JPH06508511A - 特異的な結合ペアーの構成員の製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 特異的な結合ベアーの構成員の製造方法本発明は特異的な結合ベアーの構成員を 製造する方法に関連する。

本発明は更にこれらの方法により製造された生物学的結合分子に関連する。

一定の抗原に対するその高い特異性に基づき、モノクローナル抗体の登来（Ｋｏ ｈｌｅｒ、　ＧとＭｉｌｓｔｅｉｎ　Ｃ；　１９７５　Ｎａｔｕｒｅ　２５６　 ：　４９５　）は科学的及び商業的の両者の重要な成果を伴う有意義な技術的打 破をもたらした。

モノクローナル抗体は伝統的には、特定の特異性を有する、一形態の生物学的に 機能的な抗体分子を分泌する、単独のイムノグロブリン生産性細胞に由来する不 死哺乳動物細胞系を樹立することにより作られている。抗体分泌性哺乳動物細胞 系は不死であるため、抗体の特異性はハツチ間で再現性がる。モノクローナル抗 体の重要な特性は特定の抗原に対するその特異性及びそれらが製造されうる際の 再現性にある。

構造的には、最も単純な抗体（ＩｇＧ）は４本のポリペプチド鎖、即ち、２木の 重（Ｈ）鎖及び２木の軽（鎖）を含んで成り、これらはジスルフィド結合によっ て相互結合している（図１参照のこと）。

軽鎖はカッパー（Ｋ）及びランダム（λ）と呼ばれる２ｉ１りの別個の形態にお いて存在する。それぞれの鎖は定常領域（Ｃ）及び可変領域（Ｖ）を有する。そ れぞれの鎖は一連のドメインへと統合されている。軽鎖は２つのドメイン、即ち 、Ｃ領域に相当するものとＶ領域に相当する他のものとを有する。重鎮は４つの ドメインを有し、１つはＶＳｉ域に相当し、そして３つのドメイン（１３２及び ３）はＣＶＡ域にある。この抗体は２本の腕（それぞれの腕はＦ　ａ　ｂ　％Ｊ ｌ域である）ををし、それぞれは互いに結合し合っているＶＬ及びｖＢ＋１域を 有する。このｙ　９５域（ＶＬとＶＨ）のベアーは抗体間で異なり（アミノ酸配 列のバリエーションに原因する）、そしてそれらは共に抗原の認識及び抗原結合 部位（八ＢＳ）を担うことの原因となっている。さらにより詳しくは、各■領域 は、４つのフレームワーク領域（ＦＲ）で分割された３つの相補性決定領域（Ｃ ＤＩ？）より成る。ＣＤＩ＋は可変領域のうちで最も可変性な部分であり、そし てそれらは臨界的な抗原結合機能を担う。ＣＤＲ領域は組換、突然変異及び選別 を含む複雑な過程を介して、数多くの有用な生殖系列配列から得られる。

結合性抗原の機能は完全抗体のフラグメントに担われうろことが示されている。

典型的な結合性フラグメントは（ｉ　）　ＶＬ、　ＶＨ，ＣＬ及びＣＨＩドメイ ンより成るＦａｂフラグメント；（ｉｉ）ＶＨ及びＣ旧ドメインより成るＰｄフ ラグメント；（ｉｊ）抗体の一本の腕のＶＬ及びＶ）ｌドメインより成るＦＶフ ラグメント、（ｉｖ）　ｄａｂフラグメント（Ｗａｒｄ。

Ｅ、　Ｓ、ら、Ｎａｔｕｒｅ　３４１．５４４−５４６　（１９８９）　にれは ＶＨドメインより成る）；　（ｖ）単離化ＣＤＲ８Ｕ域；並びに（ｖｉ）ヒンジ 領域においてジスルフィド架橋によって連結された２本のＦａｂフラグメントを 含んで成る二価フラグメントであるＦ　（ａｂ’Ｌフラグメント、である。

ＦＶフラグメントの２つのドメインは別々の遺伝子によってコードされているに もかかわらず、組換法によってそれらも一本のタンパク譬鎖（一本積ＦＶ　（ｓ ｃＦＶ）　として知られる；　Ｂｉｒｄ、　Ｒ，Ｅ、ら、５ｃｉｅｎｃｅ　２４ ２．４２３−４２６　（１９８８）　）Ｉｕｓｔｏｎ、　Ｊ、　Ｓ、ら、Ｐｒｏ ｃ、　Ｎａｔｌ。

Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、、　ＩＪＳＡ　８５．５８７９−５８８３　（１９８８） ）として作成することを可能とする合成リンカ−を作ることが可能であることが 証明されている。このような５ｃＦＶフラグメントは事前に単離されたモノクロ ーナル由来の遺伝子から集成されている。

モノクローナル抗体は、そのフラグメント及び誘導体が真人な数の利点を有する にもかかわらず、それに関連する数多くの制限がある。

第一に、ヒト不死細胞系により生産されたモノクローナル抗体の治療的用途は広 範囲にわたる障害の処置についての多大なる望みを抱えている（ＣＩｉｎｉｃａ ｌ　Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ　ｏｆ　Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ＾ｎｔｉｂｏｄｉ ｅｓ。

Ｅ、Ｓ、Ｌｏｎｄｏｎ編。　Ｂｒ１ｔｉｓｈ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｂｕｌｌｅｔｉ ｎ　１９８４　、ＣｈｕｒｃｈｉｌｌＬｉｖｉｎｇｓｔｏｎｅ出版）。残念なが ら、不死抗体生産性ヒト細胞系は樹立せしめるのが非常に難しく、そして低収量 の抗体を供する（約ｌμｇ／ｍｌ）。反対に、同価のげっ歯細胞系は高収量の抗 体をもたらす（約１００μｇ／ｌ）。しかしながら、このような外来げっ歯タン パク質のヒトへの繰り返し投与は有害な超過散性反応をもたらしうる。これを主 にして、このようなげっ歯−由来モノクローナル抗体は限られた治療的用途を有 する。

第二に、モノクローナル抗体の単離における重要な観点は、所望の特異性を有す る抗体生産性細胞を単離するために、理論的にどれだけサンプルしなくてはなら ないかに比して、様々な特異性を有する抗体生産性細胞のどれだけの種類のクロ ーンを実際に樹立及びサンプルできるかにある（Ｍｉｌｓｔｅｉｎ、　ｃ、ｌ　 Ｒｏｙａｌ　Ｓｏｃ、　ＣｒｏｏｎｉａｎＬｅｃｔｕｒｅ、　Ｐｒｏｃ、　Ｒ， Ｓａｃ、　Ｌｏｎｄｏｎ　Ｂ、　２３９　；　１　１６．　（１９９０））　、 例えば、ネズミ免疫系のリンパ球により一時に発現される様々な特異性体の数は 約１０’と考えられ、そしてこれは潜在的な特異性のレパートリ−のほんの一部 にすぎない。しかしながら、所望の特異性を有する典型的な抗体生産性細胞の単 離の際、研究者は１０’〜１０’の個別の特異性体しかサンプルできない。ヒト においてはもっとひどく、約１０”のリンパ球特異性体があり、１０’又は１０ ４のサンプリングの限界はそのままである。

この問題は免疫化養生法を利用することによって実験動物においである程度解消 されている。従って、特定のエピトープに対する特異性を有するモノクローナル 抗体を製造したいとき、動物をこのエピトープを発現せしめる免疫原で免疫する 。この動物にはこれによってこの免疫原に対する免疫応答が備わり、そしてこの エピトープに対する特異性を存するリンパ球の増殖が起こるであろう。所望の特 異性を有するリンパ球の増殖に原因し、サンプリング手順においてそれらを検出 することがより容易となる。しかしながら、この手法は全てのケースにおいてを 効であるのではなく、なぜなら適当な免疫原が入手できない場合があるからであ る。更に、ヒトモノクローナル抗体を製造したいとき（例えば前記した治療投与 のため）、かかる手法は現実的、倫理的又は実現可能でない。

ここ数年、これらの問題は！ｌｌ換ＤＮＡ法の利用により、細菌、例えばＥ、コ リ（Ｅ、　ｃｏｌｔ）の中での、抗原結合能力を有する抗体及び抗体フラグメン ト等の単離及び製造にある程度向けられている。

不死化細胞の「工場」としての細菌細胞による単純な交換は、大量の結合分子の 製造にとっての手順をかなり簡潔にする。更に、組換製造系はテーラ−メート抗 体及びそのフラグメントの製造を可能とする。例えば、結合とエフェクター機能 との新たな組合せ、ヒト化抗体（例えばヒト定常ドメインと合わさったネズミ可 変領域又はヒトＦＲにグラフトされたネズミ抗体ＣＤＲ）及び新規の抗原結合性 分子を製造することが可能である。更に、細胞（例えばハイブリドーマ及びＢ細 胞）から抗体生産性配列を単離するためのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増殖 （Ｓａ＋に＋、　Ｒ−Ｋ−ら、５ｃｉｅｎｃｅ　２３９．４８７−４９１（１９ ８８））の利用は特異性体を単離しうる時間を早める多大な可能性を秘めている 。増幅ＶＨ及びＶＬ遺伝子を、細菌又は哺乳動物細胞の中での発現のため、ベク ターの中に直接クローンさせる（Ｏｒｌａｎｄｉ、　Ｒ。

ら、１９８９．　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、、　ＵＳＡ　８ ６．３８３３−３８３７　；　Ｗａｒｄ。

Ｅ、　Ｓ、ら、１９８９前掲；　Ｌａｒｒｉｃｋ、　Ｊ、　ＩｐＪ、ら、１９８ ９．　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ。

Ｒｅｓ、　Ｃｏｍ＊ｕｎ、　１６０＋　１２５０−１２５５　；　５ａｓｔｒｙ ＋　Ｌ、ら、１９８９＋　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ。

Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、、　ｌｌ５Ａ、、　８６．５７２８−５７３２　）　、細 菌から分泌した可溶性抗体フラグメントを次に結合活性についてのスクリーンに 付する。

しかしながら、不死化細胞をベースとする製造系と同様に、組換製造系は前述し た選別問題に未だ悩まされており、それ故所望の特異性体を有する細胞の割合を 増やすために動物の免疫化を転りとする。更に、これらの技術のうちのいくつか はスクリーニングの問題を悪化させうる。例えば、免疫化マウスから大きな独立 のＨ及びＬ鎖うイブラリーを生産することができ、そしてそれらをスクリーニン グの前にランダムな順列組合せ状態で一緒にする（Ｈｕｓｅ、　Ｈ，Ｄ。

ら、１９８９．５ｃｉｅｎｃｅ　２４６．１２７５−１２８１．１１０９０／１ ４４４３　；　ｉ　９０／１４４２４及びＮｏ　９０／１４４３０）。ところで 重要なことに、各細胞が抱える情報、即ち、一本のし鎖と一本のＨ鎖との本来の ベアリングが失われてしまう。これは動物において免疫化プロトコールを利用す ることによって得られる長所の一部を失わせる。現在、単一のＶＨ鎖に由来する ライブラリー（ｄＡｂｓ　；　Ｈａｒｄ、　Ｅ、　Ｓ、ら、１９８９．前掲）の みがこの欠点に悩まされていない。しかしながら、全ての抗体ＶＨドメインが抗 原に結合できるわけではないので、より多くをスクリーンせねばならない。更に 、原核細胞における数多くの様々特異性体の直接スクリーングの問題を解決する ことが残されている。

従って、上記又はその他の問題のうちの一つ又は数値を軽減又は解消するスクリ ーニング系が必要とされている。理想的な系は、非常に大量の特異性体（例えば １０′″以上）のサンプリング、各クローニング段階での迅速な選別、及び製造 過程の一工程から次の工程への結合性分子をコードする遺伝子材料の迅速な転移 を可能とするであろう。

このタイプのスクリーニングにとって最も有力な候補は原核系生物であり（なぜ ならこれらは迅速に増殖し、操作することが比較的簡単であり、そして大量のク ローンが作られうるからである）、その表層に機能的な結合ドメイン、例えば抗 体、レセプター、酵素等を発現及び表示するものであろう。英国特許ＧＢ　２１ ３７６３１Ｂにおいて、イムノグロブリンの可変性Ｈ及びし鎖遺伝子の単独宿主 細胞における同時発現のための方法が開示されている。しかしながら、このタン パク質は細胞内的に発現され、そして可溶性である。更に、このタンパク質は結 合活性を有する抗体フラグメントを作製するために多大なる処理を必要とし、そ してこのことは、一定の濃度における抗体フラグメントに関して予測される結合 活性のほんのわずかしが有さない材料を作り出してしまう。抗体フラグメントは 適当なシグナルペプチドによって細胞膜を通じて分泌され、（Ｓｋｅｒｒａ、　 Ａ、とＰｌｕｃｋｔｈｕｎ、　Ａ、１９８８５ｃｉｅｎｃｅ　２４０１０３８− １０４０　；　Ｂｅｔｔｅｒ、　Ｍら１９８８゜５ｃｉｅｎｃｅ　２４０１０４ １−１０４３　）　、その結果、抗体フラグメントの結合活性は上昇することが 既に示されている。これらの方法はマウスモノクローナル抗体と同しように、結 合活性についての個々のクローンのスクリーニングを必要とする。

しかしながら、機能性結合ドメイン、例えば抗体、抗体フラグメント、レセプタ ー、酵素等が、いわゆるその抗原結合特異性体のサンプリング及び所望の特異性 体を有するクローンについての選別を可能にする形態においてどのようにして細 菌表層の上に保持されているかは示されていない。このことはほとんど、細菌表 層が複雑な構造にあること、そしてグラム陰性生物においてはその位置を更に複 雑にする外壁があることに原因している。更に、例えば抗体ドメインは、細菌又 はハタテリオファージの表層タンパク質との融合体として発現されるとき、正し く折りたたまれているかが証明されていない。

バクテリオファージはこのタイプのスクリーニングにとっての有効な原核細胞関 連生物である。一般に、それらの表層は比較的簡単な構造であり、それらは簡単 に大量に増殖でき、それらは数多くの有用な大量スクリーニングプログラムに包 括されている実用的な取り扱いに付されることができ、そしてそれらは小さく簡 単なパッケージの中でそれら自体の合成にとっての遺伝情報を抱えている。困難 性は、この状態にあるバクテリオファージをどのうにて利用するかの問題を実用 的に解決することにある。　Ｇｅｎｅｘ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｔｏｎの特許出願− ０８８１０６６３０号は、バクテリオファージが抗体分子の発現にとっての適切 な媒体であろうことを提唱しているが、しかし彼らはその理念の実施を可能とす る教示を呈示していない。例えば、１８８１０６６３０は配列であって（ａ）遺 伝子■との融合体として発現される；　（ｂ）ラムダの表層上に発現される；及 び（Ｃ）タンパク質が生物活性を保持するように発現されるような配列を全く示 していない。更に、適切な融合体についてどのようにスクリーンするかの教示が ない。更に、ラムダピリオンは細胞内で集成するため、融合タンパク質は細胞内 的に発現され、従って不活性であると予想されうる。１９９０年１２月において Ｂａ５ｓらは、フィラメント状バクテリオファージＭ１３の遺伝子■の一部を欠 失させる及びこの遺伝子のＮ末端部位にヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）についてコ ードする配列を挿入することを述べている。Ｍ１３上で表示されるこの成長ホル モンは機能的であることが示されている。（Ｂａｓｓ、　ｓ、ら、Ｐｒｏｔｅｉ ｎｓ＋　５ｔｒｕｃｔｕｒｅ。

Ｆｕｎｃｔｉｏｎ　ａｎｄ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　（１９９０）　８　戸３０９− ３１４）。遺伝子■の機能的なコピーが、この融合体が発現されるときに更に常 に存在している。

Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｅｎｇｅｎｅｅｒｉｎｇ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎの特許出願 −ｏ　９０１０２８０９はウシ膵臓トリプシンインヒビター（ＢＰＴＩ）につい てコードする配列のＭ１３の遺伝子■への挿入を提唱している。しかしながら、 この提唱が有効であるかは示されていない。例えば、タンパク質■との融合体と してのＢＰＴＩ配列の発現及びＭ１３の表層上での表示の実証がない、。

更に、この文献は、融合体を遺伝子■で作るとき、若干の変化していない遺伝子 ■タンパク質が生じうるために、遺伝子■の第二合成コピーを利用する必要があ ることを教示している。本出願の態様はこれを行っていない。ファージミドをＭ １３ＫＯ７遺伝子■欠失ファージで救済（レスキュー）する態様において、不変 遺伝子■は全くない。

Ｎｏ　９０１０２８０９は、Ｍ１３の全長ゲノムを含まず、且つ、ヘルパーファ ージの同時感染による救済を必要とするファージミドはこのような目的に適さな いことを教示しており、なぜなら同時感染は＆ｌｔ＊をもたらしうるからである 。

本出願人がファージミドを利用する全ての態様において、彼らはへルバーファー ジを利用しており、そしてファージミドにおけるフィラメント状バクテリオファ ージに由来する唯一の配列は複製起点及び遺伝子■配列とした。

Ｗｏ　９０１０２８０９は、それらの工程が、出発分子のヌクレオチド配列及び その三次元構造のような情報を必要とすることも教示している。

本明細書に開示されているような結合構成員を選別するための予め存在している 結合性分子のレパートリ−の利用、例えば動物のイムノグロブリン遺伝子のレパ ートリ−を用いることは開示されていない。更に、彼らは好適な改良分子の作製 及び不都合な変異を防ぐための、イムノグロブリンのＣＤＲのような天然の可変 性ブロックにおける結合分子の好適な変異を述べていない、　ＷＯ９０１０２８ ０９はまた５ｃＦＶ分子の製造への彼らの工程の適用を特に排除している。

上述の特許（Ｗｏ　８８１０６６３０及び−０９０１０２８０９）のそれぞれに おいて、表示のために提唱されているタンパク質は一氷核ポリペプチドである。

カスピドタンパク質との融合体としての一モノマー及び遊離形態における他の分 子の発現による二量体分子の表示についての方法の開示は全くない。

１９９１年５月に公開された別の開示は、Ｍ１３の遺伝子■への、抗体のＦａｂ 領域の二本鎖のうちの一方についてのコード配列の挿入と、プラスミドに由来す る他方の同時発現とを開示している。これら２木の鎖はファージの表層上で機能 的Ｆａｂフラグメントとして発現される（Ｋａｎｇ　Ａ、　Ｓ、ら（１９９１） 　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、＾ｃａｄ、　Ｓｃｉ＋　ＵＳＡ＋　８８＋ｐ４３６３ −４３６６）。遺伝子■への挿入部位についての開示はなく、そしてＥＬＩＳ＾ によるｐａｂ結合活性のためのアッセイはファージではなく抗体り鎖に特異的な 試薬を利用している。１９９１年３月に公開された更なる開示は、＾■ＤＳウィ ルスタンパク質のフラグメントｇａｇの、バクテリオファージｆｄの遺伝子■の Ｎ末端領域への挿入を述べている。

ｇａｇタンパク質フラグメントの発現は免疫学的手法により検出されるが、しか しこのタンパク質が機能状態において発現されているかどうかは示されていない （Ｔｓｕｎｅｔｓｕｇｕ−Ｙｏｋｏｔａ　Ｙら（１９９１）　Ｇｅｎｅ凹ｐ２６ １−２６５）。

この方法においてバクテリオファージをどのようにして利用するかの問題は実際 に難しい。このタンパク質はファージの中に、ファージコートの保全性が害され ないように、且つ、このタンパク質それ自体が抗原結合性に関する生物学的活性 を機能的に保持すべきように挿入されていなくてはならない。従って、選択のタ ンパク質が抗体のとき、それは効率的、且つ、適切にたたまれ、そして抗原結合 のために提供されるべきである。抗体分子及びフラグメントについての問題の解 消は特異的な結合ペアーの構成員、例えばレセプター分子及び酵素である任意の 生物分子のための一般手法も提供するであろう。

驚くべきことに本出願人は、表層に大きな生物学的に機能的な結合性分子（例え ば抗体フラグメント、酵素及びレセプター）を発現、且つ、表示し、更に完全、 且つ、感染性であり続けるバクテリオファージを構築することができた。これは −０９２１０１０４７に記載され、その開示内容は引用することで本明細書に組 入れている。本明細書の読み手は記載の実験に用いられている数多くの手順の詳 細な説明についてＷｏ　９２１０１０４７を参考にすることを勧める。本出願人 は、ウィルス粒子とウィルス表層に表示されている結合性分子とを含んで成る構 造を「パッケージ」と呼んでいる。結合性分子が抗体、抗体の誘導体もしくはフ ラグメント、又はイムノグロブリンドメインに相同性のドメインのとき、本出願 はこのパッケージのことを「ファージ抗体Ｊ　（ｐＡｂ）と呼んでいる。しかし ながら、何らかの記載がない限り、ファージ抗体なる語を一般的に用いていると き、これは、ウィルス粒子と、ウィルス表層で表示されている生物学的に機能的 な結合性分子とを含んで成る任意のパッケージとの同義語をも意味している。

ｐＡｂは抗原結合活性体をコードする抗体遺伝子の選別において幅広い用途を有 する。例えば、ｐＡｂはハイブリドーマのクローニング及び救済（Ｏｒｌａｎｄ ｉ、　Ｒ，、ら（１９８９）　ＰＮＡＳ　８６　ｐ３８３３−３８３７）のため に、並びに大きな順列組合せライブラリーのスクリーニングにおいて利用できる （これはＨｕｓｅ、　Ｈ，Ｄ、ら、１９８９．５ｃｉｅｎｃｅ　２４６．１２７ ５−１２８１に見い出せる）。特に、ｐＡｂを利用する選別段階はこのライブラ リーから親和性の高めの抗体を救済するのに役立ちうる６抗体のＦＶ領領域含ん で成るオリジナルのＶＨ／ＶＬペアーを救済するために抗原−選択細胞に由来す る小さなライブラリー（Ｃａｓａｌｉ、　Ｐ、ら（１９８６）５ｃｉｅｎｃｅ　 ２３４　ｐ４７６−４７９）をスクリーンすることが好適でありうる。

ｐＡｂの利用は合成抗体全体の構築も可能とする。更に、抗体はいくつかの合成 配列、例えばＣＤＲ及びいくつかの誘導配列を有するように作られうる０例えば 、■遺伝子レパートリーを、並べ換えていないＶ遺伝子と、Ｄ及びＪセグメント とを組合せることによってインビトロで作ることができる。ｐＡｂのライブラリ ーを次に抗原への結合性により選択し、抗原結合ループ又はＶドメインフレーム ワーク領域においてインビトロで過度変異させ、そして更なる段階の選別及び突 然変異誘発に付する。

前述した通り、独立のＨとＬｔｉライブラリーはオリジナルの核間の組合せを失 っている。特に、好都合なＨとＬ鎖との組合せにとって十分に大きいライブラリ ーを作ること及びスクリーンすることは難しい。

例えば、マウスにおいて約１０’可能なＨ鎖と１０７可能なし鎖とがある。従っ て、１０１４可能なＨとＬ鎖の組合せがあり、そしてこのような数の組合せを試 験するには約ＩＱ＋ａクローンのライブラリーを作ってスクリーンする必要があ ろう。

本発明はこの問題を軽減する手法を提供する。

第一の手法においては、可能な１０１４の有用な組合せを発現するぐらいのでき るだけ大きな現実的に可能なライブラリーを作る。ところで、ファージの表層上 のＨとＬ鎖の発現により、アフィニティー技術（選別方式の詳細に関して後を参 照のこと）によって、作り上げた組合せ全てから所望の組合せを選ぶことが論理 的に可能である。

ある手法において（本山＠）により、多重順列組合せ手法と呼ぶ）、大きなライ ブラリーは所望の組合せの選別のために２つの小さめのライブラリーから作る。

この手法は、（１）例えばテトラサイタリンに耐性なバクテリオファージ上に表 示される（遺伝子■によりコードされるタンパク質との融合体として）仮りに１ ０７の例えばＨ鎖の第１ライブラリー；及び（ｉｉ）仮に１０？の例えばＬｍの 第２ライブラリーを作り上げることを包括し、ここでこれら軽鎖についてのコー ド配列はプラスミドベクター内にあり、そして宿主細菌の細胞質空間の中で発現 される０次にこの第１ライブラリーを、第２ライブラリーを含む細菌を感染せし めるために用いて、細菌上清液に生ずるファージの表層上の１０′′のＨとＬ鎖 との組合せをもたらす。

この手法の利点は例えば１０７の２つの独立したライブラリーを、１０１４の組 合せをもたらすために作ることにある。１０７のライブラリーを作るのは現実に 可能である。

このｉｏ”の組合せを次に本出願で開示する選別に付する（選別方式の詳細につ いては後を参照のこと）、この選別は、所望の特異性を有するＨとＬ鎖との特定 の組合せを表示するファージの集団をもたらすであろう。ところで選ばれたファ ージは、一対のＨとＬ鎖のの集団を含む溶離サンプルを２つに分ける。第一部は 例えばテトラサイクリンプレート上で増殖させて、所望の抗原結合に関与するＨ 鎖をコードするＤＮＡを含むバクテリオファージを選ぶ。第二部は例えばアンピ シリンプレート上で増殖させて、所望の抗原結合に関与するし鎖をコードするフ ァージミドＤＮ＾を含むバクテリオファージを選ぶ。例えばテトラサイタリンプ レートから個別に単離したクローン由来の一連のコロニーを次に例えばアンピシ リンプレートに由来する特定のコロニーを感染せしめるために用いる。これは、 抗原結合性についてアッセイできる、ＨとＬｉＮの特定の組合せを発現するバク テリオファージをもたらす。

別の手法において（本出願人により、分類段階二重組合せ手法又は鎖シャフリン グと呼ばれる）、抗生物質プレート上での増殖により選ばれたＨ又はＬ鎖のクロ ーンの一方に由来する個別のコロニーを、他方の鎖（Ｈ又はＬ）をコードするク ローンの完全ライブラリーに感染せしめるのに用いる。選別は前述した通りであ る。これは最も好適な組合せの単離を助長する。

ファージミドは前述した。本出願人は数多くの場合においてファージミドがファ ージよりも好ましいと認識し、そして実証しており、なぜならより包括的な免疫 レパートリ−のライブラリーを作るのにそれらが利用し易いことによる。その理 由は、ファージミドは細菌を形質転換せしめるうえでバクテリオファージＤＮＡ より約１００倍有効であるからである（Ｗｏ　９２１０１０４７の実施例１９を 参照のこと）。また、ファージミドの利用はバクテリオファージの表層上に表示 される遺伝子■結合性分子融合タンパク質の数を変える能力を提供する（Ｗｏ　 ９２１０１０４７の実施例１７を参照のこと）。例えば、遺伝子■融合タンパク 質をコードするファージミドを含み、且つ、ヘルパーファージで感染された細菌 細胞を含んで成る系において、遺伝子■融合タンパク質の発現を様々な度合いに まで誘発せしめることは、重感染に続く内部と外部細菌膜との間で規定される空 間に存在する遺伝子■融合タンパク質の数を決定するであろう。これは集成ファ ージにより表示される遺伝子■融合タンパク質、対、天然遺伝子■タンパク質と の比を決定するであろう。

ピリオン当り一融合タンパク質を発現させることは、２コピーの低親和性抗体を 発現するファージが、■コピーの親和性の高めな抗体を発現するファージと見か け上同じ親和性を有する場合の「結合活性（ａν１ｄｉｔｙ）　Ｊ効果を回避す ることで、親和性に基づいた抗体特異性の選別に役立ちうる。しかしながらある ケースにおいては、ファージミドを含む細胞の重感染により誘導された遺伝子■ 分子全てが融合体を伴って表示されるでいることが重要であろう（例えば、低親 和性結合分子の選別のため、又はＥＬＩＳＡでの感度を高めるため）。

これを行う一つの方法は欠陥遺伝子■を含むバクテリオファージで重感染せしめ ることである。従って本出願人は−０９２１０１０４７に記載の遺伝子■におい て欠失しているファージを開発及び利用している。

機能性抗原ドメインがファージの表層上で表示されうるという現象は、新規抗体 の構築に勝る含蓄を有している。例えば、ファージの表層においてその他のタン パク質ドメインが表示されうるなら、この表示されたタンパク質の結合特性によ り、遺伝子をクローン及び選別するのにファージヘクターを利用することができ る。更に、タンパク質の表層に組込まれたエピトープライブラリーを含むタンパ ク質の変異体を作ることができ、そして結合活性に関して容易に選択することが できる。実際、その他のタンパク質構築物は［ヌーヘルＪ抗体として働きうる。

本技法は、抗原結合性ループがその上で折りたたまれている構造フレームワーク の利点を利用する第一原理からの、抗体の構築の可能性を提供する。一般に、こ れらのループは、択一的なループの組合せ及び様々な側鎖を有する様々な結合部 位より成る限られた数のコンホメーションを有する。抗原結合性部位のモデル化 における近年の成功は新たなデザインのより前兆である。どのケースにおいても 、大いに分析された抗原の構造が必要とされる。しかしながら、この手法は例え ば触媒性抗体、特に小さな変質に対する抗体を作るのに有用である。ここで、基 質の遷移状態に選択的に結合するためだけでなく、結合の形成及び分断にも直接 かかわる、補欠分子族に対する側鎖又は結合性部位を導入することができる。唯 一の問題は結合のために特別に仕上げた抗体構築物が触媒を組立てるのに最良な 出発点であるかどうかである。真性酵素構築物、例えばトリホース三リン酸イソ メラーゼ（ＴＩＭ）バレルがより適切でありうる。抗体と同様に、７１Ｍ酵素は 基質に結合するためのフレームワーク構造（β−鎖とα−ヘリックスのバレル） 及びループをも有する。多彩な触媒特性を存する数多くの酵素はこの構造を基礎 とし、そしてループは新規の触媒性及び結合性特性のデザインに関してフレーム ワークとは独立に操作されうる０本開示内容により供されるファージ３ＪＡｉｆ ｆ系は、抗体フレームワーク又は７７Ｍバレルフレームワークのいづれかに利用 される、抗原結合活性及びそれにより特定されるＣＤＲループを選ぶために利用 できる。例えば７１Ｍバレルフレームワーク上にあるループは突然変異誘発によ り更に改変されることができ、そして更なる選別に付されうる。従って、一工程 において親和性の高い結合活性を選ぶ必要はない。低親和力が高親和力へと発展 する免疫系の手法は本発明を利用することによりより現実的となり、且つ、擬態 化されうる。

本タイプの用途に有用でありうる分子の一クラスはレセプターである。例えば、 ファージの表層上に特定のレセプターが表示され、それはそのリガンドに結合す ることができるであろう。このレセフ。

ターは次に例えばインビトロ突然変異誘発によって改変されることができ、そし てリガンドに対するより高い結合親和力を有する変異体が選ばれる。この選別は 下記の１又は複数の方式に従って実施されうる。

他方、リガンド、改変りガント又は潜在薬剤候補の結合性についての迅速なスク リーニング系の基礎として、フプージレセブターを利用することができる。この 系の利点は即ち、簡単なりローニング、好適な発現、標準の試薬及び容易な操作 が、薬剤スクリーニング用途を極めて有用にすることにある。本明細書において 、レセプターとは特異的な、又は特異的な群のリガンドに結合する分子を意味す る。天然レセプターは細胞の集団の表層上に発現されうるか、又はそれはかかる 分子の細胞外ドメインであるか（そのような形態が天然にあるがないかにかかわ らず）、又は血漿中、もしくは細胞もしくは器官内における天然結合機能を担う 可溶性分子でありうる。

他の可能性は、ファージの表層上での酵素分子又は酵素分子の活性部位の表示で ある（ＷＯ９２１０１０４７の実施例１１．１２．３０．３１．３２及び３６を 参照のこと）、、ファージ酵素が発現されると、それは例えば遷移状類似体で誘 導化されたカラム上でのアフィニティークロマトグラフィーにより選別されうる 。異なる又は改変された特異性を有する酵素が所望されるなら、バクテリオファ ージ上での融合体として表示される酵素を突然変異させ、次いで所望の改変特異 性を有する酵素に対してより高い親和力を有するものとして選ばれた類似体で誘 導化されたカラム上で選別することが可能でありうる。

本明細書全体にわたって本出願人は高い親和性のｐＡｂの変異体についてのスク リーニングの可能性を説明しているが、彼ら一定の用途、例えば低親和性クロマ トグラフィーにおいては（Ｏ１＋１ｓｏｎ、　Ｓ、ら、Ａｎａｌ、　Ｂｉｏｃｈ ｅｍ、　１６９．　ｐ２０４−２０８　（１９８Ｂ））、低めの親和性変異体を 単離することが所望されうろことを認識している。

ｐＡｂはまた向上した安定性に関する抗体の選別を可能とする。数多くの抗体に 関して、その収率及び安定性が抗体が３７°Ｃよりも３０°Ｃで発現されたとき に向上していることが認められている。ｐＡｂが３７°Ｃで表示されると、そこ で安定なものだけがアフィニティー選別に有用となるであろう。抗体をインビボ で治療的又は診断目的のために用いたとき、高められた安定性は循環抗体の半減 期を伸ばすであろう。

安定性は、ファージを用いて選別した全ての抗体及び抗体ドメインにとって重要 であるが、ＶＨとＶＬフラグメントとの非共有結合によって形成されるＦＶフラ グメントの選別にとって極めて重要である。

Ｆνフラグメントは解離しがちであり、そして完全抗体に比べて循環系において はるかに短い半減期を有する。ＦＶフラグメントは、遺伝子■タンパク質融合体 として発現される一本鎖と、可溶性フラグメントとして発現される相補鎖との結 合により、ファージの表層上で表示される。鎖のペアーの解離する傾向が高いと き、それらはｐＡｂとして選ばれにくいであろう。従って、安定に結合したペア ーにその集団は富むであろう。Ｆａｂフラグメントにとっては解離は小さな問題 であるが、安定に結合したＦａｂフラグメントについての選別もできるであろう 。ｐＡｂはプロテアーゼの攻撃に対する安定性についての選別を可能とし、プロ テアーゼによって切断されなかったｐＡｂのみがそのリガンドと結合することが でき、従ってファージの集団は安定な抗体ドメインを表示するもので冨むであろ う。

ファージ表層上に結合性分子を表示させる技術は一次クローニング系としても利 用できる。例えば、ｃＤＮＡライブラリーを構築して、バクテリオファージの中 に挿入することができ、そしてこのファージライブラリーはりガントと結合する 能力についてスクリーンに付されうる。リガンド／結合性分子との組合せには、 互いに特異的に結合する能力の備った任意のペアーの分子、例えば、レセプター ／リガンド、酵素／基質（又は類似体）核酸結合性クンノイク質／核酸等が含ま れる。相補ペアーの一方の構成員が入手できたら、これはそのペアーの他方の構 成員についてのクローンを単離する好ましい手段でありうる。

通常、ファージ上のタンパク質の表示に関してクローンされた遺伝子の集団の多 様性を高める又は個々のヌクレオチド配列を変異させることが必要であろう。い づれの目的にとってもインビトロ又はインビボ突然変異誘発技術が利用できるが 、極めて適切な方法は突然変異誘発株の利用であろう。突然変異誘発株は、その 中で複製されるＤＮＡをその親ＤＮ＾に対応して突然変異させる遺伝欠陥を含む 株である。従って、遺伝子■融合体としての遺伝子の集団をこれらの株の中に導 入せしめると、それは更に多様化し、そして所望するならば表示及び選別のため に非突然変異誘発株へと導入されうる。

標的化遺伝子の導入 有用、且つ、新規な一連の用途は、特定の細胞又は細胞群をファージゲノムが標 的とするように、ファージ上の結合性タンパク質を利用する。例えば、細胞表層 分子に特異的なｐＡｂが、表層分子を介して標的細胞に結合させるのに利用でき る。次にこのファージは、レセプター自体の作用を介して、又はその他の現象（ 例えばエレクトロポレーションの技術におけるような放電）の結果としてインク ナリゼーシジンされうる。このファージゲノムは、もし関連のコントロールシグ ナル（転写及び翻訳、並びに可能として複製のため）があるなら、発現されるで あろう。このことはもしファージゲノムが、標的細胞において発現が所望される 配列を（適当な発現コントロール配列と一緒）含むなら極めて有用であろう。有 効な配列は、受容細胞に抗生物質耐性を授けうるか、又は生成物の発現により細 胞をラベルするか（例えば、その配列が検出可能な遺伝子生成物、例えばルシフ ェラーゼを発現せしめるとき；　Ｗｈｉｔｅ、　Ｍら、Ｔｅｃｈｎ　１ｑｕｅｓ ２　（４）、　ｐ１９４−２０１１９９０））、又は標的細胞上に特定の性質を 授けるか（例えば、標的細胞がＩＩ瘍細胞であり、そして新規の配列が腫瘍抑制 遺伝子の発現を導くとき）、又は標的細胞において遺伝子もしくは一連の遺伝子 を無効にするようにデザインされたアンチセンス構築体を発現させるか、又は標 的細胞に対して毒性となるようにデザインされた遺伝子もしくは遺伝子生成物を 発現させるものでありうる。

他方、標的細胞の中で発現が所望されている配列はファージミド上でコードされ うる。ファージミドＤＮＡを次に細胞表層レセプターに特異的な抗体を表示する ファージの中に組込むことができうる。

例えば、組込みはファージミドを含む細菌と、ゲノムが標的細胞に特異的な抗体 フラグメントをコードするヘルパーファージとの重感染によるものでよい０次に このパッケージを用いてファージミドを標的細胞へと導く。

「標的化遺伝子導入」の技術は研究、そして更には治療及び診断において数多く の用途を有する。例えば、遺伝子治療は通常、活性において欠陥のある特定の細 胞タイプを交換遺伝子が狙うようにすることを目的とする。ｐＡｂを標的とする ことはこれを達成する手段を提供する。

診断において、特定の細菌又は細菌群に特異的なファージを、マーカー遺伝子、 例えばルシフェラーゼが細菌宿主に狙いを定めるようにするために利用すること ができる。（例えば、Ｕｌｉｔｚｅｒ、　Ｓ、とにｕｈｎ、　Ｊ、　ＥＰＡ　８ ５３０３９１３．９を参照のこと）。ファージの宿主域が適切なら、試験した細 菌のみがファージにより感染され、ルシフェラーゼ遺伝子を発現し、そしてそれ らが発する光により検出されるであろう。この系はサルモネラの存在を検出する のに利用されている。

この手法に関する一つの大きな問題は適切な宿主域を有するバクテリオファージ の初期単離及びその後のファージへのルンフェラーゼ遺伝子カ七ノドのクローニ ング（それが機能的であるように）にある。ｐＡｂ系はルシフェラーゼカセット がよく特性化された系（フィラメント状ファージ）へとクローンされることを可 能とし、更にｐＡｂがコードする抗体（又はその他の結合性分子）特異性を改質 することによって適切な宿主域の簡単な選別を可能にする。

本出願人は、このような複製可能な遺伝子表示パンケージ、例えばｐＡｂの固有 の特性に依存する、新規な選択系及びアッセイ方式の開発をも可能にする。

語 本章に述べているほとんどの語は適宜本明細書に挙げられている。

特異的結合性ペアー（ｓｂｐ） これは天然に由来する又は合成的に作られるペアーの分子（それぞれは特異的結 合性ペアーの構成員である）を意味する。ペアーの分子の一方はその表層上に、 他方の分子の特定の空間及び極性構造と特異的に結合する、それ故相補性である と定義する領域又はくぼみを有しており、従ってこのペアーは互いに特異的に結 合し合う特性を有している。特異的結合性ベアーのタイプの例は、抗原−抗体、 ビオチン−アビジン、ホルモン−ホルモンレセプター、レセプター−リガンド、 酵素−基質、ＩｇＧ−プロティンＡである。

多量体構成員 これは、ポリペプチドが遊離形態において、及び／又は基体の表層上で発現され るときに、少なくとも第２ポリペプチドと結合しているであろう第１ポリペプチ ドを意味する。この基体はバクテリオファージにより供されうる。２個の結合し たポリペプチドがあるとき、この結合ポリペプチド複合体は二量体であり、３個 あるとき、三量体である。二量体、三量体、多量体等々、又は多量体構成員は特 異的結合性ペアーの構成員を含んで成りうる。

多量体構成員の例はイムノグロブリン分子を基礎とする重ドメイン、イムノグロ ブリン分子を基礎とする軽ドメイン、Ｔ細胞レセプターサブユニットである。

複製可能な遺伝子表示パンケージ（Ｒｇｄρ）これは複製能力の傭った粒子を提 供する、遺伝情報を有する生物学的粒子を意味する。この粒子はその表層上に少 なくともポリペプチドの一部を表示しうる。このポリペプチドは、この粒子にと って天然な及び／又は粒子もしくはその先祖の中に人工的に入れられた遺伝情報 によりコードされうる。表示されたポリペプチドは特異的結合性ペアーの任意の 構成員、例えばイムノグロブリン分子を基礎とする重もしくは軽鎖ドメイン、酵 素又はレセプター等でありうる。

この粒子はウィルス、例えばバクテリオファージ、例えばｆｄ又はＭ１３であっ てよい。

パッケージ これは、粒子がその表層において特異的結合性ベアーの構成員を表示する複製可 能な遺伝子表示パンケージを意味する。このパンケージはバクテリオファージで あってよく、これはその表層に抗原結合性ドメインを表示する。このタイプのパ ッケージをファージ抗体（ｐＡｂ）と呼んでいる。

抗体 これは、天然、又は部分的もしくは完全に合成的に作られたイムノグロブリンを 意味する。この語はまた、イムノグロブリンの結合性ドメインに相同性な結合ド メインを有する全てのタンパク質を包括する。これのタンパク質は天然起源に由 来するか、又は部分的もしくは完全に合成的に作られたものでありうる。

抗体の例はイムノグロブリンイソタイプ及びＦａｂ、Ｆ　（ａｂ’）ｚ　。

ｓｃＦν、　ＦＶ、　ｄＡｂ、　Ｆｄフラグメントである。

イムノグロブリン松科 これは、ポリペプチドの科を意味し、その構成員は、イムノグロブリン分子の可 変又は定常ドメインに近縁な構造を有するドメインを少なくとも一つは有してい る。このドメインは２つのβ−シー゛トを含み、そして通常は保存型ジスルフィ ド結合にある（Ａ、　Ｆ。

ＷｉｌｌｉａｍｓとＡ、　Ｎ、　Ｂａｒｃｌａｙ、１９８８．　Ａｎｎ、　Ｒｅ ｖ　ＩＩＩＩＬｌｕｎｏｌ、　６　３８１−４０５を参照のこと〕。

イムノグロブリン松科の構成員の例は、ＣＤ４、血小板由来成長ホルモンレセプ ター（ＰＤＧＰＲ）、細胞内接着分子（ＩＣＡＭ）である。文脈中に何らかの記 載がない限り、本明細におけるイムノグロブリン及びイムノグロブリン同族体に 関し、イムノグロブリン松科及びその同族体の構成員が含まれる。

同族体 この語は、−次、二次又は三次構造における対応の位置に同−又は保存型残基を 有するポリペプチドを意味する。この語は同族ポリペプチドをコードする２種以 上のヌクレオチド配列にも及んでいる。

同族ペプチドの例はイムノグロブリン　イソタイプである。

機能 ｒｇｄｐの表層上に表示されるｓｂｐ構成員に関連して、ｓｂｐ構成員は、折り たたまれた形態において存在し、その相補性ｓｂｐ構成員に対する特異的な結合 性ドメインはその天然形態と同−又はがなり類似し、従って相補性ｓｂｐ構成員 に対する似かよった特異性を示すことを意味する。これに関連して、これは、規 定の折りたたみ形態を有さす、且つ、それが接触しうる相補性構成員によって決 定される様々な形態を帯びうる５ｗ１ｔｈら、前掲のペプチドとは相違する。

遺伝的に多様性な集団 ｓｐｂ構成員又はそのポリペプチド成分に関連して、これは天然の細胞又は器官 の集団の中に存在しうる多様性のみでなく、インビトロ又はインビトロでの人工 的突然変異により作り出されうる多様性をも意味している。

インビトロでの突然変異は、例えば改変することを所望する配列のランダム突然 変異を有するオリゴヌクレオチドを利用するランダム突然変異誘発を包括しうる 。インビボ突然変異誘発は例えばＤＮＡを取込む宿主微生物の突然変異誘発株を 利用する（ＷＯ’　９２１０１０４７の実施例３８を参照のこと）。「集団」な 語口体は、例えば遺伝的に多様性でない、即ち全て同一である複数のポリペプチ ド鎖を意味しうる。

ドメインはタンパク質の一部であって、その中に折りたたまれ、そして同しタン パク質のその他の部分とは独立し、且つ、相補性結合性構成員とは独立した部分 である。

折りだたまり単位 これはα−ヘリックス及び／又はβ−鎖及び／又はβ−ターン構造の特定の組合 せである。ドメイン及び折りたたまり単位は、−次構造においては隣接し合わな いアミノ酸を一緒にする構造を含んでいる。

遊離形態 これは復製可能な遺伝子表示パンケージにより表示されないポリペプチドの状態 を意味する。

条件欠陥 これは、ある一連の条件では特定のポリペプチドを発現しないが、別の一連の条 件ではそれを発現する遺伝子を意味する。例えば、これは非抑制又は抑制宿主そ れぞれにおいて発現されるアン／ｓ＋変異を含む遺伝子である。

他方、遺伝子は、ある一連の条件では欠陥であり、しかし別の一連の条件では欠 陥でないタンパク質を発現しうる。その例は温度域受性突然変異を有する遺伝子 である。

抑制可能翻訳停止コドン これはコドンであって、ある一連の条件ではコドンの下流のヌクレオチド配列の 翻訳を可能とし、そして別の一連の条件のもとではこのコドンにて停止するコド ンを意味する。抑制可能翻訳停止コドンの例はアンバー、オーカー及びオパール コドンである。

突然変異誘発株 これは宿主細胞であって、その中で複製されるＤＮＡがその親［ＩＮ＾に関連し て突然変異されてしまう遺伝欠陥を有する細胞である。突然変異誘発株の例はＮ Ｒ９０４６ＩＩｕｔ　Ｄ５及びＮＲ９０４６ｎｕｔ　Ｔｌである（実施例３８を 参照のこと）。

ヘルパーファージ これは、欠陥ファージゲノムを含む細胞を感染せしめるのに用いられ、そしてこ の欠陥を補完するように機能するファージである。

この欠陥ファージゲノムは、遺伝子配列をコードする一部の機能が除去されたフ ァージミド又はファージでありうる。ヘルパーファージの例はＭ１３ＫＯ７，Ｍ １３ＫＯ７遺伝子Ｉ［［ｎｏ、３、及びカスブトタンバク質に融合した結合性分 子を表示又はコードするファージである。

ベクター これは、組換ＤＮＡ分子を構築しようと、遺伝子の挿入された宿主生物の中で複 製できるＤＮＡ分子である。

ファージベクター これは、プラスミドについてではなく、バクテリオファージについての複製起点 を含むファージゲノムの改変に由来するベクターである。

ファージミドベクター これは、バクテリオファージについての複製起点及びプラスミドの複製起点を含 む、プラスミドゲノムの改変に由来するベクターである。

分泌型 これは、ｒｇｐｄ又はｒｇｄｐ上に表示されるｓｂｐの構成員と結合する分子で あって、そのｓｂｐ構成員及び／又は分子が折りたたまれ、そしてパンケージが 細胞質ゾルの外側で集成されるものを意味する。

並べかえイムノグロブリン遺伝子のレパートリ−動物における発現化イムノグロ ブリン遺伝子をコードするＤＮＡ配列のような天然ヌクレオチドの集合である。

この配列は、Ｈ鎖にとっての例えばＶ、Ｄ及びＪセグメント、並びにＬ鎖にとっ ての例えば■及びＪセグメントのインビボでの並べかえにより作られる。他方、 これらの配列は、インビトロで免疫され、そして免疫化に応答する並べかえが細 胞内で起こる細胞系より作られうる。「レパートリ−」なる語は遺伝子の多様性 を表わすために用いている。

ライブラリー 個々のポリペプチドもしくはｓｂｐ構成員、又はポリペプチドもしくはｓｂｐ構 成員の複合集団を提供する選別又はスクリーングにかけることのできる、ヌクレ オチド、例えばＤＮＡ、クローン内の配列の集団、あるいはポリペプチドもしく は特異的結合性ペアーの構成員、又はｒｇｄｐ上で表示されるポリペプチドもし くはｓｐｂ構成員の遺伝的に多様性な集団をいう。

人工的に並べかえしたイムノグロブリン遺伝子のレパートリ−ヌクレオチド、例 えばＤＮＡ、動物に由来する並べかえイムノグロブリン配列以外の起源に完全に 又は部分的に由来する配列の集団である。これは例えば、並べかえしていないＶ セグメントとＤ及びＪセグメントとの組合せによるＶＨをコードするＤＮＡ配列 、並びに■とＪセグメントとの組合せによるＶＬドメインをコードするＤＮＡ配 列を含む。

ＤＮＡ配列の一部又は全体はオリゴヌクレオチド合成に由来しうる。

分泌リーダーペプチド これはポリペプチドのＮ末端に連結しており、そして細胞質ゾルの外へのポリペ プチドの移動を誘導するアミノ酸配列である。

溶離液 これは２分子間の結合を切るのに利用する溶液である。結合は非共有結合でも共 有結合でもよい。この２分子はｓｂｐの構成員であってよい。

誘導体 これは分泌型ｒｇｄｐ内のＤＮＡによりコードされるポリペプチドに由来する物 質である。誘導ポリペプチドはコード化ポリペプチドとは、アミノ酸の付加、欠 失、置換もしくは挿入、又はコード化ポリペプチドへの他の分子の連結により相 違しうる。これらの変更はヌクレオチド又はタンパク質しヘルにてなされうる。

例えば、コード化ポリペプチドはＦａｂフラグメントであってよく、これを別の 起源に由来するＰｃテールに連結させる。他方、マーカー、例えば酵素、蛍光団 等を例えばＦａｂ、　５ｃＦｖフラグメントに連結してよい。

本発明の一観点に従い、多量体特異的結合性ペアー（ｓｂｐ）構成員を製造する 方法が提供され、この方法は、組換宿主生物細胞の中のベクターから、分泌型複 製可能な遺伝子表示パッケージ（ｒｇｄｐ）の成分に融合した特異的結合性ペア ーの構成員の第１ポリペプチド鎖の集団を発現させ、これによりｒｇｄｐの表層 に前記ポリペプチド鎖を表示させ、次いで前記集団を、前記特異的結合性ペアー 構成員の第２ポリペプチド鎖の集団と、この第１と第２ポリペプチド鎖とが一緒 になってｒｇｄｐにより表示される前記多量体特異的結合性ペアー構成員のライ ブラリーを形成することによって組合せ、前記第２ポリペプチド鎖の集団は前記 第１ポリペプチド鎖の集団と同一のベクターからは発現されず、前記集団の少な くとも一方は遺伝的に多様性であり、且つ、前記ｒｇｄｐ成分を利用してパッケ ージされることのできる核酸から発現されており、従って、前記ｒｇｄｐ成分そ れぞれは前記遺伝的多様性集団のポリペプチド鎖をコードする、ことを含んで成 る。この第１及び第２ポリペプチド鎖は同一の宿主生物細胞において発現されて も、同一の宿主生物細胞において発現されなくてもよい、後者の場合、第２ポリ ペプチド鎖の集団はヒト又は動物起動から精製したポリペプチドのレパートリ− を含んで成りうる。

好ましい方法において、それぞれの前記ポリペプチド鎖は前記成分融合生成物を 用い、ｒｇｄｐとしてパッケージされることのできる核酸配列から発現される。

この方法は、前記第１ポリペプチド鎖の集団を発現することのできるベクターを 、前記第２ポリペプチド鎖の集団を遊離形態で発現できる宿主生物に導入するこ と、又は前記第２ポリペプチド鎖の集団を遊離形態で発現できるベクターを、前 記第１ポリペプチド鎖の集団を発現する宿主生物の中に導入することを含んで成 りうる。

他方、前記第２ポリペプチド鎖それぞれを、ｒｇｄｐの成分との融合体として発 現させよく、これによりｒｇｄｐはその表層に前記第２ポリペプチド鎖を表示す る。換言すれば、第１及び第２鎖は両方とも、例えばカスビドタンパク質との融 合によってｒｇｄｐ上に表示されうる。

可溶性鎖を、ポリペプチド鎖とｒｇｄｐ成分との融合体と組合せる方法において 、下記の工程を含ませることができる：（ａ）可溶性第２ポリペプチド鎖の集団 と、第１ポリペプチド鎖の集団を表示するｒｇｄｐとの細胞外混合物を作る；次 いで（ｂ）第１と第２ポリペプチド鎖とを一緒にして、前記多量体特異的結合性 ペアー構成員のライブラリーを作る。

この細胞外混合物は、前記第１と第２ポリペプチド鎖とを一緒にして前記ライブ ラリーを作るために再結合させる前に部分的に変性させてよい。第２ポリペプチ ド鎖の集団はヒト又は動物起動より精製したポリペプチドのレパートリ−を含ん で成りうる。

前記ポリペプチド鎖の集団は： （ｉ）相補性５ｔｒｐ構成員で免疫した動物の並べかえイムノグロブリン遺伝子 のレパートリ−； （ｉｉ）相補性ｓｂｐ構成員で免疫していない動物の並べかえイムノグロブリン 遺伝子のレパートリ−； （ｉｊ）人工的に並べかえしたイムノグロブリン遺伝子のレパートリ−； （ｉｖ）イムノグロブリン同族遺伝子のレパートリ−；又は（ｖ）生殖系列イム ノグロブリン遺伝子に由来する配列のレパートリ−； （ｖｉ）　１又は複数の点突然変異の導入により人工的変異させたイムノグロブ リン遺伝子のレパートリ−；（ｖｉ）任意の（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｊ）、（ｉ ｖ）、（ｖ）及び（ｖｉ）の混合物、に由来しうる。

ｒｇｄｐとしてファージを用いるとき、それはクラス■ファージ、ｆｄ。

Ｍ１３．　ｆｌ、　［ｆｌ、　ｌｋｅ、　２Ｊ／２．　Ｆｆ並びにクラス■ファ ージ、Ｘｆ。

Ｐｆｌ及びＦｆ３より選ばれうる。

組合せに続き、ｒｇｄｐを選択又はスクリーンして、ポリペプチド鎖をコードす る核酸を有する対応のｒｇｄｐと一体化した個々のｓｂｐ構成員又は前記ｓｂｐ 構成員の複合集団を提供することができる。この方法で供されるポリペプチド鎖 の少なくとも１タイプの限定集団を次に、個々の相補鎖、又は限定された相補鎖 の集団の選択のうえで、更なる二重順列組合せ法に利用することができる。

前記第１ポリペプチド鎖をコードする限定ｒｇｄｐ集団より得た核酸を、前記第 ２ポリペプチド鎖をコードする核酸の遺伝的多様性レパートリ−に由来する核酸 をも導入された組換ベクターの中に導入するか、又は前記第２ポリペプチド鎖を コードする限定ｒｇｄｐ集団より得た核酸を、前記第１ポリペプチド鎖をコード する核酸の遺伝的多様性レパートリ−に由来する核酸をも導入された組換ベクタ ーの中に導入してよい。

組換ベクターは、２つのベクター間での細胞内組換によって作られることができ 、そしてこれは部位特異的組換が起こるであろう配列、例えばコリファージＰｉ より獲得できるｆｏｘ　Ｐ配列をベクターに含ませる０部位特異的組換は、これ もコリファージＰ１より獲得できるＣｒｅ−リコンビナーゼにより触媒されうる 。

利用するＣｒｅ〜リコンビナーゼは制御可能ブロモ−クーのコントロール下で発 現可能でありうる。

組換ベクターの製作物は、第１と第２ベクター間での組換により得られるイムノ グロブリンの一本鎖ＦＶｇＪ［域誘導体をコードする核酸を作るのに利用できる 。

第１ポリペプチド鎖をコードする核酸を含んで成るベクターかファージもしくは ファージミドであり、他方第２ポリペプチド鎖をコードする核酸を含んで成るベ クターがプラスミドであるか、又は、第１ポリペプチド鎖をコードする核酸を含 んで成るベクターかプラスミドであり、他方第２ポリペプチド鎖をコードする核 酸を含んで成るベクターかファージもしくはファージミドであることが所望され ることがある。次に、細胞内組換えを、ファージもしくはファージミドに優先し てプラスミドを複製するか、又はプラスミドに優先してファージもしくはファー ジミドを複製する細菌宿主の中で起こす。一方のタイプのベクターの複製が他方 に優先するのが条件的である系の利用が好都合でありうる。

これはＥ、コリのＰｏ１６株又は別のグラム陰性菌に関連付けて後に述べる。

本発明は、多量体特異的結合性ペアー（ｓｂρ）構成員を製造する方法も提供し 、この方法 （ｉ）（ａ）特異的結合性ペアー構成員の第１ポリペプチド鎖と分泌型複製可能 遺伝子表示パッケージ（ｒｇｄｐ）の成分との融合体の集団をコードする核酸を 含んで成る第１ベクターと、（ｂ）特異的結合性ペアー構成員の第２ポリペプチ ド鎖の集団をコードする核酸を含んで成る第２ベクターとでの細胞内組換を起こ させ（ここで前記集団の少なくとも一方は遺伝的に多様性であり、その組換えは 、前記ポリペプチド融合体と前記第２ポリペプチド鎖をコードし、且つ、前記ｒ ｇｄｐ成分を利用してパッケージされることのできる核酸をそれぞれ含んで成る 組換ベクターをもたらす）；次いで（ｉｉ）前記ポリペプチド融合体及び前記第 ２ポリペプチド鎖を発現させ、表層にて前記第１及び第２ポリペプチド鎖を生産 し、且つ、前記第１ポリペプチド鎖及び前記第２ポリペプチド鎖をコードする核 酸配列をそれぞれ含んで成るｒｇｄｐを作ること、を含んで成る。

これは本発明にかかわるその他のいづれかの方法により、第２ポリペプチド鎖の 集団のうちの一つの予備的な選別又は限定を伴って、又は伴わないでなされうる 。

本発明の重要な観点は、課題の対応特異的結合性ペアー構成員に対して特異的な 、特異的結合性ペアーの多重積ポリペプチド構成員（ｓｂｐ構成員）のうちの一 つ又は特定の集団を作る方法を提供し、この方法は下記の工程： （ｉ）組換宿主生物細胞中のベクターから、複製可能な遺伝子表示パッケージ（ ｒｇｄｐ）の成分に融合している前記多重積タンパク質の第１ポリペプチド鎖の 遺伝的多様性集団を発現させ、これによりｒｇｄｐの表層において前記ポリペプ チド鎖を表示させ；（ｉｉ）前記集団を、前記多重核ｓｂｐ構成員（これは前記 第１ポリペプチド鎖の集団と同一のベクターからは発現されない）の第２ポリペ プチド鎖の固有又は限定集団と組合せ（ここで前記組合せはｒｇｄｐにより表示 される前記多重鎖ｓｂｐ構成員のライブラリーを形成せしめ、前記遺伝的多様性 集団は前記ｒｇｄｐ成分を用いてパッケージされることのできる核酸から発現し 、従って前記ｒｇｄｐそれぞれの遺伝材料は前記第１ポリペプチド鎖をコードす る）；（ｉｉ）前記第１ポリペプチド鎖をコードする核酸を有する対応のｒｇｄ ｐと一体化した、前記の対応ｓｂｐ構成員に特異的な、課題の多重鎮ｓｂｐ構成 員のうちの前記対応ｓｂｐとの親和性により選別し；（ｉｖ　）工程（ｉｉｉ） において選ばれた、多重鎮ｓｂｐ構成員のうちの前記第１ポリペプチド鎖を、多 重鎖ｓｂｐ構成員の第２ポリペプチド鎖の遺伝的多様性集団と組合せ、ここで前 記第２ポリペプチド鎖はｒｇｄｐの成分に融合され、従ってｒｇｄｐの表層にお いてそれらは表示され、この工程（ｒＶ）における前記組合せは多重鎖ｓｂｐ構 成員のライブラリーを形成し、それより前記対応ｓｂｐ構成員に特異的な１又は 複数の多重鎖ｓｂｐ構成員がそれとの親和性により選択可能となること、を含ん で成る。

この多重ｔｌｓｂｐ構成員は抗体、又はイムノグロブリン科のその他の構成員、 又はその結合性フラグメント、又は任意のその他の多量体ｓｂｐ構成員でありう る。他の例については本明細書の他の箇所を参照のこと。

かかる方法の利点及び長所は本明細書で述べた。この技術は抗体の「ヒト化」の ため、任意的にＣＤＲのグラフトの組合せにおいて、そしておそらくはキメラポ リペプチド鎖の利用を伴って改変されうる。有用なキメラは、課題の抗原に特異 的な非ヒト動物抗体に由来する可変性ドメインと、ヒト抗体ドメイン、例えばｃ ｙｔを含んで成るものとを含んで成りうる。キメラ第２ポリペプチド鎖の遺伝的 に多様性な集団をこの方法の工程（１１）に利用することができる。工程（１■ ）において組合される第２ポリペプチド鎖の前記集団のそれぞれは、前記抗原に 特異的な非ヒト動物抗体由来の付加された相補性決定領域（ＣＤＲ）を含んで成 る。もし前記第１ポリペプチド鎖がイムノグロブリン軽鎖であり、そして前記第 ２ポリペプチド鎖がイムノグロブリン重鎮なら、付加ＣＤＲにとっての特異性の 高いヒト化抗体の選別においてＣＤＲ３が有利となりうる。

本発明は本発明の任意の観点にかかわる方法を実施するうえで利用するためのキ ットを包括する。キットは、本方法を実施するために必要な付随的な成分の他に 下記の成分：（ｉ）下記の特徴を有するベクター、即ち：（ａ）一本積バタテリ オファージにとっての複製起点、（ｂ）　ｓｂｐ構成員のポリペプチド成分をコ ードする核酸の挿入のための制限部位、（Ｃ）ファージカスビドタンパク質の成 熟コード配列の５′末端領域に前記制限部位があること、及び（ｄ）カスピドタ ンパク質とｓｂｐポリペプチドとの融合体を細菌宿主の細胞周辺腔へと導く、前 記部位の上流の分泌リーダー配列を有すること；と（ｉｉ　）上記の（ｉ）に記 載のベクターの特徴（ａ）、（ｂ）、（ｃ）及び（ｄ）の一部又は全てを有する 別のベクターとを有しうる。

本発明の一観点にかかわる方法を実施するうえで利用するための別のキットは、 本方法を実施するために必要な付随成分に加えて下記の成分を有しうる： （ｉ）下記の特徴を有する第１ベクター、即ち：（ａ）ｓｂρ構成員のポリペプ チド成分をコードする核酸の挿入のための制限部位、（ｂ）ファージカスピドタ ンパク質の成熟コード配列の５′末端領域に前記制限部位があること、及び（Ｃ ）カスビドタンパク質とｓｂｐポリペプチドとの融合体を細菌宿主の細胞周辺腔 へと導く、前記部位の上流の分泌リーダー配列を有すること；と（１１）第２の 前記ポリペプチド鎖をコードする核酸の挿入のための制限部位を有する第２ベク ター、 （ｉｉ）一本積バタテリオファージにとっての複製起点を有する少なくとも一つ のベクター、及び （ｉｖ）部位特異的組換えが起こる配列を有するベクター、を有しうる。

上記の方法において、結合性分子は抗体、又はイムノグロブリンと同族なドメイ ンでありうる。この抗体又はドメインは天然もしくは合成、又は両者の組合せの いづれかでよい。このドメインはＦａｂ。

５ｃＦＶ、　ＦＶ　ｄＡｂ又はＦｄ分子でありうる。他方、この結合性分子は酵 素もしくはレセプター又はフラグメント、任意のかかる酵素もしくはレセプター の誘導体又はｍｊＱ１体でありうる。他方、この結合性分子はイムノグロブリン 松科の構成員であってよく、そしてこれはイムノグロブリン分子を基礎とする構 造形態を有する。

本発明はまた前記で定義したｒｇｄｐ、並びに特異的結合性ペアーの構成員、例 えば上記のいづれかの方法を利用することにより獲得できる抗体、酵素、レセプ ター、フラグメント及びそれらの誘導体のような結合性分子も提供する。これら の誘導体は酵素又はＦｃテールのような他の分子に融合した特異的結合性ペアー の構成員を含んで成りうる。

本発明は本方法を実施するためのキットも含む。これらのキットは必須のベクタ ーを含むであろう。かかるベクターの一つは典型的には一本核バクテリオファー ジにとっての複製起点を有し、そしてｓｂｐ構成員核酸を含むか、又はファージ カスピドタンパク質の成熟コード配列の５′末端領域におけるその挿入のための 制限部位を有し、そしてカスピドタンパク質外因性ペプチドの融合体を細胞周辺 腔へと導く、前記部位の上流の分泌リーダーコード配列を有する。

ベクターにおける制限部位はタンパク質コード配列を稀にしか切らない酵素のそ れが好ましい。

このキットは好ましくは、上記の特徴を有するか、又はコード化ポリペプチドを 遊離形態で発現させるためのｓｂｐ構成員核酸の挿入のための部位を含むもしく は有するファージミドベクターを含む。

このキットは更に、本方法を実施するために必要な付随成分も含み、かかる成分 の性質はむろん利用する特定の方法に依存する。

有用な付随成分は様々な種類のへルバーファージ、ＰＣＲプライマー並びに緩衝 剤及び酵素を含んで成りうる。

ｓｂｐ構成員が抗体であるときに利用するＰＣＲプイラマー及び関連の試薬は下 記の特徴を有しうる： （ｉ）抗体のドメインをコードする配列のセンス又はアンチセンス鎖の５′末端 に対する相同性を有するプライマー；及び（ｉｉ）ベクターへの挿入を可能とす る制限部位を含む、この相同性配列に対して５′側にあるｔａｇ配列を含むプラ イマー；それに伴なって、ＦＶ。

５ｃＦＶ又はＦａｂフラグメントとして発現されることを可能とする、増１１ｍ ＶＩＩ及びＶＬ領領域集成を可能とする配列。

本発明により更に考慮されるのは、選択した又は部分的に選択した、ベクター又 は特異的結合性ペアー構成員、例えば抗体の複合集団を含んで成る二重順列組合 せ法の中間生成物の提供であり、これは更なる組合せ及び選別の方法に利用され うる。

緩衝液及び酵素は、本明細書に記載の手法に従って、並べかえ又は並べかえして いないイムノグロブリン遺伝子に由来するＦＶ、　ｓｃＦν又はＦａｂフラグメ ントをコードするヌクレオチド配列の調製を可能とするために一般に利用する。

木出廓人は、表層上での結合性分子、例えば抗体及び抗体フラグメント、並びに それらの誘導体の表示のための媒体、更にはその後の選別及び操作を助長するこ とを提供しうるファージのタイプの例としてフィラメント状Ｆ−特異的バクテリ オファージを選んだ。

このＦ−特異的ファージ（例えばｆｌ、　ｆｄ及びＭ１３）は、宿主細胞を殺さ ない増殖方法を発展させ、そしてそれらは組換ＤＮＡにとっての媒体として一般 に利用されている（にｏｒｎｂｅｒｇ＋　Ａ、＋　ＤＮＡ　Ｒｅｐｌｉｃａｔｉ ｏｎ。

−、Ｈ，Ｆｒｅｅ＋＊ａｎ及びＧｏ−＋　Ｓａｎ　Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ＋　１９ ８０）　ｅ　ｆｄの一本鎖［ＩＮＡゲノム（約６．４ｋｂ）は細菌膜を突き出し 、そこでカスピドサブユニ、トを離して、成熟ピリオンを生産する。これらのピ リオンは径６ｎ−１長さ１．ｃＩｍであり、そしてそれぞれはウィルス遺伝子■ によりコードされる約２，８００の主要コートタンパク質及び４分子の収着分子 遺伝子■タンパク質（ｇ’ｐ）を含み、この後者はピリオンの一端に位置する。

この構造は−ｅｂｓ　ｔｅｒ　ら、１９７８のＴｈｅ　Ｓｉｎｇｌｅ　５ｔｒａ ｎｄｅｄＤＮＡ　Ｐｈａｇｅｓ＋　５５７−５６９＋　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ 　ｔｌａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓに記載されている。遺伝 子■生成物は細菌性Ｆ−ビルスへのファージの結合に関与する。

これらのファージは正常な複製の際にその宿主を殺さないが、その遺伝子の多少 の崩壊は細胞を死に到らしめることがありうる（Ｋｏｒｎｂｅｒｇ＋　Ａ、　１ ９８０＋前掲）。このことは、それらの利用を多少控えさせる０本出願人は、フ ァージｆｄの遺伝子■が生物学的に活性な外来配列の挿入のための有効な可能性 であることを認めている。しかしながら、例えば遺伝子■及び遺伝■を含むその 他の候補の部位がある。

タンパク質自体はファージコートの微量な成分にすぎなく、従って遺伝子の崩壊 は細胞を死に到らしめることはない（Ｓａ＋ｉｔｈ、　Ｇ。

１９８８、　ＶｉｒｏｌｏｇＶ　１６７　：　１５６−１６５）　。更に、いく つかの外来遺伝子（生物学的機能を有さないもの）を遺伝子における様々な位置 に挿入することが可能である（Ｓｍｉｔｈ、　Ｇ、　１９８５５ｃｉｅｎｃｅ　 ２２８　：　１３１５−１３１７、＋　Ｐａｒｌｅｙ、　Ｓ、　Ｆ、とＳｍ１ｔ ｈ、　Ｇ、　Ｐ、　Ｇｅｎｅ　：　７３　（１９８８）　ｐ、３０５−３１８、 及びｄｅ　Ｉａσｒｕｚ＋　Ｖ、　Ｆ、ら、１９８８．　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃ ｈｅｗ、、　２３６　：４３１８−４３２２）。Ｓ＋ｓ　ｉ　ｔｈ　らは、ファ ージの外表層上でのペプチドの表示を述べているが、彼らはタンパク質ドメイン の表示は述べていない。

ペプチドは一連の構造を採用することができ、これは例えば抗体に結合している とき、又はタンパク質の一部を形成しているときと、遊離溶融中とでは異なりう る（Ｓｔａｎｆｉｅｌｄ、　Ｒ，１，ら（１９９０）　５ｃｉｅｎｃｅ２４８、 　ｐ７１２−７１９）。タンパク質は一般によく規定された三次構造を有し、そ してこの構造を採用でいるときのみにその生物学的機能を発揮する。例えば、抗 Ｄ１．３の構造は遊離形態において、及び抗体に結合しているときとがわかって いる（Ｂｈａｔ、　Ｔ、　Ｎ、ら（１９９０）　Ｎａｔｕｒｅ３４７、　ｐ４８ ３−４８５）、タンパク質の大まかな構造は各状況において同一であり、抗原に 対する結合部位の周辺にほんのわずかな変異があるにすぎない。その他のタンパ ク質、例えば触媒周期にある酵素へキソキナーゼ及びピルベートデヒドロゲナー ゼはりガントの結合に基づいてより実質的なコンホメーション変化を有し、しか しそれらは折りたたみの全体的なパターンを未だ維持する。この構造保全体は完 全タンパク質に限定されず、タンパク質ドメインによっても示される。このこと は折りたたまれ単位の概念を導き、これはタンパク質の一部、通常はドメインで あり、これはよく規定された一次、二次及び三次構造を有し、そして結合性パー トナ−と結合していようとなかろうと、同一の全体的な折りたたみパターンを保 持する。

Ｓｍ１ｔｈ　らが述べたドメイン（おそらくは小さくとも５０アミノ酸）をコー ドするのに十分なサイズである唯一の遺伝子配列は、β−ガラクトシダーゼ遺伝 子配列におけるヌクレオチド８６１−１１９５に相当するβ−ガラクトシダーゼ の３３５ｂρのフラグメントである（Ｐａｒ＋＊Ｉｅｙ＋Ｓ、＋Ｓ義ｉｔｈ、　 Ｇ、　Ｐ、　１９８Ｂ前掲）。

これはずっと大きい３８０アミノ酸ドメインのうちの１１２アミノ酸をコードす るであろう。従って、本発明に先行して、実質的に完全なドメイン又は折りたた まれ単位はファージ上に表示されていない。

これらのケースにおいて、挿入した配列は例えば抗体の利用によりファージ表層 上で検出されうる。

遺伝子■によりコードされるタンパク質は複数のドメインを有しくＰｒｏｔｔ、 　Ｄ、ら、１９６９．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ　３９　：　４２−５３、Ｇｒａｎｔ、 　Ｒ，＾ら、１９８１、　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｗ、　２５６　：　５３９ −５４６、及び＾ｒｍｓｔｒｏｎｇ＋　Ｊ、　ら、ＦＥＢＳ　ＬＥＴＴ、　ｌ井 ：　１６７−１７２１９８１）、それには：　（ｉ）タンパク質を細胞膜まで誘 導し、そして外れるシグナル配列；（ｉｉ）成熟タン、１り質を細菌細胞膜（そ して更にはファージコートの中に抑留させるドメイン；及び（山）ファージレセ プター、即ち、宿主細菌のＦ−プルスに特異的に結合するドメイン、が含まれる 。タン）ｉり質分子に由来する短い配列が、成熟分子における２つの箇所に挿入 されている（Ｓｗｉｔｈ、　Ｇ、　１９８５前掲、及びＰａｒｍｌｅｙ、　ｓ、 　Ｆ、とＳｍ１ｔｈ　Ｇ、　Ｐ。

１９８８前掲）、即ち、ドメイン間領域、更にはＮ−末端においてのアミノ酸２ と３との間に挿入されている。Ｎ−末端での挿入部位は遺伝子■タンパク質の構 造保全性を維持するうえで、及びファージの表層上でペプチドを表示するうえで より有効である。ペブチ日こ対する抗血清特異性を利用することにより、この位 置に挿入されたペプチドはファージの表層上にあることが実証されている。これ らの著者はこの性質を利用してファージを精製することもできている。

しかしながら、ファージにより発現されるペプチドはそれ自体の測定可能な生物 学的機能を有さない。

分子がその天然状態とは根本的に異なる背景において発現されるときにその生物 学的機能を維持することは困難である。分子の構造上の要件は厳しいものである 。他方、特異的な抗血清と結合する能力を維持することは受動的な過程であり、 これはあまり厳しくな（Ｉ）分子の構造に基づく要件を強いる。例えば、ウェス タンプロットにおいて、ポリクローナル抗血清が全体的に変性され、且つ、生物 学的に不活性となったタンパク質を認識するであろうことは、例外ではなく、原 則である（例えばＨａｒｌｏｗ、　Ｅ、とＬａｎｅ＋　ｏ、ｌ　Ａｎｔｉｂｏｄ ｉｅｓ。

ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａ＋、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒ ｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ　１９８８を参照のこと）。従って 、抗血清によって釣り出されるような構造を可能とする領域へのペプチドの挿入 は、その領域が、挿入された配列が暴露されるようになることのみを教示し、そ してその領域が、生物学的又は結合性機能を有する分子の表示のために要求され ている構造的拘束を有する大きな配列の挿入にとって適切であるかは教示しない 。特に、これはタンパク質のドメイン又は折りたたまれ単位がこの領域の中に挿 入された配列から表示されうるかを教示しない。

ウェスタンプロットによるこの実験は写実的な実用に則した実証であり、これは 、特異的な抗血清と結合する能力を維持することは、生物学的機能の保持にとっ て折りたたみが要求するものよりもはるかに厳しさの少ない、ポリペプチドの構 造に基づく要件を強いることを示す。

Ｅ、コリが、外膜タンパク質＋ａｍＢとの融合体としてタンパク質β−アドレナ リンレセプターを発現するように操作する研究が行われた。β−アドレナリンレ セプターは結合活性の存在により決定される機能状態で発現される。しかしなが ら、同価の抗体融合体がＩａｍＢにより作られたとき、この抗体融合体は宿主細 胞に対して毒性である。

本出願人は、大きな融合タンパク質を発現するための、ｆｄの遺伝子［［８Ｊ域 への、生物学的に活性な抗体フラグメントについての遺伝子コード配列の挿入の 可能性を調べた。先行の論文より明らかな通リ、この手法は融合タンパク質の機 能性に基づくわずられし要件を利用する。挿入するのは、少なくとも１００〜２ ００アミノ酸の大きなコード抗体フラグメントである；抗体由来ドメインは抗原 結合性を表示するために効率的、且つ、適切に折りたたまれなくてはならない； そして遺伝子■の機能のほとんどが維持されなくてはならない。

融合分子の構築への本出願人のアプローチは、これらの機能の崩壊の危険性を最 少限とするようにデザインされている。本発明の態様において、利用する一次ベ クターは、ｆｄ−ｔｅｔ（２ａｃｈｅｒ、　Ａ、　Ｎ、ら、１９８０、　Ｇｅｎ ｅ　９．１２７−１４０）、即ち、ｆｄバクテリオファージのテトラサイクリン 耐性バージョンとし、これは感染Ｅ　コリ宿主にテトラサイタリン耐性を授ける プラスミドとして増殖しうる。本出願人はｆｄ遺伝子■タンパク質のシグナル配 列の後ろに挿入することを、いくつかの理由のために選んだ。特に、本出願人は シグナルペプチダーゼ切断のための背景を維持するために、成熟タンパク質のア ミノ酸ｌの後ろに挿入することを選んだ。遺伝子■自体の構造及び機能を維持す るため、大半のもとのアミノ酸は挿入イムノグロブリン配列の後方で合成したも のであろう。挿入イムノグロブリン配列はＶＨ−νＬをＣＨＩ−ＣＬにつなげる スイッチ領域に由来する残基を含むようにデザインしである（Ｌｅｓｋ、　Ａ、 とＣｈｏｔｈｉａ、　Ｃ，、Ｎａｔｕｒｅ　３３５．１８８−１９０゜１９８８ ）。

驚くべきことに、バクテリオファージｆｄの遺伝子■を操作することより、本出 願人は、その表層上に大きな生物学的に機能的な抗体、酵素及びレセプター分子 を表示し、その際、完全性及び感染性を維持しているバクテリオファージを構築 することができた。更に、これらのファージは所望の特異性の抗体を抱え、この 特異性を示さないファージのハックグランドから選別されうる。

ファージ表層上に抗体の結合性機能の発現を付与するための、抗体分子の集団を コードする及びベクターの中に挿入するための配列は様々な起源に由来しうる。

例えば免疫化又は非免疫化げっ歯頚又はヒト、並びに器官、例えば牌臓及び末梢 血液リンパ球に由来しうる。コード配列は当業者に知られている技術によってこ れらの起源から引き出せる（Ｏｒｌａｎｄｉ、　Ｒ，ら、１９８８前掲；Ｌａｒ ｒｉｃｋ、　Ｊ、　Ｈ，ら、１９８９前掲；　Ｃｔ＋＋ａｎｇ＋　Ｙ、　Ｌ、ら 、１９８９　Ｂｉｏ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ　７．　ｐ、３６０−３６６　；　 Ｈａｒｄ、　Ｅ、　Ｓ、ら、１９８９前掲；　５ａｓｔｒｙ＋　Ｌ、ら、１９８ ９前掲）。

本出願によりなされる開示は重要であり、そして生物学的結合性分子、それらの フラグメント及び誘導体の組換法の利用による製造に関する技術に有意義な打破 を提供する。

抗体の製造のための標準的な組換技術において、抗体ポリペプチド鎖をコードす る配列を含む発現ベクターを、例えばＥ、コリを形質転換させるために用いた。

この抗体ポリペプチドは標準のスクリーニング系の利用により発現及び検定した 。スクリーンが所望の特異性の抗体ポリペプチドを検出したら、所望の抗体ポリ ペプチドを発現する特定の形質転換Ｅ、コリへと戻らなくてはならない。更に、 所望の抗体ポリペプチドについてのコード配列を含むベクターを次に更なる処理 工程において利用するためにＥ、コリから単離しなくてはならない。

しかしながら、本発明において、所望の抗体ポリペプチドは、発現したときに、 既にその遺伝子コード配列と一緒にパッケージされている。このことは、所望の 特異性の抗体ポリペプチドが選ばれたら、その配列の単離のためにもとの成分に 戻る必要がないことを意味する。更に、標準の組換技術における従来の方法にお いては、抗体を発現する各クローンは個々にスクリーンされねばならない。本出 願は所望の特性を有する抗体を発現するクローンの選別を提供し、そしてそれ故 濃厚なプールからのクローンのスクリーニングのみを必要とする。

ｒｇｄｐ　（例えばｐＡｂ　）は、特異的結合性ペアーの構成員（例えばモノク ローナル抗原結合特異性の抗体）を、この構成員をコードする遺伝情報も含む比 較的簡単な復製可能構造体の表層で表示されるため、この特異的結合性ペアーの 相補構成員（例えば抗原）に結合するｒｇｄｐ、例えばｐＡｂは、例えばジエチ ルアミン、高塩等を利用してこの相補性構成員を溶離させ、次いで適当な細菌に 感染せしめることによって、又はこの構造体を変性させ、次いでＰＣＲを用いて この構成員をコードする配列を特異的に増幅させることによって非常に効率的に 回収できる。即ち、ｐＡｂを発生するもとの細菌クローンに戻る必要がない。

いくつかの目的のため、例えば免疫沈殿及びいくつかの診断検査のためには、ポ リクローナル抗体又は抗体フラグメントを利用することが好都合である。本発明 は、所望の特性を有するｐＡｂに冨んだプールの選別により、又は所望の特性を 有する個々の単離クローンを混合することのいづれかによってこれが達成される ことを可能とする。このように選んだポリクローナルｐＡｂ集団は、ファージの ストックから、ファージミドを含む細菌から、又は選んだポリクローナル集団に 由来する可溶性フラグメントを発現する細菌から増殖されうる。従って、ポリク ローナル抗血清と同等な試薬が作られることができ、これは動物を利用せずに培 養液の中で復製、且つ、日常的に製造されうる。

選別方式及び親和性成熟 例えば抗原に対する所望の特異性を発現する個々のｒｇｄｐは、常用のスクリー ニング技術を利用して雑多なライブラリーから単離されうる（例えば、Ｈａｒｌ ｏｗ、　Ｅ、とＬａｎｅ、　０．１９８８＋前掲、Ｅ、ら１９９０．　Ｊ。

本出願はｒｇｄｐの固有な特性のためにのみ実用的である一連の新規な選別技術 も設計した。いくつかのスクリーニング手順の概略を、ｐＡｂを例示的なｒｇｄ ｐのタイプとして用いて図１５に示している。

スクリーンすべきｐＡｂの集団／ライブラリーは免疫化もしくはその他の動物か ら作ることができるか；又は予め存在しているファージ抗体をインビトロで突然 変異させることによって作られうる（当業者によく知られる技術、例えばオリゴ ヌクレオチド特異的突然変異誘発（Ｓａ＋ｗｂｒｏｏｋ＋　Ｊ、ら１９８９　Ｍ ｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　ａ　ＬａｂｏｒａｆｏｒｙＭａｎｕａｌ、 　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　）ｌａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｆｏｒｙ　Ｐｒｅｓ ｓ）を利用して）。この集団は、図１５に関する下記の１又は複数の方式におい てスクリーンされて、抗原結合特性がサンプルＣとは異なる個々のｐＡｂを導き 出すことができる。

結合溶離 図１５　（ｉ　）は固相（ｓ）に結合した抗原（ａｇ）を示し、この固相（Ｓ） はペトリ皿、クロマトグラフィービーズ、磁性ビーズ等より供されうる。次にｐ Ａｂの集団／ライブラリーをａｇに通し、そして結合した個りのｐは洗浄後に維 持され、そして任意的に検出系ｄにより検出される。抗−ｆｄ抗血清に基づく検 出系は−０９２１０１０４７の実施例４により詳しく説明されている。結合集団 ｐのサンプルを強まっていく緊縮条件下で除去すると、各サンプル中に示される 結合親和力は強まるであろう。強めの緊縮条件は例えば、浸漬時間を長くする又 は浸漬溶液のｐＨを変えることによって獲得できる。

競合 図１５（ｉｉ）に関して、抗原ａｇは固相支持体Ｓに結合していてよく、そして もとの結合分子Ｃと飽和になるまで結合する。突然変異ｐＡｂ（又は一連の無間 係なｐＡｂ　）をこの複合体に供すると、Ｃよりも抗原ａｇに対して高めの親和 力を有するもののみが結合するであろう。

ほとんどの例において、はんのわずかな集団ｃしか集団ｐ由来の個物より置換さ れない、もしＣが伝統的な抗体分子なら、全ての結合材料は回収でき、そして結 合したｐは適当な細菌で感染することにより、及び／又は標準の技術、例えばＰ ＣＲを利用することにより回収できる。

本出願の利点は、ａｇをレセプターとして用い、そしてＣが相補性リガンドであ るときである。回収される結合集団ｐはレセプター結合性部位及び／又はリガン ドと構造的に関連する。このタイプの特異性は薬理産業において非常に有用であ ることが知られている。

現在、抗−イディオタイプ抗体について直接選別することは難しい。ｐＡｂは、 　ｐＡｂライブラリー（例えば天然ライブラリー）をＢ細胞（これはその表層上 に抗体を発現する）に結合させ、そしてよく競合したファージを単離することに よって直接この選別を行う能力を提供するであろう。

ある状況においては、これは予め選別した集団ｐに利点を供しうる。例えば、上 記の抗−イディオタイプの例において、ｐは抗原と結合しない関連の抗体に吸収 されうる。

しかしながら、もしＣがｐＡｂなら、Ｃ及びｐの一方又は両方は何らかの手段で 好適にマークされて結合型Ｃから結合型ｐが区別及び選別されうる。このマーキ ングは物理的、例えばｐｔビオチンで予めラベルすることによるものであるか、 又はより好都合には遺伝子的でありうる。例えば、ＣをＥｃｏ８制限部位でマー クしながら、他方でｐをＥ　ｃ、ｏ　Ｋ制限部位でマークしてよい（１１：ａｒ ｔｅｒ、　Ｐら、１９８５．　Ｎｕｃｌ。

Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、１３．４４３１−４４４３を参照のこと）。結合化ｐ＋ｃ を抗原から？ｇＭさせ、そして適当な細菌に感染させるために利用するとき、集 団Ｃ（即ち、本例においてはＥｃｏＢ限定細菌）の限定（それ故増殖しない）が ある。増殖する任意のファージは高めの結合親和力を有するｐに由来する個物に 大いに冨んでいるであろう。他方、遺伝的マーキングは、ｐを新しい配列、即ち 、ＰＣＲを用いて混合物からｐを特異的に増殖させるのに利用できるものによっ て成し遂げられうる。

結合型ｐＡｂは例えばＰＣＲ又は細菌感染を利用して増幅できるため、常用の技 術を介して検出を可能とするには不十分な個物しか結合していないときでさえも 所望の特性を救済することが可能である。

所望の特異性又は親和力を有するタンパク質分子を表示するファージの選別のた めの好ましい方法は、通常はリガンドを有するアフィニティーマトリックスから の溶離であろう（例えば−０９２１０１０４７の実施例２１）。上昇する濃度の リガンドによる溶離は、親和力の強まっている結合性分子を表示するファージを 溶離させうる。しかしながら、例えばｐＡｂがその抗原と（又は他のタンパク質 がその結合性パートナ−と）高い親和力又は結合力で結合するとき、抗原に関係 する分子を有するアフィニティーマトリックスからｐＡｂを溶離させることは可 能ではないことがある。他方、十分に高い濃度で調製できうる適当な特異的溶離 用分子はないであろう。このようなケースにおいて、例えば抗原−抗体複合体に 特異的でない溶離方法を利用する必要がある。一般的に利用されているいくつか の非特異的な溶離方法はファージの生存率を低め、例えばファージ生存率はｐＨ １２で経時的に低下する（Ｒｏｓｓｏｍａｎｄｏ、　Ｅ、　Ｆ、とＺｉｎｄｅｒ 　Ｎ、　Ｄ、　Ｊ、　Ｍｏｌ。

Ｂｉｏｌ、　３６３８７−３９９１９６８）。例えば抗体とアフィニティーマト リックスとの間に相互作用があることがあり、これはファージ感染性を完全に取 り除かない限り壊われることがないであろう。このようなケースにおいて、例え ば抗体−抗原相互作用の崩壊を転りにしないでファージを溶離させる方法が必要 である。従って、ファージの構造を崩壊させない温和な条件（ジチオスレイトー ルによるジチオール基の還元）のもとて結合型ｐＡｂの溶離を可能とする方法が 企画された。

この溶離手順は、温和な条件下での溶離手順の一例にすぎない。

特に有利な方法は、特異性の高いプロテアーゼによる切断のための認識部位を構 成するアミノ酸をコードするヌクレオチド配列を、挿入した外来遺伝子の間に、 この場合は抗体フラグメントについての遺伝子と、遺伝子■の残りの配列との間 に挿入することであろう。

かかる特異性の高いプロテアーゼの例は因子Ｘ及びスロンビンである。ファージ をアフィニティーマトリックスに結合させ、そして非特異的結合ファージ及び弱 く結合したファージを除くために溶離した後、強く結合したファージはこのカラ ムを、切断部位での消化にとって適切な条件のもとてプロテアーゼで洗うことに よって除去されるであろう、これは抗体フラグメントをファージ粒子から切り離 してファージを溶離させるであろう。これらのファージは感染性と予期でき、な ぜなら唯一のプロテアーゼ部位は特異的に導入したものであろうからである。強 く結合したファージは次に例えばＥ、コリのＴＧＩ細胞に感染させることによっ て回収できうる。

上記に代わる手順は、強く結合したｐＡｂを保持したアフィニティーマトリック スを作り、そして例えばＳＯ３溶液の中で煮沸することによってＤＮＡを抽出す ることである。抽出されたＤＮＡは、次にＥ。

コリ宿主細胞を直接形質転換させるために用いられるか、又はそうでなければ抗 体をコードする配列を、例えばＰＣＲにより、例えば本明細書に開示する適当な プライマーで増幅させ、その後、更なる研究のために可溶性抗体として発現させ るベクターの中に、又は更なる選別の段階のためにｐＡｂの中に挿入していよい 。

アフィニティーにかかわる選別のための他の好ましい方法は、少量のリガンドを 含むアフィニティーマトリックスへの結合によるものであろう。

ファージの集団からリガンドに対して高い親和力を有するタンパク質分子を表示 するものを選別することを願うとき、好ましい手法はファージの集団を、少量の りガントを含むアフィニティーマトリックスに結合させることにある。マトリッ クス上のりガントに対する結合についての、高い親和力と低い親和力のタンパク 質を表示するファージ間での競合が起こる。高い親和力のタンパク質を表示する ファージは優先して結合し、そして低い親和力タンパク質は洗い流される。そし て高い親和力のタンパク質は、リガンドでの溶離により、又はファージをアフィ ニティーマトリックスから溶離させるその他の手順（Ｎｏ　９２１０１０４７の 実施例３５がこの手順を説明している）により回収される。

まとめると、アフィニティ一工程からのパッケージ型ＤＮＡの回収に関して、こ のパッケージは簡単に溶離でき、これは相補性ｓｂρ構成員に対する結合につい て前記パッケージと競合する同族ｓｂｐ構成員の存在下でＲＭできる；これは煮 沸により除去でき、これはタンパク質のタンパク質分解によって除去できる；そ してその他の方法、例えば支持体と相補性ｓｂｐ構成員との間の結合を破壊して 前記パッケージ型ＤＮＡ及びｓｂｐ構成員を切り離すことは当業者に明らかであ ろう。いづれにせよ、この目的はパッケージからＤＮＡを獲得して、それにより コードされるｓｂｐ構成員を発現させるのに直接的又は間接的に用いることをで きるようにすることにある。

ｐＡｂについての本選別手順の効率性のよさ及び非常に大きなライブラリーを作 り出す能力は、課題の抗体を生産するスクリーンに付される細胞の割合を高める ために開発された免疫技術が絶対的に必要とはされないであろうことを意味する 。本技術は結合特異性体、例えば抗原結合特異性体、例えば常用の技術によって は困難又は獲得できないであろうもの、例えば触媒性又は抗イデイオタイプ抗体 の迅速な単離を可能とする。免疫レパートリ−の完璧なライブラリーが構築でき たら、動物を完全に排除することもここで可能となるであろう。ｐＡｂ分子の構 造体は数多くのその他の用途に利用することができ、そのいくつかの例は下記の 通りである：ノブナル増幅 それ自体本質的に分子として働いて、ｒｇｄｐ、例えばｐＡｂは、もし主要コー トタンパク質を他の成分に連結させるために用いているなら、特異的な分子、例 えば抗原に結合する能力と増幅を保有する。

この成分は免疫学、化学又はその他の手段を通じて連結されていてよく、そして 例えばインビボ又はインビトロで利用するための、複合体を検出試薬又は細胞毒 性分子でラベルさせるために用いられうる。

物理的検出 ｒｇｄｐ、例えばｐＡｂのサイズは、電子顕微鏡及び／又はいくつかのバイオセ ンサー、例えば表層プラスモン共鳴のような物理的検出方法に特に関連するマー カーとして利用されうる。

診断アッセイ ｒｇｄｐ、例えばｐＡｂは診断アッセイにおいて、特に分離をその物理的性質を 利用して行うとき、例えば遠心、濾過等のときにも有利である。

本発明をより完全に理解していただくため、下記に説明する図面を参照しながら その態様をより詳しく説明するが、それらは例示であって限定を意図するもので はない。

図面の簡単な説明 図１は、ライブラリーのサイズに対する、一定のｐ　（Ｋ）値を有する抗体を単 離する確率のプロントを示す。

図２は、ファージ上でのｇ３融合体としての重鎮、ファージミド由来の可溶性フ ラグメントとして発現される軽鎖をクローンする手法の概略である。

図３は、２つのレプリコンのうちの一方のみがフィラメント状粒子の中にパッケ ージされることが可能であるクローニング手法を示す。

図４は、多重順列組合せライブラリーにおける重鎮と軽鎖、遺伝子融合体及びレ プリコンの考えられる様々な組合せを示している。

図５はインビトロでの、精製軽鎖と組合さったファージ上でのｇ３融合体として 重鎮をクローニングする手法を示す。

図６は多重順列組合せライブラリーの構築のための部位特異的組合せの利用を例 証する。

図７は実施例１に用いる鋳型クローンの配列を示す。これはＡａｂＮ口１０．１ ２．５　（）１ｏｏｇｅｎｂｏｏｓら、１９９１、前掲）である。

図８は別々の要素として重鎮と軽鎖をクローンする手法を例示する。

図９は実施例１におけるｐＵｃｌ９及びｐＵｃｌ１９に用いたポリリンカー配列 を示す。

回１０はファージとファージミドベクター間での干渉を示す、実施例１に記載の 感染実験の結果を示している。

［Ｊｌｌはファージ及びプラスミドと比較した、ファージ及びファージミドベク ター間での干渉の、ＥＬＩＳＡ　シグナルに及ぼす効果を例示する。

図１２は実施例３において実証される、適切な重鎮と軽鎖との組合せを利用した ときにのみ機能的な抗体が製造されることを示すＥＬＩＳＡ結合を示す。

図１３はマウスモノクローナル抗体をヒト化するための方法の例を示す。

図１４は最も単純な抗体分子１ｇＧの基本構造を示す。

図１５はｐＡｂの固有の性質を利用する計画的選別技術を示す；１５（ｉ）は結 合／溶離系を示し；そして１５（ｉｉ）は競合系を示す（ｐ＝ｐＡｂ；ａｇ＝抗 原（ｐＡｂの結合が要求されるもの）；Ｃ＝競合集団、例えば抗体、ｐｎｂ、リ ガンド；ｓ＝支持体（例えばプラスチックビーズ等）；ｄ＝検出系）。

図１６はｆｄ　ＤＯＧＩの遺伝子■におけるクローニング部位周辺の配列を示す 。制限酵素部位を、抗体由来配列によりコードされるアミノ酸と一緒に示してい る。これらには５′末端において遺伝子■シグナルペプチドが、そして３′末端 にて３個のアラニン残基（Ｎｏｔｌ制御部位によりコート化）と残りの成熟遺伝 子■タンパク質でフランクされている。矢印はシグナルペプチドの切断のための 切断部位を示す。

図１７は、ａ）実施例２４に記載のｐＵｃｌ　１９の誘導体であるファージミド ｐＨＥＮｌ；及びｂ）ファージミドｐＨＥＮにおけるクローニング部位、を示す 。

図１８゜ファージの表層上での表示のためにｆｄ−ＤＯＧＩ及びｐｌ（ＥＮＩに クローンされた抗体構築体。構築体１．　Ｉｔ、ＩＩＩ及び■はｆｄ−ＤＯＧＩ （ＡｐａＬ　Ｉ　−Ｎｏｔ　ｌフラグメントとして）及びｐｉ（ＥＮＩ　（Ｓｆ ｉｌ−Ｎｏｔ　Ｉフラグメントａして）の両者にクローンした。全ての構築体は 、マウス抗−ｐｈｏｘ抗体１１（］　ＩＯ，１２，５の重鎖（Ｖ）ｌ）及び軽鎖 （ＶＫ）可変領域を含んでいる。定常ドメインはヒトＣＫ及びＣＨＩ（ｒｌイソ トープ）とした。

図１９゜遺伝子■タンパク質への融合によりファージの表層上に抗体フラグメン トを表示せしめる３通りの態様。

ここで開示するのは抗体の重及び軽鎖の非常に多様性なライブラリーの製造のた めの方法である。重鎮及び軽鎖を個々のレプリコン上でクローンし、そして機能 的性抗体を、インビボ又はインビトロでの重鎮と軽鎖との翻訳後集成により作り 、従って作り上げられる組合せの最終的な数は、重鎮の数に、軽鎖を乗じた数で ある。かかる方式は鎖シャフリング、突然変異誘発、ヒト化及びＣＤＲｒインプ リンティングＪにとっても好都合である。この方法は２種以上の異なるサブユニ ットを集成して機能性オリゴマーを作り上げているその他のタンパク質に適用す ることもできる。

フィラメント状ファージの表層上で発現させるべき第１機能性抗体分子は一木Ｉ ＪＦＶ　（ｓｃＦν）とし、なぜそう呼ばれるかというと、通常は２つの独立し たタンパク質にある重鎮と軽鎖の可変性ドメインが柔軟なリンカ−ペプチドによ り共有結合しているからである。それに代わる発現手法も有効となっている。モ ノマーＦａｂ分子は、もしその鎖のうちの一方（重又は軽）がｇ３カスピドタン パク質に融合しており、そして相補鎖が可溶性分子として細胞周辺腔へと輸送さ れたときにファージ上で表示されうる。これら２本の鎖は同−又は異なるレプリ コン上でコードされうる；重要な点は、２本の抗体鎖が翻訳後に集成され、そし てその二量体が、一方の鎖のｇ３ｐへの結合を介してファージ粒子に一体化され ることにある。

より最近のクローニング実験は、ファージＤＮＡよりも約１００倍の形質転換効 率を有する「ファージミド」ベクターで実施されている。

これらは、ファージミドＤＮＡの一本核コピーが製造されることを可能とするフ ィラメント状ＤＮＡに由来する遺伝子開領域を含むプラスミドであり、そしてこ れらは、それらを含む細胞が、ファージ成分の翻訳（ｉｎ　ｔｒａｎｓ）を担う ヘルパーファージで感染されているときに感染性フィラメント状粒子へとパッケ ージされる。ファージミドが抗体遺伝子（例えばｐＨＥＮ−１）に融合したｇｍ を含むとき、得られる融合タンパク質はファージミド粒子の上に表示される（Ｈ ｏｏｇｅｎｂｏｏｍ＋Ｈ，Ｒ，、Ａ、Ｄ、Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ、に、Ｓ、Ｊｏｈ ｎｓｏｎ、Ｄ、Ｊ、Ｃｈｉｓｗｅｌｌ、Ｐ。

ＨｕｄｓｏｎとＧ、　Ｗｉｎｔｅｒ　、（１９９１）。Ｍｕｌｔｉ−ｓｕｂｕｎ ｉｔ　ｐｒｏｔｅｉｎｓ　ｏｎ　ｔｈｅｓｕｒｆａｃｅ　ｏｆ　ｆｉｌａｍｅｎ ｔｏｕｓ　ｐｈａｇｅ　：　ｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｉｅｓ　ｆｏｒ　ｄｉｓｐｌ ａｙｉｎｇａｎｔｉｂｏｄｙ　（Ｐａｂ）　ｈｅａｖｙ　ａｎｄ　ｌｉｇｈｔ　 ｃｈａｉｎｓ、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、１９（１５）、　４１３ ３−４１３７）　、大量の様々な抗体フラグメント、例えばレパートリ−を取り 扱うときに最も重要となっている要素である抗体遺伝子のクローニングのための 効率的な手法の開発においてかなりの進歩がなされている。

ファージ抗体レパートリ−についての初期の研究においてはクローニングヘクタ ーｆｄ−ＤＯＧ−１が利用されており、ここで５ｃＦＶフラグメントはハブテン 　オキサザロンで免疫したマウスの牌［１ｍ　ＲＮ　Ａに由来する（Ｃ１ａｃｋ ｓｏｎ、　Ｔ、、　Ｈ，Ｒ，Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ、　Ａ、　Ｄ、　Ｇｒｉｆｆ ｉｔｈｓ　とＧ。

Ｗｉｎｔｅｒ、　（１９９１）。Ｍａｋｉｎｇ　ａｎｔｉｂｏｄｙ　ｆｒａｇｍ ｅｎｔｓ　ｕｓｉｎｇ　ｐｈａｇｅ　ｄｉｓｐｌａｙｌｉｂｒａｒｉｅｓ　、Ｎ ａｔｕｒｅ　３５２＋　６２４−６２８）　；　ＶＨ及びＶＬドメインを別々に 増幅させ、そして５ｃＦＶリンカ−ペプチドをコードする短いＤＮＡフラグメン トを介してランダムで連結させて、約１０Ｓ種のクローンのライブラリーを作っ ている。これを免疫抗原に対して精錬して、機能性抗体を製造するＶＨとＶＬと 組合せを選んだ、いくつかのバインダー、とりわけ、常用のハイブリドーマ技術 で作った最良のモノクローナル抗体よりあまり下まわらない親和力を有するもの を単離した。

マウスにおいて、常に約１０’可能なＨｕｉと１０’可能なし鎖とがあり、これ らの２鎖をランダムで組合せたとき、１０”可能なりＨ：　ＶＬの組合せができ る（これらの数字はレパートリ−サイズの大まかな指標を推定さゼ、且つ、単に 提供する）。これらの数字より、上記のマウスライブラリーは１０７可能なりＨ ：　ＶＬの組合せのうちの１つの見本となる。良好な親和力の抗体が単離できる ようであり、なぜなら免疫化トナー由来の肺臓細胞のうちで抗原を認識すること のできるＢ細胞はクローン的に増殖され、そして大量のＩｇ　ｍＲＮＡを生産す るからである。この実験における低いライブラリー複雑度はプラスミド（又はフ ァージミド）に比してのファージＤＮＡの固有の低形質転換効率にある程度基づ く。

Ｍａｒｋｓら（Ｍａｒｋｓ、　Ｊ、Ｄ、　Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ＋　Ｈ，Ｒ，Ｂ ｏｎｎｅｒｔ＋　Ｔ、　Ｐ、。

門ｃＣａｆｆｅｒｔｙ、　Ｊ、＋　Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ、　Ａ、　Ｄ、と一１ｎ ｔｅｒ、　Ｇ、（１９９１）　Ｂｙ−ｐａｓｓｉｎｇｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ 　：　Ｈｕｍａｎ　ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ　ｆｒｏｍ　Ｖ−ｇｅｎｅ　１ｉｂｒ ａｒｉｅｓ　ｄｉｓｐｌａｙｅｄｏｎ　ｐｈａｇｅ、　Ｊ、　Ｍｏ１．　Ｂｉｏ ｌ、　２２２．５８１−５９７）及びＰＣＴ／ＧＢ９１１０１１３４は、ファー ジミドｐＨＥＮ−１の中でクローンした、非免疫化ヒトに由来する抗体レパート リ−の構築を述べている。３．１０’のクローンよりなるこのライブラリーは今 までに１０種の抗原に対する特異的な抗体を有する。これらの抗体は一次免疫応 答より予測される中程度の親和力ををし、ある域の構造的多様性抗原に対して有 用な抗体が事実上単一の起源から単離できることを実証している。

「鎖シャフリング」と呼ばれる手順を利用して、ファージ抗体ライブラリーから 単離したクローンから新たなバインダーを作ることができる。この工程において 、２本の鎖のうちの一方は固定し、そして他方を変更する。例えば、親和力の最 も高いマウス抗−〇χファージ抗体由来の重鎮を固定し、そしてそれに沿って軽 鎖のレパートリ−を再クローンすることにより、４．１０’のライブラリーが構 築される。いくつかの新たな０χ−バインダーが単離され、そしてその大半は最 初に単離したものとは異なる軽鎖を有し、そして多様性ががなり高かった。これ らの観察は、一方の鎖しが変えていないとき、採用できる多様性を引き出すのに 小さなライブラリーで十分であることに反映し、これはもとのライブラリーが採 用できる多様性を含むのに十分に大きくないときに有効な手順である。

ライブラリーのサイズは極めて重要である。これは特に、天然のヒトレパートリ −から抗体を単離する試みの際に真実であるが、しかし免疫化起源に由来する親 和力の最大の抗体の単離に関しても同様である。

ファージが抗体遺伝子をクローニング及び選別するための極めて強力な手段を表 示するが、我々は現存の技術を利用しながら最も小さい潜在的な多様性のみを引 き出していることが明らかである。形質転換効率がライブラリーのサイズに最大 の制限を認定し、現状の方法を利用すると約１０９が限界である。大まかな計算 は、これは標的の効率よりも数桁低いことを示唆する；より厳しい分析がそれを 確証せしめた。

ＰｅｒｅｌｓｏｎとＯｓ　ｔｅｒは、免疫レパートリ−のサイズと、一定の闇値 の親和力に以上で一定のエピトープを認識することのできる抗体を作り上げる傾 向との関係についての理論的考察を示している。その関係は次の式で示されてい る： ｐ　＝　ｅ−Ｎ（ｐｌＫｌｌ ここでＰ＝エピトープが、レパートリ−中のどの抗体によっても上記の閾値に以 上の親和力で認識されない確率。

Ｎ＝レパートリ−中の異なる抗体の数。

そしてｐ　（Ｋ）−個々の抗体がンダムエピトープを、閾値に以上の親和力で認 識する確率。

この分析においてｐ　［Ｋ）は親和力に反比例するが、この関係を正確に説明す る演算古代は推定されていない。にもかかわらず、抗体の親和力が高いほど、ｐ 　（Ｋ）は低くなり、そして抗体を単離するための妥当な確率が得られるために はレパートリ−は大きくなくてはならない。他の重要な特徴はこの関数が指数で あることにある；図１に示す通り、ライブラリーサイズにおける小さな変化は一 定のｐ　（Ｋ３を有する抗体の単離の確率に、無視できるような効果、又は劇的 な効果のいづれかを及ぼしうることかでき、これはライブラリーサイズによって 曲線上のどの点が付与されるかに依存する。

本出願人は、形質転換効率の限界（それ故、ライブラリーサイズの上限値）はＤ ＮＡを細胞に導入する有効な方法により解消されうることを認識した。好ましい 形態において、重及び軽視遺伝子は別々に２つの異なるレプリコンにクローンす る。ここでこのうちの少なくとも一方はフィラメント状粒子の中に一体化される ことが可能である。一方の鎖を保有する感染性粒子を、その相補鎖を抱えている 細胞に感染せしめる；〉９０％の感染頻度が容易に達せられる。重及び軽鎖はこ れにより細胞周辺腔の中で後翻訳的に一体化することができ、そして一方又は両 方の鎖がｇ３ｐに連結されることによってこのフィラメント状粒子の表層上にそ の組合せが表示される。例えば、１０７の重鎮のライブラリーを未融合集団とし てファージミドの中にクローンし、そして１０’の軽鎖をｆｄ−ＤＯＧ−１の中 にｇ３融合体としてクローンする。両集団を次に増殖によって増やし、１０’の 各重鎮含有細胞及びそれぞれの軽鎖ファージの１０７のコピーがあるようにする 、ファージを細胞に感染させることにより、１０’　ｘｌＯ’　＝ｌＯ”の固有 の組合せが作られることができ、なぜなら１０７のファージを保有する異なる軽 鎖によってそれぞれが感染されうる同一の重鎮を保有する１０’の細胞があるか らである。それぞれ異なる重鎮クローンについてこれを繰り返すと、個別の細胞 において１０１４種までの重／軽組合せに至る。この手法は図２に概略し、これ はファージ上でｇ３融合体としてクローンした重鎮及びファージミドより可溶性 フラグメントとして発現される軽鎖を示す。明らかに、逆の組合せ、即ち、ファ ージ上での軽鎖、ファージミド上での重鎮条理にかなっている。

図２に示す形態において、ｆｄ−ＤＯＧはファージミドを「救済」し、従ってフ ァージとファージミドＤＮＡの両者はフィラメント状粒子の中にパッケージされ 、そして両タイプは、対を成した重鎮と軽鎖をその表層上に、その一方のみの遺 伝情報しか有さないにもかかわらず有するであろう。一定の抗原又はエピトープ に関し、重鎮と軽鎖の対の大半は非機能的であり、従って抗原による選別は重鎮 と軽鎖の集団の複雑度を大いに小さくする効果を有するであろう。第一段階の選 別の後、クローンを再び雑多にしく本例においては新鮮な宿主細胞を感染せしめ ることによる）、そして両レプリコンについて選別する。数段階の抗原選別及び ２種のレプリコンの回収を経て、かなり小さくなった重鎮と軽鎖の集団を同一の レプリコンの上でクローンし、そして常用の手段により分析する。この取り合わ せについての一つの技術的な問題は、同一の複製のしくみに関する競合の結果と しての、異なるレプリコン上で保有されるフィラメント状ファージ復製起点間で のいわゆる「干渉」である。この問題はファージ及び／もしくはファージミド起 源のいづれかの「干渉−耐性」突然変異体の横築により（Ｊｏｈｎｓｔ６ｎ、　 Ｓ、とＲａｙ、　Ｄ、　Ｓ、　Ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅｂｅｔｗｅｅｎ　Ｍ１ ３　ａｎｄ　ｏｒｉ　Ｍ１３　ｐｌａｓｍｉｄｓ　ｉｓ　ｍｅｄｉａｔｅｄ　ｂ ｙ　ａ　ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎｅｎｈａｎｃｅｒ　５ｅｑｕｅｎｃｅ　ｎｅａ ｒ　ｔｈｅ　ｖｉｒａｌ　５ｔｒａｎｄ　ｏｒｉｇｉｎ、　（１９８４）　Ｊ、 　Ｍｏｌ。

Ｂｉｏｌ、　１７７、６８５−７００）又は例えばファージミド上の二本鎖複製 起点（フィラメント状ファージ遺伝子間領域とは異なる）を例えば温度感受性ラ ンナウェイ（ｒｕｎａｗａｙ）レプリコンのそれに置き換えることによりコピー 数をコントロールすることを介して軽減されうる。これにより、常在性ファージ ミドのコピー数は干渉を最小限にするように低く保たれ、従ってファージを樹立 することができ、そしてファージミドのコピー数を抗体の発現のために増やすこ とが可能となる。

他方、２種のレプリコンのうちの一方のみがフィラメント状粒子へとパッケージ されることが可能である必要がある。かかる手法は図３において概略し、そして 実施例２において実施されている。軽鎖のライブラリーをプラスミドｐＵｃ１９ の中にクローンし、そして重鎮はｆｄ−ＤＯＧ−１の中でｇ３融合体として発現 させている。この場合は干渉はなく、なぜなら複製のメカニズムが異なるからで ある。ここでの主なる操作的相異は、このプロセスが、この場合最良の重鎮の選 別をもたらすことにある；軽鎖はクローンされない。適切な軽鎖はその後に、選 別された重鎮を同一のレプリコン上の軽鎖のレパートリ−と−緒にクローンする ときに単離し、次いで常法で選別する。

ここでも、本原理は図４に示すようにベクター、鎖及びｇ３融合体の種々の組合 せを有する一連の他の方式に変換されうる。

他の形態は図５に示すように重鎮をファージ上でｇ３融合体としてクローンし、 そしてインビトロで精製軽鎖を付加することである。

これらの鎖を５１！１Ｍの最終濃度に至る塩酸グアニジンを加えることによって 部分的に変性させ、次いでこの変性剤を透析して追い出し、重鎮と軽鎖が集成し てファージ表層上で機能的抗体組合せ部位を作る。これらは次いで抗原に基づい て選別でき、そして適切な重鎮ファージが単離される。必要ならば、選別は新た な軽鎖で繰り返してよい。適当な濃度の他の変性剤、例えば尿素又はイソチオシ アン酸カリウムも有効性を示すであろう。この手順を行うことにより、非常に小 さな集団の重鎮遺伝子が残され、これを好ましくは同一のレプリコン上で、軽鎖 レパートリ−と−緒にクローンすることができる。可溶性鎖は組換ＤＮＡ技術、 ■もしくは複数のモノクローナル抗体、又は血清抗体より作られうる。逆の形態 、即ち、ファージ上の軽鎖を可溶性重鎮、又は重鎖のフラグメントと一緒にする ことも可能である。更に考えられるのは、例えば化学修飾によって連結できうる 重鎖と軽鎖との連結法である。

ここまで、記載の手法はレパートリ−の複雑度をまず下げ、それに付随する小さ くなった集団の一方又は両方の鎖をその後頁クローニングする可能性の原理に基 づく。両方の鎖を同一のレプリコン上で高い効率でクローンすることを可能とす る他の方法も全文てた。

これらも重鎮と軽鎖の遺伝子を別々のレプリコン上でクローニングすることを幀 りにするが、しかしこの時に２つのベクター間の組換え助長する狙いが伴い、従 って両方の鎖は同一のレプリコン上に置く。図式を図６に示し、ここではＩＪＩ 喚系はコリファージＰ１のｆｏｘ　ＰＺ９Ｌリコンビナーゼ系に基づ＜　（Ｈｏ ｅｓｓ＋　Ｒ，Ｈ，ａｎｄ　Ａｂｒｅｍｓｋｉ＋　Ｋ。

（＋９９０）　Ｔｈｅ　Ｃｒｅ−ｆｏｘ　ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ　ｓｙｓ ｔｅｍ　。　ｒＮｕｃｌｅｉｃ　ａｃｉｄｓ　ａｎｄ門ｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｂｉ ｏｌｏｇｙ　」、　ＥｃＫｓｔｅｉｎ、　Ｆ、とＬｉ１ｌｅｙ、　Ｄ、　Ｍ、　 Ｊ、！、第４巻、　１９９−１０９＋　Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、　Ｂ ｅｒｌｉｎ、　Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ）。

Ｃｒｅ−リコンビナーゼは、配列、いわゆるｆａｘ、　ｌｏｘ　Ｐにおいて特異 性の高い＆ｌ］喚現象を触媒する。ファージＰ１における組換部位は、８ｂｐの 非対象的な中核で隔てられた２つの１５ｂｐの反転反復より成る。

図６に詳細な形態において、可溶性軽鎖を一つのｌｏｘ　Ｐ部位を含むファージ ミド上にクローンする。これらの重鎮を３ｇ融合体としてプラスミド上にクロー ンする。ｇ３融合体に沿っているのは、選択マーカーのための遺伝子、及び２つ のｌｏｘ　Ｐ部位がフランクしている重鎖／ｇ３／マーカー配列である。このプ ラスミドは制御性プロモーター上にＣｒｅリコンビナーゼをも含み、そしてファ ージミド上、更にはへルバーファージ上に適応する二本鎖複製起点を有する。例 えば、ｐ１５八、　ｌｌ５Ｆ　１０１０及びｃｏｌ　Ｅｌ起点は同一の細胞の中 で共存するであろう。次にこのファージミドをドナープスミドを含む細胞の中に 感染させ、そして−Ｃｒｅリコンビナーゼプロモーターを誘発させ、↓ＯＸ　Ｐ 部位間での組換を感染細胞内で起こさせる。これらの組換現象の一部は重鎖／ｇ ３／マーカー配列がファージミド上へとプロングとして、その片方のｆｏｘ　Ｐ 部位へと移動することをもたらしうる。

次にファージミドをヘルパーファージ、例えばＭ１３ＫＯ？で救済し、そして得 られるファージミド粒子を抗原により直接選別するか、又は新鮮な宿主細胞の中 に感染させ、次いで増殖させて両方のマーカー（一方はファージミド自体に由来 し、そして他方は重鎖７ｇ３／マーカーブロツクに由来する）の存在についての 選別を行う。

遺伝子を同一のレプリコンに置く部位特異的組換の利用は、例えば−末鎖Ｆｖ分 子を構築するための、同一のレプリコン上での連続コート°配列の作製にまで及 ぶことがある。ｓｃＦシリンカーに一体化されうる単一のオープンリーディング フレームが１ｏｘＰ配列の中にあり、これはＣｒｅ−触媒化部位特異的組換のた めの基質となるであろう。

融合すべき遺伝子の一方又は両端におけるかかる改質５ｃＦｖリンカーノ配置は 、Ｃｒｅ　リコンビナートを供する際にインビボ又はインビトロでの連続オープ ンリーディングフレームの作製をもたらしうる。

この手法は、Ｃｒｅ−触媒化組換を、細菌、好ましくはＥ、コリ又はその他のグ ラム陰性薗の１株の中で行うと更に精錬化されうる（これらの細胞はＤＮＡポリ メラーゼ１を欠失しており、そしてプラスミドの複製を助けることができない（ Ｊｏｎｓｔｏｎ、　Ｓ、　とＲａｙ、　Ｄ、Ｓ。

１９８４、　ｔｔ’［ｉ）　）。しかしながら、それらはフィラメント状ファー ジ及びフィラメント状ファージの遺伝手間領域を含むプラスミドの複製を助ける ことができる。同一のＬｕ細胞における両選別マーカーの存在について選別する ことにより、有効な組換現象が富み、なぜなら組換は複製及び発現すべき第２マ ーカー遺伝子にとって代わらなければならないからである。得られる細胞はこれ により完全なレパートリ−となり、そして細胞のように増殖し、そしてファージ ヘルパーと一緒に感染して、重鎖についての遺伝子を含み、且つ、表層上にそれ らを発現するファージミドをもたらすことができる。

他の一般的及び／又は部位特異的組換メカニズムも同一の結果を及ぼすのに利用 できうる（　’Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ａｎｄ　Ｓａｌｍｏｎｅｌ ｌａｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ、Ｃｅ１ｌｕｌａｒ　ａｎｄ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ 　Ｂｉｏｌｏｇｙ　Ｊ　（１９８７）　、頁１０３４−１０４３．　１０５４− １０７０．　Ｎｅ１ｄｈａｒｔ、Ｆ、Ｃ，編、　Ｃｈｉｅｆ、八ｍｅｒｉｃａｎ 　５ｏｃｉｅｔｙｆｏｒ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ）　ａ多様性を作るために ２種以上のレプリコンを利用する概念はフィラメント状ハタテリオファージの表 層上で表示させることに限定されるわけではないことが明らかであろう。例えば 、複製可能な遺伝子表示パッケージとして細菌を利用することができる。例えば Ｆｕｃｈｓらは、機能性抗体をＥ、コリの表層の上に、ペプチドグリカン結合型 リポタンパク質への融合によって表示させることができることを示している。（ Ｆｕｃｈｓ、　Ｐ、＋　Ｂｒｅｉｆｌｉｎｇ、　ｐ、ｌ　Ｄｕｂｅｌ、　Ｓ、、 　５ｅｅｈａｕｓ＋Ｔ　とし１ｔｔｌｅ、Ｍ、（１９９１）　Ｔａｒｇｅｔｔｉ ｎｇ　ｏｆ　ｒｅｃｏ請ｂｉｎａｎＬ　ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓｔｏ　ｔｈｅ　５ ｕｒｆａｃｅ　ｏｆ　Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　Ｃｏ１１：　ｆｕｓｉｏｎ　ｔ ｏ　ａ　ｐｅｐｔｉｄｏｇｌｙｃａｎａｓｓｏｃｉａｔｅｄ　１ｉｐｏｐｒｏｔ ｅｉｎ、　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　９＋　１３６９−１３７３）　ａ　Ｋ ｌａｕｓｅｒらは、ネイセリア（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）　ＩｇＡプロテアーゼへ の融合によるＥ。

コリの表層への異種タンパク質の輸送を述べている（Ｋｌａｕｓｅｒ、　Ｔ、＋ Ｐｏｈｌｅｒ、　Ｊ、とＭｅｙｅｒ、　Ｔ、Ｆ、（１９９０）　Ｅｘｔｒａｃｅ ｌｌｕｌａｒ　ｔｒａｎｓｐｏｒｔ　ｏｒｃｈｏｌｅｒａ　ｔｏｘｉｎ　Ｂ　５ ｕｂｕｎｉｔ　ｕｓｉｎｇ　Ｎｅ１ｓｓｅｒｉａ　ＩｇＡ　ｐｒｏｔｅａｓｅ　 Ｂ　ｄｏｍａｉｎ：ｃｏｎｆｏｒｍａＬｉｏｎ−ｄｅｐｅｎｄｅｎＬ　ｏｕｔｅ ｒ　ｍｅｍｂｒａｎｅ　ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎ、　ＥＭＢＯ９＋１９９］ −１９９９）。その他の表層タンパク質、例えばピリ、ｏｍｐＡ又は表層露出型 リポタンパク質Ｔｒａ　Ｔも利用でき、そしてダラム陽性菌、例えばラクトバチ ルス（Ｉａｃｔｏｂａｃｉｌｌｉ）及びストレプトコッカス（ｓｔｒｅｐｔｏｃ ｏｃｃｉ　）を利用できる。真核生物におけるクローニング及び発現も考慮され る。

ファージの代わりに細胞を利用するとき、他のクローニング手法が可能である。

例えば、レプリコンを細胞の中に、形質転換及び感染に加えてコンジエゲーシジ ンにより導入することができる。更に、１又は複数の遺伝子を染色体に一体化せ しめて、適合性レプリコンの利用の制限を小さくすることができる。

多重順列組合せ概念も突然変異実験にとって極めて有利であり、その理由は多大 な数の変異子孫を作製せしめることを可能にすることにある。

本出願人は、多重順列組合せ概念が抗体以外の多量体タンパク質、例えばＴ細胞 レセプター、ＣＤ３及びインスリンレセプターに通用できることに気づいた。２ 種以上の異なるサブユニットを有するタンパク質のライブラリーは例えば数サイ クルの感染によって作られうる。一方のサブユニットを含む細胞を、第２サブユ ニツトを含むファージで感染させ、そして得られる集団を次に第３のサブユニッ トを保有する適合性ファージで感染させる。

あるケースにおいて、多量体の２種以上の成分のポリペプチドドメインをｇ３融 合体として発現させることが有利である。これは別々の核間の弱い相互作用を安 定化させる、又は弱く相互作用するポリペプチドドメインを安定化させる、又は リガンドの存在下においてのみ結合するポリペプチドドメインを安定化させるの に有利であろう。

この多重順列組合せ手法で可能な組合せの数は、レパートリ−それぞれの中に存 在しているクローン数、及び一方の鎖を他方を含む感染細胞に供するファージを 用いる特異的状況、製造すべきファージ及び細胞数によってのみ限定される。■ 又は複数の精錬された方法、例えば発酵技術の利用は、より大きな数を可能とす るであろう。

Ａｆｆｙｍａｙより提出されたＰＣ↑／ｗｏ９１／　１７２７１は、抗体の重及 び軽鎖の発現を述べているが、しかしながら、別のレプリコンを有するファージ によるーレプリコンを存している細胞の感染が、大きなサイズのライブラリーの 作製を可能とすることは示唆していない。それは、２つのレプリコンを用いる課 題の抗体フラグメントの選別についての選別プロセスを述べていない。それらは 単に、２本の鎖を同一のファージ又は細菌の中に一緒に維持する二重選別を考慮 しており、彼らが述べている方式においては、構築されうるライブラリーのサイ ズは制限されうる。個々のベクター上の重鎮及び軽鎖ライブラリーにより、その 重鎮と軽鎖が再シャンフルされうるであろうこと、又はどのようにして所望の組 合せを同定するかについては示されていない。

従来の手法とは異なる重要な相違は、重及び軽鎖の個別の起源の利用、並びによ り大きな多様性ライブラリーを作るためにどのようにしてそれらを組合せるかに ある。本出願人はかかるライブラリーの構築のための方法、及びどのようにして 重鎮と軽鎖のライブラリーとを組合せて真人な数の機能的組合せを作るかの教示 、更には、所望の組合せを選別及び単離する手段を供する。重要な利点は、この 方法により構築したライブラリーが従来可能であったものよりも数桁おおきくな りうることにある。２つのレプリコンを用いるとき、それらはファージ、ファー ジミド及びプラスミドの任意の対の組合せであってよく、全てのケースにおいて 、抗体の鎖は可溶性フラグメントとして、又はファージミドカスピドと結合して 発現される。

少なくとも一方のベクターは感染性ファージ様粒子に一体化されることが可能で あり、そして少なくとも一方のベクターは抗体鎖とファージカスビドとの結合を 、例えばｇ３ρとの融合によって可能とする。上記のどの形態も新規のヒト化／ 突然変異手順に用いることができる。

’８１シャ、フリツプ」順列組合せ手法が本発明の特に有用な態様である。例え ば、−木の重鎮又は一定の数の重鎮を、所望の抗原特異性ををすることで知られ る抗体から、又は課題の抗原で免疫したヒト又は動物に由来する抗体のレパート リ−から獲得し、次いでかかる鎖の集団を、この場合はｒｇｄｐ成分に融合した 軽鎖のおそらくは非常に大きな遺伝的に多様な集団と組合せることができる。こ の軽鎖はｒｇｄｐの中でパッケージされることのできる核酸から発現されるであ ろう。次に、課題の抗原に対して特異的な抗体を形成する軽鎖とそれに結合した 重鎮を表示するｒｇｄｐそれぞれについて選別することができる。かかるｒｇｄ ｐはそれぞれ軽鎖をコードする核酸を含むであろう。このようにして選別した限 定集団の軽鎖を次に、ｒｇｄｐ成分に融合した重鎮の非常に大きな集団と組合せ 、そしてｒｇｄｐの中でパッケージされることのできる核酸から発現されるであ ろう。課題の抗原に特異的な特異的結合性ペアー構成員を表示するｒｇｄｐにつ いての第２段階選別は、所望の特異性の抗体を形成するように予め選別した軽鎖 と結合することのできる重鎮の限定集団をもたらすであろう。

本技術は集団多様性の、より取扱い可能なレベルへの削減を可能とし、一方非常 に大量の組合せのサンプリングを可能とする。どの従来の技術もこれを成し遂げ ていない。これは非ヒト動物起源より単＃／精製した抗体のヒト化に有利に用い られうる。

下記の実施例はどのようにして実施されうるかの概念を例示する。

当業者はこれらのテーマの数多くの変更が満足たる結果をもたらすことを理解し ているであろう。下記は単に例示であって限定ではない。

実施例１：ファージｆｄ−ＤＯＧ−１によるファージミドの救済。

本実施例において、ファージミドを「救済Ｊするためにファージを利用する概念 （図２）を、キメラ抗体のモデルを用いて試験している。

一方の鎖は可溶性細胞周辺校タンパク質としてｐＬｌｃ１９．　ｐＵｃ１１９又 はｐ）ＩＥＮ−１の中で発現させ、そして相補鎖はｇ３融合体としてｆｄ−ＤＯ Ｇ−１上にクローンした。両鏡はｐＵｃ１９の中でクローンしたＦａｂフラグメ ントのモデルに由来し、その中でマウス抗−ｐｈＯｘ（２−フェニル−５−オキ サザロン）　ＮＯ１０，１２，５に由来する軽及び重鎖■領域ドメインはそれぞ れヒトＣ及びＣＩドメインに融合されている。通常は軽鎖と重鎮との間で共有連 結を形成するＣ末端システィン残基はこの構築体においては両方の定常ドメイン から除かれており、そしてこの特徴はその後の構築体においても維持される。鋳 型クローンの配列を図７に示す。

別々の要素として重鎮及び軽鎖をクローニングする手法を図８に示す；簡単に述 べると、これらの鎖を、フラグメントの末端上に適切な制限部位を含むプライマ ーで別々に増幅せしめる。これらのフラグメントを次にｐＨＥＮ−１及びｆｄ− ＤＯＧ−１の中へと両形態において、即ら、ファージ上に重鎮を、ファージミド 上に軽鎖を、そしてその逆においてクローンする。重鎮の５ｆｉｌ−Ｎｏロフラ グメントを、ｐ［Ｉｃ１９及びｐＵｃ１１９誘導体（これらはＥｃｏＲ［と旧ｎ ｄｌ［［部位との間のポリリンカーが図９に示す配列で置き代えられ、適合性Ｓ ｆｉ　Ｉ及びＮｏｔ１部位を含む）の中にもクローンした。これらのクローンを ｐＵｃＩ９／ｐｌＪｃ１１９　Ｓｆｉ　−Ｎｏｔ　ｐｏｌｙｍｙｃと呼ぶ。ｐｌ （ＥＮ−１クローンを、謹、ＩａＣＩ及び非サプレッサーであるＥ、コリ株１（ Ｂ２１５１に形質転換させてｐＨＥＮ−１におけるアンバーコドンを停止コドン として読まれるようにし、これによって細胞周辺腔へと輸送される可溶性鎖を作 った。

構築体の残りはＥ、コリＴＧＩに形質転換させた。

これらの細胞を次に、パートナ−鎖をｇ３融合として保有するｆｄ−ＤＯＧ−１ フアージで「救済コし、そして得られるファージ／ファージミド集団をＥＬＩＳ Ａでｐｈｏｘ構築についてアッセイした。

本実施例において、章ａ）〜ｇ）は、プラスミド、ファージミド及びオファージ クローンの調製を説明し、章ｉ）とｊ）はファージミド又はプラスミドを救済す るのにファージを利用する効果、及び抗体発現に及ぼす効果を示している。

ａ）重鎮と軽鎖のＰＣＲ増幅 ＰＣＲ増幅の鋳型としてプラスミドｐＵｃ１９　Ｆａｂ　ＮＱ　１０．１２．５ 　ＤＮＡを利用した。４種の個別のＰＣＲ反応を、下記の対の組合せについて設 定した（表１）： 重鎖　ｆｄ−ＤＯＧ−１７ｙ−ジ：　ＶＨＩＢＡＣＫＡＰＡとＦＡＢＮＯＴＦＯ Ｈ重ｔＪｆ　ｐ）ＩＥＮ−１７フージミｌ’　：　ＶＩＩＩＢＡＣＫＳＦＩとＦ ＡＢＮＯＴｌ’ＯＨ軽ＩＮ　ｆｄ−ＤＯＧ−１ファージ二　ＭνにＢＡＡＰＡと ＦＡＢＮＯＴＦＯＫ軽鎖　ｐＨＥＮ−１７ｙ−ジミド：　ＭＶＫＢＡＳＦＩとＦ ＡＢＮＯＴＦＯＫＰＣ１１反応物は、１０＋ｍＭのトリス−ＨＣＩ（ｐｌ（８， ３）、　５０５ＭのにＣ１，１，２５ｍＭの各ｄＮＴＰ、　２．５　ｍＭのＭｇ Ｃ１ｇ　、　０．０１％のゼラチン、０．１単位／μｌのＴａｑポリメラーゼ（ Ｃｅｔｕｓ／Ｐａｅｒｋｉｎ　Ｅｌｍｅｒ）＋　１ｍＭの多層プライマー及びｌ ｎｇの鋳型ＤＮＡを含んだ。Ｐｃｔ？はＴｅｃｈｎｅ　ＰＨＣ−２サーマルサイ クラ−（Ｔｅｃｈｎｅ、　Ｄｕｒｆｏｒｄ、　Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ＋　Ｕ、に、 ）で行い、９４°Ｃ１分、５０°Ｃで１分及び７２°Ｃで２分のサイクル２５回 を利用した。

ｂ　）　ＰＣＲフラグメントの消化 得られる生成物をＳａｍｂｒｏｏｋら（Ｓａｓｂｒｏｏｋ、　Ｊ、＋　Ｆｒ１ｔ ｓｃｈ、　Ｅ、Ｆ、とＭａｎｉａｔｉｓ、　Ｔ、　（１９９０）　’Ｍｏ１ｅｃ ｕｌａｒ　ｃｌｏｎｉｎｇ−ａ　１ａｂｏｒａｔｏｒｙ　請ｏｎｕａＪ　。

Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ＋　Ｎｅｗ　Ｙ ｏｒｋ）に記載の通りに１：１のフェノール：クロロホルムで抽出し、次いでエ タノール抽出し、そしてペレント化ＤＮＡを３５μｌの水の中に再溶解させた。

制限消化は通常、製造業者により推奨されている条件及び製造業者より供給され た緩衝液の中で、１００〜２００μｌの容量の中で０．３〜０．４単位の酵素／ μｌ　（添加酵素の容量は全反応容量の１７２０を超えないようにした）で実施 した。０．４単位／μｍのＮｏｔｌ酵素（ｎｅｗ　ＥｎｇｌａｎｄＢｉｏＬａｂ ｓ）による消化は、製造業者の仕様書に従って１５０μｌの容量の中で、製造業 者により供給された緩衝液の中で３７°Ｃで３ｈｒ行った。

この生成物をフェノール：クロロホルム抽出し、次いで更にもう一回エタノール 沈澱し、そしてＡｐａｌ　Ｉ又は５ｆｉｌのいづれかで消化した。ＶＨＣＨＩ　 Ａｐａ　Ｌｌ−Ｎｏｔ　ＩフラグメントのＡｐａ　Ｌｌ消化とは別に（下記参照 のこと）、製造業者の仕様書（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂ１１Ｌａｂｓ）に従 って１５０μｍの容量中で０．４単位／μ■の酵素を用い、そして製造業者によ り供給される緩衝液の中で消化を行った。Ａｐａ　Ｌ４消化は３７°Ｃで３ｈｒ 、５ｆｉｌは５０°Ｃで３ｈｒ行った。

ＶＨＣＨＩ　Ａｐａ　Ｌ［−Ｎｏｔ　ＩフラグメントのＡｐａ　Ｌｌ消化は内在 Ａｐａ　Ｌ１部位の存在下にある程度依存する。これは０．０４単位／μ■のの Ａｐａ　Ｌｌで１時間の消化により達せられ、そして全長フラグメントをアガロ ースゲルから単離した（下記参照）。

Ｃ）　ＤＮＡフラグメントの精製 反応生成物をエタノール沈殿させてその容量を小さくし、次いで調製用の２％の 低融点アガロース／ＴＡＥ（１−リスーアセテートＥＤＴＡゲル）上で流し、約 ７００ｂｐのハンドを切り出し、そしてｇｅｎｅｃｌｅａｎキットを用いて、そ の製造業者の仕様書（Ｂｉｏ　１０１＋　Ｌａ　Ｊｏｌｌａ。

Ｃａ１ｉｆｏｒｎｉａ、　ＩＪＳＡ）に従ってＤＮＡ　フラグメントを精製した 。ＤＮＡフラグメントをＴＥ　（ＩＯｍＭのトリス−ｔｌｃｌ（ｐＨ８，０）、 　０．１ｍＭのＥＤＴＡ　）の中に再ｇ４し、そして調製したベクター（章ｄと ｅ）にリゲートさせた。

ｄ）ベクターＤＮＡの調製 １０μｇの塩化セシウム精製化をｆｄ−ＤＯＧ−１を上記の通りにＡｐａ　Ｌｒ 及びＮｏｔ　ｌで消化した。１０μｇの塩化セシウム精製化ｐＬｌｃ１９　Ｓｆ ｉ／Ｎｏｔ、　ｐＵｃ１１９　Ｓｆｉ　／Ｎｏｔ及びｐＨＥＮ−Ｉ　ＤＮＡを、 上記のｂ）に記載と同一の条件を利用して、５４ｉ１及びＮｏｔｌで消化した。

消化及びエタノール沈殿の後、ベクターＤＮ＾を、製造業者（Ｂｏｅｈｒｉｎｇ ｅｒ　ＭａｎｈｅｉｍＬＩＫ　Ｌｔｄ、、　Ｂｅ１ｌ　Ｌａｎｅ＋　Ｌｅｗｅｓ ＋　Ｅａｓｔ　５ｕｓｓｅｘ、　ＥＮ７１ＬＧ）により推奨、且つ、ＩＯＸのス トックとして供給された緩衝液５０ＩＩｌの中で、３７°Ｃで３０分間、１単位 の牛小腸アルカリホスファターゼでホスファターゼ処理し、次いで更に１単位の 酵素を加え、そしてインキュベーションを繰り返した。次に４０μｌの水、１０ μｍの５ＴＥ（ＩＯＸのＳ、ＴＥは、１００ｍＭ　（７）　）　’Ｊ　ス−ＨＣ １，ｐＨ（８，０）、１　＋ｍＭ（７）ＮａＣＩ、　１０ｍＭ（７）ＥＤＴＡテ ある）及び５μｍの１０％のＳＤｓを加え、そしてこの混合物を６８°Ｃで２０ 分インキュベートしてこのホスファターゼを不活性化せしめた。この混合物を氷 上で短い間冷やし、そして１：１のフェノール：クロロボルムで２回抽出し、そ してＳａｍｂｒｏｏｋら（１９８９、前掲）に記載の通りにエタノール沈殿させ た。

ｅ）リゲーシゴン 下記のリゲーションを設定した： ｐ［Ｉｃ１９　Ｓｒｉ　Ｉ　−Ｎｏｔ　［＋Ｖ）ＩＣＨＩ　Ｓｆｉ　Ｉ　−Ｎｏ ｔ　１ｐＵｃ１１９　Ｓｆｉ　Ｉ　−Ｎｏ口　＋ＶＨＣＨＩ　Ｓｆｉ　Ｉ　−Ｎ ｏ口ｐＨＥＮ　Ｓｆｉ　Ｉ　−Ｎｏｔ　Ｉ　＋Ｖ）ＩｃＨＩ　Ｓｆｉ　Ｉ　−Ｎ ｏｔ　１ｐＨＥＮ　Ｓｆｉ　Ｔ　−Ｎｏｔ　Ｉ　＋ＶＬＣＬ　Ｓｆｉ　［−Ｎｏ ｔ　１ｆｄ−ＤＯＧ　Ａｐａ　Ｌｌ　−Ｎｏｔ　Ｉ　＋ＶＨＣＨＩ　Ａｐａ　Ｌ ｌ　−Ｎｏｔ　［（部分的に＾ｐａＬＩ） ｆｄ−ＤＯＧ　Ａｐａ　Ｌｌ　−Ｎｏｔ　Ｉ　＋ＶＬＣＬ　Ａｐａ　Ｌｌ　−Ｎ ｏｔ　１それぞれについて、下記のリゲーション反応を設定した：＊ｌＯ×のＮ ＥＢ−リゲーション緩衝液　１μＩ＊　水　６μｍ ＊消化ヘクター（３０ｎｇ／μｍ）　２μｍ＊消化ＰＣＲフラグメント（２０〜 ５０ｎｇ／　ｕ　Ｉ　）　’　１　ｕ　ｌ＊Ｔ４−ＤＮＡ　リガーゼ（４００単 位／μＩ、ＮＥＢ）を加えた。

３．２５°Ｃで２ｈｒ、そして１６°Ｃで一夜放置。

４、Ｅ、コリに形質転換（下記参照）。

１犬上　１０×のＮＥＢ−リゲーシぢン緩衝液は、０．５Ｍのトリス−１（ＣＩ 、　ｐＨ７，８，０，１ＭのＭｇＣｈ、０．２ＭのＤＴＴ、　１０ａ＋ＭのｒＡ ＴＰ及び５００μｇ／ｍｌのＢＳＡである。

ｆ　）　ＴＧＩ　又ハＨＢ　２１５１へのエレクトロボレーシゴン１、氷上のエ レクトロボレーシゴンーコンビテント細菌のバイヤルを融解する。ｐＨＥＮ１由 来の抗体フラグメントの可溶性発現のため、非サブレ・ノサー株ＨＢ２１５１を 用いた。他については、ＴＧＩを用いた。

２．５０μｌの細胞を、予め冷やしておいた０、２ｃ＋＊のキュベツト（Ｂｉｏ ｒａｄ）に移し、２μｌのリゲーション混合物を加え、底に到るまで振盪し、そ して氷上に１分間静止させた。

３、シーンパルサー（Ｂｉｏｒａｄ）を２５＃　Ｆ　、　２．５ｋＶで設定し、 パルスコントローラーを２００　ｏｈ蒙に設定した。

４、組織を有するキュヘットを乾かし、そしてエレクトロボレーシゴン槽に入れ た。

５、−回パルスを付する（これは４．５〜５　ｍ５ｅｃの定常時間でパルスをも たらすであろう）。

６、直ちに１１のＳＯＣ（新鮮）をキュベツトに加え、そして３７°Ｃでｌｈｒ 振盪する。

８、ｐＨＥＮ及びｐＵＣレプリコンについては、１００μｇ／ｍｌのアンピシリ ン、１％のグルコースを含む２ＹＴアガープレート上に、そしてｆｄ−ＤＯＧに ついては１５ｇｇ／ｍｌのテトラサイクリンを含む２ＹＴアガープレート上に一 部をプレートした。

Ｕ↓：　ＳＯＢは１リツトル中の２０８のＢａｃｔｏ−）リプトン、５ｇの酵母 抽出物及び０．５ｇのＮａＣｌである。

ＳＯＣは１０１００Ｏ当り５ｓｌの２０％のグルコース、１ｓｌのＩＭのＭｇＣ １，および１−１のＩＭのＭｇＳＯ４が加えられたＳＯＢである。

２Ｙは１リツトル中の２０ｇの１３ａｃｔｏ−）リプトン、１０ｇの酵母抽出物 及び５ｇのＮａＣ１である。

備考２：　形質転換効率を高めるため、リゲーション混合物中のＤＮＡは、フェ ノール、フェノールクロロホルム及びエーテルで抽出し、エタノール沈殿させ、 そして水の中で再懸濁させることによって精製できる。他方、サンプルをｇｅｎ ｅｃｌｅａｎ（Ｂｉｏ　１０１）を用いて清浄することができる。この精製工程 を含ませると効率は１０〜１００倍になる。

所望のクローンを、これらのフラグメントをクローンするのに用いたプライマー を用いるＰＣＨによりスクリーンし、そしてその同一性をＤＮＡ配列分析によっ て確認した１次に感染性粒子をこれらのクローンから作った（下記参照）。

ｇ　）　ｆｄ−ＤＯｃ感染性ファージ粒子の調製１、ｆｄ−ＤＯＧを含む細菌の コロニーを、１５ｇｇ／剛■のテトラサイクリンを含む２ＹＴ培地に接種する。

３７゛Ｃで２０〜２４ｈｒ振盪させて増殖させる。ファージ粒子の収率は約１０ ”ＴＩＪ　（形質導入単位−下記参照）／上清液ｍｌであろう。

２、８．０００ｒｐ清で１０分（又は４．００Ｏｒｐｍで２０分）遠心。

３、上清液に、１１５容量のＰＥＧ／ＮａＣ１（２０％のＰＥ６６０００．２． ５ｓｌＭのＮａＣＩ）を加え、４℃でＩｈｒ放置する。８．００Ｏｒｐｍで１５ 分（又は４．００Ｏｒｐｍで３０分）遠心。

４、少量の水にベレットを再懸濁し、そしてエッペンドルフチューブに入れる。

５、残留細胞を全て遠心する（マイクロ遠心機で５分）。

５、上清液に、１１５容量のＰＥＧ／ＮａＣｌを加える。

６、上清液を取り出し、このベレットを短い間遠心する。

７、残留ＰＥＧをアスピレート除去する。

８、ベレットを水に再懸濁しく梅雨物のもとの容量の１７１００）、そしてマイ クロ遠心機で２分間再遠心して、残留細菌及び凝集ファージを除去する。０．４ ５μｍの除菌フィルター（Ｍｉｎｉｓａｒｔ　ＮＭＲ；５ａｒｔｏｒｉｕｓ）で 濾過する。

９、濾液を４°Ｃで保存。ファージの濃度は約１０”Ｔｔ１ｍド１にすべきであ る。

ｈ）感染実験 ｐＨＥＮ−１を感染するためにｆｄ−ＤＯＧファージを用いる予備実験は、これ らの２つのベクターの間で干渉があることを示唆し、なぜならそれらは共に、同 一の複製のしくみについての競合を起こさせるフィラメント状フ１−ジ遺伝子間 領域を保有するからである。下記の実験がこれを証明する。

形質転換しティない、又はｐＬＩｃ１９．　ｐＵｃ１１９．　ｐＵｃ１９　ＮＱ 　１０．１２．５キメラシＨＣ旧及びｐＵｃ１１９　ＮＧ１１０．１２．５キ／ 　ラＶＨｃＨ１を有するいづれかのＴＧＩ細胞を、ＴＧＩに対する抗生物質なし で、又は組換体のための１１００ｔＩ／ｍｌのアンピリジン及び１％のグルコー スを含む２ＹＴ培地の中で３７°Ｃにて、中期対数期となるまで増殖させた。次 にこれらの培養物を、およそＯ，Ｄ、６ＱＯ１，０＝５．１０”　：＋　ｏ　ニ ー形成単位（ｃｆｕ／ｍｌ）を利用して約ｉｏ”細胞／　ｍ　ｌとなるように希 釈し、次いでｆｄ−ＤＯＧファージを３．１０”のテトラサイクリン耐性形質導 入単位（ＴＵ　ｉ　ＴＧＩでアッセイ）７ｓｌとなるように加えた。３７°Ｃで ３０分インキユヘーションした後、この希釈物を１５ｇｇ／ｍｌのテトラサイク リン及び１％のグルコースを含む２ＹＴアガー上でプレートし、そして３７°Ｃ で一夜インキュベートして、有効な感染現象の数（＝ｔｅｔｒコロニーの数）を 得た。この結果を図１０でグラフで示す。ｆｄ−ＤＯＧファージをＴＧＩ細胞又 はｐＵｃ１９を含むＴＧＩ細胞に感染させたときに力価に若干の相違があった。

力価は投入細胞数に相当する（なぜなら、この実験においてファージは過剰であ るからである）。しかしながら、宿主細胞がｐＨｃ１１９　（又はｐＨｃ１１９ に基づく全てのベクター）を含むとき、健全なｔｅｔ　’コロニー（径２〜３Ｉ ＩＩＩ）の数は約１００分の１に下がり、そして草大な数の小さなコロニー（径 ０．３〜０．５ａｎ）が存在した。このような小さなコロニーはテトラサイクリ ンを有する液体培地の中では増殖せず、そして小さい十大きいコロニーの数が投 入細胞数に等しいため、ファージが樹立しない感染現象があるものと信じられる 。

ｐＵｃ１９又はｐＬｌｃ１１９における抗体の重鎮の存在はｆｄ−ＤＯＧにより 感染した後のｔｅｔ　’コロニーの収率への影響は小さかった。類似の干渉が、 ＭＩ３で　ｆｄ−ＤＯＧを置き換え、そして有効な感染現象数をプラーク数でア ッセイしたときにも見られた。ファージの表層上で機能性抗体が回復する能力を 試験した一下記の章ｉ及びｊ。

！　）　Ｆａｂファージの救済 下記の救済を設定した：全での鎖はＮＯ１０，１２，５キメラとした：ｐＵｃＩ ９重１！ｆ　Ｘ　ｆｄ−ＤＯＧ−軽鎖ｐＵｃ１１９重鎖Ｘ　ｒｄ−ｏｏｃ−軽鎖 ｐｉ（ＥＮ　重鎖　Ｘ　ｆｄ−ＤＯＧ−軽鎖ｐ）ＩＥＮ　軽鎖　Ｘ　ｆｄ−ＤＯ Ｇ−重鎖ｐｌ（ＥＮ　ｕ鎖　Ｘ　ｆｄ−［１０Ｇ−軽鎖ｐＨＥＮ　重＃ｉ　Ｘ　 ｆｄ−１）ＯＧ−重鎖２本のＦａｂ鎖のうちの一方を有するプラスミド／ファー ジミドを含む宿主細胞（ｐＨＥＮ−１についてはＨＢ２１５１．　ｐＵＣについ てはＴＧＩ）を、１００μｇ／ｍｌのアンピシリン及び１％のグルコースを含む ２ＹＴ　（２ＹＴＡＧ）の中で３７°Ｃで一夜増殖させた。グルコースはＩａｃ プロモーターを抑制して、抗体遺伝子の発現率を下げるために用いている。定常 期培養物を５０１のポリプロピレンチューブ（Ｆａｌｃｏｎ）の中で１０ｍ１の 新鮮な２ＹＴＡＧの中に１：１００に希釈し、そして３７℃で０．５の０．０． ６００となるまで増殖させ、次いでｇ３融合体としての重又は軽鎖遺伝子のいづ れかを含む１ｆｄ−ＤＯＧファージを１．１０”　７０７ｍ１（７）最終濃度と なるまで加えた。これらの培養物を３７℃で３０分、振盪せずにインキュベート し、次いで更に３０分迅速に振盪させてインキュベートした。次に細胞を４，０ ００　ｘ　ｇで４°Ｃで２０分間遠心し、このチューブを水抜きし、そしてこれ らの細胞を１００μｇ／ｍｌのテトラサイタリンを含む新鮮な２Ｙ１０ｍｌに再 懸濁せしめ（グルコースなし→誘発）、次いで強く攪拌しなから３７°Ｃで一夜 増殖させた。

翌日、細胞を４，０００ｇで２０分間、４°Ｃでの遠心によりペレット化し、そ してその上清液をＥＬＩＳ＾により機能性抗体の存在についてア１、プレート（ Ｆａｌｃｏｎ　３９１２）をウェル当り、ＰＢＳ中の１０ｇｇ／ｌｌｌのｐｈＯ Ｘ−ＢＳＡ　（１４：　１　ｉｉｆ換）１００μｌでコートした。室温で一夜放 置。

２、ウェルをＰＢＳで３回洗い、ウェル当り２００μ＋の２％のＭａｒｖｅｌ／ ＰＢＳで３７゛Ｃで２ｈｒブロツクする。

３、ウェルをＰＢＳで３回洗い、次いで２５μ＋の１０％のＭａｒｖｅｌ　／　 ＰＢＳを全てのウェルに加える。

４、適宜のウェルに１００μｌの培養上清液を加える。混合し、室温で２ｈｒ放 置する。

５、ウェルをＰＢＳ、　０１０５％のツイーン２０で３回、そしてＰＢＳで３回 洗う。２％のＭａｒｖｅｌ　／　ＰＢＳの中に１　：　１０００で希釈した１０ ０μｌのヒツジ抗−Ｍ１３抗血清を各ウェルに加える。室温で１．５ｈｒインキ ユベートする。

６、ウェルをＰＢＳ、　０．０５％のツイーン２０で３回、次いでＰＢＳで３回 洗う。抗ヒツジＩｇＧ（ベルオキシダーゼコンジュゲート化、Ｓｉｇｍａ）の１ ：５０００の希釈物１００μｍを分注する。室温で１．５ｈｒインキユベートす る。

７、第２抗体を捨て、そしてＰＢＳ、　０．０５％のツイーン２０で３回、次い でＰＢＳで３回洗う。

８、　ｌｏｎｇのＡＢＴＳ（２，２’　−アジン　ビス（３−エチルヘンズチア ジンンー６−スルホン酸）＝アンモニウム塩）錠剤−錠を２０−１の５０１のク エン酸緩衝液＄１）１４．５に加える（５抛りのクエン酸緩衝液、　ａｌ１４． ５は、等容量の５抛Ｍのクエン酸三ナトリウムと５抛Ｈのクエン酸を混ぜ合わせ ることにより作る）。

９、上記の溶液を分注する直前に３０％の過酸化水素２０μｌを加える。

１０、各ウェルに上記の溶液１００μｌを加える。室温で３０分放置。

１１、５０μＩの３．２ｓｇ／ｍｌのフッ化ナトリウムを加えることによりクエ ンチする。　４５０ｎｍで測定する。

遁考上工　’Ｍａｒｖｅｌ　Ｊはドライミルク粉末である。　ＰＢＳは１リツト ル中の５．８４ｇのＮａＣｌ、　４．７２　ｇのＮａ、ＨＰＯａ及び２．６４　 ｇのＮａＨｚＰＯａ　・２ＬＯ１ｐＨ７，２である。

結果を図１１に示し、ここで、常在性レプリコンがプラスミド又はファージミド であるかは、相補鎖を抱えるｆｄ−ＤＯＧにより救済される抗体の量に有意な影 響を及ぼすことが認められうる。軽鎖を保有するｆｄ−ＤＯＧで救済したときの ｐｌＪｃ１９上に重鎖を保有する細胞から発生するシグナルは、ｐＵｃ１１９上 にこの鎖を保有する細胞からのそれの約１０倍である。ｐＨＥＮは、重鎮をｐＨ ＥＮにおいて発現させ、そして軽鎖がｆｄ−ＤＯＧ上のとき、及びその逆におい て、ｐＵｃ１１９に類似の結果を提供する。弱いながらも、このシグナルは特異 的であり、なぜなら入り込むファージがｐＨＥＮ上のものと同じ鎖を有するとき 抗体は全く作られないからである。明らかに、相補鎖を保有するファージミドを 救済するために一方の鎖を保有するファージを利用することは有効であり、しか もこの系は干渉を軽減するようファージ又はファージミドを操作することにとっ て好都合であろう。それに代わる方法は、プラスミドヘクターをファージと一緒 に利用することにあり、これは２本の鎖のうちの一本のみの選別をもたらす、か かる手法は実施例２に用いている。

実施例２：多重順列組合せライブラリ一本例において、ヒトＶＨレバートリーを 、ＩｇＧ１のヒトＣＨＩ　ドメイン（Ｃｒｌドメイン）を保有するｆｄ−ＤＯＧ にクローンする。軽鎖のレパートリ−をｐｔｌｃ１９　Ｓｆｉ　／Ｎｏｔ　／ｐ ｏｌｙｍｙｃプラスミドの中にＳｆｉ／Ｎｏｔフラグメントとしてクローンし、 そしてそれとは別にｐ）ＩＥＮファージミドの中に、一方の末端においてＳｆｉ 部位により、そして他方においてＡｓｃ及びＮｏｔ部位によりフランクされてク ローンした。

Ｉｄ−ＤＯＧ重鎖ファージをｐｔｌｃ１９軽鎖を「救済」するために用い、そし て得られるファージを抗原により選別した。これにより縮小した重鎮の集団を次 に、Ａｓｃ　Ｉ及びＮｏｔ１部位を含むプライマーでＰＣＲ増幅し、そしてこれ らのフラグメントをｐ）ＩＥＮプラスミドにおける選別していない軽鎖に沿って クローンした。重鎖についての遺伝子はこれにより同一のレプリコン上にあり、 そしてヘルパーファージによる救済を経て抗原により同時に選別されうる。

本実施例において用いたＶ）ＩドメインはＩｇＭに由来するが、しかしＣ−末端 システィンを有さないＩｇＧ１　ｆｄ（即ち、Ｖ）ＩｃＨＩ）フラグメントとし てクローンした。

下記の選別ａ及びｂは、天然＾ρａＬ１部位の除去したヒトＣｒ１ド及び軽鎖の レパートリ−の調製を包括する。章ｒは特異的な抗体フラグメントを単離するの にどのようにしてこれらのレパートリ−が利用できるかを説明している。

ａ　）　Ｃ）ＩＩのΔＡｐａ　Ｌｌバージョンの構築ＣＨＩのΔＡｐａ　Ｌｌバ ージョンの構築をここで説明する。この構築は若干複雑であり、なぜなら第一目 的は新規のファージミドクローニングヘクターの構築にあり、そして（４１１に おけるＡｐａ　Ｌｒ部位の除去はこの手順における一工程にすぎないからである 。　Ｃ）ＩＩのΔ＾ｐａ　Ｌｌバージジンを含む新しいファージミドを次の章で 鋳型として用いた。

ヒトＣＴ１ドメインにおける天然のＡｐａ　Ｌｒ部位は、Ａｐａ　Ｌｒ部位の周 辺と重復し、且つ、この配列をＧＴＧＧＡＣからＧＴＧＧＡＣへと変える部分相 補性オリゴヌクレオチドを用いるｒ　ＰＣＲ突然変異誘発」により欠失される。

２通りのＰＣＢ反応を実施し、そして２本のフラグメントを重複伸長によって第 ２　ＰＣＲスプライシングにおいて連結させた。

２通り（７）ＰＣＲ反応は、ＡＰＡＯＵＴＦＯＲニ関しテＲＪＨＸ）ＩＯＢＡＣ Ｋを用い、そして１ｌｔｌＧ　［ＣＹＳＡＳＣＮＯＴＦＯＲニ関してはＡＰＡＯ ｌｌＴＢＡＩＪを用いて実施例１の通りに設定した。鋳型はｐＵｃ１９　Ｆａｂ 　０１．３としたーこの抗リゾチームＦａｂは、実施例１に記載のｐＵｃ１９　 Ｆａｂ　ＮＱ　１０．１２．５と同じヒトＩｇＧ　ＣＩ（１ドメインを有する。

ＰＣＲ条件は実施例１に記載の通りであるが、ただしアニーリング温度は５５゛ Ｃとし、そして伸長は７２℃で１分とした。

得られるフラグメントを集成のために下記の通りに精製した＝１、集成ＰＣＲに ついての小さなフラグメントを単離するため、ＰＣＲ混合物を１本のチューブに 集め、そして２％のＬＧＴ　（低ゲル化温度）のアガロースゲル上でＴＢＥ　Ｉ Ｉ衝液を用いて電気泳動した。

２、これらのフラグメントを５ＰＩＮ−Ｘカラム（Ｃｏｓｔａｒ）を用いて精製 した。

３、ゲルスプライスを５ＰＩＮ−Ｘカラムのカートリッジに載せ、そしてドライ アイスでｔｏ−１５分凍結した。

４、チューブを融解し、そして凍結工程を繰り返した（任意的）。

５．マイクロ遠心機で１５〜３０分遠心した（約１３．００Ｏｒｐｍ）。

６．１／１０容量の３Ｍの酢酸ナトリウムｐＨ５，２及び２．５容量のエタノー ルを加えて濾液を沈殿させた。

７、ドライアイス上で１５分冷やし、１３．００Ｏｒ、ｐ、ｍ、で４°Ｃで１０ 分遠心した。

８、ペレントを１ｍｌの７０％のエタノールで洗い、そして真空で乾かした。

ｑ、ｔｍ製リンカ−を５０μｍのオリジナルＰＣＲ当り５μｍの水又はＴＨの中 で希釈し、そしてゲル上の濃度を測定した。

次にこれらのフラグメントをＰＣＲにより凍結させた。５０μＩのＰＣＲ反応物 は前記した通りであり、これは５μｌの各フラグメントを含むがプライマーは含 まない。反応は９５°Ｃで５分保ち、次いで９４°Ｃで１分、６８°Ｃで１分及 び７２°Ｃで１分を数回繰り返した。フランクするＲＪ）ＩＸＩＩＯＢＡＣＫ及 びＨｌｌＧＩＣＹＳＡＳＣＮＯＴＦＯＨ−ＩＪゴヌクレオチドを次に油ノモとで 加え、そして同一の条件を利用して反応を更に１０回サイクルにかけ、適切に集 成した分子を増幅させた０反応生成物をフエトル抽出し、次いでエタノール沈殿 し、そしてＸｈｏ　Ｉ及びＡｓｃ　Ｉで消化し、次いでゲル精製した（全て標準 条件下で）。　゛ｇｎＴリーダー全体とｆｄ−ＤＯＧのポリリンカーを含む第２ フラグメントで増幅させた。ｆｄ−ＤＯＧ　ＤＮＡをプライ７−Ｇ３ＬＡＳＣＧ ＴＧＢＡＣＫ及びｆｄｓｅｑで増幅させ、Ａｓｃ　Ｉ及びＮｏＬＩで切り、そし てゲル精製した（全て実施例Ｉに記載の通り）。

３通りのリゲーションを、当モル置のＸｈｏ　［−Ｎｏｔ−切断ｐＨＥＮＤＮＡ 、　Ｘｈｏ　Ｉ　−Ａｓｃ　ｒ−切断ＣＴ１フラグメント、及びＡｓｃ　Ｉ　− Ｎｏロー切断ｇｍリーダー＋ポリリンカーフラグメントを用いて設定した。

得られる混合物を実施例１に記載の通りにＴＧＩに形質転換せしめ、そして次の 構造：　ｐＨＥＮ−ｐｅｌＢ　’）−ダー／　Ｓｆｉ　Ｉ　／　Ｎｃｏ　Ｉ　／ 　Ｘｈｏ　Ｉ　−Ｃｙ　ｌ　−Ａｓｃｌ／ｇＩ［ＩリーダーＡｐａ　Ｌｌ　−Ｎ ｏｔ　Ｉ　／　ｇ　ｍを有するクローンをアルカリ溶解ミプレップ及び制限酵素 分析（Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）前掲）により同定した。保全性をＤＮＡ シーケンシング（Ｓａｓｂｒｏｏｋら（１９８９）前掲）で評価し、そして内在 型Ａｐａ　Ｌ１部位の除去されたＣγｌドメインを保有する代表クローンをｐＪ ＩＭ　ＣγＩｇｌＩ［Ｌと呼んだ。

ｂ　）　ｆｄ　ＤＯＧへのＣＨＩ　ドメインの挿入ＣＨＩのΔＡｐａ　Ｌｌバー ジョンをここでは、Ａｐａ　ＬＩ部位を欠＜　ＣＨＩ　ドメインを含むｆｄ−Ｄ ＯＧ誘導体の構築のための鋳型として用いた。この構築において、通常軽鎖とジ スルフィド結合を形成するＣ末端システィン残基をＦＡＢＮＯＴＦＯ）ｌプライ マーを用いてＰＣＩＩによってセリンに換えた。このベクターはここで、Ａｐａ 　Ｌｌ　−Ｓａｌ　ＩフラグメントとしてＶＨドメインのレパートリ−のクロー ニングのために適切である。

５００ｎｇのｐＪ［ＭｃｒｒｇＩ［ｌＬ鋳型ＯＮ八へ、実施例１に記載の条件で 、Ａｐａ　Ｌｌ及びＮｏｔ１部位をもたらすプライマーＦＤＧＡ阿ＩＢＡＡＰＡ 及びＦＡＢＮＯＴＦＯＨを用いて５０μＩの反応体の中でＰＣＲ増幅させた。

ＦＡＢＮＯＴＦＯＨプライマーはＣ末端システィンを除去もする。次に約３００ ｂｐのＰＣＲフラグメントを加工し、そして実施例１に記載の条件を用いてＡｐ ａ　Ｌｌ及びＮｏｔ［で消化した。Ａｐａ　Ｌｌ　−Ｎｏｔ　Ｉフラグメントを 次に、実施例１に記載の実験のために調製したＡｐａ　Ｌｌ及びＮｏｔｌ−切断 ｆｄ−ＤＯＧ　ＤＮＡの調製物にクローンし、そして同じ手順を利用してＴＧＩ の中へとりゲート及び形質転換させた。

プライマーｆｄｓｅｑ（表１）を用いて通常の方法（実施例１）で調製したフィ ラメント状粒子から単離した一本鎖ＤＮＡのヘクターの配列を、ＤＮＡ　シーケ ンシング（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９、前掲）によりｎ認した。このヘクタ ーを次にＣｓＣｌ−精製しくＳａｍｂｒｏｏｋら、１９８９、前掲）、そしてＡ ｐａ　Ｌｌ及び５ａｌｌで切った。両酵素共Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　ＢｉｏＬ ａｂｓに由来し、そして０．４単位の酵素／μｍを利用する次の消化は製造業者 より供される緩衝液の中で３７℃で実施した（実施例１参照のこと）。

ｃ　）　ｃＤＮ＾鋳型の調製 約１０”のＢリンパ球を含む血液５００１を２人の健康なボランティアから獲得 した。白血球をフィコールで分離し、そしてＤＮＡを改良方法（Ｃａｔｈａｌａ 、　Ｇ、＋　Ｊ、　５ａｖｏｕｒｅｔ、　Ｂ、　Ｍｅｎｄｅｚ、　Ｂ、Ｌ、　Ｗ ｅｓｒ、　Ｍ。

にａｒｉｎ、　Ｊ、Ａ、　Ｍａｒｔｉａｌ　とＪ、Ｄ、　Ｂａｘｔｅｒ　（１９ ８３）　’＾ｍｅｔｈｏｄ　ｆｏｒｉｓｏｌａｔｉｏｎ　ｏｆ　１ｎｔａｃｔ、 　ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌｌｙ　ａｃｔｉｖｅ　ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｉ ｃａｃｉｃＪ　ＤＮＡ　２．３２９）を利用して調製した。３本の第−鎖ｃＤＮ へ合成体は、Ｍａｒｋｓ　ら（１９９１、前掲）に記載の通りに、２．５Ｘ１０ ’のＢ細胞に対応するｌ？ＮＡから、重鎮に関してはＩｇＭ定常令頁域プライマ ーを、そして軽鎖に関してはχ又はλ定常領域プライマーを用いて作製した（表 １）。

ｄ）重鎮のＰＣＲ ＰＣＲ増輻ＶＨ遺伝子の２種の調製品を作った。両方の調製はＨＩＩＪＨＦＯＲ プライマー（表１）の当モル混合物を利用する；調製品の一方において、Ｈｔｌ νＩＩＢＡｃＫプライマーそれぞれを用いて６通りの個別のＰＣＲ増幅を行い（ 表１）、そして他方においては、全ての６Ｈ［ＩＶＨＢＡＣＫプライマーの当モ ル混合物を用いて単独のＰＣＲ反応を行った。７種のＰＣＲ全てに関して、５０ μｍの反応混合物を調製し、これは、ＨＵ［ＧＭＦＯＲプライマーを用いるｃＤ Ｎ八合へに由来する上清液５０μＩ、総濃度２０ｐｍｏｌの後退プライマー、総 濃度２０ｐｍｏ　ｌの前進プライマー、２５０νＭのｄＮＴＰ、ｌ０ｍＭのＫＣ Ｉ、ｌ０ｍＭの（ＮＨａ）ｚＳＯａ、２０ｍＭのトリスＨＣＩ（ｐＨ８，８）　 。

２．０１のＭｇＣｈ、　１００ｍｇ／ｍｌのＢＳＡ及び１μｌ（１単位）のＶｅ ｎｔ　ＤＮＡポリメラーゼ（Ｎｅ智Ｅｎｇｌａｎｄ　ＢｉｏＬａｂｓ）を含んだ 。この反応混合物に鉱物（パラフィン）油を載せ、そしてＴｅｃｈｎｅ　ＰＨＣ −２サーマルサイクラ−を用いて３０サイクルの増幅にがけた。サイクルは９４ °Ｃで１分（変性）、５７°Ｃで１分（アニーリング）及び７２゛ｃで１分（伸 長）とした。この生成物を１．５％のアガロースゲルで精製し、Ｇｅｎｅｃｌｅ ａｎ（Ｂｉｏ−１０１）でゲルから単離し、そして２５μｍの■２ｏに再懸濁さ せた。

７種の生成物を次にプールし、そしてＡｐａ　Ｌｌと５ａｉｌ制限部位を連結さ せるために［プルスルー（ｐｕｌｌｔｈｒｏｕｇｈ）　Ｊ　ＰＣＲ反応を行った 。

プルスルー反応はプライマー）＋１１ＶＨＢＡＡＰＡ　（６種のプライマーの当 モル混合物）及び）ＩＵＪＨＦＯＲｓＡＬ　（４種のプライマーの当モル混合物 ）で設定した。先の工程に由来するプールＰＣＲ生成物５μｌを含む反応物５０ μＩを先のＰＣＲと同じ条件、ただし２５サイクルの増幅を利用して増幅させた 。得られるフラグメントをＡｐａ　Ｌｌ及び５ａｉｌで消化し、ゲル精製し、そ してこれらのフラグメントを先に記載のＡｐａ　Ｌｌ及びＳａｌ　ｌ−切断ｆｄ −ＤＯＧ　ＣＨＩにリゲートさせた。このリゲーション混合物をＴＧＩ細胞への エレクトロポレーションの前にフェノール−クロロホルム抽出した（実施例１） 。形質転換細胞のアリコートを、１５ｍｇ／＋＊ｌのテトラサイクリンを付与し た２ＹＴアガー上にプレートし、ソシて３７°Ｃで一夜増殖させた。

ｅ）軽鎖のＰＣＲ に及びλ−鎖を別々に、適当な科をヘースとする後退及び前進プライマー（表１ ）の当モル混合物を用いて増殖させた。に−鎖遺伝子をｃＤＮ八合へ体より、） ＩＵＣＫＦＯＲプライマーを用いて、６本の８１１νにＢＡＣＫＩａ−６ａプラ イマーとＨＵＣＫＦＯＲ３ＥＲプライマーとの当モル混合物を用いて、増殖させ た。λ鎖をｃＤＮＡ合成体より、ＨＩＩＣＬＦＯＲプライマーを用いて増殖させ 、そして７本のＨＵＬＢＡＣＫ　１−６プライマーとＩＩＵｃＬＦＯＲｓＥＲプ ライマーとの当モル混合物を用いて増幅させた。各ケースにおいて、５０μｌの 反応混合物を作り、これは適当なｃＤＮＡ合成体由来の上清液５０μＩ、総濃度 ２０ｐｍｏｌの後退プライマー、総濃度２０ｐｍｏｌの前進プライマー、２５０ μＭのｄＮＴＰ、　１０ｍＨのＭＣ１，ｌ抛ｉの（ＮＨ，）２ＳＯ４，２０１１ Ｍのトリス−ｔｌｃＩ（ｐＨ８，８）、　２．０ｓＭのＭｇＣｂ＋　１００ｍｇ ／＋＋ｌのＢＳ＾及び１μｌ（１単位）のＶｅｎｔ　ＤＮＡポリメラーゼ（Ｎｅ ｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　ＢｉｏＬａｂｓ）を含んだ。この反応混合物に鉱物（パラ フィン）油を載せ、そしてＴｅｃｈｎｅサーマルサイクラ−を用いて３０サイク ルの増幅にかけた。サイクルは９４°Ｃで１分（変性）、５７°Ｃで１分（アニ ーリング）及び７２°Ｃで２．５分（伸長）とした。この生成物を２％のアガロ ースゲル上で精製し、Ｇｅｎｅｃｌｅａｎ　（Ｂｉｏ　１０１）によりゲルから 単離し、そして２５μｍの）ｌｚｏに再懸濁させた。

２種類の異なるプルスルー反応を２本の軽鎖調製物それぞれについて実施した。

に鎖遺伝子は２通りの反応において、６本のＨＵＶＫＢＡＳＦＩ　プライマーと 、ＨＵＣＦＯＲ３ＥＲＡＳＣＮＯＴ又はＨＵＣＫＦＯＲ５ＥＲＮＯＴのいづれか との当モル混合物を用いて増幅させた。λ鎖遺伝子も２通りの反応において、７ 本のＨＵＶＬＢＡＳＦＩ　プライマーと、ＨＵＣＬＦＯＲ５εＲＡＳＣＮＯＴ又 はＨＵＣＬＦＯＲ５ＥＲＩＩＯＴのいづれかとの当モル混合物を用いて増幅させ た。プルスルー条件は上記の第一軽鎖ＰＣＲと同じようにしたが、ただし２５サ イクルの増幅を利用した。４種のＰＣＲ生成物全てを先に用いたのと同し条件（ 実施例１及び上記）を用いてＮｃｏ　Ｉ及びＮｏＬＩで消化した。５ＥＲＡＳＣ ＮＯＴ前進プライマーで増幅したこれらのχ及びλ−鎖遺伝子をＮｃｏ　ｒ　− Ｎｏｔ　ｌ−切断ｐＨＥＮ−１ヘクター（標準方式を用いて調製）に挿入した； 　５ＥＲＮＯＴ前進プライマーを用いて増幅させたものは、Ｎｃｏ　Ｉ−Ｎｏｔ 　Ｉ−切断ｐＵｃ１９　Ｓｆｉ／Ｎｃｏ　／　Ｎｏｔ　／　ｐｏｌｙｍｙｃに挿 入した。両レパートリ−を実施例Ｉと同し方法でＴＧＩ　にエレクトロポレーシ ョンした。このリゲーション混合物をフェノール抽出により精製し、そしてエタ ノール沈殿させた。

リゲートしたＤＮＡを１０μＩの水に再懸濁し、そして２．５μｍのサンプルを ５０μｍのＥ、コリＴＧＩ　にエレクトロボレートした。細胞を１−１のＳＯＣ の中でｌｈｒ増幅させ、次いで２４３　Ｘ　２４３ｍ−の皿（Ｎｕｎｃ）中の１ ００μｇ／ｍｌのアンピシリン及び１％のグルコースを有する３ＹＴアガープレ ート（２ＹＴＡＧ）上にプレートシた。コロニーをこのプレートからかき取って １０Ｉｌｌの２ＹＴＡＧ及び１５％のグリセロールの中に入れ、ライブラリ一本 実施例として一７０°Ｃで保存した。

ｒ）抗体フラグメントの選別 章ａ）〜ｅ）の最終結果は２種類の軽鎖ライブラリー及び１種の重鎮ライブラリ ーの構築にある。この軽鎖ライブラリー（ＶＬＣＬ）をｐＨＥＮ−１及びｐＵｃ １９５ｆｉ−Ｎｏｔ　ｐｏｌｙｓ＋ｙｃの両者の中にＮｃｏ　Ｔ　−Ｎｏｔ　Ｉ フラグメントとしてクローンした。ＶＨ遺伝子は、天然の＾ｐａ　Ｌ１部位を除 去しであるＩ＝　）ＣＨＩ（Ｃｒ　１　）　ｌ’／インを含むｆｄ−ＤＯＧ（ｆ ｄ−ＤＯＧ　ＧＩＣＨＩ）の中にＡｐａ　Ｌｌ　−Ｓａｌ　Ｉフラグメントとし てクローンした。

このプロセスをここで図１３において図式的に説明する。ｐＵｃ１９重鎖ライブ ラリーを、重鎖ｆｄ−ＤＯＧライブラリー、並びに表層上に作られた重鎮と軽鎖 との組合せを抱えるｆｄファージで感染せしめた。これらのファージを抗原で選 別しく軽鎖ライブラリーの再感染が任意的な再選別の段階により）、そして選別 した重鎮遺伝子をプライマーＧ３ＬＡＳＣＧＴＧＢＡＣＫ及びｆｄｓｅｑを用い るＰＣＲによりファージゲノムから増幅させた。

Ｇ３ＬＡＳＣＧＴＧＢＡＣＫプライマーは天然ｇ３シグナル配列の開始の上流の ｆｄ　ＤＮＡにアニールし、そして固有の＾ｓｃ１部位及びリポソーム結合部位 （ＲＢＳ）をもたらす。ｆｄｓｅｑはＣγ１ドメインにフランクするＮｏｔ１部 位の下流のｇ３の構造部位の５′末端（即ち、シグナル配列の切断部位の下流） にアニールする。従ってＰＣＲフラグメントは：Ａｓｃ　Ｉ　−ＲＢＳ　−ｇ　 ３　リーダー−ＶＨＣＨＩ　−Ｎｏｔ　Ｉを含む。これらのフラグメントを＾５ ｃｌ−ＮｏｔｌフラグメントとしてｐＨＥＮ−１軽鎖ライブラリーの中にクロー ンすると、重鎖はｐｕＥｉｉ−１のｇ３に融合し、そしてＮｏｔ１部位にはｍｙ ｃ　ｔａｇ及びアンバーコドンがフランクする。

ｓｕｐ　Ｅ株におけるこれらの組換より生成したファージミド粒子はその表層上 に重鎮及び軽鎖を抱えるだけでなく、それらは重鎮及び軽鎖の両方をコードする 遺伝子をも含む。１又は複数回の抗原による選別は機能的な重鎮及び軽鎖の組合 せの単離をもたらすであろう。

これらのクローンは次に、ファージミドを非すプレッサー株、例えば）ＩＢ２１ ５１の中に導入する際に、可溶性フラグメントとして抗原結合性についてスクリ ーンされうる。効率的な選別プロセスが本実施例において極めて有利であろう。

実施例３：可溶性順列組合せライブラリ一本実施例において、軽鎖か、又は重鎖 のｆｄフラグメント（即ち、Ｖｌ（ＣＨＩ）のいづれかが、ファージ粒子上で発 現し、そして相補鎖は可溶性フラグメントとして供される。混合物を部分的に変 性させ、鎖は分離するがドメインがほどけないようにする。次に変性剤をゆっく り透析除去し、軽鎖と重鎮が一緒にパンクされ、それらが抗原により選別されう るようにする。この手順の効果は、２本の鎖（いづれかがファージに結合してい る）の一方の集団が大いに縮小され、従って常用の技術によってパートナ−鎖の レパートリ−と−緒にクローンされうることになる。

二の手法は理論的に可能である：もしあるものがファージ当り２〜３分子の重鎮 を存するとき、１．１０”ＴＯのファージは約１０”の重鎮を提供し、従ってＴ ｌｌについてのアッセイはファージの絶対数の少なくとも１０倍を提供する。２ ５ｋｃｌの軽鎖ｌＩＩｇは２．４．１０”分子（１０倍過剰りである。

明らかに、本テーマにおける数多くの変更が、その背景の原理が正しいことが示 されるなら可能である。例えば、重鎮及び軽鎖の位置は逆であってよく、そして 鎖自体、異なる起源に由来しうる。例えばファージ上のヒ日ｄ重鎖を、Ｅ、コリ において発現される可溶性軽鎖レパートリ−に由来する軽鎖と複合させることが できる。他方、軽鎖をヒト血清から精製することができる。

下記の実施例は本原理が事実であるだけでなく、本プロセスが驚くべきほど効果 的であることも実証する。

ａ）重鎮ファージの調製 ｆｄ−ＤＯＧにおけるνＩＣ）ＩＩ　Ｎ（１１０，１２，５を実施例１において 構築した。

ｆｄ−ＤＯＧにおけるＶＨＣＨＩ抗−ＴＮＦを陰性コントロールとして用いた。

このクローンはネズミ抗腫瘍壊死因子モノクローナル抗体より構築した。この抗 体のＶＨ遺伝子をＰｃｔ？増幅し、そしてＰＣＲにより、フレーム内で、天然Ａ ｐａ　Ｌ１部位の除去したヒトＣＨＩ　（Ｃ１０）ドメインに連結させ（実施例 ２参照）、そしてＡｐａ　Ｌｌ　−ＮｏＬＩフラグメントとしてｆｄ−ＤＯＧの 中にクローンした。これらのファージを実施例１に記載の通りに増殖させ、そし て！ＩＷした。

ｂ）可溶性重鎮及び軽鎖ＮＱ　１０．１２．５の調製これらは、親マウスモノク ローナル抗体ＮＯ１０，１２，５より調製した。

培養土清液をプロティンＡセファロースで精製し、そしてＡｍ１ｃｏｎ限外濾過 装置により２０ｍｇ／ｇＩｌに濃縮した。次にこれを等容量のＩＭのトリスｐＨ ８，０と１／１０容量のＩＭの２メルカプトエタノールで希釈した；この量のメ ルカプトエタノールは鏡開ジスルフィド結合を還元するには十分であり、そして 鎖内のそれを還元するには不十分である。室温で一時間後、遊離のチオール基を １／ｌＯ容量の１．５Ｍのヨードアセトアミドの添加によりアルキル化し、そし て氷上で１時間インキュベートした。

分離した鎖をＨＰＬＣ（Ｇｉｌｓｏｎ）に接続したＺｏｒｂａｘ　Ｂｉｏｓｉｅ ｖｅｓ　ＧＦ　２５０ＴＳＫカラム（ＤｕＰｏｎｔ）上のゲル濾過により精製し た。還元混合物の２５０μｍのアリコートを５ＭのグアニジンＨＣＩ　７２０ｍ Ｍのリン酸ナトリウム、ｐＨ８，０の中に、下記の条件のもとで流した：流速＝ ０．５ｍｌ／分；画分容量＝０．２５ｍ１　Ｂチャートスピード＝１０＋ｉｍ／ 分；検出域−２，０（２８０ｒｖ＋）　；圧＝１０００ｐｓｉ　まで；流し時間 ＝３０分。

ピーク画分を５０５−ＰＡＧＥで分析し、そして純粋な重鎮及び軽鎖を存する両 分を複合実験に用いた。

ｃ　）　１１の＆ｌｌ換 下記の複合を設定した： Ｎ［１１０，１２，５重鎖ファージ　＋　可溶性Ｎ１１ｌ　１０．１２．５重鎮 ＮＧ　１０．１２．５重鎖ファージ　＋　可溶性ＮＱ　ｌｏ、１２．５軽鎖ＮＱ 　ｌｏ、１２．５重鎖ファージのみ抗−ＴＮＦ重鎮ファージ　＋　可溶性ＮＯ１ ０，１２，５重鎖抗−ＴＮＦ　１！Ｌ鎖フアージ　＋　可溶性ＮＱ　ｌＯ，１２ ，５軽鎖抗−ＴＮＦ重鎮ファージのみ 各ケースにおいて、１．１０”Ｔ、Ｌｌ、のファージを、２５μｇ、１０μｇ。

５μｓ又は１μｓの精製可溶性軽鎖と複合させ、そして最終容量９００μｍにお いて５ＭのグアニジンＨＣＩ／２０ｍＭのリン酸ナトリウム、ｐｕｓ、　０にし た。これらのサンプルを次にビスキングチューブ（Ｎｏ、　２゜Ｍｅｃｌｉｃｅ ｌｌ　Ｌｔｄ、　Ｌｏｎｄｏｎ　ＮＩ　ＩＬに、　Ｅｌｌｇｌａｎｄ）でシール したＰｉｅｒｃｅのマイクロダイアライザーシステム５００の中に入れた。サン プルを３回交換する１００ｍＭのトリスＨＣＩ、　ｐＨ７，４に対して４”Ｃで ４８時間に透析し、上記の処理（特に５ＭのグアニジンＩ（Ｃ１工程）は、少な くとも感染性に関するファージ粒子の構造に影響を及ぼさない又はわずかに及ぼ すことが認められ、なぜなら実験中にサンプルのＴ、Ｕ、の低下がなかったから である。

ｄ）再折りたたまれた抗体の機能性を示すＥＬＩＳＡ再折りたたまりの効率を、 適切に再折りたたみした抗体を検出する、ｐｈＯＸ−ＢＳＡに対するＥＬＩＳ＾ によってアッセイした。このＥｌｊＳＡは実施例１に記載と同しように行った。

重要な見解は、重鎮ＮＱ　１０．１２゜５フアージを精製ＮＱ　１０．１２．５ 軽鎖と複合させたときに、機能性抗体が実際に回収できることにある。事実、ｌ μｇにまで下がる軽鎖濃度の範囲にわたって獲得されるシグナルにおいて相違は 小さく、これらのファージを希釈した場合もそうである；便宜上、１Ｍｇの結果 しか図１２に示していない。これより、刺激は絶対的に特異的であることが明ら かである：刺激は重鎖抗−０×ファージを抗−〇に軽鎖と複合させたときにのみ 認められた。重鎖抗−０χファージのみ、又は重鎮抗−〇Ｘファージを可溶性抗 −Ｏｘ重鎮と複合させたときは刺激は認められなかった。抗ＴＮＦ重鎮ファージ を単独で用いたとき、又は抗−Ｏｘ重鎮もしくは軽鎖と複合させたときは刺激は 全く認められなかった。適切な重鎮と軽鎖との組合せを用いたときのみに機能性 抗体は製造された。

本実験は、本プロセスが驚（べきほどによく働くことを実証する。

軽鎖は他の起源、例えば巳、コリにおいて構築したライブラリー又は血清抗体に 由来しうる。このプロセスは、重鎮と軽鎖を反対にしたとき、即ち、ファージ上 の軽鎖及び可溶性重鎮と゛したときも有効であろう。

実施例４：多重順列組合せライブラリー及びＣＤＩ？プリンティングを利用する げっ書類抗体のヒト化 重鎮のＣＤＲ３は長さ及び配列の両方において全てのＣＤＲうちでの最も可変性 であることが一般に見い出されており、そして抗原と重要な接触をしうる（Ｗｉ ｎｔｅｒ、　ｃ、とＭｉｌｓｔｅｉｎ　Ｃｏ　Ｍａｎ−Ｍａｄｅ　Ａｎｔｉｂｏ ｄｉｅｓ（１９９１）　Ｎａｔｕｒｅ　３４９．２９３−２９９）　、これはＣ ＤＲ−グラフティング又は鎖シャフリングによることができるヒト化の際に重要 な概念である（ＰＣＴ／ＧＢ９１１０１１３４）。本出願人は、げっ歯頚抗体ノ Ｖｌ（ＣＤＲ３配列をヒトシＨセグメントにインプリントする鎖シャフリングプ ロセスによるヒト化に多重順列組合せ手法を利用することは有利でありうること に気づいた。

本実施例において、マウス抗−ＨＩＶ　ｇｐ１２０モノクローナル抗体をヒト化 する。このマウス抗体のＶ）ＩドメインをヒトＣｒｌ　ドメインに融合させ、次 イテｐｌＪｃ　１９　Ｓｆｉ／　Ｎｏｔ　／ｐｏｌ＋７ｍｙｃ　１．’ニークロ ーンする。

ｆｄ−ＤＯＧにｇ、融合体としてクローンした純真なヒト軽鎖のレノイートリー を次にキメラ重鎖を保有する細胞の中に感染せしめ、そして抗原に基づいてファ ージを選別する。これらのファージはその表層上に重鎮及び軽鎖の両方を有すが 、ファージゲノムは軽鎖のみをコードする：これは問題とはならず、なぜなら重 鎮のみが提供すべきものであるからである。

このようにして選別した軽鎖を次に純真なヒトシＨドメインのライブラリーに対 合させ、ヒト抗体のＣＤＲ３がもとのマウス重鎮のそれに置き代わるような方法 でＰＣＲ増幅させる。

章ａ）はキメラＦａｂフラグメントの構築を扱い、ここでマウスＦ５８ＶＩＩ及 びｖＬＬｌインはヒトＣ１１１及びＣＫ配列に融合させる。このクローンを抗体 の籾量特性化に用い、そしてこれは重鎮のその後のＰＣＲ増幅のための鋳型とし て働き、ｐＬＩＣＩ９５ｆｉ−Ｎｏｔ　ｐｏｌｙｍｙｃの中にＰｓｔ　ｌ　−Ｎ ｏｔ　Ｉフラグメントとしてクローンする（章ｂ）。章Ｃ）はｒｄ−ＤＯＧの中 でのヒト軽鎖レパートリ−の構築を説明し、これを次にｐＨｃ１９上にキメラ重 鎖を含む細胞の中に感染させる（章ｄ）。得られるファージをペプチドに対して より分け（章ｅ）、そして選ばれた軽鎖をＰＣｔｌ−増幅し、そしてキメラ重鎖 に沿ってＡｓｃ　Ｉ　−Ｎｏｔ　Ｉフラグメントとしてクローンしく章ｒ）、次 いでＥＬＩＳＡにより抗原への結合能力についてアッセイした（章ｇ）。選別し た軽鎖をρＵＣの中に再クローンしく章ｈ）、そして純真Ｖｌ（ドメインを、ド メイン上にＦ５８　ＣＤＲ３配列を付与する突然変異プライマーで増幅させ、そ して得られるフラグメントをファージの中にクローンした（章ｉ）。

インプリントした重鎮ファージのレパートリ−を次に、ｐＩＩｃ上に選別軽鎖を 保有する細胞を感染せしめるために用い、そして得られるファージを抗原に基づ いてより分けた。最後に、選別した重鎮及び軽鎖を同一のレプリコン上に一緒に クローンし、そして抗原に対する結合性についてアッセイした（章ｊ）。

ａ）Ｆ５８キメラ重鎖のクローニング ｉ　）　ｃＤＮ八合へ及び−次ＰＣＲ ５ｍｌの培養ハイブリドーマ細胞（約２Ｘ１０６細胞）をＰＢＳの中て洗い、ペ レット化し、水中の０．１％のジエチルピロカーボネート２００μｌの中に再懸 濁し、そして直ちに５分間煮沸した。遠心後、６８μｍの「煮沸済」上清液を２ ８μＩの反応混合物に加え、これにより、　１４０ｍＭのにＣ１，５０ｍＭのト リス・ＨＣＩ　（ｐＨ８，１１ｊ４２°Ｃ）、８ｍＭのＭｇＣｈ、　１０ｍＭの ＤＴＴ、　５００μＭのデオキシチミジン三リン酸、５００μＭのデオキシシチ ジン三リン酸、５００μＭのデオキシアデンニン三リン酸、及び５００ｔＩＭの デオキシグアニン三すン酸ヌクレオチド三リン酸（５００ｕ　ＭのｄＮＴＰｓ） 、１６０単位のヒト胎盤Ｔｌ）ｌａｓｅインヒビター及びＩＯｐｍワ１の前進プ ライマーを含む反応混合物９６μｌが得られた。

４μｍの（１００屯位）のトリ骨髄芽球ウィルス（ＡＭＶ　）逆転写酵素を加え 、この反応混合物を４２°Ｃで１時間インキュベートし、１００’Ｃで３分間熱 し、氷で急冷し、そして５分間遠心した。この上清液をＰＣＲのために直ちに利 用した。

重鎮及び軽鎖に関して別々のＰＣＲ増幅を行った。５０μＩの反応混合物を調製 し、これはｃ［ＩＮＡ合成に由来の上清？ｆｆ１５μｍ、２５０μＭのｄＮＴＰ 、　５０ｍＭのＫＣＩ、　１００ｍＭのトリス・ＨＣｌ　（ｐＨ８，３）、１． ５ｍＭのＭｇＣ＋、。

１７５μｇ／ｌのＢＳＡ　、前進及び後退プライマーのそれぞれ２０ｐｍｏｌの 適当な混合物（Ｃ１ａｃｋｓｏｎ、　Ｔら（１９９１）前掲）、並びにｌμ＋（ ５単位）のサーマス　アクアティカス（Ｔａｑ）　ＯＮ＾ポリメラーゼ（Ｃｅｔ ｕｓ。

Ｅ＊ｅｒｙｖｉｌｌｅ、　ＣＡ）を含む。この反応混合物の上にパラフィン油を 載せ、そしてＴｅｃｈｎｅ　ＰＨＣ−２サーマルサイクラ−を用い３０サイクル の増幅に付した。このサイクルは９４°Ｃで１分（変性）、５５°Ｃで１分（ア ニーリング）及び７２゛Ｃで１分（伸長）とした。この生成物５μＩを２％のア ガロースゲルに流すことによって分析した。残りはエーテルで２回、フェノール ／クロロホルムで１回抽出し、エタノール沈殿し、そして５０μｌのＨ２Ｏに再 懸濁させた。

１１）増幅Ｖｌｌ及びＶｋ　ＤＮＡのクローニング及びシーケンシング増ｌｌ１ ｖｏ　ＤＮＡをＰｓｔｌ及びＢｓｔＥｔｌテ消化し、２％の低融点アガロース’ ｙ’　ルテ精製し、次１ｒ”テＰｓｔｌ及びＢｓｔＥＩＩテ消化したＭ１３ＶＨ ＰＧＲ１の中にリゲートせしめた（Ｏｒｌａｎｄｉ、　Ｒ，、Ｄ、Ｈ，Ｇｕｓｓ ｏｗ＋　Ｐ、Ｔ、　ＪｏｎｅｓとＧ、　ＷｉｎＬｅ；（１９８９）。Ｃｌｏｎｉ ｎｇ　ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ　ｖａｒｉａｂｌｅ　ｄｏｍａｉｎｓＦｏ ｒ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｂｙ　ｔｈｅ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　ｃｈａｉｎ 　ｒｅａｃｔｉｏｎ＋　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ。

Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、、　ＵＳ八へ６　（１０）、　３８３３−７）、増幅ＶＫ 　ＤＮＡをＰｖｕ　Ｉｆ及びＢｇｌＩＩで消化し、そしてＰｖｕ　Ｕ及びＢｃｌ 　Ｉで消化したＭ１３νＫＰＣＩ１１にリゲートせしめた。このリゲーション混 合物をコンピテントＴＧＩ細胞を形質転換せしめるのに用いた。別々の増幅に由 来する２種のクローンをジデオキシヌクレオチド連鎖停止法を用いて各ＶＨ及び ＶＫについてノーケンス化した。

１ｉｉ）Ｅ、　コリの中での発現のためのＦａｂ構築体の作製Ｆ５８可変ドメイ ン並びにヒトＩｇＧＩ　Ｃ旧及びＣＫドメインを含むキメラＦａｂを、Ｆ５８Ｖ −ドメインを定常ドメインを含むヘクターの中にリゲートすることによって構築 した。Ｐ５８Ｖを含むＭ１３Ｖｌ（ＰＣＲＩをＰｓｔｌ及びＢｓｔＥＩ［スプル 上で精製し、Ｇｅｎｅｃｌｅａｎによりゲルから単離し、そしてＰｓｔｌ及びＢ ｓｔＥＩＩで消化したｐＪＭ−Ｉ　ＦａｂＤｌ、３にリゲートした（このクロー ンは実施例１に記載のＦａｂ　ＮＱ　１０．１２．５と同じ定常ドメイン及び制 限部位を有する。実際、Ｆａｂ　ＮＱ　１０．１２．５は定常ドメインｐＪＭ− Ｉ　ＦａｂＤｌ、３を用いて構築している）。このリゲーション混合物を、コン ピテントＥ、コリＮ４Ｂ３０−１細胞（Ｇｏｔｔｅｓ＋＊ａｎ、Ｍ、Ｅ、　Ａｄ ｈｙａ、　Ｓ、とＤａｓ　、＾。

（１９８０）　Ｊ、　Ｍｏ１．　Ｒｉｏｔ、　１４０．５７−７５）、及びＦ５ ８Ｖ）Ｉを含む（ＲＦ　ＤＮＡの制限分析により同定）クローンを形質転換させ るために用いた。

Ｆ５８Ｖにを、プライマー、ＶＫ２ＢＡＣＫ及びＶＷ３ＦＯＲ２（Ｃ１ａｃｋｓ ｏｎ、　Ｔ、ら（１９９１）前掲）により、鋳型としてＦ５８ＶＫを含む？ｌ１ ３ＶＫＰＣＲを用いるＰＣＲにより増幅させた。ＰＣＲ生成物をＳａｃ　Ｉ及び Ｘｈｏ　Ｉで消化し、１．５％のアガロースゲルで精製し、Ｇｅｎｅｃｌｅａｎ でゲルから単離し、そしてＳａｃ　Ｉ及びＸｈｏ　Ｉで消化したＦ５８Ｖｌ（を 含むｐＪＭ−Ｉ　Ｆａｂ　ヘクターの中にリゲートさせた。このリゲーション混 合物を、コンビテン）　Ｅ、　コ’Ｊ　Ｎ４８３０−１細胞及びＲＦ　ＤＮＡ（ ７）制限分析によりＦ５８ＶＫを含むと同定されたクローンを形質転換させるた めに用いた。

Ｆ５８キメラ重鎖を、Ｆ１ａ　ＦａｂクローンＤＮＡから、実施例１に記載の手 順を利用し、且つ、プライ７−ＶＨＩＢＡＣＫＳＦ１１５及びＨＵＣ）Ｉ　ＩＰ ＯＲＡＳＣＮＯＴ（表１）を用い、ＰＣＲ増幅させた。得られた約７００ｂｐの フラグメントをＰｓｔｒ及びＮｏｔ［で消化し、そして標準の手順（Ｓａｍｂｒ ｏｏｋ、　Ｊ。

ら１９８９、前掲及び実施例Ｉ）を用いてＰｓｔｌ及びＮｏｔｌ−切断ｐｕｃ１ ９Ｓｆｉ／Ｎｏｔ　／ｐｏｌｙｍｙｃプラスミドの中にクローンせしめた。

Ｃ）軽鎖レパートリ−の構築 実施例２に記載と同じ材料及び条件を利用して軽鎖レパートリ−を構築したが、 ただしプルスルーは下記のプライマーで実施した。

Ｌ鎖：　ＨＩＩＶＬＢＡＡＰＡ　（１〜６　（７）当モル混合物）とＨＵＣＬＦ ＯＲ５ＥＲＮＯＴＫ鎖：　ｌ［ＶＫＢＡＡＰＡ　（１〜６　（７）当モル混合物 ）と）１１．１ｃＫＦＯＲ３ＥｌｌＮＯＴ標準の方式を利用してＰＣＲ生成物を ＡｐａＬ　Ｉ及びＮ０口で消化し、そして実施例１及び２に記載の通りにＡｐａ Ｌ　Ｉ及びＮｏｔｌ−切断ｆｄ−ＤＯＧにクローンした。実施例１及び２に記載 の通りにファージをライブラリークローンから調製し、そして重鎮を含む細胞に 感染するのに用いた（下記参照）。

ｄ）ノヤノフルしたＦａｂファージの製造Ｆ５８キメラ重鎖を含む細胞を２ＹＴ ＡＧの中で３７°Ｃで一夜増殖させ、次いでその５００μｌを、三角フラスコの 中で３７゛Ｃに予め温めておいた５０Ｉ！Ｉｌの新鮮な２ＹＴ１ｍｐ培地に加え た。この細胞を振盪しながら０．Ｄ。

６００が約０．５となる迄増殖させ、次いで軽鎖レパートリ−由来のファージ全 部で１０１１個を加えた。この培養物を振盪せずに３７°Ｃで４５分間放置し、 次いで強く振盪しながら更に４５分間置き、そして１５μｇ／／ｍ１のテトラサ イクリンを加え、−夜振盪させた。

前述した通り（実施例１及び２）に培養上清液のＰＥＧ沈殿によってファージを 回収し、そして選別の実験のために用いた。

ｅ）ンヤノフル化Ｆａｂファージのより分けこれはｎ７１述したマキシソームプ レート上で行い（Ｍａｒｋｓ　Ｊ　ら、１９９１、前掲）、ただしチューブを、 水の中で１０μｇ／ｍｌに溶解させたＩＩＩＶ−１単翻化［［ＩＢのＨｖ　ｇｐ 　１２０　Ｖ３ループペプチドでコートしである。このペプチドはＡＩＤＳを目 的とするプログラム（保存番号＝ＡＩ）Ｆ７ａ７　）から獲得し、そして下記の 配列を有する：ＣＴＲＩ’ＮＮＮ丁Ｒ１？ＳＩＲ［ＱＲＧＰＧＲＡＰＶＴＩＧＫ ＩＧＮＩ’ｌＲ［１ＡＨＣＮ二のチューブから溶離させたファージを、Ｆ５８キ メラ重鎖を含む新鮮細胞を再感染せしめるのに用い、そしてより分け／再感染手 順を更に３回操り返した。

ｆ）選別軽鎖の再クローニング 選別した軽鎖をｆｄ−ＤＯＧ軽鎖ＤＮ＾から、実施例１に記載の手順並びにプラ イマーＧ３ＬＡＳＣＧＴＧＢＡＣＫ及びＨＵＣＬＦＯＲ３ＥＲＮＯＴ又はＩＩＵ ｃＫＦＯＲ３ＥＮＯＴを用いてＰＣＲ増幅させた。Ｇ３ＬＡＳＣＧＴＧＢＡＣＫ プライマーはｆｄにおけるｇｌ［Ｉシグナルの翻訳開始の上流にアニールし、そ してＡｓｃ　１部位及びリポソーム結合部位（ＩＩＩＢＳ）をもたらす。これら のフラグメントをＡｓｃ　Ｉ及びＮｏｔｌで消化し、そしてＡｓｃ　Ｉ及びＮｏ ｔｌ−切断ｐｕｃ　１９Ｆ５８プラスミド（図１３に示す）にクローンして、可 溶性Ｆａｂを作る二とができるシストロンを作り上げた。これをＥＬＩＳＡによ りペプチド結合について分析し、結合抗体を軽鎖の末端上のｍｙｃ　ｔａｇペプ チドにより検定した。

ｇ　）　ＥＬＩＳＡ これは下記の通りに実施した。

１．９６穴プレート（ｒｃｅｌｌ　ｈｅｌｌｓ」Ｎｕｃｌｏｎ）中の１００μｌ の２ｘのＴＶ、１００μｇ／ｌのアンピシリン、１％のグルコースに接種を行い 、そして３７°Ｃで一夜、振盪させながら（３００ｒｐｍ）増殖させる。

２．９６穴トランスフアー器具を用い、このプレートから少量の接種物を、ウェ ル当り２００μｌの新鮮な２ＸのＴＹ、１００μｇ／ｍｌのアンピシリン、０． １％のグルコースを含む第２の９６穴プレートに移す。

振盪しなから３７°Ｃで増殖させ、Ｏ，Ｄ、６００μｍが約０．９となるまで行 う（約３ｈ「）。もとのブレートのウェルに、ウェル当り６０％のグリセロール ２５μｍを加え、そして−７０°Ｃで保存する。

３．２５μｌの２ｘのＴＶ、１００μｇ／ｎ＋Ｉのアンピシリン、９ｍＨのＩＰ ＴＧ（最＃３！濃度１ｍＭのＩＰＴＧ）を加える。３０°Ｃで更に１６〜２４ｈ ｒ振盪を続ける。

４　、４．００Ｏｒｐｍで１０分遠心し、そして１００μｌの上清液をＥ【、Ｉ ＳＡに用いる。

５、プレート（Ｆａｌｃｏｎ　３９１２）を、ウェル当り、水中の１０μｇ／ｍ ｌのペプチド５０μｌでコートする。室温で一夜放置する。

６、ウェルをＰＢＳで３回すすぎ、そしてウェル当り、１％のＢＳ＾／ＰＢＳ　 ２００　ｌＩＩで、３７°Ｃでｌｈｒプロ・ツクする。

７、ウェルをＰＢＳで３回すすぎ、次いで全てのウェルに６％のＢＳＡ／ＰＢＳ 　２５μｍを加える。

８、適宜のウェルに可溶性Ｆａｂを含む培養上清液１００μｌを加える。

混合し、室温で１．５ｈｒ放置する。

９、試験溶液を捨て、そしてＰＢＳ、　０．０５％のツイーン２０で３回、そし てＰＢＳで３回洗う。各ウェルに、２％のＭａｒｖｅｌ　／　ＰＢＳ中の４μｇ ／ｌの精製９Ｅ１０抗体１００μｌを分注する。室温で１．５ｈｒインキュベー トする。

１０、９Ｅ１０抗体を捨て、そしてＰＢＳ、　０．０５％のライ−７２０で３回 、そしてＰＢＳで３回洗う。抗マウス抗体（ベルオキシダーゼーコンジエゲート 化抗マウス抗体、ＤａｋｏρａＬｓ／ＩＣＮ、又はベルオキシタ゛−ゼコンジュ ゲート化抗マウスＩｇＧ、　Ｆｃ特異性、Ｓｉｇｍａ　Ａ−２５５４）の１：５ ００の希釈物１００μｍを分注する。室温で１．５ｈｒインキユベートする。

比第２抗体を捨て、そしてＰＢＳ、　０．０５％のツイーン２０で３回、そして ＰＢＳで３回洗う。

１２、１０ｍｇのＡＢＴＳ（２，２’−アジノビス（３−エチルヘンズチアソ゛ リンー６−スルホン酸）−アンモニウム塩）１錠を２０＊　１の５０ｍＭのクエ ンｆｌ！緩衝液、ｐＨ４，５に加える（５０ｍＭのクエン酸緩衝液、ｐＨ４，５ 番よ、等容ｌの５０１のクエン酸三ナトリウム及び５０ｍＭのクエン酸を混ぜる ことにより作られる）。

１３、分注する直前に上記の溶液に３０％の過酸化水素２μｌをカロえる。

１４、上記の溶液１００μＩを各ウェルに加える、室温で２０〜３０分放置。

１５、３．２　ｍｇ／ｍｌのフソイはトリウム５０μｍを加えることによりクエ ンチする。４０５ｎｍで測定する。

１考土工　択一的に、形質転換プレート由来のクローンを、９６穴ウエル（’ｃ ｅｌｌ　ｗｅｌｌｓＪＮｕｃｌｏｎ）中の１００ｕｌの２ＸのＴＹ、１０（ｂｚ 　ｇ／蒙１のアンピシリン、０．１％のグルコースに接種し、次いで３７°Ｃで 振盪させながら（３００ｒｐ＋ｗ）増殖させ、振盪をＯ，０，６００ｎｍが約０ ．９となるまで続ける（約６ｈｒ）、工程３に続く。

傭１１１づ−　この方法はＤｅＢｅｌｌｉｓ　Ｄ、　とＳｃｈｗａｒｔｚ　Ｉ＋ 　１９９０　Ｎｕｃｌ。

Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、１８　：１３１１のそれをヘースとし、そして出発培地の 中に存在している、加えられる誘発剤（ＩＦ’ＴＧ）により経時的に代謝される 低レベルのグルコースに基づく。

備考３　：　’Ｍａｒｖｅｌ」はドライミルク粉である。ＰＢＳはｌリットル中 の５．８４　ｇのＮａＣ１、４，７２ｇのＮａｚＨＰＯａ及び２．６４　ｇのＮ ａＨｚＰＯａ　Ｈ２８ｚＯ。

ｐＨ７，２である。ＢＳＡはウシ血清アルブミンである。

ｈ）選別軽鎖のサブクローニング 軽鎖を、選別クローンから、７本のＨＵＶＬＢＡＳＦＩ　プライマーとＨＵＣＬ ＦＯＲ５ＥＲＡＳＣＮＯＴとの当モル混合物、又は６本（７）ＨＵＶＫＢＡＳＦ Ｉプライマーとｌ（［ＩＣＫＦＯＲ５ＥＲＡＳＣＮＯＴとの当モル混合物を用い て、実施例２に記載の通りにＰＣＲ増幅させた。ＰＣＲフラグメントを５ｆｉｌ 及びＮｏｔｌで切り、そして５ｆｉｌ及びＮｏｔｌ−切断ｐＨｃ１９ｓｆｉ／Ｎ ｏｔ　／ｐｏｌｙｍｙｃにクローンし、次いで丁ＧＩに形質転換せしめた。

上記のより分け／感染プロセスを本質的に繰り返し、今回は重鎮と軽鎖の位置を 逆にした。

１）ＣＯＲ−インプリンティングＶＨ Ｖ）Ｉドメインを実施例２に記載のプールしたＰＣＲ材料から増幅させた。６通 りの個別のプリスルー反応を、突然変異誘発Ｆ５８ＧＲＡＦＴＪＨ４ＳＡＬプラ イマー及び個ｋＯ）各１（ＵＶＩＩＢＡＡＰＡＩ−６プライマーテ行った。プル スルーについての条件は実施例２（ｄ）と同しであるが、ただしアニーリング温 度は４５°Ｃに低めた。

得られるＶｌ（フラグメントをプールし、そして標準の条件を用いてＡｐａＬＩ 及びＳａｌ　Ｉで切り、次いで標準のプロトコールを用いてＡｐａＬｌ及びＸｈ ｏ　Ｉ−切断ｆｄ−ＤＯＧ−Ｇ４ＣＨ１にクローンした（Ｓａｌ　Ｉ及びＸｈｏ 　Ｉは適合性ＣＴＡＧ突き出しをもたらす）。前述の通りにこのライブラリーか らファージを調製し、今回はｐＵｃ　１９Ｓｆｉ／Ｎｏｔ　／ｐｏｌｙｍｙｃに おいて発現される選別軽鎖を保有する細胞を感染せしめるのに重鎮ファージを利 用した。

Ｊ）最終重鎮の組合せのスクリーニングこのプロセスの最終結果は、選別重鎮の プール及び選別軽鎖のプールである。ここでは重鎮クローンを、６本のＨＵＶＨ ＢＡＣＫＳＦ　Ｉ　プライマーとＨＵＣＩ（ＩＦＯＲＡＳＣＮＯＴの当モル混合 物を用い、実施例１に記載の手順を用いてＰＣＲ増幅させた。これらのフラグメ ンを５ｆｉｌ及びＡｓｃ　Ｉで切り、そして標準の手順（実施例１）を用いてゲ ル精製し、次いで当モル盪の上記の工程ｒ）で作ったＡｓｃ　Ｉ　−Ｎｏｔ　Ｔ −切断軽鎖反びこれも先に作った５ｆｉＩ及びＮｏｔｌ−切断ｐ［Ｉｃ　１９Ｓ ｆｉ／Ｎｏｔ　／ｐｏｌｙｍｙｃ　ヘクターにリゲートさせた。他方、これらＳ ｆｉ　Ｉ　−Ａｓｃ　Ｉフラグメントを図１３（Ａ）の終りに示す構築体におい てＦ５Ｂ重鎖に置き換えた。次にこれらの構築体をＴＧＩに形質転換させ、そし て前述のＥＣｌ５Ａによりペプチド結合活性について分析した。

Ｍ柊生成物は親げっ歯頚抗体と同−又は類似の抗原特異性を有する完全なヒトＦ ａｂフラグメントである。

実施例５ ｐＨＥＮ　Ｉ及びｆｄｃＡＴ２を用いるバタテリオファージｆｄ上での、抗−オ キサゾロン抗体ＮＱ　１０．１２．５に由来する一本鎖Ｆｖ及びＦａｂフラグメ ントの表示 一定の構築体（図１８参照）を、マウス抗−ｐｈｏｘ（２−フェニル−５−オキ サシロン）抗体ＮＱ　ｌｏ、１２．５　（Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ、　Ｇ、Ｍ、　ら 、Ｎａｔｕｒｅ３１２、２７１−２７５．１９８４）に由来する可溶性Ｆａｂフ ラグメント（Ｂｅｔｔｅｒら１９８８、上記参照）の細菌における発現のために デザインされたクローン（木質的にはｐＵｃ１９における構築体■）より作った 。構築体Ｈにおいて、■領域はＮＱ　ｌｏ、１２．５に由来し、そしてヒトＧＫ 及びＣＨＩ（１イソタイプ）定常ドメインに結合している。通常は軽鎖と重鎖抗 体核間の共有結合を形成するＣ末端システィン残基は両定常ドメインから除去さ れている。重鎮及び軽鎖遺伝子を一緒にＦａｂフラグメントとして（構築体■） 又は別々の鎖として（構築体■及び■）クローンするため、１）ＮＡをＰＣＨに より構築体■から増幅させて、３′末端にＮｏｔｌ制限部位を、そして５末端に ＡｐａＬ１部位（ｆｄ−ＣＡＴｚへのクローニングのため）又はＳｆｉ１部位（ ｐＨＥＮｌへのクローニングのため）のいづれかを導入する。Ｆａｂフラグメン トをコードする遺伝子（構築体ｌ）のＰＣＲ増幅のためにプライマーＰＡＢＮＯ ＴＦＯＫとＶＨＩＢＡＣＫＡＰＡ　（又はＶＨＩＢＡＣＫＳＦ１１５　）を、重 鎮（構築体■）のためにプライ７−ＦＡＢＮＯＴＦＯＨとν旧ＢＡＣＫＡＰＡ　 （又はＶＨＩＢＡＣＫＳＰＩ１５）を、そして軽鎖（構築体■）ためにプライ７ −ＦＡＢＮＯＴＦＯＫとＭＶＫＢＡＡＰＡ　（又はＭＶＫＢＡＳＦＩ　）を用い る。

ＮＱ　１０．］２．５の一本１ｉＦＶバー　シｑ　７　（構築体［）　は柔軟’ ）７カー（Ｇｌｙ４Ｓｅｔ）により連結した重鎮（νＨ）と軽鎖（Ｖｋ）可変ド メインを有しくＨｕｓｔｏｎ、　Ｊ、Ｓ、ら、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａ ｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　８５５８７９−５８８３゜１９８８）　、そしてこれ は構築体■から、同９２１０１０４７の実施例１４のように「重複伸長によるス プライシング」によって構築した。集成遺伝子をプライ７−ＶＫ３Ｆ２ＮＯＴ及 びＶＩＩＩＢＡＣＫＡＰＡ　（又はＶＨＩＢＡＣＫＳＦ［１５）　テ再増幅させ て、ｆｄ−ＣＡＴｚ　（ＡｐａＬＩ−Ｎｏｔｌ）又はｐｆｌＥＮｌ　（Ｓｆｉ　 ｌ　−Ｎｏｔ　Ｉ　）へのクローニングのための制限部位を付加した。

ＶＫ３Ｆ２ＮＯＴ、５’−ＴＴＣＴＧＣＧＧＣＣＧＣＣＣＧ　ＴＴＴ　ＣＡＧ　 ＣＴＣＧＡＧ　ＣＴＴ　ＧＧＴ　ＣＣＣ０制限部位に下線を付した。

ファージ及びファージミドの救済 構築体１−■（図２７）をｆｄ−ＣＡＴ２及びｐＨＥＮ１の両者に導入した。

ファージｆｄ−ＣＡＴ２（及びｆｄ−ＣＡＴ２−１．　Ｉｔ、　Ｉ［ｌ又は■） を、１２．５μｇ／ｌのテトラサイクリンを有する２ｘのＴＹ培地の中での３７ ℃で一夜の振盪を経た感染化Ｅ、コリＴＧＩの上清液がら獲得し、そしてＥＬＩ ＳＡに直接利用した。Ｅ、コリＴＧＩ　（ｓｕｐＥ）におけるファージミドｐＨ ＥＮ１（並びにｐＨＥＮｌ−１及び■）を２１の２ｘのＴＹ培地、１１００ｐ／ ｍｌのアンピシリン及び１％グルコースの中で一夜増殖させた（グルコースがな いと、ｇ３ｐの発現はその後のへルバーファージによる重感染を妨げる）。１０ μｍの一夜培養物を２ｍｌの２ｘのＴＶ培培地１００ビ８３７°Ｃで１時間振力 させた。これらの細胞を２　ｘ　（７）ＴＹ，　ｌｏｏＩＪｇ　／ｍｌのアンピ シリンで洗っ゛ζ再懸濁し、そしてファージミド粒子を２μｍ（１０”ｐｆｕ） のｖＣ３Ｍ１３ヘルパーファージ（Ｓ　Ｌｒａ　ｔａｇｅｎｅ　）の添加により 救済した。１時間増殖後、４／１１のカナマイシン（２５ｍｇ／＋ｎｌ）を加え 、そしてこの培養物を一夜増殖させた。ファージミド粒子をポリエチレングリコ ールによる沈殿によってＥＬＩＳＡのために１０倍に濃縮した。

ＥＬＩＳＡ ２−フェニル−５−オキサシロン（ｐｈｏｘ）へのファージの結合性の検定を実 施例９の通りに実施した。９６穴プレートをＰＢＳ中の１１０１Ｉ／　ｍ　Ｉの ｐｈｏｘ−ＢＳＡ又は１０μｇ／＋ｍｌのＢＳＡで室温で一夜コートし、そして ２％のスキムミルク粉を有するＰＢＳＳでブロックした。４％のスキムミルク粉 を含むＰＢＳ　５０μｍと混合したファージ（ミド）上清液（５０μｍ）をウェ ルに加え、そしてアッセイした。ｐＨＥＮｌより分泌した可溶性５ｃＦＶ又はＦ ａｂフラグメントの結合性を検定するため、ＭｕｎｒｏとＰｅｌｈａｍ１９８６ 前掲に記載のＣ−ｍｙｃペプチドｔａｇを、抗−＋ｓｙｃモノクローナル９Ｅ１ ０　（Ｅｖａｎ，　Ｇ．１．ら、Ｍｏ１Ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｌ　５　３６１０−３ ６１６。

１９８５）を用い、それに続いてペルオキシダーゼ−コンジュゲート化ヤギ抗ー マウスイムノグロブリンを用いる検定により検出した。

ｆｄＤＯＧｌ及びｐＨＥＮｌにおける構築体はフィラメント状ファージの表層に 抗体フラグメントを表示する。このファージベクター、ｆｄ−ＤＯＧＩ（図１６ ）はベクターｆｄ−Ｌｅｔ　（Ｚａｃｈｅｒ，　Ａ．Ｎ．らＧｅｎｅ　９　１２ ７１−１４０．　１９８０）を基礎とし、そしてこれは、ファージコートタンパ ク質ｇ３ｐのＮ末端への融合体として発現させるために、抗体遺伝子又はその他 のタンパク質遺伝子をクローニングするための制限部位（ＡｐａＬ　Ｉ及びＮｏ ｔｌ）を有する。表示のためにｆｄ−ＤＯＧＩの中にクローンするＮ口１０。

１２、　１５のＦａｂ　ａｂｄ　５ｃＦＶフラグメントは、ＥＬＩＳＡによって ｐｈｏｘ−ＢＳＡに結合する（しかしＢＳＡには結合しない）ことが示された。

サンプルの八４０５がＥＬＩＳＡにおけるハックグランドより少なくとも１０倍 高いなら、ファージは結合性であると考えられた。

ファージミドベクターｐ）ＩＥＮＩ　（図１７）はρＵＣ１１９をヘースとし、 そして融合タンパク質のクローニングのための制限部位（Ｓｆｉｌ及びＮｏｔｌ ）を含む。ここで、抗体−ｇ３ｐ融合体の転写は、誘発性１ａｃＺプロモーター によりもたらされ、そして融合タンパク質はｐｅｌ　Ｂリーダーによって細胞周 辺腔を標的としている。ファージミドを、グルコース又はＩＰＴＧを含まない２ ｘのＴＹ培地の中のＶＣ５Ｍ１３へルバーファージで救済した：これらの条件の もとで、抗体−ｇ３ｐの十分な発現がある。表示のためにｐＨＲＮｌにクローン したＮＱ　１０．１２．５のＦａｂ及びｓｃＦνフラグメントは上記と同じ条件 を用いるＥＬＩＳＡによってｐｈｏｘ−ＢＳＡに結合する（しかしＢＳＡには結 合しない）ことが示された（表２）。

ファージの表層上に発現されるＦａｂフラグメントのライブラリーを調製するた めの他の方法論： １、ファージゲノム中のインサートから、重鎮（ＶＨＣＩＩ）遺伝子を発現する ファージのライブラリーを調製する。

２、Ｅ．コリの中のプラスミド発現ベクター、好ましくはファージミドにおいて 軽鎖遺伝子のライブラリーを作り、そしてこのライブラリーから発現される可溶 性タンパク質軽鎖を発現させる。

３、ライブラリーに由来する可溶性タンパク質軽鎖をファージ上に表示される重 鎮ライブラリーに結合させる。

４、所望の親和性及び特異性の性質を有するファージを選別する。

これらは重鎮（ＶＨＣＩＩ）遺伝子をコードするであろう。

５、特定の重鎖と組合さった適切な抗原結合性部位を形成する軽鎖をコードする 軽鎖遺伝子を、好ましくは軽鎖を発現するファーシト含む細胞と、特定の重鎮を 発現するファージとの重感染を利用してｍＭし、そして抗原結合についてアッセ イする。

実施例１６ ファージ上に表示される相補性抗体鎖をコードするファージによる、抗体の重鎮 又は軽鎖を有する遺伝子■タンパク質融合体をコードするファージミドの救済、 及び二重順列組合せライブラリーを作るためのこの技術の利用 ランダム順列組合せライブラリーでは、細菌細胞の形質転換効率に基づいて、表 示されるＦａｂフラグメントの潜在的な多様性に限界がある。この問題を解決す るためにここで説明する手法は（二重順列組合せライブラリー）、ファージの数 を１０’の係数に潜在的に高める。

重鎮と軽鎖との集成体を別々のベクターから発現させるため、ファージミド（ｐ ＨＥＮｌ−　ｍ又は■）をＥ．コリ）ＩＢ２１５１　（非サプレッサー株）の中 で増殖させて、可溶性鎖の製造を可能にし、そして上記の通りに救済したが、た だしパートナ−鎖をｇ３ｐへの融合体とし゛ζ発現するヘルパーファージ（それ ぞれ１０”　ＴＯのｆｄ−ＤＯＧＩ−　ＴＶ又は■）及びカナマイシの代わりに ２μｍのテトラサイクリン（１２．５ｍｇ／ｎ＋１　）を用いた。

Ｆａｂ重及び軽鎖をコードする独立ベクターＦａｂフラグメントの重及び軽鎖は 同一のベクターの中で一緒に又は別々のベクターの中でコードされうる。これを 実証するため、重鎮（構築体■）をｐｉ（ＥＮＩにクローンしく可溶性フラグメ ントを供するため）、そして軽鎖（構築体■）をｆｄ−ＤＯＧＩにクローンした （ｇ３ｐとの融合体を作るため）。Ｅ．コリ１（Ｂ２１５１　（非サプレッサー ）の中で増殖させたファージミドｐＨＥＮｌ−　ＩＩＩをｆｄ−ＤＯＧ−　ＩＶ ファージで救済し、そしてファージ（ミド）はｐＢＳＡではなく、ｐｈｏｘ　： 　ＢＳＡに結合することが示された（表２）。このことは、可溶性軽鎖がｇ３ｐ に結合している重鎮と正しく結合することを示し、なぜなら重鎮も軽鎖も単独で は抗原に結合しないからである（表２）。

類（以の結果が逆の実験（〕〕７ージミドｐＨＥＮー１ーｒＶびｆｄ−ＣＡＴ２ −　１［１フアージ）において得られ、ここでは重鎮を可溶性分子として、そし て軽鎖はｇ３Ｐに結合させて製造した（表２）。従って、Ｆａｂフラグメントは 重鎖又は軽鎖のいづれがのｇ３１１への融合によりファージの表層上に集成され 、供される他方の鎖は同−又は別々のベクターを利用して分泌される。

得られるファージ集団はファージａｂｄ救済化ファージミドの混合物である。２ 種の粒子の比は、対数増殖期のＥ、コリＴＧＩに感染させ、そして１５μｇ／ｗ ｌのテトラサイクリン（ｆｄ−［１０Ｇ１についての選別のため）又は１００μ ｇ／ｍｌのアンピシリン（ｐＨＥＮｌの選別のため）のいづれかを有するＴＹＥ プレート上でプレートすることによって評価した。ｆｄ−ＤＯＧＩの力価は５　 ＸＩＯ”ＴＯ／ｍｌであり、そしてｐＨＥＮｌの力価は２　Ｘｌ０Ｉ０ＴＬＩ／ ｍｌであり、ファージミド当り２５個ファージのノで７ケージング比を示唆する 。

ここで実証されるのは、ファージの表層上でのへテロニ量体抗体Ｆａｂフラグメ ントの表示を包括する択一的な手法である。一方の鎖はｇ３ｐに融合しており、 そして他方は可溶性形態においてＥ、コリの細胞周辺腔に分泌され、そこでそれ はｇ３ｐ融合体と非共有的に結合し、そして抗原に特異的に結合する。軽鎖又は 重鎮のいづれもｇ３１）に融合させることができる：それらはファージ上にＦａ ｂフラグメントとして表示され、そして抗原に結合する（図１９）。示している のは表層表示のためのファージ及びファージミドベクターの両方である。ファー ジミドはおそらく大きなファージ表示ライブラリーの創作のため、ファージベク ターより優れる。特にその高いトランスフェクション効率の点は（２〜３桁高い ）、より大きなライブラリーが構築されるのを可能とする。ファージミドベクタ ーｐＨＥ１１１は非すプレッサーＥ、コリにおける可溶性Ｆａｂフラグメントの 発現も可能とする。

更にここで実証するのは、同一のベクター（構築体■）又は別々のベクター（構 築体■又は■）上でコードされる重及び軽鎖が、Ｆａｂフラグメントとして表示 されうろことである。このことは、表示のためのランダム順列組合せライブラリ ーを作る２通りの異なる手法を提供する。ＰＣＨにより増幅させた重鎮及び軽鎖 遺伝子のライブラリーは、「重複伸長によるスプライシング」を基礎とするｒ　 ＰＣＲ集成」プロセス（Ｗ０９２１０１０４７の実施例１４）によりランダム連 結でき、ファージ（ミド）表示ベクターにクローンでき、そして上記と同じ転写 体（構築体■）の一部として同一のプロモーターから又は別の転写体として別の プロモーターから発現できる。ここで、ファージ（ミド）ベクターは重鎖をコー ド及び表示する。１０７の重鎖及び１０’の軽鎖の順列組合せライブラリーに関 して、表されるＦａｂフラグメントの潜在的な多様性（１０′′）は、ベクター による細菌細胞のトランスフェクション効率により限定される（切断及びリゲー したプラスミドのμｇ当り、約１０’のクローンが最良である）（Ｗ、Ｊ、Ｄｏ ｗｅｒ　ら、Ｎｕｃｌ、Ａｃ１ｄｓ、　Ｒｏｓ、１６６１２７−６１４５．１９ ８８）。これにより作られたライブラリーはＨｕｓｅ＋　Ｗ、Ｄ、ら５ｃｉｅｎ ｃｅ　２４６１２７５−１２８１　（１９８９）に記載のランダム順列組合せラ イブラリー法に類似するが、ファージ表層上での表示が、作り上げた大量のクロ ーンから抗体特異性体を選別する強力な方法をもたらす重大な追加の特徴を有す る。

他方、重鎮及び軽鎖のライブラリーを同一の細胞の中で発現させるために、ｇ３ ｐ融合体をコードするファージベクター及び可溶性鎖をコードするファージミド は異なるベクターにクローンすることができる。このファージはヘルパーとして 働き、そして感染細菌はパッケージ型ファージ及びファージミドの両者を製造す る。各ファージ又はファージミドは両方の鎖を表示するが、しかし一方の鎖のみ をコードし、従って抗原結合性部位の半分の遺伝情報のみをコードする。しかし ながら、両方の抗体鎖についての遺伝子は選別培地上にプレートすることにより 別々の回収でき、相互に相補性な抗原結合性重鎮及び軽鎖の組合せの対がランダ ム順列組合せライブラリーから選別できる手段を示唆する。例えば、ｆｄファー ジ上の軽鎖レパートリ−を、ファージミド上に可溶性重鎮のライブラリーを抱え る細胞を感染せしめるのに用いることができる。アフィニティー精製したファー ジミドライブラリーを次に、アフィニティー精製ファージライブラリーで救済し たＥ、コリを感染せしめるのに利用することができ、そして新たな順列組合せラ イブラリーを更なる選別の工程にかけることができる。これにより、各精製工程 を経て、抗体の重鎮と軽鎖遺伝子は再シャツフルされる。最後に、数工程の後、 感染細菌をプレートし、そして抗原結合性ファージについて個別にスクリーンで きる。かかる「二重」順列組合せライブラリーは単一ベクター上でコードされる ものよりも潜在的により多様性である。１０７の軽鎖ファージ（ミド）の別々の ライブラリーを組合せることにより、表示されるＦａｂフラグメントの多様性（ 潜在的に１０−）は細菌数（１０”／す７）ル）によってのみ限定される。より 簡単には、２種のベクターの利用は、「構築」ライブラリーであって、固定化重 鎮又は軽鎖が、「よく調節された」抗体親和性及び特異性を授けるライブラリー 又はパートナ−（実施例２２）と対を成しているライブラリーの構築を助長もす る。

ＵＩ−Ｉ−Ｉｌ−Ｉ−Ｉ−１−）→く り　（ＩＪ　ＩＪ　ＩＪ　ＬＪ　ＬＪ　ＩＪ＋：　リ　”　）−）−１−１−ｔ −＋ヒ　く　リ　じＬ＋ロリリリ Ｈ＜　リ　（＜　＜（＜＜ Ｕ　リ　１−）Ｕとクリリし り　じとクリじす 口　Ｅ− じ　り　く　じ冒じ３に巴 り　Ｈト　リくじリクリ く　リ　ａ ８　ヮ　ト　じｉじじじじ リ　リ　Ｕ　りＬＪ　ｌｊ　Ｌ）りじ じ　８　に　已訃已已巴已 く　← １　と　リ　く　じりじりすく １−１−＋−１−ト←← ｔ？　詳　し　く　じりじり。じ ＢＢＢＢ３ｇご ｖｈ＜ｏａｖｕ Ｑυυ＜ＵＵＵ υυυ０υＣＪＣＪ 記浅足ゴ淀淀 υ（Ｊ（ＪＣＪ（Ｊυ○ ド肝肝■ 旨８８暗年８ ０ＱＯｏべＯベ ト　＜　０υ ＄　ヒ　■ 姿　０　ｉ目 ？　ＣＪ　ｔｓｕ Ｌ　８　ごＥＪ　ＣＪ（ＪＣＪＣＪυ○ぺｏ　ＬＩ　ＣＪＬ＋　ｕｔｐυＱυ− Ｑ淀　８　８藁　８ε壽化８８ （！ｌ　ａ　ｔｐｕ　（Ｊ（Ｊ（ＪＣ！ＩｃＪ（ＪＣＪＱりじ○○じ　＠リリリ 　じり シミ８禦８七　＜＜＜＜　＜＜ 淀８已冒ご８　リＬＪＬＪＩＪ　ＩＪす０じじ○く０　リリＵじ　ＬｊＬｊ （％＞　＊Ｒ１ｃ＝ｕ♀”ａ潰Ｃ’ｌ’！Ｚｌ−（＋ＧＬ）−（ＪｔＬ−Ａ　− 工、。ゎうイ、うヮーヶイ２＝　１０１２潜在的ライブラリーサイズ＝　１ｏ１ ２軽　鎖−ｇｌｌｌ−プラスミド　＋　可溶性−重　鎖　ファージ軽　鎖−ｇＩ ＩＩ−プラスミド　＋　可溶性−重　鎖　ファージミド軽　鎖−ｇｉｒｌ−ファ ージミド　＋　可溶性−重　鎖　ファージ軽　鎖−ｇｉｒｌ−ファージミド　＋ 　可溶性−重　鎖　プラスミド軽　鎖−ｇＨＩ−ファージ　＋　可溶性−重　鎮 　ファージミド軽　鎖−ｇＩＩＩ−ファージ　＋　可溶性−重　鎖　プラスミド 可溶性−軽　鎖−プラスミド　十　重　鎮−ｇｒＩＩ　ファージミド可溶性−軽 　鎖−ファージ　十　重　鎮−ｇｌＩ　Ｉ　ファージミド可溶性−軽　鎖−ファ ージ　十　重　鎮−ｔｒｉｌ　プラスミド可溶性−軽　鎖−ファージミド　十　 重　鎮−ｇＩＩｌ　プラスミド可溶性−軽　鎖−ファージミド　十　重　鎮−ｇ Ｈｌ　ファージＦｊｇ、５゜ 可溶性順列組合せライブラリー 、ヶ。うイ、うヮーツィ、ｒ＝２ｘ１０１３ＡｐａＬＩ　Ｐｓｔｌ　５ａｃｌ　 Ｘｈｏｌ　Ｎｏｔｌ＋抗原バインダーについて選別 ＋ｐＵＣ１９Ｆ５Ｂの中のクローン 可溶性発現についてチェック ＋　抗原バインダーについて選別 可溶性Ｆａｂ発現についてクローニング＋Ｆ５Ｂ！鎖に置き代わるためにρＵＣ １９にクローン÷ 可溶性発現についてチェック −−−−−−１−−−−−ｃ・ｍｙｃ＋ａｇ　−−−−−一−１トｆｄ−遺伝子 ＋　１１−１ａｃＺ　ｐｅｌＢｔａｇ　ｇｌｌｌ 明細書 特異的な結合ペアーの構成員の製造方法本発明は特異的な結合ベアーの構成員を 製造する方法に関連する。

本発明は更にこれらの方法により製造された生物学的結合分子に関連する。

一定の抗原に対するその高い特異性に基づき、モノクローナル抗体の登来（Ｋｏ ｈｌｅｒ、　ＧとＭｉｌｓｔｅｉｎ　Ｃ；　１９７５　Ｎａｔｕｒｅ　２５６　 ；　４９５）は科学的及び商業的の両者の重要な成果を伴う有意義な技術的打破 をもたらした。

モノクローナル抗体は伝統的には、特定の特異性を有する、一形態の生物学的に 機能的な抗体分子を分泌する、単独のイムノグロブリン生産性細胞に由来する不 死哺乳動物細胞系を樹立することにより作られている。抗体分泌性哺乳動物細胞 系は不死であるため、抗体の特異性はバッチ間で再現性がある。モノクローナル 抗体の重要な特性は特定の抗原に対するその特異性及びそれらが製造されうる際 の再現性にある。

構造的には、最も単純な抗体（ＩｇＧ）は４本のポリペプチド鎖、即ち、２本の 重（Ｈ）Ｍ及び２本の軽（鎖）を含んで成り、これらはジスルフィド結合によっ て相互連結している（図１４参照のこと）。

軽鎖はカッパー（に）及びラムダ（λ）と呼ばれる２通りの別個の形態において 存在する。それぞれの鎖は定常領域（Ｃ）及び可変領域（Ｖ）を有する。それぞ れの鎖は一連のドメインへと統合されている。軽鎖は２つのドメイン、即ち、Ｃ ｅＭ域に相当するものと■領域に相当する他のものとを存する。重鎮は４つのド メインを有し、１つはＶＳＪＩ域に相当し、そして３つのドメイン（１，２及び ３）は実施例５ Ｃ領域にある。この抗体は２本の腕（それぞれの腕はＦａｂｅｆｆ域である）を 存し、それぞれは互いに結合し合っているｖし及びｖＢＢ域を有する。このＶＳ Ｉ域（ＶＬとＶＨ）のペアーは抗体間で異なり（アミノ酸配列のバリエーション に原因する）、そしてそれらは共に抗原の認識及び抗原結合部位（＾ＢＳ）を担 うことの原因となっている。さらにより詳しくは、各ＶＳＩ域は、４つのフレー ムワーク領域（ＰＲ）で分割された３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）より成る。

ＣＤＲは可変領域のうちで最も可変性な部分であり、そしてそれらは臨界的な抗 原結合機能を担う。ＣＤＲ領域は組換、突然変異及び選別を含む複雑な過程を介 して、数多くの有用な生殖系列配列から得られる。

結合性抗原の機能は完全抗体のフラグメントに担われうることか示されている。

典型的な結合性フラグメントは（ｉ　）　ＶＬ、　ＶＨ，ＣＬ及びＣ）Ｉｔ　ド メインより成るＦａｂフラグメント；（ｉｉ）ＶＨ及びＣＨＩ　ドメインより成 るＦｄフラグメント；　（ｉｊ）抗体の一本の腕のＶＬ及びＶＨドメインより成 るＦｖフラグメント、（ｉｖ）ｄＡｂフラグメント（Ｗａｒｄ。

Ｅ、Ｓ、ら、Ｎａｔｕｒｅ　３４ユ、　５４４−５４６　（１９８９）　（これ はＶ）ｌドメインより成る）；　（Ｖ）単離化ＣＤＲＳ＋Ｉ域；並びに（ｖｉ） ヒンジ領域においてジスルフィド架橋によって連結された２本のＦａｂフラグメ ントを含んで成る二価フラグメントであるＦ（ａｂ’　Ｌフラグメント、である 。

うに［重複伸長によるスプライシング」によって構築した。集成遺ｐ）ＩＥＮＩ 　＆びｆｄＣＡＴ２を用いるハタテリオファージｆｄ上での、抗−オキサゾロン 抗体ＮＯＩＯ，１２，５に由来する一本鎖Ｆｖ及びＦａｂフラグメントの表示 一定の構築体（図１８参照）を、マウス抗＝ｐｈｏｘ（２−フェニル−５−オキ サシロン）抗体ＮＯ１０，１２，５（Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ、　Ｇ、Ｍ、ら、Ｎａ ｔｕｒｅ３１２、２７１−２７５．１９８４）に由来する可溶性Ｆａｂフラグメ ント（Ｂｅｔｔｅｒら１９８日、上記参照）の細菌における発現のためにデザイ ンされたクローン（本質的にはｐＬｌｃ１９における構築体■）より作った。構 築体■において、ＶＳＩ域はＮＧ　１０．１２．５に由来し、そしてヒ）Ｃに及 びＣＬ（１イソタイプ）定常ドメインに結合している。通常は軽鎖と重鎖抗体核 間の共有結合を形成するＣ末端システィン残基は両定常ドメインから除去されて いる。重鎮及び軽鎖遺伝子を一緒にＦａｂフラグメントとして（構築体■）又は 別々の鎖として（構築体■及び■）クローンするため、ＤＮＡをＰＣＲにより構 築体■から増幅させて、３′末端にＮｏｔｌ！ＩＩ限部位を、そして５末端にＡ ｐａＬ１部位（ｆｃｌ−ＣＡＴｚ　ヘのクローニングのため）又はＳｆｉ１部位 （ｐＨＥＮＩへのクローニングのため）のいづれかを導入する。Ｆａｂフラグメ ントをコードする遺伝子（構築体■）のＰＣＲ増幅のためにプライマーＦＡＢＮ ＯＴＦＯＫとν）ＩＩＢＡｃＫＡＰＡ　（又はＶＨＩＢＡＣＫＳＦ１１５）を、 重鎮（構築体■）のためにプライ７−ＦＡＢＮＯＴＦＯＨとＶ）ＩＩＢＡＣＫＡ ＰＡ　（又はＶ）ｌＩＢＡｃＫｓＦ１１５）を、そして軽鎖（構築体■）ために プライマーＦＡＢＮＯＴＦＯＲと門νＫＢＡＡＰへ（又は？ＩＶＫＢＡＳＦｌ） を用いる。

ＮＱ　Ｉｏ、１２．５の一本鎖ＦＶバージョン（構築体ｌ）は柔軟リンカ−（Ｇ ＩｙａＳｅｒ）により連結した重鎮（ＶＨ）と軽鎖（Ｖｋ）可変ドメインを有し くＨｕｓｔｏｎ、　Ｊ、Ｓ、ら、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、 　ＵＳＡ　８５５８７９−５８８３゜１９８８）　、そしてこれは構築体■から 、ＷＯ９２１０１０４７の実施例１４のよ転子をブライ７−ＶＫ３Ｆ２ＮＯＴ及 びＶ）ＩＩＢＡｃＫＡＰＡ　（又はＶ）ｌＩＢＡｃＫｓＦ１１５）　テ再増幅さ せて、ｆｄ−ＣＡＴｚ　（＾ｐａＬｒ−Ｎｏｔｌ）又はｐＨＥＮｌ　（Ｓｆｉ　 Ｉ　−Ｎｏｔ　Ｉ　）　ヘのクローニングのための制限部位を付加した。

制限部位に下線を付した。

ファージ及びファージミドの救済 構築体！−■（図１８）をｆｄ−ＣＡＴ２及びｐＦＩＥＮｌの両者に導入した。

ファージｆｄ−ＣＡＴ２（及びｆｄ−ＣＡＴ２−１．　ＩＩ、Ｉ［ｌ又は■）を 、１２．５μｇ／ｍｌのテトラサイクリンを有する２ＸのＴＹ培地の中での３７ °Ｃで一夜の振盪を経た感染化Ｅ、コリＴＧＩの上清液から獲得し、そしてＥＬ ＩＳＡに直接利用した。Ｅ、コリＴＧＩ　（ｓｕｐＥ）におけるファージミドｐ ＨＥＮ１（並びにｐ）ＩＥＮＩ−１及び■）を２ｍｌの２ｘのＴＹ培地、１００ μｇ／ｌ！＋のアンピシリン及び１％グルコースの中で一夜増殖させた（グルコ ースがないと、ｇ３ｐの発現はその後のへルバーファージによる重感染を妨げる ）。ｌＯμｌの一夜培養物を２ａ＋ｌの２ＸのＴＶ培培地１註０８５３７°Ｃで １時間振盪させた。これらの細胞を２ｘのＴＹ，　１００μｇ／＋ｅｌのアンピ シリンで洗って再懸濁し、そしてファージミド粒子を２μｍ（１０”ｐｆｕ）の ＶＣ３？１１３ヘルパーファージ（Ｓ　ｔｒａ　ｔａｇｅｎｅ　）の添加により 救済した。１時間増殖後、４μｌのカナマイシン（２５ｍｇ／ｍｌ）を加え、そ してこの培養物を一夜増殖させた。ファージミド粒子をポリエチレングリコール による沈殿によってＥＬＩＳＡのために１０倍にｆＡ縮した。

■、ファージゲノム中のインサートから、重鎮（ＶＨＣＨ）遺伝子を発現するフ ァージのライブラリーを調製する。

２、Ｅ、コリの中のプラスミド発現ベクター、好ましくはファージミドにおいて 軽鎖遺伝子のライブラリーを作り、そしてこのライブラリーから発現される可溶 性タンパク質軽鎖を発現させる。

３、ライブラリーに由来する可溶性タンパク質軽鎖をファージ上に表示される重 鎮ライブラリーに結合させる。

４、所望の親和性及び特異性の性質を有するファージを選別する。

これらは重鎮（ＶＨＣＨ）遺伝子をコードするであろう。

５、特定の重鎮と組合さった適切な抗原結合性部位を形成する軽鎖をコードする 軽鎖遺伝子を、好ましくは軽鎖を発現するファーシト含む細胞と、特定の重鎮を 発現するファージとの重感染を利用して単離し、そして抗原結合についてアッセ イする。

実施例６ ファージ上に表示される相補性抗体鎖をコードするファージによる、抗体の重鎮 又は軽鎖を有する遺伝子■タンパク質融合体をコードするファージミドの救済、 及び二重順列組合せライブラリーを作るためのこの技術の利用 ランダム順列組合せライブラリーでは、細菌細胞の形質転換効率に基づいて、表 示されるＦａｂフラグメントの潜在的な多様性に限界がある。この問題を解決す るためにここで説明する手法は（二重順列組合せライブラリー）、ファージの数 を１０７の係数に潜在的に高める。

重鎮と軽鎖との集成体を別々のベクターから発現させるため、ファージミド（ｐ ＨＥＮｌ−ｍ又は■）をＥ、コリＨＢ２１５１　（非サプレッサー株）の中で増 殖させて、可溶性鎖の製造を可能にし、そして上記の通りに救済したが、ただし パートナ−鎖をｇ３Ｐへの融合体として発現ずルヘ／Ｌ／　ハフ　７−ジ（それ ぞれ１０９ＴＵのｆｄ−ＤＯＧＩ−ＴＶ又は■）及びカナマイシの代わりに２μ Ｉのテトラサイクリン（１２，５ｍｇ／麟１）Ｆａｂフラグメントの重及び軽鎖 は同一のベクターの中で一緒に又は別々のベクターの中でコードされうる。これ を実証するため、重鎮（構築体■）をｐＨＥＮｌにクローンしく可溶性フラグメ ントを供するため）、そして軽鎖（構築体■）をｆｄ−ＤＯＧＩにクローンした 軸３ｐとの融合体を作るため）。Ｅ、コリＨＢ２１５１　（非サプレッサー）の 中で増殖させたファージミドｐＨＥＮ１−　ＩＩＩをｆｄ−ＤＯＧ−ＩＶファー ジで救済し、そしてファージ（ミド）はｐＢＳ＾ではなく、ｐｈｏｘ　：　ＢＳ Ａに結合することが示された（表２）。このことは、可溶性軽鎖がｇ３ρに結合 している重鎮と正しく結合することを示し、なぜなら重鎮も軽鎖も単独では抗原 に結合しないからである（表２）。

類似の結果が逆の実験（ファージミドｐＨＥＮ−１−ＩＶ及びｆｄ−ＣＡＴ２− 　ＩＩＩファージ）において得られ、ここでは重鎮を可溶性分子として、そして 軽鎖はｇ３ｐに結合させて製造した（表２）。従って、Ｆａｂフラグメントは重 鎖又は軽鎖のいづれかのｇ３ｐへの融合によりファージの表層上に集成され、供 される他方の鎖は同−又は別々のベクターを利用して分泌される。

他方、重鎮及び軽鎖のライブラリーを同一の細胞の中で発現させるために、ｇ３ ｐ融合体をコードするファージベクター及び可溶性鎖をコードするファージミド は異なるベクターにクローンすることができる。このファージはヘルパーとして 働き、そして感染細菌はパンケージ型ファージ及びファージミドの両者を製造す る。各ファージ又はファージミドは両方の鎖を表示するが、しかし一方の鎖のみ をコードし、従って抗原結合性部位の半分の遺伝情報のみをコードする。しかし ながら、両方の抗体鎖についての遺伝子は選別培地上にプレートすることにより 別々の回収でき、相互に相補性な抗原結合性重鎮及び軽鎖の組合せの対がランダ ム順列組合せライブラリーから選別できる手段を示唆する。例えば、ｆｄファー ジ上の軽鎖レパートリ−を、ファージミド上に可溶性重鎮のライブラリーを抱え る細胞を感染せしめるのに用いることができる。アフィニティー精製したファー ジミドライブラリーを次に、アフィニティー精製ファージライブラリーで救済し たＥ、コリを感染せしめるのに利用することができ、そして新たな順列組合せラ イブラリーを更なる選別の工程にかけることができる。これにより、各精製工程 を経て、抗体の重鎮と軽鎖遺伝子は再シャツフルされる。最後に、数工程の後、 感染細菌をプレートし、そして抗原結合性ファージについて個別にスクリーンで きる。かかる「二重」順列組合せライブラリーは単一ベクター上でコードされる ものよりも潜在的により多様性である。１０７の軽鎖ファージ（ミド）の別々の ライブラリーを組合せることにより、表示されるＦａｂフラグメントの多様性（ 潜在的に１０”）は細菌数（１０′２／リツトル）によってのみ限定される。よ り簡単には、２種のベクターの利用は、「構築Ｊライブラリーであって、固定化 重鎮又は軽鎖が、「よく調節された」抗体親和性及び特異性を授けるライブラリ ー又はパートナ−と対を成しているライブラリーの構築を助長もする。

１＋＋＋＋１＋＋ｌ　Ａ＋ｌＬ＋１＋＋　ｖ−ρＣＴ／Ｇ８　９２１００８８３ 国際調査報告 フロントページの続き （５１）Ｉｎｔ、Ｃ１，５識別記号　庁内整理番号ＧＯＩＮ　３３１５３　Ｄ　 ８３１０−２Ｊ３３１５３１　Ａ　８３１０−２Ｊ ／／（Ｃ１２Ｐ　２１１０２ Ｃ１２Ｒ１：１９） （３１）優先権主張番号　９２０６３１８．９（３２）優先臼　１９９２年３月 ２４日（３３）優先権主張国　イギリス（ＧＢ）（８１）指定回　ＥＰ（ＡＴ、 ＢＥ、ＣＨ，ＤＥ。

ＤＫ、ＥＳ、ＦＲ，ＧＢ、ＧＲ，ＩＴ、ＬＵ、ＭＣ，ＮＬ、ＳＥ）、０Ａ（ＢＦ 、ＢＪ、ＣＦ、ＣＧ、ＣＩ、ＣＭ、ＧＡ、ＧＮ、ＭＬ、ＭＲ，ＳＮ、ＴＤ、ＴＧ ）、ＡＴ、　ＡＵ、　ＢＢ、　ＢＧ、　ＢＲ，ＣＡ、　ＣＨ，Ｃ３，ＤＥ。

ＤＫ、　ＥＳ、　ＦＩ、　ＧＢ、　ＨＵ、ＪＰ、　ＫＰ、　ＫＲ，ＬＫ、ＬＵ、 ＭＧ、ＭＮ、ＭＷ、ＮＬ、Ｎｏ、ＰＬ、ＲＯ、ＲＵ、　ＳＤ、　ＳＥ、　ＵＳ Ｉ （７２）発明者　ジョンソン、ケビン　ステユアートイギリス国、ケンブリッジ シャー　ピーイー１８８イーエツクス、ゴツトマンチェスター、ホルムヒル　３ ２ （７２）発明者　グリフイス、アンドリュー　デビットイギリス国、ケンブリッ ジ　シーピー１４エーワイ、チェリー　ヒントン　ロード、ライラック　コート 　２８ （７２）発明者　スミス、アンドリュー　ジョン　ハモンドイギリス国、ケンブ リッジ　シーピー２２ビーアイ、デボンシャー　ロード、デボンシャー　ミュー ズ　８２

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．多量体特異的結合性ペアー（ｓｂｐ）構成員を製造する方法であって、組換 宿主生物細胞中のベクターから、分泌型複製可能な遺伝子表示パッケージ（ｒｇ ｄｐ）の成分に融合した特異的結合性ペアー構成員の第一ポリペプチド領の集団 を発現させ、これにより前記ポリペプチド鎖はこのｒｇｄｐの表層において表示 され、次いで前記集団を、前記特異的結合性ペアー構成員の第二ポリペプチド鎖 、この第一と第２ポリペプチド鎖とが一緒になってｒｇｄｐにより表示される前 記多量体特異的結合性ベアー構成員のライブラリーを成形するようにすることに よって、組合せることを含んで成り、ここで前記第二ポリペプチド鎖の集団は前 記第一ポリペプチド鎖の集団と同一のベクターからは発現されず、前記集団のう ちの少なくとも一方は遺伝子的に多様性であり、且つ、前記ｒｇｄｐ成分を利用 してパッケージされることのできる核酸から発現し、これにより前記ｒｇｄｐそ れぞれの遺伝子材料は前記遺伝子的に多様性な集団のポリペプチド鎖をコードし ている方法。 ２．前記集団の少なくとも一方がファージベクターより発現される、請求項１に 記載の方法。 ３．前記集団の少なくとも一方がファージベクターより発現される方法であって 、前記ファージミドゲノムのパッケージを助けるための相補性ファージ遺伝子を 発現するヘルパーファージ又はブラスミドを利用することを含み、そして前記ｒ ｇｄｐの成分がそのカスピドタンパク質である、請求項１又は請求項２に記載の 方法。 ４．前記第一及び第二ポリペプチド鎖が同一の宿主生物細胞において発現される 、請求項１〜３のいづれか１項に記載の方法。 ５．前記ポリペプチド鎖それぞれが、前記成分融合生成物を利用してｒｇｄｐと してパッケージされることのできる核酸から発現し、これにより両方の前記ポリ ペプチド鎖に関するコード核酸がそれぞれのｒｇｄｐの中にパッケージされてい る、先の請求項のうちのいづれか１項に記載の方法。 ６．前記第一ポリペプチド鎖の集団を発現することのできるベクターを、前記第 二ポリペプチド鎖を遊離形態において発現する宿主生物の中に導入するか、又は 前記第二ポリペプチド鎖の集団を遊離形態において発現することのできるベクタ ーを、前記第一ポリペプチド鎖の集団を発現する宿主生物の中に導入することを 含んで成る、先の請求項のうちのいづれか１項に記載の方法。 ７．前記第二ポリペプチド鎖がそれぞれｒｇｄｐの成分との融合体として発現さ れ、これによりｒｇｄｐの表層において前記第二ポリペプチド鎖が表示される、 請求項１〜５のいづれか１項に記載の方法。 ８．第二ポリペプチド鎖の集団が第一ポリペプチド鎖の集団と同一の宿主生物細 胞において発現される方法であって、下記の追加の工程： （ａ）可溶性第二ポリペプチドの集団と、第一ポリペプチド鎖の集団を表示する ｒｇｄｐとの細胞外混合物を形成し；次いで（ｂ）この第一と第二のポリペプチ ド鎖とが一緒になって前記多量体特異的結合性ペアー構成員のライブラリーを形 成させるようにする； ことを含んで成る請求項１〜３のいづれか１項に記載の方法。 ９．前記第一と第二ポリペプチド鎖とが一緒になって前記ライブラリーを形成す るように再結合させる前に、前記混合物を部分的に変性させる、請求項８に記載 の方法。 １０．前記第二ポリペプチド鎖の集団が、ヒト又は動物起源から精製したポリペ プチドのレパートリーを含んで成る、請求項９に記載の方法。 １１．任意の前記ポリペプチド鎖の集団が：（ｉ）相補性ｓｂｐ構成員で免疫し た動物の並べがえしたイムノグロブリン遺伝子のレパートリー； （ｉｉ）相補性ｓｂｐ構成員で免疫していない動物の並べかえしたイムノグロブ リン遺伝子のレパートリー；（ｉｉｉ）人工的に並べかえしたイムノグロブリン 遺伝子のレパートリー； （ｉｖ）イムノグロブリン同族遺伝子のレパートリー；（ｖ）生殖系列遺伝子に 由来する配列のレパートリー；（ｖｉ）１又は複数箇所での点突然変異の導入に より人工的に変異されたイムノグロブリン遺伝子のレパートリー；（ｖｉｉ）（ ｉ），（ｉｉ），（ｉｉｉ），（ｉｖ），（ｖ）と（ｖｉ）の複合物； に由来する、請求項１〜１０のいづれか１項に記載の方法。 １２．前記ｓｈｐ構成員がイムノグロブリンドメインである、又はそれに相同性 である、先の請求項のいづれか１項に記載の方法。 １３．前記ｒｇｄｐがバクテリオファージであり、前記宿主が細菌であり、そし て前記ｒｇｄｐの成分がバクテリオファージにとってのカスピドタンパク質であ る、先の請求項のいづれか１項に記載の方法。 １４．前記ファージがフィラメント状ファージである、請求項１３に記載の方法 。 １５．前記ファージが、クラス１ファージ、ｆｄ，Ｍ１３，ｆ１，Ｉｆ１，Ｉｋ ｅ．ＺＪ／Ｚ，Ｆｆ、並びにクラスＩＩファージ、Ｘｆ，Ｐｆ１，及びＰｆ３よ り選ばれる、請求項１４に記載の方法。 １６．前記第一ポリペプチド鎖が、ファージｆｄの遺伝子ＩＩＩカスピドタンパ ク質との、又は別のフィラメント状ファージにおけるその対応物との融合体とし て発現される、請求項１４又は請求項１５に記載の方法。 １７．前記第一ポリペプチド鎖をそれぞれ、分泌リーダー配列の下流の成熟カス ピドタンパク質のＮ−末端領域に挿入する、請求項１６に記載の方法。 １８．前記宿主がＥ．コリである、請求項１３〜１７のいづれか１項に記載の方 法。 １９．ｓｂｐ構成員ポリペプチドをコードする核酸が、ウイルスカスピドタンパ ク質の下流に連結され、制御する可能な翻訳停止コドンに至っている、先の請求 項のいづれか１項に記載の方法。 ２０．前記発現により形成さるｒｇｄｐを、ポリペプチド鎖をコードする核酸を 有する対応のｒｇｄｐに結合した個々のｓｂｐ構成員又は前記ｓｈｐ構成員の複 合集団を供するために選別又はスクリーンに付する、先の請求項のいづれか１項 に記載の方法。 ２１．前記ｒｇｄｐを、前記ｓｂｐ構成員に相補性な構成員との親和性により選 別する、請求項２０に記載の方法。 ２２．前記相補性ｓｂｐ構成員に結合した任意のｒｇｄｐを溶離液で洗浄するこ とにより回収することを含んで成る、請求項２１に記載の方法。 ２３．前記溶離液が、相補性ｓｂｐ構成員に対する結合に関して前記ｒｇｄｐと 競合する分子を含んでいる、請求項２２に記載の方法。 ２４．ｒｇｄｐを前記相補性ｓｈｐ構成員に、前記相補性ｓｂｐ構成員に対する 結合に関して前記パッケージと競合する分子の存在下において適用する、請求項 ２１〜２３のいづれか１項に記載の方法。 ２５．選別又はスクリーンに付したｒｇｄｐに由来する核酸を、組換宿主生物の 中で前記ｓｂｐ構成員又はそのフラグメントもしくは誘導体を発現させるために 用いる、請求項２０〜２４のいづれか１項に記載の方法。 ２６．１又は数種のｒｇｄｐ由来の核酸を獲得し、そして個々のｓｂｐ構成員も しくはｓｂｐ構成員の複合集団、又はそのポリペプチド鎖成分、又はそのコード 核酸を獲得するための更なる方法に用いる、請求項２０に記載の方法。 ２７．獲得した核酸が前記第一ポリペプチド鎖をコードし、そしてこれを、前記 第二ポリペプチド鎖をコードする核酸の遺伝子的に多様性なレパートリーに由来 する核酸をも導入された組換ベクターの中に導入するか、又は獲得した核酸が前 記第二ポリペプチド鎖をコードし、そしてこれを、前記第一ポリペプチド鎖をコ ードする核酸の遺伝子的に多様性なレパートリーに由来する核酸をも導入された 組換ベクターの中に導入する、請求項２６に記載の方法。 ２８．第一ポリペプチド鎖をコードする核酸を含んで成るベクターと、第二ポリ ペプチド鎖をコードする核酸を含んで成るベクターとの細胞間組換により、組換 ベクターか製造されるようにする工程を含む請求項２７に記載の方法。 ２９．前記細胞間組換を、部位特異的組換が起こるであろう配列をベクターの中 に含ませることによって助長せしめる、請求項２８に記載の方法。 ３０．得られる前記組換ベクターが、第一と第二ベクターとの組換に由来するイ ムノグロブリンの一本鎖Ｆｖ領域誘導体をコードする核酸を含んで成る、請求項 ２９に記載の方法。 ３１．部位特異的組換が起こるであろう配列がコリファージＰ１より獲得できる ＩｏｘＰ配列であり、そして部位特異的組換が、これもコリファージＰ１より獲 得できるＣｒｅ−リコンビナーゼにより触媒される、請求項２９又は３０に記載 の方法。 ３２．利用するＣｒｅ−リコンビナーゼが調節性プロモーターの制御下で発現可 能である、請求項３１に記載の方法。 ３３．前記第一ポリペプチド鎖をコードする核酸を含んで成るベクターがファー ジもしくはファージミドであり、そして前記第二ポリペプチド鎖をコードする核 酸を含んで成るベクターがブラスミドであるか、又は前記第一ポリペプチド鎖を コードする核酸を含んで成るベクターがブラスミドであり、そして前記第二ポリ ペプチド鎖をコードする核酸を含んで成るベクターがファージもしくはファージ ミドであり、そして細胞間組換が、ブラスミドをファージもしくはファージミド に優先して複製するか、又はファージもしくはファージミドをブラスミドに優先 して複製する細菌宿主の中で行う、請求項２８〜３２のいづれか１項に記載の方 法。 ３４．前記宿主細胞がＥ．コリ又はその他のグレイン陰性菌のＰｏｌＡ株である 、請求項３３に記載の方法。 ３５．多量体特異的結合性ペアー（ｓｂｐ）構成員を製造する方法であって、 （１）（ａ）特異的結合性ペアー構成員の第一ポリペプチド鎖と分泌型複製可能 な遺伝子表示パッケージ（ｒｇｄｐ）の成分との融合体の集団をコードする核酸 を含んで成る第一ベクターと、（ｂ）特異的結合性ペアー構成員の第二ポリペプ チド鎖の集団をコードする核酸を含んで成る第二ベクターとの細胞間組換えを行 い（ここで前記集団の少なくとも一方は遺伝子的に多様性であり、この組換えは 、それぞれが前記ポリペプチド融合体と前記第二ポリペプチド鎖とをコードする 核酸を含んで成り、且つ、前記ｒｇｄｐ成分を利用してパッケージされることの できる組換ベクターをもたらす）；次いで（ｉｉ）前記ポリペプチド融合体及び 前記第二ポリペプチド鎖を発現させ、表層に前記第一と第二ポリペプチド鎖とを 表示し、且つそれぞれが前記第一ポリペプチド鎖と前記第二ポリペプチド鎖とを コードする核酸を含んで成るｒｇｄｐを製造すること；を含んで成る方法。 ３６．前記細胞間組換を、部位特異的組換が起こるであろう配列をベクターの中 に含ませることによって助長せしめる、請求項３５に記載の方法。 ３７．得られる前記組換ベクターが、第一と第二ベクターとの組換に由来するイ ムノグロブリンの一本鎖Ｆｖ領域誘導体をコードする核酸を含んで成る、請求項 ３６に記載の方法。 ３８．部位特異的組換が起こるであろう配列がコリファージＰ１より獲得できる ＩｏｘＰ配列であり、そして部位特異的組換が、これもコリファージＰ１より獲 得できるＣｒｅ−リコンビナーゼにより触媒される、請求項３６又は３７に記載 の方法。 ３９．利用するＣｒｅ−リコンビナーゼが調節性プロモーターの制御下で発現可 能である、請求項３８に記載の方法。 ４０．前記第一ベクターがファージもしくはファージミドであり、そして前記第 二ベクターがブラスミドであるか、又は前記第一ベクターがブラスミドであり、 そして前記第二ベクターがファージもしくはファージミドであり、そして細胞間 組換が、ブラスミドをファージもしくはファージミドに優先して複製するか、又 はファージもしくはファージミドをブラスミドに優先して複製する細菌宿主の中 で行う、請求項３５〜３９のいづれか１項に記載の方法。 ４１．前記宿主細胞がＥ．コリ又はその他のグレイン陰性菌のＰｏｌＡ株である 、請求項３９に記載の方法。 ４２．１又は数種のｒｇｄｐ由来の核酸で獲得とし、そして個々のｓｂｐ構成員 もしくはｓｂｐ構成員の複合集団、又はそのポリペプチド鎖成分、又はそのコー ド核酸を獲得するための更なる方法に用いる、請求３５〜４１のいづれか１項に 記載の方法。 ４３．課題の対応の特異的結合性構成員に対して特異性である特異的結合性ペア ー（ｓｂｐ）の多重鎖ポリペプチド構成員の一集団又は特定の集団を製造する方 法であって、下記の工程：（ｉ）複製可能な遺伝子表示パッケージ（ｒｇｄｐ） の成分に融合した、前記多重鎖タンパク質の第一ポリペプチド鎖の遺伝子的に多 様性な集団を組換宿主生物の細胞中のベクターから発現させ、これにより前記ポ リペプチド鎖はｒｇｄｐの表層で表示され；（ｉｉ）前記集団を、この第一ポリ ペプチド鎖の集団と同一のベクターからは発現されない前記多重鎖ｓｈｐ構成員 の第二ポリペプチド鎖の固有又は限定集団と組合せ、前記組合せはｒｇｄｐによ り表示される前記多重鎖ｓｂｐ構成員のライブラリーを形成せしめ、ここで前記 遺伝子的に多様性な集団は前記ｒｇｄｐ成分を利用してパッケージされることの できる核酸から発現され、これにより前記ｒｇｄｐそれぞれの遺伝子材料は前記 第一ポリペプチド鎖をコードし；（ｉｉｉ）前記第一ポリペプチド鎖をコードす る核酸を有する対応のｒｇｄｐに結合している、前記対応ｓｈｐ構成員に対して 特異的な課題の多重鎖ｓｈｐ構成員の、前記対応ｓｂｐ構成員との親和性による 選別を行い； （ｉｖ）工程（ｉｉｉ）において選別した前記多重鎖ｓｂｐ構成員の第一ポリペ プチド鎖を、多重鎖ｓｂｐ構成員の第二ポリペプチド鎖の遺伝子的に多様性な集 団と組合せること〔ここで前記第二ポリペプチド鎖はｒｇｄｐの成分に融合され 、これによりそれらはｒｇｄｐの表層に表示され、この工程（ｉｖ）における前 記組合せが多重鎖ｓｈｐ構成員のライブラリー（これより前記対応ｓｂｐ構成員 に対して特異的な１又は複数の多重鎖ｓｂｐ構成員が、それとの親和性によって 選別可能である）を形成せしめる〕； を含んで成る方法。 ４４．前記多重鎖ｓｂｐ構成員が抗体、又はイムノグロブリン科のその他の構成 員、又はその結合性フラグメントである、請求項４３に記載の方法。 ４５．工程（ｉｉ）において組合せる前記第二鎖それぞれが、（ｉｉｉ）課題の 抗原に対して特異的な非ヒト動物抗体に由来する可変性ドメインを含んで成る、 請求項４４に記載の方法。 ４６．前記第二ポリペプチド鎖がヒト抗体ドメインを含んで成るキメラである、 請求項４５に記載の方法。 ４７．前記ヒト抗体ドメインがＣｙ１を含んで成る、請求項４６に記載の方法。 ４８．（ｖ）前記抗原に対するヒト化抗体をそれとの親和性により選別する追加 の工程を含んで成る、請求項４４〜４７に記載の方法。 ４９．請求項１〜４８のいづれか１項に記載の方法と実施するために利用するキ ットであって、この方法を実施するために必要な付随的な成分の他に下記の成分 ： （ｉ）下記の特徴を有するベクター： （ａ）一本鎖バクテリオファージにとっての複製起点、（ｂ）ｓｂｐ構成員又は そのポリペプチド成分をコードする核酸の挿入のための制限部位、（ｃ）前記制 限部位がファージカスピドタンパク質の成熟コード配列の５′末端領域にあるこ と、及び（ｄ）前記部位の上流に、カスピドタソバク質とｓｂｐポリペプチドと の融合体を細菌宿主の細胞周辺腔へと導く分泌リーダー配列を有すること；並び に（ｉ）に記載したベクターの特徴（ａ），（ｂ），（ｃ）及び（ｄ）の一部又 は全てを有する別のベクター、を有する前記のキット。 ５０．請求項３６〜４１のいづれか１項に記載の方法を実施するために利用する キットであって、この方法を実施するために必要な付随の成分に加えて、下記の 成分： （ｉ）下記の特徴を有するベクター （ａ）ｓｂｐ構成員又はそのポリペプチド成分をコードする核酸の挿入のための 制限部位、（ｂ）前記制限部位がフアージカスビドタンパク質の成熟コード配列 の５′末端にあること、及び（ｃ）カスピドタンパク質とｓｂｐポリペプチドと の融合体と細菌宿主の細胞周辺腔へと導く分泌リーダー配列が前記の部位の上流 にあること；並びに （ｉｉ）前記第二ポリペプチド鎖をコードする核酸の挿入のための制限部位を有 する第二ベクター； （ｉｉｉ）一本鎖バクテリオファージにとっての複製起点を有する少なくとも一 つのベクター；並びに （ｉｖ）部位特異的組換が起こるであろう配列を有するベクター；を有する前記 のキット。