BR112017014067B1

BR112017014067B1 - usos de um anticorpo receptor de il-6 para no tratamento de doenças relacionadas a il-6

Info

Publication number: BR112017014067B1
Application number: BR112017014067-5A
Authority: BR
Inventors: Takahiro Kakehi; Akinori Yamada; Yoshimasa Ishida
Original assignee: Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha
Priority date: 2015-02-27
Filing date: 2016-02-26
Publication date: 2021-01-12
Also published as: EP4269440A3; SG11201705093UA; WO2016136933A1; CN107249637A; JP6775463B2; AU2021202594B2; TWI805046B; KR20170095802A; CA2972393A1; BR112017014067A2; ES2967627T3; EP3263132A4; US20210017286A1; AU2021202594A1; KR20180095740A; JP6130983B2; US20180148509A1; TWI759261B; MX2017010858A; EP4269440A2

Abstract

A presente invenção refere-se a uma composição farmacêutica para tratar doenças relacionadas a IL-6 tendo como um ingrediente ativo um inibidor de IL-6, em que a composição farmacêutica é administrada como de costume depois de um período de dosagem de intervalo curto onde a mesma dose como a dose usual é administrada em um intervalo mais curto do que o intervalo de dosagem usual.

Description

Campo Técnico

[001] A presente invenção refere-se a composições farmacêuticas ou regime de dosagem usados para tratar doenças relacionadas a IL-6.

Antecedentes da Técnica

[002] Interleucina-6 (IL-6) é uma citocina também referida como fator 2 estimulante de célula B (BSF2) ou interferon β2. IL-6 foi descoberta como um fator de diferenciação envolvido na ativação de células linfoides B (Documento que Não de Patente 1), e foi mais tarde descoberta ser uma citocina multifuncional que afeta as funções de uma variedade de células (Documento que Não de Patente 2). IL-6 foi relatada como induzindo a maturação de células linfoides T (Documento que Não de Patente 3).

[003] IL-6 transmite sua atividade biológica por intermédio de dois tipos de proteínas nas células. Uma delas é o receptor de IL-6, que é uma proteína de ligação a ligante que tem um peso molecular de aproximadamente 80 kD à qual IL-6 se liga (Documentos que Não de Patente 4 e 5). O receptor de IL-6 existe como um receptor de IL-6 solúvel, que é principalmente composto de sua região extracelular, além de uma forma ligada à membrana expressada na membrana celular e penetra através da membrana celular.

[004] A outra é a proteína de membrana gp130, que tem um peso molecular de cerca de 130 kDa e está envolvida na transdução de sinal que não de ligação a ligante. A atividade biológica de IL-6 é transmitida em uma célula através da formação de um complexo de IL- 6/receptor de IL-6 por IL-6 e o receptor de IL-6, seguido por ligação do complexo com gp130 (Documento que Não de Patente 6).

[005] Inibidores de IL-6 são substâncias que inibem a transmissão de atividade biológica de IL-6. Até agora, anticorpos contra IL-6 (anticorpos anti-IL-6), anticorpos contra o receptor de IL-6 (anticorpos anti-receptor de IL-6), anticorpos contra gp130 (anticorpos anti-gp130), variantes de IL-6, peptídeos parciais de IL-6 ou o receptor de IL-6, e deste mesmo modo foram conhecidos.

[006] Existem vários relatos com respeito aos anticorpos anti receptor de IL-6 (Documentos que Não de Patente 7 e 8, e Documentos de Patente 1 a 3). Um deles é um anticorpo PM-1 humanizado obtido transplantando-se a região determinante de complementaridade (CDR) de anticorpo PM-1 de camundongo (Documento que Não de Patente 9) em um anticorpo humano (Documento de Patente 1).

[007] Tocilizumabe, que é um anticorpo anti-receptor de IL-6, é correntemente usado para tratar doenças inflamatórias tais como artrite reumatoide e doença de Castleman (Documento que Não de Patente 10), e o mesmo também foi confirmado como sendo eficaz para doenças tais como neuromielite óptica (NMO) (Documento que Não de Patente 11).

[008] Os efeitos terapêuticos de anticorpos de IL-6 sobre miastenia grave também foram relatados (Documento que Não de Patente 12).

[009] Anticorpos humanizados tais como tocilizumabe são produtos farmacêuticos de anticorpo de primeira geração. Produtos farmacêuticos de anticorpo segunda geração estão correntemente sendo desenvolvidos melhorando-se a eficácia do fármaco, conveniência, e custo dos produtos farmacêuticos de anticorpo de primeira geração (Documento de Patente 2). Como um anticorpo farmacêutico de segunda geração, SA237, um novo anticorpo antireceptor de IL-6, foi produzido aplicando-se tecnologias de melhoria tais como aquelas para realçar a função efetora, capacidade de ligação a antígeno, farmacocinética, e estabilidade, ou aquelas para reduzir riscos imunogênicos, e já entraram em experiências clínicas.

[010] Embora muitos tratamentos com anticorpo estejam correntemente sendo realizados, a atenuação de efeitos terapêuticos devido ao desenvolvimento de anti-anticorpos foi confirmado em alentuzumabe. De modo a impedir esta atenuação, o mesmo foi relatado como sendo eficaz para administrar um mutante que não de ligação à célula que pode ser administrado em doses altas, ao invés de induzir tolerância imunológica administrando-se uma dose alta de alentuzumabe (Documento que Não de Patente 13).

[011] Os documentos da técnica anterior relacionados à invenção deste pedido são mostrados abaixo. Documentos da Técnica Anterior [Documento que Não de Patente] [Documento que Não de Patente 1] Hirano, T. et al., Nature (1986) 324, 73 - 76 [Documento que Não de Patente 2] Akira, S. et al., Adv. in Immunology (1993) 54, 1 - 78 [Documento que Não de Patente 3] Lotz, M. et al., J. Exp. Med. (1988) 167, 1253 - 1258 [Documento que Não de Patente 4] Taga, T. et al., J. Exp. Med. (1987) 166, 967 - 981 [Documento que Não de Patente 5] Yamasaki, K. et al., Science (1988) 241, 825 - 828 [Documento que Não de Patente 6] Taga, T. et al., Cell (1989) 58, 573 - 581 [Documento que Não de Patente 7] Novick, D. et al., Hybridoma (1991) 10, 137 - 146 [Documento que Não de Patente 8] Huang, Y. W. et al., Hybridoma (1993) 12, 621 - 630 [Documento que Não de Patente 9] Hirata, Y. et al., J. Immunol. (1989) 143, 2900 - 2906 [Documento que Não de Patente 10] Nishimoto, N. et al., Blood. 15 de Out. de 2005; 106(8):2627 - 32 [Documento que Não de Patente 11] Araki et al., Mod. Rheumatol. (2013) 23(4), 827 - 831 [Documento que Não de Patente 12] Aricha, R. et al., J. Autoimmun. (2011) 36(2), 135 - 141 [Documento que Não de Patente 13] Charlotte L. et al., Nature Reviews Rheumatology (2010) 6, 558 - 559 [Documento de Patente] [Documento de Patente 1] Publicação do Pedido de Patente Internacional No WO 92-19759 [Documento de Patente 2] Publicação do Pedido de Patente Internacional No WO 2010/035769

Sumário da Invenção [Problemas a serem Resolvidos pela Invenção]

[012] Mesmo com SA237 (um anticorpo tendo a sequência de cadeia pesada da SEQ ID NO: 3 e a sequência de cadeia leve da SEQ ID NO: 4), que é produzido aplicando-se tecnologias para reduzir a imunogenicidade, em um estudo de Fase I (SA-001JP) de administrar subcutaneamente uma dose única de 120 mg de SA237 a sujeitos masculinos adultos saudáveis, anticorpos anti-SA237 foram gerados em 54,2 % dos casos (39 de 72 casos) e um problema imunogênico ocorreu. Um objetivo da presente invenção é suprimir a geração de anti-anticorpo e fornecer composições farmacêuticas ou regime de dosagem mais eficazes a serem usados no tratamento de doenças relacionadas a IL-6.

[Meios para Resolver os Problemas]

[013] Para resolver os problemas mencionados acima, os presentes inventores focaram na tolerância imunológica, e descobriram que a geração de anti-anticorpo pode ser suprimida administrando-se uma composição farmacêutica com um método e dose de administração predeterminados.

[014] Mais especificamente, os presentes inventores descobriram que a geração de anti-anticorpo pode ser suprimida usando-se uma composição farmacêutica administrada em uma dose e método de administração predeterminados para tratar doenças relacionadas a IL- 6, e desse modo concluíram a presente invenção.

[015] Especificamente, a presente invenção inclui o seguinte: [1] Uma composição farmacêutica para o uso no tratamento de uma doença relacionada a IL-6 compreendendo um inibidor de IL-6 como um ingrediente ativo, em que a composição farmacêutica é rotineiramente administrada depois de um período de dosagem de intervalo curto onde a mesma dose como a dose de rotina é administrada múltiplas vezes em um intervalo mais curto do que o intervalo de dosagem de rotina. [2] A composição farmacêutica de [1], em que o intervalo de dosagem de rotina é de três a cinco semanas. [3] A composição farmacêutica de [1], em que o intervalo de dosagem de rotina é de quatro semanas. [4] A composição farmacêutica de qualquer um de [1] a [3], em que o intervalo de dosagem durante o período de dosagem de intervalo curto onde a dose é administrada múltiplas vezes em um intervalo mais curto do que o intervalo de dosagem de rotina é de uma a duas semanas. [5] A composição farmacêutica de qualquer um de [1] a [3], em que o intervalo de dosagem durante o período de dosagem de intervalo curto onde a dose é administrada múltiplas vezes em um intervalo mais curto do que o intervalo de dosagem de rotina é de duas semanas. [6] A composição farmacêutica de qualquer um de [1] a [5], em que o período de dosagem de intervalo curto é de quatro semanas a partir da administração inicial. [7] A composição farmacêutica de qualquer um de [1] a [6], em que a dose de rotina é 50 mg a 800 mg por administração. [8] A composição farmacêutica de qualquer um de [1] a [7], em que a dose de rotina é 120 mg por administração. [9] A composição farmacêutica de qualquer um de [1] a [8], em que o inibidor de IL-6 é um anticorpo anti-receptor de IL-6. [10] A composição farmacêutica de [9], em que o anticorpo anti-receptor de IL-6 é um anticorpo quimérico, um anticorpo humanizado, ou um anticorpo humano. [11] A composição farmacêutica de [9], em que o anticorpo anti-receptor de IL-6 compreende uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência da SEQ ID NO: 1 e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência da SEQ ID NO: 2. [12] A composição farmacêutica de [9], em que o anticorpo anti-receptor de IL-6 compreende uma cadeia pesada tendo a sequência da SEQ ID NO: 3 e uma cadeia leve tendo a sequência da SEQ ID NO: 4. [13] A composição farmacêutica de [9], em que o anticorpo anti-receptor de IL-6 é SA237. [14] A composição farmacêutica de qualquer um de [1] a [13], em que a doença relacionada a IL-6 é artrite reumatoide, artrite idiopática juvenil, artrite idiopática juvenil de início sistêmico, doença de Castleman, lúpus eritematoso sistêmico (SLE), nefrite luptosa, doença de Crohn, linfoma, colite ulcerativa, anemia, vasculite, doença de Kawasaki, doença de Still, amiloidose, esclerose múltipla, transplante, degeneração macular relacionada à idade, espondilite anquilosante, psoríase, artrite psoriática, doença pulmonar obstrutiva crônica (COPD), nefropatia por IgA, osteoartrite, asma, nefropatia diabética, GVHD, endometriose, hepatite (NASH), infarto do miocárdio, arteriosclerose, sepse, osteoporose, diabete, mieloma múltiplo, câncer de próstata, câncer renal, linfoma não-Hodgkin de células B, câncer pancreático, câncer de pulmão, câncer esofágico, câncer de cólon, caquexia associada ao câncer, invasão de nervos pelo câncer, infarto do miocárdio, neovascularização coroidal associada à miopia, neovascularização coroidal idiopática, uveíte, tireoidite crônica, hipersensibilidade retardada, dermatite de contato, dermatite atópica, mesotelioma, polimiosite, dermatomiosite, panuveíte, uveíte anterior, uveíte intermediária, esclerite, ceratite, inflamação orbital, neurite óptica, retinopatia diabética, vitreorretinopatia proliferativa, síndrome do olho seco, inflamação pós-operatória, neuromielite óptica, miastenia grave, ou hipertensão pulmonar. [15] A composição farmacêutica de qualquer um de [1] a [14], em que a composição farmacêutica é uma formulação para administração subcutânea. [16] Um método para tratar uma doença relacionada a IL-6 compreendendo administrar um inibidor de IL-6, em que o inibidor de IL-6 é administrado rotineiramente depois de um período de dosagem de intervalo curto onde a mesma dose como a dose de rotina é administrada múltiplas vezes em um intervalo mais curto do que o intervalo de dosagem de rotina. [17] Um inibidor de IL-6 para o uso no tratamento de uma doença relacionada a IL-6, em que o inibidor de IL-6 é administrado rotineiramente depois de um período de dosagem de intervalo curto onde a mesma dose como a dose de rotina é administrada múltiplas vezes em um intervalo mais curto do que o intervalo de dosagem de rotina. [18] Uso de um inibidor de IL-6 para a fabricação de um medicamento para o tratamento de uma doença relacionada a IL-6, em que o inibidor de IL-6 é administrado rotineiramente depois de um período de dosagem de intervalo curto onde a mesma dose como a dose de rotina é administrada múltiplas vezes em um intervalo mais curto do que o intervalo de dosagem de rotina.

Efeitos da Invenção

[016] A composição farmacêutica ou regime da presente invenção pode resolver o problema imunogênico da geração de anticorpo anti-fármaco, e fornecer uma composição farmacêutica com menos carga ao paciente visto que a mesma não expõe o paciente a doses altas.

Breve Descrição dos Desenhos

[017] A Fig. 1 indica mudanças no valor médio (e desvio padrão) da concentração de SA237 sérica. A Fig. 1a mostra mudanças na concentração de SA237 durante o período de avaliação primário, a Fig. 1b mostra mudanças na concentração de SA237 durante o período de extensão, e a Fig. 1c mostra mudanças na concentração de SA237 sérica até a semana 8.

[018] A Fig. 2 indica mudanças no valor médio (e desvio padrão) da concentração de sIL-6R sérica que é o marcador farmacodinâmico de SA237. A Fig. 2a mostra mudanças na concentração de sIL-6R durante o período de avaliação primário, e a Fig. 2b mostra mudança na concentração de sIL-6R sérica durante o período de extensão.

[019] A Fig. 3 indica a mudança no valor médio (e desvio padrão) da concentração de CRP sérica que é o gerador farmacodinâmico de SA237. A Fig. 3a mostra mudanças na concentração de CRP durante o período de avaliação primário, e a Fig. 3b mostra mudanças na concentração de CRP durante o período de extensão. Modo para Realizar a Invenção

[020] Aqui abaixo, a presente invenção será descrita em detalhe.

[021] A presente invenção refere-se a composições farmacêuticas ou regime de dosagem a serem usados no tratamento de doenças relacionadas a IL-6.

[022] "Inibidores de IL-6" da presente invenção são substâncias que bloqueiam a transdução de sinal por IL-6, e inibem as atividades biológicas de IL-6. Inibidores de IL-6 são preferivelmente substâncias que têm efeitos inibitórios contra a ligação a qualquer um de IL-6, receptor de IL-6, e gp130.

[023] Exemplos de um inibidor de IL-6 da presente invenção incluem, mas não são particularmente limitados a, anticorpos anti-IL-6, anticorpos anti-receptor de IL-6, anticorpos anti-gp130, variantes de IL- 6, variantes de receptor de IL-6 solúvel, ou peptídeos parciais de IL-6 ou receptor de IL-6, e substâncias de peso molecular baixo mostrando uma atividade similar. Exemplos de um inibidor de IL-6 da presente invenção podem ser preferivelmente anticorpos de reconhecimento de receptor de IL-6.

[024] A origem dos anticorpos da presente invenção não é particularmente limitada, mas a mesma é preferivelmente um mamífero e mais preferivelmente ser humano.

[025] Um anticorpo anti-IL-6 usado na presente invenção pode ser obtido como um anticorpo policlonal ou monoclonal usando métodos conhecidos. Um anticorpo monoclonal derivado de um mamífero é particularmente preferido para o anticorpo anti-IL-6 usado na presente invenção Os anticorpos monoclonais derivados de um mamífero incluem aqueles produzidos por um hibridoma e aqueles produzidos por um hospedeiro transformado com um vetor de expressão contendo um gene de anticorpo usando métodos de engenharia genética. Por ligação a IL-6, este anticorpo inibe a ligação de IL-6 a um receptor de IL-6, e bloqueia a transdução da atividade biológica de IL-6 em células.

[026] Exemplos de um tal anticorpo incluem o anticorpo MH166 (Matsuda, T. et al., Eur. J. Immunol. (1988) 18, 951 - 956) e o anticorpo SK2 (Sato, K. et al., The abstracts of the 21st Annual Meeting of the Japanese Society for Immunology (1991) 21, 166).

[027] Basicamente, hibridomas que produzem um anticorpo anti- IL-6 podem ser produzidos usando técnicas conhecidas como abaixo. Especificamente, os hibridomas podem ser produzidos realizando-se a imunização por um método de imunização convencional usando IL-6 como um antígeno sensibilizante, fundindo as células imunes resultantes com células precursoras conhecidas por um método de fusão de célula convencional, e depois triando quanto a células que produzem anticorpos monoclonais usando um método de triagem convencional.

[028] Especificamente, anticorpos anti-IL-6 podem ser produzidos como abaixo. IL-6 humana a ser usada como um antígeno sensibilizante para obter anticorpos pode ser obtida, por exemplo, usando-se as sequências de gene de IL-6 e/ou aminoácido divulgadas em Eur. J. Biochem (1987) 168, 543 - 550; J. Immunol. (1988)140, 1534 - 1541; e Agr. Biol. Chem. (1990)54, 2685 - 2688.

[029] Depois que uma célula hospedeira apropriada é transformada com um sistema de vetor de expressão conhecido inserido com uma sequência de gene de IL-6, a proteína de IL-6 alvo é purificada a partir do interior da célula hospedeira ou a partir do sobrenadante de cultura usando um método conhecido. Esta proteína de IL-6 purificada pode ser usada como um antígeno sensibilizante. Alternativamente, uma proteína de fusão da proteína de IL-6 e uma outra proteína pode ser usada como um antígeno sensibilizante.

[030] Um anticorpo anti-receptor de IL-6 usado na presente invenção pode ser obtido como um anticorpo policlonal ou monoclonal usando métodos conhecidos. Um anticorpo monoclonal derivado de um mamífero é particularmente preferido para o anticorpo anti-receptor de IL-6 usado na presente invenção. Os anticorpos monoclonais derivados de um mamífero incluem aqueles produzidos por um hibridoma e aquelas produzidos por um hospedeiro transformado com um vetor de expressão contendo um gene de anticorpo usando métodos de engenharia genética. Por ligação a um receptor de IL-6, este anticorpo inibe a ligação de IL-6 a um receptor de IL-6, e bloqueia a transdução da atividade biológica de IL-6 nas células.

[031] Exemplos de um tal anticorpo incluem o anticorpo MR16-1 (Tamura, T. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1993) 90, 11924 - 11928), anticorpo PM-1 (Hirata, Y. et al., J. Immunol. (1989) 143, 2900 - 2906), anticorpo AUK12-20, anticorpo AUK64-7, e anticorpo AUK146- 15 (Publicação do Pedido de Patente Internacional No WO 92-19759). Dentre eles, o anticorpo PM-1 é listado como um exemplo de um anticorpo monoclonal preferido contra o receptor de IL-6 humana, e o anticorpo MR16-1 é listado um exemplo de um anticorpo monoclonal preferido contra o receptor de IL-6 de camundongo.

[032] Basicamente, hibridomas que produzem um anticorpo monoclonal anti-receptor de IL-6 podem ser produzidos usando técnicas conhecidas como abaixo. Especificamente, os hibridomas podem ser produzidos realizando-se a imunização por um método de imunização convencional usando um receptor de IL-6 como um antígeno sensibilizante, fundindo as células imunes resultantes com células precursoras conhecidas por um método de fusão de célula convencional, e depois triando quanto a células que produzem anticorpos monoclonais usando um método de triagem convencional.

[033] Especificamente, anticorpos anti-receptor de IL-6 podem ser produzidos como abaixo. Um receptor de IL-6 humana ou receptor de IL-6 de camundongo a ser usado como um antígeno sensibilizante para obter anticorpos pode ser obtido, por exemplo, usando-se as sequências de gene de receptor de IL-6 e/ou de aminoácido respectivamente divulgadas na Publicação do Pedido de Patente Europeia No EP 325474 e Publicação Kokai do Pedido de Patente Japonesa No (JP-A) H03-155795 (pedido de patente japonês publicado, não examinado).

[034] Existem dois tipos de proteínas de receptor de IL-6: uma expressada na membrana celular e a outra separada da membrana celular (receptor de IL-6 solúvel) (Yasukawa, K. et al., J. Biochem. (1990) 108, 673 - 676). O receptor de IL-6 solúvel é essencialmente composto da região extracelular do receptor de IL-6 ligado à membrana celular, e difere do receptor de IL-6 ligado à membrana em que ele carece da região de transmembrana ou tanto das regiões de transmembrana quanto intracelulares. Qualquer receptor de IL-6 pode ser utilizado como a proteína de receptor de IL-6, contanto que ele possa ser usado como um antígeno sensibilizante para produzir um anticorpo anti-receptor de IL-6 a ser usado na presente invenção.

[035] Depois que uma célula hospedeira apropriada é transformada com um sistema de vetor de expressão conhecido inserido com uma sequência de gene de receptor de IL-6, a proteína de receptor de IL-6 alvo é purificada a partir do interior da célula hospedeira ou a partir do sobrenadante de cultura usando um método conhecido. Esta proteína de receptor de IL-6 purificada pode ser usada como um antígeno sensibilizante. Alternativamente, uma célula que expressa o receptor de IL-6 ou uma proteína de fusão da proteína de receptor de IL-6 e uma outra proteína podem ser usadas como um antígeno sensibilizante.

[036] Um anticorpo anti-gp130 usado na presente invenção pode ser obtido como um anticorpo policlonal ou monoclonal usando métodos conhecidos. Um anticorpo monoclonal derivado de um mamífero é particularmente preferido para o anticorpo anti-gp130 usado na presente invenção. Os anticorpos monoclonais derivados de um mamífero incluem aqueles produzidos por um hibridoma e aquelas produzidos por um hospedeiro transformado com um vetor de expressão contendo um gene de anticorpo usando um método de engenharia genética. Por ligação a gp130, este anticorpo inibe a ligação de um complexo de IL-6/receptor de IL-6 a gp130, e bloqueia a transdução da atividade biológica de IL-6 nas células.

[037] Exemplos de um tal anticorpo incluem o anticorpo AM64 (JP-A (Kokai) H03-219894), anticorpos 4B11 e 2H4 (US 5571513), e os anticorpos B-S12 e B-P8 (JP-A (Kokai) H08-291199).

[038] Basicamente, hibridomas que produzem um anticorpo monoclonal anti-gp130 podem ser produzidos usando técnicas conhecidas como abaixo. Especificamente, os hibridomas podem ser produzidos realizando-se a imunização por um método de imunização convencional usando gp130 como um antígeno sensibilizante, fundindo as células imunes resultantes com células precursoras conhecidas por um método de fusão de célula convencional, e depois triando quanto a células que produzem anticorpos monoclonais usando um método de triagem convencional.

[039] Especificamente, os anticorpos monoclonais podem ser produzidos como abaixo. Por exemplo, gp130 a ser usado como um antígeno sensibilizante para obter anticorpos pode ser obtido usando- se as sequências de gene gp130 e/ou aminoácido divulgadas na Publicação do Pedido de Patente Europeia No EP 411946.

[040] Depois que uma célula hospedeira apropriada é transformada com um sistema de vetor de expressão conhecido inserido com uma sequência de gene gp130, a proteína de gp130 alvo é purificada a partir do interior da célula hospedeira ou a partir do sobrenadante de cultura usando um método conhecido. Esta proteína de gp130 purificada pode ser usada como um antígeno sensibilizante. Alternativamente, uma célula que expressa gp130 ou uma proteína de fusão da proteína de gp130 e uma outra proteína pode ser usada como um antígeno sensibilizante.

[041] Mamíferos a serem imunizados com um antígeno sensibilizante não são particularmente limitados, mas são preferivelmente selecionados em consideração da compatibilidade com células precursoras usadas para fusão de célula. Tipicamente, roedores tais como camundongos, ratos, e hamsters são usados.

[042] Os animais são imunizados com um antígeno sensibilizante de acordo com métodos conhecidos. Tipicamente, a imunização é realizada, por exemplo, por injeção intraperitoneal ou subcutânea do antígeno sensibilizante a um mamífero. Especificamente, é preferível diluir ou colocar em suspensão o antígeno sensibilizante em solução salina tamponada com fosfato (PBS), solução salina fisiológica, e semelhantes, a um volume apropriado, e misturá-lo com uma quantidade apropriada de um adjuvante convencional tal como adjuvante completo de Freund se desejado e emulsificar, e depois administrar ao mamífero a cada quatro a 21 dias por várias vezes. Um portador apropriado também pode ser usado para imunização com o antígeno sensibilizante.

[043] Depois de imunizar o mamífero desta maneira, e confirmar que o nível sérico de um anticorpo desejado aumentou, células imunizadas são removidas do mamífero e submetidas à fusão de célula. Células do baço são particularmente preferidas como as células imunizadas a serem submetidas à fusão de célula.

[044] Células de mieloma de mamíferos são usadas como células precursoras a serem fundidas com as células imunizadas. Até agora, várias linhagens de célula conhecidas tais como P3X63Ag8.653 (Kearney, J. F. et al., J. Immunol (1979) 123, 1548 - 1550), P3X63Ag8U.1 (Current Topics in Microbiology and Immunology (1978) 81, 1 - 7), NS-1 (Kohler, G. e Milstein, C., Eur. J. Immunol. (1976) 6, 511 - 519), MPC-11 (Margulies, D. H. et al., Cell (1976) 8, 405 - 415), SP2/0 (Shulman, M. et al., Nature (1978) 276, 269 - 270), F0 (de St. Groth, S. F. et al., J. Immunol. Methods (1980) 35, 1 - 21), S194 (Trowbridge, I. S., J. Exp. Med. (1978) 148, 313 - 323), e R210 (Galfre, G. et al., Nature (1979) 277, 131 - 133) são adequadamente usadas.

[045] Basicamente, a fusão de célula das células imunes anteriormente mencionadas com células de mieloma pode ser realizada de acordo com métodos conhecidos tais como o método de Milstein et al. (Kohler, G. e Milstein, C., Methods Enzymol. (1981) 73, 3 - 46).

[046] Mais especificamente, a fusão de célula é realizada, por exemplo, em um meio de cultura de nutriente convencional na presença de um promotor de fusão de célula. Por exemplo, polietilenoglicol (PEG) ou vírus Sendai (HVJ) é usado como o promotor de fusão, e se desejado, um adjuvante tal como sulfóxido de dimetila pode ser adicionado ainda para o uso em melhorar a eficiência de fusão.

[047] A razão de células imunes para células de mieloma usada é preferivelmente, por exemplo, 1 a 10 células imunes para cada célula de mieloma. O meio de cultura usado para a fusão de célula é, por exemplo, um meio de cultura RPMI1640 ou MEM adequado para a proliferação das linhagens de célula de mieloma. Outros meios de cultura convencionais usados para este tipo de cultura de célula também podem ser usados. Além disso, suplementos séricos tais como soro de bezerro fetal (FCS) também podem ser usados em combinação.

[048] Para a fusão de célula, as células de fusão (hibridomas) de interesse são formadas misturando-se completamente quantidades predeterminadas da célula imune e célula de mieloma anteriormente mencionadas no meio de cultura anteriormente mencionado, adicionando uma solução de PEG (por exemplo, uma solução de PEG com um peso molecular médio de cerca de 1.000 a 6.000) pré- aquecida até cerca de 37 °C, usualmente em uma concentração de 30 % a 60 % (p/v), e depois misturando-as. Depois, os agentes de fusão de célula e tais que são inadequados para o crescimento de hibridomas podem ser removidos repetindo-se a operação de adicionar sequencialmente um meio de cultura apropriado e remover o sobrenadante por centrifugação.

[049] Os hibridomas são selecionados cultivando-se em um meio de cultura de seleção geral, por exemplo, o meio de cultura HAT (um meio de cultura contendo hipoxantina, aminopterina, e timidina). A cultura no meio de cultura HAT é continuada por um período suficiente, geralmente de vários dias a várias semanas, para matar as células exceto os hibridomas de interesse (células infundidas). Depois, um método de diluição limitante padrão é realizado para triar quanto a e clonar hibridomas que produzem um anticorpo de interesse.

[050] Além de obter os hibridomas imunizando-se animais não humanos com um antígeno, anticorpos humanos desejados tendo uma atividade de ligação a um antígeno ou célula que expressa antígeno desejados podem ser obtidos sensibilizando-se um linfócito humano com uma proteína antigênica ou célula que expressa antígeno desejada in vitro, e fundindo-se o linfócito B sensibilizado com uma célula de mieloma humano tal como U266 (ver, Publicação Kokoku do Pedido de Patente Japonesa No (JP-B) H01-59878 (Pedido de Patente Japonês aprovado, examinado publicado para oposição)). Além disso, um antígeno ou célula que expressa antígeno podem ser administrados a um animal transgênico tendo um repertório de genes de anticorpo humano, e depois um anticorpo humano desejado pode ser obtido seguindo o método anteriormente mencionado (ver, Publicações de Pedido de Patente Internacionais Nos WO 93/12227, WO 92/03918, WO 94/02602, WO 94/25585, WO 96/34096, e WO 96/33735).

[051] Os hibridomas preparados como tal que produzem anticorpos monoclonais podem ser subcultivados em um meio de cultura convencional e armazenados em nitrogênio líquido por um período longo.

[052] Para obter anticorpos monoclonais a partir dos hibridomas, os métodos seguintes podem ser utilizados: cultivar os hibridomas de acordo com métodos convencionais e obter os anticorpos como um sobrenadante de cultura ou proliferar os hibridomas administrando-os a um mamífero compatível e obter os anticorpos de ascite; e assim por diante. O primeiro método é adequado para obter anticorpos com pureza alta, e o último é adequado para produção de anticorpo em grande escala.

[053] Por exemplo, hibridomas que produzem anticorpos anti receptor de IL-6 podem ser preparados pelo método divulgado em JP- A (Kokai) H03-139293. Uma tal preparação pode ser realizada injetando-se hibridomas que produzem anticorpos PM-1 na cavidade abdominal de um camundongo BALB/c, obtendo-se ascite, e depois purificando-se os anticorpos PM-1 a partir da ascite; ou cultivando-se os hibridomas em um meio apropriado (tal como um meio RPMI 1640 contendo 10 % de soro bovino fetal, e 5 % de BM-Condimed H1 (Boehringer Mannheim); o meio SFM de hibridoma (GIBCO-BRL); ou o meio PFHM-II (GIBCO-BRL)) e depois purificando-se os anticorpos PM-1 a partir do sobrenadante de cultura.

[054] Anticorpos recombinantes podem ser usados como os anticorpos monoclonais da presente invenção, em que os anticorpos recombinantes são produzidos usando técnicas de recombinação genética clonando-se um gene de anticorpo de um hibridoma, inserindo-se o gene em um vetor apropriado, e depois introduzindo-se o vetor em um hospedeiro (ver, por exemplo, Borrebaeck, C. A. K. e Larrick, J. W., THERAPEUTICAL MONOCLONAL ANTIBODIES, Publicado no Reino Unido por MACMILLAN PUBLISHERS LTD, 1990).

[055] Mais especificamente, mRNAs que codificam regiões de anticorpo variável (V) são isolados de células que produzem anticorpos de interesse, tais como hibridomas. mRNAs podem ser isolados preparando-se RNAs totais de acordo com métodos conhecidos, tais como o método de ultracentrifugação de guanidina (Chirgwin, J. M. et al., Biochemistry (1979) 18, 5294 - 5299) e o método AGPC (Chomczynski, P. et al., Anal. Biochem. (1987) 162, 156 - 159), e preparando-se mRNAs usando um Kit de Purificação de mRNA (Pharmacia) e semelhantes. Alternativamente, mRNAs podem ser diretamente preparados usando o Kit de Purificação de mRNA QuickPrep (Pharmacia).

[056] cDNAs das regiões V de anticorpo são sintetizados a partir dos mRNAs obtidos usando transcriptase reversa. cDNAs podem ser sintetizados usando o Kit de Síntese de cDNA de Primeiro Filamento de Transcriptase Reversa de AMV e semelhantes. Além disso, para sintetizar e amplificar os cDNAs, o método 5’-RACE (Frohman, M. A. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1988) 85, 8998 - 9002; Belyavsky, A. et al., Nucleic Acids Res. (1989) 17, 2919 - 2932) usando o Kit 5’-Ampli FINDER RACE (Clontech) e PCR pode ser usada. Um fragmento de DNA de interesse é purificado a partir dos produtos de PCR obtidos e depois ligado com um DNA vetorial. Depois, um vetor recombinante é preparado usando-se o acima, e introduzido em Escherichia coli e semelhantes, e depois suas colônias são selecionadas para preparar um vetor recombinante desejado. A sequência de nucleotídeo do DNA de interesse é confirmada por um método conhecido tal como o método de didesóxi.

[057] Quando um DNA que codifica a região V do anticorpo de interesse é obtido, o DNA é ligado com um DNA que codifica a região constante (região C) de um anticorpo desejado, e inserido em um vetor de expressão. Alternativamente, um DNA que codifica uma região V de anticorpo pode ser inserido em um vetor de expressão compreendendo um DNA de uma região C de anticorpo.

[058] Para produzir um anticorpo a ser usado na presente invenção, um gene de anticorpo é inserido em um vetor de expressão tal que ele é expressado sob o controle de uma região de regulação de expressão tal como um realçador e promotor, como descrito abaixo. Depois, o anticorpo pode ser expressado transformando-se uma célula hospedeira com este vetor de expressão.

[059] Na presente invenção, anticorpos recombinantes artificialmente modificados, por exemplo, anticorpos quiméricos, anticorpos humanizados, ou anticorpos humanos podem ser usados, por exemplo, para reduzir a heteroantigenicidade contra seres humanos. Estes anticorpos modificados podem ser preparados usando métodos conhecidos.

[060] Um anticorpo quimérico pode ser obtido ligando-se um DNA que codifica uma região V de anticorpo obtida como acima com um DNA que codifica uma região C de anticorpo humano, inserindo-o em um vetor de expressão, e introduzindo o vetor em um hospedeiro para produzir o anticorpo quimérico (ver, Publicação do Pedido de Patente Europeia No EP 125023; Publicação do Pedido de Patente Internacional No WO 92-19759). Este método conhecido pode ser usado para obter anticorpos quiméricos úteis para a presente invenção.

[061] Anticorpos humanizados também são referidos como anticorpos humanos reformados ou anticorpos fabricados no tipo humano. Eles são produzido transplantando-se as regiões determinantes de complementaridade (CDRs) de um anticorpo a partir de um mamífero não humano (por exemplo, um camundongo) nas CDRs de um anticorpo humano. Métodos gerais para esta recombinação de gene também são conhecidos (ver, Publicação do Pedido de Patente Europeia No EP 125023, Publicação do Pedido de Patente Internacional No WO 92-19759).

[062] Mais especificamente, sequências de DNA designadas para ligar as CDRs de um anticorpo de camundongo com as regiões de estrutura (FRs) de um anticorpo humano são sintetizadas por PCR a partir de vários oligonucleotídeos produzidos para conter porções sobrepostas em seus términos. O DNA obtido é ligado com um DNA que codifica uma região C de anticorpo humano e inserido em um vetor de expressão, e o vetor de expressão é introduzido em um hospedeiro para produzir o anticorpo humanizado (ver, Publicação do Pedido de Patente Europeia No EP 239400, Publicação do Pedido de Patente Internacional No WO 92 - 19759).

[063] FRs de anticorpo humano a serem ligadas por intermédio das CDRs são selecionadas de modo que as CDRs formem sítios de ligação a antígeno satisfatórios. O(s) aminoácido(s) dentro das regiões de estrutura das regiões variáveis de anticorpo podem ser substituídos conforme necessário de modo que as CDRs do anticorpo humano reformado formem sítios de ligação a antígeno apropriados (Sato, K. et al., Cancer Res. (1993) 53, 851 - 856).

[064] Regiões C de anticorpo humano são usados para os anticorpos quiméricos e humanizados. Exemplos de regiões C de anticorpo humano incluem CY, e por exemplo, CY1, CY2, CY3, ou CY4 podem ser usados. Além disso, para melhorar a estabilidade dos anticorpos ou sua produção, as regiões C de anticorpo humano podem ser modificadas.

[065] Anticorpos quiméricos são compostos da região variável de um anticorpo derivado de um mamífero não humano e a região C derivada de um anticorpo humano; e anticorpos humanizados são compostos das CDRs de um anticorpo derivado de um mamífero não humano e as regiões de estrutura e regiões C derivadas de um anticorpo humano. Sua antigenicidade no corpo humano é reduzida, e assim eles são úteis como anticorpos para o uso na presente invenção.

[066] Exemplos específicos preferidos de anticorpos humanizados para o uso na presente invenção incluem um anticorpo PM-1 humanizado (ver, Publicação do Pedido de Patente Internacional No WO 92-19759).

[067] Além disso, além dos métodos anteriormente mencionados para obter anticorpos humanos, técnicas para obter anticorpos humanos por panning usando uma biblioteca de anticorpo humano também são conhecidas. Por exemplo, a região variável de um anticorpo humano pode ser expressada em uma superfície de fago como um anticorpo de cadeia única (scFv) usando-se o método de exibição de fago, e fagos de ligação a antígeno depois podem ser selecionados. Analisando-se os genes dos fagos selecionados, a sequência de DNA que codifica a região variável do anticorpo humano que se liga ao antígeno pode ser determinada. Uma vez que a sequência de DNA de um scFv que se liga ao antígeno é revelada, um vetor de expressão apropriado compreendendo as sequência pode ser preparado para obter um anticorpo humano. Estes métodos já são conhecidos, e as publicações, WO 92/01047, WO 92/20791, WO93/06213, WO 93/11236, WO 93/19172, WO 95/01438, e WO 95/15388, podem ser usadas como referências.

[068] O gene de anticorpo construído como descrito acima pode ser expressado de acordo com métodos conhecidos. Quando uma célula mamífera é usada, o gene de anticorpo pode ser expressado usando-se um DNA em que um gene promotor eficaz comumente usado, o gene de anticorpo a ser expressado, e um sinal de poli A no lado 3’ (a jusante) do gene de anticorpo são operativamente ligados entre si, ou usando-se um vetor compreendendo o DNA. Exemplos de um promotor/realçador incluem o promotor/realçador inicial imediato de citomegalovírus humano.

[069] Além disso, outros promotores/realçadores que podem ser usados para expressar os anticorpos para o uso na presente invenção incluem promotores/realçadores virais de retrovírus, vírus de polioma, adenovírus, vírus símio 40 (SV40), e semelhantes; e promotores/realçadores derivados de célula mamífera tais como fator de elongação humano 1α (HEF1α).

[070] A expressão pode ser facilmente realizada, por exemplo, seguindo-se o método em Mulligan et al. (Mulligan, R. C. et al., Nature (1979) 277, 108 - 114) quando do uso do promotor/realçador de SV40, ou seguindo-se o método em Mizushima et al. (Mizushima, S. e Nagata S., Nucleic Acids Res. (1990) 18, 5322) quando do uso do promotor/realçador de HEF1α.

[071] Quando E. coli é usado, o gene de anticorpo pode ser expressado ligando-se operativamente um gene promotor eficaz comumente usado, uma sequência de sinal para secreção de anticorpo, e o gene de anticorpo a ser expressado. Exemplos do promotor incluem um promotor de lacZ e um promotor de araB. Um promotor de lacZ pode ser usado de acordo com o método de Ward et al. (Ward, E. S. et al., Nature (1989) 341, 544 - 546; Ward, E. S. et al., FASEB J. (1992) 6, 2422 - 2427); e um promotor de araB pode ser usado de acordo com o método de Better et al. (Better, M. et al., Science (1988) 240, 1041 - 1043).

[072] Quando o anticorpo é produzido no periplasma de E. coli, a sequência de sinal de pel B (Lei, S. P. et al., J. Bacteriol. (1987) 169, 4379 - 4383) pode ser usada como uma sequência de sinal para a secreção de anticorpo. O anticorpo produzido no periplasma é isolado, e depois apropriadamente redobrado na estrutura de anticorpo a ser usada (ver, por exemplo, WO 96/30394).

[073] Como a origem de replicação, aqueles derivados de SV40, vírus de polioma, adenovírus, vírus de papiloma bovino (BPV) e semelhantes podem ser usados. Além disso, para aumentar o número de cópia de gene em um sistema de célula hospedeira, o vetor de expressão pode compreender o gene de aminoglicosídeo fosfotransferase (APH), gene de timidina cinase (TK), gene de xantina- guanina fosforribosiltransferase (Ecogpt) de E. coli, gene de diidrofolato redutase (dhfr), e semelhantes, como um marcador de seleção.

[074] Qualquer sistema de produção pode ser usado para preparar os anticorpos para o uso na presente invenção. Os sistemas de produção para preparação de anticorpo incluem sistemas de produção in vitro e in vivo. Sistemas de produção in vitro incluem aqueles usando células eucarióticas ou aqueles usando células procarióticas.

[075] Quando células eucarióticas são usadas, os sistemas de produção incluem aqueles usando células animais, células vegetais, ou células fúngicas. Tais células animais incluem (1) células mamíferas tais como CHO, COS, mieloma, rim de hamster neonato (BHK), HeLa, e Vero; (2) células de anfíbios tais como oócitos de Xenopus; e (3) células de insetos tais como sf9, sf21, e Tn5. Células vegetais conhecidas incluem células derivadas de Nicotiana tabacum, que podem ser cultivadas em calo. Células fúngicas conhecidas incluem leveduras tais como Saccharomyces (por exemplo, Saccaromyces cerevisiae) e bolores tais como Aspergillus (por exemplo, Aspergillus niger).

[076] Quando células procarióticas são usadas, sistemas de produção incluem aqueles usando células bacterianas. Células bacterianas conhecidas incluem E. coli e Bacillus subtilis.

[077] Anticorpos podem ser obtidos introduzindo-se o gene de anticorpo de interesse nestas células por transformação, e depois cultivando-se as células transformadas in vitro. As células são cultivadas de acordo com métodos conhecidos. Por exemplo, DMEM, MEM, RPMI 1640, ou IMDM podem ser usados como o meio de cultura, e suplementos séricos tais como soro de bezerro fetal (FCS) podem ser usados em combinação. Alternativamente, células introduzidas com o gene de anticorpo podem ser transferidas na cavidade abdominal e semelhantes de um animal para produzir os anticorpos in vivo.

[078] Entretanto, sistemas de produção in vivo incluem aqueles usando animais ou aqueles usando plantas. Quando do uso de animais, sistemas de produção incluem aqueles usando mamíferos ou insetos.

[079] Mamíferos que podem ser usados incluem cabras, porcos, ovelhas, camundongos, e bovinos (Vicki Glaser, SPECTRUM Biotechnology Applications, 1993). Além disso, insetos que podem ser usados incluem bichos-da-seda. Quando do uso de plantas, tabaco e semelhantes podem ser usados.

[080] Um gene de anticorpo é introduzido nestes animais ou plantas, e os anticorpos são produzidos no corpo dos animais ou plantas e depois recuperados. Por exemplo, um gene de anticorpo pode ser preparado como um gene de fusão inserindo-o no centro de um gene que codifica uma proteína exclusivamente produzida no leite, tal como β caseína de cabra. Fragmentos de DNA compreendendo o gene de fusão, que inclui o gene de anticorpo, inserido são injetados em embriões de cabra, e os embriões são introduzidos em cabras fêmeas. Os anticorpos desejados são obtidos do leite produzido por cabras transgênicas nascidas das cabras que receberam os embriões, ou suas progênies. Quando apropriado, as cabras transgênicas podem ser fornecidas com hormônios para aumentar o volume do leite contendo os anticorpos desejados que elas produzem (Ebert, K. M. et al., Bio/Thecnology (1994) 12, 699 - 702).

[081] Quando bichos-da-seda são usados, os bichos-da-seda são infectados com um baculovírus inserido com o gene de anticorpo de interesse, e os anticorpos desejados são obtidos dos fluidos corporais destes bichos-da-seda (Maeda, S. et al., Nature (1985) 315, 592 - 594). Além disso, quando tabaco é usado, o gene de anticorpo de interesse é inserido em um vetor de expressão de planta tal como pMON530, e o vetor é introduzido em bactérias tais como Agrobacterium tumefaciens. Esta bactéria é usada para infectar tabaco tal como Nicotiana tabacum, e depois o anticorpo desejado é obtido das folhas deste tabaco (Julian, K.-C. Ma et al., Eur. J. Immunol. (1994) 24, 131 - 138).

[082] Quando da produção de anticorpos usando sistemas de produção in vitro ou in vivo como descrito acima, DNAs que codificam uma cadeia pesada (cadeia H) e cadeia leve (cadeia L) de anticorpo podem ser inseridos em vetores de expressão separados, e um hospedeiro é depois co-transformado com os vetores. Alternativamente, o DNA que codifica a cadeia H e o DNA que codifica a cadeia L podem ser inseridos em um único vetor de expressão para transformar um hospedeiro (ver a Publicação do Pedido de Patente Internacional No WO 94-11523).

[083] Os anticorpos usados na presente invenção podem ser fragmentos de anticorpo ou produtos modificados destes, contanto que eles possam ser adequadamente usados na presente invenção. Por exemplo, fragmentos de anticorpo incluem Fab, F(ab’)2, Fv, e Fv de cadeia única (scFv) em que os Fvs das cadeias H e L são ligados por intermédio de um ligador apropriado.

[084] Especificamente, os fragmentos de anticorpo são produzidos tratando-se anticorpos com enzimas tais como papaína ou pepsina, ou alternativamente, construindo-se genes que codificam estes fragmentos de anticorpo e introduzindo-os nos vetores de expressão, e depois expressando os vetores em células hospedeiras apropriadas (ver, por exemplo, Co, M. S. et al., J. Immunol. (1994) 152, 2968 - 2976; Better, M. & Horwitz, A. H., Methods in Enzymology (1989) 178, 476 - 496; Plueckthun, A. & Skerra, A., Methods in Enzymology (1989) 178, 497 - 515; Lamoyi, E., Methods in Enzymology (1989) 121, 652 - 663; Rousseaux, J. et al., Methods in Enzymology (1989) 121, 663 - 666; e Bird, R. E. et al., TIBTECH (1991) 9, 132 - 137).

[085] Um scFv pode ser obtido ligando-se a região V de cadeia H e a região V de cadeia L de um anticorpo. Neste scFv, a região V de cadeia H e a região V de cadeia L são ligadas por intermédio de um ligador, preferivelmente por intermédio de um ligador de peptídeo (Huston, J. S. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1988) 85, 5879 - 5883). As regiões V das cadeias H e L em um scFv podem ser derivadas de qualquer um dos anticorpos descritos acima. Ligadores de peptídeo para ligar as regiões V incluem, por exemplo, um peptídeo de cadeia única arbitrário consistindo em 12 a 19 resíduos de aminoácido.

[086] Um DNA que codifica um scFv pode ser obtido amplificando-se uma porção de DNA que codifica a sequência de aminoácido desejada em sequências padrão com PCR usando um par de iniciador que define os términos da porção, em que um DNA que codifica uma região V de cadeia H ou uma de cadeia H e um DNA que codifica uma região V de cadeia L ou uma de cadeia L dos anticorpos anteriormente mencionados são usados como os padrões, e depois amplificando-se ainda a porção de DNA amplificada com um DNA que codifica uma porção de ligador de peptídeo e um par de iniciador que define ambas as extremidades do ligador de modo que ele possa ser ligado a cada uma das cadeias H e L.

[087] Uma vez que um DNA que codifica scFv foi preparado, um vetor de expressão compreendendo o DNA e um hospedeiro transformado com o vetor de expressão podem ser obtidos de acordo com métodos convencionais. Além disso, um scFv pode ser obtido de acordo com métodos convencionais usando-se o hospedeiro.

[088] Similar ao acima, os fragmentos de anticorpo podem ser produzidos obtendo-se seus genes, expressando-os, e depois usando um hospedeiro. Um "anticorpo" como usado aqui abrange fragmentos de anticorpo semelhantes.

[089] Anticorpos ligados a várias moléculas tais como polietilenoglicol (PEG) também podem ser usados como anticorpos modificados. Um "anticorpo" como usado aqui abrange anticorpos modificados semelhantes. Estes anticorpos modificados podem ser obtidos modificando-se quimicamente os anticorpos obtidos. Tais métodos já são estabelecidos na técnica.

[090] Anticorpos produzidos e expressados como acima podem ser isolados a partir do interior ou exterior das células ou a partir dos hospedeiros, e depois purificados até a homogeneidade. Os anticorpos para o uso na presente invenção podem ser isolados e purificados por cromatografia de afinidade. Colunas usadas para a cromatografia de afinidade incluem colunas de proteína A e colunas de proteína G. Portadores usados para as colunas de proteína A incluem HyperD, POROS, e Sepharose F.F. Outros métodos usados para o isolamento e/ou purificação de proteínas comuns podem ser usados sem limitação.

[091] Por exemplo, os anticorpos usados para a presente invenção podem ser isolados e purificados selecionando-se e combinando-se apropriadamente cromatografias exceto a cromatografia de afinidade descrita acima, filtração, ultrafiltração, relargagem, diálise, e semelhantes. Exemplos de cromatografias incluem cromatografia de troca de íon, cromatografia hidrofóbica, e filtração em gel. Estas cromatografias podem ser aplicadas à cromatografia líquida de alto desempenho (HPLC). Alternativamente, HPLC de fase reversa pode ser usada.

[092] A concentração dos anticorpos obtidos como acima pode ser determinada por medição de absorvância, ELISA, e semelhantes. Especificamente, quando do uso de medição de absorvância, a concentração pode ser determinada diluindo-se apropriadamente a solução de anticorpo com PBS(-), medindo-se sua absorvância em 280 nm, e calculando-se a concentração usando-se o fator de conversão 1,35 OD/1 mg/ml. Alternativamente, quando do uso de ELISA, a concentração pode ser determinada como abaixo. Especificamente, 100 μl de IgG anti-humana de cabra (TAG) diluída a 1 μg/ml com tampão de bicarbonato a 0,1 M (pH 9,6) são adicionados a uma placa de 96 reservatórios (Nunc) e incubados durante a noite a 4 °C para imobilizar o anticorpo. Depois do bloqueio, 100 μl de um anticorpo apropriadamente diluído a ser usado na presente invenção ou uma amostra apropriadamente diluída compreendendo o anticorpo, ou IgG humana (CAPPEL) como um padrão são adicionados, e a placa é incubada por uma hora na temperatura ambiente.

[093] Depois da lavagem, 100 μl de IgG anti-humana rotulada com fosfatase alcalina diluída 5.000 x (BIO SOURCE) são adicionados, e a placa é incubada por uma hora na temperatura ambiente. Depois de uma outra lavagem, a solução de substrato é adicionado, a placa é incubada, e a absorvância em 405 nm é medida usando Leitor de Microplaca Modelo 3550 (Bio-Rad) para calcular a concentração do anticorpo de interesse.

[094] As variantes de IL-6 usadas na presente invenção são substâncias que têm atividade de ligação a um receptor de IL-6 e que não transmitem atividade biológica de IL-6. Isto é, as variantes de IL-6 competem com IL-6 pela ligação a um receptor de IL-6, mas não transmitem atividade biológica de IL-6, e assim bloqueiam a transdução de sinal mediada por IL-6.

[095] As variantes de IL-6 são produzidas introduzindo-se mutação(ões) substituindo-se resíduo(s) de aminoácido na sequência de aminoácido de IL-6. Qualquer IL-6 a partir da qual a variante de IL-6 é derivada pode ser usada, mas IL-6 humana é preferida, considerando a antigenicidade e semelhantes.

[096] Mais especificamente, as substituições de aminoácido são realizadas prognosticando-se a estrutura secundária de IL-6 a partir da sequência de aminoácido de IL-6 usando programas de modelagem molecular conhecidos tais como WHATIF (Vriend et al., J. Mol. Graphics (1990) 8, 52 - 56), e avaliando-se ainda a influência do(s) resíduo(s) de aminoácido substituído(s) na molécula integral. Depois de determinar o(s) resíduo(s) de aminoácido apropriado(s) a serem substituídos, mutação(ões) são introduzidas por um método de PCR comumente realizado usando um vetor compreendendo uma sequência de nucleotídeo que codifica um gene de IL-6 humana como um padrão para causar substituição(ões) de aminoácido, e o gene que codifica a variante de IL-6 é desse modo obtido. Se necessário, este gene é inserido em um vetor de expressão apropriado, e a variante de IL-6 pode ser obtida de acordo com os métodos anteriormente mencionados para expressão, produção, e purificação de anticorpos recombinantes.

[097] Exemplos específicos das variantes de IL-6 são divulgados em Brakenhoff et al., J. Biol. Chem. (1994) 269, 86 - 93; Savino et al., EMBO J. (1994) 13, 1357 - 1367; WO 96-18648; e WO 96-17869.

[098] Peptídeos parciais de IL-6 ou o receptor de IL-6 a ser usado na presente invenção são substâncias que têm uma atividade de ligação ao receptor de IL-6 ou IL-6, respectivamente, e que não transmitem as atividades biológicas de IL-6. Isto é, os peptídeos parciais de IL-6 ou do receptor de IL-6 se ligam a e capturam o receptor de IL-6 ou IL-6, e desse modo especificamente inibem a ligação de IL-6 ao receptor de IL-6. Como um resultado, as atividades biológicas de IL-6 não são transmitidas, e assim, a transdução de sinal mediada por IL-6 é bloqueada.

[099] Peptídeos parciais de IL-6 ou do receptor de IL-6 são peptídeos que são compostos da sequência de aminoácido integral da região da sequência de aminoácido de IL-6 ou receptor de IL-6 ou uma parte desta envolvida na ligação entre IL-6 e o receptor de IL-6. Tais peptídeos são usualmente compostos de 10 a 80, preferivelmente 20 a 50, mais preferivelmente 20 a 40 resíduos de aminoácido.

[0100] Peptídeos parciais de IL-6 ou do receptor de IL-6 podem ser produzidos especificando-se a região da sequência de aminoácido de IL-6 ou receptor de IL-6 envolvida na ligação entre IL-6 e o receptor de IL-6, e aplicando-se métodos geralmente conhecidos tais como técnicas de engenharia genética e métodos de síntese de peptídeo à sequência de aminoácido integral da região especifica ou uma porção desta.

[0101] Para preparar um peptídeo parcial de IL-6 ou um receptor de IL-6 por métodos de engenharia genética, uma sequência de DNA que codifica o peptídeo desejado é inserida em um vetor de expressão, e depois o peptídeo pode ser obtido aplicando-se os métodos anteriormente mencionados para expressar, produzir, e purificar anticorpos recombinantes.

[0102] Para produzir um peptídeo parcial de IL-6 ou um receptor de IL-6 por métodos de síntese de peptídeo, métodos de síntese de peptídeo geralmente usados tais como métodos de síntese de fase sólida e métodos de síntese de fase líquida podem ser usados.

[0103] Especificamente, os peptídeos podem ser sintetizados de acordo com o método descrito em "The sequel of Development of Pharmaceuticals (Zoku Iyakuhin no Kaihatsu), Vol. 14, Peptide Synthesis (ed. Haruaki Yajima, 1991, Hirokawa Shoten)". Como um método de síntese de fase sólida, o seguinte método e semelhantes podem ser utilizados: ligação do aminoácido correspondendo ao término C do peptídeo a ser sintetizado a um suporte que é insolúvel em solventes orgânicos, e depois prolongando o filamento de peptídeo repetindo-se alternadamente (1) a reação de condensar aminoácidos cujos grupos α-amino e grupos funcionais de cadeia ramificada são protegidos com grupos de proteção apropriados, um por um em uma direção do término C ao término N; e (2) a reação de remover os grupos de proteção dos grupos α-amino dos aminoácidos ou peptídeos ligados à resina. A síntese de peptídeo de fase sólida é amplamente classificada no método Boc e no método Fmoc, dependendo do tipo de grupos de proteção usados.

[0104] Depois de sintetizar o peptídeo de interesse como acima, a reação de desproteção e a reação de clivagem do filamento de peptídeo do suporte são realizadas. Para a reação de clivagem do filamento de peptídeo, fluoreto de hidrogênio ou ácido trifluorometano sulfônico é geralmente usado para o método Boc, e TFA é geralmente usado para o método Fmoc. No método Boc, por exemplo, a resina ligada a peptídeo protegida é tratada com fluoreto de hidrogênio na presença de anisol. Depois, o peptídeo é recuperado removendo-se os grupos de proteção e clivando-se o peptídeo de seu suporte. Liofilizando-se o peptídeo recuperado, um peptídeo bruto pode ser obtido. No método Fmoc, a reação de desproteção e a reação de clivagem do filamento de peptídeo do suporte podem ser realizadas em TFA e semelhantes por operações similares àquelas descritas acima.

[0105] Os peptídeos brutos obtidos podem ser separados e purificados aplicando-se HPLC. Eluição pode ser realizada sob condições ideais usando um sistema de solvente de água-acetonitrila, que é geralmente usado para a purificação de proteína. As frações correspondendo aos picos do perfil cromatográfico obtido são coletadas e secas por congelamento. Frações de peptídeo purificadas deste modo são identificadas por análise de peso molecular por intermédio de análise de espectro de massa, análise de composição de aminoácido, análise de sequência de aminoácido, e semelhantes.

[0106] Exemplos específicos dos peptídeos parciais de IL-6 e do receptor de IL-6 são divulgados em JP-A (Kokai) H02-188600, JP-A (Kokai) H07-324097, JP-A (Kokai) H08-311098, e Publicação de Patente dos EUA No US5210075.

[0107] Os anticorpos usados na presente invenção podem ser anticorpos conjugados que são ligados a várias moléculas tais como polietilenoglicol (PEG), substâncias radioativas, e toxinas. Tais anticorpos conjugados podem ser obtidos modificando-se quimicamente os anticorpos obtidos. Métodos para modificação de anticorpo já foram estabelecidos neste campo. Consequentemente, o termo "anticorpo" como usado aqui abrange anticorpos conjugados semelhantes.

[0108] Na presente invenção, "doença relacionada a IL-6" refere- se a uma doença relacionada a IL-6, e exemplos incluem artrite reumatoide, artrite idiopática juvenil, artrite idiopática juvenil de início sistêmico, doença de Castleman, lúpus eritematoso sistêmico (SLE), nefrite luptosa, doença de Crohn, linfoma, colite ulcerativa, anemia, vasculite, doença de Kawasaki, doença de Still, amiloidose, esclerose múltipla, transplante, degeneração macular relacionada à idade, espondilite anquilosante, psoríase, artrite psoriática, doença pulmonar obstrutiva crônica (COPD), nefropatia por IgA, osteoartrite, asma, nefropatia diabética, GVHD, endometriose, hepatite (NASH), infarto do miocárdio, arteriosclerose, sepse, osteoporose, diabete, mieloma múltiplo, câncer de próstata, câncer renal, linfoma não-Hodgkin de células B, câncer pancreático, câncer de pulmão, câncer esofágico, câncer de cólon, caquexia associada ao câncer, invasão de nervos pelo câncer, infarto do miocárdio, neovascularização coroidal associada à miopia, neovascularização coroidal idiopática, uveíte, tireoidite crônica, hipersensibilidade retardada, dermatite de contato, dermatite atópica, mesotelioma, polimiosite, dermatomiosite, panuveíte, uveíte anterior, uveíte intermediária, esclerite, ceratite, inflamação orbital, neurite óptica, retinopatia diabética, vitreorretinopatia proliferativa, síndrome do olho seco, inflamação pós- operatória, neuromielite óptica, miastenia grave, e hipertensão pulmonar.

[0109] Na presente invenção, "intervalo de dosagem de rotina" refere-se a um intervalo de dosagem geralmente usado para os produtos farmacêuticos mencionados acima (composições farmacêuticas da presente invenção), por exemplo, um intervalo de dosagem para administração de rotina que pode ser descrito em uma inserção de pacote como "doses subsequentes devem ser administradas em intervalos de quatro semanas" e semelhantes. O intervalo de dosagem de rotina na presente invenção não é particularmente limitado, mas exemplos incluem um dia a 24 semanas, preferivelmente duas semanas a oito semanas, mais preferivelmente três a cinco semanas, e ainda mais preferivelmente quatro semanas. Os intervalos de dosagem de rotina podem ter uma certa faixa.

[0110] Na presente invenção, "dose de rotina" é uma dose comumente usada para os produtos farmacêuticos mencionados acima (composições farmacêuticas da presente invenção), por exemplo, uma dose geralmente administrada que pode ser descrita em uma inserção de pacote como "geralmente, uma dose única é 8 mg por kg de peso corpóreo". A dose de rotina na presente invenção não é particularmente limitada, mas a dose por administração pode ser, por exemplo, dois a 20 mg de inibidor de IL-6 por kg de peso corpóreo (2 a 20 mg/kg) ou 50 mg a 800 mg de inibidor de IL-6, preferivelmente dois a oito mg de inibidor de IL-6 por kg de peso corpóreo (2 a 8 mg/kg) ou 80 a 160 mg de inibidor de IL-6, ou mais preferivelmente 8 mg de inibidor de IL-6 por kg de peso corpóreo (8 mg/kg) ou 120 mg de inibidor de IL-6.

[0111] Na presente invenção, "período de dosagem de intervalo curto" refere-se a um período de administração para induzir tolerância imunológica contra fármacos (composições farmacêuticas da presente invenção) para suprimir a geração de anticorpos anti-fármaco devido à imunogenicidade. O período de dosagem de intervalo curto na presente invenção refere-se a um período onde a mesma dose como a dose de rotina é administrada múltiplas vezes em um intervalo mais curto do que o intervalo de dosagem de rotina. Embora o período de intervalo curto não seja particularmente limitado contanto que ele seja um período onde a tolerância imunológica é induzida, o período é preferivelmente uma a oito semanas a partir da administração inicial, e mais preferivelmente quatro semanas a partir da administração inicial. "A mesma dose como a dose de rotina" inclui doses que fornecem a mesma concentração sanguínea de inibidor de IL-6 como uma dose de rotina. "Intervalo mais curto do que o intervalo de dosagem de rotina" não é particularmente limitado contanto que ele seja mais curto do que um intervalo de dosagem de rotina, e seja preferivelmente metade de um intervalo de dosagem de rotina, por exemplo, duas semanas quando o intervalo de dosagem de rotina for quatro semanas. Por exemplo, o período de dosagem de intervalo curto pode ter uma certa faixa semelhante como uma a duas semanas. "(Sendo) administrado múltiplas vezes" refere-se a duas ou mais administrações incluindo a administração inicial, e é preferivelmente duas a cinco administrações incluindo a administração inicial, mais preferivelmente três administrações incluindo a administração inicial. Se a tolerância imunológica foi induzida pode ser determinada observando-se se a geração de anticorpos anti-fármaco é suprimida.

[0112] "Administração de rotina" na presente invenção refere-se a uma administração comumente usada para os produtos farmacêuticos mencionados acima (composições farmacêuticas da presente invenção), por exemplo, uma administração na "dose de rotina" e "intervalo de dosagem de rotina" descritos acima.

[0113] Exemplos preferidos de um "anticorpo anti-receptor de IL-6" da presente invenção incluem tocilizumabe que é um anticorpo IgG1 anti-receptor de IL-6 humanizado, e anticorpos anti-receptor de IL-6 humanizados produzidos modificando-se as regiões variáveis e constantes de tocilizumabe, especificamente, um anticorpo contendo uma região variável de cadeia pesada compreendendo a sequência da SEQ ID NO: 1 e uma região variável de cadeia leve compreendendo a sequência da SEQ ID NO: 2. Um exemplo mais preferível é um anticorpo contendo uma cadeia pesada compreendendo a sequência da SEQ ID NO: 3 (cadeia pesada de SA237) e uma cadeia leve compreendendo a sequência da SEQ ID NO: 4 (cadeia leve de SA237). SA237 é particularmente preferido.

[0114] Tais anticorpos podem ser obtidos de acordo com os métodos descritos em WO2010/035769, WO2010/107108, WO2010/106812, e semelhantes. Especificamente, anticorpos podem ser produzidos usando técnicas de recombinação genética conhecidas àqueles habilitados na técnica, com base na sequência do anticorpo anti-receptor de IL-6 mencionado acima (ver, por exemplo, Borrebaeck CAK e Larrick JW, THERAPEUTIC MONOCLONAL ANTIBODIES, Publicado no Reino Unido por MACMILLAN PUBLISHERS LTD, 1990). Um anticorpo recombinante pode ser obtido clonando-se um DNA que codifica o anticorpo a partir de um hibridoma ou uma célula produtora de anticorpo tal como um linfócito sensibilizado produtor de anticorpo, inserindo o DNA em um vetor apropriado, e introduzindo o vetor em um hospedeiro (célula hospedeira) para produzir o anticorpo.

[0115] Tais anticorpos podem ser isolados e purificados usando métodos de isolamento e purificação convencionalmente usados para purificação de anticorpo, sem limitação. Por exemplo, os anticorpos podem ser isolados e purificados selecionando-se e combinando-se apropriadamente cromatografia em coluna, filtração, ultrafiltração, relargagem, precipitação de solvente, extração de solvente, destilação, imunoprecipitação, eletroforese em SDS-gel de poliacrilamida, focalização isoelétrica, diálise, recristalização, e semelhantes.

[0116] Na presente invenção, o período de administração de rotina começa a partir da administração final do período de dosagem de intervalo curto. Mais especificamente, a administração final no período de dosagem de intervalo curto é seguida por um intervalo de dosagem de rotina, e depois a primeira administração no período de administração de rotina é realizada.

[0117] A composição farmacêutica da presente invenção é preferivelmente uma composição farmacêutica em que a mesma dose de um inibidor de IL-6 como a dose de rotina é administrada duas a cinco vezes com intervalos de uma a três semanas a partir da administração inicial no período de dosagem de intervalo curto, e depois o inibidor de IL-6 é administrado com intervalos de duas a oito semanas partindo da administração final no período de dosagem de intervalo curto usando uma dose de rotina de 50 mg a 800 mg por administração; ou mais preferivelmente uma composição farmacêutica em que SA237 é administrado três vezes na mesma dose como a dose de rotina com intervalos de duas semanas a partir da administração inicial no período de dosagem de intervalo curto (isto é, na semana 0, semana 2, e semana 4), e depois SA237 é administrado rotineiramente com intervalos de oito semanas partindo da administração final no período de dosagem de intervalo curto (isto é, na semana 12, semana 20, semana 28 e assim por diante com intervalos de oito semanas, contando a partir da administração inicial no período de dosagem de intervalo curto) usando uma dose de rotina de 120 mg por administração.

[0118] O programa de administração preferido para o inibidor de IL-6 pode ser ajustado, por exemplo, prolongando apropriadamente o intervalo de administração monitorando-se as condições da doença e mudanças nos valores de teste sanguíneo.

[0119] Composições farmacêuticas da presente invenção usadas para propósitos terapêuticos ou preventivos podem ser formuladas para produzir formulações secas por congelamento ou formulações de solução misturando-se, se necessário, com portadores, veículos farmaceuticamente aceitáveis adequados, e semelhantes. Os portadores e veículos farmaceuticamente aceitáveis adequados incluem, por exemplo, água esterilizada, solução salina fisiológica, estabilizadores, excipientes, antioxidantes (tais como ácido ascórbico), tampões (tais como fosfato, citrato, histidina, e outros ácidos orgânicos), anti-sépticos, tensoativos (tais como PEG e Tween), agentes quelantes (tais como EDTA), e aglutinantes. Outros polipeptídeos de peso molecular baixo, proteínas tais como albumina sérica, gelatina, e imunoglobulinas, aminoácidos tais como glicina, glutamina, asparagina, ácido glutâmico, ácido aspártico, metionina, arginina, e lisina, açúcares e carboidratos tais como polissacarídeos e monossacarídeos, e álcoois de açúcar tais como manitol e sorbitol também podem estar contidos. Quando da preparação de uma solução aquosa para injeção, solução salina fisiológica e soluções isotônicas compreendendo glicose e outros adjuvantes tais como D- sorbitol, D-manose, D-manitol, e cloreto de sódio pode ser usado; e solubilizadores apropriados tais como álcool (por exemplo, etanol), poliálcoois (tais como propileno glicol e PEG), e tensoativos não iônicos (tais como polisorbato 80, polisorbato 20, poloxâmero 188, e HCO-50) podem ser usados em combinação. Misturando-se hialuronidase na formulação, um volume de fluido maior pode ser administrado subcutaneamente (Expert Opin. Drug Deliv. Jul de 2007; 4(4): 427 - 40). Além disso, seringas podem ser pré-cheias com a composição farmacêutica da presente invenção. Formulações de solução podem ser preparadas de acordo com o método descrito em WO2011/090088.

[0120] Se necessário, as composições farmacêuticas da presente invenção podem ser encapsuladas em microcápsulas (por exemplo, aquelas fabricadas de hidroximetilcelulose, gelatina, e poli(metilmetacrilato)), ou incorporadas em sistemas de liberação de fármaco coloidal (por exemplo, lipossomas, microesferas de albumina, microemulsão, nanopartículas, e nanocápsulas) (ver, por exemplo, "Remington’s Pharmaceutical Science 16a edição", Oslo Ed. (1980)). Métodos para preparar os agentes farmacêuticos como agentes farmacêuticos de liberação controlada também são conhecidos, e métodos semelhantes podem ser aplicados às composições farmacêuticas da presente invenção (Langer et al., J. Biomed. Mater. Res. 15: 267 - 277 (1981); Langer, Chemtech. 12: 98 - 105 (1982); Patente dos EUA No 3.773.919; Publicação do Pedido de Patente Europeia No EP 58.481; Sidman et al., Biopolymers 22: 547 - 556 (1983); e EP 133,988).

[0121] A composição farmacêutica da presente invenção pode ser administrada a um paciente por intermédio de qualquer via apropriada. Por exemplo, ela pode ser administrada a um paciente intravenosamente por injeção em bolo ou por infusão contínua, intramuscularmente, intraperitonealmente, intracerebroespinhalmente, transdermicamente, subcutaneamente, intraarticularmente, sublingualmente, intrassinovialmente, oralmente, por inalação, localmente, ou externamente, por um certo período de tempo. Administração intravenosa ou administração subcutânea é preferida.

[0122] Todas as referências da técnica anterior citadas aqui são incorporadas por referência no presente relatório descritivo.

Exemplos

[0123] Aqui abaixo, a presente invenção será especificamente descrita com referência aos Exemplos, mas a mesma não deve ser interpretada como sendo limitada a estes. [Exemplo 1] Preparação de inibidores de IL-6

[0124] SA237, o anticorpo anti-receptor de IL-6 descrito no documento de patente, WO2010/035769 (um anticorpo contendo uma cadeia pesada tendo a sequência da SEQ ID NO: 26 de WO 2010/035769 (SEQ ID NO: 3 do presente relatório descritivo) e uma cadeia leve tendo a sequência da SEQ ID NO: 29 de WO 2010/035769 (SEQ ID NO: 4 do presente relatório descritivo) em WO2010/035769), foi produzido de acordo com a descrição no documento de patente anteriormente mencionado. O anticorpo produzido foi usado para preparar formulações para administração subcutânea pelo método no documento de patente de WO2011/090088. [Exemplo 2] Examinação por administração subcutânea única a sujeitos masculinos adultos saudáveis japoneses e caucasianos (SA001JP)

[0125] Segurança, tolerabilidade, farmacocinética, e biodisponibilidade de SA237 quando administrado subcutaneamente a sujeitos masculinos adultos saudáveis japoneses e caucasianos foram avaliadas. Neste estudo, SA237 foi administrado subcutaneamente ou intravenosamente por infusão por gotejamento a 48 indivíduos japoneses, e administrado subcutaneamente a 24 indivíduos caucasianos. A segurança e a tolerabilidade em uma única administração de SA237 foram predominantemente satisfatórias em 24 casos. A biodisponibilidade absoluta de SA237 para administrações subcutâneas de 60 mg e 120 mg foi de 64,6 % e 69,4 %, respectivamente. O desenvolvimento de anticorpos anti-SA237 foi observado em 39 de 72 sujeitos administrados com SA237. [Exemplo 3] Estudo comparativo de grupo paralelo, aberto por administração subcutânea múltipla a pacientes japoneses com artrite reumatoide (SA-105JP)

[0126] Os pacientes que satisfazem aos critérios seguintes foram selecionados como os sujeitos: (1) Diagnosticado com artrite reumatoide (RA) de acordo com os critérios de 1987 American College of Rheumatology (ACR); (2) Duração da doença RA por seis meses ou mais; (3) Mostrou um nível de proteína C-reativa (CRP) acima do limite superior da faixa de referência laboratorial em um teste realizado dentro de duas semanas antes de iniciar a administração do produto medicinal investigacional (IMP); (4) Da idade de 20 anos ou mais no momento do consentimento informado; (5) Assinou a forma de consentimento informado na pessoa; (6) Não recebeu tratamento com metotrexato (MTX) mais tarde ou em 16 semanas antes de iniciar a administração do IMP; (7) Não recebeu tratamento com leflunomida mais tarde ou em 12 semanas antes de iniciar a administração do IMP (ou mais tarde ou em quatro semanas antes de iniciar a administração do agente investigacional, se um tratamento com colestiramina padrão ou eliminação de fármaco foi realizado com carvão ativado); (8) Não recebeu tratamento com DMARD ou agentes imunossupressivos exceto aqueles descritos acima mais tarde ou em quatro semanas antes de iniciar a administração do agente investigacional; e (9) Não recebeu tratamento excedendo 10 mg por dia como equivalência de prednisolona, mais tarde ou em duas semanas antes de iniciar a administração do agente investigacional.

[0127] Os sujeitos foram randomizados em três grupos (grupos A, B, e C) de acordo com o método de registro central, e o estudo comparativo de grupo paralelo, aberto foi realizado (ver a Tabela 1). A randomização foi estratificada por peso corpóreo. Este estudo clínico compreende um período de avaliação primário, um período de extensão, e um período de acompanhamento.

[0128] No período de avaliação primário, 120 mg de SA237 foram administrados na semana 0, semana 2, e semana 4; e 120 mg, 60 mg, e 30 mg de SA237 foram administrados aos grupos A, B, e C, respectivamente, da semana 8 até a semana 16 com intervalos de quatro semanas. Posteriormente, em princípio, os grupos A, B, e C foram observados até as semanas 32, 28, e 24, respectivamente, tempo este em que as concentrações de SA237 séricas foram esperadas serem de nível indetectável em cada um dos grupos (a observação incluiu medições de anticorpo anti-SA237).

[0129] No período de extensão, 120 mg de SA237 foram administrados na semana 0, semana 2, e semana 4; e 120 mg de SA237 foram administrados da semana 8 até as 20 semanas com intervalos de quatro semanas, e a observação foi continuada até a semana 32.

[0130] O fármaco de teste estava na forma de um frasco cheio com 1,0 mL de uma solução contendo 120 mg de SA237. A solução continha L-histidina, L-arginina, ácido L-aspártico, e polioxietileno (160) polioxipropileno (30) glicol como aditivos, e foi ajustada ao pH 5,5 a 6,5. Em princípio, o fármaco foi subcutaneamente administrado à área abdominal. [Tabela 1] NÚMERO DE CASOS:

[0131] Nas avaliações farmacocinéticas e farmacodinâmicas, e na examinação de eficácia (no ajuste de análise completa (FAS)) e segurança de administrar repetidamente SA237 a pacientes com RA, os fundamentos dos sujeitos nos grupos de 11 casos respectivos (33 casos em total) submetidos a cada análise foi 59,0 a 65,0 anos de idade (faixa mediana para cada um dos grupos; o mesmo aplica-se daqui em diante) e 50,30 a 57,90 kg de peso corpóreo. A porcentagem de fêmeas em cada grupo foi alta, e foi 81,8 % no grupo A (casos 9/11), 90,9 % no grupo B (casos 10/11), e 63,6 % no grupo C (casos 7/11). Os sujeitos que receberam o agente investigacional até o final do período de avaliação primário foram os casos 10/11 (90,9 %) no grupo A, casos 10/11 (90,9 %) no grupo B, e casos 9/11 (81,8 %) no grupo C; e os sujeitos que podem ser observados durante a duração integral (o período de avaliação primário e o período de extensão) foram os casos 10/11 (90,9 %) no grupo A, casos 7/11 (63,6 %) no grupo B, e casos 7/11 (63,6 %) no grupo C. (1) Farmacocinética

[0132] Método de avaliação: Observação e teste foram realizados de acordo com as Tabelas 2 e 3. Onde o mesmo não é particularmente especificado, as avaliações foram realizadas antes da administração do agente investigacional. Mesmo se o período de avaliação primário definido não atingisse a conclusão, quando a avaliação foi realizada no dia da administração inicial ou depois da mesma do período de extensão, a observação e teste subsequentes para o período de avaliação primário foram determinados como sendo desnecessários. Os períodos de teste foram definidos como abaixo.

[0133] Período de avaliação primário: Em princípio, o período de observação e teste partindo do primeiro dia de administração do agente investigacional até as semanas 32, 28, e 24 para os grupos A, B, e C, respectivamente, tempo este em que as concentrações de SA237 sérias foram esperadas serem eliminadas. Entretanto, no caso quando a concentração de SA237 sérica foi confirmada como nível indetectável e a administração no período de extensão foi iniciada antes do final do período acima, o período de avaliação primário seria ajustado ao período até a observação e teste antes da primeira administração no período de extensão.

[0134] Período de extensão: Partindo da administração inicial no período de extensão a seguir da conclusão do período de avaliação primário, e até a observação e teste na semana 24 do período de extensão.

[0135] Período pós-observação: Partindo da conclusão da observação e teste na semana 24 do período de extensão e até a semana 32. [Tabela 2] CRONOGRAMA DE OBSERVAÇÃO E TESTE (PERÍODO DE AVALIAÇÃO PRIMÁRIO)

[Tabela 3] CRONOGRAMA DE OBSERVAÇÃO E TESTE (PERÍODO DE EXTENSÃO E PERÍODO DE ACOMPANHAMENTO)

[0136] Resultados: Gráficos indicando farmacocinética neste estudo são mostrados na Fig. 1. Os níveis mínimos da concentração de SA237 sérica foram aproximadamente constantes da semana 4 e em diante tanto no período de avaliação primário para o grupo A quanto no período de extensão. Por outro lado, as concentrações de SA237 séricas nos grupos B e C durante o período de avaliação primário diminuíram da semana 8 e em diante. Visto que o período de avaliação primário e o período de extensão não mostraram diferenças significantes na concentração de SA237 sérica e AUC0-2W até a semana 8, a farmacocinética não mudou quando a administração de SA237 foi interrompida e depois retomada. (2) Avaliações farmacodinâmicas

[0137] Resultados: Gráficos das avaliações farmacodinâmicas neste estudo são mostrados nas Figs. 2 e 3. Da semana 8 à semana 20 no grupo A durante o período de avaliação primário, e da semana 8 à semana 24 durante o período de extensão, onde a concentração de SA237 sérica foi mantida em um nível constante, e a concentração de sIL-6R sérica também foi mantida em um nível aproximadamente constante. Por outro lado, da semana 8 e em diante nos grupos B e C durante o período de avaliação primário, a concentração sérica de sIL- 6R, que é um marcador de PD para inibição de IL-6, diminuiu junto com a redução na concentração de SA237.

[0138] Durante o período de avaliação primário, CRP, que é um marcador de PD para inibição de IL-6, foi mais baixo do que o limite inferior de quantificação (0,005 mg/dL) da semana 4 à semana 20 em aproximadamente metade dos sujeitos no grupo A, e a média também permaneceu baixa em torno de 0,01 mg/dL. O valor aumentou para 0,1 mg/dL ou mais alto da semana 16 e em diante no grupo B e da semana 8 e em diante no grupo C. A porcentagem de normalização de CRP (0,3 mg/dL ou menos) também mostrou uma tendência similar à mudança na média. As porcentagens na semana 4 para cada um dos grupos foram 81,8 % a 90,9 %; e subsequentemente, quando as porcentagens na semana 20 foram comparadas àquelas da semana 8, o grupo A não mostrou mudança de 100 %, o grupo B mostrou uma mudança de 81,8 % a 80,0 % e foi cerca da mesma, e o grupo C mostrou uma diminuição de 90,9 % a 33,3 %. Na maioria dos sujeitos e pontos no tempo, CRP foi considerado como sendo diminuído do nível de referência, contanto que a concentração de SA237 sérica seja quantificável (0,2 μg/mL). (3) Eficácia

[0139] Método de avaliação: DAS28 (Registro de atividade de doença modificada com base em registros de 28 articulações) é um indicador para avaliar a atividade de artrite reumatoide, que é calculada a partir da equação seguinte usando a contagem de articulações dolorosas (TJC) e contagem de articulações inflamadas (SJC) nas 28 articulações, ESR, e a "avaliação global do paciente". A mudança no DAS28 a partir do início da administração até o dia final de observação foi examinada. Estatísticas de sumário (média, desvio padrão, mediana, valor mínimo, e valor máximo) foram calculadas para cada grupo e cada período. Além disso, a taxa de remissão clínica foi calculada. VINTE E OITO ARTICULAÇÕES EXAMINADAS QUANTO A DAS28

[0140] Critérios de melhoria de ACR de 20 %, 50 %, e 70 % (ACR20, ACR50, e ACR70) foram avaliados como abaixo. CRITÉRIOS DE MELHORIA DE ACR

[0141] Resultados: O curso de tempo de registros de DAS28 no período de avaliação primário, que indica a eficácia neste exame, é mostrado abaixo na Tabela 4. [Tabela 4]

[0142] DAS28 mostrou melhoria na semana 8. Depois do começo da administração de doses diferentes (na semana 8) no período de avaliação primário, o grupo A mostrou ainda mais melhoria em DAS28, o grupo B não mostrou uma mudança significante, e o grupo C mostrou uma tendência para retornar ao registro de valor de referência.

[0143] A frequência de 20 % de melhoria como por critérios de ACR foi 70,0 % a 81,8 % em cada um dos grupos na semana 8, a frequência de 50 % de melhoria foi 40,0 % a 50,0 %, e a frequência de 70 % de melhoria foi 18,2 % a 30,0 %. Na semana 20 comparada à semana 8, a frequência de melhoria de 20 % foi mantida nos grupos A e B, mas diminuiu no grupo C. As frequências de melhoria de 50 % e 70 % na semana 20 no grupo A aumentou para 72,7 % (casos 8/11) e 54,5 % (casos6/11), respectivamente, comparadas aos valores na semana 8; entretanto, nenhuma mudança significante foi observada nos grupos B e C. (4) Avaliação, eficácia e segurança de imunogenicidade e farmacocinética, farmacodinâmica nos casos positivos para anticorpo

[0144] Anticorpos anti-SA237 foram detectados em um único caso para cada um dos grupos B e C, isto é, casos 2/33 em total. Nestes dois casos, a concentração de SA237 sérica durante o período de extensão depois que os anticorpos anti-SA237 foram detectados foi mais baixa do que o limite inferior de quantificação, e a partir do momento que os anticorpos foram detectados e em diante, o aumento na concentração de receptor de IL-6 solúvel (sIL-6R) e a diminuição na concentração de CRP devido à administração de SA237 não foram observados, e DAS28, CDAI, e SDAI foram aumentados. Um evento adverso, que foi diabete suave, foi observado em um destes dois casos depois que os anticorpos foram detectados. Este evento adverso não foi uma reação alérgica, mas foi uma exacerbação das complicações. Um problema de segurança não foi observado em administrar repetidamente SA237 a ambos os sujeitos depois que os anticorpos foram detectados. (5) Conclusão

[0145] Quando 120 mg de SA237 foram administrados a pacientes com RA três vezes com intervalos de duas semanas, seguido por três administrações de 120 mg com intervalos de 4 semanas a partir da semana 8 e em diante, uma concentração de fármaco sérica estável foi mantida da semana 4 até quatro semanas depois da administração final. Isto resultou em concentração alta de sIL-6R sérica e CRP baixo, e melhoria estável de todos os itens para avaliação da eficácia incluindo DAS28. A incidência de um anticorpo anti-SA237 para o estudo clínico inteiro foi 6,1 % (casos 2/33), e nos casos onde um anticorpo anti-SA237 foi detectado, a concentração de SA237 sérica foi descoberta diminuir depois da detecção do anticorpo anti-SA237, mas problemas de segurança não foram observados e a imunogenicidade foi considerada aceitável. Consequentemente, não houve nenhuma preocupação com segurança neste regime de administração.

Aplicabilidade Industrial

[0146] As composições farmacêuticas ou regime da presente invenção podem resolver o problema imunogênico de geração de anticorpo anti-fármaco, diminuir os efeitos colaterais, e fornecer uma composição farmacêutica que apresenta efeitos terapêuticos mais altos com menos carga ao paciente visto que a mesma não expõe o paciente a doses altas.

Claims

1. Uso de um anticorpo receptor de IL-6 compreendendo uma cadeia pesada tendo a sequência da SEQ ID NO: 3 e uma cadeia leve tendo a sequência da SEQ ID NO: 4, caracterizado pelo fato de ser para a preparação de um medicamento para o tratamento ou prevenção de uma doença relacionada a IL-6, em que o medicamento é uma formulação para administração subcutânea e é administrado três vezes na mesma dose como a dose de rotina com intervalos de duas semanas a partir da administração inicial no período de dosagem de intervalo curto, e então rotineiramente administrada com intervalos de quatro semanas a partir da administração final no período de dosagem de intervalo curto, e em que a dose de rotina é 120 mg por administração.

2. Uso, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o anticorpo receptor de IL-6 é SA237.

3. Uso, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que a doença relacionada a IL-6 é artrite reumatoide, artrite idiopática juvenil, artrite idiopática juvenil de início sistêmico, doença de Castleman, lúpus eritematoso sistêmico (SLE), nefrite luptosa, doença de Crohn, linfoma, colite ulcerativa, anemia, vasculite, doença de Kawasaki, doença de Still, amiloidose, esclerose múltipla, transplante, degeneração macular relacionada à idade, espondilite anquilosante, psoríase, artrite psoriática, doença pulmonar obstrutiva crônica (COPD), nefropatia por IgA, osteoartrite, asma, nefropatia diabética, GVHD, endometriose, hepatite (NASH), infarto do miocárdio, arteriosclerose, sepse, osteoporose, diabete, mieloma múltiplo, câncer de próstata, câncer renal, linfoma não-Hodgkin de células B, câncer pancreático, câncer de pulmão, câncer esofágico, câncer de cólon, caquexia associada ao câncer, invasão de nervos pelo câncer, infarto do miocárdio, neovascularização coroidal associada à miopia, neovascularização coroidal idiopática, uveíte, tireoidite crônica, hipersensibilidade retardada, dermatite de contato, dermatite atópica, mesotelioma, polimiosite, dermatomiosite, panuveíte, uveíte anterior, uveíte intermediária, esclerite, ceratite, inflamação orbital, neurite óptica, retinopatia diabética, vitreorretinopatia proliferativa, síndrome do olho seco, inflamação pós-operatória, neuromielite óptica, miastenia grave, ou hipertensão pulmonar.