JP2011511647A - 特異的結合対を作製するための改善された方法 - Google Patents
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- C12N15/1037—Screening libraries presented on the surface of microorganisms, e.g. phage display, E. coli display
Abstract
Description
本願は、2008年2月13日出願の米国特許出願第61/028,265号および2008年4月10日出願の米国特許出願61/043,938号に対する優先権を主張する。これらの先の出願の開示は、本出願の開示の一部とみなされ(そして参考として援用され)る。
ファージディスプレイ法は、生物科学およびバイオテクノロジーにおいて公知であり広く応用されている(例えば、特許文献1、特許文献2、およびそこに引用されている参考文献を参照されたい)。この方法では、対象の外来ポリペプチドをコードする核酸配列をファージの外殻タンパク質をコードする配列と融合させて、ファージまたはファージミドから調製した粒子の表面に外来ポリペプチドを提示させることを利用する。この技術の応用には、属するメンバーが個々のファージ粒子の表面に提示されるポリペプチドライブラリーから、特定のクローンを選択するために親和性相互作用を使用することが含まれる。ポリペプチドの提示は、そのポリペプチドをコードする配列が挿入されたファージベクターから、その配列が発現されることによってなされる。したがって、対象のポリペプチドを選択するために用いることができるファージライブラリーを形成するために、ポリペプチドをコードする配列のライブラリーを個々の提示ファージベクターに移入する。
ファージまたはファージミドにおいてFabおよびscFvのライブラリーを構築するために用いられる現行の方法は、1つにはMh種の重鎖(HC)とNl種の軽鎖(LC)を組み合わせるために、Mh×NlのDNA分子を構築し、E.coliに導入して形質転換することが必要なことから、面倒で効率が悪い。本方法により、例えば、Mh種の(プラスミド)+Nl種の(ファージ)新規DNA分子を構築することを通して、Mh種のHCとNl種のLCを組み合わせることが可能になる。組み合わせの混合は、DNAファージまたはファージミド分子の組換えライゲーションよりもはるかに効率的なファージ感染によって実現される。Nl種からなるLCは何回も繰り返し使用することができる。それゆえ、例えば107種からなるLCの集団を用いて10種のHCを試験するために必要なライゲーションおよび形質転換は、108回ではなく、10回である。我々の知る限りでは、同様の研究系は報告されておらず、細胞ライブラリーが大き過ぎる場合にこの方法の効率が減少するという希釈効果については考察されていない。
便宜上、本発明をさらに説明する前に、本明細書、実施例および添付の特許請求の範囲で使用した特定の用語についてここで定義する。
[結合]=N・[遊離]/((1/Ka)+[遊離])
しかし、親和性の定性的または半定量的な測定値を得ることで十分なこともあるので、Kaを正確に決定することは必ずしも必要ではなく、例えば、ELISAまたはFACS分析などの方法を用いて決定した親和性の定性的または半定量的な測定値はKaに比例し、したがって、例えば機能アッセイ、例えばin vitroアッセイまたはin vivoアッセイにおける活性によって、親和性の定性的測定値を得るため、または親和性についての推論を得るために、高い親和性が、例えば2倍高いかどうかを決定することなどの比較のために使用することができる。
本発明を以下の実施例によりさらに例示し、これは限定的なものと決して解釈すべきではない。本願を通して引用した全ての参考文献、係属中の特許出願および公開特許の内容は、参照により明示的に本明細書に組み込まれる。
軽鎖の迅速最適化(ROLIC)
ROLICとは、軽鎖の迅速最適化である。この方法の例示的な実施形態において、SS−VH(i)−CH1の集団をコードする遺伝子を、PlacZなどの適切な調節可能なプロモーターの制御下で、ベクター内(pHCSK22など)に置く。SSは、E.coliにおいてVH(i)−CH1の分泌を引き起こし得るシグナル配列である(iは、集団におけるこのVHの指数であり、iは1、2、・・・Nであり得る)。VH(i)は、抗体の重鎖の可変ドメインであり、CH1は、IgG重鎖(HC)の第1の定常ドメインである。ベクターpHCSK22もpBR322の複製起点およびカナマイシン耐性遺伝子(kanR)を含有する。pHCSK22内に入れられたHC集団は、特定の標的抗原に対して親和性を有するようにまたは他の一部の望ましい性質を選択されることになる。
1.FAB−310またはFAB−410からの選択を1〜2ラウンド行う。
5.ファージELISAを使用して役立つLC/HC対を有するコロニーを選び取る。
図2は、ROLICを用いてLCを選択する1つの方法を例証している。図3は、潜在的に高速な方法を例証している。
完全なライブラリーを樹立する前に、以下の評価実験を完了させた。
5.各ライブラリーに対して4つのプレートについて配列決定することにより、各ライブラリーの多様性を評価した。
PFU:XL1 Blue MRF’−3.58×109;Ecloni−1.56×109およびTop10F’−5.07×109
CFU:XL1 Blue MRF’−1.19×109;Ecloni−5.36×108およびTop10F’−6.30×108
軽鎖の発現、形質転換効率およびファージの産生能力は、試験したE.coli株全てで同等であった。
1.試験ライゲーション
2.大規模ライゲーション(×60)
3.試験電気穿孔処理(EPs)
4.大規模EPs(ライブラリーごと60回のEPs)
5.力価(ライブラリーのサイズ):カッパ型−全CFU2×107およびラムダ型−全CFU1×107
6.NUNC培養/スクラッピング
7.PEG沈殿およびファージの精製
8.最終力価:カッパ型−6×107/μLおよびラムダ型−8×106/μL
HCを発現させてLCライブラリーと対合させるために用いるHCベクター、およびその構築に関する情報を図5に示す。
実証実験のために、Tie−1に対して特異性を有するHC20種を選択した。抗Tie−1および抗重鎖(V5)および抗軽鎖についてのELISAを用いて、DY3F85LCの軽鎖20種とpHCSK22の重鎖20種が対合してファージ上で機能的Fabが創出され得るどうかを評価した(LC1種×HC1種)。例示的なELISAの結果を図6および7に示し、それにより、LCがHCと対合して抗Tie−1活性を持つFab(LCとHCの両方を有する)が創出され得ることが示されている。
ROLIC法におけるVH/VL−CL再連結
この方法は、ROLICクローニングの手順中に失われた軽鎖遺伝子と重鎖遺伝子との間の遺伝子型連結の再確立を可能にする1つの様式である(軽鎖と重鎖に対して異なるROLICベクター)。これにより、抗体カセットをApalI−NheI断片としてpMID21ベクター内に1工程でクローニングして戻すことができる。pMID21.03をレピシエントとして使用する場合、次いでsFabを作製するためのベクターを得る。簡単に述べると、この方法工程は、
1.HC細菌にLCファージを感染させる。
1−重鎖遺伝子の増幅−付加RBSリンカー:
重鎖の経済的選択(ESCH)
抗体の親和性および特異性の大部分はHC由来であり、LCは許容状態であることのみが必要であることが頻繁に指摘されてきた。したがって、実施例1に記載のROLICにおける役割を逆にすることが可能である。LCの小集団を、その分泌を引き起こすベクター内に置き、ファージにおいてHCの新規ライブラリーを樹立する。次にこれらを非常に効率的な感染方法により組み合わせることができる。有効なHCの少数のセットが選択されたら、ROLICにかけて最適なHC/LC対合を得ることができ、または有効なHCの少数のセットをそのまま使用することができる。
親和性成熟のためのROLICの使用
ROLIC法を、血漿カリクレイン(pKal)の抗体阻害剤6種に対する親和性成熟方法として用いた。簡単に述べると、この方法は、これらの抗体の6種のHCを我々の全LCレパートリーと試験することを可能にする手段を提供する。
I.ヒトのみ
a.ラウンド1:ヒトタンパク質200pmol
b.ラウンド2:ヒトタンパク質100pmol
II.マウスのみ
a.ラウンド1:マウスタンパク質200pmol
b.ラウンド2:マウスタンパク質100pmol
III.ヒトおよびマウス
a.ラウンド1:ヒトタンパク質200pmol
b.ラウンド2:マウスタンパク質100pmol
pHCSK22内に6種の重鎖を含有する新鮮なTG1細胞に、ラウンド間に得られたファージ産出物を感染させた。ファージを一晩増幅させてその後の選択ラウンドに使用した。ラウンド2の最後に、6種の重鎖を含有する新しいTG1細胞にこのファージ産出物を感染させ、単一のコロニーを増殖させるために培養した。分離したコロニーを96ウェルプレート中の液体培養で一晩増殖させ、ファージを含有する上清の、ビオチン化ヒトpKalおよびビオチン化マウスpKalへの結合性を標準ELISAによって試験した。
LCとHCを一緒にジッピングするための代替プライマー
以下は、LCとHCを一緒に再連結するために使用することができる試薬および方法の追加例である。
・重鎖はpHCSK22ベクター由来であり得る。
・全ての重鎖は、pHCSK22ベクターの構築による雑種7シグナル配列を含有し得る。
・実際の雑種7シグナル配列:
・DY3F85LCベクター内には停止コドンがなく、したがって、さらにRBSに樹立し戻す必要があり得る。
・RBS配列は、ベクターの全配列に記したようにpMID21ベクターストックに含有される実際の配列に基づいて樹立し戻すことができる。
・ラムダ型定常領域オリゴは生殖系列および繊維状ファージに基づき、したがってC0プライマーである。
・LCの最後のコドンとHC SSの最初のコドンとの間の配列は、以下の通りである。
ROLICで得たpMiD21ラムダ型ジッピング試料
・任意選択の工程:ジッピングする前に、軽鎖および重鎖を長い尾部なしで持ち上げ、その結果全部で3つのPCR事象がもたらされる。
・全てのオリゴヌクレオチド(ON)配列を下記の表1に示す。
・方法:
LCss(ApaLI)からLCconstまでのPCR
・G3ss.Forおよび
・Kconst Revおよび
・ラムダ型C0 Revおよび
・ラムダ型C2 Revおよび
・ラムダ型C3 Revおよび
・ラムダ型C7 Rev
HCssからNheI部位までのPCR
・HCss.Forおよび
・HC.const.rev.
LCss(ApaLI)からLC+RBS突出までのPCR
・G3ss.Forおよび
・K.RBS.Revまたは
・LC0.RBS.Rev
・LC2.RBS.Rev
・LC3.RBS.Rev
・LC7.RBS.Rev
RBS+HCssからHCconst(NheI部位)までのPCR
・HCss.RBS.Forおよび
・HC.const.rev
LCss(ApaLI)からHCconst(NheI部位)までのジッピング
・G3ss.Forおよび
・HC.const.rev
ApaLIからNheIを介したpMID21へのクローニング
本願を通して引用した参考文献、交付済み特許、公開または非公開特許出願ならびに以下に列挙したそれらを含めた、全ての引用した参考文献の内容は、その全体が参照により明示的に本明細書に組み込まれる。矛盾する場合は、本明細書における任意の定義を含め、本願が優先する。
本発明の実施形態をいくつも記載した。しかし、本発明の精神と範囲から逸脱することなく種々の改変を行うことができることを理解されたい。したがって、他の実施形態も以下の特許請求の範囲内である。
Claims (21)
- 所定の標的に対して親和性がある特異的結合対(SBP)メンバーを作製する方法であって、該SBPは第1のポリペプチド鎖および第2のポリペプチド鎖を含み、該方法は、
(i)1またはそれより多くの望ましい性質を有するように選択された該第1のポリペプチド鎖の1またはそれより多くの種類をコードする遺伝物質の集団を含む第1のベクター集団を含む宿主細胞を提供する工程であって、該第1のポリペプチド鎖が該宿主細胞から分泌される工程と、
(ii)該第2のポリペプチド鎖をコードする遺伝物質の多様な集団を含む第2のベクター集団を、該細胞に感染させる工程であって、該第2のポリペプチド鎖は、該第2のポリペプチド鎖を複製可能な遺伝子提示パッケージ(RGDP)の表面に提示させるための、分泌型RGDPの成分と融合している工程と、
(iii)該第1のポリペプチド鎖および該第2のポリペプチド鎖を該宿主細胞内で発現させて、該RGDPの表面に提示されるSBPメンバーのライブラリーを形成する工程であって、該第1のポリペプチド鎖と該第2のポリペプチド鎖とが該RGDPの表面で結合している工程と、
(iv)SBPメンバーを該所定の標的に対する結合について選択する工程と
を含む方法。 - 前記第1のポリペプチド鎖が抗体の重鎖(HC)またはその抗原結合断片を含む、請求項1に記載の方法。
- 前記第2のポリペプチド鎖が抗体の軽鎖(LC)またはその抗原結合断片を含む、請求項1に記載の方法。
- 前記第1のポリペプチド鎖が抗体の軽鎖(LC)またはその抗原結合断片を含む、請求項1に記載の方法。
- 前記第2のポリペプチド鎖が抗体の重鎖(HC)またはその抗原結合断片を含む、請求項1に記載の方法。
- 前記第1のベクターがプラスミドである、請求項1に記載の方法。
- 前記第1のベクターがファージベクターである、請求項1に記載の方法。
- 前記第2のベクターがファージベクターである、請求項1に記載の方法。
- 前記第1のベクター集団が1〜1000種の異なる第1のポリペプチド鎖をコードする、請求項1に記載の方法。
- 前記第2のベクターが、105種以上の異なる第2のポリペプチド鎖の遺伝的に多様な集団をコードする、請求項1に記載の方法。
- 前記選択する工程がELISA(酵素結合免疫吸着検定法)を含む、請求項1に記載の方法。
- 前記所定の標的に結合する特異的結合対メンバーを単離する工程をさらに含む、請求項1に記載の方法。
- 工程(iv)から選択された前記RGDPを工程(i)の宿主細胞の新鮮な試料に感染させる工程をさらに含む、請求項1に記載の方法。
- 前記第1の集団が2つ以上の亜集団に分割され、1つの亜集団から作製されるファージが、他の集団で作製されるファージから選択され別々に増殖される、請求項1に記載の方法。
- 所定の標的に対して改善された親和性がある特異的結合対(SBP)メンバーを作製する方法であって、該SBPは、第1のポリペプチド鎖および第2のポリペプチド鎖を含み、該方法は、
(i)該ポリペプチド鎖を複製可能な遺伝子提示パッケージ(RGDP)の表面に提示させるための分泌型RGDPの成分と融合させた、該所定の標的に対して親和性を有するように選択された該第1のポリペプチド鎖の1またはそれより多くの種類をコードする核酸を含む第1のベクター集団と、
(ii)該第2のポリペプチド鎖の遺伝的に多様な集団をコードする核酸を含む第2のベクター集団と、
を宿主細胞に導入する工程であって、
該第1のベクターが感染性RGDP内にパッケージングされており、それを該第2のベクターを有する宿主細胞に感染させることにより該第1のベクターを宿主細胞に導入するか、または、
該第2のベクターが感染性RGDP内にパッケージングされており、それを該第1のベクターを有する宿主細胞に感染させることにより該第2のベクターを宿主細胞に導入する工程と、
該宿主細胞内で該第1のポリペプチド鎖および該第2のポリペプチド鎖を発現させて、RGDPによって提示される該SBPメンバーのライブラリーを形成する工程であって、該集団の少なくとも1つが、該RGDP成分を用いてパッケージング可能な核酸から発現され、それによって該RGDPのそれぞれの遺伝物質が、RGDPの表面に提示される該SBPメンバーのポリペプチド鎖をコードする工程と、
該集団のメンバーを該所定の標的に対する高親和性結合について選択する工程と
を含む方法。 - 前記第1の集団が、2つ以上の亜集団に分割され、1つの亜集団から作製されるファージが、他の集団で作製されるファージから選択され別々に増殖される、請求項15に記載の方法。
- 前記第1のベクター集団が1000種以下の第1のポリペプチド鎖をコードする、請求項1または15に記載の方法。
- 前記第1のベクター集団が100種以下の第1のポリペプチド鎖をコードする、請求項1または15に記載の方法。
- 前記第1のベクター集団が20種以下の第1のポリペプチド鎖をコードする、請求項1または15に記載の方法。
- 前記第1のベクター集団が10種以下の第1のポリペプチド鎖をコードする、請求項1または15に記載の方法。
- 前記第1のベクター集団が1種の第1のポリペプチド鎖をコードする、請求項1または15に記載の方法。
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