436，其中該數字顯示根據EU編號之取代位置。
[2]如[1]所述之抗原-結合分子，其中該FcRn結合域具有胺基酸於位置EU252及EU434之胺基酸取代；以及於選自下列所成群組之一個或多個位置之胺基酸取代： EU238、EU250、EU252、EU254、EU255、EU256、EU258、EU286、EU387、EU307、EU308、EU309、EU311、EU315、EU428、EU433、EU434及EU436。
[3]如[1]或[2]所述之抗原-結合分子，其中該經改質FcRn結合域包含於位置EU238之天冬胺酸，於位置EU250之纈胺酸，於位置EU252之酪胺酸，於位置EU254之蘇胺酸，於位置EU255之白胺酸，於位置EU256之麩胺酸，於位置EU258之天冬胺酸或異白胺酸，於位置EU286之麩胺酸，於位置EU307之麩胺醯胺，於位置EU308之脯胺酸，於位置EU309之麩胺酸，於位置EU311之丙胺酸或組胺酸，於位置EU315之天冬胺酸，於位置EU428之異白胺酸，於位置EU433之丙胺酸、離胺酸、脯胺酸、精胺酸或絲胺酸，於位置EU434之酪胺酸或色胺酸，及/或於位置EU436之異白胺酸、白胺酸、纈胺酸、蘇胺酸或苯丙胺酸。
[4]如[2]所述之抗原-結合分子，其中該FcRn結合域包含胺基酸於選自下列所成群組之一個或多個位置組合之胺基酸取代EU252、EU434及EU436；EU252、EU307、EU311及EU434；EU252、EU315及EU434；EU252、EU308及EU434；EU238、EU252及EU434；EU252、EU434、EU307、EU311及EU436；以及EU252、EU387及EU434。
[5]如[4]所述之抗原-結合分子，其中該FcRn結合域包含：於位置EU252之酪胺酸，於位置EU315之天冬胺酸及於位置EU434之酪胺酸；或於位置EU252之酪胺酸，於位置EU434之酪胺酸及於位置EU436之異白胺酸；或於位置EU252之酪胺酸，於位置EU434之酪胺酸及於位置EU436之白胺酸；或於位置EU252之酪胺酸，於位置EU434之酪胺酸及於位置EU436之纈胺酸；或於位置EU252之酪胺酸，於位置EU254之蘇胺酸，於位置EU434之酪胺酸及於位置EU436之異白胺酸。
[6]如[2]所述之抗原-結合分子，其中該FcRn結合域包含於三個或更多個位置之胺基酸取代，其中該三個或多個位置係 下列所成群組之組合之一者EU252/EU434/EU307/EU311/EU286；EU252/EU434/EU307/EU311/EU286/EU254；EU252/EU434/EU307/EU311/EU436；EU252/EU434/EU307/EU311/EU436/EU254；EU252/EU434/EU307/EU311/EU436/EU250；EU252/EU434/EU308/EU250；EU252/EU434/EU308/EU250/EU436；以及EU252/EU434/EU308/EU250/EU307/EU311。
[7]如[6]所述之抗原-結合分子，其中該FcRn結合域包含：於位置EU252之酪胺酸，於位置EU286之麩胺酸，於位置EU307之麩胺醯胺，於位置EU311之丙胺酸以及於位置EU434之酪胺酸；或於位置EU252之酪胺酸，於位置EU254之蘇胺酸，於位置EU286之麩胺酸，於位置EU307之麩胺醯胺，於位置EU311之丙胺酸及於位置EU434之酪胺酸；或於位置EU252之酪胺酸，於位置EU307之麩胺醯胺，於位置EU311之丙胺酸，於位置EU434之酪胺酸及於位置436之異白胺酸；或於位置EU252之酪胺酸，於位置EU254之蘇胺酸，於位置EU286之麩胺酸，於位置EU307之麩胺醯胺，於位置EU311之丙胺酸，於位置EU434之酪胺酸及於位置EU436之異白胺酸；或 於位置EU250之纈胺酸，於位置EU252之酪胺酸，於位置EU254之蘇胺酸，於位置EU308之脯胺酸，於位置EU434之酪胺酸及於位置EU436之纈胺酸；或於位置EU250纈胺酸，於位置EU252之酪胺酸，於位置EU307麩胺醯胺，於位置EU311丙胺酸，於位置EU434酪胺酸及於位置EU436之纈胺酸；或於位置EU252之酪胺酸，於位置EU307之麩胺醯胺，於位置EU311之丙胺酸，於位置EU434之酪胺酸及於位置EU436之纈胺酸；或於位置EU250之纈胺酸，於位置EU252之酪胺酸，於位置EU308之脯胺酸及於位置EU434酪胺酸；或於位置EU250之纈胺酸，於位置EU252之酪胺酸，於位置EU307之麩胺醯胺，於位置EU308之脯胺酸，於位置EU311之丙胺酸及於位置EU434之酪胺酸。
[8]如[2]所述之抗原-結合分子，其中該FcRn結合域包含於三個或更多個位置之胺基酸取代，其中該三個或多個位置係下列所成群組之組合之一者EU252及EU434及EU307及EU311及EU436及EU286；EU252及EU434及EU307及EU311及EU436及EU250及EU308；EU252及EU434及EU307及EU311及EU436及EU250及EU286及EU308；EU252及EU434及EU307及EU311及EU436及EU250及EU286及EU308及EU428。
[9]如[8]所述之抗原-結合分子，其中該FcRn結合域包含：於位置EU252之酪胺酸，於位置EU286之麩胺酸，於位置EU307之麩胺醯胺，於位置EU311之丙胺酸，於位置EU434之酪胺酸及於位置EU436之纈胺酸；或於位置EU250之纈胺酸，於位置EU252之酪胺酸，於位置EU307之麩胺醯胺，於位置EU308之脯胺酸，於位置EU311之丙胺酸，於位置EU434之酪胺酸及於位置EU436之纈胺酸；或於位置EU250之纈胺酸，於位置EU252之酪胺酸，於位置EU286之麩胺酸，於位置EU307之麩胺醯胺，於位置EU308之脯胺酸，於位置EU311之丙胺酸，於位置EU434之酪胺酸及於位置EU436之纈胺酸；或於位置EU250之纈胺酸，於位置EU252之酪胺酸，於位置EU286之麩胺酸，於位置EU307之麩胺醯胺，於位置EU308之脯胺酸，於位置EU311之丙胺酸，於位置EU434之酪胺酸及於位置EU436之纈胺酸。
[10]如[2]所述之抗原-結合分子，其中該FcRn結合域包含於三個或更多個位置之胺基酸取代，其中該三個或多個位置係下列所成群組之組合之一者：EU434及EU307及EU311；EU434及EU307及EU309及EU311；或EU434及EU250及EU252及EU436。
[11]如[10]所述之抗原-結合分子，其中該FcRn結合域包 含：於位置EU307之麩胺醯胺，於位置EU311之組胺酸及於位置EU434之酪胺酸；或於位置EU307之麩胺醯胺，於位置EU309之麩胺酸，於位置EU311丙胺酸及於位置EU434之酪胺酸；或於位置EU307之麩胺醯胺，於位置EU309之麩胺酸，於位置EU311之組胺酸及於位置EU434酪胺酸；或於位置EU250之纈胺酸；於位置EU252之酪胺酸，於位置EU434之酪胺酸及於位置EU436之纈胺酸。
[12]如[1]至[11]中任一項所述之抗原-結合分子，其中該高分子量物之比例低於2%。
[13]如[1]至[12]中任一項所述之抗原-結合分子，其中該抗原-結合分子包含具有下述者之抗原-結合域對於抗原於pH5.5至6.5具有相較於pH7至8為較低之結合活性或對於抗原「鈣濃度-依賴性結合活性」。
[14]如[1]至[5]中任一項所述之抗原-結合分子，其中該結合分子對於該FcRn之結合活性於pH7為50至150nM，Tm為高於63.0℃及Epibase分數低於250。
[15]如[1]至[3]及[6]至[7]中任一項所述之抗原-結合分子，其中該結合分子對於FcRn之結合活性於pH7為15至50nM，Tm為高於60℃及Epibase分數低於500。
[16]如[1]至[3]及[8]至[9]中任一項所述之抗原-結合分子，其中該結合分子對於FcRn之結合活性於pH7為強於 15nM，Tm為高於57.5℃及Epibase分數低於500。
[17]如[1]至[3]中任一項所述之抗原-結合分子，其中該FcRn結合域包含胺基酸取代於於該位置EU238、EU255及/或EU258，以及於三個或更多個位置，其中該三個或更多個位置為表4至表7所示組合之一者。
[18]如[1]至[17]中任一項所述之抗原-結合分子，其中於該FcRn結合域之位置EU257之胺基酸不為選自下列所成群組之胺基酸：丙胺酸、纈胺酸、異白胺酸、白胺酸及蘇胺酸，及/或於該FcRn結合域之位置EU252之胺基酸不為色胺酸。
[19]如[1]至[18]中任一項所述之抗原-結合分子，其中該抗原-結合分子對於預先存在之抗藥物抗體具有結合活性，相較於包含完整FcRn結合域之對照抗體的結合親和性，該預先存在之抗藥物抗體不顯著增加。
[20]如[19]所述之抗原-結合分子，其中該FcRn結合域進一步包含於選自下列所成群組之一個或多個位置之胺基酸取代：EU387、EU422、EU424、EU426、EU433、EU436、EU438及EU440。
[21]如[20]所述之抗原-結合分子，其中該FcRn結合域包含選自下列所成群組之一個或多個胺基酸取代於位置EU387之精胺酸；於位置EU422之麩胺酸，精胺酸，或絲胺酸，天冬胺酸，離胺酸，蘇胺酸或麩胺醯胺； 於位置EU424之麩胺酸或精胺酸，離胺酸或天冬醯胺；於位置EU426之天冬胺酸，麩胺醯胺，丙胺酸或酪胺酸；於位置EU433之天冬胺酸；於位置EU436之蘇胺酸；於位置EU438之麩胺酸，精胺酸，絲胺酸或離胺酸；以及於位置EU440之麩胺酸，天冬胺酸或麩胺醯胺。
[22]如[1]至[21]中任一項所述之抗原-結合分子，其中該經改質FcRn結合域包含三個或更多個取代，其中該三個或更多個取代為表12至表13所示組合之一者。
[23]如[1]至[22]中任一項所述之抗原-結合分子，其中該經改質FcRn結合域包含三個或更多個取代，其中該三個或更多個取代為表14至表15所示組合之一者。
[24]如[20]至[23]中任一項所述之抗原-結合分子，其中該FcRn結合域包含：於位置EU252之酪胺酸，於位置EU387之精胺酸，於位置EU434之酪胺酸及於位置EU436之纈胺酸；或於位置EU252之酪胺酸，於位置EU422之麩胺酸，於位置EU434之酪胺酸及於位置EU436之纈胺酸；或於位置EU252之酪胺酸，於位置EU422之精胺酸，於位置EU434之酪胺酸及於位置EU436之纈胺酸；或於位置EU252之酪胺酸，於位置EU422之絲胺酸，於位置EU434之酪胺酸及於位置EU436之纈胺酸；或於位置EU252之酪胺酸，於位置EU424之麩胺酸，於位置EU434之酪胺酸及於位置EU436之纈胺酸；或 於位置EU252之酪胺酸，於位置EU424之精胺酸，於位置EU434之酪胺酸及於位置EU436之纈胺酸；或於位置EU252之酪胺酸，於位置EU434之酪胺酸，於位置EU436之纈胺酸及於位置EU438之麩胺酸；或於位置EU252之酪胺酸，於位置EU434之酪胺酸，於位置EU436之纈胺酸及於位置EU438精胺酸；或於位置EU252之酪胺酸，於位置EU434之酪胺酸，於位置EU436之纈胺酸及於位置EU438之絲胺酸；或於位置EU252之酪胺酸，於位置EU434之酪胺酸，於位置EU436之纈胺酸及於位置EU440之麩胺酸。
[25]如[1]至[24]中任一項所述之抗原-結合分子，其中該抗原結合分子為抗體。
[26]一種[1]至[25]中任一項所述之抗原-結合分子之用途，係用於改良抗原-結合分子-媒介之抗原攝入至細胞。
[27]一種[1]至[25]中任一項所述之抗原-結合分子之用途，系用於降低特定抗原的血漿濃度，其中該抗原-結合分子包含可結合該抗原之抗原-結合域。
[28]一種用於改良抗原-結合分子之藥物動力學的方法，包含於選自下列所成群組之一個或多個位置將胺基酸取代導入該抗原-結合分子之FcRn結合域的步驟：EU238、EU250、EU252、EU254、EU255、EU258、EU286、EU307、EU308、EU309、EU311、EU315、EU428、EU433、EU434及EU436。
[29]一種用以延遲對象中抗原-結合分子之清除的方法，包含於選自下列所成群組之一個或多個位置將胺基酸取代導 入該抗原-結合分子之FcRn結合域的步驟：EU238、EU250、EU252、EU254、EU255、EU258、EU286、EU307、EU308、EU309、EU311、EU315、EU428、EU433、EU434及EU436。
[30]一種延長抗原-結合分子之血漿滯留時間的方法，包含於選自下列所成群組之一個或多個位置將胺基酸取代導入該抗原-結合分子之FcRn結合域的步驟：EU238、EU250、EU252、EU254、EU255、EU258、EU286、EU307、EU308、EU309、EU311、EU315、EU428、EU433、EU434及EU436。
[31]一種增加抗原-結合分子之血漿抗原-清除速率的方法包含於選自下列所成群組之一個或多個位置將胺基酸取代導入該抗原-結合分子之FcRn結合域的步驟：EU238、EU250、EU252、EU254、EU255、EU258、EU286、EU307、EU308、EU309、EU311、EU315、EU428、EU433、EU434及EU436。
[32]一種增加抗原-結合分子清除血漿抗原的能力，包含於選自下列所成群組之一個或多個位置將胺基酸取代導入該抗原-結合分子之FcRn結合域的步驟：EU238、EU250、EU252、EU254、EU255、EU258、EU286、EU307、EU308、EU309、EU311、EU315、EU428、EU433、EU434及EU436。
[33]如[28]至[32]中任一項所述之方法，其中進一步於位置EU256將胺基酸取代導入該FcRn結合域。
[34]如[28]至[32]中任一項所述之方法，其中該方法進一步包含於選自下列所成群組之一個或多個位置將胺基酸取代導入該FcRn結合域之步驟：EU387、EU422、EU424、EU426、EU433、EU436、EU438及EU440。
[35]一種用於製造[1]至[25]中任一項所述之抗原-結合分子的方法，包含下列步驟選擇親代FcRn結合域且藉由於選自下列所成群組之一個或多個位置導入胺基酸取代而改變親代FcRn：EU238、EU250、EU252、EU254、EU255、EU258、EU286、EU307、EU308、EU309、EU311、EU315、EU428、EU433、EU434及EU436；選擇抗原-結合分子之抗原-結合域且改變至少一個抗原-結合域之胺基酸以獲得pH-依賴性抗原-結合域或鈣-離子依賴性抗原-結合域；獲得編碼抗原-結合分子之基因，其中該人類FcRn結合域與抗原-結合域係於(a)及(b)中製備與連接以及使用於(c)中製備之基因製造抗原-結合分子。
[36]如[35]所述之方法，其中步驟(a)進一步將位置EU256胺基酸取代導入至該FcRn結合域。
[37]如[35]至[36]中任一項之方法，其中該方法進一步包含於選自下列所成群組之一個或多個位置將胺基酸取代導入至該FcRn結合域之步驟：EU387、EU422、EU424、EU426、EU433、EU436、EU438及EU440。
[38]一種抗原-結合分子，包含經改質FcRn結合域，其中該經改質FcRn結合域包含選自下列所成群組之一個或多個位置之胺基酸取代：EU387、EU422、EU424、EU426、EU433、EU436、EU438及EU440，其中該抗原-結合分子對於預先存在之抗藥物抗體(ADA)具有結合活性，相較於包含完整FcRn結合域之對照抗體的結合親和性，該預先存在之抗藥物抗體於中 性pH不顯著增加。
[39]如[38]所述之抗原-結合分子，其中該抗原-結合分子進一步於中性或酸性pH範圍對於FcRn具有增加的結合親和性。
[40]如[38]或[39]所述之抗原-結合分子，其中取代於選自於EU387、EU422、EU424、EU426、EU433、EU436、EU438及EU440所成群組之位置之胺基酸係選自下列所成群組於位置EU387之精胺酸；於位置EU422之麩胺酸，精胺酸，絲胺酸，天冬胺酸，離胺酸，蘇胺酸或麩胺醯胺；於位置EU424之麩胺酸，精胺酸，離胺酸或天冬醯胺；於位置EU426之天冬胺酸，麩胺醯胺，丙胺酸或酪胺酸；於位置EU433之天冬胺酸；於位置EU436之蘇胺酸；於位置EU438之麩胺酸，精胺酸，絲胺酸或離胺酸；以及於位置EU440之麩胺酸，天冬胺酸，或麩胺醯胺。
[41]如[38]至[40]中任一項所述之抗原-結合分子，其中該經改質FcRn結合域包含於一個或多個位置之胺基酸取代或表10所示組合之一者。
[42]如[38]至[40]中任一項所述之抗原-結合分子，其中該經改質FcRn結合域包含胺基酸取代或表11所示取代組合之任一者。
[43]如[39]至[42]中任一項所述之抗原-結合分子，其中該經改質FcRn結合域進一步包含於該FcRn結合域於選自下列所 成群組之一個或多個位置之胺基酸取代：EU238、EU250、EU252、EU254、EU255、EU256、EU258、EU286、EU307、EU308、EU309、EU311、EU315、EU428、EU434及EU436，其中該取代於中性pH或酸性pH賦予FcRn結合活性增加。
[44]如[39]至[43]中任一項所述之抗原-結合分子，其中該經改質FcRn結合域包含於FcRn結合域位置之胺基酸取代i)a)EU438/EU440或b)EU424；以及ii)a)EU434,b)EU252/EU254/EU256；c)EU428/EU434；或d)EU250/EU428。
[45]如[44]所述之抗原-結合分子，其中該經改質FcRn結合域包含胺基酸取代i)a)EU438R/EU440E或b)EU424N；以及ii)a)M434H；b)M252Y/S254T/T256E；c)M428L/N434S；或d)T250Q及M428L(EU編號)。
[46]如[45]所述之抗原-結合分子，其中該經改質FcRn結合域包含三個或更多個取代，其中該三個或更多個取代為表13及表15所示組合之一者。
[47]如[39]至[42]中任一項所述之抗原-結合分子，其中該經改質FcRn結合域包含取代於選自EU387、EU422、EU424、EU438、EU440、EU433所成群組之位置之一個或多個，或於二個或更多個位置，其中該二個位置為EU422/EU424及EU438/EU440所成群組之組合之一者；以及二個或更多個位置，其中該二個位置為表9所示組合之一 者。
[48]如[47]所述之抗原-結合分子，其中該經改質FcRn結合域包含三個或更多個胺基酸取代，其中該三個或更多個胺基酸取代為表12或表14所示組合之一者。
[49]如[39]至[48]中任一項所述之抗原-結合分子，其中該抗原-結合分子包含pH-依賴性抗原-結合域或鈣離子-依賴性抗原結合域。
[50]一種用於對包含FcRn結合域之抗原-結合分子之預先存在的ADA降低結合性的方法，該FcRn結合域於中性或酸性pH對FcRn具有增加的結合活性以及於中性pH對預先存在之ADA具有增加的結合性，該方法包含下列步驟提供具有FcRn結合域之抗原-結合分子，該FcRn結合域具有於中性或酸性pH對FcRn增加的結合活性以及於中性pH對預先存在之ADA增加的結合性；以及於選自EU387、EU422、EU424、EU426、EU433、EU436、EU438及EU440所成群組之一個或多個位置取代FcRn結合域中之胺基酸以產生具有經改質FcRn結合域之抗原-結合分子。
[51]如[50]所述之方法，其中該步驟b)包含於三個或更多個位置取代胺基酸，其中該三個或更多個位置為表10所示組合之一者。
[52]如[50]所述之方法，其中該步驟b)包含將三個或更多個胺基酸取代導入至該FcRn結合域，其中該三個或更多個胺基酸取代為表11所示組合之一者。
[53]一種用以增加抗原總數的方法，該抗原總數為單一 抗原-結合分子可與其結合而相較於親代抗體對於預先存在之ADA於中性pH不顯著增加結合活性，該方法包含下列步驟提供包含親代FcRn結合域之抗原-結合分子，藉由於選自EU238、EU250、EU252、EU254、EU255、EU256、EU258、EU286、EU307、EU308、EU309、EU311、EU315、EU428、EU433、EU434及EU436所成群組之一個或多個位置之親代FcRn結合域之胺基酸序列取代胺基酸而改變步驟a)之親代FcRn結合域；以及藉由於選自EU387、EU422、EU424、EU426、EU433、EU436、EU438及EU440所成群組之一個或多個位置之親代FcRn結合域之胺基酸序列取代胺基酸而改變步驟b)之該經改質FcRn結合域。
[54]一種有助於以無抗原結合形式將胞外釋放之無抗原之抗原-結合分子攝入細胞中而相較於親代抗體於中性pH不顯著增加該抗原-結合分子對於預先存在之ADA結合活性的方法，包含下列步驟提供包含親代FcRn結合域之抗原-結合分子，藉由於選自EU238、EU250、EU252、EU254、EU255、EU256、EU258、EU286、EU307、EU308、EU309、EU311、EU315、EU428、EU433、EU434及EU436所成群組之一個或多個位置之親代FcRn結合域之胺基酸序列取代胺基酸而改變步驟a)之親代FcRn結合域；以及藉由於選自EU387、EU422、EU424、EU426、EU433、EU436、EU438及EU440所成群組之一個或多個位置之親代 FcRn結合域之胺基酸序列取代胺基酸而改變步驟b)之該經改質FcRn結合域。
[55]一種用於增加抗原-結合分子之活性以清除血漿抗原而相較於親代抗體於中性pH不顯著增加對於預先存在之ADA結合活性的方法，該方法包含下列步驟提供包含親代FcRn結合域之抗原-結合分子，藉由於選自EU238、EU250、EU252、EU254、EU255、EU256、EU258、EU286、EU307、EU308、EU309、EU311、EU315、EU428、EU433、EU434及EU436所成群組之一個或多個位置之親代FcRn結合域之胺基酸序列取代胺基酸而改變步驟a)之親代FcRn結合域；以及藉由於選自EU387、EU422、EU424、EU426、EU433、EU436、EU438及EU440所成群組之一個或多個位置之親代FcRn結合域之胺基酸序列取代胺基酸而改變步驟b)之該經改質FcRn結合域。
[56]一種用於改良抗原-結合分子之藥物動力學而相較於親代抗體於中性pH不顯著增加對於預先存在之ADA結合活性的方法，該方法包含下列步驟提供包含親代FcRn結合域之抗原-結合分子，藉由於選自EU238、EU250、EU252、EU254、EU255、EU256、EU258、EU286、EU307、EU308、EU309、EU311、EU315、EU428、EU433、EU434及EU436所成群組之一個或多個位置之親代FcRn結合域之胺基酸序列取代胺基酸而改變步驟a)之親代FcRn結合域；以及 藉由於選自EU387、EU422、EU424、EU426、EU433、EU436、EU438及EU440所成群組之一個或多個位置之親代FcRn結合域之胺基酸序列取代胺基酸而改變步驟b)之該經改質FcRn結合域。
[57]一種用於降低總數或游離抗原血漿濃度而相較於親代抗體於中性pH不顯著增加該抗原-結合分子對於預先存在之ADA結合活性的方法，該方法包含下列步驟提供包含親代FcRn結合域之抗原-結合分子，該抗原-結合分子包含可結合該抗原之抗原-結合域，藉由於選自EU238、EU250、EU252、EU254、EU255、EU256、EU258、EU286、EU307、EU308、EU309、EU311、EU315、EU428、EU433、EU434及EU436所成群組之一個或多個位置之親代FcRn結合域之胺基酸序列取代胺基酸而改變該親代FcRn結合域；以及藉由於選自EU387、EU422、EU424、EU426、EU433、EU436、EU438及EU440所成群組之一個或多個位置之親代FcRn結合域之胺基酸序列取代胺基酸而改變步驟b)之該經改質FcRn結合域。
[58]一種用於製造包含FcRm結合域之抗原-結合分子的方法，該FcRn結合域於中性或酸性pH對FcRn具有增加的結合活性以及於中性pH對預先存在之ADA具有增加的結合性，該方法包含下列步驟提供於中性或酸性pH範圍對FcRn具有增加的結合活性以及於中性pH範圍對預先存在之ADA具有增加的結合性之 FcRn結合域，於選自EU387、EU422、EU424、EU426、EU433、EU436、EU438及EU440所成群組之一個或多個位置取代胺基酸選擇抗原-結合分子之抗原-結合域及改變抗原-結合域之至少一個胺基酸以獲得pH-依賴性抗原-結合域，或選擇鈣離子-依賴性抗原-結合域；獲得編碼抗原-結合分子之基因，其中人類FcRn結合域與(a)與(b)所製備之抗原-結合域連接以及使用(c)所製備之基因製造抗原-結合分子，其中所製造之該抗原-結合分子相較於具有完整FcRn結合域之親代抗原-結合域具有於中性或酸性pH對FcRn增加的結合活性以及於中性pH對預先存在之ADA增加的結合性。
[59]如[58]所述之方法，其中該於中性或酸性pH範圍對FcRn及預先存在之ADA具有增加的結合活性以及於中性pH範圍對預先存在之ADA具有增加的結合性之FcRn結合域包含於選自下列所成群組之一個或多個位置之胺基酸取代：EU238、EU250、EU252、EU254、EU255、EU256、EU258、EU286、EU307、EU308、EU309、EU311、EU315、EU428、EU433、EU434及EU436。
[60]如[53]至[57]中任一項所述之方法，其中該步驟a)中導入之胺基酸為三個或更多個位置，其中該三個或更多個位置為表4至表7所示組合之一者。
[61]如[53]至[60]中任一項所述之方法，其中該步驟b)中導入之胺基酸取代為三個或更多個位置，其中該三個或更多個 位置為表10所示組合之一者。
圖1A顯示圖式說明相較於具有增加的FcRn的pH-依賴性抗原結合抗體之由先前技術抗體(傳統抗體)之血漿的抗原清除，該二抗體於中性Ph均結合可溶抗體。傳統抗體於血漿中結合至抗原且為非專一性的由細胞攝入至酸性內體。於內體的酸性環境中，傳統抗體於囊泡內結合FcRn且運送回至細胞表面，於該細胞表面處再次釋放。於內化與循環過程中，抗原結合至抗原-結合域。
於中性pH具有增加的FcRn結合的pH-性抗原結合抗體，結合至細胞表面的FcRn且快速地內化至細胞中，因而相較於傳統抗體為較高頻率。於內體的酸性環境中，抗原由經改質抗體解離且傳遞至溶酶體，且抗原於融媒體處被蛋白質分解性地降解。仍結合至FcRn的該抗體，循環回至細胞表面。於該細胞表面處，該經循環的游離抗體可再一次結合至另一抗原。藉由重複此FcRn-媒介攝入的循環，抗原解離與降解，以及抗體循環，該等於中性pH對於FcRn具有經改良的親和性的pH-依賴性抗原-結合抗體，相較於傳統抗體可傳送顯著較大量的抗原至溶酶體，且因而相較於傳統抗體可顯著地降低血漿中的總抗原濃度。
圖1B顯示圖式說明於內體中之來自具有pH-依賴性抗原-結合域之IgG抗體的可溶抗原的解離。此導致抗原清除增加，且使抗體於血漿中結合至另一抗原。
圖2顯示hFcRn結合親和性(x軸)與包含Fc變異體之抗體的Tm於y軸的圖(Fc變異體F1-F599：空心方塊；Fc變異體F600-F1052：實心方塊)。
圖3顯hFcRn結合親和性(x-軸)與包含Fc變異體之抗體的高分子量(HMW)比例(以%)(y軸)的圖(Fc變異體F1-F599：空心方塊，Fc變異體F600-F1050：實心方塊)。
圖4顯示hFcRn結合親和性(x-軸)與包含Fc變異體之抗體的免疫原性分數(Epibase分數)的圖(F1-F599之Fc變異體：空心方塊，Fc變異體F600-F1052：實心方塊)。
圖5顯示hFcRn結合親和性(x-軸)與熔解溫度Tm(y軸)與包含Fc變異體之抗體(其FcRn結合親和性強於15nM)的熔解溫度Tm(y軸)的圖(F1-F599之Fc變異體具有Kd小於或等於15nM：空心方塊，F600-F1052之Fc變異體具有Kd小於或等於15nM(群1)：實心方塊)。
圖6顯示hFcRn結合親和性(x軸)與包含Fc變異體之抗體(其FcRn結合親和性強於15nM)的HMW(以%)(y-軸)的圖(F1-F599之Fc變異體具有Kd小於或等於15nM：空心方塊；F600-F1052之Fc變異體具有Kd小於或等於15nM(群1)：實心方塊)。
圖7顯示hFcRn結合親和性與包含Fc變異體之抗體(其FcRn結合親和性強於15nM)的免疫抗原性分數的圖(F1-F599之Fc變異體具有Kd小於或等於15nM：空心方塊；F600-F1052之Fc變異體具有Kd小於或等於15nM(群1)：實心方塊)。
圖8顯示顯示的圖hFcRn結合親和性與包含Fc變異體之抗體(其FcRn結合親和性介於15nM與50nM之間)的Tm的圖(F1-F599之Fc變異體具有Kd=15至50nM，空心方塊；F600-F1052之Fc變異體具有Kd=15至50nM(群2)：實心方塊)
圖9顯示hFcRn結合親和性與包含Fc變異體之抗體的(其FcRn結合親和性介於15nM與50nM之間)的HMW(%)的圖(F1-F599之Fc變異體具有Kd=15至50nM，空心方塊；F600-F1052之Fc變異體具有Kd=15至50nM(群2)：實心方塊)。
圖10顯示hFcRn結合親和性與包含Fc變異體之抗體(其FcRn結合親和性介於15nM與50nM之間)的免疫原性分數的圖(F1-F599之Fc變異體具有Kd=15至50nM，空心方塊；F600-F1052之Fc變異體具有Kd=15至50nM(群2)：實心方塊)
圖11顯示hFcRn結合親和性與包含Fc變異體之抗體(其FcRn結合親和性介於50nM與150nM之間)的Tm的圖(F1-F599之Fc變異體具有Kd=50至150nM，空心方塊；F600-F1052之Fc變異體具有Kd=50至150nM(群3)：實心方塊)。
圖12顯示的圖hFcRn結合親和性與包含Fc變異體之抗體(其FcRn結合親和性介於50nM與150nM之間)的HMW(%)的圖(F1-F599之Fc變異體具有Kd=50至150nM，空心方塊；F600-F1052之Fc變異體具有Kd=50至150nM(群3)：實心方塊)。
圖13顯示hFcRn結合親和性與包含Fc變異體之抗體(其FcRn結合親和性介於50nM與150nM之間)的免疫原性分數的圖(F1-F599之Fc變異體具有Kd=50至150nM：空心方塊；F600-F1052之Fc變異體具有Kd=50至150nM(群3)：實心方塊。
圖14顯示hFcRn結合親和性與包含Fc變異體之抗體(其FcRn結合親和性介於150nM與700nM之間)的Tm的圖(F1-F599之Fc變異體具有Kd=150至700nM，空心方塊；Fc變異體F600-F1052具有Kd=150至700nM(群4)：實心方塊)。
圖15顯示hFcRn結合親和性與包含Fc變異體之抗體(其FcRn結合親和性介於150nM與700nM之間)的HMW(%)的圖(F1-F599之Fc變異體具有Kd=150至700nM：空心方塊；F600-F1052之Fc變異體具有Kd=150至700nM(群4)：實心方塊)。
圖16顯示hFcRn結合親和性與包含Fc變異體之抗體(其FcRn結合親和性介於150nM與700nM之間)的免疫原性分數的圖(F1-F599之Fc變異體具有Kd=150至700nM：空心方塊；F600-F1052之Fc變異體具有Kd=150至700nM(群4)：實心方塊)。
圖17顯示圖形表示之於人類FcRn基因轉殖鼠注射Fv4-IgG1、Fv4-F652、Fv4-F890之後與Fv4-F946以及於對照小鼠(無抗體注射)之歷時血漿抗原(hsIL-6R)濃度。
圖18顯示圖形表示之於人類FcRn基因轉殖鼠注射 Fv4-IgG1、Fv4-F652、Fv4-F890之後的歷時血漿抗體濃度。
圖19顯示圖形表示之於人類FcRn基因轉殖小鼠之對照(無抗體注射)以及於Fv4-IgG1、Fv4-F11與Fv4-F652之注射後之歷時血漿抗原(hsIL-6R)濃度。
圖20顯示圖形表示之於人類FcRn基因轉殖小鼠之Fv4-IgG1、Fv4-F11與Fv4-F652之注射後之歷時血漿抗體濃度。
圖21顯示圖形表示之來自15個各別RA患者(a-1至a-5)對抗Fv4-IgG1、Fv4-F11、Fv4-F268、Fv4-F890與Fv4-F947的血漿電化學發光(ECL)回應，以及該ECL回應之平均(b)、幾何平均(c)以及中間值(d)。
圖22顯示來自15個各別RA患者對抗Fv4-IgG1、Fv4-F890與Fv4-F1058至Fv4-F1073(a-1至a-18)的血漿電化學發光(ECL)回應，以及該ECL回應之平均(b)、幾何平均(c)以及中間值(d)。
圖23顯示對人類FcRn基因轉殖小鼠(線276)投藥抗-人類IL-6受體抗體之可溶形式後之歷時血漿濃度圖，其中可溶形式人類IL-6受體的血漿濃度為恆定(穩態輸助模式)。
圖21顯示圖形表示之來自30個各別RA患者對抗人源化抗-IL-6受體抗體Fv4-IgG1(圖21-1)、YTE變異體(圖21-2)及其LS變異體(圖21-3)之血漿的電化學發光(ECL)回應圖。
圖22顯示圖形表示之來自15個各別RA患者對抗人源化抗-IL-6受體抗體Fv4-IgG1(Fig.22-1)、Fv4-N434H(圖22-2)、Fv4-F11(圖22-3)、Fv4-F68(圖22-4)、Fv4-890(圖22-5)與 Fv4-F947(圖22-6)之血漿的電化學發光(ECL)回應。
圖23顯示圖22中所示來自15個各別RA患者對抗Fv4-IgG1、Fv4-F11、Fv4-F68、Fv4-F890與Fv4-F947之ECL回應之平均(圖23-1)、幾何平均(圖23-2)與中間值(圖23-3)。
圖24顯示圖形表示之來自15個各別RA患者對抗人源化抗-IL-6受體抗體Fv4-IgG1(圖24-1)以及變異體Fv4-F890、Fv4-F1058、Fv4-F1059、Fv4-F1060、Fv4-F1061、Fv4-F1062、Fv4-F1063、Fv4-F1064、Fv4-F1065、Fv4-F1066、Fv4-F1067、Fv4-F1068、Fv4-F1069、Fv4-F1070、Fv4-F1071、Fv4-F1072與Fv4-F1073(圖24-2至圖24-18)之血漿的電化學發光(ECL)回應。
圖25顯示圖24中所示來自15個各別RA患者對抗Fv4-IgG1、變異體Fv4-F890、Fv4-F1058、Fv4-F1059、Fv4-F1060、Fv4-F1061、Fv4-F1062、Fv4-F1063、Fv4-F1064、Fv4-F1065、Fv4-F1066、Fv4-F1067、Fv4-F1068、Fv4-F1069、Fv4-F1070、Fv4-F1071、Fv4-F1072與Fv4-F1073之血漿的ECL回應的平均(圖25-1)、幾何平均(圖25-2)與中間值(圖25-3)。
圖26顯示圖形表示之來自15個各別RA患者對抗變異體Fv4-F1104、Fv4-F1105與Fv4-F1106之血漿的電化學發光(ECL)回應。
圖27顯示圖形表示之來自15個各別RA患者對抗變異體Fv4-F1107、Fv4-F1108、Fv4-F1109、Fv4-F1110、Fv4-F1111、Fv4-F1112、Fv4-F1113與Fv4-F1114(圖27-1至圖27-8)之血漿的電化學發光(ECL)回應
圖28顯示圖形表示之來自15個各別RA患者對抗變異體Fv4-F1230(圖28-1)、Fv4-F1231(圖28-2)、Fv4-F1232(圖28-3)之血漿的電化學發光(ECL)回應。
圖29顯示圖形表示之來自15個各別RA患者對抗變異體Fv4-F947、Fv4-F1119、Fv4-F1120、Fv4-F1121、Fv4-F1122、Fv4-F1123與Fv4-F1124之血漿的電化學發光(ECL)回應
圖30-1至圖30-4顯示圖形表示之來自15個各別RA患者對抗變異體Fv4-F939、Fv4-F1291、Fv4-F1268與Fv4-F1269之血漿的電化學發光(ECL)回應。圖30-5至圖30-9顯示圖形表示之來自15個各別RA患者對抗變異體Fv4-F1243、Fv4-F1245、Fv4-F1321、Fv4-F1340與Fv4-F1323之血漿的電化學發光(ECL)回應。
圖31顯示圖形表示之來自15個各別RA患者對抗變異體Fv4-F890(圖31-1)與Fv4-F1115(=F890+S424N、圖31-2)之血漿的電化學發光(ECL)回應。
圖32顯示圖形表示之來自15個或30個各別RA患者對抗變異體Fv4-YTE(圖32-1)、Fv4-F1166(=YTE+Q438R/S440E，圖32-2)、Fv4-F1167(=YTE+S424N，圖32-3)、Fv4-LS(圖32-4)、Fv4-F1170(=LS+Q438R/S440E，圖32-5)、Fv4-F1171(LS+S424N，圖32-6)、Fv4-N434H(圖32-7)、Fv4-F1172(=N434H+Q438R/S440E，圖32-8)、Fv4-F1173(=N434H+S424N，圖32-9))之血漿的電化學發光(ECL)回應。
圖33顯示圖形表示之來自30個各別RA患者對抗變異體 Fv4-LS、Fv4-F1380(圖33-2)、Fv4-F1384(圖33-3)、Fv4-F1385(圖33-4)、Fv4-F1386(LS+S426Y，圖33-5)、Fv4-F1388(圖33-6)與Fv4-F1389(LS+Y436T，圖33-7)之血漿的電化學發光(ECL)回應。
圖34顯示圖形表示之來自30個各別RA患者對抗變異體F939之電化學發光(ECL)回應。
圖35顯示圖形表示之來自30個各別RA患者對抗變異體F1378之電化學發光(ECL)回應。
圖36顯示圖形表示之來自30個各別RA患者對抗變異體F1379之電化學發光(ECL)回應。
圖37顯示圖形表示之來自30個各別RA患者對抗變異體F1262之電化學發光(ECL)回應。
圖38顯示圖形表示之來自30個各別RA患者對抗變異體F1138之電化學發光(ECL)回應。
圖39顯示圖形表示之來自30個各別RA患者對抗變異體F1344之電化學發光(ECL)回應。
圖40顯示圖形表示之來自30個各別RA患者對抗變異體F1349之電化學發光(ECL)回應。
圖41顯示圖形表示之來自30個各別RA患者對抗變異體F1350之電化學發光(ECL)回應。
圖42顯示圖形表示之來自30個各別RA患者對抗變異體F1351之電化學發光(ECL)回應。
圖43顯示圖形表示之來自30個各別RA患者對抗變異體F1261之電化學發光(ECL)回應。
圖44顯示圖形表示之來自30個各別RA患者對抗變異體F1263之電化學發光(ECL)回應。
圖45顯示圖形表示之來自30個各別RA患者對抗變異體F1305之電化學發光(ECL)回應。
圖46顯示圖形表示之來自30個各別RA患者對抗變異體F1306之電化學發光(ECL)回應。
圖47顯示圖形表示之來自30個各別RA患者對抗變異體F1268之電化學發光(ECL)回應。
圖48顯示圖形表示之來自30個各別RA患者對抗變異體F1269之電化學發光(ECL)回應。
圖49顯示圖形表示之來自30個各別RA患者對抗變異體F1413之電化學發光(ECL)回應。
圖50顯示圖形表示之來自30個各別RA患者對抗變異體F1416之電化學發光(ECL)回應。
圖51顯示圖形表示之來自30個各別RA患者對抗變異體F1419之電化學發光(ECL)回應。
圖52顯示圖形表示之來自30個各別RA患者對抗變異體F1420之電化學發光(ECL)回應。
圖53顯示圖形表示之來自30個各別RA患者對抗變異體F1370之電化學發光(ECL)回應。
圖54顯示圖形表示之來自30個各別RA患者對抗變異體F1371之電化學發光(ECL)回應。
圖55顯示圖形表示之來自30個各別RA患者對抗變異體F1599之電化學發光(ECL)回應。
圖56顯示圖形表示之來自30個各別RA患者對抗變異體F1600之電化學發光(ECL)回應。
圖57顯示圖形表示之來自30個各別RA患者對抗變異體F1566之電化學發光(ECL)回應。
圖58顯示圖形表示之來自30個各別RA患者對抗變異體F1448之電化學發光(ECL)回應。
圖59顯示圖形表示之來自30個各別RA患者對抗變異體F1601之電化學發光(ECL)回應。
圖60顯示圖形表示之來自30個各別RA患者對抗變異體F1602之電化學發光(ECL)回應。
圖61顯示圖形表示之來自30個各別RA患者對抗變異體F1603之電化學發光(ECL)回應。
圖62顯示圖形表示之來自30個各別RA患者對抗變異體F1531之電化學發光(ECL)回應。
圖63顯示圖形表示之來自30個各別RA患者對抗變異體F1604之電化學發光(ECL)回應
圖64顯示圖形表示之來自30個各別RA患者對抗變異體F1605之電化學發光(ECL)回應。
圖65顯示圖形表示之來自30個各別RA患者對抗變異體F1586之電化學發光(ECL)回應。
圖66顯示圖形表示之來自30個各別RA患者對抗變異體F1592之電化學發光(ECL)回應。
圖67顯示圖形表示之來自30個各別RA患者對抗變異體F1610之電化學發光(ECL)回應。
圖68顯示圖形表示之來自30個各別RA患者對抗變異體F1611之電化學發光(ECL)回應。
圖69顯示圖形表示之來自30個各別RA患者對抗變異體F1612之電化學發光(ECL)回應。
圖70顯示圖形表示之來自30個各別RA患者對抗變異體F1613之電化學發光(ECL)回應。
圖71顯示圖形表示之來自30個各別RA患者對抗變異體F1614之電化學發光(ECL)回應。
圖72顯示圖形表示之來自30個各別RA患者對抗變異體F1 615之電化學發光(ECL)回應。
圖73顯示圖形表示之來自30個各別RA患者對抗變異體F1567之電化學發光(ECL)回應。
圖74顯示圖形表示之來自30個各別RA患者對抗變異體F1572之電化學發光(ECL)回應。
圖75顯示圖形表示之來自30個各別RA患者對抗變異體F1576之電化學發光(ECL)回應。
圖76顯示圖形表示之來自30個各別RA患者對抗變異體F1578之電化學發光(ECL)回應。
圖77顯示圖形表示之來自30個各別RA患者對抗變異體F1579之電化學發光(ECL)回應。
圖78顯示圖形表示之來自30個各別RA患者對抗變異體F1641之電化學發光(ECL)回應。
圖79顯示圖形表示之來自30個各別RA患者對抗變異體F1642之電化學發光(ECL)回應。
圖80顯示圖形表示之來自30個各別RA患者對抗變異體F1643之電化學發光(ECL)回應。
圖81顯示圖形表示之來自30個各別RA患者對抗變異體F1644之電化學發光(ECL)回應
圖82顯示圖形表示之來自30個各別RA患者對抗變異體F1645之電化學發光(ECL)回應。
圖83顯示圖形表示之來自30個各別RA患者對抗變異體F1646之電化學發光(ECL)回應。
圖84顯示圖形表示之來自30個各別RA患者對抗變異體F1647之電化學發光(ECL)回應。
圖85顯示圖形表示之來自30個各別RA患者對抗變異體F1648之電化學發光(ECL)回應。
圖86顯示圖形表示之來自30個各別RA患者對抗變異體F1649之電化學發光(ECL)回應。
圖87顯示圖形表示之來自30個各別RA患者對抗變異體F1650之電化學發光(ECL)回應。
圖88顯示圖形表示之來自30個各別RA患者對抗變異體F1651之電化學發光(ECL)回應。
圖89顯示圖形表示之來自30個各別RA患者對抗變異體F1652之電化學發光(ECL)回應。
圖90顯示圖形表示之來自30個各別RA患者對抗變異體F1653之電化學發光(ECL)回應
圖91顯示圖形表示之來自30個各別RA患者對抗變異體F1654之電化學發光(ECL)回應。
圖92顯示圖形表示之來自30個各別RA患者對抗變異體F1655之電化學發光(ECL)回應。
圖93顯示圖形表示之來自30個各別RA患者對抗變異體F1329之電化學發光(ECL)回應。
圖94顯示圖形表示之來自30個各別RA患者對抗變異體F1331之電化學發光(ECL)回應。
圖95顯示圖形表示之來自30個各別RA患者對抗變異體F1718之電化學發光(ECL)回應。
圖96顯示圖形表示之來自30個各別RA患者對抗變異體F1719之電化學發光(ECL)回應。
圖97顯示圖形表示之來自30個各別RA患者對抗變異體F1720之電化學發光(ECL)回應。
圖98顯示圖形表示之來自30個各別RA患者對抗變異體F1721之電化學發光(ECL)回應。
圖99顯示圖形表示之來自30個各別RA患者對抗變異體F1671之電化學發光(ECL)回應。
圖100顯示圖形表示之來自30個各別RA患者對抗變異體F1670之電化學發光(ECL)回應。
圖101顯示圖形表示之來自30個各別RA患者對抗變異體F1711之電化學發光(ECL)回應。
圖102顯示圖形表示之來自30個各別RA患者對抗變異體F1712之電化學發光(ECL)回應。
圖103顯示圖形表示之來自30個各別RA患者對抗變異體F1713之電化學發光(ECL)回應。
圖104顯示圖形表示之來自30個各別RA患者對抗變異體F1722之電化學發光(ECL)回應。
圖105顯示圖形表示之來自30個各別RA患者對抗變異體F1723之電化學發光(ECL)回應。
圖106顯示圖形表示之來自30個各別RA患者對抗變異體F1724之電化學發光(ECL)回應。
圖107顯示圖形表示之來自30個各別RA患者對抗變異體F1725之電化學發光(ECL)回應。
圖108顯示圖形表示之來自30個各別RA患者對抗變異體F1675之電化學發光(ECL)回應。
圖109顯示圖形表示之來自30個各別RA患者對抗變異體F1714之電化學發光(ECL)回應。
圖110顯示圖形表示之來自30個各別RA患者對抗變異體F1715之電化學發光(ECL)回應。
圖111顯示圖形表示之來自30個各別RA患者對抗變異體F1716之電化學發光(ECL)回應。
圖112顯示圖形表示之來自30個各別RA患者對抗變異體F1717之電化學發光(ECL)回應。
圖113顯示圖形表示之來自30個各別RA患者對抗變異體F1683之電化學發光(ECL)回應。
圖114顯示圖形表示之來自30個各別RA患者對抗變異體F1756之電化學發光(ECL)回應。
圖115顯示圖形表示之來自30個各別RA患者對抗變異體F1757之電化學發光(ECL)回應。
圖116顯示圖形表示之來自30個各別RA患者對抗變異體F1758之電化學發光(ECL)回應。
圖117顯示圖形表示之來自30個各別RA患者對抗變異體F1759之電化學發光(ECL)回應。
圖118顯示圖形表示之來自30個各別RA患者對抗變異體F1681之電化學發光(ECL)回應。
圖119顯示圖形表示之來自30個各別RA患者對抗變異體F1749之電化學發光(ECL)回應。
圖120顯示圖形表示之來自30個各別RA患者對抗變異體F1750之電化學發光(ECL)回應。
圖121顯示圖形表示之來自30個各別RA患者對抗變異體F1751之電化學發光(ECL)回應。
圖122顯示圖形表示之來自30個各別RA患者對抗變異體F1760之電化學發光(ECL)回應。
圖123顯示圖形表示之來自30個各別RA患者對抗變異體F1761之電化學發光(ECL)回應。
圖124顯示圖形表示之來自30個各別RA患者對抗變異體F1762之電化學發光(ECL)回應。
圖125顯示圖形表示之來自30個各別RA患者對抗變異體F1763之電化學發光(ECL)回應。
圖126顯示圖形表示之來自30個各別RA患者對抗變異體F1752之電化學發光(ECL)回應。
圖127顯示圖形表示之來自30個各別RA患者對抗變異體F1753之電化學發光(ECL)回應。
圖128顯示圖形表示之來自30個各別RA患者對抗變異體F1754之電化學發光(ECL)回應。
圖129顯示圖形表示之來自30個各別RA患者對抗變異體F1755之電化學發光(ECL)回應。
圖130顯示圖形表示之來自30個各別RA患者對抗變異體F1685之電化學發光(ECL)回應。
圖131顯示圖形表示於人類FcRn基因轉殖小鼠注射Fv4-IgG1、Fv4-F1243與Fv4-F1245後之歷時血漿抗體濃度。
圖132顯示圖形表示於人類FcRn基因轉殖小鼠注射Fv4-IgG1、Fv4-F1243與Fv4-F1245後以及於對照小鼠(無抗體注射)之歷時血漿抗原(hsIL-6R)濃度。
圖133顯示圖形表示之於人類FcRn基因轉殖小鼠注射Fv4-IgG1、Fv4-F1389後之歷時血漿抗體濃度。
圖134顯示SPR分析之感應圖譜(sensorgram)。抗-hIgA抗體的hIgA結合係於不同條件(pH、Ca-濃度)中分析。
圖135顯示圖形表示於人類FcRn基因轉殖小鼠注射GA2-F760與GA2-F1331後之歷時血漿抗體濃度。
圖136顯示圖形表示於人類FcRn基因轉殖小鼠注射GA2-F760與GA2-F1331後之歷時血漿hIgA濃度。
圖137顯示圖形表示於人類FcRn基因轉殖小鼠注射278-F760與278-F1331後之歷時血漿抗體濃度。
圖138顯示圖形表示之於人類FcRn基因轉殖小鼠注射278-F760與278-F1331後之歷時血漿hIgE(Asp6)濃度。
說明本發明的材料與方法之前，應了解該等說明僅為例示且不意圖限制。亦應了解本發明不限定為本文所揭示之特定尺寸、形狀、維度、材料、方法、過程等，期可根據常規試驗及/或最適化而加以變化。用於說明的詞語僅為了敘述特定態樣或具體例的目的，且不意圖限制本發明之範疇，本發明之範疇僅由隨附之申請專利範圍予以界定。除非具體指明，本文中所使用之所有技術與科學用語具有屬於此項技術領域中具有通常知識者通常認識之相同意義。矛盾的情況時，以本發明說明書，包括定義，為基準。
本說明書中所述及之各文獻、專利或專利申請案的揭示內容，以參考方式併入本文。然而，此處所列者不應被理解為承認因優點或先前發明之早於本發明的揭示內容而影響本發明的權利。
除非具體指明，使用於本文之單字「一」、「一者」及「該」意指「至少一個」。
揭示於專利WO/2011/122011的研究已顯示於pH7.4對FcRn具有增加的結合之抗原-結合分子(例如抗-IL6受體抗體)能由血漿清除抗原且降低血漿中之總抗原濃度，且因而可藉由pH-依賴性抗原結合(於pH7.4於血漿中結合至抗原且於pH 6.0於酸性內體中解離該抗原)或藉由離子化鈣濃度-依賴性抗原結合(以高離子化鈣濃度於血漿中結合至抗原且以低離子化鈣濃度於內體中解離該抗原)改良抗原清除的效率(參照圖1B)。相較於傳統抗體，藉由於中性pH對於FcRn具有改良的結合親和性的pH-依賴性抗原結合抗體由血漿之抗原清除 機制係顯示於圖1A。
本發明提供於FcRn-結合域之新的胺基酸取代而增加抗原-結合分子於酸性與中性pH範圍之FcRn結合活性，其中該FcRn-結合活性於中性pH範圍強於完整IgG或包含完整FcRn-結合域之抗原-結合分子之一者(例如強於3200nM)。經改質抗原-結合分子於其投藥後相對於包含相同抗原-結合域而為完整人類IgGFcRn-結合域之對照抗原-結合分子，可降低血漿中之總抗原濃度。
Fc受體為免疫細胞之表面蛋白質，免疫細胞例如天然殺手細胞、巨噬細胞、中性球與肥大細胞。其等結合至抗體之Fc(片段，可結晶)區域，該區域與受感染細胞或侵入病原接觸且刺激吞噬性細胞或細胞毒性細胞以破壞微生物，或藉由抗體-媒介之吞噬作用或抗體-依賴性細胞-媒介的細胞毒性以破壞受感染細胞。
有數種類型之Fc受體，其係根據其所辨識之抗體類型而分類。本文中，詞語「FcRn」意指結合至IgG之新生兒Fc受體，結構類似於MHC第I型蛋白質，且於人類係由FCGRT基因編碼。
如使用於本文之詞語「FcRn結合域」意指直接或間接結合至FcRn的蛋白質域。較佳地，該FcRn為哺乳動物FcRn，更較佳為人類FcRn。直接結合至FcRn的FcRn結合域為抗體Fc區域。同時，能結合至例如白蛋白或IgG之具有人類FcRn-結合活性之多肽的區域，可經由白蛋白、IgG等間接結合至人類FcRn。因此，該等人類FcRn-結合域可為結合至具 有人類FcRn-結合活性之多肽的區域。
如使用於本文之詞語「Fc區域」或「抗原-結合分子之Fc區域」意指直接結合至FcRn的FcRn-結合域，較佳為哺乳動物FcRn，更較佳為人類FcRn。特別地，Fc區域為抗體之Fc區域。較佳地，該Fc區域為哺乳動物Fc區域，更較佳人類Fc區域。更特別地，本發明之Fc區域為包含人類免疫球蛋白的第2及第3恆定域(CH2與CH3)的Fc區域，更較佳為鉸鏈區、CH2與CH3。較佳地，該免疫球蛋白為IgG。較佳地，該Fc區域為人類IgG1之Fc區域。
本發明提供具有經改質FcRn-結合域之抗原-結合分子，其中該抗原-結合分子相較於具有完整FcRn-結合域之抗原-結合分子，於中性pH範圍具有增加的FcRn-結合活性。
忒別地，本發明提供具有經改質FcRn-結合域之抗原-結合分子，該FcRn-結合域於選自下述所成群組之一個或多個位置具有胺基酸取代：EU238、EU250、EU252、EU254、EU255、EU25、EU286、EU307、EU308、EU309、EU311、EU315、EU428、EU433、EU434與EU436。本發明之抗原-結合分子亦可於額外的位置包含取代。例如，該抗原-結合分子除了於上述一個或多個位置之取代之外，可包含於位置EU256之取代。較佳地，於位置EU256之胺基酸係經麩胺酸取代。
除非另行指明，詞語「結合親和性」或「結合活性」意指藉由測定二物質所形成之複合物之解離常數(KD)時之該二物質之間的非共價交互作用強度。結合蛋白質(或「配體」)，例如對於特定標靶分子(例如FcRn)可具有KD小於10-5、 10-6、10-7或10-8M。結合配體對於標靶於第一pH範圍之相較於對於標靶於第二pH範圍之較高親和性，可藉由於第一pH範圍結合標靶之數值KD，較於第二pH範圍結合標靶之數值KD為小而予以指示。結合親和性之差異可為至少1.5、2、3、4、5、10、15、20、50、70、80、100、500或1000倍。結合親和性可藉由各種方法測定，包含表面等離子共振、平衡透析、膠體過濾、ELISA或光譜(例如使用螢光分析)。
FcRn-結合域於pH範圍對於FcRn之增加的結合親和性係相應於與完整FcRn-結合域所測量的FcRn-結合親和性比較時，所測量的增加的FcRn-結合親和性。結合親和性之KD(完整)/KD(變異體)的差異至少為1.5、2、3、4、5、10、15、20、50、70、80、100、500或1000倍。FcRn-結合域對於FcRn之增加的結合親和性可於酸性或中性pH範圍。
詞語「包含完整FcRn結合域之抗原-結合分子」意指包含未經改質FcRn-結合域之抗原-結合分子。如使用於本文之詞語「完整IgG FcRn-結合域」意指人類IgG之未經改質FcRn-結合域。特別地，該FcRn-結合域為完整人類IgG之FcRn-結合域。較佳地，完整FcRn-結合域為完整Fc區域。詞語「包含完整Fc區域之抗體」意指包含未經改質Fc區域之抗體。該源自未經改質Fc區域之抗體較佳為IgG。更較佳地，其為人類IgG1、IgG2、IgG3或IgG4，又更較佳地為人類IgG1。本發明之特別較佳具體例中，包含完整Fc區域之抗體為包含未經改質Fc區域之抗體。包含完整Fc區域之抗體可為完整人IgG。
如使用於本文之詞語「完整IgG」意指未經改質IgG且不限於特定類型之IgG。此意味人類IgG1、IgG2、IgG3、IgG4或其同種異型變異體可使用作為「完整人類IgG」，只要其可於酸性pH範圍結合至人類FcRn。較佳地，「完整IgG」為人類IgG1。較佳地，完整IgG為包含野生型Fc區域之IgG。
本發明內容中，抗原-結合分子於中性pH範圍之增加的FcRn-結合活性較佳強於KD 3.2微莫耳，較佳地，於中性pH範圍之增加的FcRn-結合活性強於700奈米莫耳，更較佳地強於500奈米莫耳以及最較佳地強於150奈米莫耳。
於中性pH範圍之本發明抗原-結合分子增加的FcRn-結合活性一般比完整IgG之FcRn-結合活性強於約2-倍至約100-倍的範圍。較佳地，於酸性pH範圍之抗原-結合分子增加的FcRn-結合活性比完整IgG之FcRn-結合活性強於至少10-倍。更較佳地，於中性pH範圍之本發明抗原-結合分子增加的FcRn-結合活性比完整IgG之FcRn-結合活性強於至少20-倍。
如使用於本文之詞語「中性pH範圍」與「中性pH」，典型地意指pH 6.7至pH 10.0，較佳地為pH 7.0至pH 8.0內之任何pH值，其實例包括pH 7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9與8.0。特別較佳的酸性pH值為pH 7.4，其接近活體內之血漿(血液)pH。
如使用於本文之詞語「酸性pH範圍」與「酸性pH」，典型地意指pH 4.0至pH 6.5，較佳地為pH5.5至pH 6.5內之任何pH值，其實例包括pH 5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、 6.1、6.2、6.3、6.4與6.5。特別較佳的酸性pH值為pH 5.8至pH 6.0的範圍，其接近活體內之早期內體之pH。
胺基酸位置意指此應用中，除非另行指明，如「EU387」或「位置387」為根據稱為EU編號系統流程之編號(Kabat,E.A.,T.T.Wu,H.M.Perry,K.S.Gottesman,C.Foeler.1991.Sequences of Proteins of Immunological Interest.No.91-3242 U.S.Public Health Services,National Institutes of Health,Bethesda)以及意指FcRn-結合域的位置，特別是Fc區域。於類似方式中，取代係顯示為例如「EU387R」或「EU440E」，其中在「EU」之後所提供數字指示根據EU編號之取代位置以及在數字之後的字母為以單一字母碼所提供之經取代之胺基酸。取代可書寫成(胺基酸1)-位置(胺基酸2)，其中第1個胺基酸為經取代之胺基酸以及第2個胺基酸為於特定位置取代之胺基酸。
如使用於本文之詞語「取代」與「胺基酸之取代」意指於胺基酸序列之胺基酸以另一者置換，其中後者係不同於經置換之胺基酸。用於置換胺基酸的方法為此項技術領域者所習知且包括，但不限於，編碼該胺基酸序列之核苷酸序列的突變。更具體地，於FcRn-結合域之胺基酸取代意指相對於親代之胺基酸序列之胺基酸置換。已具有所欲取代之經改質FcRn-結合域亦包括於本發明之FcRn-結合域。親代FcRn-結合域為具有於位置EU238之脯胺酸、於位置EU250之蘇胺酸、於位置EU252之甲硫胺酸、於位置EU254之絲胺酸、於位置EU255之精胺酸、於位置EU256之蘇胺酸、於位置EU258之麩胺酸、 於位置EU286之天冬醯胺、於位置EU307之蘇胺酸、於位置EU308之纈胺酸、於位置EU309之白胺酸、於位置EU311之麩胺醯胺、於位置EU315之天冬醯胺、於位置EU387之脯胺酸、於位置EU422之纈胺酸、於位置EU424之絲胺酸、於位置EU426之絲胺酸、於位置EU428之甲硫胺酸、於位置EU433之組胺酸、於位置EU434之天冬醯胺、於位置EU436之酪胺酸、於位置EU438之麩胺醯胺與於位置EU440之絲胺酸且於中性pH對於FcRn無或為低的親和性(弱於3200nM)之FcRn-結合域。親代FcRn-結合域可包含於其他位置之取代，但較佳地，親代FcRn-結合域係未經改質。較佳地，親代FcRn結合域為Fc區域(親代Fc區域)。較佳地，親代Fc區域細衍生自哺乳動物抗體；更較佳地，親代Fc區域為人類抗體之Fc區域。本文中人類抗體之Fc區域較佳意指人類Fc區域。
親代Fc區域較佳為完整Fc區域，更較佳為人類完整Fc區域。較佳地，親代Fc區域為IgG之Fc區域，更較佳為人類IgG。甚至更較佳地，親代Fc區域為包含野生型鉸鏈區、野生型CH2與野生型CH3知人類Fc區域。本發明之內容中，詞語親代抗體意指包含親代Fc區域之抗體。
親代抗原-結合分子包括，但不限於，受體蛋白質(膜結合受體與可溶性受體)、辨識例如細胞表面標記之膜抗原的抗體以及辨識例如細胞激素之可溶性抗原的抗體。
如使用於本文之詞語「親代抗原-結合分子」意指具有親代FcRn-結合域之抗原-結合分子。「親代抗原-結合分子」之來源並無限定且可由任何有機體獲得：非人類的動物或 人類。較佳地，有機體係選自小鼠、大鼠、天竺鼠、倉鼠、長爪沙鼠、貓、兔、犬、山羊、綿羊、牛、馬、駱駝與非人類靈長類。於另一具體例中，「親代抗原-結合分子」亦可由食蟹猴、狨猴、獼猴、黑猩猩或人類化獲得。親代IgG可為天然產生的IgG，或天然產生的IgG之變異體或工程化版本。親代IgG可意指多肽本身、包含親代IgG之組成物、或編碼其等之胺基酸序列。應注意的是「親代IgG」包括已市售，如下文所概述之重組所製造之IgG。較佳地，「親代IgG」係由人類IgG1獲得，但不限於特定之IgG亞型。此意味人類IgG1、IgG2、IgG3或IgG4可合適地使用作為「親代IgG」。於相同方式中，來自前文所敘述之任何有機體之IgG的任何亞型可較佳地使用作為「親代IgG」。天然產生的IgG之變異體或工程化版本的實例係揭示於Curr Opin Biotechnol.2009 Dec；20(6)：685-91,Curr Opin Immunol.2008 Aug；20(4)：460-70,Protein Eng Des Sel.2010 Apr；23(4)：195-202、專利WO 2009/086320、WO 2008/092117、WO 2007/041635與WO 2006/105338，但不限於該等。
本發明之FcRn-結合域或Fc區域可包含於二個或多個位置之取代，於本文中意指「取代之組合」。例如，由組合「EU424/EU434/EU436」所定義之Fc區域為包含於位置EU424、EU434與EU436之取代的Fc區域。
取代胺基酸(該胺基酸係具有其中逾親代FcRn-結合域之胺基酸係經取代)可為任何胺基酸，除非本文中特別指明，包括但不限於下述所成群組：丙胺酸(Ala，A)、精胺酸(arg， R)、天冬醯胺(asn，N)、天冬胺酸(asp，D)、半胱胺酸(cys，C)、麩胺酸(glu，E)、麩胺醯胺(gln，Q)、甘胺酸(gly，G)、組胺酸(his，H)、異白胺酸(ile，I)、白胺酸(leu，L)、離胺酸(lys，K)、甲硫胺酸(met，M)、苯丙胺酸(phe，F)、脯胺酸(pro，P)、絲胺酸(ser，S)、蘇胺酸(thr，T)、色胺酸(trp，W)、酪胺酸(tyr，Y)與纈胺酸(val，V)。較佳地，於位置EU387、EU422、EU424、EU426、EU433、EU436、EU438與EU440之任一者之該取代胺基酸係選自下述所成群組：丙胺酸(Ala，A)、精胺酸(arg，R)、麩胺酸(glu，E)、麩胺醯胺(gln，Q)、天冬胺酸(asp，D)、絲胺酸(ser，S)、蘇胺酸(thr，T)、酪胺酸(tyr，Y)與離胺酸(lys，K)。
本發明之較佳具體例中，本發明之抗原-結合分子具有經改質FcRn-結合域其包含與經取代者為不同胺基酸之胺基酸取代於位置EU252與EU434以及於選自下述所成群組之一個或多個位置：EU238、EU250、EU252、EU254、EU255、EU258、EU286、EU307、EU308、EU309、EU311、EU315、EU428、EU433、EU434與EU436。
本文中除非具體指明，取代胺基酸可為任何胺基酸。對於位置EU238、EU250、EU252、EU254、EU255、EU258、EU286、EU307、EU308、EU309、EU311、EU315、EU428、EU433、EU434與EU436之取代胺基酸顯示於表1。
較佳地，本發明之經改質FcRn-結合域包含製烤一個表1所示之胺基酸取代。可使用FcRn-結合域而無任何改變，只要其以具有至少一個上述所提供之胺基酸於特定位置且該FcRn-結合域於酸性與中性pH範圍具有人類FcRn-結合活性，藉此使該FcRn-結合活性於中性pH範圍為增加的。
較佳具體例中，本發明之經改質抗原-結合分子包含於FcRn-結合域之三個或更多個位置之改質，其中該三個或更多個位置為表2、4至7所示之組合之一。
[表2]FcRn-結合域中取代位置之較佳組合
於更較佳具體例中，本發明之抗原-結合分子包含於FcRn-結合域之三個或更多個胺基酸取代，其中該三個或更多個取代為表3、12、14與17至20所示之組合之一。
[表3]FcRn-結合域中之較佳取代組合
安定性、免疫原性與凝集物形成
藉由導入取代而工程化FcRn-結合域可降低抗原-結合分子之安定性(WO/2007/092772)。藥物蛋白質的安定性對於製造醫藥品為重要的，此乃因具有不佳安定性之蛋白質於儲存期間傾向容易凝集。因此，因於Fc區域之取代所引起的降低的 安定性將使安定配方物的開發困難(WO2007/092772)。
此外，具有單體物種與高分子量物種之藥物蛋白質的純度，對於醫藥品開發亦為重要的。於蛋白質A純化後之野生型IgG1不含有顯著量的高分子量物種，但藉由導入取代而工程化之FcRn-結合域考造成大量的高分子量物種。於此情況中，高分子量物種需要藉由純化過程由大量藥物物質移除，在純化過程的開發中此點可能為困難的。
再者，蛋白質醫藥品於人類之免疫原性為重要的，此乃因抗-藥物抗體的存在將造成藥物由身體的廓清且因而損失治療藥效(IDrugs 2009；12：233-7.)。當取代經導入至野生型Fc域(如IgG1 Fc域)時，該經改質序列扁乘非-人類序列。該等經改質序列將藉由MHC第II型呈示且因此於人類患者為免疫原性的。
蛋白質將不會被開發作為藥物，如果該等蛋白質包含顯現不佳安定性與純度的Fc變異體，以及不佳的免疫原性將阻礙鄰床發展。因此本發明之一目的係改良於pH7.4的FcRn結合親和性而不損失顯著的安定性；增加高分子量物種比例的量，以及增加免疫原性風險(抗-藥物抗體形成的風險)。
(群1)
因此，本發明亦提供原-結合分子其包含在FcRn-結合域之胺基酸取代於位置EU252、EU434、EU307與EU311，具有於pH7對於FcRn的結合活性為高於15nM，熔解溫度Tm為57.5℃或更高，HMW低於2%以及低免疫原性，其中低免疫原 性係相當於以Epibase(Lonza)所測定之分數低於500。
較佳地，抗原-結合分子包含於FcRn-結合域中胺基酸取代於四個或更多個位置，其中該四個或更多個位置為下述所成群組之組合EU252/EU434/EU307/EU311/EU436，以及EU252/EU434/EU307/EU311/EU436與選自EU286、EU308與EU428所成群組之一個或多個位置的組合。
較佳組合示於表4。
特別較佳為表4之組合a)、g)、h)與i)。
於更較佳具體例中，經改質FcRn-結合域包含：於位置EU252之酪胺酸、於位置EU286之麩胺酸、於位置EU307之麩胺醯胺、於位置EU311之丙胺酸、於位置EU434之酪胺酸以及於位置EU436之纈胺酸；或於位置EU250之纈胺酸、於位置EU252之酪胺酸、於位置EU307之麩胺醯胺、於位置EU308之脯胺酸、於位置EU311之丙胺酸、於位置EU434之酪胺酸與於位置EU436之纈胺酸 ；或於位置EU250之纈胺酸、於位置EU252之酪胺酸、於位置EU286之麩胺酸、於位置EU307之麩胺醯胺、於位置EU308之脯胺酸、於位置EU311丙胺酸、於位置EU434之酪胺酸與於位置EU436之纈胺酸；或於位置EU250之纈胺酸、於位置EU252之酪胺酸、於位置EU286之麩胺酸、於位置EU307之麩胺醯胺、於位置EU308脯胺酸、於位置EU311之丙胺酸、於位置EU434之酪胺酸與於位置EU436之纈胺酸。
(群2)
本發明亦提供抗原-結合分子包含於FcRn-結合域中胺基酸取代於三個或更多個位置，其中該三個或更多個位置為下述所成群組之組合之一者：a)EU252/EU434/EU307/EU311；與b)EU252/EU434/EU308；其中該抗原-結合分子於中性pH之FcRn-結合活性為15至50nM，Tm高於60℃，HMW低於2%且其中該抗原-結合分子具有低免疫原性，據此低免疫原性係相當於以Epibase(Lonza)測定之分舒數低於500。
較佳具體例中，胺基酸取代係於四個或更多個位置，其中該四個或更多個位置為表5所示組合之一。
[表5]較佳組合
更較佳的為抗原-結合分子包含四個或更多個胺基酸取代，其中該四個或更多個取代為下屬所成群組之組合之一：於位置EU252之酪胺酸、於位置EU286之麩胺酸、於位置EU307之麩胺醯胺、於位置EU311之丙胺酸與於位置EU434之酪胺酸；於位置EU252之酪胺酸、於位置EU254之蘇胺酸、於位置EU286之麩胺酸、於位置EU307之麩胺醯胺、於位置EU311之丙胺酸與於位置EU434之酪胺酸；於位置EU252之酪胺酸、於位置EU307之麩胺醯胺、於位置EU311之丙胺酸、於位置EU434之酪胺酸與於位置436之異白胺酸；於位置EU252之酪胺酸、於位置EU254之蘇胺酸、於位置EU286之麩胺酸、於位置EU307之麩胺醯胺、於位置EU311之丙胺酸、於位置EU434之酪胺與於位置EU436之異白胺酸；於位置EU250之纈胺酸、於位置EU252之酪胺酸、於位置EU254之蘇胺酸、於位置EU308之脯胺酸、於位置EU434之酪胺酸與於位置EU436之纈胺酸； 於位置EU250之纈胺酸、於位置EU252之酪胺酸、於位置EU307之麩胺醯胺、於位置EU311之丙胺酸、於位置EU434之酪胺酸與於位置EU436之纈胺酸；於位置EU252之酪胺酸、於位置EU307之麩胺醯胺、於位置EU311之丙胺酸、於位置EU434之酪胺酸與於位置EU436之纈胺酸；於位置EU250之纈胺酸、於位置EU252之酪胺酸、於位置EU308之脯胺酸、與於位置EU434之酪胺酸；以及於位置EU250之纈胺酸、於位置EU252之酪胺酸、於位置307之麩胺醯胺、於位置EU308之脯胺酸、於位置EU311之丙胺酸與於位置EU434之酪胺酸。
(群3)
本發明亦提供抗原-結合分子包含於FcRn-結合域之胺基酸取代於位置EU252/EU434；以及於位置EU436及/或於位置EU254及/或於位置EU315；且於pH 7具有FcRn-結合活性為50至150nM，Tm高於63℃，HMW低於2%且其中該抗原-結合分子具有低免疫原性，據此低免疫原性係相當於以Epibase(Lonza)測定之分數低於250。
較佳地，胺基酸取代為三個或更多個位置，其中該三個或更多個位製為表6所適組合之一。
[表6]較佳組合
於較佳具體例中，該經改質抗原-結合分子包含三個或更多個胺基酸取代，其中該三個或更多個胺基酸取代為下述所成群組之組合之一：於位置EU252之酪胺酸、於位置EU315之天冬胺酸與於位置EU434之酪胺酸；於位置EU252之酪胺酸、於位置EU434之酪胺酸與於位置EU436之異白胺酸；於位置EU252之酪胺酸、於位置EU434之酪胺酸與於位置EU436之白胺酸；於位置EU252之酪胺酸、於位置EU434之酪胺酸與於位置EU436之纈胺酸；以及於位置EU252之酪胺酸、於位置EU254之蘇胺酸、於位置EU434之酪胺酸與於位置EU436之異白胺酸。
(群4)
本發明進一步提供抗原-結合分子其包含於FcRn-結合域之三個或更多個胺基酸取代，其中該三個或更多個胺基酸取代為表7所示組合之一。該經改質抗原-結合分子於pH 7具有FcRn-結合活性為150至700nM，Tm高於66.5℃，HMW低於2%且其中該抗原-結合分子具有低免疫原性，據此低免疫原性係相當於以Epibase(Lonza)測定之分數低於250。
[表7]
較佳地，經改質抗原-結合分子包含三個或更多個取代，其中該三個或更多個取代為下述所成群組之組合之一於位置EU307之麩胺醯胺、於位置EU311之組胺酸與於位置EU434之酪胺酸；於位置EU307之麩胺醯胺、於位置EU309之麩胺酸、於位置EU311之丙胺酸、於位置EU434之酪胺酸；於位置EU307之麩胺醯胺、於位置EU309之麩胺酸、於位置EU311之組胺酸、於位置EU434之酪胺酸；或於位置EU250之纈胺酸、於位置EU252之酪胺酸、於位置EU434之酪胺酸、於位置EU436之纈胺酸。
預先存在之抗-藥物抗體
抗體中之胺基酸的取代可產生負向結果，例如至料抗體之免疫原性增加，換言之，其可造成細胞激素風暴及/或抗-藥物抗體(ADA)的產生。由於ADA可影響治療抗體的藥效與藥物動力學，而且有時候導致嚴重的副作用，治療抗性體的臨床利用與藥效會受到限制。許多因子影響治療抗體之免疫原性，以及起效子T-細胞抗原決定基的存在為因子之一。同樣地，對抗治療抗體之預先存在之抗體的出現亦可能成為問題。該預先存在之抗體的一實例為類風濕性因子(RF)，自體抗體(抗體相關於對抗自體蛋白質)對抗抗體(亦即IgG)的Fc部分。類風濕性因子已見於特別是罹患全身性紅斑狼瘡(SLE)或風濕性關節炎 的患者。關節炎患者中，RF與IgG聯合以形成免疫複合物其有助於疾病進程。近來，經報導具有Asn434His突變之人源化抗-C IgG1抗體引起顯著的類風濕性因子結(Clin Pharmacol Ther.2011 Feb；89(2)：283-90(NPL 9))。詳細的研究已證實於人類IgG1之Asn434His突變，相較於親代人類IgG1，增加類風濕性因子對該抗體之Fc區域的結合。
RF為對抗人類IgG1的多株自體-抗體，以及於人類IgG序列之RF的抗原決定基於純株之間變異，但RF抗原決定機似乎位於CH2/CH3介面區域以及CH3域可與FcRn節和抗原決定基重疊。因此，於中性pH增加對FcRn的結合親和性的突變，亦可能增加對RF之特定純株的結合親和性。
因此，較佳為於中性及/或酸性pH增加對FcRn的結合親和性而不增加治療抗體於中性pH對於血漿中預先存在之抗體的結合親和性。
因此，本發明亦提供抗原-結合分子包含經改質FcRn-結合域(較佳為經改質Fc區域)，藉此相較於包含野生型Fc區域之抗原-結合分子的結合親和性，預先存在之ADA於中性pH的結合活性不顯著增加。經改質FcRn-結合域(經改質Fc區域)較佳包含胺基酸取代於選自EU387、EU422、EU424、EU426、EU433、EU436、EU438與EU440所成群組之一個或多個位置。
上述取代較佳係經導入至於中性或酸性pH對於FcRn具有增加的親和性之抗原-結合分子的FcRn-結合域或Fc區域，藉此該經改質FcRn-結合域或Fc區域於中性pH對於 預先存在之ADA具有增加的結合活性。取代的效果為對於預先存在的ADA的結合活性的降低。因此，於較佳具體例中，相較於於中性或酸性pH對於FcRn具有增加的結合活性以及於中性pH範圍對於預先存在之抗-藥物抗體具有增加的活性之FcRn-結合域或Fc區域，本發明之經改質FcRn-結合域或經改質Fc區域對於預先存在之ADA具有降低的結合活性。較佳地，於中性pH對於FcRn與預先存在之ADA具有增加的結合活性之抗原-結合分子為抗原-結合分子包含胺基酸取代於如上所述之選自下述所成群組之一個或多個位置：EU238、EU250、EU252、EU254、EU255、EU258、EU286、EU307、EU308、EU309、EU311、EU315、EU428、EU433、EU434與EU436。除了上述之一個或多個位置外，亦可包含取代於位置EU256。較佳地，胺基酸於位置EU256係以麩胺酸取代。
因此，本發明亦提供包括於中性或酸性pH對於FcRn具有增加的親和性之經改質Fc區域之抗原-結合分子，藉此相較於包含野生型Fc區域之抗原-結合分子的結合親和性，於中性pH對於預先存在之抗-藥物抗體(ADA)之親和性無顯著增加。於較佳具體例中，本發明提供包括於中性或酸性pH對於FcRn具有增加的親和性之經改質Fc區域之抗原-結合分子，其包含胺基酸取代於選自下述所成群組之一個或多個位置：EU387、EU422、EU424、EU426、EU433、EU436、EU438與EU440。
較佳地，該包括於中性或酸性pH對於FcRn具有增加的親和性之經改質Fc區域之抗原-結合分子，藉此相較於 對照之抗原-結合分子，於中性pH對於預先存在之ADA之結合活性無顯著增加，其中該wherein the經改質Fc區域包含胺基酸取代於選自表8所示取代之一個或多個位置。
如使用於本文之詞語「抗-藥物抗體」與「ADA」意指對於位在治療性抗體之抗原決定基具有結合親和性且因而能結該治療性抗體之內源性抗體。如使用於本文之詞語「預先存在之抗-藥物抗體」與「預先存在之ADA」意指於治療性抗體投藥至患者之前，存在於患者的血液且可偵測的抗-藥物抗體。較佳地，該預先存在之ADA為人類抗體。於特別較佳具體例中，該預先存在之ADA類風濕性因子，對抗人類IgG抗體之Fc區域的多株或單株自體抗體。類風濕性因子的抗決定基係位在CH2/CH3界面區域以及CH3域，但於純株之間有變動。
包括於中性或酸性pH對於FcRn且於中性pH對於預先存在之抗-藥物抗體具有增加的親和性之經改質Fc區域之抗原-結合分子之FcRn-結合域區域之抗原-結合分子為包括FcRn-結合域(或Fc區域)之抗原-結合分子，相較於包含完整 FcRn-結合域(或完整Fc區域)之抗體，該FcRn-結合域(或Fc區域)經改質以增加抗原-結合分子之FcRn-結合域(或Fc區域)之結合親和性。改質涉及包括，但不限於，於抗原-結合域之Fc區域之胺基酸序列的胺基酸取代。包括FcRn-結合域或Fc區域之抗原-結合分子，其對於下述者具有增加的結合活性a)於中性pH範圍之預先存在之ADA以及於中性(在中性pH具有增加的FcRn-結合活性之感興趣的抗原-結合分子的情況)或酸性pH(在酸性pH具有增加的FcRn-結合活性之感興趣的抗原-結合分子的情況)對於FcRn，本文中稱為「參考抗體」。「參考抗體」較佳為於選自EU387、EU422、EU424、EU426、EU433、EU436、EU438與EU440所成群組之一個或多個位置取代胺基酸前之經改質抗原-結合分子，更較佳地為經導入表8所示取代之任一者前之經改質抗原-結合分子。「參考抗體」可為抗原-結合分子其包括於FcRn-結合域之胺基酸取代於選自下述所成群組之一個或多個位置：EU238、EU250、EU252、EU254、EU255、EU256、EU258 EU286、EU307、EU308、EU309、EU311、EU315、EU428、EU433、EU434與EU436。
於中性pH具有增加的FcRn-結合活性之「參考抗體」為抗原-結合分子其包括於中性pH範圍對於FcRn具有增加的親和性的Fc區域且於中性pH對於預先存在之ADA具有增加的親和性，包括於Fc區域之胺基酸取代於位置EU252與EU434；以及選自下述所成群組之一個或多個位置：EU238、EU250、EU254、EU255、EU256、EU258、EU286、EU307、EU308、 EU309、EU311、EU315、EU428、EU433與EU436。
更較佳地，該包括於中性pH對於FcRn具有增加的親和性之Fc區域且於中性pH範圍對於預先存在之ADA具有增加的親和性之抗原-結合分子，包括表9所示之組合之一。
[表9]於中性pH範圍具有增加的FcRn-結合活性之參考抗體的取代之較佳組合
於酸性pH具有增加的FcRn-結合活性之「參考抗體」為抗原-結合分子其包括於中性pH範圍對於FcRn具有增加的親和性的Fc區域且於中性pH對於預先存在之ADA具有增加的親和性，較佳包括取代於於位置EU434，或ii)於二個或更多個位置，其中該二個或更多個位置為選 自下述所成群組之組合之一：a)EU252/EU254/EU256；b)EU428/EU434；與c)EU250/EU428。
較佳地，該包括於酸性pH範圍具有增加的親和性之Fc區域且於中性pH範圍對於預先存在之ADA具有增加的親和性之抗原-結合分子包括取代M434H；或ii)下述所成群組之組合之一：a)M252Y/S254T/T256E；b)M428L/N434S；與c)T250Q與M428L(EU編號)。
較佳地，該包括Fc區域之抗原-結合分子(該Fc區域包括下述取代或組合之一者a)M252Y/S254T/T256E、b)M428L/N434S或c)T250Q與M428L or d)M434H(EU編號))於酸性pH對於FcRn具有增加的結合活性而於中性pH範圍不增加結合活性。
對於預先存在之抗-藥物抗體之抗原-結合分子之Fc區域的結合活性於目前應用中係於中性pH以電化學發光(ECL)表現；然而，其他適合用於測定對於預先存在之ADA之結合活性的方法為此項技術領域中具有通常知識者所習知。ECL分析係舉例說明於Moxness等人(Clin Chem、2005、51：1983-85)以及本發明之實施例。測定對於預先存在之ADA之結合活性之分析所使用之條件，可由此項技術領域者予以合適的選擇，且因而不特別限制。
對於預先存在之ADA之增加的或較高的結合親和性，相較於對照抗原-結合分子之對於預先存在之ADA之結合親和性為增加的。
如使用於本文之詞語「對照抗原-結合分子」意指包括完整人類Fc區域之抗原-結合分子，較佳為包括完整人類Fc區域之抗體或抗體衍生物。
對於預先存在之ADA之結合親和性可於溫度自10℃至50℃予以評估。較佳地，應用15℃至40℃以測定人類Fc區域與人類預先存在之ADA之間的結合親和性。更較佳地，由20℃至35℃之任和溫度，例如應用20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34與35℃之任一者以測定人類Fc區域與人類預先存在之ADA之間的結合親和性。較佳地，溫度係於20與25℃之間，更較佳地為25℃。較佳具體例中，人類預先存在之ADA與人類Fc區域之間的交互作用係於pH 7.4(或pH7.0)且於25℃測定。
本發明之內溶中，詞語「對於預先存在之ADA之增加的結合親和性」意指相較於對照抗原-結合分子之對於預先存在之ADA所測定之結合親和性，本發明之抗原-結合分子所測定之結合親和性(亦即KD)的增加。該等對於結合親和性for a預先存在之ADA之結合親和性的增加可於個別患者或患者群中觀察到。
如使用於本文之詞語「患者群」或「患者」，不特別限定且包含罹患疾病之所有人類以及對其投藥治療或治療性抗原-結合分子。較佳地，患者為罹患自體免疫疾病者。更較佳地，患者為罹患關節炎疾病或全身性紅斑狼瘡(SLE)者。關節炎疾病特別包括類風濕性關節炎。
本發明之內容中，於個別患者之對於預先存在之 ADA的結合活性的顯著增加，相較於對照抗原-結合分子對於預先存在之ADA的結合活性，係對應於患者之包括經改質Fc區域之治療性抗原-結合分子(亦即，治療性抗體)對於預先存在之ADA的結合活性測定增加至少10%、至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%。相較於對照抗原-結合分子對於預先存在之ADA的結合活性，該包括經改質Fc區域之抗原-結合分子的結合活性，較佳的該增加為至少20%、更較佳的該增加為至少30%，甚至較佳的其至少40%以及最較佳的該增加為至少50%。或者，於患者之對於預先存在之ADA的抗原-結合分子的結合活性顯著增加，較佳為ECL回應對於該抗原-結合分子多於250，較佳為對ECL之至少500，更較佳為對ECL之至少1000，最較佳為對ECL之至少2000。更較佳地，相較於對照抗原-結合分子之ECL回應該增加為低於500(更較佳為低於250)。對照抗原-結合分子之對於預先存在之ADA之結合活性與具有經改質Fc區域之抗原-結合分子之間的較佳範圍，特別於ECL回應由低於250達至少250，由低於250達至少500，由低於500達500或更高，由低於500至1000或更多，以及由低於500達至少2000。
對於預先存在之ADA之結合活性的增加，亦可回應於患者族群之部分患者中所測定的增加，相較於中性pH對於對照抗原-結合分子具有ECL回應至少500(較佳為至少250)的部分患者，對抗原-結合分子具有ECL回應至少500(較佳為至少250)，該抗原-結合分子a)於中性或酸性pH對於FcRn以及b)於中性pH對於預先存在之ADA具有增加的結合活 性。患者族群之部分患者中的「顯著」增加，相較於對於對照抗原-結合分子具有ECL回應的部分患者，較佳為增加至少10%、至少20%、至少30%、至少40%、至少50%患者，該患者具有包含經改質Fc區域之治療性抗原-結合分子於中性pH對於類風濕性因子具有ECL回應為500或更低(較佳為250或更高)。較佳地，該增加為至少20%，更較佳地為至少30%，甚至更較佳地，其為至少40%以及最較佳地為50%或更高。
本發明內容中，對於預先存在之ADA之結合親和性的降低意指相較於對參考抗體所測定之結合活性，測定到降低的結合活性(亦即，KD或ECL回應)，該等對於預先存在之ADA之結合親和性的降低，可於個別患者或患者族群中觀察。於個別患者中，在中性pH之治療性抗原-結合分子對於預先存在之ADA的親和性降低，意指相較於該患者之參考抗體於中性pH對於預先存在之ADA所測定之結合活性，於中性pH測定到降低的結合活性。較佳地，相較於參考抗體於中性pH對於預先存在之ADA所測定之結合活性，於個別患者之顯著降低為經改質抗原-結合分子對於預先存在之ADA之結合活性於中性pH測定到降低為至少10%、至少20%、至少30%、至少40%、至少50%。更較佳地，相較於參考抗體，該降低為至少30%，甚至更較佳為40%以及最較佳為50%。
或者，於個別患者之經改質抗原-結合分子對於預先存在之ADA之結合活性的顯著降低，可測定為相較於參考抗體之ECL回應，該抗原-結合分子之ECL回應的降低為500或更高(較佳地，由ECL為1000或更高、更較佳地由ECL為 2000或更高)，至低於500，較佳地低於250。較佳的降低為由ECL回應之500或更高至ECL回應之低於500，更較佳由至少250至低於250，甚至更較佳由至少500至低於250。較佳範圍為，具體地，由至少250至低於250、由至少500至低於250、由至少1000至低於250、由至少2000至低於250、由至少500至低於500、由至少1000至低於500以及由至少2000至低於500。
降低亦可為患者族群中之患者百分比的降低，該患者族群具有其預先存在之ADA於中性pH範圍對於經改質抗原-結合分子之增加的結合。換言之，該降低可測定為相較於對參考抗體之ECL回應，具有其預先存在之ADA對經改質抗原-結合分子之ECL回應之族群的百分比降低。較佳地，降低可為相較於具有參考抗體對於預先存在之ADA之增加的結合活性之部分患者，其中之治療性抗原-結合分子對於預先存在之ADA具有增加的結合性之患者族群中之部分患者降低至少10%、至少20%、至少30%、至少40%、至少50%，其中該增加的結合活性係表示為ECL回應之500或更高，較佳地為250或更高。較佳地該降低為至少20%，更較佳地該降低為至少30%，甚至更較佳，其為40%以及最較佳地為50%或更高。
較佳具體例中，本發明之治療性抗原-結合分子於中性pH對於預先存在之ADA具有低的結合活性。特別地，本發明之經改質抗原-結合分子於中性pH對於預先存在之ADA的結合活性，相較於參考抗體於中性pH對於預先存在之ADA 的結合活性，為顯著降低。更較佳地，本發明之經改質抗原-結合分子於中性pH對於預先存在之ADA的結合活性，相較於對照抗原-結合分子(具有對於作為對照抗原-結合分子之預先存在之ADA約相同活性)之結合活性，為不顯著增加。對於預先存在之ADA的低的結合活性或基線親和性，較佳於個別患者之ECL回應不低於500。較佳地，ECL回應不低於250。於患者族群中，對於預先文在之ADA的低的結合活性，於患者族群之90%患者中之ECL回應不低於500，更較佳為95%患者中，最較佳為98%患者中。
更較佳具體例中，包括具有於中性或酸性pH對於FcRn具有增加的勤合性之經改質FcRn-結合域之抗原-結合分子，其中相較於對照抗原-結合分子，於中性pH對於預先存在之ADA的結合活性不顯著增加，藉此本發明之經改質FcRn-結合域包括表10所示一個或多個位置或組合之取代。
更較佳具體例中，本發明之抗原-結合分子包括具有表11所示之一個或多個取代或組合之經改質FcRn-結合域。
較佳具體例中，具有a)於中性或酸性pH對於FcRn之增加的親和性b)於中性pH對於預先存在之ADA之結合親和性相較於對照抗原-結合分子為不顯著增加之包括經改 質FcRn-結合域之抗原-結合分子，該抗原-結合分子包括表12所示取代組合之任一者。
亦較佳地，於中性pH範圍具有增加的FcRn結合活性且於中性pH對於預先存在之ADA之結合親和性相較於包括野生型Fc區域之抗原-結合分子為不顯著增加的抗原-結合分子，包括胺基酸取代於FcRn-結合域於a)選自下述所成群組之一個或多個位置：EU387、EU422、EU424、EU438、EU440、EU433，或b)二個或更多個位置，其中該二個或更多個位置矽誜組合：EU422/EU424；或EU438/EU440。更較佳地，該取代為選自表11所示組合。
甚至更較佳地，於中性pH範圍對於FcRn具有增加的結合活性且於中性pH對於預先存在之ADA之結合親和性相較於包括野生型Fc區域之抗原-結合分子為不顯著增加的抗原-結合分子包括表12所示的取代組合之任一者。特別地，於中性pH範圍具有增加的FcRn結合活性而藉此於中性pH對於預先存在之ADA之結合親和性不顯著增加的較佳經改質抗原-結合分子whereby the結合親和性包括三個或更多個取代於FcRn-結合域，其中該三個或更多個取代為表12所示之組合編號(2)至(26)與(28)至(59)之任一者。
[表12]於中性pH範圍增加FcRn-結合活性而不顯著地增加對於預先存在之ADA的結合活性之Fc區域的取代組合(根據EU編號流程所提供的位置)。
本發明亦提供於酸性pH範圍對於FcRn具有增加的結合活性且於中性pH對於預先存在之ADA之結合親和性相較於對照抗原-結合分子為不顯著增加的抗原-結合分子，包括胺基酸取代於a)位置EU424或b)位置EU438/EU440。
更較佳地，取代選自於a)EU424N與EU438R/EU440E。
較佳地，於酸性pH範圍對於FcRn具有增加的結合活性且於中性pH對於預先存在之ADA之結合親和性相較於對照抗原-結合分子為不顯著增加的抗原-結合分子的FcRn-結合域，包括表13所示取代組合之一。更較佳地，於酸性範圍具有增加的FcRn-結合活性且藉此於中性pH對於預先存在之ADA之結合親和性相較於對照抗原-結合分子為不顯著增加的抗原-結合分子，包括表13所示取代組合編號(13)至(28)之任一者。
[表13]於酸性pH範圍增加FcRn-結合活性而不顯著地增加對於
除了取代於位置EU387、EU422、EU424、EU426、EU433、EU436、EU438與EU440之任一者外，本發明之Fc區域進一步亦包括下述胺基酸取代於下述位置之一者或多者：EU248、EU249、EU250、EU251、EU252、EU253、EU254、EU255、EU256、EU257， EU305、EU306、EU307、EU308、EU309、EU310、EU311、EU312、EU313、EU314，EU342、EU343、EU344、EU345、EU346、EU347、EU348、EU349、EU350、EU351、EU352、EU380、EU381、EU382、EU383、EU384、EU385、EU386、EU388，EU414、EU415、EU416、EU417、EU418、EU419、EU420、EU421、EU423、EU425、EU427、EU428、EU429、EU430、EU431、EU432、EU433、EU434、EU435、EU436、EU437、EU441、EU442、EU443與EU444。
於該等位置之任一者取代Fc區域可降低對於預先存在之ADA的結合親和性，特別是對於類風濕性因子，而不負向影響對於FcRn的結合親和性。
進一步地，本發明的方法可進一步包括於一個或多個下述位置取代如上述的抗原-結合分子的Fc區域的步驟：EU248、EU249、EU250、EU251、EU252、EU253、EU254、EU255、EU256、EU257，EU305、EU306、EU307、EU308、EU309、EU310、EU311、EU312、EU313、EU314、EU342、EU343、EU344、EU345、EU346、EU347、EU348、EU349、EU350、EU351、EU352、EU380、EU381、EU382、EU383、EU384、EU385、EU386、EU388，EU414、EU415、EU416、EU417、EU418、EU419、EU420、EU421、EU423、EU425、EU427、EU428、EU429、EU430、EU431、EU432、EU433、EU434、EU435、EU436、EU437 、EU441、EU442、EU443與EU444。
對於起效子受體為弱的或無結合活性、或結合至Fc β受體之補體蛋白質、或補體蛋白質，亦可引起不欲之反應(例如不適合的血小板活化)。不結合例如Fc β RIIa受體之起效子受體的經改質抗原-結合分子較為安全及/或較為有效。因此，較佳具體例中，本發明之經改質抗原-結合分子額外地對於起效子受體具有弱的結合活性或不結合至起效子受體。起效子受體之實例包含但不限於活化Fc β受體，特別是Fc β受體I、Fc β受體II與Fc β受體III。Fc β受體I包含Fc β受體Ia、Fc β受體Ib與Fc β受體Ic與其亞型。Fc β受體II包含Fc β受體IIa(其具有二個同種異型R131與H131)與Fc β受體IIb。Fc β受體III包含Fc β受體IIIa(其具有二個同種異型：V158與F158)與Fc β受體IIIb(其具有二個同種異型：Fc β IIIb-NA1與Fc β IIIb-NA2)。對於起效子受體具有弱的結合活性或不結合至起效子受體的抗體，例如為包括靜默Fc區域之抗體或無Fc區域之抗體(例如Fab、F(ab)'2、scFv、sc(Fv)2、雙體抗體(diabodies))。
對於起效子受體具有弱的結合活性的Fc區域，例如揭示於Strohl等人(Current Opinion in Biotechnology(2009)20(6),685-691)者。特別地，其揭示例如去糖基化Fc區域(N297A,N297Q)與靜默Fc區域之實例，其具有Fc區域經工程化為靜默(或免疫壓抑)起效子功能性(IgG1-L234A/L235A、IgG1-H268Q/A330S/P331S、IgG1-C226S/C229S、IgG1-C226S/C229S/E233P/L234V/L235A、IgG1-L234F/L235E/P331S、IgG2- V234A/G237A、IgG2-H268Q/V309L/A330S/A331S、IgG4-L235A/G237A/E318A、IgG4-L236E)。專利WO2008/092117揭示包括Fc區域之抗體，該Fc區域包括靜默Fc區域其包括取代G236R/L328R、L235G/G236R、N325A/L328R或N325L/L328R(位置根據EU編號系統)。再者，專利WO 2000/042072揭示包括靜默Fc區域之抗體，該Fc區域包括取代於下述一個或多個位置：EU233、EU234、EU235與EU237。專利WO 2009/011941揭示包括靜默Fc區域之抗體，該Fc區域包括由EU231至EU238的殘基刪除。Davis等人(Journal of Rheumatology(2007)34(11)：2204-2210)揭示包括靜默Fc區域之抗體，該Fc區域包括取代C220S/C226S/C229S/P238S。Shields等人(Journal of Biological Chemistry(2001)276(9),6591-6604)揭示包括靜默Fc區域之抗體，該Fc區域包括取代D265A。
詞語「對於起效子受體之弱的結合」意指結合活性為完整IgG(或包含完整Fc區域之抗體)對於起效子受體之結合活性之95%或更低，較佳為90%或更低、85%或更低、80%或更低、75%或更低，更較佳為70%或更低、65%或更低、60%或更低、55%或更低、50%或更低、45%或更低、40%或更低、35%或更低、30%或更低、25%或更低、20%或更低、15%或更低、10%或更低、9%或更低、8%或更低、7%或更低、6%或更低、5%或更低、4%或更低、3%或更低、2%或更低、1%或更低。對於FcβR之結合活性，相較於完整IgG(或包含完整Fc區域之抗體)對於起效子受體之結合活性，較佳降低倍數為至 少約10-倍或更多，約50-倍或更多，約100-倍或更多。
靜默Fc區域為包括一個或多個胺基酸取代、插入、增加及/或刪除之經改質Fc區域，相較於完整Fc區域其降低對於起效子受體之結合。對於起效子受體之結合活性可降低多達該Fc區域不再結合起效子受體。靜默Fc區域的實例包含但不限於其包括胺基酸取代於選自下述所成群組之一個或多個位置的Fc區域：EU234、EU235、EU236、EU237、EU238、EU239、EU265、EU266、EU267、EU269、EU270、EU271、EU295、EU296、EU297、EU298、EU300、EU324、EU325、EU327、EU328、EU329、EU331與EU332。
特別地，靜默Fc區域具有選自下述列表之胺基酸取代於選自下述所成群組之一個或多個位置：EU234、EU235、EU236、EU237、EU238、EU239、EU265、EU266、EU267、EU269、EU270、EU271、EU295、EU296、EU297、EU298、EU300、EU324、EU325、EU327、EU328、EU329、EU331與EU332。較佳地，靜默Fc區域具有選自下述列表之胺基酸取代於選自下述所成群組之一個或多個位置：EU235、EU237、EU238、EU239、EU270、EU298、EU325與EU329。
胺基酸於位置EU234較佳係以選自下述所成群組之胺基酸之一者置換：Ala、Arg、Asn、Asp、Gln、Glu、Gly、His、Lys、Met、Phe、Pro、Ser與Thr。
胺基酸於位置EU235較佳係以選自下述所成群組之胺基酸之一者置換：Ala、Asn、Asp、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Lys、Met、Pro、Ser、Thr、Val與Arg。
胺基酸於位置EU236較佳係以選自下述所成群組之胺基酸之一者置換：Arg、Asn、Gln、His、Leu、Lys、Met、Phe、Pro與Tyr。
胺基酸於位置EU237較佳係以選自下述所成群組之胺基酸之一者置換：Ala、Asn、Asp、Gln、Glu、His、Ile、Leu、Lys、Met、Pro、Ser、Thr、Val、Tyr與Arg。
胺基酸於位置EU238較佳係以選自下述所成群組之胺基酸之一者置換：Ala、Asn、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Lys、Thr、Trp與Arg。
胺基酸於位置EU239較佳係以選自下述所成群組之胺基酸之一者置換：Gln、His、Lys、Phe、Pro、Trp、Tyr與Arg。
胺基酸於位置EU265較佳係以選自下述所成群組之胺基酸之一者置換：Ala、Arg、Asn、Gln、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Ser、Thr、Trp、Tyr與Val。，
胺基酸於位置EU266較佳係以選自下述所成群組之胺基酸之一者置換：Ala、Arg、Asn、Asp、Gln、Glu、Gly、His、Lys、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp與Tyr。
胺基酸於位置EU267較佳係以選自下述所成群組之胺基酸之一者置換：Arg、His、Lys、Phe、Pro、Trp與Tyr。
胺基酸於位置EU269較佳係以選自下述所成群組之胺基酸之一者置換：Ala、Arg、Asn、Gln、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr與Val。
胺基酸於位置EU270較佳係以選自下述所成群組之胺基 酸之一者置換：Ala、Arg、Asn、Gln、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr與Val。
胺基酸於位置EU271較佳係以選自下述所成群組之胺基酸之一者置換：Arg、His、Phe、Ser、Thr、Trp與Tyr。
胺基酸於位置EU295較佳係以選自下述所成群組之胺基酸之一者置換：Arg、Asn、Asp、Gly、His、Phe、Ser、Trp與Tyr。
胺基酸於位置EU296較佳係以選自下述所成群組之胺基酸之一者置換：Arg、Gly、Lys與Pro。
胺基酸於位置EU297較佳以Ala置換。
胺基酸於位置EU298較佳係以選自下述所成群組之胺基酸之一者置換：Arg、Gly、Lys、Pro、Trp與Tyr。
胺基酸於位置EU300較佳係以選自下述所成群組之胺基酸之一者置換：Arg、Lys與Pro。
胺基酸於位置EU324較佳以Pro置換。
胺基酸於位置EU325較佳係以選自下述所成群組之胺基酸之一者置換：Ala、Arg、Gly、His、Ile、Lys、Phe、Pro、Thr、Trp、Tyr與Val。
胺基酸於位置EU327較佳係以選自下述所成群組之胺基酸之一者置換：Arg、Gln、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr與Val。
胺基酸於位置EU328較佳係以選自下述所成群組之胺基酸之一者置換：Arg、Asn、Gly、His、Lys與Pro。
胺基酸於位置EU329較佳係以選自下述所成群組之胺基 酸之一者置換：Asn、Asp、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Ser、Thr、Trp、Tyr、Val與Arg。
胺基酸於位置EU330較佳以Pro或Ser置換。。
胺基酸於位置EU331較佳係以選自下述所成群組之胺基酸之一者置換：Arg、Gly與Lys。
胺基酸於位置EU332較佳係以選自下述所成群組之胺基酸之一者置換：Arg、Lys與Pro。
較佳地，靜默Fc區域包括以Lys或Arg取代於位置EU235、以Lys或Arg取代於EU237、以Lys或Arg取代於EU238、以Lys或Arg取代於EU239、以Phe取代於EU270、以Gly取代於EU298、以Gly取代於EU325或以Lys或Arg取代於EU329。更較佳地，靜默Fc區域包括以精胺酸取代於位置EU235以及以離胺酸取代於位置EU239。更較佳地，其包括取代L235R/S239K。
再者，本發明之經改質抗原-結合分子較佳為經去糖基化的。更較佳地，本發明之經改質抗原-結合分子包含突變於重鏈糖基化位點以防止於該位點之糖基化，例如揭示於專利WO2005/03175。因此，本發明之較佳具體例中，該經改質無糖基之抗原-結合分子戲藉由改質重鏈糖基化位點，亦即導入取代N297Q或N297A(位置根據EU編號系統)且於合適宿主細胞中表現該蛋白質。用於導入取代的方法可使用實施例所揭示者。
本發明之特定具體例中，本發明之經改質抗原-結合分子其對於補體蛋白質具有弱的結合活性或不結合至補體 蛋白質。較佳地，該補體蛋白質為C1q。對於補體蛋白質為弱的結合活性，較佳為於補體蛋白質的結合活性，相較於完整IgG或包含完整Fc區域之抗體之對於補體蛋白質的結合活性，其降低倍數約10倍或更高，約50-倍或更高，約100-倍或更高。Fc區域對於補體蛋白質之結合活性可藉由改質胺基酸序列而降低，例如胺基酸胺基酸取代、插入、增加及/或刪除。
本發明之較佳具體例中，該抗原-結合分子於酸性或中性pH具有增加的FcRn-結合親和性且對於起效子受體及/或補體蛋白質具有弱的或無結合活性。較佳地，該抗原-結合分子包括於FcRn-結合域取代於選自下述所成群組之一個或多個位置：EU238、EU250、EU252、EU254、EU255、EU256、EU258、EU286、EU307、EU308、EU309、EU311、EU315、EU428、EU433、EU434與EU436以及於選自下述所成群組之一個或多個位置：：EU234、EU235、EU236、EU237、EU238、EU239、EU265、EU266、EU267、EU269、EU270、EU271、EU295、EU296、EU297 EU298、EU300、EU324、EU325、EU327、EU328、EU329、EU331與EU332(根據EU編號系統)。更較佳地，對於起效子受體及/或補體蛋白質具有降低的或無結合活性之本發明之經改質抗原-結合分子，包括一個或多個取代於Fc區域之選自下述所成群組之取代：以Lys或Arg取代於位置EU235、以Lys或Arg取代於EU237、以Lys或Arg取代於EU238、以Lys或Arg取代於EU239、以Phe取代於EU270、以Gly取代於EU298、以 Gly取代於EU325以及以Lys或Arg取代於EU329。甚至更較佳地，其包括取代於Fc區域之於位置EU235之以及於位置EU239之Lys。以及甚至更較佳地，其包括取代組合L235R/S239K於Fc區域。
較佳地，該抗原-結合分子對於預先存在之ADA不具有顯著增加的結合活性。因此，本發明之對於起效子受體及/或補體蛋白質具有降低的或無結合活性之抗原-結合分子進一步包括胺基酸取代於c)選自下述所成群組之一個或多個位置：EU387、EU422、EU424、EU426、EU433、EU436、EU438與EU440。本發明之更較佳具例中，該經改質抗原-結合分子包括三個或更多個胺基酸取代於FcRn-結合域，其中該三個或更多個胺基酸取代為表14及15所示之組合之一
[表14]於中性pH範圍增加FcRn-結合活性而不顯著地增加對於預先存在之ADA的結合活性，且降低對於起效子受體及/或補體蛋白質之結合活性的取代組合。
[表15]於酸性pH範圍增加FcRn-結合活性而不顯著地增加對於預先存在之ADA的結合活性，且降低對於起效子受體及/或補體蛋白質之結合活性的取代組合。
進一步的改質
再者，本發明之抗原-結合分子除了上述改質外包括於FcRn-結合域之位置EU257不為選自下述所成群組之胺基酸：丙胺酸、纈胺酸、異白胺酸、白胺酸與蘇胺酸，及/或於FcRn-結合域之位置EU252不為色胺酸。換言之，本發明之較佳抗原-結合分子除了上述任何改質外包括於位置EU257之丙胺酸、纈胺酸、異白胺酸、白胺酸、蘇胺酸、精胺酸、天冬醯胺、天冬胺酸、半胱胺酸、之麩胺酸、麩胺醯胺、甘胺酸、組胺酸、離胺酸、甲硫胺酸、苯丙胺酸、脯胺酸、絲胺酸、色胺酸或酪胺酸，以及於位置EU252之精胺酸、天冬醯胺、天冬胺酸、半胱胺酸、麩胺酸、麩胺醯胺、甘胺酸、組胺酸、離胺酸、甲硫胺酸、苯丙胺酸、脯胺酸、絲胺酸或酪胺酸。
亦較佳的為經改質FcRn-結合域其包括除了取代於本文述及位置或位置組合之任一者外，於位置EU239之離胺 酸及/或於位置EU270之苯丙胺酸。
抗原-結合分子
本發明之抗原-結合分子不特別限定，只要其包含具有特定於標靶抗原之結合活性之抗原-結合域與本發明之FcRn-結合域即可。較佳的抗原-結合域包含，例如具有抗體之抗原-結合域之域。抗體之抗原-結合區域包括，例如CDR。抗體之抗原-結合區域可含有來自全抗體之所有六個CDR，或一個或二個或更多個CDR。抗體之抗原-結合區域包括胺基酸山除、取代、增加及/或插入，或其可包括部分CDR。
另一方面，本發明之抗原-結合分子包含具有拮抗性活性之抗原-結合分子
(拮抗性抗原-結合分子)、具有促效性活性之抗原-結合分子(促效性抗原-結合分子)以及具有細胞毒性之分子。較佳具體例中，該抗原-結合分子為拮抗性抗原-結合分子，特別地為辨識例如受體或細胞激素之抗原的拮抗性抗原-結合分子。
本發明之抗原-結合分子較佳為抗體。本發明內容中之較佳抗體包含，例如，IgG抗體。當所使用之抗體為IgG抗體時，不特別限定IgG的類型；因此，IgG可屬於任何亞型(亞類)如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4。對於人類IgG1、IgG2、IgG3或IgG4恆定區、基因多型體(同種異型)係揭示於「Sequences of proteins of immunological interest,IH Publication No.91-3242」。該等同種異型於此應用中亦可使用於恆定區。特別地，對於人類IgG1，胺基酸Asp-Glu-Leu(DEL)與Glu-Glu-Met(EEM)二者可使用於EU編號 之殘基356至358。類似地，對於人類免疫球蛋白kappa恆定區、基因多型體(同種異型)係揭示於「Sequences of proteins of immunological interest,IH Publication No.91-3242」。該等同種異型於此應用中亦可使用於恆定區。再者，本發明之抗原-結合分子可包含抗體恆定區，以及胺基酸突變可經導入至該恆定區。可經導入之胺基酸突變包含，例如，該等賦予或修復結合至Fc受體者(Proc Natl Acad Sci U S A.2006 Mar 14；103(11)：4005-10)，但不限定於該等實例。或者，亦可能藉由如IgG2之和示的恆定區而改變pH-依賴性結合(WO09125825)。
當本發明之抗原-結合分子為抗體時，該抗體可衍生自任何動物如小鼠、人類、大鼠、兔、山羊或駱駝。較佳地，該抗體為人類抗體。再者，該抗體可為經改變之抗體，例如，嵌合抗體，以及特別地，包括胺基酸取代於人源化抗體之序列之經改變抗體等。本發明所考慮之抗體類別亦包含雙特異性抗體、與各種分子連結之抗體改質產品以及包含抗體片段(特別是免疫球蛋白及/或免疫活性抗體片段)。較佳具體例中，該抗原-結合分子為單株抗體。
「嵌合抗體」係藉由組和衍生自不同動物之序列所製備之抗體。具體地，嵌和抗體包含，例如，具有重鏈與輕鏈可變(V)區域來自小鼠抗體以及重鏈與輕鏈恆定(C)區域來自人類抗體的抗體。用於產生嵌和抗體的方法為已知。於人類-小鼠嵌合抗體的情況，例如，編碼抗體V區域之DNA可連結至編碼人類抗體C區域之DNA；其可插入至表現載體且導入至宿主以製造嵌合抗體。
「人源化抗體」亦指稱重構型抗體，為此項技術領域所習知之抗體，其中抗體之互補決定區(CDR)衍生自非人類哺乳動物，例如，小鼠，且經移植至人類抗體的CDR。用於鍵定CDR的方法為已知(Kabat et al.,Sequence of Proteins of Immunological Interest(1987),National Institute of Health,Bethesda,Md.；Chothia et al.,Nature(1989)342：877)。適合用於此目的之一般遺傳重組技術亦為已知(參照歐洲專利申請案EP 125023；及專利WO 96/02576)。人源化抗體可藉由已知方法製造，例如，可測定小鼠抗體的CDR，且獲得編碼抗體之DNA，其中該抗體之CDR係連結製人類抗體的框架區域(FR)。然後使用利用傳統表現載體的系統而製造人源化抗體。該等DNA可藉由PCR合成，使用製備為具有與CDR及FR二者之終端區域重疊之數個寡核苷酸作為引子(參照揭示於專利WO 98/13388之方法)。選擇經由CDR連結之人類抗體FR以使CDR形成合適的抗源結合位典。必要時，於抗體可變區之FR的胺基酸可經改變而使重構型人類抗體之CDR可形成合適的抗原結合位點(Sato et al.,Cancer Res.(1993)53：10.01-6)。可經改變之FR的胺基酸殘基包含經由非共價鍵直接結合至抗原的部分(Amit et al.,Science(1986)233：747-53)、對於CDR結構有影響或具有效果的部分(Chothia et al.,J.Mol.Biol.(1987)196：901-17)以及涉及VH-VL交互作用的部分(EP 239400)。
當本發明之抗原-結合分子為嵌合抗體或人源化抗體時，該等抗體之恆定區較加衍生自人類抗體。例如，C-γ1、C-γ2、C-γ3與C-γ4可使用於H鏈，而C-kappa與C-lambda 可使用於L鏈。尤有甚者，必要時，胺基酸突變可經導入至人類抗體C區域以增強或降低結合至Fc-γ受體或改良抗體安定性或製造性。本發明之嵌合抗體較加包含衍生自非人類哺乳動物之抗體的可變區以及衍生自人類抗體之衡定區域。同時，人源化抗體較加包含衍生自非人類哺乳動物之抗體的CDR以及衍生自人類抗體之FR與C區域。衍生自非人類抗體之恆定區較佳包含人類FcRn-結合區域。該抗體包含，例如，IgG類(IgG1、IgG2、IgG3與IgG4)。用於本發明之人源化抗體之恆定區可為任何同型抗體之恆定區。較佳使用衍生自人類IgG1之恆定區，但不限定為該等。衍生自人類抗體之FR，其使用於人源化抗體，不特別限制，且可衍生自任何同型抗體。
如使用於本文之詞語「雙特異性抗體」意指一抗體，其具有於相同抗體分子中辨識不同抗原決定基之可變區。雙特異性抗體可為辨識二種或更多種不同抗原之抗體，或為於相同抗原辨識二種或更多種抗原決定基之抗體。
再者，包含抗體片段之多肽可為，例如，scFv-Fc(WO 2005/037989)、dAb-Fc與Fc融合蛋白質。於該多肽中之抗體片對可為例如Fab片段、F(ab')2片段、scFvs(Nat Biotechnol.2005 Sep；23(9)：1126-36)、域抗體(dAbs)(WO 2004/058821、WO 2003/002609)，Fc區域可使用作為人類FcRn-結合域當分子包含when a molecule區域時。或者，FcRn-結合域可融合至該等分子。
進一步地，可應用於本發明之抗原-結合分子可為或可包含類抗體分子(例如，具有類抗體分子之本發明Fc區 域的融合蛋白質)。類抗體分子(支架分子、肽分子)為藉由結合至標靶分子可顯示功能之分子(Current Opinion in Biotechnology(2006)17：653-658；Current Opinion in Biotechnology(2007)18：1-10；Current Opinion in Structural Biology(1997)7：463-469；Protein Science(2006)15：14-27)且包含，例如，DARPins(WO 2002/020565)、Affibody(WO 1995/001937)、Avimer(WO 2004/044011；WO 2005/040229)與Adnectin(WO 2002/032925)。如果該等類抗體分子可結合至標靶分子以pH-依賴性或鈣-依賴方式及/或於中性pH範圍具有人類FcRn-結合活性，可能有助於抗原藉由抗原-結合分子攝入至細胞，有助於藉由投藥抗原-結合分子降低血漿抗原濃度以及改良抗原-結合分子之動力學且增加對單一抗原-結合分子可予以結合之抗原總數。
再者，抗原-結合分子可為由本發明之FcRn-結合域與結核至包含配體之標靶的受體蛋白質之間的融合所產生的蛋白質，包含，例如，TNFR-Fc融合蛋白質、IL1R-Fc融合蛋白質、VEGFR-Fc融合蛋白質與CTLA4-Fc融合蛋白質(Nat Med.2003、Jan；9(1)：47-52；BioDrugs.(2006)20(3)：151-60)。如果該等受體-FcRn-結合域融合蛋白質除了於中性pH範圍具有FcRn-結合活性之外，以pH-依賴性或鈣-依賴方式結合至包含配體的標靶分子，其可能有助於抗原藉由抗原-結合分子攝入至細胞，有助於藉由投藥抗原-結合分子降低血漿抗原濃度以及改良抗原-結合分子之動力學且增加對單一抗原-結合分子可予以結合之抗原總數。受體蛋白質係合適地經 設計與經改質而使其包含對於包含配體之標靶之受體蛋白質的結合域。作為前文例示者(亦即，TNFR-Fc融合蛋白質、IL1R-Fc融合蛋白質、VEGFR-Fc融合蛋白質與CTLA4-Fc融合蛋白質)，特別較佳為包含該等結合至包含配體之標靶者所需之受體蛋白質之細胞外域的可溶性受體分子。該等經設計與改質之受體意指本發明之人工受體/用於設計與改質受體分子已構築人工受體的方法於此項技術中為已知且確實傳統的。
再者，本發明之抗體可具有將改質糖鏈。具有經改質糖鏈之抗體包含，例如，具有經改質糖基化之抗體(WO 99/54342)、經添加至糖鏈而於岩藻糖有缺陷之抗體(WO 00/61739；WO 02/31140；WO 2006/067847；WO2006/067913)與具有二等分GlcNAc之糖鏈的抗體(WO 02/79255)。
根據Journal of Immunology(2009)182：7663-7671，完整人類IgG1之人類FcRn-結合活性於酸性pH範圍(pH 6.0)為KD 1.7微莫耳(microM)，而於中性pH範圍該活性為幾乎不可偵測。因此較佳具體例中，本發明之抗原-結合分子包含抗原-結合分子其人類FcRn-結合活性於酸性pH範圍強於KD 1.7微莫耳且於中性pH範圍較完整人類IgG1之人類FcRn-結合活性為相同或更強。更較佳具體例中，相較於完整IgG1，其於中性pH範圍對於預先存在之ADA之結合活性不顯著增加。上述KD值係藉由揭示於Journal of Immunology(2009)182：7663-7671(藉由將抗原-結合分子固定化至晶片且裝填人類FcRn作為分析物)之方法測定。
解離常數(KD)人類FcRn-結合活性之值。然而，完整人類IgG之人類FcRn-結合活性於中性pH範圍(pH 7.4)具有少的人類FcRn-結合活性。因而，通常難以計算活性為KD。用於評估人類FcRn-結合活性於pH 7.4是否高於完整人類IgG者之方法包含藉由比較於相同濃度裝填分析物後所回應之Biacor的強度。具體地，當裝填人類FcRn至經固定有抗原-結合分子的晶片於pH 7.4之回應強於裝填人類FcRn至經固定有完整人類IgG的晶片於pH 7.4之回應時，該抗原-結合分子之人類FcRn-結合活性係被判斷於pH 7.4強於完整人類IgG之人類FcRn-結合活性。。
本發明之內容中，pH 7.0可使用作為中性pH範圍。使用pH 7.0作為中性pH可有助於人類FcRn與FcRn-結合域之間的弱的交互作用。關於應用於分析條件之溫度，結合親和性可於自10℃至50℃之任何溫度評估。較佳地，應用任何溫度範圍自15℃至40℃以測定人類FcRn-結合域與人類FcRn之間的結合親和性。更較佳地，亦應用任何溫度範圍自20℃至35℃，例如下列任一者：20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34與35℃以測定人類FcRn-結合域與人類FcRn之間的結合親和性。揭示於專利WO2011/122011之實施例5之25℃溫度為本發明之具體例之一實例。較佳具體例中，人類FcRn-結合域與人類FcRn之間的交互作用可於pH 7.0與25℃如同專利WO2011/122011之實施例5揭示方法予以測定。抗原-結合分子對人類FcRn之結合親和性可如同專利WO2011/122011之實施例5揭示方藉由 Biacore測定。
較佳地，於中性pH範圍之結合親和性係於pH 7.4測定，其接近活體內血漿(血液)pH。當人類FcRn-結合域與人類FcRn之間的結合親和性因其於pH 7.4的低親和性而難以評估時，可使用pH 7.0作為替代pH 7.4。較佳地，於酸性pH範圍之結合親和性係於pH 6.0測定，其接近活體內早期內體之pH。關於應用於分析條件之溫度，人類FcRn-結合域與人類FcRn之間的結合親和性可於自10℃至50℃之任何溫度評估。較佳地，應用任何溫度範圍自15℃至40℃以測定人類FcRn-結合域與人類FcRn之間的結合親和性。更較佳地，亦應用任何溫度範圍自20℃至35℃，例如下列任一者：20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34與35℃以測定人類FcRn-結合域與人類FcRn之間的結合親和性。揭示於專利WO2011/122011之實施例5與本發明實施例之25℃溫度為本發明之具體例之一實例。
完整人類IgG1、IgG2、IgG3或IgG4較佳使用作為參考完整人類IgG以與抗原-結合分子對該等人類FcRn結合活性或活體內活性相比較。較佳地，包括相同抗原-結合域作為本發明之抗原-結合分子以及完整人類IgG Fc區域作為人類FcRn-結合域之抗原-結合分子，係使用作為參考。更較佳地，完整人類IgG1係使用作為參考完整人類IgG用以將其人類FcRn結合活性或活體內活性與本發明之抗原-結合分子之人類FcRn結合活性或活體內活性做比較。
用於分析抗原-結合或人類FcRn-結合活性的pH 以外的條件可由此項技術領域中具有通常知識者合適地選擇且該等條件不特別限定。例如，可使用揭示於專利WO 2009/125825之於37℃使用MES緩衝劑的條件以測定活性。另一具體例中，可使用揭示於專利WO2011/122011之實施例4或5之於25℃使用Na-磷酸鹽緩衝劑以測定活性。同時，抗原-結合分子之抗原-結合活性與人類FcRn-結合活性可藉由此項技術領域習知之方法測定，例如，使用Biacore(GE Healthcare)等。當抗原為可溶性抗原時，抗原-結合分子對結合至可溶性抗原之活性可藉由將抗原作為分析物裝填至經固定有抗原-結合分子之晶片而測定。或者，當抗原為膜-型抗原時，抗原-結合分子對結合至膜-型抗原之活性可藉由將抗原-結合分子做為分析物裝填至經固定抗原之晶片而測定。抗原-結合分子之人類FcRn-結合活性可藉由分別將人類FcRn或抗原-結合分子作為分析物裝填至經固定有抗原-結合分子或人類FcRn之晶片而測定。
本發明提供之包含抗原-結合域與拒於中性範圍具有增加的FcRn-結合活性之人類Fc區域之本發明之抗原-結合分子。較佳地，其於中性pH範圍對於預先存在之ADA之結合活性不顯著增加。該抗原-結合分子於中性pH範圍之FcRn-結合活性較佳強於KD 3.2微莫耳。更較佳地，於中性pH範圍之FcRn-結合活性強於700微毫莫耳，甚至更較佳為強於500微毫莫耳且最較佳地，強於150微毫莫耳。較佳地，抗原-結合分子於中性pH範圍具有增加的人類FcRn-結合活性且抗原-結合活性於酸性pH範圍較低於中性pH範圍或於 低鈣濃度較低於高鈣濃度條件。較佳地，該抗原-結合分子於中性pH範圍對於預先存在之ADA之結合活性不顯著增加。本發明亦提供包含抗原-結合域與人類FcRn-結合域之本發明之抗原-結合分子，其中其人類FcRn-結合活性於中性pH範圍為增加的，再其中該人類FcRn-結合活性於中性pH範圍為28-倍強於完整人類IgG者，更較佳地，該人類FcRn-結合活性於中性pH範圍為38-倍強於完整人類IgG者。較佳地，該抗原-結合分子於中性pH範圍對於預先存在之ADA之結合活性不顯著增加。本發明之抗原-結合分子於中性pH範圍具有增加的FcRn-結合活性。較佳地，於中性pH範圍對於預先存在之ADA不顯著增加之結合活性，於pH 7.0與25℃之人類FcRn-結合活性，相較於完整人類IgG為強於28-倍，較佳為強於38-倍。或者，於pH 7.0與25℃具有增加的FcRn結合活性之抗原-結合分子之人類FcRn-結合活性，較佳強於KD 3.2微莫耳。更較佳地，於pH 7.0與25℃之FcRn-結合活性強於700微毫莫耳，更較佳地強於500微毫莫耳以及最較佳地，強於150微毫莫耳。
本發明提供本發明之抗原-結合分子，包含本發明之抗原-結合域與a人類Fc區域，於酸性pH範圍具有增加的FcRn-結合活性且於中性pH範圍對於預先存在之ADA之結合活性不顯著增加。本發明亦提供
本發明之抗原-結合分子其包含抗原-結合域與於酸性pH範圍具有增加的人類FcRn-結合活性之人類FcRn-結合域且相較於完整IgG之對於預先存在之ADA之結合活性，於中性pH 範圍對於預先存在之ADA之結合活性不顯著增加，其中該人類FcRn-結合活性於酸性pH範圍係約2-倍至約100-倍範圍強於完整人類IgG之人類FcRn-結合活性。較佳地，本發明之抗原-結合分子於酸性pH範圍之人類FcRn-結合活性係至少10-倍強於完整人類IgG之人類FcRn-結合活性，更較佳地，於酸性pH範圍之人類FcRn-結合活性係至少20-倍強於完整人類IgG之人類FcRn-結合活性。本發明之於酸性pH範圍具有增加的FcRn-結合活性且藉此其於中性pH範圍對於預先存在之ADA之結合活性不顯著增加之抗原-結合分子，於pH 6.0與25℃具有之人類FcRn-結合活性為10-倍強於，較佳為25-倍強於完整人類IgG。
本發明之抗原-結合分子可具有於中性pH範圍之增加的FcRn-結合活性以及於酸性pH範圍之抗原-結合活性(其係低於抗原-結合活性於中性pH範圍之抗原-結合活性)或於低鈣濃度之抗原-結合活性(其係低於高鈣濃度之抗原-結合活性)。該抗原-結合分子之具體實例包含於pH7.4對於人類FcRn相較於完整IgG具有較高結合活性且其抗原-結合活性於pH 5.8係低於pH 7.4(該等pH分別假設為早期內體與血漿之活體內pH)。其抗原-結合活性於pH 5.8係低於pH 7.4之抗原-結合分子亦可意指為其抗原-結合活性於pH 7.4係強於pH 5.8之抗原-結合分子。KD(pH 5.8)/KD(pH 7.4)之值，其為對抗原之解離常數(KD)於pH 5.8與pH 7.4之比例，為1.5、2、3、4、5、10、15、20、50、70、80、100、500、1000或10,000，較佳為2或更大，更較佳為10或更大以及再較佳為40或更大。 KD(pH 5.8)/KD(pH 7.4)之值的上限不特別限定且可為任何值，例如，400、1,000或10,000，址要可使用本項技術領域所習知之技術製造即可。
亦較佳地，本發明之抗原-結合分子於酸性pH範圍具有增加的FcRn-結合活性，以及於酸性pH範圍相較於中性pH範圍為較低的抗原-結合活性或於低鈣濃度相較於高鈣濃度為較低的抗原-結合活性。較佳地，該抗原-結合分子於中性pH範圍對於預先存在之ADA圍之結合活性不顯著增加。該抗原-結合分子之具體實例包含於pH 5.8至pH 6.0相較於IgG，對於人類FcRn具有較高之結合活性者，該等pH矽假設為活體內之早期內體的pH且其抗原-結合活性於pH 5.8係低於pH 7.4。其抗原-結合活性於pH 5.8係低於pH 7.4之抗原-結合分子亦可意指為抗原-結合分子其抗原-結合活性於pH 5.8係弱於pH 7.4之抗原-結合分子。較佳地，於酸性pH範圍對於FcRn具有增加的結合活性之抗原-結合分子，於中性pH範圍相較於完整人類IgG具有較強的FcRn-結合活性。
本發明之經改質FcRn-結合域可應用至任何抗原-結合分子，而無關於標靶抗原之類型。
本發明之抗原-結合分子可具有其他性質。例如，其可為促效性或拮抗性抗原-結合分子，只要其具有a)必要的中性pH範圍之增加的人類FcRn-結合活性或b)對於酸性範圍之增加的人類FcRn-結合活性且其對於預先存在之ADA之結合活性不顯著增加。較佳地，該抗原-結合分子之抗原-結合活性於酸性pH範圍係低於中性pH範圍。較佳地，本發明之抗 原-結合分子包含，例如，拮抗性抗原-結合分子。該拮抗性抗原-結合分子典型地為藉由阻斷配體(促效劑)與受體之間的結合而抑制受體-媒介之細胞內信號傳遞之抗原-結合分子。
同時，本發明之抗原-結合分子可辨識任何抗原。藉由本發明之抗原-結合分子可辨識之具體抗原包含，例如，上述受體蛋白質(膜-固著受體與可溶性受體)、膜抗原如細胞表面標記與可溶性抗原如細胞激素。該等抗原包含，例如，下述抗原。
包含抗原-結合域之本發明之抗原-結合分子可利用pH的不同而因血漿與內體之間的環境差異而使抗原結合分子對抗原於血漿與內體有不同的結合親和性(於血漿為強的結合且於內體為弱的結合)。由於血漿與內體之間的環境差異不限於pH不同，pH依賴性結合性質對於抗原-結合分子對抗原的結合可利用其濃度於血漿中與內體中為不同的其他因子取代，該等例如離子化鈣濃度。該因子亦可使用於產生於血漿中結合至抗原而於內體內接離該抗原之抗體。因此，本發明亦包含包括人類FcRn-結合域之抗原-結合分子，其人類FcRn-結合活性於中性pH範圍為增加的且其抗原-結合活性於內體中係低於與血漿比較時。較佳地，該等抗原-結合分子於中性pH範圍對於預先存在之ADA的結合活性不顯著增加。該抗原-結合分子之人類FcRn-結合活性於血漿中係強於完整人類IgG者與且進一步地該抗原-結合分子之抗原-結合域對於內體內之抗原相較於血漿中者具有較低親和性。較佳地，該抗原-結合域為其抗原-結合活性於酸性pH範圍係低於中性pH範圍之抗原- 結合域(pH-依賴性抗原-結合域)或其抗原-結合活性於低鈣濃度係低於高鈣濃度之抗原-結合域(鈣-濃度-依賴性抗原-結合域)。本發明亦包含具有人類FcRn-結合域之抗原-結合分子，其於酸性pH範圍具有增加的人類FcRn-結合活性且該抗原-結合分子進一步地包括對於抗原相較於血漿中於內體內具有較低親和性之抗原-結合域，以致於該抗原-結合分子之人類FcRn-結合活性於內體中強於完整人類IgG者且該抗原-結合分子之抗原-結合活性於內體中強於血漿中。較佳地，該等抗原-結合分子於中性pH範圍對於預先存在之ADA的結合活性不顯著增加。較佳地，該抗原-結合域為其抗原-結合活性於酸性pH範圍係低於中性pH範圍之抗原-結合域(pH-依賴性抗原-結合域)或其抗原-結合活性於低鈣濃度係低於高鈣濃度之抗原-結合域(鈣-濃度-依賴性抗原-結合域)。
本發明之抗原-結合分子有助於抗原攝入至細胞，特別是當本發明之包含pH-依賴性抗原-結合域或鈣-濃度-依賴性抗原-結合域之抗原-結合域之抗原-結合分子。抗原-結合分子於內體中容易地由抗原解離且然後藉由結合至人類FcRn而釋放至細胞外側。本發明之抗原-結合分子係推測於血漿中再次容易地結合至抗原。因此，例如，當本發明之抗原-結合分子為中和抗原-結合分子時，可藉由投藥該分子而有助於血漿抗原濃度的降低。
抗原-結合域
較佳地，抗原-結合分子之抗原-結合域於酸性pH活於低鈣離子濃度對於抗原具有降低的親和性。更較佳地，該抗原- 結合域為本文所述之pH-依賴性抗原-結合域或離子化鈣濃度依賴性抗原-結合域。
pH-依賴性抗原-結合域，
再者，本發明之抗原-結合分子較佳包含pH-依賴性抗原-結合域其抗原-結合活性於酸性pH範圍係較低於中性pH範圍。該抗原-結合分子較佳具有抗原-結合活性於酸性pH範圍係較低於中性pH範圍。該結合活性比例不特別限定，只要抗原-結合活性於酸性pH範圍係較低於中性pH範圍。較佳具體例中，本發明之抗原-結合分子包含抗原-結合分子其抗原-結合活性於pH 7.4係二倍或更高於pH 5.8者，較佳地該抗原-結合活性於pH 7.4係十倍或更高於pH 5.8。再較佳具體例中，本發明之抗原-結合分子包含抗原-結合分子其抗原-結合活性於於pH 7.4係40倍或更高於pH 5.8者。
本發明之抗原-結合分子之具體實例包含揭示於專利WO 2009/125825之具體例。較佳具體例中，本發明之包含pH-依賴性抗原-結合域之抗原-結合分子具有抗原-結合活性於pH 5.8係較低於pH 7.4者，其中該KD(pH5.8)/KD(pH7.4)之值，其為對抗原之解離常數(KD)於pH 5.8與pH 7.4之比例，較佳為2或更大，更較佳為10或更大以及再較佳為40或更大。KD(pH 5.8)/KD(pH 7.4)之值的上限不特別限定且可為任何值，例如，400、1,000或10,000，只要可使用本項技術領域所習知之技術製造即可。
另一較佳具體例中，本發明之抗原-結合分子其抗原-結合活性於pH 5.8係較低於pH 7.4者，具有KD(pH5.8)/ KD(pH7.4)之值其為於pH 5.8對抗原之KD與於pH 7.4對抗原之KD之比例，為2或更大，更較佳為5或更大以及甚至較佳為10或更大以及再較佳為30或更大。KD(pH5.8)/KD(pH7.4)值之上限不特別限定且可為任何值，例如50、100或200，只要可使用此項技術領域所習知之技術製造即可。
測定抗原-結合活性、對於預先存在之ADA之結合活性與人類FcRn-結合活性之pH以外的條件可由此項技術領域中具有通常知識者予以適當地選擇且該等條件並不特別限定；然而，可於，例如，MES緩衝劑與37℃的條件下進行，如同實施例所述。再者，抗原-結合分子之抗原-結合活性可藉由此項技術領域所習知之方法測定，例如，使用Biacore T100(GE Healthcare)等，如同實施例所述。
用於降低(損害)抗原-結合分子之抗原-結合活性於酸性pH範圍至低於抗原-結合活性於中性pH範圍者(pH-依賴性結合活性之方法)之方法不特別限定且and合適的方法為已知於此項技術領域。專利WO 2009/125825，例如，揭示用於降低(損害)抗原-結合活性於酸性pH範圍至低於中性pH範圍者之方法，係藉由取代組胺酸用於抗原-結合域之胺基酸或插入組胺酸至抗原-結合域。其進一步已知抗體可藉由取代組胺酸用於抗體之胺基酸而授予pH-依賴性抗原-結合活性(FEBS Letter(1992)309(1)：85-88)。其他合適方法包含用於取代非天然胺基酸用於抗原-結合域之胺基酸或插入非天然胺基酸組胺酸至抗原-結合域。其已知pKa可藉由使用非天然胺基酸而人工的予以調整(Angew.Chem.Int.Ed.2005,44,34； Chem Soc Rev.2004 Sep 10,33(7)：422-30；Amino Acids.(1999)16(3-4)：345-79)。任何非天然胺基酸皆可使用於本發明內容。事實上，可使用非天然胺基酸係習知於此項技術領域。
較佳具體例中，本發明之包含抗原-結合域(具有抗原-結合活性於酸性pH範圍係較低於中性pH範圍者)之抗原-結合分子，包含抗原-結合分子其中抗原-結合分子中之至少一個胺基酸係經以組胺酸或非天然胺基酸取代及/或其中至少一個組胺酸或非天然胺基酸經插入。經組胺酸或非天然胺基酸突變所導入之位點不特別限定且可為任何位點只要此項技術領域者認為合適的皆可，限制條件為所得抗原-結合活性相較於取代之前，於酸性pH範圍係較弱於於中性pH範圍者(KD(於酸性pH範圍)/KD(於中性pH範圍)值係較大或kd(於酸性pH範圍)/kd(於中性pH範圍)值係較大)。於抗原-結合分子為抗體的情況中，實例包含抗體之可變區與CDR。欲以組胺酸或非天然胺基酸置換之胺基酸數目以及欲插入之胺基酸數目可由此項技術領域者合適地予以選擇。一個胺基酸可經組胺酸或非天然胺基酸置換，或一個胺基酸可經插入，或二個或更多個胺基酸可經組胺酸或非天然胺基酸置換，換二個或更多個胺基酸可經插入。再者，除了組胺酸或非天然胺基酸之取代，或組胺酸或非天然胺基酸之插入，亦可同時進行其他胺基酸之刪除、增加及/或取代等。組胺酸或非天然胺基酸之取代，或組胺酸或非天然胺基酸之插入，可使用如組胺酸掃描之方法隨機進行，於丙胺酸掃描中以丙胺酸取代組胺酸為此項技術領域者所習知。其KD(pH5.8)/KD(pH7.4)或kd(pH5.8)/kd(pH7.4)相較於突 變之前係增加的抗原-結合分子，可由其中經隨機導入組胺酸或非天然胺基酸突變之抗原-結合分子。
較佳地，抗原-結合域之結合活性於中性pH(亦即，pH7.4)係予以維持的。當抗原-結合分子之抗原-結合活性於組胺酸或非天然胺基酸突變之前設定為100%，該抗原-結合分子之抗原-結合活性於pH7.4於組胺酸或非天然胺基酸突變之後為至少10%或更高，較佳為50%或更高，更較佳為80%或更高以及再較佳為90%或更高。抗原-結合活性於pH 7.4在組胺酸或非天然胺基酸突變之後可較抗原-結合活性於pH 7.4在組胺酸或非天然胺基酸突變之前為更強。當該抗原-結合分子之抗原-結合活性因為組胺酸或非天然胺基酸之取代或插入而增加時，抗原-結合活性可藉由導入一個或多個胺基酸之取代、刪除、增加及/或插入等至抗原-結合分子予以調整而使抗原-結合活性變成與組胺酸取代或插入之前相等。
本發明內容中，當抗原-結合分子為抗體時，組胺酸或非天然胺基酸取代之可能位點包含，例如，抗體之CDR序列以及負責CDR結構之序列，包含，例如，揭示於專利WO 2009/125825之位點。
再者，本發明提供抗原-結合分子其具有組胺酸或非天然胺基酸之取代於下述位點之至少一個胺基酸
重鏈：H27、H31、H32、H33、H35、H50、H58、H59、H61、H62、H63、H64、H65、H99、H100b與H102
輕鏈：L24、L27、L28、L32、L53、L54、L56、L90、L92與L94
H32、H61、L53、L90與L94之該等改變位點，係推測為一般之高度改變位點。胺基酸位置係顯示根據Kabat編號(Kabat et al.,Sequences of Immunological Interest.5th Ed.Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,Md.(1991))。當指稱可變域中的殘基時，通常使用Kabat編號系統(大約輕鏈之殘基1至170與重鏈之殘基1至113)。對於組胺酸或非天然胺基酸取代之具體較佳位點組合包含，例如，H27、H31與H35之組合；H27、H31、H32、H35、H58、H62與H102之組合；L32與L53之組合；以及L28、L32與L53之組合。再者，於重鏈與輕鏈之取代位點之較佳組合包含，例如，H27、H31、L32與L53之組合。
當抗原為IL-6受體(例如，人類IL-6受體)時，較佳改變位點包含但不特別限定於下述者：
重鏈：H27、H31、H32、H35、H50、H58、H61、H62、H63、H64、H65、H100b與H102
輕鏈：L24、L27、L28、L32、L53、L56、L90、L92與L94
對於組胺酸或非天然胺基酸取代之位點之具體較佳組合包含，例如，H27、H31與H35之組合；H27、H31、H32、H35、H58、H62與H102之組合；L32與L53之組合；以及L28、L32與L53之組合。再者，於重鏈與輕鏈之取代位點之較佳組合包含，例如，H27、H31、L32與L53之組合。
組胺酸或非天然胺基酸可經取代於上述位置之一個或多個。
或者，本發明之抗原-結合分子可包含經改變以使 抗原-結合活性於pH5.8係較低於pH7.4者之抗體恆定區。用於改變Methods for altering包含於抗原-結合分子之抗體恆定區的方法對於此項技術領域者為習知且確實為常規的。改變後抗體恆定區之具體實例包含揭示於專利WO 2009/125825(序列編號：11、12、13與14)實施例之恆定區。
同時，用於改變抗體恆定區的方法包含，例如用於評估各種恆定區同型(IgG1、IgG2、IgG3與IgG4)與選擇於酸性範圍降低抗原-結合活性之同型(增加於酸性pH範圍之解離速率)之方法為已知。該等方法亦包含藉由導入胺基酸取代至野生型同型之胺基酸序列(野生型IgG1、IgG2、IgG3或IgG4之胺基酸序列)而降低於酸性pH範圍之抗原-結合活性(增加於酸性pH範圍之解離速率)的方法。The sequence of hinge區域in the抗體恆定區之鉸鏈區序列被考慮於同型(IgG1,IgG2,IgG3與IgG4)之間有差異且於鉸鏈區胺基酸序列之差異對於抗原-結合活性具有重大影響。因此，可能跟具抗原或抗原決定基的類型而選擇合適的同型以降低於酸性pH範圍之抗原-結合活性(增加於酸性pH範圍之解離速率)。再者，由於鉸鏈區胺基酸序列的差異對於抗原-結合活性具有重大影響，於野生型同型之胺基酸序列之較加胺基酸取代係推測於鉸鏈區內。
上述方法可藉由胺基酸取代或插入而自不具該等性質之抗原-結合分子製造於酸性pH範圍之抗原-結合活性係經降低(減弱)至低於中性pH範圍者(抗原-結合分子結合為pH-依賴性方式)之抗原-結合分子。其他方法包含用於直接獲得具有上述性質之抗原-結合分子的方法。例如，具有所欲之感興 趣性質的抗體可使用pH-依賴性抗原結合作為指示劑，由藉由以抗原將動物(小屬、大屬、倉鼠、兔、人類免疫球蛋白-基因轉殖鼠、人類免疫球蛋白-基因轉殖鼠、人類免疫球蛋白-基因轉殖兔、羊駝、駱駝等)免疫所獲得之抗體，藉由篩選而直接予以選擇。抗體可藉由融合瘤技術或B-細胞選殖技術(Bernasconi et al,Science(2002)298,2199-2202；專利WO2008/081008)予以製造，其為此項技術領域所習知之方法，但不限定為該等方法。或者，具有感興趣性質之抗體可使用pH-依賴性抗原結合作為指示劑，於活體外自存在之抗原-結合域庫藉由篩選而直接予以選擇。該等庫包含此項技術領域者所習知庫之人類原始庫、由非-人類哺乳動物與人類之經免疫庫、半合成庫與合成庫(Methods Mol Biol.2002；178：87-100；J Immunol Methods.2004 Jun；289(1-2)：65-80；and Expert Opin Biol Ther.2007 May；7(5)：763-79)，但不限於該等。然而，方法不特別限定於該等實例。
B)離子化鈣-依賴性抗原-結合域
較佳具體例中，本發明之抗原-結合分子包含鈣-離子依賴性抗原-結合域。該抗原-結合分子之抗原-結合活性依賴於鈣濃度，藉此抗原-結合活性於低幹濃度係較低於高鈣濃度者。
較佳地，抗原-結合活性包含抗原-結合活性於0.5至10微莫耳之離子化鈣濃度。更較佳地離子化鈣濃度包含於活體內早期內體中之離子化鈣濃度。具體地，抗原-結合活性包含活性於1至5微莫耳。同時，抗原-結合分子之抗原-結合活性於高鈣濃度不特別限定，限制條件為抗原-結合活性於 100微莫耳至10mM之離子化鈣濃度。較佳地，抗原-結合活性包含抗原-結合活性於200微莫耳至5mM之離子化鈣濃度。較佳地，低鈣濃度為0.1至30微莫耳之離子化鈣濃度以及高鈣濃度為100微莫耳至10mM之離子化鈣濃度。
較佳地，低鈣濃度為離子化鈣之內體內濃度以及高鈣濃度為離子化鈣之血漿濃度。更具體地，包含該鈣-依賴性抗原-結合域之抗原-結合分子包含抗原-結合分子其抗原-結合活性於活體內早期抗體之離子化鈣濃度(如1至5微莫耳之低鈣濃度)係較低於活體內血之離子化鈣濃度(如0.5至2.5mM之高鈣濃度)。
相對於抗原-結合活性於低鈣濃度係較低於高鈣濃度者之抗原-結合分子之抗原-結合活性，並無特別於抗原-結合活性中之此差異，限制條件抗原-結合活性於低鈣濃度係較低於高鈣濃度者。甚至可接受抗原-結合分子之抗原-結合活性於低鈣濃度條件下僅些微較低。
較佳具體例中，對於本發明之其抗原-結合活性於低鈣濃度(低Ca)係較低於高鈣濃度(高Ca)之抗原-結合分子，KD(低鈣)/KD(高鈣)之值，其為低鈣濃度與高鈣濃度之間的KD比例，為2或更大，較佳KD(低鈣)/KD(高鈣)之值為10或更大以及更較佳KD(低鈣)/KD(高鈣)之值為40或更大。KD(低鈣)/KD(高鈣)值之上限並不特別限定且可為任何值如400、1,000與10,000，限制條件為其可藉由此項技術領域者所習知之技術予以製造。
較佳具體例中，對於包含其抗原-結合活性於低鈣 濃度係較低於高鈣濃度者之鈣-依賴性抗原-結合域之抗原-結合分子，kd(低鈣)/kd(高鈣)之值，其為低鈣濃度與pH7.4時的KD比例，為2或更大，較佳kd(低鈣)/kd(高鈣)之值為5或更大，更較佳kd(低鈣)/kd(高鈣)之值為10或更大以及再較佳kd(低鈣)/kd(高鈣)之值為30或更大。kd(低鈣)/kd(高鈣)值之上限並不特別限定且可為任何值如50、100與200，限制條件為其可藉由此項技術領域者所習知之技術予以製造。
抗原-結合分子之抗原-結合活性可藉由此項技術領域所習知之方法予以測定。合適的條件除了離子化鈣濃度之外可由此項技術領域者予以選擇。抗原-結合分子之抗原-結合活性可藉由使用KD(解離常數)、表觀KD(表觀解離常數)、解離速率kd(解離速率)、表觀kd(表觀解離：表觀解離速率)等予以評估。其等可藉由此項技術領域者所習知之方法予以測定，例如，使用Biacore(GE Healthcare)、Scatchard plot、FACS等。
欲藉由本發明之篩選方法予以篩選之抗原-結合分子可為任何抗原-結合分子。其可篩選，例如，具有天然序列之抗原-結合分子或具有含取代之胺基酸序列之抗原-結合分子。欲藉由本發明之篩選方法予以篩選之包含鈣-離子依賴性抗原-結合域之抗原-結合分子可藉由任何方法製備。可能使用，例如，預先存在之抗體、預先存在之庫(噬菌體庫等)與自經免疫動物之B細胞或將動物免疫所製備之融合瘤而製備之抗體與庫、藉由將能螯合鈣之胺基酸(例如，天冬胺酸或麩胺酸)或非天然胺基酸突變導入至該等抗體或庫(具有高含量之非 天然胺基酸或能螯合鈣之胺基酸(例如，天冬胺酸或麩胺酸)之庫、經於特定位點導入非天然胺基酸突變或能螯合鈣之胺基酸突變之庫等)所獲得之抗體或庫等。
抗原-結合分子其抗原-結合活性於低鈣濃度條件係較低於高鈣濃度條件者可使用習知於此項技術的方法(參照例如PCT申請案號PCT/JP2011/077619)容易地予以篩選、鑑定與單離。該等篩選方法之實例包對於具有至少一種選自下述功能之抗原-結合分子進行分析的步驟：促進抗原攝入至細胞的功能；結合至抗原二次或更多次的功能；促進降低血漿抗原濃度的功能；以及優異血漿滯留的功能。
具體地，本發明提供篩選包含鈣-離子依賴性抗原-結合域之抗原-結合分子的方法，其包含下述步驟：測定抗原-結合分子於低鈣濃度條件之抗原-結合活性；測定抗原-結合分子於高鈣濃度條件之抗原-結合活性；以及選擇抗原-結合分子其抗原-結合活性於低鈣濃度條件係較低於高鈣濃度條件者。
製造具有鈣-離子依賴性抗原-結合域之抗原-結合分子的方法式例如包含下述步驟之方法：測定抗原-結合分子於低鈣濃度條件之抗原-結合活性；測定抗原-結合分子於高鈣濃度條件之抗原-結合活性；以及 選擇抗原-結合分子其抗原-結合活性於低鈣濃度條件係較低於高鈣濃度條件者。
製造具有鈣-離子依賴性抗原-結合域之抗原-結合分子的另一方法是例如包含下述步驟之方法：使抗原與抗原-結合分子或抗原-結合分子庫於高鈣濃度條件接觸；獲得步驟(a)中之結合至抗原的抗原-結合分子；使步驟(b)獲得之抗原-結合分子置於低鈣濃度條件；獲得抗原-結合分子其抗原-結合活性於步驟(c)係較低於步驟(b)選擇之活性；獲得編碼步驟(d)所獲得之抗原-結合分子的基因；以及使用步驟(e)所獲得之基因製造抗原-結合分子。
步驟(a)至(e)可重複二次或更多次。因此，本發明提供進一步包括於上述方法中步驟(a)至(e)重複二次或更多次的方法。步驟(a)至(e)重複的數目不特別限定；然而，該數目通常為10或更少。
使用於本發明製造方法之抗原-結合分子可藉由任何傳統方法製備。例如，可能使用預先存在之抗體、預先存在之庫(噬菌體庫等)、自經將動物免疫所製備之融合瘤或免疫動物之B細胞所製備之抗體與庫、藉由將組基酸或非天然胺基酸突變導入至上述抗體與庫(具有高含量之組胺酸或非天然胺基酸之庫、經於特定位點導入組胺酸或非天然胺基酸之庫等)所製備之抗體或庫等。
篩選該等鈣-離子依賴性抗原-結合分子或鈣-離子依賴性 抗原-結合域之進一步的方法係揭示於PCT專利申請案號PCT/JP2011/077619。
抗原
藉由本發明之抗原-結合分子所辨識之抗原，例如本發明之抗體，不特別限定。該等本發明之抗原-結合分子可辨識任何抗原。藉由本發明之抗原-結合分子所辨識之抗原的具體實例包含但不限於：17-IA、4-1 BB、4Dc、6-酮基-PGF1a、8-異-PGF2a、8-側氧基-dG、A1腺苷受體、A33、ACE、ACE-2、活化素、活化素A、活化素AB、活化素B、活化素C、活化素RIA、活化素RIA ALK-2、活化素RIB ALK-4、活化素RIIA、活化素RIIB、ADAM、ADAM10、ADAM12、ADAM15、ADAM17/TACE、ADAM8、ADAM9、ADAMTS、ADAMTS4、ADAMTS5、地址素、脂聯素、ADP核糖基環化酶-1、aFGF、AGE、ALCAM、ALK、ALK-1、ALK-7、過敏原、α1-抗胰凝乳蛋白酶、α1-抗胰蛋白酶、α-突觸核素、α-V/β-1拮抗劑、阿密寧(aminin)、澱粉不溶素、澱粉樣蛋白β、澱粉樣蛋白免疫球蛋白重鏈可變區、澱粉樣蛋白免疫球蛋白輕鏈可變區、雄激素、ANG、血管升壓素、血管生成素配體-2、抗-Id、抗凝血素III、Anthrax、APAF-1、APE、APJ、apo A1、apo血清澱粉樣蛋白A、Apo-SAA、APP、APRIL、AR、ARC、ART、Artemin、ASPARTIC、心房肽因子、心房肽、心房肽A、心房肽B、心房肽C、av/b3整合素、Axl、B7-1、B7-2、B7-H、BACE、BACE-1、炭疽桿菌保護性抗原、Bad、BAFF、BAFF-R、Bag-1、BAK、Bax、BCA-1、BCAM、Bcl、BCMA、BDNF、b-ECGF、β-2-微 球蛋白、β內醯胺酶、bFGF、BID、Bik、BIM、BLC、BL-CAM、BLK、B-淋巴球刺激子(BIyS)、BMP、BMP-2(BMP-2a)、BMP-3(成骨素)、BMP-4(BMP-2b)、BMP-5、BMP-6(Vgr-1)、BMP-7(OP-1)、BMP-8(BMP-8a)、BMPR、BMPR-IA(ALK-3)、BMPR-IB(ALK-6)、BMPR-II(BRK-3)、BMPs、BOK、蛙皮素、骨-衍生神經營養因子、骨生長荷爾蒙、BPDE、BPDE-DNA、BRK-2、BTC、B-淋巴球細胞黏附分子、C10、C1-i抑制劑、C1q、C3、C3a、C4、C5、C5a(補體5a)、CA125、CAD-8、鈣黏著蛋白-3、抑鈣素(Calcitonin)、cAMP、碳酸酐媒-IX、癌胚胎抗原(CEA)、癌-關聯抗原、心肌營養素-1、組織蛋白酶A、組織蛋白酶B、組織蛋白酶C/DPPI、組織蛋白酶D、組織蛋白酶E、組織蛋白酶H、組織蛋白酶L、組織蛋白酶O、組織蛋白酶S、組織蛋白酶V、組織蛋白酶X/Z/P、CBL、CCI、CCK2、CCL、CCL1/I-309、CCL11/嗜酸細胞活化驅化因子、CCL12/MCP-5、CCL13/MCP-4、CCL14/HCC-1、CCL15/HCC-2、CCL16/HCC-4、CCL17/TARC、CCL18/PARC、CCL19/ELC、CCL2/MCP-1、CCL20/MIP-3-α、CCL21/SLC、CCL22/MDC、CCL23/MPIF-1、CCL24/嗜酸細胞活化驅化因子-2、CCL25/TECK、CCL26/嗜酸細胞活化驅化因子-3、CCL27/CTACK、CCL28/MEC、CCL3/M1P-1-α、CCL3L1/LD-78-β、CCL4/MIP-1-β、CCL5/RANTES、CCL6/C10、CCL7/MCP-3、CCL8/MCP-2、CCL9/10/MTP-1-β、CCR、CCR1、CCR10、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5、CCR6、CCR7、CCR8、CCR9、CD1、CD10、CD105、CD11a、CD11b、CD11c、CD123、 CD13、CD137、CD138、CD14、CD140a、CD146、CD147、CD148、CD15、CD152、CD16、CD164、CD18、CD19、CD2、CD20、CD21、CD22、CD23、CD25、CD26、CD27L、CD28、CD29、CD3、CD30、CD30L、CD32、CD33(p67蛋白質)、CD34、CD37、CD38、CD3E、CD4、CD40、CD40L、CD44、CD45、CD46、CD49a、CD49b、CD5、CD51、CD52、CD54、CD55、CD56、CD6、CD61、CD64、CD66e、CD7、CD70、CD74、CD8、CD80(B7-1)、CD89、CD95、CD105、CD158a、CEA、CEACAM5、CFTR、cGMP、CGRP受體、CINC、CKb8-1、緊密連結蛋白18、CLC、肉毒桿菌毒素、困難梭狀芽孢桿菌毒素、產氣莢膜梭狀芽孢桿菌毒素、c-Met、CMV、CMV UL、CNTF、CNTN-1、補體因子3(C3)、補體因子D、皮質類固醇結合球蛋白、菌落刺激因子-1受體、COX、C-Ret、CRG-2、CRTH2、CT-1、CTACK、CTGF、CTLA-4、CX3CL1/Fractalkine、CX3CR1、CXCL、CXCL1/Gro-α、CXCL10、CXCL11/I-TAC、CXCL12/SDF-1-α/β、CXCL13/BCA-1、CXCL14/BRAK、CXCL15/Lungkine.CXCL16、CXCL16、CXCL2/Gro-β CXCL3/Gro-β、CXCL3、CXCL4/PF4、CXCL5/ENA-78、CXCL6/GCP-2、CXCL7/NAP-2、CXCL8/IL-8、CXCL9/Mig、CXCL1O/IP-10、CXCR、CXCR1、CXCR2、CXCR3、CXCR4、CXCR5、CXCR6、血清胱蛋白C、細胞角質蛋白腫瘤-關聯抗原、DAN、DCC、DcR3、DC-SIGN、破壞加速因子、類δ蛋白質配體4、des(1-3)-IGF-1(腦IGF-1)、Dhh、DHICA氧化酶、Dickkopf-1、毛地黃、二肽醯肽酶IV、DK1、DNAM-1、Dnase、Dpp、DPPIV/CD26、Dtk、ECAD、EDA、 EDA-A1、EDA-A2、EDAR、EGF、EGFR(ErbB-1)、含類EGF域蛋白質7、彈性蛋白酶、彈性素、EMA、EMMPRIN、ENA、ENA-78、內皮唾液酸蛋白、內皮受體、內毒素、腦啡肽酶、eNOS、Eot、嗜酸細胞活化驅化因子、嗜酸細胞活化驅化因子-2、嗜酸細胞活化驅化因子、EpCAM、Ephrin B2/EphB4、Epha2酪胺酸激酶受體、表皮生長因子受體(EGFR)、ErbB2受體、ErbB3酪胺酸激酶受體、ERCC、紅血球生成素(EPO)、紅血球生成素受體、E-選擇素、ET-1、Exodus-2、RSV之F蛋白質、F10、F11、F12、F13、F5、F9、因子Ia、因子IX、因子Xa、因子VII、因子VIII、因子VIIIc、Fas、FcαR、FcεRI、FcBIIb、FcβRI、FcβRIIa、FcβRIIIa、FcβRIIIb、FcRn、FEN-1、鐵蛋白、FGF、FGF-19、FGF-2、FGF-2受體、FGF-3、FGF-8、FGF-酸性、FGF-鹼性、FGFR、FGFR-3、纖維蛋白、纖維母細胞激活蛋白(FAP)、纖維母細胞生長因子、纖維母細胞生因子-10、纖連蛋白、FL、FLIP、Flt-3、FLT3配體、葉酸受體、濾泡刺激荷爾蒙(FSH)、Fractalkine(CX3C)、游離重鏈、游離輕鏈、FZD1、FZD10、FZD2、FZD3、FZD4、FZD5、FZD6、FZD7、FZD8、FZD9、G250、Gas 6、GCP-2、GCSF、G-CSF、G-CSF受體、GD2、GD3、GDF、GDF-1、GDF-15(MIC-1)、GDF-3(Vgr-2)、GDF-5(BMP-14/CDMP-1)、GDF-6(BMP-13/CDMP-2)、GDF-7(BMP-12/CDMP-3)、GDF-8(肌肉生長抑制素)、GDF-9、GDNF、凝溶膠蛋白、GFAP、GF-CSF、GFR-α1、GFR-α2、GFR-α3、GF-β1、gH套膜糖蛋白、GITR、升糖素、升糖素受體、類升糖素肽1受體、Glut 4、麩胺酸羧 肽酶II、糖蛋白荷爾蒙受體、糖蛋白IIb/IIIa(GP IIb/IIIa)、磷脂醯肌醇蛋白聚糖-3、GM-CSF、GM-CSF受體、gp130、gp140、gp72、顆粒球-CSF(G-CSF)、GRO/MGSA、生長荷爾蒙釋放因子、GRO-β、GRO-β、幽門螺旋桿菌、半抗原(NP-cap或NIP-cap)、HB-EGF、HCC、HCC 1、HCMV gB套膜糖蛋白、HCMV UL、造血生長因子(HGF)、Hep B gp120、乙醯肝素酶、肝素輔因子II、肝細胞生長因子、炭疽桿菌保護抗原、肝炎C病毒E2糖蛋白、肝炎E、鐵調素、Her1、Her2/neu(ErbB-2)、Her3(ErbB-3)、Her4(ErbB-4)、單純皰疹病毒(HSV)gB糖蛋白、HGF、HGFA、高分子量黑色素瘤-關聯抗原(HMW-MAA)、HIV套膜蛋白質such as GP120、HIV MIB gp 120 V3環、HLA、HLA-DR、HM1.24、HMFG PEM、HMG B-1、HRG、Hrk、HSP47、Hsp90、HSV gD糖蛋白、人類心肌肌球蛋白、人類巨細胞病毒(HCMV)、人類生長荷爾蒙(hGH)、人類血清白蛋白、人類組織型纖維蛋白溶原活化劑(t-PA)、Huntingtin、HVEM、IAP、ICAM、ICAM-1、ICAM-3、ICE、ICOS、IFN-α、IFN-β、IFN-β、IgA、IgA受體、IgE、IGF、IGF結合蛋白質、IGF-1、IGF-1 R、IGF-2、IGFBP、IGFR、IL、IL-1、IL-10、IL-10受體、IL-11、IL-11受體、IL-12、IL-12受體、IL-13、IL-13受體、IL-15、IL-15受體、IL-16、IL-16受體、IL-17、IL-17受體、IL-18(IGIF)、IL-18受體、IL-1α、IL-1β、IL-1受體、IL-2、IL-2受體、IL-20、IL-20受體、IL-21、IL-21受體、IL-23、IL-23受體、IL-2受體、IL-3、IL-3受體、IL-31、IL-31受體、IL-3受體、IL-4、IL-4受體IL-5、IL-5受體、IL-6、IL-6受體、IL-7、IL-7受 體、IL-8、IL-8受體、IL-9、IL-9受體、免疫球蛋白免疫複合物、免疫球蛋白、INF-α、INF-α受體、INF-β、INF-β受體、INF-β、INF-β受體、IFN type-I、IFN type-I受體、流感病毒、抑制素、抑制素α、抑制素β、iNOS、胰島素、胰島素A-鏈、胰島素B-鏈、類胰島素生長因子1、類胰島素生長因子2、類胰島素生長因子結合蛋白質、整合素、整合素α2、整合素α3、整合素α4、整合素α4/β1、整合素α-V/β-3、整合素α-V/β-6、整合素α4/β7、整合素α5/β1、整合素α5/β3、整合素α5/β6、整合素α-δ(αV)、整合素α-θ、整合素β1、整合素β2、整合素β3(GPIIb-IIIa)、IP-10、I-TAC、JE、激肽釋放酶(kalliklein)、激肽釋放酶11、激肽釋放酶12、激肽釋放酶14、激肽釋放酶15、激肽釋放酶2、激肽釋放酶5、激肽釋放酶6、激肽釋放酶L1、激肽釋放酶L2、激肽釋放酶L3、激肽釋放酶L4、激肽釋放酶抑制劑(kallistatin)、KC、KDR、角化細胞生長因子(KGF)、角化細胞生長因子-2(KGF-2)、KGF、類殺手免疫球蛋白受體、kit配體(KL)、Kit酪胺酸激酶、層黏連蛋白5、LAMP、LAPP(澱粉不溶素、islet-澱粉樣蛋白多肽)、LAP(TGF-1)、潛伏關聯肽、潛TGF-1、潛TGF-1 bp1、LBP、LDGF、LDL、LDL受體、LECT2、Lefty、瘦體素、促黃體荷爾蒙(LH)、Lewis-Y抗原、Lewis-Y相關抗原、LFA-1、LFA-3、LFA-3受體、Lfo、LIF、LIGHT、脂蛋白類、LIX、LKN、Lptn、L-選擇素、LT-a、LT-b、LTB4、LTBP-1、肺表面活性劑、促黃體荷爾蒙、淋巴細胞驅化因子、淋巴細胞毒素B受體、Lyso鞘脂受體、Mac-1、巨噬細胞-CSF(M-CSF)、MAdCAM、MAG、MAP2、MARC、乳腺 絲胺酸蛋白酶抑制因子、MCAM、MCK-2、MCP、MCP-1、MCP-2、MCP-3、MCP-4、MCP-I(MCAF)、M-CSF、MDC、MDC(67 a.a.)、MDC(69 a.a.)、絲胺酸蛋白酶抑制因子(megsin)、Mer、MET酪胺酸激酶受體家族、METALLOPROTEASES、膜糖蛋白OX2、間皮素、MGDF受體、MGMT、MHC(HLA-DR)、微生物蛋白質、MIF、MIG、MIP、MIP-1 α、MIP-1 β、MIP-3 α、MIP-3 β、MIP-4、MK、MMAC1、MMP、MMP-1、MMP-10、MMP-11、MMP-12、MMP-13、MMP-14、MMP-15、MMP-2、MMP-24、MMP-3、MMP-7、MMP-8、MMP-9、單核細胞吸引蛋白質、單核細胞菌落抑制性因子、小鼠促性腺激素關聯肽、MPIF、Mpo、MSK、MSP、MUC-16、MUC18、黏蛋白(Mud)、穆勒氏-抑制物質、Mug、MuSK、髓鞘關聯糖蛋白、骨髓原始抑制劑因子-1(MPIF-I)、NAIP、奈米抗體、NAP、NAP-2、NCA 90、NCAD、N-鈣黏著素、NCAM、腦啡肽酶、神經細胞黏著分子、神經絲抑蛋白(neroserpin)、神經細胞生長因子(NGF)、神經營養蛋白-3、神經營養蛋白-4、神經營養蛋白-6、神經鞭毛素蛋白1、神經鐵蛋白(Neurturin)、NGF-β、NGFR、NKG20、N-甲硫基人類生長荷爾蒙、nNOS、NO、Nogo-A、Nogo受體、來自C型肝炎病毒之非結構蛋白型3(NS3)、NOS、Npn、NRG-3、NT、NT-3、NT-4、NTN、OB、OGG1、抑瘤素M、OP-2、OPG、OPN、OSM、OSM受體、骨誘導因子、谷橋蛋白、OX40L、OX40R、經氧化LDL、p150、p95、PADPr、副甲狀腺荷爾蒙、PARC、PARP、PBR、PBSF、PCAD、P-鈣黏著素、PCNA、PCSK9、PDGF、PDGF受體、PDGF-AA、PDGF-AB、 PDGF-BB、PDGF-D、PDK-1、PECAM、PEDF、PEM、PF-4、PGE、PGF、PGI2、PGJ2、PIGF、PIN、PLA2、胎盤生長因子、胎盤鹼性磷酸酶(PLAP)、胎盤催乳激素、血纖維蛋白溶解酶原活化劑抑制劑-1、血小板生長因子、plgR、PLP、不同尺寸之聚二醇鏈(例如PEG-20、PEG-30、PEG40)、PP14、前激肽釋放酶、普里昂(prion)蛋白質、前降鈣素、計劃性胞死亡蛋白質1、pro胰島素、泌乳素、前驅蛋白質轉化素PC9、弛激素原、前列腺特異性膜抗原(PSMA)、蛋白質A、蛋白質C、蛋白質D、蛋白質S、蛋白質Z、PS、PSA、PSCA、PsmAr、PTEN、PTHrp、Ptk、PTN、P-選擇素糖蛋白配體-1、R51、RAGE、RANK、RANKL、RANTES、弛激素、弛激素A-鏈、弛激素B-鏈、腎素、呼吸道合瘤病毒(RSV)F、Ret、網狀蛋白(reticulon)4、類風濕性因子、RLI P76、RPA2、RPK-1、RSK、RSV Fgp、S100、RON-8、SCF/KL、SCGF、Sclerostin、SDF-1、SDF1 α、SDF1 β、絲胺酸、血清澱粉樣蛋白P、血清白蛋白、sFRP-3、Shh、類志賀氏毒素II、SIGIRR、SK-1、SLAM、SLPI、SMAC、SMDF、SMOH、SOD、SPARC、鞘胺醇1-磷酸酯受體1、葡萄球菌脂磷壁酸、Stat、STEAP、STEAP-II、幹細胞因子(SCF)、鏈激酶、超氧化物歧化酶、多配體蛋白聚醣(syndecan)-1、TACE、TACI、TAG-72(腫瘤關聯糖蛋白-72)、TARC、TB、TCA-3、T-cell受體α/β、TdT、TECK、TEM1、TEM5、TEM7、TEM8、肌腱蛋白、TERT、睪丸類PLAP鹼性磷酸酶、TfR、TGF、TGF-α、TGF-β、TGF-β Pan特異性、TGF-β RII、TGF-β RIIb、TGF-β RIII、TGF-β R1(ALK-5)、TGF-β1、TGF-β2、 TGF-β3、TGF-β4、TGF-β5、TGF-I、凝血酶、促血小板生成素(TPO)、胸腺間質淋巴生成素受體、胸腺Ck-1、甲狀腺刺激荷爾蒙(TSH)、甲狀腺素、甲狀腺素-結合球蛋白、Tie、TIMP、TIQ、組織因子、組織因子蛋白酶抑制劑、組織因子蛋白質、TMEFF2、Tmpo、TMPRSS2、TNF受體I、TNF受體II、TNF-α、TNF-β、TNF-β2、TNFc、TNF-RI、TNF-RII、TNFRSF10A(TRAIL R1 Apo-2/DR4)、TNFRSF10B(TRAIL R2 DR5/KILLER/TRICK-2A/TRICK-B)、TNFRSF10C(TRAIL R3 DcR1/LIT/TRID)、TNFRSF10D(TRAIL R4 DcR2/TRUNDD)、TNFRSF11A(RANK ODF R/TRANCE R)、TNFRSF11B(OPG OCIF/TR1)、TNFRSF12(TWEAK R FN14)、TNFRSF12A、TNFRSF13B(TACI)、TNFRSF13C(BAFF R)、TNFRSF14(HVEM ATAR/HveA/LIGHT R/TR2)、TNFRSF16(NGFR p75NTR)、TNFRSF17(BCMA)、TNFRSF18(GITR AITR)、TNFRSF19(TROY TAJ/TRADE)、TNFRSF19L(RELT)、TNFRSF1A(TNF R1 CD120a/p55-60)、TNFRSF1B(TNF RII CD120b/p75-80)、TNFRSF21(DR6)、TNFRSF22(DcTRAIL R2 TNFRH2)、TNFRSF25(DR3 Apo-3/LARD/TR-3/TRAMP/WSL-1)、TNFRSF26(TNFRH3)、TNFRSF3(LTbR TNF RIII/TNFC R)、TNFRSF4(OX40 ACT35/TXGP1 R)、TNFRSF5(CD40 p50)、TNFRSF6(Fas Apo-1/APT1/CD95)、TNFRSF6B(DcR3 M68/TR6)、TNFRSF7(CD27)、TNFRSF8(CD30)、TNFRSF9(4-1 BB CD137/ILA)、TNFRST23(DcTRAIL R1 TNFRH1)、TNFSF10(TRAIL Apo-2配體/TL2)、TNFSF11(TRANCE/RANK 配體ODF/OPG配體)、TNFSF12(TWEAK Apo-3配體/DR3配體)、TNFSF13(APRIL TALL2)、TNFSF13B(BAFF BLYS/TALL1/THANK/TNFSF20)、TNFSF14(LIGHT HVEM配體/LTg)、TNFSF15(TL1A/VEGI)、TNFSF18(GITR配體AITR配體/TL6)、TNFSF1A(TNF-a Conectin/DIF/TNFSF2)、TNFSF1B(TNF-b LTa/TNFSF1)、TNFSF3(LTb TNFC/p33)、TNFSF4(OX40配體gp34/TXGP1)、TNFSF5(CD40配體CD154/gp39/HIGM1/IMD3/TRAP)、TNFSF6(Fas配體Apo-1配體/APT1配體)、TNFSF7(CD27配體CD70)、TNFSF8(CD30配體CD153)、TNFSF9(4-1 BB配體CD137配體)、TNF-α、TNF-β、TNIL-I、毒性代謝物、TP-1、t-PA、Tpo、TRAIL、TRAIL R、TRAIL-R1、TRAIL-R2、TRANCE、轉鐵蛋白受體、轉型生長因子(TGF)如TGF-α與TGF-β、穿膜糖蛋白NMB、運甲狀腺蛋白(Transthyretin)、TRF、Trk、TROP-2、滋養母細胞糖蛋白、TSG、TSLP、腫瘤壞死因子(TNF)、腫瘤關聯抗原CA 125、表現Lewis Y相關羧化酶之腫瘤關聯抗原、TWEAK、TXB2、Ung、uPAR、uPAR-1、尿激酶、VAP-1、血管內皮生長因子(VEGF)、脂肪特異性絲胺酸蛋白酶抑制劑(vaspin)、VCAM、VCAM-1、VECAD、VE-鈣黏著素、VE-鈣黏著素-2、VEFGR-1(flt-1)、VEFGR-2、VEGF受體(VEGFR)、VEGFR-3(flt-4)、VEGI、VIM、病毒抗原、VitB12受體、Vitronectin受體、VLA、VLA-1、VLA-4、VNR整合素、von Willebrand因子(vWF)、WIF-1、WNT1、WNT10A、WNT10B、WNT11、WNT16、WNT2、WNT2B/13、WNT3、WNT3A、WNT4、 WNT5A、WNT5B、WNT6、WNT7A、WNT7B、WNT8A、WNT8B、WNT9A、WNT9B、XCL1、XCL2/SCM-1-β、XCL1/淋巴細胞驅化因子(Lymphotactin)、XCR1、XEDAR、XIAP、XPD、HMGB1、IgA、Aa、CD81、CD97、CD98、DDR1、DKK1、EREG、Hsp90、IL-17/IL-17R、IL-20/IL-20R、oxidized LDL、PCSK9、pre激肽釋放酶、RON、TMEM16F、SOD1、嗜鉻粒蛋白A、嗜鉻粒蛋白B、tau、VAP1、高分子量激肽原、IL-31、IL-31R、Nav1.1、Nav1.2、Nav1.3、Nav1.4、Nav1.5、Nav1.6、Nav1.7、Nav1.8、Nav1.9、EPCR、C1、C1q、C1r、C1s、C2、C2a、C2b、C3、C3a、C3b、C4、C4a、C4b、C5、C5a、C5b、C6、C7、C8、C9、因子B、因子D、因子H、備解素、硬化蛋白、纖維蛋白原、纖維蛋白、凝血原、凝血酶、組織因子、因子V、因子Va、因子VII、因子VIIa、因子VIII、因子VIIIa、因子IX、因子IXa、因子X、因子Xa、因子XI、因子XIa、因子XII、因子XIIa、因子XIII、因子XIIIa、TFPI、抗凝血酶III、EPCR、調節蛋白、TAPI、tPA、血漿素原、血漿素、PAI-1、PAI-2、GPC3、多配體蛋白聚醣(Syndecan)-1、Syndecan-2、Syndecan-3、Syndecan-4、LPA、S1P。
揭示於本發明之抗原結合分子能降低血漿中上述抗原的濃度。揭示於本發明之抗原結合分子亦能藉由結合至病毒、細菌與真菌之結構性組分而清除病毒、細菌與真菌。特別地，RSV、葡萄球菌磷脂壁酸、困難梭狀芽孢桿菌毒素、類志賀氏毒素II、炭疽菌保護性抗原與C型肝炎病毒E2醣蛋白之F蛋白質可使用作為病毒、細菌與真菌之結構性組分。
用途
本發明亦提供上述本發明之抗原-結合分子之多種用途。
因此，本發明提供本發明之經改質抗原-結合分子用於改良抗原-結合分子-媒介抗原攝入至細胞的用途。再者，本發明亦提供用於改良抗原-結合分子-媒介抗原攝入至細胞的方法，包括改變包含親代FcRn-結合域之抗原-結合分子，藉由取代胺基酸於親代FcRn-結合域於選自下述所成群組之一個或多個位置：EU238、EU250、EU252、EU254、EU255、EU258、EU286、EU307、EU308、EU309、EU311、EU315、EU428、EU433、EU434與EU436，且因而相較於具有完整FcRn-結合域之抗原-結合分子於中性pH增加FcRn-結合活性。
本文中，詞語藉由抗原-結合分子媒介之「攝入至細胞的抗原」意指抗原被攝入至細胞係藉由胞吞作用。同時，本文中，詞語「有助於攝入至細胞」意指結合至抗原之抗原-結合分子於血漿中之細胞內攝入的速率係增加的及/或經射入抗原至血漿的循環量係降低的。此意指相較於FcRn-結合域改質前之抗原-結合分子，係有助於攝入至細胞的速率且因此於增加抗原-結合分子於中性pH範圍之人類FcRn-結合活性之前，或於增加抗原-結合分子於酸性pH範圍之人類FcRn-結合活性且降低抗原-結合活性(結合能力)之前，係低於其中性pH範圍之抗原-結合活性。該速率係經改良較佳為相較於完整IgG與更較佳為相較於完整人類IgG。因此，本發明，其抗原攝入至細胞係藉由抗原-結合分子而有所助益的，可以抗原攝入至細胞的速率為基準而予以評估。抗原攝入至細胞的速率可藉 由，例如，偵測於含有人類FcRn-表現細胞之培養基於添加抗原與抗原-結合分子至該培養基後於該培養基中之抗原濃度的歷時降低，或偵測抗原攝入至人類FcRn-表現細胞之歷時的量而予以計算。使用本發明之方法用以助於抗原-結合分子-媒介抗原攝入至細胞的速率，例如，藉由投藥本發明之抗原-結合分子可增加抗原自血漿清除的速率。因此，抗原-結合分子-媒介抗原攝入至細胞是否有助益的可藉由，例如，藉由投藥本發明之抗原-結合分子測試抗原自血漿清除的速率是否加速或血漿中總抗原濃度是否降低而予以評估。
本文中，詞語「血漿中總抗原濃度」意指結合抗原與未結合抗原之抗原-結合分子濃度之加總，「血漿中游離抗原濃度」為未結合抗原之抗原-結合分子濃度。測定「血漿中總抗原濃度」的各種方法如同後文所揭示之習知於此項技術領域。
本發明亦提供本發明之抗原-結合分子的用途，用以增加抗原於其將藉之前可結合至單一抗原-結合分子之總數。本發明亦提供用以增加抗原可結合至單一抗原-結合分子之數目的方法，係藉由使用本發明之抗原-結合分子。具體第，本發明亦提供用以增加抗原可結合至單一抗原-結合分子之數目的方法，係藉由取代胺基酸於該抗原-結分子之親代FcRn-結合域於選自下述所成群組之一個或多個位置：EU238、EU250、EU252、EU254、EU255、EU258、EU286、EU307、EU308、EU309、EU311、EU315、EU428、EU433、EU434與EU436且因而相較於具有完整FcRn-結合域之抗原-結合分子 於中性pH增加FcRn-結合活性。
「傳統抗體」於其將解於內體中前通常僅可結合一種或二種抗原。本發明之抗原-結合分子可增加循環數直到該抗原-結合分子降解，因此各循環由下述所組成：抗原於血漿中結合至抗原-結合分子，結合至抗原之抗原-結合分子之細胞內攝入以及於內體中自抗原解離，接著抗原-結合分子回至血漿。此意指相較於FcRn-結合域改質前且因此於中性pH或酸性範圍增加抗原-結合分子之人類FcRn-結合活性之前，或於增加人類FcRn-結合活性與降低抗原-結合分子於酸性pH範圍之抗原-結合活性(結合能力)至低於其中性範圍之抗原-結合活性之前的抗原-結合分子，循環數係增加的。因此，循環述是否增加可藉由測試是否上述「有助於細胞內攝入」或是下述之「藥物動力學經改良」而予以評估。
本發明亦提供本發明之抗原-結合分子用以改良自哺乳動物(亦即人類)血液之抗原-移除的用途。特別地，本發明提供本發明之抗原-結合分子用以降低特定抗原之血漿濃度的用途，其中該抗原-結合分子包括可結合至該抗原之抗原-結合域。本發明亦提供用以降低特定抗原之血漿濃度的方法，其中該抗原-結合分子包括可結合至該抗原之抗原-結合域，藉由取代胺基酸於親代FcRn-結合域於選自下述所成群組之一個或多個位置：EU238、EU250、EU252、EU254、EU255、EU258、EU286、EU307、EU308、EU309、EU311、EU315、EU428、EU433、EU434與EU436且因而相較於具有完整FcRn-結合域之抗原-結合分子於中性pH增加FcRn-結合活性。
本發明亦提供本發明之抗原-結合分子用以有助於抗原-游離抗原-結合分子之細胞外釋放之用途，該抗原-結合分子係以抗原-結合形式被攝入至細胞。更具體地，本發明亦提供用以有助於抗原-游離抗原-結合分子之細胞外釋放的方法，該抗原-結合分子係以抗原-結合形式被攝入至細胞，而相較於親代抗體不顯著增加於中性pH對於預先存在之ADA之結合活性，藉由取代胺基酸於親代FcRn-結合域於選自下述所成群組之一個或多個位置：EU238、EU250、EU252、EU254、EU255、EU258、EU286、EU307、EU308、EU309、EU311、EU315、EU428、EU433、EU434與EU436且因於相較於具有完整FcRn-結合域之抗原-結合分子於中性pH增加FcRn-結合活性。
本文中，「以抗原-結合形式被攝入至細胞之抗原-游離抗原-結合分子之細胞外釋放」不必然意指所有被攝入至細胞之結合至抗原之抗原-結合分子以抗原-游離形式被釋放至細胞外側。可接受的是相較於FcRn-結合域改質前且因此於酸性pH範圍增加抗原-結合分子之抗原-結合活性之前至低於其中性pH範圍以及降低於酸性pH範圍之人類FcRn-結合活性之前，以抗原-游離形式被釋放至細胞外側之抗原-結合分子的比例係增加的。釋放至細胞外側之抗原-結合分子較佳保留抗原-結合活性。
本發明亦提供本發明之FcRn-結合域的用途，用以增加抗原-結合分子清除血漿抗原的能力。本發明中，「用以增加清除血漿抗原的能力」為「使抗原-結合分子自血漿清除抗原的能力加倍的方法」之同意詞。更具體地，本發明亦提供 用以增加抗原-結合分子清除血漿抗原之能力的方法，藉由取代胺基酸於親代FcRn-結合域於選自下述所成群組之一個或多個位置：EU238、EU250、EU252、EU254、EU255、EU258、EU286、EU307、EU308、EU309、EU311、EU315、EU428、EU433、EU434與EU436且因而相較於具有完整FcRn-結合域之抗原-結合分子於中性及/或酸性pH增加增加FcRn-結合活性。
本文中，詞語「清除血漿抗原之能力」意指當於活體內投藥或分泌忼原-結合分子時，自血漿移除抗原的能力。因此，本文中「增加抗原-結合分子清除血漿抗原的能力」意指相較於FcRn-結合域改質前且因此於中性pH增加抗原-結合分子之人類FcRn-結合活性之前，或於酸性pH範圍增加人類FcRn-結合活性同時降低抗原-結合分子之抗原-結合活性(結合能力)至低於其中性範圍之抗原-結合活性之前，一旦投藥該抗原-結合分子，抗原自血漿清除的速率為加速的。抗原-結合分子自血漿清除抗原的能力的增加可藉由，例如，活體內投藥可溶性抗原與抗原-結合分子以及測定投藥後血漿中可溶性抗原的濃度而予以評估。當投藥可溶性抗原與經改質抗原-結合分子後血漿中可溶性抗原的濃度為降低時，抗原-結合分子清除血漿抗原的能力可判斷為增加的。可溶性抗原的形式可為A form of soluble抗原can be結合抗原之抗原-結合分子或未結合抗原之抗原-結合分子，其濃度可分別測定為「血漿中結合抗原-結合分子之抗原濃度」以及「血漿中為結核抗原-結合分子之抗原濃度」。後者係與「血漿中游離抗原濃度」為同義詞。 由於「血漿中總抗原濃度」意指結合抗原-結合分子之抗原濃度與未結合抗原-結合分子之抗原濃度之加總，或「血漿中游離抗原濃度」為為結合抗原-結合分子之抗原濃度，可溶性抗原的濃度可測定為「血漿中總抗原濃度」。如揭示於後文中之用於測定「血漿中總抗原濃度」或「血漿中游離抗原濃度」之各種方法為此項技術所習知。
本發明亦提供本發明之FcRn-結合域用以改良抗原-結合分子之藥物動力學的用途。更具體地，本發明亦提供用以改良抗原-結合分子之藥物動力學的方法，係藉由取代胺基酸於親代FcRn-結合域於選自下述所成群組之一個或多個位置：EU238、EU250、EU252、EU254、EU255、EU258、EU286、EU307、EU308、EU309、EU311、EU315、EU428、EU433、EU434與EU436且因而相較於具有完整FcRn-結合域之抗原-結合分子於中性及/或酸性pH增加FcRn-結合活性。
本文中，詞語「藥物動力學的增強」、「藥物動力學的改良」與「優異的藥物動力學」可再敘述為「血漿(血液)滯留的增強」、「血漿(血液)滯留的改良」或「優異的血漿(血液)滯留」與「延長的血漿(血液)滯留」。該等用語於本文中使用作為同義詞。
改良藥物動力學特別涵括：延後的清除：相較於對照抗原-結合分子(例如具有完整FcRn-結合域之抗原-結合分子)，延長抗原-結合分子之投藥與清除之間的時間；及/或延長抗原-結合分子之血漿滯留時間，較佳地為可結合至 其抗原之抗體或抗體衍生物，投藥抗原-結合分子後相較於對照抗原-結合分子之血漿滯留時間；及/或相較於對照抗原-結合分子，縮短於抗原-結合分子之投藥與清除之間抗原為游離的期間(相較於對照抗原-結合分子，延長於個體體內抗原-結合分子係結合至其抗原期間之投藥與清除之間的期間(例如具有完整FcRn-結合域之抗原-結合分子)；及/或於抗體降解之前，相較於抗原結合至對照抗原-結合分子(例如具有完整FcRn-結合域之抗原-結合分子)之比例，增加體內結合至抗原-結合分子之抗原相對於總抗原之比例(相較於投藥與降解之間對照抗原-結合分子之結合個案數，增加抗體或抗體衍生物之投藥與降解之間抗原-結合分子與其抗原結合個案數)。
相較於投藥對照抗原-結合分子後之血漿總抗原或游離抗原濃度，降低投藥抗原-結合分子後之血漿總抗原或游離抗原濃度。
本發明亦提供用以於個體中延後抗原-結合分子之清除的方法，包括導入改質至該抗原-結合分子之FcRn-結合域於選自下述所成群組之一個或多個位置的步驟：EU238、EU250、EU252、EU254、EU255、EU258、EU286、EU307、EU308、EU309、EU311、EU315、EU428、EU433、EU434與EU436。
使用於本文之詞語「改良的藥物動力學」意指不僅延長對個體投藥(人類，或非人類動物如小鼠、大鼠、猴、 兔與犬)抗原-結合分子與自血漿清除(例如，直到抗原-結合分子於細胞內降解等且不能回至血漿)之間的期間，也延長抗原-結合分子以於自抗原-結合分子之投藥質導降解之期間，抗原-結合分子以使抗原結合之形式(例如，以抗原-結合分子之無抗原形式)之抗原-結合分子的血漿滯留。
所以，本發明亦提供延長抗原-結合分子之血漿治療時間的方法，包括導入改質至該抗原-結合分子之FcRn-結合域於選自下述所成群組之一個或多個位置的步驟：EU238、EU250、EU252、EU254、EU255、EU258、EU286、EU307、EU308、EU309、EU311、EU315、EU428、EU433、EU434與EU436.。完整人類IgG可結合至非人類哺乳動物5FcRn。例如，由於完整人類IgG可結合至小鼠FcRn較強於結合至人類FcRn，投藥至小鼠較佳使用於確認發明之抗原-結合分子之性質(Int Immunol.2001 Dec；13(12)：1551-9)。作為另一實例，其本質之FcRn基因係經破壞且人類FcRn基因之轉殖基因經攜帶用以表現的小鼠(Methods Mol Biol.2010；602：93-104)亦可較佳使用於投藥以確認後文揭示之本發明抗原-結合分子之性質。
具體地，「藥物動力學的改良」亦包含於抗原-結合分子之投藥與降解之間不結合至抗原(抗原-結合分子之無抗原形式)的期間延長。當抗原-結合分子已經結合至抗原時，抗原-結合分子於血漿中不能結合至新抗原。因此，抗原-結合分子不能結合至抗原的期間越長，期具有結合至新抗原的潛力期間越長(結合至性另一抗原的機會越高)換言之，於較短的時間期間 更多抗原為結合的。因此，抗原-結合分子之無抗原形式的血漿濃度可為增加的且抗原結合至抗原-結合分子之總期間可藉由投藥經改質抗原-結合分子加速自血漿之抗原清除而予以延長。
具體地，本文之「抗原-結合分子之藥物動力學的改良」包含抗原-結合分子之無抗原形式之藥物動力學參數的改良(血漿半衰期的延長、血漿中平均滯留的延長與血漿廓清的損傷)，投藥經改質抗原-結合分子後抗原結合至抗原-結合分子之期間的延長以及自血漿之抗原-結合分子-媒介抗原清除的加速。
抗原-結合分子之藥物動力學的改良可藉由測定抗原-結合分子或其無抗原形式之任何參數、血漿半衰期、平均血漿滯留時間與血漿廓清而予以評估(「Pharmacokinetics：Enshu ni yoru Rikai(Understanding through practice)」Nanzando)。例如，抗原-結合分子或其無抗原形式之脂血漿濃度係於投藥抗原-結合分子至小鼠、大鼠、猴、兔、犬或人類之後予以測定。然後，測定各參數。當血漿半衰期或平均血漿滯留時間為延長時，抗原-結合分子之藥物動力學可判斷為獲得改良。參數可藉由此項技術領域者所習知方法予以測定。參數可藉由，例如，根據隨附的操作手冊使用藥物動力學分析軟體WinNonlin(Pharsight)藉由非模室數據分析而予以評估。無抗原之抗原-結合分子之血漿濃度可藉由此項技術領域者所習知方法予以測定，例如，使用揭示於Clin Pharmacol.2008 Apr；48(4)：406-17之分析方法。
本文中，詞語「藥物動力學的改良」亦包含延長投藥抗原-結合分子後抗原結合至該抗原-結合分子的期間。投藥該抗原-結合分子後抗原結合至該抗原-結合分子的期間是否延長可藉由測定游離抗原之血漿濃度而予以評估。延長可根據所測定之游離抗原之血漿濃度或游離抗原濃度對總抗原濃度之比例增加所需時間期間而予以判斷。
本發明亦提供本發明之抗原-結合分子用以降低特定抗原之總游離抗原血漿濃度或游離抗原血漿濃度的用途，其中該抗原-結合分子包括可結合該抗原之抗原-結合域。更具體地，本發明亦提供用以降低總抗原血漿濃度或游離抗原血漿濃度的方法，該方法包括下述步驟：提供包括親代FcRn-結合域之抗原-結合分子，其中該抗原-結合分子包括可結合至該抗原之抗原-結合域，取代胺基酸於親代FcRn-結合域於選自下述所成群組之一個或多個位置：EU238、EU250、EU252、EU254、EU255、EU258、EU286、EU307、EU308、EU309、EU311、EU315、EU428、EU433、EU434與EU436且因而相較於具有完整FcRn-結合域之抗原-結合分子於中性pH增加FcRn-結合活性。
再者，本發明亦提供，包括導入改質至該抗原-結合分子之FcRn-結合域於選自下述所成群組之一個或多個位置的步驟：EU238、EU250、EU252、EU254、EU255、EU258、EU286、EU307、EU308、EU309、EU311、EU315、EU428、EU433、EU434與EU436。使用於本文之詞語「抗原-清除速率」意指於抗體或抗體衍生物之投藥與清除(亦即，降解)之間的時 間，抗原-結合分子可自血漿移除的抗原數目。
未結合至抗原-結合分子之游離抗原的血漿濃度或游離抗原濃度對總濃度的比例可藉由此項技術領域者所習知方法，例如，揭示於Pharm Res.2006 Jan；23(1)：95-103之方法而予以測定。或者，當抗原於活體內顯示特別功能時，抗原是否結合至中和抗原功能之抗原-結合分子(結抗性分子)可藉由測試抗原功能是否被中和而予以評估。抗原功能是否被中和可藉由分析反應抗原功能之活體內標記而予以評估。抗原是否結合至活化抗原功能之抗原-結合分子(促效性分子)可藉由分析反應抗原功能之活體內標記而予以評估。
游離抗原漿濃度的測定以及血漿中游離抗原量與血漿中總抗原量之比例，活體內標記分析與該等測量不特別限定；然而，該等分析較佳可於投藥抗原-結合分子後歷經某時間期間而進行。本發明中，該投藥抗原-結合分子後的期間不特別限定；此項技術領域者可取決於所投藥脂抗原-結合分子的性質等而決定合適的期間。該等期間包含，例如，投藥該抗原-結合分子後一日、投藥該抗原-結合分子後三日、投藥該抗原-結合分子後七日、投藥該抗原-結合分子後14日投藥該抗原-結合分子後28日。本文中，詞語「血漿抗原濃度」意指「血漿中總抗抗原濃度」其為結合抗原或未結合抗原之抗原-結合分子濃度之加總或「血漿中游離抗原濃度」其為未結合抗原脂抗原-結合分子濃度。
血漿中總抗原濃度相較於投藥包括作為人類FcRn-結合域之完整人類IgG Fc區域之參考抗原-結合分子或 相較於當本發明之抗原-結合域分子為投藥時，藉由投藥本發明之抗原-結合分子可較低於2-倍、5-倍、10-倍、20-倍、50-倍、100-倍、200-倍、500-倍、1,000-倍，或甚至更高倍。
分子抗原/抗原-結合分子比例可計算如下所示；
A值：於各時間點之分子抗原濃度
B值：於各時間點分子抗原-結合分子濃度
C值：於各時間點之各分子抗原-結合分子濃度之分子抗原濃度(分子抗原/抗原-結合分子比例)
C=A/B。
較小的C值表示抗原-結合分子之較高的抗原清除效率，反之，較高的C值表示各抗原-結合分子之較低的抗原清除效率。
分子抗原/抗原-結合分子比例相較於投藥包含完整人類IgG Fc區域作為人類FcRn-結合域之參考抗原-結合分子，藉由投藥本發明之抗原-結合分子可較低於2-倍、5-倍、10-倍、20-倍、50-倍、100-倍、200-倍、500-倍、1,000-倍，或甚至更高倍。
本文中，完整人類IgG1、IgG2、IgG3或IgG4較佳使用於作為完整人類IgG而用於欲與抗原-結合分子比較其等之人類FcRn結合活性或活體內活性之參考完整人類IgG的目的。較佳地，可適宜地使用包含相同抗原-結合域作為有興趣的抗原-結合分子以及完整人類IgG Fc區域作為人類FcRn-結合域之參考抗原-結合分子。更較佳地，完整人類IgG1係使用作為欲與抗原-結合分子相比較其等之人類FcRn結合活性或 活體內活性之參考完整人類的目的。
降低血漿中總抗原濃度或分子抗原/抗體比例可如專利WO2011/122011之實施例6、8與13揭示之方法予以評估。更具體地，使用人類FcRn基因轉殖小鼠株32或株276(Jackson Laboratories,Methods Mol Biol.(2010)602：93-104.)，當有興趣之抗原-結合分子不與小鼠之對應抗原不交叉反應時，其等可藉由抗原-抗體共注射模式或穩態抗原輸注模式而予以評估。當抗原-結合分子與對應抗原交叉反應時，其等可藉由簡單地注射抗原-結合分子至人類FcRn基因轉殖小鼠株32 o或株276(Jackson Laboratories)而予以評估。於共注射模式中，抗原-結合分子與抗原之混合物係投藥至小鼠。於穩態抗原輸注模式中，含有抗原溶液之輸注泵係殖入至小鼠以達到恆定血漿抗原濃度且然後注射該抗原-結合分子至小鼠。對所有經投藥之測試抗原-結合分子細使用相同劑量。血漿中總抗原濃度、血漿中游離抗原濃度與血漿係於抗原-結合分子濃度係使用此項技術領域者所習知方法於適當時間點測定。
總或血漿中游離抗原濃度與分子抗原/抗原-結合分子比例可藉由於投藥後之2、4、7、14、28、56或84日予以測定以評估本發明之長期效果。換言之，長期血漿抗原濃度係藉由於投藥抗原-結合分子後之2、4、7、14、28、56或84日，測定總或血漿中游離抗原濃度與分子抗原/抗原-結合分子比例而予以決定，以評價本發明之抗原-結合分子性質。血漿抗原濃度或分子抗原/抗原-結合分子比例降低是否藉由本發明所揭示之抗原-結合分子達成可藉由評價於上述時間點之任一 者或多者的降低而決定。
總或血漿中游離抗原濃度與分子抗原/抗原-結合分子比例可藉由於投藥後之15分鐘1、2、4、8、12或24小時予以測定而評價本發明之短期效果。換言之，短期血漿抗原濃度係藉由於投藥抗原-結合分子後之15分鐘1、2、4、8、12或24小時，測定總或血漿中游離抗原濃度與分子抗原/抗原-結合分子比例而予以決定，以評價本發明之抗原-結合分子性質。
更具體地，如本發明所揭示之該等於清除血漿中抗原活性具有長期效果之抗原-結合分子，於pH 7.0與25℃具有人類FcRn-結合活性於28-倍至440-倍的範圍內較強於完整人類IgG1或KD於3.0微莫耳至0.2微莫耳的範圍內。較佳地，KD於700微毫莫耳至0.2微毫莫耳的範圍內，更較佳地，KD於500微毫莫耳至3.5微毫莫耳的範圍內，更較佳地，於150微毫莫耳至3.5微毫莫耳的範圍內。長期血漿抗原濃度係藉由於投藥抗原-結合分子後之2、4、7、14、28、56或84日，測定總或血漿中游離抗原濃度與分子抗原/抗原-結合分子比例而予以決定，以評價本發明之抗原-結合分子對於血漿中清除抗原之活性的長期效果。血漿抗原濃度或分子抗原/抗原-結合分子比例的降低是否藉由本發明所揭示之抗原-結合分子達成，可藉由評價於上述時間點之任一者或多者的降低而決定。
又更具體地，如本發明所揭示之該等於清除血漿中抗原活性具有短期效果之抗原-結合分子，於pH 7.0與25℃具有人類FcRn-結合活性440-倍較強於完整人類IgG1或KD 強於0.2微莫耳，較佳地強於700微毫莫耳，更較佳地強於500微毫莫耳，最較佳地，強於150微毫莫耳。短期血漿抗原濃度係藉由於投藥抗原-結合分子後之15分鐘1、2、4、8、12或24小時，測定總或血漿中游離抗原濃度與分子抗原/抗原-結合分子比例而予以決定，以評價本發明之抗原-結合分子對於血漿中清除抗原之活性的短期效果。
本發明之抗原-結合分子之投藥途徑可選擇自皮內、靜脈內、玻璃體內、皮下、腹膜內、腸道外與肌肉內注射。
本發明之內容中，較佳為人類之藥物動力學的改良。當於人類之血漿滯留難以測定時，可根據小鼠(例如，正常小鼠、表現人類抗原之基因轉殖小鼠、表現人類FcRc之基因轉殖小鼠)或猴(例如，食蟹猴)之血漿滯留而予以預測。
本文中，詞語「降低抗原-結合分子之抗原-結合活性於酸性pH範圍至較低於中性pH範圍者」意指相較於pH6.7至pH10.0之抗原-結合活性該抗原-結合分子於pH 4.0至pH 6.5之抗原-結合活性係減弱的。較佳地，上述片語意指抗原-結合分子之抗原-結合活性於pH5.5至pH 6.5相較於pH7.0至pH8.0係減弱的，更較佳地意指活體內其抗原-結合活性於早期內體之pH相較於其抗原-結合活性於血漿之pH係減弱的。具體地，相較於pH7.4之抗原-結合活性該抗原-結合分子於pH 5.8至pH 6.0之抗原-結合活性係減弱的。
本文中，詞語「降低抗原-結合分子於中性pH範圍之抗原-結合活性至較低於酸性pH範圍者」意指相較於pH4.0至pH6.5之抗原-結合活性該抗原-結合分子於pH 6.7至pH 10.0之抗原 -結合活性係減弱的。較佳地，上述片語意指抗原-結合分子之抗原-結合活性於pH7.0至pH 8.0相較於pH5.5至pH6.5係減弱的，更較佳地意指活體內其抗原-結合活性於血漿之pH相較於其抗原-結合活性於早期內體之pH係減弱的。具體地，相較於5.8至pH 6.0之抗原-結合活性該抗原-結合分子於pH 7.4之抗原-結合活性係減弱的。
同時，本文中之表示「降低降低抗原-結合分子之抗原-結合活性於酸性pH範圍至較低於中性pH範圍者」亦表示為「增加抗原-結合分子於中性pH範圍之抗原-結合活性至較高於酸性pH範圍者」。具體地，本發明中，可能增加抗原-結合分子於酸性與中性pH範圍之間之抗原結合活性的比例。例如，於下述之具體中KD(pH 5.8)/KD(pH 7.4)之值係增加的。抗原-結合分子於酸性與中性pH範圍之間之抗原結合活性的比例可增加，例如，藉由降低其酸性pH範圍之抗原-結合活性或增加其中性pH範圍之抗原-結合活性，或二者。
表示「降低抗原-結合分子於中性pH範圍之抗原-結合活性至較低於酸性pH範圍者」亦表示為「增加抗原-結合分子於酸性pH範圍之抗原-結合活性至較高於中性pH範圍者」。具體地，本發明中，可能增加抗原-結合分子於酸性與中性pH範圍之間之抗原結合活性的比例。例如，於下述之具體中KD(pH7.4)/KD(pH 5.8)之值係增加的。抗原-結合分子於酸性與中性pH範圍之間之抗原結合活性的比例可增加，例如，藉由降低其中性pH範圍之抗原-結合活性或增加其酸性pH範圍之抗原-結合活性，或二者。
使用於本文之詞語「降低於低鈣-離子濃度之抗原-結合活性(結合能力)至較低於高鈣-離子濃度之抗原-結合活性者」意指相較於該抗原-結合域於高鈣-離子濃度對於抗原之結合親和性，降低該抗原-結合域於低鈣-離子濃度對於抗原之結合親和性。低鈣濃度較佳為0.5至10微莫耳，更較佳為0.1至30微莫耳之離子化鈣以及高鈣濃度為100微莫耳至10mM，更較佳為200微莫耳至5mM之離子化鈣。
本文中，表示「相較於中性pH範圍，損害於酸性pH範圍之抗原-結合活性」有時以「降低於酸性pH範圍之抗原-結合活性至較低於中性H範圍者」。
本文中，於酸性pH範圍人類FcRn-結合活性意指pH4.0至pH6.5之人類FcRn-結合活性，較佳為pH5.5至pH6.5之人類FcRn-結合活性人類FcRn-結合活性以及特別較佳為pH5.8至pH6.0之人類FcRn-結合活性，其係相較於活體內早期內體pH。同時，本文中於中性pH範圍人類FcRn-結合活性意指pH6.7至pH10.0之人類FcRn-結合活性，較佳為pH7.0至pH8.0之人類FcRn-結合活性人類FcRn-結合活性以及特別較佳為pH7.4之人類FcRn-結合活性，其係相較於活體內血漿pH。
雖然本發明之抗原-結合分子與用途不為任何特病理論所限制，降低(損害)抗原-結合分子於酸性pH範圍抗原-結合能力至較低於中性pH範圍者及/或增加(增強)於中性pH範圍之人類FcRn-結合活性以及增加單一抗原-結合分子可結合之抗原數目之間的關係，起因於有助於抗原-結合分子攝入 至細胞與自血漿之抗原清除的增強，可如下文解釋。
例如，當抗原-結合分子為結合至膜抗原時，投藥至深體的抗體結合至抗原且然後在抗體仍結合至抗原的情況下，經由與抗原內化至細胞中的內體。然後在抗體仍結合至抗原的情況下，抗體轉位至溶酶體且然後抗體係藉由溶酶體與抗原一起被降解。內化-媒介之自血漿的清除被稱為抗原-依賴性清除且該清除已與數種抗體分子被報導(Drug Discov Today.2006 Jan；11(1-2)：81-8)。當IgG抗體之單一分子以二價方式結合至抗原時，該單一抗體分子在抗體仍維持結合至二個抗原分子的情況下被內化且於溶酶體中被降解。因此，於典型抗體的情況中，一分子的IgG抗體不能結合至三個或更多個抗原分子。例如，具有中和活性之單一IgG抗體分子不能中和三個或更多個抗原分子。
IgG分子於血漿之相對延長的滯留(慢清除)係起因於已知為IgG分子之搶救受體之人類FcRn的功能。當經由包飲作用被攝入至細胞時，IgG分子於內體酸性條件下結合至表現於內體之人類FcRn。雖然不結合至人類FcRn之IgG分子轉移至溶酶體(其於該處被降解)，結合至人類FcRn的IgG分子轉位至細胞表面且藉由於血漿之中性條件下自人類FcRn解離而再次回至血漿。
或者，當抗原-結合分子為結合至可溶性抗原之抗體時，經投藥至深體的抗體結合至抗源且然後在抗體維持結合至抗源的情況下被攝入至細胞。被攝入至細胞之許多抗體經由FcRn被釋放至細胞外側。然而，由於抗體被釋放至細胞外側， 抗體仍維持結合至抗原，抗體不能再次結合至抗原。因此，類似於結合至膜抗原脂抗體，於典型抗體的情況中，一分子IgG抗體不能結合至三個或更多個抗原分子。
於血漿之中性條件下強烈地結合至抗原氮於內體之酸性條件下自抗原解離的pH-依賴性抗原-結合抗體(亦即，於中性條件結合但於酸性條件解離的抗體)可於內體中自抗原解離。該pH-依賴性抗原-結合抗體當抗原解離後藉由FcRn循環至血漿時，可再次結合至抗原；因此，各抗體可重複地結合至數個抗原。再者，結合至抗原-結合分子之抗原於內體中解離且不循環至血漿。此有助於抗原-結合分子-媒介抗原攝入至細胞。因此，投藥抗原-結合分子可增強抗原清除且因而降低血漿抗原濃度。
鈣濃度-依賴性抗原-結合抗體，其於血漿之高鈣濃度條件下強烈地結合至抗原且於內體之低鈣濃度條件下自抗原解離，可於內體中自抗原解離。鈣濃度-依賴性抗原-結合抗體當於抗原解離後經由FcRn循環至血漿時可再次結合至抗原。因此，該單一抗體可重複的結合至多述抗原。同時，因為內體中之抗原解離，結合至抗原-結合分子之抗原不循環至血漿且因此，抗原-結合分子促進抗原攝入至細胞。抗原-結合分子的投藥促進抗原清除且使血漿中抗原濃度減低。
抗原-結合分子-媒介抗原攝入至細胞可進一步藉由於中性條件(pH 7.4)對以pH-依賴性方式(於中性條件結合但於酸性條件解離)結合至抗原之抗體授予人類FcRn-結合活性而有助益。因此，抗原-結合分子的投藥可增強抗原清除且因 而降低血漿抗原濃度。正常地，抗體與抗原-抗體複合物二者係藉由非特異性胞飲作用被攝入至細胞且然後於內體之酸性條件下藉由結合至FcRn被轉運至細胞表面。抗體與抗原-抗體複合物於細胞表面之中性條件下經由自FcRn解離而循環至血漿。因此，當於抗原結合顯現充分的pH依賴性(於中性條件結合但於酸性條件解離)之抗體於血漿中結合至抗原且然後於內體中自所結合之抗原解離時，抗原清除速率係假設為相等於經由非特異性胞飲作用之抗原攝入至細胞的速率。另一方面，當pH依賴性不充分時，於內體中不解離之抗原亦循環至血漿。同時，當pH依賴性充分時，抗清除之速率-決定步驟為藉由非特異性胞飲作用之攝入至細胞。因為FcRn自內體轉運抗體至細胞表面，所以若干FcRn係推測位於細胞表面。
本發明假設IgG-type免疫球蛋白，其為抗原-結合分子之一，典型地於中性pH範圍具有少的FcRn-結合能力但其等於中性pH範圍顯現FcRn-結合能力，可於細胞表面結合至FcRn且然後藉由結合至細胞表面FcRn以FcRn-依賴性方式被攝入至細胞。FcRn-媒介攝入至細胞的速率係較解由非特異性胞飲作用之攝入至細胞的速率為更快速。因此，抗原清除速率可藉由於中性pH範圍授予FcRn-結合能力而進一步地加速。具體地，於中性pH範圍具有FcRn-結合能力之抗原-結合分子轉運抗原至細胞更快速於典型(完整人類)IgG-型免疫球蛋白且然後該抗原-結合分子於內體中自抗原解離。抗原-結合分子循環至細胞表面或血漿且再次結合至另一抗原且經由FcRn被攝入至細胞。此循環速率可藉由改良於中性pH範圍之 FcRn-結合能力而予以加速，藉此加速自血漿之抗原清除速率。再者，係進一步藉由降低抗原-結合分子於酸性pH範圍之抗原-結合活性至較低於中性pH範圍者而進一步改良。此外，單一抗原-結合分子可結合之抗原數，係假設為藉由單一抗原-結合分子所達成之循環數增加而隨之增加。本發明之抗原-結合分子包括抗原-結合域與FcRn-結合域。由於FcRn-結合域不影響抗原結合，或由上述機制的觀點，抗原-結合分子-媒介抗原攝入至細胞的助長，可表現為無關於抗原的類型且結果為藉由降低抗原-結合分子於酸性pH範圍之抗原-結合活性(結合能力)至較低於中性pH範圍者及/或增加於血漿pH其FcRn-結合活性而增加抗原清除速率。
前述本發明之抗原-結合分子之用途中，除了取代於所述之一個或多個位置之外，亦可包括取代於位置EU256。較佳地，胺基酸於位置EU256係經以麩胺酸取代。再者，所有前述用途的方法，除了取代於選自下述所成群組之之一個或多個位置之外，亦可包括取代於位置EU256：EU238、EU250、EU252、EU254、EU255、EU258、EU286、EU307、EU308、EU309、EU311、EU315、EU428、EU433、EU434與EU436，藉此胺基酸於位置EU256係較佳地經以麩胺酸取代。
所有前述用途與方法之較佳具體例中，FcRn-結合域為Fc區域，更較佳地，其為人類Fc區域。
再者，用於中性或酸性pH增加FcRn-結合活性之取代於親代FcRn-結合域之胺基酸序列較佳於位置EU252與EU434以及選自下述所成群組之一個或多個位置：EU238、 EU250、EU254、EU255、EU256、EU258、EU286、EU307、EU308、EU309、EU311、EU315、EU428、EU433與EU436。更較佳地，取代係於三個或更多個位置，其中該三個或更多個位置為表2、4至7所示組合之一。甚至更較佳地，取代為表3所示組合之一。
再者，前述用途的方法可額外地包括導入胺基酸取代於選自下述所成群組之一個或多個位置的步驟：EU387、EU422、EU424、EU426、EU433、EU436、EU438與EU440且藉此降低對於預先存在之ADA之增加的結合活性。較佳地，取代為選自表11之組合。
此外，前述用途的方法亦可包括額外的步驟之導入胺基酸取代於FcRn-結合域於選自下述所成群組之一個或多個位置：EU234、EU235、EU236、EU237、EU238、EU239、EU265、EU266、EU267、EU269、EU270、EU271、EU295、EU296、EU297 EU298、EU300、EU324、EU325、EU327、EU328、EU329、EU331與EU332(根據EU編號系統)。較佳地，矽導入取代L235R/S239K。較佳地，取代為選自表14之組合。
所有前述用途與方法之抗原-結合分子可包括pH-依賴性抗原-結合域或鈣離子-依賴性抗原-結合域。藉由本發明之抗原-結合分子所媒介之抗原攝入至細胞係藉由降低上述抗原-結合分子於酸性pH範圍之抗原-結合活性(結合能力)至較低於其抗原-結合活性於中性pH範圍者而進一步改良。亦較佳地為藉由降低本發明抗原-結合分子於低鈣-離子濃度(亦即0.5至10微莫耳)之抗原-結合活性(結合能力)至較低於其於高鈣- 離子濃度(亦即100微莫耳至10mM)者而進一步改良抗原攝入至細胞，例如藉由取代具有離子化鈣-濃度依賴性抗原-結合域之抗原-結合分子之抗原-結合域。或者，親代抗原-結合分子已包括離子化鈣-濃度依賴性抗原-結合域。用於藉由改變上述抗原-結合分子之抗原-結合域之至少一個胺基酸而降低於酸性範圍之抗原-結合活性(結合能力)的方法係如上所述。較佳地，抗原-結合域係藉由於上述抗原-結合分子之抗原-結合域中導入組胺酸用於至少一個胺基酸或插入至少一個胺基酸改變，其有助於抗原攝入至細胞。
當該等改質增加抗原-結合分子對於預先存在之ADA(例如，類風濕性因子)的親和性時，於中性或酸性pH範圍具有增加的FcRn-結合活性之經改質抗原-結合分子的廓清可降低。此意指藉由進一步改質該抗體且因而降低對於預先存在之ADA的親和性，相較於第二改質前之抗原-結合分子，循環數可增加且因此相較於之前對於預先存在之ADA的親和性為減少的。
該等於中性pH範圍相較於野生型Fc區域，對於預先存在之抗-藥物抗體的親和性不顯著增加之本發明之抗原-結合分子，特別是該等包括於FcRn結合域之胺基酸取代於選自下述所成群組之一個或多個位置者：EU387、EU422、EU424、EU426、EU433、EU436、EU438與EU440，特別有用於作為用於治療罹患自體免疫疾病、移植排斥(移植物-相對-宿主的疾病)、其他炎性及並與過敏性疾病之人類患者的治療性抗體。
自體免疫疾病為當身體組織受到其免疫系統攻擊 時所發生的病況。本文所涵括之自體免疫疾病的實例包含全身性紅斑狼瘡、狼瘡性腎炎、類天疱瘡、天皰瘡、皮肌炎、自體免疫性肝炎、薛格連氏症候群、橋本甲狀腺炎、類風濕性關節炎、青少年糖尿病(1型)、多發性肌炎，硬皮症、愛迪生氏病、乳糜瀉、格林-巴利綜合症、擴張型心肌症，混合性結締組織症、韋格納肉芽腫、抗磷脂質抗體症候群、白斑症、惡性貧血、腎小球性腎炎、與肺部纖維化、重症肌無力、葛瑞夫茲氏病、特發性血小板減少紫斑症、溶血性貧血、糖尿病、發炎性腸道疾病、克隆氏症、潰瘍性大腸炎、多發性硬化症、乾癬予藥物誘發之自體免疫疾病，例如，藥物誘發之狼瘡。較佳地，自體免疫疾病為全身性紅斑狼瘡或狼瘡性腎炎。移植排斥包含移植物-相對-宿主的疾病，為移植接受者的免疫系統攻擊所移植的器官或組織的過程。其他炎性與過敏性疾病包含動脈粥樣硬化症與花粉症。
對於預先存在之ADA之增加的結合親和性可降治療性抗體之臨床使用與藥效。由於該等ADA可影響其藥效與藥物動力學(例如降解速率)，所以該治療性抗體之使用可受到預先存在之ADA的限制。有些時候，此結合可導致嚴重的副作用。再者，本發明亦提供用以降低包含Fc區域之抗原-結合域於中性pH對於預先存在之ADA之結合活性，該Fc區域於中性或酸性pH對於FcRn具有增加的結合活性且於中性pH對於預先存在之ADA具有增加的結合活性。
本發明亦提供包含經改質FcRn-結合域之本發明之抗原-結合分子之用途，用以降低抗原-結合分子於中性pH對於預先 存在之ADA之結合活性，該抗原-結合分子於中性或酸性pH對於FcRn具有增加的結合活性且於中性pH對於預先存在之ADA具有增加的結合活性。
特別地，本發明亦提供用以降低抗原-結合分子之Fc區域之於中性pH對於預先存在之ADA的結合活性的方法，該抗原-結合分子於中性或酸性pH對於FcRn具有增加的結合活性，該方法包括提供於中性或酸性pH對於FcRn具有增加的結合活性且於中性pH對於預先存在之ADA具有增加的結合活性之Fc區域以及取代胺基酸於選自下述所成群組之一個或多個位置：EU387、EU422、EU424、EU426、EU433、EU436、EU438與EU440。
較佳Fc區域為步驟a)為人類Fc區域。較佳地，於中性或酸性pH對於FcRn且於中性pH對於預先存在之ADA具有增加的結合活性之Fc區域包括胺基酸取代於於選自下述所成群組之一個或多個位置：EU238、EU250、EU252、EU254、EU255、EU256、EU258 EU286、EU307、EU308、EU309、EU311、EU315、EU428、EU433、EU434與EU436。更較佳地，其包括取代於選自表2與4至7之位置組合之任一者。甚至更較佳地，其包括表3與17至20之任一者所示取代或取代組合。
較佳地，步驟b)包括取代胺基酸於表8之任一位置。更較佳地，步驟b)包括導入選自表11之取代或組合之一者。
亦較佳地，抗原-結合分子額外地包括pH-依賴性抗原-結合域或鈣離子-依賴性抗原-結合域。
再者，本發明亦提供用以降低抗原-結合分子之對於預先存在之ADA的結合活性的方法，該抗原-結合分子包括於中性pH對於FcRn具有增加的結合活性之Fc區域，該方法包括下述步驟：提供包括於酸性pH對於FcRn以及於於中性pH對於預先存在之ADA均具有增加的結合活性之Fc區域之抗原-結合分子以及取代胺基酸於Fc區域於選自下述所成群組之一個或多個位置：EU387、EU422、EU424、EU426、EU433、EU436、EU438與EU440。
步驟a)中較佳的Fc區域為人類Fc區域。較佳地，於中性pH對於FcRn以及於於中性pH對於預先存在之ADA均具有增加的結合活性之Fc區域包括胺基酸取代於選自下述所成群組之一個或多個位置：EU238、EU250、EU252、EU254、EU255、EU258、EU286、EU307、EU308、EU309、EU311、EU315、EU428、EU433、EU434與EU436。除了取代於上述一或多個位置之外，其亦可包括取代於位置EU256，藉此胺基酸於位置EU256係較佳地經以麩胺酸取代。更較佳地，其包括取代於選自表2及4至7之位置組合之任一位置。甚至更較佳地，其包括選自表3與17至20之任一者之取代或取代組合之任一者。
較佳地，步驟b)包括取代胺基酸於表10之任一位 置。更較佳地，該位係選自下述所成群組：a)EU387、b)EU422、c)EU424、d)EU438、e)EU440、f)EU422/EU424與g)EU438/EU440。甚至更較佳地，步驟b)包括導入選自表11之取代或組合之一者。
再者，本發明亦提供用以降低抗原-結合分子對於預先存在之ADA之結合活性的方法，該抗原-結合分子包括於酸性pH對於FcRn具有增加的結合活性之Fc區域，該方法包括下述步驟：提供包括於酸性pH對於FcRn且於中性pH對於預先存在之ADA具有增加的結合活性之Fc區域之抗原-結合分子以及取代胺基酸於Fc區域於選自下述所成群組之一個或多個位置：EU387、EU422、EU424、EU426、EU433、EU436、EU438與EU440。
步驟a)之較佳Fc區域為人類Fc區域。較佳地，於酸性pH對於FcRn且於中性pH對於預先存在之ADA具有增加的結合活性之Fc區域包括胺基酸取代其包括取代於位置EU434，或ii)於二個或更多個位置，其中該二個或更多個位置為下述所成群組之組合之一者a)EU252/EU254/EU256；b)EU428/EU434；與c)EU250/EU428。較佳地，Fc區域包括i)取代M434H；或ii)下述所成群組之組合之一者：a)M252Y/S254T/T256E；b)M428L/N434S；與c)T250Q與M428L(EU編號)。
較佳具體例中，步驟b)中胺基酸係經取代於a)位置EU424 或b)位置EU438/EU440。更較佳地，取代為a)EU424N或b)組合EU438R/EU440E。
進一步較佳具體例中，用於降低對於預先存在之ADA的結合活性的方法進一步包括步驟c)確認該具有經改質Fc域之抗原-結合分子相較於如前述步驟a)所示之包括完整Fc域之原始抗原-結合分子，對於內生性ADA具有降低的結合活性。
亦較佳地，抗原-結合分子額外地包括pH-依賴性抗原-結合域或鈣離子-依賴性抗原-結合域。
本發明亦提供the use of an本發明之抗原-結合分子用以自哺乳動物血液增加抗原移除的用途，該部乳動物較佳地為罹患自體免疫疾病的人類。
本發明進一步提供用以增加單一抗原-結合分子可結合之抗原數，而相較於親代抗體不顯著增加於中性pH對於預先存在之ADA之結合活性的方法，該方法包括下述步驟提供包括親代FcRn結合域之抗原-結合分子，改變步驟a)之親代FcRn結合域，藉由取代胺基酸於親代FcRn結合域之胺基酸序列於選自下述所成群組之一個或多個位置：EU238、EU250、EU252、EU254、EU255、EU256、EU258EU286、EU307、EU308、EU309、EU311、EU315、EU428、EU433、EU434與EU436；以及改變步驟b)之經改質FcRn-結合域，藉由取代胺基酸於親代FcRn-結合域之胺基酸序列於選自下述所成群組之一個或多個位置：EU387、EU422、EU424、EU426、EU433、EU436、 EU438與EU440。
本發明進一步提供有助於經以抗原-結合形式攝入至細胞之無抗原-結合分子的細胞外釋放，而相較於親代抗體不顯著增加該抗原-結合分子於中性pH對於預先存在之ADA的結合活性的方法，該方法包括下述步驟提供包括親代FcRn-結合域之抗原-結合分子，改變親代FcRn結合域，藉由取代胺基酸於親代FcRn-結合域之胺基酸序列於選自下述所成群組之一個或多個位置：EU238、EU250、EU252、EU254、EU255、EU256、EU258 EU286、EU307、EU308、EU309、EU311、EU315、EU428、EU433、EU434與EU436與EU428；以及改變步驟b)之經改質FcRn-結合域，藉由取代胺基酸於親代FcRn-結合域之胺基酸序列於選自下述所成群組之一個或多個位置：EU387、EU422、EU424、EU426、EU433、EU436、EU438與EU440。
本發明進一步提供用於增加抗原-結合分子清除血漿抗原的能力，而相較於親代抗體不顯著增加於中性pH對於預先存在之ADA的結合活性的方法，該方法包括下述步驟提供包括親代FcRn-結合域之抗原-結合分子，改變親代FcRn結合域，藉由取代胺基酸於親代FcRn-結合域之胺基酸序列於選自下述所成群組之一個或多個位置：EU238、EU250、EU252、EU254、EU255、EU256、EU258 EU286、EU307、EU308、EU309、EU311、EU315、EU428、EU433、EU434與EU436與EU428；以及 改變步驟b)之經改質FcRn-結合域，藉由取代胺基酸於親代FcRn-結合域之胺基酸序列於選自下述所成群組之一個或多個位置：EU387、EU422、EU424、EU426、EU433、EU436、EU438與EU440。
本發明進一步提供用於改良抗原-結合分子之藥物動力學，相較於親代抗體不顯著增加於中性pH對於預先存在之ADA的結合活性的方法，該方法包括下述步驟提供包括親代FcRn-結合域之抗原-結合分子，改變親代FcRn-結合域，藉由取代胺基酸於親代FcRn-結合域之胺基酸序列於選自下述所成群組之一個或多個位置：EU238、EU250、EU252、EU254、EU255、EU256、EU258 EU286、EU307、EU308、EU309、EU311、EU315、EU428、EU433、EU434與EU436；以及改變步驟b)之經改質FcRn-結合域，藉由取代胺基酸於親代FcRn-結合域之胺基酸序列於選自下述所成群組之一個或多個位置：EU387、EU422、EU424、EU426、EU433、EU436、EU438與EU440。
本發明進一步提供用以降低總或游離抗原血漿濃度，相較於親代抗體不顯著增加於中性pH對於預先存在之ADA的結合活性的方法，該方法包括下述步驟提供包括親代FcRn-結合域之抗原-結合分子，其中該抗原-結合分子包括可結合該抗原之抗原-結合域，改變親代FcRn-結合域藉由取代胺基酸於親代FcRn-結合域之胺基酸序列於選自下述所成群組之一個或多個位置： EU238、EU250、EU252、EU254、EU255、EU256、EU258 EU286、EU307、EU308、EU309、EU311、EU315、EU428、EU433、EU434與EU436；以及改變步驟b)之經改質FcRn-結合域，藉由取代胺基酸於親代FcRn-結合域之胺基酸序列於選自下述所成群組之一個或多個位置：EU387、EU422、EU424、EU426、EU433、EU436、EU438與EU440。
錢術用途之方法之步驟a)之較佳Fc區域為人類Fc區域。較佳具體例中，步驟b)之胺基酸取代於一個或多個位置為取代於選自下述所成群組之一個或多個位置：EU238、EU250、EU252、EU254、EU255、EU258、EU286、EU307、EU308、EU309、EU311、EU315、EU428、EU433、EU434與EU436，藉此步驟b)之Fc區域於中性pH對於預先存在之ADA具有增加的結合活性。除了取代於上述一或多個位置之外，其亦可包括取代於位置EU256，藉此胺基酸於位置EU256係較佳地經以麩胺酸取代。更較佳地，其包括取代於選自表2及4至7之位置組合之任一位置。甚至更較佳地，其包括選自表3與17至20之任一者之取代或取代組合之任一者。
較佳地，步驟c)包括取代胺基酸於表10之任一位置。更較佳地，該位置選自下述所成群組：a)EU387、b)EU422、c)EU424、d)EU438、e)EU440、f)EU422/EU424與g)EU438/EU440。甚至更較佳地，步驟c)包括導入選自表11之取代或組合之一者。
另一較佳具體例中，步驟b)之胺基酸取代於一個 或更多個位置係取代於位置EU434，或ii)於二個或更多個位置，其中該二個或更多個位置係選自下述所成群組之組合之一者：a)EU252/EU254/EU256；b)EU428/EU434；以及c)EU250/EU428，藉此步驟b之Fc區域具有於酸性範圍具有增加的FcRn-結合活性且於中性pH範圍對於預先存在之ADA具有增加的結合活性。較佳地，Fc區域包括i)取代M434H；或ii)下述所成群組之組合之一者：a)M252Y/S254T/T256E；b)M428L/N434S；與c)T250Q與M428L(EU編號)。較佳具體例中，步驟c)之胺基酸係經取代於a)位置EU424或b)位置EU438/EU440。更較佳地，取代為a)EU424N或b)組合EU438R/EU440E。
醫藥組成物
本發明亦提供相關之醫藥組成物，其包含本發明之抗原-結合分子或藉由本發明之造方法所製造之抗原-結合分子。本發明之抗原-結合分子與藉由本發明之造方法所製造之抗原-結合分子，相較於典型的抗原-結合分子，藉由投藥具有較大的降低血漿抗原濃度的能力且因而有用於作為醫藥組成物。本發明之醫藥組成物可包含醫藥可接受載劑。本發明中，醫藥組成物常規一只用於治療或預防、或測試與診斷疾病之藥劑。
本發明之醫藥組成物可藉由此項技術領域者所習知方法予以調配。例如，其可使用於腸道外，以包含水或其它醫藥可接受液體之無菌溶液或懸浮液的形式。例如，該組成物可藉由混合一般醫藥品製造實務上所核可之單位劑量形式而 調配，藉由合適地與醫藥可接受載劑或媒劑組合，具體地係與無菌水、生理鹽水、蔬菜油、乳化劑、懸浮劑、界面活性劑、安定化劑、矯味劑、賦形劑、沒記、防腐劑、黏合劑等。該等調配物中，活性成分的量可容易地且常堆地予以判斷而於預先測定範圍中獲得合適量。
用於注射之無菌組成物，可根據標準調配食物，為使用如注射用蒸餾水之媒劑而予以調配。用於注射之水溶液包含，例如，生理鹽水與含有葡萄糖或其他佐劑(例如，D-山梨醇、D-甘露糖、D-甘露醇與氯化鈉)之等張溶液。亦可能使用組合合適溶解助劑，例如，醇類(乙醇等)、聚醇類(丙二醇、聚乙二醇等)、非離子性界面活性劑(聚山梨醇酯、80(TM)、HCO-50等)。
油類包含芝麻油與大豆油。苯甲酸苄酯及/或苄醇可使用於組合作為溶解助劑。亦可能組合緩衝液(例如，磷酸鹽緩衝液與乙酸鈉緩衝液)、舒緩劑(例如，鹽酸普卡因)、安定化劑(例如，苄醇與酚)及/或抗氧化劑。所製備之注射物係經填充於合適的安瓿。
本發明之醫藥組成物較佳為腸道外投藥。例如，組成物可為用於注射之劑量形式、經鼻投藥、經肺投藥或經埤頭藥。該組成物可藉由靜脈內注射、肌肉內注射、腹腔內注射、皮下注射等而為全身性投藥或局部性投藥。
投藥方法可考慮患者的年齡與症狀的條件而合適地選擇。含有抗原-結合分子之醫藥組成物之劑量可為，例如，每次投藥由0.0001至1,000毫克/kg。或者，劑量可為，例如， 每位患者0.001至100,000毫克。然而，本發明不限定為上述數值。劑量與投藥方法依據患者的體重、年齡、症狀等有所改變。此項技術領域者可考慮上述因子的條件而設定合適的劑量與投藥方法。
本發明之胺基酸序列所含有之胺基酸可為經轉譯後改質的。例如，藉由此項技術領域者所習知之焦麩胺醯化將N-末端麩胺醯胺改質為焦麩胺酸。自然地，該等經轉譯後改質的胺基酸包含於本發明之胺基酸序列。
製造方法
本發明亦提供用以製造本發明之抗原-結合分子的方法。特別地，本發明亦提供用以製造具有FcRn-結合域之抗原-結合分子，相較於包含野生型Fc區域之抗原-結合分子，於中性pH對於FcRn-結合域具有增加的結合活性。
本發明亦提供用以製造抗原-結合分子的方法，其包括下述步驟：選擇親代FcRn-結合域且以胺基酸取代於胺基酸序列而改變親代FcRn，該胺基酸序列具有另一胺基酸於選自下述所成群組之一個或多個位置：EU252、EU434、EU436、EU315、EU311、EU308、EU307、EU286、EU254、EU250、EU238、EU387、EU422、EU424、EU428、EU438與EU440；選擇抗原-結合分子之抗原-結合域且改變抗原-結合域之至少一個胺基酸以獲得pH-依賴性抗原-結合域或鈣-離子依賴性抗原-結合域；獲得編碼抗原-結合分子之基因，其中於步驟(a)與(b)所製 備之人類FcRn-結合域與抗原-結合域係經連結；以及使用製備於步驟(c)的基因製造抗原-結合分子。
較佳地，所選擇之抗原-結合分子包括抗原-結合域，其於pH 5.5至6.5相較於pH7至8對於抗原具有較低結合活性或具有鈣依賴性抗原結合活性。較佳地，步驟a)之FcRn-結合域為本發明之FcRn-結合域。更較佳地，FcRn-結合域包括胺基酸取代三個或更多個位置，其中該三個或更多個位置為表2與4至7所示之組合之一者。甚至更較佳地，FcRn-結合域包括三個或更多個取代中該三個或更多個取代為表3、17至20所示組合之一者。
步驟(a)可包括包括取代胺基酸取代於選自下述所成群組之一個或多個位置：EU238、EU250、EU252、EU254、EU255、EU258、EU286、EU307、EU308、EU309、EU311、EU315、EU428、EU433、EU434與EU436且選擇於中性pH範圍具有較強於KD 3.2微莫耳之人類FcRn-結合活性之FcRn-結合域。
步驟(b)可包括選擇抗原-結合域且如上述之改變抗原-結合域之至少一個胺基酸以獲得pH-依賴性抗原-結合域或選擇鈣-離子依賴性抗原-結合域。改變胺基酸係較佳地取代組胺酸作為至少一個胺基酸或插入至少一個組胺酸。同時，經導入至少一個組胺酸突變處之位點並不特別限定且因此可導入至任何位置，只要組胺酸突變降低抗原-結合活性於酸性pH範圍至較低於於中性pH範圍者。該組胺酸突變可經導入於單一位點或二個或更多個位點。步驟a)與b)可重複二次或更多次。步驟a)與b)之重複數目不特別限定；然而，該數目典型地為10 次或更少。
操作式連接(a)與(b)所製備之FcRn-結合域與抗原-結合域之連接子不限定為任何形式。人類FcRn-結合域與抗原-結合域可藉由共價力或非-共價力連接。特別地，連接子可為肽連接子或化學連接子或結合對連接子如生物素與鏈黴親和素的組合。包括人類FcRn-結合域與抗原-結合域之多肽的改質係習知於此項技術領域。另一具體例中，本發明之人類FcRn-結合域與抗原-結合域可藉由於人類FcRn-結合域與抗原-結合域之間形成融合蛋白質而予以連接。為了構築人類FcRn-結合域與抗原-結合域之間的融合蛋白質，編碼人類FcRn-結合域與抗原-結合域的基因可操作式地連接以形成框架融合多肽。合適地，包含由數個胺基酸所組成之連接子可插入至人類FcRn-結合域與抗原-結合域之間。例如其序列由(GGGGS)n(序列編號：11)所組成之多個可變化之連接子已知於此項技術領域。
本發明進一步提供用以製造包含FcRn-結合域之抗原-結合分子的方法，相較於包含野生型Fc區域之抗原-結合分子，於中性或酸性pH對於FcRn具有增加的結合活性且不顯著增加於中性pH對於預先存在之ADA之結合活性。
較佳地，用以製造包含Fc區域之抗原-結合分子的方法，於中性或酸性pH對於FcRn具有增加的結合活性且於中性pH對於預先存在之ADA具有減低的結合活性，包括下述步驟：提供於中性或酸性pH對於FcRn具有增加的結合活性且於中性pH範圍對於預先存在之ADA具有增加的結合活性之Fc區域， 取代胺基酸於Fc區域之胺基酸序列於選自下述所成群組之一個或多個位置：EU387、EU422、EU424、EU426、EU433、EU436、EU438與EU440。
(c)改變抗原-結合分子之抗原-結合域之至少一個胺基酸且選擇具有抗原-結合活性於中性pH範圍較強於酸性範圍者之抗原-結合分子；(d)獲得編碼抗原-結合分子之基因，其中(b)所製備之人類FcRn-結合域與(c)所製備之抗原-結合域係經連接，以及(e)使用(d)所製備之基因製造抗原-結合分子。
步驟a)之較佳Fc區域為人類Fc區域。較佳地，於中性或酸性pH範圍對於FcRn與於中性pH範圍預先存在之ADA具有增加的結合活性之Fc區域包括胺基酸取代於於選自下述所成群組之一個或多個位置：EU238、EU250、EU252、EU254、EU255、EU258、EU286、EU307、EU308、EU309、EU311、EU315、EU428、EU433、EU434與EU436。更較佳地，其包括取代於選自表2與4至7之位置組合之任一位置。甚至更較佳地，其包括選自表3與17至20之任一者所示取代或取代組合之任一者。較佳地，步驟a)包含提供編碼於於中性或酸性pH範圍對於FcRn與預先存在之ADA具有增加的結合活性之Fc區域的核苷酸序列。
較佳地，步驟b)之胺基酸取代之取代於表10所示一個或更多個位置或位置組合。更較佳地，步驟b)之取代為表11所示取代或取代組合之一者。步驟b)之胺基酸於選自下述所成群組之一個或多個位置：EU387、EU422、EU424、EU426、EU433、 EU436 EU438與EU440較佳地係藉由於核苷酸序列中置換一個或多個核苷酸而予以取代。
步驟(b)與(c)可依任一順序進行。再者，步驟c)可包括於如上述之抗原-結合域改變至少一個胺基酸以獲得pH-依賴性抗原-結合域，或選擇鈣-離子依賴性抗原-結合域。步驟(c)中，改變胺基酸係較佳地取代組胺酸做為至少一個胺基酸或插入至少一個組胺酸。同時，經導入至少一個組胺酸突變處之位點並不特別限定且因此可導入至任何位置，只要組胺酸突變降低抗原-結合活性於酸性pH範圍至較低於於中性pH範圍者。該組胺酸突變可經導入於單一位點或二個或更多個位點。步驟b)與c)可重複二次或更多次。步驟(b)與(c)之重複數目不特別限定；然而，該數目典型地為10次或更少。
操作式連接(b)與(c)所製備之FcRn-結合域與抗原-結合域之連接子不限定為任何形式。人類FcRn-結合域與抗原-結合域可藉由共價力或非-共價力連接。特別地，連接子可為肽連接子或化學連接子或結合對連接子如生物素與鏈黴親和素的組合。包括人類FcRn-結合域與抗原-結合域之多肽的改質係習知於此項技術領域。另一具體例中，本發明之人類FcRn-結合域與抗原-結合域可藉由於人類FcRn-結合域與抗原-結合域之間形成融合蛋白質而予以連接。為了構築人類FcRn-結合域與抗原-結合域之間的融合蛋白質，編碼人類FcRn-結合域與抗原-結合域的基因可操作式地連接以形成框架融合多肽。合適地，包含由數個胺基酸所組成之連接子可插入至人類FcRn-結合域與抗原-結合域之間。例如其序列由(GGGGS)n(序列編 號：11)所組成之多個可變化之連接子已知於此項技術領域。
因此，本發明之製造方法可進一步包括下述步驟：改變上述胺基酸且取代或插入組胺酸。本發明之製造方法中，可使用非天然胺基酸取代組胺酸。因此，本發明亦可理解為以非天然胺基酸置換上述組胺酸。
本發明製造方法之步驟a)除了取代於上述一或多個位置之外，亦可包括取代於位置EU256，藉此胺基酸於位置EU256係較佳地經以麩胺酸取代。
再者，本發明之製造方法可進一步包括步驟，其包括取代胺基酸於Fc區域之胺基酸序列於選自下述所成群組之一個或多個位置：EU234、EU235、EU236、EU237、EU238、EU239、EU265、EU266、EU267、EU269、EU270、EU271、EU295、EU296、EU297 EU298、EU300、EU324、EU325、EU327、EU328、EU329、EU331與EU332(根據EU編號系統)。較佳地，係導入取代L235R/S239K。
使用於本發明之製造方法之親代FcRn-結合域與包含其等之抗原-結合分子可藉由任何方法製備。例如，可使用預先存在之抗體、預先存預先存在之庫(噬菌體庫等)、自經免疫動物之B細胞或將動物免疫所製備之融合瘤而製備之抗體與庫、藉由將隨機的胺基酸取代導入至上述抗體與庫所製備之抗體與庫、藉由導入組胺酸或非天然胺基酸突變至上述抗體與庫所製備之抗體與庫九高含量之組胺酸或非天然胺基酸之庫、於特定位點經導入組胺酸或非天然胺基酸之庫等)等。
抗原-結合分子之抗原-結合活性與人類FcRn結合 活性可藉由此項技術領域者所習知方法予以測定。除了pH以外的條件可由此項技術領域者合適地決定。
上述製造方法中，抗原與抗原-結合分子可以任何狀態彼此結合以及人類FcRn與抗原-結合分子可以任何狀態彼此結合。該狀態不特別限定；例如，抗原或人類FcRn可與經固定之抗原-結合分子接觸以結合至抗原-結合分子。或者，抗原-結合分子可與經固定之抗原或人類FcRn接觸以結合至抗原-結合分子。或者，抗原-結合分子可與抗原或人類FcRn於溶液中接觸以結合至抗原-結合分子。
由上述方法所製造之抗原-結合分子可為任何本發明之抗原-結合分子；以及較佳的抗原-結合分子包含，例如，其具有抗原-結合域為離子化鈣-濃度依賴性抗原-結合域者或具有抗原-結合域為組胺酸取代作為胺基酸或插入至少一個組胺酸者，且該抗原-結合分子進一步包括人類FcRn-結合域，其包括胺基酸取代於選自下述所成群組之一個或多個位置：EU238、EU250、EU252、EU254、EU255、EU258、EU286、EU307、EU308、EU309、EU311、EU315、EU428、EU433、EU434與EU436(EU編號)。本發明之抗原-結合分子除了取代於上述一個或多個位置之外，亦可包括取代於位置EU256。較佳地，胺基酸於位置EU256係經以麩胺酸取代。更較佳地，FcRn-結合域包括胺基酸取代三個或更多個位置，其中該三個或更多個位置為表2與4至7所示組合之一者。甚至更較佳地，FcRn-結合域包括三個或更多個取代，其中該三個或更多個取代為表3、17至20所示組合之一者。
進一步較佳的抗原-結合分子包含例如，其具有抗原-結合域為離子化鈣-濃度依賴性抗原-結合域者或具有抗原-結合域為組胺酸取代作為胺基酸或插入至少一個組胺酸者，且該抗原-結合分子進一步包括人類Fc區域，其具有胺基酸取代於選自下述所成群組之一個或多個位置：EU387、EU422、EU424、EU426、EU433、EU436、EU438與EU440。更較佳地，FcRn-結合域胺基酸取代於人類FcRn-結合域於三個或更多個位置，其中該三個或更多個位置為表9與10所示組合之一者。
更較佳之抗原-結合分子包含該等具有為離子化鈣-濃度依賴性抗原-結合域者或具有抗原-結合域為組胺酸取代作為胺基酸或插入至少一個組胺酸者，且該抗原-結合分子進一步包括人類Fc區域具有取代胺基酸於選自下述所成群組之一個或多個位置：EU238、EU250、EU252、EU254、EU255、EU256、EU258、EU286、EU307、EU308、EU309、EU311、EU315、EU428、EU433、EU434與EU436以及於選自下述所成群組之一個或多個位置：EU387、EU422、EU424、EU426、EU433、EU436、EU438與EU440(EU編號)。
較佳地，胺基酸於位置EU256係經以麩胺酸取代。
更較佳地，抗原-結合分子包括表11至13所示取代組合。
具有所欲活性之抗體可藉由篩選自下述之抗體庫或融合瘤所獲得之多數抗體予以選擇。
當改變抗原-結合分子之胺基酸時，其可使用已知序列作為改變前之抗原-結合分子的胺基酸序列或藉由此項技 術領域者所習知方法新鑑定之抗原-結合分子的胺基酸序列。例如，當抗原-結合分子為抗體時，可自抗體庫或自產生單株抗體之融合瘤選殖編碼抗體之基因而獲得。
關於抗體庫，許多抗體庫為已知且用於製造抗體庫的方法亦為已知；因此，此項技術領域者可合適地獲得抗體庫。例如，關於噬菌體庫，可參考文獻例如Clackson et al.,Nature(1991)352：624-8；Marks et al.,J.Mol.Biol.(1991)222：581-97；Waterhouses et al.,Nucleic Acids Res.(1993)21：2265-6；Griffiths et al.,EMBO J.(1994)13：324.0-60；Vaughan et al.,Nature Biotechnology(1996)14：309-14；以及日本專利申請案公表公開案(JP-A)H20-504970(對應於非日本之國家內公開之未審查之日本國家階段公開案)。此外，可能使用方法如使用真核細胞作為庫(WO 95/15393)以及核糖體顯示方法。再者，使用人類抗體庫藉由淘選(panning)以獲得人類抗體的技術亦為已知。例如，人類抗體的可變區可使用噬菌體顯示方法予選擇結合至抗原的噬菌體而表現於噬菌體之表面作為單鏈抗體(scFvs)。所選擇之噬菌體的基因分析可決定編碼結合至抗原之人類抗體的可變區的DNA序列。一旦結合至抗原之scFvs的DNA序列被解明，根據該等序列可製造合適的表現宰體以獲得人類抗體。該等方法為已知且可參考專利WO 92/01047、WO 92/20791、WO 93/06213、WO 93/11236、WO 93/19172、WO 95/01438與WO 95/15388。
關於自融合瘤獲得編碼基因的方法，基本上可使用已知技術，其涉及使用所欲抗原或表現所欲抗原之細胞作為 敏化抗原，使用該等抗原根據傳統免疫方法進行免疫，以已知的親代細胞藉由傳統的細胞融合方法融合所得的免疫細胞，藉由傳統篩選方法篩選單株抗體產生細胞(融合瘤)、使用反轉錄酵素由所獲得之融合瘤的mRNA合成抗體可變區(V區)的cDNA以及將該等cDNA與編碼所欲抗體恆定區(C區)之DNA連接。
更具體地，敏化抗原以獲得上述編碼H鏈與L鏈之抗原-結合分子基因可包含，例如，具有免疫性之完全抗原與包括半抗原而無免疫原性之不完全抗原二者；然而其等不限制於該等實例。例如，可使用全蛋白質與膽興趣的蛋白質的部分肽。此外，已知包括多醣類、核酸、脂類等之物質可為抗原。因此，本發明之抗原-結合分子之抗原不特別限定。抗原可藉由此項技術領域者所習知方法製備，例如，藉由以桿狀病毒為主的方法(例如，WO 98/46777)等。融合瘤可藉由，例如，Milstein等人的方法(G.Kohler and C.Milstein,Methods Enzymol.(1981)73：3-46)等而製造。當抗原之免疫原性低時，免疫可於將抗原與具有免疫原性之巨分子(例如白蛋白)連接後進行。或者，必要時，抗原可藉由其等與其它分子連接而轉化為可溶性抗原。當使用如膜抗原(例如，受體)之穿膜分子作為抗原時，該膜抗原之細胞外區域的部份可使用作為片段，或表現穿膜分子的細胞余錫細胞表面可使用作為免疫原。
抗原-結合分子-產生細胞可使用如上述之合適的敏化抗原藉由免疫動物而獲得。或者，抗原-結合分子-產生細胞可藉由於活體外將可製造抗原-結合分子之淋巴球免疫而製 備。多種哺乳動物可使用於免疫；該等通常使用之動物包含嚙齒類、兔形目與靈長類。該等動物包含，例如，如小鼠、大鼠與倉鼠之嚙齒類；如兔之兔形目；以及包含如食蟹猴、獼猴、狒狒與黑猩猩之靈長類。此外，帶有人類抗體基因目錄之基因轉殖動物亦為已知且人類抗體可藉由該等動物獲得(參照專利WO 96/34096；Mendez et al.,Nat.Genet.(1997)15：146-56)。替代使用該等基因轉殖動物，例如，具有對抗抗原之結合活性的所欲人類抗體可藉由於活體外以所欲抗原或表現所欲抗原之細胞敏化淋巴球，然後將經敏化之淋巴球與如U266之人類骨髓瘤細胞融合(參照日本專利申請案公表公開案No.(JP-B)H01-59878(未審查，用於異議之經核准公開之日本專利申請案))。再者，所欲人類抗體可藉由使用所欲抗原將帶有完整目錄之人類抗體基因的基因轉殖動物敏化而獲得(參照WO 93/12227、WO 92/03918、WO 94/02602、WO 96/34096與WO 96/33735)。
動物免疫可藉由將敏化抗原合適的稀釋與懸浮於磷酸鹽緩衝液(PBAS)、生理鹽水等而進行，或必要時將該等與佐劑乳化。然後將其以腹腔內或皮下注射至動物。然後，與弗佐氏不完全作驥混合之敏化抗原係係較佳地每4至21日投藥數次。抗體產生可使用傳統方法於動物血清藉由測量感興趣抗體之力價而予以確認。
自淋巴球或以所欲抗原免疫化之動物所獲得之抗原-結合分子-產生細胞，可使用傳統融合劑(例如，聚乙二醇)與骨髓瘤融合以製造融合瘤(Goding,Monoclonal Antibodies： Principles and Practice,Academic Press,(1986)59-103)。當需要時，融合瘤細胞可培養與生長以及自該等融合瘤所產生之抗原-結合分子之結合特異性，可使用已知分析方法，例如免疫沉澱、放射免疫分析(RIA)與酵素連接免疫吸附分析(ELISA)，而予以測量。之後，若必要時，生感興趣之抗原-結合分子之融合瘤之特異性、親和性或活性，可藉由如限制性稀釋之方法予一次選殖而測定。
其次，編碼所選擇之抗原-結合分子的基因可使用特異性結合至抗原-結合分子(例如，互補於編碼抗體恆定區之序列之寡核苷酸)之探針，自融合瘤或抗原-結合分子-產生細胞(經敏化之淋巴球等)選殖。譯可能使用RT-PCR自mRNA選殖基因。免疫球蛋白分類為5種不同類型，IgA、IgD、IgE、IgG與IgM。該等類型可進一步分成數種亞型(同型物)(例如，IgG-1、IgG-2、IgG-3與IgG-4；IgA-1與IgA-2；等)。使用於本發明以生產抗原-結合分子的H鏈與L鏈不特別限定且可為源自屬於任何該等型或亞型之抗體；然而，IgG特別較佳。
本文中，可能使用遺傳工程技術改變H-鏈-編碼基因與L-鏈-編碼基因。遺傳改變抗體，如嵌合抗體與人源化抗體，其已經人工化改變以具有降低對抗人類等異源免疫原性目的，可合適地製造抗體如小鼠抗體、大鼠抗體、兔抗體、倉鼠抗體、山羊抗體與駱駝抗體。嵌合抗體為抗體包含非人類哺乳動物抗體之H-鏈與L-鏈可變區，如小鼠抗體，以及人類抗體之H-鏈與L-鏈之恆定區。嵌合抗體可藉由將編碼想鼠抗體之可變區的DNA接合至編碼人類抗體之恆定區DNA，插入至表 現載體且將載體導入至宿主以產生抗體。人源化抗體，亦稱為重塑人類抗體，可使用數種寡核苷酸藉由PCR合成，該寡核苷酸係經製造使其DNA序列之終端具有重疊部分，該DNA序列係經設計連接如小鼠之非人類哺乳動物之抗體的互補決定區(CDR)。所得DNA可接合至編碼人類抗體恆定區之DNA。所接合之DNA可插入至表現載體且該載體可導入至宿主以產生抗體(參照EP 239400與WO 96/02576)。噹CDR型呈較佳的抗原-接合位點時，選擇經由CDR接合之人類抗體FR。必要時，抗體可變區之框架區的胺基酸可經置換，以使重塑人類抗體之CDR形成合適的抗原-結合位點(K.Sato et al.,Cancer Res.(1993)53：10.01-10.06)。
除上述人源化之外，抗體可經改變以改良其生物性質，例如，結合至抗原。本發明中，該改變可藉由如定點突變(參照例如，Kunkel(1910.0)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82：488)、PCR突變與盒式突變之方法而達成。一般而言，其生物性質經改良之突變抗體，當相較於原始抗體可變區之胺基酸序列時，顯示序列同源性及/或相似性為70%或更高、更較佳為80%或更高以及甚至較佳為90%或更高(例如，95%或更高、97%、98%或99%)。本文中，序列同源性及/或相似性係經定義為在序列同源性之值已藉由序列對準以及必要時之間隙導入而予以最佳化後，對於原始抗體殘基為同源(相同殘基)或類似(根據胺基酸側鏈之一般性質將胺基酸殘基分類為相同群組)之胺基酸殘基的比例。一般而言，天然胺基酸殘基係根據其側鏈而分類為下述群組： 疏水性：丙胺酸、異白胺酸、纈胺酸、甲硫胺酸與白胺酸；中性親水性：天冬醯胺、麩胺醯胺、半胱胺酸、蘇胺酸與絲胺酸；酸性：天冬胺酸與麩胺酸；鹼性：精胺酸、組胺酸與離胺酸；影響鏈定向之殘基：甘胺酸與脯胺酸；以及芳香性：酪胺酸、色胺酸與苯丙胺酸。
再者，本發明亦提供編碼本發明之FcRn-結合域與本發明之抗原-結合分子的基因。編碼本發明之抗原-結合分子的基因可為任何基因且可為DNA、RNA、核酸類似物等。
再者，本發明亦提供戴有上述基因之宿主細胞。宿主細胞不特別限定且包含，例如，大腸桿菌(E.coli)與各種動物細胞。宿主細胞可使用，例如，作為生產系統亦生產與表現本發明之抗體。可得活體外與活體內的生產系統用於多肽生產系統。該等活體外生產系統包含，例如，使用真核細胞或原核細胞之生產系統。
可使用作為宿主細胞之真核細胞包含，例如，動物細胞、植物細胞與真菌細胞。動物細胞包含：哺乳動物細胞，例如，CHO(中國倉鼠卵細胞株)、COS(猴腎細胞株)、骨髓瘤(Sp2/O,NS0 etc)、BHK(胎兒倉鼠腎細胞株)Hela,Vero,HEK293(具有經剪切之腺病毒(Ad)5 DNA之人類胚胎腎細胞)、PER.C6細胞(經轉形有腺病毒第5型(Ad5)E1A與E1B基因之人類胚胎眼細胞株)293等(參照Current Protocols in Protein Science(May,2001,Unit 5.9,Table 5.9.1))，兩棲細胞 如爪蟾卵母細胞(Xenopus laevis oocytes)(Valle et al.,Nature(1981)291：338-340)；以及昆蟲系包如Sf9、Sf21與Tn5。較佳使用CHO-DG44、CHO-DX11B、COS7細胞、HEK293細胞與BHK細胞表現本發明之抗體。動物細胞中，CHO細胞特別教家用於大規模表現。可將載體導入至宿主細，例如，藉由鈣麟酸鹽方法、DEAE-葡萄糖方法、使用陽離子微脂體DOTAP(Boehringer-Mannheim)的方法、電穿孔方法與脂質體轉染方法。
關於植物細胞，例如，菸草-衍生細胞與浮萍(Lemna minor)已知作為蛋白生產系統。由該等細胞培養之癒合組織以生產本發明之抗原-結合分子。關於真菌細胞，已知蛋白質生產系統係使用酵母細胞者，例如，酵母菌屬(如釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)與裂殖酵母(Saccharomyces pombe))之細胞；以及絲狀真菌的細胞，例如，麴菌屬(如黑麴菌(Aspergillus niger))。該等細胞可使用作為宿主以生產本發明之抗原-結合分子。
細菌細胞可使用於真核細胞生產系統。關於細菌細胞，除上述之使用大腸桿菌之生產系統之外，亦已知使用枯草桿菌之生產系統。該等系統可使用於生產本發明之抗原-結合分子。
由本發明之生產方法所獲得之基因，典型地藉由合適的載體攜帶(插入)且然後導入至宿主細胞。載體不特別限定只要其安定地保留經插入的核酸即可。例如，當使用E.coli作為宿主時，較佳的選殖載體包含pBluescript載體 (Stratagene)；然而，可使用各種市售可得載體。當使用載體生產本發明之抗原-結合分子時，表現載體特別有用。該等表現載體不特別限定只要該載體於活體外、於大腸桿菌中、於培養細胞中或於有機體之體內表現抗原-結合分子即可。例如，pBEST載體(Promega)係較佳用於活體外表現；pET載體(Invitrogen)係較佳用於E.coli；pME18S-FL3載體(GenBank Accession No.AB009864)係較佳用於培養細胞；以及pME18S載體(Mol Cell Biol.(1988)8：466-472)係較佳用於有機體體內。此外，EBNA1蛋白質可共表現以增加感興趣基因的拷貝數。於此情況中，使用包含複製起始點之載體(Biotechnol Bioeng.2001 Oct 20；75(2)：197-203,Biotechnol Bioeng.2005 Sep 20；91(6)：670-7.)。本發明之DNA可藉由傳統方法插入至載體，例如，藉由使用限制性酵素位點之接合(Current protocols in Molecular Biology,edit.Ausubel et al.,(1987)Publish.John Wiley & Sons,Section 11.4-11.11)。
上述宿主細胞不特別限定且各種宿主細胞可根據目的而使用。用於表現抗原-結合分子之細胞的實例包含細菌細胞(如鏈球菌、葡萄球菌、大腸桿菌、鏈黴菌與枯草桿菌之細胞)、真核細胞(如酵母菌與麴菌之細胞)、昆蟲細胞(如果蠅S2與夜蛾SF9)、動物細胞(如CHO、COS、HeLa、C127、3T3、BHK、HEK293與黑色素瘤細胞)與植物細胞。載體可藉由習知方法導入至宿主細胞，例如，鈣磷酸鹽沉澱方法、電穿孔方法(Current protocols in Molecular Biology edit.Ausubel et al.(1987)Publish.John Wiley & Sons,Section 9.1-9.9)、脂質體 轉染方法與微注射方法。
宿主細胞可藉由習知方法培養。例如，當使用動物細胞作為宿主時，可使用DMEM、MEM、RPMI1640或IMDM作為培養基。其等可與血清補充物如FBS或胎牛血清(FCS)一起使用。細胞可培養於無血清培養基。較佳pH於培養期間為6至8。培養典型地係於30至40℃培養15至200小時。根據需要，更換培養基、充氣或攪動。
合適的分泌信號可併入感興趣之多肽，以使表現於宿主細胞之抗原-結合分子分泌至內質網的內腔、至周質空間或至細胞外環境。該等信號可為內源性至感興趣之抗原-結合分子或可為異源性信號。
另一方面，例如，使用動物或植物之生產系統可使用作為活體內生產多肽的系統。感興趣之多肽係導入至動物或植物且該多肽係於動物獲質物體內生產而後予以收集。本發明之「宿主」包含該等動物與植物。
使用動物之生產系統包含使用動物或昆蟲者。可能使用之動物如山羊、豬、綿羊、小鼠與牛(Vicki Glaser SPECTRUM Biotechnology Applications(1993))。該等哺乳動物可為基因轉殖動物。
例如，編碼本發明之抗原-結合分子之多核苷酸係與編碼專一生產於乳中之多肽，如山羊的基因β-酪蛋白，一起製備為融合基因。其次，以含有融合基因之多核苷酸片段注射山羊胚胎，以及然後移植至雌山羊。所欲之抗原-結合分子可自基因轉殖山羊所生產之乳中獲得，其係自接受胚胎之山羊產 得，或自其等之後代獲得。可投藥荷爾蒙以合適的增加由基因轉殖山羊所生產之含有抗原-結合分子之乳量(Ebert et al.,Bio/Technology(1994)12：699-702)。
如蠶之昆蟲可使用於生產本發明之抗原-結合分子。當使用蠶時，帶有編碼感興趣之抗原-結合分子之多核苷酸可使用於感染蠶以及感興趣之抗原-結合分子可自其等之體液獲得。
再者，當植物使用於生產本發明之抗原-結合分子，例如，可使用菸草。當使用菸草時，編碼感興趣之抗原-結合分子之多核苷酸係經插入至植物表現載體，例如，pMON 530，然後該載體係經導入至細菌，如根癌農桿菌(Agrobacterium tumefaciens)。然後使該細菌感染菸草如Nicotiana tabacum，以及所欲之抗原-結合分子可自其葉子收集(Ma et al.,Eur.J.Immunol.(1994)24：131-138)。或者，可以類似細菌感染浮萍(Lemna minor)。選殖後，所欲之抗原-結合分子可自浮萍細胞獲得(Cox KM et al.,Nat.Biotechnol.2006 Dec；24(12)：1591-1597)。
由此所得之抗原-結合分子可自宿主細胞的內側或外側(如培養基或乳)單離且純化為實質純的與均質抗原-結合分子。用於單離與純化抗原-結合分子的方法不特別限定，以及可使用通常使用於多肽純化之單離與純化方法。抗原-結合分子可藉由合適選擇與組合予以單離與純化，例如，層析管柱、過濾、超過濾、鹽析、溶劑沉澱、溶劑萃取、蒸餾、免疫沉澱、SDS-聚丙烯醯胺膠體電泳、等電點電泳、透析與再結晶。
層析技術的實例包括，但不限於，親和性層析、離子交換層析、輸水性層析、膠體過濾、逆相層析與吸附層析(Strategies for Protein Purification and Characterization：A Laboratory Course Manual.Ed Daniel R.Marshak et al.,(1996)Cold Spring Harbor Laboratory Press)。該等曾析方法可使用液相層析如HPLC與FPLC進行。使用於親和性層析的管柱包含蛋白質A管柱與蛋白質G管柱。使用蛋白質A之管柱包含，例如，Hyper D、POROS與Sepharose F.F.(Pharmacia)。
必要時，抗原-結合分子可為任意地經改質以及肽可藉由合適的蛋白質改質酵素部分地經刪除以作為純化之前或之後的抗原-結合分子。該等蛋白質改質酵素包括胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、肽鏈內切酶、蛋白質激酶與葡糖苷酶。
[實施例]
雖然本發明於本文中詳細的且參考其具體例詳細地說明，但應了解前述敘述為力示性且例示於本質，且意圖闡明本發明與期較佳具體例。經由常規的試驗，此項技術領域中具有通常知識者可不悖於本發明的精神與範疇而容易地辨識可於其中完成各種變化與修改，其公認範圍將由隨附之申請專利範圍界定。
[實施例1]構築新穎的中性pH之FcRn結合親和性經改良的Fc變異體
與FcRn交互作用之抗原-結合分子(抗體)之Fc區域(Nat Rev Immunol.2007 Sep；7(9)：715-25)係經工程化以於中性pH對於FcRn具有經改良的結合親和性以增加由血漿之抗原清 除。以於中性pH對於FcRn具有經改良的結合親和性的pH-依賴性抗原結合抗體之由血漿之抗原清除機制與傳統抗體的比較係示於圖1A。
專利WO2011/122011之實施例1至17揭示於中性pH改良對於FcRn之結合親和性之突變(胺基酸取代)且說明產生具有於抗體的中性pH改良對於FcRn的結合親和性的變異體F1至F599(表16)。然而，對於包含該等Fc變異體的抗體開發，不僅是其藥理性質(亦即經改良的FcRn結合)，亦須考量安定性、純度與免疫原性。顯示較差安定性與純度之抗體不是合作為藥物，而且不佳的免疫原性將阻礙其鄰床發展。
具有於中性pH對hFcRn經改良之結合親和性的Fc變異體的設計與產生
設計具有於中性pH對於hFcRn經改良之結合親和性而仍維持高安定性、高純度與低免疫原性風險的各種Fc變異體。對於各Fc變異體之導入至野生型IgG1之Fc區域的突變(胺基酸取代)係示於表M 16(IgG1-F1至F1434)。藉由揭示於專利WO2011/122011的參考例1之此項技術領域所習知的方法，胺基酸取代係經導入至VH3-IgG1(序列編號：1)以產生Fc變異體。
[表16]Fc變異體
變異體(IgG1-F600至IgG-F1434)各包含如上述方法所製備之重鏈與L(WT)-CK(序列編號：2)係藉由專利WO2011/122011之參考例2所揭示知此項技術領域者所習知之方法予以表現與純化。
使用Biacore之Fc變異體的FcRn結合親和性的 評估
製備於實施例1(F600至F1434)的新Fc變異體與製備於專利WO2011/122011(F1至F599)的實施例1的先前技術Fc變異體的hFcRn結合親和性係使用Biacore T100(GE Healthcare)評估。為此目的，以揭示於參考例A2之方法製備人類FcRn。藉由胺基偶合方法將合適量之蛋白質L(ACTIGEN)固定至感應器晶片CM4(GE Healthcare)，且使該晶片捕捉有興趣的抗體。然後，注射經稀釋之FcRn溶液與泳動緩衝液(作為參考溶液)以使人類FcRn與經捕捉於感應器晶片的抗體交互作用。所使用之泳動緩衝液包含50毫莫耳/升之磷酸鈉、150毫莫耳/升之NaCl與0.05%(w/v)之Tween 20(pH 7.0)。FcRn各使用緩衝液稀釋。該晶片使用10毫莫耳/升之甘胺酸-HCl(pH 1.5)再生。分析於25℃排他性地進行。結合率常數ka(1/Ms)與解離率常數kd(1/s)，二者皆為動力學參數，係根據分析所得之感應圖譜而計算，以及各抗體對於人類FcRn的KD(M)係由該等值計算。各參射係使用Biaeore T100 Evaluation Software(GE Healthcare)計算。所有Fc變異體的結合親和性係顯示於表16。
使用差示掃描螢光光譜儀(DSF)之Fc變異體安定性的評估
製備於實施例1(F600至F1434)的新Fc變異體與製備於專利WO2011/122011(F1至F599)的實施例1的先前技術Fc變異體的安定性係使用差示掃描螢光光譜儀(DSF)評估。此方法係由於逐漸增加的溫度測量極性敏感探針的螢光強度，以及 獲得蛋白質之疏水性區域之暴露的瞬時溫度所組成。已有報導使用DSF獲得之瞬時溫度係與使用差示掃描熱量儀所獲得的熔解溫度有相關(Journal of Pharmaceutical Science 2010；4：1707-1720)。將SYPRO橘色染料(Molecular Probes)稀釋於PBS(Sigma)，且添加至蛋白質溶液。各樣品係與20毫升之染料溶液使用。螢光發射係以固定激發於470nm而於555nm收集。於DSF試驗期間，溫度由30增加至99℃，且於測量前於各溫度以6秒平衡時間以4℃增加。數據使用Rotor-Gene Q Series Software(QIAGEN)分析。螢光傳遞的溫度係定義為熔解溫度(Tm)。Fc變異體F1至F1434的Tm值係顯示於表16。
使用尺寸排除層析(SEC)之Fc變異體的純度評估
製備於實施例1(F600至F1434)的新Fc變異體與製備於專利WO2011/122011(F1至F599)的實施例1的先前技術Fc變異體的高分子量物種百分比(HMW(%))係使用尺寸排除層析(SEC)評估。SEC係於ACQUITY UPLC H-Class系統(Waters)進行。將抗體注射至BEH200 SEC管柱(1.7微米，4.6 x 150mm，Waters)。移動相為0.05M磷酸鈉、0.3M氯化鈉(pH7.0，Isekyu)，運行係不隨時間改變的以流速為0.3毫升/分鐘。經溶洗之蛋白質係於215nm以UV吸收偵測。使用Empower2(waters)分析數據。溶洗早於抗體單體峰之峰係記錄為HMW成分百分比。所有Fc變異體(F1-F1434)的HMW(%)係顯示於表16。
使用silico免疫原性預測工具Epibase評估Fc便異體之免疫原性
治療性抗體之臨床利用與藥效可因抗-藥物抗體(ADA)的產生而受到限制，此乃因ADA可影響其藥效與藥物動力學，有時導致嚴重的副作用。雖然許多因子影響治療性抗體的免疫原性，已有多個報導敘述起效子T-細胞抗原決定基存在於治療性蛋白質的重要性。
於silico工具預測T-細胞抗原決定基中，已開發如Epibase(Lonza)、iTope/TCED(Antitope)與EpiMatrix(EpiVax)。藉由於silico工具中使用該等，可預測T-細胞抗原決定基於各胺基酸序列之存在(Expert Opin Biol Ther.2007 Mar；7(3)：405-18.)，允許Fc變異體之潛在免疫原性的評估。Epibase Light(Lonza)係使用於評估Fc便異體之潛在免疫原性。
Epibase Light(Lonza)係於silico工具中使用FATER演算法計算9-聚體肽對主要DRB1等位基因之結合親和性(Expert Opin Biol Ther.2007 Mar；7(3)：405-18.)。Epibase Light(Lonza)鑑定具有強結合之T-細胞抗原決定基以及對MHC第II型之中等結合。對於各Fc變異體之silico免疫原性分數係使用併入Epibase Light(Lonza)系統之下述公式計算。免疫原性分數=加總(各DRB1異型族群頻率)×(臨界抗原決定基之數目))。
對於使用於該公示中之DRB1異型族群頻率，係使用根據高加索族群之DRB1異型族群頻率。
DRB1*0701(25.3%)、DRB1*1501(23.1%)、DRB1*0301(21.7%)、DRB1*0101(15.3%)、DRB1*0401(13.8%)、DRB1*1101(11.8%)、DRB1*1302(8.0%)、DRB1*1401(4.9%)、DRB1*0403 (2.3%)、DRB1*0901(1.8%)
藉由FASTER演算法於變異體之恆定區(CH1-絞鏈-CH2-CH3)所鑑定之任何強的與中等的結合抗原決定基的總數係使用作為該是中林藉抗原決定基之數目。經過濾之抗原決定基為具有人類抗體生殖線序列或於可電驅予行定區之間的接合區域以及位過濾之抗原決定基係考慮於(計算為臨界抗原決定基)免疫原性分數計算中。
揭示於實施例1(F600至F1434)之新的Fc變異體之胺基酸序列的免疫原分數以及揭示於專利WO2011/122011(F1至F599)之實施例1的先前的Fc變異體係使用上述Epibase Light(Lonza)系統計算。所有Fc變異體(F1至F1434)之免疫原性分數係揭示於表16。
[實施例2]鑑定FcRn結合之具有高的安定性、低的高分子量物種與低的免疫原性風險之經改良的Fc變異體
2-1. 藉由對於hFcRn結合親和性作圖Tm、HMW(%)與免疫原性分數之先前與新的Fc變異體的分析揭示於專利WO2011/122011之實施例1之先前的Fc變異體(F1至F599)及於實施例1所製造與評估之新的Fc變異體(F600至F1052)的hFcRn結合親和性與Tm係作圖且顯示於圖2。先前的與新的Fc變異體之hFcRn結合親和性與HMW(%)係作圖且顯示於圖3。Fc變異體F1至F599與新的Fc變異體(F600至F1052)之hFcRn結合親和性與免疫原性分數係作圖且顯示於圖4。
新的Fc變異體(F600至F1052)與先前的Fc變異體(F1至F599)之具有Ser239Lys或Asp270Phe突變之變異體係 自該等途刪除。由於Ser239Lys與Asp270Phe突變改良安定性(Tm)而其不改良對FcRn結合親和性且降低對所有人類Fc γ受體之結合親和性，於下述群組1至4的詳細分析中，Fc變異體之安定性應於不具有Ser239Lys或Asp270Phe突變之變異體相比較。
此外，新的Fc變異體(F600至F1052)與先前的Fc變異體(F1至F599)之具有Pro257Xxx(Xxx為Ala或Val或Ile或Leu或Thr)或Met252Trp突變之變異體係由該等圖刪除，雖然該等變異體改良FcRn結合親和性。Pro257Xxx與Met252Trp突變於Tm不顯示顯著的降低，建議具有Pro257Xxx與Met252Trp突變之變異體具有高安定性。然而該等具有Pro257Xxx與Met252Trp突變之變異體於加速安定性的研究期間或當冷藏儲存時，顯示顯著的凝集與沉澱。由於其不利的安定性，具有Pro257Xxx與Met252Trp突變之Fc變異體不為醫藥開發所接受，且因而於下述群組1至4的詳細分析中，該Fc變異體應自該等圖刪除。
2-2.群組1(對hFcRn之結合親和性強於15nM)之詳細分析
於實施例1製造與評估的新的Fc變異體(F600至F1052)與揭示於專利WO2011/122011之實施例1的先前Fc變異體(F1至F599)，對於hFcRn具有結合親和性強於15nM(後文揭示為群組1)，係藉由作圖hFcRn結合親和性於X-軸以及Tm、HMW(%)與免疫原性分數於Y-軸而詳細分析。
藉由作圖hFcRn結合親和性(KD強於15nM)於X-軸以及 Tm、HMW(%)與免疫原性分數於Y-軸之群組1的詳細分析係分別顯示於圖5、6及7。
作為群組1之Fc變異體之發展能力標準，Tm標準係設定高於57.5℃、HMW(%)標準係設定低於2%、與免疫原性分數係設定低於500。
群組1之滿足所有發展能力標準(Tm高於57.5℃、HMW(%)低於2%、與免疫原性分數低於500)之Fc變異體係顯示於表17。
先前的Fc變異體(F1至F599)無任一者具有親和性強於15nM，反之，於實施例1製造之數個新的Fc變異體係強於15nM且符合所有發展能力標準。揭示於表17之該群組1之新的Fc變異體，對於Fc域極有價值能使其非常快速且延長的自血漿之抗原清除，特別是當與pH-依賴性抗原-結合域組合使用時。
2-3.群組2(對hFcRn之結合親和性界於15nM與50nM之間)之詳細分析
於實施例1製造與評估的新的Fc變異體(F600至F1052) 與揭示於專利WO2011/122011之實施例1的先前Fc變異體(F1至F599)，對於hFcRn具有結合親和性界於15nM與50nM之間(後文揭示為群組2)，係藉由作圖hFcRn結合親和性於X-軸以及Tm、HMW(%)與免疫原性分數於Y-軸而詳細分析。
藉由作圖hFcRn結合親和性(KD界於15nM與50nM之間)於X-軸以及Tm、HMW(%)與免疫原性分數於Y-軸之群組2的詳細分析係分別顯示於圖8、9及10。
作為群組2之Fc變異體之發展能力標準，Tm標準係設定高於60℃、HMW(%)標準係設定低於2%、與免疫原性分數係設定低於500。
群組2之滿足所有發展能力標準(Tm高於60℃、HMW(%)低於2%、與免疫原性分數低於500)之Fc變異體係顯示於表18。
先前的Fc變異體(F1至F599)無任一者符合所有發展能力標準，但於實施例1製造之數個新的Fc變異體符合所有發展能力標準。該群組2之該等符合所有發展能力標準之 Fc變異體，極有價值能使其非常快速且延長的自血漿之抗原清除，特別是當與pH-依賴性抗原-結合域組合使用時。
2-4. 群組3(對hFcRn之結合親和性界於50nM與150nM之間)之詳細分析
於實施例1製造與評估的新的Fc變異體(F600至F1052)與揭示於專利WO2011/122011之實施例1的先前Fc變異體(F1至F599)，對於hFcRn具有結合親和性界於50nM與150nM之間(後文揭示為群組3)，係藉由作圖hFcRn結合親和性於X-軸以及Tm、HMW(%)與免疫原性分數於Y-軸而詳細分析。
藉由作圖hFcRn結合親和性(KD界於50nM與150nM之間)於X-軸以及Tm、HMW(%)與免疫原性分數於Y-軸之群組3的詳細分析係分別顯示於圖11、12及13。
作為群組3之Fc變異體之發展能力標準，Tm標準係設定高於63℃、HMW(%)標準係設定低於2%、與免疫原性分數係設定低於250。
群組3之滿足所有發展能力標準(Tm高於63℃、HMW(%)低於2%、與免疫原性分數低於250)之Fc變異體係顯示於表19。
先前的Fc變異體(F1至F599)無任一者符合所有發 展能力標準，反之，於實施例1製造之數個新的Fc變異體符合所有發展能力標準。該群組3之該等符合所有發展能力標準之Fc變異體極有價值為能使其非常快速且延長的自血漿之抗原清除，特別是當與pH-依賴性抗原-結合域組合使用時。
2-5. 群組4(對hFcRn之結合親和性界於150nM與700nM之間)之詳細分析
於實施例1製造與評估的新的Fc變異體(F600至F1052)與揭示於專利WO2011/122011之實施例1的先前Fc變異體(F1至F599)，對於hFcRn具有結合親和性界於150nM與700nM之間(後文揭示為群組4)，係藉由作圖hFcRn結合親和性於X-軸以及Tm、HMW(%)與免疫原性分數於Y-軸而詳細分析。
藉由作圖hFcRn結合親和性(KD界於50nM與150nM之間)於X-軸以及Tm、HMW(%)與免疫原性分數於Y-軸之群組4的詳細分析係分別顯示於圖14、15及16。
作為群43之Fc變異體之發展能力標準，Tm標準係設定高於66.5℃、HMW(%)標準係設定低於2%、與免疫原性分數係設定低於250。
群組3之滿足所有發展能力標準(Tm高於66.5℃、HMW(%)低於2%、與免疫原性分數低於250)之Fc變異體係顯示於表20。
先前的Fc變異體(F1至F599)無任一者符合所有發展能力標準，反之，於實施例1製造之數個新的Fc變異體符合所有發展能力標準。該群組4之該等符合所有發展能力標準之Fc變異體極有價值為能使其非常快速且延長的自血漿之抗原清除，特別是當與pH-依賴性抗原-結合域組合使用時。
總結而言，揭示於表17至20的新的Fc變異體具有高Tm、低HMW(%)與低免疫原性分數，其係適合於能自血漿移除抗原之抗原-結合分子的醫藥開發。
[實施例3]使用人類FcRn基因轉殖研究於人類IL-6受體穩態融合模式中之新的Fc變異體之活體內抗原清除
3-1. 製備用於活體內研究之抗體
pH-依賴性抗-人類IL6受體IgG1抗體、包括VH3-IgG1(序列編號：1)與VL3-CK(序列編號：3)之Fv4-IgG1、包括VH3-F11(序列編號：4)與VL3-CK(序列編號：3)之先前的Fc變異體Fv4-F11、新的Fc變異體、包括VH3-F652(序列編號：5)與VL3-CK(序列編號：3)之Fv4-F652與包括VH3-F890(序列編號：6)與VL3-CK(序列編號：3)Fv4-F890與包括VH3-F946(序列編號：7)與VL3-CK(序列編號：3)之Fv4-F946係藉由揭示於專利參考例2 of WO2011/122011之參考例2知此項技術領域中具有通常知識者所習知之方法表現與純化。
Fv4-IgG1、Fv4-F11、Fv4-F652、Fv4-F890與Fv4-F946之活體內抗原清除研究係於使用人類FcRn基因轉殖於人類IL-6受體穩態融合模式中進行。
3-2. 使用人類FcRn基因轉殖小鼠株32藉由穩態輸注模式之抗體活體內研究
活體內測試係使用人類FcRn基因轉殖小鼠株30藉由穩態輸注模式進行。含有可溶性人類IL-6受體之輸注泵(MINI-OSMOTIC PUMP MODEL 2004；alzet)係植入於人類FcRn基因轉殖小鼠株32(B6.mFcRn-/-.hFcRn Tg line 32 +/+ mouse(B6.mFcRn-/- hFCRN Tg32 B6.Cg-Fcgrt<tm1Dcr>Tg(FCGRT)32Dcr),Jackson Laboratories；Methods Mol Biol.(2010)602：93-104)的背部皮膚下，以製備可溶性人類IL-6受體的血漿濃度保持恆定的模式動物。抗-人類IL-6受體抗體係投藥治模式動物以評估投藥可溶性人類IL-6受體後之活體內動力學。單株抗-小鼠CD4抗體(內部的)係以20毫克/kg於植入輸注泵之前以及於於抗體投藥至尾靜脈後7與17日投藥，以抑制對抗可溶性人類IL-6受體之中和抗體的產生。然後，含有92.8微克/毫升之可溶性人類IL-6受體輸注泵係植入至小鼠背部皮膚下。輸注泵植入3日後，投藥抗-人類IL-6受體抗體一次至尾靜脈。研究1中，Fv4-IgG1、Fv4-F652、Fv4-F890與Fv4-F946係以劑量1毫克/kg與約1g/kg之Sanglopor(CSL Behring)一起投藥，以及研究2中，Fv4-IgG1、Fv4-F11與Fv4-F652係以1毫克/kg投藥。於二研究中，無抗體投藥至對照組(無抗體注射)。於投藥抗-人類IL-6受體抗體後之合適時間點收集血液。所收集的血液立即以15,000rpm於4℃離心15分鐘以分離血漿。經分離之血漿於分析前儲存於-20℃或更低溫的冷凍箱。
3-3. 藉由ELISA之抗-人類IL-6受體抗體血漿濃度的測定
小鼠血漿中之抗-人類IL-6受體抗體的濃度係藉由ELISA測量。抗-人類IgG(γ-鏈專一性)F(ab')2抗體片段(Sigma)係分注於Nunc-ImmunoPlate MaxiSorp(Nalge Nunc International)且使其於4℃靜置隔夜以製備抗-人類IgG-經固定化盤。製備具有血漿濃度0.8、0.4、0.2、0.1、0.05、0.025與0.0125微克/毫升之校正曲線樣品以及經稀釋100-倍或更高倍之小鼠血漿樣品。200微升之20ng/毫升hsIL-6R係添加至100微升之校正曲線樣品與血漿樣品，然後使該等樣品於室溫靜置一小時。接著，將樣品分注入抗-人類IgG-經固定化盤且使其於室溫靜置一小時。然後，添加生物素化抗-人類IL-6R抗體(R&D)於室溫反應一小時。接著，添加Streptavidin-PolyHRP80(Stereospecific Detection Technologies)於室溫反應一小時且使用TMP One Component HRP Microwell Substrate(BioFX Laboratories)作為基質進行發色性反應。以1N硫酸(Showa Chemical)中止反應後，藉由微孔盤測讀儀測定於450nm的吸收。小鼠血漿之濃度係使用分析軟體SOFTmax PRO(Molecular Devices)由校正曲線的吸收予以計算。
3-4. 藉由電化學發光分析之hsIL-6R血漿濃度的測定
小鼠血漿中hsIL-6R之濃度係藉由電化學發光予以測定。製備經調整為濃度2,000、1,000、500、250、125、62.5與31.25pg/毫升之hsIL-6R校正曲線樣品與經稀釋50-倍或更高備之小 鼠血漿樣品。樣品與以Sulfo-Tag NHS Ester(Meso Scale Discovery)經釕標記之單株抗-人類IL-6R抗體(R&D)、生物素化抗-人類IL-6R抗體(R&D、Systems Inc.、USA)與托珠單抗(tocilizumab)(Chugai Pharmaceutical Co.、Ltd.))之溶液混合後與使其於37℃反應隔夜。作為抗-人類IL-6受體抗體之托珠單抗的最終濃度為333微克/毫升，其為過量於包含於樣品之抗-人類IL-6受體抗體濃度，用以結合幾乎所有樣品中之hsIL-6R分子至托珠單抗的目的。接著，樣品分注至MA400 PR Streptavidin Plate(Meso Scale Discovery)與使其於室溫反應一小時後進行清洗。於分注Read Buffer T(x4)(Meso Scale Discovery)後，立即藉由Sector PR 400 Reader(Meso Scale Discovery)進行測量。使用分析軟體SOFTmax PRO(Molecular Devices)基於校正曲線的回應計算hsIL-6R濃度。
3-5. 研究1之結果；新的Fc變異體之活體內抗原清除效果
圖17顯示血漿hsIL-6R濃度之時間趨勢以及圖18顯示注射Fv4-IgG1、Fv4-F652、Fv4-F890與Fv4-F946後之血漿抗體濃度的時間趨勢。相較於Fv4-IgG1與對照(無抗體注射)，具有新的Fc變異體(具有於中性pH經改良的結合至FcRn)之Fv4-F652、Fv4-F890與Fv4-F946顯示顯著的血漿hsIL-6R濃度降低，其顯示具有於中性pH之改良的結合至FcRn的pH-依賴性抗原結合抗體之活體內抗原清除效果。雖然相較於Fv4-IgG1，Fv4-F652與Fv4-F890於第7日分別顯示30-倍與10-倍之抗原清除效果，Fv4-F652與Fv4-F890之血漿抗體濃度 時間趨勢係相當於Fv4-IgG1。
因此，此研究顯示Fv4-F652與Fv4-F890能選擇性第自血漿清除可溶性抗原而維持抗體藥物動力學相當於Fv4-IgG1者。Fv4-F890屬於群組3且此研究顯示群組3之Fc變異體可降低血漿抗原濃度接浸10-倍而仍維持抗體藥物動力學相當於IgG1。此意味應用群組3 Fc變異體至結合IgG1抗體之pH-依賴性抗原，可降低抗體10-倍。該具由群組3Fc變異體之抗體劑量的降低，當抗體劑量需要被降低而同時需要析少的用藥時，特別有意義。
另一方面，相較於Fv4-IgG1，Fv4-F946顯示血漿hsIL-6R濃度的100-倍降低，以及Fv4-F946之抗體廓清係大於Fv4-IgG1。Fv4-F946屬於群組2且此研究顯示群組2之Fc變異體可降低血漿抗原濃度接近100-倍，即便抗體廓清大於IgG1。此意味應用群組2 Fc變異體至結合IgG1抗體之pH-依賴性抗原，可降低總血漿抗原濃度接近100-倍。於藉由實際抗體劑量(亦即100毫克/kg)欲中和之標靶血漿抗原濃度過高時，抗原濃度的100-倍降低而無關於群組2Fc變異體之抗原廓清的增加，意味標靶抗原可藉由低於10毫克/kg之實際抗體劑量予以中和。
hFcRn結合親和性of Fv4-F652與Fv4-F890之hFcRn結合親和性係以多重複測定以及對抗hFcRn之親和性對於F652為2.4E-07 M(n=7)與對於F890為1.1E-07 M(n=12)。揭示於專利for F890.Previous studies described in實施例1 of WO2011/122011之實施例1的先前研究解明抗原清除與抗 體廓清的程度係相關於於中性pH對於FcRn之結合親和性。如示於圖17，相較於Fv4-F890，Fv4-F652顯示較大程度的抗原清除而抗體藥物動力學係相當於Fv4-F890。因此，其建議於F652之特異突變有助於增強抗原掃除效果。
為了鍵定哪一個殘基有助於增強F652之抗原掃除效果，使用F11(Met252Tyr、Asn434Tyr雙突變)與F652(Pro238Asp、Met252Tyr、Asn434Tyr三突變進行研究2)。對抗hFcRn之親和性對於F11為3.1E-07 M(n=12)，其相當於對於F652所測定之親和性。
3-6. 研究2之結果；Pro238Asp突變之活體內之抗原清除效果
圖19顯示血漿hsIL-6R濃度時間趨勢以及圖20顯示注射Fv4-IgG1、Fv4-F1與Fv4-F652後之血漿抗體濃度時間趨勢。雖然Fv4-F11顯示降低血漿hsIL-6R濃度，Fv4-F652顯示較大的降低血漿hsIL-6R濃度。Fv4-F11與Fv4-F652顯示相當之血漿抗體濃度時間趨勢。
因此，此研究顯示Pro238Asp突變能增強抗原清除血漿而仍然維持相當於Fv4-IgG1之抗體藥物動力學。因此，Pro238Asp突變對於增強藉由pH-依賴性抗原結合抗體之抗原清除極有價值。
[實施例4]結合至FcRn(其結合藉由定點導向突變而改良之Fc變異體)之類風濕性因子的清除
治療性抗體之臨床利用與藥效可因抗-藥物抗體(ADA)的產生而受到限制，此乃因ADA可影響其藥效與藥物動力學， 有時導致嚴重的副作用。許多因子影響治療性抗體的免疫原性以及起效子或T-細胞抗原決定基存在為因子之一。此外，對抗治療性抗體之預先存在之抗體的存在，由ADA的觀點亦可能成為問題。特別是於治療性抗體用於罹患例如類風濕性關節炎、類風濕性因子、對抗人類IgG之自體抗體之患者，預先存在之抗體可成為重點。近來，已有報導具有Asn434His突變之人源化抗-CD4 IgG1抗體引起顯著的類風濕性因子結合(Clin Pharmacol Ther.2011 Feb；89(2)：283-90)。詳細的研究已確認於人類IgG1之Asn434His突變，相較於親代人類IgG1，增加類風濕性因子對抗體之Fc區域的結合。
類風濕性因子為對抗人類IgG之多株自體抗體且其於人類IgG之抗原決定基於各株之間有變異，但其等之抗原決定基似乎位於CH2/CH3界面以及可與FcRn結合之抗原決定基重疊之CH3域。因此，使對於FcRn之結合親和性增加之突變，亦可能增加對類風濕性因子之特異株的結合親和性。
先前的研究顯示Fc-工程化以增加於酸性pH對於FcRn的結合親和性，改良抗體之內體循環效率且延長藥物動力學。對於實施例，M252Y/S254T/T256E(YTE)變異體(J Biol Chem 2006 281：23514-23524.)、M428L/N434S(LS)變異體(Nat Biotechnol、2010 28：157-159.)與N434H變異體(Clinical Pharmacology & Therapeutics(2011)89(2)：283-290.)顯示相對於原始IgG1，於半衰期有改良。
為達成自血漿之抗原清除，與FcRn交互作用之抗原-結合分子(抗體)之Fc區域(Nat Rev Immunol.2007 Sep； 7(9)：715-25)係經工程化以於中性pH對於FcRn具有改良的結合親和性，該經工程化之Fc變異體包含F11變異體、F68變異體、F890變異體與F947變異體。相較於傳統抗體，藉由於中性pH對於FcRn具有改良的結合親和性之pH-依賴性抗原結合抗體自血漿之抗原清除的機制係示於圖1。
該等具有改良的FcRn-結合(於pH6.0及/或中性pH)之Fc變異體，如先前所報導之Asn434His突變的情況，對於可顯示增加的結合。因此，本發明人們測試該等結合經改良Fc變異體之FnRc對於類風濕性因子是否顯示增加的結合。使用於下述研究之變異體抗體為Fv4-hIgG1、Fv4-YTE、Fv4-LS、Fv4-N434H、Fv4-F11、Fv4-F68、Fv4-890與Fv4-F947。
4-1.結合經改良Fc變異體之FnRc之類風濕性因子結合研究
對抗類風濕性因子之結合分析係於p7.4藉由電化學(ECL)發光進行。該等分析係以15或30個各別RA患者(Proteogenex)的血清進行。混何經50-倍稀釋之血清樣品、生物素標記測試抗體(1微克/毫升)與經SULFO-TAG NHS Ester(Meso Scale Discovery)標記測試抗體(1微克/毫升)且於室溫培養3小時。然後，該混合物添加至Streptavidin包覆之MULTI-ARRAY 96孔盤(Meso Scale Discovery)且該等盤於室溫培養2小時後清洗。對各孔添加Read Buffer T(x4)(Meso Scale Discovery)後，立即將盤置於SECTOR imager 2400 Reader(Meso Scale Discovery)且測定電化學發光。
此研究之結果示於圖21與22。圖21與22為來自 15或30個各別RA患者血清之ECL回應。具有原始人類IgG1(圖21-1與22-1)地Fv4-hIgG1僅顯示若的類風濕性因子結合，反之所有結合經改良Fc變異體之FnRc(Fv4-YTE(圖21-2)、Fv4-LS(圖21-3)、Fv4-N434H(圖22-2)、Fv4-F11(圖22-3)、Fv4-F68(圖22-4)、Fv4-890(圖22-5)與Fv4-F947(圖22-6))於多於二個捐贈者中顯著地增加類風濕性因子結合。此研究清楚顯示，當考慮對於FcRn具有改良的結合親和性之治療性抗體對於例如類風濕性關節炎之自體免疫疾病的臨床發展時，相對於預先存在之類風濕性因子之免疫原性可為重點。圖23顯示上述15個RA患者之抗體變異體之血清的ECL回應之平均、幾何平均與中間值。
因此，於其次之研究中，本發明人者以製造能有利地降低多株類風濕性因子結合而仍維持FcRn結合能力之變異體名單。
4-2.結合經改良Fc變異體之FnRc藉由導入突變於Fc區域之類風濕性因子結合的降低
為了製造具有降低的多株類風濕性因子結合而仍維持FcRn結合能力之變異體，將突變合理地導入至假設不干擾人類FcRn/人類IgG交互作用之接近CH2/CH3界面的表面殘基。
Fv4-F890係選擇作為親代Fc變異體以及單一突變與單一突變之組合的Fc變異體系導入至Fv4-F890。製造揭示於表21之新穎的Fc變異體F1058至F1073、F1107至F1114、F1104至F1106與F1230至F1232。此外，Fv4-F947係選擇作為親代Fc變異體以及導入若干單一與組合突變。製造揭示 於表21之新穎的Fc變異體F1119至F1124。首先評估該變異體其等於pH7.0對於人類FcRn之結合親和性。結果亦揭示於表21。相較於其親代Fv4-F890或Fv4-F947，該等變異體對抗人類FcRn不顯示顯著降低的結合親和性，說明該等突變不影響人類FcRn結合。
然後，本發明人們進行表21之變異體於pH7之類風濕性因子結合研究。此研究之結果示於圖24至29。該等圖顯示來自15個各別FA患者之血清，對於下述抗體之變異體的ECL回應：Fv4-IgG1、Fv4-F890、Fv4-F1058至Fv4-1073(圖24)、Fv4-F1104至Fv4-F1106(圖26)、Fv4-F1107 to Fv4-F1114(圖27)、Fv4-F1230至Fv4-F1232(圖28)、Fv4-947與Fv4-F1119至Fv4-F1124(圖29)。圖25-1、25-2與25-3來自15個各別FA患者之血清對於變異體Fv4-IgG1、Fv4-F890與Fv4-F1058至Fv4-1073之ECL回應的平均、幾何平均與中間值。
意外地，相較於顯示強的類風濕性因子結合之F890，對F890具有單一突變之新穎的Fc變異體，如F1062、F1064至F1072與F1107至F1114顯示顯著降低的類風濕性因子結合。特別地，F1062、F1064、F1068、F1070、F1072、F1107至F1109與F1111至F1113顯示相當於原始IgG1之類風濕性因子結合，說明F890變異體之增加的免疫原性風險係完全地藉由導入額外的單一突變而清除以降低類風濕性因子結合而不影響人類FcRn結合。由於患者之類風濕性因子為結合至Fc區域之複數個抗原決定基的多株抗體，意外地單一突變顯著地清除類 風濕性因子對Fc區域之結合。
再者，相較於經單一突變之Fc F1070(Q438R)或F1072(S440E)，經雙突變之Fc F1106(Q438R/S440E)顯示顯著降低的類風濕性因子結合。同樣地，經雙突變之Fc F1230(Q438R/S440D)、F1231(Q438K/S440E)與F1232(Q438K/S440D)，藉由突變之組合，亦顯示額外降低的類風濕性因子結合。同時，F1104(V422E/S424R)或F1105(V422S/S424R)不顯示任何組合效果。
此外，具有經選擇做為親代Fc變異體之Fv4-F939，評估其他突變對於增加FcRn結合(S254T或T256E)與降低類風濕性因子結合(H433D)。製造揭示於表22之新穎的Fc變異體(F1291、F1268、F1269、F1243、F1245、F1321、F1340與F1323)。首先，評估該變異體其等於pH7.0對於人類FcRn之結合親和性。結果揭示於表22。
然後本發者們對於上述該等變異體進行類風濕性因子結合研究。研究結果示於圖30。意外地，相較於F939、F1291(單一H433D突變於F939)於若干捐贈者顯示顯著降低的 類風濕性因子結合。類似地，相較於F1321、F1323(單一H433D突變於F1321)於若干捐贈者顯示顯著降低的類風濕性因子結合。再者，Q438R/S440E、Q438K/S440D與Q438K/S440E突變顯示降低的類風濕性因子結合於具有其他突變用以增加FcRn結合(S254T或T256E)之變異體。
4-3. 結合經改良Fc變異體之FnRc藉由於Fc域導入額外的N-糖基化之類風濕性因子結合的降低
導入額外的N-糖基化於接近類風濕性因子結合之抗原決定基亦可消除類風濕性因子結合，此乃因具有巨大N糖基化之立體阻礙。突變可選擇自該點，而使突變導入N-糖基化序列(Asn-Xxx-Ser/Thr)而仍維持FcRn結合。為了導入額外的N-糖基化序列至Fc區域，單一或雙突變係導入至Fv4-F11。製造揭示於表23之新穎的Fc變異體(F1077至F1083、F1094至F1097)。評估該變異體其等於pH7.0對於人類FcRn之結合親和性以及藉由SDS-Page評估額外糖基化的存在。結果示於表23。發現F1077(K248N)、F1080(S424N)、F1081(Y436N/Q438T)與F1082(Q438N)具有額外的糖基化且特別是F1080(S424N)維持對抗人類FcRn之結合親和性。
因此，其次之研究中，製造經S424N突變導入至揭示於表24之Fv4-F890、Fv4-F1115以及評估其等於pH7.0對於人類FcRn之結合親和性。結果亦揭示於表24。
然後本發者們對於上述該等變異體進行類風濕性因子結合研究。研究結果示於圖31。意外地，單一S424N突變株、Fv4-F1115，顯示顯著降低的類風濕性因子結合。此結果建議額外的N-糖基化的導入，對於消除類風濕性因子結合為有效的方案。
4-4. YTE、N434H與LS變異體之類風濕性因子結合的降低
為了降低Fv4-YTE、Fv4-N434H與Fv4-LS變異體之類風濕性因子結合、其改良於酸性pH之FcRn結合且延長抗體藥物動力學，Q438R/S440E突變或S424N突變係導入至該等變異體。製造揭示於表25之新穎的Fc變異體(F1166、F1167、F1172、F1173、F1170與F1171)。首先該變異體其等於pH6.0對於人類FcRn之結合親和性。結果亦示於表25。
然後本發明者們對於上述該等變異體(Fv4-F1166、F1167、F1172、F1173、F1170與F1171)進行類風濕性因子結合研究。此研究結果示於圖32。相較於二個捐贈者(90216S與90214S)顯示強的類風濕性因子結合的YTE，F1166(Q438R/S440E)與F1167(S424N)顯示顯著降低的類風濕性因子結合。再者，F1173與F1171顯示S424N突變亦能消除N434H與LS變異體之類風濕性因子結合。然而，Q438R/S440E突變不能完全消除N434H與LS變異體之類風濕性因子結合，類風濕性因子結合可見於一或二個捐贈者。
4-5. LS變異體之類風濕性因子結合的降低之替代突變
製造揭示於表26之新穎的單一突變經導入之Fv4-LS、Fc變異體(Fv4-F1380至Fv4-F1392)。
然後本發明者們對於該等於pH6.0仍維持FcRn結合之變異體(Fv4-F1380、F1384-F1386、F1388與F1389)進行類風濕性因子結合研究。此研究結果示於圖33。該等變異體於若干捐贈者顯示顯著降低的類風濕性因子結合。特別地，Fv4-F1389顯示相當於原始IgG1之類風濕性因子結合。
因此，突變如Pro387Arg、Val422Glu、Val422Arg、Val422Ser、Val422Asp、Val422Lys、Val422Thr、Val422Gln、Ser424Glu、Ser424Arg、Ser424Lys、Ser424Asn、Ser426Asp、Ser426Ala、Ser426Gln、Ser426Tyr、His433Asp、Tyr436Thr、Gln438Glu、Gln438Arg、Gln438Ser、Gln438Lys、Ser440Glu、Ser440Asp、Ser440Gln(位置係提供於EU編號)對於降低含有FcRn結合增加的Fc區域(對於實施例F1至F1434)之抗原-結合分子免疫原性極有價值，該抗原-結合分子例如於中性pH對於FcRn具有經改良之結合親和性之pH-依賴性抗原結合抗體其能自血漿清除抗原，以及於酸性pH對於FcRn具有增加的結合親和性之抗體其能改良抗體藥物動力學。
除了EU387、EU422、EU424、EU426、EU433、EU436、EU438與EU440以外，用於降低類風濕性因子的結合而不影響人類FcRn結合之突變位點，可選擇自EU編號248至257、305至314、342-352、380至386、388、414至421、 423、425至437、439與441至444。
[實施例5]於中性pH對於人類FcRn具有經改良的結合之新穎的Fc變異體之類風濕性因子結合的降低
製造揭示於表27之新穎的Fc變異體(F939、F1378、F1379、F1262、F1138、F1344、F1349、F1350、F1351、F1261、F1263、F1305、F1306、F1268、F1269、F1413、F1416、F1419、F1420、F1370、F1371、F1599、F1600、F1566、F1448、F1601-F1603、F1531、F1604、F1605、F1586、F1592、F1610-F1615、F1567、F1572、F1576、F1578、F1579、F1641-F1655、F1329、F1331)。首先評估該等變異體於pH7.0對於人類FcRn之結合親和性。結果亦示於表27。
然後本發明者們進行表27之該等變異體於pH7.4之類風濕性因子結合研究。此研究結果示於圖34至94。 用於降低類風濕性因子結合之雙突變(Q438R/S440E、Q438R/S440D、Q438K/S440E與Q438K/S440D)顯示顯著降低的類風濕性因子結合對用以於中性pH增加FcRn結合之其他突變。
5-1.於酸性pH對於人類FcRn具有經改良的結合之新穎的Fc變異體之類風濕性因子結合的降低
製造揭示於表28之新穎的Fc變異體(F1718-F1721、F1671、F1670、F1711至F1713、F1722至F1725、F1675、F1714至F1717、F1683、F1756至F1759、F1681、F1749至F1751、F1760至F1763、F1752至F1755、F1685)。首先評估該等變異體其等於pH6.0對於人類FcRn之結合親和性。結果亦示於表28。
然後本發明者們對於表28之變異體於pH7.4進行類風濕性因子結合研究。此研究之結果示於圖95至130。
用於降低類風濕性因子結合之雙突變(Q438R/S440E、Q438R/S440D、Q438K/S440E與Q438K/S440D)顯示顯著降低的類風濕性因子結合對用以於酸性pH增加FcRn結合之其他突變。
[實施例6]使用人類FcRn基因轉殖小鼠於人類IL-6受體穩態輸注模式中新穎的Fc變異體之活體內抗原清除研究
6-1. 製備用於活體內研究之抗體
藉由揭示於專利WO2011/122011之實施例2之此項技術領域者所習知方法表現與純化pH-依賴性抗-人類IL6受體IgG1抗體、包括VH3-IgG1(序列編號：1)與VL3-CK(序列編號：3)之Fv4-IgG1、新的Fc變異體、包括VH3-F1243(序列編號：8)與VL3-CK(序列編號：3)之Fv4-F1243以及包括VH3-F1245(序列編號：9)與VL3-CK(序列編號：3)之Fv4-F1245。
如揭示於實施例4，Fv4-F1243與Fv4-F1245具有新穎的Fc區域(其於中性pH對於人類FcRn具有改良的結合親和性)，但顯著降低結合至類風濕性因子。為了評估該等變異體之抗原清除效果，使用人類FcRn基因轉殖小鼠於人類 IL-6受體穩態輸注模式中進行Fv4-IgG1、Fv4-F1243與Fv4-F1245之活體內研究。
6-2. 使用人類FcRn基因轉殖小鼠株32藉由穩態輸注模式之抗體的活體內研究
使用人類FcRn基因轉殖小鼠株32藉由穩態輸注模式之活體內測試係以揭示於專利WO2011/122011之實施例13相同方法進行。
6-3. 研究結果；新的Fc變異體之活體內抗原清除效果
圖131顯示血漿hsIL-6R濃度時間趨勢以及圖132顯示注射Fv4-IgG1、Fv4-F1243與Fv4-F1245後之血漿抗體濃度時間趨勢。相較於Fv4-IgG1與對照(無抗體注射)，具有新穎的Fc變異體(其於中性pH對於FcRn具有經改良的結合)之Fv4-F1243與Fv4-F1245顯示顯著降低的血漿hsIL-6R濃度，說明於中性pH對於FcRn具有將改良的結合之pH-依賴性抗原結合抗體之活體內抗原清除。相較於Fv4-IgG1，Fv4-F1243與Fv4-F1245於21日或7日分別顯示10-倍抗原清除效果，反之Fv4-F1243與Fv4-F1245之血漿抗體濃度時間趨勢相當於Fv4-IgG1。
[實施例7]使用人類FcRn基因轉殖小鼠之新穎的Fc變異體之活體內PK研究
7-1. 製備用於活體內研究之抗體
藉由揭示於專利WO2011/122011之參考例2之此項技術領域者所習知方法表現與純化pH-依賴性抗-人類IL6受體 IgG1抗體、包括VH3-IgG1(序列編號：1)與VL3-CK(序列編號：3)之Fv4-IgG1、新的Fc變異體、包括VH3-F1389(序列編號：10)與VL3-CK(序列編號：3)之Fv4-F1389。
如揭示於實施例4，Fv4-F1389具有新穎的Fc區域(其於酸性pH對於人類FcRn具有改良的結合親和性)，但顯著降低結合至類風濕性因子。為了評估此變異體之藥物動力學，使用人類FcRn基因轉殖小鼠進行Fv4-IgG1與Fv4-F1389之活體內研究。
7-2. 使用人類FcRn基因轉殖小鼠株32之抗體的活體內研究
使用人類FcRn基因轉殖小鼠株32之活體內測試係以揭示於專利WO2011/122011之實施例13相同方法進行。
7-3.新的Fc變異體之活體內PK研究的結果
圖133顯示注射Fv4-IgG1與Fv4-F1389後之血漿抗體濃度時間趨勢。相較於Fv4-IgG1，具有新穎的Fc變異體(其於酸性pH對於FcRn具有改良的結合以及對於類風濕性因子之降低的結合)之Fv4-F1389，顯示經改良的藥物動力學。揭示於表28之新穎的Fc變異體於pH6.0對於FcRn具有與F1389同程度之增加的結合親和性。因此，該等變異體亦期望使用人類FcRn基因轉殖小鼠株32顯現經改良的藥物動力學而對於類風濕性因子仍具有降低的結合。
[實施例8]製備以鈣-依賴性方式結合至人類IgA之抗體
8-1. 製備人類IgA(hIgA)
人類IgA(後文簡稱為「hIgA」)係藉由使用下述重組技術製備作為抗原。hIgA(可變區係衍生自抗-人類IL-6受體抗體)係藉由培養帶有經插入有H(WT)-IgA1(序列編號：12)與L(WT)(序列編號：13)之重組載體之宿主細胞而予以表現且藉由使用離子交換層析與膠體過濾沉澱之此項技術領域所習知方法予以純化。
8-2. 結合至hIgA之抗體的表現與純化
GA2-IgG1(重鏈序列編號：14；輕鏈序列編號：15)為結合至hIgA之抗體。編碼GA2-IgG1重鏈(序列編號：14)與GA2-IgG1輕鏈(序列編號：15)之DNA序列，係藉由此項技術領域中具有通常知識者所習知方法插入至動物細胞表現質體。抗體係藉由下述方法表現。人類胎腎細胞衍生之細胞株FreeStyle 293-F(Invitrogen)之細胞細懸浮於FreeStyle 293 Expression Medium(Invitrogen)。細胞懸浮物係以細胞密度1.33 x 106cells/毫升接種至6-孔盤(3毫升/孔)。然後，所構築之質體藉由脂質體轉染方法導入至細胞。細胞於CO2培養箱(37℃，8% CO2，90rpm)培養4日。使用rProtein A SepharoseTM Fast Flow(Amersham Biosciences)藉由此項技術領域者所習知方法自經單離之細胞培養上清部份純化抗體。使用分光光度計測定經純化抗體溶液之吸收(波長280nm)。藉由PACE方法(Protein Science(1995)4、2411-2423)使用吸收係數計算自所測得之值決定抗體濃度。
8-3. 所得抗體對於鈣-依賴性hIgA-結合活性之評估
如揭示於8-2所單離之抗體係使用Biacore T200(GE Healthcare)評估其hIgA-結合活性(解離常數KD(M))。使用於測量之泳動緩衝液為0.05% tween20/20mmol/L ACES/150mmol/L NaCl(pH 7.4 or 5.8)含有3uM或1.2mM CaCl2。
使抗體結合至藉由胺基偶合方法固定有適當量之重組蛋白質A/G(Thermo Scientific)之感應器晶片CM5(GE Healthcare)。然後，注射合適濃度之hIgA(揭示於8-1)作為分析物而使其與感應器晶片上的抗體交互作用。測量係於37℃進行。測量後，注射10mmol/L甘胺酸-HCl(pH 1.5)以重生該感應器晶片。解離常數KD(M)係使用Biacore T200 Evaluation Software(GE Healthcare)藉由曲線配適分析與平衡參數分析自測量結果計算。結果與所得感應圖譜係分別示於表29與圖134。其係解明GA2-IgG1於1.2mM之Ca2+濃度強烈地結合至hIgA而抗體於3uM之Ca2+濃度微弱地結合至hIgA。再者，於1.2mM之Ca2+濃度，GA2-IgG1係顯示於pH7.4強烈地結合至人類IgA但於pH5.8則為微弱的。更具體地，係解明GA2-IgG1以pH-與鈣-依賴方式結合至人類IgA。
[實施例9]製備具有經改質之以鈣-依賴方式結合至hIgA之Fc區域的抗體
其次，為了評估FcRn結合對於自血漿之抗原(hIgA)清除 的效果，GA2-F760(重鏈序列編號：16；輕鏈序列編號：15)係藉由導入胺基酸取代L235R與S239K至GA2-IgG1以清除結合至FcγR而構築。再者藉由導入胺基酸取代G236R、M252Y、S254T、T256E、N434Y、Y436V、Q438R與S440E至GA2-F760而構築GA2-F1331(重鏈序列編號：17；輕鏈序列編號：15)，其於pH7.4對於FcRn結合強於GA2-F760。經改質抗體係藉由上述方法使用藉由此項技術領域所習知方法插入編碼GA2-F1331(重鏈序列編號：17；輕鏈序列編號：15)與GA2-F760(重鏈序列編號：16；輕鏈序列編號：15)之DNA序列之動物表現質體而予以表現。抗體濃度係於純化後測定。評估GA2-F760對於其結合至小鼠FcγR(mFcγRI、mFcγRII、mFcγRIII與mFcγRIV)。結果顯示GA2-F760不結合至任何受體。
[實施例10]使用人類FcRn基因轉殖小鼠評估抗原之Ca-依賴性hIgA-結合抗體於血漿滯留的效果
10-1. 使用人類FcRn基因轉殖小鼠之活體內測試
hIgA與抗-hIgA抗體之藥物動力學係於hIgA(人類IgA；如揭示於實施例8之方式製備)單獨或與抗-hIgA抗體組合投藥至人類FcRn基因轉殖小鼠(B6.mFcRn-/-.hFcRn Tg line 32 +/+ mouse、Jackson Laboratories；Methods Mol Biol.(2010)602：93-104)之後評估。A mixture of hIgA與抗-hIgA抗體之混合物係以劑量10毫升/kg經由尾靜脈投藥一次。上述之GA2-F760與GA2-F1331為所使用之抗-hIgA抗體。
各混合物中，hIgA濃度為80微克/毫升以及抗 -hIgA抗體濃度為2.69毫克/毫升。於上述條件中，由於抗-hIgA抗體係以充分過量於hIgA存在，主要部份的hIgA係預測結合至抗體。於投藥後15分鐘、1小時、2小時、7小時、1日、3日、7日與14日，自小鼠收集血液。所收集的血液立即以12,000於4℃離心15分鐘以獲得血漿。直到測量前，經分離之血將係儲存於-20℃或更低溫的冷凍箱。
10-2. 藉由ELISA測量人類FcRn基因轉殖小鼠之血漿抗-hIgA抗體濃度
小鼠血漿之抗-hIgA抗體濃度係藉由ELISA測量。首先，抗-人類IgG-固定盤係藉由分取抗-人類IgG(γ-鏈特異性)F(ab')2片段抗體(SIGMA)至Nunc-Immuno Plate，MaxiSorp(Nalge nunc International)之各孔而製備使該等盤於4℃靜置隔夜。抗-hIgA抗體標準曲線樣品製備為血漿濃度於0.5、0.25、0.125、0.0625、0.03125、0.01563與0.007813微克/毫升之標準溶液以及分析樣品係藉由稀釋100-倍或更高所製備之小鼠血漿樣品細分取至抗-人類IgG-固定盤，然後該等盤於25℃培養1小時。其次，山羊抗-人類IgG(γ-鏈特異性)生物素(BIOT)接合物(Southern Biotechnology Associates Inc.)分取至該等盤之各孔，然後該等盤於25℃培養1小時。然後，對該等盤之各孔添加Streptavidin-PolyHRP80(Stereospecific Detection Technologies)，接著該等盤於25℃培養1小時。使用TMB One Component HRP Microwell Substrate(BioFX Laboratories)作為基質之發色反應係以1N硫酸(Showa Chemical)中止，然後各孔中之反應混合物係使用微孔盤測讀儀 測量以測定於450nm的吸收。小鼠血漿之抗-hIgA抗體濃度係使用分析軟體SOFTmax PRO(Molecular Devices)由標準曲線之吸收計算。藉由上述方法測定，於人類基因轉殖小鼠之GA2-F1331與GA2-F760之血漿濃度抗體的時間歷程，係示於圖135。
10-3. 藉由ELISA測定血漿之hIgA濃度
小鼠血漿之hIgA濃度係藉由ELISA測定。首先，抗-人類IgA-固定盤係藉由分取山羊抗-人類IgA抗體(BETHYL)至Nunc-Immuno Plate，MaxiSorp(Nalge nunc International)之各孔而製備且使該等盤於4℃靜置隔夜。製備hIgA標準曲線樣品於血漿濃度為0.4、0.2、0.1、0.05、0.025、0.0125與0.00625微克/毫升以及分析樣品係藉由稀釋小鼠血漿樣品100-倍或更高而製備。各樣品(100微升)與200微升之500ng/毫升hsIL-6R於室溫混合1小時後，將其分取100微升/孔至抗-人類IgA-固定盤。使所得盤於室溫靜置1小時。其次，添加生物素化抗-人類IL-6R抗體(R&D)至該等盤之各孔後，使該等盤於室溫培養1小時。然後，分取Streptavidin-PolyHRP80(Stereospecific Detection Technologies)至該等盤之各孔後，該等盤於室溫培養1小時。使用作為基質之TMB One Component HRP Microwell Substrate(BioFX Laboratories)之發色反應係以1N硫酸(Showa Chemical)中止，然後各孔中之反應混合物係使用微孔盤測讀儀測量以測定於450nm的吸收。小鼠血漿之濃度係使用分析軟體SOFTmax PRO(Molecular Devices)由標準曲線之吸收計算。藉由上述方法測定，於人類基因轉殖小鼠之靜脈投藥後血漿hIgA 濃度的時間歷程，係示於圖136。
結果顯示，當hIgA與GA2-F1331(其為顯示強的人類FcRn結合之抗體)組合投藥時，相較於當hIgA與GA2-F760(其對於人類FcRn具有非常弱的親和性)組合投藥時，hIgA之清除明顯地加速。
[實施例11]製備pH-依賴性抗-IgE抗體
11-1. 製備抗-人類IgE抗體
為了製備pH-依賴性抗-人類IgE抗體，作為抗原之人類IgE(重鏈序列編號：18；輕鏈序列編號：19)(可變區係衍生自抗-人類glypican3抗體)係使用FreeStyle293(Life Technologies)表現。人類IgE係使用此項技術領域所習知之傳統層析方法藉由純化所表現的人類IgE而製備。
由多數之所獲得的抗體，選擇以pH-依賴性方式結合至人類IgE之抗體。經選擇之抗-人類IgE抗體係使用人類IgG1重鏈恆定區與人類輕鏈恆定區表現後純化。所產生之抗體命名為278(重鏈序列編號：20；輕鏈序列編號：21)。
11-2. 評估抗-人類IgE抗體之結合活性與pH-依賴性結合活性
能於內體中自抗原解離的抗體不僅可設計其以pH-依賴性方式結合至抗原，亦可其以Ca-依賴性方式結合至抗原而予以製造。因此，純株278與IgE-結合活性不取決於pH/Ca之對照Xolair(奧馬珠單抗(omalizumab)；Novartis)，係評估其人類IgE(hIgE)-結合活性之pH依賴性與pH/Ca依賴性。
更具體地，純株278與Xolair之hIgE-結合活性(解 離常數KD(M))係使用Biacore T200(GE Healthcare)評估。
分析中所使用之泳動緩衝液為：1.2mmol/l CaCl2/0.05% tween20、20mmol/l ACES、150mmol/l NaCl、pH 7.4；1.2mmol/l CaCl2/0.05% tween20、20mmol/l ACES、150mmol/l NaCl、pH 5.8；以及3uMol/l CaCl2/0.05% tween20、20mmol/l ACES、150mmol/l NaCl、pH 5.8。
其C-末端Lys係經生物素化之化學合成之具有人類glypican 3蛋白質-衍生的序列(序列編號：22)(後文簡稱為「生物素化GPC3肽」)的肽，係以合適量添加且基於生物素與鏈黴親和素之間的親和性固定化至感應器晶片SA(GE Healthcare)。人類IgE係經由將其以合適濃度注射而固定化至晶片，而由生物素化GPC3肽所捕捉。作為分析物，純株278以合適濃度注射且使其與感應器晶片上的人類IgE交互作用。然後，注射10mmol/L甘胺酸-HCl(pH 1.5)以再生感應器晶片。交互作用通常於37℃測量。測量結果係使用Biacore T200 Evaluation Software(GE Healthcare)藉由曲線配適分析以計算結合速率常數ka(1/Ms)與解離速率常數kd(1/s)。解離常數KD(M)係自上述常數計算。再者，各抗體於[pH 5.8，1.2mM Ca]對[pH 7.4，1.2mM Ca]條件下之KD比例係計算以評估pH-依賴性結合，而各抗體於[pH 5.8，3uM Ca]to[pH 7.4，1.2mM Ca]之KD比例係計算以評估pH/Ca-依賴性結合。結果示於表30。
[表30]
[實施例12]製備用於活體內測試之結核製人類IgE之具有經改質Fc區域的抗體
其次，為了評估由血漿清除FcRn結合之抗原(人類IgE)的效果，構築278-F760(重鏈序列編號：23；輕鏈序列編號：21)以清除結合至FcγR。再者，藉由導入胺基酸取代G236R、M252Y、S254T、T256E、N434Y、Y436V、Q438R與S440E至278-F760而構築278-F1331(重鏈序列編號：24；輕鏈序列編號：21)，其於pH7.4結合至FcRn較278-F760強。經改質抗體係藉由上述方法使用經以此項技術領域者所習知之方法插入編碼278-F1331(重鏈序列編號：24；輕鏈序列編號：21)與278-F760(重鏈序列編號：23；輕鏈序列編號：21)之DNA序列的動物表限載體而表現。純化後測量該抗體濃度。
[實施例13]純株278之活體內評估
13-1. 製備用於活體內評估之人類IgE(hIgE(Asp6))
hIgE(Asp6)(衍生自抗-人類磷脂醯肌醇聚糖(glypican)3抗體之可變區域)，其為用於活體內評估由重鏈(序列編號：25)與輕鏈(序列編號：19)所組成之人類IgE，係藉由與實施例11所述之相同方法產生。hIgE(Asp6)為於人類IgE的六個N-連結的糖基化位點之天冬醯胺-至-天冬胺酸轉變所造成之經改質分子，因而於人類IgE之N-連結糖鏈的異質性，不會被作為抗原之人類IgE的血漿中濃度的時間-依賴性變化所影響。
13-2.評估純株278對於使用人類FcRn基因轉殖小鼠之加速人類IgE清除的效果
hIgE(Asp6)與抗-人類IgE抗體的藥物動力學係於hIgE(Asp6)與抗-hIgE抗體(278-F760與278-F1331)及Sanglopor(人類正常免疫球蛋白，CSL Behring)組合對人類FcRn基因轉殖小鼠(B6.mFcRn-/-.hFcRn Tg line 32 +/+ mouse，Jackson Laboratories；Methods Mol Biol.(2010)602：93-104)投藥後評估。hIgE(Asp6)、抗-人類IgE抗體與Sanglopor(濃度顯示於表31)的混合物，係以劑量10毫升/公斤經由尾靜脈投藥一次。於上述條件中，由於各抗體相較於hIgE(Asp6)係充分過量地存在，係hIgE(Asp6)預測幾乎完全地結合至該抗體。於投藥後5分鐘、2小時、7小時、1日、2日、4或5日、7日、14日、21日及28日由小鼠收集血液。所收集的血液立即於15,000rpm及4℃離心5分鐘以獲得血漿。經分離的血漿儲存於-20℃或更低溫度直到測量。
[表31]
13-3. 於人類FcRn基因轉殖小鼠測定血漿抗-人類IgE抗體濃度
小鼠血漿中之抗-hIgE抗體濃度係藉由電化學發光(ECL)分析而測定。標準曲線樣品係製備於血漿濃度32、16、8、4、2、1、0.5及0.25微克/毫升。標準曲線樣品與小鼠血漿分析樣品分曲至經固定有hIgE(Asp6)的ECL盤。該等盤於4℃靜置隔夜。然後，抗兔子抗體(山羊)，經SULFO-TAG標示(Meso Scale Discovery)於室溫反應1小時。於分散讀取緩衝劑T(x4)(Meso Scale Discovery)之後立即藉由Sector Imager 2400 Reader(Meso Scale Discovery)進行測量。小鼠血漿中之濃度係使用分析軟體SOFTmax PRO(Molecular Devices)由標準曲線的回應而計算。靜脈內投藥後之血漿抗體濃度的時間曲線，其係藉由上述方法測定，示於圖137。
13-4. 測定於人類FcRn基因轉殖小鼠之血漿hIgE(Asp6)濃度
小鼠血漿中之hIgE(Asp6)濃度系藉由ELISA測定。標準曲線樣品係製備於血漿濃度192、96、48、24、12、6、與3ng/毫升。以10微克/毫升添加Xolair(Novartis)至標準取線樣品且小鼠血漿分析樣品係平衡於hIgE(Asp6)與抗-hIgE抗體的免疫複合物。於室溫培養30分鐘後，標準曲線樣品與小鼠血漿分析樣品分取至經固定有抗-人類IgE抗體之免疫盤(MABTECH) 或經固定有抗-人類IE抗體(純株107；MABTECH)之免疫盤Nunc F96 MicroWell Plate(Nalge nunc International))。使該等盤於室溫靜置2小時或於4℃靜至隔夜。然後，人類GPC3 core protein(序列編號：26)、經以NHS-PEG4-Biotin(Thermo Fisher Scientific)生物素化之抗-GP3抗體(於中外製藥股份有限公司製備)與鏈黴抗生物素蛋白(Sterptavidin)-PolyHRP80(Stereospecific Detection Technologies)依序各反應1小時。發色反應使用作為基質的TMB One Component HRP Microwell Substrate(BioFX Laboratories)以N硫酸(Showa Chemical)終止，然後，小鼠盤之濃度係藉由其中顯色係使用微孔盤測讀儀測量450nm的吸收的方法，或其中發光反應使用SuperSignal(r)ELISA Pico Chemiluminescent Substrate(Thermo Fisher Scientific)作為基質且發光強度係使用微孔盤測讀儀測量而進行的方法。小鼠盤之濃度係使用分析軟體SOFTmax PRO(Molecular Devices)由標準曲線的吸收或發光強度而計算。靜脈內投藥後之血漿hIgE(Asp6)濃度的時間曲線，其係藉由上述方法測定，示於圖138。
結果顯示，當人類IgE與278-F1331合並投藥時，人類IgE的清除顯著地加速，該278-F1331結合至人類FcRn大幅地強於278-F760。具體地，其顯示不僅於IL6R與IgA的情況，於IgE的情況亦然，對於FcRn具有增加的活性之pH-依賴性抗原結合抗體可加速自血漿的抗原廓清且降低血漿中的抗原濃度。
[參考例A1]製備可溶性人類IL-6受體(hsIL-6R)
作為抗原之重組人類IL-6受體如下述方式製備。如報導於J.Immunol.152：4958-4968(1994)之持續地表現具有來自N終端之位置1至357的胺基酸序列的可溶性人類IL-6受體(後文稱為hsIL-6R)的細胞株係藉由此項技術領域中具有通常知識者所習知之方法建立。培養該細胞以表現hsIL-6R。藉由下述二步驟由培養上清部分純化該The hsIL-6R：Blue Sepharose 6 FF管柱層析與膠體過濾層析。於最終步驟呈主峰之經溶洗之分液係使用作為最終純化產物。
[參考例A2]製備人類FcRn
FcRn為FcRn α鏈與β2-微球蛋白的異二聚體。Oligo-DNA引子係根據已公開之人類FcRn基因序列(J Exp Med.1994 Dec 1；180(6)：2377-81)予以製備。編碼全基因的DNA片段係使用人類cDNA(Human Placenta Marathon-Ready cDNA，Clontech)作為模板以及所製備的引子藉由PCR製備。使用所得之DNA片段作為模板，編碼含有信號區域(Met1-Leu290)的細胞外域的DNA片段藉由PCR擴增，且插入至哺乳細胞表現載體。同樣地，oligo-DNA引子係根據已公開之人類β2-微球蛋白基因序列(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.99(26)：16899-16903(2002))予以製備。編碼全基因的DNA片段係使用人類cDNA(人類Placenta Marathon-Ready cDNA，Clontech)作為模板以及所製備的引子藉由PCR製備。使用所得之DNA片段作為模板，編碼含有信號區域(Met1-Met119)的細胞外域的DNA片段藉由PCR擴增，且插入至哺乳細胞表現載體。
可溶性人類FcRn係藉由下述步驟表現。經構築 之用於表現人類FcRn α鏈(序列編號：27)與β2-微球蛋白(序列編號：28)的質體，使用PEI(Polyscience)以脂質體轉染法(lipofection)導入至人類胚胎腎癌細胞衍生的細胞株HEK293H(Invitrogen)的細胞中。收集所得培養上清部分，且使用IgG Sepharose 6 Fast Flow(Amersham Biosciences)純化FcRn，接著使用HiTrap Q HP(GE Healthcare)進一步純化(J Immunol.2002 Nov 1；169(9)：5171-80)。
[參考例A3]製備人類IgA(hIgA)
包含H(WT)-IgA1(序列編號：12)與L(WT)(序列編號：13)的hIgA係經表現且使用rProtein L-agarose(ACTIgen)接著使用膠體過濾層析之此項技術領域中具有通常知識者所習知之方法予以純化。
[參考例A4]製備可溶性人類plexin A1(hsPlexin A1)
作為抗原之重組可溶性人類plexin A1(後文稱為hsPlexin A1)如下述方式製備。藉由參照NCBI參考序列(NP_115618)構築hsPlexin A1。特別地，包含於上述NCBI Reference FLAG-tag(DYKDDDDK，序列編號：29)位置27至1243的胺基酸序列的hsPlexin A1係連接至其C終端。使用FreeStyle293(Invitrogen)將hsPlexin A1瞬時表現且由下述二步驟由培養物純化：抗-FLAG管柱層析與膠體過濾層析。於最終步驟呈主峰之經溶洗之分液係使用作為最終純化產物。
[產業上可利用性]
當標靶可溶性抗原之傳統抗體投藥至個體時，該 抗原結合至抗體且安定地持續於血漿中。由於結合至抗體的抗原，相較於抗原單獨具有顯著較長的半衰期，於傳統抗體注射後抗原濃度由基線增加漿進總血漿抗原濃度的10至1000倍。對於治療性抗體而言，該總血漿抗原濃度的增加較不佳，此乃因相較於當總血漿抗原濃度無實質增加發生時所需者，抗體濃度必須為10至1000-倍高。因此，由血漿清除抗原且亦降低總血漿抗原濃度之抗體相較於傳統抗體極為有價值，此乃因所需劑量為10至1000-倍低於傳統抗體所需者。
本發明者們對於於中性pH對於FcRn具有增強的親和性的經改質FcRn-結合域以及包含具有低免疫原性、高安定性且僅形成少數凝集物之該FcRn-結合域之抗原-結合分子，進行致力的研究。其結果，發現於FcRn-結合域之特定位置的取代，增加於中性pH對於FcRn的親和性而不實質地增加高分子量物種的免疫原性與比例，且不實質地降低包含該FcRn-結合域之抗原-結合分子的安定性。於本發明之包含該FcRn-結合域之抗原-結合分子於藥物動力學優異而有助於降低血漿抗原濃度且符合低免疫原性、高安定性與非常少凝集物之可發展性要件。
再者，Fc-工程化增加於中性或酸性pH對於FcRn的結合親和性可改良抗體的內體循環效率以及藥物動力學。然而，抗體的胺基酸序列的改質(例如胺基酸取代與插入)亦可增加治療性抗體的免疫原性，換言之，可導致抗藥物抗體(ADA)的細胞激素風暴及/或產生。
本發明者們對於包含因於FcRn-結合域的取代而 於中性pH或酸性pH對於FcRn增加親和性，而使其對於預先存在的抗-藥物抗體(ADA)的結合活性於中性pH經增加的經改質的FcRn-結合域的抗原-結合分子進行致力的研究。其結果，發現於FcRn-結合域的特定位置的其他取代，降低於中性pH對於預先存在的抗-藥物抗體(ADA)結合活性，而於各別的pH範圍維持高程度的增加的FcRn-結合活性。本發明之抗原-結合分子於藥物動力學優異而有助於降低血漿抗原濃度且不增加抗體廓清。
<110> 中外製藥股份有限公司
<120> 治療性之具有促進抗原清除之FcRn結合區的抗原結合劑
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Claims (32)

  1. 一種抗原-結合分子，包含經改質的抗體Fc區域，其中該經改質的抗體Fc區域在EU438位置包含精胺酸的胺基酸取代，更包括在選自下列所成群組的一或多個之胺基酸取代：a)於位置EU387之精胺酸之胺基酸取代；b)於位置EU422之麩胺酸、精胺酸、絲胺酸、天冬胺酸、離胺酸、蘇胺酸、或麩胺醯胺之胺基酸取代；c)於位置EU424之麩胺酸、精胺酸、離胺酸、或天冬醯胺之胺基酸取代；d)於位置EU426之天冬胺酸、麩胺醯胺、丙胺酸、或酪胺酸之胺基酸取代；e)於位置EU433之天冬胺酸之胺基酸取代；f)於位置EU436之蘇胺酸之胺基酸取代；以及g)於位置EU440之麩胺酸、天冬胺酸、或麩胺醯胺之胺基酸取代，其中相較於包含完整抗體Fc區域的結合親和性，該抗原-結合分子於中性pH下對於類風濕性因子之該抗體Fc區域的結合親和性不顯著增加。
  2. 如申請專利範圍第1項所述之抗原-結合分子，其中該經改質的抗體Fc區域包括以下胺基酸取代的組合之任一者：1)EU438R/EU440E；2)EU438R/EU440D。
  3. 如申請專利範圍第1或2項所述之抗原-結合分子，其中該經改質的抗體Fc區域更包括選自下列所成群組之抗體Fc 區域的一個或多個位置之胺基酸取代：EU238、EU250、EU252、EU254、EU255、EU256、EU258、EU286、EU307、EU308、EU309、EU311、EU315、EU428、EU433、EU434及EU436，其中該取代於中性pH或酸性pH範圍增加FcRn結合活性。
  4. 如申請專利範圍第1或2項所述之抗原-結合分子，其中該經改質的抗體Fc區域包含胺基酸取代i)a)EU438R/EU440E；以及ii)a)M434H、b)M252Y/S254T/T256E、c)M428L/N434S、或d)T250Q及M428L(EU編號)。
  5. 如申請專利範圍第1或2項所述之抗原-結合分子，其中該經改質的抗體Fc區域包含以下胺基酸取代的組合之任一者：1)EU252Y/EU254T/EU256E/EU438R/EU440E；2)EU428L/EU434S/EU438R/EU440E；3)EU434H/EU438R/EU440E；4)N434Y/Y436V/Q438R/S440E；5)N434Y/Y436V/Q438R/S440D；6)H433D/N434Y/Y436V/Q438R/S440E；7)H433D/N434Y/Y436V/Q438R/S440D；8)N434Y/Y436T/Q438R/S440E；9)N434Y/Y436T/Q438R/S440D；10)H433D/N434Y/Y436T/Q438R/S440E；11)H433D/N434Y/Y436T/Q438R/S440D。
  6. 如申請專利範圍第1或2項所述之抗原-結合分子，其中該經改質的抗體Fc區域包含以下胺基酸取代的組合之任一者：1)L235R/S239K/N434Y/Y436V/Q438R/S440E；2)L235R/S239K/N434Y/Y436V/Q438R/S440D；3)L235R/S239K/H433D/N434Y/Y436V/Q438R/S440E；4)L235R/S239K/H433D/N434Y/Y436V/Q438R/S440D；5)L235R/S239K/N434Y/Y436T/Q438R/S440E；6)L235R/S239K/N434Y/Y436T/Q438R/S440D；7)L235R/S239K/H433D/N434Y/Y436T/Q438R/S440E；8)L235R/S239K/H433D/N434Y/Y436T/Q438R/S440D。
  7. 如申請專利範圍第1或2項所述之抗原-結合分子，其中該經改質的抗體Fc區域包含以下胺基酸取代的組合之任一者：1)M252Y/N434Y/Y436V/Q438R/S440E；2)M252Y/N434Y/Y436T/Q438R/S440E；3)M252Y/N434Y/Y436F/Q438R/S440E；4)M252Y/N434Y/Y436V/Q438R/S440D；5)M252Y/H433D/N434Y/Y436V/Q438R/S440D；6)M252Y/H433D/N434Y/Y436V/Q438R/S440E；7)M252Y/H433D/N434W/Y436V/Q438R/S440E；8)M252Y/S254T/T256B/H433D/N434Y/Y436V/Q438R/S440E；9)M252Y/S254T/T256E/H433D/N434Y/Y436V/Q438R/S440 D；10)M252Y/S254T/T256E/N286E/H433D/N434Y/Y436V/Q438R/S440E；11)M252Y/S254T/T256E/N286E/H433D/N434Y/Y436V/Q438R/S440D；12)M252Y/S254T/R255L/T256E/H433D/N434Y/Y436V/Q438R/S440E；13)M252Y/S254T/R255L/T256E/H433D/N434Y/Y436V/Q438R/S440D；14)M252Y/S254T/R255L/T256E/E258D/H433D/N434Y/Y436V/Q438R/S440E；15)M252Y/S254T/R255L/T256E/E258I/H433D/N434Y/Y436V/Q438R/S440E；16)M252Y/S254T/R255L/T256E/E258D/H433D/N434Y/Y436V/Q438R/S440D；17)M252Y/S254T/R255L/T256E/E258I/H433D/N434Y/Y436V/Q438R/S440D；18)M252Y/S254T/T256E/H433A/N434Y/Y436V/Q438R/S440E；19)M252Y/S254T/T256E/H433K/N434Y/Y436V/Q438R/S440E；20)M252Y/S254T/T256E/H433P/N434Y/Y436V/Q438R/S440E；21)M252Y/S254T/T256E/H433R/N434Y/Y436V/Q438R/S44 0E；22)M252Y/S254T/T256E/H433S/N434Y/Y436V/Q438R/S440E；23)M252Y/S254T/T256E/H433A/N434Y/Y436V/Q438R/S440D；24)M252Y/S254T/T256E/H433K/N434Y/Y436V/Q438R/S440D；25)M252Y/S254T/T256E/H433P/N434Y/Y436V/Q438R/S440D；26)M252Y/S254T/T256E/H433R/N434Y/Y436V/Q438R/S440D；27)M252Y/S254T/T256E/H433S/N434Y/Y436V/Q438R/S440D；28)L235R/G236R/S239K/M252Y/S254T/N434Y/Y436V/Q438R/S440E；29)L235R/G236R/S239K/M252Y/S254T/T256E/N434Y/Y436V/Q438R/S440E；30)EU252Y/EU434Y/EU436V/EU438R/EU440E；31)EU252Y/EU434Y/EU436V/EU438R/EU440D。
  8. 如申請專利範圍第1或2項所述之抗原-結合分子，其中該經改質的抗體Fc區域包含以下胺基酸取代的組合之任一者：
  9. 如申請專利範圍第1~8項中任一項所述之抗原-結合分子，包括於pH 7.4之抗原-結合活性係二倍或更高於pH 5.8之抗原-結合活性之抗體可變區，或於離子化鈣濃度0.1μM~30μM之抗原-結合活性低於離子化鈣濃度100μM~10mM之抗原-結合活性之抗體可變區。
  10. 一種用於降低包含經改質的抗體Fc區域之抗原-結合分子對類風濕因子的結合活性的方法，該抗體Fc區域於中性或酸性pH對FcRn具有增加的結合活性以及於中性pH對於類風濕性因子具有增加的結合活性，該方法包含下列步驟：(a)提供具有抗體Fc區域之抗原-結合分子，該抗體Fc區域於中性或酸性pH對FcRn具有增加的結合活性以及於中性pH對於類風濕性因子具有增加的結合性；以及(b)以精氨酸取代EU438位置的胺基酸。
  11. 如申請專利範圍第10項所述之方法，其中步驟(b)更包括於選自EU440、EU436、EU433、EU426、EU424、EU422、及EU387所成群組之一個或多個位置進行胺基酸取代。
  12. 如申請專利範圍第11項所述之方法，其中該步驟b)包括將以下胺基酸取代的組合之任一者導入抗體Fc區域：1)EU438R/EU440E；2)EU438R/EU440D。
  13. 一種用以增加單一抗原-結合分子可結合的抗原總數，而相較於親代抗體不顯著增加該經改質的抗體Fc區域於中性pH對於類風濕性因子的結合活性的方法，該方法包含下列步驟： a)提供包含親代抗體Fc區域之抗原-結合分子；b)藉由於選自EU238、EU250、EU252、EU254、EU255、EU256、EU258、EU286、EU307、EU308、EU309、EU311、EU315、EU428、EU433、EU434及EU436所成群組之一個或多個位置之親代抗體Fc區域之胺基酸序列取代胺基酸而改變步驟a)之親代抗體Fc區域；以及c)藉由於EU438位置以精胺酸取代親代抗體Fc區域之胺基酸序列中的胺基酸而改變步驟b)之該經改質的抗體Fc區域。
  14. 如申請專利範圍第13項所述之方法，其中該步驟c)更包括於選自EU440、EU436、EU433、EU426、EU424、EU422、及EU387所成群組之一個或多個位置之親代抗體Fc區域之胺基酸序列取代胺基酸。
  15. 一種有助於經以抗原-結合形式攝入至細胞之無抗原-結合之抗原-結合分子的細胞外釋放，而相較於親代抗體不顯著增加該經改質的抗體Fc區域於中性pH對於類風濕性因子的結合活性的方法，該方法包含下列步驟：a)提供包含親代抗體Fc區域之抗原-結合分子；b)藉由於選自EU238、EU250、EU252、EU254、EU255、EU256、EU258、EU286、EU307、EU308、EU309、EU311、EU315、EU428、EU433、EU434、及EU436所成群組之一個或多個位置之親代抗體Fc區域之胺基酸序列取代胺基酸而改變親代抗體Fc區域；以及c)藉由於EU438位置以精胺酸取代親代抗體Fc區域之胺基 酸序列中的胺基酸而改變步驟b)之該經改質的抗體Fc區域。
  16. 如申請專利範圍第15項所述之方法，其中該步驟c)更包括於選自EU440、EU436、EU433、EU426、EU424、EU422、及EU387所成群組之一個或多個位置之親代抗體Fc區域之胺基酸序列取代胺基酸。
  17. 一種用於增加抗原-結合分子清除血漿抗原的能力，而相較於親代抗體不顯著增加經改質的抗體Fc區域於中性pH對於類風濕性因子的結合活性的方法，該方法包含下列步驟：a)提供包含親代抗體Fc區域之抗原-結合分子；b)藉由於選自EU238、EU250、EU252、EU254、EU255、EU256、EU258、EU286、EU307、EU308、EU309、EU311、EU315、EU428、EU433、EU434、及EU436所成群組之一個或多個位置之親代抗體Fc區域之胺基酸序列中胺基酸進行取代而改變親代抗體Fc區域；以及c)藉由於EU438位置以精胺酸取代親代抗體Fc區域之胺基酸序列中的胺基酸而改變步驟b)之該經改質的抗體Fc區域。
  18. 如申請專利範圍第17項所述之方法，其中該步驟c)更包括於選自EU440、EU436、EU433、EU426、EU424、EU422、及EU387所成群組之一個或多個位置之親代抗體Fc區域之胺基酸序列取代胺基酸。
  19. 一種用於改良抗原-結合分子之藥物動力學，而相較於親代抗體不顯著增加經改質的抗體Fc區域於中性pH對於類風 濕性因子的結合活性的方法，該方法包含下列步驟：a)提供包含親代抗體Fc區域之抗原-結合分子；b)藉由於選自EU238、EU250、EU252、EU254、EU255、EU256、EU258、EU286、EU307、EU308、EU309、EU311、EU315、EU428、EU433、EU434、及EU436所成群組之一個或多個位置之親代抗體Fc區域之胺基酸序列取代胺基酸而改變親代抗體Fc區域；以及c)藉由於EU438位置以精胺酸取代親代抗體Fc區域之胺基酸序列中的胺基酸而改變步驟b)之該經改質的抗體Fc區域。
  20. 如申請專利範圍第19項所述之方法，其中該步驟c)更包括於選自EU440、EU436、EU433、EU426、EU424、EU422、及EU387所成群組之一個或多個位置之親代抗體Fc區域之胺基酸序列取代胺基酸。
  21. 一種用於降低血漿中之總抗原濃度或游離抗原濃度，而相較於親代抗體不顯著增加經改質的抗體Fc區域於中性pH對於類風濕性因子的結合活性的方法，該方法包含下列步驟：a)提供包含親代抗體Fc區域之抗原-結合分子，該抗原-結合分子包含可結合該抗原之抗原-結合域；b)藉由於選自EU238、EU250、EU252、EU254、EU255、EU256、EU258、EU286、EU307、EU308、EU309、EU311、EU315、EU428、EU433、EU434、及EU436所成群組之一個或多個位置之親代抗體Fc區域之胺基酸序列取代胺基酸 而改變親代抗體Fc區域；以及c)藉由於EU438位置以精胺酸取代親代抗體Fc區域之胺基酸序列中的胺基酸而改變步驟b)之該經改質的抗體Fc區域。
  22. 如申請專利範圍第21項所述之方法，其中該步驟c)更包括於選自EU440、EU436、EU433、EU426、EU424、EU422、及EU387所成群組之一個或多個位置之親代抗體Fc區域之胺基酸序列取代胺基酸。
  23. 如申請專利範圍第13至22項中任一項所述之方法，其中該步驟b)中導入之胺基酸取代為以下組合之一者：a)EU252/EU434/EU307/EU311/EU436/EU286；b)EU252/EU434/EU307/EU311/EU436/EU308；c)EU252/EU434/EU307/EU311/EU436/EU286/EU308；d)EU252/EU434/EU307/EU311/EU436/EU428；e)EU252/EU434/EU307/EU311/EU436/EU308/EU428；f)EU252/EU434/EU307/EU311/EU436/EU250/EU428；g)EU252/EU434/EU307/EU311/EU436/EU250/EU308；h)EU252/EU434/EU307/EU311/EU436/EU250/EU286/EU308；i)EU252/EU434/EU307/EU311/EU436/EU250/EU286/EU308/EU428。
  24. 如申請專利範圍第13至22項中任一項所述之方法，其中該步驟b)中導入之胺基酸取代為以下組合之一者：a)EU252/EU434/EU307/EU311/EU286； b)EU252/EU434/EU307/EU311/EU286/EU254；c)EU252/EU434/EU307/EU311/EU436；d)EU252/EU434/EU307/EU311/EU436/EU254；e)EU252/EU434/EU307/EU311/EU436/EU250；f)EU252/EU434/EU308/EU250；g)EU252/EU434/EU308/EU250/EU436；h)EU252/EU434/EU308/EU250/EU307/EU311。
  25. 如申請專利範圍第13至22項中任一項所述之方法，其中該步驟b)中導入之胺基酸取代為以下組合之一者：a)EU252/EU315/EU434；b)EU252/EU434/EU436；c)EU252/EU254/EU434/EU436。
  26. 如申請專利範圍第13至22項中任一項所述之方法，其中該步驟b)中導入之胺基酸取代為以下組合之一者：a)EU307/EU311/EU434；b)EU307/EU309/EU311/EU434；c)EU307/EU309/EU311/EU434；d)EU250/EU252/EU434/EU436。
  27. 如申請專利範圍第13至22項中任一項所述之方法，其中該步驟c)中導入之胺基酸取代為以下組合之一者：1)EU438R/EU440E；2)EU438R/EU440D。
  28. 一種用於製造包含Fc域之抗原-結合分子的方法，該Fc域於中性或酸性pH對FcRn具有增加的結合活性以及於中性 pH對於類風濕性因子具有減少的結合活性，該方法包含下列步驟：(a)提供於中性或酸性pH範圍對FcRn以及於中性pH範圍對於類風濕性因子具有增加的結合活性之Fc域，(b)於EU438位置以精胺酸取代Fc域的胺基酸序列中的胺基酸；(c)以下步驟的任一者：(i)選擇pH-依賴性抗體可變區，包括：決定抗體可變區於pH 7.4之抗原-結合活性、決定抗體可變區於pH 5.8之抗原-結合活性、以及選擇於pH 7.4之抗原-結合活性係二倍或更高於pH 5.8之抗原-結合活性之抗體可變區；或者(ii)選擇鈣離子-依賴性抗體可變區，包括：決定抗體可變區於離子化鈣濃度0.1μM~30μM之抗原-結合活性、決定抗體可變區於離子化鈣濃度100μM~10mM之抗原-結合活性、以及選擇於於離子化鈣濃度0.1μM~30μM之抗原-結合活性低於離子化鈣濃度100μM~10mM之抗原-結合活性之抗體可變區；(d)獲得編碼抗原-結合分子之基因，於其中(b)所製備之人類Fc域與(c)所製備之抗體可變區係經連結；以及(e)使用(d)所製備之基因製造抗原-結合分子。
  29. 如申請專利範圍第28項所述之方法，其中該步驟b)更包括於選自EU440、EU436、EU433、EU426、EU424、EU422、及EU387所成群組之一個或多個位置之Fc區域之胺基酸序列取代胺基酸。
  30. 如申請專利範圍第28或29項所述之方法，其中該於中性或酸性pH範圍對FcRn以及於中性pH範圍對於類風濕性因子具有增加的結合活性之該Fc域包含於選自下列所成群組之一個或多個位置之胺基酸取代：EU238、EU250、EU252、EU254、EU255、EU256、EU258、EU286、EU307、EU308、EU309、EU311、EU315、EU428、EU433、EU434、及EU436。
  31. 一種用於製造抗原-結合分子的方法，該方法包括以下步驟：(a)選擇親代抗體Fc區域且藉由於EU438位置以精胺酸對胺基酸序列中的胺基酸進行取代而改變該親代抗體Fc區域；(b)以下步驟的任一者：(i)選擇pH-依賴性抗體可變區，包括：決定抗體可變區於pH 7.4之抗原-結合活性、決定抗體可變區於pH 5.8之抗原-結合活性、以及選擇於pH 7.4之抗原-結合活性係二倍或更高於pH 5.8之抗原-結合活性之抗體可變區；或者(ii)選擇鈣離子-依賴性抗體可變區，包括：決定抗體可變區於離子化鈣濃度0.1μM~30μM之抗原-結合活性、決定抗體可變區於離子化鈣濃度100μM~10mM之抗原-結合活性、以及選擇於於離子化鈣濃度0.1μM~30μM之抗原-結合活性低於離子化鈣濃度100μM~10mM之抗原-結合活性之抗體可變區；(c)獲得一編碼抗原-結合分子之基因，其中於步驟(a)與(b)所製備之該人類抗體Fc區域與該抗原可變區係經連結；以 及(d)使用於步驟(c)所製備之基因製造抗原-結合分子。
  32. 如申請專利範圍第31項所述之方法，其中該步驟a)更包括於選自EU440、EU436、EU433、EU426、EU424、EU422、及EU387所成群組之一個或多個位置之Fc區域之胺基酸序列取代胺基酸。
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