JP3507073B2 - 特異的結合対の成員の製造方法 - Google Patents

特異的結合対の成員の製造方法

Info

Publication number
JP3507073B2
JP3507073B2 JP51640093A JP51640093A JP3507073B2 JP 3507073 B2 JP3507073 B2 JP 3507073B2 JP 51640093 A JP51640093 A JP 51640093A JP 51640093 A JP51640093 A JP 51640093A JP 3507073 B2 JP3507073 B2 JP 3507073B2
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
site
sequence
primary
phage
specific recombination
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Fee Related
Application number
JP51640093A
Other languages
English (en)
Other versions
JPH07505055A (ja
Inventor
スチュアート ジョンソン，ケビン
ポール ウィンター，グレゴリー
デビッド グリフィスズ，アンドリュー
ジョン ハモンド スミス，アンドリュー
ウォーターハウス，ピーター
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Medical Research Council
Original Assignee
Medical Research Council
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from GB929206318A external-priority patent/GB9206318D0/en
Priority claimed from PCT/GB1992/000883 external-priority patent/WO1992020791A1/en
Application filed by Medical Research Council filed Critical Medical Research Council
Publication of JPH07505055A publication Critical patent/JPH07505055A/ja
Application granted granted Critical
Publication of JP3507073B2 publication Critical patent/JP3507073B2/ja
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Fee Related legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C40—COMBINATORIAL TECHNOLOGY
    • C40B—COMBINATORIAL CHEMISTRY; LIBRARIES, e.g. CHEMICAL LIBRARIES
    • C40B40/00—Libraries per se, e.g. arrays, mixtures
    • C40B40/02—Libraries contained in or displayed by microorganisms, e.g. bacteria or animal cells; Libraries contained in or displayed by vectors, e.g. plasmids; Libraries containing only microorganisms or vectors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/22—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against growth factors ; against growth regulators
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/24—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against cytokines, lymphokines or interferons
    • C07K16/241—Tumor Necrosis Factors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C07K16/2812—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against CD4
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2863—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against receptors for growth factors, growth regulators
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2866—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against receptors for cytokines, lymphokines, interferons
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C07K16/3007—Carcino-embryonic Antigens
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/40—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against enzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/42—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against immunoglobulins
    • C07K16/4208—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against immunoglobulins against an idiotypic determinant on Ig
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/46—Hybrid immunoglobulins
    • C07K16/461—Igs containing Ig-regions, -domains or -residues form different species
    • C07K16/462—Igs containing a variable region (Fv) from one specie and a constant region (Fc) from another
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/46—Hybrid immunoglobulins
    • C07K16/468—Immunoglobulins having two or more different antigen binding sites, e.g. multifunctional antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1034—Isolating an individual clone by screening libraries
    • C12N15/1037—Screening libraries presented on the surface of microorganisms, e.g. phage display, E. coli display
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J2219/00—Chemical, physical or physico-chemical processes in general; Their relevant apparatus
    • B01J2219/00274—Sequential or parallel reactions; Apparatus and devices for combinatorial chemistry or for making arrays; Chemical library technology
    • B01J2219/00718—Type of compounds synthesised
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/55—Fab or Fab'
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C07K2317/62—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising only variable region components
    • C07K2317/622—Single chain antibody (scFv)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/02—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a signal sequence
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/40—Fusion polypeptide containing a tag for immunodetection, or an epitope for immunisation
    • C07K2319/41—Fusion polypeptide containing a tag for immunodetection, or an epitope for immunisation containing a Myc-tag
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/70—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction
    • C07K2319/735—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing a domain for self-assembly, e.g. a viral coat protein (includes phage display)

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は特異的結合対（sbp）の成員の製造方法に関
する。特に本発明はsbp成員のポリペプチド鎖成分をコ
ードする核酸を含有するベクター間の組換えを包含する
特異的結合対の成員の製造方法に関する。
構造的には、最も簡単な抗体（IgG）は４つのポリペ
プチド鎖、即ちジスルフィド結合により相互連結される
２本の重（Ｈ）鎖及び２本の軽（Ｌ）鎖から成る（図１
参照）。Ｌ鎖はカッパ（Κ）ラムダ（λ）と呼ばれる２
つの異なる形態で存在する。各鎖は不変部（Ｃ）及び可
変部（Ｖ）を有する。各鎖は一連のドメイン中に組織化
される。Ｌ鎖は一方がＣ部に対応し他方がＶ部に対応す
る２つのドメインを有する。Ｈ鎖は１つがＶ部に、そし
て３ドメイン（1,2及び３）がＣ部にある４つのドメイ
ンを有する。抗体は２つのアームは（各アームはFab部
にある）を有し、各々が相互に関連したVL及びVH部を有
する。ある抗体が他の抗体と異なるのはＶ部のこの対
（VL及びVH）であり、ともに抗原を認識し抗原結合部位
（ABS）を提供することに関与する。さらに詳細に言え
ば、各Ｖ部は４つのフレームワーク領域（FR）で分離さ
れる３つ相補性決定領域（CDR）から成る。CDRは可変部
の最も変動し易い部分であり、それらは重大な抗原結合
機能を成し遂げる。CDR領域は組換え、突然変異及び選
択を含めた複雑な工程を経て多数の潜在的再生産系列配
列から得られる。
結合抗原の機能は全抗体の断片により実施しされるこ
とが示されている。結合断片の例としては、（ｉ）VL,V
H,CL及びCH1ドメインから成るFab断片；（ii）VH及びCH
1ドメインから成るFd断片；（iii）抗体の単一アームの
VL及びVHドメインから成るFv断片；（iv）VHドメインか
ら成るdAb断片（Ward,E.S.et al.,Nature 341,544−546
（1989））；（ｖ）単離CDR領域及び（vi）Ｆ（ab'）２
断片、即ちヒンジ部でのジスルフィド架橋により結合さ
れる２つのFab断片から成る二価断片が挙げられる。
Fv断片の２つのドメインは別々の遺伝子によりコード
されるがしかし、組換え法によりそれらを単一タンパク
質鎖（一重鎖Fv（scFv）として公知;Bird,R.E.et al.,S
cience 242,423−426（1988）;Huston,J.S.et al.,Pro
c.Natl.Acad.Sci.,USA 85,5879−5883（1988））として
製造され得るようにする合成リンカーを製造することが
できることが立証されている。これらのscFv断片は、予
め単離されていたモノクローナルからの遺伝子から収集
された。
大きな生物学的機能性結合分子（例えば抗体断片、並
びに酵素及び受容体）をその表面で発現及び表示し、そ
して依然として無傷で且つ感染性であるバクテリオファ
ージが構築された。これは国際特許WO 92/01047（この
記載内容は参照により本明細書中に含めるものとする）
に記載されている。本文書の読者は、本明細書に記載さ
れている実験に用いられる多数の手順の詳細な説明のた
めには国際特許WO 92/01047をぜひとも念願において頂
きたい。出願人はウイルス粒子及びウイルス表面に表示
される結合分子を含有する構造を｀パッケージ´と呼ん
でいる。結合分子が抗体、抗体誘導体又は断片、あるい
はイムノグロブリンドメインと相同であるドメインであ
る場合は、出願人はパッケージを｀ファージ抗体´（pA
b）と呼ぶ。しかしながら別記する場合を除いて、ファ
ージ抗体という用語を用いる場合、それはウイルス粒子
及びウイルス表面に表示される生物学的機能性結合分子
を含有するあらゆるパッケージを指すと解釈されるべき
である。
pAbは、抗原結合活性をコードする抗体遺伝子を選択
するに際して一連の適用を有する。例えばpAbはハイブ
リドーマのクローニング及び救済のために（Orlandl,
R.,et al（1989）PNAS 86 p3833−3837）、そして大規
模組合せライブラリーのスクリーニングに（Huse,W.D.e
t al.,1989,Science 246,1275−1281）用い得る。特
に、pAbを用いる選択のラウンドは後者のライブラリー
からより高い親和性抗体を救済する場合の助けとなる抗
体のFv部から成る原VH/VL対を救済するためには、抗原
選択細胞に由来する小ライブラリーをスクリーニングす
る（Casali,P.,et al.,（1986）Science234 p476−47
9）のが好ましい。pAbの使用はさらに完全合成抗体の構
築を可能にする。さらにいくつかの合成配列、例えばCD
R、及びいくつかの天然由来配列を有する抗体を作成し
得る。例えばＶ遺伝子レパートリーは、未転位Ｖ遺伝子
をＤ及びＪセグメントと結合させることによりin vitro
で作成し得る。次にpAbのライブラリーを抗原と結合さ
せることにより選択し、抗原結合ループまたはＶドメイ
ンフレームワーク領域でin vitroに突然変異増進し、そ
してさらなるラウンドの選択及び突然変異誘発に供する
ことができる。
機能的抗原結合ドメインがファージの表面で表示され
得るという証明は、新規の抗体の構築以外に意味を有す
る。例えば他のタンパク質ドメインがファージ表面に表
示され得る場合は、表示タンパク質の結合特性によりフ
ァージベクターを用いて遺伝子をクローニングし選択し
得る。さらに、タンパク質表面に組み入れられるエピト
ープライブラリーを含めたタンパク質の変異体を作成
し、結合活性に関して容易に選択し得る。実際、他のタ
ンパク質構築は“新規の”抗体として役立つ。
本技術は第一の原理から抗体を構築する可能性を提供
し、抗原結合性ループが折り重なる構造フレームワーク
を利用する。概して、これらのループは他に採り得るル
ープの組合せによりそして異なる部位鎖により種々の結
合部位を生じる限定数のコンホーメーションを有する。
抗原結合部位のモデリングにおける最近の成功はde nov
o設計にとって幸先がよい。いかなる場合にも、抗原の
高分解能構造を要する。しかしながら、本アプローチは
例えば特に小基質に対する触媒性抗体の製造にとって魅
力的である。ここで、遷移状態の基質と選択的に結合す
るだけでなく、結合の生成及び分離に直接関与するため
に、補欠分子族に関する側鎖又は結合部位を導入しう
る。唯一の疑問は、結合のために特殊化された抗体構築
が触媒構築のための最良の出発点であるか否かというこ
とである。トリオースリン酸イソメラーゼ（TIM）バレ
ルのような真性酵素構築がより好適である。抗体と同様
に、TIM酵素も基質と結合するためのフレームワーク構
造（β−鎖及びα−ヘリックス バレル）及びループを
有する。多様な触媒特性を有する多数の酵素はこの構築
を基礎にしており、ループは新規の触媒及び結合特性の
設計のためにフレームワーク上で別々に操作し得る。本
開示により提供されるようなファージ選択系を用いて抗
原結合活性に関して選択し得るし、このようにして選択
されたCDRループを抗体フレームワーク又はTIMバレルフ
レームワーク上で用い得る。例えばTIMバレルフレーム
ワーク上に置かれたループをさらに突然変異誘発により
修飾して、さらに選択を施し得る。したがって、単一工
程において高親和性結合活性に関して選択する必要はな
い。低親和性が高親和性に進化する免疫系の戦法はより
実際的にあると思われるし、本発明を用いて模倣し得
る。
この種の適用に有用であると思われる分子の一種類と
しては受容体がある。例えば特異的受容体はそれがその
配位子を結合するようにファージの表面に表示し得る。
次に受容体を例えばin vitro突然変異誘発により修飾
し、変異体は選択される配位子に関してより高い結合親
和性を有する。選択は下記の１つ又はそれ以上のフォー
マットにより実施し得る。
あるいはファージ受容体は、配位子、変化配位子又は
は潜在的薬剤候補の結合に関する迅速スクリーニング系
の基礎として用い得る。この系の利点即ち簡単なクロー
ニング、便利な発現、標準的試薬及び容易な取扱いは薬
剤スクリーニング適用を特に魅力あるものにする。本考
察の状況では、受容体は特異的配位子又は特異的配位子
群を結合する分子を意味する。天然受容体は細胞集団の
表面に発現されるか、あるいはこのような分子（このよ
うな形態が天然に存在しようがすまいが）又は血中、あ
るいは細胞又は器官内で天然結合機能を遂行する可溶性
分子の細胞外ドメインである。
別の可能性は、酵素分子又はファージの表面での酵素
分子の活性部位の表示である（WO 92/01047の実施例11,
12,30,31,32及び36参照）。一旦ファージ酵素が発現さ
れると、それは例えば遷移状態類似体を用いて誘導され
るカラム上でアフィニティークロマトグラフィーにより
選択し得る。異なる又は修飾化特異性を有する酵素が所
望される場合、バクテリオファージ上の融合体として表
示される酵素を突然変異させ、次いで所望の修飾化特異
性を有する酵素に関して高親和性を有するよう選択され
た類似体で誘導されるカラム上で選択することができ
る。
本出願を通して、出願人はpAbの高親和性変異体に関
するスクリーニングの可能性を考察しているが、しかし
彼らは、いくつかの適用例えば低アフィニティークロマ
トグラフィー（Ohlson,S.et al.,Anal.Biochem.169,p20
4−208（1988））においては、低アフィニティー変異体
を単離するのが望ましいと認識している。
pAbはまた安定性改良のための抗体の選択を可能にす
る。37℃よりむしろ30℃で抗体が発現される場合に、収
量及び安定性が改良されるということが多数の抗体に関
して認められた。pAbが37℃で表示される場合、安定な
ものだけが親和性選択に用いられる。抗体が治療又は診
断のためにin vivoで用いられる場合、安定性増大は循
環中の抗体の半減期を延長し得る。
ファージを用いて選択される全ての抗体及び抗体ドメ
インにとって安定性は重要であるけれども、VH及びVL断
片の非共有結合により生成されるFv断片の選択に関して
それは特に重要である。Fv断片は解離する傾向があり、
全抗体に比して循環中の半減期が非常に減少する。Fv断
片は、遺伝子IIIタンパク質融合として発現されるある
鎖の可溶性断片として発現される相補的鎖との会合によ
りファージの表面に表示される。鎖の対が強い解離傾向
を示す場合、それらはpAbとして選択されるとは考えら
れない。したがって、集団は安定に会合する対に富むこ
とになる。解離はFab断片に関して問題を有することは
ほとんど無いが、しかし選択は安定に会合するFab断片
に関しても生じ得る。pAbはプロテアーゼ攻撃に対する
安定性のための選択を許し、プロテアーゼによって開裂
されないpAbだけがそれらの配位子と結合可能で、した
がって、ファージの集団は安定抗体ドメインを表示する
ものに富む。
ファージ表面の結合分子を表示する技術は、一次クロ
ーニング系としても用い得る。例えば、cDNAライブラリ
ーを構築してバクテリオファージに挿入し、このファー
ジライブラリーを配位子を結合する能力に関してスクリ
ーニングし得る。配位子／結合分子組合せは、互いに特
異的に結合する能力を有する分子のあらゆる対、例えば
受容体／配位子、酵素／基質（又は類似体）、核酸結合
タンパク質／核酸等が含まれる。相補的対の一方の成員
が利用できる場合、これは対の他方の成員に関するクロ
ーンを単離する好ましい方法であると思われる。
糸状ファージの表面に発現される一次機能性抗体分子
は、普通２つの別々のタンパク質上のＨ及びＬ鎖可変性
ドメインが可動性リンカーペプチドにより共有的に結合
されるために、いわゆる一重鎖Fv（scFv）であった。い
ま一つの発現方法も上首尾であった。鎖の一方（Ｈ又は
Ｌ）をg3キャプシドタンパク質と融合し相補的鎖が可溶
性分子として細胞周辺に輸送される場合に、Fab分子を
ファージ上に表示し得る。２本の鎖は同一の又は異なる
レプリコン上にコードされ得る；重要な点は、各Fab分
子における２つの抗体鎖が翻訳後に集合し、ダイマーが
g3pに対する鎖の１つの結合を介してファージ粒子中に
組込まれることである。
さらに最近のクローニングは、ファージDNAより約100
倍高い形質転換効率を有する｀ファージミド´ベクター
を用いて成し遂げられた。これらは、それらを保有する
細胞がトランス形でファージ成分を提供する｀ヘルパー
´ファージに感染した場合に、生成され、感染性糸状粒
子中にパッケージされるファジミドDNAの一重鎖コピー
を可能にする糸状ファージからの遺伝子間領域を含有す
るプラスミドである。ファージミドが抗体遺伝子（例え
ばpHEN−１）と融合するg IIIを含有する場合は、その
結果生じる融合タンパク質はファージミド粒子上に示さ
れる（Hoogenboom,H.R.,A.D.Grifiths,K.S.Johnson,D.
J.Chiswell,P.Hudson and G.Wlnter（1991）.Multi−su
bunit protelns on the surface of filamentous phag
e:methodologies for displaying antibody（Fab）heav
y and light chains.Nucleic Acids Res.19（15）,4133
−4137）。レパートリーのような多数の異なる抗体断片
を処理する場合に最も重要となる因子である抗体遺伝子
をクローニングするために有効な方法が開発された。
scFv断片がハプテンオキサザロンで免疫化したマウス
の脾臓mRNAから得られるファージ抗体レパートリーに関
する初期研究に、クローニングベクターfd−DOG−１が
用いられた（Clackson,T.,H.R.Hoogenboom A.D.Griffit
hs and G.Winter（1991）.Making antibody fragments
using phage display librarics.Nature.352,624−62
8）;VH及びVLドメインを別々に増幅し、次いでscFvリン
カーペプチドをコードする短DNA断片を介して無作為に
連結して約105の異なるクローンのライブラリーを作成
した。これは、機能性抗体を産生したVH及びVLの組合せ
を選択するために免疫化抗原に対して選択された。数個
の結合体が単離されたが、特にその内の１つは、慣用的
ハイブリドーマ法で産生される最良のモノクローナル抗
体の場合よりさほど低くない親和性を有した。
マウスにおいては、いずれの時にも約107位のＨ鎖及
び約105位のＬ鎖が認められ、２つの差を無作為に合わ
せると計1012位のVH:VLの組合せとなる（これらの数字
は概算であり、レパートリーのサイズのおよその指針を
提供するに過ぎない）。これらの数字により、上記のマ
ウスライブラリーは、107位のVH:VLの組合せにおいて１
つだけをサプリングした。抗原を認識できるＢ細胞がク
ローンで拡張されて大量のIg mRNAを産生する免疫化ド
ナーから脾臓細胞は得られたため、前段に記載した研究
において良好な親和性抗体が単離されたと思われる。こ
の実験における低ライブラリー複雑性は、一部はプラス
ミド（又はファージミド）に比して本質的に低いファー
ジDNAの形質転換率に依っている。
Marks等（Marks,J.D.,Hoogenboom,H.R.,Bonnert,T.
P.,McCafferty,J.,Griffiths,A.D.and Winter,G.（199
1）By−passing immunizatlon:Human antibodies from
V−gene libraries displayed on phage.J.Mol.Biol.22
2,581−597）及び国際特許WO 92/01047は、ファージミ
ドpHEN−１でクローニングした非免疫化ヒトからの抗体
レパートリーの構築を記載する。3.107個のクローンか
ら成るこのライブラリーは、多数の異なる抗原に対する
特異的抗体をこれまで産生してきた。これらの抗体は一
次免疫反応から予期される中程度の親和性を有する傾向
があり、このことは一連の構造的に異なった抗原に対す
る有用な抗体が単一供給源から実際に単離され得ること
を示す。
新規の結合体は、｀鎖シャッフリング´と呼ばれる手
法を用いてファージ抗体ライブラリーから単離されるク
ローンから生成し得る。この手法においては、２本の鎖
の一方は固定され、他方は変化する。例えば最高親和性
マウス抗−OXファージ抗体からのＨ鎖を固定してその横
側にＬ鎖のレパートリーを再クローニングすることによ
り、4.107のライブラリーを構築した。数個の新規のOX
−結合体が単離されたが、これらの大多数は最初に単離
されたものとは異なり且つかなり多様なＬ鎖を有した。
これらの観察は、一方の鎖だけが変化する場合に有用な
多様性を開発するには小ライブラリーで十分であり、元
のライブラリーが有用な多様性を含有するのに十分でな
い大きさである場合に有用な手法であるという事実を反
映している。
ライブラリーのサイズは決定的な重要性を有する。こ
れは、免疫化されていないヒトレパートリーから抗体を
単離しようとする場合に特にいえるが、しかし免疫化源
からの最高親和性抗体の単離にも同様に当てはまる。
ファージは抗体遺伝子をクローニング及び選択するた
めの例外的に強力な道具である一方、既存の技法を用い
て潜在的多様性を有する最小分画だけをわれわれは抜き
取っていることは明かである。形質転換効率はライブラ
リーサイズに最大の制限があって、109が最新方法を用
いたおよその限界である。概算は、これが目標効率を数
オーダー下回る大きさであることを示唆する；さらに厳
密な分析がそれを確証する。
PerelsonとOsterは、免疫レパートリーのサイズと一
定の値Ｋより大きい親和性をを有する既定エピトープを
認識することができる。抗体を生じる可能性との関係に
理論的考察を示した。その関係は以下の等式で記載され
る： Ｐ＝e-N（Ｐ［Ｋ］） （式中、Ｐ＝エピトープがレパートリー中のいかなる抗
体によっても域値Ｋより大きい親和性を有すると認めら
れない確率； Ｎ＝レパートリー中の異なる抗体の数；及び ｐ〔Ｋ〕＝個々の抗体が域値Ｋより大きい親和性を有
する無作為エピトープを認識する確率）。
この分析では、ｐ〔Ｋ〕は親和性に逆比率するが、し
かしこの関係を記す算法は正確に推論されなかった。こ
れにもかかわらず、抗体より高い親和性、より低いその
ｐ〔Ｋ〕及びより大きなレパートリーがその抗体を単利
する論理的確率を達成するには必要であることは明かで
ある。他の重要な特徴は、関数が指数である点である；
図１に示すように、ライブラリーの小変化は、曲線上の
どの点がライブラリーサイズにより指定されるかによっ
て、指定のｐ〔Ｋ〕値を有する抗体を単離する確率にご
くわずかなまたは劇的な影響を及ぼし得る。
国際特許WO 92/01047及びWO 92/20791は、感染のよう
なDNAを細胞に導入する他の方法の使用により、形質転
換効率の制限（したがってライブラリーサイズの上限）
を如何に克服し得るかを記載する。ある配置では、Ｈ及
びＬ鎖遺伝子は、少なくとも一方が糸状粒子中に組み込
まれ得る２つの異なるレプリコン上で別々にクローニン
グされる。一方の鎖を保有する感染粒子を相補的鎖を有
する細胞中に感染させる；＞90％の感染頻度は容易に達
成し得る。次いでＨ及びＬ鎖を細胞周囲で翻訳後に会合
させると、その組合せはg3pに結合される一方または両
方の鎖によって糸状粒子の表面に表示される。例えば、
107H鎖のライブラリーをファージミド中で未融合集団と
してクローニングし、107L鎖をfd−DOG−１でg3融合体
としてクローニングする。次に両集団を、それらが107
の各Ｈ鎖含有細胞及び107コピーの各Ｌ鎖ファージが存
在するように増殖により拡張させる。異なるＬ鎖を有す
る107個のファージにより各々感染され得る同一Ｈ鎖を
有する107個の細胞が存在するために、ファージを細胞
に感染させることにより107×107＝1014個の独特の組合
せが生じ得る。これを各々の異なるＨ鎖クローンをに関
して反復させると、あるものは最後には異なる細胞にお
いて1014個までの異なるH/L組合せを有するようにな
る。この方法を図２に略述するが、ファージ上のg3融合
としてクローン化されるＨ鎖と、ファージミドからの可
溶性断片として発現されるＬ鎖をしめす。明らかに、逆
の組合せ、即ちファージ上のＬ鎖、ファージミド上のＨ
鎖も主張し得る。
図２に示す配置では、fd−DOGは、ファージ及びファ
ージミドDNAの両方が糸状粒子中にパッケージされるよ
うにファージミドを｀救済´し、それらの一方のみに関
する遺伝情報しか有していないにもかかわらず、両方が
それらの表面でＨ及びＬ鎖を一対にする。規定の抗原ま
たはエピトープに関しては、大多数のＨ及びＬ鎖対は非
機能性であり（即ちその抗原またはエピトープを結合し
ない）、したががって抗原上の選択はＨ及びＬ鎖集団の
複雑性を大いに低減する効果を有する。選択の第一ラウ
ンド終了後に、クローンは、例えば新鮮な宿主細胞を感
染させて両レプリコンに関して選択することにより組換
えがなされる。数ラウンドの抗原選択及び２つのレプリ
コンの回収後、かなり低減されたＨ及びＬ鎖集団を同一
レプリコン上でクローン化して、慣用手段で分析し得
る。いわゆる1014の組合せからの選択により、所望の特
異性を有するＨ及びＬ鎖の特定の組合せを示すファージ
集団が生じる。しかしながら、選択されたファージは対
合したＨ及びＬ鎖の一方の相手をコードするDNAを含有
するだけである。２つのレプリコンに関する選択を以下
に示す。Ｈ鎖ライブラリーのベクターはテトラサイクリ
ン耐性をコードし、Ｌ鎖ライブラリーのベクターはアン
ピシリン耐性をコードする。集団を含有する標本溶離液
を２つの部分に分ける。第一の部分は、例えばテトラサ
イクリンプレート上で増殖させて所望の抗原結合に包含
されるＨ鎖をコードするDNAを含有するバクテリオファ
ージを選択する。第二の部分は、例えばアンピシリンプ
レート上で増殖させて所望の抗原結合に包含されるＬ鎖
をコードするDNAを含有するバクテリオファージを選択
する。ついで、例えばテトラサイクリンプレートから別
々に単離されたクローンからの１組のコロニーを用い
て、例えばアンピシリンプレートからの特定のコロニー
を感染させる。これによってＨ及びＬ鎖の特定の組合せ
を発現するバクテリオファージを生じ、次にこれを抗原
結合に関して検定し得る。
VL及びVH鎖に関する別々のレプリコンの使用に伴う１
つの技術的問題は、同一複製機構に対する競合の結果と
して異なるレプリコン上で実行される複製の糸状ファー
ジオリジン間のいわゆる｀干渉´である。
先ずレパートリーの複雑性を低減し、次いで低減集団
の一方または両方の鎖を再クローニングするという原則
に基づいて実行手順が記載されている（WO92/20791）。
本発明は異なるアプローチを示す。
用 語 本節で考察される用語の多くは、適切な場合は本文中
に記載した。
特異的結合対（sbp） これは天然由来または合成により生成された分子の対
（各々が特異的結合対の成員である）を示す。分子対の
一方はその表面上の領域または特異的に結合する腔を有
し、したがって他の分子の特定の空間及び極性編成に関
して相補的であると定義され、したがってその対は互い
に特異的に結合するという特性を有する。特異的結合対
の型の例としては、抗原−抗体、ビオチン−アビジン、
ホルモン−ホルモン受容体、受容体−配位子、酵素−基
質、IgG−プロテインＡが挙げられる。
多重合性成員 これは、ポリペプチドが遊離形態で及び／又は基質表
面で発現される場合に、少なくとも二次ポリペプチドと
会合する一次ポリペプチドを示す。基質はバクテリオフ
ァージにより提供される。２個の会合ポリペプチドが存
在する場合は、会合ポリペプチド複合体は二量体であ
り、３個の場合は三量体という具合いである。二量体、
三量体、多量体等、又は多重合性成員は、特異的結合対
の一員を包含し得る。
多重合性成員の例としては、イムノグロブリン分子を
基礎にしたＨドメイン、イムノグロブリン分子を基礎に
したＬドメイン、Ｔ細胞受容体サブユニットが挙げられ
る。
複製可能遺伝子表示パッケージ（Rgdp） これは、複製する能力を有する粒子を提供する遺伝情
報を有する生物学的粒子を示す。粒子は、ポリペプチド
の少なくとも一部をその表面に表示し得る。ポリペプチ
ドは粒子に本来備わっている及び／又は人工的に粒子又
はその祖先の中に置かれた遺伝情報によりコードされ
る。表示ポリペプチドは特異的結合対の任意の成員、例
えばイムノグロブリン分子を基礎にしたＨ又はＬ鎖ドメ
イン、酵素又は受容体等である。
粒子はウイルス、例えばfd又はM13のようなバクテリ
オファージであってもよい。
パッケージ これは、粒子がその表面で特異的結合対の一員を発現
中の複製可能性遺伝子表示パッケージを示す。この種の
パッケージはファージ抗体（pAb）と呼ばれている。
抗 体 これは、天然のものであれ、あるいは部分的又は全体
的に合成で生成されたものであれ、イムノグロブリンを
示す。本用語はまたイムノグロブリン結合ドメインと相
同の結合ドメインを有するあらゆるタンパク質を網羅す
る。これらのタンパク質は天然供給源から得られるか、
あるいは一部又は全部合成により生成される。
抗体の例としては、イムノグロブリンアイソタイプ及
びFab,F（ab1）2,scFv,Fv,dAb,Fd断片が挙げられる。
イムノグロブリン超科 これは、ポリペプチド族を示し、その成員はイムノグ
ロブリン分子の可変又は不変ドメインの構造に関連した
構造を有する少なくとも１つのドメインを有する。ドメ
インは２つのβシート、並びに通常は保存ジスルフィド
結合を含有する（A.F.Williams and A.N.Barclay 1988
Ann.Rev Immunol.6,381−405参照）。
イムノグロブリン超科の成員の例としては、CD4、血
小板由来成長因子受容体（PDGFR）、細胞間付着分子（I
CAM）が挙げられる。別記する場合を除いて、本出願中
のイムノグロブリン及びイムノグロブリン同族体につい
ての言及は、イムノグロブリン超科及びその同族体の成
員を含む。
同族体 この用語は、その一次、二次又は三次構造における対
応する位置に同一又は保存残基を有するポリペプチドを
示す。本用語はまた、相同ポリペプチドをコードする２
つ又はそれ以上のヌクレオチドに及ぶ。
相同ペプチドの例は、イムノグロブリンアイソタイプ
である。
機能的 rgdpの表面に表示されるsbp成員に関しては、sbp成員
が折り畳まれた形態で存在し、その場合その相補的sbp
成員に対するその特異的結合ドメインはその本来の配置
と同一であるか又は非常に類似し、それにより相補的sb
p成員に関して同様の特異性を示す。これに関しては、
それは上記のSmith等のペプチドとは異なって、明確な
折り畳み配置をもたず、それらが接触され得る相補的成
員により決定される種々の配置を想定し得る。
遺伝的多様集団 sbp成員又はそのポリペプチド成分に関連して、これ
は細胞又は生物体の天然集団に存在し得る多様性だけで
なく、in vitro又はin vivoの人工的突然変異により生
じ得る多様性をも指している。
In vitroの突然変異としては、例えば変更が望ましい
配列の無作為突然変異を有するオリゴヌクレオチドを用
いる無作為突然変異誘発が挙げられる。In vivo突然変
異誘発は、例えばDNAを保有するために宿主微生物のミ
ューテーター株を用い得る（WO 92/01047の実施例37参
照）。“集団”という言葉はそれ自体、複数の例えばポ
リペプチド鎖を表すために用い得るが、これは遺伝的に
は多様ではなく、即ちそれらはすべて同一である。
ドメイン ドメインはそれ自体の内側に折り畳まれるタンパク質
の一部であり、同一タンパク質の多の部分とは無関係
で、且つ相補的結合成員とは無関係である。
折り畳みユニット これはα−ヘリックス及び／又はβ鎖及び／又はβ戻
り構造の特定の組合せである。ドメイン及び折り畳みユ
ニットは、一次構造において隣接しないアミノ酸を結び
合わせる構造を含有する。
遊離形態 これは複製可能性遺伝子表示パッケージにより表示さ
れないポリペプチドの状態を示す。
条件付きで不完全な これは、ある条件下では特定のポリペプチドを発現し
ないが、しかし別の条件下ではそれを発現する遺伝子を
示す。例としては、それぞれ非抑圧又は抑圧宿主で発現
されるアンバー突然変異を含有する遺伝子がある。
あるいは、遺伝子は一揃いの条件下では不完全である
が、しかし別の条件下ではそうでない。例としては、温
度感受性突然変異を有する遺伝子である。
抑圧性翻訳停止コドン これは、一揃いの条件下ではコドンの下流のヌクレオ
チド配列の翻訳をかのうにするが、しかし別の条件下で
は本コドンで翻訳が停止するコドンを示す。抑圧性翻訳
停止コドンの例は、アンバー、オーカ及びオパールコド
ンである。
ミューテーター株 これは、その内部で複製されるDNAにその親DNAに関し
て突然変異を起こさせる遺伝子欠陥を有する宿主であ
る。ミューテーター株の例としては、NR9046 mut D5及
びNR9046 mut T1が挙げられる（実施例38参照）。
ヘルパーファージ これは、欠陥ファージゲノムを含有する細胞を感染さ
せるために用いられる、そして欠陥を補足するために機
能するファージである。欠陥ファージゲノムは、除去さ
れた遺伝子配列をコードするいくつかの機能を有するフ
ァージミド又はファージである。ヘルパーファージの例
としては、M13K07,M13K07遺伝子III no.3が挙げられ、
ファージはキャプシドタンパク質に融合される結合分子
を表示するか又はコードする。
ベクター これは、組換えDNA分子を構築するために遺伝子が挿
入される宿主生物体で複製可能なDNA分子である。
ファージベクター これは、ファージゲノムの修飾により得られるベクタ
ーで、バクテリオファージに対する複製のオリジンを含
有するが、しかしプラスミドに対するものは含有しな
い。
ファージミドベクター これは、プラスミドゲノムの修飾により得られるベク
ターで、バクテリオファージに対する複製のオリジン並
びに複製のプラスミドオリジンを含有する。
分泌性 これは、rgdp上に表示されるsbpの成員を伴うrgdp又
は分子を説明するが、この場合、sbp成員及び／又は分
子は折り畳まれており、パッケージは細胞質ゾル外部に
集合される。
転位イムノグロブリン遺伝子のレパートリー 天然ヌクレオチド、例えば動物における発現イムノグ
ロブリン遺伝子をコードするDNA配列の収集。配列は、
例えばＨ鎖に関するV,D及びＪセグメントの、並びに例
えばＬ鎖に関するＶ及びＪセグメントのin vivo転位に
より生じる。あるいは、配列はin vitroで免疫化された
細胞株から生じ得るが、この場合、免疫化に対する転位
は細胞内で起きる。“レパートリー”という用語は、遺
伝的多様性を示すのに用いられる。
ライブラリー ヌクレオチド、例えばクローン内のDNA配列の収集；
又はポリペプチドの遺伝子的に多様な収集、あるいは特
異的結合対成員、あるいは個々のポリペプチド又はsbp
成員を提供するための選択又はスクリーニングが可能な
rgdp上に表示されるポリペプチド又はsbp成員、あるい
はポリペプチド又はsbp成員の混合集団。
人工的転位イムノグロブリン遺伝子のレパートリー ヌクレオチド、例えば動物からの転位イムノグロブリ
ン配列以外の供給源から全部又は一部得られるDNA配列
の収集。これは、例えば非転位ＶセグメントをＤ及びＪ
セグメントと併合することによりVHドメインをコードす
るDNA配列、並びにＶ及びＪセグメントを併合すること
によりVLドメインをコードするDNA配列を含み得る。
DNA配列の一部又は全部は、オリゴヌクレオチド合成
により得られる。
分泌性リーダーペプチド これは、ポリペプチドのＮ末端に接合するアミノ酸の
配列であり、細胞質ゾルの外のペプチドの運動を指図す
る。
溶離液 これは、２個の分子間の結合を分解するために用いら
れる溶液である。結合は非共有又は共有結合である。２
個の分子はsbpの成員であり得る。
誘導体 これは、選択されたrgdp内のDNAによりコードされる
ポリペプチドから得られる物質である。誘導体ポリペプ
チドは、アミノ酸の付加、欠失、置換又は挿入により、
あるいは多の分子のコード化ポリペプチドとの結合によ
りコード化ポリペプチドとは異なる。これらの変化は、
ヌクレオチド又はタンパク質レベルでなされる。例えば
コード化ポリペプチドはFab断片であってもよく、次に
これを別の供給源からのFc尾部に結合させる。あるいは
酵素、フルオレセイン等のようなマーカーを例えばFab,
scFv断片に結合し得る。
本発明の一態様によれば、以下の： （ａ）特異的結合対成員の一次ポリペプチド鎖と複製
可能遺伝子表示パッケージ（rgdp）の成分との融合の集
団をコードする核酸を含有する一次ベクターと、（ｂ）
特異的結合対成員の二次ポリペプチド鎖の集団をコード
する核酸を含有する二次ベクターとの間の組換えを引き
起こすか又はは可能にし、上記の集団の少なくとも一つ
が遺伝子的に別種であり、組換えが組換え体ベクターを
生じて、その各々が上記のポリペプチド融合及び上記の
二次ポリペプチド鎖をコードする核酸を含有し、上記の
rgdp成分を用いてrgdp中にパッケージされ得る 工程から成る多重合性特異的結合対（sbp）成員の製造
方法が提供される。
一次及び二次ポリペプチド鎖の集団の一方又は他方又
は両方が遺伝子的に別種である。両方が遺伝子的に異な
る場合は、組換え体ベクターはsbp成員の非常に異なる
レパートリーを示す。おそらくは先行する選択又はスク
リーニング工程によって、利用可能な全レパートリーに
比して、いずれか又は両方の集団は遺伝子的に異なるが
しかし限定される。ポリペプチド鎖の限定集団をコード
する核酸のライブラリーは、rgdp表示を用いた選択又は
スクリーニングの産物である。
本発明の別の態様によれば、以下の工程から成る多重
合性特異的結合対（sbp）成員の製造方法が提供され
る： （ｉ）組換え体宿主生物細胞中のベクターから複製可能
遺伝子表示パッケージ（rgdp）の成分に融合される特異
的結合対成員の一次ポリペプチド鎖の集団を発現し、そ
れによりrgdp表面に上記のポリペプチド鎖を表示し、そ
して一次及び二次ポリペプチド鎖集団がrgdpにより表示
される上記の多重合性特異的結合対成員のライブラリー
を一緒に形成するようにさせることにより上記の集団を
上記の特異的結合対成員の二次ポリペプチド鎖の集団と
併合し、二次ポリペプチド鎖の上記の集団が一次ポリペ
プチド鎖の上記の集団と同一のベクターから発現され
ず、上記の集団の少なくとも１つが遺伝子的に異なっ
て、上記のrgdp成分を用いてパッケージされ得る核酸か
ら発現され、それにより上記のrgdpの各々の遺伝子物質
が上記の遺伝子的に異なる集団のポリペプチド鎖をコー
ドし； （ii）上記の発現により生成されるrgdpを選択し又はス
クリーニングして個々のsbp成員又はそのポリペプチド
鎖をコードする核酸を有するそれぞれのrgdpに会合する
上記のsbp成員の混合集団を提供し； （iii）選択又はスクリーニングされたrgdpから核酸を
得るが、得られた核酸は（ａ）一次ポリペプチド鎖をコ
ードする核酸、（ｂ）二次ポリペプチド鎖をコードする
核酸、並びに（ｃ）（ａ）と（ｂ）の混合物であり； （iv）（ａ）一次ポリペプチド鎖をコードする工程（ii
i）で得られる核酸を含有するベクター及び二次ポリペ
プチド鎖をコードする核酸を含有するベクター、又は
（ｂ）一次ポリペプチド鎖をコードする核酸を含有する
ベクター及び二次ポリペプチド鎖をコードする工程（ii
i）で得られる核酸を含有するベクター間の組換えを起
こさせるか又は可能にすることにより組換え体ベクター
を生成する。
組換えは細胞内で又はin vitroで起こり得るが、しか
し組換え体宿主細胞で起きるのが好ましい。これは別の
箇所で考察されるが、しかし手短にいえば、sbp成員の
一次（又は二次）ポリペプチド鎖成分をコードする核酸
を含有するベクターのライブラリーを、sbp成員の二次
（又は一次）ポリペプチド鎖成分をコードする核酸を含
有するベクターのライブラリーを保有する宿主細胞中に
導入することを含む。
組換え後、ポリペプチド融合体（rgdp成分と融合した
一次ポリペプチド鎖）及び二次ポリペプチド鎖が発現さ
れて、rgdpを生じるが、これは上記の一次及び二次ポリ
ペプチド鎖をその表面に表示し、そしてrgdp中への組換
え体ベクターのパッケージングにより各々が上記の一次
ポリペプチド鎖及び上記の二次ポリペプチド鎖をコード
する核酸を含有する。したがってこの発現は、rgdp上に
表示されるsbp成員の非常に異なるライブラリーを生じ
る。ある態様においては、sbp成員を表示するrgdpはpAb
（即ち抗体あるいは抗体断片又は誘導体を表示するファ
ージ）であり、問題の抗原を結合するものはそれらの結
合能力用いて選択され得る。各pAbはその表面に表示さ
れる抗体の両ポリペプチド鎖をコードする核酸をその内
部に含有するため、問題の抗原との結合により選択され
るpAbはその抗原と結合する抗体をコードする核酸を提
供する。核酸は選択されたpAbから単離し、規定の場合
に必要なあらゆる増幅及びクローニング後に、その後の
所望の抗体の獲得に使用し得る。
組換えは、部位特異性組換えが生じる配列をベクター
に含めることにより促進し得る。これによりその結果生
じる組換え体ベクターを正確に設計できるようになる。
例えば、部位特異性組換えが生じる配列は、単一鎖sbp
成員の２つのドメインを接合するポリペプチドリンカー
をコードする核酸中にある。単一鎖sbp成員は、イムノ
グロブリンVLドメインに結合するイムノグロブリンVHド
メインから成る。VH及びVLドメインは会合して抗原結合
部位を形成する。次いで、その結果生じる組換え体ベク
ターは、一次及び二次ベクター間の組換えに起因するイ
ムノグロブリンの単一鎖Fv誘導体をコードする核酸を含
有する（注：単一鎖sbp成員、例えば抗体のscFv断片又
は誘導体は、抗体のVL及びVHのような２つのポリペプチ
ド鎖ドメインから成るため、多重合性（二量体）である
と考えられる）。
部位特異性組換えが生じる配位は、大腸菌ファージP1
から得られるloxP配列であり、部位特異性組換えは、こ
れも大腸菌ファージから得られるCre−リコンビナーゼ
により触媒される。使用する部位特異性組換え配列は、
大腸菌ファージP1から得られるloxP配列からえられる。
使用するCre−リコンビナーゼは、調節可能プロモー
ターの制御下で発現できる。
本方法の効率を増大するために、結果的に生じる所望
の組換え体ベクターに先立つ生産性組換えの割合を増大
すると、各ベクターは互いに異なる２つの部位特異性組
換え配列を含む。そのとき配列は、組換えが異なるベク
ター上の同様の配列間では起きるが同一ベクター上の異
なる配列間では起きないようなものである必要がある。
一次ベクターの各々及び二次ベクターの各々は、一次
部位特異性組換え配列及び一次とは異なる二次部位特異
性組換え配列を含有すし、部位特異性組換えは、異なる
ベクター上の一次部位特異性組換え配列間及び異なるベ
クター上の二次部位特異性組換え配列間で起こるが、し
かし同一ベクター上の一次部位特異性組換え配列及び二
次部位特異性組換え配列間では起きない。
一次部位特異性組換え配列は大腸菌P1から得られるlo
xPであり、二次部位特異性組換え配列は突然変異loxP配
列であるか、あるいはその逆であってもよい。一次配列
は二次配列と組換えられないが、しかし一次配列が互い
に組換わり二次配列が互いに組換わる限りは、潜在的に
一次及び二次部位特異性組換え配列は両方とも突然変異
体であり得る。
好適な突然変異体loxP配列はloxP 511である。
一次ベクターはファージ又はファージミドであり二次
ベクターはプラスミドであるか、あるいは一次ベクター
がプラスミドであり二次ベクターがファージ又はファー
ジミドである。
ある態様では、組換えは細胞内に存在し、好ましくは
一次ベクター及び二次ベクターを通して組換え体ベクタ
ーを複製する細菌宿主中で起こる。これを用いて上首尾
の組換えの選択の機会をを多くし得る。細胞内組換え
は、好ましくはファージ又はファージミドを通してプラ
スミドを複製するか、あるいは好ましくはプラスミドを
通してファージ又はファージミドを複製する細菌宿主中
で起こり得る。例えば、細菌宿主は大腸菌又は別のグラ
ム陰性細菌のPolA株である。PolA細胞はプラスミドの複
製を指示できないが、しかし糸状ファージ及びファージ
ミドの複製を支持し得る（プラスミドは糸状ファージ遺
伝子間領域を含有する）。したがって、例えば一次ベク
ターが一次マーカー遺伝子を含有するプラスミドであ
り、二次ベクターが二次マーカー遺伝子を含有するファ
ージ又はファージミドである場合、そのマーカーが複製
され且つ発現されるためにはプラスミドから一次マーカ
ーを移動する組換えが起きねばならないため、両マーカ
ーに対する選択は上首尾の組換えの産物である組換え体
ベクターを産生する。
１つ又はそれ以上のrgdpから核酸を取り出し、別の方
法で用いて個々のsbp成員又はsbp成員の混合集団、ある
いはそのポリペプチド鎖成分、あるいはそのコード核酸
を得る。
本発明はさらに、以下の： （ｉ）sbp成員のポリペプチド成分をコードする核酸の
挿入のための制限部位を有する一次ベクターで、上記の
制限部位がファージキャプシドタンパク質の成熟コード
配列の５′末端部にあり、上記の部位の上流にキャプシ
ドタンパク質及びsbpポリペプチドの細菌宿主の細胞周
辺腔への融解を指図する機密性リーダー配列を伴い；並
びに （ii）二次上記ポリペプチド鎖をコードする核酸の挿入
のための制限部位を有する二次ベクター を有し、ベクターの少なくとも１つが一重鎖バクテリオ
ファージのための複製のオリジンを有し、ベクターが部
位特異性組換えが生じる配列を有する、提供された方法
を実施するのに用いるためのキットを提供する。
キットは、方法を実行するのに必要な補助的成分を含
有しうる。
本発明によりさらに提供されるのは、機密性複製可能
遺伝子表示パッケージ（rgdp）の成分と融合するsbp成
員の一次ポリペプチド鎖をコードする核酸を各々含有す
る一次ベクターと、sbp成員の二次ポリペプチド鎖をコ
ードする核酸を各々含有する二次ベクターのライブラリ
ーを保有する組換え体宿主細胞、rgdp成分を用いてrgdp
中にパッケージされ得る一次ベクターまたは二次ベクタ
ーまたは両方、そして部位特異性組換えが生じる配列を
有するベクターである。
本発明の別の態様によれば、その表面にsbp成員を各
々表示し、その表面に表示されるsbp成員の一次及び二
次ポリペプチド鎖をコードし、部位特異性組換え配列を
含む核酸を各々含有するrgdpの集団が提供される。
本発明の別の態様によれば、その表面にsbp成員を各
々表示し、（ｉ）sbp成員の一次ポリペプチド鎖をコー
ドする核酸、及び（ii）sbp成員の二次ポリペプチド鎖
をコードする核酸の組合せを包含する核酸を各々含有す
るrgdpの集団であって、1010又はそれ以上の（ｉ）及び
（ii）組合せを含有する集団が提供される。このような
集団は、有用な技法を用いて達成し得る最大のサイズを
上回る。本発明は、sbp成員を表示するrgdpの非常に多
様なライブラリー又は集団を生じさせる。sbp成員の一
次ポリペプチド鎖をコードする核酸は、例えば集団全体
で107個の異なる配列を有する。sbp成員の二次ポリペプ
チド鎖をコードする核酸も集団全体でこのような遺伝子
多様性を有する場合、一次及び二次ポリペプチド鎖をコ
ードする核酸の異なる組合せの数は莫大である。
本発明の態様を、図を参照しながら以下の実施例でさ
らに詳述するが、本発明はこれらに限定されない。
図面の簡単な説明 図１は、ライブラリーのサイズに対する既定値ｐ
〔Ｋ〕をもつ抗体を単離する確率のプロットを示す。
図２は、ファージ上のg3融合としてＨ鎖をクローニン
グする方法を概略するが、Ｌ鎖はファージミドから可溶
性断片として発現される。
図３（ｉ）及び（ii）は、多組合せライブラリーの構
築のための部位特異性組換えの使用を説明する。
図4Aは、アクセプターファージベクターfdDOG−2lox
（Ａ）とドナープラスミドベクターpUC19−2lox（Ｂ）
との間のCre介在性組換えにより生成されるレプリコン
を示す。Ａはfd−tet−DOG1を基礎にしており、ヒトCk
不変ドメインに結合するマウス抗−phOx抗体NQ10.12.5
からのVk、及びヒトCml不変ドメインに結合するマウス
抗−TNFa抗体からのVHを伴う。Ｂは、pUC19を基礎にし
ており、ヒトCgl不変ドメインに結合するNQ10.12.5のVH
を伴う。大腸菌内部では、６つのベクター間の平衡はlo
x−Cre系における組換えの可逆性によって発展する。リ
ボソーム結合部位（小開環）、ｃ−mycペプチドタッグ
（myc）、ファージfd遺伝子IIIリーダーペプチド配列
（Lg3）、pelBリーダーペプチド配列（LpelB）、fdファ
ージ遺伝子III（g III）並びにハイブリダイゼーション
及びスクリーニングに用いられるオリゴヌクレオチドの
位置設定を示す。
図4Bは、fdDOG−2lox（Ａ）及びpUC19−2lox（Ｂ）中
に存在する野生型loxP及び突然変異体loxP 511を通る配
列を示す。loxP部位における逆方向反復を矩形で囲み、
突然変異体loxP 511部位における点突然変異の位置
（＃）、並びにリボソーム結合部位（r.b.s.）を示す。
すぐ上流のＨ鎖がファージ上での表示のために遺伝子II
Iに融合され得ることを保証するために野生型loxP部位
はフレーム内にある。
図５は、pAbの特性を用いる選択方法を模式的に示す;
5（ｉ）は、結合／溶離系を示す;5（ii）は、競合系を
示す（ｐ＝pAb;ag＝pAbによる結合が必要なものに対す
る抗原;c＝競合体集団、例えば抗体、pAb、配位子;s＝
基質（例えばプラスチックビーズ）;d＝検出系）。
抗体Ｈ及びＬ鎖のような特異的結合対成員の非常に多
様なライブラリーを作成するのに有用な方法をここに開
示する。別々のレプリコン上にクローン化されたＨ及び
Ｌ鎖を宿主細胞に導入する。Ｈ及びＬ鎖遺伝子を、生成
される組合せの最終数がＨ鎖数xL鎖数となるように同一
レプリコン上に組換える。組換えはin vivo又はin vitr
oで生じ得る。好ましくは受容体レプリコンは、Ｈ及び
Ｌ鎖遺伝子の機能的組合せが選択されるようにrgdp中に
組み込まれ得る。このようなフォーマットは、例えば非
免疫化ドナー、免疫化ドナー又は単数又は複数の人工的
転位イムノグロブリン遺伝子のレパートリーからの抗体
Ｈ及びＬ鎖の非常に多様なライブラリーの構築に特に有
益であり、そして鎖シャッフリング、突然変異誘発、人
体適応化及びCDR｀刷り込み´にも便利である。
これらの方法は、２つ又はそれ以上のサブユニットが
集合して機能的オリゴマーを作る他の蛋白質に適用して
もよい。
２つの個々のレプリコン上に存在する両方のサブユニ
ットに関する遺伝子を、サブユニット遺伝子の好ましい
組合せが広範な再クローニングに依らずに直接単離し得
るように、同一rgdp上で合わせ得る。これは、一旦それ
らが同一細胞内に導入されるや、レプリコン間の組換え
により達成される。好ましい配置において、組換えは、
鎖の一方の遺伝子が相手の鎖に関する遺伝子を含有する
受容体レプリコン上で組換えられるように実行する。好
ましくは、受容体レプリコンはrgdp中にパッケージされ
得る。最も好ましくは、機能的多重合体がrgdpの表面に
表示されるために、１つ又はそれ以上のサブユニットを
コードする遺伝子をg IIIのようなキャプシド遺伝子に
融合させる。
種々の組換え系が公知であり、これらの多数はレプリ
コン間の組換えを実行するような方法で利用し得る。組
換え系の例としては、一般組換え、転位及び部位特異性
組換えが挙げられる。
一般組換えは、それによって何らかの相同を共有する
DNAセグメント間に遺伝子交換が生じる方法で、｀相同
性組換え´として公知である。それは遺伝物質が染色体
間で移動される主要メカニズムであり、大腸菌において
は、本方法はrec BCD酵素に触媒される（“Escherichia
coli and Salmonella typhimurium.Cellular and Mole
cular Biology."（1987）pp1034−1043.Neidhart,F.C.E
ditor in Chief.American Society for Microbiolog
y）。例えば、rgdpゲノムが一方の鎖に関する遺伝子と
｀ダミー´の相手鎖遺伝子を有し、したがって機能的対
合を生成するためには、rgdpレプリコン上のダミー遺伝
子を二次レプリコン上の機能的遺伝子に置換するために
組換えが生じなければならない場合は、一般組換えメカ
ニズムを用いてあるレプリコンから他のレプリコンに遺
伝子を移動し得る。
転位を用いても、あるレプリコンからもう一つのレプ
リコンへの遺伝情報の移動を実行し得る（“Escherichi
a coli and Salmonella typhimurium.Cellular and Mol
ecular Biology."（1987）pp1061−1070.Neidhart,F.C.
Editor in Chief.American Society for Microbiolog
y）。Th ３及びTh 10のようなトランスポゾンは、｀
ジャンピング遺伝子´及び｀利己的DNA´とも呼ばれて
いるDNAセグメントであって、プラスミド上で並びに大
腸菌染色体中に見い出される。トランスポゾン構造は可
変的であるが、しかし通常は反復DNA配列と側面を接す
るリコンビナーゼ遺伝子を含む；リコンビナーゼは宿主
因子と一緒に、トランスポゾンが挿入される部位の重複
を通常は引き起こすメカニズムによって、染色体上の部
位へのトランスポゾンの挿入を触媒する。いくつかのト
ランスポゾンによる挿入は高度に部位特異性であるが、
一方他のものは本質的に無作為に挿入する。あるレプリ
コンから別のレプリコンに遺伝子を移動するためには、
ドナー遺伝子をTn ７のような高度部位特異性トランス
ポゾン内に組み込み得る。受容体プラスミドを遺伝子工
学的処理を施して標的DNA配列を含入させる。
十二分に理解された部位特異性組換え系の一つは、バ
クテリオファージ ラムダの組込み及び切り出しに用い
るものである（“Escherichia coli and Salmonella ty
phimurium.Cellular and Molecular Biology."（1987）
pp1054−1060.Neidhart,F.C.Editor in Chief.American
Society for Microbiology）。このバクテリオファー
ジは、一旦細胞の内側に入ると２つの発育経路をたど
る：即ち溶解又は抗原である。抗原経路はラムダゲノム
の感染細菌の染色体中への組込みを包含する；組込み
は、att Pと呼ばれるバクテリオファージ中の約240bp配
列とatt Bと呼ばれる細菌染色体中の約25bp配列との間
の部位特異性組換えの結果である。組込みはIHFと呼ば
れる宿主コード因子と２つのatt部位に共通の15bp領域
を認識するIntリコンビナーゼと呼ばれるファージコー
ド酵素とにより触媒される。組込みDNAはatt B及びatt
P由来の配列が側面に接し、これらはatt L及びatt L及
びatt Rと呼ばれる。組込みは可逆的であり、Int,IHF及
び二次バクテリオファージコード酵素Xisに触媒され
る。この系は、大腸菌内のレプリコン間の配列移動のた
めに用い得るとみなされる。例えば、ドナー遺伝子はat
t L及びatt R部位が側面に接し、したがってInt及びXis
蛋白質が宿主細胞中に提供されると、att L及びatt R部
位間の組換えはドナー遺伝子を含有する環状DNAセグメ
ントを生じ、att B部位を作り直す。次いでこの環状セ
グメントを受容体プラスミド中に処理されるatt P部位
と組換え得る。
代替的部位特異性組換え系は、大腸菌ファージP1のlo
xP/Cre−リコンビナーゼ系である（Hoess,R.H.and Aber
mski,K.（1990）The Cre−lox recombination system.I
n｀Nucleic acids and Molecular Biology.´Eckstein,
F.and Lilley,D.M.J.eds.Vol.4,pp99−109,Springer−V
erlag,Berlin,Heidelberg）。Cre−リコンビナーゼはlo
xと呼ばれる配列で高度特異的組換えを触媒する。ファ
ージP1における組換え部位であるloxPは、8bp不斉コア
により分離される２つの13bp逆反復から成る（図３）。
以下の本出願に記載した研究に関しては、組換えが高度
配列特異性で、非常に有効であり、そしてクローニング
ベクター中に容易に取り込まれる短標的部位で生じるた
め、loxP/Cre系を利用可能なほかの方法から選択した。
図３の配置を略記した例では、可溶性Ｌ鎖を単一loxP
部位を含有するファージミド上にクローニングする。Ｈ
鎖は、g3融合体としてプラスミド上にクローニングす
る。g3融合は選択可能マーカーに関する遺伝子であると
ともに、Ｈ鎖/g3/マーカー配列は２つのloxP部位に側面
を接する。このプラスミドは調節可能プロモーター上に
Cre−リコンビナーゼを含有し、ヘルパーファージ、例
えばP15A,RSF 1010上の他にファージミド上のものに匹
敵する二重鎖複製のオリジンを有し、col E1オリジンが
同一細胞中に共存する。次いでファージミドをドナープ
ラスミド及び誘発されたCre−リコンビナーゼプロモー
ターを含有する細胞中に感染させて、loxP部位間の組換
えを感染細胞内部で起こさせる。これらの組換えのいく
つかは、その単一loxP部位のファージミド上にブロック
としてＨ鎖/g3/マーカー配列を移動させる。次いでファ
ージミドをM13K07のようなヘルパーファージにより救済
し（WO92/01047参照）、その結果生じたプラスミド粒子
を直接抗原上で選択するか、あるいは新鮮な宿主細胞中
に感染させて両マーカーの存在に関する選択により増殖
させる；即ち一方はファージミドそれ自体から、他方は
Ｈ鎖/g3/マーカーブロックから。
同一レプリコン上に遺伝子を持ってくるための部位特
異性組換えの使用は、例えば一重鎖Fv分子を構築するた
めに、同一レプリコン上の連続コード配列の創造に及び
得る。Cre−触媒処理部位特異性組換えのための基質で
あるscFvリンカーに組み込まれるloxP配列中に単一開放
読み枠が存在する。融合される遺伝子の一端又は両端で
のこのような修飾scFリンカー配列の配置は次に、Cre−
リコンビナーゼが提供されると、in vivo又はin vitro
での連続開放読み枠の創造を生じ得る。
他の部位特異性組換え系を用いた場合と同様に、Cre
−リコンビナーゼ組換えは可逆的で、したがって生産的
組換え体は組換え体の分画のみを生成する。生産的転位
の選択は細菌、好ましくは大腸菌又は他のグラム陰性細
菌のpolA株の使用により促進し得る。これらの細胞DNA
ポリメラーゼＩを欠き、プラスミドの複製を支持できな
い（Johnston,S.and Ray,D.S.1984,上記）。しかしなが
ら、それらは糸状ファージ遺伝子間領域を含有する糸状
ファージ及びファージミドの複製を支持し得る。Cre触
媒処理組換えをpolA細菌中で実行する場合、組換えは複
製され発現される二次マーカー遺伝子に関して起きねば
ならないため、同一polA細胞中の両方の選択可能マーカ
ーの存在に対する選択により、上首尾の組換えが高めら
れる。その結果生じる細胞は完全レパートリーを含有
し、細胞として増殖されて、ヘルパーファージに感染さ
れて、両鎖に関する遺伝子を含有するファージミドを産
生し、それらをその表面に発現する。
生産的組換えを高める別の方法は、突然変異体loxP部
位を用いることである。loxP配列のいくつかの突然変異
体が公知であり、これらは互いに及び野生型loxP配列と
組換わるその能力に関して処理される（Hoess,R.H.,Wie
rzbicki,A.and Abremski,K.（1986）Nucl.Acids Res.1
4,2287−2300）。例えばloxP 511は中央8bpセグメント
にＧ→Ａ点突然変異を有し、その結果他のloxP 511部位
と組換わるだけで、野生型loxP配列とは組換わらない
（Hoess,R.H.,Wierzbicki,A.and Abremski,K.（1986）
上記）。野生型及び突然変異体loxP配列の組合せの配置
は組換えが可能であることを指図し得る：それらの使用
は実施例１に記載されている。他の突然変異体loxP部位
が公知であるが、しかし互いに及び野生型loxP配列と組
換わるそれらの能力は広範に特性づけられてはおらず、
多分loxP511は独特ではない。ベクター中の異なる突然
変異体loxP部位が準備されていれば組換えの発生全体を
さらに大きく制御することができて、より複雑で制御可
能な且つ有効な組換え法が可能になる。
ベクター中の部位特異性組換えに関する標的DNA配列
の存在は、その後の遺伝子操作に用途を見出す。原核及
び真核生物のゲノム中の天然の又は人工的に誘発された
loxP配列は、遺伝子挿入のための標的部位として用い得
る。さらに、Cre触媒処理組換えはin vitroで容易に生
じるため、例えば異なるベクター間のin vitroでの遺伝
子の迅速且つ有効な移動も意図される（Boyd,A.C.（199
3）Nuc.Acids Res.21,817−821）。
多様性を生じさせるために２つ又はそれ以上のレプリ
コンを用いるという概念は糸状バクテリオファージの表
面での多重合体の表示に限定されないことは明らかであ
る。例えば細菌は、複製可能遺伝子表示パッケージとし
て用い得る。例えばFuchs等は、ペプチドグリカン会合
リポ蛋白質との融合により大腸菌の表面に機能的抗体が
表示されることを示した（Fuchs,P.,Breitling,F.,Dube
l,S.,Seehaus,T and Little,M.（1991）Targetting of
recombinant antibodies to the surface of Escherich
ia coli:fusion to apeptidoglycan associated lipopr
otein.BioTechnology 9,1369−1373）。Klauser等は、N
eisseria IgAプロテアーゼとの融合による大腸菌の表面
への異種蛋白質の移動を記載する（Klauser,T.,Pohler,
J.and Meyer,T.F.（1990）Extracellular transport of
cholera toxin B subunit using Neisseria IgA prote
ase B domain:conformation−dependent outer membran
e translocation.EMBO 9,1991−1999）。他の表面蛋白
質、例えばpili,ompA又は表面露出リポ蛋白質Tra Tを用
い得るし、グラム陰性細菌例えば乳酸桿菌及び連鎖球菌
を用いてもよい。真核生物におけるクローニング及び発
現も意図される。
ファージの代わりに細菌を用いる場合には、別のクロ
ーニング法が考えられる。形質転換及び感染の他に、例
えば接合によりレプリコンを細胞中に導入し得る。さら
に、１つ又はそれ以上の遺伝子を染色体中で組換えるか
又は置換して、相溶性レプリコンを使用しなければなら
ないという制限を低減し得る。
多組合せ概念も、より多数の突然変異体子孫を産生さ
せることによる突然変異誘発実験には特に有益である。
例えば、多重合性ペプチド又はポリペプチドをコードす
る遺伝子を総計10アミノ酸位置で突然変異誘発してこれ
らの位置のあらゆるアミノ酸を組み込む場合には、組合
せ総数は2010＝＞1.024 1013である。この数字は標準ク
ローニングフォーマットの範囲をはるかに超えている
が、しかし本明細書に記載したアプローチを用いて達成
し得る。
本明細書に記載の方法は、Ｔ細胞受容体、CD3及びイ
ンシュリン受容体のような抗体以外の多重合性蛋白質に
適用可能である。例えば１サイクル以上の感染により、
２つ以上の異なる且つ多様なサブユニットを有する蛋白
質のライブラリーを創造し得る。サブユニットの１つを
含有する細胞を二次サブユニットを含有するファージで
感染させ、その結果生じる集団を第三のサブユニットを
保有する相溶性ファージに２回感染させる。
いくつかの場合、多重合体の全成分をg3融合体として
発現することは有益である。これは別々の鎖間の、例え
ばVHg3及びVLg3間の弱い相互作用を安定化して同一粒子
上でg3と融合するVH及びVLの両方を有するファージ又は
ファージミド粒子を生成するか、あるいは弱く相互作用
するポリペプチド又は配位子の存在下で会合するだけの
ポリペプチドを安定化するという利点を有する。
多組合せアプローチにより可能な組合せの数は、各レ
パートリー中に存在するクローンの数によってのみ限定
され、そして一方の鎖を支持するファージを用いて他方
を含有する細胞を感染させる特定の場合には産生される
ファージ及び細胞の数により限定される。さらに洗練さ
れた方法、例えば発酵法を用いると、さらに多数の組合
せを入手し得る。
抗体の一次及び二次ポリペプチド成分をコードする核
酸は、免疫化又は非免疫化動物又はヒトのレパートリー
から、あるいは単数又は複数の人工的転位イムノグロブ
リン遺伝子から得られる。イムノグロブリン遺伝子の人
工的転位は、in vitroで生殖系列ＶセグメントをＪセグ
メントに、VHドメインの場合はＤセグメントに結合され
ることを包含する。V,D及びＪセグメントはいずれも合
成である。結合には、ランダム配列の領域を有するプラ
イマーを用いて生成物である人工的転位イムノグロブリ
ン遺伝子中に配列多様性を導入するPCR−ベース法を用
い得る。
糸状Ｆ特異性バクテリオファージは、その表面での結
合分子、例えば抗体及び抗体断片及びその誘導体の表示
のためのビヒクルを提供し、その後の選択及び操作を促
進するファージ種の好適な例である。
Ｆ特異性ファージ（低えばfl,fd及びM13）は宿主細胞
を殺さない増殖方法を進化させており、それらは一般に
組換え体DNAのビヒクルとして用いられる（Kornberg,
A.,DNA Replication,W.H.Freeman and Co.,San Francis
co,1980）。ファージfdの遺伝子IIIは、生物学的活性外
来配列の挿入にとって魅力がある。しかしながら、例え
ば遺伝子VIII及び遺伝子VIを含めた他の候補部位が存在
する。
遺伝子IIIにコードされる蛋白質は数個のドメインを
有する（Pratt,D.,et al.,1969 Virology 39:42−53.,G
rant,R.A.,et al.,1981,J.Biol.Chem.256:539−546 and
Armstrong,J.,et al.,FEBS Lett.135:167−172 198
1）。
生物学的活性抗体断片に関する遺伝子コード配列はfd
の遺伝子III領域に挿入されて大型融合蛋白質を発現し
た。用いられた最初のベクターは、完全大腸菌宿主にテ
トラサイクリン耐性を付与するプラスミドとして増殖し
得るfdバクテリオファージのテトラサイクリン耐性バー
ジョンであるfd−tet（Zacher,A.N.,et al.,1980,Gene
9,127−140）であった。出願人は、いくつかの理由で、
fd遺伝子III蛋白質のシグナル配列の後ろに挿入するこ
とを選んだ。特に、出願人は、シグナルペプチダーゼ開
裂に関する情況を保持するために成熟蛋白質のアミノ酸
１の後ろに挿入することを選択した。遺伝子IIIそれ自
体の構造及び機能を保持するために、元のアミノ酸の大
多数は挿入イムノグロブリン配列の後ろに合成される。
挿入イムノグロブリン配列は、VH−VLをCH1−CLにつな
ぐスイッチ領域からの残基を含むよう意図された（Lee
k,A.,and Chothia,C.,Nature 335,188−190,1988）。
バクテリオファージfdの遺伝子IIIを操作することに
より、生物学的に非常に機能的な抗体、酵素及び受容体
分子をその表面に表示する一方、無傷で感染性のままで
あるバクテリオファージを構築し得る。さらに、所望の
特異性を有する抗体を保有するファージは、この特異性
を示さないファージのバックグラウンドから選択し得
る。
抗体分子の集団をそしてファージ表面での抗体結合機
能の発現を提供するためのベクターへの挿入をコードす
る配列は、種々の供給源に由来する。例えば、例えば免
疫化又は非免疫化齧歯類又はヒトから、並びに脾臓及び
末梢血リンパ球のような器官からである。コード配列
は、当業者に公知の方法によりこれらの供給源から得ら
れる（Orlandi,R.,et al.,1989上記;Larrick,J.W.,et a
l.,1989上記;Chang,Y.L.,et al.,1989 Bio Techniques
7,p.360−366;Ward,E.S.,et al.,1989上記;Sastry,L.,e
t al.,1989上記）。
抗体産生のための標準組換え法では、抗体ポリペプチ
ド鎖をコードする配列を含有する発現ベクターを用いて
例えば大腸菌を形質転換する。抗体ポリペプチドは、標
準スクリーニング系の使用により発現され、検出され
る。スクリーンが所望の特異性を有する抗体ポリペプチ
ドを検出する場合は、所望の抗体ポリペプチドを発現す
る特定の形質転換大腸菌に戻らねばならない。さらに、
次いで使用するには別の処理工程における大腸菌から、
所望の抗体ポリペプチドに関するコード配列を含有する
ベクターを単離しなければならない。
しかしながら本発明では、所望の抗体ポリペプチド
は、発現される場合は、その遺伝子コード配列で既にパ
ッケージされている。これは、所望の特異性を有する抗
体ポリペプチドを選択する場合には、その配列の単離の
ために元の培養に戻る必要がないことを意味する。さら
に標準組換え体技術における先の方法では、抗体を発現
するクローンを別々にスクリーニングする必要はない。
本出願は、所望の特性を有する抗体を発現するクローン
の選択を提供する。
rgdp（例えばpAb）は、成員をコードする遺伝情報を
含有する相対的に簡単な複製可能構造の表面で特異的結
合対の成員（例えばモノクローナル抗原結合特異性を有
する抗体）を表示するため、特異的結合対の成員（例え
ば抗原）の相補的成員と結合する成員rgdp、例えばpAb
は、例えばジエチルアミン、高塩等を用いて相補的成員
を溶出して好適な細菌を感染するかあるいは構造を変性
させ、PCRを用いて成員をコードする配列を特異的に増
幅することにより、非常に有効に回収し得る。即ち、pA
bを生じた元の細菌クローンに差し戻す必要はない。
選択フォーマット及び親和性成熟 例えば抗原に対する所望の特異性を発現する個々のrg
dp、例えばpAbは、慣用的スクリーニング技法を用いて
複合ライブラリーから単離し得る（例えばHarlow,E.,an
d Lane,D.,1988上記;Gherardi,E.et al.,1990,J.Immuno
l.meth.126 p61−68）。
国際特許WO92/01047に記載し、説明されている他の選
択技法は、rgdpの独特の特性に関してのみ実施可能であ
る。いくつかのスクリーニング法の一般的概略を、rgdp
の例としてpAbを用いて図５に示す。
スクリーニングされるpAbの集団／ライブラリーは、
免疫化又は他の動物から生成し得る；あるいは既存ファ
ージ抗体を突然変異誘発させることにより、in vitroで
生成し得る（オリゴヌクレオチド特定突然変異誘発（Sa
mbrook,J.,et al.,1989 Molecular Cloning a Laborato
ry Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press）の
ような当業界で十分公知の方法を用いて）。この集団
は、図５に関して下記の１つ又はそれ以上のフォーマッ
トでスクリーニングして抗原結合特性が標本ｃとは異な
る個々のpAbを得ることができる。
結合溶離 図５（ｉ）は、固体表面（ｓ）と結合する抗原（ag）
を示す。固体表面（ｓ）はペトリ皿、クロマトグラフィ
ービーズ、磁性ビーズ等により提供される。次にpAbの
集団／ライブラリーをag中に通して、結合する個々のｐ
を洗浄後保持し、任意に検出系ｄで検出する。抗−fd抗
血清を基礎にした検出系はWO92/01047の実施例４にさに
詳細に説明されている。結合集団ｐの標本を、緊縮増大
条件下で取り出した場合、各標本中に示される結合親和
性を増大する。緊縮増大条件は、浸漬時間を増大するこ
とにより、又は浸漬溶液のpHを変えること等によって得
られる。
競 合 図５（ii）に関しては、抗原agは固体支持体ｓに結合
され得るし、そして元の結合分子ｃによる飽和のために
結合される。突然変異体pAbの集団（又は一組の無関係
なpAb）が複合体に提供されると、ｃより高い抗原agに
対する親和性を有するものだけが結合する。殆どの場
合、集団ｃの少数だけが集団ｐからの個体により置換さ
れる。ｃが伝統的抗体分子である場合、結合物質はすべ
て回収され、結合ｐは好適な細菌を感染させることによ
り及び／又はPCRのような標準技法により回収される。
有益な適用は、agが受容体として、ｃが対応する配位
子として用いられる場合である。回収結合集団ｐはその
場合、構造的に受容体結合部位及び／又は配位子に関連
する。この種の特異性は、製薬産業に非常に有用である
ことが公知である。
別の有益な適用は、agが抗体でｃがその抗原である場
合である。回収済結合集団ｐはその場合、研究及び診断
並びに製薬産業に多くの用途を有する抗−イディオタイ
プ抗体である。
目下、抗イディオタイプ抗体を直接選択するのは難し
い。pAbは、pAbライブラリー（例えば真正ライブラリ
ー）をＢ細胞（その表面に抗体を発現する）に結合して
十分結合したファージを単離することにより直接これを
行なう能力を示す。
数例では、それは集団ｐを予め選択するのに有益であ
ることを立証し得る。例えば、上記の抗イディオタイプ
例では、ｐは抗原と結合しない関連抗体に対して吸着さ
れる。
しかしながら、ｃがpAbである場合には、ｃ及びｐの
いずれか又は両方がある方法で有益にマークされて結合
ｃ全体で結合ｐに関して認識し、選択し得る。このマー
キングは物理的なもので、例えばビオチンでｐを予め標
準する；あるいはさらに有益には遺伝子的なものであ
る。例えば、ｃはEcoB制限部位でマークし、一方ｐはEc
oK制限部位でマークし得る（Carter,P.et al.,1985,Nuc
l.Acids Res.13,4431−4443参照）。結合ｐ＋ｃを抗原
から溶離して、好適な細菌を感染するために用いる場
合、集団ｃ（即ちこの例ではEcoB制限細菌）の制限が認
められる（したがって成長は認められない）。増殖した
あらゆるファージが、ｐからのその個体に非常に富んで
いて、高結合親和性を示した。あるいは、ｐを新規の配
列でマーキングすることにより、遺伝してきマーキング
を達成し得るが、これはPCRを用いて混合物からｐを特
異的に増幅するために用い得る。
結合pAbは、例えばPCR又は細菌感染を用いて増幅し得
るため、慣用的方法による検出には不十分は個体しか結
合しない場合でも、所望の特異性を奪回し得る。
所望の特異性又は親和性を有する蛋白質分子を表示す
るファージの選択のための好ましい方法は、しばしば、
配位子による親和性マトリックスからの溶離である（例
えばWO92/01047の実施例21）。配位子の濃度を漸増して
の溶離は、親和性増大を示す結合分子を表示するファー
ジを溶離する必要がある。しかしながら、例えばpAbが
高親和性又は親和力を有するその抗原（又はその結合相
手に対する別の蛋白質）と結合する場合、抗原に関連し
た分子を用いて親和性マトリックスからpAbを溶離する
ことばできない。あるいは、十分高濃度で調製される好
適な特異的溶離分子は存在しない。これらの場合、例え
ば抗原−抗体複合体に対して特異的でない溶離法を用い
ることが必要である。一般的に用いられる非特異的溶離
法のいくつかは、例えばファージ生存能力を低減し、フ
ァージ生存能力はpH12で時間とともに低減される（Ross
omando,E.F.and Zinder N.D.J.Mol.Biol.36,387−399 1
968）。例えば抗体と親和性マトリックス間に相互作用
が認められるが、これはファージ感染性を完全に除去し
ないで途絶させることはできない。これらの場合、例え
ば抗体−抗原相互作用の途絶に頼らない方法には、ファ
ージを溶離する必要がある。したがって温和な条件下
（ジチオトレイトールによる）ジチオール基の低減）で
結合pAbを除去させる方法が案出されたが、これはファ
ージ構造を破壊しない（WO92/01047の実施例47）。
この溶離方法は温和条件下での溶離方法の唯一の例で
ある。特に有益な方法は、挿入された外来遺伝子、この
場合は抗体断片に関する遺伝子及び遺伝子IIIの残留物
の配列間の高度特異的プロテアーゼによる開裂のための
認識部位を構成するアミノ酸をコードするヌクレオチド
配列を導入することである。このような高度特異的プロ
テアーゼの例としては、Ｘ因子及びトロンビンが挙げら
れる。ファージの親和性マトリックスとの結合及び非特
異的結合ファージ及び弱結合ファージを除去するための
溶離後、開裂部位での消化に適した条件下でプロテアー
ゼを用いてカラムを洗浄することにより、強力結合ファ
ージを取り出す。これはファージを溶離するファージ粒
子から抗体断片を開裂する。これらのファージは、プロ
テアーゼ部位だけが特異的に導入されたものであるた
め、感染性であると予測される。次に強力結合ファージ
を、例えば大腸菌TG1細胞を感染することにより回収す
る。
上記の代替法は、強力結合pAbを保持する親和性マト
リックスを取り出し、例えばSDS溶液中で沸騰させてDNA
を抽出することである。次に抽出DNAを用いて大腸菌宿
主細胞を直接形質転換し得るか、あるいは、例えば本明
細書に記載のような好適なプライマーを伴うPCRを用い
て抗体コード配列を増幅して、さらなる研究のために可
溶性抗体として、又はさらに選択するためのpAbとして
発現のためにベクター中に挿入し得る。
親和性による選択のための別の好ましい方法は、少量
の配位子を含有する親和性マトリックスとの結合による
方法である。
その配位子に対して高親和性を有する蛋白質分子を表
示するファージの集団から選択したい場合、好ましい方
法はファージ集団を少量の配位子を含有する親和性マト
リックスと結合させることである。マトリックス上での
配位子との結合に関しては、高親和性及び低親和性蛋白
質を表示するファージ間に競合が認められる。高親和性
蛋白質を表示するファージは好ましくは結合し、低親和
性蛋白質は洗い流される。次に、配位子を用いた溶離に
より、又は親和性マトリックスからファージを溶離する
別の手法（例えばWO92/01047の実施例35は手法を実証す
る）により高親和性蛋白質を回収する。
要するに、親和性工程からのパッケージDNAの回収の
ためには、パッケージは簡単に溶離され、それは相補的
sbp成員との結合に関して上記パッケージと競合する相
同sbp成員の存在下で溶離される；それは沸騰により除
去し得るし、蛋白質の蛋白質分解的開裂により除去し得
る；そして他の方法、例えば基質と相補的sbp成員都の
間の結合を壊して上記のパッケージDNA及びsbp成員を放
出する方法は当業者には明らかである。いずれにして
も、目的は、直接又は関節的に用いてそれによりコード
されたsbp成員を発現し得るようにパッケージからDNAを
得ることである。
pAbに関するこの選択法の効率及び非常に大きなライ
ブラリーを作る能力は、当該抗体を産生するスクリーニ
ング化細胞の割合を増大するために開発された免疫化技
法が絶対要件ではないことを意味する。本方法は、慣用
的方法では困難な又は得ることができないことさえある
もの、例えば触媒性又は抗イディオタイプ抗体を含めた
結合特異性、例えば抗原結合特異性の迅速な単離を可能
にする。免疫レパートリーの完全ライブラリーが一旦構
築されれば、動物を全体で取り出すことは目下可能であ
る。
pAb分子の構造は、多数の他の適用で用い得る。その
いくつかの例を以下に示す： シグナル増幅 それ自体分子的実体として作用すると、大コート蛋白
質を用いて別の部分に付着する場合、rgdp例えばpAbは
特異的分子例えば抗原を結合する能力を増幅により併合
する。この部分は免疫学的、化学的又は他のあらゆる手
段によって付着し得るし、例えばin vivo又はin vitro
で用いるための検出試薬又は細胞毒性分子との複合体を
標識するために用い得る。
物理的検出 rgdp例えばpAbの大きさは、特に電子顕微鏡及び／又
は何らかのバイオセンサー、例えば表面プラスモン共鳴
のような検出の物理的方法に関してマーカーとして用い
得る。
診断検定 rgdp例えばpAbはまた、特にその物理的特性、例えば
配置、濾過等を用いて分離を実施する場合の診断検定に
有益な用途を有する。
実施例 1:Cre/loxを用いたレプリコン間の抗体遺伝子
のin vivo組換え 本実施例は、同一細胞中の２つのレプリコン間の抗体
遺伝子を移動するためのCre/loxP系の使用を説明する。
ここでは、組換え抗体遺伝子の機能的対合を生成するた
めに起きねばならない。
２つの構築物を作った：“受容体"fdファージベクタ
ーfdDOG−2lox（Ａ）及び“ドナー”プラスミドベクタ
ーpUC19−2lox（Ｂ）（図４及び凡例参照）。Ａは一次
抗体のＬ鎖をコードする（そして二次の異なる抗体から
のＨ鎖）:Bは、一次抗体のＨ鎖をコードする。両ベクタ
ーにおいて、VH遺伝子は２つのloxP部位に側面を接する
（図４参照）。Creの存在下での部位Ｈ遺伝子の欠失を
避けるために、loxPVの一方は野生型であるがしかし他
方は8bpスペーサー領域loxP 511内のＧからＡへの点突
然変異を含有する（Hoess,R.H.,Wierzbicki,A.and Abre
mski,K.（1986）上記）。野生型loxP部位及び突然変異
体loxP 511部位は同一ベクター内では互いに組換わらな
いが、しかし以下に示すように、異なるベクター中のマ
ッチング配列の部位と組換わる。ファージplCm cl.100
（Rosner,J.L.（1972）Virology,48,679−689）の大腸
菌感染によりCre−リコンビナーゼがin vivoに提供され
ると、Ａ及びＢは突然変異体又は野生型loxP部位間の組
換えにより同時組込みされて、それぞれキメラプラスミ
ドＣ又はＤを作る。次いでさらなる組換えが２つの野生
型又は２つの突然変異体loxP部位間で起きて、オリジナ
ルベクター（Ａ又はＢ）あるいは２つの新規のベクター
（Ｅ及びＦ）を生成する。したがってＡ及びＢのＨ鎖は
交換され、Ｅはここで、ファージ遺伝子３蛋白質（g3
p）のＮ末端との融合体として表示のための一次抗体のF
ab断片をコードする。
（ａ）fdDOG−2lox及びpUC19−2loxベクターの構築 fdDOG−2lox及びpUC19−2loxベクターはそれぞれfdDO
G−１及びpUC19から得た（WO92/01047及びWO92/20791;f
dDOG−１は従来fdCAT−２と呼ばれた）。部位特定性突
然変異誘発と標準分子生物学的技術を用いる二重鎖合成
オリゴヌクレオチドの結紮との組合せを用いて、これら
のベクターのクローニング部位を処理した（Sambrook,
J.,Fritsch,E.F.and Maniatis,T.（1990）“Molecular
cloning−alaboratory manual"Cold Spring Harbor Lab
oratory,New York）。
これらの構築物を用いて、図４に示したドナープラス
ミドＢ及び受容体ファージＡを生成した。プラスミドＢ
は、ヒトCglセグメントに結合し、pUC19−2lox中にSfi
1−Not 1断片としてクローニングされる抗−phOx（２−
フェニルオキサゾール−５−オン）ハイブリドーマNQ1
0.12.5（Griffiths,G.M.,Berek,C.,Kaartinen,M.and Mi
lstein,C〉（1984）Nature,312,271−275）のVH遺伝子
を含有した。受容体ファージＡは、ヒトCklセグメント
に結合し、fdDOG−2lox中にApa LI−Asc I断片としてク
ローニングされる抗−phOxハイブリドーマNQ10.12.5のV
L遺伝子を含有した。受容体ファージＡはまた、ヒトCml
セグメントに結合し、fdDOG−2lox中にSfi 1−Not 1断
片としてクローニングされる抗−腫瘍壊死因子抗体（Ra
thjen,D.A.,Furphy,L.J.and Aston,R.（1992）Br.J.Can
cer,65,852−856）からのVH遺伝子を含有した。
Ａ及びＢ構築物をともに、大腸菌TG1中に形質転換し
た。構築物Ａはテトラサイクリンに対する耐性を付与
し、構築物Ｂはアンピシリンに対する耐性付与する。
（ｂ）感染性受容体ファージ粒子（構築物Ａ）の調製 PCT WO92/01047の実施例６に記載されているように、
テトラサイクリンを含有する2x YT中で一夜増殖させた
構築物Ｂクローンの培地からファージ粒子を採集した。
（ｃ）In vivo Cre触媒処理組換え これは以下のように実施した： 1. プラスミドpUC19−2loxを含有する大腸菌を、100mg
/mlのアンピシリン及び１％グルコースを含有した2x TY
培地2ml中で37℃で増殖させて、振盪した。0.4のO.D.60
0nm。
2. 5x109形質導入単位（tu）のfdDOG−2loxファージを
加え（細菌の10倍の量）、30分間振盪せずに37℃でイン
キュベーションを継続した。
3. 5x109pfuファージPlCm cl.100（クロラムフェニコ
ール耐性を付与する;Rosner,J.L.（1972）上記）を加え
て、37℃でさらに30分インキュベーションを続けた。次
にこの培地40mlに2xTY 2ml、アンピシリン100mg/ml、テ
トラサイクリン12.5mg/ml、クロラムフェニコール12.5m
g/ml、１％グルコースを加えた。培地を30℃で40時間振
盪した。
4. 約1010tuのファージfd粒子（組換え体ファージを含
む）を13000gで５分間遠心分離して細菌を沈めることに
より培地上清から採集し、上清を0.45mm細菌フィルター
（Minisart,Sartorius）に通した。
組換え化集団をサンプリングするために、103tuの上
記fd粒子を新鮮な大腸菌TG1に感染させて、12.5mg/mlの
テトラサイクリンを含有する2xTY寒天上に置いて、次に
37℃で一夜インキュベートした。96穴に分けたコロニー
を、12.5mg/mlテトラサイクリンを含有する100ml/穴2xT
Yを入れた96穴ミクロ滴定トレーに移して、37℃で一夜
増殖させた。このプレートをマスターストックとして用
い、次いでいくつかの技法によりスクリーニングして、
組換えが起きたことを確認した： （１）ELISA:phOx−BSAに結合するファージを産生する
クローンを確認するため（ベクターＥを確認） （２）レプリカプレーティング：アンピシリン及びテト
ラサイクリンの両方に対して耐性のクローンを見つける
ため（ベクターＣ及びＤを確認する） （３）コロニーハイブリダイゼーション:NQ10.12.5 VH
のCDR3と特異的に結合する放射能標識化オリゴヌクレオ
チドVHNQ10PRを用いる（ベクターC,D及びＥを確認する
ため） （４）PCR:オリゴヌクレオチドFDPCRBACK及びVHNQ10PR
を用いる（ベクターＣ及びＥの確認） （５）PCR:オリゴヌクレオチドLMB3及びVHNQ10PRを用い
る（ベクターＤの確認） （ｄ）phOXバインダー（ベクターＥ）を確認するための
ELISA 1. PBS中に10μg/mlでウエル当たり100μｌのphOx−BS
A（14:1置換）を用いてプレートをコートする。室温で
一夜放置する。
2. PBSで３回ウエルをすすぎ、２％Marvel/PBSでウエ
ル当たり200μｌを用いて37℃で２時間ブロックする。
3. PBSで３回ウエルをすすぎ、次いですべてのウエル
に10％Marvel/PBSを25μｌを加える。
4. 適切なウエルに培地上清100μｌを加える。混合し
て、室温で２時間放置する。
5. PBSで３回ウエルをすすぎ、0.05％Tween 20で１回
そしてPBSで３回すすぐ。２％Marvel/PBS中で1:1000に
希釈したヒツジ抗−M13抗血清100mlを各ウエルに加え
る。室温で1.5時間インキュベートする。
6. PBSで３回ウエルをすすぎ、0.05％Tween 20で１回
そしてPBSで３回すすぐ。抗−ヒツジIgG抗体（ペルオキ
シダーゼ抱合、Sigma）の1:5000希釈液100μｌを分取す
る。室温で1.5時間インキュベートする。
7. 二次抗体を捨て、PBSで３回ウエルをすすぎ、0.05
％Tween20で１回そしてPBSで３回すすぐ。
8. 10mg ABTS（2,2′−アジノビス（３−エチルベンズ
チアゾリン−６−スルホン酸）ニアンモニウム塩）錠剤
１個を50mMクエン酸緩衝液、pH4.5（50mMクエン酸緩衝
液、pH4.5は等容量の50mMクエン酸三ナトリウム及び50m
Mクエン酸を混合して作る）20mlに加える。
９ 懸濁直前に上記の溶液に30％過酸化水素20μｌを加
える。
10. 各ウエルに上記の溶液100μｌを加える。室温で30
分放置する。
11. 3.2mg/mlフッ化ナトリウム50μｌを加えて冷却す
る。405nmで読み取る。
注：｀Marvel´は乾燥乳粉末である。PBSは１リット
ル中に5.84g NaCl,4.72g Na2HPO4及び2.64g NaH2PO4・2
H2O,pH7.2。
96クローンのうち68がELISA（O.D.405nM〉1.0）で陽
性であり；したがってそれらがファージ上で機能的抗−
phOx Fab断片をコードするため、テトラサイクリン耐性
クローンの71％がベクターＥに相当する（図）。
（ｅ）ベクターＣ及びＤを確認するためのレプリカプレ
ーティング マスタープレートからの細胞を、96ピン装置を用い
て、100mg/mlアンピシリン、12.5mg/mlテトラサイクリ
ン及び１％グルコースを含有する2xTY寒天プレート上で
接種した。プレートを37℃で一夜インキュベートした。
翌日５つのコロニーが増殖したが、これは5/96クローン
がＣ又はＤで示される構造を有したことを示す。
（ｆ）ベクターC,D及びＥを確認するためのコロニーハ
イブリダイゼーション Sambrook等（1989上記）が記載しているような標準技
法を用いて配列によりコロニーハイブリダイゼーション
を実施した。使用したプローブは、NQ10.12.5 VHのCDRA
3と特異的に結合する放射能標識化オリゴヌクレオチドV
HNQ10PRであった。
96コロニーのうち73％が陽性で、したがってベクター
C,D又はＥに相当した。
（ｇ）ベクターＣ及びＥを確認するためのPCRスクリー
ニング 事実上WO92/01047の実施例11に記載されているのと同
様にして、PCR反応を実施した。96クローンの各々から
の細胞を爪楊枝を用いて注意深く0.5ml遠心管中の滅菌
水20ml中に移した。次いで標本を５分間沸騰水浴中に入
れ、この2mlを各々20mlのPCR反応液のための鋳型として
用いた。
プライマーFDPCRBACK及びVHNQ10PRを用いて、増幅を
各々94℃で１分、50℃で１分及び72℃で２分間の３サイ
クル実行した。PCR反応生成物を１％TAEアガロースゲル
に溶解した（Sambrook et al.,1989上記）。
96クローンのうち72が約1kb PCR断片を示し、したが
って陽性と採点した。これらのクローンはベクターＣ及
びＥに相当する。
（ｇ）ベクターＤを確認するためのPCRスクリーニング 第二組のPCR反応を上記のように配列からの細胞に関
して実施し、この場合プライマーLMB3及びVHNQ10PRを用
いた。
96クローンのうち１つだけが約400bpのPCR断片を示
し、したがってベクターＤと評価した。
（ｈ）組換え体の分析 先行実験は、サンプリングした96のテトラサイクリン
耐性クローンのうち、23がベクターＡ、４つがベクター
Ｃ、１つがベクターＤそして68がベクターＥであった。
68のベクターＥクローンはすべて、phOx−BSAと結合す
るファージを産生したが、しかし残りの28クローンは産
生しなかった（予測通り）。したがって全テトラサイク
リン耐性クローンの70％がベクターＥに相当し、これは
ファージ上での表示のために機能的抗phOx Fabをコード
する。本方法は非常に有効で、非常に大きな組合せレパ
ートリーの作成及び使用を可能にする。
実施例 2:In vivo組換えを用いた非常に大きな組合せ
ライブラリーの作成 本実施例は、前記実施例に略述したin vivo組換え法
を用いた非免疫化ドナーからのＶ遺伝子の非常に大きな
ライブラリーの構築を記載する。以下に詳述した手法の
多くが従来記載されている（Marks,J.et al.,（1991）
上記）。
（ａ）cDNA鋳型の調製 約108個のＢ−リンパ球を含有する血液500mlを２名の
健康な有志から採取した。Ficoll上で白血球を分離し、
変法（Cathala,G.,J.Savouret,B.Mendez,B.L.Wesr,M.Ka
rin,J.A.Martial and J.D.Baxter（1983）A method for
isolation of intact,transcriptionally active ribo
nucleic acid.DNA.2,329）を用いて穴を調製した。３本
の一重鎖cDNA合成は、Ｈ鎖に関してはHuIgMFOR不変部プ
ライマーを、カッパＬ鎖に関してはHuCKFORCYS,ラムダ
Ｌ鎖に関してはHuCLFORCYSを用いて、2.5x107B細胞に相
当するRNAから、Marks等（1991上記）が記載したように
して行なった（表１）。
（ｂ）Ｈ鎖のPCR及びＨ鎖レパートリーの構築 HuVHBACKプライマーの各々と一緒にHuIgMFORプライマ
ーを用いて別々に、VH遺伝子をPCR増幅した。６つの別
々のPCR増幅を、HuIgMFORプライマー、総濃度20pmolのB
ACKプライマー、20pmolの濃度のFORMARDプライマーを用
いたcDNA合成からの上清５μｌ、250μM dNTPs,10mM KC
l,10mM（NH4）2SO4,20mM Tris.HCl（pH8.8）,2.0mM MgC
l2,100mg/ml BSA及び１μｌ（１単位）Vent DNAポリメ
ラーゼ（New England Biolabs）を含有する反応液50μ
ｌの各々について実施した。反応混合物の上に鉱（パラ
フィン）油をかけて、Techne PHC−２サーマルサイクラ
ーを用いて増幅を30サイクル施した。サイクルは94℃で
１分（変性）、57℃で１分（アニーリング）及び72℃で
2.5分（伸長）であった。生成物を1.0％アガロースゲル
上で精製し、Geneclean（Bio−101）によりゲルから単
離して、25μｌのH2O中に再懸濁した。次いで６つの生
成物をプールし、｀プルスルー´PCR反応を実施してSfi
I及びNon I制限部位を取りつけた。
プルスルー反応はプライマーHuVHBACK Sfi（６つのプ
ライマーすべての等モル混合物）及びHuCM1FONOを用い
て鎮静させた。前工程からのプールされたPCR生成物５
μｌを含有する反応液50mlを、プライマーPCRの場合と
同一条件を用いて増幅したが、但し25サイクルの増幅を
用いた。その結果生じた断片をSfi及びNot Iで消化し、
ゲル精製して、前述の方法（Sambrook,J.et al.,（198
9）上記;PCT WO92/01047）を用いて断片をSfi及びNot I
断片pUC19−2loxに結紮した。結紮混合物をフェノール
−クロロホルム抽出して、その後TGl細胞中に電気穿孔
した（Marks,J et al.,（1991）上記）。要するに、結
紮DNAを水20μｌ中に再懸濁し、2.5μｌ標本をエレクト
ロコンピテント大腸菌TG1のアリコート50μｌ中に電気
穿孔した。SOC中で１時間細胞を増殖させて、次いで243
x 243mm皿（Nunc）中の100μg/mlアンピシリン及び１
％グルコース（2YTAG）を加えた2YT寒天上に置いて、30
℃で一夜増幅させた。コロニーをプレートから15％グリ
セロールを含有する2YTAG中に掻き取って入れて、ライ
ブラリーストックとして−70℃で保存した。
Ｈ鎖レパートリーを算出すると約1.107の別々の組換
え体が確認され、これはBst N I指紋採取により非常に
多様であることが示された（PCT WO92/01047）。
（ｃ）Ｌ鎖のPCR並びにカッパ及びラムダ鎖レパートリ
ーの構築 カッパ及びラムダ鎖遺伝子を別々に増幅した。カッパ
鎖遺伝子は、HuCKFORCYSとともに12のSYNKBプライマー
の等モル混合物を用いて増幅した（表１）。HuCLFORCYS
プライマーとともに８つのDPVLプライマーの等モル混合
物を用いてcDNA合成から１−鎖遺伝子を増幅した。各々
の場合、適切なcDNA合成からの上清５μｌ、総濃度20pm
olのBACKプライマー、20pmolの濃度のFORWARDプライマ
ー、250μM dNTPs,10mM KCl,10mM（NH4）2SO4,20mM Tri
s.HCl（pH8.8）,2.0mM MgCl2,100mg/ml BSA及び１μｌ
（１単位）Vent DNAポリメラーゼ（New England Biolab
s）を含有する反応液50μｌの各々について実施した。
反応混合物の上に鉱（パラフィン）油をかけて、Techne
PHC−２サーマルサイクラーを用いて増幅を30サイクル
施した。サイクルは94℃で１分（変性）、57℃で１分
（アニーリング）及び72℃で2.5分（伸長）であった。
生成物を1.0％アガロースゲル上で精製し、Geneclean
（Bio−101）によりゲルから単離して、25μｌのH2O注
に再懸濁した。
プルスルー反応はここでは、２つのＬ鎖調製の各々に
おいて実施した。カッパ鎖遺伝子は、12のSYNKBApaプラ
イマーの等モル混合物をHuCKFORCYSNOTとともに用いて
増幅した。ラムダ鎖遺伝子は、８つのDPVLApaプライマ
ーの等モル混合物をHuCLFORCYSNOTとともに用いて増幅
した。プルスルー条件は一次Ｌ鎖PCRに関して実施した
が、但し25サイクルの増幅を用いた。
カッハ及びラムダ鎖レパートリーは別々に処理した。
各々の場合、PCR生成物をApa L1及びNot Iで消化し、Ap
a L1−Not I切断fdDOG−2lox（標準フォーマットを用い
て調製）に結紮し、結紮混合物をフェノール抽出により
精製して、エタノール沈殿させ、その後上記のようにTG
1細胞中に電気穿孔したが、但し形質転換細胞は、243 x
243mm皿（Nunc）中の12.5μg/mlテトラサイクリンを加
えた2YT寒天上に置いて、30℃で一夜増殖させた。コロ
ニーをプレートから15％グリセロールを含有する2YTAG
中に掻き取って入れて、ライブラリーストックとして−
70℃で保存した。
カッパ及びラムダ鎖レパートリーを算出すると約1.10
6の別々の組換え体が確認された;Bst N I指紋採取によ
り非常に多様であることが示された。
（ｄ）Ｈ及びＬ鎖のin vivo組換え 実施例１に記載されたものをスケールアップした手法
を用いて、カッパ及びラムダ鎖レパートリーをＨ鎖レパ
ートリーで別々に組換えた。
O.D.600nmを用いて、プレートから掻き取ったストッ
クの細胞密度を算出したが、アルゴリズムを用いると、
O.D.600nm 1.0＝5.108細胞であった。fdDOG−2lox中の
カッパ及びラムダ鎖レパートリーの各々からの約1.1010
細胞を12.5μg/mlテトラサイクリンを加えた１リットル
の容量の2xTY中で接種して、迅速に振盪させながら37℃
で30時間増殖させた。ファージ粒子をPCT WO92/01047の
実施例６に記載されているような透明成長培地から採集
して、約1.1012TU ml−１に調節して保存した。
Ｈ鎖レパートリーからの1.1011細胞を2.5L振盪フラス
コ中の2xlリットルの2YTAG中で接種し、培地が0.4ml-1
のO.D.600nmを達成するまで、迅速に振盪させながら37
℃で増殖させた。5.1012fdDOG−2loxカッパ及びラムダf
dDOG−2loxファージを加え（細菌の10倍以上）、30分振
盪せずに37℃でインキュベーションを継続した。次いで
5.1012pfuファージPlCm cl.100を加え、37℃でさらに30
分インキュベーションを継続した。次に培養液を4000xg
で４℃で15分遠心分離し、上清を注ぎ出した。細胞ペレ
ットを１リットルの2xTY,100mg/mlアンピシリン、12.5m
g/mlテトラサイクリン、12.5mg/mlクロラムフェニコー
ル、１％グルコース中に再懸濁し、培地を30℃で40時間
振盪した。ファージfd粒子（組換え体ファージを含む）
を13000gで15分間での遠心分離により細菌を除去した培
地上清から採集し、粒子PEGを沈殿させた。
次に組換え済ライブラリーファージを10mM TRIS−HCl
（pH8.0）,1mM EDTA中に再懸濁して、1.1012TU ml−１
に調整した：このストックはライブラリーを表す。これ
らのファージを抗原に関して選択し、新鮮な大腸菌中に
再感染させて、12.5μg/mlテトラサイクリン（他の抗生
物質は必要でない。図４の構築物Ｅ参照）を含有する2x
TY寒天上にプレーティングして回収した。ファージは成
長培地から回収した機能的抗体を保有する。
注：本発明を用いて得られるsbp成員及びそのコード
核酸は、誘導体の生成に用い得る。誘導体という言葉は
上記してある。
表１ オリゴヌクレオチド配列 ALL WRITTEN 5'−〉3' Ａ）一重鎖cDNA合成のためのプライマー ヒトIgM不変部プライマー ヒトカッパー不変部プライマー ヒトラムダ不変部プライマー Ｂ）Ｈ鎖−次PCR VHプライマー 前方プライマー Ｃ）制限部位プライマーによるＨ鎖再増幅 VH後方プライマー 前方プライマー Ｄ）カッパー鎖一次PCR 後方プライマー 前方プライマー HUCKFORCYS 上記参照 Ｅ）制限部位を含有するプライマーによるカッパー鎖再
増幅 後方プライマー 前方プライマー Ｆ）ラムダ鎖一次PCR 後方プライマー 前方プライマー HUCLFORCYS 上記参照 Ｇ）制限部位を有するプライマーによるラムダ鎖再増幅 後方プライマー 前方プライマー Ｈ）他のプライマー／プローブ
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ａ (72)発明者 ジョンソン，ケビン スチュアート イギリス国，ケンブリッジ シービー３ オーディーエイチ，ハンティンドン ロード 181 (72)発明者 ウィンター，グレゴリー ポール イギリス国，ケンブリッジ シービー１ ４ユーティー，キャベンディッシュ アベニュ 64 (72)発明者 グリフィスズ，アンドリュー デビッド イギリス国，ケンブリッジ シービー１ ４エーワイ，チェリー ヒントン ロ ード，ライラック コート 28 (72)発明者 スミス，アンドリュー ジョン ハモン ド イギリス国，ケンブリッジ シービー２ ２ビーアイ，デボンシャー ロード, デボンシャー ミューズ 82 (72)発明者 ウォーターハウス，ピーター オーストラリア国，オーストラリアン キャピタル テリトリー 2601，キャン ベラ，オコナー，バンジンストリート ５ (56)参考文献 特表 平６−508511（ＪＰ，Ａ) 国際公開92／001047（ＷＯ，Ａ１) 国際公開92／020791（ＷＯ，Ａ１) Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ ｉ．ＵＳＡ，Ｍａｙ 1991，88，ｐ. 4363−4366 Ｎｕｃｌ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ, 1986，14，ｐ．2287−2300 (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C12N 15/00 - 15/09 C12N 1/00 - 7/08 C12P 21/00 - 21/08 G01N 33/50 - 33/98 ＪＩＣＳＴファイル（ＪＯＩＳ) ＥＵＲＯＰＡＴ（ＱＵＥＳＴＥＬ) ＭＥＤＬＩＮＥ（ＳＴＮ) ＰｕｂＭｅｄ ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ) ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ)

Claims (23)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】多重合性の特異的結合対（sbp）の成員を
    生産する方法であって、 （ａ）特異的結合対の成員の一次ポリペプチド鎖と複製
    可能遺伝子表示パッケージ（rgdp）の成分との融合体の
    集団をコードする核酸を含有する一次ベクターと、 （ｂ）特異的結合対の成員の二次ポリペプチド鎖の集団
    をコードする核酸を含有する二次ベクターとの間で、 組換えを起こす又は起こさせることを含んで成り、 ただし、それらの集団の少なくとも一つは、遺伝子的に
    多様性を有し、 そして、その組換えによって、各々が、前記のポリペプ
    チド融合体及び二次ポリペプチド鎖をコードする核酸を
    含有し、且つrgdpの前記成分によってrgdp中にパッケー
    ジされ得る組換えベクターが生成することを含んで成る
    方法において、 前記一次ベクターの各々及び二次ベクターの各々が、一
    次部位特異性組換え配列及び一次のものとは異なる二次
    部位特異性組換え配列を含有し、異なるベクター上の一
    次部位特異性組換え配列間及び異なるベクター上の二次
    部位特異性組換え配列間では、部位特異性組換えが起き
    るが、同一ベクター上の一次部位特異性組換え配列と二
    次部位特異性組換え配列との間では、それが起きない、 ことを特徴とする方法。
  2. 【請求項２】前記のポリペプチド融合体及び二次ポリペ
    プチド鎖を発現させること、そして一次ポリペプチド鎖
    及び二次ポリペプチド鎖をコードする核酸を含有し、そ
    の一次及び二次ポリペプチド鎖を、その表面上に表示す
    るrgdpを生産することを含んで成る、請求項１記載の方
    法。
  3. 【請求項３】組換えが、細胞内で起こる、請求項１又は
    ２に記載の方法。
  4. 【請求項４】組換えが、インビトロで起こる、請求項１
    又は２に記載の方法。
  5. 【請求項５】生産された組換えベクターが、一次及び二
    次ベクター間の組換えに起因する一重鎖のsbp成員をコ
    ードする核酸を含有する、請求項１〜４のいずれか１項
    に記載の方法。
  6. 【請求項６】部位特異性組換えが起きる配列が、大腸菌
    ファージP1から得られるloxP配列又はそのloxP配列から
    得られる配列であり、そして部位特異性組換えが、大腸
    菌ファージP1から得られるCre−リコンビナーゼにより
    触媒される、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方
    法。
  7. 【請求項７】一次部位特異性組換え配列が、大腸菌ファ
    ージP1から得られるloxPであり、そして二次部位特異性
    組換え配列が、loxPの配列突然変異体である、請求項１
    〜６のいずれか１項に記載の方法。
  8. 【請求項８】一次部位特異性組換え配列が、loxP突然変
    異体であり、そして二次部位特異性組換え配列が、大腸
    菌ファージP1から得られるloxPである、請求項１〜６の
    いずれか１項に記載の方法。
  9. 【請求項９】loxP配列突然変異体が、ATAACTTCGTATA/AT
    GTATAC/TATACGAAGTTAT（loxP511）である、請求項７又
    は８に記載の方法。
  10. 【請求項１０】一次ベクターがファージ又はファージミ
    ドであり、二次ベクターがプラスミドであるか、あるい
    は一次ベクターがプラスミドであり、二次ベクターがフ
    ァージ又はファージミドである、請求項１〜９のいずれ
    か１項に記載の方法。
  11. 【請求項１１】一次ベクター及び二次ベクターよりも優
    先的に組換えベクターを複製する細菌宿主中で、細胞内
    組換えが起きる、請求項10に記載の方法。
  12. 【請求項１２】ファージ又はファージミドよりも優先的
    にプラスミドを複製するか、あるいはプラスミドよりも
    優先的にファージ又はファージミドを複製する細菌宿主
    中で、細胞内組換えが起きる、請求項11に記載の方法。
  13. 【請求項１３】細菌宿主が、大腸菌又は別のグラム陰性
    細菌のPolA株である、請求項12に記載の方法。
  14. 【請求項１４】個々のsbp成員又はsbp成員の混合集団、
    あるいはそのポリペプチド鎖成分、あるいはそのコード
    核酸を得るために、追加の方法で、１又は複数のrgdpか
    ら核酸を採取及び使用する、請求項１〜13のいずれか１
    項に記載の方法。
  15. 【請求項１５】下記の（ｉ）及び（ii）を含む、請求項
    １〜10のいずれかに記載の方法を実施する場合に用いる
    ためのキット： （ｉ）sbp成員のポリペプチド成分をコードする核酸を
    挿入するための制限部位を有し、その制限部位が、ファ
    ージキャプシド蛋白質の成熟コード配列の5'末端部にあ
    り、その部位の上流に、キャプシド蛋白質とsbpのポリ
    ペプチドとの融合体を、細菌宿主の細胞周辺腔へ導くた
    めの分泌リーダー配列を伴う一次ベクター； （ii）二次ポリペプチド鎖をコードする核酸を挿入する
    ための制限部位を有する二次ベクター； ただし、それらのベクターの少なくとも１つは、一本鎖
    バクテリオファージ用の複製起点を有し、且つそれらの
    ベクターは、部位特異性組換えが起きる配列を有するも
    のである。
  16. 【請求項１６】分泌性の複製可能遺伝子表示パッケージ
    （rgdp）の成分と融合したsbp成員の一次ポリペプチド
    鎖をコードする核酸を含有する一次ベクター及びsbp成
    員の二次ポリペプチド鎖をコードする核酸を含有する二
    次ベクターのライブラリーを保有する、ただし、その一
    次ベクター又は二次ベクターあるいはその両方が、その
    rgdp成分によってrgdp中にパッケージされ得るもので、
    且つそれらのベクターが、部位特異性組換えが起きる配
    列を有する、組換え宿主細胞であって、 一次ベクターの各々及び二次ベクターの各々が、一次部
    位特異性組換え配列及び一次のものとは異なる二次部位
    特異性組換え配列を含有し、異なるベクター上の一次部
    位特異性組換え配列間及び異なるベクター上の二次部位
    特異性組換え配列間では、部位特異性組換えが起きる
    が、同一ベクター上の一次部位特異性組換え配列と二次
    部位特異性組換え配列との間では、それが起きない、 ことを特徴とする組換え宿主細胞。
  17. 【請求項１７】部位特異性組換えが起きる配列が、大腸
    菌ファージP1から得られるloxP配列又はそのloxP配列か
    ら得られる配列である、請求項16に記載の組換え宿主細
    胞。
  18. 【請求項１８】一次部位特異性組換え配列が、大腸菌フ
    ァージP1から得られるloxPであり、そして二次部位特異
    性組換え配列が、loxPの配列突然変異体である、請求項
    16に記載の組換え宿主細胞。
  19. 【請求項１９】一次部位特異性組換え配列が、loxP突然
    変異体であり、そして二次部位特異性組換え配列が、大
    腸菌ファージP1から得られるloxPである、請求項16に記
    載の組換え宿主細胞。
  20. 【請求項２０】loxP配列突然変異体が、ATAACTTCGTATA/
    ATGTATAC/TATACGAAGTTAT（loxP511）である、請求項18
    又は19に記載の組換え宿主細胞。
  21. 【請求項２１】その表面でsbp成員を各々表示すると共
    に、その表面に表示されたsbp成員の一次及び二次ポリ
    ペプチド鎖をコードし、且つ部位特異性組換え配列を有
    する核酸を各々含有するrgdpの集団であって、請求項１
    〜14のいずれか１項に記載の方法により得られるrgdpの
    集団。
  22. 【請求項２２】その部位特異性組換え配列が、大腸菌フ
    ァージP1から得られるloxP配列又はそのloxP配列から得
    られる配列である、請求項21に記載のrgdpの集団。
  23. 【請求項２３】そのsbp成員が一重鎖のsbp成員である、
    請求項21又は22に記載のrgdpの集団。
JP51640093A 1992-03-24 1993-03-24 特異的結合対の成員の製造方法 Expired - Fee Related JP3507073B2 (ja)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
GB929206318A GB9206318D0 (en) 1992-03-24 1992-03-24 Binding substances
GB9206318.9 1992-03-24
PCT/GB1992/000883 WO1992020791A1 (en) 1990-07-10 1992-05-15 Methods for producing members of specific binding pairs
GB92/00883 1992-05-15
PCT/GB1993/000605 WO1993019172A1 (en) 1992-03-24 1993-03-24 Methods for producing members of specific binding pairs

Publications (2)

Publication Number Publication Date
JPH07505055A JPH07505055A (ja) 1995-06-08
JP3507073B2 true JP3507073B2 (ja) 2004-03-15

Family

ID=26300161

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP51640093A Expired - Fee Related JP3507073B2 (ja) 1992-03-24 1993-03-24 特異的結合対の成員の製造方法

Country Status (5)

Country Link
EP (1) EP0656941B1 (ja)
JP (1) JP3507073B2 (ja)
CA (1) CA2131151A1 (ja)
DE (1) DE69333823T2 (ja)
WO (1) WO1993019172A1 (ja)

Families Citing this family (283)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB9206318D0 (en) * 1992-03-24 1992-05-06 Cambridge Antibody Tech Binding substances
ATE199392T1 (de) * 1992-12-04 2001-03-15 Medical Res Council Multivalente und multispezifische bindungsproteine, deren herstellung und verwendung
EP0731842A1 (en) * 1993-12-03 1996-09-18 Medical Research Council Recombinant binding proteins and peptides
ATE243745T1 (de) 1994-01-31 2003-07-15 Univ Boston Bibliotheken aus polyklonalen antikörpern
FR2715940B1 (fr) * 1994-02-10 1996-04-26 Pasteur Merieux Serums Vacc Procédé de préparation d'une banque multicombinatoire de vecteurs d'expression de gènes d'anticorps, banque et systèmes d'expression d'anticorps "coliclonaux" obtenus.
US5605793A (en) * 1994-02-17 1997-02-25 Affymax Technologies N.V. Methods for in vitro recombination
US6335160B1 (en) 1995-02-17 2002-01-01 Maxygen, Inc. Methods and compositions for polypeptide engineering
FR2731014B1 (fr) * 1995-02-23 1997-03-28 Rhone Poulenc Rorer Sa Molecules d'adn, preparation et utilisation en therapie genique
US6091001A (en) * 1995-03-29 2000-07-18 Abgenix, Inc. Production of antibodies using Cre-mediated site-specific recombination
US6130364A (en) 1995-03-29 2000-10-10 Abgenix, Inc. Production of antibodies using Cre-mediated site-specific recombination
US6720140B1 (en) 1995-06-07 2004-04-13 Invitrogen Corporation Recombinational cloning using engineered recombination sites
NZ312332A (en) 1995-06-07 2000-01-28 Life Technologies Inc Recombinational cloning using engineered recombination sites
US6143557A (en) * 1995-06-07 2000-11-07 Life Technologies, Inc. Recombination cloning using engineered recombination sites
SE9503151D0 (sv) * 1995-09-13 1995-09-13 Bioinvent Internatioal Ab Combined ligand and receptor display
FR2741892B1 (fr) * 1995-12-04 1998-02-13 Pasteur Merieux Serums Vacc Procede de preparation d'une banque multicombinatoire de vecteurs d'expression de genes d'anticorps, banque et systemes d'expression d'anticorps "coliclonaux" obtenus
EP0883686A1 (en) * 1996-02-26 1998-12-16 Morphosys Gesellschaft für Proteinoptimierung mbH Novel method for the identification of nucleic acid sequences encoding two or more interacting (poly)peptides
US5916771A (en) * 1996-10-11 1999-06-29 Abgenix, Inc. Production of a multimeric protein by cell fusion method
US6420140B1 (en) 1996-10-11 2002-07-16 Abgenix, Inc. Production of multimeric protein by cell fusion method
IL119587A (en) * 1996-11-07 2000-12-06 Univ Ramot Method of preparing and for obtaining bimolecular interactions
US5851808A (en) 1997-02-28 1998-12-22 Baylor College Of Medicine Rapid subcloning using site-specific recombination
US6342369B1 (en) 1997-05-15 2002-01-29 Genentech, Inc. Apo-2-receptor
GB9712512D0 (en) 1997-06-16 1997-08-20 Bioinvent Int Ab A method for in vitro molecular evolution of protein function
EP1005569A2 (en) 1997-08-01 2000-06-07 MorphoSys AG Novel method and phage for the identification of nucleic acid sequences encoding members of a multimeric (poly)peptide complex
US6342220B1 (en) 1997-08-25 2002-01-29 Genentech, Inc. Agonist antibodies
NZ520579A (en) 1997-10-24 2004-08-27 Invitrogen Corp Recombinational cloning using nucleic acids having recombination sites and methods for synthesizing double stranded nucleic acids
EP1060395B1 (en) 1998-02-04 2008-04-30 Invitrogen Corporation Microarrays and uses therefor
JP2002517223A (ja) 1998-06-12 2002-06-18 ジェネンテック・インコーポレーテッド モノクローナル抗体、交叉反応性抗体およびそれを生成する方法
AU774643B2 (en) 1999-03-02 2004-07-01 Invitrogen Corporation Compositions and methods for use in recombinational cloning of nucleic acids
EP1194540A1 (en) * 1999-07-14 2002-04-10 Clontech Laboratories Inc. Recombinase-based methods for producing expression vectors and compositions for use in practicing the same
ES2307526T3 (es) 1999-08-23 2008-12-01 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Potenciadores de la expresion del antigeno hm1.24.
WO2002010183A1 (en) 2000-07-31 2002-02-07 Menzel, Rolf Compositions and methods for directed gene assembly
US7198924B2 (en) 2000-12-11 2007-04-03 Invitrogen Corporation Methods and compositions for synthesis of nucleic acid molecules using multiple recognition sites
US6958213B2 (en) 2000-12-12 2005-10-25 Alligator Bioscience Ab Method for in vitro molecular evolution of protein function
US20020086292A1 (en) 2000-12-22 2002-07-04 Shigeaki Harayama Synthesis of hybrid polynucleotide molecules using single-stranded polynucleotide molecules
WO2002064159A1 (en) 2001-02-07 2002-08-22 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Remedies for tumor in hematopoietic organs
UA80091C2 (en) 2001-04-02 2007-08-27 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Remedies for infant chronic arthritis-relating diseases and still's disease which contain an interleukin-6 (il-6) antagonist
US20040259153A1 (en) * 2001-08-22 2004-12-23 Yoshikazu Kurosawa Methods for selecting biding molecule
PT1298207E (pt) 2001-10-01 2010-11-08 Deutsches Krebsforsch Processo para a produção de bibliotecas de proteínas e para a selecção de proteínas a partir da mesma
EP3578168A1 (en) 2002-02-14 2019-12-11 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Formulation of antibody-containing solutions comprising a sugar as a stabilizer
JP4753578B2 (ja) 2002-06-03 2011-08-24 ジェネンテック， インコーポレイテッド 合成抗体ファージライブラリー
EP2305710A3 (en) 2002-06-03 2013-05-29 Genentech, Inc. Synthetic antibody phage libraries
EP2283869A3 (en) 2002-07-15 2012-06-27 Board of Regents, The University of Texas System Selected antibodies and duramycin peptides binding to anionic phospholipids and aminophospholipids and their use in the treatment of viral infections and cancer
US20060058511A1 (en) 2002-08-27 2006-03-16 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Method for stabilizing protein solution preparation
DK2261230T3 (en) 2002-09-11 2017-06-12 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Method of Protein Purification.
GB2401040A (en) 2003-04-28 2004-11-03 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Method for treating interleukin-6 related diseases
US9708410B2 (en) 2003-05-30 2017-07-18 Janssen Biotech, Inc. Anti-tissue factor antibodies and compositions
EP2228445A1 (en) 2003-06-18 2010-09-15 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Fucose Transporter
EP2311468B1 (en) 2003-08-08 2014-01-15 Perseus Proteomics Inc. Gene overexpressed in cancer
WO2005054438A2 (en) 2003-12-01 2005-06-16 Invitrogen Corporation Nucleic acid molecules containing recombination sites and methods of using the same
ES2337473T3 (es) 2004-02-19 2010-04-26 Genentech, Inc. Anticuerpos reparadores con cdr.
MXPA06011199A (es) 2004-03-31 2007-04-16 Genentech Inc Anticuerpos anti-tgf-beta humanizados.
US7785903B2 (en) 2004-04-09 2010-08-31 Genentech, Inc. Variable domain library and uses
US9228008B2 (en) 2004-05-28 2016-01-05 Idexx Laboratories, Inc. Canine anti-CD20 antibodies
JPWO2006067847A1 (ja) 2004-12-22 2008-06-12 中外製薬株式会社 フコーストランスポーターの機能が阻害された細胞を用いた抗体の作製方法
PT1863849E (pt) 2005-03-11 2011-05-10 Syngenta Ltd Controlo de pragas de roedores
AU2006232287B2 (en) 2005-03-31 2011-10-06 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Methods for producing polypeptides by regulating polypeptide association
KR101367544B1 (ko) 2005-06-10 2014-02-26 추가이 세이야쿠 가부시키가이샤 메글루민을 함유하는 단백질 제제의 안정화제, 및 그의이용
EP1941907B1 (en) 2005-10-14 2016-03-23 Fukuoka University Inhibitor of transplanted islet dysfunction in islet transplantation
KR101239051B1 (ko) 2005-10-21 2013-03-04 추가이 세이야쿠 가부시키가이샤 심장질환 치료제
WO2007056441A2 (en) 2005-11-07 2007-05-18 Genentech, Inc. Binding polypeptides with diversified and consensus vh/vl hypervariable sequences
US8128934B2 (en) 2005-11-14 2012-03-06 Ribomic, Inc. Method for treatment or prevention of disease associated with functional disorder of regulatory T cell
AR057582A1 (es) 2005-11-15 2007-12-05 Nat Hospital Organization Agentes para suprimir la induccion de linfocitos t citotoxicos
AR057941A1 (es) 2005-11-25 2007-12-26 Univ Keio Agentes terapeuticos para el cancer de prostata
US8957187B2 (en) 2005-12-02 2015-02-17 Genentech, Inc. Binding polypeptides and uses thereof
JP5231810B2 (ja) 2005-12-28 2013-07-10 中外製薬株式会社 抗体含有安定化製剤
CN101370521A (zh) 2006-01-27 2009-02-18 学校法人庆应义塾 伴有脉络膜血管生成的疾病的治疗药
US8278421B2 (en) 2006-03-20 2012-10-02 Xoma Techolology Ltd. Human antibodies specific for gastrin materials and methods
JP5624276B2 (ja) 2006-03-31 2014-11-12 中外製薬株式会社 抗体の血中動態を制御する方法
EP3345616A1 (en) 2006-03-31 2018-07-11 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Antibody modification method for purifying bispecific antibody
CA2648644C (en) 2006-04-07 2016-01-05 Osaka University Muscle regeneration promoter
US20100080794A1 (en) 2006-04-14 2010-04-01 Takashi Tsuji Mutant polypeptide having effector function
AR061317A1 (es) 2006-06-08 2008-08-20 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Agentes para prevenir o tratar enfermedades inflamatorias
CA2657385A1 (en) 2006-07-13 2008-01-17 Naoki Kimura Cell death inducer
US8025881B2 (en) 2006-07-21 2011-09-27 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha BMP antibodies and methods of treating kidney disease using the same
JP5406027B2 (ja) 2006-08-04 2014-02-05 ノバルティス アーゲー ＥｐｈＢ３特異的抗体およびその使用
JP5317697B2 (ja) 2006-08-14 2013-10-16 中外製薬株式会社 抗Ｄｅｓｍｏｇｌｅｉｎ３抗体を用いる癌の診断および治療
KR20140033241A (ko) 2006-08-18 2014-03-17 노바르티스 아게 Ｐｒｌｒ 특이적 항체 및 그 용도
WO2008032833A1 (fr) 2006-09-14 2008-03-20 Medical & Biological Laboratories Co., Ltd. Anticorps présentant une activité adcc accrue et son procédé de production
CA2665528C (en) 2006-10-12 2018-01-23 The University Of Tokyo Diagnosis and treatment of cancer using anti-ereg antibody
WO2008047914A1 (fr) 2006-10-20 2008-04-24 Forerunner Pharma Research Co., Ltd. Agent anticancéreux comprenant un anticorps anti-hb-egf en tant qu'ingrédient actif
EP3040347A3 (en) 2006-10-20 2016-09-21 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Pharmaceutical composition comprising anti-hb-egf antibody as active ingredient
AU2007329307B2 (en) 2006-12-07 2012-08-02 Novartis Ag Antagonist antibodies against EphB3
WO2008072723A1 (ja) 2006-12-14 2008-06-19 Forerunner Pharma Research Co., Ltd. 抗Claudin3モノクローナル抗体およびそれを用いる癌の治療および診断
WO2008081942A1 (ja) 2007-01-05 2008-07-10 The University Of Tokyo 抗prg-3抗体を用いる癌の診断および治療
CN101646459B (zh) 2007-01-23 2014-02-12 国立大学法人信州大学 慢性排斥反应抑制剂
JP5374360B2 (ja) 2007-02-27 2013-12-25 中外製薬株式会社 抗ｇｒｐ７８抗体を有効成分として含む医薬組成物
CL2008000719A1 (es) 2007-03-12 2008-09-05 Univ Tokushima Chugai Seiyaku Agente terapeutico para cancer resistente a agentes quimioterapeuticos que comprende un anticuerpo que reconoce hla de clase i como ingrediente activo; composicion farmaceutica que comprende dicho anticuerpo; y metodo para tratar cancer resistente a
JP5117765B2 (ja) 2007-05-28 2013-01-16 国立大学法人 東京大学 抗ｒｏｂｏ１抗体を含むｐｅｔ用腫瘍診断剤
JP5424330B2 (ja) 2007-07-26 2014-02-26 国立大学法人大阪大学 インターロイキン６受容体阻害剤を有効成分とする眼炎症疾患治療剤
CA2698146C (en) 2007-08-30 2016-12-20 Daiichi Sankyo Company, Limited Anti-epha2 antibody
JP5334319B2 (ja) 2007-09-26 2013-11-06 中外製薬株式会社 Ｃｄｒのアミノ酸置換により抗体の等電点を改変する方法
RU2010116756A (ru) 2007-09-28 2011-11-10 Чугаи Сейяку Кабусики Кайся (Jp) Антитело против глипикана-3 с улучшенными кинетическими показателями в плазме
KR101601986B1 (ko) 2007-10-02 2016-03-17 추가이 세이야쿠 가부시키가이샤 인터류킨 6 수용체 저해제를 유효 성분으로 하는 이식편대숙주병 치료제
SG10201605897RA (en) 2007-10-11 2016-09-29 Daiichi Sankyo Co Ltd ANTIBODY TARGETING OSTEOCLAST-RELATED PROTEIN Siglec-15
MX2010004007A (es) 2007-10-15 2010-06-15 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Metodo para la produccion de un anticuerpo.
US20120047586A9 (en) 2007-10-24 2012-02-23 Otsuka Chemical Co., Ltd Polypeptide having enhanced effector function
CA2705509A1 (en) 2007-11-14 2009-05-22 Forerunner Pharma Research Co., Ltd. Diagnosis and treatment of cancer using anti-gpr49 antibody
CA2706549A1 (en) 2007-11-15 2009-05-22 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Monoclonal antibody capable of binding to anexelekto, and use thereof
BRPI0821110B8 (pt) 2007-12-05 2021-05-25 Chugai Pharmaceutical Co Ltd anticorpo de neutralização de anti-nr10/il31ra, composição farmacêutica compreendendo o referido anticorpo e uso do mesmo
TWI441649B (zh) 2007-12-05 2014-06-21 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Use of anti-NR10 monoclonal antibody with neutralizing activity against NR10 in the manufacture of prophylactic or therapeutic agents for pruritus
EP2241333A1 (en) 2007-12-12 2010-10-20 National Cancer Center Therapeutic agent for mll leukemia and moz leukemia of which molecular target is m-csf receptor, and use thereof
US8414893B2 (en) 2007-12-21 2013-04-09 Amgen Inc. Anti-amyloid antibodies and uses thereof
PE20091174A1 (es) 2007-12-27 2009-08-03 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Formulacion liquida con contenido de alta concentracion de anticuerpo
EP4282428A3 (en) 2008-01-11 2024-03-20 The University of Tokyo Anti-cldn6 antibody
MX2010008096A (es) 2008-01-25 2010-09-22 Amgen Inc Anticuerpos de ferroportina y metodos de uso.
CL2009000647A1 (es) 2008-04-04 2010-06-04 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Composicion farmaceutica para tratar o prevenir cancer hepatico que comprende una combinacion de un agente quimioterapeutico y un anticuerpo anti-glipicano 3; agente para atenuar un efecto secundario que comprende dicho anticuerpo; metodo para tratar o prevenir un cancer hepatico de un sujeto.
KR20220162801A (ko) 2008-04-11 2022-12-08 추가이 세이야쿠 가부시키가이샤 복수 분자의 항원에 반복 결합하는 항원 결합 분자
EP2620448A1 (en) 2008-05-01 2013-07-31 Amgen Inc. Anti-hepcidin antibodies and methods of use
WO2009147781A1 (ja) 2008-06-02 2009-12-10 国立大学法人東京大学 抗がん剤
WO2009148148A1 (ja) 2008-06-05 2009-12-10 国立がんセンター総長が代表する日本国 神経浸潤抑制剤
CA2728473A1 (en) 2008-06-20 2009-12-23 National University Corporation Okayama University Antibody against oxidized ldl/.beta.2gpi complex and use of the same
AR073060A1 (es) 2008-08-14 2010-10-13 Arana Therapeutic Ltd Anticuerpos anti-il-12/il-23
MX2011006908A (es) 2008-12-26 2011-10-06 Univ Tokio Diagnosis y tratamiento del cancer utilizando el anticuerpo anti-lgr7.
JP2010210772A (ja) 2009-03-13 2010-09-24 Dainippon Screen Mfg Co Ltd 液晶表示装置の製造方法
MX347291B (es) 2009-03-20 2017-04-17 Amgen Inc Inmunoglobulinas portadoras y usos de las mismas.
CN102272306B (zh) 2009-04-09 2017-12-26 第一三共株式会社 抗‑Siglec‑15抗体
CA2760642A1 (en) 2009-05-01 2010-11-04 The University Of Tokyo Anti-cadherin antibody
EP2270053A1 (en) 2009-05-11 2011-01-05 U3 Pharma GmbH Humanized AXL antibodies
AU2010249470B2 (en) 2009-05-20 2015-06-25 Novimmune S.A. Synthetic Polypeptide Libraries And Methods For Generating Naturally Diversified Polypeptide Variants
EP2436397B1 (en) 2009-05-29 2017-05-10 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Pharmaceutical composition containing antagonist of egf family ligand as component
CN102449149B (zh) 2009-05-29 2014-04-23 莫佛塞斯公司 集合及其使用方法
AU2010278067B2 (en) 2009-07-31 2016-10-27 Shin Maeda Cancer metastasis inhibitor
AU2010285974A1 (en) 2009-08-17 2012-03-22 Forerunner Pharma Research Co., Ltd. Pharmaceutical composition comprising anti-HB-EGF antibody as active ingredient
TW201118166A (en) 2009-09-24 2011-06-01 Chugai Pharmaceutical Co Ltd HLA class I-recognizing antibodies
WO2011038301A2 (en) 2009-09-25 2011-03-31 Xoma Technology Ltd. Screening methods
US8926976B2 (en) 2009-09-25 2015-01-06 Xoma Technology Ltd. Modulators
TW201129379A (en) 2009-11-20 2011-09-01 Amgen Inc Anti-Orai1 antigen binding proteins and uses thereof
TWI505838B (zh) 2010-01-20 2015-11-01 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Stabilized antibody solution containing
KR101762467B1 (ko) 2010-01-29 2017-07-27 도레이 카부시키가이샤 폴리락트산계 수지 시트
PL2535358T3 (pl) 2010-02-10 2018-05-30 Fujifilm Ri Pharma Co., Ltd. Przeciwciało przeciwko kadherynie znakowane radioaktywnym metalem
JP2011182645A (ja) * 2010-03-04 2011-09-22 Kyushu Univ 動物細胞ディスプレイ法およびそれを利用した完全ヒトモノクローナル抗体の体外成熟法
EP2543730B1 (en) 2010-03-04 2018-10-31 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Antibody constant region variant
TWI667257B (zh) 2010-03-30 2019-08-01 中外製藥股份有限公司 促進抗原消失之具有經修飾的ＦｃＲｎ親和力之抗體
HRP20221490T1 (hr) 2010-05-28 2023-02-03 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Poboljšanje antitumorskog odgovora t stanice
EP2578233B1 (en) 2010-05-28 2017-04-26 National Cancer Center Therapeutic agent for pancreatic cancer
AU2011301803A1 (en) 2010-09-17 2013-03-21 Baxalta GmbH Stabilization of immunoglobulins and other proteins through aqueous formulations with sodium chloride at weak acidic to neutral pH
EA201370076A1 (ru) 2010-09-22 2013-08-30 Амген Инк. Иммуноглобулины-переносчики и их применение
KR20140014077A (ko) 2010-10-25 2014-02-05 리전츠 오브 더 유니버스티 오브 미네소타 교모세포종의 치료를 위한 치료 조성물
SI2636736T1 (sl) 2010-10-29 2016-09-30 Daiichi Sankyo Company, Limited Novo anti-dr5 protitelesce
WO2012057328A1 (ja) 2010-10-29 2012-05-03 株式会社ペルセウスプロテオミクス 高い内在化能力を有する抗ｃｄｈ３抗体
ES2696548T3 (es) 2010-11-19 2019-01-16 Morphosys Ag Una colección de secuencias de anticuerpos y su uso
TWI638833B (zh) 2010-11-30 2018-10-21 中外製藥股份有限公司 細胞傷害誘導治療劑
EP2647706B1 (en) 2010-11-30 2023-05-17 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Antigen-binding molecule capable of binding to plurality of antigen molecules repeatedly
JP2014504503A (ja) 2010-12-28 2014-02-24 ゾーマ テクノロジー リミテッド Ｐｄｚドメインを用いた細胞表面提示
CA2826142A1 (en) 2011-02-03 2012-08-09 Xoma Technology Ltd. Methods and materials for enhancing functional protein expression in bacteria
EP2679681B2 (en) 2011-02-25 2023-11-15 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha FcgammaRIIB-specific FC antibody
EP2698431B1 (en) 2011-03-30 2020-09-09 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Retention of antigen-binding molecules in blood plasma and method for modifying immunogenicity
US10059746B2 (en) 2011-04-04 2018-08-28 University Of Iowa Research Foundation Methods of improving vaccine immunogenicity
EP2700652B1 (en) 2011-04-18 2018-12-19 The University of Tokyo Diagnosis and treatment of cancer using anti-itm2a antibody
CA2834136C (en) 2011-04-25 2018-04-17 Daiichi Sankyo Company, Limited Anti-b7-h3 antibody
EP2708560A4 (en) 2011-05-09 2015-01-14 Perseus Proteomics Inc ANTIBODIES FOR THE SPECIFIC DETECTION OF TRANSFERRIN RECEPTORS
PT2714735T (pt) 2011-06-03 2021-10-26 Xoma Technology Ltd Anticorpos específicos para tgf-beta
EP4011913A1 (en) 2011-06-30 2022-06-15 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Heterodimerized polypeptide
US9574005B2 (en) 2011-07-19 2017-02-21 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Stable Protein-containing preparation containing argininamide or analogous compound thereof
EP2749572A4 (en) 2011-08-23 2015-04-01 Chugai Pharmaceutical Co Ltd NEW ANTI-DDR1 ANTIBODY WITH ANTITUMORACTIVITY
US10018630B2 (en) 2011-09-07 2018-07-10 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Cancer stem cell isolation
TW201817744A (zh) 2011-09-30 2018-05-16 日商中外製藥股份有限公司 具有促進抗原清除之ＦｃＲｎ結合域的治療性抗原結合分子
CN110655578A (zh) 2011-09-30 2020-01-07 中外制药株式会社 诱导针对靶抗原的免疫应答的抗原结合分子
US20140335089A1 (en) 2011-09-30 2014-11-13 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Antigen-binding molecule for promoting elimination of antigens
WO2013047748A1 (ja) 2011-09-30 2013-04-04 中外製薬株式会社 複数の生理活性を有する抗原の消失を促進する抗原結合分子
RU2732151C2 (ru) 2011-09-30 2020-09-11 Чугаи Сейяку Кабусики Кайся Библиотека зависимых от концентрации ионов связывающих молекул
EP2765192A4 (en) 2011-10-05 2015-04-15 Chugai Pharmaceutical Co Ltd ANTIGEN BINDING MOLECULE FOR PROMOTING THE PLASMA CLAIR OF AN ANTIGEN COMPRISING A SACCHARIDIC CHAIN TYPE RECEPTOR BINDING DOMAIN
WO2013062083A1 (ja) 2011-10-28 2013-05-02 ファーマロジカルズ・リサーチ プライベート リミテッド 癌幹細胞特異的分子
KR102398736B1 (ko) 2011-10-31 2022-05-16 추가이 세이야쿠 가부시키가이샤 중쇄와 경쇄의 회합이 제어된 항원 결합 분자
WO2013081143A1 (ja) 2011-11-30 2013-06-06 中外製薬株式会社 免疫複合体を形成する細胞内への運搬体（キャリア）を含む医薬
TWI593705B (zh) 2011-12-28 2017-08-01 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Humanized anti-epiregulin antibody and cancer therapeutic agent containing the antibody as an active ingredient
SG11201404751UA (en) 2012-02-09 2014-09-26 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Modified fc region of antibody
CN107266564A (zh) 2012-02-24 2017-10-20 中外制药株式会社 经由FcγIIB促进抗原消除的抗原结合分子
EP2832856A4 (en) 2012-03-29 2016-01-27 Chugai Pharmaceutical Co Ltd ANTI-LAMP5 ANTIBODIES AND USE THEREOF
MX2014011826A (es) 2012-03-30 2014-11-21 Daiichi Sankyo Co Ltd Anticuerpo anti-siglec-15 novedoso.
CN104220595A (zh) 2012-04-04 2014-12-17 株式会社英仙蛋白质科学 抗cdh3(p-钙粘着蛋白）抗体的药剂偶联物
JP6188681B2 (ja) 2012-04-09 2017-08-30 第一三共株式会社 抗ｆｇｆｒ２抗体
EP2841457B1 (en) 2012-04-27 2019-04-24 Daiichi Sankyo Company, Limited Anti-robo4-antibody
DK2857419T3 (da) 2012-05-30 2021-03-29 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Antigen-bindende molekyle til eliminering af aggregerede antigener
CA2874721A1 (en) 2012-05-30 2013-12-05 Tomoyuki Igawa Target tissue-specific antigen-binding molecule
JP6628966B2 (ja) 2012-06-14 2020-01-15 中外製薬株式会社 改変されたＦｃ領域を含む抗原結合分子
US11236168B2 (en) 2012-08-24 2022-02-01 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Mouse FcγammaRII-specific Fc antibody
BR112015001955A2 (pt) 2012-08-24 2017-11-07 Chugai Pharmaceutical Co Ltd variante de região fc específica de fcgamariib
EP2902489B9 (en) 2012-09-27 2018-02-07 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Fgfr3 fusion gene and pharmaceutical drug targeting same
BR122021014365B1 (pt) 2012-10-11 2022-07-05 Daiichi Sankyo Company, Limited Conjugado de anticorpo-fármaco, fármacos e composição farmacêutica compreendendo os mesmos, e uso
WO2014061277A1 (ja) 2012-10-19 2014-04-24 第一三共株式会社 親水性構造を含むリンカーで結合させた抗体－薬物コンジュゲート
HUE039920T2 (hu) 2012-11-08 2019-02-28 Univ Miyazaki Transzferrin receptor specifikusan felismerni képes antitest
ES2876009T3 (es) 2012-12-27 2021-11-11 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Polipéptido heterodimerizado
EP2971290A4 (en) 2013-03-14 2017-03-01 The Governing Council Of The University Of Toronto Scaffolded peptidic libraries and methods of making and screening the same
WO2014163101A1 (ja) 2013-04-02 2014-10-09 中外製薬株式会社 Ｆｃ領域改変体
CN107095872A (zh) 2013-05-16 2017-08-29 国立大学法人京都大学 用于确定癌症预后的方法
EP3009518B1 (en) 2013-06-11 2020-08-12 National Center of Neurology and Psychiatry Method for predicting post-therapy prognosis of relapsing-remitting multiple sclerosis (rrms) patient, and method for determining applicability of novel therapy
CN105517571A (zh) 2013-06-24 2016-04-20 中外制药株式会社 含有人源化抗上皮调节蛋白抗体作为有效成分的腺癌以外的非小细胞肺癌的治疗药
US10030071B2 (en) 2013-09-05 2018-07-24 University Of Miyazaki Antibody which specifically reacts with human integrin A6B4
US20160229922A1 (en) 2013-09-20 2016-08-11 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Treatment for hemorrhagic diseases by anti-protein-c antibody
WO2015046467A1 (ja) 2013-09-27 2015-04-02 中外製薬株式会社 ポリペプチド異種多量体の製造方法
EP3061818B1 (en) 2013-09-30 2020-12-16 Daiichi Sankyo Company, Limited Anti-lps o11 antibody
KR20160066024A (ko) 2013-10-08 2016-06-09 다이이찌 산쿄 가부시키가이샤 항 fgfr2 항체와 타제의 조합
EP3070168A4 (en) 2013-11-11 2017-06-28 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Antigen-binding molecule containing modified antibody variable region
KR20220142539A (ko) 2013-12-04 2022-10-21 추가이 세이야쿠 가부시키가이샤 화합물의 농도에 따라 항원 결합능이 변화되는 항원 결합 분자 및 그의 라이브러리
PL3088419T3 (pl) 2013-12-25 2019-03-29 Daiichi Sankyo Company, Limited Koniugat lek-przeciwciało anty-trop2
TWI787590B (zh) 2013-12-27 2022-12-21 日商中外製藥股份有限公司 等電點低之抗體的精製方法
US10391081B2 (en) 2013-12-27 2019-08-27 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha FGFR gatekeeper mutant gene and drug targeting same
CA2928794C (en) 2014-01-31 2019-08-13 Daiichi Sankyo Company, Limited Anti-her2 antibody-drug conjugate
CN106459993A (zh) 2014-03-31 2017-02-22 德彪药业国际股份公司 Fgfr融合体
KR102186027B1 (ko) 2014-04-10 2020-12-03 다이이치 산쿄 유럽 게엠베하 항her3 항체-약물 콘주게이트
EP3185004A4 (en) 2014-08-20 2018-05-30 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Method for measuring viscosity of protein solution
MA40764A (fr) 2014-09-26 2017-08-01 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Agent thérapeutique induisant une cytotoxicité
WO2016073157A1 (en) 2014-11-06 2016-05-12 Genentech, Inc. Anti-ang2 antibodies and methods of use thereof
RU2758608C2 (ru) 2014-11-19 2021-11-01 Конинклейке Филипс Н.В. Способ диагностики с использованием hnl
EP4269440A3 (en) 2015-02-27 2024-02-28 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Composition for treating il-6-related diseases
EP3095465A1 (en) 2015-05-19 2016-11-23 U3 Pharma GmbH Combination of fgfr4-inhibitor and bile acid sequestrant
EP3307786B1 (en) * 2015-06-12 2020-08-05 AxioMx, Inc. Methods and compositions for producing a chimeric polypeptide
WO2017002776A1 (ja) 2015-06-29 2017-01-05 第一三共株式会社 抗体－薬物コンジュゲートの選択的製造方法
BR112018005737A2 (pt) 2015-09-23 2018-10-09 Genentech Inc anticorpos, polinucleotídeo, vetor, célula hospedeira, método para produzir o anticorpo, para reduzir ou inibir a angiogênese, para tratar um distúrbio associado à angiogênese, para inibir a permeabilidade vascular, composição, conjugado de anticorpo, proteína de fusão, para identificar uma alteração de resíduos, utilização do anticorpo, utilização do conjugado e utilização da proteína
MY194586A (en) 2015-09-24 2022-12-05 Daiichi Sankyo Co Ltd Anti-garp antibody
WO2017086367A1 (ja) 2015-11-18 2017-05-26 中外製薬株式会社 免疫抑制機能を有する細胞に対するｔ細胞リダイレクト抗原結合分子を用いた併用療法
US11649293B2 (en) 2015-11-18 2023-05-16 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Method for enhancing humoral immune response
RU2746754C2 (ru) 2016-03-14 2021-04-20 Чугаи Сейяку Кабусики Кайся Индуцирующее повреждение клеток терапевтическое лекарственное средство, предназначенное для противораковой терапии
WO2018066626A1 (ja) 2016-10-07 2018-04-12 第一三共株式会社 抗ｈｅｒ２抗体－薬物コンジュゲート投与による耐性癌の治療
MX2019005661A (es) 2016-11-16 2019-10-07 Janssen Biotech Inc Método para tratar la psoriasis con el anticuerpo específico anti-il23.
KR102533814B1 (ko) 2016-11-28 2023-05-19 추가이 세이야쿠 가부시키가이샤 리간드 결합 활성을 조정 가능한 리간드 결합 분자
BR112019012901A2 (pt) 2016-12-22 2020-01-07 Daiichi Sankyo Company, Limited Anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do anticorpo, polinucleotídeo, vetor, célula, métodos para produzir um anticorpo ou um fragmento de ligação a antígeno do anticorpo e uma molécula que se ligue ao cd3 humano e ao cd3 de macaco cinomolgo, composição farmacêutica, e, molécula
WO2018135501A1 (ja) 2017-01-17 2018-07-26 第一三共株式会社 抗ｇｐｒ２０抗体及び抗ｇｐｒ２０抗体－薬物コンジュゲート
EP3573658A4 (en) 2017-01-30 2021-07-21 Janssen Biotech, Inc. ANTI-TNF ANTIBODIES, COMPOSITIONS, AND METHODS FOR TREATMENT OF ACTIVE PSORIATIC ARTHRITIS
CA3052938A1 (en) 2017-02-07 2018-08-16 Daiichi Sankyo Company, Limited Anti-gprc5d antibody and molecule comprising the antibody
WO2018147915A1 (en) 2017-02-07 2018-08-16 Janssen Biotech, Inc. Anti-tnf antibodies, compositions, and methods for the treatment of active ankylosing spondylitis
AU2018240938A1 (en) 2017-03-24 2019-10-10 Zenyaku Kogyo Co., Ltd. Anti-IgM/B cell surface antigen bispecific antibody
US11851486B2 (en) 2017-05-02 2023-12-26 National Center Of Neurology And Psychiatry Method for predicting and evaluating therapeutic effect in diseases related to IL-6 and neutrophils
TW202330036A (zh) 2017-05-15 2023-08-01 日商第一三共股份有限公司 抗體-藥物結合物之製造方法
JP7181535B2 (ja) 2017-06-30 2022-12-01 国立大学法人北海道大学 成長障害を生じない小児骨粗鬆症治療薬
KR20200032185A (ko) 2017-07-27 2020-03-25 다이이찌 산쿄 가부시키가이샤 항 cd147 항체
EP3444275A1 (en) 2017-08-16 2019-02-20 Exiris S.r.l. Monoclonal antibody anti-fgfr4
TW201922780A (zh) 2017-09-25 2019-06-16 美商健生生物科技公司 以抗ｉｌ１２／ｉｌ２３抗體治療狼瘡之安全且有效之方法
BR112020004126A2 (pt) 2017-09-29 2020-09-08 Daiichi Sankyo Company, Limited conjugado anticorpo-derivado de pirrolbenzodiazepina
TW201927336A (zh) 2017-10-05 2019-07-16 日商第一三共股份有限公司 細胞毒性ｔ細胞耗竭用組成物
KR20200074160A (ko) 2017-10-20 2020-06-24 가꼬우호우징 효고 이카다이가쿠 항il-6 수용체 항체를 함유하는 수술 후의 유착을 억제하기 위한 의약 조성물
US20210206845A1 (en) 2017-11-28 2021-07-08 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Ligand-binding molecule having adjustable ligand-binding activity
US11667713B2 (en) 2017-12-28 2023-06-06 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Cytotoxicity-inducing therapeutic agent
JP7458790B2 (ja) 2018-01-31 2024-04-01 元一 加藤 Ｉｌ－６阻害剤を含有する喘息の治療剤
EP3762015A4 (en) 2018-03-05 2022-04-27 Janssen Biotech, Inc. METHODS OF TREATING CROHN'S DISEASE WITH SPECIFIC ANTI-IL23 ANTIBODY
JP7125979B2 (ja) 2018-03-05 2022-08-25 学校法人 埼玉医科大学 異所性骨化の治療又は予防のための医薬組成物
US20210196568A1 (en) 2018-05-21 2021-07-01 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Lyophilized formulation sealed in glass container
JP2021530697A (ja) 2018-07-18 2021-11-11 ヤンセン バイオテツク，インコーポレーテツド 抗ｉｌ２３特異的抗体で治療した後の持続応答予測因子
PL3883606T3 (pl) 2018-09-24 2023-11-27 Janssen Biotech, Inc. Bezpieczny i skuteczny sposób leczenia wrzodziejącego zapalenia jelita grubego przeciwciałami anty-il12/il23
AU2019379418A1 (en) 2018-11-14 2021-06-03 Daiichi Sankyo Company, Limited Anti-CDH6 antibody-pyrrolobenzodiazepine derivative conjugate
JP7410051B2 (ja) 2018-11-20 2024-01-09 株式会社ペルセウスプロテオミクス 細胞内への鉄の取り込み阻害剤
CN113395979A (zh) 2018-11-20 2021-09-14 詹森生物科技公司 用抗il-23特异性抗体治疗银屑病的安全且有效的方法
WO2020128864A1 (en) 2018-12-18 2020-06-25 Janssen Biotech, Inc. Safe and effective method of treating lupus with anti-il12/il23 antibody
JPWO2020153467A1 (ja) 2019-01-24 2021-12-02 中外製薬株式会社 新規がん抗原及びそれらの抗原に対する抗体
CN113508140A (zh) 2019-02-28 2021-10-15 学校法人顺天堂 与切断型的突变型Calreticulin结合的抗体以及骨髄增殖性肿瘤的诊断、预防或治疗药
JP2022525145A (ja) 2019-03-14 2022-05-11 ヤンセン バイオテツク，インコーポレーテツド 抗ｉｌ１２／ｉｌ２３抗体組成物を生成するための製造方法
BR112021018441A2 (pt) 2019-03-18 2023-02-28 Janssen Biotech Inc Método para tratamento de psoríase em indivíduos pediátricos com anticorpo anti-il12/il23
CN113613676A (zh) 2019-03-19 2021-11-05 中外制药株式会社 包含对抗原的结合活性因mta而变化的抗原结合结构域的抗原结合分子及用于获得该抗原结合结构域的文库
KR20210141630A (ko) 2019-03-25 2021-11-23 다이이찌 산쿄 가부시키가이샤 항 her2 항체-피롤로벤조디아제핀 유도체 콘주게이트
JPWO2020196474A1 (ja) 2019-03-25 2020-10-01
JPWO2020196712A1 (ja) 2019-03-27 2020-10-01
AU2020273072A1 (en) 2019-04-10 2021-12-09 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Method for purifying Fc region-modified antibody
CA3135694A1 (en) 2019-04-17 2020-10-22 Hiroshima University Therapeutic agent for urological cancer which is characterized by being administered with il-6 inhibitor and ccr2 inhibitor in combination
AU2020279987A1 (en) 2019-05-23 2021-11-18 Janssen Biotech, Inc. Method of treating inflammatory bowel disease with a combination therapy of antibodies to IL-23 and TNF alpha
CA3142119A1 (en) 2019-05-29 2020-12-03 Daiichi Sankyo Company, Limited Dosage of an antibody-drug conjugate for treating cancer
MX2021014433A (es) 2019-06-05 2022-03-11 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Molecula de union a sitio de escision de anticuerpo.
EP4008350A4 (en) 2019-07-26 2023-06-14 Saitama Medical University ANTIBODY RECOGNIZING THE EXTRACELLULAR REGION OF ALK2/ACVR1
WO2021045184A1 (ja) 2019-09-04 2021-03-11 株式会社ペルセウスプロテオミクス 多血症治療薬
EP4049675A4 (en) 2019-10-25 2023-11-22 Daiichi Sankyo Company, Limited COMBINATION OF ANTI-GARP ANTIBODY AND IMMUNOREGULATOR
US20230250180A1 (en) 2019-11-27 2023-08-10 Perseus Proteomics Inc. Therapeutic drug for carcinomatous peritonitis
CN115335082A (zh) 2020-03-27 2022-11-11 光爱科技公司 用于杀死肿瘤细胞的医药品
KR20220160598A (ko) 2020-03-30 2022-12-06 고쿠리츠다이가쿠호진 미에다이가쿠 이중 특이적 항체
CN115379858A (zh) 2020-04-06 2022-11-22 光爱科技公司 用于杀死肿瘤细胞的医药品
WO2021261546A1 (ja) 2020-06-24 2021-12-30 国立大学法人 東京大学 光増感色素
KR20230047397A (ko) 2020-07-28 2023-04-07 추가이 세이야쿠 가부시키가이샤 신규 개변형 항체를 포함하는, 바늘 실드를 구비한 바늘 부가 프리필드 시린지 제제
KR20230048059A (ko) 2020-07-31 2023-04-10 추가이 세이야쿠 가부시키가이샤 키메라 수용체를 발현하는 세포를 포함하는 의약 조성물
AU2021331170A1 (en) 2020-08-27 2023-03-23 Juntendo Educational Foundation Anti-cleaved mutant calr-cd3 bispecific antibody and pharmaceutical composition
EP4227686A1 (en) 2020-10-08 2023-08-16 National University Corporation Tokai National Higher Education and Research System Method for determining sensitivity or medicinal effect of anti-transferrin receptor antibody
TW202237135A (zh) 2021-01-13 2022-10-01 紀念斯隆凱特琳癌症中心 抗體-吡咯并苯并二氮呯衍生物結合物
WO2022153195A1 (en) 2021-01-13 2022-07-21 Memorial Sloan Kettering Cancer Center Anti-dll3 antibody-drug conjugate
US20220378929A1 (en) 2021-02-25 2022-12-01 MediBoston Limted Anti-her2 antibody-drug conjugates and uses thereof
KR20230156368A (ko) 2021-03-12 2023-11-14 추가이 세이야쿠 가부시키가이샤 중증 근무력증의 치료 또는 예방용의 의약 조성물
EP4317435A1 (en) 2021-03-29 2024-02-07 Daiichi Sankyo Company, Limited Stable multispecific molecule and use thereof
KR20240049363A (ko) 2021-08-26 2024-04-16 가부시키가이샤 페르세우스 프로테오믹스 Ros(활성 산소종) 생산 증강제
CA3231632A1 (en) 2021-09-15 2023-03-23 Daiichi Sankyo Company, Limited Antibody-drug conjugate for use in methods of treating chemotherapy-resistant cancer
WO2023048231A1 (ja) 2021-09-24 2023-03-30 株式会社PhotoQ3 腫瘍細胞を死滅させるための医薬
WO2023057871A1 (en) 2021-10-04 2023-04-13 Novartis Ag Surfactant stabilizers
WO2023058723A1 (ja) 2021-10-08 2023-04-13 中外製薬株式会社 プレフィルドシリンジ製剤の調製方法
WO2023068226A1 (ja) 2021-10-18 2023-04-27 第一三共株式会社 抗ｃｄ３７抗体－薬物コンジュゲート
WO2023090361A1 (ja) 2021-11-16 2023-05-25 国立大学法人鳥取大学 改変ｄ領域を含むヒト免疫グロブリン重鎖遺伝子座を有する哺乳動物人工染色体ベクター、及びそのベクターを保持する細胞又は非ヒト動物
TW202334238A (zh) 2021-11-30 2023-09-01 日商第一三共股份有限公司 蛋白酶分解性遮蔽抗體
WO2023228095A1 (en) 2022-05-24 2023-11-30 Daiichi Sankyo Company, Limited Dosage regimen of an anti-cdh6 antibody-drug conjugate

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0489002B1 (en) * 1989-08-22 1994-12-28 E.I. Du Pont De Nemours And Company An in vitro packaging system for cloning dna fragments of 95 kb
GB9015198D0 (en) * 1990-07-10 1990-08-29 Brien Caroline J O Binding substance
CA2109602C (en) * 1990-07-10 2002-10-01 Gregory P. Winter Methods for producing members of specific binding pairs
DE69233782D1 (de) * 1991-12-02 2010-05-20 Medical Res Council Herstellung von Autoantikörpern auf Phagenoberflächen ausgehend von Antikörpersegmentbibliotheken

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Ｎｕｃｌ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ，１９８６，１４，ｐ．２２８７−２３００
Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，Ｍａｙ １９９１，８８，ｐ．４３６３−４３６６

Also Published As

Publication number Publication date
EP0656941A1 (en) 1995-06-14
DE69333823D1 (de) 2005-07-07
DE69333823T2 (de) 2006-05-04
CA2131151A1 (en) 1994-09-30
WO1993019172A1 (en) 1993-09-30
JPH07505055A (ja) 1995-06-08
EP0656941B1 (en) 2005-06-01

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP3507073B2 (ja) 特異的結合対の成員の製造方法
US5733743A (en) Methods for producing members of specific binding pairs
AU673515B2 (en) Methods for producing members of specific binding pairs
US6225447B1 (en) Methods for producing members of specific binding pairs
US5871907A (en) Methods for producing members of specific binding pairs
US5858657A (en) Methods for producing members of specific binding pairs
AU665190B2 (en) Methods for producing members of specific binding pairs
JP3176917B2 (ja) 特異的結合対の構成員を製造する方法
EP0527839B1 (en) Recombinant library screening methods
JP3949712B2 (ja) 抗体セグメントレパートリー由来でファージに表示される抗自己抗体の産生
Frei et al. Protein and antibody engineering by phage display
de Haard et al. Creating and engineering human antibodies for immunotherapy
US20060275811A1 (en) Method for producing target substance capturing protein and method for selecting component materials thereof
JPH08504100A (ja) 多価および多重特異性の結合タンパク質、それらの製造および使用
WO1995015982A2 (en) Process for generating specific antibodies
JP2011511647A (ja) 特異的結合対を作製するための改善された方法
Galanis et al. Bacteriophage library construction and selection of recombinant antibodies
Harvey Anchored periplasmic expression (APEx): a versatile technology for the flow cytometric selection of high affinity antibodies from Escherichia coli expressed libraries
Sblattero The Development of a Single Vector Recombination System to Make Large Phage Antibody Libraries
Deen Isolation of Human Endoplasmic Reticulum Antibodies Using Phage Display Technology

Legal Events

Date Code Title Description
A61 First payment of annual fees (during grant procedure)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61

Effective date: 20031218

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

LAPS Cancellation because of no payment of annual fees