CN102574917A - 含有抗hb-egf抗体作为有效成分的药物组合物 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种具有内化活性的抗HB-EGF抗体。优选细胞毒性物质与本发明的抗HB-EGF抗体结合。另外，本发明还提供含有本发明的抗体作为有效成分的癌治疗剂及细胞增殖抑制剂，以及以给与本发明的抗体为特征的癌的治疗方法及诊断方法。利用本发明的癌治疗剂能够治疗的癌包括胰腺癌、肝癌、食道癌、黑色素瘤、大肠癌、胃癌、卵巢癌、宫颈癌、乳癌、膀胱癌、脑肿瘤或血液癌。

Description

含有抗HB-EGF抗体作为有效成分的药物组合物

相关申请

本申请要求基于国际申请PCT/JP2009/003915(2009年8月17日申请)的优先权，将其内容作为参照引入本说明书中。

技术领域

本发明涉及癌的治疗方法及抗癌剂。

背景技术

肝素结合表皮生长因子样生长因子(Heparin-binding epidermalgrowth factor-like growth factor：HB-EGF)是属于EGF配体家族的生长因子。缺失HB-EGF基因的敲除小鼠表现出伴有心脏肥大的心功能衰竭等极其严重的表型，出生之后立即死亡(非专利文献1)。这表明HB-EGF与妊娠期心脏的形成有非常密切的关系。另一方面，即使在成人中，其表达也分布在肺、心脏、脑、骨骼肌等比较广的组织中(非专利文献2)，HB-EGF不仅在妊娠期而且在成人中也发挥着对维持生物体功能极其重要的作用(非专利文献3)。

在生物体内，HB-EGF以2种不同的结构体的形式存在，即，在表达HB-EGF的细胞的细胞表面上表达的膜型HB-EGF(以下称作proHB-EGF)、和从细胞中游离存在的分泌型HB-EGF(以下称作sHB-EGF或活性型HB-EGF)。图1表示proHB-EGF及sHB-EGF的结构的模式图。proHB-EGF的前体蛋白质由208个氨基酸构成，从N末端开始由信号肽、前肽、肝素结合域、EGF样域、近膜域、跨膜结构域、胞质域构成。proHB-EGF的前体蛋白质的信号肽被切断后，proHB-EGF以1型膜蛋白质的形式表达。之后，proHB-EGF经过被称作胞外域脱落(ectodomain shedding)的蛋白酶消化，以由73～87个氨基酸残基构成的sHB-EGF的形式被释放到细胞外。上述sHB-EGF仅由2个结构域构成，即，肝素结合域和EGF样域，作为活性型配体与EGF受体(Her1)及EGF受体4(Her4)结合。结果通过位于其下游的ERK/MAPK信号通路，诱导NIH3T3细胞、平滑肌细胞、上皮细胞、角质细胞、肾小管细胞等各种细胞的增殖(非专利文献4)。在经过胞外域脱落的部位引入突变、仅表达proHB-EGF的细胞的增殖能力显著降低。另外，仅表达proHB-EGF的转基因小鼠显示出与HB-EGF敲除小鼠相同的表型。基于上述观察，认为作为HB-EGF的增殖因子的功能主要由分泌型HB-EGF承担(非专利文献5及6)。

另一方面，已知proHB-EGF也在生物体内发挥与sHB-EGF不同的独特的功能。最初已知proHB-EGF作为白喉毒素(DT)的受体发挥功能(非专利文献7及8)。但是，根据此后的研究表明，proHB-EGF在细胞表面与DRAP27/CD9、及整联蛋白(integrin)α₃β₁、硫酸肝素等分子形成复合体，参与细胞粘合和迁移(migration)。另外，表明proHB-EGF利用近分泌机制，通过EGF受体(以下称作EGFR)，抑制邻近的细胞的增殖及诱导邻近的细胞凋亡。如上所述，关于作为针对EGFR的配体的HB-EGF，已知膜型proHB-EGF及分泌型sHB-EGF传递完全相反的信号(非专利文献5及8)。

HB-EGF在癌细胞等各种细胞株中具有强力地促进细胞增殖、细胞运动、浸润的活性。进而，报道了HB-EGF的表达与在正常组织中相比，在胰腺癌、肝癌、食道癌、黑色素瘤、大肠癌、胃癌、卵巢癌、宫颈癌、乳癌、膀胱癌及脑肿瘤等广泛的癌症种类中上升，这表明HB-EGF与癌的增殖和恶性化有密切的关系(非专利文献4及10)。

因此，基于上述发现，尝试了通过抑制HB-EGF的活性，抑制癌细胞的增殖。对于利用了抗HB-EGF中和抗体来抑制HB-EGF的作用的尝试，已经报道了对3T3细胞的DNA合成的抑制效果(非专利文献11)、对角质形成细胞的增殖抑制效果(非专利文献12)、对神经胶质瘤细胞的增殖抑制效果(非专利文献13)、对骨髓瘤细胞的DNA合成抑制效果(非专利文献14)等。

另一方面，还尝试了将与HB-EGF特异性结合的衰减白喉毒素(CRM 197)作为HB-EGF抑制剂使用。实际上在使用移植了卵巢癌癌细胞株的异种移植(xenograft)小鼠模型的药效试验中，在给与CRM197的组中确认到优异的肿瘤缩小效果(非专利文献15)，进而，在癌患者中也进行了使用CRM 197的临床试验(非专利文献16)。WO 2008/047914及WO 2008/047925中公开了使用抗HB-EGF的癌的治疗。

本说明书中引用的参考文献如下所述。这些文献中记载的内容全部作为本说明书的一部分引用在本说明书中。这些文献都不被认为是本说明书的现有技术。

专利文献1：WO 2008/047914

专利文献2：WO 2008/047925

非专利文献1：Iwamoto R，Yamazaki S，Asakura M et al.，Heparin-binding EGF-like growth factor and ErbB signaling is essential forheart function.Proc.Natl.Acad.Sci.USA，2003；100：3221-6.

非专利文献2：Abraham JA，Damm D，Bajardi A，Miller J，Klagsbrun M，Ezekowitz RA.Heparin-binding EGF-like growthfactor：characterization of rat and mouse cDNA clones，protein domainconservation across species，and transcript expression in tissues.Biochem Biophys Res Commun，1993；190：125-33.

非专利文献3：Karen M.，Frontiers in Bioscience，3，288-299，1998.

非专利文献4：Raab G，Klagsbrun M.Heparin-binding EGF-likegrowth factor.Biochim Biophys Acta，1997；1333：F179-99.

非专利文献5：Yamazaki S，Iwamoto R，Saeki K et al.Mice withdefects in HB-EGF ectodomain shedding show severe developmentalabnormalities.J细胞Biol，2003；163：469-75.

非专利文献6：Ongusaha P.，Cancer Res，(2004)64，5283-5290.

非专利文献7：Iwamoto R.，Higashiyama S.，EMBO J.13，2322-2330(1994).

非专利文献8：Naglich JG.，Metherall JE.，cell，69，1051-1061(1992).

非专利文献9：Iwamoto R，Handa K，Mekada E.Contact-dependent growth inhibition and apoptosis of epidermal growth factor(EGF)receptor-expressing cells by the membrane-anchored formof heparin-binding EGF-like growth factor.J.Biol.Chem.1999；274：25906-12.

非专利文献10：Miyamoto S，Cancer Sci.97，341-347(2006).

非专利文献11：Blotnick S.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，(1994)91，2890-2894.

非专利文献12：Hashimoto K.，J.Biol.Chem.(1994)269，20060-20066.

非专利文献13：Mishima K.，Act Neuropathol.(1998)96，322-328.

非专利文献14：Wang YD.Oncogene，(2002)21，2584-2592.

非专利文献15：Miyamoto S.，Cancer Res.(2004)64，5720-

非专利文献16：Buzzi S.，Cancer Immunol Immunother，(2004)53，1041-1048.

发明内容

本发明的目的在于提供一种作为药品特别有用的抗HB-EGF抗体。更详细而言，本发明的目的在于提供与HB-EGF的特定抗原决定部位结合的抗HB-EGF抗体、使用了该抗体的治疗癌的新方法、含有该抗体的新的细胞增殖抑制剂及抗癌剂。

本发明人等发现识别特定的抗原决定部位的抗HB-EGF抗体作为药品特别有用。进而，基于以上发现，本发明人等发现抗HB-EGF抗体对以卵巢癌为代表的HB-EGF表达亢进的癌的治疗有效，从而完成了本发明。

本发明人等通过用HB-EGF蛋白质来免疫小鼠，制作单克隆抗体，结果可知所得抗体具有内化活性。另外，使细胞毒性物质与所得具有内化活性的抗HB-EGF抗体结合，测定其细胞凋亡诱导活性，结果确认了有意义的细胞凋亡诱导活性。进而，测定所得抗HB-EGF抗体的ADCC活性及CDC活性，结果确认了抗HB-EGF抗体具有ADCC活性及/或CDC活性。

即，本申请提供以下(1)～(19)中任一项所述的单克隆抗体和其低分子化抗体、以及其用途。

(1)以下[1]～[2]中任一项所述的抗HB-EGF抗体：

[1]抗体，包含H链及L链，

所述H链具有序列号1记载的氨基酸序列作为CDR1、序列号2记载的氨基酸序列作为CDR2、序列号3记载的氨基酸序列作为CDR3，

所述L链具有序列号4记载的氨基酸序列作为CDR1、序列号5记载的氨基酸序列作为CDR2、序列号6记载的氨基酸序列作为CDR3；

[2]抗体，结合在与[1]所述的抗体结合的抗原决定部位相同的抗原决定部位。

(2)如(1)所述的抗HB-EGF抗体，具有内化活性。

(3)如(1)或(2)所述的抗HB-EGF抗体，结合了细胞毒性物质。

(4)如(1)～(3)中任一项所述的抗HB-EGF抗体，具有ADCC活性或CDC活性。

(5)如(1)～(4)中任一项所述的抗HB-EGF抗体，还具有中和活性。

(6)如(1)～(5)中任一项所述的抗HB-EGF抗体，结合了标记物。

(7)一种药物组合物，含有(1)～(6)中任一项所述的抗体。

(8)一种药物组合物，含有与(1)～(6)中任一项所述的抗体结合了的细胞毒性物质。

(9)如(7)或(8)所述的药物组合物，为细胞增殖抑制剂。

(10)如(9)所述的药物组合物，为抗癌剂。

(11)如(10)所述的药物组合物，其中，癌为胰腺癌、肝癌、食道癌、黑色素瘤、大肠癌、胃癌、卵巢癌、宫颈癌、乳癌、膀胱癌、脑肿瘤或血液癌。

(12)一种方法，是使用(1)～(6)中任一项所述的抗HB-EGF抗体将细胞毒性物质转运到细胞内的方法。

(13)一种方法，是通过与(1)～(6)中任一项所述的抗HB-EGF抗体结合了的细胞毒性物质抑制细胞增殖的方法。

(14)如(13)所述的方法，其中，细胞为癌细胞。

(15)如(12)～(14)中任一项所述的方法，其中，细胞毒性物质为化疗剂、放射性物质、或毒性肽。

(16)(1)～(6)中任一项所述的抗HB-EGF抗体的用途，用于将细胞毒性物质转运到细胞内。

(17)具有内化活性的(2)～(6)中任一项所述的抗HB-EGF抗体用途，用于抑制细胞增殖。

(18)如(16)或(17)所述的用途，其中，细胞为癌细胞。

(19)如(16)～(18)中任一项所述的应用，其中，细胞毒性物质与抗HB-EGF抗体结合。

附图说明

[图1]为模式化地表示proHB-EGF、sHB-EGF及作为免疫原使用的HB-EGF_Fc的结构的图。

[图2a]为模式化地表示通过HB-EGF与EGFR_Ba/F3细胞的结合对该细胞产生的影响的图。

[图2b]为表示EGFR_Ba/F3细胞的HB-EGF浓度依赖性增殖的曲线图。

[图3]为表示HC-15抗体对EGFR_Ba/F3细胞的HB-EGF依赖性增殖的中和活性的曲线图。

[图4]表示HC-15抗体的可变区的序列。

[图5]为表示抗体HA-20、HB-20及HC-15对活性型HB-EGF的结合活性的曲线图。

[图6]为表示抗体HA-20、HB-20及HC-15对proHB-EGF的结合活性的直方图。

[图7]为模式化地表示HB-EGF抗体在固相上抑制HB-EGF与EGFR的结合的状态的图。

[图8]为模式化地表示利用ELISA的EGFR与HB-EGF的结合方式的解析模型的图。

[图9]为表示通过利用ELISA的EGFR与HB-EGF的结合方式的解析模型检测的HB-EGF的浓度曲线的曲线图。

[图10]为表示利用抗体HA-20、HB-20及HC-15的HB-EGF与EGFR的结合抑制的曲线图。

[图11]表示对利用抗体HA-20、HB-20及HC-15的EGFR Ba/F3细胞增殖抑制进行比较的曲线图。

[图12a]为表示在8％FCS存在下的培养基中利用抗体HA-20、HB-20及HC-15的卵巢癌细胞株RMG-1增殖抑制的曲线图。

[图12b]为表示在2％FCS存在下的培养基中利用抗体HA-20、HB-20及HC-15的卵巢癌细胞株RMG-1增殖抑制的曲线图。

[图13]表示利用与抗原结合了的抗体(HB-EGF靶抗体与肥皂草毒蛋白标记抗体的复合体)在细胞内的内化的细胞凋亡诱导作用的模式图。

[图14]为表示HA-20、HB-20、HC-15的利用了内化活性的、HB-EGF高度表达SKOV3细胞(HB-EGF SKOV3)或亲株(SKOV3)细胞凋亡诱导活性的曲线图。

[图15]为表示抗体HA-20、HB-20、HC-15对ES-2细胞上的HB-EGF的结合活性的直方图。

[图16]为表示HA-20、HB-20、HC-15的利用了内化活性的、卵巢癌细胞ES-2细胞凋亡诱导活性的曲线图。

[图17]为利用FACS解析卵巢癌株(RMG-1，MCAS)的HB-EGF的表达的直方图。

[图18]为利用软琼脂菌落形成分析来解析利用抗体HA-20、HC-15的中和活性的RMG-1细胞的增殖抑制活性的图。

[图19]为利用软琼脂菌落形成分析来解析抗体HA-20、HC-15的利用了内化活性的、卵巢癌细胞RMG-1增殖抑制活性的图。

[图20]为利用软琼脂菌落形成分析来解析抗体HA-20、HC-15的利用了内化活性的、卵巢癌细胞MCAS增殖抑制活性的图。

[图21]为利用FACS解析各种血液癌细胞株中的HB-EGF的表达的直方图。

[图22]为表示抗体HA-20、HC-15的利用了内化活性的、各种血液癌细胞株增殖抑制活性的曲线图。

[图23a]为解析肥皂草毒蛋白标记HA-20抗体(HA-SAP)、肥皂草毒蛋白标记HC-15抗体(HC-SAP)、肥皂草毒蛋白标记对照抗体(IgG-SAP)对各种实体癌细胞株及正常人血管内皮细胞的增殖抑制活性的图。

[图23b]为解析肥皂草毒蛋白标记HA-20抗体(HA-SAP)、肥皂草毒蛋白标记HC-15抗体(HC-SAP)对各种血液癌细胞株的增殖抑制活性的图。

[图24a]为表示利用FACS解析各种抗HB-EGF抗体对在Ba/F3细胞上强制表达的HB-EGF的结合活性的曲线图，其中将染色强度作为G-mean值示于纵轴。

[图24b]其中上图为表示各种抗HB-EGF抗体对HB-EGF_Ba/F3细胞的ADCC活性的曲线图，下图为表示各种抗HB-EGF抗体对HB-EGF_Ba/F3细胞的CDC活性的曲线图。纵轴表示通过由ADCC或CDC诱导的细胞毒性从细胞释放出的铬的量。

[图25]表示利用ELISA解析chHC15及chHE39对分泌型HB-EGF的结合活性的结果。

[图26]表示利用FACS解析chHC15及chHE39对在细胞膜上表达的HB-EGF的结合活性的结果。

[图27a]表示解析体内chHE39的肿瘤抑制活性的结果。持续测定移植了HB-EGF表达SKOV-3株后每一周给与一次抗体的小鼠的肿瘤体积。

[图27b]表示解析体内chHC15的肿瘤抑制活性的结果。持续测定移植了HB-EGF表达SKOV-3株后每一周给与一次抗体的小鼠的肿瘤体积。

[图27c]表示解析体内chHE39的肿瘤抑制活性的结果。持续测定移植了MCAS细胞株后每一周给与一次抗体的小鼠的肿瘤体积。

[图27d]表示解析体内chHC15的肿瘤抑制活性的结果。持续测定移植了MCAS细胞株后每一周给与一次抗体的小鼠的肿瘤体积。

[图28a]表示解析体内模型中chHC15的肿瘤抑制活性的结果。经时测定移植了人胰脏癌细胞株BxPC-3后以10mg/kg的用量每一周给与一次抗体的小鼠的肿瘤体积。

[图28b]表示解析体内模型中chHC15的肿瘤抑制活性的结果。经时测定移植了人乳癌细胞株MDA-MB-231(体内传代株)后以10mg/kg的用量每一周给与一次抗体的小鼠的肿瘤体积。

[图28c]表示解析体内模型中chHC15的肿瘤抑制活性的结果。经时测定移植了人乳癌细胞株MDA-MB-231(体外传代株)后以10mg/kg的用量每一周给与一次抗体的小鼠的肿瘤体积。

具体实施方式

HB-EGF的分子型

HB-EGF为属于EGF配体家族的增殖因子，编码人HB-EGF的基因序列及HB-EGF的氨基酸序列分别公开为GenBank注册号NM_001945(序列号11)及GenBank注册号NP_001936(序列号12)。在本发明中，所谓“HB-EGF蛋白质”，是指包含全长蛋白质及其片段二者。本发明中所谓“片段”，是指包含HB-EGF蛋白质任意区域的多肽，片段也可以不具有天然HB-EGF蛋白质的功能。

作为特定片段的实施方式之一，本说明书中使用的sHB-EGF是在生物体内，在表达HB-EGF的细胞的细胞表面上表达的proHB-EGF受到被称作胞外域脱落的蛋白酶消化而生成的、包含73～87个氨基酸残基的分子。已知在下述结构中所具有的多个sHB-EGF分子，所述结构为以序列号12所示的由208个氨基酸构成的proHB-EGF分子中的第149号脯氨酸残基作为羧基末端，及以第63号的天冬酰胺残基、第73号的精氨酸残基、第74号的缬氨酸残基或第77号的丝氨酸残基作为氨基末端。

抗HB-EGF抗体

本发明的抗HB-EGF抗体只要是与HB-EGF蛋白质结合的抗体即可，无论其来源(小鼠、大鼠、人等)、种类(单克隆抗体、多克隆抗体)及形状(改变抗体、低分子化抗体、修饰抗体等)等如何。

优选本发明中使用的抗HB-EGF抗体特异性地与HB-EGF结合。另外，优选本发明中使用的抗HB-EGF抗体为单克隆抗体。

作为本发明中使用的抗体的优选方案之一，可以举出具有内化活性的抗体。本发明中所谓“具有内化活性的抗体”，是指与细胞表面上的HB-EGF结合时输送到细胞内(细胞质内、小囊泡、其他小器官内等)的抗体。

抗体是否具有内化活性可以采用本领域技术人员公知的方法确认，例如可以通过下述方法确认，即，使结合了标记物的抗HB-EGF抗体与表达HB-EGF的细胞接触，确认该标记物是否被摄取到细胞内的方法；使结合了细胞毒性物质的抗HB-EGF抗体与表达HB-EGF的细胞接触，确认在该HB-EGF表达细胞中是否诱导细胞凋亡的方法等。更具体而言，可以通过下述实施例所记载的方法等确认抗体是否具有内化活性。

抗HB-EGF抗体为具有内化活性的抗体时，该抗体优选为能够与proHB-EGF结合的抗体，较优选为与sHB-EGF相比，与proHB-EGF更牢固地结合的抗体。

细胞毒性物质

作为本发明中使用的抗体的其他优选方案之一，可以举出结合了细胞毒性物质的抗体。将结合了细胞毒性物质的抗体参入细胞内时，由细胞毒性物质可以诱导参入了该抗体的细胞发生细胞凋亡。因此，结合了细胞毒性物质的抗体更优选具有内化活性。

本发明中使用的细胞毒性物质只要能够诱导细胞凋亡即可，可以为任何物质，例如可以举出毒素、放射性物质、化疗剂等。上述本发明中的细胞毒性物质包括在生物体内转化为活性细胞毒性物质的前药。前药的活性化可以为酶的转化，也可以为非酶的转化。

本发明中，所谓毒素，是指显示来自于微生物、动物或植物的细胞毒性的各种蛋白质或多肽等。作为本发明中使用的毒素，例如可以举出下述毒素：白喉毒素A链(Diphtheria毒素A链)(Langone J.J.，et al.，Methods in Enzymology，93，307-308，1983)；假单胞菌外毒素(Pseudomonas Exo毒素)(Nature Medicine，2，350-353，1996)；蓖麻毒素链(Ricin A链)(Fulton R.J.，et al.，J.Biol.Chem.，261，5314-5319，1986；Sivam G.，et al.，Cancer Res.，47，3169-3173，1987；Cumber A.J.et al.，J.Immunol.Methods，135，15-24，1990；Wawrzynczak E.J.，et al.，Cancer Res.，50，7519-7562，1990；Gheeite V.，et al.，J.Immunol.Methods，142，223-230，1991)；无糖链蓖麻毒素A链(Deglicosylated Ricin A链)(Thorpe P.E.，et al.，Cancer Res.，47，5924-5931，1987)；相思豆毒素A链(Abrin A链)(Wawrzynczak E.J.，et al.，Br.J.Cancer，66，361-366，1992；Wawrzynczak E.J.，et al.，Cancer Res.，50，7519-7562，1990；Sivam G.，et al.，Cancer Res.，47，3169-3173，1987；Thorpe P.E.，et al.，CancerRes.，47，5924-5931，1987)；白树毒素(Gelonin)(Sivam G.，et al.，Cancer Res.，47，3169-3173，1987；Cumber A.J.et al.，J.Immunol.Methods，135，15-24，1990；WawrzynczakE.J.，et al.，Cancer Res.，50，7519-7562，1990；Bolognesi A.，et al.，Clin.exp.Immunol.，89，341-346，1992)；美洲商陆抗病毒蛋白(PAP-s；Pokeweed anti-viral蛋白质from接种s)(Bolognesi A.，et al.，Clin.exp.Immunol.，89，341-346，1992)；Briodin(Bolognesi A.，et al.，Clin.exp.Immunol.，89，341-346，1992)；肥皂草毒蛋白(肥皂草毒蛋白)(Bolognesi A.，etal.，Clin.exp.Immunol.，89，341-346，1992)；苦瓜毒蛋白(Momordin)(Cumber A.J.，et al.，J.Immunol.Methods，135，15-24，1990；Wawrzynczak E.J.，et al.，Cancer Res.，50，7519-7562，1990；Bolognesi A.，et al.，Clin.exp.Immunol.，89，341-346，1992)；木鳖毒蛋白(Momorcochin)(Bolognesi A.，et al.，Clin.exp.Immunol.，89，341-346，1992)；香石竹毒蛋白32(Dianthin 32)(Bolognesi A.，etal.，Clin.exp.Immunol.，89，341-346，1992)；香石竹毒蛋白30(Dianthin 30)(Stirpe F.，Barbieri L.，FEBS letter 195，1-8，1986)；塑莲根毒蛋白II(Modeccin)(Stirpe F.，Barbieri L.，FEBS letter 195，1-8，1986)；槲寄生毒蛋白(Viscumin)(Stirpe F.，Barbieri L.，FEBSletter 195，1-8，1986)；塑莲根毒蛋白I(Volkesin)(Stirpe F.，Barbieri L.，FEBS letter 195，1-8，1986)；商陆毒蛋白(Dodecandrin)(Stirpe F.，Barbieri L.，FEBS letter 195，1-8，1986)；小麦毒蛋白(Tritin)(Stirpe F.，Barbieri L.，FEBS letter 195，1-8，1986)；软瓜蛋白(Luffin)(Stirpe F.，Barbieri L.，FEBS letter 195，1-8，1986)；括楼种子毒蛋白(Trichokirin)(Casellas P.，et al.，Eur.J.Biochem.176，581-588，1988；Bolognesi A.，et al.，Clin.exp.Immunol.，89，341-346，1992)。

本发明中，所谓放射性物质，是指含有放射性同位素的物质。放射性同位素没有特别限定，可以使用任何放射性同位素，例如可以使用³²P、¹⁴C、¹²⁵I、³H、¹³¹I、¹⁸⁶Re、¹⁸⁸Re等。

本发明中所谓化疗剂，是指除上述毒素、放射性物质以外的具有细胞毒性的物质，包括细胞因子、抗肿瘤剂、酶等。本发明中使用的化疗剂没有特别限定，但优选为低分子量的化疗剂。一般认为分子量小时，即使与抗体结合后，干涉抗体功能的可能性也低。本发明中，低分子量化疗剂通常具有100～2000的分子量，优选具有200～1000的分子量。本发明中没有特别限定，例如可以使用以下化疗剂：美法仑(Melphalan)(Rowland G.F.，et al.，Nature 255，487-488，1975)；顺铂(Cis-platinum)(Hurwitz E.and Haimovich J.，Method In Enzymology 178，369-375，1986；Schechter B.，et al.，Int.J.Cancer 48，167-172，1991；卡铂(Carboplatin)(Ota，Y.，et al.，Asia-Oceania J.Obstet.Gynaecol.19，449-457，1993)；丝裂霉素C(Mitomycin C)(Noguchi，A.，et al.，Bioconjugate Chem.3，132-137，1992)；阿霉素(Adriamycin)(Doxorubicin)(Shih，L.B.，et al.，Cancer Res.514192-4198，1991；Zhu，Z.，et al.，Cancer Immunol.Immumother 40，257-267，1995；Trail，P.A.，et al.，Science 261，212-215，1993；Zhu，Z.，et al.，Cancer Immunol.Immumother 40，257-267，1995；Kondo，Y.，et al.，Jpn.J.Cancer Res.861072-1079，1995；Zhu，Z.，et al.，Cancer Immunol.Immumother 40，257-267，1995；Zhu，Z.，et al.，Cancer Immunol.Immumother 40，257-267，1995)；柔红霉素(Daunorubicin)(Dillman，R.O.，et al.，Cancer Res.48，6097-6102，1988；Hudecz，F.，et al.，Bioconjugate Chem.1，197-204，1990；Tukada Y.et al.，J.Natl.Cancer Inst.75，721-729，1984)；博来霉素(Bleomycin)(Manabe，Y.，et al.，Biochem.Biophys.Res.Commun.115，1009-1014，1983)；新制癌菌素(Neocarzinostatin)(KitamuraK.，et al.，Cancer Immunol.Immumother 36，177-184，1993；Yamaguchi T.，et al.，Jpn.J.Cancer Res.85，167-171，1994)；甲氨喋呤(Methotrexate)(Kralovec，J.，et al.，Cancer Immunol.Immumother29，293-302，1989；Kulkarni，P.N.，et al.，Cancer Res.41，2700-2706，1981；Shin，L.B.，et al.，Int.J.Cancer 41，832-839，1988；Gamett M.C.，et al.，Int.J.Cancer 31，661-670，1983)；5-氟尿苷(5-Fluorouridine)(Shin，L.B.，Int.J.Cancer 46，1101-1106，1990)；5-氟-2’-脱氧尿苷(5-Fluoro-2’-deoxyuridine)(Goerlach A.，etal.，Bioconjugate Chem.2，96-101，1991)；阿糖胞苷(Cytosinearabinoside)(Hurwitz E.，et al.，J.Med.Chem.28，137-140，1985)；氨基蝶呤(Aminopterin)(Kanellos J.，et al.，Immunol.细胞.Biol.65，483-493，1987)；长春新碱(Vincristine)(Johnson J.R.，et al.，Br.J.Cancer 42，17，1980)；脱乙酰长春花碱(Vindesine)(Johnson J.R.，et al.，Br.J.Cancer 44，472-475，1981)；白细胞介素-2(Interleukin-2)；肿瘤坏死因子(TNFα)；干扰素(INF)；羧肽酶(Carboxypeptidase)；碱性磷酸酶(Alkaline Phosphatase)；β-内酰胺酶(β-lactamase)；胞苷脱氨酶(Cytidine deaminase)。

本发明中使用的细胞毒性物质可以为一种，也可以组合两种以上细胞毒性物质进行使用。

抗HB-EGF抗体与上述细胞毒性物质的结合可以通过共价键或非共价键进行。结合有上述细胞毒性物质的抗体的制作方法是公知的。

抗HB-EGF抗体与细胞毒性物质也可以通过它们自身所具有的连接基团等直接结合，或者也可以通过连接体或中间支持体等其他物质间接结合。抗HB-EGF抗体与细胞毒性物质直接结合时的连接基团，例如可以举出使用SH基的二硫键。具体而言，用还原剂、例如二硫苏糖醇等还原抗体Fc区的分子内二硫键，同样地还原细胞毒性物质内的二硫键，将二者以二硫键结合。结合前，也可以使用活化促进剂、例如Ellman试剂(Ellman’s reagent)使抗体或细胞毒性物质中的任一方活化，促进二者二硫键的形成。作为将抗HB-EGF抗体与细胞毒性物质直接结合的其他方法，例如可以举出使用Schiff碱的方法、碳二亚胺法，活性酯法(N-羟基琥珀酰亚胺法)、使用混合酸酐(mixed anhydride)的方法、使用重氮反应的方法等。

抗HB-EGF抗体与细胞毒性物质的结合也可以通过其他物质间接地结合。用于间接地结合的其他物质没有特别限定，例如可以举出以任意1种或组合2种以上的方式具有选自氨基、羧基、巯基等中2个以上基团的化合物；肽连接体；对抗HB-EGF抗体具有结合能力的化合物等。作为以任意1种或组合2种以上的方式具有选自氨基、羧基、巯基等中2个以上基团的化合物的例子，例如可以举出N-琥珀酰亚胺基3-(2-吡啶基二硫基)丙酸酯(SPDP：N-琥珀酰亚胺基3-(2-pyridylditio)propinate)(Wawrzynczak E.J.，et al.，Cancer Res.，50，7519-7562，1990；Thorpe P.E.，et al.，Cancer Res.，47，5924-5931，1987)；琥珀酰亚胺基6-3-[2-吡啶基二硫基]丙酰胺)己酸酯(LC-SPDP：琥珀酰亚胺基6-3-[2-pyridylditio]propinamide)hexanoate)(Hermanson G.T.，BIOCONJUGATE Techniques，230-232，1996)；硫代琥珀酰亚胺基6-3-[2-吡啶基二硫基]丙酰胺)己酸酯(Sulfo-LC-SPDP：Sulfo琥珀酰亚胺基6-3-[2-pyridylditio]propinamide)hexanoate)(Hermanson G.T.，BIOCONJUGATE Techniques，230-232，1996)；N-琥珀酰亚胺基3-(2-吡啶基二硫基)丁酸酯(SPDB：N-琥珀酰亚胺基3-(2-pyridylditio)butyrate)(Wawrzynczak E.J.，et al.，Br.J.Cancer，66，361-366，1992)；琥珀酰亚胺基氧基羰基-α-(2-吡啶基二硫基)甲苯(SMPT：琥珀酰亚胺基oxy羰基-α-(2-pyridylditio)toruene)(Thorpe P.E.，et al.，Cancer Res.，47，5924-5931，1987)；琥珀酰亚胺基6-(α-甲基-[2-吡啶基二硫基]甲苯甲酰胺)己酸酯(LC-SMPT：琥珀酰亚胺基6-(α-methyl-[2-pyridylditio]toruamide)hexanoate)(Hermanson G.T.，BIOCONJUGATE Techniques，232-235，1996)；硫代琥珀酰亚胺基6-(α-甲基-[2-吡啶基二硫基]甲苯甲酰胺)己酸酯(Sulfo-LC-SMPT：Sulfo琥珀酰亚胺基6-(α-methyl-[2-pyridylditio]toruamide)hexanoate)(Hermanson  G.T.，BIOCONJUGATE Techniques，232-235，1996)；琥珀酰亚胺基-4-(对马来酰亚胺基苯基)丁酸酯(SMPB：琥珀酰亚胺基-4-(p-maleimidophenyl)butyrate)(Hermanson G.T.，BIOCONJUGATETechniques，242-243，1996)；硫代琥珀酰亚胺基-4-(对马来酰亚胺基苯基)丁酸酯(Sulfo-SMPB：Sulfo-琥珀酰亚胺基-4-(p-maleimidophenyl)butyrate)(Hermanson G.T.，BIOCONJUGATETechniques，242-243，1996)；间马来酰亚胺基苯甲酰基-N-羟基琥珀酰亚胺酯(MBS：m-Maleimidobenzoyl-N-羟基琥珀酰亚胺ester)(Hermanson G.T.，BIOCONJUGATE Techniques，237-238，1996)；间马来酰亚胺基苯甲酰基-N-羟基硫代琥珀酰亚胺酯(Sulfo-MBS：m-Maleimidobenzoyl-N-羟基sulfo琥珀酰亚胺ester)(Hermanson G.T.，BIOCONJUGATE Techniques，237-238，1996)；S-乙酰基巯基琥珀酸酐(SAMSA：S-Acetylmercaptosuccinic anhydride)(Casellas P.，et al.，Eur.J.Biochem，176，581-588，1988)；二甲基3，3’-二硫双丙亚酰胺酯(DTBP：Dimethyl3，3’-ditiobisprorionimidate)(Casellas P.，et al.，Eur.J.Biochem，176，581-588，1988)；2-亚氨基硫醇(2-Iminotiolane)(Thorpe P.E.，et al.，Cancer Res.，47，5924-5931，1987)等。

作为抗HB-EGF抗体与细胞毒性物质结合中使用的其他物质，例如可以举出肽、抗体、聚L-谷氨酸(PGA)、羧甲基葡聚糖、葡聚糖、氨基葡聚糖、亲和素·生物素、顺乌头酸、谷氨酸二酐、人血清白蛋白(HSA)等。

进而，蛋白质性的细胞毒性物质也可以通过基因工程学方法与抗体结合。具体而言，例如使编码上述细胞毒性物质肽的DNA与编码抗HB-EGF抗体的DNA框内融合，可以构筑参入表达载体中的重组载体。通过将该载体导入适当的宿主细胞内，得到转化细胞，培养该转化细胞使参入的DNA表达，以融合蛋白质的形态得到结合了毒性肽的抗HB-EGF抗体。得到与抗体形成的融合蛋白质时，通常在抗体的C末端侧配置蛋白质性的药物或毒素。在抗体与蛋白质性药物或毒素之间也可以通过肽连接体连接。

中和活性

本发明中使用的抗HB-EGF抗体也可以具有中和活性。

通常中和活性是指抑制激动剂等对细胞具有生物学活性的配体的该生物学活性的活性。即，所谓具有中和活性的物质，是指与该配体或该配体结合的受体结合，抑制该配体与受体的结合的物质。通过中和活性抑制了与配体的结合的受体无法发挥通过该受体的生物学活性。具有上述中和活性的抗体通常被称作中和抗体。某种受试物质的中和活性可以通过将在配体的存在下的生物学活性在该受试物质存在或不存在下的条件之间进行比较来测定。

EGF受体被认为是本发明的HB-EGF的主要受体。上述情况下，通过配体结合形成二聚体，使存在于细胞内的本身的区域即酪氨酸激酶活化。被活化的酪氨酸激酶通过自身磷酸化形成含有磷酸化酪氨酸的肽，使其与各种信号传递的附属分子(accessory分子)汇合。它们主要为PLCγ(磷脂酶Cγ)、Shc、Grb2等。上述附属分子中，前两者还通过EGF受体的酪氨酸激酶被磷酸化。来自EGF受体的信号传递中的主要路径为按照Shc、Grb2、Sos、Ras、Raf/MAPK激酶/MAP激酶的顺序传递磷酸化的路径。进而，认为存在作为副路径的从PLCγ到PKC的路径。由于上述细胞内的信号级联(signalcascade)因每个细胞种类的不同而不同，所以可以根据每个目标靶细胞设当设定靶分子，不限定于上述因子。通过测定生物体内信号的活化，可以评价中和活性。测定生物体内信号的活化的试剂盒可以适当使用市售的试剂盒(例如蛋白激酶C活性测定系统(GEHealthcare Biosciences株式会社)等)。

另外，将对存在于生物体内信号级联下游的靶基因的转录诱导作用作为指标，也可以检测生物体内信号的活化。靶基因的转录活性的变化可以根据报道基因分析(reporter assay)的原理检测。具体而言，在靶基因的转录因子或启动子区域的下游配置绿色荧光蛋白GFP(Green Fluorescence蛋白质)或萤光素酶等报道基因，通过测定其报道基因活性，可以测定转录活性的变化作为报道基因活性。

进而，由于通过EGF受体的信号传递通常在促进细胞增殖的方向上动作，所以通过测定目标细胞的增殖活性，可以评价中和活性。

具有兼有中和活性和内化活性的性质的抗体可以用作高度表达HB-EGF的癌的非常有效的抗癌剂。

ADCC活性及/或CDC活性

本发明中使用的抗HB-EGF抗体可以具有抗体依赖性细胞介导细胞毒性(antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity：ADCC)活性及/或补体依赖性细胞毒性(complement-dependent cytotoxicity：CDC)活性。

在本发明中，所谓CDC活性，是指由补体体系产生的细胞毒性。另一方面，所谓ADCC活性，是指如下活性，即在靶细胞的细胞表面抗原上附着特异性抗体时，具有Fcγ受体的细胞(免疫细胞等)通过Fcγ受体与其Fc部分结合，破坏靶细胞。

本发明中，可以通过公知的方法测定抗体是否具有ADCC活性或者是否具有CDC活性(例如，Current protocols in Immunology，Chapter 7.Immunologic studies in humans，Editor，John E，Coligan etal.，John Wiley & Sons，Inc.，(1993)等)。

具体而言，首先，配制效应细胞、补体溶液、靶细胞。

(1)效应细胞的配制

从CBA/N小鼠等中摘出脾脏，在RPMI 1640培养基(Invitrogen公司制)中分离脾脏细胞。用含有10％胎牛血清(FBS、Hyclone公司制)的相同培养基清洗后，将细胞浓度配制成5×10⁶/ml，由此可以配制效应细胞。

(2)补体溶液的配制

可以将Baby Rabbit Complement(CEDARLANE公司制)用含有10％FBS的培养基(Invitrogen公司制)稀释10倍，配制补体溶液。

(3)靶细胞的配制

将表达HB-EGF蛋白质的细胞与0.2mCi的51Cr-铬酸钠(GEHealthcare Biosciences公司制)一起在含有10％FBS的DMEM培养基中于37℃下培养1小时，由此可以将该靶细胞进行放射性标记。作为表达HB-EGF蛋白质的细胞，可以使用用编码HB-EGF蛋白质的基因转化的细胞、癌细胞(卵巢癌细胞等)等。放射性标记后，将细胞用含有10％FBS的RPMI 1640培养基清洗3次，将细胞浓度配制成2×10⁵/ml，由此可以配制该靶细胞。

ADCC活性、或者CDC活性可以根据下述方法测定。测定ADCC活性时，在96孔U底培养板(Becton Dickinson公司制)中加入靶细胞和抗HB-EGF抗体各50μl，在冰上使其反应15分钟。然后，加入100μl效应细胞，在二氧化碳培养箱内培养4小时。使抗体的最终浓度为0或10μg/ml。培养后，回收100μl的上清液，用γ计数器(COBRAII AUTO-GAMMA、MODEL D5005、Packard InstrumentCompany公司制)测定放射活性。使用所得的值根据计算式(A-C)/(B-C)×100，计算细胞毒性(％)。A表示各试样的放射活性(cpm)，B表示加入1％NP-40(nacalai tesque公司制)的试样的放射活性(cpm)，C表示只含靶细胞的试样的放射活性(cpm)。

另一方面，测定CDC活性时，在96孔平底培养板(BectonDickinson公司制)中加入靶细胞和抗HB-EGF抗体各50μl，在冰上使其反应15分钟。然后，加入100μl补体溶液，在二氧化碳培养箱内培养4小时。抗体的最终浓度为0或3μg/ml。培养后，回收100μl的上清液，用γ计数器测定放射活性。可以与ADCC活性测定相同地计算细胞毒性。

具有兼有ADCC活性及/或CDC活性和内化活性的性质的抗体可以用作高度表达HB-EGF的癌的非常有效的抗癌剂。另外，具有兼有ADCC活性及/或CDC活性和中和活性的性质的抗体可以用作高度表达HB-EGF的癌的非常有效的抗癌剂。进而，具有兼有全部ADCC活性及/或CDC活性、内化活性、中和活性性质的抗体可以用作高度表达HB-EGF的癌的非常有效的抗癌剂。

抗体的制造

本发明的抗HB-EGF单克隆抗体可以采用公知的方法获得。作为本发明的抗HB-EGF抗体，特别优选来自哺乳动物的单克隆抗体。来自哺乳动物的单克隆抗体，包括由杂交瘤产生的单克隆抗体、以及由宿主产生的单克隆抗体等，所述宿主采用基因工程学方法用含有抗体基因的表达载体进行了转化。

产生单克隆抗体的杂交瘤可以使用公知技术、例如如下所示地制作。首先，使用HB-EGF蛋白质作为敏化抗原，按照通常的免疫方法将其免疫。采用通常的细胞融合法使从免疫动物中得到的免疫细胞与公知的亲细胞融合，得到杂交瘤。进而，利用通常的筛选法，从此杂交瘤中筛选产生目标抗体的细胞，由此可以选择出产生抗HB-EGF抗体的杂交瘤。

具体而言，单克隆抗体的制作例如可以如下所示进行。首先，通过表达HB-EGF基因，可以得到HB-EGF蛋白质，用作获得抗体的敏化抗原。人HB-EGF基因的碱基序列被以GenBank注册号NM_001945(序列号11)等公开的序列。即，将编码HB-EGF的基因序列插入公知的表达载体中，转化适当的宿主细胞后，可以采用公知的方法从此宿主细胞中或培养上清液中纯化目标人HB-EGF蛋白质。另外，纯化的天然的HB-EGF蛋白质也可以同样地使用。可以通过组合或者单独使用1次或者多次通常的离子层析或亲和层析等多种层析法进行生成。另外，也可以将融合蛋白质用作免疫原，所述融合蛋白质是将本发明中使用的HB-EGF蛋白质的所期望的部分多肽与不同的多肽融合得到的。为了制备为免疫原的融合蛋白质，例如可以使用抗体的Fc片段或肽标记等。表达融合蛋白质的载体，可以通过使编码所期望的二种或者二种以上的多肽片段的基因框内融合，并如上所述地将该融合基因插入表达载体中，进行制作。融合蛋白质的制作方法记载于Molecular Cloning 2nd ed.(Sambrook，J.et al.，Molecular Cloning 2nd ed.，9.47-9.58，Cold Spring HarborLab.Press，1989)。

如上所示纯化的HB-EGF蛋白质可以用作对哺乳动物进行免疫时使用的敏化抗原。另外，HB-EGF的部分肽也可以用作敏化抗原。例如可以将下述肽作为敏化抗原：

通过化学合成从人HB-EGF的氨基酸序列中获得的肽；

通过将人HB-EGF基因的一部分参入表达载体使其表达从而获得的肽；

通过利用蛋白质分解酶分解人HB-EGF蛋白质获得的肽。

作为部分肽使用的HB-EGF区域及大小没有限定。优选的区域可以从构成HB-EGF细胞外区域的氨基酸序列(序列号12的氨基酸序列中第22-149号)中选择。构成作为敏化抗原的肽的氨基酸数量优选至少为3以上，例如为5以上、或6以上。更具体而言，可以将8～50、优选10～30个残基的肽作为敏化抗原。

用该敏化抗原免疫的哺乳动物没有特殊的限定。为了通过细胞融合法得到单克隆抗体，考虑到与细胞融合中使用的亲细胞的相容性，优选免疫动物。一般情况下，作为免疫动物优选啮齿动物。具体而言，可以将小鼠、大鼠、仓鼠、或者家兔用作免疫动物。此外，也可以将猴等用作免疫动物。

上述动物可以按照公知的方法通过敏化抗原进行免疫。例如，作为一般的方法，可以通过腹腔内或皮下注射敏化抗原对哺乳动物进行免疫。具体而言，每隔4至21日向哺乳动物多次给与该敏化抗原。敏化抗原可以用PBS(Phosphate-Buffered Saline)或生理盐水等以适当的稀释倍率稀释，用于免疫。并且，可以与佐剂一起给与敏化抗原。例如可以与弗式完全佐剂(Freund’s complete adjuvant)混合、乳化，形成敏化抗原。另外，用敏化抗原免疫时可以使用适当的载体。特别是分子量小的部分肽用作敏化抗原的情况下，优选使该敏化抗原肽与白蛋白、匙孔血蓝蛋白(keyhole limpethemocyanin)等载体蛋白质结合进行免疫。

如上所述将哺乳动物免疫，确认血清中的所期望的抗体量升高后，从哺乳动物中采取免疫细胞，进行细胞融合。作为免疫细胞，特别优选使用脾细胞。

作为与上述免疫细胞融合的细胞，使用哺乳动物的骨髓瘤细胞。骨髓瘤细胞优选具备用于筛选的适当的选择标记。所谓选择标记，是指在特定的培养条件下能够生存(或者不能生存)的特性。选择标记中公知有次黄嘌呤-鸟嘌呤转磷酸核糖激酶缺失(以下简称HGPRT缺失)、或者胸苷激酶缺失(以下简称TK缺失)等。具有HGPRT或TK缺失的细胞，具有次黄嘌呤-氨基蝶呤-胸苷敏感性(以下简称HAT敏感性)。HAT敏感性的细胞在HAT选择培养基中不能进行DNA合成而死亡，但如果与正常的细胞融合，则可以利用正常细胞的补救途径(salvage pathway)继续DNA的合成，因此在HAT选择培养基中也可以增殖。

HGPRT缺失或TK缺失的细胞可以分别用含有6-巯基鸟嘌呤、8-氮鸟嘌呤(以下简称为8AG)、或5’-溴脱氧尿苷的培养基进行选择。正常的细胞因将这些嘧啶类似物参入DNA中而死亡，但是缺失这些酶的细胞由于不参入上述嘧啶类似物，所以能够在选择培养基中生存。另外一个称为G418耐性的选择标记，由于存在新霉素耐性基因而赋予对2-脱氧链霉胺(2-deoxystreptamine)类抗生素(庆大霉素类似物)的耐性。公知有多种适合细胞融合的骨髓瘤细胞。例如，可以使用P3(P3×63Ag8.653)(J.Immunol.(1979)123，1548-1550)、P3×63Ag8U.1(Current Topics in Microbiology andImmunology(1978)81，1-7)，NS-1(Kohler，G.and Milstein，C.Eur.J.Immunol.(1976)6，511-519)，MPC-11(Margulies，D.H.et al.，细胞(1976)8，405-415)，SP2/0(Shulman，M.et al.，Nature(1978)276，269-270)，F0(de St.Groth，S.F.et al.，J.Immunol.Methods(1980)35，1-21)，S194(Trowbridge，I.S.J.Exp.Med.(1978)148，313-323)，R210(Galfre，G.et al.，Nature(1979)277，131-133)等之类的骨髓瘤细胞。

上述免疫细胞和骨髓瘤细胞的细胞融合可以按照公知的方法、例如Kohler和Milstein等的方法(Kohler.G.and Milstein，C.、MethodsEnzymol.(1981)73，3-46)等进行。

更具体而言，例如可以在细胞融合促进剂的存在下在通常的营养培养液中进行上述细胞融合。作为融合促进剂，例如可以使用聚乙二醇(PEG)、仙台病毒(HVJ)等。进而，根据期望也可以加入二甲基亚砜等辅助剂来提高融合效率。

免疫细胞和骨髓瘤细胞的使用比例可以任意设定。例如，优选使免疫细胞为骨髓瘤细胞的1至10倍。作为上述细胞融合中使用的培养液，例如，可以使用适用于上述骨髓瘤细胞株的增殖的RPMI1640培养液、MEM培养液、以及此类细胞培养中使用的常用培养液。并且，可以向培养液中加入胎牛血清(FCS)等血清补液(serumsupplement)。

细胞融合是将规定量的上述免疫细胞和骨髓瘤细胞在上述培养液中充分混合，混合预先加热至37℃左右的PEG溶液，由此形成为目标的融合细胞(杂交瘤)。细胞融合法中，例如可以以通常30至60％(w/v)的浓度添加平均分子量1000至6000左右的PEG。接下来，添加上述举出的适当的培养液，离心，除去上清，重复上述操作，由此除去在杂交瘤的培养中不优选的细胞融合剂等。

如上所述得到的杂交瘤，可以利用适合细胞融合中使用的骨髓瘤具有的选择标记的选择培养液进行选择。例如具有HGPRT或TK缺失的细胞可以通过在HAT培养液(含有次黄嘌呤、氨基蝶呤及胸苷的培养液)中培养来进行选择。即，将HAT敏感性的骨髓瘤细胞用于细胞融合时，在HAT培养液中，可以选择性地使成功地与正常细胞进行细胞融合的细胞增殖。使用上述HAT培养液的培养继续进行足以使目标杂交瘤以外的细胞(非融合细胞)死亡的时间。具体而言，一般情况下，通过数日至数周的培养，可以选择出目标杂交瘤。接下来，通过实施常用的有限稀释法，可以进行产生目标抗体的杂交瘤的筛选及单克隆。或者，也可以按照国际公开WO03/104453所述的方法制作识别HB-EGF的抗体。

目标抗体的筛选及单克隆优选采用基于公知的抗原抗体反应的筛选方法实施。例如，使抗原与用聚苯乙烯等制成的小球或市售96孔微量滴定板等载体结合，与杂交瘤的培养上清液反应。接着，清洗载体后，使酶标记的二次抗体等反应。如果培养上清液中含有与敏化抗原反应的目标抗体，则二次抗体通过此抗体与载体结合。最终通过检测与载体结合的二次抗体，能够确定在培养上清液中是否存在目标抗体。可以通过有限稀释法等克隆产生具有抗原结合能力的所期望的抗体的杂交瘤。此时，作为抗原，可以优选使用用于免疫的蛋白质以及实质相同的HB-EGF蛋白质。例如包含HB-EGF的胞外域、或者构成该区域的部分氨基酸序列的寡肽可以作为抗原使用。

另外，除了用抗原对人以外的动物进行免疫由此得到上述杂交瘤的方法之外，也可以用抗原将人淋巴细胞敏化得到目标抗体。具体而言，首先在体外将人淋巴细胞用HB-EGF蛋白质敏化。然后，使免疫敏化的淋巴细胞与适当的融合配偶体(fusion partner)融合。融合配偶体可以使用例如来自人的具有永久分裂能力的骨髓瘤细胞(参见日本特公平1-59878号公报)。利用此方法得到的抗HB-EGF抗体，是对HB-EGF蛋白质具有结合活性的人抗体。

进而，通过向具有人抗体基因的全部基因谱的转基因动物给与作为抗原的HB-EGF蛋白质也可以得到抗HB-EGF人抗体。通过与适当的融合配偶体细胞融合或用EB病毒(Epstein-Barr virus)感染等处理，可以使免疫动物的抗体生成细胞无限增殖化。可以从如上所述得到的无限增殖化细胞中分离出针对HB-EGF蛋白质的人抗体(参见国际公开WO94/25585、WO93/12227、WO92/03918、WO94/02602)。进而，通过对无限增殖化细胞进行克隆，也能够克隆产生具有目标反应特异性的抗体的细胞。将转基因动物作为免疫动物使用时，该动物的免疫系统将人HB-EGF识别为异物。所以，能够容易地得到针对人HB-EGF的人抗体。如上所述制作的产生单克隆抗体的杂交瘤可以在常用的培养液中传代培养。另外，该杂交瘤也可以在液氮中长期保存。

将该杂交瘤按照通常的方法进行培养，可以从其培养上清液中得到目标单克隆抗体。或者也可以将杂交瘤给与与其具有相容性的哺乳动物使其增殖，从其腹水中得到单克隆抗体。前者的方法适于得到高纯度的抗体。

本发明中，也可以利用由抗体生成细胞克隆得到的抗体基因编码得到的抗体。通过将克隆的抗体基因参入适当的载体、导入宿主，可以使抗体进行表达。用于抗体基因的分离、向载体的导入、以及宿主细胞转化的方法已经确立(例如，参见Vandamme，A.M.et al.，Eur.J.Biochem.(1990)192，767-775)。

例如，可以由产生抗HB-EGF抗体的杂交瘤细胞，得到编码抗HB-EGF抗体的可变区(V区)的cDNA。为此，通常情况下首先从杂交瘤中提取总RNA。作为用于从细胞中提取mRNA的方法，例如，可以采用胍超离心法(Chirgwin，J.M.et al.，Biochemistry(1979)18，5294-5299)、AGPC法(Chomczynski，P.et al.，Anal.Biochem.(1987)162，156-159)等。

提取得到的mRNA可以使用mRNA纯化Kit(GE HealthcareBiosciences制)等进行纯化。或者，市场上也销售用于从细胞中直接提取总mRNA的试剂盒，如QuickPrep mRNA纯化Kit(GEHealthcare Biosciences制)等。使用如上所述的试剂盒，也能够从杂交瘤中得到总mRNA。使用逆转录酶由所得的mRNA可以合成编码抗体V区的cDNA。cDNA可以利用AMV Reverse Transcriptase First-strand cDNA Synthesis Kit(生化学工业社制)等合成。另外，为了cDNA的合成及扩增，可以采用5’-Ampli FINDER RACE Kit(Clontech制)及使用PCR的5’-RACE法(Frohman，M.A.et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1988)85，8998-9002、Belyavsky，A.et al.，Nucleic Acids Res.(1989)17，2919-2932)。进而，在上述cDNA的合成过程中，可以在cDNA的两末端导入下述的适当的限制酶切位点。

从所得的PCR产物中纯化目标cDNA片段，然后，与载体DNA连结。如上所述地制作重组载体，导入大肠菌等中，选择菌落后，由形成了该菌落的大肠菌可以配制所期望的重组载体。接下来，可以通过公知方法、例如双脱氧核糖核酸链终止法等确认该重组载体是否具有目标cDNA的碱基序列。

为了得到编码可变区的基因，也可以采用使用可变区基因扩增用引物的PCR法。首先，以提取得到的mRNA作为模板合成cDNA，得到cDNA库。为了方便，在cDNA库的合成中使用市售的试剂盒。实际上，只从少数的细胞中得到的mRNA极其微量，因此将其直接纯化时收率低。所以，通常情况下在添加明确知道不含抗体基因的载体RNA后进行纯化。或者，在能够提取一定量的RNA的情况下，即使仅为抗体生成细胞的RNA也可以高效地提取。例如从10以上、或者30以上、优选50以上的抗体生成细胞中提取RNA时，有时不需要添加载体RNA。

以所得的cDNA库为模板，通过PCR法扩增抗体基因。用于通过PCR法扩增抗体基因的引物是公知的。例如，根据论文(J.Mol.Biol.(1991)222，581-597)等公开的内容，可以设计出人抗体基因扩增用引物。上述引物随免疫球蛋白的亚类不同而具有不同的碱基序列。所以，以亚类不明的cDNA库作为模板时，进行PCR法需要考虑到所有的可能性。

具体而言，例如为了获取编码人IgG的基因时，可以利用能够扩增编码γ1～γ5作为重链、κ链和λ链作为轻链的基因的引物。为了扩增IgG的可变区基因，一般情况下3’侧的引物利用在与铰链区相当的部分退火的引物。另一方面，5’侧的引物可以利用适合各亚类的引物。

由重链和轻链的各亚类的基因扩增用引物产生的PCR产物，分别形成独立的基因库。利用上述合成的基因库，能够重构包含重链和轻链的组合的免疫球蛋白。以重构的免疫球蛋白对HB-EGF的结合活性作为指标，能够筛选出目标抗体。

本发明的抗体对HB-EGF的结合更优选为特异性的。与HB-EGF结合的抗体例如可以如下所述地进行筛选：

(1)使包含通过由杂交瘤得到的cDNA编码的V区的抗体与HB-EGF接触的步骤；

(2)检测HB-EGF与抗体的结合的步骤；及

(3)选择与HB-EGF结合的抗体的步骤。

检测抗体与HB-EGF的结合的方法是公知的。具体而言，使受试抗体与固定于载体的HB-EGF的反应，然后使识别抗体的标记抗体反应。清洗后，检测出载体上的标记抗体时，可以证明该受试抗体与HB-EGF结合。标记可以使用过氧化物酶或β-半乳糖苷等酶活性蛋白质、或FITC等荧光物质。为了评价抗体的结合活性，还可以使用表达HB-EGF的细胞的固定标本。

作为以结合活性为指标的抗体的筛选方法，也可以采用利用噬菌体载体的淘选法。如上所述作为重链和轻链的亚类的基因库获取抗体基因时，利用噬菌体载体的筛选方法是有利的。编码重链和轻链的可变区的基因，通过用适当的连接体序列连结可以形成单链Fv(scFv)。如果将编码scFv的基因插入噬菌体载体，则能够得到在表面表达scFv的噬菌体。使此噬菌体与目标抗原接触，回收与抗原结合的噬菌体时，能够回收编码具有目标结合活性的scFv的DNA。通过根据需要重复此操作，能够将具有目标结合活性的scFv浓缩。

本发明中，编码抗体的多核苷酸可以编码抗体的全长，或者也可以编码抗体的一部分。所谓抗体的一部分，是指抗体分子的任意部分。作为表示抗体一部分的用语，以下有时使用抗体片段。本发明中优选的抗体片段包含抗体的互补决定区域(CDR：complementarity determining region)。更优选本发明的抗体片段包含构成可变区的全部3个CDR。

得到编码目标抗HB-EGF抗体的V区的cDNA后，该cDNA被识别插入该cDNA两末端的限制酶切位点的限制酶消化。优选的限制酶识别、消化在构成抗体基因的碱基序列中出现的可能性低的碱基序列。进而，为了将消化片段的1个拷贝以准确的方向插入载体中，优选提供粘端的限制酶。通过将如上所述被消化的编码抗HB-EGF抗体的V区的cDNA插入适当的表达载体中，可以得到抗体表达载体。此时，通过使编码抗体恒定区(C区)的基因、和编码上述V区的基因框内融合，能够得到嵌合抗体。此处所谓嵌合抗体，是指来自恒定区和可变区的生物不同。因此，除小鼠-人等不同种类的嵌合抗体之外，小鼠-人同种嵌合抗体也包含在本发明的嵌合抗体中。也可以在事先具有恒定区的表达载体中插入上述V区基因来构筑嵌合抗体表达载体。

具体而言，例如可以在保持了编码所期望的抗体恒定区(C区)的DNA的表达载体的5’侧预先配置消化上述V区的基因的限制酶的限制酶识别序列。通过用相同组合的限制酶消化两者，框内融合，由此构筑嵌合抗体表达载体。

为了制造本发明的抗HB-EGF抗体，可以将抗体基因参入表达载体使其在表达控制区的控制下进行表达。所谓用于表达抗体的表达控制区，例如包括增强子和启动子。然后，通过用此表达载体转化适当的宿主细胞，可以得到表达编码抗HB-EGF抗体的DNA的重组细胞。

抗体基因表达时，编码抗体重链(H链)及轻链(L链)的DNA可以分别参入不同的表达载体中。通过将参入H链和L链的载体在相同宿主细胞中同时转化(co-transfect)，可以使具有H链和L链的抗体分子表达。或者，也可以将编码H链及L链的DNA参入单一表达载体，使宿主细胞转化(参见国际公开WO94/11523)。

已经公知多种宿主和表达载体的组合用于将抗体基因暂时分离、导入适当的宿主制作抗体。上述表达体系均可以用于本发明。使用真核细胞作为宿主时，可以使用动物细胞、植物细胞、或者真菌细胞。具体而言，作为可以用于本发明的动物细胞，例如可以使用哺乳类细胞(CHO、COS、骨髓瘤、BHK(baby hamster kidney)、Hela、Vero等)、两栖动物类细胞(爪蟾卵母细胞(Xenopus oocytes)等)、昆虫细胞(sf9、sf21、Tn5等)等。

或者作为植物细胞，公知有由来自烟草(Nicotiana tabacum)等烟草(Nicotiana)属的细胞产生的抗体基因的表达体系。植物细胞的转化可以利用进行了愈伤组织培养的细胞。

进而，作为真菌细胞，可以使用酵母(酿酒酵母(Saccharomycesserevisiae)等酵母菌(Saccharomyces)属、甲醇毕赤酵母(Pichiapastoris)等Pichia属)、丝状真菌(黑曲霉(Aspergillus niger)等曲霉(Aspergillus)属)等。

或者，利用原核细胞的抗体基因的表达体系也是公知的。例如，使用细菌细胞时，本发明可以使用大肠杆菌(E.coli)、枯草菌等细菌细胞。

使用哺乳类细胞时，可以构筑表达载体，所述表达载体功能性地结合常用的有效启动子、表达的抗体基因、其3’侧下游的polyA信号。例如作为启动子/增强子，可以举出人巨细胞病毒立即早期启动子/增强子(human cytomegalovirus immediate early promoter/enhancer)。

另外，除此之外作为在本发明的抗体的表达中可以使用的启动子/增强子，可以举出病毒启动子/增强子、或者来自人延伸因子1α(HEF1α)等哺乳类细胞的启动子/增强子等。作为能够利用启动子/增强子的病毒，具体而言可以给出逆转录病毒、多瘤病毒、腺病毒、猴肾病毒40(SV40)等。

使用SV40启动子/增强子时，可以利用Mulligan等的方法(Nature(1979)277，108)。另外，HEF1α启动子/增强子按照Mizushima等的方法(Nucleic Acids Res.(1990)18，5322)可以容易地用于目标基因表达。

大肠杆菌的情况下，功能性地结合常用的有效启动子、用于抗体分泌的信号序列及表达的抗体基因，可以表达该基因。作为启动子，例如可以举出lacZ启动子、araB启动子。使用lacZ启动子时，可以采用Ward等的方法(Nature(1989)341，544-546；FASEBJ.(1992)6，2422-2427)。或者，araB启动子通过Better等的方法(Science(1988)240，1041-1043)可以用于目标基因的表达。

作为用于抗体分泌的信号序列，在大肠菌的周质中产生时可以使用pelB信号序列(Lei，S.P.et al.，J.Bacteriol.(1987)169，4379)。然后，将在周质中产生的抗体分离后，使用如尿素的盐酸胍之类的蛋白质变性剂，由此改组(重折叠)抗体的结构使其具有所期望的结合活性。

作为插入表达载体的复制起源，可以使用来自SV40、多瘤病毒、腺病毒、牛乳头瘤病毒(BPV)等的复制起源。进而，为了在宿主细胞体系中扩增基因拷贝数，可以向表达载体中插入选择标记。具体而言，可以使用氨基糖苷转移酶(APH)基因、胸苷激酶(TK)基因、大肠杆菌黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶(Ecogpt)基因、二氢叶酸还原酶(dhfr)基因等选择标记。

将上述表达载体导入宿主细胞，将转化的宿主细胞在体外或体内培养，产生目标抗体。宿主细胞的培养可以按照公知的方法进行。例如，作为培养液，可以使用DMEM、MEM、RPMI 1640、IMDM，也可以并用胎牛血清(FCS)等血清补液。

如上所述表达、产生的抗体可以通过单独使用或者适当地组合使用在通常的蛋白质的纯化中采用的公知方法进行纯化。例如，通过对A蛋白柱等亲和柱、色谱柱、过滤、超滤、盐析、透析等进行适当选择、组合，可以分离、纯化抗体(抗体A Laboratory Manual.EdHarlow，David Lane，Cold Spring Harbor Laboratory，1988)。

另外，重组型抗体的生成过程中，除了上述宿主细胞之外，也可以使用转基因动物。即，由导入了编码目标抗体的基因的动物可以得到该抗体。例如，抗体基因通过框内插入到编码在乳汁中固有产生的蛋白质的基因的内部，构筑成融合基因。作为乳汁中分泌的蛋白质，例如，可以使用山羊β酪蛋白等。将含有插入了抗体基因的融合基因的DNA片段注入山羊的胚中，将该注入胚导入雌性山羊中。由接受该胚的山羊生出转基因山羊(或其子孙)，从该转基因山羊产生的乳汁中能够作为与乳汁蛋白质的融合蛋白质得到所期望的抗体。另外，为了使由转基因山羊产生的含有所期望抗体的乳汁量增加，可以适当对转基因山羊使用激素(Ebert，K.M.et al.，Bio/Technology(1994)12，699-702)。

作为本发明的重组抗体的C区，可以使用来自动物抗体的C区。例如作为小鼠抗体的H链C区，可以使用Cγ1、Cγ2a、Cγ2b、Cγ3、Cμ、Cδ、Cα1、Cα2、Cε，作为L链C区，可以使用Cκ、Cλ。另外，作为小鼠抗体之外的动物抗体，可以使用大鼠、家兔、山羊、绵羊、骆驼、猴子等动物抗体。它们的序列是公知的。另外，为了改善抗体或其产生的稳定性，可以对C区进行修饰。本发明中，将抗体给与人时，为了降低对人的异种抗原性等，可以制作人为改变的基因重组型抗体。所谓基因重组型重组抗体例如包括嵌合抗体(Chimeric antibody)、人源化抗体(Humanized antibody)等。

上述工程抗体(engineered antibody)可以采用公知的方法制备。嵌合抗体是指连接彼此来自不同的可变区和恒定区的抗体。例如包含小鼠抗体的重链可变区、轻链可变区和人抗体的重链恒定区、轻链恒定区的抗体是小鼠-人-异种嵌合抗体。使编码小鼠抗体可变区的DNA与编码人抗体恒定区的DNA连接，将其参入表达载体，由此可以制作表达嵌合抗体的重组载体。培养通过载体转化得到的重组细胞，使参入的DNA表达，由此可以获得培养中产生的该嵌合抗体。人抗体及人源化抗体的C区可以使用人抗体的C区。例如在H链中，可以使用Cγ1、Cγ2、Cγ3、Cγ4、Cμ、Cδ、Cα1、Cα2及Cε作为C区。另外，L链中，可以使用Cκ及Cλ作为C区。上述C区的氨基酸序列以及编码这些序列的碱基序列是公知的。另外，为了改善抗体本身或抗体产生的稳定性，可以修饰人抗体C区。

一般情况下，嵌合抗体由来自人以外的动物的抗体的V区和来自人抗体的C区构成。相对于此，人源化抗体由来自人以外的动物的抗体的互补决定区域(CDR：complementarity determining region)、和来自人抗体的构架区(FR：framework region)及来自人抗体的C区构成。由于人源化抗体在人体内的抗原性低，所以作为本发明的治疗剂的有效成分有用。

抗体的可变区通常由夹在4个构架区(FR)中的3个互补决定区域(CDR：complementarity determining region)构成。CDR实质上为决定抗体的结合特异性的区域。CDR的氨基酸序列富有多样性。另一方面，构成FR的氨基酸序列即使在具有不同的结合特异性的抗体之间大多数情况下也显示出高的同源性。因此，通常通过CDR的移植，可以使某种抗体的结合特异性移植到其他抗体中。

人源化抗体也称作重构(reshaped)人抗体。具体而言，将人以外的动物、例如小鼠抗体的CDR移植到人抗体中的人源化抗体等是公知的。用于得到人源化抗体的一般的基因重组方法也是已知的。

具体而言，作为用于将小鼠抗体的CDR移植到人的FR中的方法，例如公知重叠延伸PCR(Overlap Extension PCR)。在重叠延伸PCR中，将编码应移植的小鼠抗体CDR的碱基序列附着在用于合成人抗体FR的引物上。针对4个FR分别准备引物。一般情况下，在将小鼠CDR向人FR的移植中，选择与小鼠FR同源性高的人FR有利于维持CDR功能。即，一般情况下优选利用下述人FR，该人FR包含与应移植的小鼠CDR邻接的FR的氨基酸序列同源性高的氨基酸序列。

另外，连结的碱基序列被设计成框内相互连接。利用各个引物，分别地合成人FR。结果得到了编码小鼠CDR的DNA附着在各FR上的产物。各产物的编码小鼠CDR的碱基序列被设计成相互重叠。接下来，以人抗体基因作为模板合成产物，使该产物的重叠CDR部分相互退火，进行互补链合成反应。利用此反应，人FR通过小鼠CDR的序列连结。

最终，3个CDR和4个FR连结的V区基因，通过在5’末端和3’末端退火且附着适当的限制酶识别序列的引物，将其全长扩增。将如上所述得到的DNA和编码人抗体C区的DNA插入表达载体中使其框内融合，由此可以制作人型抗体表达用载体。将该重组载体导入宿主，建立重组细胞后，培养该重组细胞，通过使编码该人源化抗体的DNA表达，在该培养细胞的培养物中产生该人源化抗体(参见欧洲专利公开EP239400、国际公开WO96/02576)。

定性或者定量地测定、评价如上所述制作的人源化抗体与抗原的结合活性，由此能够适当地选择出在通过CDR连结时该CDR形成良好的抗原结合部位的人抗体FR。根据需要，也可以取代FR的氨基酸残基使重构人抗体的CDR形成适当的抗原结合部位。例如，应用在将小鼠CDR向人FR中移植时使用的PCR法，能够向FR中导入氨基酸序列的突变。具体而言，能够向使FR退火的引物中导入部分的碱基序列的突变。在利用上述引物合成的FR中导入碱基序列的突变。取代氨基酸的突变型抗体与抗原的结合活性采用上述方法进行测定、评价，由此能够选择具有所期望的性质的突变FR序列(Sato，K.et al.，Cancer Res，1993，53，851-856)。

人抗体的获得方法也是公知的。例如首先将人淋巴细胞在体外用所期望的抗原或表达所期望抗原的细胞敏化。然后，使敏化的淋巴细胞与人骨髓瘤细胞融合，由此可以获得具有与抗原的结合活性的所期望的人抗体(参见日本特公平1-59878)。作为融合配偶体的人骨髓瘤细胞例如可以使用U266等。

另外，通过将具有人抗体基因的全部基因谱的转基因动物用所期望的抗原免疫，可以获得所期望的人抗体(参见国际公开WO93/12227、WO 92/03918、WO 94/02602、WO 94/25585、WO 96/34096、WO 96/33735)。进而，使用人抗体文库，通过淘选获得人抗体的技术也是公知的。例如将人抗体V区作为单链抗体(scFv)通过噬菌体展示法使其在噬菌体的表面表达，由此可以选择出与抗原结合的噬菌体。通过对选择的噬菌体的基因进行解析，可以确定编码与抗原结合的人抗体的V区的DNA序列。确定与抗原结合的scFv的DNA序列后，使该V区序列与所期望的人抗体C区的序列框内融合，然后，插入适当的表达载体，由此可以制作表达载体。通过将该表达载体导入如上述举出的优选的表达细胞中，使编码该人抗体的基因表达，由此可以获取该人抗体。上述方法已经公知(国际公开WO92/01047，WO92/20791，WO93/06213，WO93/11236，WO93/19172，WO95/01438，WO95/15388)。

本发明的抗体只要与HB-EGF蛋白质结合即可，不仅包括以IgG为代表的二价抗体，也包括一价抗体、或以IgM为代表的多价抗体。本发明的多价抗体中包括具有全部相同的抗原结合部位的多价抗体、或、具有部分或全部不同的抗原结合部位的多价抗体。本发明的抗体不限于全长分子的抗体，只要与HB-EGF蛋白质结合即可，也可以为低分子化抗体或其修饰物。

低分子化抗体包括全长抗体(whole antibody、例如whole IgG等)的部分缺失的抗体片段。只要具有与HB-EGF抗原的结合能力即可，允许抗体分子部分缺失。本发明的抗体片段优选含有重链可变区(VH)及轻链可变区(VL)中的任一个、或两者。VH或VL的氨基酸序列可以包括取代、缺失、添加及/或者插入。并且只要具有与HB-EGF抗原的结合能力即可，也可以使VH及VL中的任一个或两者的一部分缺失。另外，可变区也可以嵌合化或人源化。作为抗体片段的具体例，例如，可以举出Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv等。另外，作为低分子化抗体的具体例，例如，可以举出Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv、scFv(单链Fv)、双链抗体(Diabody)、sc(Fv)2(单链(Fv)2)等。上述抗体的多聚体(例如，二聚体、三聚体、四聚体、聚合物)也包含在本发明的低分子化抗体中。

抗体的片段可以通过用酶处理抗体使抗体片段生成而获得。作为产生抗体片段的酶，例如公知木瓜蛋白酶、胃蛋白酶、或者纤溶酶等。或者，可以构筑编码上述抗体片段的基因，将其导入表达载体后，使其在适当的宿主细胞中表达(例如，参见Co，M.S.et al.，J.Immunol，(1994)152，2968-2976、Better，M.&Horwitz，A.H.Methods in Enzymology(1989)178，476-496、Plueckthun，A.&Skerra，A.Methods in Enzymology(1989)178，476-496、Lamoyi，E.，Methods in Enzymology(1989)121，652-663、Rousseaux，J.etal.，Methods in Enzymology(1989)121，663-669、Bird，R.E.et al.，TIBTECH(1991)9，132-137)。

消化酶切断抗体片段的特定位置，从而得到下述特定结构的抗体片段。对上述通过酶法得到的抗体片段采用基因工程学方法时，可是使抗体的任意部分缺失：

木瓜蛋白酶消化：F(ab)2或Fab

胃蛋白酶消化：F(ab’)2或Fab’

纤溶酶消化：Facb

双链抗体是指通过基因融合构筑的二价(bivalent)的抗体片段(Holliger P et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：6444-6448(1993)、EP404,097号、WO93/11161号等)。双链抗体是由2条多肽链构成的二聚体。通常，构成二聚体的多肽链分别在相同的链中VL及VH通过连接体结合。一般情况下，双链抗体中的连接体在VL和VH不能相互结合的部位很短。具体而言，构成连接体的氨基酸残基例如为5个残基左右。因此，在同一多肽链上编码的VL和VH，不能形成单链可变区片段，与其它单链可变区片段形成二聚体。结果双链抗体具有2个抗原结合部位。

scFv通过将抗体的H链V区和L链V区连结而得到。scFv中，H链V区和L链V区通过连接体、优选通过肽连接体连结(Huston，J.S.et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A，1988，85，5879-5883.)。scFv中的H链V区及L链V区虽然在本说明书中记载为抗体，但也可以来自任意的抗体。连结V区的肽连接体，没有特殊的限制。例如可以使用包含3至25个残基左右的任意的单链肽作为连接体。

V区例如可以通过上述PCR法连结。为了利用PCR对V区进行连结，首先使用编码全部或所期望的部分的氨基酸序列的DNA作为模板，所述DNA序列是编码上述抗体H链或H链V区的DNA序列、及编码该抗体的L链或L链V区的DNA序列。

利用PCR法，使编码H链V区和L链V区的DNA分别扩增，所述PCR法使用具有与应扩增的DNA两端的序列对应的序列的一对引物。然后，准备编码肽连接体部分的DNA。编码肽连接体的DNA也可以使用PCR进行合成。此时在使用的引物的5’侧事先添加能够与分别合成的各V区的扩增产物连结的碱基序列。然后，使用[H链V区DNA]-[肽连接体DNA]-[L链V区DNA]的各DNA和装配PCR用引物进行PCR反应。装配PCR用引物为在[H链V区DNA]的5’侧退火的引物和在[L链V区DNA]的3’侧退火的引物的组合。即，装配PCR用引物，为能够扩增编码应合成的scFv的全长序列的DNA的引物组。另一方面，可以在[肽连接体DNA]上添加能够与各V区DNA连结的碱基序列。结果上述DNA连结，而且通过装配PCR用引物最终生成scFv的全长作为扩增产物。一旦制作成编码scFv的DNA时，含有上述DNA的表达载体及通过该表达载体转化得到的重组细胞可以通过常规方法获得。另外，结果将得到的重组细胞培养，使编码该scFv的DNA表达，由此可以获得该scFv。

sc(Fv)2是用连接体等将2个VH及2个VL结合形成单链的低分子化抗体(Hudson et al、J Immunol.Methods 1999；231：177-189)。sc(Fv)2可以通过例如将scFv用连接体连接来制作。

另外，优选具有下述特征的抗体：以单链多肽的N末端侧作为基点，将2个VH及2个VL按照VH、VL、VH、VL([VH]连接体-[VL]连接体-[VH]连接体-[VL])的顺序排列。

2个VH及2个VL的顺序不特别限定于上述配置，可以以任意顺序排列。例如还可以举出以下配置。

[VL]连接体-[VH]连接体-[VH]连接体-[VL]

[VH]连接体-[VL]连接体-[VL]连接体-[VH]

[VH]连接体-[VH]连接体-[VL]连接体-[VL]

[VL]连接体-[VL]连接体-[VH]连接体-[VH]

[VL]连接体-[VH]连接体-[VL]连接体-[VH]

作为连接抗体可变区的连接体，例如可以使用能通过基因工程学导入的任意肽连接体、或合成化合物连接体(例如参见蛋白质Engineering，9(3)，299-305(1996)中公开的连接体)。本发明中优选肽连接体。肽连接体的长度没有特别限定，本领域技术人员可以根据目的适当选择。通常构成肽连接体的氨基酸残基为1至100个氨基酸，优选为3至50个氨基酸残基，更优选为5至30个氨基酸残基，特别优选为12至18个氨基酸残基(例如15个氨基酸残基)。

构成肽连接体的氨基酸序列只要不抑制scFv的结合作用即可，可以为任意序列。

或者，也可以使用合成化学物连接体(化学交联剂)连结V区。肽化合物等交联中通常使用的交联剂可以用于本发明。例如可以使用：N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)、辛二酸二琥珀酰亚胺酯(DSS)、双(硫代琥珀酰亚胺基)辛二酸酯(BS3)、二硫代双(琥珀酰亚胺基丙酸酯)(DSP)、二硫代双(硫代琥珀酰亚胺基丙酸酯)(DTSSP)、乙二醇双(琥珀酰亚胺基琥珀酸酯)(EGS)、乙二醇双(硫代琥珀酰亚胺基琥珀酸酯)(sulfo-EGS)、酒石酸二琥珀酰亚胺酯(DST)、酒石酸二硫代琥珀酰亚胺酯(sulfo-DST)、双[2-(琥珀酰亚胺基氧基羰基氧基)乙基]砜(BSOCOES)、双[2-(硫代琥珀酰亚胺基氧基羰基氧基)乙基]砜(sulfo-BSOCOES)等。

连结4个抗体可变区时通常需要3个连接体。多个连接体可以相同，或者也可以使用不同的连接体。本发明中优选的低分子化抗体为双链抗体或sc(Fv)2。为了得到上述低分子化抗体，可以将抗体用酶(例如木瓜蛋白酶、胃蛋白酶等)处理生成抗体片段，或者构筑编码上述抗体片段的DNA，将其导入表达载体中，然后在适合的宿主细胞中使其表达(例如参见Co，M.S.et al.，J.Immunol.(1994)152，2968-2976；Better，M.and Horwitz，A.H.Methods Enzymol.(1989)178，476-496；Plueckthun，A.and Skerra，A.MethodsEnzymol.(1989)178，497-515；Lamoyi，E.Methods Enzymol.(1986)121，652-663；Rousseaux，J.et al.，Methods Enzymol.(1986)121，663-669；Bird，R.E.and Walker，B.W.TrendsBiotechnol.(1991)9，132-137)。

进而，本发明的抗体也可以以抗体修饰物的形式使用，所述抗体修饰物是抗体与聚乙二醇(PEG)等各种分子结合得到的。这些抗体修饰物可以通过对本发明的抗体进行化学修饰而得到。抗体的修饰方法已经在本领域被确立。

本发明的抗体也可以为双重特异性抗体(bispecific antibody)。所谓双重特异性抗体，是指在同一抗体分子内具有识别不同的抗原决定部位的可变区的抗体，该抗原决定部位可以存在于不同的分子中，或者也可以存在于同一分子中。即，在本发明中，双重特异性抗体可以具有识别HB-EGF分子上的不同抗原决定部位的抗原结合部位。上述双重特异性抗体中，2分子抗体分子可以与1分子HB-EGF结合。结果可以期待更强的细胞毒性作用。本发明中的“抗体”中也包含上述抗体。

另外，在本发明中，也可以组合识别HB-EGF之外的抗原的双重特异性抗体。例如也可以组合识别与HB-EGF不同的抗原的双重特异性抗体，所述抗原为与HB-EGF同样地在靶癌细胞的细胞表面特异性表达的抗原。

用于制备双重特异性抗体的方法是公知的。例如通过将识别不同抗原的2种抗体结合来制备双重特异性抗体。被结合的抗体可以为分别具有H链和L链的1/2分子，或者也可以为仅包含H链的1/4分子。或者，通过使产生不同单克隆抗体的杂交瘤融合，也可以制作双重特异性抗体产生融合细胞。进而，可以通过基因工程学方法制作双重特异性抗体。

进而，本发明的抗体也可以为糖链被修饰的抗体。已知通过修饰抗体的糖链能够增强抗体的细胞毒性。

作为糖链被修饰的抗体的例子，例如，可以举出经糖基化修饰的抗体(WO 99/54342等)、糖链中附加的岩藻糖缺失的抗体(WO00/61739、WO 02/31140、WO 2006/067847、WO 2006/067913等)、具有含有截开型GlcNAc的糖链的抗体(WO 02/79255等)等。

作为本发明的优选糖链修饰抗体，可以举出岩藻糖缺失的抗体。与抗体结合的糖链包括与抗体分子的天冬酰胺的侧链的N原子结合的N-糖基结合糖链、和与抗体分子的丝氨酸或苏氨酸的侧链羟基结合的O-糖基结合糖链，本发明中，岩藻糖是否存在与N-糖基结合糖链相关。

本发明中，所谓岩藻糖缺失的抗体，是指组合物中的抗体的N-糖基结合糖链中，20％以上、优选50％以上、较优选70％以上、更优选90％以上的N-糖基结合糖链中岩藻糖缺失。

岩藻糖缺失的抗体可以通过本领域技术人员公知的方法制作，例如，可以通过在不具有附着α-1，6核心岩藻糖(α-1，6corefucose)的能力或此能力低的宿主细胞中使抗体表达，进行制造。不具有附着岩藻糖的能力或此能力低的宿主细胞没有特殊的限定，例如，可以举出大鼠骨髓瘤YB2/3HL.P2.G 11.16Ag.20细胞(简称YB2/0细胞)(以ATCC CRL 1662保存)、FTVIII敲除CHO细胞(WO 02/31140)、Lec13细胞(WO 03/035835)、岩藻糖转运蛋白缺失细胞(WO2006/067847、WO2006/067913)等。

糖链的解析可以采用本领域技术人员公知的方法进行。例如，使N-糖苷酶F(Roche)等作用于抗体，使糖链与抗体分离。然后，通过使用纤维素柱体的固相提取(Shimizu Y.et al.，CarbohydrateResearch 332(2001)，381-388)进行除盐后，浓缩干固，用2-氨基吡啶进行荧光标记(Kondo A.et al.，Agricultural and BiologicalChemistry 54：8(1990)，2169-2170)。通过使用纤维素柱体的固相提取将所得的PA化糖链脱去试剂后，离心浓缩，形成纯化PA化糖链。然后，进行利用ODS柱的反相HPLC分析，由此可以测定。另外，也可以在配制PA化糖链后，将利用ODS柱的反相HPLC分析及利用胺柱的正相HPLC分析组合进行二维作图，由此进行测定。

作为本发明中使用的抗体的例子，可以举出以下[1]至[2]的抗体。

[1]抗体，包含H链及L链，

所述H链具有序列号1记载的氨基酸序列作为CDR1、序列号2的氨基酸序列作为CDR2、序列号3的氨基酸序列作为CDR3，

所述L链具有序列号4记载的氨基酸序列作为CDR1、序列号5的氨基酸序列作为CDR2、序列号6记载的氨基酸序列作为CDR3；

[2]抗体，结合在与[1]所述的抗体结合的抗原决定部位相同的抗原决定部位。

没有特别限定，作为具有序列号1记载的氨基酸序列作为CDR1、序列号2记载的氨基酸序列作为CDR2、序列号3记载的氨基酸序列作为CDR3的H链的例子，可以举出下述H链：包含具有序列号8记载的氨基酸序列的第20号的Glu到第137号的Ala的氨基酸序列的重链可变区。另外，没有特别限定，作为具有序列号4记载的氨基酸序列作为CDR1、序列号5记载的氨基酸序列作为CDR2、序列号6记载的氨基酸序列作为CDR3的L链的例子，可以举出下述L链：包含具有序列号10记载的氨基酸序列的第21号的Asp到第133号的Lys的氨基酸序列的轻链可变区。

作为用于制备与某种多肽功能等同的多肽的本领域技术人员熟知的方法，已知有将突变导入多肽中的方法。例如如果为本领域技术人员，则使用位点定向诱变法(Hashimoto-Gotoh，T.et al.(1995)Gene 152，271-275；Zoller，M.J.and Smith，M.(1983)MethodsEnzymol.100，468-500；Kramer，W.et al.(1984)Nucleic Acids Res.12，9441-9456；Kramer，W.and Fritz，H.J.(1987)Methods Enzymol.154，350-367；Kunkel，T.A.(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82，488-492；and Kunkel(1988)Methods Enzymol.85，2763-2766)等，将合适的突变导入本发明的抗体中，由此可以制备与该抗体具有同等活性的抗体。另外，氨基酸的突变也可以在自然界中产生。如上所述，本发明的抗体的氨基酸序列中具有1个或多个氨基酸发生了突变的氨基酸序列、与该抗体具有同等活性的抗体也包括在本发明的抗体中。一般认为，上述突变体中的突变氨基酸数，通常为50个氨基酸以内，优选为30个氨基酸以内，更优选为10个氨基酸以内(例如5个氨基酸以内)。

突变的氨基酸残基中，优选突变为保留氨基酸侧链性质的其他氨基酸。例如，基于氨基酸侧链的性质，确立如下分类：

疏水性氨基酸(A、I、L、M、F、P、W、Y、V)；

亲水性氨基酸(R、D、N、C、E、Q、G、H、K、S、T)；

具有脂肪族侧链的氨基酸(G、A、V、L、I、P)；

具有含羟基侧链的氨基酸(S、T、Y)；

具有含硫原子侧链的氨基酸(C、M)；

具有含羧酸及酰胺侧链的氨基酸(D、N、E、Q)；

具有含碱基侧链的氨基酸(R、K、H)；

具有含芳香族侧链的氨基酸(H、F、Y、W)；

(括号内均表示氨基酸的单字母符号)。

已知通过对某氨基酸序列进行1个或多个氨基酸残基的缺失、添加及/或其他氨基酸的取代，对其进行修饰，具有上述被修饰的氨基酸序列的多肽维持其生物学活性(Mark，D.F.et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1984)81，5662-5666，Zoller，M.J.and Smith，M.，Nucleic Acids Research(1982)10，6487-6500，Wang，A.et al.，Science 224，1431-1433，Dalbadie-McFarland，G.et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1982)79，6409-6413)。即，通常在构成某多肽的氨基酸序列中，被分为各类的氨基酸相互取代时，维持该多肽的活性的可能性高。本发明中，将上述氨基酸组组内的氨基酸之间的取代称作保存性取代。

另外，本发明还提供下述抗体，即，所述抗体结合在与上述[1]所述的、本发明中公开的抗HB-EGF抗体所结合的抗原决定部位相同的抗原决定部位。上述抗体例如可以通过以下方法得到。

被检抗体与某抗体共有抗原决定部位时，可以通过二者对同一抗原决定部位的竞争来确认。抗体间的竞争通过交差阻断测定(cross-blocking assay)等检测。例如竞争ELISA测定为优选的交差阻断测定。具体而言，在交差阻断测定中，在候选竞争抗体的存在下或不存在下，将涂布在微量滴定板的孔上的HB-EGF蛋白质预培养后，添加本发明的抗HB-EGF抗体。与孔中的HB-EGF蛋白质结合的本发明的抗HB-EGF抗体的量，与对相同抗原决定部位的结合发生竞争的候补竞争抗体(被检抗体)的结合能力间接相关。即，被检抗体对同一抗原决定部位的亲合性越大，本发明的抗HB-EGF抗体对涂布了HB-EGF蛋白质的孔的结合量越低，被检抗体对涂布了HB-EGF蛋白质的孔的结合量越高。

与孔结合的抗体量可以通过预先标记抗体而容易地测定。例如，生物素标记的抗体，可以通过使用亲和素过氧化物酶缀合物和适当的基质进行测定。将利用过氧化物酶等酶标记的交差阻断测定特别地称作竞争ELISA测定。抗体可以用能够检测或者测定的其他标记物进行标记。具体而言，公知的有放射标记或者荧光标记等。

进而，当被检抗体具有来自与本发明抗HB-EGF抗体不同的种的恒定区时，与孔结合的抗体的量也可以通过识别此抗体的恒定区的标记抗体进行测定。或者，为来自相同种的抗体，但类别不同时，通过识别各类别的抗体，可以测定与孔结合的抗体的量。

如果与在不存在候选竞争抗体的条件下实施的对照试验中得到的结合活性相比，候选抗体能够以至少20％、优选至少20-50％、更优选至少50％阻断抗HB-EGF抗体结合，则该候选竞争抗体是结合与本发明抗HB-EGF抗体实质相同的抗原决定部位的抗体、或者是对向相同的抗原决定部位的结合产生竞争的抗体。

抗体的结合活性

抗体的抗原结合活性的测定可以采用公知的方法(Antibodies ALaboratory Manual.Ed Harlow，David Lane，Cold Spring HarborLaboratory，1988)。例如可以使用ELISA(酶联免疫吸附检测法)、EIA(酶免疫测定法)、RIA(放射免疫测定法)、或荧光免疫法等。进而，作为测定抗体对在细胞内表达的抗原的结合活性的方法，例如可以举出上述Antibodies A Laboratory Manual中第359～420页中记载方法。

另外，作为测定在悬浮于缓冲液等的细胞表面上表达的抗原与针对该抗原的抗体的结合的方法，可以特别优选利用使用流式细胞仪的方法。作为使用的流式细胞仪，例如可以举出FACSCanto^TM II，FACSAria^TM、FACSArray^TM、FACSVantage^TM SE、FACSCalibur^TM(以上BD Biosciences公司)及EPICS ALTRA HyPerSort、Cytomics FC500、EPICS XL-MCL ADC EPICS XL ADC、Cell Lab Quanta/CellLab Quanta SC(以上Beckman Coulter公司)等。

作为被检HB-EGF抗体对抗原的结合活性的优选测定方法的一个例子，可以举出下述方法，即，使被检抗体与表达HB-EGF的细胞进行反应，用识别所述被检抗体的被FITC标记的二次抗体进行染色后，利用FACSCalibur(BD公司)进行测定，使用CELL QUESTsoftware(BD公司)解析其荧光强度。

增殖抑制活性

作为评价或测定基于抗HB-EGF抗体的细胞增殖抑制效果的方法，优选使用以下方法。作为评价或测定体外该细胞增殖抑制活性的方法，可以使用下述方法，即，对添加到培养基中的用[³H]标记的胸苷被活细胞摄取的情况进行测定，作为DNA复制能力的指标。作为更简便的方法，可以使用在显微镜下测量将锥虫蓝等色素排除到细胞外的能力的色素排除法、及MTT法。后者利用了活细胞具有将作为四唑鎓盐的MTT(3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-2，5-二苯基溴化四唑)转化为蓝色的甲暨(formazan)产物的能力。更具体而言，在被检细胞培养液中添加被检抗体和配体，经过一定时间后，在培养液中加入MTT溶液，静置一定时间，由此使MTT摄入到细胞内。结果作为黄色化合物的MTT被细胞内的线粒体内的琥珀酸脱氢酶转化为蓝色化合物。将上述蓝色产物溶解并显色后，测定其吸光度，由此作为活细胞数的指标。除MTT之外，还市售有MTS、XTT、WST-1、WST-8等试剂(Nacalai Tesque等)，可以优选使用。进行活性测定时，与抗HB-EGF抗体同样地使用对照抗体，所述对照抗体是具有与抗HB-EGF抗体相同的同种型的抗体而不具有该细胞增殖抑制活性的结合抗体，抗HB-EGF抗体显示出比对照抗体更强的细胞增殖抑制活性时，可以判定抗体具有细胞增殖抑制活性。

另外，作为评价或测定生物体内细胞增殖抑制活性的方法，可以使用带有肿瘤的小鼠模型。例如将其增殖被HB-EGF促进的癌细胞移植到非人被检动物的皮内或皮下后，从当日或次日开始每天或间隔几天静脉或腹腔内给与被检抗体。通过经时测定肿瘤的大小，可以评价细胞增殖抑制活性。与体外评价同样地给与具有同样的同种型的对照抗体，当抗HB-EGF抗体给与组中的肿瘤大小明显小于对照抗体给与组中的肿瘤大小时，可以判定抗体具有细胞增殖抑制活性。使用小鼠作为非人被检动物时，可以优选使用由遗传性缺失胸腺导致缺失T淋巴细胞功能的裸(nu/nu)小鼠。通过使用该小鼠，在对利用被给与的抗体所引起的细胞增殖抑制活性进行评价和测定时可以排除被检动物中T淋巴细胞的贡献。

抑制细胞增殖的方法

本发明提供一种通过使表达HB-EGF的细胞与本发明的抗体接触来抑制该细胞的增殖的方法。本发明的抗体如上所述，包含在本发明的细胞增殖抑制剂中，与HB-EGF蛋白质结合。与抗HB-EGF抗体接触的细胞只要为表达HB-EGF的细胞即可，没有特别限定，但优选与疾病相关的细胞。作为与疾病相关的细胞的优选例，可以举出癌细胞。癌优选为胰腺癌、肝癌、食道癌、黑色素瘤、大肠癌、胃癌、卵巢癌、宫颈癌、乳癌、膀胱癌、脑肿瘤、或血液癌。血液癌包括骨髓瘤、淋巴瘤、白血病等。

使用抗HB-EGF抗体的转运方法

本发明涉及一种使用抗HB-EGF抗体将细胞毒性物质转运到细胞内的方法。本方法中使用的抗体为上述结合了细胞毒性的抗HB-EGF抗体。细胞毒性物质的转运可以通过使结合了细胞毒性物质的抗HB-EGF抗体与表达HB-EGF的细胞接触来进行。本发明中对转运细胞毒性物质的细胞没有特别限定，但优选与疾病有关的细胞。作为与疾病有关的细胞的例子，可以举出癌细胞。癌优选为胰腺癌、肝癌、食道癌、黑色素瘤、大肠癌、胃癌、卵巢癌、宫颈癌、乳癌、膀胱癌、脑肿瘤或血液癌。血液癌包括骨髓瘤、淋巴瘤、白血病等。

本发明中所谓接触可以在体外进行或也可以在体内进行。在此情况下，作为添加的抗体的形状，可以适当地使用溶液或者通过冻结干燥等得到的固体等形状。在以水溶液形式添加时，可以是单纯地仅含抗体的水溶液，也可以是含有例如表面活性剂、赋形剂、着色剂、香料、防腐剂、稳定剂、缓冲剂、悬浮剂、等渗剂、粘合剂、崩解剂、润滑剂、流动性促进剂、矫味剂等的溶液。添加的浓度没有特殊的限制，但作为培养液中的最终浓度，可以优选使用1pg/ml至1g/ml的范围，较优选为1ng/ml至1mg/ml，更优选为1μg/ml至1mg/ml。

另外，在本发明中，在体内的“接触”还可以通过向下述动物进行给与而进行，所述动物为将HB-EGF表达细胞移植到体内的非人动物，或内在地具有表达HB-EGF的癌细胞的动物。给药方法可以通过口服、非口服给药中的任意一种实施。特别优选为通过非口服给与的给药方法，作为相关的给药方法，具体而言，可以举出注射给药、经鼻给药、经肺给药、经皮给药等。作为注射给药的例子，例如，可以通过静脉内注射、肌肉内注射、腹腔内注射、皮下注射等全身或局部地给与本发明的药物组合物细胞增殖抑制剂及抗癌剂。另外，可以根据受试动物的年龄、症状选择适当的给药方法。以水溶液形式给药时，可以为单纯地仅含有抗体的水溶液，也可以是例如含有表面活性剂、赋形剂、着色剂、香料、防腐剂、稳定剂、缓冲剂、悬浮剂、等渗剂、粘合剂、崩解剂、润滑剂、流动性促进剂、矫味剂等的溶液。作为给药量，例如，可以在每次给药每1kg体重0.0001mg至1000mg的范围内选择给药量。或者，例如，在每位患者为0.001至100000mg/body的范围内选择给药量。但是，本发明的抗体给药量并不限定于上述给药量。

药物组合物

从其他观点考虑，本发明的特征在于含有与HB-EGF蛋白质结合的抗体的药物组合物。本发明的另一个特征在于含有与HB-EGF蛋白质结合的抗体的细胞增殖抑制剂、特别是抗癌剂。本发明的细胞增殖抑制剂和抗癌剂优选给与罹患癌的对象或可能罹患癌的对象。

本发明中，含有与HB-EGF蛋白质结合的抗体的细胞增殖抑制剂还可以表现为：抑制细胞增殖的方法，所述方法包括将与HB-EGF蛋白质结合的抗体给与对象的步骤；或与HB-EGF蛋白质结合的抗体在制备细胞增殖抑制剂中的应用。

另外，本发明中，含有与HB-EGF蛋白质结合的抗体的抗癌剂，还可以表现为：预防或治疗癌的方法，所述方法包括将与HB-EGF蛋白质结合的抗体给与对象的步骤；或与HB-EGF蛋白质结合的抗体在制备抗癌剂中的应用。

本发明的药物组合物(例如细胞增殖抑制剂、抗癌剂。以下相同)中所含的抗体只要与HB-EGF蛋白质结合即可，没有特别限定，也可以使用本说明书中列举的任意抗体。

本发明的药物组合物的给药方法可以通过口服、非口服给药中的任一种方式实施。特别优选通过非口服给药进行给药的方法，作为相关的给药方法，具体而言，可以举出注射给药、经鼻给药、经肺给药、经皮给药等。作为注射给药例，例如，可以通过静脉内注射、肌肉内注射、腹腔内注射、皮下注射等全身或局部地给与本发明的药物组合物。另外，可以根据患者的年龄、症状选择适当的给药方法。作为给药量，例如，在每一次给药每1kg体重为0.0001mg至1000mg的范围内选择给药量。或者，例如，在每位患者为0.001至100000mg/body的范围内选择给药量。但是，本发明的药物组合物并不限定于上述给药量。

本发明的药物组合物可以按照常用方法进行制剂化(例如，Remington’s Pharmaceutical Science，latest edition，Mark PublishingCompany，Easton，U.S.A)，也可以同时含有药物中允许的载体或添加物。例如可以举出表面活性剂、赋形剂、着色剂、香料、防腐剂、稳定剂、缓冲剂、悬浮剂、等渗剂、粘合剂、崩解剂、润滑剂、流动性促进剂、矫味剂等。并且，并不限定于此，可以适当地使用其它常用的载体。具体而言，可以举出轻质无水硅酸、乳糖、结晶纤维素、甘露醇、淀粉、羧甲基纤维素钙、羧甲基纤维素钠、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、聚乙烯醇缩乙醛二乙氨基乙酸酯(polyvinyl acetal diethylamino acetate)、聚乙烯吡咯烷酮、明胶、中链脂肪酸三甘油酯、聚氧乙烯氢化蓖麻油60、白糖、羧甲基纤维素、玉米淀粉、无机盐类等。

药物的制备方法

本发明还提供包括以下步骤的药物、特别是抗癌剂的制备方法：

(a)提供抗HB-EGF抗体的步骤；

(b)确认抗体(a)是否具有内化活性的步骤；

(c)选择具有内化活性的抗体的步骤；

(d)将(c)中选择的抗体与细胞毒性物质结合的步骤。

是否具有内化活性可以通过上述方法确认。另外，对于抗HB-EGF抗体、细胞毒性物质也可以使用上述抗HB-EGF抗体、细胞毒性物质。

癌的诊断

与正常组织相比，HB-EGF的表达在胰腺癌、肝癌、食道癌、黑色素瘤、大肠癌、胃癌、卵巢癌、宫颈癌、乳癌、膀胱癌、脑肿瘤及血液癌等较宽的癌症种类中升高，本发明的其他方案中，本发明提供一种使用抗HB-EGF抗体的疾病的诊断方法、特别是癌的诊断方法。

本发明的诊断方法可以通过检测摄取到细胞内的抗HB-EGF抗体来进行。本发明中使用的抗HB-EGF抗体优选具有内化活性，另外优选被标记物标记。

因此，作为本发明的诊断方法的优选方案，可以举出使用用标记物标记、且具有内化活性的抗HB-EGF抗体的诊断方法。结合标记物的抗HB-EGF抗体可以使用上述抗HB-EGF抗体。

与抗HB-EGF抗体结合的标记物没有特别限定，例如可以使用荧光色素、酶、辅酶、化学发光物质、放射性物质等本领域技术人员公知的标记物，作为具体例，可以举出放射性同位素(32P、14C、125I、3H、131I等)、荧光素、罗丹明、丹磺酰氯、伞形花内酯、荧光素酶、过氧物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、β-葡糖苷酶、辣根过氧化物酶、葡糖淀粉酶、溶菌酶、糖类氧化酶、微过氧物酶、生物素等。使用生物素作为标记物时，优选在添加生物素标记抗体后再添加结合了碱性磷酸酶等酶的抗生物素蛋白。为了使标记物与抗HB-EGF抗体结合，可以使用戊二醛法、马来酰亚胺法、吡啶基二硫化物法、高碘酸法等公知的方法。标记物与抗体的结合可以根据本领域技术人员公知的方法进行。

利用本发明的方法诊断的疾病为癌的情况下，对癌的种类没有特别限定，但优选胰腺癌、肝癌、食道癌、黑色素瘤、大肠癌、胃癌、卵巢癌、宫颈癌、乳癌、膀胱癌、脑肿瘤或血液癌。血液癌包括骨髓瘤、淋巴瘤、白血病等。

本发明中的诊断可以体内或体外进行。

诊断在体外进行时，例如可以利用包括以下步骤的方法进行。

(a)提供从受试者采取试样的步骤；

(b)使(a)的试样与结合了标记物的抗HB-EGF抗体接触的步骤；

(c)检测摄取到细胞内的抗体的步骤。

对采取的试样没有特别限定，例如可以举出从受试者采取的细胞、组织等。另外，从生物体采取的组织或细胞被固定的标本或细胞的培养液等由被检试样得到的二次试样也包含在本发明中。

诊断在体内进行时，例如可以利用包括以下步骤的方法进行。

(a)给与受试者结合了标记物的抗HB-EGF抗体的步骤；

(b)检测摄取到癌细胞内的抗体的步骤。

抗HB-EGF抗体的给与量可以根据标记物的种类、诊断的疾病的种类等由本领域技术人员适当确定。被标记的抗HB-EGF抗体可以通过上述方法进行制剂化。

本发明还提供一种包括以下步骤的诊断药、特别是癌的诊断药的制备方法。

(a)提供抗HB-EGF抗体的步骤；

(b)确认(a)的抗体是否具有内化活性的步骤；

(c)选择具有内化活性的抗体的步骤；

(d)使标记物与(c)中选择的抗体结合的步骤。

是否具有内化活性可以通过上述方法确认。另外，对于抗HB-EGF抗体、标记物也可以使用上述抗HB-EGF抗体、标记物。

本说明书中公开引用的全部专利及参考文献的内容全部作为本说明书的一部分引用于此。

实施例

以下，通过实施例更详细地说明本发明，但本发明并不限定于这些实施例。

免疫

1-1.免疫原的调节

1-1-1.HB-EGF表达载体的制作

为了构筑HB-EGF表达载体，首先如下所述地进行HB-EGF基因的克隆。首先，以人心脏cDNA(human Marathon Ready cDNA，Clontech Laboratories，Inc.)作为模板，使用Pyrobest Taq polymerase(Takara Bio Inc.)，按照以下条件进行RT-PCR，克隆全长HB-EGF基因。

EGF-1：ATGAAGCTGCTGCCGTCGGTG(序列号13)

EGF-2：TCAGTGGGAATTAGTCATGCCC(序列号14)

(94℃/30秒、65℃/30秒、72℃/60秒：35个循环)

然后，将所得PCR产物作为模板，在以下条件下再次进行PCR，得到在5’端、3’端分别添加了SalI、NotI切断序列的全长HB-EGFcDNA片段。

EGF-3：TAAGTCGACCACCATGAAGCTGCTGCCGTCGGTG(序列号15)

EGF-4：TTTGCGGCCGCTCACTTGTCATCGTCGTCCTTGTAGTCGTGGGAATTAGTCATGCCCAAC(序列号16)

(94℃/30秒、65℃/30秒、72℃/60秒：25个循环)

将该片段用SalI、NotI切断，将其插入到同样用SalI、NotI切断的动物细胞用表达载体(pMCN)中，构筑HB-EGF表达载体(pMCN_HB-EGF)。

1-1-2.HB-EGF_Fc融合蛋白质表达载体的制作

作为用于获得HB-EGF中和抗体的免疫原，使用HB-EGF的胞外域和小鼠IgG2a Fc区的融合蛋白质(HB-EGF_Fc)。图1给出免疫用融合蛋白质的结构。

如下所述进行小鼠Fc区和HB-EGF的融合蛋白质的表达载体的构筑。首先以HB-EGF表达载体(pMCN_HB-EGF)作为模板，使用Pyrobest Taq polymerase(Takara Bio Inc.)在以下条件下进行PCR。

EGF-5：AAAGAATTCCACCATGAAGCTGCTGCCGTC(序列号17)

EGF-6：TATCGGTCCGCGAGGTTCGAGGCTCAGCCCATGACACCTC(序列号18)

(94℃/30秒、68℃/30秒、72℃/30秒：25个循环)

然后，用EcoRI、CpoI切断所得PCR产物。将上述DNA片段插入到具有小鼠IgG2a_Fc的动物细胞用表达载体(pMCDN_mIgG2a_Fc)的EcoRI、CpoI之间，构筑HB-EGF-Fc表达载体(pMCDN_HB-EGF-Fc)。

1-1-3.HB-EGF_Fc产生株的建立

在1.5kV，25μF条件下，利用电穿孔(Gene Pulser from Bio-Rad)，将用pvuI进行切断使其直链化的HB-EGF-Fc表达载体(pMCDN_HB-EGF-Fc)15μg导入到悬浮于PBS(-)的DG44细胞(1×10⁷细胞/mL，800μL)。用含有青霉素/链霉素(PS)的生长培养基(CHO-S-SFM II，Invitrogen)稀释到合适的细胞数后，将细胞接种到96孔板上，次日添加G418(geneticin，Invitrogen)使其为500μg/mL。约2周后，在显微镜下选择包含单克隆的孔，使用培养上清各10μL进行SDS-PAGE。用PVDF膜进行印迹后，用山羊抗HB-EGF抗体(R&D：AF-259-NA)、HRP-抗山羊抗体(BioSource：ACI3404)进行蛋白质印记，进行产生HB-EGF-Fc的细胞株的筛选。选择最高产量的株，进行扩大培养。

1-1-4.HB-EGF_Fc蛋白质的纯化

使用Hi Trap Protein G HP 1mL柱(Amersham Biosciences#17-0404-01)，从所得HB-EGF_Fc产生株的培养上清中进行HB-EGF_Fc蛋白质的纯化。以流速为1mL/min使培养上清吸附，用20mL的20mM磷酸缓冲液(pH 7.0)洗涤后，用3.5mL的0.1MGlycine-HCl(pH 2.7)进行洗脱。洗脱部分分别回收到Eppendorf管中各0.5mL，所述Eppendorf管中事先加入了各50μL的1M Tris-HCl(pH 9.0)。测定OD_280nm，收集含有目标蛋白质的部分，加入PBS(-)使总量为2.5mL后，使用PD-10柱(AmershamBiosciences#17-0851-01)用PBS(-)置换缓冲液。使纯化后的蛋白质通过0.22μm过滤器(Millipore#SLGV033RS)，在4℃下保存。

1-2.免疫

初次免疫中由Complete Adjuvant(DIFCO DF263810)制备HB-EGF_Fc蛋白质乳液，二次免疫以后由Incomplete Adjuvant(DIFCO DC263910)制备HB-EGF_Fc蛋白质乳液，将其以50μg/小鼠分别皮下注射给3只小鼠[(MRL/lpr，雄性，4周龄)(balb/c，雌性，6周龄)：均购自日本Charles River ]，由此进行免疫(1mLThermo注射器，针26G)。从初次免疫2周后进行第二次免疫，以后每隔1周进行1次，总计进行4～5次免疫。最后免疫中，将HB-EGF_Fc(50μg)悬浮于100μL PBS中，通过尾静脉注射进行免疫，3天后进行细胞融合。

1-3.杂交瘤的制作

细胞融合如下进行。从小鼠无菌地摘除脾脏，在medium 1(RPMI1640+PS)中研磨制成单一细胞悬浮液。使该悬浮液通过70μm尼龙筛(Falcon)除去脂肪组织等，计算细胞数。按照细胞数比大约为2∶1，将所得B细胞与小鼠骨髓瘤细胞(P3U1细胞)混合，加入1mL 50％PEG(Roche，cat#783 641)，进行细胞融合。将融合后的细胞悬浮于medium 2[RPMI 1640+PS，10％FCS，HAT(Sigma，H0262)，5％BM Condimed H1(Roche#1088947)]中，在适当张数(10张)的96孔板中以200μL/孔分别注入，在37℃下培养。1周后，使用培养上清进行杂交瘤的筛选。需要说明的是，使来自2只Balb/c小鼠的杂交瘤分别作为HA系列和HB系列，使来自Mrl/lpr小鼠(1只)的杂交瘤作为HC系列，进行解析。

抗HB-EGF中和抗体的筛选

2-1.人HB-EGF表达细胞株的制作

2-1-1.HB-EGF_DG44株的制作

表达HB-EGF的DG44细胞株的制作如下进行。首先将1-1-1中构筑的HB-EGF表达载体(pMCN_HB-EGF)15μg用pvuI切断，利用与1-1-3相同的方法通过电穿孔将其导入DG44细胞中。之后，挑选出G418耐性株，用山羊抗HB-EGF抗体(R&D)、FITC标记抗山羊IgG抗体将各细胞染色。用FACS Calibur(Becton，Dickinson and Company)解析在细胞表面表达的HB-EGF，选择表达量高的克隆。

2-1-2.HB-EGF_Ba/F3株的制作

在细胞膜上表达HB-EGF的Ba/F3细胞株的制作如下进行。已知在细胞膜上表达的HB-EGF被蛋白酶加工，在培养液中被切出。因此，首先构筑在蛋白酶切断部位具有突变的proHB-EGF表达载体。

将pMCN-HB-EGF作为模板，使用Pyrobest Taq polymerase(Takara)在以下2个条件下分别进行PCR。

PCR反应1

EGF-3：TAAGTCGACCACCATGAAGCTGCTGCCGTCGGTG(序列号15)

EGF-7：CGATTTTCCACTGTGCTGCTCAGCCCATGACACCTCTC(序列号19)

(94℃/30秒、68℃/30秒、72℃/30秒：20个循环)

PCR反应2

EGF-8：TGGGCTGAGCAGCACAGTGGAAAATCGCTTATATACCTA(序列号20)

EGF-4：TTTGCGGCCGCTCACTTGTCATCGTCGTCCTTGTAGTCGTGGGAATTAGTCATGCCCAAC(序列号16)

(94℃/30秒、68℃/30秒、72℃/30秒：20个循环)

然后，将PCR反应1、2中得到的2个DNA片段混合，使用Pyrobest Taq polymerase(Takara)，进行重组反应(94℃/30秒、72℃/60秒：5个循环)后，再以1μL上述反应液作为模板，在以下条件下进行。

EGF-3：TAAGTCGACCACCATGAAGCTGCTGCCGTCGGTG(序列号15)

EGF-4：TTTGCGGCCGCTCACTTGTCATCGTCGTCCTTGTAGTCGTGGGAATTAGTCATGCCCAAC(序列号16)

(94℃/30秒、68℃/30秒、72℃/60秒：22个循环)

将所得PCR产物用SalI、NotI切断后，将其插入到同样用SalI、NotI切断的动物细胞用表达载体(pMCN)中，构筑proHB-EGF表达载体(pMCN-MHB-EGF)。

然后，如下所述进行表达proHB-EGF的Ba/F3细胞株的制作。首先将构筑的proHB-EGF表达载体(pMCN-MHB-EGF)15μg用pvuI切断，在0.33kV、950μF的条件下利用电穿孔(GenePulser；Bio-Rad)，将其导入到悬浮于PBS(-)的Ba/F3细胞(1×10⁷细胞/mL，800μL)中。将上述细胞用含有1ng/mL IL-3和500μg/mLG418的培养基(RPMI 1640，10％FCS，PS)在96孔板中进行培养，2周后，挑选出G418耐性株。将各细胞用山羊抗HB-EGF抗体(R&D)、FITC标记抗小鼠IgG抗体(Beckman Coulter：PN IM0819)染色，通过FACS  (Becton，Dickinson and Company)选择细胞表面HB-EGF表达量高的克隆。

2-2.HB-EGF表达SKOV-3细胞的制作

如下所述进行表达HB-EGF的SKOV-3细胞株的制作。将作为卵巢癌细胞株的SKOV-3(购自ATTC)用含有10％FCS、青霉素/链霉素(P/S)的生长培养基(McCoy’s 5A medium，Invitrogen)培养。

将1-1-1中构筑的HB-EGF表达载体(pMCN HB-EGF)15μg用pvuI消化。之后，在1.5kV、25μF的条件下，利用电穿孔(Gene Pulser；Bio-Rad)将其导入到悬浮于PBS(-)的SKOV-3细胞(1×10⁷细胞/mL，800μL)中。用上述生长培养基稀释至合适的细胞数后，接种于96孔板。次日添加G418(geneticin，Invitrogen)使其为500μg/mL。约2周后，选择G418耐性单克隆，利用蛋白质印记筛选表达HB-EGF的细胞株。选择产量最高的株，用于以后的实验。

2-3.HB-EGF依赖性增殖的EGFR_Ba/F3细胞株的制作

2-3-1.pCV-hEGFR/G-CSFR的构筑

为了评价本发明的抗体的活性，构筑表达包含人EGFR的胞外域和小鼠G-CSFR胞内域的嵌合受体(hEGFR/mG-CSFR)的载体。图2a模式化地给出HB-EGF与表达上述嵌合受体的细胞结合时对该细胞的影响。

编码人上皮生长因子受体(EGFR)的胞外域的基因的克隆，以人肝脏cDNA(Marathon Ready cDNA，Clontech)作为模板，使用下述引物组进行PCR。人EGFR的碱基序列(MN_005228)及氨基酸序列(NP_005219)分别示于序列号21及序列号22。

EGFR-1：ATGCGACCCTCCGGGACGGC(序列号23)

EGFR-2：CAGTGGCGATGGACGGGATCT(序列号24)

(94℃/30秒、65℃/30秒、72℃/2分钟：35个循环)

从琼脂糖凝胶中切出扩增后的cDNA(约2Kb)，将其插入pCR-TOPO载体(Invitrogen)中。解析插入到该质粒中的片段的碱基序列，确认所得EGFR基因具有正确的序列。然后，以上述得到的质粒作为模板，使用以下引物组进行PCR。

EGFR-5：TTGCGGCCGCCACCATGCGACCCTCCGGGACGGC(序列号25)

EGFR-6：ACCAGATCTCCAGGAAAATGTTTAAGTCAGATGGATCGGACGGGATCTTAGGCCCATTCGT(序列号26)

(94℃/30秒、68℃/30秒、72℃/2分钟：25个循环)

通过上述操作，得到具有5’NotI位点及在3’BglII位点的、编码EGFR胞外域的基因片段。将该片段用NotI-BglII切断，插入到pCV_mG-CSFR的NotI-BamHI之间。

表达质粒载体pCV如下构筑，即，将pCOS1(国际专利公开号WO 98/13388)的poly(A)附加信号置换为来自人G-CSF的poly(A)附加信号。将pEF-BOS(Mizushima S.et al.，Nuc.Acids Res.18，5322(1990))用EcoRI及XbaI切断，得到来自人G-CSF的poly(A)附加信号片段。将该片段在EcoRI/XbaI位点插入到pBacPAK8(Clontech)。将其用EcoRI切断后，使两端平滑化，用BamHI消化。由此得到包含在5’末端添加了BamHI位点、且使3’末端平滑化的来自人G-CSF的poly(A)附加信号的片段。在BamHI/EcoRV位点将该片段用pCOS1的poly(A)附加信号部分置换，将其作为pCV。

pCV_mG-CSFR包含pCV上作为小鼠G-CSF受体胞内域的第623号的天冬酰胺残基到C末端。小鼠G-CSF受体的碱基序列(M58288)示于序列号27，氨基酸序列(AAA37673)示于序列号28。但是，由于制作了pCV_mG-CSFR的插入序列中的N末端区域中、编码cDNA的序列中作为限制酶位点的BamHI位点，所以序列号28中的第632号甘氨酸残基被谷氨酸残基置换。

确认插入到pCV_mG-CSFR中的基因片段的碱基序列，结束表达包含人EGFR的胞外域和小鼠G-CSFR的胞内域的嵌合受体(hEGFR/mG-CSFR)的载体(pCV_hEGFR/mG-CSFR)的构筑。

该表达载体表达的蛋白质、即人EGFR/小鼠G-CSFR嵌合受体的碱基序列及氨基酸序列分别示于序列号29及序列号30。

2-3-2.HB-EGF依赖性细胞株的制作

在0.33kV、950μF的条件下，利用电穿孔(Gene Pulser：Bio-Rad)，将用pvuI切断使其直链化的嵌合受体(hEGFR/mG-CSFR)表达载体(pCV_hEGFR/mG-CSFR)15μg导入到Ba/F3细胞中。将上述细胞在含有10ng/mL HB-EGF、500μg/mL G418的培养基(RPMI1640，10％FCS，PS)中培养2周，挑选出现的菌落。

然后，通过以下实验确认所得细胞株HB-EGF浓度依赖性地增殖。在0～100ng/mL的HB-EGF(R&D，259-HE)的存在下，将EGFR_Ba/F3细胞以1×10³细胞/well接种至96孔板上，培养3天。之后，使用WST-8试剂(cell counting Kit-8，同仁)按照附加的说明书计算细胞数。

结果确认了制作的细胞株(EGFR Ba/F3)的HB-EGF浓度依赖性地增殖被促进(图2b)。

2-4.杂交瘤的筛选

2-4-1.HB-EGF结合抗体的筛选(一次筛选)

为了获得抗HB-EGF中和抗体，首先进行与HB-EGF结合的抗体的筛选。结合抗体的筛选使用ELISA和FACS。

2-4-1-1.ELISA

在以1μg/mL涂布了HB-EGF蛋白质(R&D，259-HE)的ELISA用板(NUNC)上使杂交瘤的培养上清反应，培养1小时。之后，用碱性磷酸酶(AP)标记抗小鼠IgG(ZYMED：#62-6622)反应1小时，之后加入1mg/mL的基质(SIGMA：S0942-50TAB)使其显色。使用酶标仪(BioRad公司)测定OD₄₀₅，选择ELISA阳性孔。

2-4-1-2.FACS

在HB-EGF_Ba/F3细胞(约1×10⁵细胞)中加入杂交瘤的培养上清，在4℃下培养1小时。之后，加入FITC标记抗小鼠IgG抗体(Beckman Coulter：PN IM0819)，在4℃下培养30分钟。之后，通过FACS(Becton，Dickinson)解析各杂交瘤培养上清中与细胞表面HB-EGF的结合活性。

2-4-1-3.有限稀释

为了将根据ELISA或FACS解析具有与HB-EGF的结合活性的克隆进行单克隆化，进行有限稀释(LD)。测定阳性孔的细胞数，将其接种到96孔板上，使其为3个细胞/孔。培养大约10天，对于出现菌落的孔的培养上清，通过ELISA或FACS再次解析结合活性。通过上述一系列的操作，在HA系列中得到5种具有HB-EGF结合活性的单克隆，在HB系列中得到4种具有HB-EGF结合活性的单克隆，及在HC系列中得到5种具有HB-EGF结合活性的单克隆。

2-4-1-4.亚型的确定

抗体亚型的确定使用IsoStrip(Roche#1,493,027)进行。亚型的确定使用利用PBS(-)稀释10倍得到的杂交瘤培养上清。

[表1]

被分离的抗体的特征

2-4-2.抗体的纯化

使用HiTrap Protein G HP 1mL柱(Amersham Biosciences#17-0404-01)从所得单克隆杂交瘤的培养上清80mL中纯化抗体。将杂交瘤上清以流速1mL/min吸附，用20mL的20mM磷酸缓冲液(pH 7.0)清洗后，用3.5mL的0.1M glycine-HCl(pH 2.7)洗脱。将洗脱部分各0.5mL回收到Eppendorf管中，所述Eppendorf管事先加入了1M Tris-HCL(pH 9.0)各50μL。测定OD_280nm，收集含有抗体的部分，加入PBS(-)使总量为2.5mL，之后使用PD-10柱(Amersham Biosciences#17-0851-01)，将缓冲液置换为PBS(-)。使纯化后的抗体通过0.22μm的过滤器(Millipore#SLGV033RS)，以下对各纯化抗体的性质详细地进行研究。

2-4-3.EGFR_Ba/F3细胞的增殖中和活性的解析(二次筛选)

对各纯化抗体对于EGFR_Ba/F3细胞的HB-EGF依赖性增殖的中和活性进行解析。在HB-EGF(80ng/mL)存在下，将EGFR_Ba/F3细胞以2×10⁴细胞/孔接种至96孔板，以0～200ng/mL添加各纯化抗体。培养3天后，使用WST-8(cell counting Kit-8)测定细胞数。

结果可知，HC-15具有强的中和活性(图3)。

HB-EGF中和抗体(HA-20、HB-20、HC-15)的性质解析

3-1.HA-20、HB-20、HC-15的可变区的克隆和氨基酸序列的解析

使用Trizol(#15596-018，Life Technologies)从约5×10⁶个杂交瘤中纯化总RNA。使用SMART RACE cDNA Amplification Kit(Clontech，#PT3269-1)，按照附带的手册从1μg所得的总RNA中合成全长cDNA。对于各抗体，以所得cDNA作为模板，使用Advantage 2PCR Enzyme System(Clontech#PT3281-1)，按照以下条件进行PCR，使编码重链(VH)及轻链(VL)的可变区的基因扩增。

轻链可变区的克隆用引物

UPM-k(VL-k)

UPM：试剂盒中附带

VL-k：GCT CAC TGG ATG GTG GGA AGA TG(序列号31)

重链可变区的克隆用引物

HA-20：UPM-VH-G1

HB-20，HC-15：UPM -VH-2a

UPM：试剂盒中附带

VH-G1：GGG CCA GTG GAT AGA CAG ATG(序列号32)

VH-2a：CAG GGG CCA GTG GAT AGA CCG ATG(序列号33)

94℃/5秒、72℃/2分钟、5个循环

94℃/5秒、70℃/10秒、72℃/2分钟、5个循环

94℃/5秒、68℃/10秒、72℃/2分钟、27个循环

将通过上述操作扩增的基因片段TA-克隆至pCRII-TOPO(Invitrogen TOPO TA-cloning Kit，#45-0640)，之后确认各插入物的碱基序列。被确认的可变区序列示于图4。

3-2.对活性型HB-EGF的结合活性的解析

为了比较所得3种抗体(HA-20、HB-20、HC-15)对活性型HB-EGF蛋白质的结合活性，进行了以下实验。在以1μg/mL涂布了HB-EGF蛋白质(R&D，259-HE)的ELISA用板(NUNC)上，使HA-20、HB-20、HC-15抗体在各浓度下反应。之后，用碱性磷酸酶(AP)标记抗小鼠IgG(Zymed，#62-6622)反应1小时，然后加入1mg/mL的基质(Sigma：S0942-50TAB)使其显色。之后，用酶标仪测定OD405，以所得各抗体的结合曲线为基准，计算显示50％结合的抗体浓度(ED₅₀)。结果可知，对于对活性型HB-EGF的结合活性，ED₅₀值为0.2～1.4nM，均具有强的结合活性(图5)。

[表2]

抗体HA-20、HB-20及HC-15对HB-EGF的结合的ED₅₀值

3-3.对proHB-EGF的结合活性的解析

然后，解析所得3种抗体对proHB-EGF的结合活性。将已知内在地表达HB-EGF的卵巢癌细胞株RMG1细胞(购自Japan HealthSciences Foundation)在含有10％FCS的生长培养基(Ham’s F 12medium，Invitrogen)中培养。在4℃下使各抗体(10μg/mL)与下述强制性表达HB-EGF的细胞反应1小时，所述细胞为Ba/F3细胞(HB-EGF_Ba/F3)、HB-EGF表达DG44细胞(HB-EGF_DG44)、SKOV-3细胞(HB-EGF_SKOV-3)、以及内在地表达HB-EGF的RMG1细胞，然后用FITC标记抗小鼠IgG抗体(Beckman Coulter：PN IM0819)进行染色。之后，用FACS(Becton，Dickinson andCompany)解析各抗体对细胞表面HB-EGF的结合。

图6表示通过FACS解析比较下述结合活性得到的直方图，所述结合活性是抗体HA-20、HB-20及HC-15对在Ba/F3、DG44及SKOV-3细胞上强制表达的proHB-EGF、及在RMG1细胞中内在地表达的proHB-EGF的结合活性。将在不存在一次抗体下的染色图案(control)用灰色波形表示，将各抗体存在下的染色图案用实线表示。横轴表示染色强度，纵轴表示细胞数。如图6所示，HB-20、HC-15识别在细胞膜上强制表达的HB-EGF、及通过卵巢癌株内在地表达的细胞膜上的HB-EGF，相对于此，HA-20仅显示出完全不结合或非常弱的结合。上述情况表明，HA-20是与活性型HB-EGF牢固地结合、但不识别proHB-EGF的抗体。

3-4.中和活性的解析

3-4-1.EGFR/HB-EGF结合抑制作用的固相解析

3-4-1-1.EGFR-Fc蛋白质的制备

为了构筑能够在固相条件下确认HB-EGF与其受体即EGFR的结合的ELISA体系，首先制备包含EGFR的胞外域和人IgG1的FC区的融合蛋白质(EGFR-Fc)作为受体蛋白质。图7模式化地给出HB-EGF抗体在固相上抑制HB-EGF和EGFR的结合的状态。

首先构筑EGFR-Fc表达载体。将实施例2-3-1中构筑的pCV_hEGFR/mG-CSFR作为模板，使用以下引物进行PCR。

EGFR-7：GTTAAGCTTCCACCATGCGACCCTCCGGGAC(序列号34)

EGFR-8：GTTGGTGACCGACGGGATCTTAGGCCCATTCGTTG(序列号35)

(94℃/30秒、72℃/30秒：25个循环)

将扩增后的编码EGFR胞外域的基因片段用BstEII和HindIII切断，将其插入pMCDN2-Fc的BstEII-HindIII之间。确认被插入的基因片段的碱基序列，结束构筑表达包含人EGFR的胞外域和人IgG1的FC区的融合蛋白质(EGFR-Fc)的载体(pMCDN2_EGFR-Fc)。该表达载体表达的蛋白质、即EGFR-Fc的碱基序列及氨基酸序列分别示于序列号36及序列号37。

然后，如下进行EGFR-Fc蛋白质产生细胞株的构筑。首先，将15μg EGFR-Fc表达载体(pMCDN2_EGFR-Fc)用pvuI切断，通过电穿孔将其导入到DG44细胞中。之后，利用蛋白质印记解析G418耐性株的培养上清中产生EGFR-Fc蛋白质。即，通过SDS-PAGE分离10μL各培养上清，将其转印到PVDF膜上，用HRP标记抗人IgG抗体(Amersham，NA933V)检测靶蛋白质。选择产量最高的克隆，将其扩大培养，回收培养上清。

如下进行EGFR-Fc蛋白质的纯化。将所得EGFR-Fc产生株的培养上清以流速1mL/min吸附于HiTrap Protein G HP 1mL柱(Amersham Biosciences#17-0404-01)。将其用20mL的20mM磷酸缓冲液(pH 7.0)清洗后，用3.5mL的0.1M glycine-HCl(pH2.7)洗脱。利用SDS-PAGE将回收的成分中的各10μL分离，通过蛋白质印记以及利用考马斯亮蓝(CBB)染色，确认含有靶蛋白质的成分，使用PD-10柱(Amersham Biosciences#17-0851-01)将缓冲液置换为PBS(-)。将纯化后的蛋白质通过0.22μm过滤器(Millipore#SLGV033RS)，在4℃下保存。

3-4-1-2.利用ELISA的HB-EGF和EGFR的结合解析

在涂布了抗人IgG抗体的ELISA板上使纯化后的EGFR-Fc以0.5μg/mL反应1小时。使0～250ng/mL HB-EGF(R&D，259-HE)与其反应1小时，之后，利用生物素标记抗HB-EGF抗体(R&D，BAF259)和AP标记链霉抗生物素蛋白(Zymed，#43-8322)检测与EGFR-Fc结合的HB-EGF蛋白质。图8给出利用ELISA的EGFR和HB-EGF结合方式的解析模型。结果可知，通过上述固相体系，可以以约4ng/mL的浓度检测出与EGFR结合的HB-EGF(图9)。

3-4-1-3.利用抗体的HB-EGF和EGFR的结合抑制活性的解析

对于2-4-2中所得抗体的、HB-EGF和EGFR的结合抑制活性，使用上述固相评价体系进行解析。在固相化有EGFR-Fc的ELISA板上添加HB-EGF(50ng/mL)和各抗体，使其在室温下反应1小时。将板用TBS-T清洗，通过上述方法检测与EGFR结合的HB-EGF(图10)。

结果确认了全部抗体的浓度依赖性的结合抑制活性，特别是对于HA-20、HB-20、HC-15来说确认了强的结合抑制活性。

3-4-2.EGFR_Ba/F3细胞的增殖抑制活性

对于HA-20、HB-20、HC-15，对EGFR_Ba/F3细胞的HB-EGF依赖性增殖的中和活性进行比较。与上述同样地在HB-EGF(80ng/mL)的存在下，以2×10⁴细胞/孔，将EGFR_Ba/F3细胞接种至96孔板，添加各纯化抗体。培养3天后，使用WST-8(cellcounting Kit-8)测定细胞数，制作增殖曲线。以上述结果为基础，计算最大抑制效果的50％的抗体浓度(EC₅₀值)。

结果EGFR_Ba/F3细胞的增殖抑制效果最强的是HC-15(EC₅₀＝3.8nM)，其次为HA-20(EC₅₀＝32.6nM)、HB-20(EC₅₀＝40.3nM)(图11)。

[表3]

抗体HA-20、HB-20及HC-15对EGFR_Ba/F3细胞的增殖抑制效果的ED₅₀值

3-4-3.对RMG-1细胞的增殖抑制活性

对RMG-1细胞的中和活性的解析如下所述。在96孔板上将RMG-1细胞以6×10³细胞/孔接种至含有8％或2％FCS的Ham’sF12medium中，向其中添加各抗体。培养1周后，使用WST-8试剂测定细胞数。

结果HA-20抗体浓度依赖性地抑制RMG-1细胞的增殖(图12)。确认了上述增殖抑制活性在FCS浓度为2％时特别明显。

3-5.利用抗体的内化活性的细胞毒性的解析

3-5-1.利用内化活性的细胞凋亡诱导评价体系

通过抗体内化的细胞凋亡诱导活性的评价使用肥皂草毒蛋白(毒素)标记抗小鼠IgG抗体(Mab-ZAP，Advanced TargetingSystems公司)进行。首先，将一次抗体与Mab-ZAP混合，在室温下反应15分钟，由此间接地形成毒素标记抗体。将其添加到靶细胞中，使添加的抗体在细胞内内化时，Mab-ZAP也与一次抗体一起被参入到细胞内，因此在细胞内通过释放的肥皂草毒蛋白诱导细胞凋亡。图13给出其模式图。

3-5-2.在HB-EGF高表达细胞株中利用内化的细胞凋亡诱导

对使用HC-15、利用其内化活性是否可以诱导细胞凋亡进行解析。将SKOV-3细胞及强制表达HB-EGF的SKOV3细胞(HB-EGF_SKOV-3)以2×10³细胞/孔接种至96孔板。培养一夜后，使Mab-ZAP以100ng/孔与所得抗HB-EGF抗体(100ng/孔)反应，将其添加到细胞中。添加抗体4天后，利用WST-8测定活细胞数。结果仅弱表达HB-EGF的亲株的SKOV-3细胞中，任意抗体中均没有发现细胞凋亡诱导活性，但是在强制表达HB-EGF的SKOV-3细胞中，在Mab-ZAP的存在下在各抗体中均可以确认到细胞凋亡诱导活性。特别是与proHB-EGF结合的HB-20、HC-15中确认到强的细胞凋亡诱导活性(图14)。

3-5-3.在卵巢癌株中利用内化的细胞凋亡诱导

3-5-3-1.对卵巢癌株(ES-2)的细胞毒性的解析

3-5-3-1-1.各抗体对ES-2的结合活性

接下来，解析内因性地表达HB-EGF的卵巢癌细胞株(ES-2)中的细胞凋亡诱导活性。作为卵巢癌细胞株的ES-2细胞(购自ATCC)在含有10％FCS、青霉素/链霉素(P/S)的生长培养基(McCoy’s 5A medium，Invitrogen)中进行培养。

首先，利用FACS解析所得各抗体是否与ES-2细胞的细胞表面结合。用1mM EDTA剥离细胞，在FACS缓冲液(含有2％FCS、0.05％NaN₃的PBS)中使细胞与各抗体(10μg/mL)在4℃下反应1小时，再在4℃下使FITC标记抗小鼠IgG抗体(Beckman Coulter：PN IM0819)反应30分钟对其进行染色。之后，利用FACS(Becton，Dickinson and Company)解析各抗体与在细胞表面表达的HB-EGF的结合。

图15表示通过FACS解析比较抗体HA-20、HB-20及HC-15与ES-2细胞的结合活性的直方图。一次抗体不存在下的染色图案(对照)用灰色波形表示，各抗体存在下的染色图案用实线表示。横轴表示染色强度，纵轴表示细胞数。如图15所示，特别是确认了HC-15与在ES-2细胞的细胞膜上表达的HB-EGF结合。

3-5-3-1-2.对ES-2的细胞凋亡诱导活性

接下来，对利用各抗体对ES-2细胞的内化活性的细胞毒性进行解析。将ES-2细胞以2×10³细胞/孔接种至96孔板。培养一夜后，使各抗体(100ng/孔)与Mab-ZAP(100ng/孔)反应，将其添加到细胞中。3天后，利用WST-8测定活细胞数。结果如图16所示，在Mab-ZAP的存在下，与HB-EGF的结合活性最强的HC-15中确认到细胞凋亡诱导活性。

3-5-3-2.对卵巢癌株(RMG-1、MCAS)的增殖抑制能力的解析

3-5-3-2-1.HC-15与MCAS、RMG-1的结合活性

接下来，使用其他卵巢癌细胞株(RMG-1、MCAS)，研究抗体的增殖抑制能力。将MCAS细胞(购自JCRB)在含有20％FCS的生长培养基(Eagle’s Minimal Essential Medium，Invitrogen)中进行培养。

为了研究MCAS、RMG-1是否在细胞表面表达HB-EGF且表达为何种程度，使用HC-15抗体进行FACS解析。用1mM EDTA剥离细胞，在FACS缓冲液(含有2％FCS、0.05％NaN₃的PBS)中使细胞与HC-15抗体(10μg/mL)在4℃下反应1小时，再在4℃下使FITC标记抗小鼠IgG抗体(Beckman Coulter：PN IM0819)反应30分钟使其染色。之后，利用FACS(Becton，Dickinson andCompany)解析各抗体与在细胞表面上表达的HB-EGF的结合。

图17表示通过FACS解析比较HC-15抗体与RMG-1及MCAS细胞的结合活性的直方图。确认到RMG-1细胞、MCAS细胞在细胞表面上均表达HB-EGF。

3-5-3-2-2.利用软琼脂菌落形成分析的抗体对RMG-1、MCAS的增殖抑制活性的解析

接下来，利用软琼脂菌落形成分析，解析抗体对RMG-1、MCAS细胞的锚定非依赖性的增殖的活性。软琼脂菌落形成分析如下所述进行。

在96孔板的每个孔中以100μL/孔分别添加含有0.6％琼脂(3：1NuSieve，Cambrex)的MEM培养基，制备琼脂基底。接下来，使细胞以8000个细胞/孔悬浮于含有0.3％琼脂的培养基中。此时在琼脂中将抗体、Mab-ZAP等各标准品与细胞一起混合，将其以100μL/孔滴入琼脂基底上。在37℃下培养3周到1个月后，用1％碘硝基氯化四氮唑蓝(Sigma，18377)对出现的菌落进行染色，在显微镜下观察菌落。

首先，解析抗体HA-20、HC-15单独对RMG-1细胞的菌落形成的作用。将HA-20或HC-15抗体混合到RMG-1细胞中，使其为50μg/mL，约3周后，观察在琼脂中形成的菌落。结果RMG-1细胞的菌落形成在HC-15抗体添加组中与非添加组相比被抑制(图18)。由此可知，即使HC-15抗体的单独的中和活性也能够抑制RMG-1细胞的锚定非依赖性的菌落形成。

接下来，解析HA-20和HC-15抗体的利用毒素的菌落形成抑制活性。在琼脂中，将Mab-ZAP(1μg/mL)与RMG-1细胞或MCAS细胞、及HA-20或HC-15抗体(10μg/mL)混合，培养约3周到1个月。然后，将形成的菌落染色后，在显微镜下观察。

结果确认了通过同时添加RMG-1细胞(图19)、MCAS细胞(图20)及HC-15抗体、Mab-ZAP，抑制菌落形成。由此确认了HC-15抗体不仅利用其中和活性还利用内化活性，能够抑制卵巢癌细胞的菌落形成能力。

3-5-4.利用对血液癌株的内化的细胞凋亡诱导

3-5-4-1.血液癌株中的HB-EGF的表达解析

接下来，解析HC-15的利用内化活性的抗肿瘤效果是否在血液癌中也存在。将RPMI8226(多发性骨髓瘤，购自ATCC)、Jurkat(急性T细胞白血病，购自ATCC)、HL-60(急性骨髓性白血病，购自JCRB)、THP-1(急性单核细胞性血白病，购自JCRB)、U937(单核细胞性血白病，购自JCRB)在含有10％FCS的RPMI1640(Invitrogen)中培养。

为了研究上述细胞中的HB-EGF的表达，进行FACS解析。使HC-15抗体(10μg/mL)与各细胞株(2×10⁵个细胞)在冰上反应60分钟，之后用FITC标记抗小鼠IgG抗体(Beckman Coulter：PNIM0819)染色。之后，利用FACS(Becton，Dickinson and Company)解析各抗体与在细胞表面上表达的HB-EGF的结合。

图21表示通过FACS解析比较各种血液癌细胞株中的HB-EGF的表达的直方图。确认了THP-1、U937中HB-EGF显示出特别强的表达。另一方面，确认了Jurkat、RPMI8226中HB-EGF基本不表达。

3-5-4-2.对血液癌株的细胞毒性的解析

将各血液癌细胞株以1～2×10⁴细胞/孔接种至96孔板。之后，使Mab-ZAP以100ng/孔与各抗HB-EGF抗体(100ng/孔)反应，将其加入到细胞中。添加抗体5天后，利用WST-8测定活细胞数。结果通过在U937细胞和THP-1细胞中同时添加HC-15抗体和Mab-ZAP可以观察到增殖抑制(图22)。根据上述结果，HC-15抗体的内化活性作为抗肿瘤剂对几种血液癌有用。

利用肥皂草毒蛋白标记抗体的细胞凋亡诱导的解析

4-1.抗体的肥皂草毒蛋白标记

接下来，使用直接用毒素标记的HA-20抗体(HA-SAP)、HC-15抗体(HC-SAP)，进行利用抗体的内化活性的细胞毒性的解析。

对纯化后的HA-20抗体及HC-15抗体的肥皂草毒蛋白标记委托给Advanced Targeting System公司。由此，得到对HA-20平均标记了3分子的肥皂草毒蛋白、对HC-15平均标记了2.4分子肥皂草毒蛋白的抗体(分别记作HA-SAP and HC-SAP)。使用上述抗体，解析对癌细胞的细胞凋亡诱导活性。

4-2.利用肥皂草毒蛋白标记抗体的细胞毒性的解析

4-2-1.利用肥皂草毒蛋白标记抗体的固形癌细胞株的细胞毒性的解析

解析中使用的细胞如下所述。

ES-2、MCAS(卵巢癌)、Capan-2(胰腺癌，购自Japan HealthSciences Foundation)、BxPC-3、22Rv1(前列腺癌，购自ATCC)、HUVEC(人血管内皮细胞，购自Takara Bio)

上述细胞分别在供应商提供的指南所指示的培养条件下进行培养。

细胞毒性的解析如下进行。将各细胞以1～5×10³细胞/孔接种至96孔板，培养一夜。次日，添加HA-SAP、HC-SAP、作为对照抗体的IgG-SAP(肥皂草毒蛋白标记小鼠IgG、Advanced TargetingSystem公司)，使其为约100nM～1fM左右，培养3～5天。之后，利用WST-8测定活细胞数。

结果如图23a所示，作为卵巢癌细胞株的ES-2和MCAS细胞通过HC-SAP强力地诱导细胞凋亡。HC-SAP的活性的强度在ES-2细胞中为EC₅₀＝0.09nM，在MCAS细胞中为EC₅₀＝0.86nM。另一方面，对作为人正常血管内皮细胞的HUVEC基本不显示影响。

4-2-2.利用肥皂草毒蛋白标记抗体的血液癌细胞株的细胞毒性的解析

将RPMI8226(多发性骨髓瘤，购自ATCC)、HL-60(急性骨髓性白血病，购自JCRB)、SKM-1、THP-1(急性单核细胞性血白病，购自JCRB)、U937(单核细胞性血白病，购自JCRB)在含有10％FCS的RPMI1640(Invitrogen)中培养。

HA-SAP、HC-SAP对上述血液癌细胞株的细胞毒性如下所述进行。将各细胞以1～5×10³细胞/孔接种至96孔板，之后添加HA-SAP、HC-SAP使其为约100nM～1fM左右，培养3～5天。之后，利用WST-8测定活细胞数。

上述结果如图23b所示，U937、SKM-1、THP-1细胞通过HC-SAP显著诱导细胞凋亡。HC-SAP的活性强度在U937细胞中为EC₅₀＝0.33nM，在SKM-1细胞中为EC₅₀＝0.02nM，在THP-1细胞中为EC₅₀＝0.01nM。上述结果表明，用毒素等标记的、以HB-EGF为靶的抗体对血液癌也有效。

利用抗HB-EGF抗体的ADCC活性的解析

10-1.各抗体对膜表达HB-EGF的结合活性的解析

通过FACS解析比较目前得到的抗体对膜表达HB-EGF的结合活性。使各抗体(10μg/mL)与强制表达HB-EGF的细胞即Ba/F3细胞(HB-EGF_Ba/F3)在4℃下反应1小时，再用FITC标记抗小鼠IgG抗体(Beckman Coulter：PN IM0819)进行染色。之后，利用FACS(Becton，Dickinson and Company)解析各抗体与细胞表面的HB-EGF的结合。

图24a为表示通过FACS解析测定的各抗体与HB-EGF_Ba/F3的结合活性的图。纵轴的G-mean值(GEO-mean)为将由抗体诱导的细胞染色强度进行数值化得到的值。上述解析结果确认了与细胞膜上的HB-EGF的结合活性最强的抗体为HC-15，HE-39、HE-48、HE-58也具有强的结合活性。

10-2.抗HB-EGF抗体的抗体依赖性细胞介导细胞毒性(ADCC)活性的解析

针对对HB-EGF_Ba/F3显示出结合活性的抗体(HB-10、HB-20、HB-22、HC-15、HE-39、HE-48、HE-58)，利用铬释放法进行对HB-EGF_Ba/F3的ADCC的解析。

将铬-51添加到于96孔板繁殖的HB-EGF_Ba/F3细胞中，继续培养几小时。将培养液除去，用培养液清洗细胞后，添加新的培养液。然后，添加抗体，使其最终浓度为10μg/mL，进而，在各孔中添加与靶细胞相比为约5倍量或10倍量的效应细胞(在NK-92(ATCC，CRL-2407)中使小鼠Fc-γ受体3(NM_010188)强制表达的重组细胞)，将板在5％二氧化碳培养箱中、于37℃静置4小时。静置后，将板离心，从各孔中回收一定量的上清，使用γ计数器Wallac 1480测定放射活性，求出特异性铬释放率(％)。结果如图24b的上图所示，用于试验的抗HB-EGF单克隆抗体中特别是HB-22、HC-15、HE-39、HE-48、HE-58诱导非常强的ADCC活性。该结果显示对以HB-EGF为靶的肿瘤的抗体治疗非常有用。

需要说明的是，特异性铬释放率根据以下式子算出。

特异性铬释放率(％)＝(A-C)×100/(B-C)

此处，A为各孔中的放射活性，B为用终浓度1％Nonidet P-40进行细胞溶解释放到培养基中的放射活性平均值，C为仅添加培养基的情况下的放射活性平均值。

10-3.抗HB-EGF抗体的补体依赖性细胞毒性(CDC)的测定

通过离心分离(1000rpm，5分钟，4℃)回收HB-EGF_Ba/F3细胞，将细胞颗粒悬浮于约200μL的培养基及3.7MBq的铬-51(Code No.CJS4、Amersham Pharmacia Biotech)中，在5％二氧化碳培养箱中、于37℃培养1小时。将上述细胞用培养基清洗3次，之后用培养基配制成细胞密度为1×10⁴/mL，在96孔平底板中各添加100μL。

然后，将抗HB-EGF单克隆抗体(HB-10、HB-20、HB-22、HC-15、HE-39、HE-48、HE-58)及对照小鼠IgG2a抗体(Cat.No.553453，BD Biosciences Pharmingen)用培养基稀释，之后在各孔中各添加50μL。将抗体配制成最终浓度为10μg/mL。然后，将幼家兔补体(Cat.No.CL3441，Cedarlane)添加到该板的各孔中，使其浓度为3％或10％，在5％二氧化碳培养箱中、于37℃静置1.5小时。静置后，将该板离心(1000rpm，5分钟，4℃)，从各孔中回收上清各100μL，使用γ计数器(1480WIZARD 3”、Wallace)测定回收的上清的放射活性。

结果如图24b下方的图所示，用于试验的抗HB-EGF单克隆抗体中HB-20、HB-22、HC-15、HE-48确认了CDC活性，另一方面，作为对照使用的小鼠IgG2a抗体在相同浓度下不显示CDC活性。

HB-EGF中和抗体(HC15及HE39)的人嵌合抗体的制作及其 性质

11-1.HC15及HE39的人嵌合抗体的制作

HC15抗体的人嵌合抗体(chHC15)如下制作。将结合了编码小鼠HC15抗体的H链可变区(序列号8)的多核苷酸(序列号7)与编码人IgG1的H链恒定区(序列号38)的多核苷酸(序列号39)的基因片段插入动物细胞表达载体中。另外，结合了编码小鼠HC15抗体的L链可变区(序列号10)的多核苷酸(序列号9)与编码人IgG1的L链恒定区(序列号40)的多核苷酸(序列号41)的基因片段插入动物细胞表达载体中。

HE39抗体的人嵌合抗体(chHE39)如下进行制作。WO2008/047925中记载了HE39抗体的获得、特性及氨基酸序列。将结合了编码小鼠HE39抗体的H链可变区(序列号42)的多核苷酸(序列号43)与编码人IgG1的H链恒定区(序列号38)的多核苷酸(序列号39)的基因片段插入动物细胞表达载体中。另外，将结合了编码小鼠HE39抗体的L链可变区(序列号44)的多核苷酸(序列号45)与编码人IgG1的L链恒定区(序列号40)的多核苷酸(序列号41)的基因片段插入动物细胞表达载体中。所得表达载体的碱基序列通过本领域技术人员公知的方法确定。

11-2.chHC15及chHE39的表达和纯化

抗体的表达和纯化利用以下方法进行。将用pvuI切断的各抗体表达载体15μg通过电穿孔导入DG44细胞株(Invitrogen)中。将转化后的DG44细胞接种至96孔板。之后，将该细胞在含有500μg/mL的G418(Invitrogen)的CHO-S-SFM-II(Invitrogen)培养基中培养。对G418显示出耐性的孔的培养上清中的抗体产生通过ELISA检测。将确认了产生抗体的克隆进一步扩大，将回收的该克隆的培养上清用于抗体纯化。对于通过离心分离(约2,000g，5分钟，室温)除去了其中的细胞的培养上清，用0.22μm过滤器(MILLEX(R)-GV(MILLIPORE))过滤。使用Hi Trap Protein G HP柱(Amersham Biosciences#17-0404-01)，通过本领域技术人员公知的方法从该培养上清中纯化抗体。将纯化后的抗体溶液再用0.22μm过滤器(MILLIPORE#SLGV033RS)过滤，用于以后的解析。

11-3.chHC15及chHE39对sHB-EGF的结合活性的比较

制作的chHC15及chHE39对活性型HB-EGF蛋白质的结合活性通过以下实验解析。使chHC15及chHE39以各浓度在ELISA板(NUNC)的各孔中反应，所述ELISA板以浓度为1μg/mL涂布了HB-EGF蛋白质(R&D，259-HE)。然后，使其与用碱性磷酸酶(AP)标记的抗人IgG反应1小时，之后加入1mg/mL的基质。通过使用酶标仪测定OD405的吸光度，对该基质的显色进行定量化。基于所得各抗体的结合曲线，计算显示出50％结合的抗体浓度(ED₅₀)。结果chHC15及chHE39对活性型HB-EGF的结合活性以ED₅₀值计分别表示为约0.21nM、0.42nM(图25)。

11-4.chHC15及chHE39对在细胞膜上表达的HB-EGF的结合活性的解析

接下来，制作的chHC15及chHE39对在细胞膜上表达的HB-EGF的结合活性通过以下实验解析。

使HB-EGF表达DG44细胞(HB-EGF_DG44)与各浓度的chHC15或chHE39在4℃下反应1小时。之后，将该细胞用FITC标记抗人IgG抗体标记。利用FACS(Becton Dickinson)解析chHC15及chHE39对在细胞膜上表达的HB-EGF的结合。

将chHC15及chHE39在各浓度下的标记强度(Geo-Mean值)绘制成图，算出显示50％结合的抗体浓度(ED₅₀)。结果chHC15、chHE39对在HB-EGF的结合活性的ED₅₀值分别约为3.3nM、5.3nM(图26)。

chHC15及chHE39对HB-EGF的结合活性归纳于表4。

表4.chHC15及chHE39对HB-EGF的结合活性(EC₅₀值)

11-5.chHC15及chHE39的体内抗肿瘤活性的比较

将高度表达HB-EGF的SKOV3细胞株或卵巢癌细胞株(MCAS)悬浮于HBSS(SIGMA H9269)，配制5×10⁷个细胞的细胞悬浮液(0.2mL)。将该悬浮液移植到SCID小鼠(雄性、7周龄(C.B-17/lcr-scid Jcl、日本CLEA)的腹部皮下。确认肿瘤被移入后，以肿瘤体积和体重作为指标，将多个上述裸小鼠分成5组(每细胞株中对照组1组，药物给与组4组)。

从分组当日开始，每隔一周静脉内瞬间进行下述给与，即，对对照组给与PBS(Dulbecco’s PBS GIBCO 14190)，对药物给与组分别给与chHC15或chHE39，对移植了高度表达HB-EGF的SKOV3细胞株的组以10mg/kg或50mg/kg的给与量给与chHC15或chHE39，对移植了卵巢癌细胞株(MCAS)的组以2mg/kg或10mg/kg的给与量给与chHC15或chHE39。之后经时测定肿瘤体积。通过肿瘤体积的测定评价抗体的治疗效果。

图27a及27b表示高度表达HB-EGF的SKOV-3细胞株的移植模型的结果，图27c及27d表示MCAS移植小鼠模型的结果。在高度表达HB-EGF的SKOV-3株和MCAS移植模型两者中，chHC15给与组的肿瘤体积与chHE39给与组的肿瘤体积相比被抑制。即，chHC15发挥比chHE39更强的抗肿瘤活性。肿瘤体积数据通过非参数型Dunnett多重比较进行解析，结果确认了在高度表达HB-EGF的SKOV-3株及MCAS移植小鼠中，chHC15的给与均显示出有意义的肿瘤增殖抑制效果。

11-6.chHC15对其他癌细胞株的体内抗肿瘤活性的解析

使用胰腺癌细胞株BxPC-3、或乳癌细胞株MDA-MB-231株(体外传代)或MDA-MB-231(体内传代)的移植小鼠模型，解析chHC15对这些细胞株的抗肿瘤活性。

按照11-5中记载的方法，将各癌细胞株移植到小鼠中，进行上述小鼠的分组。对药物给与组的小鼠按照10mg/kg的用量每周1次给与chHC15。图28a给出BxPC-3株移植模型中的chHC15的药效评价的结果，图28b及28c给出MDA-MB-231(体外传代株)及MDA-MB-231(体内传代株)的各移植模型中的chHC15的药效评价的结果。通过非参数型Dunnett多重比较进行解析，结果确认了即使在全部移植模型中通过以10mg/kg的用量给与HC15人嵌合抗体，均显示出有意义的肿瘤增殖抑制效果。

产业上的可利用性

本发明的抗体及含有该抗体的药物组合物对癌的治疗及诊断有用。

Claims (24)

1.以下[1]～[2]中任一项所述的抗HB-EGF抗体：

[1]抗体，包含H链及L链，

所述H链具有序列号1记载的氨基酸序列作为CDR1、序列号2记载的氨基酸序列作为CDR2、序列号3记载的氨基酸序列作为CDR3，

所述L链具有序列号4记载的氨基酸序列作为CDR1、序列号5记载的氨基酸序列作为CDR2、序列号6记载的氨基酸序列作为CDR3；

[2]抗体，结合在与[1]所述的抗体结合的抗原决定部位相同的抗原决定部位。

2.如权利要求1所述的抗HB-EGF抗体，具有内化活性。

3.如权利要求1或2所述的抗HB-EGF抗体，结合了细胞毒性物质。

4.如权利要求1～3中任一项所述的抗HB-EGF抗体，具有ADCC活性或CDC活性。

5.如权利要求1～4中任一项所述的抗HB-EGF抗体，还具有中和活性。

6.如权利要求1～5中任一项所述的抗HB-EGF抗体，结合了标记物。

7.一种药物组合物，含有权利要求1～6中任一项所述的抗体。

8.一种药物组合物，含有与权利要求1～6中任一项所述的抗体结合了的细胞毒性物质。

9.如权利要求7或8所述的药物组合物，为细胞增殖抑制剂。

10.如权利要求9所述的药物组合物，为抗癌剂。

11.如权利要求10所述的药物组合物，其中，癌为胰腺癌、肝癌、食道癌、黑色素瘤、大肠癌、胃癌、卵巢癌、宫颈癌、乳癌、膀胱癌、脑肿瘤或血液癌。

12.一种方法，是使用权利要求1～6中任一项所述的抗HB-EGF抗体将细胞毒性物质转运到细胞内的方法。

13.一种方法，是通过与权利要求1～6中任一项所述的抗HB-EGF抗体结合了的细胞毒性物质抑制细胞增殖的方法。

14.如权利要求13所述的方法，其中，细胞为癌细胞。

15.如权利要求12～14中任一项所述的方法，其中，细胞毒性物质为化疗剂、放射性物质、或毒性肽。

16.权利要求1～6中任一项所述的抗HB-EGF抗体的用途，用于将细胞毒性物质转运到细胞内。

17.具有内化活性的权利要求2～6中任一项所述的抗HB-EGF抗体的用途，用于抑制细胞增殖。

18.如权利要求16或17所述的用途，其中，细胞为癌细胞。

19.如权利要求16～18中任一项所述的用途，其中，细胞毒性物质与抗HB-EGF抗体结合。

20.一种药物组合物的制备方法，包括以下步骤：

(a)提供权利要求1～6中任一项所述的抗HB-EGF抗体的步骤；

(b)确认(a)的抗体是否具有内化活性的步骤；

(c)选择具有内化活性的抗体的步骤；

(d)将细胞毒性物质与(c)中选择的抗体结合的步骤。

21.如权利要求20所述的制备方法，其中，药物组合物为抗癌剂。

22.一种癌的诊断方法，使用权利要求1～6中任一项所述的抗HB-EGF抗体。

23.如权利要求22所述的诊断方法，其特征在于，使用结合了标记物的抗HB-EGF抗体。

24.如权利要求22或23所述的诊断方法，其特征在于，检测参入到细胞内的抗HB-EGF抗体。

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