KR20140069332A

KR20140069332A - 항원 제거를 촉진하는 에프씨알엔 결합 도메인을 갖는 치료학적 항원 결합 분자

Info

Publication number: KR20140069332A
Application number: KR1020147011698A
Authority: KR
Inventors: 도모유키 이가와; 아츠히코 마에다; 후타 미모토; 다이치 구라모치
Original assignee: 추가이 세이야쿠 가부시키가이샤
Priority date: 2011-09-30
Filing date: 2012-09-28
Publication date: 2014-06-09
Also published as: JP2014528906A; WO2013046704A2; HK1257946A1; EP3549956A2; US20140363428A1; TW201817745A; US20240117059A1; TW201817744A; SG11201401098TA; CN103958547A; JP2019206526A; MX2014003891A; US10253100B2; RU2018118993A; JP2022034037A; AU2017216587A1; EP2760890A2; CN108948197A; TW201326209A; JP6541730B2

Abstract

본 발명은 중성 pH에서 신생아 Fc 수용체(FcRn)에 대해 증대된 친화성을 갖는 변형된 FcRn-결합 도메인; 낮은 면역원성, 높은 안정성을 갖고 단지 소수의 응집체만을 형성하는, 상기 FcRn-결합 도메인을 포함하는 항원-결합 분자; 기존의 항-약물 항체에 대해 중성 pH에서 증가된 결합 활성 없이 중성 또는 산성 pH에서 증가된 FcRn-결합 활성을 갖는 변형된 항원-결합 분자; 세포 내로의 항원-결합 분자-매개된 항원 흡수를 개선시키기 위한 상기 항원-결합 분자의 용도; 특정 항원의 혈장 농도를 감소시키기 위한 상기 항원-결합 분자의 용도; 단일 항원-결합 분자가 분해 전에 결합할 수 있는 항원의 총수를 증가시키기 위한 상기 변형된 FcRn-결합 도메인의 용도; 항원-결합 분자의 약동학을 개선시키기 위한 상기 변형된 FcRn-결합 도메인의 용도; 기존의 항-약물 항체에 대한 결합 활성을 감소시키기 위한 방법; 및 상기 항원-결합 분자의 생성 방법을 제공한다.

Description

항원 제거를 촉진하는 에프씨알엔 결합 도메인을 갖는 치료학적 항원 결합 분자{THERAPEUTIC ANTIGEN-BINDING MOLECULE WITH A FcRn-BINDING DOMAIN THAT PROMOTES ANTIGEN CLEARANCE}

본 발명은 중성 pH에서 신생아 Fc 수용체(FcRn)에 대해 증대된 친화성을 갖는 변형된 FcRn-결합 도메인; 낮은 면역원성, 높은 안정성을 갖고 단지 소수의 응집체만을 형성하는, 상기 FcRn-결합 도메인을 포함하는 항원-결합 분자; 기존의 항-약물 항체에 대해 중성 pH에서 증가된 결합 활성 없이 중성 또는 산성 pH에서 증가된 FcRn-결합 활성을 갖는 변형된 항원-결합 분자; 세포 내로의 항원-결합 분자-매개된 항원 흡수를 개선시키기 위한 상기 항원-결합 분자의 용도; 특정 항원의 혈장 농도를 감소시키기 위한 상기 항원-결합 분자의 용도; 단일 항원-결합 분자가 분해 전에 결합할 수 있는 항원의 총수를 증가시키기 위한 상기 변형된 FcRn-결합 도메인의 용도; 항원-결합 분자의 약동학을 개선시키기 위한 상기 변형된 FcRn-결합 도메인의 용도; 기존의 항-약물 항체에 대한 결합 활성을 감소시키기 위한 방법; 및 상기 항원-결합 분자의 생성 방법에 관한 것이다.

혈장에서의 높은 안정성 및 적은 부작용으로 인해, 점점 더 많은 수의 항체가 약제로서 사용되고 있는 중이다. 가용성 항원을 표적화하는 통상적인 항체는 주사 후 환자의 혈장 중에서 상기 항원과 결합하고 이어서 분해될 때까지 항체-항원 복합체의 형태로 안정하게 남아있는다. 전형적인 항체는 일반적으로 긴 반감기(1 내지 3주)를 갖지만, 항원은 하루 미만의 비교적 짧은 반감기를 갖는다. 따라서 항체와의 복합체 중의 항원은 상기 항원 단독보다는 현저하게 더 긴 반감기를 갖는다. 결과적으로, 상기 항원 농도는 통상적인 항체의 주사 후에 증가하는 경향이 있다. 상기와 같은 사례들이 다양한 가용성 항원, 예를 들어 IL-6 (문헌[J Immunotoxicol. 2005, 3, 131-9]. (NPL 1)), 베타 아밀로이드 (문헌[MAbs. 2010 Sep-Oct;2(5):576-88] (NPL 2)), MCP-1 (문헌[ARTHRITIS & RHEUMATISM 2006, 54,2387-92] (NPL 3)), 헵시딘 (문헌[AAPS J. 2010, 12(4):646-57]. (NPL 4)) 및 sIL-6 수용체 (문헌[Blood. 2008 Nov 15;112(10):3959-64]. (NPL 5))를 표적화하는 항체들에 대해서 보고되었다. 보고서들은 항체 투여시 기준선으로부터 대략 10 내지 1000 배(항원에 따라)의 총 혈장 항원 농도의 증가를 개시하였다.

상기와 같은 총 혈장 항원 농도의 증가는 바람직하지 않기 때문에, 치료 항체에 의한 상기 항원의 제거 전략이 개발되었다. 이러한 전략 중 하나는 IgG에 대한 신생아 Fc 수용체(FcRn)에 대해 증가된 결합 친화성을 갖는 pH-의존성 항원 결합 항체를 사용하여 상기 항원을 신속하게 처리하는 것이다(예를 들어 PCT 출원 제 PCT/JP2011/001888 호(PTL1)를 참조하시오). 상기 FcRn은 다수의 세포의 막에서 발견되는 단백질이다. 중성 pH에서 FcRn에 대해 증가된 결합 활성을 갖는 항체는 세포 표면상의 FcRn에 결합할 것이며, 이때 상기 수용체는 상기 항체와 함께 소낭 중에서 상기 세포 내로 내면화된다. 상기 소낭 내부의 pH는 점차적으로 감소하기 때문에, 상기 항원은 산성 pH에서의 그의 낮은 친화성으로 인해 상기 pH-의존성 항원 결합 항체로부터 해리될 것이다. 이어서 상기 해리된 항원은 분해되고 이러는 동안 상기 FcRn 및 결합된 항체는 분해 전에 다시 세포의 표면으로 재순환된다. 따라서, 중성 pH에서 FcRn에 대해 증가된 결합 활성을 갖는 pH-의존성 항원 결합 항체를 사용하여 혈장으로부터 항원을 제거하고 혈장 중 그의 농도를 감소시킬 수 있다.

선행의 연구들은 또한 산성 pH에서 FcRn에 대한 결합 친화성을 증가시키기 위한 Fc-공학이 항체의 엔도솜 재순환 효율 및 약동학을 또한 개선시킬 수 있음을 입증하였다. 예를 들어 M252Y/S254T/T256E (YTE) 변체 (문헌[J Biol Chem, 2006, 281:23514-23524]. (NPL 6)), M428L/N434S (LS) 변체 (문헌[Nat Biotechnol, 2010 28:157-159]. (NPL 7)), T250Q/M428L (문헌[J Immunol. 2006, 176(1):346-56]. (NPL 8)) 및 N434H 변체 (문헌[Clinical Pharmacology & Therapeutics (2011) 89(2):283-290]. (NPL 9))는 고유 IgG1에 비해 반감기의 개선을 보였다.

그러나, 상기와 같은 치환들은 치료 항체의 개발에 중요한 상기 항체의 성질들, 예를 들어 상기 항체의 안정성, 면역원성, 응집 양상 및 기존 항체(예를 들어 류마티스성 인자)에 대한 결합 친화성이 변경(altering)될 위험성을 또한 갖는다. 따라서, 본 발명의 주목적은 항체의 클리어런스(clearance)를 증대시킬 뿐만 아니라 치료학적 항원-결합 분자의 개발을 위한 기준을 충족시키는 변형된 FcRn-결합 도메인을 제공하는 것이다. 이러한 개발성(developability) 기준은 특히 높은 안정성, 낮은 면역원성, 낮은 비율의 응집체, 및 기존 항-약물 항체(ADA)에 대한 낮은 결합 친화성이다.

본 발명과 관련된 선행 기술 자료들을 하기에 나타낸다. 본 명세서에 인용된 모든 자료들은 본 발명에 참고로 인용된다.

발명의 요약

기술적 문제

본 발명은 상술한 상황들에 비추어 고안되었다. 본 발명의 목적은 중성 pH에서 FcRn에 대해 증대된 친화성을 갖는 변형된 FcRn-결합 도메인; 낮은 면역원성, 높은 안정성을 갖고 단지 소수의 응집체만을 형성하는, 상기 FcRn-결합 도메인을 포함하는 항원-결합 분자; 기존의 항-약물 항체에 대해 중성 pH에서 증가된 결합 활성 없이 중성 또는 산성 pH에서 증가된 FcRn-결합 활성을 갖는 변형된 항원-결합 분자; 세포 내로의 항원-결합 분자-매개된 항원 흡수를 개선시키기 위한 상기 항원-결합 분자의 용도; 특정 항원의 혈장 농도를 감소시키기 위한 상기 항원-결합 분자의 용도; 단일 항원-결합 분자가 분해 전에 결합할 수 있는 항원의 총수를 증가시키기 위한 상기 변형된 FcRn-결합 도메인의 용도; 항원-결합 분자의 약동학을 개선시키기 위한 상기 변형된 FcRn-결합 도메인의 용도; 및 상기 항원-결합 분자의 생성 방법을 제공하는 것이다.

문제에 대한 해법

본 발명자들은 중성 pH에서 FcRn에 대해 증대된 친화성을 갖는 변형된 FcRn-결합 도메인, 및 낮은 면역원성, 높은 안정성을 갖고 단지 소수의 응집체만을 형성하는, 상기 FcRn-결합 도메인을 포함하는 항원-결합 분자에 대해 예의 연구를 수행하였다. 그 결과, 본 발명자들은 상기 FcRn-결합 도메인의 특정 위치에서의 치환이, 상기 면역원성의 실질적인 증가, 상기 안정성의 실질적인 감소 및/또는 고 분자량 종의 비의 실질적인 증가 없이 중성 pH에서 상기 FcRn에 대한 친화성을 증가시킴을 발견하였다.

더욱 또한, 본 발명자들은 기존의 항-약물 항체에 대해 현저하게 증가된 결합 활성 없이 중성 pH 또는 산성 pH에서 FcRn에 대한 증대된 친화성을 갖는 변형된 FcRn-결합 도메인, 및 상기와 같은 FcRn-결합 도메인을 포함하는 항원-결합 분자에 대해 예의 연구를 수행하였다. 그 결과, 본 발명자들은 상기 FcRn-결합 도메인의 특정 위치에서의 치환이 상기 FcRn-결합 활성의 실질적인 감소 없이 중성 pH에서 기존 항-약물 항체에 대한 친화성을 감소시킴을 발견하였다.

구체적으로, 본 발명은

[1] 변형된 FcRn-결합 도메인을 포함하는 항원-결합 분자로, 상기 변형된 FcRn-결합 도메인은 EU238, EU250, EU252, EU254, EU255, EU258, EU286, EU307, EU308, EU309, EU311, EU315, EU428, EU433, EU434, 및 EU436으로 이루어진 그룹 중에서 선택된 하나 이상의 위치에서 아미노산 치환을 포함하며, 여기에서 상기 숫자는 EU 넘버링에 따른 치환의 위치를 가리킨다.

[2] [1]에 따른 항원-결합 분자에서, 상기 FcRn-결합 도메인이

a) EU252 및 EU434 위치에서의 아미노산의 아미노산 치환; 및

b) EU238, EU250, EU252, EU254, EU255, EU256, EU258, EU286, EU387, EU307, EU308, EU309, EU311, EU315, EU428, EU433, EU434, 및 EU436으로 이루어진 그룹 중에서 선택된 하나 이상의 위치에서의 아미노산 치환

을 갖는다.

[3] [1] 또는 [2]에 따른 항원-결합 분자에서, 상기 변형된 FcRn-결합 도메인이

EU238 위치에서 아스파트산,

EU250 위치에서 발린,

EU252 위치에서 타이로신,

EU254 위치에서 쓰레오닌,

EU255 위치에서 류신,

EU256 위치에서 글루탐산,

EU258 위치에서 아스파트산 또는 아이소류신,

EU286 위치에서 글루탐산,

EU307 위치에서 글루타민,

EU308 위치에서 프롤린,

EU309 위치에서 글루탐산,

EU311 위치에서 알라닌 또는 히스티딘,

EU315 위치에서 아스파트산,

EU428 위치에서 아이소류신,

EU433 위치에서 알라닌, 리신, 프롤린, 아르기닌 또는 세린,

EU434 위치에서 타이로신, 또는 트립토판, 및/또는

EU436 위치에서 아이소류신, 류신, 발린, 쓰레오닌 또는 페닐알라닌

을 포함한다.

[4] [2]에 따른 항원-결합 분자에서, 상기 FcRn-결합 도메인이

a) EU252, EU434, 및 EU436;

b) EU252, EU307, EU311 및 EU434;

c) EU252, EU315, 및 EU434;

d) EU252, EU308, 및 EU434;

e) EU238, EU252, 및 EU434;

f) EU252, EU434, EU307, EU311, 및 EU436; 및

g) EU252, EU387, 및 EU434

로 이루어진 그룹 중에서 선택된 하나 이상의 위치 조합에서의 아미노산의 아미노산 치환을 포함한다.

[5] [4]에 따른 항원-결합 분자에서, FcRn-결합 도메인이

a) EU252 위치에서 타이로신, EU315 위치에서 아스파트산, 및 EU434 위치에서 타이로신; 또는

b) EU252 위치에서 타이로신, EU434 위치에서 타이로신, 및 EU436 위치에서 아이소류신; 또는

c) EU252 위치에서 타이로신, EU434 위치에서 타이로신, 및 EU436 위치에서 류신; 또는

d) EU252 위치에서 타이로신, EU434 위치에서 타이로신, 및 EU436 위치에서 발린; 또는

e) EU252 위치에서 타이로신, EU254 위치에서 쓰레오닌, EU434 위치에서 타이로신, 및 EU436 위치에서 아이소류신

을 포함한다.

[6] [2]에 따른 항원-결합 분자에서, FcRn-결합 도메인이 3 개 이상의 위치에서의 아미노산 치환을 포함하며, 여기에서 상기 3 개 이상의 위치는

a) EU252 / EU434 / EU307 / EU311 / EU286;

b) EU252 / EU434 / EU307 / EU311 / EU286 / EU254;

c) EU252 / EU434 / EU307 / EU311 / EU436;

d) EU252 / EU434 / EU307 / EU311 / EU436 / EU254;

e) EU252 / EU434 / EU307 / EU311 / EU436 / EU250;

f) EU252 / EU434 / EU308 / EU250;

g) EU252 / EU434 / EU308 / EU250 / EU436; 및

h) EU252 / EU434 / EU308 / EU250 / EU307 / EU311

로 이루어진 그룹의 조합들 중 하나이다.

[7] [6]에 따른 항원-결합 분자에서, FcRn-결합 도메인이

a) EU252 위치에서 타이로신, EU286 위치에서 글루탐산, EU307 위치에서 글루타민, EU 311 위치에서 알라닌 및 EU434 위치에서 타이로신; 또는

b) EU252 위치에서 타이로신, EU254 위치에서 쓰레오닌, EU286 위치에서 글루탐산, EU307 위치에서 글루타민, EU311 위치에서 알라닌 및 EU434 위치에서 타이로신; 또는

c) EU252 위치에서 타이로신, EU307 위치에서 글루타민, EU311 위치에서 알라닌, EU434 위치에서 타이로신 및 EU436 위치에서 아이소류신; 또는

d) EU252 위치에서 타이로신, EU254 위치에서 쓰레오닌, EU286 위치에서 글루탐산, EU307 위치에서 글루타민, EU311 위치에서 알라닌, EU434 위치에서 타이로신 및 EU436 위치에서 아이소류신; 또는

e) EU250 위치에서 발린, EU252 위치에서 타이로신, EU254 위치에서 쓰레오닌, EU308 위치에서 프롤린, EU434 위치에서 타이로신 및 EU436 위치에서 발린; 또는

f) EU250 위치에서 발린, EU252 위치에서 타이로신, EU307 위치에서 글루타민, EU311 위치에서 알라닌, EU434 위치에서 타이로신 및 EU436 위치에서 발린; 또는

g) EU252 위치에서 타이로신, EU307 위치에서 글루타민, EU311 위치에서 알라닌, EU434 위치에서 타이로신 및 EU436 위치에서 발린; 또는

h) EU250 위치에서 발린, EU252 위치에서 타이로신, EU308 위치에서 프롤린, 및 EU434 위치에서 타이로신; 또는

i) EU250 위치에서 발린, EU252 위치에서 타이로신, EU307 위치에서 글루타민, EU308 위치에서 프롤린, EU311 위치에서 알라닌, 및 EU434 위치에서 타이로신

을 포함한다.

[8] [2]에 따른 항원-결합 분자에서, FcRn-결합 도메인이 3 개 이상의 위치에서의 아미노산 치환을 포함하며, 여기에서 상기 3 개 이상의 위치가

a) EU252 및 EU434 및 EU307 및 EU311 및 EU436 및 EU286;

b) EU252 및 EU434 및 EU307 및 EU311 및 EU436 및 EU250 및 EU308;

c) EU252 및 EU434 및 EU307 및 EU311 및 EU436 및 EU250 및 EU286 및 EU308;

d) EU252 및 EU434 및 EU307 및 EU311 및 EU436 및 EU250 및 EU286 및 EU308 및 EU428

로 이루어진 그룹의 조합들 중 하나이다.

[9] [8]에 따른 항원-결합 분자에서, FcRn-결합 도메인이

a) EU252 위치에서 타이로신, EU286 위치에서 글루탐산, EU307 위치에서 글루타민, EU311 위치에서 알라닌, EU434 위치에서 타이로신 및 EU436 위치에서 발린; 또는

b) EU250 위치에서 발린, EU252 위치에서 타이로신, EU307 위치에서 글루타민, EU308 위치에서 프롤린, EU311 위치에서 알라닌, EU434 위치에서 타이로신, 및 EU436 위치에서 발린; 또는

c) EU250 위치에서 발린, EU252 위치에서 타이로신, EU286 위치에서 글루탐산, EU307 위치에서 글루타민, EU308 위치에서 프롤린, EU311 위치에서 알라닌, EU434 위치에서 타이로신, 및 EU436 위치에서 발린; 또는

d) EU250 위치에서 발린, EU252 위치에서 타이로신, EU286 위치에서 글루탐산, EU307 위치에서 글루타민, EU308 위치에서 프롤린, EU311 위치에서 알라닌, EU434 위치에서 타이로신, 및 EU436 위치에서 발린

을 포함한다.

[10] [2]에 따른 항원-결합 분자에서, FcRn-결합 도메인이 3 개 이상의 위치에서의 아미노산 치환을 포함하고, 여기에서 상기 3 개 이상의 위치가

a) EU434 및 EU307 및 EU311;

b) EU434 및 EU307 및 EU309 및 EU311; 및

c) EU434 및 EU250 및 EU252 및 EU436

로 이루어진 그룹의 조합들 중 하나이다.

[11] [10]에 따른 항원-결합 분자에서, FcRn-결합 도메인이

a) EU307 위치에서 글루타민, EU311 위치에서 히스티딘 및 EU434 위치에서 타이로신; 또는

b) EU307 위치에서 글루타민, EU309 위치에서 글루탐산, EU311 위치에서 알라닌 및 EU434 위치에서 타이로신; 또는

c) EU307 위치에서 글루타민, EU309 위치에서 글루탐산, EU311 위치에서 히스티딘 및 EU434 위치에서 타이로신; 또는

d) EU250 위치에서 발린; EU252 위치에서 타이로신, EU434 위치에서 타이로신 및 EU436 위치에서 발린

을 포함한다.

[12] [1] 내지 [11] 중 어느 하나에 따른 항원-결합 분자에서, 고분자량 종의 비가 2% 미만이다.

[13] [1] 내지 [12] 중 어느 하나에 따른 항원-결합 분자에서, 항원-결합 분자가 a) pH 7 내지 8에서보다 pH 5.5 내지 6.5에서 항원에 대해 더 낮은 결합 활성 또는 b) 상기 항원에 대해 "칼슘 농도-의존성 결합" 활성을 갖는 항원-결합 도메인을 포함한다.

[14] [1] 내지 [5] 중 어느 하나에 따른 항원-결합 분자에서, pH 7에서 FcRn에 대한 결합 분자의 결합 활성이 50 내지 150 nM이고, Tm이 63.0 ℃ 초과이고, 에피염기(Epibase) 점수가 250 미만이다.

[15] [1] 내지 [3] 및 [6] 내지 [7] 중 어느 하나에 따른 항원-결합 분자에서, pH 7에서 FcRn에 대한 결합 분자의 결합 활성이 15 내지 50 nM이고, Tm이 60 ℃ 초과이고, 에피염기 점수가 500 미만이다.

[16] [1] 내지 [3] 및 [8] 내지 [9] 중 어느 하나에 따른 항원-결합 분자에서, pH 7에서 FcRn에 대한 결합 분자의 결합 활성이 15 nM 초과이고, Tm이 57.5 ℃ 초과이고, 에피염기 점수가 500 미만이다.

[17] [1] 내지 [3] 중 어느 하나에 따른 항원-결합 분자에서, FcRn-결합 도메인이

a) EU238, EU255 및/또는 EU258 위치, 및

b) 3 개 이상의 위치

에서의 아미노산 치환을 포함하고, 여기에서 상기 3 개 이상의 위치가 표 4 내지 7에 나타낸 조합들 중 하나이다.

[18] [1] 내지 [17] 중 어느 하나에 따른 항원-결합 분자에서,

a) FcRn-결합 도메인의 EU257 위치에서 아미노산이 알라닌, 발린, 아이소류신, 류신 및 쓰레오닌으로 이루어진 그룹 중에서 선택된 아미노산이 아니고/아니거나,

b) FcRn-결합 도메인의 EU252 위치에서 아미노산이 트립토판이 아니다.

[19] [1] 내지 [18] 중 어느 하나에 따른 항원-결합 분자에서, 상기 항원-결합 분자가 본래의(intact) FcRn-결합 도메인을 포함하는 대조용 항체의 결합 친화성에 비해 현저하게 증가되지 않은 기존의 항-약물 항체에 대한 결합 활성을 갖는다.

[20] [19]에 따른 항원-결합 분자에서, FcRn 결합 도메인이 EU387, EU422, EU424, EU426, EU433, EU436, EU438 및 EU440으로 이루어진 그룹 중에서 선택된 하나 이상의 위치에서의 아미노산 치환을 또한 포함한다.

[21] [20]에 따른 항원-결합 분자에서, FcRn 결합 도메인이

EU387 위치에서 아르기닌

EU422 위치에서 글루탐산, 아르기닌 또는 세린, 아스파트산, 리신, 쓰레오닌 또는 글루타민;

EU424 위치에서 글루탐산 또는 아르기닌, 리신, 또는 아스파라긴;

EU426 위치에서 아스파트산, 글루타민, 알라닌 또는 타이로신;

EU433 위치에서 아스파트산;

EU436 위치에서 쓰레오닌;

EU438 위치에서 글루탐산, 아르기닌, 세린 또는 리신; 및

EU440 위치에서 글루탐산, 아스파트산 또는 글루타민

으로 이루어진 그룹 중에서 선택된 하나 이상의 아미노산 치환을 포함한다.

[22] [1] 내지 [21] 중 어느 하나에 따른 항원-결합 분자에서, 변형된 FcRn 결합 도메인이 3 개 이상의 치환을 포함하고, 여기에서 상기 3 개 이상의 치환이 표 12 내지 13에 나타낸 조합들 중 하나이다.

[23] [1] 내지 [22] 중 어느 하나에 따른 항원-결합 분자에서, 변형된 FcRn 결합 도메인이 3 개 이상의 치환을 포함하고, 여기에서 상기 3 개 이상의 치환이 표 14 내지 15에 나타낸 조합들 중 하나이다.

[24] [20] 내지 [23] 중 어느 하나에 따른 항원-결합 분자에서, FcRn-결합 도메인이

a) EU252 위치에서 타이로신, EU387 위치에서 아르기닌, EU434 위치에서 타이로신, 및 EU436 위치에서 발린; 또는

b) EU252 위치에서 타이로신, EU422 위치에서 글루탐산, EU434 위치에서 타이로신, 및 EU436 위치에서 발린; 또는

c) EU252 위치에서 타이로신, EU422 위치에서 아르기닌, EU434 위치에서 타이로신, 및 EU436 위치에서 발린; 또는

d) EU252 위치에서 타이로신, EU422 위치에서 세린, EU434 위치에서 타이로신, 및 EU436 위치에서 발린; 또는

e) EU252 위치에서 타이로신, EU424 위치에서 글루탐산, EU434 위치에서 타이로신, 및 EU436 위치에서 발린; 또는

f) EU252 위치에서 타이로신, EU424 위치에서 아르기닌, EU434 위치에서 타이로신, 및 EU436 위치에서 발린; 또는

g) EU252 위치에서 타이로신, EU434 위치에서 타이로신, EU436 위치에서 발린, 및 EU438 위치에서 글루탐산; 또는

h) EU252 위치에서 타이로신, EU434 위치에서 타이로신, EU436 위치에서 발린, 및 EU438 위치에서 아르기닌; 또는

i) EU252 위치에서 타이로신, EU434 위치에서 타이로신, EU436 위치에서 발린, 및 EU438 위치에서 세린; 또는

j) EU252 위치에서 타이로신, EU434 위치에서 타이로신, EU436 위치에서 발린, 및 EU440 위치에서 글루탐산

을 포함한다.

[25] [1] 내지 [24] 중 어느 하나에 따른 항원-결합 분자에서, 상기 항원-결합 분자가 항체이다.

[26] 세포 내로의 항원-결합 분자-매개된 항원 흡수를 개선시키기 위한 [1] 내지 [25] 중 어느 하나에 따른 항원-결합 분자의 용도.

[27] 특정 항원의 혈장 농도를 감소시키기 위한 [1] 내지 [25] 중 어느 하나에 따른 항원-결합 분자의 용도로, 상기 항원-결합 분자가 상기 항원에 결합할 수 있는 항원-결합 도메인을 포함한다.

[28] EU238, EU250, EU252, EU254, EU255, EU258, EU286, EU307, EU308, EU309, EU311, EU315, EU428, EU433, EU434, 및 EU436으로 이루어진 그룹 중에서 선택된 위치들 중 하나 이상에서 항원-결합 분자의 FcRn-결합 도메인 내로 아미노산 치환을 도입시키는 단계를 포함하는, 상기 항원-결합 분자의 약동학을 개선시키는 방법.

[29] EU238, EU250, EU252, EU254, EU255, EU258, EU286, EU307, EU308, EU309, EU311, EU315, EU428, EU433, EU434, 및 EU436으로 이루어진 그룹 중에서 선택된 위치들 중 하나 이상에서 항원-결합 분자의 FcRn-결합 도메인 내로 아미노산 치환을 도입시키는 단계를 포함하는, 환자에게서 항원-결합 분자의 제거를 지연시키는 방법.

[30] EU238, EU250, EU252, EU254, EU255, EU258, EU286, EU307, EU308, EU309, EU311, EU315, EU428, EU433, EU434, 및 EU436으로 이루어진 그룹 중에서 선택된 위치들 중 하나 이상에서 항원-결합 분자의 FcRn-결합 도메인 내로 아미노산 치환을 도입시키는 단계를 포함하는, 항원-결합 분자의 혈장 체류 시간을 연장시키는 방법.

[31] EU238, EU250, EU252, EU254, EU255, EU258, EU286, EU307, EU308, EU309, EU311, EU315, EU428, EU433, EU434, 및 EU436으로 이루어진 그룹 중에서 선택된 위치들 중 하나 이상에서 항원-결합 분자의 FcRn-결합 도메인 내로 아미노산 치환을 도입시키는 단계를 포함하는, 항원-결합 분자의 혈장 항원-제거 속도를 증가시키는 방법.

[32] EU238, EU250, EU252, EU254, EU255, EU258, EU286, EU307, EU308, EU309, EU311, EU315, EU428, EU433, EU434, 및 EU436으로 이루어진 그룹 중에서 선택된 위치들 중 하나 이상에서 항원-결합 분자의 FcRn-결합 도메인 내로 아미노산 치환을 도입시키는 단계를 포함하는, 혈장 항원을 제거하는 항원-결합 분자의 능력을 증가시키는 방법.

[33] [28] 내지 [32] 중 어느 하나에 따른 방법에서, EU256 위치에서 FcRn 결합 도메인 내로 아미노산 치환을 또한 도입시킨다.

[34] [28] 내지 [33] 중 어느 하나에 따른 방법에서, 상기 방법은 EU387, EU422, EU424, EU426, EU433, EU436, EU438 및 EU440으로 이루어진 그룹 중에서 선택된 하나 이상의 위치에서 FcRn-결합 도메인 내로 아미노산 치환을 도입시키는 단계를 또한 포함한다.

[35] [1] 내지 [25] 중 어느 하나에 따른 항원-결합 분자의 생성 방법으로,

(a) 모 FcRn-결합 도메인을 선택하고 EU238, EU250, EU252, EU254, EU255, EU258, EU286, EU307, EU308, EU309, EU311, EU315, EU428, EU433, EU434, 및 EU436으로 이루어진 그룹 중에서 선택된 하나 이상의 위치에서의 아미노산 치환을 도입시킴으로써 상기 모 FcRn을 변경시키고;

(b) pH-의존성 항원-결합 도메인 또는 칼슘-이온 의존성 항원-결합 도메인을 획득하기 위해서 항원-결합 분자의 항원-결합 도메인을 선택하고 상기 항원-결합 도메인 중의 하나 이상의 아미노산을 변경시키고;

(c) (a) 및 (b)에서 제조된 인간 FcRn-결합 도메인 및 항원-결합 도메인이 결합된 항원-결합 분자를 암호화하는 유전자를 수득하고;

(d) (c)에서 제조된 유전자를 사용하여 항원-결합 분자를 생성시키는

단계들을 포함한다.

[36] [35]에 따른 방법에서, 단계 a)에서 추가로 EU256 위치에서 FcRn 결합 도메인 내로 아미노산 치환을 도입시킨다.

[37] [35] 내지 [36] 중 어느 하나에 따른 방법에서, EU387, EU422, EU424, EU426, EU433, EU436, EU438 및 EU440으로 이루어진 그룹 중에서 선택된 하나 이상의 위치에서 FcRn-결합 도메인 내로 아미노산 치환을 도입시키는 단계를 추가로 포함한다.

[38] 변형된 FcRn 결합 도메인을 포함하는 항원-결합 분자로, 상기 변형된 FcRn 결합 도메인이 EU387, EU422, EU424, EU426, EU433, EU436, EU438 및 EU440으로 이루어진 그룹 중에서 선택된 위치들 중 하나 이상에서의 아미노산 치환을 포함하고, 중성 pH에서 기존의 항-약물 항체(ADA)에 대한 상기 항원-결합 분자의 결합 친화성이 본래의 FcRn 결합 도메인을 포함하는 항원-결합 분자의 결합 친화성에 비해 현저하게 증가되지 않는다.

[39] [38]에 따른 항원-결합 분자에서, 상기 항원-결합 분자가 중성 또는 산성 pH 범위에서 FcRn에 대해 증가된 결합 친화성을 또한 갖는다.

[40] [38] 또는 [39]에 따른 항원-결합 분자에서, EU387, EU422, EU424, EU426, EU433, EU436, EU438 및 EU440으로 이루어진 그룹 중에서 선택된 위치들 중 하나 이상을 치환하는 아미노산이

a) EU387 위치에서 아르기닌;

b) EU422 위치에서 글루탐산, 아르기닌, 세린, 아스파트산, 리신, 쓰레오닌 또는 글루타민;

c) EU424 위치에서 글루탐산, 아르기닌, 리신 또는 아스파라긴;

d) EU426 위치에서 아스파트산, 글루타민, 알라닌 또는 타이로신;

e) EU433 위치에서 아스파트산;

d) EU436 위치에서 쓰레오닌;

g) EU438 위치에서 글루탐산, 아르기닌, 세린 또는 리신; 및

h) EU440 위치에서 글루탐산, 아스파트산, 또는 글루타민

으로 이루어진 그룹 중에서 선택된다.

[41] [38] 내지 [40] 중 어느 하나에 따른 항원-결합 분자에서, 상기 변형된 FcRn 결합 도메인이 표 10에 나타낸 하나 이상의 위치 또는 조합들 중 하나에서 아미노산 치환을 포함한다.

[42] [38] 내지 [40] 중 어느 하나에 따른 항원-결합 분자에서, 변형된 FcRn 결합 도메인이 표 11에 나타낸 아미노산 치환 또는 치환 조합들 중 어느 하나를 포함한다.

[43] [39] 내지 [42] 중 어느 하나에 따른 항원-결합 분자에서, 변형된 FcRn 결합 도메인이 EU238, EU250, EU252, EU254, EU255, EU256, EU258, EU286, EU307, EU308, EU309, EU311, EU315, EU428, EU434, 및 EU436으로 이루어진 그룹 중에서 선택된 FcRn 결합 도메인의 하나 이상의 위치에서 아미노산 치환을 또한 포함하고, 상기 치환이 중성 pH 또는 산성 pH 범위에서 FcRn 결합 활성의 증가를 부여한다.

[44] [39] 내지 [43] 중 어느 하나에 따른 항원-결합 분자에서, 변형된 FcRn 결합 도메인이 FcRn 결합 도메인 위치

i) a) EU438 / EU440 또는 b) EU424; 및

ii) a) EU434, b) EU252/EU254/EU256; c) EU428/EU434; 또는 d) EU250/EU428

에서 아미노산 치환을 포함한다.

[45] [44]에 따른 항원-결합 분자에서, 변형된 FcRn 결합 도메인이 아미노산 치환

i) a) EU438R/EU440E 또는 b) EU424N; 및

ii) a) M434H; b) M252Y/S254T/T256E; c) M428L/N434S; 또는 d) T250Q 및 M428L(EU 넘버링)

을 포함한다.

[46] [45]에 따른 항원-결합 분자에서, 변형된 FcRn 결합 도메인이 3 개 이상의 아미노산 치환을 포함하고, 상기 3 개 이상의 치환이 표 13 및 15에 나타낸 조합들 중 하나이다.

[47] [39] 내지 [42] 중 어느 하나에 따른 항원-결합 분자에서, 변형된 FcRn 결합 도메인이

a) EU387, EU422, EU424, EU438, EU440, EU433으로 이루어진 그룹 중에서 선택된 위치들 중 하나 이상에서, 또는 2 개 이상의 위치(여기에서 상기 2 개의 위치는 EU422/EU424 및 EU438/EU440으로 이루어진 그룹의 조합들 중 하나이다)에서; 및

b) 2 개 이상의 위치(여기에서 상기 2 개의 위치는 표 9에 나타낸 조합들 중 하나이다)에서

치환을 포함한다.

[48] [47]에 따른 항원-결합 분자에서, 변형된 FcRn 결합 도메인이 3 개 이상의 아미노산 치환을 포함하고, 상기 3 개 이상의 아미노산 치환이 표 12 또는 14에 나타낸 조합들 중 하나이다.

[49] [39] 내지 [48] 중 어느 하나에 따른 항원-결합 분자에서, 상기 항원-결합 분자가 pH-의존성 항원-결합 도메인 또는 칼슘 이온-의존성 항원-결합 도메인을 포함한다.

[50] 중성 또는 산성 pH에서 FcRn에 대해 증가된 결합 활성 및 중성 pH에서 기존의 ADA에 대해 증가된 결합 활성을 갖는 FcRn 결합 도메인을 포함하는 항원-결합 분자의 기존의 ADA에 대한 결합 활성을 감소시키기 위한 방법으로, 상기 방법은

a) 중성 또는 산성 pH에서 FcRn에 대해 증가된 결합 활성 및 중성 pH에서 기존의 ADA에 대해 증가된 결합 활성을 갖는 FcRn 결합 도메인을 포함하는 항원-결합 분자를 제공하고;

b) EU387, EU422, EU424, EU426, EU433, EU436, EU438 및 EU440으로 이루어진 그룹 중에서 선택된 위치들 중 하나 이상에서 상기 FcRn 결합 도메인 중의 아미노산을 치환시켜 변형된 FcRn 결합 도메인을 갖는 항원-결합 분자를 제공하는

단계들을 포함한다.

[51] [50]에 따른 방법에서, 단계 b)가 3 개 이상의 위치에서 아미노산을 치환시킴을 포함하고, 상기 3 개 이상의 위치가 표 10에 나타낸 조합들 중 하나이다.

[52] [50]에 따른 방법에서, 단계 b)가 3 개 이상의 아미노산 치환을 FcRn-결합 도메인 내로 도입시킴을 포함하고, 상기 3 개 이상의 아미노산 치환이 표 11에 나타낸 조합들 중 하나이다.

[53] 모 항체에 비해 중성 pH에서 기존의 ADA에 대한 결합 활성을 현저하게 증가시키지 않으면서 단일의 항원-결합 분자와 결합할 수 있는 항원의 총수를 증가시키는 방법으로, 상기 방법은

a) 모 FcRn 결합 도메인을 포함하는 항원-결합 분자를 제공하고,

b) EU238, EU250, EU252, EU254, EU255, EU256, EU258, EU286, EU307, EU308, EU309, EU311, EU315, EU428, EU433, EU434, 및 EU436으로 이루어진 그룹 중에서 선택된 위치들 중 하나 이상에서 상기 모 FcRn 결합 도메인의 아미노산 서열 중의 아미노산을 치환시킴으로써 단계 a)의 모 FcRn 결합 도메인을 변경시키고;

c) EU387, EU422, EU424, EU426, EU433, EU436, EU438 및 EU440으로 이루어진 그룹 중에서 선택된 하나 이상의 위치에서 상기 모 FcRn-결합 도메인의 아미노산 서열 중의 아미노산을 치환시킴으로써 단계 b)의 변형된 FcRn-결합 도메인을 변경시키는

단계들을 포함한다.

[54] 모 항체에 비해 중성 pH에서 기존의 ADA에 대한 항원-결합 분자의 결합 활성을 현저하게 증가시키지 않으면서 항원-결합된 형태로 세포 내로 흡수된 항원-부재 항원-결합 분자의 세포외 방출을 촉진하는 방법으로,

a) 모 FcRn-결합 도메인을 포함하는 항원-결합 분자를 제공하고,

b) EU238, EU250, EU252, EU254, EU255, EU256, EU258, EU286, EU307, EU308, EU309, EU311, EU315, EU428, EU433, EU434, 및 EU436, 및 EU428로 이루어진 그룹 중에서 선택된 하나 이상의 위치에서 상기 모 FcRn-결합 도메인의 아미노산 서열 중의 아미노산을 치환시킴으로써 상기 모 FcRn 결합 도메인을 변경시키고;

단계들을 포함한다.

[55] 모 항체에 비해 중성 pH에서 기존의 ADA에 대한 결합 활성을 현저하게 증가시키지 않으면서 혈장 항원을 제거하는 항원-결합 분자의 능력을 증가시키는 방법으로,

단계들을 포함한다.

[56] 모 항체에 비해 중성 pH에서 기존의 ADA에 대한 결합 활성을 현저하게 증가시키지 않으면서 항원-결합 분자의 약동학을 개선시키는 방법으로,

b) EU238, EU250, EU252, EU254, EU255, EU256, EU258, EU286, EU307, EU308, EU309, EU311, EU315, EU428, EU433, EU434, 및 EU436으로 이루어진 그룹 중에서 선택된 하나 이상의 위치에서 상기 모 FcRn-결합 도메인의 아미노산 서열 중의 아미노산을 치환시킴으로써 상기 모 FcRn 결합 도메인을 변경시키고;

단계들을 포함한다.

[57] 모 항체에 비해 중성 pH에서 기존의 ADA에 대한 결합 활성을 현저하게 증가시키지 않으면서 전체 또는 유리 항원 혈장 농도를 감소시키는 방법으로, 상기 방법은

a) 모 FcRn-결합 도메인을 포함하는 항원-결합 분자를 제공하고, 여기에서 상기 항원-결합 분자가 상기 항원에 결합할 수 있는 항원-결합 도메인을 포함하며,

단계들을 포함한다.

[58] 중성 또는 산성 pH에서 FcRn에 대해 증가된 결합 활성 및 중성 pH에서 기존 ADA에 대해 감소된 결합 활성을 갖는 FcRn 결합 도메인을 포함하는 항원-결합 분자의 생성 방법으로, 상기 방법은

(a) 중성 또는 산성 pH 범위에서 FcRn 및 중성 pH 범위에서 기존 ADA에 대해 증가된 결합 활성을 갖는 FcRn 결합 도메인을 제공하고,

(b) EU387, EU422, EU424, EU426, EU433, EU436, EU438 및 EU440으로 이루어진 그룹 중에서 선택된 위치들 중 하나 이상에서 아미노산을 치환시키고,

(c) pH-의존성 항원-결합 도메인을 획득하기 위해서 항원-결합 분자의 항원-결합 도메인을 선택하고 상기 항원-결합 도메인 중의 하나 이상의 아미노산을 변경시키거나, 또는 칼슘-이온 의존성 항원-결합 도메인을 선택하고;

(d) (a) 및 (b)에서 제조된 인간 FcRn-결합 도메인 및 항원-결합 도메인이 결합된 항원-결합 분자를 암호화하는 유전자를 수득하고;

(e) (c)에서 제조된 유전자를 사용하여 항원-결합 분자를 생성시키는

단계들을 포함하고, 여기에서 상기 생성된 항원-결합 분자가 본래의 FcRn 결합 도메인을 갖는 모 항원-결합 도메인에 비해 중성 또는 산성 pH에서 FcRn에 대해 증가된 결합 활성 및 중성 pH에서 내생적인 ADA에 대해 감소된 결합 활성을 갖는다.

[59] [58]에 따른 방법에서, 중성 또는 산성 pH 범위에서 FcRn 및 기존의 ADA 및 중성 pH 범위에서 기존의 ADA에 대해 증가된 결합 활성을 갖는 FcRn 결합 도메인이 EU238, EU250, EU252, EU254, EU255, EU256, EU258, EU286, EU307, EU308, EU309, EU311, EU315, EU428, EU433, EU434, 및 EU436으로 이루어진 그룹 중에서 선택된 하나 이상의 위치에서 아미노산 치환을 포함한다.

[60] [53] 내지 [57] 중 어느 하나에 따른 방법에서, 단계 a)에서 도입된 아미노산 치환이 3 개 이상의 위치에 존재하고, 상기 3 개 이상의 위치가 표 4 내지 7에 나타낸 조합들 중 하나이다.

[61] [53] 내지 [60] 중 어느 하나에 따른 방법에서, 단계 b)에서 도입된 아미노산 치환이 3 개 이상의 위치에 존재하고, 상기 3 개 이상의 위치가 표 10에 나타낸 조합들 중 하나이다.

[도 1A] 도 1A는 증대된 FcRn을 갖는 pH-의존성 항원 결합 항체와 비교된 종래 기술 항체("통상적인 항체)(둘 다 중성 pH에서 가용성 항원과 결합한다)의 혈장으로부터의 항원 제거의 도식적인 묘사를 나타낸다. 상기 통상적인 항체는 혈장 중 항원에 결합하며 산성 엔도솜 내로 세포에 의해 비특이적으로 흡수된다. 상기 엔도솜의 산성 조건 하에서, 상기 통상적인 항체는 소낭 내부에서 상기 FcRn과 결합하고 세포의 표면으로 다시 수송되어 여기에서 다시 방출된다. 상기 항원은 전체 내면화 및 재순환 과정 동안 상기 항원-결합 도메인에 결합된다. 중성 pH에서 증대된 FcRn 결합을 갖는 pH-의존성 항원 결합 항체는 세포 표면상의 FcRn에 결합하고 상기 세포 내로 급속히 및 따라서 통상적인 항체보다 더 큰 빈도로 내면화된다. 상기 엔도솜 중의 산성 조건 하에서, 상기 항원은 상기 변형된 항체로부터 해리되고 라이소솜으로 이동하여 여기에서 단백질 분해에 의해 분해된다. 여전히 상기 FcRn에 결합된 상기 항체는 다시 세포 표면으로 재순환된다. 거기에서, 상기 재순환된 유리 항체는 또 다른 항원에 다시 한번 결합할 수 있다. 상기 FcRn-매개된 흡수, 항원 해리 및 분해, 및 항체 재순환의 순환을 반복함으로써, 중성 pH에서 FcRn에 대해 개선된 결합 친화성을 갖는 상기와 같은 pH-의존성 항원-결합 항체는 통상적인 항체보다 현저하게 더 많은 양의 항원을 상기 라이소솜으로 전달할 수 있으며, 따라서 혈장 중의 총 항원 농도를 통상적인 항체보다 현저하게 더 많이 감소시킬 수 있다.
[도 1B] 도 1B는 엔도솜에서의 pH-의존성 항원-결합 도메인을 갖는 IgG 항체로부터의 가용성 항원의 해리를 도식적으로 나타낸다. 상기는 증가된 항원 제거를 생성시키고 상기 항체가 혈장 중의 또 다른 항원에 결합되게 한다.
[도 2] 도 2는 Fc 변체를 포함하는 항체의 hFcRn 결합 친화성(x 축) 및 y 축 상의 Tm의 플롯(Fc 변체 F1-F599: 빈 사각형; Fc 변체 F600-F1052: 닫힌 사각형)을 나타낸다.
[도 3] 도 3은 Fc 변체를 포함하는 항체의 hFcRn 결합 친화성(x 축) 및 고분자량(HMW) 부분(%)의 플롯(y 축)(Fc 변체 F1-F599: 빈 사각형; Fc 변체 F600-F1050: 닫힌 사각형)을 나타낸다.
[도 4] 도 4는 Fc 변체를 포함하는 항체의 hFcRn 결합 친화성(x 축) 및 면역원성 점수(에피염기 점수)의 플롯(Fc 변체 F1-F599: 빈 사각형; Fc 변체 F600-F1052: 닫힌 사각형)을 나타낸다.
[도 5] 도 5는 15 nM 초과의 hFcRn 결합 친화성을 갖는 Fc 변체를 포함하는 항체의 hFcRn 결합 친화성(x 축) 및 용융 온도 Tm(y 축)의 플롯(15 nM 이하의 Kd를 갖는 F1 내지 F599의 Fc 변체: 빈 사각형; 15 nM 이하의 Kd를 갖는 F600-F1052의 Fc 변체(그룹 1): 닫힌 사각형)을 나타낸다.
[도 6] 도 6은 15 nM 초과의 hFcRn 결합 친화성을 갖는 Fc 변체를 포함하는 항체의 hFcRn 결합 친화성(x 축) 및 HMW(%)(y 축)의 플롯(15 nM 이하의 Kd를 갖는 F1 내지 F599의 Fc 변체: 빈 사각형; 15 nM 이하의 Kd를 갖는 F600-F1052의 Fc 변체(그룹 1): 닫힌 사각형)을 나타낸다.
[도 7] 도 7은 15 nM 초과의 hFcRn 결합 친화성을 갖는 Fc 변체를 포함하는 항체의 hFcRn 결합 친화성 및 면역원성 점수의 플롯(15 nM 이하의 Kd를 갖는 F1 내지 F599의 Fc 변체: 빈 사각형; 15 nM 이하의 Kd를 갖는 F600-F1052의 Fc 변체(그룹 1): 닫힌 사각형)을 나타낸다.
[도 8] 도 8은 15 nM 내지 50 nM의 hFcRn 결합 친화성을 갖는 Fc 변체를 포함하는 항체의 hFcRn 결합 친화성 및 Tm의 플롯(Kd = 15-50 nM을 갖는 F1 내지 F599의 Fc 변체: 빈 사각형; Kd = 15-50 nM을 갖는 F600-F1052의 Fc 변체(그룹 2): 닫힌 사각형)을 나타낸다.
[도 9] 도 9는 15 nM 내지 50 nM의 hFcRn 결합 친화성을 갖는 Fc 변체를 포함하는 항체의 hFcRn 결합 친화성 및 HMW(%)의 플롯(Kd = 15-50 nM을 갖는 F1 내지 F599의 Fc 변체, 빈 사각형; Kd = 15-50 nM을 갖는 F600-F1052의 Fc 변체(그룹 2): 닫힌 사각형)을 나타낸다.
[도 10] 도 10은 15 nM 내지 50 nM의 hFcRn 결합 친화성을 갖는 Fc 변체를 포함하는 항체의 hFcRn 결합 친화성 및 면역원성 점수의 플롯(Kd = 15-50 nM을 갖는 F1 내지 F599의 Fc 변체: 빈 사각형; Kd = 15-50 nM을 갖는 F600-F1052의 Fc 변체(그룹 2): 닫힌 사각형)을 나타낸다.
[도 11] 도 11은 50 nM 내지 150 nM의 hFcRn 결합 친화성을 갖는 Fc 변체를 포함하는 항체의 hFcRn 결합 친화성 및 Tm의 플롯(Kd = 50-150 nM을 갖는 F1 내지 F599의 Fc 변체, 빈 사각형; Kd = 50-150 nM을 갖는 F600-F1052의 Fc 변체(그룹 3): 닫힌 사각형)을 나타낸다.
[도 12] 도 12는 50 nM 내지 150 nM의 hFcRn 결합 친화성을 갖는 Fc 변체를 포함하는 항체의 hFcRn 결합 친화성 및 HMW(%)의 플롯(Kd = 50-150 nM을 갖는 F1 내지 F599의 Fc 변체, 빈 사각형; Kd = 50-150 nM을 갖는 F600-F1052의 Fc 변체(그룹 3): 닫힌 사각형)을 나타낸다.
[도 13] 도 13은 50 nM 내지 150 nM의 hFcRn 결합 친화성을 갖는 Fc 변체를 포함하는 항체의 hFcRn 결합 친화성 및 면역원성 점수의 플롯(Kd = 50-150 nM을 갖는 F1 내지 F599의 Fc 변체: 빈 사각형; Kd = 50-150 nM을 갖는 F600-F1052의 Fc 변체(그룹 3): 닫힌 사각형)을 나타낸다.
[도 14] 도 14는 150 nM 내지 700 nM의 hFcRn 결합 친화성을 갖는 Fc 변체를 포함하는 항체의 hFcRn 결합 친화성 및 Tm의 플롯(Kd = 150-700 nM을 갖는 F1 내지 F599의 Fc 변체, 빈 사각형; Kd = 150-700 nM을 갖는 F600-F1052의 Fc 변체(그룹 4): 닫힌 사각형)을 나타낸다.
[도 15] 도 15는 150 nM 내지 700 nM의 hFcRn 결합 친화성을 갖는 Fc 변체를 포함하는 항체의 hFcRn 결합 친화성 및 HMW(%)의 플롯(Kd = 150-700 nM을 갖는 F1 내지 F599의 Fc 변체: 빈 사각형; Kd = 150-700 nM을 갖는 F600-F1052의 Fc 변체(그룹 4): 닫힌 사각형)을 나타낸다.
[도 16] 도 16은 150 nM 내지 700 nM의 hFcRn 결합 친화성을 갖는 Fc 변체를 포함하는 항체의 hFcRn 결합 친화성 및 면역원성 점수의 플롯(Kd = 150-700 nM을 갖는 F1 내지 F599의 Fc 변체: 빈 사각형; Kd = 150-700 nM을 갖는 F600-F1052의 Fc 변체(그룹 4): 닫힌 사각형)을 나타낸다.
[도 17] 도 17은 Fv4-IgG1, Fv4-F652, Fv4-F890 및 Fv4-F946의 주사 후의 인간 FcRn 트랜스제닉 마우스 및 대조용 마우스(항체 주사 없음)에서 시간에 따른 혈장 항원(hsIL-6R) 농도의 그래프 묘사를 나타낸다.
[도 18] 도 18은 Fv4-IgG1, Fv4-F652, Fv4-F890 및 Fv4-F946의 주사 후의 인간 FcRn 트랜스제닉 마우스에서 시간에 따른 혈장 항체 농도의 그래프 묘사를 나타낸다.
[도 19] 도 19는 대조용(항체 주사 없음) 및 Fv4-IgG1, Fv4-F11 및 Fv4-F652의 주사 후의 인간 FcRn 트랜스제닉 마우스에서 시간에 따른 혈장 항원(hsIL-6R) 농도의 그래프 묘사를 나타낸다.
[도 20] 도 20은 Fv4-IgG1, Fv4-F11 및 Fv4-F652의 주사 후의 인간 FcRn 트랜스제닉 마우스에서 시간에 따른 혈장 항체 농도의 그래프 묘사를 나타낸다.
[도 21] 도 21은 인간화된 항-IL-6 수용체 항체 Fv4-IgG1(도 21a), 그의 YTE 변체(도 21b) 및 LS 변체(도 21c)에 대한 30 명의 개별적인 RA 환자로부터의 혈청의 전기화학발광(ECL) 반응의 그래프 묘사를 나타낸다.
[도 22] 도 22는 인간화된 항-IL-6 수용체 항체 Fv4-IgG1 (도 22a), a Fv4-N434H (도 22b), Fv4-F11 (도 22c), Fv4-F68 (도 22d), Fv4-890 (도 22e) 및 Fv4-F947 (도 22f)에 대한 15 명의 개별적인 RA 환자로부터의 혈청의 전기화학발광(ECL) 반응의 그래프 묘사를 나타낸다.
[도 23] 도 23은 도 22에 도시된 Fv4-IgG1, Fv4-F11, Fv4-F68, Fv4-F890 및 Fv4-F947에 대한 15 명의 개별적인 RA 환자로부터의 혈청의 ECL 반응의 평균(도 23a), 기하평균(도 23b) 및 중앙값(도 23c)을 나타낸다.
[도 24] 도 24는 인간화된 항-IL-6 수용체 항체 Fv4-IgG1(도 24a) 및 변체 Fv4-F890, Fv4-F1058, Fv4-F1059, Fv4-F1060, Fv4-F1061, Fv4-F1062, Fv4-F1063, Fv4-F1064, Fv4-F1065, Fv4-F1066, Fv4-F1067, Fv4-F1068, Fv4-F1069, Fv4-F1070, Fv4-F1071, Fv4-F1072, 및 Fv4-F1073(도 24b 내지 도 24r)에 대한 15 명의 개별적인 RA 환자로부터의 혈청의 전기화학발광(ECL) 반응의 그래프 묘사를 나타낸다.
[도 25] 도 25는 도 24에 나타낸 Fv4-IgG1, 변체 Fv4-F890, Fv4-F1058, Fv4-F1059, Fv4-F1060, Fv4-F1061, Fv4-F1062, Fv4-F1063, Fv4-F1064, Fv4-F1065, Fv4-F1066, Fv4-F1067, Fv4-F1068, Fv4-F1069, Fv4-F1070, Fv4-F1071, Fv4-F1072, 및 Fv4-F1073에 대한 15 명의 개별적인 RA 환자로부터의 혈청의 ECL 반응의 평균(도 25a), 기하평균(도 25b) 및 중앙값(도 25c)을 나타낸다.
[도 26] 도 26은 변체 Fv-F1104, Fv4-F1105 및 Fv4-F1106에 대한 15 명의 개별적인 RA 환자로부터의 혈청의 전기화학발광(ECL) 반응의 그래프 묘사를 나타낸다.
[도 27] 도 27은 변체 Fv4-F1107, Fv4-F1108, Fv4-F1109, Fv4-F1110, Fv4-F1111, Fv4-F1112, Fv4-F1113, 및 Fv4-F1114(도 27a 내지 도 27h)에 대한 15 명의 개별적인 RA 환자로부터의 혈청의 전기화학발광(ECL) 반응의 그래프 묘사를 나타낸다.
[도 28] 도 28은 변체 Fv4-F1230 (도 28a), Fv4-F1231(도 28b), Fv4-F1232(도 28c)에 대한 15 명의 개별적인 RA 환자로부터의 혈청의 전기화학발광(ECL) 반응의 그래프 묘사를 나타낸다.
[도 29] 도 29는 변체 Fv4-F947, Fv4-F1119, Fv4-F1120, Fv4-F1121, Fv4-F1122, Fv4-F1123, 및 Fv4-F1124에 대한 15 명의 개별적인 RA 환자로부터의 혈청의 전기화학발광(ECL) 반응의 그래프 묘사를 나타낸다.
[도 30] 도 30a 내지 도 30d는 변체 Fv4-F939, Fv4-F1291, Fv4-F1268, 및 Fv4-F1269에 대한 15 명의 개별적인 RA 환자로부터의 혈청의 전기화학발광(ECL) 반응의 그래프 묘사를 나타낸다. 도 30e 내지 도 30i는 변체 Fv4-F1243, Fv4-F1245, Fv4-F1321, Fv4-F1340, 및 Fv4-F1323에 대한 30 명의 개별적인 RA 환자로부터의 혈청의 전기화학발광(ECL) 반응의 그래프 묘사를 나타낸다.
[도 31] 도 31은 변체 Fv4-F890(도 31a) 및 Fv4-F1115(=F890 + S424N, 도 31b)에 대한 15 명의 개별적인 RA 환자로부터의 혈청의 전기화학발광(ECL) 반응의 그래프 묘사를 나타낸다.
[도 32] 도 32는 변체 Fv4-YTE(도 32a), Fv4-F1166(=YTE + Q438R/S440E, 도 32b), Fv4-F1167(=YTE+S424N, 도 32c), Fv4-LS(도 32d), Fv4-F1170(=LS + Q438R/S440E, 도 32e), Fv4-F1171(LS + S424N, 도 32f), Fv4-N434H(도 32g), Fv4-F1172(=N434H + Q438R / S440E, 도 32h), Fv4-F1173(=N434H + S424N, 도 32i))에 대한 15 명 또는 30 명의 개별적인 RA 환자로부터의 혈청의 전기화학발광(ECL) 반응의 그래프 묘사를 나타낸다.
[도 33] 도 33은 변체 Fv4-LS, Fv4-F1380(도 33b), Fv4-F1384(도 33c), Fv4-F1385(도 33d), Fv4-F1386(LS + S426Y, 도 33e), Fv4-F1388(도 33f), 및 Fv4-F1389(LS + Y436T, 도 33g)에 대한 30 명의 개별적인 RA 환자로부터의 혈청의 전기화학발광(ECL) 반응의 그래프 묘사를 나타낸다.
[도 34] 도 34는 변체 F939에 대한 30 명의 개별적인 RA 환자로부터의 혈청의 전기화학발광(ECL) 반응의 그래프 묘사를 나타낸다.
[도 35] 도 35는 변체 F1378에 대한 30 명의 개별적인 RA 환자로부터의 혈청의 전기화학발광(ECL) 반응의 그래프 묘사를 나타낸다.
[도 36] 도 36은 변체 F1379에 대한 30 명의 개별적인 RA 환자로부터의 혈청의 전기화학발광(ECL) 반응의 그래프 묘사를 나타낸다.
[도 37] 도 37은 변체 F1262에 대한 30 명의 개별적인 RA 환자로부터의 혈청의 전기화학발광(ECL) 반응의 그래프 묘사를 나타낸다.
[도 38] 도 38은 변체 F1138에 대한 30 명의 개별적인 RA 환자로부터의 혈청의 전기화학발광(ECL) 반응의 그래프 묘사를 나타낸다.
[도 39] 도 39는 변체 F1344에 대한 30 명의 개별적인 RA 환자로부터의 혈청의 전기화학발광(ECL) 반응의 그래프 묘사를 나타낸다.
[도 40] 도 40은 변체 F1349에 대한 30 명의 개별적인 RA 환자로부터의 혈청의 전기화학발광(ECL) 반응의 그래프 묘사를 나타낸다.
[도 41] 도 41은 변체 F1350에 대한 30 명의 개별적인 RA 환자로부터의 혈청의 전기화학발광(ECL) 반응의 그래프 묘사를 나타낸다.
[도 42] 도 42는 변체 F1351에 대한 30 명의 개별적인 RA 환자로부터의 혈청의 전기화학발광(ECL) 반응의 그래프 묘사를 나타낸다.
[도 43] 도 43은 변체 F1261에 대한 30 명의 개별적인 RA 환자로부터의 혈청의 전기화학발광(ECL) 반응의 그래프 묘사를 나타낸다.
[도 44] 도 44는 변체 F1263에 대한 30 명의 개별적인 RA 환자로부터의 혈청의 전기화학발광(ECL) 반응의 그래프 묘사를 나타낸다.
[도 45] 도 45는 변체 F1305에 대한 30 명의 개별적인 RA 환자로부터의 혈청의 전기화학발광(ECL) 반응의 그래프 묘사를 나타낸다.
[도 46] 도 46은 변체 F1306에 대한 30 명의 개별적인 RA 환자로부터의 혈청의 전기화학발광(ECL) 반응의 그래프 묘사를 나타낸다.
[도 47] 도 47은 변체 F1268에 대한 30 명의 개별적인 RA 환자로부터의 혈청의 전기화학발광(ECL) 반응의 그래프 묘사를 나타낸다.
[도 48] 도 48은 변체 F1269에 대한 30 명의 개별적인 RA 환자로부터의 혈청의 전기화학발광(ECL) 반응의 그래프 묘사를 나타낸다.
[도 49] 도 49는 변체 F1413에 대한 30 명의 개별적인 RA 환자로부터의 혈청의 전기화학발광(ECL) 반응의 그래프 묘사를 나타낸다.
[도 50] 도 50은 변체 F1416에 대한 30 명의 개별적인 RA 환자로부터의 혈청의 전기화학발광(ECL) 반응의 그래프 묘사를 나타낸다.
[도 51] 도 51은 변체 F1419에 대한 30 명의 개별적인 RA 환자로부터의 혈청의 전기화학발광(ECL) 반응의 그래프 묘사를 나타낸다.
[도 52] 도 52는 변체 F1420에 대한 30 명의 개별적인 RA 환자로부터의 혈청의 전기화학발광(ECL) 반응의 그래프 묘사를 나타낸다.
[도 53] 도 53은 변체 F1370에 대한 30 명의 개별적인 RA 환자로부터의 혈청의 전기화학발광(ECL) 반응의 그래프 묘사를 나타낸다.
[도 54] 도 54는 변체 F1371에 대한 30 명의 개별적인 RA 환자로부터의 혈청의 전기화학발광(ECL) 반응의 그래프 묘사를 나타낸다.
[도 55] 도 55는 변체 F1599에 대한 30 명의 개별적인 RA 환자로부터의 혈청의 전기화학발광(ECL) 반응의 그래프 묘사를 나타낸다.
[도 56] 도 56은 변체 F1600에 대한 30 명의 개별적인 RA 환자로부터의 혈청의 전기화학발광(ECL) 반응의 그래프 묘사를 나타낸다.
[도 57] 도 57은 변체 F1566에 대한 30 명의 개별적인 RA 환자로부터의 혈청의 전기화학발광(ECL) 반응의 그래프 묘사를 나타낸다.
[도 58] 도 58은 변체 F1448에 대한 30 명의 개별적인 RA 환자로부터의 혈청의 전기화학발광(ECL) 반응의 그래프 묘사를 나타낸다.
[도 59] 도 59는 변체 F1601에 대한 30 명의 개별적인 RA 환자로부터의 혈청의 전기화학발광(ECL) 반응의 그래프 묘사를 나타낸다.
[도 60] 도 60은 변체 F1602에 대한 30 명의 개별적인 RA 환자로부터의 혈청의 전기화학발광(ECL) 반응의 그래프 묘사를 나타낸다.
[도 61] 도 61은 변체 F1603에 대한 30 명의 개별적인 RA 환자로부터의 혈청의 전기화학발광(ECL) 반응의 그래프 묘사를 나타낸다.
[도 62] 도 62는 변체 F1531에 대한 30 명의 개별적인 RA 환자로부터의 혈청의 전기화학발광(ECL) 반응의 그래프 묘사를 나타낸다.
[도 63] 도 63은 변체 F1604에 대한 30 명의 개별적인 RA 환자로부터의 혈청의 전기화학발광(ECL) 반응의 그래프 묘사를 나타낸다.
[도 64] 도 64는 변체 F1605에 대한 30 명의 개별적인 RA 환자로부터의 혈청의 전기화학발광(ECL) 반응의 그래프 묘사를 나타낸다.
[도 65] 도 65는 변체 F1586에 대한 30 명의 개별적인 RA 환자로부터의 혈청의 전기화학발광(ECL) 반응의 그래프 묘사를 나타낸다.
[도 66] 도 66은 변체 F1592에 대한 30 명의 개별적인 RA 환자로부터의 혈청의 전기화학발광(ECL) 반응의 그래프 묘사를 나타낸다.
[도 67] 도 67은 변체 F1610에 대한 30 명의 개별적인 RA 환자로부터의 혈청의 전기화학발광(ECL) 반응의 그래프 묘사를 나타낸다.
[도 68] 도 68은 변체 F1611에 대한 30 명의 개별적인 RA 환자로부터의 혈청의 전기화학발광(ECL) 반응의 그래프 묘사를 나타낸다.
[도 69] 도 69는 변체 F1612에 대한 30 명의 개별적인 RA 환자로부터의 혈청의 전기화학발광(ECL) 반응의 그래프 묘사를 나타낸다.
[도 70] 도 70은 변체 F1613에 대한 30 명의 개별적인 RA 환자로부터의 혈청의 전기화학발광(ECL) 반응의 그래프 묘사를 나타낸다.
[도 71] 도 71은 변체 F1614에 대한 30 명의 개별적인 RA 환자로부터의 혈청의 전기화학발광(ECL) 반응의 그래프 묘사를 나타낸다.
[도 72] 도 72는 변체 F1615에 대한 30 명의 개별적인 RA 환자로부터의 혈청의 전기화학발광(ECL) 반응의 그래프 묘사를 나타낸다.
[도 73] 도 73은 변체 F1567에 대한 30 명의 개별적인 RA 환자로부터의 혈청의 전기화학발광(ECL) 반응의 그래프 묘사를 나타낸다.
[도 74] 도 74는 변체 F1572에 대한 30 명의 개별적인 RA 환자로부터의 혈청의 전기화학발광(ECL) 반응의 그래프 묘사를 나타낸다.
[도 75] 도 75는 변체 F1576에 대한 30 명의 개별적인 RA 환자로부터의 혈청의 전기화학발광(ECL) 반응의 그래프 묘사를 나타낸다.
[도 76] 도 76은 변체 F1578에 대한 30 명의 개별적인 RA 환자로부터의 혈청의 전기화학발광(ECL) 반응의 그래프 묘사를 나타낸다.
[도 77] 도 77은 변체 F1579에 대한 30 명의 개별적인 RA 환자로부터의 혈청의 전기화학발광(ECL) 반응의 그래프 묘사를 나타낸다.
[도 78] 도 78은 변체 F1641에 대한 30 명의 개별적인 RA 환자로부터의 혈청의 전기화학발광(ECL) 반응의 그래프 묘사를 나타낸다.
[도 79] 도 79는 변체 F1642에 대한 30 명의 개별적인 RA 환자로부터의 혈청의 전기화학발광(ECL) 반응의 그래프 묘사를 나타낸다.
[도 80] 도 80은 변체 F1643에 대한 30 명의 개별적인 RA 환자로부터의 혈청의 전기화학발광(ECL) 반응의 그래프 묘사를 나타낸다.
[도 81] 도 81은 변체 F1644에 대한 30 명의 개별적인 RA 환자로부터의 혈청의 전기화학발광(ECL) 반응의 그래프 묘사를 나타낸다.
[도 82] 도 82는 변체 F1645에 대한 30 명의 개별적인 RA 환자로부터의 혈청의 전기화학발광(ECL) 반응의 그래프 묘사를 나타낸다.
[도 83] 도 83은 변체 F1646에 대한 30 명의 개별적인 RA 환자로부터의 혈청의 전기화학발광(ECL) 반응의 그래프 묘사를 나타낸다.
[도 84] 도 84는 변체 F1647에 대한 30 명의 개별적인 RA 환자로부터의 혈청의 전기화학발광(ECL) 반응의 그래프 묘사를 나타낸다.
[도 85] 도 85는 변체 F1648에 대한 30 명의 개별적인 RA 환자로부터의 혈청의 전기화학발광(ECL) 반응의 그래프 묘사를 나타낸다.
[도 86] 도 86은 변체 F1649에 대한 30 명의 개별적인 RA 환자로부터의 혈청의 전기화학발광(ECL) 반응의 그래프 묘사를 나타낸다.
[도 87] 도 87은 변체 F1650에 대한 30 명의 개별적인 RA 환자로부터의 혈청의 전기화학발광(ECL) 반응의 그래프 묘사를 나타낸다.
[도 88] 도 88은 변체 F1651에 대한 30 명의 개별적인 RA 환자로부터의 혈청의 전기화학발광(ECL) 반응의 그래프 묘사를 나타낸다.
[도 89] 도 89는 변체 F1652에 대한 30 명의 개별적인 RA 환자로부터의 혈청의 전기화학발광(ECL) 반응의 그래프 묘사를 나타낸다.
[도 90] 도 90은 변체 F1653에 대한 30 명의 개별적인 RA 환자로부터의 혈청의 전기화학발광(ECL) 반응의 그래프 묘사를 나타낸다.
[도 91] 도 91은 변체 F1654에 대한 30 명의 개별적인 RA 환자로부터의 혈청의 전기화학발광(ECL) 반응의 그래프 묘사를 나타낸다.
[도 92] 도 92는 변체 F1655에 대한 30 명의 개별적인 RA 환자로부터의 혈청의 전기화학발광(ECL) 반응의 그래프 묘사를 나타낸다.
[도 93] 도 93은 변체 F1329에 대한 30 명의 개별적인 RA 환자로부터의 혈청의 전기화학발광(ECL) 반응의 그래프 묘사를 나타낸다.
[도 94] 도 94는 변체 F1331에 대한 30 명의 개별적인 RA 환자로부터의 혈청의 전기화학발광(ECL) 반응의 그래프 묘사를 나타낸다.
[도 95] 도 95는 변체 F1718에 대한 30 명의 개별적인 RA 환자로부터의 혈청의 전기화학발광(ECL) 반응의 그래프 묘사를 나타낸다.
[도 96] 도 96은 변체 F1719에 대한 30 명의 개별적인 RA 환자로부터의 혈청의 전기화학발광(ECL) 반응의 그래프 묘사를 나타낸다.
[도 97] 도 97은 변체 F1720에 대한 30 명의 개별적인 RA 환자로부터의 혈청의 전기화학발광(ECL) 반응의 그래프 묘사를 나타낸다.
[도 98] 도 98은 변체 F1721에 대한 30 명의 개별적인 RA 환자로부터의 혈청의 전기화학발광(ECL) 반응의 그래프 묘사를 나타낸다.
[도 99] 도 99는 변체 F1671에 대한 30 명의 개별적인 RA 환자로부터의 혈청의 전기화학발광(ECL) 반응의 그래프 묘사를 나타낸다.
[도 100] 도 100은 변체 F1670에 대한 30 명의 개별적인 RA 환자로부터의 혈청의 전기화학발광(ECL) 반응의 그래프 묘사를 나타낸다.
[도 101] 도 101은 변체 F1711에 대한 30 명의 개별적인 RA 환자로부터의 혈청의 전기화학발광(ECL) 반응의 그래프 묘사를 나타낸다.
[도 102] 도 102는 변체 F1712에 대한 30 명의 개별적인 RA 환자로부터의 혈청의 전기화학발광(ECL) 반응의 그래프 묘사를 나타낸다.
[도 103] 도 103은 변체 F1713에 대한 30 명의 개별적인 RA 환자로부터의 혈청의 전기화학발광(ECL) 반응의 그래프 묘사를 나타낸다.
[도 104] 도 104는 변체 F1722에 대한 30 명의 개별적인 RA 환자로부터의 혈청의 전기화학발광(ECL) 반응의 그래프 묘사를 나타낸다.
[도 105] 도 105는 변체 F1723에 대한 30 명의 개별적인 RA 환자로부터의 혈청의 전기화학발광(ECL) 반응의 그래프 묘사를 나타낸다.
[도 106] 도 106은 변체 F1724에 대한 30 명의 개별적인 RA 환자로부터의 혈청의 전기화학발광(ECL) 반응의 그래프 묘사를 나타낸다.
[도 107] 도 107은 변체 F1725에 대한 30 명의 개별적인 RA 환자로부터의 혈청의 전기화학발광(ECL) 반응의 그래프 묘사를 나타낸다.
[도 108] 도 108은 변체 F1675에 대한 30 명의 개별적인 RA 환자로부터의 혈청의 전기화학발광(ECL) 반응의 그래프 묘사를 나타낸다.
[도 109] 도 109는 변체 F1714에 대한 30 명의 개별적인 RA 환자로부터의 혈청의 전기화학발광(ECL) 반응의 그래프 묘사를 나타낸다.
[도 110] 도 110은 변체 F1715에 대한 30 명의 개별적인 RA 환자로부터의 혈청의 전기화학발광(ECL) 반응의 그래프 묘사를 나타낸다.
[도 111] 도 111은 변체 F1716에 대한 30 명의 개별적인 RA 환자로부터의 혈청의 전기화학발광(ECL) 반응의 그래프 묘사를 나타낸다.
[도 112] 도 112는 변체 F1717에 대한 30 명의 개별적인 RA 환자로부터의 혈청의 전기화학발광(ECL) 반응의 그래프 묘사를 나타낸다.
[도 113] 도 113은 변체 F1683에 대한 30 명의 개별적인 RA 환자로부터의 혈청의 전기화학발광(ECL) 반응의 그래프 묘사를 나타낸다.
[도 114] 도 114는 변체 F1756에 대한 30 명의 개별적인 RA 환자로부터의 혈청의 전기화학발광(ECL) 반응의 그래프 묘사를 나타낸다.
[도 115] 도 115는 변체 F1757에 대한 30 명의 개별적인 RA 환자로부터의 혈청의 전기화학발광(ECL) 반응의 그래프 묘사를 나타낸다.
[도 116] 도 116은 변체 F1758에 대한 30 명의 개별적인 RA 환자로부터의 혈청의 전기화학발광(ECL) 반응의 그래프 묘사를 나타낸다.
[도 117] 도 117은 변체 F1759에 대한 30 명의 개별적인 RA 환자로부터의 혈청의 전기화학발광(ECL) 반응의 그래프 묘사를 나타낸다.
[도 118] 도 118은 변체 F1681에 대한 30 명의 개별적인 RA 환자로부터의 혈청의 전기화학발광(ECL) 반응의 그래프 묘사를 나타낸다.
[도 119] 도 119는 변체 F1749에 대한 30 명의 개별적인 RA 환자로부터의 혈청의 전기화학발광(ECL) 반응의 그래프 묘사를 나타낸다.
[도 120] 도 120은 변체 F1750에 대한 30 명의 개별적인 RA 환자로부터의 혈청의 전기화학발광(ECL) 반응의 그래프 묘사를 나타낸다.
[도 121] 도 121은 변체 F1751에 대한 30 명의 개별적인 RA 환자로부터의 혈청의 전기화학발광(ECL) 반응의 그래프 묘사를 나타낸다.
[도 122] 도 122는 변체 F1760에 대한 30 명의 개별적인 RA 환자로부터의 혈청의 전기화학발광(ECL) 반응의 그래프 묘사를 나타낸다.
[도 123] 도 123은 변체 F1761에 대한 30 명의 개별적인 RA 환자로부터의 혈청의 전기화학발광(ECL) 반응의 그래프 묘사를 나타낸다.
[도 124] 도 124는 변체 F1762에 대한 30 명의 개별적인 RA 환자로부터의 혈청의 전기화학발광(ECL) 반응의 그래프 묘사를 나타낸다.
[도 125] 도 125는 변체 F1763에 대한 30 명의 개별적인 RA 환자로부터의 혈청의 전기화학발광(ECL) 반응의 그래프 묘사를 나타낸다.
[도 126] 도 126은 변체 F1752에 대한 30 명의 개별적인 RA 환자로부터의 혈청의 전기화학발광(ECL) 반응의 그래프 묘사를 나타낸다.
[도 127] 도 127은 변체 F1753에 대한 30 명의 개별적인 RA 환자로부터의 혈청의 전기화학발광(ECL) 반응의 그래프 묘사를 나타낸다.
[도 128] 도 128은 변체 F1754에 대한 30 명의 개별적인 RA 환자로부터의 혈청의 전기화학발광(ECL) 반응의 그래프 묘사를 나타낸다.
[도 129] 도 129는 변체 F1755에 대한 30 명의 개별적인 RA 환자로부터의 혈청의 전기화학발광(ECL) 반응의 그래프 묘사를 나타낸다.
[도 130] 도 130은 변체 F1685에 대한 30 명의 개별적인 RA 환자로부터의 혈청의 전기화학발광(ECL) 반응의 그래프 묘사를 나타낸다.
[도 131] 도 131은 Fv4-IgG1, Fv4-F1243, 및 Fv4-F1245의 주사 후의 인간 FcRn 트랜스제닉 마우스에서 시간에 따른 혈장 항체 농도의 그래프 묘사를 나타낸다.
[도 132] 도 132는 Fv4-IgG1, Fv4-F1243, 및 Fv4-F1245의 주사 후의 인간 FcRn 트랜스제닉 마우스 및 대조용 마우스(항체 주사 없음)에서 시간에 따른 혈장 항원(hsIL-6R) 농도농도의 그래프 묘사를 나타낸다.
[도 133] 도 133은 Fv4-IgG1, Fv4-F1389의 주사 후의 인간 FcRn 트랜스제닉 마우스에서 시간에 따른 혈장 항체 농도의 그래프 묘사를 나타낸다.
[도 134] 도 134는 SPR 분석의 센서그램을 나타낸다. 항-hIgA 항체의 hIgA 결합을 상이한 조건(pH, Ca-농도) 하에서 분석하였다.
[도 135] 도 135는 GA2-F760 및 GA2-F1331의 주사 후의 인간 FcRn 트랜스제닉 마우스에서 시간에 따른 혈장 항체 농도의 그래프 묘사를 나타낸다.
[도 136] 도 136은 GA2-F760 및 GA2-F1331의 주사 후의 인간 FcRn 트랜스제닉 마우스에서 시간에 따른 혈장 hIgA 농도의 그래프 묘사를 나타낸다.
[도 137] 도 137은 278-F760 및 278-F1331의 주사 후의 인간 FcRn 트랜스제닉 마우스에서 시간에 따른 혈장 항체 농도의 그래프 묘사를 나타낸다.
[도 138] 도 138은 278-F760 및 278-F1331의 주사 후의 인간 FcRn 트랜스제닉 마우스에서 시간에 따른 혈장 hIgE(Asp6) 농도의 그래프 묘사를 나타낸다.

발명의 상세한 설명

본 발명의 물질 및 방법을 개시하기 전에, 이들 명세가 단지 예시적일 뿐이며 제한하고자 하지 않음은 물론이다. 본 발명이 본 원에 개시된 특정한 크기, 모양, 치수, 물질, 방법, 프로토콜 등(이들은 통상적인 실험 및/또는 최적화에 따라 변화될 수 있으므로)으로 제한되지 않음은 또한 물론이다. 본 명세에 사용된 용어는 단지 특정한 버전이나 실시태양을 개시하기 위한 것이며, 오직 첨부된 청구의 범위에 의해서만 제한되는 본 발명의 범위를 제한하고자 하지 않는다. 달리 정의되지 않는 한, 본 발명에 사용된 모든 기술과학 용어들은 본 발명이 속하는 분야의 통상적인 숙련가에 의해 통상적으로 이해되는 바와 동일한 의미를 갖는다. 상충되는 경우, 정의를 포함하여, 본 명세서가 지배할 것이다.

본 명세서에서 언급된 각각의 공보, 특허 또는 특허 출원의 명세는 내용 전체가 본 발명에 구체적으로 참고로 인용된다. 그러나, 본 발명이 선행 발명에 의해 상기와 같은 명세에 앞서는 자격을 받지 못한다는 승인으로서 해석되는 것은 결코 아니다.

본 발명에 사용된 바와 같은 단어 "하나의" 및 "상기"는 구체적으로 달리 지시되지 않는 한 "하나 이상"을 의미한다.

WO/2011/122011에 개시된 연구는 pH 7.4에서 FcRn에 대해 증가된 결합을 갖는 항원-결합 분자(예를 들어 항-IL6 수용체 항체)가 혈장으로부터 항원을 제거할 수 있고 혈장 중 총 항원 농도를 감소시킬 수 있으며, 따라서 항원 제거 효율을 pH-의존적인 항원 결합(pH 7.4에서 혈장 내에서 항원에 결합하고 pH 6.0에서 산성 엔도솜 내에서 상기 항원을 해리한다)에 의해서 또는 이온화된 칼슘 농도-의존적인 항원 결합(높은 이온화된 칼슘 농도에서 혈장 내에서 항원에 결합하고 낮은 이온화된 칼슘 농도에서 엔도솜 내에서 상기 항원을 해리한다)에 의해서 개선시킬 수 있음을 입증하였다(도 1B 참조). 통상적인 항체에 비해 중성 pH에서 FcRn에 대해 개선된 결합 친화성을 갖는 pH-의존성 항원 결합 항체에 의해 혈장으로부터 항원을 제거하는 기전이 도 1A에 도시되어 있다.

본 발명은 산성 및 중성 pH 범위에서 항원-결합 분자의 FcRn 결합 활성을 증가시키는 FcRn-결합 도메인 중의 신규의 아미노산 치환을 제공하며, 여기에서 중성 pH 범위에서 상기 FcRn-결합 활성은 본래의 IgG 및 본래의 FcRn-결합 도메인을 포함하는 항원-결합 분자 중 하나보다 더 강하다(예를 들어 3200 nM 초과이다). 상기 변형된 항원-결합 분자는 투여 후, 동일한 항원-결합 도메인, 그러나 본래의 인간 IgG FcRn-결합 도메인을 포함하는 대조용 항원-결합 분자보다 더 혈장 중 총 항원 농도를 감소시킬 수 있다.

Fc 수용체는 천연 살해 세포, 대식세포, 호중구 및 비만 세포와 같은 면역 세포의 표면상 단백질이다. 상기 수용체는, 감염된 세포 또는 침입 병원체에 결합된 항체의 Fc(단편, 결정화 가능한) 영역에 결합하고 식세포 또는 세포독성 세포를 자극하여, 항체-매개된 식작용 또는 항체-의존적인 세포-매개된 세포독성에 의해 미생물 또는 감염된 세포를 파괴한다.

다수의 상이한 유형의 Fc 수용체들이 존재하며, 이들을 인식하는 항체의 유형을 기준으로 분류된다. 본 발명에서, "FcRn"이란 용어는 IgG에 결합하고, MHC 부류 I 단백질과 구조가 유사하며, 인간에서 FCGRT 유전자에 의해 암호화되는 신생아 Fc 수용체를 지칭한다.

본 발명에 사용된 바와 같은 "FcRn 결합 도메인"이란 용어는 상기 FcRn에 직접적으로 또는 간접적으로 결합하는 단백질 도메인을 지칭한다. 바람직하게는 상기 FcRn은 포유동물 FcRn, 보다 바람직하게는 인간 FcRn이다. FcRn에 직접 결합하는 FcRn 결합 도메인은 항체 Fc 영역이다. 한편으로, 인간 FcRn-결합 활성을 갖는 알부민 또는 IgG와 같은 폴리펩타이드에 결합할 수 있는 영역들은 알부민, IgG 또는 상기와 같은 것들을 통해 인간 FcRn에 간접적으로 결합할 수 있다. 따라서, 상기와 같은 인간 FcRn-결합 영역은 인간 FcRn-결합 활성을 갖는 폴리펩타이드에 결합하는 영역일 수 있다.

본 발명에 사용된 바와 같은 "Fc 영역" 또는 "항원-결합 분자의 Fc 영역"이란 용어는 FcRn, 바람직하게는 포유동물 FcRn, 보다 바람직하게는 인간 FcRn에 직접적으로 결합하는 FcRn-결합 도메인을 지칭한다. 특히, Fc 영역은 항체의 Fc 영역이다. 바람직하게는, 상기 Fc 영역은 포유동물 Fc 영역, 보다 바람직하게는 인간 Fc 영역이다. 특히, 본 발명의 Fc 영역은 인간 면역글로불린의 제 2 및 제 3 불변 도메인(CH2 및 CH3), 보다 바람직하게는 힌지, CH2 및 CH3를 포함하는 Fc 영역이다. 바람직하게는, 상기 면역글로불린은 IgG이다. 바람직하게는, 상기 Fc 영역은 인간 IgG1의 Fc 영역이다.

본 발명은 변형된 FcRn-결합 도메인을 갖는 항원-결합 분자를 제공하며, 여기에서 상기 항원-결합 분자는 본래의 FcRn-결합 도메인을 갖는 항원-결합 분자에 비해 중성 pH 범위에서 증가된 FcRn-결합 활성을 갖는다.

특히, 본 발명은 EU238, EU250, EU252, EU254, EU255, EU258 EU286, EU307, EU308, EU309, EU311, EU315, EU428, EU433, EU434, 및 EU436으로 이루어진 그룹 중에서 선택된 하나 이상의 위치에서 FcRn-결합 도메인 중의 아미노산 치환을 갖는 변형된 FcRn-결합 도메인을 갖는 항원-결합 분자를 제공한다. 본 발명의 항원-결합 분자는 또한 추가의 위치들에서의 치환을 포함할 수도 있다. 예를 들어, 상기 항원-결합 분자는 상기 언급한 하나 이상의 위치들에서의 치환 외에 EU256 위치에서의 치환을 포함할 수 있다. 바람직하게는, EU256 위치에서의 아미노산은 글루탐산으로 치환된다.

"결합 친화성" 또는 "결합 활성"이란 용어는 달리 명백히 정의되지 않는 한, 2 개 물질에 의해 형성된 복합체의 해리 상수(KD)에 의해 측정된 바와 같은 상기 두 물질들 간의 비-공유 상호작용의 강도를 지칭한다. 결합 단백질(또는 "리간드")는 예를 들어 특정 표적 분자, 예를 들어 FcRn에 대해 10^-5, 10^-6, 10^-7 또는 10^-8 M 미만의 KD를 가질 수 있다. 제 2 pH 범위에서 표적에 비해 제 1 pH 범위에서 표적에 결합하는 리간드의 보다 높은 결합 친화성은 상기 제 2 pH 범위에서 상기 표적에 결합하기 위한 수치 KD보다 더 작은, 상기 제 1 pH 범위에서의 상기 표적에 결합하기 위한 수치 KD에 의해 나타날 수 있다. 결합 친화성의 차이는 1.5, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 50, 70, 80, 100, 500, 또는 1000 배 이상일 수 있다. 결합 친화성을 다양한 방법들, 예를 들어 표면 플라스몬 공명, 평형 투석, 평형 결합, 젤 여과, ELISA, 또는 분광분석법(예를 들어 형광 분석을 사용하는)에 의해 측정할 수 있다.

pH 범위에서 FcRn에 대한 FcRn-결합 도메인의 증가된 결합 친화성은 본래의 FcRn-결합 도메인에 대해 측정된 FcRn-결합 친화성과 비교 측정된 상기 FcRn-결합 친화성의 증가에 상응한다. KD(본래의)/KD(변체)의 결합 친화성의 차이는 1.5, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 50, 70, 80, 100, 500, 또는 1000 이상이다. FcRn에 대한 FcRn-결합 도메인의 증가된 결합 친화성은 산성 또는 중성 pH 범위 중에 있을 수 있다.

"본래의 FcRn 결합 도메인을 포함하는 항원-결합 분자"란 용어는 변형되지 않은 FcRn-결합 도메인을 포함하는 항원-결합 분자를 지칭한다. 본 발명에 사용된 바와 같은 "본래의 IgG FcRn-결합 도메인"이란 용어는 인간 IgG의 변형되지 않은 FcRn-결합 도메인을 지칭한다. 특히, 상기 FcRn-결합 도메인은 본래의 인간 IgG의 FcRn-결합 도메인이다. 바람직하게는, 본래의 FcRn-결합 도메인은 본래의 Fc 영역이다. "본래의 Fc 영역을 포함하는 항체"란 용어는 변형되지 않은 Fc 영역을 포함하는 항체를 지칭한다. 변형되지 않은 Fc 영역이 기원하는 항체는 바람직하게는 IgG이다. 보다 바람직하게는 상기는 인간 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4, 더욱 더 바람직하게는 인간 IgG1이다. 본 발명의 특히 바람직한 실시태양에서 본래의 Fc 영역을 포함하는 항체는 변형되지 않은 Fc 영역을 포함하는 항체이다. 본래의 Fc 영역을 포함하는 항체는 본래의 인간 IgG일 수 있다.

본 발명에 사용된 바와 같은 "본래의 IgG"란 용어는 변형되지 않은 IgG를 지칭하며 IgG의 특정 부류로 제한되지 않는다. 이는 인간 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 또는 이들의 알로타입 변체를, 상기 변체가 산성 pH 범위에서 인간 FcRn에 결합할 수 있는 한, "본래의 인간 IgG"로서 사용할 수 있음을 의미한다. 바람직하게는, "본래의 IgG"는 인간 IgG1이다. 바람직하게는 본래의 IgG는 야생형 Fc 영역을 포함하는 IgG이다.

본 발명과 관련하여, 중성 pH 범위에서 항원-결합 분자의 증가된 FcRn-결합 활성은 바람직하게는 KD 3.2 마이크로몰 초과이다. 바람직하게는, 상기 중성 pH 범위에서 증가된 FcRn-결합 활성은 700 나노몰 초과, 보다 바람직하게는 500 나노몰 초과 및 가장 바람직하게는 150 나노몰 초과이다.

산성 pH 범위에서 본 발명의 항원-결합 분자의 증가된 FcRn-결합 활성은 일반적으로 본래의 IgG의 FcRn-결합 활성보다 약 2 배 내지 약 100 배 초과 범위의 FcRn-결합 활성이다. 바람직하게는 산성 pH 범위에서 항원-결합 분자의 증가된 FcRn-결합 활성은 본래의 IgG의 FcRn-결합 활성보다 10 배 이상 더 강하다. 보다 바람직하게는, 상기 산성 pH 범위에서 본 발명의 항원-결합 분자의 증가된 FcRn-결합 활성은 본래의 IgG의 FcRn-결합 활성보다 20 배 이상 더 강하다.

본 발명에 사용된 바와 같은 "중성 pH 범위" 및 "중성 pH"란 용어들은 전형적으로 pH 6.7 내지 pH 10.0, 바람직하게는 pH 7.0 내지 pH 8.0 내의 임의의 pH 값을 지칭하며, 이의 예는 pH 7.0, 7.1, 7.2, 7.3, 7.4, 7.5, 7.6, 7.7, 7.8, 7.9, 및 8.0을 포함한다. 특히 바람직한 산성 pH 값은 pH 7.4이며, 이는 생체 내 혈장(혈액) pH에 가깝다.

본 발명에 사용된 바와 같은 "산성 pH 범위" 및 "산성 pH"란 용어들은 전형적으로 pH 4.0 내지 pH 6.5, 바람직하게는 pH 5.5 내지 pH 6.5 내의 임의의 pH 값을 지칭하며, 이의 예는 pH 5.5, 5.6, 5.7, 5.8, 5.9, 6.0, 6.1, 6.2, 6.3, 6.4, 및 6.5를 포함한다. 특히 바람직한 산성 pH 값은 pH 5.8 내지 pH 6.0의 범위이며, 이는 생체 내 초기 엔소솜 중의 pH에 가깝다.

본 출원에서 지칭된 아미노산 위치, 예를 들어 "EU387" 또는 "387 위치"는 달리 나타내지 않는 한, EU 넘버링 시스템(문헌[Kabat, E. A., T. T. Wu, H. M. Perry, K. S. Gottesman, C. Foeler. 1991. Sequences of Proteins of Immunological Interest. No. 91-3242 U. S. Public Health Services, National Institutes of Health, Bethesda])이라 칭하는 도표에 따라 넘버링되며 FcRn-결합 도메인, 특히 Fc 영역 중의 위치들을 지칭한다. 유사한 방식으로, 치환을 예를 들어 "EU387R" 또는 "EU440E"로서 나타내며, 여기에서 "EU" 뒤에 주어진 숫자는 상기 EU 넘버링에 따른 치환의 위치를 가리키고 상기 숫자 뒤의 문자는 한문자 코드로 제공된 치환된 아미노산이다. 치환을 또한 (아미노산 1)-위치-(아미노산 2)로서 쓸 수 있으며, 이때 첫 번째 아미노산은 명시된 위치에서 치환된 아미노산이고 두 번째 아미노산은 치환하는 아미노산이다.

본 발명에 사용된 바와 같은 "치환" 및 "아미노산의 치환"이란 용어는 아미노산 서열 중의 아미노산의 또 다른 아미노산에 의한 교체를 지칭하며, 여기에서 후자의 아미노산은 상기 교체된 아미노산과 상이하다. 아미노산의 교체 방법은 당해 분야의 숙련가에게 널리 공지되어 있으며, 비제한적으로 상기 아미노산 서열을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열의 돌연변이를 포함한다.

보다 특히, FcRn-결합 도메인 중의 아미노산의 치환은 모 FcRn-결합 도메인의 아미노산 서열과 관련된 아미노산의 교체를 지칭한다. 이미 목적하는 치환을 갖는 변형된 FcRn-결합 도메인이 또한 본 발명의 FcRn-결합 도메인에 포함된다. 모 FcRn-결합 도메인은 EU238 위치에서 프롤린, EU250 위치에서 쓰레오닌, EU252 위치에서 메티오닌, EU254 위치에서 세린, EU255 위치에서 아르기닌, EU256 위치에서 쓰레오닌, EU258 위치에서 글루탐산, EU286 위치에서 아스파라긴, EU307 위치에서 쓰레오닌, EU308 위치에서 발린, EU309 위치에서 류신, EU311 위치에서 글루타민, EU315 위치에서 아스파라긴, EU387 위치에서 프롤린, EU422 위치에서 발린, EU424 위치에서 세린, EU426 위치에서 세린, EU428 위치에서 메티오닌, EU433 위치에서 히스티딘, EU434 위치에서 아스파라긴, EU436 위치에서 타이로신, EU438 위치에서 글루타민, 및 EU440 위치에서 세린을 갖고 중성 pH에서 FcRn에 대해 낮은 친화성(3200 nM 미만)을 갖거나 친화성을 갖지 않는 FcRn-결합 도메인이다. 상기 모 FcRn-결합 도메인은 다른 위치들에서 치환을 포함할 수도 있지만, 바람직하게는 상기 모 FcRn-결합 도메인은 변형되지 않는다. 바람직하게는, 상기 모 FcRn 결합 도메인은 Fc 영역(모 Fc 영역)이다. 바람직하게는, 상기 모 Fc 영역은 포유동물 항체로부터 유래되며; 보다 바람직하게는, 상기 모 Fc 영역은 인간 항체의 Fc 영역이다. 인간 항체의 Fc 영역을 본 발명에서는 인간 Fc 영역이라 칭한다.

모 Fc 영역은 바람직하게는 본래의 Fc 영역, 보다 바람직하게는 인간 본래의 Fc 영역이다. 바람직하게는, 상기 모 Fc 영역은 IgG, 보다 바람직하게는 인간 IgG의 Fc 영역이다. 훨씬 더 바람직하게는, 모 Fc 영역은 야생형 힌지, 야생형 CH2 및 야생형 CH3 도메인을 포함하는 인간 Fc 영역이다. 본 발명과 관련하여, 모 항체란 용어는 모 Fc 영역을 포함하는 항체를 지칭한다.

모 항원-결합 분자는 비제한적으로 수용체 단백질(막-결합된 수용체 및 가용성 수용체), 세포 표면 마커와 같은 막 항원을 인식하는 항체, 및 사이토킨과 같은 가용성 항원을 인식하는 항체를 포함한다.

본 발명에 사용된 바와 같은 "모 항원-결합 분자"란 용어는 모 FcRn-결합 도메인을 갖는 항원-결합 분자를 지칭한다. "모 항원-결합 분자"의 기원은 제한되지 않으며 상기 항체는 비인간 동물 또는 인간의 임의의 기원으로부터 수득될 수 있다. 바람직하게, 상기 유기체는 마우스, 래트, 기니 피그, 햄스터, 모래쥐, 고양이, 토끼, 개, 염소, 양, 소, 말, 낙타, 및 비인간 영장류로 이루어진 그룹 중에서 선택된다. 또 다른 실시태양에서, "모 항원-결합 분자"는 또한 키노몰구스 원숭이, 마모셋, 붉은털 원숭이, 침팬지 또는 인간으로부터 수득될 수 있다. 상기 모 IgG는 천연 IgG, 또는 천연 IgG의 변체 또는 조작된 버전일 수 있다. 모 IgG는 폴리펩타이드 자체, 상기 모 IgG를 포함하는 조성물, 또는 상기를 암호화하는 아미노산 서열을 지칭할 수 있다. "모 IgG"가 하기에 개략된 바와 같은 공지된 상업적, 재조합적으로 생산된 IgG를 포함함을 알아야 한다. 바람직하게는, "모 IgG"는 인간 IgG1으로부터 수득되지만, IgG의 특정 부류로 제한되지 않는다. 이는 인간 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4가 "모 IgG"로서 적합하게 사용될 수 있음을 의미한다. 유사한 방식으로, 앞서 본 발명에 개시된 임의의 유기체로부터의 IgG의 임의의 하위부류를 바람직하게는 "모 IgG"로서 사용할 수 있다. 천연 IgG의 변체 또는 조작된 버전의 예는 문헌[Curr Opin Biotechnol. 2009 Dec; 20(6): 685-91], [Curr Opin Immunol. 2008 Aug; 20(4): 460-70], [Protein Eng Des Sel. 2010 Apr; 23(4): 195-202], WO 2009/086320, WO 2008/092117, WO 2007/041635 및 WO 2006/105338에 개시되어 있으나, 이들로 제한되지 않는다.

본 발명의 FcRn-결합 도메인 또는 Fc 영역은, 본 발명에서 치환들의 "조합"으로서 지칭되는 2 개 이상 위치에서의 치환을 포함할 수도 있다. 예를 들어 조합 "EU424/EU434/EU436"에 의해 한정된 Fc 영역은 EU424, EU434 및 EU436 위치에서의 치환을 포함하는 Fc 영역이다.

상기 치환 아미노산(모 FcRn-결합 도메인 중의 아미노산을 치환하는 아미노산)은 본 발명에서 달리 구체적으로 언급되지 않는 한 임의의 아미노산, 예를 들어 비제한적으로 알라닌(Ala, A), 아르기닌(arg, R), 아스파라긴(asn, N), 아스파트산(asp, D), 시스테인(cys, C), 글루탐산(glu, E), 글루타민(gln, Q), 글리신(gly, G), 히스티딘(his, H), 아이소류신(ile, I), 류신(leu, L), 리신(lys, K), 메티오닌(met, M), 페닐알라닌(phe, F), 프롤린(pro, P), 세린(ser, S), 쓰레오닌(thr, T), 트립토판(trp, W), 타이로신(tyr, Y), 및 발린(val, V)으로 이루어진 그룹일 수 있다. 바람직하게는, EU387, EU422, EU424, EU426, EU433, EU436, EU438 및 EU440 위치 중 어느 하나에서의 상기 치환 아미노산은 알라닌(Ala, A), 아르기닌(arg, R), 글루탐산(glu, E), 글루타민(gln, Q), 아스파트산(asp, D), 세린(ser, S), 쓰레오닌(thr, T), 타이로신(tyr, Y), 및 리신(lys, K)으로 이루어진 그룹 중에서 선택된다.

본 발명의 바람직한 실시태양에서, 본 발명의 항원-결합 분자는

a) EU252 및 EU434 위치, 및

b) EU238, EU250, EU252, EU254, EU255, EU256, EU258, EU286, EU307, EU308, EU309, EU311, EU315, EU428, EU433, EU434, 및 436으로 이루어진 그룹 중에서 선택된 하나 이상의 위치

에서 치환된 것과 상이한 아미노산을 갖는 아미노산 치환을 포함하는 변형된 FcRn-결합 도메인을 갖는다.

상기 치환 아미노산은 본 발명에서 구체적으로 언급되지 않는 한 임의의 아미노산일 수도 있다. EU238, EU250, EU252, EU254, EU255, EU258, EU286, EU307, EU308, EU309, EU311, EU315, EU428, EU433, EU434, 및 EU436위치에 대한 바람직한 치환 아미노산을 표 1에 나타낸다.

바람직한 치환 아미노산

위치(EU 넘버링 도표에 따라)	치환 아미노산
EU238	아스파트산
EU250	발린
EU252	타이로신
EU254	쓰레오닌
EU255	류신
EU256	글루탐산
EU258	아스파트산 또는 아이소류신
EU286	글루탐산
EU307	글루타민
EU308	프롤린
EU309	글루탐산
EU311	알라닌 또는 히스티딘
EU315	아스파트산
EU428	아이소류신
EU433	알라닌, 리신, 프롤린, 아르기닌 또는 세린
EU434	타이로신 또는 트립토판
EU436	아이소류신, 류신, 발린, 쓰레오닌, 또는 페닐알라닌

바람직하게는, 본 발명의 변형된 FcRn-결합 도메인은 표 1에 나타낸 아미노산 치환들 중 하나 이상을 포함한다. 상기 FcRn-결합 도메인들을, 이들이 명시된 위치에서 상기 주어진 아미노산 중 하나 이상을 갖고 상기 FcRn-결합 도메인이 산성 및 중성 pH 범위에서 인간 FcRn-결합 활성을 가지며, 이때 중성 pH 범위에서 상기 FcRn-결합 활성이 증가되는 한, 어떠한 변경도 없이 사용할 수 있다.

바람직한 실시태양에서, 본 발명의 변형된 항원-결합 분자는 상기 FcRn-결합 도메인 중의 3 개 이상의 위치에서 변형을 포함하며, 여기에서 상기 3 개 이상의 위치는 표 2, 4 내지 7에 나타낸 조합들 중 하나이다.

보다 바람직한 실시태양에서, 본 발명의 항원-결합 분자는 FcRn-결합 도메인 중의 3 개 이상의 아미노산 치환들을 포함하며, 여기에서 상기 3 개 이상의 치환은 표 3, 12, 14 및 17 내지 20에 나타낸 조합들 중 하나이다.

안정성, 면역원성 및 응집체 형성

치환을 도입시킴으로써 FcRn-결합 도메인을 조작하는 것은 상기 항원-결합 분자의 안정성을 감소시킬 수 있다(WO/2007/092772). 약물 단백질의 안정성은, 불량한 안정성을 갖는 단백질이 보관 중에 쉽게 응집하는 경향이 있기 때문에 약제의 제조에 중요하다. 따라서 Fc 영역 중의 치환에 의해 야기된 감소된 안정성은 안정한 제형의 개발을 어렵게 만들 것이다(WO2007/092772).

또한, 단량체 종 및 고분자량 종들에 대한 약물 단백질의 순도가 약제 개발에 또한 중요하다. 단백질 A 정제 후의 야생형 IgG1은 상당량의 고분자량 종들을 함유하지 않지만, 치환을 도입시킴으로써 FcRn-결합 도메인을 조작하는 것은 보다 많은 양의 고분자량 종들을 생성시킬 수 있다. 상기와 같은 경우에, 고분자량 종은 정제 공정에 의해 벌크 약물 물질로부터 제거해야할 필요가 있으며, 이는 상기 정제 공정의 전개에 있어서 어려울 수도 있다.

더욱이, 인간에서 단백질 약제의 면역원성이 중요한데, 그 이유는 항-약물 항체의 존재가 상기 인체로부터 상기 약물의 제거를 발생시키고 따라서 치료 효능을 상실시킬 것이기 때문이다(문헌[IDrugs 2009; 12:233-7]). 치환을 야생형 Fc 도메인(예를 들어 IgG1 Fc 도메인)에 도입시키는 경우, 상기 변형된 서열은 비-인간 서열로 된다. 상기와 같은 변형된 서열은 MHC 부류 II에 의해 제공될 수 있으며 따라서 인간 환자에서 면역원성일 수 있다.

단백질이 불량한 안정성 및 순도를 나타내는 Fc 변체를 포함하는 경우 상기 단백질은 약물로서 개발되지 못할 것이며, 불량한 면역원성은 임상 개발을 방해할 것이다. 따라서 본 발명의 목적은

현저한 안정성을 상실하지 않고;

고분자량 종들의 양의 비를 증가시키지 않고;

면역원성의 위험(항-약물 항체 형성의 위험)을 증가시키지 않으면서,

pH 7.4에서 FcRn 결합 친화성을 개선시키는 것이다.

(그룹 1)

따라서, 본 발명은 또한 FcRn-결합 도메인 중의 EU252, EU434, EU307 및 EU311 위치에서 아미노산 치환을 포함하고, pH 7에서 15 nM 초과의 FcRn에 대한 결합 활성, 57.5 ℃ 이상의 용융 온도 Tm, 2% 미만의 HMW, 및 에피염기(Lonza)에 의해 측정된 500 미만의 점수와 동등한 낮은 면역원성을 갖는 항원-결합 분자를 제공한다.

바람직하게는, 항원-결합 분자는 상기 FcRn-결합 도메인 중의 4 개 이상의 위치에서 아미노산 치환을 포함하며, 여기에서 상기 4 개 이상의 위치는

a) EU252/ EU434 / EU307 / EU311 / EU436, 및

b) EU286, EU308, 및 EU428로 이루어진 그룹 중에서 선택된 하나 이상의 위치와 함께 EU252/ EU434 / EU307 / EU311 / EU436

으로 이루어진 그룹의 조합들 중 하나이다.

바람직한 조합들을 표 4에 나타낸다.

표 4의 조합 a), g), h) 및 i)가 특히 바람직하다.

훨씬 더 바람직한 실시태양에서, 상기 변형된 FcRn-결합 도메인은

a) EU252 위치에서 타이로신, EU286 위치에서 글루탐산, EU307 위치에서 글루타민, EU311 위치에서 알라닌, EU434 위치에서 타이로신, 및 EU436 위치에서 발린; 또는

을 포함한다.

(그룹 2)

본 발명은 또한 FcRn-결합 도메인 중의 3 개 이상의 위치에서 아미노산 치환을 포함하는 항원-결합 분자를 제공하며, 여기에서 상기 3 개 이상의 위치는 a) EU252/EU434/EU307/EU311; 및 b) EU252/EU434/EU308로 이루어진 그룹의 조합들 중 하나이며; 중성 pH에서 상기 항원-결합 분자의 FcRn-결합 활성은 15 내지 50 nM이고, Tm은 60 ℃ 초과이고, HMW는 2% 미만이며, 상기 항원-결합 분자는 에피염기(Lonza)에 의해 측정된 500 미만의 점수와 동등한 낮은 면역원성을 갖는다.

바람직한 실시태양에서, 상기 아미노산 치환은 4 개 이상의 위치에 존재하며, 여기에서 상기 4 개 이상의 위치는 표 5에 나타낸 조합들 중 하나이다.

4 개 이상의 아미노산 치환을 포함하는 항원-결합 분자가 보다 바람직하며, 여기에서 상기 4 개 이상의 치환은

a) EU252 위치에서 타이로신, EU286 위치에서 글루탐산, EU307 위치에서 글루타민, EU311 위치에서 알라닌, 및 EU434 위치에서 타이로신;

b) EU252 위치에서 타이로신, EU254 위치에서 쓰레오닌, EU286 위치에서 글루탐산, EU307 위치에서 글루타민, EU311 위치에서 알라닌, 및 EU434 위치에서 타이로신;

c) EU252 위치에서 타이로신, EU307 위치에서 글루타민, EU311 위치에서 알라닌, EU434 위치에서 타이로신, 및 EU436 위치에서 아이소류신;

d) EU252 위치에서 타이로신, EU254 위치에서 쓰레오닌, EU286 위치에서 글루탐산, EU307 위치에서 글루타민, EU311 위치에서 알라닌, EU434 위치에서 타이로신, 및 EU436 위치에서 아이소류신;

e) EU250 위치에서 발린, EU252 위치에서 타이로신, EU254 위치에서 쓰레오닌, EU308 위치에서 프롤린, EU434 위치에서 타이로신, 및 EU436 위치에서 발린; 또는

f) EU250 위치에서 발린, EU252 위치에서 타이로신, EU307 위치에서 글루타민, EU311 위치에서 알라닌, EU434 위치에서 타이로신, 및 EU436 위치에서 발린;

g) EU252 위치에서 타이로신, EU307 위치에서 글루타민, EU311 위치에서 알라닌, EU434 위치에서 타이로신, 및 EU436 위치에서 발린;

h) EU250 위치에서 발린, EU252 위치에서 타이로신, EU308 위치에서 프롤린, 및 EU434 위치에서 타이로신; 및

으로 이루어진 그룹의 조합들 중 하나이다.

(그룹 3)

본 발명은 또한

a) EU252/EU434 위치에서; 및

b) EU436 위치에서 및/또는 EU254 위치에서 및/또는 EU315 위치에서

FcRn-결합 도메인 중의 아미노산 치환을 포함하고 pH 7에서 50 내지 150 nM의 FcRn-결합 활성, 63 ℃ 초과의 Tm, 2% 미만의 HMW, 및 에피염기(Lonza)에 의해 측정된 250 미만의 점수로서 정의된 매우 낮은 면역원성을 갖는 항원-결합 분자를 제공한다.

바람직하게, 상기 아미노산 치환은 3 개 이상의 위치에 존재하며, 여기에서 상기 3 개 이상의 위치는 표 6에 나타낸 조합들 중 하나이다.

보다 바람직한 실시태양에서, 상기 변형된 항원-결합 분자는 3 개 이상의 아미노산 치환을 포함하며, 여기에서 상기 3 개 이상의 치환은

a) EU252 위치에서 타이로신, EU315 위치에서 아스파트산, 및 EU434 위치에서 타이로신;

b) EU252 위치에서 타이로신, EU434 위치에서 타이로신, 및 EU436 위치에서 아이소류신;

c) EU252 위치에서 타이로신, EU434 위치에서 타이로신, 및 EU436 위치에서 류신;

d) EU252 위치에서 타이로신, EU434 위치에서 타이로신, 및 EU436 위치에서 발린; 및

으로 이루어진 그룹의 조합들 중 하나이다.

(그룹 4)

본 발명은 또한 3 개 이상의 위치에서 상기 FcRn-결합 도메인 중의 아미노산 치환을 포함하는 항원-결합 분자를 제공하고, 여기에서 상기 3 개 이상의 위치는 표 7에 나타낸 조합들 중 하나이다. 상기 변형된 항원-결합 분자는 pH 7에서 150 내지 700 nM의 FcRn에 대한 결합 활성, 66.5 ℃ 초과의 Tm, 2% 미만의 HMW, 및 에피염기(Lonza)에 의해 측정된 250 미만의 점수로서 정의된 매우 낮은 면역원성을 갖는다.

바람직하게, 상기 변형된 항원-결합 분자는 3 개 이상의 치환을 포함하며, 여기에서 상기 3 개 이상의 치환은

a) EU307 위치에서 글루타민, EU311 위치에서 히스티딘, 및 EU434 위치에서 타이로신;

b) EU307 위치에서 글루타민, EU309 위치에서 글루탐산, EU311 위치에서 알라닌, EU434 위치에서 타이로신;

c) EU307 위치에서 글루타민, EU309 위치에서 글루탐산, EU311 위치에서 히스티딘, EU434 위치에서 타이로신; 또는

d) EU250 위치에서 발린, EU252 위치에서 타이로신, EU434 위치에서 타이로신, EU436 위치에서 발린

으로 이루어진 그룹의 조합들 중 하나이다.

기존의 항-약물 항체

항체에서 아미노산의 치환은 부정적인 결과, 예를 들어 치료 항체의 면역원성의 증가를 제공할 수 있으며, 이는 차례로 항-약물 항체(ADA)의 사이토킨 습격 및/또는 생산을 발생시킬 수 있다. ADA는 치료 항체의 효능 및 약동학에 영향을 미칠 수 있으며 때때로 심한 부작용을 도출하여, 상기 치료 항체의 임상적 유용성 및 효능을 제한할 수 있다. 다수의 인자들이 치료 항체의 면역원성에 영향을 미치며, 효과기 T-세포 에피토프의 존재가 상기 인자들 중 하나이다. 마찬가지로, 치료 항체에 대한 기존 항체의 존재가 또한 문제가 될 수 있다. 상기와 같은 기존 항체의 예는 항체(즉 IgG)의 Fc 부분에 대한 자가-항체(자기 단백질에 대한 항체)인 류마티스성 인자(RF)이다. 상기 류마티스성 인자는 특히 전신 홍반성 루푸스(SLE) 또는 류마티스성 관절염을 앓고 있는 환자에게서 발견된다. 관절염 환자에서, RF 및 IgG는 결합하여 면역 복합체를 형성하고 이는 질병 과정에 원인이 된다. 최근에, Asn434His 돌연변이를 갖는 인간화된 항-CD4 IgG1 항체가 중대한 류마티스성 인자 결합을 유도함이 보고되었다(문헌[(Clin Pharmacol Ther. 2011 Feb;89(2):283-90](NPL 9)). 상세한 연구들은 인간 IgG1에서 Asn434His 돌연변이가 모 인간 IgG1에 비해 상기 항체의 Fc 영역에 대한 류마티스성 인자의 결합을 증가시킴을 확인하였다.

RF는 인간 IgG1에 대한 다클론 자가항체이며, 상기 인간 IgG의 서열에서 상기 RF의 에피토프는 클론들 가운데 다양하지만, 상기 RF 에피토프는 CH2/CH3 계면 영역뿐만 아니라 CH3 도메인(상기 FcRn 결합 에피토프와 겹칠 수 있다) 중에 위치하는 것으로 보인다. 따라서, 중성 pH에서 FcRn에 대한 결합 친화성을 증가시키는 돌연변이는 RF의 특정 클론에 대한 결합 친화성도 또한 증가시킬 수 있다.

따라서, 중성 pH에서 혈장 중의 기존 항체에 대한 치료 항체의 결합 친화성을 또한 증가시키지 않으면서 중성 및/또는 산성 pH에서 FcRn 결합 친화성을 증가시키는 것이 바람직하다.

따라서, 본 발명은 또한 변형된 FcRn-결합 도메인(바람직하게는 변형된 Fc 영역)을 포함하는 항원-결합 분자를 제공하며, 이때 중성 pH에서 기존 ADA에 대한 결합 활성은 야생형 Fc 영역을 포함하는 항원-결합 분자의 결합 친화성에 비해 현저하게 증가하지 않는다. 상기 변형된 FcRn-결합 도메인(변형된 Fc 영역)은 바람직하게는 EU387, EU422, EU424, EU426, EU433, EU436, EU438 및 EU440으로 이루어진 그룹 중에서 선택된 위치들 중 하나 이상에서 아미노산 치환을 포함한다.

상술한 치환을 바람직하게는 중성 또는 산성 pH에서 FcRn에 대해 증가된 친화성을 갖는 항원-결합 분자의 FcRn-결합 도메인 또는 Fc 영역에 도입시키며, 이때 상기 변형된 FcRn-결합 도메인 또는 Fc 영역은 중성 pH에서 기존 ADA에 대해 증가된 결합 활성을 갖는다. 상기 치환의 효과는 상기 기존 ADA에 대한 결합 활성의 감소이다. 따라서, 바람직한 실시태양에서, 본 발명의 변형된 FcRn-결합 도메인 또는 변형된 Fc 영역은 중성 또는 산성 pH에서 FcRn에 대해 증가된 결합 활성, 및 중성 pH 범위에서 기존 항-약물 항체에 대해 증가된 결합 활성을 갖는 FcRn 결합 도메인 또는 Fc 영역에 비해 상기 기존 ADA에 대해 감소된 결합 활성을 갖는다. 바람직하게는, 중성 pH에서 FcRn 및 기존 ADA에 대해 증가된 결합 활성을 갖는 항원-결합 분자는 상술한 바와 같이 EU238, EU250, EU252, EU254, EU255, EU258, EU286, EU307, EU308, EU309, EU311, EU315, EU428, EU433, EU434, 및 EU436으로 이루어진 그룹 중에서 선택된 하나 이상의 위치에서 아미노산 치환을 포함하는 항원-결합 분자이다. 상기는 또한 상기 언급한 하나 이상의 위치에서의 치환 외에 EU256 위치에서의 치환을 포함할 수 있다. 바람직하게는, 상기 EU256 위치에서의 아미노산은 글루탐산으로 치환된다.

따라서, 본 발명은 중성 또는 산성 pH에서 FcRn에 대해 증가된 친화성을 갖는 변형된 Fc 영역을 포함하는 항원-결합 분자를 또한 제공하며, 이때 중성 pH에서 기존 항-약물 항체(ADA)에 대한 친화성은 야생형 Fc 영역을 포함하는 항원-결합 분자의 결합 친화성에 비해 현저하게 증가되지 않는다. 바람직한 실시태양에서, 본 발명은 EU387, EU422, EU424, EU426, EU433, EU436, EU438 및 EU440으로 이루어진 그룹 중에서 선택된 위치들 중 하나 이상에서 아미노산 치환을 포함하는, 중성 또는 산성 pH에서 FcRn에 대해 증가된 친화성을 갖는 변형된 Fc 영역을 포함하는 항원-결합 분자를 제공한다.

바람직하게는, 상기 중성 또는 산성 pH에서 FcRn에 대해 증가된 친화성을 갖는 변형된 Fc 영역을 포함하는 항원-결합 분자는, 중성 pH에서 기존 ADA에 대한 결합 친화성이 대조용 항원-결합 분자에 비해 현저하게 증가하지 않으며, 여기에서 상기 변형된 Fc 영역은 표 8에 나타낸 바와 같은 치환들 중에서 선택된 위치들 중 하나 이상에서의 아미노산 치환을 포함한다.

본 발명에 사용된 바와 같은 "항-약물 항체" 및 "ADA"란 용어는 치료 항체 상에 위치한 에피토프에 대해 결합 친화성을 갖고 따라서 상기 치료 항체와 결합할 수 있는 내생적인 항체를 지칭한다. 본 발명에 사용된 바와 같은 "기존 항-약물 항체" 및 "기존 ADA"란 용어는 환자에게 상기 치료 항체의 투여에 앞서 상기 환자의 혈액 중에 존재하고 검출될 수 있는 항-약물 항체를 지칭한다. 바람직하게는, 상기 기존 ADA는 인간 항체이다. 특히 바람직한 실시태양에서, 상기 기존 ADA는 인간 IgG 항체에 대한 Fc 영역에 대한 다클론 또는 단클론 자가항체인 류마티스성 인자이다. 상기 류마티스성 인자의 에피토프는 CH2/CH3 계면 영역뿐만 아니라 CH3 도메인 중에 위치하나, 클론들 중에서 다양할 수 있다.

중성 또는 산성 pH에서 FcRn 및 중성 pH에서 기존 항-약물 항체에 대해 증가된 친화성을 갖는 FcRn-결합 도메인 영역(또는 Fc 영역)을 포함하는 항원-결합 분자는, 본래의 FcRn-결합 도메인(또는 본래의 Fc 영역)을 포함하는 항체에 비해 FcRn에 대한 항원-결합 분자의 상기 FcRn-결합 도메인(또는 Fc 영역)의 결합 친화성이 증가하도록 변형된 FcRn-결합 도메인(또는 Fc 영역)을 포함하는 항원-결합 분자이다. 고려되는 변형으로는 비제한적으로 항원-결합 도메인의 Fc 부분의 아미노산 서열 중의 아미노산의 치환이 있다. a) 중성 pH 범위에서 기존 ADA 및 중성(중성 pH에서 증가된 FcRn-결합 활성을 갖는 관심 항원-결합 분자의 경우에) 또는 산성 pH(산성 pH에서 증가된 FcRn-결합 활성을 갖는 관심 항원-결합 분자의 경우에)에서 FcRn에 대해 증가된 결합 활성을 갖는, FcRn-결합 도메인 또는 Fc 영역을 포함하는 항원-결합 분자를 본 발명에서 "기준 항체"라 칭한다. "기준 항체"는 바람직하게는 EU387, EU422, EU424, EU426, EU433, EU436, EU438 및 EU440으로 이루어진 그룹 중에서 선택된 하나 이상의 위치에서 아미노산의 치환 전, 보다 바람직하게는 표 8에 나타낸 치환들 중 어느 하나의 도입 전의 변형된 항원-결합 분자이다. "기준 항체"는 EU238, EU250, EU252, EU254, EU255, EU256, EU258 EU286, EU307, EU308, EU309, EU311, EU315, EU428, EU433, EU434, 및 EU436으로 이루어진 그룹 중에서 선택된 하나 이상의 위치에서 FcRn-결합 도메인 중의 아미노산 치환을 포함하는 항원-결합 분자일 수 있다.

중성 pH 범위에서 증가된 FcRn-결합 활성을 갖는 "기준 항체"의 예는

a) EU252 및 EU434 위치에서; 및

b) EU238, EU250, EU254, EU255, EU256, EU258, EU286, EU307, EU308, EU309, EU311, EU315, EU428, EU433, 및 EU436으로 이루어진 그룹 중에서 선택된 하나 이상의 위치에서

Fc 영역 중의 아미노산 치환을 포함하는, 중성 pH 범위에서 FcRn에 대해 증가된 친화성을 갖고 중성 pH에서 기존 ADA에 대해 증가된 친화성을 갖는 Fc 영역을 포함하는 항원-결합 분자이다.

보다 바람직하게, 중성 pH 범위에서 FcRn에 대해 증가된 친화성을 갖고 중성 pH 범위에서 기존 ADA에 대해 증가된 친화성을 갖는 Fc 영역을 포함하는 항원-결합 분자는 표 9에 나타낸 조합들 중 하나를 포함한다.

산성 pH 범위에서 증가된 FcRn-결합 활성을 갖는 "기준 항체"에 대한 예는, 바람직하게는

i) EU434 위치에서, 또는

ii) 2 개 이상의 위치에서(여기에서 상기 2 개 이상의 위치는 a) EU252/EU254/EU256; b) EU428/EU434; 및 c) EU250/EU428로 이루어진 그룹의 조합들 중 하나이다)

치환을 포함하는, 산성 pH 범위에서 FcRn에 대해 증가된 친화성을 갖고 중성 pH 범위에서 기존 ADA에 대해 증가된 친화성을 갖는 Fc 영역을 포함하는 항원-결합 분자이다.

바람직하게, 상기 산성 pH 범위에서 증가된 친화성을 갖고 중성 pH에서 기존 ADA에 대해 증가된 친화성을 갖는 Fc 영역을 포함하는 항원-결합 분자는

i) 치환 M434H; 또는

ii) a) M252Y/S254T/T256E; b) M428L/N434S; 및 c) T250Q 및 M428L(EU 넘버링)으로 이루어진 그룹의 조합들 중 하나

를 포함한다.

바람직하게, 하기의 치환 또는 조합 a) M252Y/S254T/T256E, b) M428L/N434S 또는 c) T250Q 및 M428L 또는 d) M434H(EU 넘버링) 중 하나를 포함하는 Fc 영역을 포함하는 항원-결합 분자는 중성 pH 범위에서 결합 활성의 증가 없이 산성 pH에서 FcRn에 대해 증가된 결합 활성을 갖는다.

기존 항-약물 항체에 대한 항원-결합 분자의 Fc 영역의 결합 활성을 본 출원에서 중성 pH에서의 전기화학발광(ECL) 반응으로서 표현하지만; 당해 분야의 숙련가에게 공지된 기존 ADA에 대한 결합 활성의 다른 적합한 측정 방법들이 존재한다. ECL 분석은 예를 들어 문헌[Moxness et al., Clin Chem, 2005, 51:1983-85] 및 본 발명의 실시예에 개시되어 있다. 기존 ADA에 대한 결합 활성의 측정을 위한 분석에 사용되는 조건들을 당해 분야의 숙련가들에 의해 적합하게 선택할 수 있으며, 따라서 상기 조건들은 특별히 제한되지 않는다.

기존 ADA에 대해 증가된 또는 보다 높은 결합 친화성은 대조용 항원-결합 분자의 기존 ADA에 대한 결합 친화성에 비해 증가된다.

본 발명에 사용된 바와 같은 "대조용 항원-결합 분자"란 용어는 본래의 인간 Fc 영역을 포함하는 항원-결합 분자, 바람직하게는 본래의 인간 Fc 영역을 포함하는 항체 또는 항체 유도체를 지칭한다.

기존 ADA에 대한 결합 친화성을 10 ℃ 내지 50 ℃의 임의의 온도에서 평가할 수 있다. 바람직하게는 인간 Fc 영역과 인간 기존 ADA 간의 결합 친화성을 측정하기 위해서 15 ℃ 내지 40 ℃의 온도가 사용된다. 보다 바람직하게, 인간 Fc 영역과 인간 기존 ADA 간의 결합 친화성을 측정하기 위해서 20 ℃ 내지 35 ℃의 임의의 온도, 예를 들어 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 및 35 ℃ 중 어느 하나가 사용된다. 바람직하게는 상기 온도는 20 내지 25 ℃, 보다 바람직하게는 25 ℃이다. 바람직한 실시태양에서, 인간 기존 ADA와 인간 Fc 영역 간의 상호작용을 pH 7.4(또는 pH 7.0) 및 25 ℃에서 측정한다.

본 발명과 관련하여, "기존 ADA에 대해 증가된 결합 친화성"이란 용어는 기존 ADA에 대해 측정된 대조용 항원-결합 분자의 결합 친화성과 비교된 바와 같은, 기존 ADA에 대해 측정된 본 발명의 항원-결합 분자의 결합 친화성(즉 KD)의 증가를 지칭한다. 기존 ADA에 대한 상기와 같은 결합 친화성의 증가를 개별적인 환자 또는 환자 그룹에서 관찰할 수 있다.

본 발명에 사용된 바와 같은 "환자들" 및 "환자"란 용어는 특별히 제한되지 않으며 치료 과정 중에 치료학적 항원-결합 분자가 투여되는 질병을 앓고 있거나 상기가 투여된 모든 인간을 포함한다. 바람직하게는, 환자는 자가면역 질병을 앓고 있는 사람이다. 보다 바람직하게는, 환자는 관절염 질병 또는 전신 홍반성 루푸스(SLE)를 앓고 있는 사람이다. 관절염 질병은 특히 류마티스성 관절염을 포함한다.

본 발명과 관련하여, 개인 환자에서 기존 ADA에 대한 결합 활성의 현저한 증가는 대조용 항원-결합 분자의 기존 ADA에 대한 결합 친화성에 비해, 환자에서 변형된 Fc 영역을 포함하는 치료 항원-결합 분자(즉 치료 항체)의 기존 ADA에 대한 결합 활성의 10% 이상, 20% 이상, 30% 이상, 40% 이상, 50% 이상, 60% 이상의 측정된 증가에 상응한다. 바람직하게는 상기 증가는 대조용 항원-결합 분자의 기존 ADA에 대한 결합 친화성에 비해, 변형된 Fc 영역을 포함하는 항원-결합 분자의 결합 활성의 20% 이상이고, 보다 바람직하게는 상기 증가는 30% 이상이고, 훨씬 더 바람직하게는 상기는 40% 이상이며 가장 바람직하게는 상기 증가는 50% 이상이다. 한편으로, 환자에서 기존 ADA에 대한 항원-결합 분자의 결합 활성에 있어서 현저한 증가는 바람직하게는 250 초과의 항원-결합 분자에 대한 ECL 반응, 바람직하게는 500 이상의 ECL, 보다 바람직하게는 1000 이상의 ECL, 가장 바람직하게는 2000 이상의 ECL이다. 보다 바람직하게는, 상기 증가는 500 미만(바람직하게는 250 미만)의 대조용 항원-결합 분자의 ECL 반응과 비교시의 증가이다. 상기 대조용 항원-결합 분자의 기존 ADA에 대한 결합 활성과 변형된 Fc 영역을 갖는 항원-결합 분자의 경우 간의 바람직한 범위는 특히 250 미만 내지 250 이상, 250 미만 내지 500 이상, 500 미만 내지 500 이상, 500 미만 내지 1000 이상, 및 500 미만 내지 2000 이상의 ECL 반응이다.

기존 ADA에 대한 결합 활성의 증가는 또한 중성 pH에서 대조용 항원-결합 분자에 대한 500 이상(바람직하게는 250 이상)의 ECL 반응을 갖는 환자 부분과 비교 시, 환자 집단에서 a) 중성 또는 산성 pH에서 FcRn 및 b) 중성 pH에서 기존 ADA에 대해 증가된 결합 활성을 갖는 항원-결합 분자에 대한 500 이상(바람직하게는 250 이상)의 ECL 반응을 갖는 환자 부분의 증가에 상응할 수 있다. 환자 집단에서 상기 환자 부분의 "현저한" 증가는 바람직하게는 대조용 항원-결합 분자에 대한 ECL 반응을 갖는 환자 부분에 비해 중성 pH에서 500 이상(바람직하게는 250 이상)의 류마티스성 인자에 대한 변형된 Fc 영역을 포함하는 치료 항원-결합 분자의 ECL 반응을 갖는 환자의 10% 이상, 20% 이상, 30% 이상, 40% 이상, 50% 이상의 증가이다. 바람직하게는 상기 증가는 20% 이상, 보다 바람직하게는 30% 이상, 훨씬 더 바람직하게는 40% 이상 및 가장 바람직하게는 50% 이상이다.

본 발명과 관련하여, 기존 ADA에 대한 결합 친화성의 감소는 기준 항체에 대해 측정된 결합 활성과 비교 측정된 결합 활성(즉 KD 또는 ECL 반응)의 감소를 지칭한다. 기존 ADA에 대한 상기와 같은 결합 친화성의 감소는 개별적인 환자 또는 환자 그룹에서 관찰될 수 있다. 개별적인 환자에서 중성 pH에서 기존 ADA에 대한 치료학적 항원-결합 분자의 친화성의 감소는 상기 환자에서 중성 pH에서 기존 ADA에 대한 기준 항체에 대해 측정된 결합 친화성에 대해 비교 측정된, 중성 pH에서 상기 결합 활성의 감소를 지칭한다. 바람직하게는, 개별적인 환자에서 현저한 감소는 중성 pH에서 기존 ADA에 대한 기준 항체의 결합 활성에 대해 비교 측정된, 중성 pH에서 기존 ADA에 대한 상기 변형된 항원-결합 분자의 결합 활성의 10% 이상, 20% 이상, 30% 이상, 40% 이상, 50% 이상의 감소이다. 보다 바람직하게는, 상기 감소는 기준 항체와 비교 시 30% 이상, 훨씬 더 바람직하게는 40% 및 가장 바람직하게는 50% 이상이다.

한편으로, 개별적인 환자에서 기존 ADA에 대한 변형된 항원-결합 분자의 결합 활성의 현저한 감소는 기준 항체의 ECL 반응과 비교 시 500 이상(바람직하게는 1000 이상의 ECL, 가장 바람직하게는 2000 이상의 ECL)의 ECL 반응에서부터 500 미만, 바람직하게는 250 미만의 상기 항원-결합 분자의 ECL 반응의 감소로서 측정될 수 있다. 바람직한 감소는 500 이상의 ECL 반응 내지 500 미만의 ECL 반응, 보다 바람직하게는 250 이상 250 미만, 훨씬 더 바람직하게는 500 이상 250 미만이다. 바람직한 범위는 특히 250 이상 250 미만, 500 이상 250 미만, 1000 이상 250 미만, 2000 이상 250 미만, 500 이상 500 미만, 1000 이상 500 미만, 및 2000 이상 500 미만이다.

상기 감소는 또한 환자 집단 중의 중성 pH 범위에서 상기 변형된 항원-결합 분자에 대한 그의 기존 ADA의 증가된 결합을 갖는 환자의 백분율의 감소일 수 있다. 즉, 상기 감소는 기준 항체에 대한 ECL 반응과 비교 시, 변형된 항원-결합 분자에 대한 그의 기존 ADA의 ECL 반응을 갖는 사람들의 백분율의 감소로서 측정될 수 있다. 바람직하게는, 감소는 환자 집단 중의 상기 치료학적 항원-결합 분자가 기존 ADA에 대한 기준 항체의 증가된 결합 활성을 갖는 환자 부분과 비교시 기존 ADA에 대해 증가된 결합 활성을 갖는 환자 부분의 10% 이상, 20% 이상, 30% 이상, 40% 이상, 50% 이상의 감소일 수 있으며, 여기에서 상기 증가된 결합은 500 이상, 바람직하게는 250 이상의 ECL 반응으로서 표현된다. 바람직하게는 상기 감소는 20% 이상이고, 보다 바람직하게는 상기 감소는 30% 이상이고, 훨씬 더 바람직하게는 상기 감소는 40%이고, 가장 바람직하게는 50% 이상이다.

바람직한 실시태양에서, 본 발명의 치료학적 항원-결합 분자는 중성 pH에서 기존 ADA에 대해 낮은 결합 활성을 갖는다. 특히, 중성 pH에서 기존 ADA에 대한 본 발명의 변형된 항원-결합 분자의 결합 활성은 바람직하게는 중성 pH에서 기존 ADA에 대한 기준 항체의 결합 활성에 비해 현저하게 감소된다. 보다 바람직하게는, 중성 pH에서 기존 ADA에 대한 본 발명의 변형된 항원-결합 분자의 결합 활성은 대조용 항원-결합 분자(기존 ADA에 대해 대조용 항원-결합 분자와 대략 동일한 결합 활성을 갖는다)의 결합 친화성에 비해 현저하게 증가되지 않는다. 기존 ADA에 대한 낮은 결합 활성 또는 기준선 친화성은 바람직하게는 개별적인 환자에서 500 미만의 ECL 반응이다. 바람직하게는, ECL 반응은 250 미만이다. 환자 집단에서, 기존 ADA에 대한 낮은 결합 활성은 환자 집단 중 상기 환자의 90%에서, 보다 바람직하게는 상기 환자의 95%, 가장 바람직하게는 상기 환자의 98%에서 500 미만의 ECL 반응이다.

보다 바람직한 실시태양에서, 중성 또는 산성 pH에서 FcRn에 대해 증가된 친화성을 갖는 변형된 FcRn-결합 도메인을 포함하는 항원-결합 분자에서, 중성 pH에서 기존 ADA에 대한 결합 활성은 대조용 항원-결합 분자에 비해 현저하게 증가되지 않으며, 이때 본 발명의 변형된 FcRn-결합 도메인은 표 10에 나타낸 위치들 또는 조합들 중 하나 이상에서 치환을 포함한다.

`

보다 바람직한 실시태양에서, 본 발명의 항원-결합 분자는 표 11에 나타낸 치환들 또는 조합들 중 하나 이상을 갖는 변형된 FcRn-결합 도메인을 포함한다.

바람직한 실시태양에서, a) 중성 또는 산성 pH에서 FcRn에 대해 증가된 친화성 b) 중성 pH에서 대조용 항원-결합 분자에 비해 현저하게 증가되지 않은 기존 ADA에 대한 결합 친화성을 갖는 변형된 FcRn-결합 도메인을 포함하는 항원-결합 분자에서, 상기 항원-결합 분자는 표 12에 나타낸 치환의 조합들 중 임의의 하나를 포함한다.

또한 바람직하게는, 중성 pH 범위에서 증가된 FcRn 결합 활성 및 중성 pH에서 야생형 Fc 영역을 포함하는 항원-결합 분자에 비해 현저하게 증가되지 않은 기존 ADA에 대한 결합 친화성을 갖는 항원-결합 분자는 a) EU387, EU422, EU424, EU438, EU440, EU433으로 이루어진 그룹 중에서 선택된 위치들 중 하나 이상에서, 또는 b) 2 개 이상의 위치에서(여기에서 상기 2 개 이상의 위치는 조합 EU422/EU424; 또는 EU438/EU440이다) FcRn-결합 도메인 중의 아미노산 치환을 포함한다. 보다 바람직하게는, 상기 치환은 표 11에 나타낸 치환들 중에서 선택된다.

훨씬 더 바람직하게는, 중성 pH 범위에서 FcRn에 대해 증가된 결합 활성 및 중성 pH에서 야생형 Fc 영역을 포함하는 항원-결합 분자에 비해 현저하게 증가되지 않은 기존 ADA에 대한 결합 친화성을 갖는 항원-결합 분자의 FcRn-결합 도메인은 표 12에 나타낸 치환 조합들 중 임의의 하나를 포함한다. 특히, 중성 pH 범위에서 증가된 FcRn-결합 활성을 갖는 바람직한 변형된 항원-결합 분자(이때 중성 pH에서 기존 ADA에 대한 결합 친화성은 현저하게 증가되지 않는다)는 상기 FcRn-결합 도메인 중에 3 개 이상의 치환을 포함하며, 여기에서 상기 3 개 이상의 치환은 표 12에 나타낸 조합 (2) 내지 (26)번 및 (28) 내지 (59)번 중 임의의 하나이다.

본 발명은 또한, 산성 pH 범위에서 FcRn에 대해 증가된 결합 활성 및 중성 pH에서 대조용 항원-결합 분자에 비해 현저하게 증가되지 않은 기존 ADA에 대한 결합 친화성을 가지며, a) EU424 위치에서 또는 b) EU438/EU440 위치에서 아미노산 치환을 포함하는 항원-결합 분자를 제공한다.

보다 바람직하게는, 상기 치환은 a) EU424N 및 b) EU438R/EU440E 중에서 선택된다.

바람직하게는, 산성 pH 범위에서 FcRn에 대해 증가된 결합 활성 및 중성 pH에서 대조용 항원-결합 분자에 비해 현저하게 증가되지 않은 기존 ADA에 대한 결합 친화성을 갖는 항원-결합 분자의 FcRn-결합 도메인은 표 13에 나타낸 치환 조합들 중 하나를 포함한다. 보다 바람직하게는, 산성 pH 범위에서 증가된 FcRn-결합 활성을 갖는 항원-결합 분자(이때 중성 pH에서 기존 ADA에 대한 결합 친화성은 대조용 항원-결합 분자에 비해 현저하게 증가되지 않는다)는 표 13에 나타낸 치환 조합 (13) 내지 (28)번 중 임의의 하나를 포함한다.

EU387, EU422, EU424, EU426, EU433, EU436, EU438 및 EU440 위치들 중 임의의 하나에서의 치환 외에, 본 발명의 Fc 영역은 또한 하기의 위치들 중 하나 이상에서 아미노산의 추가의 치환을 포함할 수 있다:

EU248, EU249, EU250, EU251, EU252, EU253, EU254, EU255, EU256, EU257, EU305, EU306, EU307, EU308, EU309, EU310, EU311, EU312, EU313, EU314, EU342, EU343, EU344, EU345, EU346, EU347, EU348, EU349, EU350, EU351, EU352, EU380, EU381, EU382, EU383, EU384, EU385, EU386, EU388, EU414, EU415, EU416, EU417, EU418, EU419, EU420, EU421, EU423, EU425, EU427, EU428, EU429, EU430, EU431, EU432, EU433, EU434, EU435, EU436, EU437, EU441, EU442, EU443, 및 EU444.

이들 위치 중 임의의 하나에서 Fc 영역의 치환은, FcRn에 대한 결합 친화성에 부정적으로 영향을 미치지 않으면서 기존 ADA, 특히 류마티스성 인자에 대한 결합 친화성을 감소시킬 수 있다.

더욱 또한, 본 발명의 방법은 하기의 위치들 중 하나 이상에서 상술한 바와 같은 항원-결합 분자의 Fc 영역을 치환시키는 단계를 추가로 포함할 수 있다:

효과기 수용체 또는 보체 단백질에 대한 약하거나 또는 존재하지 않는 결합 활성

Fc 감마 수용체 또는 보체 단백질에 대한 결합은 또한 바람지하지 못한 효과(예를 들어 부적합한 혈소판 활성화)를 야기할 수 있다. Fc 감마 RIIa 수용체와 같은 효과기 수용체와 결합하지 않는 변형된 항원-결합 분자가 보다 안전하고/하거나 보다 유효하다. 따라서, 바람직한 실시태양에서, 본 발명의 변형된 항원-결합 분자는 추가로 효과기 수용체 대한 약한 결합 활성을 갖거나 또는 효과기 수용체에 결합하지 않는다. 효과기 수용체의 예는 비제한적으로 활성화 Fc 감마 수용체, 특히 Fc 감마 수용체 I, Fc 감마 수용체 II 및 Fc 감마 수용체 III을 포함한다. Fc 감마 수용체 I은 Fc 감마 수용체 Ia, Fc 감마 수용체 Ib 및 Fc 감마 수용체 Ic, 및 이들의 하위유형들을 포함한다. Fc 감마 수용체 II는 Fc 감마 수용체 IIa(2 개의 알로타입 R131 및 H131을 갖는다) 및 Fc 감마 수용체 IIb를 포함한다. Fc 감마 수용체 III은 Fc 감마 수용체 IIIa(2 개의 알로타입: V158 및 F158을 갖는다) 및 Fc 감마 수용체 IIIb(2 개의 알로타입: Fc 감마 IIIb-NA1 및 Fc 감마 IIIb-NA2를 갖는다)를 포함한다. 효과기 수용체에 대해 약한 결합 활성을 갖거나 또는 상기 수용체에 결합하지 않는 항체는 예를 들어 잠재성(silent) Fc 영역을 포함하는 항체 또는 Fc 영역(예를 들어 Fab, F(ab)'2, scFv, sc(Fv)2, 다이아바디)이 없는 항체이다.

효과기 수용체에 대해 약한 결합 활성을 갖거나 결합 활성을 갖지 않는 Fc 영역에 대한 예는 문헌[Strohl et al., Current Opinion in Biotechnology (2009) 20(6), 685-691]에 개시되어 있다. 특히, 상기 문헌은 예를 들어 탈글리코실화된 Fc 영역(N297A, N297Q), 및 잠재성 Fc 영역의 예(이는 잠재된(또는 면역억제성) 효과기 작용성에 대해 조작된 Fc 영역들(IgG1-L234A/L235A, IgG1-H268Q/A330S/P331S, IgG1-C226S/C229S, IgG1-C226S/C229S/E233P/L234V/L235A, IgG1-L234F/L235E/P331S, IgG2-V234A/G237A, IgG2-H268Q/V309L/A330S/A331S, IgG4-L235A/G237A/E318A, IgG4-L236E)이다)를 개시한다. WO2008/092117은 치환 G236R/L328R, L235G/G236R, N325A/L328R, 또는 N325L/L328R(EU 넘버링 시스템에 따른 위치들)을 포함하는 잠재성 Fc 영역들을 포함하는 항체를 개시한다. 더욱 또한, WO 2000/042072는 EU233, EU234, EU235 및 EU237 위치 중 하나 이상에서 치환을 포함하는 잠재성 Fc 영역을 포함하는 항체를 개시한다. WO 2009/011941은 EU231 내지 EU238의 잔기의 결실을 포함하는 잠재성 Fc 영역을 포함하는 항체를 개시한다. 문헌[Davis et al., Journal of Rheumatology (2007) 34(11): 2204-2210]은 치환 C220S/C226S/C229S/P238S을 포함하는 잠재성 Fc 영역을 포함하는 항체를 개시한다. 문헌[Shields et al., Journal of Biological Chemistry (2001) 276 (9), 6591-6604]은 치환 D265A를 포함하는 잠재성 Fc 영역을 포함하는 항체를 개시한다.

"효과기 수용체 대한 약한 결합"이란 용어는 상기 효과기 수용체 대한 본래의 IgG(또는 본래의 Fc 영역을 포함하는 항체)의 결합 활성의 95% 이하, 바람직하게는 90% 이하, 85% 이하, 80% 이하, 75% 이하, 보다 바람직하게는 70% 이하, 65% 이하, 60% 이하, 55% 이하, 50% 이하, 45% 이하, 40% 이하, 35% 이하, 30% 이하, 25% 이하, 20% 이하, 15% 이하, 10% 이하, 9% 이하, 8% 이하, 7% 이하, 6% 이하, 5% 이하, 4% 이하, 3% 이하, 2% 이하, 1% 이하인 결합 활성을 지칭한다. Fc 감마 R에 대한 결합 활성은 바람직하게는 상기 효과기 수용체에 대한 본래의 IgG(또는 본래의 Fc 영역을 포함하는 항체)의 결합 활성에 비해 적어도 약 10 배 이상, 약 50 배 이상, 약 100 배 이상의 인자까지 감소된다.

잠재성 Fc 영역은 본래의 Fc 영역에 비해 효과기 수용체에 대한 결합을 감소시키는 하나 이상의 아미노산 치환, 삽입, 첨가 및/또는 결실을 포함하는 변형된 Fc 영역이다. 상기 효과기 수용체에 대한 결합 활성은 상기 Fc 영역이 더 이상 효과기 수용체에 결합하지 않을 만큼 충분히 감소될 수 있다. 잠재성 Fc 영역의 예는 비제한적으로 EU234, EU235, EU236, EU237, EU238, EU239, EU265, EU266, EU267, EU269, EU270, EU271, EU295, EU296, EU297, EU298, EU300, EU324, EU325, EU327, EU328, EU329, EU331, 및 EU332로 이루어진 그룹 중에서 선택된 위치들 중 하나 이상에서 아미노산 치환을 포함하는 Fc 영역들을 포함한다.

특히, 잠재성 Fc 영역은 EU234, EU235, EU236, EU237, EU238, EU239, EU265, EU266, EU267, EU269, EU270, EU271, EU295, EU296, EU297, EU298, EU300, EU324, EU325, EU327, EU328, EU329, EU331, 및 EU332로 이루어진 그룹 중에서 선택된 하나 이상의 위치에서 하기 목록 중에서 선택된 아미노산에 의한 치환을 갖는다. 바람직하게는, 잠재성 Fc 영역은 EU235, EU237, EU238, EU239, EU270, EU298, EU325, 및 EU329로 이루어진 그룹 중에서 선택된 하나 이상의 위치에서 하기 목록 중에서 선택된 아미노산에 의한 치환을 갖는다.

EU234 위치의 아미노산은 바람직하게는 Ala, Arg, Asn, Asp, Gln, Glu, Gly, His, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, 및 Thr로 이루어진 그룹 중에서 선택된 아미노산 중 하나로 치환된다.

EU235 위치의 아미노산은 바람직하게는 Ala, Asn, Asp, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Lys, Met, Pro, Ser, Thr, Val 및 Arg로 이루어진 그룹 중에서 선택된 아미노산 중 하나로 치환된다.

EU236 위치의 아미노산은 바람직하게는 Arg, Asn, Gln, His, Leu, Lys, Met, Phe, Pro 및 Tyr로 이루어진 그룹 중에서 선택된 아미노산 중 하나로 치환된다.

EU237 위치의 아미노산은 바람직하게는 Ala, Asn, Asp, Gln, Glu, His, Ile, Leu, Lys, Met, Pro, Ser, Thr, Val, Tyr 및 Arg로 이루어진 그룹 중에서 선택된 아미노산 중 하나로 치환된다.

EU238 위치의 아미노산은 바람직하게는 Ala, Asn, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Lys, Thr, Trp 및 Arg로 이루어진 그룹 중에서 선택된 아미노산 중 하나로 치환된다.

EU239 위치의 아미노산은 바람직하게는 Gln, His, Lys, Phe, Pro, Trp, Tyr 및 Arg로 이루어진 그룹 중에서 선택된 아미노산 중 하나로 치환된다.

EU265 위치의 아미노산은 바람직하게는 Ala, Arg, Asn, Gln, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Ser, Thr, Trp, Tyr 및 Val로 이루어진 그룹 중에서 선택된 아미노산 중 하나로 치환된다.

EU266 위치의 아미노산은 바람직하게는 Ala, Arg, Asn, Asp, Gln, Glu, Gly, His, Lys, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp 및 Tyr로 이루어진 그룹 중에서 선택된 아미노산 중 하나로 치환된다.

EU267 위치의 아미노산은 바람직하게는 Arg, His, Lys, Phe, Pro, Trp 및 Tyr로 이루어진 그룹 중에서 선택된 아미노산 중 하나로 치환된다.

EU269 위치의 아미노산은 바람직하게는 Ala, Arg, Asn, Gln, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr 및 Val로 이루어진 그룹 중에서 선택된 아미노산 중 하나로 치환된다.

EU270 위치의 아미노산은 바람직하게는 Ala, Arg, Asn, Gln, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr 및 Val로 이루어진 그룹 중에서 선택된 아미노산 중 하나로 치환된다.

EU271 위치의 아미노산은 바람직하게는 Arg, His, Phe, Ser, Thr, Trp 및 Tyr로 이루어진 그룹 중에서 선택된 아미노산 중 하나로 치환된다.

EU295 위치의 아미노산은 바람직하게는 Arg, Asn, Asp, Gly, His, Phe, Ser, Trp 및 Tyr로 이루어진 그룹 중에서 선택된 아미노산 중 하나로 치환된다.

EU296 위치의 아미노산은 바람직하게는 Arg, Gly, Lys 및 Pro로 이루어진 그룹 중에서 선택된 아미노산 중 하나로 치환된다.

EU297 위치의 아미노산은 바람직하게는 Ala로 치환된다.

EU298 위치의 아미노산은 바람직하게는 Arg, Gly, Lys, Pro, Trp 및 Tyr로 이루어진 그룹 중에서 선택된 아미노산 중 하나로 치환된다.

EU300 위치의 아미노산은 바람직하게는 Arg, Lys 및 Pro로 이루어진 그룹 중에서 선택된 아미노산 중 하나로 치환된다.

EU324 위치의 아미노산은 바람직하게는 Lys 또는 Pro로 치환된다.

EU325 위치의 아미노산은 바람직하게는 Ala, Arg, Gly, His, Ile, Lys, Phe, Pro, Thr, Trp, Tyr, 및 Val로 이루어진 그룹 중에서 선택된 아미노산 중 하나로 치환된다.

EU327 위치의 아미노산은 바람직하게는 Arg, Gln, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr 및 Val로 이루어진 그룹 중에서 선택된 아미노산 중 하나로 치환된다.

EU328 위치의 아미노산은 바람직하게는 Arg, Asn, Gly, His, Lys 및 Pro로 이루어진 그룹 중에서 선택된 아미노산 중 하나로 치환된다.

EU329 위치의 아미노산은 바람직하게는 Asn, Asp, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Ser, Thr, Trp, Tyr, Val 및 Arg로 이루어진 그룹 중에서 선택된 아미노산 중 하나로 치환된다.

EU330 위치의 아미노산은 바람직하게는 Pro 또는 Ser로 치환된다.

EU331 위치의 아미노산은 바람직하게는 Arg, Gly 및 Lys로 이루어진 그룹 중에서 선택된 아미노산 중 하나로 치환된다.

EU332 위치의 아미노산은 바람직하게는 Arg, Lys 및 Pro로 이루어진 그룹 중에서 선택된 아미노산 중 하나로 치환된다.

바람직하게는, 잠재성 Fc 영역은 EU235 위치에서 Lys 또는 Arg로, EU237에서 Lys 또는 Arg로, EU238에서 Lys 또는 Arg로, EU239에서 Lys 또는 Arg로, EU270에서 Phe로, EU298에서 Gly로, EU325에서 Gly로, 또는 EU329에서 Lys 또는 Arg로 치환됨을 포함한다. 보다 바람직하게는 잠재성 Fc 영역은 EU235 위치에서 아르기닌으로 및 EU239 위치에서 리신으로 치환됨을 포함한다. 보다 바람직하게는, 상기는 치환 L235R/S239K를 포함한다.

더욱 또한, 본 발명의 변형된 항원-결합 분자는 바람직하게는 탈글리코실화된다. 보다 바람직하게, 본 발명의 변형된 항원-결합 분자는 예를 들어 WO2005/03175에 개시된 바와 같이 중쇄 글리코실화 부위에서 글리코실화를 방지하기 위해 상기 부위에서 돌연변이를 포함한다. 따라서, 본 발명의 바람직한 실시태양에서, 상기 변형된 아글리코실 항원-결합 분자는 상기 중쇄 글리코실화 부위를 변형시킴, 즉 치환 N297Q 또는 N297A(EU 넘버링 시스템에 따른 위치)를 도입시키고 상기 단백질을 적합한 숙주 세포에서 발현시킴으로써 제조된다. 치환을 도입시키기 위해서, 실시예에 개시된 방법을 사용할 수 있다.

본 발명의 특정한 실시태양에서, 본 발명의 변형된 항원-결합 분자는 보체 단백질에 대해 약한 결합 활성을 갖거나 또는 보체 단백질에 결합하지 않는다. 바람직하게는, 상기 보체 단백질은 Clq이다. 보체 단백질에 대한 약한 결합 활성은 바람직하게는 본래의 IgG의 보체 단백질 또는 본래의 Fc 영역을 포함하는 항체의 결합 활성에 비해 약 10 배 이상, 약 50 배 이상, 약 100 배 이상의 인자까지 감소되는 보체 단백질에 대한 결합 활성이다. 보체 단백질에 대한 Fc 영역의 결합 활성을 아미노산 치환, 삽입, 첨가 및/또는 결실과 같은 아미노산 서열의 변형에 의해 감소시킬 수 있다.

본 발명의 바람직한 실시태양에서, 상기 항원-결합 분자는 산성 또는 중성 pH에서 증가된 FcRn-결합 친화성을 가지며 효과기 수용체 및/또는 보체 단백질에 대해 약한 결합 활성을 갖거나 결합 활성을 갖지 않는다. 바람직하게는, 상기와 같은 항원-결합 분자는

a) EU238, EU250, EU252, EU254, EU255, EU256, EU258, EU286, EU307, EU308, EU309, EU311, EU315, EU428, EU433, EU434, 및 EU436으로 이루어진 그룹 중에서 선택된 하나 이상의 위치에서, 및

b) EU234, EU235, EU236, EU237, EU238, EU239, EU265, EU266, EU267, EU269, EU270, EU271, EU295, EU296, EU297, EU298, EU300, EU324, EU325, EU327, EU328, EU329, EU331, 및 EU332로 이루어진 그룹 중에서 선택된 하나 이상의 위치에서(EU 넘버링 시스템에 따라)

FcRn-결합 도메인 중에 치환을 포함한다. 보다 바람직하게는, 효과기 수용체 및/또는 보체 단백질에 대해 감소되거나 존재하지 않는 결합 활성을 갖는 본 발명의 변형된 항원-결합 분자는 EU235 위치에서 Lys 또는 Arg로, EU237에서 Lys 또는 Arg로, EU238 위치에서 Lys 또는 Arg로, EU239 위치에서 Lys 또는 Arg로, EU270 위치에서 Phe로, EU298 위치에서 Gly로, EU325 위치에서 Gly로, 및 EU329 위치에서 Lys 또는 Arg로의 치환으로 이루어진 그룹 중에서 선택된 Fc 영역 중의 하나 이상의 치환을 포함한다. 훨씬 더 바람직하게, 상기는 EU235 위치에서 Arg로 및 EU239 위치에서 Lys로의 Fc 영역 중의 치환을 포함한다. 또한 훨씬 더 바람직하게, 상기는 상기 Fc 영역 중에 치환 조합 L235R/S239K를 포함한다.

바람직하게는, 상기와 같은 항원-결합 분자는 또한 기존 ADA에 대해 현저하게 증가된 결합 활성을 갖지 않는다. 따라서, 효과기 수용체(들) 및/또는 보체 단백질에 대해 감소되거나 존재하지 않는 결합 활성을 갖는 본 발명의 항원-결합 분자는 c) EU387, EU422, EU424, EU426, EU433, EU436, EU438 및 EU440으로 이루어진 그룹 중에서 선택된 하나 이상의 위치에서 아미노산 치환을 추가로 포함한다. 본 발명의 보다 바람직한 실시태양에서, 상기 변형된 항원-결합 분자는 FcRn-결합 도메인에서 3 개 이상의 아미노산 치환을 포함하며, 여기에서 상기 3 개 이상의 치환은 표 14 및 15에 나타낸 조합들 중 하나이다.

추가의 변형들

더욱 또한, 본 발명의 항원-결합 분자는 상술한 변형 이외에, 상기 FcRn-결합 도메인의 EU257 위치에서 알라닌, 발린, 아이소류신, 류신 및 쓰레오닌으로 이루어진 그룹 중에서 선택된 아미노산을 포함하지 않고/않거나 상기 FcRn-결합 도메인의 EU252 위치에서 트립토판을 포함하지 않는다. 즉, 본 발명의 바람직한 항원-결합 분자는 상술한 변형들 중 임의의 것 외에, EU257 위치에서 알라닌, 발린, 아이소류신, 류신, 쓰레오닌, 아르기닌, 아스파라긴, 아스파트산, 시스테인, 글루탐산, 글루타민, 글리신, 히스티딘, 리신, 메티오닌, 페닐알라닌, 프롤린, 세린, 트립토판 또는 타이로신, 및 EU252 위치에서 아르기닌, 아스파라긴, 아스파트산, 시스테인, 글루탐산, 글루타민, 글리신, 히스티딘, 리신, 메티오닌, 페닐알라닌, 프롤린, 세린 또는 타이로신을 포함한다.

본 발명에서 언급된 위치 또는 위치들의 조합 중 임의의 하나에서의 치환 외에, EU239 위치에서 리신 및/또는 EU270 위치에서 페닐알라닌을 포함하는 변형된 FcRn-결합 도메인이 또한 바람직하다.

항원-결합 분자

본 발명의 항원-결합 분자는 상기 분자가 표적 항원에 특이적인 결합 활성을 갖는 항원-결합 도메인 및 본 발명의 FcRn-결합 도메인을 포함하는 한, 특별히 제한되지 않는다. 바람직한 항원-결합 도메인은 예를 들어 항체의 항원-결합 영역을 갖는 도메인을 포함한다. 항체의 항원-결합 영역은 예를 들어 CDR을 포함한다. 항체의 항원-결합 영역은 전체 항체로부터의 6 개 CDR 모두, 또는 1개, 2개 또는 그 이상의 CDR을 함유할 수도 있다. 상기 항체의 항원-결합 영역은 아미노산 결실, 치환, 첨가 및/또는 삽입을 포함하거나 또는 CDR의 일부를 포함할 수 있다.

다른 한편으로, 본 발명의 방법에 사용되는 항원-결합 분자는 길항작용 활성(길항작용성 항원-결합 분자)을 갖는 항원-결합 분자, 작용 활성을 갖는 항원-결합 분자(작용성 항원-결합 분자), 및 세포독성을 갖는 분자를 포함한다. 바람직한 실시태양에서, 상기 항원-결합 분자는 길항성 항원-결합 분자, 특히 수용체 또는 사이토킨과 같은 항원을 인식하는 길항성 항원-결합 분자이다.

본 발명의 항원-결합 분자는 바람직하게는 항체이다. 본 발명과 관련하여 바람직한 항체는 예를 들어 IgG 항체를 포함한다. 상기 사용되는 항체가 IgG 항체인 경우, IgG의 유형은 제한되지 않으며; 따라서 상기 IgG는 임의의 아이소타입(하위부류), 예를 들어 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4에 속할 수 있다. 인간 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 불변 영역의 경우에, 유전자 다형성(알로타입)이 문헌["Sequences of proteins of immunological interest, NIH Publication No.91-3242"]에 개시되어 있다. 이들 알로타입은 또한 본 출원의 불변 영역에 사용될 수 있다. 특히, 인간 IgG1의 경우, 아미노산 Asp-Glu-Leu(DEL) 및 Glu-Glu-Met(EEM)을 모두 EU 넘버링에서 356-358 중의 잔기에 사용할 수 있다. 유사하게, 인간 면역글로불린 카파 불변 영역의 경우, 유전자 다형성(알로타입)이 문헌["Sequences of proteins of immunological interest, NIH Publication No.91-3242"]에 개시되어 있다. 이들 알로타입을 또한 본 출원의 불변 영역에 사용할 수 있다. 더욱 또한, 본 발명의 항원-결합 분자는 항체 불변 영역을 포함할 수 있으며, 아미노산 돌연변이를 상기 불변 영역에 도입시킬 수 있다. 도입되는 아미노산 돌연변이는 예를 들어 Fc감마 수용체에 대한 결합을 강화하거나 손상하는 것들(문헌[Proc Natl Acad Sci U S A. 2006 Mar 14; 103(11): 4005-10])을 포함하나, 이들 예로 제한되지 않는다. 한편으로, IgG2의 것과 같은 적합한 불변 영역을 선택함으로써 pH-의존적인 결합을 변경시키는 것도 또한 가능하다(WO09125825).

본 발명의 항원-결합 분자가 항체인 경우, 상기 항체는 임의의 동물, 예를 들어 마우스, 인간, 래트, 토끼, 염소, 또는 낙타로부터 유래할 수 있다. 바람직하게, 상기 항체는 인간 항체이다. 더욱 또한, 상기 항체는 변경된 항체, 예를 들어 키메릭 항체, 및 특히 인간화된 항체의 서열에 아미노산 치환을 포함하는 변경된 항체 등일 수도 있다. 본 발명에 의해 고려되는 상기 항체의 범주는 또한 이중특이성 항체, 다양한 분자들과 결합된 항체 변형 산물, 및 항체 단편(특히 면역원성 및/또는 면역반응성 항체 단편)을 포함하는 폴리펩타이드를 포함한다. 바람직한 실시태양에서, 상기 항원-결합 분자는 단클론 항체이다.

"키메릭 항체"는 상이한 동물들로부터 유래한 서열들을 결합시켜 제조한 항체이다. 구체적으로, 상기 키메릭 항체는 예를 들어 마우스 항체의 중쇄 및 경쇄 가변(V) 영역 및 인간 항체의 중쇄 및 경쇄 불변(C) 영역을 갖는 항체를 포함한다. 키메릭 항체의 생성 방법은 공지되어 있다. 예를 들어 인간-마우스 키메릭 항체의 경우에, 예를 들어 항체 V 영역을 암호화하는 DNA를 인간 항체 C 영역을 암호화하는 DNA에 결합시킬 수 있으며; 이를 발현 벡터 내로 삽입하고 숙주에 도입시켜 키메릭 항체를 생성시킬 수 있다.

"인간화된 항체"(또한 개장된(reshaped) 인간 항체라고도 칭함)는 비인간 포유동물, 예를 들어 마우스로부터 유래한 항체의 상보성 결정 영역(CDR)이 인간 항체의 CDR 내로 이식된 항체로서 당해 분야에 공지되어 있다. CDR의 동정 방법은 공지되어 있다(문헌[Kabat et al., Sequence of Proteins of Immunological Interest (1987)], [National Institute of Health, Bethesda, Md.; Chothia et al., Nature (1989) 342: 877]). 상기 목적에 적합한 일반적인 유전자 재조합 기술들도 또한 공지되어 있다(유럽 특허 출원 EP 125023; 및 WO 96/02576을 참조하시오). 인간화된 항체를 공지된 방법에 의해 생성시킬 수 있다, 예를 들어 마우스 항체의 CDR을 결정하고, 상기 CDR이 인간 항체의 프레임워크 영역(FR)에 결합된 항체를 암호화하는 DNA를 수득한다. 이어서 인간화된 항체를 통상적인 발현 벡터를 사용하는 시스템을 사용하여 생성시킬 수 있다. 상기와 같은 DNA를, CDR 및 FR 모두의 단부 영역과 겹치는 부분들을 갖도록 제조된 여러 올리고뉴클레오타이드를 프라이머로서 사용하여, PCR에 의해 합성할 수 있다(WO 98/13388에 개시된 방법을 참조하시오). CDR을 통해 결합된 인간 항체 FR을 상기 CDR이 적합한 결합 부위를 형성하도록 선택한다. 경우에 따라, 항체 가변 영역의 FR 중의 아미노산을, 상기 개장된 인간 항체의 CDR이 적합한 항원 결합 부위를 형성할 수 있도록 변경시킬 수도 있다(문헌[Sato et al., Cancer Res. (1993) 53: 10.01-6]). 변경시킬 수 있는 FR 중의 아미노산 잔기는 비-공유 결합을 통해 항원에 직접 결합하는 부분(문헌[Amit et al., Science (1986) 233: 747-53]), CDR 구조에 영향을 미치는 부분(문헌[Chothia et al., J. Mol. Biol. (1987) 196: 901-17]), 및 VH-VL 상호작용에 관여하는 부분(EP 239400)을 포함한다.

본 발명의 항원-결합 분자가 키메릭 항체 또는 인간화된 항체인 경우, 이들 항체의 불변 영역은 바람직하게는 인간 항체로부터 유래한다. 예를 들어, H 쇄의 경우 C-감마1, C-감마2, C-감마3, 및 C-감마4를 사용할 수 있는 반면, L 쇄의 경우 C-카파 및 C-람다를 사용할 수 있다. 더욱이, 경우에 따라, 아미노산 돌연변이를, Fc-감마 수용체에 대한 결합을 증대 또는 감소시키거나, 또는 항체 안정성 또는 생산성을 개선시키기 위해서 인간 항체 C 영역 내로 도입시킬 수도 있다. 본 발명의 키메릭 항체는 바람직하게는 비인간 포유동물로부터 유래한 항체의 가변 영역 및 인간 항체로부터 유래한 불변 영역을 포함한다. 한편, 인간화된 항체는 바람직하게는 비인간 포유동물로부터 유래한 항체의 CDR 및 인간 항체로부터 유래한 FR 및 C 영역을 포함한다. 상기 인간 항체로부터 유래한 불변 영역은 바람직하게는 인간 FcRn-결합 영역을 포함한다. 상기와 같은 항체는 예를 들어 IgG(IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4)를 포함한다. 본 발명의 인간화된 항체에 사용되는 불변 영역은 임의의 아이소타입의 항체의 불변 영역일 수 있다. 바람직하게는 인간 IgG1으로부터 유래한 불변 영역이 사용되지만, 이들로 제한되는 것은 아니다. 상기 인간화된 항체에 사용되는, 인간 항체로부터 유래한 FR들은 어느 것으로도 특별히 제한되지 않으며, 임의의 아이소타입의 항체로부터 유래될 수 있다.

본 발명에 사용된 바와 같은 "이중특이성 항체"란 용어는 동일한 항체 분자 안에 상이한 에피토프를 인식하는 가변 영역들을 갖는 항체를 지칭한다. 이중특이성 항체는 2 개 이상의 상이한 항원을 인식하는 항체, 또는 동일 항원 상의 2 개 이상의 상이한 에피토프를 인식하는 항체일 수 있다.

더욱 또한, 항체 단편을 포함하는 폴리펩타이드는 예를 들어 scFv-Fc(WO 2005/037989), dAb-Fc, 및 Fc 융합 단백질일 수 있다. 상기와 같은 폴리펩타이드 중의 항체 단편은 예를 들어 Fab 단편, F(ab')2 단편, scFv(문헌[Nat Biotechnol. 2005 Sep; 23(9): 1126-36]), 도메인 항체(dAb)(WO 2004/058821, WO 2003/002609)일 수 있다. Fc 영역을, 분자가 Fc 영역을 포함하는 경우 인간 FcRn-결합 도메인으로서 사용할 수 있다. 한편으로, FcRn-결합 도메인을 상기 분자에 융합시킬 수도 있다.

더욱이, 본 발명에 적용할 수 있는 항원-결합 분자는 항체-유사 분자(예를 들어 본 발명의 Fc 영역과 항체-유사 분자와의 융합 단백질)이거나 상기 분자를 포함할 수 있다. 항체-유사 분자(스캐폴드 분자, 펩타이드 분자)는 표적 분자에 결합함으로써 기능을 발휘할 수 있는 분자이며(문헌[Current Opinion in Biotechnology (2006) 17: 653-658]; [Current Opinion in Biotechnology (2007) 18: 1-10]; [Current Opinion in Structural Biology (1997) 7: 463-469]; [Protein Science (2006) 15: 14-27]), 예를 들어 DARPins(WO 2002/020565), 애피바디(Affibody)(WO 1995/001937), 애비머(Avimer) (WO 2004/044011; WO 2005/040229), 및 애드넥틴(Adnectin) (WO 2002/032925)을 포함한다. 이들 항체-유사 분자가 pH-의존적인 또는 칼슘-의존적인 방식으로 표적 분자에 결합하고/하거나 중성 pH 범위에서 인간 FcRn-결합 활성을 가질 수 있는 경우, 상기 분자는 항원-결합 분자에 의한 세포 내로의 항원 흡수를 촉진하고, 항원-결합 분자를 투여함으로써 혈장 항원 농도의 감소를 촉진하고, 항원-결합 분자의 약동학을 개선시키고, 단일 항원-결합 분자가 결합할 수 있는 항원의 수를 증가시킬 수 있다.

더욱 또한, 상기 항원-결합 분자는 본 발명의 FcRn-결합 도메인과, 리간드를 포함하는 표적에 결합하는 수용체 단백질 간의 융합으로부터 생성되는 단백질일 수 있으며, 예를 들어 TNFR-Fc 융합 단백질, IL1R-Fc 융합 단백질, VEGFR-Fc 융합 단백질, 및 CTLA4-Fc 융합 단백질을 포함한다(문헌[Nat Med. 2003, Jan; 9(1): 47-52]; [BioDrugs. (2006) 20(3): 151-60]). 이들 수용체-FcRn-결합 도메인 융합 단백질이 중성 pH 범위에서 FcRn-결합 활성을 갖는 외에 pH-의존적인 또는 칼슘-의존적인 방식으로 리간드를 포함하는 표적 분자에 결합하는 경우, 상기 단백질은 항원-결합 분자에 의한 세포 내로의 항원 흡수를 촉진하고, 항원-결합 분자를 투여함으로써 혈장 항원 농도의 감소를 촉진하고, 항원-결합 분자의 약동학을 개선시키고, 단일 항원-결합 분자가 결합할 수 있는 항원의 수를 증가시킬 수 있다. 수용체 단백질을, 리간드를 포함한 표적에 대한 상기 수용체 단백질의 결합 도메인을 포함하도록 적합하게 디자인하고 변형시킨다. 이후의 실시예에 대해 언급하는 바와 같이(즉 TNFR-Fc 융합 단백질, IL1R-Fc 융합 단백질, VEGFR-Fc 융합 단백질, 및 CTLA4-Fc 융합 단백질), 리간드를 포함하는 상기 표적에의 결합에 필요한 수용체 단백질의 세포 외 도메인을 포함하는 가용성 수용체 분자가 특히 바람직하다. 상기와 같이 디자인되고 변형된 수용체 분자를 본 발명에서 인공 수용체라 지칭한다. 인공 수용체 분자의 제작을 위해 수용체 분자를 디자인하고 변형시키는데 사용되는 방법은 당해 분야에 공지되어 있으며 실제로 통상적이다.

더욱 또한, 본 발명의 항체들은 변형된 당 쇄를 가질 수 있다. 변형된 당 쇄를 갖는 항체는 예를 들어 변형된 글리코실화를 갖는 항체(WO 99/54342), 당 쇄에 첨가된 퓨코스가 불충분한 항체(WO 00/61739; WO 02/31140; WO 2006/067847; WO 2006/067913) 및 양분하는 GlcNAc가 있는 당 쇄를 갖는 항체(WO 02/79255)를 포함한다.

문헌[Journal of Immunology (2009) 182: 7663-7671]에 따라, 산성 pH 범위(pH 6.0)에서의 본래의 인간 IgG1의 인간 FcRn-결합 활성은 KD 1.7 마이크로몰(microM)인 반면, 중성 pH 범위에서 상기 활성은 거의 검출할 수 없다. 따라서, 바람직한 실시태양에서, 본 발명의 항원-결합 분자는 산성 pH 범위에서 인간 FcRn-결합 활성이 KD 1.7 마이크로몰보다 더 강하고 중성 pH 범위에서 본래의 인간 IgG의 경우와 동일하거나 이보다 더 강한 항원-결합 분자를 포함한다. 보다 바람직한 실시태양에서, 중성 pH 범위에서 기존 ADA에 대한 그의 결합 활성은 본래의 IgG1에 비해 현저하게 증가되지 않는다. 상기 KD 값을 문헌[the Journal of Immunology (2009) 182: 7663-7671]에 개시된 방법에 의해(칩 상에 상기 항원-결합 분자를 고정화하고 분석물로서 인간 FcRn을 로딩함으로써) 측정한다.

해리 상수(KD)를 인간 FcRn-결합 활성의 값으로서 사용할 수 있다. 그러나, 본래의 인간 IgG의 인간 FcRn-결합 활성은 중성 pH 범위(pH 7.4)에서 인간 FcRn-결합 활성을 거의 갖지 않는다. 따라서 KD로서 상기 활성을 계산하는 것은 종종 어렵다. 인간 FcRn-결합 활성이 pH 7.4에서 본래의 인간 IgG의 경우보다 더 큰지의 여부를 평가하는 방법은 동일한 농도로 분석물을 로딩한 후 비아코어 반응의 강도를 비교함에 의한 평가 방법을 포함한다. 구체적으로, pH 7.4에서 항원-결합 분자가 고정화된 인간 FcRn 칩의 로딩 후 반응이 pH 7.4에서 본래의 인간 IgG가 고정화된 칩 상에 인간 FcRn 로딩 후의 반응보다 더 강한 경우, 상기 항원-결합 분자의 인간 FcRn-결합 활성은 pH 7.4에서 본래의 인간 IgG의 경우보다 더 큰 것으로 판단된다.

본 발명과 관련하여, pH 7.0을 중성 pH 범위로서 사용할 수 있다. 중성 pH로서 pH 7.0의 사용은 인간 FcRn과 FcRn-결합 도메인 간의 약한 상호작용을 촉진할 수 있다. 상기 분석 조건에 사용된 온도로서, 10 내지 50 ℃ 중 임의의 온도에서 결합 친화성을 평가할 수 있다. 바람직하게는 인간 FcRn-결합 도메인과 인간 FcRn 간의 결합 친화성을 측정하기 위해서 15 내지 40 ℃ 범위의 온도를 사용한다. 보다 바람직하게는, 20 내지 35 ℃ 범위 중 임의의 온도, 예를 들어 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34 및 35 ℃ 중 어느 하나의 온도를 인간 FcRn-결합 도메인과 인간 FcRn 간의 결합 친화성을 측정하기 위해서 또한 사용한다. WO2011/122011의 실시예 5에 개시된 25 ℃의 온도가 본 발명의 실시태양에 대한 일례이다. 바람직한 실시태양에서, FcRn-결합 도메인과 인간 FcRn 간의 상호작용을 WO2011/122011의 실시예 5에 개시된 바와 같이 pH 7.0 및 25 ℃에서 측정할 수 있다. 인간 FcRn에 대한 항원-결합 분자의 결합 친화성을 WO2011/122011의 실시예 5에 개시된 바와 같이 비아코어에 의해 측정할 수 있다.

바람직하게는 중성 pH 범위에서의 결합 친화성을 pH 7.4에서 측정하며, 상기 pH는 생체 내 혈장(혈액) pH에 가깝다. pH 7.4에서의 낮은 친화성으로 인해 인간 FcRn-결합 도메인과 인간 FcRn간의 결합 친화성을 평가하기 어려울 때 pH 7.0을 pH 7.4에 대한 대안으로서 사용할 수 있다. 바람직하게는 산성 pH 범위에서의 결합 친화성을 pH 6.0에서 측정하며, 상기 pH는 생체 내 초기 엔도솜 중의 pH에 가깝다. 상기 분석 조건에 사용되는 온도로서, 인간 FcRn-결합 도메인과 인간 FcRn 간의 결합 친화성을 10 ℃ 내지 50 ℃ 중 임의의 온도에서 평가할 수 있다. 바람직하게, 인간 FcRn-결합 도메인과 인간 FcRn 간의 결합 친화성을 측정하기 위해서 15 ℃ 내지 40 ℃의 온도를 사용한다. 보다 바람직하게는, 20 내지 35 ℃ 중 임의의 온도, 예를 들어 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34 및 35 ℃ 중 어느 하나의 온도를 인간 FcRn-결합 도메인과 인간 FcRn 간의 결합 친화성을 측정하기 위해서 또한 사용한다. 25 ℃의 온도는 예를 들어 WO2011/122011의 실시예 5 및 본 발명의 실시예에 개시되어 있다.

본래의 인간 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4를 바람직하게는 인간 FcRn 결합 활성 또는 생체 내 활성에 대해 상기 항원-결합 분자와 비교되는 본래의 인간 IgG 기준으로서 사용한다. 바람직하게는, 관심 항원-결합 분자와 동일한 항원-결합 도메인 및 인간 FcRn-결합 도메인으로서 본래의 인간 IgG Fc 영역을 포함하는 항원-결합 분자를 기준으로서 사용한다. 보다 바람직하게는, 본래의 인간 IgG1을 본 발명의 항원-결합 분자의 인간 FcRn 결합 활성 또는 생체 내 활성과 그의 인간 FcRn 결합 활성 또는 생체 내 활성을 비교하기 위한 본래의 인간 IgG 기준으로서 사용한다.

pH 이외에 항원-결합 또는 인간 FcRn-결합 활성에 대한 분석에 사용되는 조건은 당해 분야의 숙련가들에 의해 적합하게 선택될 수 있으며, 상기 조건들은 특별히 제한되지 않는다. 예를 들어, WO 2009/125825에 개시된 바와 같이 37 ℃에서 MES 완충제를 사용하는 조건을 사용하여 상기 활성을 측정할 수 있다. 또 다른 실시태양에서, WO2011/122011의 실시예 4 또는 5에 개시된 바와 같이 25 ℃에서 Na-포스페이트 완충제를 사용하여 상기 활성을 측정할 수 있다. 한편, 항원-결합 분자의 항원-결합 활성 및 인간 FcRn-결합 활성을 당해 분야의 숙련가들에게 공지된 방법에 의해, 예를 들어 비아코어(GE 헬쓰케어(Healthcare)) 등을 사용하여 측정할 수 있다. 상기 항원이 가용성 항원인 경우, 상기 가용성 항원에 결합하는 항원-결합 분자의 활성을, 분석물로서 상기 항원을 상기 항원-결합 분자가 고정화된 칩 상에 로딩함으로써 측정할 수 있다. 한편으로, 상기 항원이 막-유형 항원인 경우, 상기 막-유형 항원에 결합하는 항원-결합 분자의 활성을 항원-고정화된 칩 상에 분석물로서 상기 항원-결합 분자를 로딩함으로써 측정할 수 있다. 항원-결합 분자의 인간 FcRn-결합 활성을, 각각 상기 항원-결합 분자 또는 인간 FcRn이 고정화된 칩 상에 분석물로서 인간 FcRn 또는 항원-결합 분자를 로딩함으로써 측정할 수 있다.

본 발명은 중성 pH 범위에서 증가된 인간 FcRn-결합 활성을 갖는, 항원-결합 도메인 및 인간 FcRn-결합 도메인을 포함하는 본 발명의 항원-결합 분자를 제공한다. 바람직하게는, 중성 pH 범위에서 기존 ADA에 대한 그의 결합 활성은 현저하게 증가되지 않는다. 중성 pH 범위에서 상기와 같은 항원-결합 분자의 FcRn-결합 활성은 바람직하게는 KD 3.2 마이크로몰보다 더 강하다. 보다 바람직하게는, 중성 pH 범위에서의 상기 FcRn-결합 활성은 700 나노몰보다 더 강하고, 훨씬 더 바람직하게는 500 나노몰보다 더 강하고, 가장 바람직하게는 150 나노몰보다 더 강하다. 바람직하게는, 상기 항원-결합 분자는 중성 pH 범위에서 증가된 인간 FcRn-결합 활성, 및 중성 pH 범위에서보다 산성 pH 범위에서 더 낮거나 또는 고 칼슘 농도 조건에서보다 저 칼슘 농도 조건에서 더 낮은 항원-결합 활성을 갖는다. 바람직하게는 중성 pH 범위에서 기존 ADA에 대한 상기와 같은 항원-결합 분자의 결합 활성은 현저하게 증가되지 않는다. 본 발명은 또한 항원-결합 도메인 및 인간 FcRn-결합 도메인을 포함하는 본 발명의 항원-결합 분자를 제공하며, 여기에서 상기 분자의 인간 FcRn-결합 활성은 중성 pH 범위에서 증가되고, 더욱이 중성 pH 범위에서 상기 인간 FcRn-결합 활성은 본래의 인간 IgG의 경우보다 28 배 더 강하며, 보다 바람직하게는 중성 pH 범위에서 상기 인간 FcRn-결합 활성은 본래의 인간 IgG의 경우보다 38 배 더 강하다. 바람직하게는, 중성 pH 범위에서 기존 ADA에 대한 상기와 같은 항원-결합 분자의 결합 활성은 현저하게 증가되지 않는다. 본 발명의 항원-결합 분자는 중성 pH 범위에서 증가된 FcRn-결합 활성을 갖는다. 바람직하게, 중성 pH 범위에서 현저하게 증가되지 않은 기존 ADA에 대한 결합 활성은 pH 7.0 및 25 ℃에서, 본래의 인간 IgG보다 28 배 더 강한, 바람직하게는 38 배 더 강한 인간 FcRn-결합 활성을 갖는다. 한편으로, pH 7.0 및 25 ℃에서 증가된 FcRn 결합 활성을 갖는 항원-결합 분자의 인간 FcRn-결합 활성은 바람직하게는 KD 3.2 마이크로몰보다 더 강하다. 보다 바람직하게는 pH 7.0 및 25 ℃에서 FcRn-결합 활성은 700 나노몰보다 더 강하고, 보다 바람직하게는 500 나노몰보다 더 강하며, 가장 바람직하게는 150 나노몰보다 더 강하다.

본 발명은 산성 pH 범위에서 증가된 FcRn-결합 활성 및 중성 pH 범위에서 현저하게 증가되지 않은 기존 ADA에 대한 결합 활성을 갖는, 본 발명의 항원-결합 도메인 및 인간 Fc 영역을 포함하는 본 발명의 항원-결합 분자를 제공한다. 본 발명은 또한 산성 pH 범위에서 증가된 인간 FcRn-결합 활성 및 중성 pH 범위에서 본래의 IgG의 기존 ADA에 대한 결합 활성에 비해 현저하게 증가되지 않은 기존 ADA에 대한 결합 활성을 갖는 항원-결합 도메인 및 인간 FcRn-결합 도메인을 포함하는 본 발명의 항원-결합 분자를 제공하며, 여기에서 산성 pH 범위에서 상기 인간 FcRn-결합 활성은 본래의 인간 IgG의 인간 FcRn-결합 활성보다 약 2 배 내지 약 100 배 더 강한 범위에 있다. 바람직하게는 산성 pH 범위에서 본 발명의 항원-결합 분자의 인간 FcRn-결합 활성은 본래의 인간 IgG의 FcRn-결합 활성보다 10 배 이상 더 강하고, 보다 바람직하게는, 산성 pH 범위에서 상기 인간 FcRn-결합 활성은 본래의 IgG의 경우보다 20 배 이상 더 강하다. 산성 pH 범위에서 증가된 FcRn-결합 활성을 갖는 본 발명의 항원-결합 분자(이때 중성 pH 범위에서 기존 ADA에 대한 그의 결합 활성은 현저하게 증가되지 않는다)는 pH 6.0 및 25 ℃에서 본래의 인간 IgG보다 10 배 더, 바람직하게는 20 배 더 강한 인간 FcRn-결합 활성을 갖는다.

본 발명의 항원-결합 분자는 중성 pH 범위에서 증가된 FcRn-결합 활성뿐만 아니라 중성 pH 범위에서의 항원-결합 활성보다 더 낮은 산성 pH 범위에서의 항원-결합 활성, 또는 고 칼슘 농도 조건에서의 항원-결합 활성보다 더 낮은 저 칼슘 농도에서의 항원-결합 활성을 가질 수 있다. 상기와 같은 항원-결합 분자의 구체적인 예는, pH 7.4에서 본래의 Ig보다 더 높은 인간 FcRn에 대한 결합 활성을 갖고 항원-결합 활성이, 각각 혈장 및 초기 엔도솜의 생체 내 pH인 것으로 추정되는 pH 7.4에서보다 pH 5.8에서 더 낮은 것들을 포함한다. 항원-결합 활성이 pH 7.4에서보다 pH 5.8에서 더 낮은 항원-결합 분자를 또한, 항원-결합 활성이 pH 5.8에서보다 pH 7.4에서 더 강한 항원-결합 분자로서 지칭할 수 있다. KD(pH 5.8)/KD(pH 7.4)의 값(이는 pH 5.8 및 pH 7.4에서 항원에 대한 해리 상수(KD)의 비이다)은 1.5, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 50, 70, 80, 100, 500, 1000 또는 10,000, 바람직하게는 2 이상, 보다 바람직하게는 10 이상, 훨씬 더 바람직하게는 40 이상이다. 상기 KD(pH 5.8)/KD(pH 7.4) 값의 상한은 특별히 제한되지 않으며, 당해 분야의 숙련가들의 기술을 사용하여 생성이 가능한 한은 임의의 값, 예를 들어 400, 1,000 또는 10,000일 수 있다.

산성 pH 범위에서 증가된 FcRn-결합 활성뿐만 아니라, 중성 pH 범위에서보다 산성 pH 범위에서 더 낮은 항원-결합 활성 또는 고 칼슘 농도에서보다 저 칼슘 농도에서 더 낮은 항원-결합 활성을 갖는 본 발명의 항원-결합 분자가 또한 바람직하다. 바람직하게는, 중성 pH 범위에서 기존 ADA에 대한 상기와 같은 항원-결합 분자의 결합 활성은 현저하게 증가되지 않는다. 상기와 같은 항원-결합 분자의 구체적인 예는 pH 5.8 내지 pH 6.0(이는 초기 엔도솜의 생체 내 pH인 것으로 추정되며 상기 분자의 항원-결합 활성은 pH 7.4에서보다 pH 5.8에서 더 낮다)에서 IgG보다 더 큰 인간 FcRn에 대한 결합 활성을 갖는 것들을 포함한다. 항원-결합 활성이 pH 7.4에서보다 pH 5.8에서 더 낮은 항원-결합 분자를 또한, 항원-결합 활성이 pH 7.4에서보다 pH 5.8에서 더 약한 항원-결합 분자라 칭할 수 있다. 바람직하게는, 산성 pH 범위에서 증가된 결합 활성을 갖는 항원-결합 분자는 중성 pH 범위에서 본래의 인간 IgG보다 더 강한 FcRn-결합 활성을 갖는다.

본 발명의 변형된 FcRn-결합 도메인을 표적 항원의 유형에 관계없이, 임의의 항원-결합 분자에 적용할 수 있다.

본 발명의 항원-결합 분자는 다른 성질들을 가질 수도 있다. 예를 들어, 상기 분자는 a) 중성 pH 범위에서 필수적인 증가된 인간 FcRn-결합 활성, 또는 b) 산성 범위에서 증가된 인간 FcRn-결합 활성을 갖고 기존 ADA에 대한 그의 결합 활성이 현저하게 증가되지 않는다면, 작용성 또는 길항성 항원-결합 분자일 수 있다. 바람직하게는, 상기와 같은 항원-결합 분자의 항원-결합 활성은 중성 pH 범위에서보다 산성 pH 범위에서 더 낮다. 본 발명의 바람직한 항원-결합 분자는 예를 들어 길항작용성 항원-결합 분자이다. 상기와 같은 길항작용성 항원-결합 분자는 전형적으로 리간드(작용물질)와 수용체 간의 결합을 차단함으로써 수용체-매개된 세포 내 신호전달을 억제하는 항원-결합 분자이다.

한편, 본 발명의 항원-결합 분자는 임의의 항원을 인식할 수 있다. 본 발명의 항원-결합 분자에 의해 인식된 구체적인 항원은 예를 들어 상술한 수용체 단백질(막-결합된 수용체 및 가용성 수용체), 막 항원, 예를 들어 세포-표면 마커, 및 가용성 항원, 예를 들어 사이토킨을 포함한다. 상기와 같은 항원은 예를 들어 하기에 개시되는 항원들을 포함한다.

항원-결합 도메인을 포함하는 본 발명의 항원-결합 분자는 혈장 및 엔도솜에서 항원에 대한 항원 결합 분자의 차별적인 결합 친화성(혈장에서 강한 결합 및 엔도솜에서 약한 결합)에 대해 혈장과 엔도솜 간의 환경적 차이로서 pH의 차이를 이용할 수 있다. 혈장과 엔도솜 간의 환경적 차이가 pH의 차이로 제한되지 않으므로, 항원 상의 항원-결합 분자의 결합에 대한 pH 의존적인 결합 성질은 상기 혈장과 엔도솜 내에서 농도가 상이한 다른 인자들, 예를 들어 이온화된 칼슘 농도의 사용에 의해 대체될 수 있다. 상기와 같은 인자를 또한, 혈장 내에서 항원에 결합하지만 엔도솜 내에서는 항원을 해리하는 항체를 생성시키는데 사용할 수 있다. 따라서, 본 발명은 또한 인간 FcRn-결합 활성이 중성 pH 범위에서 증가되고 엔도솜 중에서의 항원-결합 활성이 혈장에 비해 더 낮은 인간 FcRn-결합 도메인을 포함하는 항원-결합 분자를 포함한다. 바람직하게는, 중성 pH 범위에서 기존 ADA에 대한 상기 항원-결합 분자의 결합 활성은 현저하게 증가되지 않는다. 상기와 같은 항원-결합 분자의 인간 FcRn-결합 활성은 혈장에서 본래의 인간 IgG의 경우보다 더 강하며, 또한 상기와 같은 항원-결합 분자의 항원-결합 도메인은 상기 혈장에서보다 엔도솜 내부에서 상기 항원에 대해 더 낮은 친화성을 갖는다. 바람직하게는, 상기 항원-결합 도메인은, 산성 pH 범위에서 항원-결합 활성이 중성 pH 범위에서보다 더 낮은 항원-결합 도메인(pH-의존성 항원-결합 도메인), 또는 항원-결합 활성이 고 칼슘 농도 조건 하에서보다 저 칼슘 농도에서 더 낮은 항원-결합 도메인(칼슘-농도-의존성 항원-결합 도메인)이다. 본 발명은 또한 산성 pH 범위에서 증가된 인간 FcRn-결합 활성을 갖는, 인간 FcRn-결합 도메인을 갖는 항원-결합 분자를 포함하고, 상기 항원-결합 분자는, 상기 엔도솜 중의 항원-결합 분자의 인간 FcRn-결합 활성이 본래의 인간 IgG의 경우보다 더 강하고 상기 엔도솜 중의 항원-결합 분자의 항원-결합 활성이 혈장 중에서보다 더 강하도록, 혈장에서보다 엔도솜 내부에서 상기 항원에 대해 더 낮은 친화성을 갖는 항원-결합 도메인을 추가로 포함한다. 바람직하게는 중성 pH 범위에서 기존 ADA에 대한 상기 항원-결합 분자의 결합 활성이 현저하게 증가되지 않는다. 바람직하게는, 상기 항원-결합 도메인은 산성 pH 범위에서 항원-결합 활성이 중성 pH 범위에서보다 더 낮은 항원-결합 도메인(pH-의존성 항원-결합 도메인) 또는 항원-결합 활성이 고 칼슘 농도 조건 하에서보다 저 칼슘 농도에서 더 낮은 항원-결합 도메인(칼슘-농도-의존성 항원-결합 도메인)이다.

본 발명의 항원-결합 분자는, 특히 본 발명의 항원-결합 분자가 pH-의존성 항원-결합 도메인이거나 또는 칼슘-농도-의존성 항원-결합 도메인인 항원-결합 도메인을 포함하는 경우, 세포 내로의 항원 흡수를 촉진한다. 상기 항원-결합 분자는 엔도솜에서 항원으로부터 쉽게 해리되고, 이어서 인간 FcRn에의 결합에 의해 세포 밖으로 방출된다. 본 발명의 항원-결합 분자는 다시 혈장 중에서 항원에 쉽게 결합하는 것으로 추정된다. 따라서, 예를 들어 본 발명의 항원-결합 분자가 중화 항원-결합 분자인 경우, 상기 혈장 항원 농도의 감소는 상기 분자의 투여에 의해 촉진될 수 있다.

항원-결합 도메인

바람직하게는, 상기 항원-결합 분자의 항원-결합 도메인은 산성 pH 또는 저 칼슘 이온 농도에서 항원에 대해 감소된 친화성을 갖는다. 보다 바람직하게는, 상기 항원-결합 도메인은 본 발명에 개시된 pH-의존성 항원-결합 도메인 또는 이온화된 칼슘 농도 의존성 항원-결합 도메인이다.

A) pH-의존성 항원-결합 도메인

더욱 또한, 본 발명의 항원-결합 분자는 바람직하게는 산성 pH 범위에서의 항원-결합 활성이 중성 pH 범위에서보다 더 낮은 pH-의존성 항원-결합 도메인을 포함한다. 상기 항원-결합 분자는 바람직하게는 중성 pH 범위에서보다 산성 pH 범위에서 더 낮은 항원-결합 활성을 갖는다. 상기 결합 활성비는, 상기 항원-결합 활성이 중성 pH 범위에서보다 산성 pH 범위에서 더 낮다면, 제한되지 않는다. 바람직한 실시태양에서, 본 발명의 항원-결합 분자는 pH 7.4에서의 항원-결합 활성이 pH 5.8에서의 경우보다 2 배 더 큰, 바람직하게는 pH 7.4에서의 항원-결합 활성이 pH 5.8에서의 경우보다 10 배 더 큰 항원-결합 분자를 포함한다. 더욱 더 바람직한 실시태양에서, 본 발명의 항원-결합 분자는 pH 7.4에서의 항원-결합 활성이 pH 5.8에서의 경우보다 40 배 이상 더 큰 항원-결합 분자를 포함한다.

본 발명의 항원-결합 분자의 구체적인 예는 WO 2009/125825에 개시된 실시태양들을 포함한다. 바람직한 실시태양에서, pH-의존성 항원-결합 도메인을 포함하는 본 발명의 항원-결합 분자는 pH 5.8에서, pH 7.4에서의 경우보다 더 낮은 항원-결합 활성을 가지며, 여기에서 KD(pH 5.8)/KD(pH 7.4)의 값(이는 pH 5.8 및 pH 7.4에서 항원에 대한 해리 상수(KD)의 비이다)은 바람직하게는 2 이상, 보다 바람직하게는 10 이상, 훨씬 더 바람직하게는 40 이상이다. 상기 KD(pH 5.8)/KD(pH 7.4) 값의 상한은 특별히 제한되지 않으며, 당해 분야의 숙련가들의 기술을 사용하여 생성이 가능한 한은 임의의 값, 예를 들어 400, 1,000 또는 10,000일 수 있다.

또 다른 바람직한 실시태양에서, pH 5.8에서의 항원-결합 활성이 pH 7.4에서의 경우보다 더 낮은 본 발명의 항원-결합 분자는 2 이상, 보다 바람직하게는 5 이상, 훨씬 더 바람직하게는 10 이상, 및 훨씬 더 바람직하게는 30 이상인, KD(pH 5.8)/KD(pH 7.4)의 값(이는 pH 5.8에서의 항원에 대한 KD 및 pH 7.4에서의 항원에 대한 KD의 비이다)을 갖는다. 상기 KD(pH 5.8)/KD(pH 7.4) 값의 상한은 특별히 제한되지 않으며, 당해 분야의 숙련가들의 기술을 사용하여 생성이 가능한 한은 임의의 값, 예를 들어 50, 100 또는 200일 수 있다.

상기 항원-결합 활성, 기존 ADA에 대한 결합 활성 및 인간 FcRn-결합 활성을 측정하는 pH 이외의 조건은 당해 분야의 숙련가들에 의해서 적합하게 선택될 수 있으며, 상기와 같은 조건은 특별히 제한되지 않으나; 상기 측정을 예를 들어 실시예에 개시된 바와 같이 MES 완충제 및 37 ℃의 조건 하에서 수행할 수 있다. 더욱 또한, 항원-결합 분자의 항원-결합 활성을 실시예에 개시된 바와 같이, 당해 분야의 숙련가들에게 공지된 방법에 의해, 예를 들어 비아코어 T100(GE 헬쓰케어) 등을 사용하여 측정할 수 있다.

산성 pH 범위에서의 항원-결합 분자의 항원-결합 활성을 중성 pH 범위에서의 경우보다 작게 감소(손상)시키는 방법(pH-의존적인 결합 능력을 부여하는 방법)은 특별히 제한되지 않으며 적합한 방법들은 당해 분야의 숙련가에게 공지되어 있다. WO 2009/125825는 예를 들어 항원-결합 도메인 중의 아미노산을 히스티딘으로 치환시키거나 상기 항원-결합 도메인 내로 히스티딘을 삽입함으로써 산성 pH 범위에서의 항원-결합 활성을 중성 pH 범위에서의 경우보다 작게 감소(손상)시키는 방법을 개시한다. 항체 중의 아미노산을 히스티딘으로 치환시킴으로써 항체에 pH-의존적인 항원-결합 활성을 부여할 수 있음이 추가로 공지되어 있다(문헌[FEBS Letter (1992) 309(1): 85-88]). 다른 적합한 방법은 항원-결합 도메인 중의 아미노산을 비-천연 아미노산으로 치환시키거나 또는 상기 항원-결합 도메인 내로 비-천연 아미노산을 삽입하는 방법을 포함한다. pKa를 비-천연 아미노산을 사용하여 인위적으로 조절할 수 있음은 공지되어 있다(문헌[Angew. Chem. Int. Ed. 2005, 44, 34]; [Chem Soc Rev. 2004 Sep 10, 33 (7): 422-30]; [Amino Acids. (1999) 16(3-4): 345-79]). 본 발명과 관련하여 임의의 비천연 아미노산을 사용할 수도 있다. 실제로, 당해 분야에 공지된 비천연 아미노산을 사용하는 것이 가능하다.

바람직한 실시태양에서, 중성 pH 범위에서보다 산성 pH 범위에서 더 낮은 항원-결합 활성을 갖는 항원-결합 도메인을 포함하는 본 발명의 항원 결합 분자는 상기 항원-결합 분자 중의 하나 이상의 아미노산이 히스티딘 또는 비천연 아미노산으로 치환되고/되거나 하나 이상의 히스티딘 또는 비천연 아미노산이 삽입된 항원-결합 분자를 포함한다. 상기 히스티딘 또는 비천연 아미노산 돌연변이가 도입되는 부위는 특별히 제한되지 않으며 당해 분야의 숙련가들에 의해 적합한 것으로 생각되는 임의의 부위일 수 있으나, 단 치환 전에 비해 산성 pH 범위에서 생성된 항원-결합 활성이 중성 pH 범위에서의 경우보다 더 약해야 한다(KD(산성 pH 범위에서)/KD(중성 pH 범위에서) 값이 더 크거나 또는 kd(산성 pH 범위에서)/kd(중성 pH 범위에서) 값이 더 커야 한다). 예로서 상기 항원-결합 분자가 항체인 경우에 상기 항체의 가변 영역 및 CDR을 포함한다. 히스티딘 또는 비-천연 아미노산으로 치환되는 아미노산의 수 및 삽입되는 아미노산의 수는 당해 분야의 숙련가들에 의해 적합하게 결정될 수 있다. 하나의 아미노산이 히스티딘 또는 비-천연 아미노산으로 치환되거나, 또는 하나의 아미노산이 삽입되거나, 또는 2 개 이상의 아미노산이 히스티딘 또는 비-천연 아미노산으로 치환되거나, 또는 2 개 이상의 아미노산이 삽입될 수도 있다. 더욱이, 히스티딘 또는 비-천연 아미노산의 치환 또는 히스티딘 또는 비-천연 아미노산의 삽입과 별개로, 다른 아미노산들의 결실, 첨가, 삽입 및/또는 치환 등이 동시에 수행될 수도 있다. 히스티딘 또는 비-천연 아미노산의 치환 또는 히스티딘 또는 비-천연 아미노산의 삽입을 히스티딘 스캐닝(당해 분야의 숙련가들에게 공지된 알라닌 스캐닝에서 알라닌 대신에 히스티딘을 사용한다)과 같은 방법을 사용하여 랜덤하게 수행할 수 있다. 상기 돌연변이의 도입 전에 비해 KD(pH 5.8)/KD(pH 7.4) 또는 kd(pH 5.8)/kd(pH 7.4)가 증가된 항원-결합 분자를, 히스티딘 또는 비-천연 아미노산 돌연변이가 랜덤하게 도입된 항원-결합 분자로부터 선택할 수 있다.

바람직하게는, 중성 pH(즉 pH 7.4)에서 상기 항원-결합 도메인의 결합 활성이 유지된다. 상기 히스티딘 또는 비-천연 아미노산 돌연변이 전의 항원-결합 분자의 항원-결합 활성을 100%로 정하는 경우, 상기 히스티딘 또는 비-천연 아미노산 돌연변이 후 pH 7.4에서의 항원-결합 분자의 항원-결합 활성이 10% 이상, 바람직하게는 50% 이상, 보다 바람직하게는 80% 이상, 및 더욱 더 바람직하게는 90% 이상임을 의미한다. 상기 히스티딘 또는 비-천연 아미노산 돌연변이 후 pH 7.4에서의 항원-결합 활성이 히스티딘 또는 비-천연 아미노산 돌연변이 전 pH 7.4에서의 항원-결합 활성보다 더 강할 수도 있다. 상기 항원-결합 분자의 항원-결합 활성이 히스티딘 또는 비-천연 아미노산의 치환 또는 삽입으로 인해 감소하는 경우, 상기 항원-결합 활성을, 상기 항원-결합 활성이 히스티딘 치환 또는 삽입 전의 경우와 동등해지도록 상기 항원-결합 분자 내로 하나 이상의 아미노산을 치환, 결실, 첨가 및/또는 삽입하는 등으로써 조절할 수도 있다.

본 발명과 관련하여, 상기 항원-결합 분자가 항체인 경우, 히스티딘 또는 비천연 아미노산의 가능한 치환 부위는 예를 들어 WO 2009/125825에 개시된 부위를 포함하여, CDR 서열 및 항체의 CDR 구조를 맡는 서열을 포함한다.

더욱 또한, 본 발명은 하기 부위들 중 하나에서 하나 이상의 아미노산에 대한 히스티딘 또는 비-천연 아미노산의 치환을 갖는 항원-결합 분자를 제공한다

중쇄: H27, H31, H32, H33, H35, H50, H58, H59, H61, H62, H63, H64, H65, H99, H100b, 및 H102

경쇄: L24, L27, L28, L32, L53, L54, L56, L90, L92, 및 L94

이들 변경 부위 중에서, H32, H61, L53, L90, 및 L94는 대단히 일반적인 변경 부위인 것으로 추정된다. 상기 아미노산 위치는 카밧 넘버링에 따라 나타낸다(문헌[Kabat et al., Sequences of Immunological Interest. 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)]). 상기 카밧 넘버링 시스템을 일반적으로는 가변 도메인 중의 잔기(대략 경쇄의 1 내지 107 잔기 및 중쇄의 1 내지 113 잔기)를 지칭하는 경우에 사용한다. 구체적으로, 히스티딘 또는 비-천연 아미노산 치환에 바람직한 부위들의 조합은 예를 들어 H27, H31, 및 H35의 조합; H27, H31, H32, H35, H58, H62, 및 H102의 조합; L32 및 L53의 조합; 및 L28, L32, 및 L53의 조합을 포함한다. 더욱 또한, 중쇄 및 경쇄 중의 치환 부위의 바람직한 조합은 예를 들어 H27, H31, L32 및 L53의 조합을 포함한다.

상기 항원이 IL-6 수용체(예를 들어 인간 IL-6 수용체)인 경우에, 바람직한 변경 부위는 하기를 포함하나, 이들로 특별히 제한되지 않는다.

중쇄: H27, H31, H32, H35, H50, H58, H61, H62, H63, H64, H65, H100b, 및 H102

경쇄: L24, L27, L28, L32, L53, L56, L90, L92, 및 L94

구체적으로, 히스티딘 또는 비-천연 아미노산 치환에 바람직한 부위들의 조합은 예를 들어 H27, H31, 및 H35의 조합; H27, H31, H32, H35, H58, H62, 및 H102의 조합; L32 및 L53의 조합; 및 L28, L32, 및 L53의 조합을 포함한다. 더욱 또한, 중쇄 및 경쇄 중의 치환 부위의 바람직한 조합은 예를 들어 H27, H31, L32 및 L53의 조합을 포함한다.

히스티딘 또는 비-천연 아미노산을 상기 언급한 위치들 중 하나 이상에서 치환시킬 수 있다.

한편으로, 본 발명의 항원-결합 분자는 pH 5.8에서의 항원-결합 활성이 pH 7.4에서의 경우보다 더 낮도록 변경된 항체 불변 영역을 포함할 수 있다. 상기 항원-결합 분자 중에 함유된 항체 불변 영역을 변경시키기 위한 방법은 공지되어 있으며 실제로 당해 분야의 숙련가에게 통상적이다. 변경 후 항체 불변 영역의 구체적인 예는 WO 2009/125825의 실시예에 개시된 불변 영역(서열번호 11, 12, 13 및 14)을 포함한다.

한편, 항체 불변 영역을 변경시키는 방법은 예를 들어 다양한 불변 영역 아이소타입(IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4)을 평가하는 방법을 포함하고 산성 pH 범위에서의 항원-결합 활성을 감소시키는(산성 pH 범위에서의 해리속도를 증가시키는) 아이소타입을 선택하는 방법은 공지되어 있다. 상기와 같은 방법은 또한 야생형 아이소타입의 아미노산 서열(야생형 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4의 아미노산 서열) 내로 아미노산 치환을 도입시킴으로써 산성 pH 범위에서의 항원-결합 활성을 감소시키는(산성 pH 범위에서의 해리속도를 증가시키는) 방법을 포함한다. 상기 항체 불변 영역 중의 힌지 영역의 서열은 아이소타입들(IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4) 가운데에서도 상당히 상이하며, 상기 힌지 영역 아미노산 서열의 차이는 상기 항원-결합 활성에 큰 영향을 미친다. 따라서 항원 또는 에피토프의 유형에 따라 산성 pH 범위에서의 항원-결합 활성을 감소시키기 위해(산성 pH 범위에서의 해리속도를 증가시키기 위해) 적합한 아이소타입을 선택하는 것이 가능하다. 더욱 또한, 상기 힌지 영역 아미노산 서열의 차이가 상기 항원-결합 활성에 큰 영향을 미치므로, 야생형 아이소타입의 아미노산 서열 중 바람직한 아미노산 치환 부위는 상기 힌지 영역 내에 있는 것으로 추정된다.

상술한 방법들을 사용하여 상기와 같은 성질을 갖지 않는 항원-결합 분자로부터 아미노산 치환 또는 삽입에 의해 상기 산성 pH 범위에서의 항원-결합 활성이 중성 pH 범위에서의 경우보다 작게 감소되는(약화되는) 항원-결합 분자(pH-의존적인 방식으로 결합하는 항원-결합 분자)를 생성시킬 수 있다. 다른 방법은 상술한 성질을 갖는 항원-결합 분자를 직접 수득하는 방법을 포함한다. 예를 들어, 목적하는 관심 성질을 갖는 항체를, 동물(마우스, 래트, 햄스터, 토끼, 인간 면역글로불린-트랜스제닉 마우스, 인간 면역글로불린-트랜스제닉 래트, 인간 면역글로불린-트랜스제닉 토끼, 라마, 낙타 등)을 항원으로 면역시켜 수득한 항체로부터 지표로서 상기 pH-의존적인 항원 결합을 사용하여 선별함으로써 직접 선택할 수도 있다. 항체를 당해 분야의 숙련가들에게 공지된 방법들인 하이브리도마 기술 또는 B-세포 클로닝 기술(문헌[Bernasconi et al., Science (2002) 298, 2199-2202]; WO2008/081008)에 의해 생성시킬 수 있으나, 이들로 제한되지 않는다. 한편으로, 관심 성질을 갖는 항체를, 시험관 내에서 항원-결합 도메인을 제공하는 라이브러리로부터 지표로서 pH-의존적인 항원 결합을 사용하여 선별함으로써 직접 선택할 수도 있다. 상기와 같은 라이브러리는 당해 분야의 숙련가들에게 공지된 라이브러리들인 인간 본래의 라이브러리, 비-인간 동물 및 인간으로부터의 면역된 라이브러리, 반-합성 라이브러리 및 합성 라이브러리를 포함하나(문헌[Methods Mol Biol. 2002; 178: 87-100]; [J Immunol Methods. 2004 Jun; 289(1-2): 65-80]; 및 [Expert Opin Biol Ther. 2007 May; 7(5): 763-79]), 이들로 제한되지 않는다. 그러나, 상기 방법들은 이들 예로 특별히 제한되지 않는다.

B) 이온화된 칼슘-의존성 항원-결합 도메인

또 다른 바람직한 실시태양에서, 본 발명의 항원-결합 분자는 칼슘-이온 의존성 항원-결합 도메인을 포함한다. 상기와 같은 항원-결합 분자의 항원-결합 활성은 칼슘 농도에 의존하며, 이때 저 칼슘 농도에서 상기 항원-결합 활성은 고 칼슘 농도에서보다 낮다.

바람직하게는, 상기 항원-결합 활성은 0.5 내지 10 마이크로몰의 이온화된 칼슘 농도에서의 항원-결합 활성을 포함한다. 보다 바람직한 이온화된 칼슘 농도는 생체 내 초기 엔도솜 중의 이온화된 칼슘 농도를 포함한다. 구체적으로, 상기 항원-결합 활성은 1 내지 5 마이크로몰에서의 활성을 포함한다. 한편, 고 칼슘 농도에서 항원-결합 분자의 항원-결합 활성은 특별히 제한되지 않으나, 단 상기 활성은 100 마이크로몰 내지 10 mM의 이온화된 칼슘 농도에서 항원-결합 활성이어야 한다. 바람직하게는, 상기 항원-결합 활성은 200 마이크로몰 내지 5 mM의 이온화된 칼슘 농도에서 항원-결합 활성을 포함한다. 바람직하게는 저 칼슘 농도는 0.1 내지 30 마이크로몰의 이온화된 칼슘 농도이고, 고 칼슘 농도는 100 마이크로몰 내지 10 mM의 이온화된 칼슘 농도이다.

바람직하게는, 상기 저 칼슘 농도는 이온화된 칼슘의 엔도솜 내 농도이고, 상기 고 칼슘 농도는 이온화된 칼슘의 혈장 농도이다. 보다 구체적으로, 상기 칼슘-의존성 항원-결합 도메인을 포함하는 항원-결합 분자는 생체 내 초기 엔도솜 중의 이온화된 칼슘 농도(예를 들어 1 내지 5 마이크로몰의 낮은 칼슘 농도)에서의 항원-결합 활성이 생체 내 혈장 중의 이온화된 칼슘 농도(예를 들어 0.5 내지 2.5 mM의 높은 칼슘 농도)에서보다 더 낮은 항원-결합 분자를 포함한다.

저 칼슘 농도에서의 항원-결합 활성이 고 칼슘 농도에서의 경우보다 더 낮은 항원-결합 분자의 항원-결합 활성에 관하여, 상기 항원-결합 활성에 있어서 상기 차이에 대한 제한은 없으나, 단 저 칼슘 농도에서의 항원-결합 활성이 고 칼슘 농도에서의 경우보다 더 낮아야 한다. 심지어 항원-결합 분자의 항원-결합 활성이 저 칼슘 농도 조건 하에서 단지 약간만 낮은 것도 허용 가능하다.

바람직한 실시태양에서, 저 칼슘 농도(저 Ca)에서의 항원-결합 활성이 고 칼슘 농도(고 Cal)에서의 경우보다 더 낮은 본 발명의 항원-결합 분자에 대해서, 저 및 고 칼슘 농도 간의 KD 비인 KD(저 Ca)/KD(고 Ca)의 값은 2 이상이고, 바람직하게는 상기 KD(저 Ca)/KD(고 Ca)의 값은 10 이상이고, 보다 바람직하게 상기 KD(저 Ca)/KD(고 Ca)의 값은 40 이상이다. 상기 KD(저 Ca)/KD(고 Ca)의 값의 상한은 특별히 제한되지 않으며, 당해 분야의 숙련가들에게 공지된 기법에 의해 생성될 수 있는 한, 상기는 400, 1,000 및 10,000과 같은 임의의 값일 수 있다.

또 다른 바람직한 실시태양에서, 저 칼슘 농도에서의 항원-결합 활성이 고 칼슘 농도에서의 경우보다 더 낮은 칼슘-의존성 항원-결합 도메인을 포함하는 항원-결합 분자에 대해서, 저 칼슘 농도 조건과 pH 7.4 간의 항원에 대한 kd의 비인 kd(저 Ca)/kd(고 Ca)의 값은 2 이상이고, 바람직하게는 상기 kd(저 Ca)/kd(고 Ca)의 값은 5 이상이고, 보다 바람직하게 상기 kd(저 Ca)/kd(고 Ca)의 값은 10 이상이고, 훨씬 더 바람직하게는 상기 kd(저 Ca)/kd(고 Ca)의 값은 30 이상이다. 상기 kd(저 Ca)/kd(고 Ca) 값의 상한은 특별히 제한되지 않으며, 당해 분야의 숙련가들에게 공지된 기법에 의해 생성될 수 있는 한, 상기는 50, 100 및 200과 같은 임의의 값일 수 있다.

항원-결합 분자의 항원-결합 활성을 당해 분야의 숙련가들에게 공지된 방법에 의해 측정할 수 있다. 이온화된 칼슘 농도 외에 적합한 조건을 당해 분야의 숙련가들에 의해 선택할 수 있다. 항원-결합 분자의 항원-결합 활성을 KD(해리 상수), 겉보기 KD(겉보기 해리 상수), 해리도 kd(해리도), 겉보기 kd(겉보기 해리: 겉보기 해리도) 등을 사용하여 평가할 수 있다. 이들을 당해 분야의 숙련가들에게 공지된 방법에 의해, 예를 들어 비아코어(GE 헬쓰케어), 스캐차드 플롯, FACS 등을 사용하여 측정할 수 있다.

본 발명의 선별 방법에 의해 선별되는 항원-결합 분자는 임의의 항원-결합 분자일 수 있다. 예를 들어 천연 서열을 갖는 항원-결합 분자 또는 치환된 아미노산 서열을 갖는 항원-결합 분자를 선별하는 것이 가능하다. 본 발명의 선별 방법에 의해 선별되는 칼슘-이온 의존성 항원-결합 도메인을 포함하는 항원-결합 분자를 임의의 방법에 의해 제조할 수 있다. 예를 들어, 기존의 항체, 기존의 라이브러리(파지 라이브러리 등), 및 면역된 동물의 B 세포 또는 동물을 면역시켜 제조된 하이브리도마로부터 제조된 항체 및 라이브러리, 칼슘을 킬레이트화할 수 있는 아미노산(예를 들어 아스파트산 또는 글루탐산) 또는 비-천연 아미노산 돌연변이를 특정 부위에서 상기와 같은 항체 또는 라이브러리에 도입시킴으로써 수득되는 항체 또는 라이브러리(고 함량의 비-천연 아미노산 또는 칼슘을 킬레이트화할 수 있는 아미노산(예를 들어 아스파트산 또는 글루탐산)을 갖는 라이브러리, 비-천연 아미노산 돌연변이 또는 칼슘을 킬레이트화할 수 있는 아미노산(예를 들어 아스파트산 또는 글루탐산)을 갖는 돌연변이가 도입된 라이브러리 등) 등을 사용할 수 있다.

저 칼슘 농도 조건 하에서의 항원-결합 활성이 고 칼슘 농도 조건 하에서의 경우보다 더 낮은 항원-결합 분자를 당해 분야에 통상적인 방법을 사용하여 쉽게 선별하고, 동정하고 단리할 수 있다(예를 들어 PCT 출원 제 PCT/JP2011/077619 호를 참조하시오). 상기와 같은 선별 방법의 예는

(i) 세포 내로의 항원의 흡수를 촉진하는 작용;

(ii) 항원에 2 배 이상 결합하는 작용;

(iii) 혈장 항원 농도의 감소를 촉진하는 작용; 및

(iv) 우수한 혈장 체류 작용

중에서 선택된 하나 이상의 작용을 갖는 항원-결합 분자를 분석하는 단계를 포함한다.

구체적으로, 본 발명은 칼슘-이온 의존성 항원-결합 도메인을 포함하는 항원-결합 분자의 선별 방법을 제공하며, 상기 방법은

(a) 저 칼슘 농도 조건 하에서 항원-결합 분자의 항원-결합 활성을 측정하고;

(b) 고 칼슘 농도 조건 하에서 상기 항원-결합 분자의 항원-결합 활성을 측정하고;

(c) 상기 저 칼슘 농도 조건 하에서의 항원-결합 활성이 상기 고 칼슘 농도 조건 하에서의 경우보다 더 낮은 항원-결합 분자를 선택하는

단계들을 포함한다.

칼슘-이온 의존성 항원-결합 도메인을 갖는 항원-결합 분자의 생성 방법은 예를 들어

단계들을 포함하는 방법이다.

칼슘-이온 의존성 항원-결합 도메인을 갖는 항원-결합 분자의 또 다른 생성 방법은

(a) 항원을 고 칼슘 농도 조건 하에서 항원-결합 분자 또는 항원-결합 분자의 라이브러리와 접촉시키고;

(b) 단계 (a)에서 항원에 결합된 항원-결합 분자를 수득하고;

(c) 단계 (b)에서 수득된 항원-결합 분자를 저 칼슘 농도 조건 하에서 정치시키고;

(d) 단계 (c)에서의 항원-결합 활성이 단계 (b)에서의 선택에 대한 활성보다 낮은 항원-결합 분자를 수득하고;

(e) 단계 (d)에서 수득된 항원-결합 분자를 암호화하는 유전자를 수득하고;

(f) 단계 (e)에서 수득된 유전자를 사용하여 항원-결합 분자를 생성시키는

단계들을 포함하는 방법이다.

단계 (a) 내지 (e)를 2 회 이상 반복할 수도 있다. 따라서, 본 발명은 상술한 방법에서 단계 (a) 내지 (e)를 2 회 이상 반복하는 단계를 추가로 포함하는 방법들을 제공한다. 단계 (a) 내지 (e)의 반복 회수는 특별히 제한되지 않으나; 상기 회수는 일반적으로 10 회 이하이다.

본 발명의 생성 방법에 사용되는 항원-결합 분자를 임의의 통상적인 방법에 의해 제조할 수 있다. 예를 들어, 기존의 항체, 기존의 라이브러리(파지 라이브러리 등), 동물을 면역시켜 수득한 하이브리도마 또는 면역된 동물의 B 세포로부터 제조된 항체 및 라이브러리, 히스티딘 또는 비-천연 아미노산 돌연변이를 상술한 항체 및 라이브러리에 도입시킴으로써 제조된 항체 및 라이브러리(고함량의 히스티딘 또는 비-천연 아미노산을 갖는 라이브러리, 특정 부위에서 히스티딘 또는 비-천연 아미노산이 도입된 라이브러리 등) 등을 사용할 수 있다.

상기와 같은 칼슘-이온 의존성 항원-결합 분자 또는 칼슘-이온 의존성 항원-결합 도메인을 선별하기 위한 추가의 방법들이 PCT 출원 제 PCT/JP2011/077619 호에 개시되어 있다.

항원

본 발명의 항원-결합 분자, 예를 들어 본 발명의 항체에 의해 인식되는 항원은 특별히 제한되지 않는다. 상기와 같은 본 발명의 항원-결합 분자는 임의의 항원을 인식할 수 있다. 본 발명의 항원-결합 분자에 의해 인식되는 항원의 구체적인 예는 비제한적으로 하기를 포함한다: 17-IA, 4-1 BB, 4Dc, 6-케토-PGF1a, 8-아이소-PGF2a, 8-옥소-dG, A1 아데노신 수용체, A33, ACE, ACE-2, 액티빈(Activin), 액티빈 A, 액티빈 AB, 액티빈 B, 액티빈 C, 액티빈 RIA, 액티빈 RIA ALK-2, 액티빈 RIB ALK-4, 액티빈 RIIA, 액티빈 RIIB, ADAM, ADAM10, ADAM12, ADAM15, ADAM17/TACE, ADAM8, ADAM9, ADAMTS, ADAMTS4, ADAMTS5, 아드레신(Addressin), 아디포넥틴, ADP 리보실 사이클라제-1, aFGF, AGE, ALCAM, ALK, ALK-1, ALK-7, 알레르젠, 알파1-안티케모트립신, 알파1-안티트립신, 알파-시누클레인, 알파-V/베타-1 길항물질, 아미닌, 아밀린, 아밀로이드 베타, 아밀로이드 면역글로불린 중쇄 가변 영역, 아밀로이드 면역글로불린 경쇄 가변 영역, 안드로젠, ANG, 안지오텐시노젠, 안지오포이에틴 리간드-2, 안티-Id, 안티트롬빈III, 안트락스(Anthrax), APAF-1, APE, APJ, 아포 A1, 아포 혈청 아밀로이드 A, 아포-SAA, APP, APRIL, AR, ARC, ART, 알테민(Artemin), ASPARTIC, 심방 나트륨 이뇨 인자, 심방 나트륨 이뇨 펩타이드, 심방 나트륨 이뇨 펩타이드 A, 심방 나트륨 이뇨 펩타이드 B, 심방 나트륨 이뇨 펩타이드 C, av/b3 인테그린, Axl, B7-1, B7-2, B7-H, BACE, BACE-1, 탄저균 보호 항원, Bad, BAFF, BAFF-R, Bag-1, BAK, Bax, BCA-1, BCAM, Bcl, BCMA, BDNF, b-ECGF, 베타-2-마이크로글로불린, 베타락타마제, bFGF, BID, Bik, BIM, BLC, BL-CAM, BLK, B-림프구 자극제 (BIyS), BMP, BMP-2 (BMP-2a), BMP-3 (오스테오제닌(Osteogenin)), BMP-4 (BMP-2b), BMP-5, BMP-6 (Vgr-1), BMP-7 (OP-1), BMP-8 (BMP-8a), BMPR, BMPR-IA (ALK-3), BMPR-IB (ALK-6), BMPR-II (BRK-3), BMPs, BOK, 봄베신(Bombesin), 뼈-유래 신경영양인자, 소 성장 호르몬, BPDE, BPDE-DNA, BRK-2, BTC, B-림프구 부착 분자, C10, C1-억제제, C1q, C3, C3a, C4, C5, C5a(보체 5a), CA125, CAD-8, 카데린(Cadherin)-3, 칼시토닌(Calcitonin), cAMP, 카보닉 안하이드라제-IX, 암태아성 항원(CEA), 암종-관련 항원, 카디오트로핀(Cardiotrophin)-1, 카텝신(Cathepsin) A, 카텝신 B, 카텝신 C/DPPI, 카텝신 D, 카텝신 E, 카텝신 H, 카텝신 L, 카텝신 O, 카텝신 S, 카텝신 V, 카텝신 X/Z/P, CBL, CCI, CCK2, CCL, CCL1/I-309, CCL11/에오탁신(Eotaxin), CCL12/MCP-5, CCL13/MCP-4, CCL14/HCC-1, CCL15/HCC-2, CCL16/HCC-4, CCL17/TARC, CCL18/PARC, CCL19/ELC, CCL2/MCP-1, CCL20/MIP-3-알파, CCL21/SLC, CCL22/MDC, CCL23/MPIF-1, CCL24/에오탁신-2, CCL25/TECK, CCL26/에오탁신-3, CCL27/CTACK, CCL28/MEC, CCL3/M1P-1-알파, CCL3Ll/LD-78-베타, CCL4/MIP-l-베타, CCL5/RANTES, CCL6/C10, CCL7/MCP-3, CCL8/MCP-2, CCL9/10/MTP-1-감마, CCR, CCR1, CCR10, CCR2, CCR3, CCR4, CCR5, CCR6, CCR7, CCR8, CCR9, CD1, CD10, CD105, CD11a, CD11b, CD11c, CD123, CD13, CD137, CD138, CD14, CD140a, CD146, CD147, CD148, CD15, CD152, CD16, CD164, CD18, CD19, CD2, CD20, CD21, CD22, CD23, CD25, CD26, CD27L, CD28, CD29, CD3, CD30, CD30L, CD32, CD33 (p67 단백질), CD34, CD37, CD38, CD3E, CD4, CD40, CD40L, CD44, CD45, CD46, CD49a, CD49b, CD5, CD51, CD52, CD54, CD55, CD56, CD6, CD61, CD64, CD66e, CD7, CD70, CD74, CD8, CD80 (B7-1), CD89, CD95, CD105, CD158a, CEA, CEACAM5, CFTR, cGMP, CGRP 수용체, CINC, CKb8-1, 클라우딘(Claudin)18, CLC, 클로스트리듐 보툴리늄 독소, 클로스트리듐 디피실 독소, 클로스트리듐 페르프린젠스 독소, c-Met, CMV, CMV UL, CNTF, CNTN-1, 보체 인자 3 (C3), 보체 인자 D, 코르티코스테로이드-결합 글로불린, 콜로니 자극 인자-1 수용체, COX, C-Ret, CRG-2, CRTH2, CT-1, CTACK, CTGF, CTLA-4, CX3CL1/프락탈킨(Fractalkine), CX3CR1, CXCL, CXCL1/Gro-알파, CXCL10, CXCL11/I-TAC, CXCL12/SDF-l-알파/베타, CXCL13/BCA-1, CXCL14/BRAK, CXCL15/렁킨(Lungkine). CXCL16, CXCL16, CXCL2/Gro-베타 CXCL3/Gro-감마, CXCL3, CXCL4/PF4, CXCL5/ENA-78, CXCL6/GCP-2, CXCL7/NAP-2, CXCL8/IL-8, CXCL9/Mig, CXCLlO/IP-10, CXCR, CXCR1, CXCR2, CXCR3, CXCR4, CXCR5, CXCR6, 시스타틴 C, 사이토케라틴 종양-관련 항원, DAN, DCC, DcR3, DC-SIGN, 부패 촉진 인자, 델타-유형 단백질 리간드 4, des(1-3)-IGF-l (뇌 IGF-1), Dhh, DHICA 옥시다제, Dickkopf-1, 디곡신, 다이펩티딜 펩티다제 IV, DKl, DNAM-1, Dnase, Dpp, DPPIV/CD26, Dtk, ECAD, EDA, EDA-A1, EDA-A2, EDAR, EGF, EGFR (ErbB-1), EGF 유형 도메인 함유 단백질 7, 엘라스타제(Elastase), 엘라스틴, EMA, EMMPRIN, ENA, ENA-78, 엔도시알린(Endosialin), 엔도텔린 수용체, 내독소, 엔케팔리나제(Enkephalinase), eNOS, Eot, 에오탁신, 에오탁신-2, 에오탁시니, EpCAM, 에프린(Ephrin) B2/EphB4, Epha2 티로신 키나제 수용체, 표피 성장 인자 수용체 (EGFR), ErbB2 수용체, ErbB3 티로신 키나제 수용체, ERCC, 에리쓰로포이에틴(EPO), 에리쓰로포이에틴 수용체, E-셀렉틴, ET-1, 엑소두스(Exodus)-2, RSV의 F 단백질, F10, F11, F12, F13, F5, F9, 인자 Ia, 인자 IX, 인자 Xa, 인자 VII, 인자 VIII, 인자 VIIIc, Fas, Fc알파R, Fc엡실론RI, Fc감마IIb, Fc감마RI, Fc감마RIIa, Fc감마RIIIa, Fc감마RIIIb, FcRn, FEN-1, 페리틴(Ferritin), FGF, FGF-19, FGF-2, FGF-2 수용체, FGF-3, FGF-8, FGF-산성, FGF-염기성, FGFR, FGFR-3, 피브린, 섬유아세포 활성화 단백질(FAP), 섬유아세포 성장 인자, 섬유아세포 성장 인자-10, 피브로넥틴, FL, FLIP, Flt-3, FLT3 리간드, 폴레이트 수용체, 여포 자극 호르몬(FSH), 프락탈킨(CX3C), 유리 중쇄, 유리 경쇄, FZD1, FZD10, FZD2, FZD3, FZD4, FZD5, FZD6, FZD7, FZD8, FZD9, G250, Gas 6, GCP-2, GCSF, G-CSF, G-CSF 수용체, GD2, GD3, GDF, GDF-1, GDF-15 (MIC-1), GDF-3 (Vgr-2), GDF-5 (BMP-14/CDMP-1), GDF-6 (BMP-13/CDMP-2), GDF-7 (BMP-12/CDMP-3), GDF-8 (미오스타틴), GDF-9, GDNF, 젤솔린(Gelsolin), GFAP, GF-CSF, GFR-알파1, GFR-알파2, GFR-알파3, GF-베타1, gH 외막 당단백질, GITR, 글루카곤, 글루카곤 수용체, 글루카곤-유형 펩타이드 1 수용체, 글럿(Glut) 4, 글루타메이트 카복시펩티다제 II, 당단백질 호르몬 수용체, 당단백질 IIb/IIIa (GP IIb/IIIa), 글리피칸(Glypican)-3, GM-CSF, GM-CSF 수용체, gp130, gp140, gp72, 과립구-CSF (G-CSF), GRO/MGSA, 성장 호르몬 방출 인자, GRO-베타, GRO-감마, 에이치 파일로리, 합텐(NP-cap 또는 NIP-cap), HB-EGF, HCC, HCC 1, HCMV gB 외막 당단백질, HCMV UL, 조혈 성장 인자(HGF), Hep B gp120, 헤파라나제, 헤파린 보조인자 II, 간 성장 인자, 탄저균 보호 항원, C형 간염 바이러스 E2 당단백질, E형 간염, 헤프시딘(Hepcidin), Her1, Her2/neu (ErbB-2), Her3 (ErbB-3), Her4 (ErbB-4), 헤르페스 단순 바이러스 (HSV) gB 당단백질, HGF, HGFA, 고 분자량 흑색종 관련 항원(HMW-MAA), HIV 외막 단백질, 예를 들어 GP120, HIV MIB gp 120 V3 고리, HLA, HLA-DR, HM1.24, HMFG PEM, HMGB-1, HRG, Hrk, HSP47, Hsp90, HSV gD 당단백질, 인간 심장 미오신, 인간 거대세포바이러스(HCMV), 인간 성장 호르몬(hGH), 인간 혈청 알부민, 인간 조직-유형 플라스미노겐 활성제(t-PA), 헌팅틴(Huntingtin), HVEM, IAP, ICAM, ICAM-1, ICAM-3, ICE, ICOS, IFN-알파, IFN-베타, IFN-감마, IgA, IgA 수용체, IgE, IGF, IGF 결합 단백질, IGF-1, IGF-1 R, IGF-2, IGFBP, IGFR, IL, IL-1, IL-10, IL-10 수용체, IL-11, IL-11 수용체, IL-12, IL-12 수용체, IL-13, IL-13 수용체, IL-15, IL-15 수용체, IL-16, IL-16 수용체, IL-17, IL-17 수용체, IL-18 (IGIF), IL-18 수용체, IL-1알파, IL-1베타, IL-1 수용체, IL-2, IL-2 수용체, IL-20, IL-20 수용체, IL-21, IL-21 수용체, IL-23, IL-23 수용체, IL-2 수용체, IL-3, IL-3 수용체, IL-31, IL-31 수용체, IL-3 수용체, IL-4, IL-4 수용체 IL-5, IL-5 수용체, IL-6, IL-6 수용체, IL-7, IL-7 수용체, IL-8, IL-8 수용체, IL-9, IL-9 수용체, 면역글로불린 면역 복합체, 면역글로불린, INF-알파, INF-알파 수용체, INF-베타, INF-베타 수용체, INF-감마, INF-감마 수용체, IFN 유형-I , IFN 유형-I 수용체, 인플루엔자, 인히빈, 인히빈 알파, 인히빈 베타, iNOS, 인슐린, 인슐린 A-쇄, 인슐린 B-쇄, 인슐린-유형 성장 인자 1, 인슐린-유형 성장 인자 2, 인슐린-유형 성장 인자 결합 단백질, 인테그린, 인테그린 알파2, 인테그린 알파3, 인테그린 알파4, 인테그린 알파4/베타1, 인테그린 알파-V/베타-3, 인테그린 알파-V/베타-6, 인테그린 알파4/베타7, 인테그린 알파5/베타1, 인테그린 알파5/베타3, 인테그린 알파5/베타6, 인테그린 알파-델타 (알파V), 인테그린 알파-쎄타, 인테그린 베타1, 인테그린 베타2, 인테그린 베타3(GPIIb-IIIa), IP-10, I-TAC, JE, 칼리클레인, 칼리크레인(Kallikrein) 11, 칼리크레인 12, 칼리크레인 14, 칼리크레인 15, 칼리크레인 2, 칼리크레인 5, 칼리크레인 6, 칼리크레인 L1, 칼리크레인 L2, 칼리크레인 L3, 칼리크레인 L4, 칼리스타틴, KC, KDR, 각질세포 성장 인자 (KGF), 각질세포 성장 인자-2 (KGF-2), KGF, 킬러 면역글로불린-유형 수용체, 키트 리간드 (KL), 키트 타이로신 키나제, 라미닌 5, LAMP, LAPP (아밀린, 섬-아밀로이드 폴리펩타이드), LAP (TGF- 1), 잠복 관련된 펩타이드, 잠복성 TGF-1, 잠복성 TGF-1 bp1, LBP, LDGF, LDL, LDL 수용체, LECT2, 레프티(Lefty), 렙틴(Leptin), 황체 호르몬 (LH), 루이스-Y 항원, 루이스-Y 관련 항원, LFA-1, LFA-3, LFA-3 수용체, Lfo, LIF, LIGHT, 지단백질, LIX, LKN, Lptn, L-셀렉틴, LT-a, LT-b, LTB4, LTBP-1, 폐 계면활성제, 황체 호르몬, 림포탁틴(Lymphotactin), 림포톡신(Lymphotoxin) 베타 수용체, 리소스핑고리피드(Lysosphingolipid) 수용체, Mac-1, 대식세포-CSF (M-CSF), MAdCAM, MAG, MAP2, MARC, 매스핀, MCAM, MCK-2, MCP, MCP-1, MCP-2, MCP-3, MCP-4, MCP-I (MCAF), M-CSF, MDC, MDC (67 a.a.), MDC (69 a.a.), 메그신, Mer, MET 타이로신 키나제 수용체 패밀리, METALLOPROTEASES, 막 당단백질 OX2, 메소텔린(Mesothelin), MGDF 수용체, MGMT, MHC (HLA-DR), 미생물 단백질, MIF, MIG, MIP, MIP-1 알파, MIP-1 베타, MIP-3 알파, MIP-3 베타, MIP-4, MK, MMAC1, MMP, MMP-1, MMP-10, MMP-11, MMP-12, MMP-13, MMP-14, MMP-15, MMP-2, MMP-24, MMP-3, MMP-7, MMP-8, MMP-9, 단핵구 유인 단백질, 단핵구 콜로니 억제 인자, 마우스 성선자극호르몬 관련 펩타이드, MPIF, Mpo, MSK, MSP, MUC-16, MUC18, 뮤신 (Mud), 뮬러리안-억제 물질, Mug, MuSK, 마이엘린 관련 당단백질, 골수양 선조세포 억제 인자-1 (MPIF-I), NAIP, 나노바디(Nanobody), NAP, NAP-2, NCA 90, NCAD, N-카데린, NCAM, 네프릴리신(Neprilysin), 신경세포 부착 분자, 네로서핀, 신경세포 성장 인자 (NGF), 뉴로트로핀-3, 뉴로트로핀-4, 뉴로트로핀-6, 뉴로필린 1, 뉴르튜린(Neurturin), NGF-베타, NGFR, NKG20, N-메티오닐 인간 성장 호르몬, nNOS, NO, 노고(Nogo)-A, 노고 수용체, C형 간염 바이러스로부터의 비-구조 단백질 유형 3 (NS3), NOS, Npn, NRG-3, NT, NT-3, NT-4, NTN, OB, OGG1, 온코스타틴(Oncostatin) M, OP-2, OPG, OPN, OSM, OSM 수용체, 골유도 인자, 오스테오폰틴, OX40L, OX40R, 산화된 LDL, p150, p95, PADPr, 부갑상선 호르몬, PARC, PARP, PBR, PBSF, PCAD, P-Cadherin, PCNA, PCSK9, PDGF, PDGF 수용체, PDGF-AA, PDGF-AB, PDGF-BB, PDGF-D, PDK-1, PECAM, PEDF, PEM, PF-4, PGE, PGF, PGI2, PGJ2, PIGF, PIN, PLA2, 태반 성장 인자, 태반 알칼리성 포스파타제 (PLAP), 태반 락토젠, 플라스미노겐 활성제 억제제-1, 혈소판-성장 인자, plgR, PLP, 상이한 크기의 폴리 글리콜 쇄(예를 들어 PEG-20, PEG-30, PEG40), PP14, 칼리크레인 전구물질, 프리온 단백질, 프로칼시토닌, 프로그램화된 세포사 단백질 1, 프로인슐린, 프로락틴, 전구단백질 컨버타제 PC9, 프로릴렉신, 전립선 특이성 막 항원 (PSMA), 단백질 A, 단백질 C, 단백질 D, 단백질 S, 단백질 Z, PS, PSA, PSCA, PsmAr, PTEN, PTHrp, Ptk, PTN, P-셀렉틴 당단백질 리간드-1, R51, RAGE, RANK, RANKL, RANTES, 릴렉신, 릴렉신 A-쇄, 릴렉신 B-쇄, 레닌, 호흡기 세포융합 바이러스 (RSV) F, Ret, 레티쿨론 4, 류마티스양 인자, RLI P76, RPA2, RPK-1, RSK, RSV Fgp, S100, RON-8, SCF/KL, SCGF, 스클레로스틴(Sclerostin), SDF-1, SDF1 알파, SDF1 베타, SERINE, 혈청 아밀로이드 P, 혈청 알부민, sFRP-3, Shh, 쉬가형 독소 II, SIGIRR, SK-1, SLAM, SLPI, SMAC, SMDF, SMOH, SOD, SPARC, 스핑고신 1-포스페이트 수용체 1, 스타필로코커스 리포테이코산((Staphylococcal lipoteichoic acid), Stat, STEAP, STEAP-II, 줄기 세포 인자 (SCF), 스트렙토키나제, 과산화물 디스뮤타제, 신데칸-1, TACE, TACI, TAG-72 (종양-관련 당단백질-72), TARC, TB, TCA-3, T-세포 수용체 알파/베타, TdT, TECK, TEM1, TEM5, TEM7, TEM8, 테나신, TERT, 고환 PLAP-유형 알칼리성 포스파타제, TfR, TGF, TGF-알파, TGF-베타, TGF-베타 팬 특이성, TGF-베타 RII, TGF-베타 RIIb, TGF-베타 RIII, TGF-베타 Rl (ALK-5), TGF-베타1, TGF-베타2, TGF-베타3, TGF-베타4, TGF-베타5, TGF-I, 트롬빈, 트롬보포이에틴 (TPO), 흉선 간질 림포단백질 수용체, 흉선 Ck-1, 갑상선 자극 호르몬 (TSH), 티록신, 티록신-결합 글로불린, Tie, TIMP, TIQ, 조직 인자, 조직 인자 프로테아제 억제제, 조직 인자 단백질, TMEFF2, Tmpo, TMPRSS2, TNF 수용체 I, TNF 수용체 II, TNF-알파, TNF-베타, TNF-베타2, TNFc, TNF-RI, TNF-RII, TNFRSF10A (TRAIL R1 Apo-2/DR4), TNFRSF10B (TRAIL R2 DR5/KILLER/TRICK-2A/TRICK-B), TNFRSF10C (TRAIL R3 DcR1/LIT/TRID), TNFRSF10D (TRAIL R4 DcR2/TRUNDD), TNFRSF11A (RANK ODF R/TRANCE R), TNFRSF11B (OPG OCIF/TR1), TNFRSF12 (TWEAK R FN14), TNFRSF12A, TNFRSF13B (TACI), TNFRSF13C (BAFF R), TNFRSF14 (HVEM ATAR/HveA/LIGHT R/TR2), TNFRSF16 (NGFR p75NTR), TNFRSF17 (BCMA), TNFRSF18 (GITR AITR), TNFRSF19 (TROY TAJ/TRADE), TNFRSF19L (RELT), TNFRSF1A (TNF Rl CD120a/p55-60), TNFRSF1B (TNF RII CD120b/p75-80), TNFRSF21 (DR6), TNFRSF22 (DcTRAIL R2 TNFRH2), TNFRSF25 (DR3 Apo-3/LARD/TR-3/TRAMP/WSL-1), TNFRSF26 (TNFRH3), TNFRSF3 (LTbR TNF RIII/TNFC R), TNFRSF4 (OX40 ACT35/TXGP1 R), TNFRSF5 (CD40 p50), TNFRSF6 (Fas Apo-1/APT1/CD95), TNFRSF6B (DcR3 M68/TR6), TNFRSF7 (CD27), TNFRSF8 (CD30), TNFRSF9 (4-1 BB CD137/ILA), TNFRST23 (DcTRAIL R1 TNFRH1), TNFSF10 (TRAIL Apo-2 리간드/TL2), TNFSF11 (TRANCE/RANK 리간드 ODF/OPG 리간드), TNFSF12 (TWEAK Apo-3 리간드/DR3 리간드), TNFSF13 (APRIL TALL2), TNFSF13B (BAFF BLYS/TALL1/THANK/TNFSF20), TNFSF14 (LIGHT HVEM 리간드/LTg), TNFSF15 (TL1A/VEGI), TNFSF18 (GITR 리간드 AITR 리간드/TL6), TNFSF1A (TNF-a 코넥틴(Conectin)/DIF/TNFSF2), TNFSF1B (TNF-b LTa/TNFSF1), TNFSF3 (LTb TNFC/p33), TNFSF4 (OX40 리간드 gp34/TXGP1), TNFSF5 (CD40 리간드 CD154/gp39/HIGM1/IMD3/TRAP), TNFSF6 (Fas 리간드 Apo-1 리간드/APT1 리간드), TNFSF7 (CD27 리간드 CD70), TNFSF8 (CD30 리간드 CD153), TNFSF9 (4-1 BB 리간드 CD137 리간드), TNF-알파, TNF-베타, TNIL-I, 독성 대사산물, TP-1, t-PA, Tpo, TRAIL, TRAIL R, TRAIL-R1, TRAIL-R2, TRANCE, 트랜스페린 수용체, 형질전환 성장 인자 (TGF) 예를 들어 TGF-알파 및 TGF-베타, 막관통 당단백질 NMB, 트랜스티레틴(Transthyretin), TRF, Trk, TROP-2, 영양세포층 당단백질, TSG, TSLP, 종양 괴사 인자 (TNF), 종양-관련 항원 CA 125, 루이스 Y 관련 탄수화물을 발현시키는 종양-관련 항원, TWEAK, TXB2, Ung, uPAR, uPAR-1, 유로키나제, VAP-1, 혈관 내피 성장 인자 (VEGF), 바스핀, VCAM, VCAM-1, VECAD, VE-카데린, VE-카데린-2, VEFGR-1 (flt-1), VEFGR-2, VEGF 수용체 (VEGFR), VEGFR-3 (flt-4), VEGI, VIM, 바이러스 항원, VitB12 수용체, 비트로넥틴 수용체, VLA, VLA-1, VLA-4, VNR 인테그린, 폰 빌레브란트 인자 (vWF), WIF-1, WNT1, WNT10A, WNT10B, WNT11, WNT16, WNT2, WNT2B/13, WNT3, WNT3A, WNT4, WNT5A, WNT5B, WNT6, WNT7A, WNT7B, WNT8A, WNT8B, WNT9A, WNT9B, XCL1, XCL2/SCM-l-베타, XCLl/림포탁틴, XCR1, XEDAR, XIAP, XPD, HMGB1, IgA, Aa, CD81, CD97, CD98, DDR1, DKK1, EREG, Hsp90, IL-17/IL-17R, IL-20/IL-20R, 산화된 LDL, PCSK9, 프리칼리크레인, RON, TMEM16F, SOD1, 크로모그라닌 A, 크로모그라닌 B, 타우, VAP1, 고분자량 키니노겐, IL-31, IL-31R, Nav1.1, Nav1.2, Nav1.3, Nav1.4, Nav1.5, Nav1.6, Nav1.7, Nav1.8, Nav1.9, EPCR, C1, C1q, C1r, C1s, C2, C2a, C2b, C3, C3a, C3b, C4, C4a, C4b, C5, C5a, C5b, C6, C7, C8, C9, 인자 B, 인자 D, 인자 H, 프로페르딘, 스클레로스틴, 피브리노겐, 피브린, 프로트롬빈, 트롬빈, 조직 인자, 인자 V, 인자 Va, 인자 VII, 인자 VIIa, 인자 VIII, 인자 VIIIa, 인자 IX, 인자 IXa, 인자 X, 인자 Xa, 인자 XI, 인자 XIa, 인자 XII, 인자 XIIa, 인자 XIII, 인자 XIIIa, TFPI, 항트롬빈 III, EPCR, 트롬보모듈린, TAPI, tPA, 플라스미노겐, 플라스민, PAI-1, PAI-2, GPC3, 신데칸-1, 신데칸-2, 신데칸-3, 신데칸-4, LPA, S1P.

본 발명에 개시된 항원 결합 분자는 혈장 중의 상술한 항원의 전체 항원 농도를 감소시킬 수 있다. 본 발명에 개시된 항원 결합 분자는 또한 바이러스, 세균 및 진균의 구조 성분에 결합함으로써 혈장으로부터 바이러스, 세균 및 진균을 제거할 수 있다. 특히, RSV의 F 단백질, 스타필로코커스 리포테이코산, 클로스트리듐 디피실 독소, 쉬가형 독소 II, 탄저균 보호 항원 및 C형 간염 바이러스 E2 당단백질을 바이러스, 세균 및 진균의 구조 성분으로서 사용할 수 있다.

용도

본 발명은 또한 상술한 바와 같은 본 발명의 항원-결합 분자의 다수의 용도를 제공한다.

따라서, 본 발명은 세포 내로의 상기 항원-결합 분자 매개된 항원 흡수를 개선시키기 위한 본 발명의 변형된 항원-결합 분자의 용도를 제공한다. 더욱 또한, 본 발명은 또한 EU238, EU250, EU252, EU254, EU255, EU258, EU286, EU307, EU308, EU309, EU311, EU315, EU428, EU433, EU434, 및 EU436으로 이루어진 그룹 중에서 선택된 하나 이상의 위치에서 모 FcRn-결합 도메인 중의 아미노산을 치환시키고 이에 의해 본래의 FcRn-결합 도메인을 갖는 항원-결합 분자에 비해 중성 pH에서 상기 FcRn-결합 활성을 증가시킴으로써, 상기 모 FcRn-결합 도메인을 포함하는 항원-결합 분자를 변경시킴을 포함하는, 세포 내로의 항원-결합 분자-매개된 항원 흡수를 개선시키기 위한 방법을 제공한다.

본 발명에서, 항원-결합 분자에 의해 매개된 "세포 내로의 항원 흡수"란 용어는 항원이 세포 이물 흡수에 의해 세포 내로 흡수됨을 의미한다. 한편, 본 발명에서 "세포 내로의 흡수를 촉진한다"는 혈장 중 항원에 결합된 항원-결합 분자의 세포 내 흡수율이 증대되고/되거나 상기 혈장으로의 흡수된 항원의 재순환 양이 감소함을 의미한다. 이는 세포 내로의 흡수율이, 중성 pH 범위에서의 항원-결합 분자의 인간 FcRn-결합 활성 증가 전 또는 인간 FcRn-결합 활성이 증가하고 산성 pH 범위에서의 항원-결합 분자의 항원-결합 활성(결합 능력)이 중성 pH 범위에서의 그의 항원-결합 활성보다 작게 감소하기 전의 항원-결합 분자에 비해 촉진됨을 의미한다. 상기 흡수율은 바람직하게는 본래의 인간 IgG에 비해, 보다 바람직하게는 본래의 인간 IgG에 비해 개선된다. 따라서, 본 발명에서, 세포 내로의 항원 흡수가 항원-결합 분자에 의해 촉진되는 지의 여부를 상기 세포 내로의 항원 흡수율의 증가를 근거로 평가할 수 있다. 상기 세포 내로의 항원 흡수율을, 예를 들어 인간 FcRn-발현 세포를 함유하는 배양 배지에 상기 항원 및 항원-결합 분자를 첨가한 후에 상기 배지 중의 항원 농도의 시간에 따른 감소를 모니터하거나, 또는 인간 FcRn-발현 세포 내로의 항원 흡수량을 시간에 따라 모니터함으로써 계산할 수 있다. 세포 내로의 항원-결합 분자-매개된 항원 흡수율을 촉진하는 본 발명의 방법을 사용하여, 예를 들어, 상기 혈장으로부터 항원 제거 속도를 본 발명의 항원-결합 분자를 투여함으로써 증대시킬 수 있다. 따라서, 세포 내로의 항원-결합 분자-매개된 항원 흡수가 촉진되는 지의 여부를 또한, 예를 들어 상기 혈장으로부터의 항원 제거 속도가 가속화되는지의 여부 또는 혈장 중 총 항원 농도가 본 발명의 항원-결합 분자의 투여에 의해 감소하는 지의 여부를 시험함으로써 평가할 수 있다.

본 발명에서, "혈장 중 총 항원 농도"란 용어는 항원-결합 분자 결합된 항원, 및 비-결합된 항원 농도 또는 항원-결합 분자 비-결합된 항원 농도인 "혈장 중 유리 항원 농도"의 합계를 의미한다. "혈장 중 총 항원 농도" 및 "혈장 중 유리 항원 농도"를 측정하는 다양한 방법들은 본 발명에서 이후에 개시하는 바와 같이 당해 분야에 널리 공지되어 있다.

본 발명은 또한 단일 항원-결합 분자가 그의 분해 전에 결합할 수 있는 항원의 총수를 증가시키기 위한 본 발명의 항원-결합 분자의 용도를 제공한다. 본 발명은 또한 본 발명의 항원-결합 분자를 사용함으로써, 단일 항원-결합 분자가 결합할 수 있는 항원의 총수를 증가시키기 위한 방법을 제공한다. 구체적으로, 본 발명은 EU238, EU250, EU252, EU254, EU255, EU258, EU286, EU307, EU308, EU309, EU311, EU315, EU428, EU433, EU434, 및 EU436으로 이루어진 그룹 중에서 선택된 하나 이상의 위치에서 단일 항원-결합 분자의 모 FcRn-결합 도메인 중의 아미노산을 치환시키고 이에 의해 본래의 FcRn-결합 도메인을 갖는 항원-결합 분자에 비해 중성 pH에서 상기 FcRn-결합 활성을 증가시킴으로써, 상기 항원-결합 분자가 결합할 수 있는 항원의 총수를 증가시키는 방법을 제공한다.

"통상적인 항체"는 대개 엔도솜 중에서 분해되기 전에 단지 하나 또는 2 개의 항원과 결합할 수 있다. 본 발명의 항원-결합 분자는 상기 항원-결합 분자가 분해될 때까지 성취되는 순환의 수를 증가시킬 수 있으며, 이때 각각의 순환은 혈장 중 항원-결합 분자에 대한 항원의 결합, 상기 항원에 결합된 항원-결합 분자의 세포 내 흡수, 및 엔도솜에서 상기 항원으로부터의 해리에 이은 상기 항원-결합 분자의 혈장으로의 복귀로 이루어진다. 이는 상기 순환의 수가, 상기 FcRn-결합 도메인의 변형 전 및 따라서 중성 pH 또는 산성 범위에서의 항원-결합 분자의 인간 FcRn-결합 활성 증가 전, 또는 인간 FcRn-결합 활성이 증가하고 산성 pH 범위에서의 항원-결합 분자의 항원-결합 활성(결합 능력)이 중성 pH 범위에서의 그의 항원-결합 활성보다 작게 감소하기 전의 항원-결합 분자에 비해 증가함을 의미한다. 따라서, 상기 순환의 수가 증가하는 지의 여부를, 상술한 "세포 내 흡수가 촉진되는" 지의 여부 또는 하기 개시하는 바와 같이 "약동학이 개선되는" 지의 여부를 시험함으로써 평가할 수 있다.

본 발명은 또한 포유동물, 즉 인간에서 혈액으로부터 항원-제거를 개선시키기 위한 본 발명의 항원-결합 분자의 용도를 제공한다. 특히, 본 발명은 특정 항원의 혈장 농도를 감소시키기 위한 본 발명의 항원-결합 분자의 용도를 제공하며, 여기에서 상기 항원-결합 분자는 상기 항원과 결합할 수 있는 항원-결합 도메인을 포함한다. 본 발명은 또한 EU238, EU250, EU252, EU254, EU255, EU258, EU286, EU307, EU308, EU309, EU311, EU315, EU428, EU433, EU434, 및 EU436으로 이루어진 그룹 중에서 선택된 하나 이상의 위치에서 모 FcRn-결합 도메인 중의 아미노산을 치환시키고 이에 의해 본래의 FcRn-결합 도메인을 갖는 항원-결합 분자에 비해 중성 pH에서 상기 FcRn-결합 활성을 증가시킴으로써, 특정 항원의 혈장 농도를 감소시키기 위한 방법을 제공하며, 여기에서 상기 항원-결합 분자는 상기 항원에 결합할 수 있는 항원-결합 도메인을 포함한다.

본 발명은 또한 항원-결합된 형태로 세포 내 흡수된 항원-부재 항원-결합 분자의 세포 외 방출을 촉진하기 위한 본 발명의 항원-결합 분자의 용도를 제공한다. 보다 구체적으로, 본 발명은 EU238, EU250, EU252, EU254, EU255, EU258, EU286, EU307, EU308, EU309, EU311, EU315, EU428, EU433, EU434, 및 EU436으로 이루어진 그룹 중에서 선택된 하나 이상의 위치에서 모 FcRn-결합 도메인 중의 아미노산을 치환시키고 이에 의해 본래의 FcRn-결합 도메인을 갖는 항원-결합 분자에 비해 중성 pH에서 상기 FcRn-결합 활성을 증가시킴으로써, 중성 pH에서 모 항체에 비해 기존 ADA에 대한 결합 활성을 현저하게 증가시키지 않으면서 항원-결합된 형태로 세포 내 흡수된 항원-부재 항원-결합 분자의 세포 외 방출을 촉진하는 방법을 제공한다.

본 발명에서, "항원-결합된 형태로 세포 내 흡수된 항원-부재 항원-결합 분자의 세포 외 방출"은 세포 내로 흡수된 항원에 결합된 항원-결합 분자가 모두 상기 세포의 밖에서 항원-부재 형태로 방출됨을 반드시 의미하는 것은 아니다. 항원-부재 형태로 세포 밖으로 방출된 항원-결합 분자의 비율이, 상기 FcRn-결합 도메인의 변형 전 및 따라서 산성 pH 범위에서의 항원-결합 분자의 항원-결합 활성을 중성 pH 범위에서의 경우보다 작게 감소시키고 중성 pH 범위에서의 인간 FcRn-결합 활성을 증가시키기 전의 경우에 비해 증가하는 것은 허용될 수 있다. 상기 세포의 밖으로 방출된 항원-결합 분자는 바람직하게는 항원-결합 활성을 유지한다.

본 발명은 또한 혈장 항원을 제거하는 항원-결합 분자의 능력을 증가시키기 위한 본 발명의 FcRn-결합 도메인의 용도를 제공한다. 본 발명에서, "혈장 항원을 제거하는 능력을 증가시키는 방법"은 "혈장으로부터 항원을 제거하는 항원-결합 분자의 능력을 증대시키는 방법"과 동의어이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 EU238, EU250, EU252, EU254, EU255, EU258, EU286, EU307, EU308, EU309, EU311, EU315, EU428, EU433, EU434, 및 EU436으로 이루어진 그룹 중에서 선택된 하나 이상의 위치에서 모 FcRn-결합 도메인 중의 아미노산을 치환시키고 이에 의해 본래의 FcRn-결합 도메인을 갖는 항원-결합 분자에 비해 중성 및/또는 산성 pH에서 상기 FcRn-결합 활성을 증가시킴으로써, 혈장 항원을 제거하는 항원-결합 분자의 능력을 증가시키는 방법을 제공한다.

본 발명에서, "혈장 항원을 제거하는 능력"이란 용어는 항원-결합 분자를 투여하거나 상기 분자가 생체 내로 분비되는 경우 혈장으로부터 항원을 제거하는 능력을 의미한다. 따라서, 본 발명에서 "혈장 항원을 제거하는 항원-결합 분자의 능력의 증가"는 혈장으로부터 항원 제거 속도가 상기 항원-결합 분자의 투여 시, 상기 FcRn-결합 도메인의 변형 전 및 따라서 중성 pH 범위에서의 항원-결합 분자의 인간 FcRn-결합 활성을 증가시키기 전, 또는 인간 FcRn-결합 활성을 증가시키고 동시에 산성 pH 범위에서의 그의 항원-결합 활성을 중성 pH 범위에서의 경우보다 작게 감소시키기 전에 비해 가속화됨을 의미한다. 혈장으로부터 항원을 제거하는 항원-결합 분자의 활성의 증가를, 예를 들어 생체 내에 가용성 항원 및 항원-결합 분자를 투여하고 투여 후 혈장 중 상기 가용성 항원의 농도를 측정함으로써 평가할 수 있다. 상기 가용성 항원 및 변형된 항원-결합 분자 투여 후 혈장 중 가용성 항원의 농도를 감소시키는 경우, 상기 혈장 항원을 제거하는 항원-결합 분자의 능력은 증가하는 것으로 판단할 수 있다. 가용성 항원의 한 형태는 각각 "혈장 중 항원-결합 분자 결합된 항원 농도" 및 "혈장 중 항원-결합 분자 비-결합된 항원 농도"(후자는 "혈장 중 유리 항원 농도"와 동의어이다)로서 측정될 수 있는 농도를 갖는 항원-결합 분자 결합된 항원 또는 항원-결합 분자 비-결합된 항원일 수 있다. "혈장 중 총 항원 농도"는 항원-결합 분자 결합된 항원 및 비-결합된 항원 농도 또는 "혈장 중 유리 항원 농도"(이는 항원-결합 분자 비-결합된 항원 농도이다)의 합을 의미하므로, 상기 가용성 항원의 농도를 "혈장 중 총 항원 농도"로서 측정할 수 있다. "혈장 중 총 항원 농도" 또는 "혈장 중 유리 항원 농도"를 측정하는 다양한 방법들이 이후에 개시되는 바와 같이 당해분야에 널리 공지되어 있다.

본 발명은 또한 항원-결합 분자의 약동학을 개선시키기 위한 본 발명의 FcRn-결합 도메인의 용도를 제공한다. 보다 구체적으로, 본 발명은 EU238, EU250, EU252, EU254, EU255, EU258, EU286, EU307, EU308, EU309, EU311, EU315, EU428, EU433, EU434, 및 EU436으로 이루어진 그룹 중에서 선택된 하나 이상의 위치에서 모 FcRn-결합 도메인 중의 아미노산을 치환시키고 이에 의해 본래의 FcRn-결합 도메인을 갖는 항원-결합 분자에 비해 중성 및/또는 산성 pH에서 상기 FcRn-결합 활성을 증가시킴으로써, 항원-결합 분자의 약동학을 개선시키는 방법을 제공한다.

본 발명에서 "약동학의 증대", "약동학의 개선", 및 "우수한 약동학"이란 용어를 "혈장 (혈액) 체류의 증대", "혈장 (혈액) 체류의 개선", "우수한 혈장 (혈액) 체류", 및 "연장된 혈장 (혈액) 체류"로서 고쳐 말할 수 있다. 이들 용어는 동의어이다.

상기 약동학의 개선은 특별히 하기를 포함한다:

(1) 지연된 제거: 대조용 항원-결합 분자(예를 들어 본래의 FcRn-결합 도메인을 갖는 항원-결합 분자)에 비해 상기 항원-결합 분자의 투여와 혈장으로부터 상기 분자의 제거 사이의 시간을 연장시키고/시키거나;

(2) 바람직하게는 상기 항체 또는 항체 유도체가 항원-결합 분자의 투여 후 그의 항원에 결합할 수 있는 형태로, 대조용 항원-결합 분자(예를 들어 본래의 FcRn-결합 도메인을 갖는 항원-결합 분자)의 혈장 체류 시간에 비해 상기 항원-결합 분자의 혈장 체류 시간을 연장시키고/시키거나;

(3) 항원-결합 분자의 투여와 제거 사이에서 상기 항원이 유리된(신체 중에서 상기 항원-결합 분자에 결합되지 않은) 기간을 대조용 항원-결합된 분자에 비해 단축시키고/시키거나(상기 항원-결합 분자가 환자의 신체 중에서 그의 항원에 결합되어 있는 동안 투여와 제거 사이의 기간을 대조용 항원-결합 분자(예를 들어 본래의 FcRn-결합 도메인을 갖는 항원-결합 분자)에 비해 연장시킴);

(4) 항체의 분해 전에 신체 중의 전체 항원에 대한 항원-결합된 분자에 결합된 항원의 비를 대조용 항원-결합 분자(예를 들어 본래의 FcRn-결합 도메인을 갖는 항원-결합 분자)에 결합된 항원의 비에 비해 증가시키고(항체 또는 항체 유도체의 투여와 분해 사이의 상기 항원-결합 분자와 그의 항원과의 결합 사건의 수를 대조용 항원-결합 분자의 투여와 분해 사이의 결합 사건의 수에 비해 증가시킴);

(5) 상기 항원-결합 분자의 투여 후 혈장 중 전체 또는 유리 항원 농도를 대조용 항원-결합 분자(예를 들어 본래의 FcRn-결합 도메인을 갖는 항원-결합 분자)의 투여 후 혈장 중 전체 또는 유리 항원 농도에 비해 감소시킴

을 포함한다.

본 발명은 또한 환자에서 항원-결합 분자의 제거를 지연시키기 위한 방법을 제공하며, 상기 방법은 EU238, EU250, EU252, EU254, EU255, EU258, EU286, EU307, EU308, EU309, EU311, EU315, EU428, EU433, EU434, 및 EU436으로 이루어진 그룹 중에서 선택된 위치들 중 하나 이상에서 상기 항원-결합 분자의 FcRn-결합 도메인 내로 변형을 도입시키는 단계를 포함한다.

본 발명에 사용된 바와 같은 "약동학의 개선"이란 용어는 환자(인간, 또는 비-인간 동물, 예를 들어 마우스, 래트, 당나귀, 토끼 및 개)에의 상기 항원-결합 분자의 투여와 혈장으로부터의 제거(예를 들어 상기 항원-결합 분자가 세포내 등으로 분해되어 혈장으로 복귀될 수 없을 때까지) 사이의 기간의 연장 뿐만 아니라 투여로부터 상기 항원-결합 분자의 분해시까지 기간 동안 항원 결합을 허용하는 형태로(예를 들어 항원-결합 분자의 항원-부재 형태로) 상기 항원-결합 분자의 혈장 체류의 연장을 지칭한다.

따라서, 본 발명은 또한 항원-결합 분자의 혈장 체류 시간의 연장 방법을 제공하며, 상기 방법은 EU238, EU250, EU252, EU254, EU255, EU258, EU286, EU307, EU308, EU309, EU311, EU315, EU428, EU433, EU434, 및 EU436으로 이루어진 그룹 중에서 선택된 위치들 중 하나 이상에서 상기 항원-결합 분자의 FcRn-결합 도메인 내로 변형을 도입시키는 단계를 포함한다. 본래의 인간 IgG는 비-인간 동물로부터의 FcRn에 결합할 수 있다. 예를 들어, 본래의 인간 IgG는 인간 FcRn보다 마우스 FcRn에 더 강하게 결합할 수 있으므로 본 발명의 항원-결합 분자의 성질을 확인하기 위해서는 마우스에의 투여를 사용하는 것이 바람직할 수 있다(문헌[Int Immunol. 2001 Dec; 13(12):1551-9]). 또 다른 예로서, 고유 FcRn 유전자가 파괴되고 인간 FcRn 유전자에 대한 트랜스유전자가 발현되도록 잠복되어 있는 마우스(문헌[Methods Mol Biol. 2010; 602:93-104])를 또한 이후에 개시하는 본 발명의 항원-결합 분자의 성질을 확인하기 위해 투여에 사용하는 것이 바람직할 수 있다.

구체적으로, "약동학의 개선"은 또한 항원에 결합되지 않은 동안의 항원-결합 분자(항원-결합 분자의 항원-부재 형태)의 투여와 분해 사이의 기간의 연장을 포함한다. 혈장 중 상기 항원-결합 분자는 상기 항원-결합 분자가 이미 항원에 결합된 경우 새로운 항원에 결합할 수 없다. 따라서, 상기 항원-결합 분자가 항원에 결합되지 않은 기간이 길수록, 새로운 항원에 결합할 가능성을 갖는 기간이 길어진다(또 다른 항원에 결합할 기회가 더 높아진다). 즉 보다 많은 항원이 보다 짧은 기간 동안 결합된다. 따라서, 상기 항원-결합 분자의 항원-유리 형태의 혈장 농도가 증가될 수 있고 항원이 상기 항원-결합 분자에 결합되는 전체 기간이, 상기 변형된 항원-결합 분자의 투여에 의해 상기 혈장으로부터의 항원 제거를 가속화함으로써 연장될 수 있다.

구체적으로, 본 발명에서 "항원-결합 분자의 약동학의 개선"은 항원-결합 분자의 항원-부재 형태의 약동학적 매개변수의 개선(혈장 중 반감기의 연장, 혈장 중 평균 체류 시간의 연장, 및 혈장 제거의 장애 중 어느 하나), 상기 변형된 항원-결합 분자의 투여 후 항원이 상기 항원-결합 분자에 결합되는 기간의 연장, 및 혈장으로부터 항원-결합 분자-매개된 항원 제거의 가속화를 포함한다.

상기 항원-결합 분자의 약동학의 개선을, 상기 매개변수들인, 혈장 중 반감기, 평균 혈장 체류 시간, 및 항원-결합 분자 또는 그의 항원-부재 형태의 혈장 제거 중의 어느 하나를 측정함으로써 평가할 수 있다(문헌[ "Pharmacokinetics: Enshu ni yoru Rikai (실행을 통한 이해)" Nanzando]). 예를 들어 상기 항원-결합 분자 또는 그의 항원-부재 형태의 혈장 농도를 마우스, 래트, 원숭이, 토끼, 개 또는 인간에게 상기 항원-결합 분자의 투여 후에 측정한다. 이어서, 각각의 매개변수를 측정한다. 상기 혈장 반감기 또는 평균 혈장 체류 시간이 연장되는 경우, 상기 항원-결합 분자의 약동학은 개선되는 것으로 판단할 수 있다. 상기 매개변수들을 당해 분야의 숙련가들에게 공지된 방법에 의해 측정할 수 있다. 상기 매개변수들을 예를 들어 첨부된 사용 설명서에 따라 약동학 분석 소프트웨어 윈놀린(WinNonlin)(파사이트(Pharsight))을 사용하여 비-구획 분석에 의해 적합하게 평가할 수 있다. 상기 항원-부재 항원-결합 분자의 혈장 농도를 당해 분야의 숙련가들에게 공지된 방법, 예를 들어 문헌[Clin Pharmacol. 2008 Apr; 48(4): 406-17]에 개시된 분석 방법을 사용하여 측정할 수 있다.

본 발명에서, "약동학의 개선"이란 용어는 또한 항원-결합 분자의 투여 후 상기 항원-결합 분자에 항원이 결합하는 기간의 연장을 포함한다. 상기 항원-결합 분자의 투여 후 상기 항원-결합 분자에 항원이 결합하는 기간이 연장되는 지의 여부를 유리 항원의 혈장 농도를 측정함으로써 평가할 수 있다. 상기 연장은 유리 항원 농도 대 총 항원 농도의 비의 증가에 필요한 시간 또는 유리 항원의 측정된 혈장 농도를 근거로 판단될 수 있다.

본 발명은 또한 특정 항원의 총 또는 유리 항원 혈장 농도를 감소시키기 위한 본 발명의 항원-결합 분자의 용도를 제공하며, 여기에서 상기 항원-결합 분자는 상기 항원과 결합할 수 있는 항원-결합 도메인을 포함한다. 보다 구체적으로, 본 발명은 총 또는 유리 항원 혈장 농도의 감소 방법을 제공하며, 상기 방법은

a) 모 FcRn-결합 도메인을 포함하는 항원-결합 분자를 제공하고, 여기에서 상기 항원-결합 분자는 상기 항원과 결합할 수 있는 항원-결합 도메인을 포함하며,

b) EU238, EU250, EU252, EU254, EU255, EU258, EU286, EU307, EU308, EU309, EU311, EU315, EU428, EU433, EU434, 및 EU436으로 이루어진 그룹 중에서 선택된 하나 이상의 위치에서 모 FcRn-결합 도메인 중의 아미노산을 치환시키고 이에 의해 본래의 FcRn-결합 도메인을 갖는 항원-결합 분자에 비해 중성 pH에서 상기 FcRn-결합 활성을 증가시키는

단계들을 포함한다.

더욱이, 본 발명은 EU238, EU250, EU252, EU254, EU255, EU258, EU286, EU307, EU308, EU309, EU311, EU315, EU428, EU433, EU434, 및 EU436으로 이루어진 그룹 중에서 선택된 위치들 중 하나 이상에서 상기 항원-결합 분자의 FcRn-결합 도메인 내로 변형을 도입시키는 단계를 포함한다. 본 발명에 사용된 바와 같은 "항원-제거율"이란 용어는 항원-결합 분자가 상기 항체 또는 항체 유도체의 투여와 제거(즉 분해) 사이의 시간 동안 혈장으로부터 제거할 수 있는 항원의 수를 지칭한다.

상기 항원-결합 분자에 결합되지 않은 유리 항원의 혈장 농도 또는 유리 항원 농도 대 총 농도의 비를 당해 분야의 숙련가들에게 공지된 방법에 의해, 예를 들어 문헌[Pharm Res. 2006 Jan; 23 (1): 95-103]에 개시된 방법에 의해 측정할 수 있다. 한편으로, 항원이 생체 내에서 특정 작용을 나타내는 경우, 상기 항원이 상기 항원 작용을 중화하는 항원-결합 분자(길항 분자)에 결합하는 지의 여부를 상기 항원 작용이 중화되는 지의 여부의 시험에 의해 평가할 수 있다. 상기 항원 작용이 중화되는 지의 여부를, 상기 항원 작용을 반영하는 생체 내 마커를 분석함으로써 평가할 수 있다. 상기 항원이 상기 항원 작용을 활성화하는 항원-결합 분자(작용 분자)에 결합하는 지의 여부를, 상기 항원 작용을 반영하는 생체 내 마커를 분석함으로써 평가할 수 있다.

유리 항원의 혈장 농도 및 혈장 중 유리 항원의 양 대 혈장 중 총 항원의 양의 비의 측정, 생체 내 마커 분석, 및 상기와 같은 측정은 특별히 제한되지 않지만; 상기 분석을 바람직하게는 상기 항원-결합 분자 투여 후 일정 기간이 지난 후에 수행한다. 본 발명에서, 상기 항원-결합 분자의 투여 후 기간은 특별히 제한되지 않으며; 당해 분야의 숙련가들은 상기 투여된 항원-결합 분자의 성질 등에 따라 적합한 기간을 결정할 수 있다. 상기와 같은 기간은 예를 들어 상기 항원-결합 분자 투여 후 1일째, 상기 항원-결합 분자 투여 후 3일째, 상기 항원-결합 분자 투여 후 7일째, 상기 항원-결합 분자 투여 후 14일째, 및 상기 항원-결합 분자 투여 후 28일째를 포함한다. 본 발명에서, "혈장 항원 농도"란 용어는 항원-결합 분자 결합된 항원과 비-결합된 항원 농도의 합인 "혈장 중 총 항원 농도"이거나 또는 항원-결합 분자 비-결합된 항원 농도인 "혈장 중 유리 항원 농도"를 의미한다.

혈장 중 총 항원 농도를 본 발명의 항원-결합 분자의 투여에 의해, 인간 FcRn-결합 도메인으로서 본래의 인간 IgG Fc 도메인을 포함하는 기준 항원-결합 분자의 투여에 비해 또는 본 발명의 항원-결합 도메인 분자를 투여하지 않은 경우에 비해 2 배, 5 배, 10 배, 20 배, 50 배, 100 배, 200 배, 500 배, 1,000 배까지 또는 심지어 더 많이 낮출 수 있다.

항원/항원-결합 분자의 몰 비를 하기 나타낸 바와 같이 계산할 수 있다;

값 A: 각 시점에서의 몰 항원 농도

값 B: 각 시점에서의 몰 항원-결합 분자 농도

값 C: 각 시점에서 몰 항원-결합 분자 농도에 따른 몰 항원 농도(항원/항원-결합 분자 몰 비)

C = A/B.

보다 작은 값 C는 항원-결합 분자당 더 높은 항원 제거 효율을 가리키는 반면, 보다 높은 값 C는 항원-결합 분자당 더 낮은 항원 제거 효율을 가리킨다.

항원/항원-결합 분자 몰 비를 본 발명의 항원-결합 분자의 투여에 의해, 인간 FcRn-결합 도메인으로서 본래의 인간 IgG Fc 영역을 포함하는 기준 항원-결합 분자의 투여에 비해 2 배, 5 배, 10 배, 20 배, 50 배, 100 배, 200 배, 500 배, 1,000 배까지 또는 심지어 더 많이 낮출 수 있다.

본 발명에서, 본래의 인간 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4를 바람직하게는, 그의 인간 FcRn 결합 활성 또는 생체 내 활성에 대해 비교용의 본래의 인간 IgG와 상기 항원-결합 분자를 비교할 목적으로 본래의 인간 IgG로서 사용한다. 바람직하게는, 관심의 항원-결합 분자와 동일한 항원-결합 도메인 및 인간 FcRn-결합 도메인으로서 본래의 인간 IgG Fc 영역을 포함하는 기준 항원-결합 분자가 적합하게 사용될 수 있다. 보다 바람직하게는, 본래의 인간 IgG1을 그의 인간 FcRn 결합 활성 또는 생체 내 활성에 대해 본래의 인간 IgG 기준과 상기 항원-결합 분자를 비교할 목적으로 사용한다.

혈장 중의 총 항원 농도 또는 항원/항체 몰비의 감소를 WO 2011/122011의 실시예 6, 8 및 13에 개시된 바와 같이 평가할 수 있다. 보다 구체적으로, 인간 FcRn 트랜스제닉 마우스 계열 32 또는 계열 276(잭슨 레보라토리즈(Jackson Laboratories), 문헌[Methods Mol Biol. 2010; 602:93-104])을 사용하여, 이들을, 관심 항원-결합 분자가 상기 마우스 대응 항원과 교차 반응하지 않는 경우 항원-항체 동시-주사 모델 또는 정상 상태 항원 주입 모델에 의해 평가할 수 있다. 항원-결합 분자가 마우스 대응물과 교차 반응하는 경우, 이들을 인간 FcRn 트랜스제닉 마우스 계열 32 또는 계열 276(잭슨 레보라토리즈)에 항원-결합 분자를 단순히 주사함으로써 평가할 수 있다. 동시 주사 모델에서, 항원-결합 분자와 항원의 혼합물을 상기 마우스에게 투여한다. 정상 상태 항원 주입 모델에서, 항원 용액을 함유하는 주입 펌프를 상기 마우스에게 이식하여 일정한 혈장 항원 농도를 성취하고, 이어서 항원-결합 분자를 상기 마우스에게 주사한다. 투여된 시험 항원-결합 분자 모두에 대해 동일한 투여량을 사용한다. 혈장 중 총 항원 농도, 혈장 중 유리 항원 농도 및 혈장 항원-결합 분자 농도를 당해 분야의 숙련가들에게 공지된 방법을 사용하여 적합한 시점에서 측정한다.

혈장 중 총 또는 유리 항원 농도 및 항원/항원-결합 분자 몰 비를 본 발명의 장기적인 효과의 평가를 위해 투여 후 2, 4, 7, 14, 28, 56 또는 84일째에 측정할 수 있다. 즉, 장기적인 혈장 항원 농도를, 본 발명의 항원 결합 분자의 성질을 평가하기 위해 항원-결합 분자의 투여 후 2, 4, 7, 14, 28, 56 또는 84일째에 혈장 중 총 또는 유리 항원 농도 및 항원/항원-결합 분자 몰 비를 측정함으로써 측정한다. 상기 혈장 항원 농도 또는 항원/항원-결합 분자 몰 비의 감소가 본 발명에 개시된 항원-결합 분자에 의해 성취되는 지의 여부를 상술한 시점들 중 임의의 하나 이상의 시점에서 상기 감소의 평가에 의해 결정할 수 있다.

혈장 중 총 또는 유리 항원 농도 및 항원/항원-결합 분자 몰 비를 본 발명의 단기간 효과의 평가를 위해 투여 후 15 분, 1, 2, 4, 8, 12 또는 24 시간째에 측정할 수 있다. 즉, 단기 혈장 항원 농도를, 본 발명의 항원 결합 분자의 성질을 평가하기 위해 항원-결합 분자의 투여 후 15 분, 1, 2, 4, 8, 12 또는 24 시간째에 혈장 중 총 또는 유리 항원 농도 및 항원/항원-결합 분자 몰 비를 측정함으로써 측정한다.

보다 구체적으로, 본 발명에 개시된 바와 같이 혈장 중의 항원 제거 활성에 대해 장기간 효과를 갖는 항원-결합 분자들은 pH 7.0 및 25 ℃에서 3.0 마이크로몰 내지 0.2 마이크로몰 범위 내의 본래의 인간 IgG1 또는 KD보다 28 배 내지 440 배 더 강한 범위 내의 인간 FcRn-결합 활성을 갖는다. 바람직하게는, 상기 KD는 700 나노몰 내지 0.2 나노몰의 범위 이내이고, 보다 바람직하게는, 상기 KD는 500 나노몰 내지 3.5 나노몰의 범위 이내, 보다 바람직하게는 150 나노몰 내지 3.5 나노몰의 범위 이내이다. 상기 장기간 혈장 항원 농도를, 혈장 중의 항원 제거 활성에 대한 본 발명의 항원-결합 분자의 장기간 효과를 평가하기 위해서 혈장 중의 총 또는 유리 항원 농도 및 항원/항원-결합 분자 몰비를 항원-결합 분자 투여 후 2, 4, 7, 14, 28, 56 또는 84일째에 측정함으로써 측정한다. 상기 혈장 항원 농도 또는 항원/항원-결합 분자 몰비의 감소가 본 발명에 개시된 항원-결합 분자에 의해 성취되는 지의 여부를 상술한 시점들 중 임의의 하나 이상의 시점에서 상기 감소의 평가에 의해 결정할 수 있다.

훨씬 더 구체적으로, 본 발명에 개시된 바와 같이 혈장 중의 항원 제거에 대해 단기간 효과를 갖는 항원-결합 분자는 pH 7.0 및 25 ℃에서 0.2 마이크로몰 초과, 바람직하게는 700 나노몰 초과, 보다 바람직하게는 500 나노몰 초과, 가장 바람직하게는 150 나노몰 초과의 본래의 인간 IgG 또는 KD보다 440 배 더 강한 인간 FcRn-결합 활성을 갖는다. 단기간 혈장 항원 농도를, 혈장 중의 항원 제거 활성에 대한 본 발명의 항원-결합 분자의 단기간 효과를 평가하기 위해서 혈장 중의 총 또는 유리 항원 농도 및 항원/항원-결합 분자 몰비를 항원-결합 분자 투여 후 15 분, 1, 2, 4, 8, 12 또는 24 시간째에 측정함으로써 측정한다.

본 발명의 항원-결합 분자의 투여 경로를 피 내, 정맥 내, 안 내, 피하, 복강 내, 비 경구 및 근육 내 주사 중에서 선택할 수 있다.

본 발명과 관련하여, 인간에서의 약동학의 개선이 바람직하다. 인간에서 혈장 체류를 측정하기 어려운 경우, 마우스(예를 들어 정상 마우스, 인간 항원-발현 트랜스제닉 마우스, 인간 FcRn-발현 트랜스제닉 마우스) 또는 원숭이(예를 들어 키노몰구스 원숭이)에서의 혈장 체류를 근거로 상기 체류를 예견할 수도 있다.

본 발명에서 "산성 pH 범위에서의 항원-결합 분자의 항원-결합 활성을 중성 pH 범위에서의 경우보다 작게 감소시킴"이란 용어는 pH 4.0 내지 pH 6.5에서의 항원-결합 분자의 항원-결합 활성이 pH 6.7 내지 pH 10.0에서의 그의 항원-결합 활성에 비해 감소함을 의미한다. 바람직하게는, 상기 어구는 pH 5.5 내지 pH 6.5에서의 항원-결합 분자의 항원-결합 활성이 pH 7.0 내지 pH 8.0에서의 경우에 비해 감소함을 의미하며, 보다 바람직하게는 초기 엔도솜 pH에서의 항원-결합 활성이 생체 내 혈장 pH에서의 그의 항원-결합 활성에 비해 감소함을 의미한다. 구체적으로, pH 5.8 내지 pH 6.0에서의 항원-결합 분자의 항원-결합 활성이 pH 7.4에서의 상기 항원-결합 분자의 항원-결합 활성에 비해 감소된다.

본 발명에서 "중성 pH 범위에서의 항원-결합 분자의 항원-결합 활성을 산성 pH 범위에서의 경우보다 작게 감소시킴"이란 용어는 pH 6.7 내지 pH 10.0에서의 항원-결합 분자의 항원-결합 활성이 pH 4.0 내지 pH 6.5에서의 그의 항원-결합 활성에 비해 손상됨을 의미한다. 바람직하게는, 상기 어구는 pH 7.0 내지 pH 8.0에서의 항원-결합 분자의 항원-결합 활성이 pH 5.5 내지 pH 6.5에서의 경우에 비해 손상됨을 의미하며, 보다 바람직하게는 생체 내 혈장 pH에서의 상기 분자의 항원-결합 활성이 초기 엔도솜 pH에서의 그의 항원-결합 활성에 비해 손상됨을 의미한다. 구체적으로, pH 7.4에서의 항원-결합 분자의 항원-결합 활성이 pH 5.8 내지 pH 6.0에서의 상기 항원-결합 분자의 항원-결합 활성에 비해 손상된다.

한편, 본 발명에서 "산성 pH 범위에서의 항원-결합 분자의 항원-결합 활성을 중성 pH 범위에서의 경우보다 작게 감소시킴"이란 표현을 또한 "중성 pH 범위에서의 항원-결합 분자의 항원-결합 활성을 산성 pH 범위에서의 경우보다 더 증가시킴"으로도 표현한다. 구체적으로, 본 발명에서 산성 및 중성 pH 범위 간의 항원-결합 분자의 항원 결합 활성의 비를 증가시키는 것이 가능하다. 예를 들어 KD(pH 5.8)/KD(pH 7.4)의 값이 하기에 개시하는 실시태양에서 증가된다. 산성 및 중성 pH 범위 간의 항원-결합 분자의 항원-결합 활성의 비를 예를 들어 산성 pH 범위에서의 상기 분자의 항원-결합 활성을 감소시키거나, 중성 pH 범위에서의 상기 분자의 항원-결합 활성을 증가시키거나, 또는 이 둘 모두에 의해 증가시킬 수 있다.

"중성 pH 범위에서의 항원-결합 분자의 항원-결합 활성을 산성 pH 범위에서의 경우보다 작게 감소시킴"이란 표현을 또한 "산성 pH 범위에서의 항원-결합 분자의 항원-결합 활성을 중성 pH 범위에서의 경우보다 더 증가시킴"으로도 표현한다. 구체적으로, 본 발명에서 산성 및 중성 pH 범위 간의 항원-결합 분자의 항원 결합 활성의 비를 증가시키는 것이 가능하다. 예를 들어 KD(pH 7.4)/KD(pH 5.8)의 값이 하기에 개시하는 실시태양에서 증가된다. 산성 및 중성 pH 범위 간의 항원-결합 분자의 항원-결합 활성의 비를 예를 들어 중성 pH 범위에서의 상기 분자의 항원-결합 활성을 감소시키거나, 산성 pH 범위에서의 상기 분자의 항원-결합 활성을 증가시키거나, 또는 이 둘 모두에 의해 증가시킬 수 있다.

본 발명에 사용된 바와 같이 "저 칼슘-이온 농도에서의 항원-결합 활성(결합 능력)을 고 칼슘-이온 농도에서의 그의 항원-결합 활성보다 작게 감소시킴"이란 용어는 고 칼슘-이온 농도에서 상기 항원-결합 도메인의 항원에 대한 결합 친화성에 비해 저 칼슘-이온 농도에서 상기 항원에 대한 항원-결합 도메인의 결합 친화성을 감소시킴을 지칭한다. 상기 저 칼슘 농도는 바람직하게는 0.5 내지 10 마이클로몰, 보다 바람직하게는 0.1 내지 30 마이크로몰의 이온화된 칼슘이고, 상기 고 칼슘 농도는 100 마이크로몰 내지 10 mM, 보다 바람직하게는 200 마이크로몰 내지 5 mM의 이온화된 칼슘이다.

본 발명에서, "산성 pH 범위에서의 항원-결합 활성을 중성 pH 범위에서의 경우에 비해 손상시킴"이란 표현은 때때로 "산성 pH 범위에서의 항원-결합 활성을 중성 pH 범위에서의 경우보다 작게 감소시킴" 대신에 사용된다.

본 발명에서, 산성 pH 범위에서의 인간 FcRn-결합 활성은 pH 4.0 내지 pH 6.5에서의 인간 FcRn-결합 활성, 바람직하게는 pH 5.5 내지 pH 6.5에서의 인간 FcRn-결합 활성, 및 특히 바람직하게는 pH 5.8 내지 pH 6.0(이는 생체 내 초기 엔도솜 pH에 필적한다)에서의 인간 FcRn-결합 활성을 의미한다. 한편, 본 발명에서 중성 pH 범위에서의 인간 FcRn-결합 활성은 pH 6.7 내지 pH 10.0에서의 인간 FcRn-결합 활성, 바람직하게는 pH 7.0 내지 pH 8.0에서의 인간 FcRn-결합 활성, 및 특히 바람직하게는 pH 7.4(이는 생체 내 혈장 pH에 필적한다)에서의 인간 FcRn-결합 활성을 의미한다.

본 발명의 항원-결합 분자 및 용도들을 임의의 특정한 이론으로 제한하지는 아니지만, 산성 pH 범위에서의 항원-결합 분자의 항원-결합 능력의, 중성 pH 범위에서의 경우보다 작은 감소(손상) 및/또는 중성 pH 범위에서의 인간 FcRn-결합 활성의 증가(증대)와 단일 항원-결합 분자가 결합할 수 있는 항원의 수의 증가 간의 관계를, 세포 내로의 항원-결합 분자의 흡수 촉진 및 혈장으로부터의 항원 제거의 증대에 기인하여 하기와 같이 설명할 수 있다.

예를 들어, 상기 항원-결합 분자가 막 항원에 결합하는 항체인 경우, 체내에 투여되는 항체는 상기 항원에 결합하고 이어서 상기 항원에 대한 결합을 유지하면서 상기 항원과 함께 세포 중의 엔도솜 내로의 내면화를 통해 흡수된다. 이어서, 상기 항체는 상기 항원에 대한 결합을 유지하면서 리소솜으로 전위하고, 상기 항원과 함께 상기 리소솜에 의해 분해된다. 상기 혈장으로부터의 내면화-매개된 제거를 항원-의존적인 제거라 칭하며, 상기와 같은 제거는 다수의 항체 분자들에 대해 보고되었다(문헌[Drug Discov Today. 2006 Jan; 11(1-2): 81-8]). IgG 항체의 단일 분자가 2가 방식으로 항원에 결합하는 경우, 상기 단일 항체 분자는 상기 2 개 항원 분자에 대한 결합을 유지하면서 내면화되고, 상기 리소솜에서 분해된다. 따라서, 전형적인 항체의 경우에, IgG 항체의 한 분자는 항원의 3 개 이상의 분자에 결합할 수 없다. 예를 들어 중화 활성을 갖는 단일의 IgG 항체 분자는 3 개 이상의 항원 분자를 중화시킬 수 없다.

혈장 중 IgG 분자의 비교적 연장된 체류(느린 제거)는 IgG 분자의 구조 수용체로서 공지된 인간 FcRn의 작용에 기인한다. IgG 분자는 음세포작용을 통해 엔도솜 내로 흡수된 경우, 상기 엔도솜 중의 산성 조건 하에서 상기 엔도솜에서 발현된 인간 FcRn에 결합한다. 인간 FcRn에 결합하지 않은 IgG 분자는 리소솜으로 이동하는 반면(여기에서 분해된다), 인간 FcRn에 결합한 IgG 분자는 세포 표면으로 전위하고 혈장 중의 중성 조건 하에서 인간 FcRn으로부터의 해리에 의해 상기 혈장 중에 다시 복귀한다.

한편으로, 상기 항원-결합 분자가 가용성 항원에 결합하는 항체인 경우에, 체내로 투여된 항체는 상기 항원에 결합하고 이어서 상기 항원에 대한 결합을 유지하면서 세포 내로 흡수된다. 세포 내로 흡수된 다수의 항체는 FcRn을 통해 상기 세포 밖으로 방출된다. 그러나, 상기 항체는 상기 세포 밖으로 방출되기 때문에(이때 상기 항체는 항원에 결합된 채로 유지된다), 항원에 다시 결합할 수 없다. 따라서, 막 항원에 결합하는 항체와 유사하게, 전형적인 항체의 경우에, IgG 항체의 하나의 분자는 3 개 이상의 항원 분자에 결합할 수 없다.

혈장 중의 중성 조건 하에서 항원에 강하게 결합하지만 엔도솜 중의 산성 조건 하에서는 상기 항원으로부터 해리되는 pH-의존성 항원-결합 항체(즉 중성 조건 하에서는 결합하지만 산성 조건 하에서는 해리되는 항체)는 상기 엔도솜 내에서 상기 항원으로부터 해리될 수 있다. 상기와 같은 pH-의존성 항원-결합 항체는 항원 해리 후 FcRn에 의해 혈장으로 재순환되는 경우 항원에 다시 결합할 수 있으며; 따라서 각각의 항체는 다수의 항원에 반복적으로 결합할 수 있다. 더욱 또한, 상기 항원-결합 분자에 결합된 항원은 상기 엔도솜 내에서 해리되고 혈장으로 재순환되지 않는다. 이는 상기 항원-결합 분자-매개된 항원의 세포 내로의 흡수를 촉진한다. 따라서, 항원-결합 분자의 투여는 항원 제거를 증대시킬 수 있으며 이에 의해 혈장 항원 농도가 감소한다.

혈장 중의 고 칼슘 농도 조건 하에서 항원에 강하게 결합하고 엔도솜 중의 저 칼슘 농도 조건 하에서 항원으로부터 해리되는 칼슘 농도-의존성 항원-결합 항체는 상기 엔도솜 내에서 상기 항원으로부터 해리될 수 있다. 상기 칼슘 농도-의존성 항원-결합 항체는 항원 해리 후 FcRn을 통해 혈장으로 재순환될 때 다시 항원에 결합할 수 있다. 따라서, 상기와 같은 단일 항체는 다수의 항원에 반복적으로 결합할 수 있다. 한편, 상기 항원-결합 분자에 결합된 항원은 상기 항원이 엔도솜 중에서 해리되기 때문에 혈장으로 재순환되지 않으며, 따라서 상기 항원-결합 분자는 상기 항원의 세포 내로의 흡수를 촉진한다. 상기 항원-결합 분자의 투여는 항원의 제거를 촉진하며, 이는 혈장 중의 항원 농도의 감소를 허용한다.

pH-의존적인 방식으로 항원에 결합하는(중성 조건 하에서 결합하지만 산성 조건 하에서는 해리되는) 항체에 중성 조건(pH 7.4) 하에서 상기 인간 FcRn-결합 활성을 부여함으로써 상기 항원-결합 분자-매개된 항원의 세포 내로의 흡수를 더욱 촉진시킬 수 있다. 따라서, 항원-결합 분자의 투여는 항원 제거를 증대시키고 이에 의해 혈장 항원 농도를 감소시킬 수 있다. 통상적으로, 항체와 항원-항체 복합체는 모두 비-특이적인 세포 이물 흡수에 의해 세포 내로 흡수되고, 이어서 엔도솜 중의 산성 조건 하에서 FcRn에 결합함으로써 세포 표면으로 이동한다. 상기 항체 및 항원-항체 복합체는 세포 표면상의 중성 조건 하에서 FcRn으로부터의 해리를 통해 혈장으로 재순환된다. 따라서, 항원 결합에서 충분한 pH 의존성을 나타내는(중성 조건 하에서 결합하지만 산성 조건 하에서는 해리되는) 항체가 혈장 중의 항원에 결합하고 이어서 엔도솜 중의 결합된 항원으로부터 해리되는 경우, 상기 항원 제거 속도는 비-특이적인 세포 이물 흡수를 통한 항원 흡수 속도와 동일한 것으로 추정된다. 다른 한편으로, 상기 pH 의존성이 불충분하면, 상기 엔도솜 중에서 해리되지 않은 항원은 또한 혈장으로 재순환된다. 한편, 상기 pH 의존성이 충분한 경우, 상기 항원 제거에서 속도-결정 단계는 상기 비-특이적 세포 이물 흡수에 의한 세포 내로의 흡수이다. FcRn 중 일부는 세포 표면상에 집중되는 것으로 추정되는데, 그 이유는 FcRn이 항체를 상기 엔도솜으로부터 세포 표면으로 운반하기 때문이다.

본 발명자들은 항원-결합 분자 중 하나인 IgG-유형 면역글로불린이 전형적으로 중성 pH 범위에서는 FcRn-결합 능력을 거의 갖지 않지만 중성 pH 범위에서 FcRn-결합 능력을 나타내는 것들은 세포 표면상의 FcRn에 결합할 수 있으며 따라서 세포-표면 FcRn에 결합함으로써 FcRn-의존적인 방식으로 세포 내로 흡수됨을 추정하였다. 세포 내로 FcRn-매개된 흡수의 속도는 비-특이적인 세포 이물 흡수에 의한 세포 내로의 흡수 속도보다 더 빠르다. 따라서, 항원 제거 속도를, 중성 pH 범위에서의 FcRn-결합 능력을 부여함으로써 더욱 가속시킬 수 있다. 구체적으로, 중성 pH 범위에서 FcRn-결합 능력을 갖는 항원-결합 분자는 전형적인(본래의 인간) IgG-유형 면역글로불린보다 더 빠르게 세포 내로 항원을 운반하며, 이어서 상기 항원-결합 분자는 엔도솜 중에서 상기 항원으로부터 해리된다. 상기 항원-결합 분자는 세포 표면 또는 혈장으로 재순환되고, 다시 또 다른 항원에 결합하며 FcRn을 통해 세포 내로 흡수된다. 상기 순환의 속도는 중성 pH 범위에서의 FcRn-결합 능력을 개선함으로써 가속화될 수 있으며, 이는 혈장으로부터 항원 제거 속도를 가속화할 수 있다. 더욱 또한, 상기 효율을, 산성 pH 범위에서의 항원-결합 분자의 항원-결합 활성을 중성 pH 범위에서의 경우보다 작게 감소시킴으로써 추가로 개선시킬 수 있다. 또한, 단일 항원-결합 분자에 결합할 수 있는 항원의 수는 단일 항원-결합 분자에 의해 성취된 순환의 증가 수에 따라 증가하는 것으로 추정된다. 본 발명의 항원-결합 분자는 항원-결합 도메인 및 FcRn-결합 도메인을 포함한다. 상기 FcRn-결합 도메인은 항원-결합에 영향을 미치지 않으므로, 또는 상술한 기전에 비추어, 상기 세포 내로의 항원-결합 분자-매개된 항원 흡수의 촉진은 항원의 유형에 관계없이 예상될 수 있으며, 그 결과 산성 pH 범위에서 항원-결합 분자의 항원-결합 능력(결합 능력)을 중성 pH 범위에서의 경우보다 작게 감소시키고/시키거나 혈장 pH에서 그의 FcRn-결합 활성을 증가시킴으로써 항원 제거 속도를 증가시킨다.

모든 상기의 용도에서 본 발명의 항원-결합 분자는 상기 언급한 하나 이상의 위치에서의 치환 외에 EU256 위치에서의 치환을 또한 포함할 수 있다. 바람직하게는, EU256 위치에서의 아미노산을 글루탐산으로 치환시킨다. 더욱 또한, 모든 상기 사용 방법들은 또한 EU238, EU250, EU252, EU254, EU255, EU258, EU286, EU307, EU308, EU309, EU311, EU315, EU428, EU433, EU434, 및 EU436으로 이루어진 그룹 중에서 선택된 하나 이상의 위치에서의 치환 외에 EU256 위치에서의 치환을 포함할 수 있으며, 이때 상기 EU256 위치에서의 아미노산은 바람직하게는 글루탐산으로 치환된다.

상기 모든 용도 및 방법의 바람직한 실시태양에서, 상기 FcRn-결합 영역은 Fc 영역이고, 보다 바람직하게는 상기는 인간 Fc 영역이다.

더욱이, 중성 또는 산성 pH에서의 FcRn-결합 활성을 증가시키기 위한 모 FcRn-결합 도메인의 아미노산 서열의 치환은 바람직하게는 EU252 및 EU434 위치 및 EU238, EU250, EU254, EU255, EU256, EU258, EU286, EU307, EU308, EU309, EU311, EU315, EU428, EU433, 및 EU436으로 이루어진 그룹 중에서 선택된 하나 이상의 위치들 중 하나에 존재한다. 보다 바람직하게는 상기 치환은 3 개 이상의 위치에서 존재하며, 여기에서 상기 3 개 이상의 위치는 표 2, 및 4 내지 7에 나타낸 조합들 중 하나이다. 훨씬 더 바람직하게는, 상기 치환은 표 3에 나타낸 조합들 중 하나이다.

더욱 또한, 상기 용도의 방법들은 EU387, EU422, EU424, EU426, EU433, EU436, EU438 및 EU440으로 이루어진 그룹 중에서 선택된 하나 이상의 위치에서 아미노산 치환을 도입시키고 이에 의해 기존 ADA에 대한 증가된 결합 활성을 감소시키는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 바람직하게는, 상기 치환은 표 11 중에서 선택된 조합들이다.

또한, 상기 용도의 방법들은 또한 EU234, EU235, EU236, EU237, EU238, EU239, EU265, EU266, EU267, EU269, EU270, EU271, EU295, EU296, EU297 EU298, EU300, EU324, EU325, EU327, EU328, EU329, EU331, 및 EU332(EU 넘버링 시스템에 따라)로 이루어진 그룹 중에서 선택된 하나 이상의 위치에서 FcRn-결합 도메인 중에 아미노산 치환을 도입시키는 추가의 단계를 포함할 수 있다. 바람직하게는, 치환 L235R/S239K를 도입시킨다. 바람직하게는, 상기 치환은 표 14 중에서 선택된 조합들이다.

상기 모든 용도 및 용도의 방법의 항원-결합 분자는 pH-의존성 항원-결합 도메인 또는 칼슘 이온-의존성 항원-결합 도메인을 포함할 수 있다. 본 발명의 항원-결합 분자에 의해 매개되는 세포 내로의 상기 항원 흡수를, 상술한 항원-결합 분자의 산성 pH 범위에서의 항원-결합 활성(결합 능력)을 중성 pH 범위에서의 그의 항원-결합 활성보다 작게 감소시킴으로써 추가로 개선시킨다. 또한, 예를 들어 상기 항원-결합 분자의 항원-결합 도메인을 이온화된 칼슘-농도 의존성 항원-결합 도메인으로 치환시킴으로써, 저 칼슘-이온 농도(즉 0.5 내지 10 마이크로몰)에서의 본 발명의 항원-결합 분자의 항원-결합 활성(결합 능력)을 고 칼슘-이온 농도(즉 100 마이크로몰 내지 10 mM)에서의 그의 항원-결합 활성보다 작게 감소시킴으로써 상기 세포 내로의 항원 흡수를 추가로 개선시키는 것이 바람직하다. 한편으로, 상기 모 항원-결합 분자는 이미 이온화된 칼슘-농도 의존성 항원-결합 도메인을 포함한다. 상술한 항원-결합 분자의 항원-결합 도메인 중의 하나 이상의 아미노산을 변경시킴으로써 산성 pH 범위에서의 항원-결합 활성(결합 능력)을 감소시키는 방법은 상기에 개시되어 있다. 바람직하게는, 상기 항원-결합 도메인을, 하나 이상의 아미노산 대신에 히스티딘을 사용하거나, 또는 세포 내로의 항원 흡수를 촉진하는 상술한 항원-결합 분자의 항원-결합 도메인 내에 하나 이상의 히스티딘을 삽입함으로써 변경시킨다.

중성 또는 산성 pH에서 증가된 FcRn-결합 활성을 갖는 변형된 항원-결합 분자의 클리어런스는, 상기 변형이 기존 ADA, 예를 들어 류마티스성 인자에 대한 상기 항원-결합 분자의 친화성을 증가시키는 경우 감소될 수 있다. 이는 상기와 같은 항체를 추가로 변형시키고 이에 의해 기존 ADA에 대한 친화성을 감소시킴으로써, 상기 순환의 수를 두 번째 변형 전, 및 따라서 기존 ADA에 대한 친화성이 감소되기 전의 항원-결합 분자에 비해 증가시킬 수 있다.

기존 항-약물 항체에 대한 친화성이 중성 pH에서 야생형 Fc 영역, 특히 EU387, EU422, EU424, EU426, EU433, EU436, EU438 및 EU440으로 이루어진 그룹 중에서 선택된 하나 이상의 위치에서 상기 FcRn 결합 도메인 중에 아미노산 치환을 포함하는 것들에 비해 현저하게 증가되지 않은 본 발명의 항원-결합 분자가, 자가면역 질병, 이식 거부(이식편 대 숙주병), 다른 염증성 질병 및 알러지성 질병을 앓고 있는 인간 환자를 치료하기 위한 치료 항체로서 특히 유용하다.

자가면역 질병은 체조직이 그 자신의 면역계에 의해 공격받는 경우 발생하는 병이다. 본 발명에서 고려되는 자가면역 질병의 예는 전신 홍반성 루푸스, 루푸스 신염, 유사천포창, 천포창, 피부근염, 자가면역 간염, 쇼그렌 증후군, 하시모토 갑상선염, 류마티스성 관절염, 소아(1형) 당뇨병, 다발성근염, 경피증, 애디슨병, 만성 소화 장애증, 길랑-바레 증후군, 확장성 심근병증, 혼합된 결합 조직 질병, 베게너 육아종증, 항-인지질 항체 증후군, 백반증, 악성 빈혈, 사구체신염, 및 폐 섬유증을 포함한다. 중증 근무력증, 그레이브스 병, 특발성 혈소판 감소성 자반증, 용혈성 빈혈, 당뇨병, 염증성 장 질병, 크론병, 궤양성 대장염, 다발성 경화증, 건선, 및 약물-유발된 자가면역 질병, 예를 들어 약물-유발된 루푸스. 바람직하게는, 상기 자가면역 질병은 전신 홍반성 루푸스 또는 루푸스 신염이다. 이식 거부는 이식편 대 숙주병을 포함하며 이는 이식 수용자의 면역계가 이식된 기관 또는 조직을 공격하는 과정이다. 다른 염증성 및 알러지성 질병은 죽상동맥경화증 및 건초열을 포함한다.

기존 ADA에 대해 증가된 결합 친화성은 치료 항체의 임상적 유용성 및 효능을 감소시킬 수 있다. 상기 ADA는 효능 및 약동학(예를 들어 분해율)에 영향을 미칠 수 있기 때문에, 상기 치료 항체의 유용성 그차제가 기존 ADA에 의해 제한될 수 있다. 때때로 상기 결합은 심한 부작용을 도출할 수 있다. 더욱 또한, 본 발명은 중성 또는 산성 pH에서 FcRn에 대해 증가된 결합 활성 및 중성 pH에서 기존 ADA에 대해 증가된 결합 활성을 갖는 Fc 영역을 포함하는 항원-결합 도메인의 기존 ADA에 대한 중성 pH에서의 결합 활성을 감소시키는 방법을 제공한다.

본 발명은 또한 중성 또는 산성 pH에서 FcRn에 대해 증가된 친화성 및 기존 ADA에 대해 증가된 결합 활성을 갖는 항원-결합 분자의 중성 pH에서의 기존 ADA에 대한 결합 활성을 감소시키기 위한, 변형된 FcRn-결합 도메인을 포함하는 본 발명의 항원-결합 분자의 용도를 제공한다.

특히, 본 발명은 중성 또는 산성 pH에서 FcRn에 대해 증가된 결합 활성을 갖는 항원-결합 분자의 Fc 영역의 중성 pH에서의 기존 ADA에 대한 결합 활성을 감소시키는 방법을 제공하며, 상기 방법은

a) 중성 또는 산성 pH에서 FcRn 및 중성 pH에서 기존 ADA에 대해 증가된 결합 활성을 갖는 Fc 영역을 제공하고;

b) EU387, EU422, EU424, EU426, EU433, EU436, EU438 및 EU440으로 이루어진 그룹 중에서 선택된 위치들 중 하나 이상에서 아미노산을 치환시킴

을 포함한다.

단계 a)에서 바람직한 Fc 영역은 인간 Fc 영역이다. 바람직하게는, 중성 또는 산성 pH 범위에서 FcRn 및 중성 pH 범위에서 기존 ADA에 대해 증가된 결합 활성을 갖는 Fc 영역은 EU238, EU250, EU252, EU254, EU255, EU256, EU258 EU286, EU307, EU308, EU309, EU311, EU315, EU428, EU433, EU434, 및 EU436으로 이루어진 그룹 중에서 선택된 하나 이상의 위치에서 아미노산의 치환을 포함한다. 보다 바람직하게는, 상기는 표 2 및 4 내지 7 중에서 선택된 위치의 조합들 중 임의의 하나의 위치에서 치환을 포함한다. 훨씬 더 바람직하게, 상기는 표 3 및 17 내지 20 중 임의의 하나에 나타낸 치환 또는 치환의 조합들 중 임의의 하나를 포함한다.

바람직하게는, 단계 b)는 표 8의 위치 중 임의의 하나에서의 아미노산의 치환을 포함한다. 보다 바람직하게는, 단계 b)는 표 11 중에서 선택된 치환 또는 조합들 중 하나를 도입시킴을 포함한다.

또한 바람직하게, 상기 항원-결합 분자는 pH-의존성 항원-결합 도메인 또는 칼슘 이온-의존성 항원-결합 도메인을 추가로 포함한다.

더욱이, 본 발명은 중성 pH에서 FcRn에 대해 증가된 결합 할성을 갖는 Fc 영역을 포함하는 항원-결합 분자의 기존 ADA에 대한 결합 활성을 감소시키는 방법을 제공하며, 상기 방법은

a) 산성 pH에서 FcRn 및 중성 pH에서 기존 ADA에 대해 증가된 결합 활성을 갖는 Fc 영역을 포함하는 항원-결합 분자를 제공하고,

b) EU387, EU422, EU424, EU426, EU433, EU436, EU438 및 EU440으로 이루어진 그룹 중에서 선택된 위치 중 하나 이상에서 상기 Fc 영역 중의 아미노산을 치환시키는

단계를 포함한다.

단계 a)에서 바람직한 Fc 영역은 인간 Fc 영역이다. 바람직하게는, 중성 pH 범위에서 FcRn 및 중성 pH 범위에서 기존 ADA에 대해 증가된 결합 활성을 갖는 Fc 영역은 EU238, EU250, EU252, EU254, EU255, EU258, EU286, EU307, EU308, EU309, EU311, EU315, EU428, EU433, EU434, 및 EU436으로 이루어진 그룹 중에서 선택된 하나 이상의 위치에서 아미노산의 치환을 포함한다. 상기는 또한 상기 언급한 하나 이상의 위치에서의 치환 외에 EU256 위치에서 치환을 포함할 수 있으며, 이때 상기 EU256 위치에서의 아미노산은 바람직하게는 글루탐산으로 치환된다. 보다 바람직하게는, 상기는 표 2 및 4 내지 7 중에서 선택된 위치의 조합들 중 임의의 하나의 위치에서 치환을 포함한다. 훨씬 더 바람직하게, 상기는 표 3 및 17 내지 20 중 임의의 하나에 나타낸 치환 또는 치환의 조합들 중 임의의 하나를 포함한다.

바람직하게는, 단계 b)는 표 10의 위치 중 임의의 하나에서의 아미노산의 치환을 포함한다. 보다 바람직하게는, 상기 위치는 a) EU387, b) EU422, c) EU424, d) EU438, e) EU440, f) EU422/EU424, 및 g) EU438/EU440으로 이루어진 그룹 중에서 선택된다. 훨씬 더 바람직하게는, 단계 b)는 표 11 중에서 선택된 치환 또는 조합들 중 하나를 도입시킴을 포함한다.

더욱이, 본 발명은 산성 pH에서 FcRn에 대해 증가된 결합 활성을 갖는 Fc 영역을 포함하는 항원-결합 분자의 기존 ADA에 대한 결합 활성을 감소시키는 방법을 제공하며, 상기 방법은

단계를 포함한다.

단계 a)에서 바람직한 Fc 영역은 인간 Fc 영역이다. 바람직하게는, 산성 pH 범위에서 FcRn 및 중성 pH 범위에서 기존 ADA에 대해 증가된 결합 활성을 갖는 Fc 영역은

i) EU434 위치에서, 또는

ii) 2 개 이상의 위치에서(여기에서 상기 2 개 이상의 위치는 a) EU252/EU254 / EU256; b) EU428 / EU434; 및 c) EU250 / EU428로 이루어진 그룹의 조합들 중 하나이다)

치환을 포함하는 아미노산 치환을 포함한다. 바람직하게는, 상기 Fc 영역은 i) 치환 M434H; 또는 ii) a) M252Y/S254T/T256E; b) M428L/N434S; 및 c) T250Q 및 M428L(EU 넘버링)로 이루어진 그룹의 조합들 중 하나를 포함한다.

바람직한 실시태양에서, 단계 b)에서 아미노산은 a) EU424 위치 또는 b) EU438/EU440 위치에서 치환된다. 보다 바람직하게, 상기 치환은 a) EU424N 또는 b) 조합 EU438R/EU440E이다.

추가의 바람직한 실시태양에서, 기존 ADA에 대한 결합 활성을 감소시키는 방법은 단계 c) 변형된 Fc 도메인을 갖는 상기 항원 결합 분자가 본래의 Fc 도메인을 포함하는 단계 a)에 나타낸 바와 같은 원래의 항원-결합 분자에 대한 결합 활성에 비해 내생적인 ADA에 대해 감소된 결합 활성을 가짐을 확인함을 추가로 포함한다.

본 발명은 포유동물, 바람직하게는 자가면역 질병을 앓고 있는 인간 환자의 혈액으로부터 항원 제거를 증가시키기 위한 본 발명의 항원-결합 분자의 용도를 제공한다.

본 발명은 모 항체에 비해 중성 pH에서 기존의 ADA에 대한 결합 활성을 현저하게 증가시키지 않으면서 단일의 항원-결합 분자와 결합할 수 있는 항원의 총수를 증가시키는 방법을 추가로 제공하며, 상기 방법은

단계들을 포함한다.

본 발명은 모 항체에 비해 중성 pH에서 기존의 ADA에 대한 항원-결합 분자의 결합 활성을 현저하게 증가시키지 않으면서 항원-결합된 형태로 세포 내로 흡수된 항원-부재 항원-결합 분자의 세포외 방출을 촉진하는 방법을 추가로 제공하며,

단계들을 포함한다.

본 발명은 모 항체에 비해 중성 pH에서 기존의 ADA에 대한 결합 활성을 현저하게 증가시키지 않으면서 혈장 항원을 제거하는 항원-결합 분자의 능력을 증가시키는 방법을 추가로 제공하며, 상기 방법은

단계들을 포함한다.

본 발명은 모 항체에 비해 중성 pH에서 기존의 ADA에 대한 결합 활성을 현저하게 증가시키지 않으면서 항원-결합 분자의 약동학을 개선시키는 방법을 추가로 제공하며, 상기 방법은

단계들을 포함한다.

본 발명은 모 항체에 비해 중성 pH에서 기존의 ADA에 대한 결합 활성을 현저하게 증가시키지 않으면서 전체 또는 유리 항원 혈장 농도를 감소시키는 방법을 추가로 제공하며, 상기 방법은

단계들을 포함한다.

상기 용도의 방법에서 단계 a)에서 바람직한 Fc 영역은 인간 Fc 영역이다. 바람직한 실시태양에서, 단계 b)에서 하나 이상의 위치에서 아미노산 치환은 EU238, EU250, EU252, EU254, EU255, EU258, EU286, EU307, EU308, EU309, EU311, EU315, EU428, EU433, EU434, 및 EU436으로 이루어진 그룹 중에서 선택된 하나 이상의 위치에서의 치환이며, 이때 상기 단계 b)의 Fc 영역은 중성 pH 범위에서 FcRn 및 기존 ADA에 대해 증가된 결합 활성을 갖는다. 상기는 또한 상기 언급한 하나 이상의 위치에서의 치환 외에 EU256 위치에서 치환을 포함할 수 있으며, 이때 상기 EU256 위치에서 아미노산은 바람직하게는 글루탐산으로 치환된다. 보다 바람직하게는, 상기는 표 2 및 4 내지 7 중에서 선택된 위치의 조합들 중 임의의 하나의 위치에서 치환을 포함한다. 훨씬 더 바람직하게, 상기는 표 3 및 17 내지 20 중 임의의 하나에 나타낸 치환 또는 치환 조합들 중 임의의 하나를 포함한다.

바람직하게는, 단계 c)는 표 10의 위치 중 임의의 하나에서의 아미노산의 치환을 포함한다. 보다 바람직하게는, 상기 위치는 a) EU387, b) EU422, c) EU424, d) EU438, e) EU440, f) EU422/EU424, 및 g) EU438/EU440으로 이루어진 그룹 중에서 선택된다. 훨씬 더 바람직하게는, 단계 c)는 표 11 중에서 선택된 치환 또는 조합들 중 하나를 도입시킴을 포함한다.

또 다른 바람직한 실시태양에서, 상기 단계 b)에서 하나 이상의 위치에서의 아미노산 치환은

i) EU434 위치에서, 또는

의 치환이며, 이때 상기 단계 b)의 Fc 영역은 산성 범위에서 증가된 FcRn-결합 활성 및 중성 pH 범위에서 기존 ADA에 대해 증가된 결합 활성을 갖는다. 바람직하게는, 상기 Fc 영역은 i) 치환 M434H; 또는 ii) a) M252Y/S254T/T256E; b) M428L/N434S; 및 c) T250Q 및 M428L(EU 넘버링)로 이루어진 그룹의 조합들 중 하나를 포함한다.

바람직한 실시태양에서, 단계 c)에서 아미노산은 a) EU424 위치 또는 b) EU438/EU440 위치에서 치환된다. 보다 바람직하게, 상기 치환은 a) EU424N 또는 b) 조합 EU438R/EU440E이다.

약학 조성물

본 발명은 또한 본 발명의 항원-결합 분자, 또는 본 발명의 생성 방법에 의해 생성된 항원-결합 분자를 포함하는 약학 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 항원-결합 분자 및 본 발명의 생성 방법에 의해 생성된 항원-결합 분자는 전형적인 항원-결합 분자에 비해, 투여에 의해 혈장 항원 농도를 감소시키기에 더 큰 능력을 가지며, 따라서 약학 조성물로서 유용하다. 본 발명의 약학 조성물은 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함할 수 있다. 본 발명에서, 약학 조성물을 통상적으로는 질병의 치료 또는 예방, 또는 시험 및 진단을 위한 작용제라 칭한다.

본 발명의 약학 조성물을 당해 분야의 숙련가들에게 공지된 방법에 의해 제형화할 수 있다. 예를 들어, 상기 조성물을 비경구에 의해, 물 또는 다른 약학적으로 허용 가능한 액체를 포함하는 멸균 용액 또는 현탁액의 주사의 형태로 사용할 수 있다. 예를 들어, 상기와 같은 조성물을, 약학적으로 허용 가능한 담체 또는 매질, 구체적으로 멸균 수, 생리 식염수, 식물성 오일, 유화제, 현탁제, 계면활성제, 안정제, 풍미제, 부형제, 비히클, 보존제, 결합제 등과 적합하게 배합함으로써 일반적으로 승인된 약물 제조 실시에 필요한 단위 용량의 형태로 혼합함으로써 제형화할 수 있다. 상기와 같은 제형에서, 활성 성분의 양을, 적합한 양을 소정의 범위로 획득하기 위해 쉽고 통상적으로 조절할 수 있다.

주사용 멸균 조성물을 표준 제형화 실시에 따라, 비히클, 예를 들어 주사용 증류수를 사용하여 제형화할 수 있다. 주사용 수용액은 예를 들어 생리식염수, 및 덱스트로스 또는 다른 보조제(예를 들어 D-솔비톨, D-만노오스, D-만니톨, 및 염화 나트륨)를 함유하는 등장성 용액을 포함한다. 적합한 용해제들, 예를 들어 알콜(에탄올 등), 폴리알콜(프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜 등), 비-이온성 계면활성제(폴리솔베이트 80(상표), HCO-50 등)를 함께 사용하는 것도 또한 가능하다.

오일은 참깨 오일 및 대두 오일을 포함한다. 벤질 벤조에이트 및/또는 벤질 알콜을 용해제로서 함께 사용할 수 있다. 완충제(예를 들어 포스페이트 완충제 및 나트륨 아세테이트 완충제), 진정제(예를 들어 프로카인 하이드로클로라이드), 안정제(예를 들어 벤질 알콜 및 페놀), 및/또는 산화방지제를 병용하는 것도 또한 가능하다. 적합한 앰풀을 상기 제조된 주사액으로 충전한다.

본 발명의 약학 조성물을 바람직하게는 비경구 투여한다. 예를 들어 상기 조성물은 주사, 경비 투여, 경폐 투여, 또는 경피 투여를 위한 투여일 수 있다. 상기와 같은 조성물을 정맥 내 주사, 근육 내 주사, 복강 내 주사, 피하 주사 등에 의해 전신 또는 국소 투여할 수 있다.

투여 방법을 환자의 연령 및 증상을 고려하여 적합하게 선택할 수 있다. 항원-결합 분자를 함유하는 약학 조성물의 용량은 예를 들어 각각의 투여에 대해 0.0001 내지 1,000 ㎎/㎏일 수 있다. 한편으로, 상기 용량은 예를 들어 환자당 0.001 내지 100,000 ㎎일 수 있다. 그러나, 본 발명은 상술한 수치들로 제한되지 않는다. 상기 용량 및 투여 방법은 환자의 체중, 연령, 증상 등에 따라 변한다. 당해 분야의 숙련가들은 상술한 인자들을 고려하여 적합한 용량 및 투여 방법을 정할 수 있다.

본 발명의 아미노산 서열 중에 함유된 아미노산을 번역 후 변형시킬 수도 있다. 예를 들어 N-말단 글루타민을 피로글루타밀화에 의해 피로글루탐산으로 변형시키는 것은 당해 분야의 숙련가들에게 널리 공지되어 있다. 물론, 상기와 같은 번역 후 변형된 아미노산들은 본 발명의 아미노산 서열 중에 포함된다.

생성 방법

본 발명은 본 발명의 항원-결합 분자의 생성 방법을 제공한다. 특히, 본 발명은 야생형 Fc 영역을 포함하는 항원-결합 분자에 비해 중성 pH에서 FcRn에 대해 증가된 결합 활성을 갖는 FcRn-결합 도메인을 갖는 항원-결합 분자의 생성 방법을 제공한다.

본 발명은

(a) 모 FcRn-결합 도메인을 선택하고 EU252, EU434, EU436, EU315, EU311, EU308, EU307, EU286, EU254, EU250, EU238, EU387, EU422, EU424, EU428, EU438 및 EU440으로 이루어진 그룹 중에서 선택된 하나 이상의 위치에서 아미노산 서열 중의 아미노산을 또 다른 아미노산으로 치환시켜 상기 모 FcRn을 변경시키고;

(b) pH-의존성 항원-결합 도메인 또는 칼슘-이온 의존성 항원-결합 도메인을 수득하기 위해서 항원-결합 분자의 항원-결합 도메인을 선택하고 상기 항원-결합 도메인 중의 하나 이상의 아미노산을 변경시키고;

단계를 포함하는, 항원-결합 분자의 생성 방법을 제공한다.

바람직하게는, 상기 선택된 항원-결합 분자는 pH 7 내지 8에서보다 pH 5.5 내지 6.5에서 상기 항원에 대해 더 낮은 결합 활성을 갖거나 또는 칼슘 의존성 항원 결합 활성을 갖는 항원-결합 도메인을 포함한다. 바람직하게는, 상기 단계 a)의 FcRn-결합 도메인은 본 발명의 FcRn-결합 도메인이다. 보다 바람직하게, 상기 FcRn-결합 도메인은 3 개 이상의 위치에서 아미노산 치환을 포함하며, 여기에서 상기 3 개 이상의 위치는 표 2 및 4 내지 7에 나타낸 조합들 중 하나이다. 훨씬 더 바람직하게, 상기 FcRn-결합 도메인은 3 개 이상의 치환을 포함하며, 여기에서 상기 3 개 이상의 치환은 표 3, 17 내지 20에 나타낸 조합들 중 하나이다.

단계 (a)는 EU238, EU250, EU252, EU254, EU255, EU258, EU286, EU307, EU308, EU309, EU311, EU315, EU428, EU433, EU434, 및 EU436으로 이루어진 그룹 중에서 선택된 하나 이상의 위치에서 아미노산 치환을 치환시키고 중성 pH 범위에서 KD 3.2 마이크로몰보다 더 강한 인간 FcRn-결합 활성을 갖는 FcRn-결합 도메인을 선택함을 포함할 수 있다.

단계 (b)는 pH-의존성 항원-결합 도메인을 획득하기 위해서 상술한 바와 같이 항원-결합 도메인을 선택하고 상기 항원-결합 도메인 중의 하나 이상의 아미노산을 변경시키거나, 또는 칼슘-이온 의존성 항원-결합 도메인을 선택함을 포함할 수 있다. 아미노산의 변경은 바람직하게는 하나 이상의 아미노산에 대해 히스티딘을 치환시키거나 또는 하나 이상의 히스티딘을 삽입하는 것이다. 한편, 상기 하나 이상의 히스티딘 돌연변이가 도입되는 부위는 특별히 제한되지 않으며, 따라서 상기 히스티딘 돌연변이가 산성 pH 범위에서의 항원-결합 활성을 중성 pH 범위에서의 경우보다 작게 감소시키는 한 상기 돌연변이를 임의의 위치에서 도입시킬 수 있다. 상기와 같은 히스티딘 돌연변이를 단일 부위 또는 2 개 이상의 부위에서 도입시킬 수 있다. 단계 a) 및 b)를 2 회 이상 반복시킬 수 있다. 단계 (a) 및 (b)의 반복 회수는 특별히 제한되지 않으나; 상기 회수는 전형적으로 10 회 이하이다.

(a) 및 (b)에서 제조된 FcRn-결합 도메인과 항원-결합 도메인을 작동적으로 결합시키는 링커는 임의의 형태로 제한되지 않는다. 상기 인간 FcRn-결합 도메인 및 항원-결합 도메인을 공유력 또는 비-공유력에 의해 결합시킬 수 있다. 특히, 상기 링커는 펩타이드 링커 또는 화학적 링커 또는 비오틴과 스트렙트아비딘의 조합 같은 결합 쌍일 수 있다. 상기 인간 FcRn-결합 도메인 및 항원-결합 도메인을 포함하는 폴리펩타이드의 변형은 당해 분야에 공지되어 있다. 또 다른 실시태양에서, 본 발명의 인간 FcRn-결합 도메인 및 항원-결합 도메인을 상기 인간 FcRn-도메인과 항원-결합 도메인 간에 융합 단백질을 형성시킴으로써 결합시킬 수 있다. 상기 인간 FcRn-결합 도메인 및 항원-결합 도메인 간의 융합 단백질을 제작하기 위해서, 상기 인간 FcRn-결합 도메인 및 항원-결합 도메인을 암호화하는 유전자를 인프레임 융합 폴리펩타이드가 형성되도록 작동적으로 결합시킬 수 있다. 적합하게는, 다수의 아미노산으로 이루어진 펩타이드를 포함하는 링커를 상기 인간 FcRn-결합 도메인과 항원-결합 도메인 사이에 삽입할 수 있다. (GGGGS)_n(서열번호 11)으로 이루어진 서열을 갖는 링커와 같은 다양한 가요성 링커들이 당해 분야에 공지되어 있다.

본 발명은 야생형 Fc 영역을 포함하는 항원-결합 분자에 비해 중성 pH에서 기존 ADA에 대해 현저하게 증가된 결합 활성 없이 중성 또는 산성 pH에서 FcRn에 대해 증가된 결합 활성을 갖는 FcRn-결합 도메인을 포함하는 항원-결합 분자의 생성 방법을 추가로 제공한다.

바람직하게는, 중성 또는 산성 pH에서 FcRn에 대해 증가된 결합 활성 및 중성 pH에서 기존 ADA에 대해 감소된 결합 활성을 갖는 Fc 영역을 포함하는 항원-결합 분자의 생성 방법은

(a) 중성 또는 산성 pH 범위에서 FcRn에 대해 증가된 결합 활성 및 중성 pH 범위에서 기존 ADA에 대해 증가된 결합 활성을 갖는 Fc 영역을 제공하고,

b) EU387, EU422, EU424, EU426, EU433, EU436, EU438 및 EU440으로 이루어진 그룹 중에서 선택된 위치들 중 하나 이상에서 상기 Fc 영역의 아미노산 서열 중의 아미노산을 치환시키고,

(c) 항원-결합 분자의 항원-결합 도메인 중의 하나 이상의 아미노산을 변경시키고 산성 pH 범위에서보다 중성 pH 범위에서 더 강한 항원-결합 활성을 갖는 항원-결합 분자를 선택하고;

(d) (b)에서 제조된 인간 FcRn-결합 도메인 및 (c)에서 제조된 항원-결합 도메인이 결합된 항원-결합 분자를 암호화하는 유전자를 수득하고;

(e) (d)에서 제조된 유전자를 사용하여 항원-결합 분자를 생성시키는

단계들을 포함한다.

단계 a)에서 바람직한 Fc 영역은 인간 Fc 영역이다. 바람직하게는, 중성 또는 산성 pH 범위에서 FcRn 및 기존 ADA 및 중성 pH 범위에서 기존 ADA에 대해 증가된 결합 활성을 갖는 Fc 영역은 EU238, EU250, EU252, EU254, EU255, EU258, EU286, EU307, EU308, EU309, EU311, EU315, EU428, EU433, EU434, 및 EU436으로 이루어진 그룹 중에서 선택된 하나 이상의 위치에서 아미노산의 치환을 포함한다. 보다 바람직하게는, 상기는 표 2 및 4 내지 7 중에서 선택된 위치 조합들 중 임의의 하나의 위치에서의 치환을 포함한다. 훨씬 더 바람직하게는, 상기는 표 3 및 17 내지 20 중 임의의 하나 중에 나타낸 치환 또는 치환의 조합들 중 임의의 하나를 포함한다. 바람직하게는, 단계 a)는 중성 또는 산성 pH 범위에서 FcRn 및 기존 ADA에 대해 증가된 결합 활성을 갖는 Fc 영역을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 제공함을 포함한다.

바람직하게는, 단계 b)에서 치환은 표 10에 나타낸 하나 이상의 위치 또는 위치 조합에서의 아미노산 치환이다. 보다 바람직하게, 상기 단계 b)의 치환은 표 11에 나타낸 치환 조합들 중 하나이다. 단계 b)에서 EU387, EU422, EU424, EU426, EU433, EU436, EU438 및 EU440으로 이루어진 그룹 중에서 선택된 위치들 중 하나 이상에서 아미노산은 바람직하게는 뉴클레오타이드 서열 중의 하나 이상의 뉴클레오타이드를 치환시킴으로써 치환된다.

단계 (b) 및 (c)를 임의의 순서로 수행할 수 있다. 더욱 또한, 단계 c)는 pH-의존성 항원-결합 도메인을 수득하기 위해서 상술한 바와 같이 항원-결합 도메인 중의 하나 이상의 아미노산을 변경시키거나, 또는 칼슘-이온 의존성 항원-결합 도메인을 선택함을 포함할 수 있다. 단계 (c)에서, 아미노산의 변경은 바람직하게는 하나 이상의 아미노산에 대해 히스티딘을 치환시키거나 또는 하나 이상의 히스티딘을 삽입하는 것이다. 한편, 상기 하나 이상의 히스티딘 돌연변이가 도입되는 부위는 특별히 제한되지 않으며, 따라서 상기 히스티딘 돌연변이가 산성 pH 범위에서의 항원-결합 활성을 중성 pH 범위에서의 경우보다 작게 감소시키는 한 상기 돌연변이를 임의의 위치에서 도입시킬 수 있다. 상기와 같은 히스티딘 돌연변이를 단일 부위 또는 2 개 이상의 부위에서 도입시킬 수 있다. 단계 b) 및 c)를 2 회 이상 반복시킬 수 있다. 단계 (b) 및 (c)의 반복 회수는 특별히 제한되지 않으나; 상기 회수는 전형적으로 10 회 이하이다.

(b) 및 (c)에서 제조된 FcRn-결합 도메인과 항원-결합 도메인을 작동적으로 결합시키는 링커는 임의의 형태로 제한되지 않는다. 상기 인간 FcRn-결합 도메인 및 항원-결합 도메인을 공유력 또는 비-공유력에 의해 결합시킬 수 있다. 특히, 상기 링커는 펩타이드 링커 또는 화학적 링커 또는 비오틴과 스트렙트아비딘의 조합 같은 결합 쌍일 수 있다. 상기 인간 FcRn-결합 도메인 및 항원-결합 도메인을 포함하는 폴리펩타이드의 변형은 당해 분야에 공지되어 있다. 또 다른 실시태양에서, 본 발명의 인간 FcRn-결합 도메인 및 항원-결합 도메인을, 상기 인간 FcRn-도메인과 항원-결합 도메인 간에 융합 단백질을 형성시킴으로써 결합시킬 수 있다. 상기 인간 FcRn-결합 도메인 및 항원-결합 도메인 간의 융합 단백질을 제작하기 위해서, 상기 인간 FcRn-결합 도메인 및 항원-결합 도메인을 암호화하는 유전자를 인프레임 융합 폴리펩타이드가 형성되도록 작동적으로 결합시킬 수 있다. 적합하게는, 다수의 아미노산으로 이루어진 펩타이드를 포함하는 링커를 상기 인간 FcRn-결합 도메인과 항원-결합 도메인 사이에 삽입할 수 있다. (GGGGS)_n(서열번호 11)으로 이루어진 서열을 갖는 링커와 같은 다양한 가요성 링커들이 당해 분야에 공지되어 있다.

따라서, 본 발명의 생성 방법은 상술한 아미노산의 변경 및 히스티딘의 치환 또는 삽입 단계를 추가로 포함할 수 있다. 본 발명의 생성 방법에서, 비-천연 아미노산을 히스티딘 대신에 사용할 수 있다. 따라서, 본 발명은 또한 상기 언급한 히스티딘을 비-천연 아미노산으로 치환시킴으로써 이해될 수 있다.

본 발명의 생성 방법의 단계 a)는 또한 상기 언급한 하나 이상의 위치에서의 치환 외에 EU256 위치에서의 치환을 포함할 수 있으며, 이때 EU256 위치에서 아미노산은 바람직하게는 글루탐산으로 치환된다.

더욱 또한, 본 발명의 생성 방법은 EU234, EU235, EU236, EU237, EU238, EU239, EU265, EU266, EU267, EU269, EU270, EU271, EU295, EU296, EU297, EU298, EU300, EU324, EU325, EU327, EU328, EU329, EU331, 및 EU332(EU 넘버링 시스템에 따라)로 이루어진 그룹 중에서 선택된 위치들 중 하나 이상에서 Fc 영역의 아미노산 서열 중의 아미노산을 치환시킴을 포함하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 바람직하게, 치환 L235R/S239K를 도입시킨다.

본 발명의 생성 방법에 사용되는 모 FcRn-결합 도메인 및 이를 포함하는 항원-결합 분자를 임의의 방법에 의해 제조할 수 있다. 예를 들어, 기존의 항체, 기존의 라이브러리(파지 라이브러리 등), 면역된 동물의 B 세포 또는 동물 면역화에 의해 제조된 하이브리도마로부터 제조된 항체 및 라이브러리, 랜덤한 아미노산 변경을 상술한 항체 및 라이브러리에 도입시켜 제조된 항체 및 라이브러리, 히스티딘 또는 비-천연 아미노산 돌연변이를 상술한 항체 및 라이브러리에 도입시킴으로써 제조된 항체 및 라이브러리(히스티딘 또는 비-천연 아미노산의 함량이 높은 라이브러리, 특정 부위에서 히스티딘 또는 비-천연 아미노산이 도입된 라이브러리 등) 등을 사용하는 것이 가능하다.

항원-결합 분자의 항원-결합 활성 및 인간 FcRn 결합 활성을 당해 분야의 숙련가들에게 공지된 방법에 의해 측정할 수 있다. pH를 제외한 조건들은 당해 분야의 숙련가들에 의해 적합하게 측정될 수 있다.

상술한 생성 방법에서, 항원 및 항원-결합 분자를 임의의 상태로 서로 결합시킬 수 있고, 상기 인간 FcRn과 항원-결합 분자를 서로 임의의 상태로 결합시킬 수 있다. 상기 상태는 특별히 제한되지 않으며; 예를 들어, 상기 항원 또는 인간 FcRn을 고정화된 항원-결합 분자와 접촉시켜 상기 항원-결합 분자를 결합시킬 수 있다. 한편으로, 상기 항원-결합 분자를 고정화된 항원 또는 인간 FcRn과 접촉시켜 상기 항원-결합 분자를 결합시킬 수 있다. 한편으로, 상기 항원-결합 분자를 용액 중에서 상기 항원 또는 인간 FcRn과 접촉시켜 상기 항원-결합 분자를 결합시킬 수 있다.

상술한 방법에 의해 생성된 항원-결합 분자는 본 발명의 임의의 항원-결합 분자일 수 있으며; 바람직한 항원-결합 분자는 예를 들어 항원-결합 도메인(이는 이온화된 칼슘-농도 의존성 항원-결합 도메인 또는 아미노산(들)에 대한 히스티딘 치환 또는 하나 이상의 히스티딘의 삽입을 갖는 항원-결합 도메인이다)을 갖는 것들을 포함하며, 상기 항원-결합 분자는 인간 FcRn-결합 도메인을 추가로 포함하고, 상기 도메인은 EU238, EU250, EU252, EU254, EU255, EU258, EU286, EU307, EU308, EU309, EU311, EU315, EU428, EU433, EU434, 및 EU436 (EU 넘버링)으로 이루어진 그룹 중에서 선택된 하나 이상의 위치에서 아미노산 치환을 포함한다. 본 발명의 항원-결합 분자는 또한 상기 언급한 하나 이상의 위치에서의 치환 외에 EU256 위치에서 치환을 포함할 수 있다. 바람직하게는, 상기 EU256 위치에서 아미노산은 글루탐산으로 치환된다. 보다 바람직하게는, 상기 FcRn-결합 도메인은 3 개 이상의 위치를 포함하며 여기에서 상기 3 개 이상의 위치는 표 2 및 4 내지 7에 나타낸 조합들 중 하나이다. 훨씬 더 바람직하게, 상기 FcRn-결합 도메인은 3 개 이상의 치환을 포함하며 여기에서 상기 3 개 이상의 치환은 표 3 및 17 내지 20에 나타낸 조합들 중 하나이다.

추가의 바람직한 항원-결합 분자는 예를 들어 이온화된 칼슘-농도 의존성 항원-결합 도메인 또는 아미노산에 대한 히스티딘 치환 또는 하나 이상의 히스티딘의 삽입을 갖는 항원-결합 도메인인 항원-결합 도메인을 갖는 것들을 포함하며, 상기 항원-결합 분자는 EU387, EU422, EU424, EU426, EU433, EU436, EU438 및 EU440으로 이루어진 그룹 중에서 선택된 위치들 중 하나 이상에서 아미노산의 치환을 갖는 인간 Fc 영역을 추가로 포함한다. 보다 바람직하게, 상기 FcRn-결합 도메인은 3 개 이상의 위치에서 상기 인간 FcRn-결합 도메인 중의 아미노산의 치환을 함유하며, 여기에서 상기 3 개 이상의 위치는 표 9 및 10에 나타낸 조합들 중 하나이다.

보다 바람직한 항원-결합 분자는 이온화된 칼슘-농도 의존성 항원-결합 도메인 또는 아미노산에 대한 히스티딘 치환 또는 하나 이상의 히스티딘의 삽입을 갖는 항원-결합 도메인인 항원-결합 도메인을 갖는 것들을 포함하며, 상기 항원-결합 분자는

a) EU238, EU250, EU252, EU254, EU255, EU256, EU258, EU286, EU307, EU308, EU309, EU311, EU315, EU428, EU433, EU434, 및 EU436으로 이루어진 그룹 중에서 선택된 위치들 중 하나 이상에서, 및

b) EU387, EU422, EU424, EU426, EU433, EU436, EU438 및 EU440(EU 넘버링)으로 이루어진 그룹 중에서 선택된 위치들 중 하나 이상에서

아미노산의 치환을 갖는 인간 Fc 영역을 추가로 포함한다.

바람직하게, EU256 위치에서 아미노산은 글루탐산으로 치환된다.

보다 바람직하게, 상기 항원-결합 분자는 표 11 내지 13에 나타낸 치환 조합을 포함한다.

목적하는 활성을 갖는 항체를 하기 개시하는 항체 라이브러리 또는 하이브리도마로부터 수득된 다수의 항체로부터 선별에 의해 선택할 수 있다.

항원-결합 분자 중의 아미노산 변경 시, 변경 전의 항원-결합 분자의 아미노산 서열에 대해 공지된 서열 또는 당해 분야의 숙련가들에게 공지된 방법에 의해 새롭게 확인된 항원-결합 분자의 아미노산 서열을 사용하는 것이 가능하다. 예를 들어, 상기 항원-결합 분자가 항체인 경우, 이를 항체 라이브러리로부터 또는 단클론 항체-생산 하이브리도마로부터 항체-암호화 유전자를 클로닝함으로써 수득할 수 있다.

항체 라이브러리에 관하여, 다수의 항체 라이브러리들이 이미 공지되어 있으며, 항체 라이브러리의 생성 방법이 또한 공지되어 있고; 따라서 당해 분야의 숙련가들은 항체 라이브러리를 적합하게 획득할 수 있다. 예를 들어 파지 라이브러리에 관하여, 예를 들어 문헌[Clackson et al., Nature (1991) 352: 624-8]; [Marks et al., J. Mol. Biol. (1991) 222: 581-97]; [Waterhouses et al., Nucleic Acids Res. (1993) 21: 2265-6]; [Griffiths et al., EMBO J. (1994) 13: 324.0-60]; [Vaughan et al., Nature Biotechnology (1996) 14: 309-14]; 및 일본 특허 공개 공보 제 (JP-A) H20-504970 호(비-일본 국제 공보에 상응하는 일본 비심사 국내 단계 공개 공보)를 참조할 수 있다. 또한, 공지된 방법들, 예를 들어 라이브러리로서 진핵 생물 세포를 사용하는 방법(WO 95/15393) 및 리보솜 디스플레이 방법을 사용하는 것이 가능하다. 더욱 또한, 인간 항체 라이브러리를 사용하는 패닝(panning)에 의해 인간 항체를 수득하는 기술이 또한 공지되어 있다. 예를 들어, 인간 항체의 가변 영역을 파지 디스플레이 방법을 사용하여 단쇄 항체(scFv)로서 파지의 표면상에서 발현시킬 수 있으며, 항원에 결합하는 파지를 선택할 수 있다. 상기 선택된 파지의 유전자 분석은 상기 항원에 결합하는 인간 항체의 가변 영역을 암호화하는 DNA 서열을 결정할 수 있다. 일단 상기 항원에 결합하는 scFv의 DNA 서열이 밝혀지면, 적합한 발현 벡터를 상기 서열을 근거로 제조하여 인간 항체를 수득할 수 있다. 이러한 방법들은 이미 널리 공지되어 있으며, WO 92/01047, WO 92/20791, WO 93/06213, WO 93/11236, WO 93/19172, WO 95/01438, 및 WO 95/15388을 참조할 수 있다.

하이브리도마로부터 항체를 암호화하는 유전자를 수득하기 위한 방법에 관하여, 목적하는 항원 또는 감작 항원으로서 목적하는 항원을 발현하는 세포를 사용하고, 이를 사용하여 통상적인 면역화 방법에 따라 면역화를 수행하고, 생성된 면역 세포를 통상적인 세포 융합 방법에 의해 공지된 모 세포와 융합시키고, 통상적인 선별 방법에 의해 단클론 항체 생산 세포(하이브리도마)를 선별하고, 역 전사효소를 사용하여 상기 수득된 하이브리도마의 mRNA로부터 항체 가변 영역(V 영역)의 cDNA를 합성하고, 이를 목적하는 항체 불변 영역(C 영역)을 암호화하는 DNA와 결합시킴을 수반하는 공지된 기술들을 기본적으로 사용할 수 있다.

보다 구체적으로, H 쇄 및 L 쇄를 암호화하는 상술한 항원-결합 분자 유전자를 수득하기 위한 항원 감작화는 예를 들어 면역원성을 갖는 완전 항원 및 면역원성이 없는 합텐 등을 포함한 불완전 항원 모두를 포함할 수 있지만; 이들로 제한되지 않는다. 예를 들어, 전체 단백질 및 단백질의 관심 부분 펩타이드를 사용하는 것이 가능하다. 또한, 폴리사카라이드, 핵산, 지질 등을 포함하는 물질이 항원일 수 있음은 공지되어 있다. 따라서, 본 발명의 항원-결합 분자의 항원은 특별히 제한되지 않는다. 상기 항원을 당해 분야의 숙련가들에게 공지된 방법에 의해, 예를 들어 바큘로바이러스 기재 방법(예를 들어 WO 98/46777) 등에 의해 제조할 수 있다. 하이브리도마를 예를 들어 문헌[G. Kohler and C. Milstein, Methods Enzymol. (1981) 73: 3-46]의 방법 등에 의해 생성시킬 수 있다. 항원의 면역원성이 낮은 경우, 상기 항원과 면역원성을 갖는 거대분자, 예를 들어 알부민과의 결합 후에 면역화를 수행할 수도 있다. 한편으로, 필요에 따라, 항원을 다른 분자와의 결합에 의해 가용성 항원으로 전환시킬 수도 있다. 막관통 분자, 예를 들어 막 항원(예를 들어 수용체)을 항원으로서 사용하는 경우, 상기 막 항원의 세포 외 영역의 부분을 단편으로서 사용하거나, 또는 표면상에서 막관통 분자를 발현하는 세포를 면역원으로서 사용할 수도 있다.

항원-결합 분자-생산 세포를 상술한 적합한 감작 항원을 사용하여 동물을 면역시킴으로써 수득할 수 있다. 한편으로, 항원-결합 분자-생산 세포를, 항원-결합 분자를 생산할 수 있는 림프구의 시험관 내 면역화에 의해 제조할 수 있다. 다양한 포유동물을 면역화에 사용할 수 있으며; 상기와 같은 통상적으로 사용되는 동물은 설치류, 토끼목 및 영장류를 포함한다. 상기와 같은 동물로는 예를 들어 설치류, 예를 들어 마우스, 래트 및 햄스터; 토끼목, 예를 들어 토끼; 및 원숭이, 예를 들어 키노몰구스 원숭이, 붉은털 원숭이, 개코원숭이 및 침팬지를 포함한 영장류가 있다. 또한, 인간 항체 유전자 레퍼토리를 수반하는 트랜스제닉 동물이 또한 공지되어 있으며, 인간 항체를 이들 동물을 사용하여 수득할 수 있다(WO 96/34096; 문헌[Mendez et al., Nat. Genet. (1997) 15: 146-56]을 참조하시오). 상기와 같은 트랜스제닉 동물 대신에, 예를 들어 항원에 대한 결합 활성을 갖는 목적하는 인간 항체를, 목적하는 항원을 갖는 인간 림프구 또는 목적하는 항원을 발현하는 세포의 시험관 내 감작화, 및 이어서 상기 감작된 림프구와 인간 골수종 세포, 예를 들어 U266과의 융합에 의해 수득할 수 있다(일본 특허 출원 공고 공보 제 (JP-B) H01-59878 호 (반박을 위해 공개된 승인된 일본 특허 출원 공고 공보)를 참조하시오). 더욱 또한, 목적하는 인간 항체를, 인간 항체 유전자의 완전한 레퍼토리를 수반하는 트랜스제닉 동물을 목적하는 항원으로 면역시킴으로써 수득할 수 있다(WO 93/12227, WO 92/03918, WO 94/02602, WO 96/34096, 및 WO 96/33735를 참조하시오).

동물 면역화는 감작 항원을 포스페이트 완충된 염수(PBS), 생리 식염수 등에서 적합하게 희석 및 현탁하고, 필요에 따라 이를 항원보강제 (adjuvant)와 혼합하여 유화시킴으로써 수행될 수 있다. 이어서 이를 동물 내로 복강 내 또는 피하 주사한다. 이어서, 프로인트 불완전 항원보강제와 혼합된 상기 감작 항원을 바람직하게는 매 4 내지 21일마다 수 회 투여한다. 항체 생산은 통상적인 방법을 사용하여 동물 혈청 중의 관심 항체의 역가를 측정함으로써 확인할 수 있다.

목적하는 항원으로 면역된 동물 또는 림프구로부터 수득된 항원-결합 분자-생산 세포를 통상적인 융합제(예를 들어 폴리에틸렌 글리콜)를 사용하여 골수종 세포와 융합시켜 하이브리도마를 생성시킬 수 있다(문헌[Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press, (1986) 59-103]). 필요한 경우, 하이브리도마 세포를 배양 및 생육시킬 수 있으며, 이들 하이브리도마로부터 생산된 항원-결합 분자의 결합 특이성을 공지된 분석 방법, 예를 들어 면역침전법, 방사성 면역분석(RIA) 및 효소-결합된 면역흡수 분석(ELISA)을 사용하여 측정할 수 있다. 그 후에, 필요에 따라, 특이성, 친화성 또는 활성이 측정된 관심 항원-결합 분자 생산 하이브리도마를 제한 희석과 같은 방법에 의해 서브클로닝할 수 있다.

이어서, 상기 선택된 항원-결합 분자를 암호화하는 유전자를 상기 항원-결합 분자에 특이적으로 결합할 수 있는 탐침(예를 들어 상기 항체 불변 영역을 암호화하는 서열에 상보적인 올리고뉴클레오타이드)을 사용하여 하이브리도마 또는 항원-결합 분자-생산 세포(감작된 림프구 등)로부터 클로닝할 수 있다. 또한 RT-PCR을 사용하여 mRNA로부터 상기 유전자를 클로닝하는 것도 가능하다. 면역글로불린을 5 가지 상이한 부류들, IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM으로 분류한다. 이들 부류를 여러 개의 하위부류(아이소타입)(예를 들어 IgG-1, IgG-2, IgG-3 및 IgG-4; IgA-1 및 IgA-2 등)로 추가로 분류한다. 항원-결합 분자의 생성을 위해 본 발명에 사용되는 H 쇄 및 L 쇄는 특별히 제한되지 않으며 이들 부류 또는 하위부류 중 어느 하나에 속하는 항체로부터 기원할 수 있으나; IgG가 특히 바람직하다.

본 발명에서, 유전 공학 기술을 사용하여 H-쇄-암호화 유전자 및 L-쇄-암호화 유전자를 변경시키는 것이 가능하다. 유전자 변경된 항체, 예를 들어 키메릭 항체 및 인간화된 항체(인간에 대한 이종 면역원성 등의 감소를 목적으로 인위적으로 변경되었다)를 마우스 항체, 래트 항체, 토끼 항체, 햄스터 항체, 양 항체 및 낙타 항체에 대해 적합하게 생성시킬 수 있다. 키메릭 항체는 비인간 포유동물 항체, 예를 들어 마우스 항체의 H-쇄 및 L-쇄 가변 영역, 및 인간 항체의 H-쇄 및 L-쇄 불변 영역을 포함하는 항체이다. 키메릭 항체를, 마우스 항체의 가변 영역을 암호화하는 DNA를 인간 항체의 불변 영역을 암호화하는 DNA에 연결하고, 이를 발현 벡터에 삽입하고, 상기 벡터를 숙주에 도입시켜 항체를 생산함으로써 수득할 수 있다. 인간화된 항체(또한 개장된 인간 항체라 칭한다)를, 상기 항체가 마우스와 같은 비인간 포유동물의 항체의 상보성 결정 영역(CDR)을 결합시키기 위해 디자인된 DNA 서열의 단부에 겹치는 부분을 갖도록 상기 생성된 다수의 올리고뉴클레오타이드를 사용하여 PCR에 의해 합성할 수 있다. 상기 생성되는 DNA를 인간 항체 불변 영역을 암호화하는 DNA에 연결시킬 수 있다. 상기 연결된 DNA를 발현 벡터에 삽입하고 상기 벡터를 숙주에 도입시켜 항체를 생산할 수 있다(EP 239400 및 WO 96/02576을 참조하시오). CDR을 통해 연결된 인간 항체 FR을, CDR이 유리한 항원-결합 부위를 형성하는 경우 선택한다. 필요한 경우, 항체 가변 영역의 프레임워크 영역 중의 아미노산을, 상기 개장된 인간 항체의 CDR이 적합한 항원-결합 부위를 형성하도록 치환시킬 수도 있다(문헌[K. Sato et al., Cancer Res. (1993) 53: 10.01-10.06]).

상술한 인간화 이외에, 항체를 그의 생물학적 성질, 예를 들어 항원에 대한 결합을 개선하기 위해 변경시킬 수 있다. 본 발명에서, 상기와 같은 변경은 위치-지정 돌연변이(예를 들어 문헌[Kunkel (1910.0) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 488]을 참조하시오), PCR 돌연변이, 및 카세트 돌연변이와 같은 방법에 의해 성취될 수 있다. 일반적으로, 생물학적 성질이 개선된 돌연변이 항체는 원래의 항체 가변 영역의 아미노산 서열에 비해, 70% 이상, 보다 바람직하게는 80% 이상, 및 훨씬 더 바람직하게는 90% 이상(예를 들어 95% 이상, 97%, 98%, 또는 99%)의 아미노산 서열 상동성 및/또는 유사성을 나타낸다. 본 발명에서, 서열 상동성 및/또는 유사성은, 필요한 경우 서열 상동성 값을 서열 정렬 및 중단(gap) 도입에 의해 최대화한 후, 원래의 항체 잔기에 대해 상동성이거나(동일한 잔기) 또는 유사한(아미노산 측쇄의 일반적인 성질을 기준으로 동일한 그룹으로 분류된 아미노산 잔기) 아미노산 잔기의 비로서 정의된다. 일반적으로, 천연 아미노산 잔기는 그의 측쇄의 특성을 기준으로 하기와 같은 그룹으로 분류된다:

(1) 소수성: 알라닌, 아이소류신, 발린, 메티오닌, 및 류신;

(2) 중성 친수성: 아스파라긴, 글루타민, 시스테인, 트레오닌, 및 세린;

(3) 산성: 아스파트산 및 글루탐산;

(4) 염기성: 아르기닌, 히스티딘, 및 리신;

(5) 쇄의 배향에 영향을 미치는 잔기: 글리신, 및 프롤린; 및

(6) 방향족: 타이로신, 트립토판, 및 페닐알라닌.

더욱 또한, 본 발명은 본 발명의 FcRn-결합 도메인을 암호화하는 유전자 및 본 발명의 항원-결합 분자를 제공한다. 본 발명의 항원-결합 분자를 암호화하는 유전자는 임의의 유전자일 수 있으며, DNA, RNA, 핵산 동족체 등일 수 있다.

더욱 또한, 본 발명은 또한 상술한 유전자를 운반하는 숙주 세포를 제공한다. 상기 숙주 세포는 특별히 제한되지 않으며, 예를 들어 에스케리키아 콜라이 및 다양한 동물 세포를 포함한다. 상기 숙주 세포를 예를 들어 본 발명의 항체를 생산하고 발현하는 생산 시스템으로서 사용할 수도 있다. 시험관 내 및 생체 내 생산 시스템을 폴리펩타이드 생산 시스템에 이용할 수 있다. 상기와 같은 시험관 내 생산 시스템은 예를 들어 진핵생물 세포 또는 원핵생물 세포를 사용하는 생산 시스템을 포함한다.

숙주 세포로서 사용될 수 있는 진핵생물 세포는 예를 들어 동물 세포, 식물 세포, 및 진균 세포를 포함한다. 동물 세포는 포유동물 세포, 예를 들어 CHO(중국 햄스터 난소 세포주), COS(원숭이 신장 세포주), 골수종(Sp2/O, NS0 등), BHK(아기 햄스터 신장 세포주), Hela, Vero, HEK293(절단된 아데노바이러스 (Ad)5 DNA를 갖는 인간 배 신장 세포주), PER.C6 세포(아데노바이러스 유형 5(Ad5) E1A 및 E1B 유전자로 형질전환된 인간 배 신장 세포주) 293 등(문헌[Current Protocols in Protein Science(May, 2001, Unit 5.9, Table 5.9.1)]을 참조하시오), 양서류 세포, 예를 들어 손톱 개구리 난모세포(문헌[Valle et al., Nature (1981) 291: 338-340]); 및 곤충 세포, 예를 들어 Sf9, Sf21, 및 Tn5를 포함한다. CHO-DG44, CHO-DX11B, COS7 세포, HEK293 세포, 및 BHK를 본 발명의 항체의 발현에 사용하는 것이 바람직하다. 동물 세포들 중에서, CHO 세포가 대규모 발현에 특히 바람직하다. 벡터를 예를 들어 칼슘 포스페이트 방법, DEAE-덱스트란 방법, 양이온성 리포솜 DOTAP(베링거-만하임(Boehringer-Mannheim))를 사용하는 방법, 일렉트로포레이션 방법, 및 리포펙션 방법에 의해 숙주 세포에 도입시킬 수 있다.

식물 세포에 관하여, 예를 들어 담배 니코틴-유래된 세포 및 좀개구리밥(렘나 미노르)이 단백질 생산 시스템으로서 공지되어 있다. 상기 세포로부터 칼루스를 배양하여 본 발명의 항원-결합 분자를 생산할 수 있다. 진균 세포에 관하여, 공지된 단백질 발현 시스템은 효모 세포, 예를 들어 사카로마이세스 속(예를 들어 사카로마이세스 세레비지아에 및 사카로마이세스 폼베)의 세포; 및 사상균, 예를 들어 아스퍼질러스 속(예를 들어 아스퍼질러스 니거)의 세포를 사용하는 것들이다. 이들 세포를 숙주로서 사용하여 본 발명의 항원-결합 분자를 생산할 수 있다.

세균 세포를 원핵생물 생산 시스템에 사용할 수 있다. 세균 세포에 관하여, 상술한 에스케리키아 콜라이를 사용하는 생산 시스템 이외에 바실러스 서브틸리스를 사용하는 생산 시스템이 공지되어 있다. 상기와 같은 시스템을 본 발명의 항원-결합 분자의 생산에 사용할 수 있다.

본 발명의 생성 방법에 의해 수득된 유전자는 전형적으로는 적합한 벡터에 의해 운반되며(상기 벡터 내로 삽입되며), 이어서 숙주 세포 내로 도입된다. 상기 벡터는 상기 삽입된 핵산을 안정하게 유지하는 한 특별히 제한되지 않는다. 예를 들어, 에스케리키아 콜라이를 숙주로서 사용하는 경우, 바람직한 클로닝 벡터는 p블루스크립트(pBluescript) 벡터(스트라타진(Stratagene))를 포함하지만; 다양한 상업적으로 입수할 수 있는 벡터들을 사용할 수도 있다. 본 발명의 항원-결합 분자를 생성시키기 위해 벡터를 사용하는 경우, 발현 벡터가 특히 유용하다. 상기 발현 벡터는 시험관 내, 에스케리키아 콜라이 내, 배양 세포 내, 또는 유기체의 몸 안에서 상기 항원-결합 분자를 발현하는 한 특별히 제한되지 않는다. 예를 들어, pBEST 벡터(프로메가(Promega))가 시험관 내 발현에 바람직하고; pET 벡터(인비트로젠(Invitrogen))는 에스케리키아 콜라이에 대해 바람직하며; pME18S-FL3 벡터(진뱅크 수납 번호 AB009864)는 배양 세포에 바람직하고; pME18S 벡터(문헌[Mol Cell Biol. (1988) 8:466-472])는 유기체의 몸에 바람직하다. 또한, EBNA1 단백질을 함께 발현시켜 관심 유전자의 사본수를 증가시킬 수도 있다. 이 경우에, 복제 개시 부위로서 OriP를 포함하는 벡터가 사용된다(문헌[Biotechnol Bioeng. 2001 Oct 20;75(2):197-203], [Biotechnol Bioeng. 2005 Sep 20;91(6):670-7]). 본 발명의 DNA를 통상적인 방법에 의해, 예를 들어 제한 효소 부위를 사용하는 연결에 의해 상기 벡터 내로 삽입할 수 있다(문헌[Current protocols in Molecular Biology, edit. Ausubel et al., (1987) Publish. John Wiley & Sons, Section 11.4-11.11]).

상기 숙주 세포는 특별히 제한되지 않으며, 다양한 숙주 세포를 목적에 따라 사용할 수 있다. 항원-결합 분자를 발현시키기 위한 세포의 예는 세균 세포(예를 들어 스트렙토코커스, 스타필로코커스, 에스케리키아 콜라이, 스트렙토마이세스 및 바실러스 서브틸리스의 세포), 진핵생물 세포(예를 들어 효모 및 아스퍼질러스의 세포), 곤충 세포(예를 들어 드로소필라 S2 및 스포도프테라 SF9), 동물 세포(예를 들어, CHO, COS, HeLa, C127, 3T3, BHK, HEK293 및 보우스 흑색종 세포), 및 식물 세포를 포함한다. 벡터를 공지된 방법, 예를 들어 칼슘 포스페이트 침전 방법, 일렉트로포레이션 방법(문헌[Current protocols in Molecular Biology edit. Ausubel et al. (1987) Publish. John Wiley & Sons, Section 9.1-9.9]), 리포펙션 방법, 및 미세주사 방법에 의해 숙주 세포 내로 도입시킬 수 있다.

상기 숙주 세포를 공지된 방법에 의해 배양할 수 있다. 예를 들어, 숙주로서 동물 세포를 사용하는 경우, DMEM, MEM, RPMI1640, 또는 IMDM을 배양 배지로서 사용할 수 있다. 상기 배지를 FBS 또는 송아지 태아 혈청(FCS)과 같은 혈청 보충물과 함께 사용할 수도 있다. 상기 세포를 무혈청 배양물 중에서 배양할 수도 있다. 바람직한 pH는 배양 과정 동안 약 6 내지 8이다. 배양을 전형적으로는 약 15 내지 200 시간 동안 30 내지 40 ℃에서 수행한다. 배지를 필요에 따라 교환하거나, 통기하거나, 교반한다.

적합한 분비 신호를, 상기 숙주 세포에서 발현된 항원-결합 분자가 소포체의 관강 내로, 원형질 공간 내로, 또는 세포 외 환경 내로 분비되도록 관심 폴리펩타이드에 통합시킬 수 있다. 상기 신호는 상기 관심 항원-결합 분자에 대해 내생적이거나 또는 이종 신호일 수도 있다.

다른 한편으로, 예를 들어 동물 또는 식물을 사용하는 생산 시스템을 생체 내에서 폴리펩타이드를 생산하기 위한 시스템으로서 사용할 수도 있다. 관심 폴리뉴클레오타이드를 동물 또는 식물 내에 도입시키고 상기 폴리펩타이드를 상기 동물 또는 식물의 몸 안에 생성시키고 이어서 수거한다. 본 발명의 "숙주"는 상기와 같은 동물 및 식물을 포함한다.

동물을 사용하는 생산 시스템은 포유동물 또는 곤충을 사용하는 것들을 포함한다. 염소, 돼지, 양, 마우스 및 소와 같은 포유동물을 사용하는 것이 가능하다(문헌[Vicki Glaser SPECTRUM Biotechnology Applications (1993)]). 상기 포유동물은 트랜스제닉 동물일 수도 있다.

예를 들어, 본 발명의 항원-결합 분자를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 우유(milk) 중에서 특이적으로 생성된 폴리펩타이드, 예를 들어 염소 베타-카제인을 암호화하는 유전자와 융합 유전자로서 제조한다. 이어서, 염소 태아에 상기 융합 유전자를 함유하는 폴리뉴클레오타이드 단편을 주사하고, 이어서 암컷 염소에 이식한다. 목적하는 항원-결합 분자를 트랜스제닉 염소(상기 태아를 수태한 염소, 또는 그의 자손으로부터 태어난)에 의해 생산된 우유로부터 수득할 수 있다. 적합한 경우 호르몬을 투여하여 상기 트랜스제닉 염소에 의해 생산된 항원-결합 분자를 함유하는 우유의 부피를 증가시킬 수도 있다(문헌[Ebert et al., Bio/Technology (1994) 12: 699-702]).

누에와 같은 곤충을 사용하여 본 발명의 항원-결합 분자를 생산할 수 있다. 누에를 사용하는 경우, 관심 항원-결합 분자를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 운반하는 바큘로바이러스를 사용하여 누에를 감염시키고, 상기 관심 항원-결합 분자를 그의 체액으로부터 수득할 수 있다.

더욱 또한, 식물을 본 발명의 항원-결합 분자의 생산에 사용하는 경우, 예를 들어 담배를 사용할 수도 있다. 담배가 사용되는 경우, 관심 항원-결합 분자를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 식물 발현 벡터, 예를 들어 pMON 530에 삽입하고, 이어서 상기 벡터를 세균, 예를 들어 아그로박테리움 튜메파시엔스 내로 도입시킨다. 이어서 상기 세균이 니코티아나 타바쿰과 같은 담배를 감염시키게 하고, 목적하는 항원-결합 분자를 상기 담배의 잎으로부터 수거할 수 있다(문헌[Ma et al., Eur. J. Immunol. (1994) 24: 131-138]). 한편으로, 좀개구리밥(렘나 미노르)을 유사한 세균으로 감염시키는 것이 가능하다. 클로닝 후, 상기 목적하는 항원-결합 분자를 상기 좀개구리밥 세포로부터 수득할 수 있다(문헌[Cox KM et al., Nat. Biotechnol. 2006 Dec; 24(12): 1591-1597]).

상기와 같이 수득한 항원-결합 분자를 숙주 세포의 내부 또는 외부(예를 들어 배지 및 우유)로부터 단리할 수 있으며, 실질적으로 순수하고 균일한 항원-결합 분자로서 정제할 수 있다. 상기 항원-결합 분자의 단리 및 정제 방법은 특별히 제한되지 않으며, 폴리펩타이드 정제에 통상적으로 사용되는 단리 및 정제 방법을 사용할 수 있다. 항원-결합 분자를, 예를 들어 크로마토그래피 컬럼, 여과, 한외여과, 염석, 용매 침전, 용매 추출, 증류, 면역침전, SDS-폴리아크릴아미드 젤 전기영동, 등전점 전기영동, 투석 및 재결정화를 적합하게 선택하고 병용하여 단리 및 정제할 수 있다.

크로마토그래피 기법의 예는 비제한적으로 친화성 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피, 소수성 크로마토그래피, 젤 여과, 역상 크로마토그래피, 및 흡착 크로마토그래피를 포함한다(문헌[Strategies for Protein Purification and Characterization: A Laboratory Course Manual. Ed Daniel R. Marshak et al., (1996) Cold Spring Harbor Laboratory Press]). 상기와 같은 크로마토그래피 방법을 HPLC 및 FPLC와 같은 액상 크로마토그래피를 사용하여 수행할 수 있다. 친화성 크로마토그래피에 사용되는 컬럼은 단백질 A 컬럼 및 단백질 C 컬럼을 포함한다. 단백질 A를 사용하는 컬럼은 예를 들어 하이퍼(Hyper) D, POROS, 및 세파로스 F.F.(파마시아(Pharmacia))를 포함한다.

필요한 경우, 항원-결합 분자를 임의로 변형시킬 수 있으며, 펩타이드를, 적합한 단백질 변형 효소가 상기 항원-결합 분자의 정제 전 또는 후에 작용하게 함으로써 부분적으로 결실시킬 수 있다. 상기와 같은 단백질 변형 효소는 예를 들어 트립신, 키모트립신, 리실 엔도펩티다제, 단백질 키나제, 및 글루코시다제를 포함한다.

실시예

본 발명을 여기에서 그의 특정한 실시태양들을 참고로 상세히 개시하며, 상기 명세는 사실상 예시적이고 설명적이며 본 발명 및 그의 바람직한 실시태양들을 예시하고자 하는 것으로 이해해야 한다. 통상적인 실험을 통해서, 당해 분야의 숙련가는 다양한 변화 및 변형을 본 발명의 진의 및 범위로부터 이탈됨 없이 수행할 수 있음을 쉽게 알 것이며, 본 발명의 계측 및 범위는 첨부된 청구의 범위에 의해서 한정된다.

[실시예 1] 신규의 중성 pH FcRn 결합 친화성 개선된 Fc 변체의 제조

FcRn과 상호작용하는 항원-결합 분자(항체)의 Fc 영역(문헌[Nat Rev Immunol. 2007 Sep; 7(9):715-25])을 혈장으로부터 항원 제거를 증대시키기 위해서 중성 pH에서 FcRn에 대해 개선된 결합 친화성을 갖도록 조작하였다. 통상적인 항체에 비해 중성 pH에서 FcRn에 대해 개선된 결합 친화성을 갖는 pH-의존성 항원 결합 항체에 의한 혈장으로부터 항원 제거의 기전을 도 1A에 도시한다.

WO2011/122011의 실시예 1 내지 17은 중성 pH에서 FcRn에 대한 결합 친화성을 개선시키는 돌연변이(아미노산 치환)를 개시하고 중성 pH에서 항체의 FcRn에 대한 결합 친화성의 개선에 초점을 두어 생성시킨 Fc 변체 F1 내지 F599(표 16)를 개시한다. 그러나, 상기와 같은 Fc 변체를 포함하는 항체의 약학적 개발을 위해서, 상기 항체의 약물학적 성질(즉 개선된 FcRn 결합)뿐만 아니라 안정성, 순도 및 면역원성을 고려해야 한다. 불량한 안정성과 순도를 나타내는 항체들은 약물로서 적합하지 않으며, 불량한 면역원성은 그의 임상적 개발을 방해할 것이다.

1-1. 중성 pH에서 hFcRn에 대해 개선된 결합 친화성을 갖는 Fc 변체의 설계 및 생성

높은 안정성, 높은 순도 및 낮은 면역원성 위험성을 유지시키면서 중성 pH에서 hFcRn에 대해 개선된 결합 친화성을 갖는 다양한 Fc 변체들이 설계되었다. 야생형 IgG1의 Fc 영역 내로 도입된 돌연변이(아미노산 치환)를 표 16에 각각의 Fc 변체에 대해서 나타낸다(IgG1-F1 내지 F1434). 상기 아미노산 치환을, WO2011/122011의 비교 실시예 1에 개시된 당해 분야의 숙련가들에게 공지된 방법에 의해 VH3-IgG1(서열번호 1)에 도입시켜 Fc 변체를 생성시켰다.

각각 상술한 바와 같이 제조된 중쇄 및 L(WT)-CK(서열번호 2)를 포함하는 변체들(IgG1-F600 내지 IgG-F1434)을 WO2011/122011의 비교 실시예 2에 개시된 당해 분야의 숙련가들에게 공지된 방법에 의해 발현 및 정제시켰다.

1-2. 비아코어를 사용한 Fc 변체의 FcRn 결합 친화성의 평가

실시예 1에서 제조된 신규의 Fc 변체(F600-F1434) 및 WO2011/122011의 실시예 1에서 제조된 선행 Fc 변체(F1-F599)의 hFcRn 결합 친화성을 비아코어 T100(GE 헬쓰케어)을 사용하여 평가하였다. 이를 위해서, 인간 FcRn을 비교 실시예 A2에 개시된 바와 같이 제조하였다. 적합한 양의 단백질 L(ACTIGEN)을 아미노 결합 방법에 의해 센서 칩 CM4(GE 헬쓰케어) 상에 고정화하고, 상기 칩이 관심 항체를 포획하게 하였다. 이어서, 희석된 FcRn 용액 및 실행 완충제(비교 용액으로서)를 주사하여 인간 FcRn이 상기 센서 칩 상에 포획된 항체와 상호작용하게 하였다. 상기 사용된 실행 완충제는 50 mmol/l 나트륨 포스페이트, 150 mmol/l NaCl, 및 0.05%(w/v) 트윈 20(pH 7.0)을 포함하였다. FcRn을 각각의 완충제를 사용하여 희석하였다. 상기 칩을 10 mmol/l 글리신-HCl(pH 1.5)을 사용하여 재생시켰다. 분석을 오직 25 ℃에서만 수행하였다. 결합속도 상수 ka(1/Ms) 및 해리속도 상수 k_d(1/s)(이 둘은 모두 동역학적 매개변수이다)를 상기 분석에서 획득한 센소그램을 근거로 계산하고, 인간 FcRn에 대한 각 항체의 KD(M)를 상기 값으로부터 측정하였다. 각각의 매개변수(parameter)를 비아코어 T100 평가 소프트웨어(GE 헬쓰케어)를 사용하여 계산하였다. 모든 Fc 변체들의 결합 친화성을 표 16에 나타낸다.

1-3. 차동 주사 형광측정법(DSF)을 사용한 Fc 변체의 안정성의 평가

실시예 1에서 제조된 신규의 Fc 변체(F600-F1434) 및 WO2011/122011의 실시예 1에서 제조된 선행 Fc 변체(F1-F599)의 안정성을 차동 주사 형광측정법(DSF)을 사용하여 평가하였다. 상기 방법은 점차적으로 증가하는 온도에서 극성 감수성 탐침의 형광 강도를 측정하고 단백질의 소수성 영역의 노출의 전이 온도를 획득하는 것으로 이루어진다. DSF를 사용하여 획득된 전이 온도가 차동 주사 열량측정법을 사용하여 획득한 용융 온도와 양호한 상관성이 있음은 이미 보고되어 있다(문헌[Journal of Pharmaceutical Science 2010; 4: 1707-1720]). SYPRO 오렌지 염료몰레큘라 프로브스(Molecular Probes))를 PBS(시그마(Sigma))로 희석하고 단백질 용액에 가하였다. 각각의 샘플을 20 마이크로리터의 상기 염색된 용액과 함께 사용하였다. 형광 방출을 555 ㎚에서 수집하였으며, 이때 고정된 여기 파장은 470 ㎚이었다. 상기 DSF 실험 동안, 온도를 30에서부터 99 ℃까지, 0.4 ℃의 증분으로 증가시켰으며, 이때 측정 전에 각 온도에서 6 초의 평형화 시간을 가졌다. 상기 데이터를 로터-진 Q 시리즈 소프트웨어(Rotor-Gene Q Series Software)(퀴아겐(QIAGEN))를 사용하여 분석하였다. 상기 형광 전이의 온도를 용융 온도(Tm)로서 정의한다. 상기 Fc 변체 F1-F1434의 Tm 값들을 표 16에 나타낸다.

1-4. 크기 배제 크로마토그래피(SEC)를 사용한 Fc 변체의 순도의 평가

실시예 1에서 제조된 신규의 Fc 변체(F600-F1434) 및 WO2011/122011의 실시예 1에서 제조된 선행 Fc 변체(F1-F599)의 고분자량 종 백분율(HMW(%))을 크기 배제 크로마토그래피(SEC)를 사용하여 평가하였다. SEC를 ACQUITY UPLC H-클래스 시스템(워터스(waters))에서 수행하였다. 상기 항체들을 BEH200 SEC 컬럼(1.7 마이크로미터, 4.6 x 150 ㎜, 워터스) 상에 주입하였다. 이동상은 0.05 M 나트륨 포스페이트, 0.3 M 염화 나트륨(pH 7.0, 이세큐(Isekyu))이며, 0.3 ㎖/분의 유속으로 균등하게 흘렀다. 용리된 단백질을 215 ㎚에서 UV 흡광도에 의해 검출하였다. 상기 데이터를 엠파워(Empower)2(워터스)를 사용하여 분석하였다. 상기 항체 단량체 피크보다 먼저 용출되는 피크를 HMW 성분 백분위수로 기록하였다. 모든 Fc 변체(F1-F1434)의 HMW(%)를 표 16에 나타낸다.

1-5. 인실리코 면역원성 예측 도구 에피염기를 사용한 Fc 변체의 면역원성 위험의 평가

상기 치료 항체의 임상적 유용성 및 효능은 항-약물 항체(ADA)의 생산에 의해 제한될 수 있는데, 그 이유는 ADA가 상기 항체의 효능 및 약동학에 영향을 미치고 때때로 심한 부작용을 도출할 수 있기 때문이다. 다수의 인자들이 치료 항체의 면역원성에 영향을 미치지만, 다수의 보고서들은 상기 치료 단백질 중에 존재하는 효과기 T-세포 에피토프의 중요성을 개시한다.

T-세포 에피토프를 예측하기 위한 인실리코 도구, 예를 들어 에피염기(론자(Lonza)), iTope/TCED(안티토프(Antitope)) 및 에피매트릭스(EpiMatrix)(에피백스(EpiVax))가 개발되었다. 이들 인실리코 도구를 사용함으로써, 각 아미노산 서열 중의 T-세포 에피토프의 존재를 예측할 수 있으며(문헌[Expert Opin Biol Ther. 2007 Mar;7(3):405-18]), 이는 상기 Fc 변체의 잠재적인 면역원성의 평가를 허용한다. 에피염기 라이트(론자)를 사용하여 상기 Fc 변체의 잠재적인 면역원성을 평가하였다.

에피염기 라이트(론자)는 FASTER 알고리즘을 사용하여 주요 DRB1 대립유전자에 대한 9-머 펩타이드의 결합 친화성을 계산하는 인실리코 도구이다(문헌[Expert Opin Biol Ther. 2007 Mar;7(3):405-18]). 에피염기 라이트(론자)는 MHC 부류 II에 대해 강한 결합 및 중간 결합을 갖는 T-세포 에피토프를 확인한다. 각각의 Fc 변체에 대한 인실리코 면역원성 점수를 에피염기 라이트(론자) 시스템에 통합된 하기 식을 사용하여 계산하였다. 면역원성 점수 = 합((각각의 DRB1 알로타입 집단 도수) x (중요한 에피토프의 수)).

상기 식에 사용된 DRB1 알로타입 집단 도수에 대해서, 백인 집단에 근거한 하기 DRB1 알로타입 집단 도수를 사용하였다.

DRB1*0701 (25.3%), DRB1*1501 (23.1%), DRB1*0301 (21.7%), DRB1*0101 (15.3%), DRB1*0401 (13.8%), DRB1*1101 (11.8%), DRB1*1302 (8.0%), DRB1*1401 (4.9%), DRB1*0403 (2.3%), DRB1*0901 (1.8%).

FASTER 알고리즘에 의해 상기 변체의 불변 영역(CH1-힌지-CH2-CH3)에서 확인된 임의의 강한 및 중간 결합 에피토프의 총수를 상기 식에서 중요한 에피토프의 수로서 사용하였다. 여과된 에피토프는 인간 항체 생식계열 서열 또는 가변 영역과 불변 영역 사이의 접합 영역을 갖는 것들이며, 오직 여과되지 않은 에피토프들만을 상기 면역원성 점수 계산에 고려한다(중요한 에피토프로서 카운트한다).

실시예 1에 개시된 신규의 Fc 변체(F600-F1434) 및 WO2011/122011의 실시예 1에 개시된 선행 Fc 변체(F1-F599)의 아미노산 서열의 면역원성 점수를 상술한 에피염기 라이트(론자) 시스템을 사용하여 계산하였다. 모든 Fc 변체(F1-F1434)의 면역원성 점수를 표 16에 나타낸다.

[실시예 2] 높은 안정성, 낮은 고분자량 종 및 낮은 면역원성 위험을 갖는 FcRn 결합 개선된 Fc 변체의 확인

2-1. hFcRn 결합 친화성에 대한 Tm, HMW(%) 및 면역원성 점수의 플롯팅에 의한 선행 및 신규 Fc 변체의 분석

WO2011/122011의 실시예 1에 개시된 선행 Fc 변체(F1-F599)의 hFcRn 결합 친화성 및 Tm, 및 실시예 1에서 제조되고 평가된 신규의 Fc 변체(F600-F1052)를 플롯팅하고 도 2에 도시한다. 선행 및 신규 Fc 변체의 hFcRn 결합 친화성 및 HMW(%)를 플롯팅하고 도 3에 도시한다. Fc 변체 F1-F599 및 신규의 Fc 변체(F600-F1052)의 hFcRn 결합 친화성 및 면역원성 점수를 플롯팅하고 도 4에 도시한다.

Ser239Lys 또는 Asp270Phe 돌연변이를 갖는 상기 신규의 Fc 변체(F600-F1052) 및 선행의 Fc 변체(F1-F599)를 상기 플롯으로부터 삭제하였다. Ser239Lys 및 Asp270Phe 돌연변이는 안정성(Tm)을 개선시킨 반면 FcRn 결합 친화성을 개선시키지 않고 모든 인간 Fc 감마 수용체에 대한 결합 친화성을 감소시켰기 때문에, 하기 그룹 1 내지 4의 상세한 분석에서, Fc 변체의 안정성을 Ser239Lys도, Asp270Phe 돌연변이도 갖지 않는 변체들 내에서 비교해야 한다.

또한, Pro257Xxx(Xxx는 Ala 또는 Val 또는 Ile 또는 Leu 또는 Thr이다) 또는 Met252Trp 돌연변이를 갖는 신규의 Fc 변체(F600-F1052) 및 선행의 Fc 변체(F1-F599)는 FcRn 결합 친화성을 개선시키지만 상기 플롯으로부터 삭제하였다. Pro257Xxx 및 Met252Trp 돌연변이는 Tm의 현저한 감소를 나타내지 않았으며, 이는 Pro257Xxx 및 Met252Trp 돌연변이를 갖는 변체들이 높은 안정성을 가짐을 암시한다. 그럼에도 불구하고, Pro257Xxx 또는 Met252Trp 돌연변이를 갖는 이들 변체는 가속화된 안정성 연구 동안 또는 냉장 보관 시 현저한 응집과 침전을 나타내었다. 이들의 유해한 안정성으로 인해, Pro257Xxx 및 Met252Trp 돌연변이를 갖는 Fc 변체들은 약제 개발에 허용될 수 없으며 따라서 하기 그룹 1 내지 4의 상세한 분석에서 상기와 같은 Fc 변체들은 플롯으로부터 삭제되어야 한다.

2-2. 그룹 1(15 nM 초과의 hFcRn에 대한 결합 친화성)의 상세한 분석

15 nM 초과의 hFcRn에 대한 결합 친화성을 갖는, 실시예 1에서 제조되고 평가된 신규의 Fc 변체(F600-F1052) 및 WO2011/122011의 실시예 1에 개시된 선행의 Fc 변체(F1-F599)(이후부터 그룹 1로서 개시함)를, X-축에서 hFcRn 결합 친화성 및 Y-축에서 Tm, HMW(%) 및 면역원성 점수를 플롯팅함으로써 상세히 분석하였다. X-축에서 hFcRn 결합 친화성(15 nM 초과의 KD) 및 Y-축에서 Tm, HMW(%) 및 면역원성 점수의 플롯팅에 의한 그룹 1의 상세한 분석을 각각 도 5, 6 및 7에 도시한다.

그룹 1에서 Fc 변체의 개발성(developability) 기준에 관하여, Tm 기준을 57.5 ℃보다 높게 설정하고, HMW(%) 기준을 2%보다 낮게 설정하고, 면역원성 점수를 500 보다 낮게 설정하였다.

상기 모든 개발성 기준(57.5 ℃ 초과의 Tm, 2% 미만의 HMW(%), 및 500 미만의 면역원성 점수)을 충족시키는 그룹 1의 Fc 변체들을 표 17에 나타낸다.

선행의 Fc 변체들(F1-F599) 중 어느 것도 15 nM 초과의 친화성을 갖지 못한 반면, 실시예 1에서 제조된 다수의 신규의 Fc 변체들은 15 nM 보다 강하였고 상기 모든 개발성 기준을 충족시켰다. 표 17에 개시된 상기와 같은 그룹 1의 신규의 Fc 변체들은 Fc 도메인이 특히 pH-의존성 항원-결합 도메인과 함께 사용될 때 혈장으로부터 매우 빠르고 광범위한 항원 제거를 가능하게 하는데 매우 귀중하다.

2-3. 그룹 2(15 nM 내지 50 nM의 hFcRn에 대한 결합 친화성)의 상세한 분석

15 nM 내지 50 nM의 hFcRn에 대한 결합 친화성을 갖는, 실시예 1에서 제조되고 평가된 신규의 Fc 변체(F600-F1052) 및 WO2011/122011의 실시예 1에 개시된 선행의 Fc 변체(F1-F599)(이후부터 "그룹 2"라 칭함)를, X-축에서 hFcRn 결합 친화성 및 Y-축에서 Tm, HMW(%) 및 면역원성 점수를 플롯팅함으로써 상세히 분석하였다.

X-축에서 hFcRn 결합 친화성(15 nM 내지 50 nM의 KD) 및 Y-축에서 Tm, HMW(%) 또는 면역원성 점수의 플롯팅에 의한 그룹 2의 상세한 분석을 각각 도 8, 9 및 10에 도시한다.

그룹 2에서 Fc 변체의 개발성 기준에 관하여, Tm 기준을 60 ℃보다 높게 설정하고, HMW(%) 기준을 2%보다 낮게 설정하고, 면역원성 점수를 500 보다 낮게 설정하였다.

상기 모든 개발성 기준(60 ℃ 초과의 Tm, 2% 미만의 HMW(%), 및 500 미만의 면역원성 점수)을 충족시키는 그룹 2의 Fc 변체들을 표 18에 나타낸다.

선행의 Fc 변체들(F1-F599) 중 어느 것도 상기 모든 개발성 기준을 충족시키지 못했으나, 실시예 1에서 제조된 다수의 신규의 Fc 변체들은 모두 충족시켰다. 상기 개발성 기준을 충족시키는 상기와 같은 그룹 2의 Fc 변체들은 특히 pH-의존성 항원-결합 도메인과 함께 사용될 때 혈장으로부터 매우 빠르고 광범위한 항원 제거를 가능하게 하는데 매우 귀중하다.

2-4. 그룹 3(50 nM 내지 150 nM의 hFcRn에 대한 결합 친화성)의 상세한 분석

50 nM 내지 150 nM의 hFcRn에 대한 결합 친화성을 갖는, 실시예 1에서 제조되고 평가된 신규의 Fc 변체(F600-F1052) 및 WO2011/122011의 실시예 1에 개시된 선행의 Fc 변체(F1-F599)(이후부터 "그룹 3"이라 칭함)를, X-축에서 hFcRn 결합 친화성 및 Y-축에서 Tm, HMW(%) 및 면역원성 점수를 플롯팅함으로써 상세히 분석하였다.

X-축에서 hFcRn 결합 친화성(50 nM 내지 150 nM의 KD) 및 Y-축에서 Tm, HMW(%) 또는 면역원성 점수의 플롯팅에 의한 그룹 3의 상세한 분석을 각각 도 11, 12 및 13에 도시한다.

그룹 3에서 Fc 변체의 개발성 기준에 관하여, Tm 기준을 63.0 ℃보다 높게 설정하고, HMW(%) 기준을 2%보다 낮게 설정하고, 면역원성 점수를 250 보다 낮게 설정하였다.

상기 모든 개발성 기준(63 ℃ 초과의 Tm, 2% 미만의 HMW(%), 및 250 미만의 면역원성 점수)을 충족시키는 그룹 3의 Fc 변체들을 표 19에 나타낸다.

선행의 Fc 변체들(F1-F599) 중 어느 것도 상기 모든 개발성 기준을 충족시키지 못한 반면, 실시예 1에서 제조된 다수의 신규의 Fc 변체들은 모두 충족시켰다. 모든 개발성 기준을 충족시키는 상기와 같은 그룹 3의 신규의 Fc 변체들은 특히 pH-의존성 항원-결합 도메인과 함께 사용될 때 혈장으로부터 보통의 지속적인 항원 제거를 가능하게 하는데 매우 귀중하다.

2-5. 그룹 4(150 nM 내지 700 nM의 hFcRn에 대한 결합 친화성)의 상세한 분석

150 nM 내지 700 nM의 hFcRn에 대한 결합 친화성을 갖는, 실시예 1에서 제조되고 평가된 신규의 Fc 변체(F600-F1052) 및 WO2011/122011의 실시예 1에 개시된 선행의 Fc 변체(F1-F599)(이후부터 "그룹 4"라 칭함)를, X-축에서 hFcRn 결합 친화성 및 Y-축에서 Tm, HMW(%) 및 면역원성 점수를 플롯팅함으로써 상세히 분석하였다.

X-축에서 hFcRn 결합 친화성(150 nM 내지 700 nM의 KD) 및 Y-축에서 Tm, HMW(%) 또는 면역원성 점수의 플롯팅에 의한 그룹 4의 상세한 분석을 각각 도 14, 15 및 16에 도시한다.

그룹 4에서 Fc 변체의 개발성 기준에 관하여, Tm 기준을 66.5 ℃보다 높게 설정하고, HMW(%) 기준을 2%보다 낮게 설정하고, 면역원성 점수를 250 보다 낮게 설정하였다.

상기 모든 개발성 기준(66.5 ℃ 초과의 Tm, 2% 미만의 HMW(%), 및 250 미만의 면역원성 점수)을 충족시키는 그룹 4의 Fc 변체들을 표 20에 나타낸다.

선행의 Fc 변체들(F1-F599) 중 어느 것도 상기 모든 개발성 기준을 충족시키지 못한 반면, 실시예 1에서 제조된 다수의 신규의 Fc 변체들은 모두 충족시켰다. 모든 개발성 기준을 충족시키는 상기와 같은 그룹 4의 신규의 Fc 변체들은 특히 pH-의존성 항원-결합 도메인과 함께 사용될 때 혈장으로부터 보통의 지속적인 항원 제거를 가능하게 하는데 매우 귀중하다.

요약하면, 표 17 내지 20에 개시된 신규의 Fc 변체들은 혈장으로부터 항원을 제거할 수 있는 항원-결합 분자의 약학적 개발에 적합한 높은 Tm, 낮은 HMW(%), 및 낮은 면역원성 점수를 갖는다.

[실시예 3] 인간 FcRn 트랜스제닉을 사용한 인간 IL-6 수용체 정상-상태 주입 모델에서의 신규의 Fc 변체의 생체 내 항원 제거 연구

3-1. 생체 내 연구를 위한 항체의 제조

pH-의존성 항-인간 IL6 수용체 IgG1 항체, VH3-IgG1 (서열번호 1) 및 VL3-CK (서열번호 3)을 포함하는 Fv4-IgG1, VH3-F11 (서열번호 4) 및 VL3-CK (서열번호 3)를 포함하는 선행 Fc 변체 Fv4-F11, 신규의 Fc 변체, VH3-F652 (서열번호 5) 및 VL3-CK (서열번호 3)를 포함하는 Fv4-F652, 및 VH3-F890 (서열번호 6) 및 VL3-CK (서열번호 3)를 포함하는 Fv4-F890, 및 VH3-F946 (서열번호 7) 및 VL3-CK (서열번호 3)를 포함하는 Fv4-F946을 WO2011/122011의 비교 실시예 2에 개시된 당해 분야의 숙련가들에게 공지된 방법에 의해 발현 및 정제시켰다.

Fv4-IgG1, Fv4-F11, Fv4-F652, Fv4-F890 및 Fv4-F946의 생체내 항원 제거 연구를 인간 FcRn 트랜스제닉을 사용하여 인간 IL-6 수용체 정상-상태 (steady-state) 주입 모델에서 수행하였다.

3-2. 인간 FcRn 트랜스제닉 마우스 계열 32를 사용하는 정상 상태 주입 모델에 의한 항체의 생체 내 연구

인간 FcRn 트랜스제닉 마우스 계열 32를 사용하는 정상 상태 주입 모델에 의해 생체 내 시험을 수행하였다. 가용성 인간 IL-6 수용체를 함유하는 주입 펌프(MINI-OSMOTIC PUMP MODEL 2004; 알젯)를 인간 FcRn 트랜스제닉 마우스 계열 32(B6.mFcRn-/-.hFcRn Tg 계열 32 +/+ 마우스 (B6.mFcRn-/- hFCRN Tg32 B6.Cg-Fcgrt<tm1Dcr> Tg(FCGRT)32Dcr), 잭슨 레보라토리즈(Jackson Laboratories); 문헌[Methods Mol Biol. (2010) 602: 93-104])의 등 피부 아래에 이식하여 모델 동물(상기 동물에서 가용성 인간 IL-6 수용체의 혈장 농도를 일정하게 유지시켰다)을 준비하였다. 항-인간 IL-6 수용체 항체를 상기 모델 동물에게 투여하여 가용성 인간 IL-6 수용체 투여 후의 생체 내 역학을 평가하였다. 단클론 항-마우스 CD4 항체(내부에서)를 주입 펌프 이식 전 및 꼬리 정맥 내로 항체 투여 후 7 및 17일째에 20 ㎎/㎏으로 투여하여 가용성 인간 IL-6 수용체에 대한 중화 항체의 생성을 억제하였다. 이어서, 92.8 마이크로그램/㎖의 가용성 인간 IL-6 수용체를 함유하는 주입 펌프를 상기 마우스의 등 피부 아래에 이식하였다. 주입 펌프 이식 3일 후에 항-인간 IL-6 수용체 항체를 꼬리 정맥에 1 회 투여하였다. 연구 1에서, Fv4-IgG1, Fv4-F652, Fv4-F890 및 Fv4-F946을 대략 1 g/㎏의 상로포(Sanglopor)(CSL 베링(Behring))와 함께 1 ㎎/㎏의 투여량으로 투여하였으며, 연구 2에서, Fv4-IgG1, Fv4-F11 및 Fv4-F652를 1 ㎎/㎏으로 투여하였다. 상기 두 연구 모두에서, 항체를 대조용 그룹(항체 주사 없음)에 투여하지 않았다. 항-인간 IL-6 수용체 항체의 투여 후 적합한 시점들에서 채혈하였다. 상기 채혈된 혈액을 즉시 15,000 rpm 및 4 ℃에서 15 분간 원심분리하여 혈장을 분리시켰다. 상기 분리된 혈장을 상기 분석 전에 -20 ℃ 이하의 냉장고에 보관하였다.

3-3. ELISA에 의한 항-인간 IL-6 수용체 항체 혈장 농도의 측정

마우스 혈장 중의 항-인간 IL-6 수용체 항체의 농도를 ELISA에 의해 측정하였다. 항-인간 IgG(감마-쇄 특이성) F(ab')2 항체 단편(시그마(Sigma))을 눙크-임뮤노플레이트 맥시솝(Nunc-ImmunoPlate MaxiSorp)(날게 눙크 인터내셔널(Nalge Nunc International)) 상에 분배하고 4 ℃에서 밤새 정치시켜 항-인간 IgG-고정화된 플레이트를 제조하였다. 0.8, 0.4, 0.2, 0.1, 0.05, 0.025 및 0.0125 마이크로그램/㎖의 혈장 농도를 갖는 검량선 샘플, 및 100 배 이상 희석된 마우스 혈장 샘플을 제조하였다. 200 마이크로리터의 20 ng/㎖ hsIL-6R을 100 마이크로리터의 상기 검량선 샘플 및 혈장 샘플에 가하고, 이어서 상기 샘플들을 실온에서 1 시간 동안 정치시켰다. 후속적으로, 상기 샘플들을 항-인간 IgG-고정화된 플레이트 상에 분배하고 실온에서 1 시간 동안 정치시켰다. 이어서, 비오틴화된 항-인간 IL-6R 항체(R&D)를 가하여 실온에서 1 시간 동안 반응시켰다. 후속적으로, 스트렙트아비딘-폴리HRP80(스테레오스페시픽 디텍션 테크놀로지스(Stereospecific Detection Technologies))을 가하여 실온에서 1 시간 동안 반응시키고, 기질로서 TMP 원 컴포넌트 HRP 마이크로웰 서브스트레이트(TMP One Component HRP Microwell Substrate)(BioFX 레보라토리즈)를 사용하여 발색 반응을 수행하였다. 1N 황산(쇼와 케미칼(Showa Chemical))으로 상기 반응을 정지시킨 후에, 450 ㎚에서의 흡광도를 마이크로플레이트 판독기에 의해 측정하였다. 마우스 혈장 중의 농도를 분석 소프트웨어 SOFTmax PRO(몰레큘라 디바이시즈)를 사용하여 상기 검량선의 흡광도로부터 계산하였다.

3-4. 전기화학발광 분석에 의한 hsIL-6R 혈장 농도의 측정

마우스 혈장 중의 hsIL-6R의 농도를 전기화학발광에 의해 측정하였다. 2,000, 1,000, 500, 250, 125, 62.5 및 31.25 pg/㎖ 농도로 조절된 hsIL-6R 검량선 샘플, 및 50 배 이상 희석된 마우스 혈장 샘플을 제조하였다. 상기 샘플들을, 설포-태그 NHS 이스터(메소 스케일 디스커버리), 비오틴화된 항-인간 IL-6R 항체(R&D, 시스템스 인코포레이티드(Systems Inc.), 미국 소재), 및 토실리주맵(추가이 파마슈티칼 캄파니 리미티드(Chugai Pharmaceutical Co., Ltd.))을 갖는 루테늄-표지된 단클론 항-인간 IL-6R 항체(R&D) 용액과 혼합하고, 이어서 37 ℃에서 밤새 반응시켰다. 항-인간 IL-6 수용체 항체로서 토실리주맵의 최종 농도는 상기 샘플 중의 hsIL-6R 분자 거의 모두를 토실리주맵에 결합시키기 위해서 333 마이크로그램/㎖이었으며, 이는 상기 샘플 중에 함유된 항-인간 IL-6 수용체 항체의 농도를 초과한다. 후속적으로, 상기 샘플을 MA400 PR 스트렙트아비딘 플레이트(메소 스케일 디스커버리)에 분배하고, 실온에서 1 시간 동안 반응시키고, 세척을 수행하였다. 판독 완충제 T(x4)(메소 스케일 디스커버리)를 분배한 직후에, 섹터 PR 400 판독기(메소 스케일 디스커버리)에 의해 측정을 수행하였다. 상기 hsIL-6R 농도를 분석 소프트웨어 SOFTmax RPO(몰레큘라 디바이시즈)를 사용하여 검량선의 반응을 근거로 계산하였다.

3-5. 연구 1의 결과: 신규 Fc 변체의 생체내 항원 제거 효과

도 17은 혈장 hsIL-6R 농도 시간 프로파일을 도시하고 도 18은 Fv4-IgG1, Fv4-F652, Fv4-F890 및 Fv4-F946의 주사 후 혈장 항체 농도 시간 프로파일을 도시한다. Fv4-IgG1 및 대조군(항체 주사 없음)에 비해, 중성 pH에서 FcRn에 대해 개선된 결합을 갖는 신규의 Fc 변체를 갖는 Fv4-F652, Fv4-F890 및 Fv4-F946은 혈장 hsIL-6R 농도의 현저한 감소를 나타내었으며, 이는 중성 pH에서 FcRn에 대해 개선된 결합을 갖는 pH-의존성 항원 결합 항체의 생체 내 항원 제거 효과를 입증한다. Fv4-F652 및 Fv4-F890이 Fv4-IgG1에 비해 7일째에 각각 30 배 및 10 배 항원 제거 효과를 나타내었음에도 불구하고, Fv4-F652 및 Fv4-F890의 혈장 항체 농도 시간 프로파일은 Fv4-IgG1에 필적할만하였다.

따라서, 이 연구는 Fv4-F652 및 Fv4-F890이 Fv4-IgG1의 경우에 필적하는 항체 약동학을 유지하면서 가용성 항원을 혈장으로부터 선택적으로 제거할 수 있음을 입증하였다. Fv4-F890은 그룹 3에 속하며, 이 연구는 그룹 3의 Fc 변체가 IgG1에 필적하는 항체 약동학을 유지하면서 대략 10 배까지 혈장 항원 농도를 감소시킬 수 있음을 입증하였다. 이는 그룹 3 Fc 변체를 pH-의존성 항원 결합 IgG1 항체에 적용하는 것은 상기 항체 투여량을 10배까지 낮출 수 있음을 의미한다. 그룹 3 Fc 변체에 의한 상기와 같은 항체 투여량의 감소는 항체 투여량을 감소시켜야 할 필요가 있고, 동시에 드문 투여가 요구되는 경우 특히 의미가 있다.

다른 한편으로, Fv4-F946은 Fv4-IgG1에 비해 혈장 hsIL-6R 농도의 100배 감소를 나타내었고, Fv4-F946의 항체 클리어런스는 Fv4-IgG1보다 더 컸다. Fv4-F946은 그룹 2에 속하며, 이 연구는 그룹 2의 Fc 변체가, 비록 상기 항체 클리어런스가 IgG1보다 더 크지만 상기 혈장 항원 농도를 대략 100배까지 감소시킬 수 있음을 입증한다. 이는 pH-의존성 항원 결합 IgG1 항체에 그룹 2 Fc 변체를 적용하는 것은 전체 혈장 항원 농도를 대략 100배까지 감소시킬 수 있음을 의미한다. 표적 혈장 항원 농도가 현실적인 항체 투여량(즉 100 ㎎/㎏)에 의해 중화시키기에 너무 높은 경우에, 그룹 2 Fc 변체에 의한 항원 클리어런스의 증가에 관계 없이 전체 항원 농도의 100배 감소는 표적 항원을, 현실적인 항체 투여량인 10 ㎎/㎏ 미만까지 중화시킬 수 있음을 의미한다.

Fv4-F652 및 Fv4-F890의 hFcRn 결합 친화성을 중복하여 측정하였으며, hFcRn에 대한 친화성은 F652의 경우 2.4E-07 M(n=7), 및 F890의 경우 1.1E-07 M(n=12)이었다. WO2011/122011의 실시예 1에 개시된 선행 연구는 항원 제거 및 항체 클리어런스의 정도가 중성 pH에서 FcRn에 대한 결합 친화성과 상관있음을 밝혀냈다. 도 17에 도시된 바와 같이, Fv4-F652는, 항체 약동학이 Fv4-F890에 필적할만하였지만, Fv4-F890에 비해 보다 큰 정도의 항원 제거를 나타내었다. 따라서, 이는 F652 중의 특정한 돌연변이가 증대된 항원 일소 효과에 기여함을 암시하였다.

F652의 증대된 항원 일소 효과에 기여하는 잔사를 확인하기 위해서, 연구 2를 F11(Met252Tyr, Asn434Tyr 이중 돌연변이체) 및 F652(Pro238Asp, Met252Tyr, Asn434Tyr 삼중 돌연변이체)를 사용하여 수행하였다. hFcRn에 대한 친화성은 F11의 경우 3.1E-07 M(n=12)이었으며, 이는 F652에 대해 측정된 친화성에 필적할만하였다.

3-6. 연구 2의 결과: Pro238Asp 돌연변이의 생체 내 항원 제거 효과

도 19는 혈장 hsIL-6R 농도 시간 프로파일을 도시하고 도 20은 Fv4-IgG1, Fv4-F11 및 Fv4-F652의 주사 후 혈장 항체 농도 시간 프로파일을 도시한다. Fv4-F11은 혈장 hsIL-6R 농도의 감소를 나타내었지만, Fv4-F652는 혈장 hsIL-6R 농도의 보다 큰 감소를 나타내었다. Fv4-F11 및 Fv4-F652는 필적하는 혈장 항체 농도 시간 프로파일을 나타내었다.

따라서, 이 연구는 Pro238Asp 돌연면이가 Fv4-IgG1에 필적하는 항체 약동학을 유지하면서 항원 제거 혈장을 증대시킬 수 있음을 입증하였다. 따라서, Pro238Asp 돌연변이는 pH-의존성 항원 결합 항체에 의한 항체 제거를 증대시키기에 매우 귀중하다.

[실시예 4] 부위-특이적 돌연변이에 의한 FcRn 결합 개선된 Fc 변체에 결합하는 류마티스성 인자의 제거

상기 치료 항체의 임상적 유용성 및 효능은, 항-약물 항체(ADA)가 상기 항체의 효능 및 약동학에 영향을 미치고 때때로 심한 부작용을 도출할 수 있기 때문에 상기 ADA의 생성에 의해 제한될 수 있다. 다수의 인자들이 치료 항체의 면역원성에 영향을 미치며, 효과기 T-세포 에피토프의 존재가 상기 인자들 중 하나이다. 또한, 치료 항체에 대한 기존 항체의 존재는 ADA의 관점에서 또한 문제가 될 수 있다. 특히 류마티스성 관절염과 같은 자가면역 질병이 있는 환자에 대한 치료 항체의 경우에, 류마티스성 인자인 인간 IgG에 대한 자가항체는 기존 항체의 쟁점일 수 있다. 최근에, Asn434His 돌연변이를 갖는 인간화된 항-CD4 IgG1 항체가 중요한 류마티스성 인자 결합을 이끌어냄이 보고되었다(문헌[Clin Pharmacol Ther. 2011 Feb;89(2):283-90]). 상세한 연구는 인간 IgG1에서 Asn434His 돌연변이가 모 인간 IgG1에 비해 상기 항체의 Fc 영역에 대한 류마티스성 인자의 결합을 증가시킴을 확인하였다.

류마티스성 인자는 인간 IgG에 대한 다클론성 자가항체이며, 인간 IgG에서 그의 에피토프는 클론들 가운데 다양하지만, 그의 에피토프는 CH2/CH3 계면 영역뿐만 아니라 CH3 도메인(상기 FcRn 결합 에피토프와 겹칠 수 있다) 중에 위치하는 것으로 보인다. 따라서, FcRn에 대한 결합 친화성을 증가시키는 돌연변이는 류마티스성 인자의 특정한 클론에 대한 결합 친화성을 또한 증가시킬 수도 있다.

선행의 연구들은 산성 pH에서 FcRn에 대한 결합 친화성을 증가시키는 Fc-조작이 엔도솜 재순환 효율을 개선시키고 상기 항체의 약동학을 연장시킴을 입증하였다. 예를 들어 M252Y/S254T/T256E (YTE) 변체 (문헌[J Biol Chem 2006 281:23514-23524.]), M428L/N434S (LS) 변체 (문헌[Nat Biotechnol, 2010 28:157-159.]) 및 N434H 변체 (문헌[Clinical Pharmacology & Therapeutics (2011) 89(2):283-290].)는 본래의 IgG1에 비해 반감기의 개선을 보였다.

혈장으로부터 항원 제거를 성취하기 위해서, FcRn과 상호작용하는 항원-결합 분자(항체)의 Fc 영역(문헌[Nat Rev Immunol. 2007 Sep;7(9):715-25])을 중성 pH에서 FcRn에 대해 개선된 결합 친화성을 갖도록 조작하였으며, 상기와 같은 조작된 Fc 변체는 F11 변체, F68 변체, F890 변체 및 F947 변체를 포함한다. 통상적인 항체에 비해 중성 pH에서 RcRn에 대해 개선된 결합 친화성을 갖는 pH-의존성 항원 결합 항체에 의한 혈장으로부터의 항원 제거 기전을 도 1에 도시한다.

개선된 FcRn-결합(pH 6.0 및/또는 중성 pH에서)을 갖는 상기와 같은 Fc 변체는 앞서 보고된 Asn434His 돌연변이의 경우에서와 같이 류마티스성 인자에 대해 증가된 결합을 나타낸다. 따라서, 우리는 이들 FcRn 결합 개선된 Fc 변체가 류마티스성 인자에 대해 증가된 결합을 나타내는 지의 여부를 시험하였다. 하기의 연구에 사용된 변체 항체는 Fv4-hIgG1, Fv4-YTE, Fv4-LS, Fv4-N434H, Fv4-F11, Fv4-F68, Fv4-890 및 Fv4-F947이었다.

4-1. FcRn 결합 개선된 Fc 변체의 류마티스성 인자 결합 연구

류마티스성 인자에 대한 결합 분석을 pH 7.4에서 전기화학발광(ECL)에 의해 수행하였다. 상기 분석을 15 또는 30 명의 개별적인 RA 환자의 혈청을 사용하여 수행하였다(프로테오제넥스(Proteogenex)). 50-배 희석된 혈청 샘플, 비오틴 표지된 시험 항체(1 마이크로그램/㎖) 및 SULFO-TAG NHS 에스터(메소 스케일 디스커버리) 표지된 시험 항체(1 마이크로그램/㎖)를 혼합하고 실온에서 3 시간 동안 배양하였다. 이어서, 상기 혼합물을 스트렙트아비딘 코팅된 MULTI-ARRAY 96 웰 플레이트(메소 스케일 디스커버리)에 가하고, 상기 플레이트를 실온에서 2 시간 동안 배양하고 세척하였다. 리드(Read) 완충제 T(x4)(메소 스케일 디스커버리)를 각 웰에 가한 후에, 플레이트를 SECTOR 이미저 2400 판독기(메소 스케일 디스커버리) 상에 바로 설치하고 화학발광을 측정하였다.

상기 연구의 결과를 도 21 및 22에 도시한다. 도 21 및 22는 15 또는 30 명의 개별적인 RA 환자로부터의 혈청의 ECL 반응이다. 고유의 인간 IgG1을 갖는 Fv4-hIgG1(도 21a 및 22a)은 단지 약한 류마티스성 인자 결합을 보인 반면, 모든 FcRn 결합 개선된 Fc 변체(Fv4-YTE (도 21b), Fv4-LS (도 21c), Fv4-N434H (도 22b), Fv4-F11 (도 22c), Fv4-F68 (도 22d), Fv4-890 (도 22e) 및 Fv4-F947 (도 22f))는 2 명이 넘는 공여자에서 류마티스성 인자를 현저하게 증대시켰다. 상기 연구는 기존 류마티스성 인자와 관련된 면역원성이, 류마티스성 관절염과 같은 자가면역 질병을 위한 FcRn에 대해 개선된 결합 활성을 갖는 치료 항체의 임상 개발을 고려할 때 쟁점일 수 있음을 명백히 입증한다. 도 23은 15 명의 RA 환자의 혈액에 대한 상기 언급한 항체 변체의 혈청의 ECL 반응의 평균, 기하평균 및 중앙값을 도시한다.

따라서, 다음 연구에서, 우리는 FcRn 결합 능력을 유지하면서 다클론성 류마티스성 인자 결합을 잠재적으로 감소시킬 수 있는 변체들의 패널을 생성시켰다.

4-2. Fc 영역에의 돌연변이의 도입에 의한 FcRn 결합 개선된 Fc 변체의 류마티스성 인자 결합의 감소

FcRn 결합 능력을 유지하면서 감소된 다클론성 류마티스성 인자 결합을 갖는 변체들을 생성시키기 위해서, 돌연변이를 인간 FcRn/인간 IgG 상호작용을 방해하지 않는 것으로 추정되는 CH2/CH3 계면 부근의 표면 잔기에 합리적으로 도입시켰다.

Fv4-F890을 모 Fc 변체로서 선택하였으며, 단일 돌연변이 및 단일 돌연변이의 조합된 Fc 변체들을 Fv4-F890에 도입시켰다. 표 21에 개시된 신규의 Fc 변체들 F1058 - F1073, F1107 - F1114, F1104 - F1106, 및 F1230 - F1232를 생성시켰다. 또한, Fv4-F947을 모 Fc 변체로서 선택하였으며, 동일한 단일 및 조합된 돌연변이를 도입시켰다. 표 21에 개시된 신규의 Fc 변체들 F1119 - F1124를 생성시켰다. 먼저 상기 변체들을 pH 7.0에서 인간 FcRn에 대한 그들의 결합 친화성에 대해 평가하였다. 결과를 표 21에 또한 개시한다. 모 Fv4-F890 또는 Fv4-F947에 비해, 이들 변체는 인간 FcRn에 대한 결합 친화성의 현저한 감소를 보이지 않았으며, 이는 이들 돌연변이가 인간 FcRn 결합에 영향을 미치지 않음을 입증하였다.

이어서 우리는 표 21의 변체들에 대해 pH 7에서 류마티스성 인자 결합 연구를 수행하였다. 상기 연구의 결과를 도 24 내지 29에 도시한다. 이들 도면은 하기의 항체 변체들에 대한 15 명의 개별적인 RA 환자들로부터의 혈청의 ECL 반응을 도시한다: Fv4-IgG1, Fv4-F890, Fv4-F1058 - Fv4-1073 (도 24), Fv4-F1104 - Fv4-F1106 (도 26), Fv4-F1107 - Fv4-F1114 (도 27), Fv4-F1230 - Fv4-F1232 (도 28), Fv4-947 및 Fv4-F1119 - Fv4-F1124 (도 29). 도 25a, 25b 및 25c은 변체 Fv4-IgG1, Fv4-F890, 및 Fv4-F1058 - Fv4-1073에 대한 15 명의 RA 환자로부터의 혈청의 ECL 반응의 평균, 기하평균 및 중간값이다.

놀랍게도, 강한 류마티스성 인자 결합을 나타내는 F890에 비해, F890에 대한 단일 돌연변이를 갖는 신규의 Fc 변체, 예를 들어 F1062, F1064-F1072 및 F1107-F1114는 류마티스성 인자 결합의 현저한 감소를 나타내었다. 특히 F1062, F1064, F1068, F1070, F1072, F1107 - F1109 및 F1111-F1113은 본래의 IgG1으로서 필적하는 류마티스성 인자를 나타내었으며, 이는 F890 변체의 증가된 면역원성 위험이 추가적인 단일 돌연변이의 도입에 의해 완전히 제거되어 인간 FcRn 결합에 영향을 미치지 않으면서 류마티스성 인자 결합을 감소시킴을 입증하였다. 환자에서 류마티스성 인자는 Fc 영역 중의 다수의 에피토프에 결합하는 다클론성 항체이므로, 단일 돌연변이가 상기 Fc 영역에 대한 류마티스성 인자의 결합을 현저하게 제거하는 것은 놀라웠다.

더욱 또한, 단일 돌연변이된 Fc F1070 (Q438R) 또는 F1072 (S440E)에 비해, 이중 돌연변이된 Fc F1106 (Q438R/S440E)은 류마티스성 인자 결합에 있어서 현저한 감소를 보였다. 마찬가지로, 이중 돌연변이된 Fc F1230 (Q438R/S440D), F1231 (Q438K/S440E) 및 F1232 (Q438K/S440D)가 또한 돌연변이들의 조합에 의해 류마티스성 인자 결합에 있어서 추가적인 감소를 보였다. 한편, F1104 (V422E/S424R) 또는 F1105 (V422S/S424R)는 어떠한 조합 효과도 보이지 않았다.

또한, 모 Fc 변체로서 선택된 Fv-F939을 사용하여, FcRn 결합을 증가시키기 위한(S254T 또는 T256E) 및 류마티스성 인자 결합을 감소시키기 위한(H433D) 다른 돌연변이들을 평가하였다. 표 22에 개시된 신규의 Fc 변체들(F1291, F1268, F1269, F1243, F1245, F1321, F1340 및 F1323)을 생성시켰다. 먼저, 상기 변체들을 pH 7.0에서 인간 FcRn에 대한 그들의 결합 친화성에 대해 평가하였다. 결과를 또한 표 22에 개시한다.

이어서 우리는 상술한 바와 같이 이들 변체에 대한 류마티스성 인자 결합 연구를 수행하였다. 상기 연구의 결과를 도 30에 도시한다. 놀랍게도, F939에 비해, F1291(F939에 대한 단일 H433D 돌연변이)은 일부 공여자에 있어서 류마티스성 인자 결합의 현저한 감소를 나타내었다. 유사하게, F1321에 비해, F1323(F1321에 대한 단일 H433D 돌연변이)은 일부의 공여자에서 류마티스성 인자의 현저한 감소를 나타내었다. 더욱 또한, Q438R/S440E, Q438K/S440D 및 Q438K/S440E 돌연변이는 FcRn 결합을 증가시키기 위한 다른 돌연변이(S254T 또는 T256E)를 갖는 변체에 의한 류마티스성 인자 결합의 현저한 감소를 보였다.

4-3. Fc 영역에의 추가적인 N-글리코실화의 도입에 의한 FcRn 결합 개선된 Fc 변체의 류마티스성 인자 결합의 감소

상기 류마티스성 인자 결합 에피토프 부근에 추가적인 N-글리코실화의 도입은 또한 벌키한 N-글리코실화에 의한 입체 장애로 인해 류마티스성 인자 결합을 파기시킬 수 있다. 돌연변이를, 상기 돌연변이가 FcRn 결합을 유지하면서 N-글리코실화 서열(Asn-Xxx-Ser/Thr)을 도입시키도록 하는 관점에서 선택할 수 있다. Fc 영역에 추가적인 N-글리코실화 서열을 도입시키기 위해서, 단일 또는 이중 돌연변이(들)를 Fv4-F11에 도입시켰다. 표 23에 개시된 신규의 Fc 변체(F1077-F1083, F1094-F1097)를 생성시켰다. 상기 변체를 pH 7.0에서 인간 FcRn에 대한 그의 결합 친화성 및 SDS-파지에 의한 추가적인 글리코실화의 존재에 대해서 평가하였다. 결과를 표 23에 개시한다. F1077 (K248N), F1080 (S424N), F1081 (Y436N/Q438T) 및 F1082 (Q438N)는 추가적인 글리코실화를 가지며 특히 F1080(S424N)은 인간 FcRn에 대한 결합 친화성을 유지하는 것으로 밝혀졌다.

따라서, 다음 연구에서, S424N 돌연변이를 Fv4-F890에 도입시켰으며, 표 24에 개시된 Fv4-F1115를 생성시키고, pH 7.0에서 인간 FcRn에 대한 그의 결합 친화성에 대해 평가하였다. 결과를 또한 표 24에 개시한다.

이어서 우리는 상술한 변체들에 대해 류마티스성 인자 결합 연구를 수행하였다. 상기 연구의 결과를 도 31에 도시한다. 놀랍게도, 단일 S424N 돌연변이체, Fv4-F1115는 류마티스성 인자 결합에 있어서 현저한 감소를 나타내었다. 이 결과는 추가적인 N-글리코실화의 도입이 류마티스성 인자 결합의 파기에 유효한 접근법임을 암시한다.

4-4. YTE, N434H 및 LS 변체의 류마티스성 인자 결합의 감소

Fv4-YTE, Fv4-N434H 및 Fv4-LS 변체(산성 pH에서 FcRn 결합을 개선시키고 항체 약동학을 연장시킨다)의 류마티스성 인자 결합을 감소시키기 위해서, Q438R/S440E 돌연변이 또는 S424N 돌연변이를 상기 변체에 도입시켰다. 표 25에 개시된 신규의 Fc 변체(F1166, F1167, F1172, F1173, F1170 및 F1171)를 생성시켰다. 먼저 상기 변체들을 pH 6.0에서 인간 FcRn에 대한 그들의 결합 친화성에 대해 평가하였다. 결과를 또한 표 25에 개시한다.

이어서 우리는 상술한 바와 같이 이들 변체(Fv4-F1166, F1167, F1172, F1173, F1170 및 F1171)에 대한 류마티스성 인자 결합 연구를 수행하였다. 상기 연구의 결과를 도 32에 나타낸다. 2 명의 공여자(90216S 및 90214S)에서 강한 류마티스성 인자 결합을 나타낸 YTE에 비해, F1166 (Q438R/S440E) 및 F1167 (S424N)은 류마티스성 인자 결합에 있어서 현저한 감소를 나타내었다. 더욱 또한, F1173 및 F1171는 S424N 돌연변이가 또한 N434H 및 LS 변체의 류마티스성 인자 결합을 파기할 수 있었음을 보인다. 그러나, Q438R/S440E 돌연변이는 N434H 및 LS 변체의 류마티스성 인자 결합을 완전히 파기할 수 없었으며, 류마티스성 인자 결합이 한 명 또는 2 명의 공여자에서 관찰되었다.

4-5. LS 변체의 류마티스성 인자 결합의 감소를 위한 또 다른 돌연변이

신규의 단일 돌연변이를 Fv4-LS에 도입시켰으며, 표 26에 개시된 Fc 변체(Fv4-F1380 - Fv4-F1392)를 생성시켰다.

이어서 우리는 pH 6.0에서 FcRn 결합을 유지하는 변체(Fv4-F1380, F1384-F1386, F1388 및 F1389)에 대한 류마티스성 인자 결합 연구를 수행하였다. 이 연구의 결과를 도 33에 도시한다. 이들 변체는 일부의 공여자들에 있어서 류마티스성 인자 결합의 현저한 감소를 나타내었다. 특히, Fv4-F1389는 본래의 IgG1과 필적할만한 류마티트성 인자 결합을 나타내었다.

따라서, Pro387Arg, Val422Glu, Val422Arg, Val422Ser, Val422Asp, Val422Lys, Val422Thr, Val422Gln, Ser424Glu, Ser424Arg, Ser424Lys, Ser424Asn, Ser426Asp, Ser426Ala, Ser426Gln, Ser426Tyr, His433Asp, Tyr436Thr, Gln438Glu, Gln438Arg, Gln438Ser, Gln438Lys, Ser440Glu, Ser440Asp, Ser440Gln(위치들은 EU 넘버링으로 제공된다)과 같은 돌연변이가 FcRn 결합 증가된 Fc 영역(예를 들어 F1-F1434)을 함유하는 항원-결합 분자, 예를 들어 혈장으로부터 항원을 제거할 수 있는, 중성 pH에서 FcRn에 대해 개선된 결합 친화성을 갖는 pH-의존성 항원 결합 항체 및 항체 약동학을 개선시킬 수 있는, 산성 pH에서 FcRn에 대해 개선된 결합 친화성을 갖는 항체의 면역원성을 감소시키기에 매우 유용하다.

인간 FcRn 결합에 영향을 미치지 않으면서 류마티스성 인자의 결합을 감소시키기 위한, EU387, EU422, EU424, EU426, EU433, EU436, EU438 및 EU440 외의 돌연변이 부위들을 EU 넘버링 중에서 248-257, 305-314, 342-352, 380-386, 388, 414-421, 423, 425-437, 439, 및 441-444로부터 선택될 수 있었다.

[실시예 5] 중성 pH에서 인간 FcRn에 대해 개선된 결합을 갖는 신규의 Fc 변체의 류마티스성 인자 결합의 감소

표 27에 개시된 신규의 Fc 변체(F939, F1378, F1379, F1262, F1138, F1344, F1349, F1350, F1351, F1261, F1263, F1305, F1306, F1268, F1269, F1413, F1416, F1419, F1420, F1370, F1371, F1599, F1600, F1566, F1448, F1601-F1603, F1531, F1604, F1605, F1586, F1592, F1610-F1615, F1567, F1572, F1576, F1578, F1579, F1641-F1655, F1329, F1331)를 생성시켰다. 먼저 상기 변체들을 pH 7.0에서 인간 FcRn에 대한 그들의 결합 친화성에 대해 평가하였다. 결과를 또한 표 27에 개시한다.

이어서 우리는 표 27의 변체들에 대해 pH 7.4에서 류마티스성 인자 결합 연구를 수행하였다. 상기 연구의 결과를 도 34 내지 94에 도시한다.

류마티스성 인자 결합을 감소시키기 위한 이중 돌연변이(Q438R/S440E, Q438R/S440D, Q438K/S440E 및 Q438K/S440D)는 중성 pH에서 FcRn 결합을 증가시키기 위한 다른 돌연변이에 대한 류마티스성 인자 결합의 현저한 감소를 보였다.

5-1. 산성 pH에서 인간 FcRn에 대해 개선된 결합을 갖는 신규의 Fc 변체의 류마티스성 인자 결합의 감소

표 28에 개시된 신규의 Fc 변체(F1718-F1721, F1671, F1670, F1711-F1713, F1722-F1725, F1675, F1714-F1717, F1683, F1756-F1759, F1681, F1749-F1751, F1760-F1763, F1752-F1755, F1685)를 생성시켰다. 먼저 상기 변체들을 pH 6.0에서 인간 FcRn에 대한 그들의 결합 친화성에 대해 평가하였다. 결과를 또한 표 28에 개시한다.

이어서 우리는 표 28의 변체들에 대해 pH 7.4에서 류마티스성 인자 결합 연구를 수행하였다. 상기 연구의 결과를 도 95 내지 130에 도시한다.

류마티스성 인자 결합을 감소시키기 위한 이중 돌연변이(Q438R/S440E, Q438R/S440D, Q438K/S440E 및 Q438K/S440D)는 산성 pH에서 FcRn 결합을 증가시키기 위한 다른 돌연변이에 대한 류마티스성 인자 결합의 현저한 감소를 보였다.

[실시예 6] 인간 FcRn 트랜스제닉 마우스를 사용한 인간 IL-6 수용체 정상-상태 주입 모델에서 신규의 Fc 변체의 생체 내 항원 제거 연구

6-1. 생체 내 연구를 위한 항체의 제조

pH-의존성 항-인간 IL6 수용체 IgG1 항체, VH3-IgG1 (서열번호 1) 및 VL3-CK (서열번호 3)을 포함하는 Fv4-IgG1, 신규의 Fc 변체, VH3-F1243 (서열번호 8) 및 VL3-CK (서열번호 3)을 포함하는 Fv4-F1243, 및 VH3-F1245 (서열번호 9) 및 VL3-CK (서열번호 3)을 포함하는 Fv4-F1245를 WO2011/122011의 실시예 2에 개시된 당해 분야의 숙련가들에게 공지된 방법에 의해 발현 및 정제시켰다.

실시예 4에 개시된 바와 같이, Fv4-F1243 및 Fv4-F1245는 중성 pH에서 인간 FcRn에 대해 개선된 결합 친화성을 갖는 신규의 Fc 영역을 갖지만, 류마티스성 인자에 대해 현저하게 감소된 결합을 갖는다. 이들 변체의 항원 제거 효과를 평가하기 위해서, Fv4-IgG1, Fv4-F1243 및 Fv4-F1245의 생체 내 연구를 인간 FcRn 트랜스제닉 마우스를 사용하여 인간 IL-6 수용체 정상-상태 주입 모델에서 수행하였다.

6-2. 인간 FcRn 트랜스제닉 마우스 계열 32를 사용하는 정상 상태 주입 모델에 의한 항체의 생체 내 연구

WO2011/122011의 실시예 13에 개시된 동일한 방법에 의해 인간 FcRn 트랜스제닉 마우스 계열 32를 사용하는 정상 상태 주입 모델에 의해 생체 내 시험을 수행하였다.

6-3. 연구의 결과: 신규의 Fc 변체의 생체 내 항원 제거 효과

도 131은 혈장 hsIL-6R 농도 시간 프로파일을 도시하고 도 132는 Fv4-IgG1, Fv4-F1243 및 Fv4-F1245의 주사 후 혈장 항체 농도 시간 프로파일을 도시한다. Fv4-IgG 및 대조용(항체 주사 없음)에 비해, 중성 pH에서 FcRn에 대해 개선된 결합을 갖는 신규의 Fc 변체를 갖는 Fv4-F1243 및 Fv4-F1245는 혈장 hsIL-6R 농도의 현저한 감소를 나타내었으며, 이는 중성 pH에서 FcRn에 대해 개선된 결합을 갖는 pH-의존성 항원 결합 항체의 생체 내 항원 제거를 입증한다. Fv4-F1243 및 Fv4-F1245는 Fv4-IgG1에 비해 각각 21일 또는 7일째에 10 배의 항원 제거 효과를 나타내었으며, 이때 Fv4-F1243 및 Fv4-F1245의 혈장 항체 농도 시간 프로파일은 Fv4-IgG1에 필적하였다.

[실시예 7] 인간 FcRn 트랜스제닉 마우스를 사용한 신규의 Fc 변체의 생체 내 PK 연구

7-1. 생체 내 연구를 위한 항체의 제조

pH-의존성 항-인간 IL6 수용체 IgG1 항체, VH3-IgG1 (서열번호 1) 및 VL3-CK (서열번호 3)을 포함하는 Fv4-IgG1, 신규의 Fc 변체, VH3-F1389 (서열번호 10) 및 VL3-CK (서열번호 3)을 포함하는 Fv4-F1389를 WO2011/122011의 비교 실시예 2에 개시된 당해 분야의 숙련가들에게 공지된 방법에 의해 발현 및 정제시켰다.

실시예 4 및 5에 개시된 바와 같이, Fv4-F1389는 산성 pH에서 인간 FcRn에 대해 개선된 결합 친화성을 갖는 신규의 Fc 영역을 갖지만, 류마티스성 인자에 대해 현저하게 감소된 결합을 갖는다. 상기 변체의 약동학을 평가하기 위해서, Fv4-IgG1 및 Fv4-F1389의 생체 내 연구를 인간 FcRn 트랜스제닉 마우스를 사용하여 수행하였다.

7-2. 인간 FcRn 트랜스제닉 마우스 계열 32를 사용함에 의한 항체의 생체 내 연구

WO2011/122011의 실시예 13에 개시된 동일한 방법에 의해 인간 FcRn 트랜스제닉 마우스 계열 32를 사용하는 생체 내 시험을 수행하였다.

7-3. 신규의 Fc 변체의 생체 내 PK 연구의 결과

도 133은 Fv4-IgG1 및 Fv4-F1389의 주사 후 혈장 항체 농도 시간 프로파일을 도시한다. Fv4-IgG1에 비해, 산성 pH에서 FcRn에 대해 개선된 결합 및 류마티스성 인자에 대해 감소된 결합을 갖는 신규의 Fc 변체를 갖는 Fv4-F1389는 개선된 약동학을 나타내었다. 표 28에 개시된 신규의 Fc 변체는 pH 6.0에서 FcRn에 대해 F1389와 동일한 수준으로 증가된 결합 친화성을 갖는다. 따라서, 이들 변체는 류마티스성 인자에 대해 감소된 결합을 가지면서 인간 FcRn 트랜스제닉 마우스 계열 32를 사용하여 개선된 약동학을 나타낼 것으로 예상된다.

[실시예 8] 칼슘-의존성 방식으로 인간 IgA에 결합하는 항체의 제조

8-1. 인간 IgA(hIgA)의 제조

인간 IgA(이후부터 또한 "hIgA"라 약기함)를 하기의 재조합 기법을 사용함으로써 항원으로서 제조하였다. hIgA(가변 영역은 항-인간 IL-6 수용체 항체로부터 유도된다)를 H (WT)-IgA1 (서열번호 12) 및 L (WT) (서열번호 13)가 삽입된 재조합 벡터를 갖는 숙주 세포를 배양함으로써 발현시키고 이온-교환 크로마토그래피 및 젤 여과 크로마토그래피를 사용하여 당해 분야의 숙련가들에게 공지된 방법에 의해 정제하였다.

8-2. hIgA에 결합하는 항체의 발현 및 정제

GA2-IgG1(중쇄 서열번호 14; 경쇄 서열번호 15)은 hIgA에 결합하는 항체이다. GA2-IgG1의 중쇄(서열번호 14) 및 GA2-IgG1의 경쇄(서열번호 15)를 암호화하는 DNA 서열을 당해 분야의 숙련가들에게 공지된 방법에 의해 동물 세포 발현 플라스미드에 삽입하였다. 상기 항체를 하기에 개시하는 방법에 의해 발현시켰다. 인간 태아 신장 세포-유래된 프리스타일(FreeStyle) 293-F(인비트로젠) 계열의 세포를 프리스타일 293 발현 배지(인비트로젠) 중에 현탁시켰다. 상기 세포 현탁액을 6-웰 플레이트에 1.33 x 10⁶ 세포/㎖의 세포 밀도로 시딩하였다(3 ㎖/웰). 이어서, 상기 제조된 플라스미드를 리포펙션 방법에 의해 상기 세포에 도입시켰다. 상기 세포를 CO₂ 배양기(37 ℃, 8% CO₂, 90 rpm)에서 4일 동안 배양시켰다. 상기 항체를 r프로테인 A 세파로스(상표) 패스트 플로우(애머샴 바이오사이언시즈)를 사용하여 당해 분야의 숙련가들에게 공지된 방법에 의해 상기 단리된 배양 상등액으로부터 정제하였다. 상기 정제된 항체 용액의 흡광도(파장: 280 ㎚)를 분광광도계를 사용하여 측정하였다. 상기 항체 농도를 PACE 방법에 의해 계산된 흡수 계수를 사용하여 상기 측정된 값으로부터 측정하였다(문헌[Protein Science (1995) 4, 2411-2423]).

8-3. 칼슘-의존성 hIgA-결합 활성에 대한 수득된 항체의 평가

8-2에 개시된 바와 같이 단리된 항체를 비아코어 T200(GE 헬쓰케어)를 사용하여 그의 hIgA-결합 활성(해리 상수 K_D(M))에 대해 평가하였다. 상기 측정에 사용된 실행 완충제는 3 마이크로M 또는 1.2 mM CaCl₂을 함유하는 0.05% 트윈20/20 mmol/L ACES/150 mmol/L NaCl(pH 7.4 또는 5.8)이었다.

상기 항체를, 아미노 결합 방법에 의해 적합한 양의 재조합 단백질 A/G(써모 사이언티픽)가 고정화된 센서 칩 CM5(GE 헬쓰케어)에 결합되게 하였다. 이어서, 적합한 농도의 hIgA(8-1에 개시됨)를 분석물로서 주사하여 상기 센서 칩 상의 항체와 상호작용하게 하였다. 상기 측정을 37 ℃에서 수행하였다. 상기 측정 후에, 10 mmol/L 글리신-HCl(pH 1.5)을 주사하여 상기 센서 칩을 재생시켰다. 상기 해리 상수 K_D(M)를 비아코어 T200 평가 소프트웨어(GE 헬쓰케어)를 사용하여 곡선 정합 분석 및 평형 매개변수 분석에 의해 상기 측정 결과로부터 계산하였다. 상기 결과 및 획득된 센서그램을 각각 표 29 및 도 134에 나타낸다. 상기는 GA2-IgG1이 1.2 mM의 Ca²⁺ 농도에서 hIgA에 강하게 결합하는 반면 항체는 3 마이크로M의 Ca²⁺ 농도에서 hIgA에 약하게 결합함을 밝혀내었다. 더욱 또한, 1.2 mM의 Ca²⁺ 농도에서, GA2-IgG1은 pH 7.4에서 강하게, 그러나 pH 5.8에서는 약하게 인간 IgA에 결합하는 것으로 나타났다. 보다 구체적으로, GA2-IgG1은 pH- 및 칼슘-의존적인 방식으로 인간 IgA에 결합하는 것으로 밝혀졌다.

[실시예 9] 칼슘-의존적인 방식으로 hIgA에 결합하는 변형된 Fc 영역을 갖는 항체의 제조

이어서, 혈장으로부터의 항원(hIgA) 제거에 대한 FcRn의 영향을 평가하기 위해서, GA2-F760(중쇄 서열번호 16; 경쇄 서열번호 15)을, Fc감마R에 대한 결합을 제거하도록 GA2-IgG1 내에 아미노산 치환 L235R 및 S239K를 도입시킴으로써 제조하였다. 더욱 또한 GA2-F1331(중쇄 서열번호 17; 경쇄 서열번호 15)을, GA2-F760에 아미노산 치환 G236R, M252Y, S254T, T256E, N434Y, Y436V, Q438R 및 S440E를 도입시킴으로써 제조하였으며, 이는 pH 7.4에서 GA2-F760보다 더 강하게 FcRn에 결합한다. 상기 변형된 항체를 당해 분야의 숙련가들에게 공지된 방법에 의해 GA2-F1331 (중쇄 서열번호 17; 경쇄 서열번호 15) 및 GA2-F760 (중쇄 서열번호 16; 경쇄 서열번호 15)을 암호화하는 DNA 서열이 삽입된 동물 발현 플라스미드를 사용하여 상술한 방법에 의해 발현시켰다. 상기 항체 농도를 정제 후에 측정하였다. GA2-F760을 다양한 마우스 Fc감마R(mFc감마RI, mFc감마RII, mFc감마RIII, 및 mFc감마RIV)에 대한 그의 결합에 대해 평가하였다. 상기 결과는 GA2-F760이 상기 수용체들 중 어느 것에도 결합하지 않음을 보였다.

[실시예 10] 인간 FcRn 트랜스제닉 마우스를 사용한 항원의 혈장 체류에 대한 Ca-의존성 hIgA-결합 항체의 효과의 평가

10-1. 인간 FcRn 트랜스제닉 마우스를 사용하는 생체 내 시험

hIgA 및 항-hIgA 항체의 약동학을, hIgA(인간 IgA; 실시예 8에 개시된 바와 같이 제조됨)를 단독으로 또는 항-hIgA 항체와 함께 인간 FcRn 트랜스제닉 마우스(B6.mFcRn-/-.hFcRn Tg 계열 32 +/+ 마우스, 잭슨 레보라토리즈; 문헌[Methods Mol Biol. (2010) 602: 93-104])에 투여 후에 평가하였다. hIgA 및 항-hIgA 항체의 혼합물을 꼬리 정맥을 통해 10 ㎖/㎏의 용량으로 1 회 투여하였다. 상술한 GA2-F760 및 GA2-F1331이 사용된 항-hIgA 항체였다.

모든 혼합물에서, hIgA 농도는 80 마이크로g/㎖이고 항-hIgA 항체 농도는 2.69 ㎎/㎖이었다. 상술한 조건 하에서, hIgA의 대부분은, 상기 항-hIgA 항체가 hIgA에 비해 충분히 과잉으로 존재하기 때문에 상기 항체에 결합할 것으로 예측된다. 투여 후 15 분, 1 시간, 2 시간, 7 시간, 하루, 3일, 7일 및 14일째에 상기 마우스로부터 채혈하였다. 상기 채혈된 혈액을 12,000 rpm 및 4 ℃에서 15 분간 즉시 원심분리시켜 혈장을 수득하였다. 상기 분리된 혈장을 측정시까지 -20 ℃ 이하에서 냉장고에 보관하였다.

10-2. ELISA에 의한 인간 FcRn 트랜스제닉 마우스에서의 혈장 항-hIgA 항체 농도의 측정

마우스 혈장 중의 항-hIgA 항체 농도를 ELISA에 의해 측정하였다. 먼저, 항-인간 IgG-고정화된 플레이트를, 항-인간 IgG(감마-쇄 특이성) F(ab')2 단편 항체(시그마)를 넝크-임뮤노 플레이트(Nunc-Immuno Plate), 맥시솝(MaxiSorp)(날게 눙크 인터내셔널(Nalge Nunc International))의 각 웰에 분액하고 상기 플레이트를 4 ℃에서 밤새 정치시킴으로써 제조하였다. 0.5, 0.25, 0.125, 0.0625, 0.03125, 0.01563, 및 0.007813 마이크로그램/㎖의 혈장 농도로 표준 용액으로서 제조된 항-hIgA 항체 표준 곡선 샘플, 및 마우스 혈장 샘플을 100 배 이상 희석시켜 제조된 분석 샘플을 항-인간 IgG-고정화된 플레이트에 분액하고, 이어서 상기 플레이트를 25 ℃에서 1 시간 동안 배양하였다. 이어서, 염소 항-인간 IgG(감마-쇄 특이적) 비오틴(BIOT) 접합체(써던 바이오테크놀로지 어쏘시에이츠 인코포레이티드(Southern Biotechnology Associates Inc.))를 상기 플레이트의 각 웰에 분액하고 이어서 상기 플레이트를 25 ℃에서 1 시간 동안 배양하였다. 이어서, 스트렙트아비딘-폴리HRP80(스테레오스페시픽 디텍션 테크놀로지스(Stereospecific Detection Technologies))을 상기 플레이트의 각 웰에 가하고, 그 후에 상기 플레이트를 25 ℃에서 1 시간 동안 배양하였다. 기질로서 TMP 원 컴포넌트 HRP 마이크로웰 서브스트레이트(TMP One Component HRP Microwell Substrate)(BioFX 레보라토리즈)를 사용한 발색 반응을 1N 황산(쇼와 케미칼(Showa Chemical))으로 정지시키고 이어서 각 웰 중의 반응 혼합물을 마이크로플레이트 판독기를 사용하여 450 ㎚에서의 흡광도에 대해 측정하였다. 마우스 혈장 중의 상기 항-hIgA 항체 농도를 분석 소프트웨어 SOFTmax PRO(몰레큘라 디바이시즈)를 사용하여 상기 표준 곡선의 흡광도로부터 계산하였다. 상술한 방법에 의해 측정된, 인간 FcRn 트랜스제닉 마우스 중의 GA2-F1331 및 GA2-F760의 혈장 항체 농도의 시간 과정을 도 135에 나타낸다.

10-3. ELISA에 의한 혈장 중 hIgA 농도의 측정

마우스 혈장 중의 hIgA 농도를 ELISA에 의해 측정하였다. 먼저, 항-인간 IgG-고정화된 플레이트를, 염소 항-인간 IgG 항체(베틸(BETHYL))를 넝크-임뮤노 플레이트, 맥시솝(날게 눙크 인터내셔널)의 각 웰에 분액하고 상기 플레이트를 4 ℃에서 밤새 정치시킴으로써 제조하였다. hIgA 표준 곡선 샘플을 0.4, 0.2, 0.1, 0.05, 0.025, 0.0125 및 0.00625 마이크로g/㎖의 혈장 농도로 표준 용액으로서 제조하고, 마우스 혈장 샘플을 100 배 이상 희석시켜 분석 샘플을 제조하였다. 각 샘플(100 마이크로L)을 200 마이크로L의 500 ng/㎖ hsIL-6R과 실온에서 1 시간 동안 혼합하고, 이어서 이를 100 마이크로L/웰로 상기 항-인간 IgA-고정화된 플레이트에 분액하였다. 상기 생성 플레이트를 실온에서 1 시간 동안 정치시켰다. 이어서 비오틴화된 항-인간 IL-6R 항체(R&D)를 상기 플레이트의 각 웰에 가한 후에, 상기 플레이트를 실온에서 1 시간 동안 배양하였다. 이어서, 스트렙트아비딘-폴리HRP80(스테레오스페시픽 디텍션 테크놀로지스)을 상기 플레이트의 각 웰에 가한 후에, 상기 플레이트를 실온에서 1 시간 동안 배양하였다. 기질로서 TMP 원 컴포넌트 HRP 마이크로웰 서브스트레이트(BioFX 레보라토리즈)를 사용한 발색 반응을 1N 황산(쇼와 케미칼)으로 정지시키고 이어서 각 웰 중의 반응 혼합물을 마이크로플레이트 판독기를 사용하여 450 ㎚에서의 흡광도에 대해 측정하였다. 마우스 혈장 중의 농도를 분석 소프트웨어 SOFTmax PRO(몰레큘라 디바이시즈)를 사용하여 상기 표준 곡선의 흡광도로부터 계산하였다. 상술한 방법에 의해 측정된, 정맥 내 투여 후의 인간 FcRn 트랜스제닉 마우스 중의 혈장 hIgA 농도의 시간 과정을 도 136에 나타낸다.

상기 결과는 hIgA의 제거가, hIgA를 인간 FcRn에 대해 매우 약한 친화성을 갖는 GA2-F760과 함께 투여했을 때에 비해, 강한 인간 FcRn 결합을 나타내는 항체인 GA2-F1331과 함께 투여했을 때 현저하게 촉진됨을 보였다.

[실시예 11] pH-의존성 항-IgE 항체의 제조

11-1. 항-인간 IgE 항체의 제조

pH-의존성 항-인간 IgE 항체를 제조하기 위해서, 항원으로서 인간 IgE(중쇄 서열번호 18; 경쇄 서열번호 19)(가변 영역은 항-인간 글리피칸3 항체로부터 유래된다)를 프리스타일293(라이프 테크놀로지스)을 사용하여 발현시켰다. 인간 IgE를, 상기 발현된 인간 IgE를 당해 분야의 숙련가들에게 공지된 통상적인 크로마토그래피 방법을 사용하여 정제시킴으로써 제조하였다.

pH-의존적인 방식으로 인간 IgE에 결합하는 항체를 다수의 수득된 항체로부터 선택하였다. 상기 선택된 항-인간 IgE 항체를 인간 IgG1 중쇄 불변 영역 및 인간 경쇄 불변 영역을 사용하여 발현시키고 이어서 정제시켰다. 상기 생성된 항체를 클론 278(중쇄 서열번호 20; 경쇄 서열번호 21)로 명명하였다.

11-2. 결합 활성 및 pH-의존성 결합 활성에 대한 항-인간 IgE 항체의 평가

엔도솜 내에서 항원으로부터 해리될 수 있는 항체를, pH-의존적인 방식으로 항원에 결합하도록 설계함에 의해서 뿐만 아니라 Ca-의존적인 방식으로 항원에 결합하도록 설계함으로써 생성시킬 수 있다. 따라서, pH/Ca에 의존하지 않는 IgE-결합 활성을 갖는 클론 278 및 대조용 엑솔레어(Xolair)(오말리주맵; 노바티스)를 인간 IgE(hIgE)-결합 활성의 pH 의존성 및 pH/Ca 의존성에 대해 평가하였다.

보다 구체적으로, 상기 클론 278 및 엑솔레어의 hIgE-결합 활성(해리 상수 K_D(M))을 비아코어 T200(GE 헬쓰케어)을 사용하여 평가하였다. 상기 분석에 사용된 실행 완충제는 하기와 같다:

1.2 mmol/l CaCl₂ /0.05% 트윈20, 20 mmol/l ACES, 150 mmol/l NaCl, pH 7.4; 1.2 mmol/l CaCl₂ /0.05% 트윈20, 20 mmol/l ACES, 150 mmol/l NaCl, pH 5.8; 및 3 마이크로몰/l CaCl₂ /0.05% 트윈20, 20 mmol/l ACES, 150 mmol/l NaCl, pH 5.8.

C-말단 Lys가 비오틴화된 인간 글리피칸 3 단백질-유래된 서열(서열번호 22)을 갖는 화학 합성된 펩타이드(이후부터 "비오틴화된 GPC3 펩타이드"라 약기함)를, 비오틴과 스트렙트아비딘 간의 친화성을 근거로 센서 칩 SA(GE 헬쓰케어) 상에 적합한 양으로 가하여 고정화시켰다. 인간 IgE를 상기 비오틴화된 GPC3 펩타이드에 의해 포착되도록 적합한 농도로 주사함으로써 상기 칩 상에 고정화시켰다. 분석물로서, 클론 278을 적합한 농도로 주사하고 상기 센서 칩 상의 인간 IgE와 상호작용시켰다. 이어서, 10 mmol/L 글리신-HCl(pH 1.5)을 주사하여 상기 센서 칩을 재생시켰다. 상기 상호작용을 항상 37 ℃에서 측정하였다. 상기 측정 결과를 비아코어 T200 평가 소프트웨어(GE 헬쓰케어)를 사용하여 곡선 정합에 의해 분석하여 결합속도 상수 ka(1/Ms) 및 해리속도 상수 kd(1/s)를 계산하였다. 상기 해리 상수 K_D(M)를 상술한 상수들로부터 계산하였다. 더욱 또한, [pH 5.8, 1.2 mM Ca] 대 [pH 7.4, 1.2 mM Ca]의 조건 하에서 각 항체에서의 KD 비를 계산하여 상기 pH-의존성 결합을 평가한 반면, [pH 5.8, 3 마이크로M Ca] 대 [pH 7.4, 1.2 mM Ca]의 조건 하에서 각 항체 중의 KD 비를 계산하여 pH/Ca-의존성 결합을 평가하였다. 결과를 표 30에 나타낸다.

[실시예 12] 생체 내 시험을 위한 인간 IgE에 결합하는 변형된 Fc 영역을 갖는 항체의 제조

이어서, 혈장으로부터 항원(인간 IgE) 제거에 대한 FcRn 결합의 영향을 평가하기 위해서, 278-F760(중쇄 서열번호 23; 경쇄 서열번호 21)을 Fc감마R에 대한 결합을 제거하도록 제조하였다. 더욱 또한 278-F1331(중쇄 서열번호 24; 경쇄 서열번호 21)을, 278-F760에 아미노산 치환 G236R, M252Y, S254T, T256E, N434Y, Y436V, Q438R 및 S440E를 도입시킴으로써 제조하였으며, 이는 pH 7.4에서 278-F760보다 강하게 FcRn에 결합한다. 상기 변형된 항체를 당해 분야의 숙련가들에게 공지된 방법에 의해 278-F1331(중쇄 서열 24; 경쇄 서열 21) 및 278-F760(중쇄 서열 23; 경쇄 서열 21)을 암호화하는 DNA 서열이 삽입된 동물 발현 플라스미드를 사용하여 상술한 방법에 의해 발현시켰다. 상기 항체 농도를 정제 후에 측정하였다.

[실시예 13] 클론 278의 생체 내 평가

13-1. 생체 내 평가를 위한 인간 IgE(hIgE(Asp6))의 제조

중쇄(서열번호 25) 및 경쇄(서열번호 19)로 이루어진 생체 내 평가를 위한 인간 IgE인 hIgE(Asp6)(가변 영역은 항-인간 글리피칸 3 항체로부터 유래된다)을 실시예 11에 개시된 바와 동일한 방법에 의해 생성시켰다. hIgE(Asp6)은, 인간 IgE의 N-결합된 당 쇄에서의 이종성이 항원으로서 인간 IgE의 혈장 농도의 시간-의존적인 변화에 의해 영향을 받지 않도록 인간 IgE 중의 6 개의 N-결합된 글리코실화 부위에서 아스파라긴에서 아스파트산으로의 변경으로부터 생성되는 변형된 분자이다.

13-2. 인간 FcRn 트랜스제닉 마우스를 사용한 인간 IgE 제거를 촉진하는 효과에 대한 클론 278의 평가

hIgE(Asp6) 및 항-인간 IgE 항체의 약동학을, hIgE(Asp6)을 항-hIgE 항체(278-F760 및 278-F1331) 및 상로포어(인간 정상 면역글로불린, CSL 베링)와 함께 인간 FcRn 트랜스제닉 마우스(B6.mFcRn-/-.hFcRn Tg 계열 32 +/+ 마우스, 잭슨 레보라토리즈; 문헌[Methods Mol Biol. (2010) 602: 93-104])에게 투여한 후에 평가하였다. hIgE(Asp6), 항-인간 IgE 항체 및 상로포어의 혼합물(농도들을 표 31에 나타낸다)을 꼬리 정맥을 통해 10 ㎖/㎏의 용량으로 1 회 투여하였다. 상술한 조건 하에서, hIgE(Asp6)은 각각의 항체가 hIgE(Asp6)에 비해 충분히 과잉으로 존재하기 때문에 상기 항체에 거의 완전히 결합할 것으로 예측된다. 투여 후 5 분, 2 시간, 7 시간, 하루, 2일, 4일 또는 5일, 7일, 14일, 21일, 및 28일째에 상기 마우스로부터 채혈하였다. 상기 채혈된 혈액을 15,000 rpm 및 4 ℃에서 5 분간 즉시 원심분리시켜 혈장을 수득하였다. 상기 분리된 혈장을 측정시까지 -20 ℃ 이하에서 냉장고에 보관하였다.

13-3. 인간 FcRn 트랜스제닉 마우스 중의 혈장 항-인간 IgE 항체 농도의 측정

마우스 혈장 중의 항-hIgE 항체 농도를 전기화학발광(ECL) 분석에 의해 측정하였다. 표준 곡선 샘플을 32, 16, 8, 4, 2, 1, 0.5 및 0.25 마이크로그램/㎖의 혈장 농도로 제조하였다. 상기 표준 곡선 샘플 및 마우스 혈장 분석 샘플을 hIgE(Asp6)가 고정화된 ECL 플레이트에 분액하였다. 상기 플레이트를 4 ℃에서 밤새 정치시켰다. 이어서, SULFO-TAG 표지된 항 토끼 항체(염소)(메소 스케일 디스커버리)를 실온에서 1 시간 동안 반응시켰다. 리드 완충제 T(x4)(메소 스케일 디스커버리)를 분배한 직후에, 섹터 이미저 2400 판독기(메소 스케일 디스커버리)에 의해 상기 측정을 수행하였다. 마우스 혈장 중의 농도를 분석 소프트웨어 SOFTmax PRO(몰레큘라 디바이시즈)를 사용하여 상기 표준 곡선의 반응으로부터 계산하였다. 상술한 방법에 의해 측정된, 정맥 내 투여 후 혈장 항체 농도의 시간 과정을 도 137에 도시한다.

13-4. 인간 FcRn 트랜스제닉 마우스에서 혈장 hIgE(Asp6) 농도의 측정

마우스 혈장 중의 hIgE(Asp6) 농도를 ELISA에 의해 측정하였다. 표준 곡선 샘플을 192, 96, 48, 24, 12, 6, 및 3 ng/㎖의 혈장 농도로 제조하였다. 엑솔레어(노바티스)를 10 마이크로그램/㎖로 상기 표준 곡선 샘플 및 마우스 혈장 분석 샘플에 가하여 hIgE(Asp6) 및 항-hIgE 항체의 면역 복합체를 균등화하였다. 실온에서 30 분의 배양 후에, 상기 표준 곡선 샘플 및 마우스 혈장 분석 샘플을 항-인간 IgE 항체가 고정화된 면역플레이트(MABTECH) 또는 항-인간 IgE 항체(클론 107; MABTECH)가 고정화된 면역플레이트(눙크 F96 마이크로웰 플레이트(날게 눙크 인터내셔널))에 분액하였다. 상기 플레이트를 실온에서 2 시간 동안 또는 4 ℃에서 밤새 정치시켰다. 이어서, 인간 GPC3 코어 단백질(서열번호 26), NHS-PEG4-비오틴(써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific))으로 비오틴화시킨 항-GPC 항체(추가이 파마슈티컬 캄파니 리미티드에서 제조됨), 및 스트렙트아비딘-폴리HRP80(스테레오스페시픽 디텍션 테크놀로지스)을 각각 1 시간 동안 연속적으로 반응시켰다. 기질로서 TMB 원 컴포넌트 HRP 마이크로웰 서브스트레이트(BioFx 레보라토리즈)를 사용하는 발색 반응을 1N 황산(쇼와 케미칼)으로 종결시키고, 이어서 마우스 혈장 중의 농도를, 미세플레이트 판독기를 사용하여 450 ㎚에서 흡광도를 측정하여 발색을 평가하는 방법에 의해서 또는 기질로서 슈퍼시그널(r) ELISA 피코 화학발광 기질(써모 피셔 사이언티픽)을 사용하여 발광 반응을 수행하고 상기 발광 강도를 미세플레이트 판독기로 측정하는 방법에 의해서 측정하였다. 마우스 혈장 중의 농도를 분석 소프트웨어 SOFTmax RPO(몰레큘라 디바이시즈)를 사용하여 표준 곡선의 흡광도 또는 발광 강도로부터 계산하였다. 상술한 방법에 의해 측정된, 정맥 내 투여 후 혈장 hIgE(Asp6) 농도의 시간 과정을 도 138에 도시한다.

상기 결과는 인간 IgE의 제거가, 인간 IgE를 278-F760보다 훨씬 더 강하게 인간 FcRn에 결합하는 278-F1331과 함께 투여했을 때, 현저하게 촉진됨을 보였다. 구체적으로, 상기는 IL6R 및 IgA의 경우에서 뿐만 아니라 IgE의 경우에도, FcRn에 대해 증가된 결합 활성을 갖는 pH-의존성 항원 결합 항체는 혈장으로부터 항원의 클리어런스를 촉진하고 혈장 중 항원의 농도를 감소시킬 수 있음을 입증하였다.

[비교 실시예 A1] 가용성 인간 IL-6 수용체(hsIL-6R)의 제조

항원으로서 재조합 인간 IL-6 수용체를 하기와 같이 제조하였다. 문헌[J. Immunol. 152:4958-4968(1994)]에 보고된 바와 같이 N 말단으로부터 1 번 내지 357 번 위치의 아미노산 서열을 갖는 가용성 인간 IL-6 수용체(이후부터 hsIL-6R이라 칭한다)를 구조적으로 발현하는 세포 주를 당해 분야의 숙련가들에게 공지된 방법에 의해 확립시켰다. 상기 세포를 hsIL-6R을 발현하도록 배양하였다. 상기 hsIL-6R을 2 단계, 즉 블루 세파로스 6 FF 컬럼 크로마토그래피 및 젤 여과 크로마토그래피에 의해 상기 배양 상등액으로부터 정제시켰다. 최종 단계에서 주요 피크로서 용출된 분획을 최종 정제 산물로서 사용하였다.

[비교 실시예 A2] 인간 FcRn의 제조

FcRn은 FcRn 알파쇄와 베타2-마이크로글로불린의 이종이량체이다. 올리고-DNA 프라이머를 공개된 인간 FcRn 유전자 서열을 근거로 제조하였다(문헌[J Exp Med. 1994 Dec 1; 180(6): 2377-81]). 전체 유전자를 암호화하는 DNA 단편을 주형으로서 인간 cDNA(인간 태반 마라톤-레디(Marathon-Ready) cDNA, 클론테크) 및 상기 제조된 프라이머를 사용하여 PCR에 의해 제조하였다. 주형으로서 상기 수득된 DNA 단편을 사용하여, 신호 영역(Met1-Leu290)을 함유하는 세포 외 도메인을 암호화하는 DNA 단편을 PCR에 의해 증폭시키고, 포유동물 세포 발현 벡터 내에 삽입하였다. 마찬가지로, 올리고-DNA 프라이머를 공개된 인간 베타2-마이크로글로불린 유전자 서열을 근거로 제조하였다(문헌[Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99 (26): 16899-16903 (2002)]). 전체 유전자를 암호화하는 DNA 단편을 주형으로서 인간 cDNA(인간 태반 마라톤-레디 cDNA, 클론테크) 및 상기 제조된 프라이머를 사용하여 PCR에 의해 제조하였다. 주형으로서 상기 수득된 DNA 단편을 사용하여, 신호 영역(Met1-Met119)을 함유하는 전체 단백질을 암호화하는 DNA 단편을 PCR에 의해 증폭시키고, 포유동물 세포 발현 벡터 내에 삽입하였다.

가용성 인간 FcRn을 하기 과정에 의해 발현시켰다. 인간 FcRn 알파쇄(서열번호 27) 및 베타2-마이크로글로불린(서열번호 28)을 발현시키기 위해 제작된 플라스미드를 PEI(폴리사이언스(Polyscience))를 사용하여 리포펙션 방법에 의해 인간 태아 신장암-유래된 세포 주 HEK293H(인비트로젠)의 세포에 도입시켰다. 생성된 배양 상등액을 수거하고, FcRn을 IgG 세파로스 6 패스프 플로우(애머샴 바이오사이언스)를 사용하여 정제시킨 다음, 하이트랩(HiTrap) Q HP(GE 헬쓰케어)를 사용하여 추가로 정제시켰다(문헌[J Immunol. 2002 Nov 1; 169(9): 5171-80]).

[비교 실시예 A3] 인간 IgA(hIgA)의 제조

H(WT)-IgA1(서열번호 12) 및 L(WT)(서열번호 13)를 포함하는 hIgA를 r프로테인 L-아가로스(ACTIgen)를 사용하여 당해 분야의 숙련가들에게 공지된 방법에 의해 발현 및 정제시킨 다음 젤 여과 크로마토그래피를 수행하였다.

[비교 실시예 A4] 가용성 인간 플렉신 A1(hs 플렉신 A1)의 제조

항원으로서 재조합 가용성 인간 플렉신 A1(이후부터 hs 플렉신 A1이라 칭함)을 하기와 같이 제조하였다. hs 플렉신 A1을 NCBI 비교 서열(NP_115618)을 참조하여 제작하였다. 특히, hs 플렉신 A1은 상기 언급한 NCBI 비교로부터 27 번 내지 1243 번 위치의 아미노산 서열로 구성되었다. FLAG-태그(DYKDDDDK, 서열번호 29)가 그의 C 말단에 연결되었다. hs 플렉신 A1을 프리스타일293(인비트로젠)을 사용하여 일시적으로 발현시키고 2 단계, 즉 항-FLAG 컬럼 크로마토그래피 및 젤 여과 크로마토그래피에 의해 배양 상등액으로부터 정제시켰다. 최종 단계에서 주요 피크로서 용출된 분획을 최종 정제 산물로서 사용하였다.

산업상 이용 가능성

가용성 항원을 표적화하는 통상적인 항체가 환자에게 투여될 때, 상기 항원은 상기 항체에 결합하고 혈장 중에서 안정하게 지속된다. 항체에 결합된 항원은 항원 단독보다는 현저하게 더 긴 반감기를 갖기 때문에, 상기 항원 농도는 통상적인 항체의 주사 후에 기준선으로부터 전체 혈장 항원 농도의 대략 10 내지 1000 배까지 증가한다. 상기와 같은 전체 혈장 항원 농도의 증가는, 상기 전체 혈장 항원 농도의 실질적인 증가가 발생하지 않은 경우에 비해, 상기 항체 농도(투여량)가 필요한 경우보다 10 내지 1000 배 더 높아야 하기 때문에 치료 항체에 바람직하지 못하다. 따라서, 상기 필요한 투여량이 통상적인 항체에 필요한 경우보다 10 내지 1000 배 더 낮을 것이기 때문에, 혈장으로부터 항원을 제거하고 또한 통상적인 항체에 비해 전체 혈장 항원 농도를 감소시키는 항체가 대단히 귀중하다.

본 발명자들은 중성 pH에서 FcRn에 대해 증대된 친화성을 갖는 변형된 FcRn-결합 도메인 및 낮은 면역원성, 높은 안정성을 갖고 단지 약간의 응집체만을 형성하는 상기 FcRn-결합 도메인을 포함하는 항원-결합 분자에 대한 예의 연구를 수행하였다. 그 결과, 상기 FcRn-결합 도메인의 특정 위치에서의 치환이, 상기 면역원성 및 고분자량 종의 비의 실질적인 증가 없이, 및 상기 FcRn-결합 도메인을 포함하는 항원-결합 분자의 안정성의 실질적인 감소 없이 중성 pH에서 상기 FcRn에 대한 친화성을 증가시킴을 발견하였다. 본 발명의 FcRn-결합 도메인을 포함하는 항원-결합 분자는 상기 혈장 항원 농도의 감소를 촉진함에 있어서 약동학적으로 우수하며 낮은 면역원성, 높은 안정성 및 매우 적은 응집체의 개발성 기준을 충족시킨다.

더욱 또한, 중성 또는 산성 pH에서 FcRn에 대한 결합 친화성을 증가시키는 Fc-조작은 앤도솜 재순환 효율 및 항체의 약동학을 개선시킬 수 있다. 그러나, 항체의 아미노산 서열의 변형(예를 들어 아미노산 치환 및 삽입)이 또한 상기 치료 항체의 면역원성을 증가시킬 수 있고, 이는 차례로 항-약물 항체(ADA)의 사이토킨 습격 및/또는 생산을 발생시킬 수 있다.

본 발명자들은 중성 pH 또는 산성 pH에서 FcRn에 대한 친화성을 증가시킨 상기 FcRn-결합 도메인 중의 치환으로 인해 중성 pH에서 기존 항-약물 항체(ADA)에 대한 결합 활성이 증가한 변형된 FcRn-결합 도메인을 포함하는 항원-결합 분자에 대해 예의 연구를 수행하였다. 그 결과, 상기 FcRn-결합 도메인의 특정 위치에서의 다른 치환들이 각각의 pH 범위에서 상기 증가된 FcRn-결합 활성을 높은 정도로 유지시키면서 중성 pH에서 기존 항-약물 항체(ADA)에 대한 결합 활성을 감소시킴을 발견하였다. 본 발명의 항원-결합 분자는 항체 클리어런스를 증가시키지 않으면서 혈장 항원 농도의 감소를 촉진함에 있어서 약동학적으로 우수하다.

SEQUENCE LISTING <110> CHUGAI SEIYAKU KABUSHIKI KAISHA <120> THERAPEUTIC ANTIGEN-BINDING MOLECULE WITH A FcRn-BINDING DOMAIN THAT PROMOTES ANTIGEN CLEARANCE <130> C1-A1112Y1P <150> JP 2011-218736 <151> 2011-09-30 <150> JP 2012-139211 <151> 2012-06-20 <150> PCT/JP2012/058603 <151> 2012-03-30 <150> JP 2012-123781 <151> 2012-05-30 <150> JP 2012-123773 <151> 2012-05-30 <150> JP 2012-177311 <151> 2012-08-09 <150> JP 2012-123782 <151> 2012-05-30 <160> 29 <170> PatentIn version 3.4 <210> 1 <211> 447 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> An artificially synthesized peptide sequence <400> 1 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Ser Gly His Ser Ile Ser His Asp 20 25 30 His Ala Trp Ser Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Glu Gly Leu Glu Trp 35 40 45 Ile Gly Phe Ile Ser Tyr Ser Gly Ile Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala 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<213> Artificial Sequence <220> <223> An artificially synthesized peptide sequence <400> 20 Gln Ser Leu Glu Glu Ser Gly Gly Arg Leu Val Thr Pro Gly Thr Pro 1 5 10 15 Leu Thr Leu Thr Cys Thr Ala Ser Gly Phe Ser Leu Ser Ser Tyr His 20 25 30 Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly 35 40 45 Val Ile Asn Ser Ala Gly Asn Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala Lys Gly 50 55 60 Arg Phe Thr Val Ser Lys Thr Ser Thr Thr Val Asp Leu Asn Leu Thr 65 70 75 80 Ser Leu Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala Arg Tyr Val 85 90 95 Phe Ser Ser Gly Ser His Asp Ile Trp Gly Pro Gly Thr Leu Val Thr 100 105 110 Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro 115 120 125 Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val 130 135 140 Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala 145 150 155 160 Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly 165 170 175 Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly 180 185 190 Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys 195 200 205 Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys 210 215 220 Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu 225 230 235 240 Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu 245 250 255 Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys 260 265 270 Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys 275 280 285 Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu 290 295 300 Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys 305 310 315 320 Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys 325 330 335 Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser 340 345 350 Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys 355 360 365 Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln 370 375 380 Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly 385 390 395 400 Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln 405 410 415 Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn 420 425 430 His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro 435 440 <210> 21 <211> 217 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> An artificially synthesized peptide sequence <400> 21 Ala Tyr Asp Met Thr Gln Thr Pro Ala Ser Val Glu Val Ala Val Gly 1 5 10 15 Gly Thr Val Thr Ile Lys Cys Gln Ala Ser Gln Ser Ile Gly Ser Trp 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Glu Leu Ile 35 40 45 Tyr Gly Thr Ser Thr Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ile Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Gly Val Glu Cys 65 70 75 80 Ala Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Tyr Ser Glu Asp Asn 85 90 95 Ile Asp Asn Ala Phe Gly Gly Gly Thr Glu Val Val Val Lys Arg Thr 100 105 110 Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu 115 120 125 Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro 130 135 140 Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly 145 150 155 160 Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr 165 170 175 Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His 180 185 190 Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val 195 200 205 Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 215 <210> 22 <211> 32 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> An artificially synthesized peptide sequence <400> 22 Val Asp Asp Ala Pro Gly Asn Ser Gln Gln Ala Thr Pro Lys Asp Asn 1 5 10 15 Glu Ile Ser Thr Phe His Asn Leu Gly Asn Val His Ser Pro Leu Lys 20 25 30 <210> 23 <211> 443 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> An artificially synthesized peptide sequence <400> 23 Gln Ser Leu Glu Glu Ser Gly Gly Arg Leu Val Thr Pro Gly Thr Pro 1 5 10 15 Leu Thr Leu Thr Cys Thr Ala Ser Gly Phe Ser Leu Ser Ser Tyr His 20 25 30 Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly 35 40 45 Val Ile Asn Ser Ala Gly Asn Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala Lys Gly 50 55 60 Arg Phe Thr Val Ser Lys Thr Ser Thr Thr Val Asp Leu Asn Leu Thr 65 70 75 80 Ser Leu Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala Arg Tyr Val 85 90 95 Phe Ser Ser Gly Ser His Asp Ile Trp Gly Pro Gly Thr Leu Val Thr 100 105 110 Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro 115 120 125 Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val 130 135 140 Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala 145 150 155 160 Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly 165 170 175 Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly 180 185 190 Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys 195 200 205 Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys 210 215 220 Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Arg Gly Gly Pro Lys Val Phe Leu 225 230 235 240 Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu 245 250 255 Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys 260 265 270 Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys 275 280 285 Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu 290 295 300 Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys 305 310 315 320 Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys 325 330 335 Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser 340 345 350 Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys 355 360 365 Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln 370 375 380 Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly 385 390 395 400 Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln 405 410 415 Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn 420 425 430 His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro 435 440 <210> 24 <211> 443 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> An artificially synthesized peptide sequence <400> 24 Gln Ser Leu Glu Glu Ser Gly Gly Arg Leu Val Thr Pro Gly Thr Pro 1 5 10 15 Leu Thr Leu Thr Cys Thr Ala Ser Gly Phe Ser Leu Ser Ser Tyr His 20 25 30 Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly 35 40 45 Val Ile Asn Ser Ala Gly Asn Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala Lys Gly 50 55 60 Arg Phe Thr Val Ser Lys Thr Ser Thr Thr Val Asp Leu Asn Leu Thr 65 70 75 80 Ser Leu Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala Arg Tyr Val 85 90 95 Phe Ser Ser Gly Ser His Asp Ile Trp Gly Pro Gly Thr Leu Val Thr 100 105 110 Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro 115 120 125 Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val 130 135 140 Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala 145 150 155 160 Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly 165 170 175 Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly 180 185 190 Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys 195 200 205 Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys 210 215 220 Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Arg Arg Gly Pro Lys Val Phe Leu 225 230 235 240 Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Tyr Ile Thr Arg Glu Pro Glu 245 250 255 Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys 260 265 270 Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys 275 280 285 Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu 290 295 300 Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys 305 310 315 320 Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys 325 330 335 Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser 340 345 350 Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys 355 360 365 Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln 370 375 380 Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly 385 390 395 400 Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln 405 410 415 Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Tyr 420 425 430 His Val Thr Arg Lys Glu Leu Ser Leu Ser Pro 435 440 <210> 25 <211> 543 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> An artificially synthesized peptide sequence <400> 25 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 Glu Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Ala Leu Asp Pro Lys Thr Gly Asp Thr Ala Tyr Ser Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Val Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Thr Arg Phe Tyr Ser Tyr Thr Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr 100 105 110 Val Ser Ser Ala Ser Thr Gln Ser Pro Ser Val Phe Pro Leu Thr Arg 115 120 125 Cys Cys Lys Asn Ile Pro Ser Asp Ala Thr Ser Val Thr Leu Gly Cys 130 135 140 Leu Ala Thr Gly Tyr Phe Pro Glu Pro Val Met Val Thr Trp Asp Thr 145 150 155 160 Gly Ser Leu Asp Gly Thr Thr Met Thr Leu Pro Ala Thr Thr Leu Thr 165 170 175 Leu Ser Gly His Tyr Ala Thr Ile Ser Leu Leu Thr Val Ser Gly Ala 180 185 190 Trp Ala Lys Gln Met Phe Thr Cys Arg Val Ala His Thr Pro Ser Ser 195 200 205 Thr Asp Trp Val Asp Asp Lys Thr Phe Ser Val Cys Ser Arg Asp Phe 210 215 220 Thr Pro Pro Thr Val Lys Ile Leu Gln Ser Ser Cys Asp Gly Gly Gly 225 230 235 240 His Phe Pro Pro Thr Ile Gln Leu Leu Cys Leu Val Ser Gly Tyr Thr 245 250 255 Pro Gly Thr Ile Asp Ile Thr Trp Leu Glu Asp Gly Gln Val Met Asp 260 265 270 Val Asp Leu Ser Thr Ala Ser Thr Thr Gln Glu Gly Glu Leu Ala Ser 275 280 285 Thr Gln Ser Glu Leu Thr Leu Ser Gln Lys His Trp Leu Ser Asp Arg 290 295 300 Thr Tyr Thr Cys Gln Val Thr Tyr Gln Gly His Thr Phe Glu Asp Ser 305 310 315 320 Thr Lys Lys Cys Ala Asp Ser Asn Pro Arg Gly Val Ser Ala Tyr Leu 325 330 335 Ser Arg Pro Ser Pro Phe Asp Leu Phe Ile Arg Lys Ser Pro Thr Ile 340 345 350 Thr Cys Leu Val Val Asp Leu Ala Pro Ser Lys Gly Thr Val Asp Leu 355 360 365 Thr Trp Ser Arg Ala Ser Gly Lys Pro Val Asp His Ser Thr Arg Lys 370 375 380 Glu Glu Lys Gln Arg Asn Gly Thr Leu Thr Val Thr Ser Thr Leu Pro 385 390 395 400 Val Gly Thr Arg Asp Trp Ile Glu Gly Glu Thr Tyr Gln Cys Arg Val 405 410 415 Thr His Pro His Leu Pro Arg Ala Leu Met Arg Ser Thr Thr Lys Thr 420 425 430 Ser Gly Pro Arg Ala Ala Pro Glu Val Tyr Ala Phe Ala Thr Pro Glu 435 440 445 Trp Pro Gly Ser Arg Asp Lys Arg Thr Leu Ala Cys Leu Ile Gln Asn 450 455 460 Phe Met Pro Glu Asp Ile Ser Val Gln Trp Leu His Asn Glu Val Gln 465 470 475 480 Leu Pro Asp Ala Arg His Ser Thr Thr Gln Pro Arg Lys Thr Lys Gly 485 490 495 Ser Gly Phe Phe Val Phe Ser Arg Leu Glu Val Thr Arg Ala Glu Trp 500 505 510 Glu Gln Lys Asp Glu Phe Ile Cys Arg Ala Val His Glu Ala Ala Ser 515 520 525 Pro Ser Gln Thr Val Gln Arg Ala Val Ser Val Asn Pro Gly Lys 530 535 540 <210> 26 <211> 545 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 26 Gln Pro Pro Pro Pro Pro Pro Asp Ala Thr Cys His Gln Val Arg Ser 1 5 10 15 Phe Phe Gln Arg Leu Gln Pro Gly Leu Lys Trp Val Pro Glu Thr Pro 20 25 30 Val Pro Gly Ser Asp Leu Gln Val Cys Leu Pro Lys Gly Pro Thr Cys 35 40 45 Cys Ser Arg Lys Met Glu Glu Lys Tyr Gln Leu Thr Ala Arg Leu Asn 50 55 60 Met Glu Gln Leu Leu Gln Ser Ala Ser Met Glu Leu Lys Phe Leu Ile 65 70 75 80 Ile Gln Asn Ala Ala Val Phe Gln Glu Ala Phe Glu Ile Val Val Arg 85 90 95 His Ala Lys Asn Tyr Thr Asn Ala Met Phe Lys Asn Asn Tyr Pro Ser 100 105 110 Leu Thr Pro Gln Ala Phe Glu Phe Val Gly Glu Phe Phe Thr Asp Val 115 120 125 Ser Leu Tyr Ile Leu Gly Ser Asp Ile Asn Val Asp Asp Met Val Asn 130 135 140 Glu Leu Phe Asp Ser Leu Phe Pro Val Ile Tyr Thr Gln Leu Met Asn 145 150 155 160 Pro Gly Leu Pro Asp Ser Ala Leu Asp Ile Asn Glu Cys Leu Arg Gly 165 170 175 Ala Arg Arg Asp Leu Lys Val Phe Gly Asn Phe Pro Lys Leu Ile Met 180 185 190 Thr Gln Val Ser Lys Ser Leu Gln Val Thr Arg Ile Phe Leu Gln Ala 195 200 205 Leu Asn Leu Gly Ile Glu Val Ile Asn Thr Thr Asp His Leu Lys Phe 210 215 220 Ser Lys Asp Cys Gly Arg Met Leu Thr Arg Met Trp Tyr Cys Ser Tyr 225 230 235 240 Cys Gln Gly Leu Met Met Val Lys Pro Cys Gly Gly Tyr Cys Asn Val 245 250 255 Val Met Gln Gly Cys Met Ala Gly Val Val Glu Ile Asp Lys Tyr Trp 260 265 270 Arg Glu Tyr Ile Leu Ser Leu Glu Glu Leu Val Asn Gly Met Tyr Arg 275 280 285 Ile Tyr Asp Met Glu Asn Val Leu Leu Gly Leu Phe Ser Thr Ile His 290 295 300 Asp Ser Ile Gln Tyr Val Gln Lys Asn Ala Gly Lys Leu Thr Thr Thr 305 310 315 320 Ile Gly Lys Leu Cys Ala His Ser Gln Gln Arg Gln Tyr Arg Ser Ala 325 330 335 Tyr Tyr Pro Glu Asp Leu Phe Ile Asp Lys Lys Val Leu Lys Val Ala 340 345 350 His Val Glu His Glu Glu Thr Leu Ser Ser Arg Arg Arg Glu Leu Ile 355 360 365 Gln Lys Leu Lys Ser Phe Ile Ser Phe Tyr Ser Ala Leu Pro Gly Tyr 370 375 380 Ile Cys Ser His Ser Pro Val Ala Glu Asn Asp Thr Leu Cys Trp Asn 385 390 395 400 Gly Gln Glu Leu Val Glu Arg Tyr Ser Gln Lys Ala Ala Arg Asn Gly 405 410 415 Met Lys Asn Gln Phe Asn Leu His Glu Leu Lys Met Lys Gly Pro Glu 420 425 430 Pro Val Val Ser Gln Ile Ile Asp Lys Leu Lys His Ile Asn Gln Leu 435 440 445 Leu Arg Thr Met Ser Met Pro Lys Gly Arg Val Leu Asp Lys Asn Leu 450 455 460 Asp Glu Glu Gly Phe Glu Ala Gly Asp Cys Gly Asp Asp Glu Asp Glu 465 470 475 480 Cys Ile Gly Gly Ala Gly Asp Gly Met Ile Lys Val Lys Asn Gln Leu 485 490 495 Arg Phe Leu Ala Glu Leu Ala Tyr Asp Leu Asp Val Asp Asp Ala Pro 500 505 510 Gly Asn Ser Gln Gln Ala Thr Pro Lys Asp Asn Glu Ile Ser Thr Phe 515 520 525 His Asn Leu Gly Asn Val His Ser Pro Leu Lys His His His His His 530 535 540 His 545 <210> 27 <211> 365 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 27 Met Gly Val Pro Arg Pro Gln Pro Trp Ala Leu Gly Leu Leu Leu Phe 1 5 10 15 Leu Leu Pro Gly Ser Leu Gly Ala Glu Ser His Leu Ser Leu Leu Tyr 20 25 30 His Leu Thr Ala Val Ser Ser Pro Ala Pro Gly Thr Pro Ala Phe Trp 35 40 45 Val Ser Gly Trp Leu Gly Pro Gln Gln Tyr Leu Ser Tyr Asn Ser Leu 50 55 60 Arg Gly Glu Ala Glu Pro Cys Gly Ala Trp Val Trp Glu Asn Gln Val 65 70 75 80 Ser Trp Tyr Trp Glu Lys Glu Thr Thr Asp Leu Arg Ile Lys Glu Lys 85 90 95 Leu Phe Leu Glu Ala Phe Lys Ala Leu Gly Gly Lys Gly Pro Tyr Thr 100 105 110 Leu Gln Gly Leu Leu Gly Cys Glu Leu Gly Pro Asp Asn Thr Ser Val 115 120 125 Pro Thr Ala Lys Phe Ala Leu Asn Gly Glu Glu Phe Met Asn Phe Asp 130 135 140 Leu Lys Gln Gly Thr Trp Gly Gly Asp Trp Pro Glu Ala Leu Ala Ile 145 150 155 160 Ser Gln Arg Trp Gln Gln Gln Asp Lys Ala Ala Asn Lys Glu Leu Thr 165 170 175 Phe Leu Leu Phe Ser Cys Pro His Arg Leu Arg Glu His Leu Glu Arg 180 185 190 Gly Arg Gly Asn Leu Glu Trp Lys Glu Pro Pro Ser Met Arg Leu Lys 195 200 205 Ala Arg Pro Ser Ser Pro Gly Phe Ser Val Leu Thr Cys Ser Ala Phe 210 215 220 Ser Phe Tyr Pro Pro Glu Leu Gln Leu Arg Phe Leu Arg Asn Gly Leu 225 230 235 240 Ala Ala Gly Thr Gly Gln Gly Asp Phe Gly Pro Asn Ser Asp Gly Ser 245 250 255 Phe His Ala Ser Ser Ser Leu Thr Val Lys Ser Gly Asp Glu His His 260 265 270 Tyr Cys Cys Ile Val Gln His Ala Gly Leu Ala Gln Pro Leu Arg Val 275 280 285 Glu Leu Glu Ser Pro Ala Lys Ser Ser Val Leu Val Val Gly Ile Val 290 295 300 Ile Gly Val Leu Leu Leu Thr Ala Ala Ala Val Gly Gly Ala Leu Leu 305 310 315 320 Trp Arg Arg Met Arg Ser Gly Leu Pro Ala Pro Trp Ile Ser Leu Arg 325 330 335 Gly Asp Asp Thr Gly Val Leu Leu Pro Thr Pro Gly Glu Ala Gln Asp 340 345 350 Ala Asp Leu Lys Asp Val Asn Val Ile Pro Ala Thr Ala 355 360 365 <210> 28 <211> 119 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 28 Met Ser Arg Ser Val Ala Leu Ala Val Leu Ala Leu Leu Ser Leu Ser 1 5 10 15 Gly Leu Glu Ala Ile Gln Arg Thr Pro Lys Ile Gln Val Tyr Ser Arg 20 25 30 His Pro Ala Glu Asn Gly Lys Ser Asn Phe Leu Asn Cys Tyr Val Ser 35 40 45 Gly Phe His Pro Ser Asp Ile Glu Val Asp Leu Leu Lys Asn Gly Glu 50 55 60 Arg Ile Glu Lys Val Glu His Ser Asp Leu Ser Phe Ser Lys Asp Trp 65 70 75 80 Ser Phe Tyr Leu Leu Tyr Tyr Thr Glu Phe Thr Pro Thr Glu Lys Asp 85 90 95 Glu Tyr Ala Cys Arg Val Asn His Val Thr Leu Ser Gln Pro Lys Ile 100 105 110 Val Lys Trp Asp Arg Asp Met 115 <210> 29 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> An artificially synthesized peptide sequence <400> 29 Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys 1 5

Claims

변형된 FcRn-결합 도메인을 포함하는 항원-결합 분자로, 상기 변형된 FcRn-결합 도메인이 EU238, EU250, EU252, EU254, EU255, EU258, EU286, EU307, EU308, EU309, EU311, EU315, EU428, EU433, EU434, 및 EU436으로 이루어진 그룹 중에서 선택된 하나 이상의 위치에서 아미노산 치환을 포함하며, 상기 숫자가 EU 넘버링에 따른 치환의 위치를 가리키는 항원-결합 분자.
제 1 항에 있어서,
FcRn-결합 도메인이
a) EU252 및 EU434 위치에서의 아미노산의 아미노산 치환; 및
b) EU238, EU250, EU252, EU254, EU255, EU256, EU258, EU286, EU387, EU307, EU308, EU309, EU311, EU315, EU428, EU433, EU434, 및 EU436으로 이루어진 그룹 중에서 선택된 하나 이상의 위치에서의 아미노산 치환
을 갖는 항원-결합 분자.
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
변형된 FcRn-결합 도메인이
EU238 위치에서 아스파트산,
EU250 위치에서 발린,
EU252 위치에서 타이로신,
EU254 위치에서 쓰레오닌,
EU255 위치에서 류신,
EU256 위치에서 글루탐산,
EU258 위치에서 아스파트산 또는 아이소류신,
EU286 위치에서 글루탐산,
EU307 위치에서 글루타민,
EU308 위치에서 프롤린,
EU309 위치에서 글루탐산,
EU311 위치에서 알라닌 또는 히스티딘,
EU315 위치에서 아스파트산,
EU428 위치에서 아이소류신,
EU433 위치에서 알라닌, 리신, 프롤린, 아르기닌 또는 세린,
EU434 위치에서 타이로신, 또는 트립토판, 및/또는
EU436 위치에서 아이소류신, 류신, 발린, 쓰레오닌 또는 페닐알라닌
을 포함하는 항원-결합 분자.
제 2 항에 있어서,
FcRn-결합 도메인이
a) EU252, EU434, 및 EU436;
b) EU252, EU307, EU311 및 EU434;
c) EU252, EU315, 및 EU434;
d) EU252, EU308, 및 EU434;
e) EU238, EU252, 및 EU434;
f) EU252, EU434, EU307, EU311, 및 EU436; 및
g) EU252, EU387, 및 EU434
로 이루어진 그룹 중에서 선택된 하나 이상의 위치 조합에서의 아미노산의 아미노산 치환을 포함하는 항원-결합 분자.
제 4 항에 있어서,
FcRn-결합 도메인이
a) EU252 위치에서 타이로신, EU315 위치에서 아스파트산, 및 EU434 위치에서 타이로신; 또는
b) EU252 위치에서 타이로신, EU434 위치에서 타이로신, 및 EU436 위치에서 아이소류신; 또는
c) EU252 위치에서 타이로신, EU434 위치에서 타이로신, 및 EU436 위치에서 류신; 또는
d) EU252 위치에서 타이로신, EU434 위치에서 타이로신, 및 EU436 위치에서 발린; 또는
e) EU252 위치에서 타이로신, EU254 위치에서 쓰레오닌, EU434 위치에서 타이로신, 및 EU436 위치에서 아이소류신
을 포함하는 항원-결합 분자.
제 2 항에 있어서,
FcRn-결합 도메인이 3 개 이상의 위치에서의 아미노산 치환을 포함하며, 상기 3 개 이상의 위치가
a) EU252 / EU434 / EU307 / EU311 / EU286;
b) EU252 / EU434 / EU307 / EU311 / EU286 / EU254;
c) EU252 / EU434 / EU307 / EU311 / EU436;
d) EU252 / EU434 / EU307 / EU311 / EU436 / EU254;
e) EU252 / EU434 / EU307 / EU311 / EU436 / EU250;
f) EU252 / EU434 / EU308 / EU250;
g) EU252 / EU434 / EU308 / EU250 / EU436; 및
h) EU252 / EU434 / EU308 / EU250 / EU307 / EU311
로 이루어진 그룹의 조합들 중 하나인 항원-결합 분자.
제 6 항에 있어서,
FcRn-결합 도메인이
a) EU252 위치에서 타이로신, EU286 위치에서 글루탐산, EU307 위치에서 글루타민, EU 311 위치에서 알라닌 및 EU434 위치에서 타이로신; 또는
b) EU252 위치에서 타이로신, EU254 위치에서 쓰레오닌, EU286 위치에서 글루탐산, EU307 위치에서 글루타민, EU311 위치에서 알라닌 및 EU434 위치에서 타이로신; 또는
c) EU252 위치에서 타이로신, EU307 위치에서 글루타민, EU311 위치에서 알라닌, EU434 위치에서 타이로신 및 EU436 위치에서 아이소류신; 또는
d) EU252 위치에서 타이로신, EU254 위치에서 쓰레오닌, EU286 위치에서 글루탐산, EU307 위치에서 글루타민, EU311 위치에서 알라닌, EU434 위치에서 타이로신 및 EU436 위치에서 아이소류신; 또는
e) EU250 위치에서 발린, EU252 위치에서 타이로신, EU254 위치에서 쓰레오닌, EU308 위치에서 프롤린, EU434 위치에서 타이로신 및 EU436 위치에서 발린; 또는
f) EU250 위치에서 발린, EU252 위치에서 타이로신, EU307 위치에서 글루타민, EU311 위치에서 알라닌, EU434 위치에서 타이로신 및 EU436 위치에서 발린; 또는
g) EU252 위치에서 타이로신, EU307 위치에서 글루타민, EU311 위치에서 알라닌, EU434 위치에서 타이로신 및 EU436 위치에서 발린; 또는
h) EU250 위치에서 발린, EU252 위치에서 타이로신, EU308 위치에서 프롤린, 및 EU434 위치에서 타이로신; 또는
i) EU250 위치에서 발린, EU252 위치에서 타이로신, EU307 위치에서 글루타민, EU308 위치에서 프롤린, EU311 위치에서 알라닌, 및 EU434 위치에서 타이로신
을 포함하는 항원-결합 분자.
제 2 항에 있어서,
FcRn-결합 도메인이 3 개 이상의 위치에서의 아미노산 치환을 포함하며, 상기 3 개 이상의 위치가
a) EU252 및 EU434 및 EU307 및 EU311 및 EU436 및 EU286;
b) EU252 및 EU434 및 EU307 및 EU311 및 EU436 및 EU250 및 EU308;
c) EU252 및 EU434 및 EU307 및 EU311 및 EU436 및 EU250 및 EU286 및 EU308;
d) EU252 및 EU434 및 EU307 및 EU311 및 EU436 및 EU250 및 EU286 및 EU308 및 EU428
로 이루어진 그룹의 조합들 중 하나인 항원-결합 분자.
제 8 항에 있어서,
FcRn-결합 도메인이
a) EU252 위치에서 타이로신, EU286 위치에서 글루탐산, EU307 위치에서 글루타민, EU311 위치에서 알라닌, EU434 위치에서 타이로신 및 EU436 위치에서 발린; 또는
b) EU250 위치에서 발린, EU252 위치에서 타이로신, EU307 위치에서 글루타민, EU308 위치에서 프롤린, EU311 위치에서 알라닌, EU434 위치에서 타이로신, 및 EU436 위치에서 발린; 또는
c) EU250 위치에서 발린, EU252 위치에서 타이로신, EU286 위치에서 글루탐산, EU307 위치에서 글루타민, EU308 위치에서 프롤린, EU311 위치에서 알라닌, EU434 위치에서 타이로신, 및 EU436 위치에서 발린; 또는
d) EU250 위치에서 발린, EU252 위치에서 타이로신, EU286 위치에서 글루탐산, EU307 위치에서 글루타민, EU308 위치에서 프롤린, EU311 위치에서 알라닌, EU434 위치에서 타이로신, 및 EU436 위치에서 발린
을 포함하는 항원-결합 분자.
제 2 항에 있어서,
FcRn-결합 도메인이 3 개 이상의 위치에서의 아미노산 치환을 포함하고, 상기 3 개 이상의 위치가
a) EU434 및 EU307 및 EU311;
b) EU434 및 EU307 및 EU309 및 EU311; 및
c) EU434 및 EU250 및 EU252 및 EU436
로 이루어진 그룹의 조합들 중 하나인 항원-결합 분자.
제 10 항에 있어서,
FcRn-결합 도메인이
a) EU307 위치에서 글루타민, EU311 위치에서 히스티딘 및 EU434 위치에서 타이로신; 또는
b) EU307 위치에서 글루타민, EU309 위치에서 글루탐산, EU311 위치에서 알라닌 및 EU434 위치에서 타이로신; 또는
c) EU307 위치에서 글루타민, EU309 위치에서 글루탐산, EU311 위치에서 히스티딘 및 EU434 위치에서 타이로신; 또는
d) EU250 위치에서 발린; EU252 위치에서 타이로신, EU434 위치에서 타이로신 및 EU436 위치에서 발린
을 포함하는 항원-결합 분자.
제 1 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항에 있어서,
고분자량 종의 비가 2% 미만인 항원-결합 분자.
제 1 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항에 있어서,
a) pH 7 내지 8에서보다 pH 5.5 내지 6.5에서 항원에 대해 더 낮은 결합 활성 또는 b) 상기 항원에 대해 "칼슘 농도-의존성 결합" 활성을 갖는 항원-결합 도메인을 포함하는 항원-결합 분자.
제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서,
pH 7에서 FcRn에 대한 결합 분자의 결합 활성이 50 내지 150 nM이고, Tm이 63.0 ℃ 초과이고, 에피염기(Epibase) 점수가 250 미만인 항원-결합 분자.
제 1 항 내지 제 3 항, 제 6 항 및 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서,
pH 7에서 FcRn에 대한 결합 분자의 결합 활성이 15 내지 50 nM이고, Tm이 60 ℃ 초과이고, 에피염기 점수가 500 미만인 항원-결합 분자.
제 1 항 내지 제 3 항, 제 8 항 및 제 9 항 중 어느 한 항에 있어서,
pH 7에서 FcRn에 대한 결합 분자의 결합 활성이 15 nM 초과이고, Tm이 57.5 ℃ 초과이고, 에피염기 점수가 500 미만인 항원-결합 분자.
제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서,
FcRn-결합 도메인이
a) EU238, EU255 및/또는 EU258 위치, 및
b) 3 개 이상의 위치
에서의 아미노산 치환을 포함하고, 상기 3 개 이상의 위치가 표 4 내지 7에 나타낸 조합들 중 하나인 항원-결합 분자.
제 1 항 내지 제 17 항 중 어느 한 항에 있어서,
a) FcRn-결합 도메인의 EU257 위치에서 아미노산이 알라닌, 발린, 아이소류신, 류신 및 쓰레오닌으로 이루어진 그룹 중에서 선택된 아미노산이 아니고/아니거나,
b) FcRn-결합 도메인의 EU252 위치에서 아미노산이 트립토판이 아닌 항원-결합 분자.
제 1 항 내지 제 18 항 중 어느 한 항에 있어서,
본래의 FcRn-결합 도메인을 포함하는 대조용 항체의 결합 친화성에 비해 현저하게 증가되지 않은 기존의 항-약물 항체에 대한 결합 활성을 갖는 항원-결합 분자.
제 19 항에 있어서,
FcRn 결합 도메인이 EU387, EU422, EU424, EU426, EU433, EU436, EU438 및 EU440으로 이루어진 그룹 중에서 선택된 하나 이상의 위치에서의 아미노산 치환을 또한 포함하는 항원-결합 분자.
제 20 항에 있어서,
FcRn 결합 도메인이
EU387 위치에서 아르기닌
EU422 위치에서 글루탐산, 아르기닌 또는 세린, 아스파트산, 리신, 쓰레오닌 또는 글루타민;
EU424 위치에서 글루탐산 또는 아르기닌, 리신, 또는 아스파라긴;
EU426 위치에서 아스파트산, 글루타민, 알라닌 또는 타이로신;
EU433 위치에서 아스파트산;
EU436 위치에서 쓰레오닌;
EU438 위치에서 글루탐산, 아르기닌, 세린 또는 리신; 및
EU440 위치에서 글루탐산, 아스파트산 또는 글루타민
으로 이루어진 그룹 중에서 선택된 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하는 항원-결합 분자.
제 1 항 내지 제 21 항 중 어느 한 항에 있어서,
변형된 FcRn 결합 도메인이 3 개 이상의 치환을 포함하고, 상기 3 개 이상의 치환이 표 12 내지 13에 나타낸 조합들 중 하나인 항원-결합 분자.
제 1 항 내지 제 22 항 중 어느 한 항에 있어서,
변형된 FcRn 결합 도메인이 3 개 이상의 치환을 포함하고, 상기 3 개 이상의 치환이 표 14 내지 15에 나타낸 조합들 중 하나인 항원-결합 분자.
제 20 항 내지 제 23 항 중 어느 한 항에 있어서,
FcRn-결합 도메인이
a) EU252 위치에서 타이로신, EU387 위치에서 아르기닌, EU434 위치에서 타이로신, 및 EU436 위치에서 발린; 또는
b) EU252 위치에서 타이로신, EU422 위치에서 글루탐산, EU434 위치에서 타이로신, 및 EU436 위치에서 발린; 또는
c) EU252 위치에서 타이로신, EU422 위치에서 아르기닌, EU434 위치에서 타이로신, 및 EU436 위치에서 발린; 또는
d) EU252 위치에서 타이로신, EU422 위치에서 세린, EU434 위치에서 타이로신, 및 EU436 위치에서 발린; 또는
e) EU252 위치에서 타이로신, EU424 위치에서 글루탐산, EU434 위치에서 타이로신, 및 EU436 위치에서 발린; 또는
f) EU252 위치에서 타이로신, EU424 위치에서 아르기닌, EU434 위치에서 타이로신, 및 EU436 위치에서 발린; 또는
g) EU252 위치에서 타이로신, EU434 위치에서 타이로신, EU436 위치에서 발린, 및 EU438 위치에서 글루탐산; 또는
h) EU252 위치에서 타이로신, EU434 위치에서 타이로신, EU436 위치에서 발린, 및 EU438 위치에서 아르기닌; 또는
i) EU252 위치에서 타이로신, EU434 위치에서 타이로신, EU436 위치에서 발린, 및 EU438 위치에서 세린; 또는
j) EU252 위치에서 타이로신, EU434 위치에서 타이로신, EU436 위치에서 발린, 및 EU440 위치에서 글루탐산
을 포함하는 항원-결합 분자.
제 1 항 내지 제 24 항 중 어느 한 항에 있어서,
항체인 항원-결합 분자.
세포 내로의 항원-결합 분자-매개된 항원 흡수를 개선시키기 위한 제 1 항 내지 제 25 항 중 어느 한 항에 따른 항원-결합 분자의 용도.
특정 항원의 혈장 농도를 감소시키기 위한 제 1 항 내지 제 25 항 중 어느 한 항에 따른 항원-결합 분자의 용도로, 상기 항원-결합 분자가 상기 항원에 결합할 수 있는 항원-결합 도메인을 포함하는 용도.
EU238, EU250, EU252, EU254, EU255, EU258, EU286, EU307, EU308, EU309, EU311, EU315, EU428, EU433, EU434, 및 EU436으로 이루어진 그룹 중에서 선택된 위치들 중 하나 이상에서 항원-결합 분자의 FcRn-결합 도메인 내로 아미노산 치환을 도입시키는 단계를 포함하는, 상기 항원-결합 분자의 약동학을 개선시키는 방법.
EU238, EU250, EU252, EU254, EU255, EU258, EU286, EU307, EU308, EU309, EU311, EU315, EU428, EU433, EU434, 및 EU436으로 이루어진 그룹 중에서 선택된 위치들 중 하나 이상에서 항원-결합 분자의 FcRn-결합 도메인 내로 아미노산 치환을 도입시키는 단계를 포함하는, 환자에게서 항원-결합 분자의 제거를 지연시키는 방법.
EU238, EU250, EU252, EU254, EU255, EU258, EU286, EU307, EU308, EU309, EU311, EU315, EU428, EU433, EU434, 및 EU436으로 이루어진 그룹 중에서 선택된 위치들 중 하나 이상에서 항원-결합 분자의 FcRn-결합 도메인 내로 아미노산 치환을 도입시키는 단계를 포함하는, 항원-결합 분자의 혈장 체류 시간을 연장시키는 방법.
EU238, EU250, EU252, EU254, EU255, EU258, EU286, EU307, EU308, EU309, EU311, EU315, EU428, EU433, EU434, 및 EU436으로 이루어진 그룹 중에서 선택된 위치들 중 하나 이상에서 항원-결합 분자의 FcRn-결합 도메인 내로 아미노산 치환을 도입시키는 단계를 포함하는, 항원-결합 분자의 혈장 항원-제거 속도를 증가시키는 방법.
EU238, EU250, EU252, EU254, EU255, EU258, EU286, EU307, EU308, EU309, EU311, EU315, EU428, EU433, EU434, 및 EU436으로 이루어진 그룹 중에서 선택된 위치들 중 하나 이상에서 항원-결합 분자의 FcRn-결합 도메인 내로 아미노산 치환을 도입시키는 단계를 포함하는, 혈장 항원을 제거하는 항원-결합 분자의 능력을 증가시키는 방법.
제 28 항 내지 제 32 항 중 어느 한 항에 있어서,
EU256 위치에서 FcRn 결합 도메인 내로 아미노산 치환을 또한 도입시키는 방법.
제 28 항 내지 제 33 항 중 어느 한 항에 있어서,
EU387, EU422, EU424, EU426, EU433, EU436, EU438 및 EU440으로 이루어진 그룹 중에서 선택된 하나 이상의 위치에서 FcRn-결합 도메인 내로 아미노산 치환을 도입시키는 단계를 또한 포함하는 방법.
제 1 항 내지 제 25 항 중 어느 한 항에 따른 항원-결합 분자의 생성 방법으로,
(a) 모 FcRn-결합 도메인을 선택하고 EU238, EU250, EU252, EU254, EU255, EU258, EU286, EU307, EU308, EU309, EU311, EU315, EU428, EU433, EU434, 및 EU436으로 이루어진 그룹 중에서 선택된 하나 이상의 위치에서 아미노산 치환을 도입시킴으로써 상기 모 FcRn을 변경시키고;
(b) pH-의존성 항원-결합 도메인 또는 칼슘-이온 의존성 항원-결합 도메인을 획득하기 위해서 항원-결합 분자의 항원-결합 도메인을 선택하고 상기 항원-결합 도메인 중의 하나 이상의 아미노산을 변경시키고;
(c) (a) 및 (b)에서 제조된 인간 FcRn-결합 도메인 및 항원-결합 도메인이 결합된 항원-결합 분자를 암호화하는 유전자를 수득하고;
(d) (c)에서 제조된 유전자를 사용하여 항원-결합 분자를 생성시키는
단계들을 포함하는 방법.
제 35 항에 있어서,
단계 a)에서 EU256 위치에서 FcRn 결합 도메인 내로 아미노산 치환을 또한 도입시키는 방법.
제 35 항 또는 제 36 항에 있어서,
EU387, EU422, EU424, EU426, EU433, EU436, EU438 및 EU440으로 이루어진 그룹 중에서 선택된 하나 이상의 위치에서 FcRn-결합 도메인 내로 아미노산 치환을 도입시키는 단계를 또한 포함하는 방법.
변형된 FcRn 결합 도메인을 포함하는 항원-결합 분자로, 상기 변형된 FcRn 결합 도메인이 EU387, EU422, EU424, EU426, EU433, EU436, EU438 및 EU440으로 이루어진 그룹 중에서 선택된 위치들 중 하나 이상에서 아미노산 치환을 포함하고, 중성 pH에서 기존의 항-약물 항체(ADA)에 대한 상기 항원-결합 분자의 결합 친화성이 본래의 FcRn 결합 도메인을 포함하는 항원-결합 분자의 결합 친화성에 비해 현저하게 증가되지 않는 항원-결합 분자.
제 38 항에 있어서,
중성 또는 산성 pH 범위에서 FcRn에 대해 증가된 결합 친화성을 또한 갖는 항원-결합 분자.
제 38 항 또는 제 39 항에 있어서,
EU387, EU422, EU424, EU426, EU433, EU436, EU438 및 EU440으로 이루어진 그룹 중에서 선택된 위치들 중 하나 이상을 치환하는 아미노산이
a) EU387 위치에서 아르기닌;
b) EU422 위치에서 글루탐산, 아르기닌, 세린, 아스파트산, 리신, 쓰레오닌 또는 글루타민;
c) EU424 위치에서 글루탐산, 아르기닌, 리신 또는 아스파라긴;
d) EU426 위치에서 아스파트산, 글루타민, 알라닌 또는 타이로신;
e) EU433 위치에서 아스파트산;
d) EU436 위치에서 쓰레오닌;
g) EU438 위치에서 글루탐산, 아르기닌, 세린 또는 리신; 및
h) EU440 위치에서 글루탐산, 아스파트산, 또는 글루타민
으로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 항원-결합 분자.
제 38 항 내지 제 40 항 중 어느 한 항에 있어서,
변형된 FcRn 결합 도메인이 표 10에 나타낸 하나 이상의 위치 또는 조합들 중 하나에서 아미노산 치환을 포함하는 항원-결합 분자.
제 38 항 내지 제 40 항 중 어느 한 항에 있어서,
변형된 FcRn 결합 도메인이 표 11에 나타낸 아미노산 치환 또는 치환 조합들 중 어느 하나를 포함하는 항원-결합 분자.
제 39 항 내지 제 42 항 중 어느 한 항에 있어서,
변형된 FcRn 결합 도메인이 EU238, EU250, EU252, EU254, EU255, EU256, EU258, EU286, EU307, EU308, EU309, EU311, EU315, EU428, EU434, 및 EU436으로 이루어진 그룹 중에서 선택된 FcRn 결합 도메인의 하나 이상의 위치에서 아미노산 치환을 또한 포함하고, 상기 치환이 중성 pH 또는 산성 pH 범위에서 FcRn 결합 활성의 증가를 부여하는 항원-결합 분자.
제 39 항 내지 제 43 항 중 어느 한 항에 있어서,
변형된 FcRn 결합 도메인이 FcRn 결합 도메인 위치
i) a) EU438 / EU440 또는 b) EU424; 및
ii) a) EU434, b) EU252/EU254/EU256; c) EU428/EU434; 또는 d) EU250/EU428
에서 아미노산 치환을 포함하는 항원-결합 분자.
제 44 항에 있어서,
변형된 FcRn 결합 도메인이 아미노산 치환
i) a) EU438R/EU440E 또는 b) EU424N; 및
ii) a) M434H; b) M252Y/S254T/T256E; c) M428L/N434S; 또는 d) T250Q 및 M428L(EU 넘버링)
을 포함하는 항원-결합 분자.
제 45 항에 있어서,
변형된 FcRn 결합 도메인이 3 개 이상의 아미노산 치환을 포함하고, 상기 3 개 이상의 치환이 표 13 및 15에 나타낸 조합들 중 하나인 항원-결합 분자.
제 39 항 내지 제 42 항 중 어느 한 항에 있어서,
변형된 FcRn 결합 도메인이
a) EU387, EU422, EU424, EU438, EU440, EU433으로 이루어진 그룹 중에서 선택된 위치들 중 하나 이상에서, 또는 2 개 이상의 위치(여기에서 상기 2 개의 위치는 EU422/EU424 및 EU438/EU440으로 이루어진 그룹의 조합들 중 하나이다)에서; 및
b) 2 개 이상의 위치(여기에서 상기 2 개의 위치는 표 9에 나타낸 조합들 중 하나이다)에서
치환을 포함하는 항원-결합 분자.
제 47 항에 있어서,
변형된 FcRn 결합 도메인이 3 개 이상의 아미노산 치환을 포함하고, 상기 3 개 이상의 아미노산 치환이 표 12 또는 14에 나타낸 조합들 중 하나인 항원-결합 분자.
제 39 항 내지 제 48 항 중 어느 한 항에 있어서,
pH-의존성 항원-결합 도메인 또는 칼슘 이온-의존성 항원-결합 도메인을 포함하는 항원-결합 분자.
중성 또는 산성 pH에서 FcRn에 대해 증가된 결합 활성 및 중성 pH에서 기존의 ADA에 대해 증가된 결합 활성을 갖는 FcRn 결합 도메인을 포함하는 항원-결합 분자의 기존의 ADA에 대한 결합 활성을 감소시키기 위한 방법으로,
a) 중성 또는 산성 pH에서 FcRn에 대해 증가된 결합 활성 및 중성 pH에서 기존의 ADA에 대해 증가된 결합 활성을 갖는 FcRn 결합 도메인을 포함하는 항원-결합 분자를 제공하고;
b) EU387, EU422, EU424, EU426, EU433, EU436, EU438 및 EU440으로 이루어진 그룹 중에서 선택된 위치들 중 하나 이상에서 상기 FcRn 결합 도메인 중의 아미노산을 치환시켜 변형된 FcRn 결합 도메인을 갖는 항원-결합 분자를 제공하는
단계들을 포함하는 방법.
제 50 항에 있어서,
단계 b)가 3 개 이상의 위치에서 아미노산을 치환시킴을 포함하고, 상기 3 개 이상의 위치가 표 10에 나타낸 조합들 중 하나인 방법.
제 50 항에 있어서,
단계 b)가 3 개 이상의 아미노산 치환을 FcRn-결합 도메인 내로 도입시킴을 포함하고, 상기 3 개 이상의 아미노산 치환이 표 11에 나타낸 조합들 중 하나인 방법.
모 항체에 비해 중성 pH에서 기존의 ADA에 대한 결합 활성을 현저하게 증가시키지 않으면서 단일의 항원-결합 분자와 결합할 수 있는 항원의 총수를 증가시키는 방법으로,
a) 모 FcRn 결합 도메인을 포함하는 항원-결합 분자를 제공하고,
b) EU238, EU250, EU252, EU254, EU255, EU256, EU258, EU286, EU307, EU308, EU309, EU311, EU315, EU428, EU433, EU434, 및 EU436으로 이루어진 그룹 중에서 선택된 위치들 중 하나 이상에서 상기 모 FcRn 결합 도메인의 아미노산 서열 중의 아미노산을 치환시킴으로써 단계 a)의 모 FcRn 결합 도메인을 변경시키고;
c) EU387, EU422, EU424, EU426, EU433, EU436, EU438 및 EU440으로 이루어진 그룹 중에서 선택된 하나 이상의 위치에서 상기 모 FcRn-결합 도메인의 아미노산 서열 중의 아미노산을 치환시킴으로써 단계 b)의 변형된 FcRn-결합 도메인을 변경시키는
단계들을 포함하는 방법.
모 항체에 비해 중성 pH에서 기존의 ADA에 대한 항원-결합 분자의 결합 활성을 현저하게 증가시키지 않으면서 항원-결합된 형태로 세포 내로 흡수된 항원-부재 항원-결합 분자의 세포외 방출을 촉진하는 방법으로,
a) 모 FcRn-결합 도메인을 포함하는 항원-결합 분자를 제공하고,
b) EU238, EU250, EU252, EU254, EU255, EU256, EU258, EU286, EU307, EU308, EU309, EU311, EU315, EU428, EU433, EU434, 및 EU436, 및 EU428로 이루어진 그룹 중에서 선택된 하나 이상의 위치에서 상기 모 FcRn-결합 도메인의 아미노산 서열 중의 아미노산을 치환시킴으로써 상기 모 FcRn 결합 도메인을 변경시키고;
c) EU387, EU422, EU424, EU426, EU433, EU436, EU438 및 EU440으로 이루어진 그룹 중에서 선택된 하나 이상의 위치에서 상기 모 FcRn-결합 도메인의 아미노산 서열 중의 아미노산을 치환시킴으로써 단계 b)의 변형된 FcRn-결합 도메인을 변경시키는
단계들을 포함하는 방법.
모 항체에 비해 중성 pH에서 기존의 ADA에 대한 결합 활성을 현저하게 증가시키지 않으면서 혈장 항원을 제거하는 항원-결합 분자의 능력을 증가시키는 방법으로,
a) 모 FcRn-결합 도메인을 포함하는 항원-결합 분자를 제공하고,
b) EU238, EU250, EU252, EU254, EU255, EU256, EU258, EU286, EU307, EU308, EU309, EU311, EU315, EU428, EU433, EU434, 및 EU436, 및 EU428로 이루어진 그룹 중에서 선택된 하나 이상의 위치에서 상기 모 FcRn-결합 도메인의 아미노산 서열 중의 아미노산을 치환시킴으로써 상기 모 FcRn 결합 도메인을 변경시키고;
c) EU387, EU422, EU424, EU426, EU433, EU436, EU438 및 EU440으로 이루어진 그룹 중에서 선택된 하나 이상의 위치에서 상기 모 FcRn-결합 도메인의 아미노산 서열 중의 아미노산을 치환시킴으로써 단계 b)의 변형된 FcRn-결합 도메인을 변경시키는
단계들을 포함하는 방법.
모 항체에 비해 중성 pH에서 기존의 ADA에 대한 결합 활성을 현저하게 증가시키지 않으면서 항원-결합 분자의 약동학을 개선시키는 방법으로,
a) 모 FcRn-결합 도메인을 포함하는 항원-결합 분자를 제공하고,
b) EU238, EU250, EU252, EU254, EU255, EU256, EU258, EU286, EU307, EU308, EU309, EU311, EU315, EU428, EU433, EU434, 및 EU436으로 이루어진 그룹 중에서 선택된 하나 이상의 위치에서 상기 모 FcRn-결합 도메인의 아미노산 서열 중의 아미노산을 치환시킴으로써 상기 모 FcRn 결합 도메인을 변경시키고;
c) EU387, EU422, EU424, EU426, EU433, EU436, EU438 및 EU440으로 이루어진 그룹 중에서 선택된 하나 이상의 위치에서 상기 모 FcRn-결합 도메인의 아미노산 서열 중의 아미노산을 치환시킴으로써 단계 b)의 변형된 FcRn-결합 도메인을 변경시키는
단계들을 포함하는 방법.
모 항체에 비해 중성 pH에서 기존의 ADA에 대한 결합 활성을 현저하게 증가시키지 않으면서 전체 또는 유리 항원 혈장 농도를 감소시키는 방법으로,
a) 모 FcRn-결합 도메인을 포함하는 항원-결합 분자를 제공하고, 여기에서 상기 항원-결합 분자가 상기 항원에 결합할 수 있는 항원-결합 도메인을 포함하며,
b) EU238, EU250, EU252, EU254, EU255, EU256, EU258, EU286, EU307, EU308, EU309, EU311, EU315, EU428, EU433, EU434, 및 EU436으로 이루어진 그룹 중에서 선택된 하나 이상의 위치에서 상기 모 FcRn-결합 도메인의 아미노산 서열 중의 아미노산을 치환시킴으로써 상기 모 FcRn 결합 도메인을 변경시키고;
c) EU387, EU422, EU424, EU426, EU433, EU436, EU438 및 EU440으로 이루어진 그룹 중에서 선택된 하나 이상의 위치에서 상기 모 FcRn-결합 도메인의 아미노산 서열 중의 아미노산을 치환시킴으로써 단계 b)의 변형된 FcRn-결합 도메인을 변경시키는
단계들을 포함하는 방법.
중성 또는 산성 pH에서 FcRn에 대해 증가된 결합 활성 및 중성 pH에서 기존 ADA에 대해 감소된 결합 활성을 갖는 FcRn 결합 도메인을 포함하는 항원-결합 분자의 생성 방법으로,
(a) 중성 또는 산성 pH 범위에서 FcRn 및 중성 pH 범위에서 기존 ADA에 대해 증가된 결합 활성을 갖는 FcRn 결합 도메인을 제공하고,
(b) EU387, EU422, EU424, EU426, EU433, EU436, EU438 및 EU440으로 이루어진 그룹 중에서 선택된 위치들 중 하나 이상에서 아미노산을 치환시키고,
(c) pH-의존성 항원-결합 도메인을 획득하기 위해서 항원-결합 분자의 항원-결합 도메인을 선택하고 상기 항원-결합 도메인 중의 하나 이상의 아미노산을 변경시키거나, 또는 칼슘-이온 의존성 항원-결합 도메인을 선택하고;
(d) (a) 및 (b)에서 제조된 인간 FcRn-결합 도메인 및 항원-결합 도메인이 결합된 항원-결합 분자를 암호화하는 유전자를 수득하고;
(e) (c)에서 제조된 유전자를 사용하여 항원-결합 분자를 생성시키는
단계들을 포함하고, 상기 생성된 항원-결합 분자가 본래의 FcRn 결합 도메인을 갖는 모 항원-결합 도메인에 비해 중성 또는 산성 pH에서 FcRn에 대해 증가된 결합 활성 및 중성 pH에서 내생적인 ADA에 대해 감소된 결합 활성을 갖는 방법.
제 58 항에 있어서,
중성 또는 산성 pH 범위에서 FcRn 및 기존의 ADA 및 중성 pH 범위에서 기존의 ADA에 대해 증가된 결합 활성을 갖는 FcRn 결합 도메인이 EU238, EU250, EU252, EU254, EU255, EU256, EU258, EU286, EU307, EU308, EU309, EU311, EU315, EU428, EU433, EU434, 및 EU436으로 이루어진 그룹 중에서 선택된 하나 이상의 위치에서 아미노산 치환을 포함하는 방법.
제 53 항 내지 제 57 항 중 어느 한 항에 있어서,
단계 a)에서 도입된 아미노산 치환이 3 개 이상의 위치에 존재하고, 상기 3 개 이상의 위치가 표 4 내지 7에 나타낸 조합들 중 하나인 방법.
제 53 항 내지 제 60 항 중 어느 한 항에 있어서,
단계 b)에서 도입된 아미노산 치환이 3 개 이상의 위치에 존재하고, 상기 3 개 이상의 위치가 표 10에 나타낸 조합들 중 하나인 방법.