CN101951953A - 含抗grp78抗体作为有效成分的药物组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明旨在提供使用抗GRP78抗体的新药物组合物。本发明更具体旨在提供使用抗GRP78抗体的新的癌症治疗方法、含抗GRP78抗体的新的细胞增值抑制剂和抗癌剂，及新的抗GRP78抗体。发明人在探索制备以定位于癌细胞的细胞膜的GRP78作为靶标的抗肿瘤抗体的过程中成功得到了特异性结合于癌细胞表面的抗GRP78抗体，从而解决了上述课题。

Description

含抗GRP78抗体作为有效成分的药物组合物
技术领域
本发明涉及治疗癌症的方法和抗癌剂。
背景技术
GRP蛋白(葡萄糖调节蛋白)是位于ER的分子伴侣。已知是在如缺乏葡萄糖时，或高级结构发生异常的蛋白质蓄积于小泡(ER)内时，细胞响应来自细胞内外的各种ER压力而诱导表达的蛋白质家族(非专利文献1)。
GRP78是分子量为78kDa的GRP蛋白，又被称为BiP(免疫球蛋白结合蛋白)。通过GRP78过量表达实验或反义抑制(Knock down)实验发现，GRP78与针对ER压力引起的细胞死亡的防御反应相关(非专利文献1)。
癌化细胞或癌化所致的变化的体内环境所呈现的如低营养、低氧、低pH常被认为是伴随ER压力而发生的状态。为支持此情况，在多种癌细胞株和临床癌症检体中发现GRP78蛋白的表达升高(非专利文献2～5)。通过实验发现，具有抑制拓扑异构酶的活性或抑制血管生成的活性的抗癌剂的抗癌性的获得与GRP78蛋白表达升高及其抗凋亡活性密切相关(非专利文献6、7)。临床中也发现，GRP78表达抗进的乳癌患者组相比GRP78表达低下的组，用阿霉素进行的化学疗法的效果差(非专利文献8)。
这些报道提示，GRP78的表达抗进在癌细胞的存活、恶化、抗癌剂耐受的机理中发挥作用(非专利文献1)。
如上所述，已知GRP78是位于ER的分子伴侣，而有报道称在一部分癌细胞中，GRP78蛋白位于细胞表面。且通过几种全然不同方法提示了应用以所述定位于细胞表面的GRP78为靶标的抗肿瘤剂的可能性。
用毒胡萝卜内酯(Tg)处理横纹肌肉瘤细胞株TE671/RD后进行FACS分析证实，有少数细胞膜被抗GRP78抗体着色，表明GRP78位于细胞膜上(非专利文献9)。
但所述报道仅表明由Tg处理所诱导的细胞死亡时的瞬时现象，并非表示癌细胞的恒常的GRP78位置变化的数据。且由于所用抗体为市售的源自山羊的多克隆抗体，也不清楚其表位。
此后，其它研究小组通过噬菌体结合测定得到了2种GRP78结合肽(WIFPWIQL、WDLAWMFRLPVG)，并报道所述肽不仅与固定于平板上的GRP78蛋白结合，还吸附于前列腺癌细胞株DU145的细胞表面并被所述细胞摄入(非专利文献10)。此实验揭示了GRP78位于癌细胞的细胞膜上的可能性。
还确认了可将所述GRP78结合肽用作抗肿瘤剂的可能性。即有报道称于所述GRP78结合肽上附加凋亡诱导肽序列(KLAKLAK)2(非专利文献11)而合成的肽不仅体外诱导DU145细胞的细胞死亡，还在利用小鼠移植模型的体内实验中表现出抗肿瘤效果(非专利文献10)。
另外，其它研究小组在探索已知抑制血管生成的纤溶酶原的被称为Kringle5(K5)的结构域所识别的靶标分子的过程中发现，K5的靶标是血管内皮细胞所表达的GRP78蛋白(非专利文献16)。还发现重组的K5通过GRP78不仅抑制血管生成，还诱导在低氧条件下培养的各种癌细胞株的细胞死亡(非专利文献16)。
这一连串的实验表明，可将与在癌细胞或血管内皮细胞的细胞表面表达的GRP78结合的肽用作抗肿瘤剂。但还不清楚所述肽识别被认为表达于细胞表面的GRP78的哪部分，所以利用所述肽开发药物还被认为有些困难。
与所述观点不同，另外2个独立的研究小组用各自不同的方法报道了GRP78位于细胞膜上。
一个研究小组发现，识别受体的α2巨球蛋白(α2M*)对前列腺癌细胞株(1-LN)发挥增殖因子的功能(非专利文献12)；此后该小组发现所述受体即为GRP78(非专利文献13)。此发现表明，长期被认为是ER蛋白的GRP78蛋白还在细胞膜上发挥增殖因子的受体的功能。
而另一小组发现前列腺癌患者的血清中存在识别肽序列“CNVSDKSC”的抗体(抗CNVSDKSC抗体)，并在分析所述抗体识别的抗原蛋白的过程中发现，所述抗原蛋白即为GRP78蛋白(非专利文献14)。但实际上GRP78内不存在序列“CNVSDKSC”或其类似序列，尚不清楚所述来自前列腺癌患者的抗体识别GRP78的哪部分。
此后，其它研究小组对所述肽“CNVSDKSC”进行三级结构分析，并搜索了GRP78中是否存在具有同样的三级结构的区域。结果发现，位于GRP78的Leu98-Leu115的序列“LIGRTWNDPSVQQDIKFL”相当于所述序列。在制备出针对所述序列的兔多克隆抗体后发现，所述抗体可对诸如前列腺癌株1-LN、DU145、黑色素细胞株DM413的癌细胞的细胞表面进行染色。且发现，所述抗体同加入α2M*时所观察到的一样，可升高前列腺癌细胞的细胞内钙浓度、诱导前列腺癌细胞的细胞增值，及呈现出对TNFα的抗凋亡作用(非专利文献15)。如此，从针对GRP78的Leu98-Leu115的抗体模拟了α2M*的配体活性得知，GRP78中的此区域是α2M*的结合序列(非专利文献15)。
此报告证实了GRP78存在于前列腺癌等的细胞表面，且清楚了GRP78的Leu98-Leu115(LIGRTWNDPSVQQDIKFL)作为α2M*的结合位点暴露于细胞外。
而且，通过其它方法发现针对GRP78的98-115的区域的抗体可使癌细胞的细胞表面着色，从而清楚了所述区域可为GRP78的细胞外表位。
尽管已如述在多种癌症中发现GRP78蛋白表达升高，且已清楚其定位于细胞膜，但仍难于利用这些知识制备以GRP78为靶标的新的抗体治疗药物。原因是，第一，因为尚不知所述GRP78结合肽与GRP78蛋白的那个区域结合，所以不可能制备出预期与所述肽具有同样效果的抗体。实际上也不存在可替代所述肽的作用的单克隆抗体。第二，尽管与GRP78的98-115的区域结合的抗体可结合于癌细胞的细胞表面，但顶多能模拟α2M*的增殖促进作用，尚期待不了所述抗体具有抗肿瘤活性。
因此认为难于利用与GRP78结合的抗体抑制肿瘤活性。
非专利文献1：Lee AS.Trends Biochem Sci.2001，26，504-10
非专利文献2：Patierno，et al.1998，Cancer Re s.47，6220-24
非专利文献3：Bini et al.1997，Electrophoresis.18，2832-41
非专利文献4：Gazit et al.1999，Breast Cancer Res.Treat.54，135-46
非专利文献5：Fernandez et al.2000，Breast Cancer Res.Treat.59，15-26
非专利文献6：Reddy et al，J.Bio.Chem.2003，278，20915-24
非专利文献7：Dong et al，2005，Cancer Res.65，5785-5791
非专利文献8：Lee et al.2006，Cancer Res.66，7849-7853
非专利文献9：Delpino et al.1998，Molecular MembraneBiology，15，21-26
非专利文献10：Arap et al.2004，CANCER CELL.6，275-284
非专利文献11：Javadpour et al.1996，J.Med.Chem.39，3107-3113
非专利文献12：Asplin et al.2000，Archives of Biochemistryand Biophysics.383，135-141
非专利文献13：Misra et al.2002，J.Biol.Chem.277，42082-42087
非专利文献14：Mintz et al.2003，Nat Biotech.21，57-63
非专利文献15：Gonzalez-Gronow et al.2006，Cancer Res.66，11424-11431
非专利文献16：Davidoson et al.，2005，Cancer Res.65，4663-4672
发明内容
发明拟解决的课题
本发明旨在提供使用抗GRP78抗体的新的药物组合物。本发明更具体旨在提供使用抗GRP78抗体的新的癌症治疗方法、含抗GRP78抗体的新的细胞增值抑制剂和抗癌剂，及新的抗GRP78抗体。
解决课题的方法
发明人尝试了制备以定位于癌细胞的细胞膜的GRP78为靶标的抗肿瘤抗体。为此，需要首先鉴定可成为暴露于癌细胞的细胞表面的抗体的表位的氨基酸。所以纯化了GRP78蛋白，用其免疫小鼠，并筛选了仅使癌细胞着色的抗体。结果成功得到了特异性结合于癌细胞的细胞表面的抗GRP78抗体。然后尝试鉴定了识别所得抗体的序列。通过分析发现，所述抗体特异性识别GRP78的376-415的40个氨基酸。即发现了GRP78的376-415氨基酸区域暴露于细胞外。接下来证实识别所述表位的抗体被细胞迅速摄入。通过制备所述抗体上附加了毒素的scFv抗体，并分析对癌细胞株的体外作用发现，所得经毒素标记的scFv抗体特异性杀伤癌细胞。使用移植了癌细胞的异种移植小鼠模型分析抗体的作用时观察到，抗体的施用显著抑制了移植肿瘤的增殖。此结果证实，所述抗体不仅在体外，还在体内发挥抗肿瘤活性。以上认识提示，可将针对GRP78的细胞外区域的抗体用作抗肿瘤剂。
本发明的发明人基于以上认识意识到可解决上述课题。
具体提供下列(1)-(28)中记载的方案。
(1)含与葡萄糖调节蛋白78(GRP78)结合的抗体的药物组合物。
(2)(1)的组合物，其是抗癌剂。
(3)(1)或(2)的组合物，其中所述抗体是单克隆抗体。
(4)(1)-(3)中任一项的组合物，其中所述抗体是与位于细胞表面的GRP78结合的抗体。
(5)(1)-(4)中任一项的组合物，其中所述抗体是被表达GRP78的细胞摄入的抗体。
(6)(1)-(5)中任一项的组合物，其中所述抗体是与SEQ IDNO：3所示表位结合的抗体。
(7)(1)-(6)中任一项的组合物，其中所述抗体是结合有伤细胞物质的抗体。
(8)与GRP78结合的单克隆抗体。
(9)(8)的抗体，其特征在于与在细胞表面表达的GRP78结合。
(10)(8)或(9)的抗体，其特征在于被表达GRP78的细胞摄入。
(11)(8)-(10)中任一项的抗体，其特征在于与SEQ ID NO：3所示表位结合。
(12)(8)-(10)中任一项的抗体，其特征在于识别与下列(a)-(f)中任一项的抗体识别的表位相同的表位：
(a)具有下述重链可变区和轻链可变区的抗体：
其中所述重链可变区具有下述CDR1-CDR3，其中，
CDR1具有SEQ ID NO：8所示氨基酸序列、
CDR2具有SEQ ID NO：9所示氨基酸序列、
CDR3具有SEQ ID NO：10所示氨基酸序列，
且其中所述轻链可变区具有下述CDR1-CDR3，其中，
CDR1具有SEQ ID NO：11所示氨基酸序列、
CDR2具有SEQ ID NO：12所示氨基酸序列、
CDR3具有SEQ ID NO：13所示氨基酸序列；
(b)具有下述重链可变区和轻链可变区的抗体：
其中所述重链可变区具有下述CDR1-CDR3，其中，
CDR1具有SEQ ID NO：18所示氨基酸序列、
CDR2具有SEQ ID NO：19所示氨基酸序列、
CDR3具有SEQ ID NO：20所示氨基酸序列，
且其中所述轻链可变区具有下述CDR1-CDR3，其中，
CDR1具有SEQ ID NO：21所示氨基酸序列、
CDR2具有SEQ ID NO：22所示氨基酸序列、
CDR3具有SEQ ID NO：23所示氨基酸序列；
(c)具有下述重链可变区和轻链可变区的抗体：
其中所述重链可变区具有下述CDR1-CDR3，其中，
CDR1具有SEQ ID NO：61所示氨基酸序列、
CDR2具有SEQ ID NO：62所示氨基酸序列、
CDR3具有SEQ ID NO：63所示氨基酸序列，
且其中所述轻链可变区具有下述CDR1-CDR3，其中，
CDR1具有SEQ ID NO：64所示氨基酸序列、
CDR2具有SEQ ID NO：65所示氨基酸序列、
CDR3具有SEQ ID NO：66所示氨基酸序列；
(d)具有下述重链可变区和轻链可变区的抗体：
其中所述重链可变区具有下述CDR1-CDR3，其中，
CDR1具有SEQ ID NO：71所示氨基酸序列、
CDR2具有SEQ ID NO：72所示氨基酸序列、
CDR3具有SEQ ID NO：73所示氨基酸序列，
且其中所述轻链可变区具有下述CDR1-CDR3，其中，
CDR1具有SEQ ID NO：74所示氨基酸序列、
CDR2具有SEQ ID NO：75所示氨基酸序列、
CDR3具有SEQ ID NO：76所示氨基酸序列；
(e)具有下述重链可变区和轻链可变区的抗体：
其中所述重链可变区具有下述CDR1-CDR3，其中，
CDR1具有SEQ ID NO：81所示氨基酸序列、
CDR2具有SEQ ID NO：82所示氨基酸序列、
CDR3具有SEQ ID NO：83所示氨基酸序列，
且其中所述轻链可变区具有下述CDR1-CDR3，其中，
CDR1具有SEQ ID NO：84所示氨基酸序列、
CDR2具有SEQ ID NO：85所示氨基酸序列、
CDR3具有SEQ ID NO：86所示氨基酸序列；
(f)具有下述重链可变区和轻链可变区的抗体：
其中所述重链可变区具有下述CDR1-CDR3，其中，
CDR1具有SEQ ID NO：91所示氨基酸序列、
CDR2具有SEQ ID NO：92所示氨基酸序列、
CDR3具有SEQ ID NO：93所示氨基酸序列，
且其中所述轻链可变区具有下述CDR1-CDR3，其中，
CDR1具有SEQ ID NO：94所示氨基酸序列、
CDR2具有SEQ ID NO：95所示氨基酸序列、
CDR3具有SEQ ID NO：96所示氨基酸序列。
(13)(8)-(12)中任一项的抗体，其特征在于对表达GRP78的细胞具有伤细胞活性。
(14)(13)的抗体，其特征在于结合有伤细胞物质。
(15)使用抗GRP78抗体将伤细胞物质递送至细胞内的方法。
(16)通过结合于抗GRP78抗体的伤细胞物质抑制细胞增殖的方法。
(17)(15)或(16)的方法，其中所述细胞是癌细胞。
(18)抗GRP78抗体用于将伤细胞物质递送至细胞内的用途。
(19)具有被细胞摄入活性的抗GRP78抗体用于抑制细胞增殖的用途。
(20)(18)或(19)的用途，其中所述细胞是癌细胞。
(21)(18)-(20)中任一项的用途，其特征在于所述抗GRP78抗体结合有伤细胞物质。
(22)制备药物组合物的方法，包括：
(a)提供抗GRP78抗体；
(b)确认(a)中的抗体是否具有被细胞摄入活性；
(c)筛选具有被细胞摄入活性的抗体；
(d)向(c)中筛选出的抗体结合伤细胞物质。
(23)(22)的方法，其中所述药物组合物是抗癌剂。
(24)使用抗GRP78抗体诊断癌症的方法。
(25)(24)的方法，其特征在于使用结合有标记物的抗GRP78抗体。
(26)(24)或(25)的方法，其特征在于检测被摄入细胞内的抗GRP78抗体。
(27)结合有标记物的抗GRP78抗体。
(28)由SEQ ID NO：3的氨基酸序列构成的多肽或其片段。
发明效果
本发明示可通过提供具有GRP78结合活性，且可被细胞摄入的新抗体来提供可用于治疗暴露GRP78于细胞表面的各种肿瘤或癌症的新的药物组合物。还可通过使用具有所述特征的抗体来提供诊断各种肿瘤或癌症的方法。
附图简述
图1：通过蛋白印迹法分析所得抗体与GRP78的结合活性的图。泳道1中为由DU145细胞制备的细胞裂解物，泳道2中为由大肠杆菌制备的GST-GRP78融合蛋白，泳各抗体进行染色。抗血清是细胞融合前采集的小鼠抗血清。
图2：通过FACS分析所得抗GRP78抗体与DU145细胞的细胞表面的结合活性的图。
图3：通过FACS分析GA-20抗体与各种癌细胞的细胞表面的结合活性的图。
图4：(A)通过FACS分析GA-20抗体与各种永生细胞株的细胞表面的结合活性的图；(B)使用GA-20进行蛋白印迹来分析各种永生细胞株的GRP78蛋白表达的图。
图5：通过FACS分析GA-20、GA-21抗体被摄入细胞内的活性的图。使各抗体与DU145细胞反应，在0℃或37℃温育2小时后，用第二抗体(经FITC标记的抗小鼠IgG抗体)检测结合于细胞表面的抗体。
图6：通过细胞免疫染色分析与DU145的细胞表面结合的GA-20抗体，不与所述细胞的细胞表面结合的GA-31抗体是否被摄入细胞内的图。将各抗体加入培养中的DU145细胞，并于37℃连续培养3小时。随后如图6下所示流程处理细胞，并检测被摄入细胞内的抗体。
图7：通过蛋白印迹分析结合于GRP78的各抗体的表位的图。上图为表位分析中使用的GST-GRP78融合蛋白(1-6)的模式图。下图为对各GST-GRP78融合蛋白(1-6)进行SDS-PAGE，并通过蛋白印迹法分析针对各蛋白的各抗体的反应性的结果。
图8：为进一步纯化GA-20、GA-21的GRP78内的表位而进行的蛋白印迹分析结果的图。上图是限定于更小范围的GST-GRP78融合蛋白的模式图。下图为对各GST-GRP78融合蛋白(1-5)进行SDS-PAGE，并通过蛋白印迹法分析针对各蛋白的GA-20、GA-21抗体的反应性的结果。
图9：显示通过以与GRP78的结合活性为指标的ELISA系统检测由大肠杆菌纯化的经毒素标记的GA-20scFv抗体(GA20-PE40)从哪个级分洗脱出的分析结果。上图为表示检测GA20-PE40与GRP78的结合活性的ELISA系统的模式图，下图显示ELISA结果所得洗脱级分的结合活性。
“初始级分”表示进行GA20-PE40的表达诱导的大肠杆菌裂解物，
“通过级分”表示施于HisTrap柱的裂解物径直通过柱的级分，
“洗涤级分”表示洗涤柱的级分，
“洗脱级分1”-“洗脱级分7”表示从柱洗脱出的洗脱级分。
图10：显示经纯化的GA20-PE40对DU145细胞(图10A)、22Rv1细胞(图10B)或DG44细胞(图10C)的伤细胞活性。向各细胞以10％的浓度加入洗脱级分(洗脱级分2、3、4)，随后测定活细胞数，并量化了相对PBS加入组的细胞数的比例。
图11：通过FACS分析所得抗GRP78抗体与22Rv1细胞的细胞表面的结合活性。
图12：图12(A)是在分析GA-20抗体及通过再免疫得到的4种新抗体(GC-18抗体、GC-20抗体、GD-4抗体、GD-17抗体)的表位时使用的GST-GRP78融合蛋白的模式图。图12(B)是通过SDS-PAGE和CBB染色确认通过加入IPTG而诱导大肠杆菌表达各GST-GRP78融合蛋白的结果。
图13：通过蛋白印迹法分析各抗体的表位的图。显示了对各GST-GRP78融合蛋白进行SDS-PAGE，并分析各抗体的反应性的蛋白印迹结果。下表显示从蛋白印迹结果得到的各抗体的表位的结果。
图14：为调节经纯化的GD17scFv-PE40的纯度，对所述经纯化的GD17scFv-PE40进行SDS-PAGE后进行CBB染色的图。
图15：显示为分析经纯化的GD17scFv-PE40与GRP78蛋白的结合活性及蛋白的稳定性而进行的ELISA的结果。将4℃保存、37℃静置过夜的GD17scFv-PE40及经冻融的GD17scFv-PE40稀释成各浓度，并通过ELISA分析了与GST-GRP78的结合活性。下表以EC50值显示了各样品的与GRP78蛋白的结合活性。
图16A：显示经纯化的GD17scFv-PE40对各种细胞株的伤细胞活性的结果。将GD17scFv-PE40稀释成各浓度后加入癌细胞株(图16A)，并在培养数日后分析活细胞数。表中显示了给出最大活性的50％的活性时的抗体浓度(EC50值)。
图16B：显示经纯化的GD17scFv-PE40对各种细胞株的伤细胞活性的结果。将GD17scFv-PE40稀释成各浓度后加入正常细胞株(图16B)，并在培养数日后分析活细胞数。表中显示了给出最大活性的50％的活性时的抗体浓度(EC50值)。
图17：显示了使用GD-17抗体通过蛋白印迹法分析各种细胞株的GRP78蛋白表达的图。
图18：分析小鼠移植模型中GD17scFv-PE40的体内抗肿瘤活性的结果。在移植22Rv1(第0天)后第17天、第21天、第23天、第26天和第29天时施用PBS(媒质)或0.5mg/kg的GD17scFv-PE40，并随后经时测定了肿瘤体积。
具体实施方式
本发明的抗GRP78抗体只要是可与GRP78蛋白(SEQ ID NO：2)结合的抗体即可，不限其来源(如小鼠、大鼠、人)、种类(如单克隆抗体、多克隆抗体)及形状(如经改变抗体、经缩减抗体、经修饰抗体)。
本发明所用抗GRP78抗体优选与GRP78特异性结合。且本发明所用抗GRP78抗体优选为单克隆抗体。
已知GRP78位于如癌细胞的细胞膜上。本发明所用抗GRP78抗体的优选实施方式之一可为例如，识别GRP78位于细胞膜上时暴露于细胞外的区域的抗体。
例如，可通过用GRP78蛋白(SEQ ID NO：2)作为免疫原来制备抗体，并从制备出的抗体中筛选可与在细胞膜上表达GRP78的癌细胞(例如前列腺癌细胞株DU145等)结合的抗体，从而得到所述抗体。更具体而言，可通过实施例中记载的方法得到识别GRP78位于细胞膜上时暴露于细胞外的区域的抗体。
本发明中所述GRP78位于细胞膜上时暴露于细胞外的区域优选是抗体与所述区域结合时不模拟α2巨球蛋白的增值促进作用的区域，尤其优选GRP78的98号-115号氨基酸之外的区域。
优选的GRP78位于细胞膜上时暴露于细胞外的区域为例如SEQ IDNO：2的氨基酸序列的376号-415号氨基酸的区域(SEQ ID NO：3)。所以，识别GRP78位于细胞膜上时暴露于细胞外的区域的抗体优选为例如识别GRP78的376号-415号氨基酸的区域的抗体。对识别GRP78的376号-415号氨基酸的区域的抗体无特定限制，可为例如识别384号-391号氨基酸(即SEQ ID NO：3的9号-16号氨基酸)的抗体、识别392号-407号氨基酸(即SEQ ID NO：3的17号-32号氨基酸)的抗体、识别400号-415号氨基酸(即SEQ ID NO：3的25号-40号氨基酸)的抗体。可通过本领域技术人员公知的方法(例如实施例中记载的方法)确认抗体是否识别目标表位。
本发明所用抗体的其它优选实施方式为例如具有被细胞摄入活性的抗体。本发明所述“具有被细胞摄入活性的抗体”指与位于细胞表面的GRP78结合时可被输送至细胞内(如细胞质内、小泡内、其它小细胞器内)的抗体。
可通过本领域技术人员公知的方法确认抗体是否具有被细胞摄入活性，例如可通过使结合有标记物的抗GRP78抗体与表达GRP78的细胞(例如前列腺癌细胞株DU145等)接触，并确认所述标记物是否被摄入细胞内的方法；使结合有伤细胞物质的抗GRP78抗体与表达GRP78的细胞接触，并确认是否可诱导所述表达GRP78的细胞的细胞死亡的方法等进行确认。更具体而言，可通过如实施例中记载的方法等确认抗体是否具有被细胞摄入活性。
本发明的特别优选的抗体可为例如识别GRP78位于细胞膜上时暴露于细胞外的区域、且具有被细胞摄入活性的抗体。可通过首选根据上述方法筛选出识别GRP78位于细胞膜上时暴露于细胞外的区域的抗体，随后从筛选出的抗体中再筛选具有被细胞摄入活性的抗体来得到所述抗体。
本发明所用的优选抗体可为例如下列(a)-(s)的抗体。
(a)含具有下述CDR1-CDR3的重链可变区的抗体，其中
CDR1具有SEQ ID NO：8所示氨基酸序列；
CDR2具有SEQ ID NO：9所示氨基酸序列；
CDR3具有SEQ ID NO：10所示氨基酸序列。
(b)含具有下述CDR1-CDR3的轻链可变区的抗体，其中
CDR1具有SEQ ID NO：11所示氨基酸序列；
CDR2具有SEQ ID NO：12所示氨基酸序列；
CDR3具有SEQ ID NO：13所示氨基酸序列。
(c)含(a)的重链可变区和(b)的轻链可变区的抗体。
(d)含具有下述CDR1-CDR3的重链可变区的抗体，其中
CDR1具有SEQ ID NO：18所示氨基酸序列；
CDR2具有SEQ ID NO：19所示氨基酸序列；
CDR3具有SEQ ID NO：20所示氨基酸序列。
(e)含具有下述CDR1-CDR3的轻链可变区的抗体，其中
CDR1具有SEQ ID NO：21所示氨基酸序列；
CDR2具有SEQ ID NO：22所示氨基酸序列；
CDR3具有SEQ ID NO：23所示氨基酸序列。
(f)含(d)的重链可变区和(e)的轻链可变区的抗体。
(g)含具有下述CDR1-CDR3的重链可变区的抗体，其中
CDR1具有SEQ ID NO：61所示氨基酸序列；
CDR2具有SEQ ID NO：62所示氨基酸序列；
CDR3具有SEQ ID NO：63所示氨基酸序列。
(h)含具有下述CDR1-CDR3的轻链可变区的抗体，其中
CDR1具有SEQ ID NO：64所示氨基酸序列；
CDR2具有SEQ ID NO：65所示氨基酸序列；
CDR3具有SEQ ID NO：66所示氨基酸序列。
(i)含(g)的重链可变区和(h)的轻链可变区的抗体。
(j)含具有下述CDR1-CDR3的重链可变区的抗体，其中
CDR1具有SEQ ID NO：71所示氨基酸序列；
CDR2具有SEQ ID NO：72所示氨基酸序列；
CDR3具有SEQ ID NO：73所示氨基酸序列。
(k)含具有下述CDR1-CDR3的轻链可变区的抗体，其中
CDR1具有SEQ ID NO：74所示氨基酸序列；
CDR2具有SEQ ID NO：75所示氨基酸序列；
CDR3具有SEQ ID NO：76所示氨基酸序列。
(l)含(j)的重链可变区和(k)的轻链可变区的抗体。
(m)含具有下述CDR1-CDR3的重链可变区的抗体，其中
CDR1具有SEQ ID NO：81所示氨基酸序列；
CDR2具有SEQ ID NO：82所示氨基酸序列；
CDR3具有SEQ ID NO：83所示氨基酸序列。
(n)含具有下述CDR1-CDR3的轻链可变区的抗体，其中
CDR1具有SEQ ID NO：84所示氨基酸序列；
CDR2具有SEQ ID NO：85所示氨基酸序列；
CDR3具有SEQ ID NO：86所示氨基酸序列。
(o)含(m)的重链可变区和(n)的轻链可变区的抗体。
(p)含具有下述CDR1-CDR3的重链可变区的抗体，其中
CDR1具有SEQ ID NO：91所示氨基酸序列；
CDR2具有SEQ ID NO：92所示氨基酸序列；
CDR3具有SEQ ID NO：93所示氨基酸序列。
(q)含具有下述CDR1-CDR3的轻链可变区的抗体，其中
CDR1具有SEQ ID NO：94所示氨基酸序列；
CDR2具有SEQ ID NO：95所示氨基酸序列；
CDR3具有SEQ ID NO：96所示氨基酸序列。
(r)含(p)的重链可变区和(q)的轻链可变区的抗体。
(s)识别与(a)-(r)中任一项的抗体识别的表位相同的表位的抗体。
可通过例如下列方法得到与某抗体识别相同表位的抗体。
可通过对相同表位的竞争结合来确认被检抗体与某抗体共有表位。可通过例如竞争阻断测定法检测抗体间的竞争。优选的交叉阻断测定法为例如竞争性ELISA测定法。具体而言，在存在或不存在候选竞争抗体的情况下，对包被于微孔板的孔中的GRP78蛋白进行预温育，然后加入本发明的抗GRP78抗体。结合于孔中的GRP78蛋白的本发明的抗GRP78抗体的量与和相同表位竞争结合的候选竞争抗体(被检抗体)的结合能力间接相关。即，随着被检抗体对同一表位的亲和性增大，本发明的抗GRP78抗体与包被有GRP78蛋白的孔的结合量就降低，而被检抗体与包被有GRP78蛋白的孔的结合量就增加。
可通过预先标记抗体来易于测定与孔结合的抗体量。例如，可通过使用抗生物素蛋白过氧化物酶缀合物及合适的底物来测定经生物素标记的抗体。特将利用了酶(如过氧化物酶)标记物的交叉阻断测定法称为竞争性ELISA测定法。可使用可进行检测或测定的其它标记物标记抗体。具体而言，公知发射性标记物或荧光标记物。
被检抗体与本发明的抗GRP78抗体具有源于不同物种的恒定区时，也可由识别所述抗体的恒定区的标记抗体来测定结合于孔的抗体量。即便对于来源于同一物种的抗体，只要当类型不同时，即可由识别各类型的抗体来测定结合于孔的抗体量。
相比在不存在候选竞争抗体的情况下进行的对照实验得到的结合活性，只要候选抗体可阻断至少20％、优选至少20-50％、更优选至少50％的抗GRP78抗体的结合，则所述候选竞争抗体实质上是与本发明的抗GRP78抗体结合相同表位或可竞争结合相同表位的抗体。
本发明所用抗体的优选实施方式之一为例如结合有伤细胞物质的抗体。当结合有伤细胞物质的抗体被摄入细胞内时，可由所述伤细胞物质诱导摄入所述抗体的细胞的杀伤作用或细胞死亡。因此，结合有伤细胞物质的抗体优选还具有被细胞摄入活性。
本发明的结合有伤细胞物质的抗GRP78抗体的优选实施方式可为例如对表达GRP78的癌细胞(如DU145、22Rv1、MCF7)具有伤害活性或诱导细胞死亡的抗体。
本发明所用伤细胞物质只要是可诱导细胞杀伤作用或细胞死亡的物质即可，可为例如，毒素、放射性物质、化学治疗剂等。这些本发明的伤细胞物质包括可转化为具有体内活性的伤细胞物质的药物前体。所述药物前体的活化可为酶转化，也可为非酶转化。
本发明所述“毒素”指源于微生物、动物或植物的表现出细胞毒性的各种蛋白或多肽。本发明所用毒素可为例如下列物质。白喉毒素A链(Langone J.J.，et al.，Methods in Enzymology，93，307-308，1983)、假单胞菌外毒素(Nature Medicine，2，350-353，1996)、蓖麻毒素A链(Fulton R.J.，et al.，J.Biol.Chem.，261，5314-5319，1986；Sivam G.，et al.，Cancer Res.，47，3169-3173，1987；CumberA.J.et al.，J.Immunol.Methods，135，15-24，1990；WawrzynczakE.J.，et al.，Cancer Res.，50，7519-7562，1990；Gheeite V.，etal.，J.Immunol.Methods，142，223-230，1991)、去糖基化蓖麻毒素A链(Thorpe P.E.，et al.，Cancer Res.，47，5924-5931，1987)、相思豆毒素A链(Wawrzynczak E.J.，et al.，Br.J.Cancer，66，361-366，1992；Wawrzynczak E.J.，et al.，Cancer Res.，50，7519-7562，1990；Sivam G.，et al.，Cancer Res.，47，3169-3173，1987；Thorpe P.E.，et al.，Cancer Res.，47，5924-5931，1987)、白树毒素(Sivam G.，et al.，Cancer Res.，47，3169-3173，1987；Cumber A.J.et al.，J.Immunol.Methods，135，15-24，1990；Wawrzynczak E.J.，et al.，Cancer Res.，50，7519-7562，1990；Bolognesi A.，et al.，Clin.exp.Immunol.，89，341-346，1992)、美洲商陆抗病毒蛋白(PAP-s)(Bolognesi A.，et al.，Clin.exp.Immunol.，89，341-346，1992)、briodin(Bolognesi A.，et al.，Clin.exp.Immunol.，89，341-346，1992)、皂草素(Bolognesi A.，et al.，Clin.exp.Immunol.，89，341-346，1992)、苦瓜毒蛋白(Cumber A.J.，et al.，J.Immunol.Methods，135，15-24，1990；Wawrzynczak E.J.，et al.，Cancer Res.，50，7519-7562，1990；Bolognesi A.，et al.，Clin.exp.Immunol.，89，341-346，1992)、木鳖毒蛋白(Bolognesi A.，et al.，Clin.exp.Immunol.，89，341-346，1992)、香石竹毒蛋白32(Bolognesi A.，et al.，Clin.exp.Immunol.，89，341-346，1992)、香石竹毒蛋白30(Stirpe F.，Barbieri L.，FEBS letter 195，1-8，1986)、塑莲根毒蛋白II(Modeccin)(Stirpe F.，Barbieri L.，FEBS letter 195，1-8，1986)、槲寄生毒蛋白(Stirpe F.，Barbieri L.，FEBS letter 195，1-8，1986)、塑莲根毒蛋白I(Volkesin)(Stirpe F.，Barbieri L.，FEBS letter 195，1-8，1986)、商陆毒蛋白(Stirpe F.，BarbieriL.，FEBS letter 195，1-8，1986)、小麦毒蛋白(Stirpe F.，BarbieriL.，FEBS letter 195，1-8，1986)、软瓜蛋白(Stirpe F.，BarbieriL.，FEBS letter 195，1-8，1986)、trichokirin(Casellas P.，etal.，Eur.J.Biochem.176，581-588，1988；Bolognesi A.，et al.，Clin.exp.Immunol.，89，341-346，1992)。
本发明所述“放射性物质”指含放射性同位素的物质。对放射性同位素无特定限制，可使用任意放射性同位素，例如32P、14C、125I、3H、131I、186Re、188Re等。
本发明所述“化学治疗剂”指除所述毒素、放射性物质之外的具有伤细胞活性的物质，包括细胞因子、抗肿瘤剂、酶等。对本发明所用化学治疗剂无特定限制，优选低分子量的化学治疗剂。分子量小，则认为与抗体结合后干扰抗体功能的可能性也低。本发明的低分子量化学治疗剂通常具有100-2000、优选200-1000的分子量。在本发明中，虽无特定限制，可使用例如下列化学治疗剂。美法仑(Rowland G.F.，et al.，Nature 255，487-488，1975)、顺铂(Hurwitz E.andHaimovich J.，Method In Enzymology 178，369-375，1986；SchechterB.，et al.，Int.J.Cancer 48，167-172，1991)、卡铂(Ota，Y.，et al.，Asia-Oceania J.Obstet.Gynaecol.19，449-457，1993)、丝裂霉素C(Noguchi，A.，et al.，Bioconjugate Chem.3，132-137，1992)、阿霉素(多柔比星)(Shih，L.B.，et al.，Cancer Res.514192-4198，1991；Zhu，Z.，et al.，Cancer Immunol.Immumother 40，257-267，1995；Trail，P.A.，et al.，Science 261，212-215，1993；Zhu，Z.，et al.，Cancer Immunol.Immumother 40，257-267，1995；Kondo，Y.，et al.，Jpn.J.Cancer Res.861072-1079，1995；Zhu，Z.，et al.，Cancer Immunol.Immumother 40，257-267，1995；Zhu，Z.，et al.，Cancer Immunol.Immumother 40，257-267，1995)、柔红霉素(Dillman，R.O.，et al.，Cancer Res.48，6097-6102，1988；Hudecz，F.，et al.，Bioconjugate Chem.1，197-204，1990；TukadaY.et al.，J.Natl.Cancer Inst.75，721-729，1984)、博来霉素(Manabe，Y.，et al.，Biochem.Biophys.Res.Commun.115，1009-1014，1983)、新制癌菌素(Kitamura K.，et al.，CancerImmunol.Immumother 36，177-184，1993；Yamaguchi T.，et al.，Jpn.J.Cancer Res.85，167-171，1994)、甲氨蝶呤(Kralovec，J.，etal.，Cancer Immunol.Immumother 29，293-302，1989；Kulkarni，P.N.，et al.，Cancer Res.41，2700-2706，1981；Shin，L.B.，etal.，Int.J.Cancer 41，832-839，1988；Gamett M.C.，et al.，Int.J.Cancer 31，661-670，1983)、5-氟尿苷(Shin，L.B.，Int.J.Cancer 46，1101-1106，1990)、5-氟-2’-脱氧尿苷(GoerlachA.，et al.，Bioconjugate Chem.2，96-101，1991)、阿糖胞苷(Hurwitz E.，et al.，J.Med.Chem.28，137-140，1985)、氨基蝶呤(Kanellos J.，et al.，Immunol.Cell.Biol.65，483-493，1987)、长春新碱(Johnson J.R.，et al.，Br.J.Cancer 42，17，1980)、长春地辛(Johnson J.R.，et al.，Br.J.Cancer 44，472-475，1981)、白细胞介素2(I L-2)、肿瘤坏死因子α(TNFα)、干扰素(INF)、羧肽酶、碱性磷酸酶、β-内酰胺酶、胞苷脱氨酶。
在本发明中可使用一种伤细胞物质，也可将两种或多种伤细胞物质组合使用。
抗GRP78抗体与所述伤细胞物质的结合可为共价结合，也可为非共价结合。本领域公知制备结合有这些伤细胞物质的抗体的方法。
可将抗GRP78抗体与伤细胞物质通过它们自身具有的连接基团直接连接，也可通过接头或中间支持物等其它物质间接连接。可直接结合抗GRP78抗体与伤细胞物质的连接基团可为例如使用SH基的二硫键。具体而言，用还原剂(如二硫苏糖醇等)还原抗体Fc区域的分子内二硫键，且同样还原伤细胞物质内的二硫键，然后将二者用二硫键结合。可在结合前用活化剂(如埃尔曼试剂)活化抗体或伤细胞物质中的任一方，从而促进两者二硫键的形成。其它直接结合抗GRP78抗体与伤细胞物质的方法有例如使用希夫碱的方法、碳二亚胺法、活化酯法(N-羟基琥珀酰亚胺法)、使用混和酸酐的方法、利用重氮反应的方法等。
抗GRP78抗体与伤细胞物质也可通过其它物质间接结合。对可用于间接结合的其它物质无特定限制，可为例如具有2个或多个氨基、羧基、巯基等中的任一种或者两种或多种的组合的化合物、具有肽接头、能结合抗GRP78抗体的化合物等。所述具有2个或多个氨基、羧基、巯基等中的任一种或者两种或多种的组合的化合物可为例如，N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶二硫基)丙酸酯(SPDP)(Wawrzynczak E.J.，et al.，Cancer Res.，50，7519-7562，1990；Thorpe P.E.，et al.，Cancer Res.，47，5924-5931，1987)；、琥珀酰亚胺基-6-3-[2-吡啶二硫基]-丙酰胺)己酸酯(LC-SPDP)(Hermanson G.T.，BIOCONJUGATE Techniques，230-232，1996)、硫代琥珀酰亚胺基-6-3-[2-吡啶二硫基]-丙酰胺)己酸酯(Sulfo-LC-SPDP)(HermansonG.T.，BIOCONJUGATE Techniques，230-232，1996)、N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶二硫基)丁酸酯(SPDB)(Wawrzynczak E.J.，et al.，Br.J.Cancer，66，361-366，1992)、琥珀酰亚胺基oxycarbonyl-α-(2-吡啶二硫基)甲苯(Thorpe P.E.，et al.，Cancer Res.，47，5924-5931，1987)、琥珀酰亚胺基-6-(α-甲基-[2-吡啶二硫基]甲苯酰胺)-己酸酯(LC-SMPT)(Hermanson G.T.，BIOCONJUGATE Techniques，232-235，1996)、硫代琥珀酰亚胺基-6-(α-甲基-[2-吡啶二硫基]甲苯酰胺)-己酸酯(Sulfo-LC-SMPT)(Hermanson G.T.，BIOCONJUGATETechniques，232-235，1996)、琥珀酰亚胺基-4-(p-马来酰亚胺基苯基)-丁酸酯(SMPB)(Hermanson G.T.，BIOCONJUGATE Techniques，242-243，1996)、硫代琥珀酰亚胺基-4-(p-马来酰亚胺基苯基)-丁酸酯(Sulfo-SMPB)(Hermanson G.T.，BIOCONJUGATE Techniques，242-243，1996)、m-马来酰亚胺基苯甲酰基-N-羟基琥珀酰亚胺基酯(MBS)(Hermanson G.T.，BIOCONJUGATE Techniques，237-238，1996)、m-马来酰亚胺基苯甲酰基-N-羟基硫代琥珀酰亚胺基酯(Sulfo-MBS)(Hermanson G.T.，BIOCONJUGATE Techniques，237-238，1996)、S-乙酰基巯基琥珀酸酐(SAMSA)(Casellas P.，et al.，Eur.J.Biochem，176，581-588，1988)、二甲基-3，3-二硫代双丙二酰亚胺酯(prorionimidate)(DTBP)(Casellas P.，et al.，Eur.J.Biochem，176，581-588，1988)、2-亚胺基硫烷(2-iminotiolane)(ThorpeP.E.，et al.，Cancer Res.，47，5924-5931，1987)等。
其它用于结合抗GRP78抗体与伤细胞物质的物质为例如肽、抗体、聚L-谷氨酸(PGA)、羧甲基右旋糖苷、右旋糖苷、氨基右旋糖苷、抗生物素蛋白-生物素、顺乌头酸、谷氨酸二酰肼、人血清白蛋白(HSA)等。
还可通过基因工程方法将蛋白类伤细胞物质与抗体结合。具体而言，可将例如编码所述伤细胞肽的DNA与编码抗GRP78抗体的DNA框内融合，并整合入表达载体内，从而构建重组载体。可通过培养将所述载体导入合适的宿主细胞内而得到的转化细胞，并表达重组DNA，从而得到结合了毒性肽的抗GRP78抗体的融合蛋白。得到抗体的融合蛋白时，一般在抗体的C端设置蛋白类药剂或毒素。也可通过肽接头连接抗体与蛋白类药剂或毒素。
可根据公知方法得到本发明的抗GRP78单克隆抗体。本发明的抗GRP78抗体尤其优选为源于哺乳动物的单克隆抗体。源于哺乳动物的单克隆抗体包括由杂交瘤产生的单克隆抗体，及由经通过基因工程方法含抗体基因的表达载体转化的宿主产生的单克隆抗体等。
可使用公知技术(例如，如下)制备产生单克隆抗体的杂交瘤。首先将GRP78蛋白用作致敏抗原，根据常规免疫方法进行免疫。将获自免疫动物的免疫细胞根据常规细胞融合方法融合于公知的亲代细胞，从而得到杂交瘤。再根据常规筛选方法从所述杂交瘤筛选出产生目的抗体的细胞，从而筛选出产生抗GRP78抗体的杂交瘤。
具体而言，可如下制备单克隆抗体。首先，可通过表达GRP78基因来得到用作得到抗体的致敏抗原的GRP78蛋白(SEQ ID NO：2)。已知人GRP78基因的碱基序列(SEQ ID NO：1)。即可通过将编码GRP78的基因序列插入公知的表达载体并转化合适的宿主细胞后，通过公知方法从所述宿主细胞或培养上清中纯化目的人GRP78蛋白。也可同样使用经纯化的天然GRP78蛋白。可通过组合或单独使用单次或多次多个常规层析法(如离子层析法或亲和层析法等)进行生成。如本发明所用，还可将把GRP78蛋白的期望部分多肽与不同多肽融合而成的融合蛋白用作免疫原。可利用例如抗体的Fc片段或肽标签等制备用作免疫原的融合蛋白。可通过将编码期望的两种或多种多肽片段的基因框内融合，并将所述融合基因插入如上所述的表达载体中，从而制备表达融合蛋白的载体。融合蛋白的制备方法记载于Molecular Cloning2nd ed.(Sambrook，J.et al.，Molecular Cloning 2nd ed.，9.47-9.58，Cold Spring Harbor Lab.Press，1989)。
可将如述纯化的GRP78蛋白用作对哺乳动物进行免疫的致敏抗原。也可将GRP78的部分肽用作致敏抗原。例如，可将下列肽用作致敏抗原：
根据人GRP78的氨基酸序列化学合成得到的肽；
通过将人GRP78基因的一部分整合入表达载体而进行表达得到的肽；
通过将人GRP78蛋白用蛋白分解酶分解得到的肽。
对GRP78的用作部分肽的区域及其大小无特定限制。优选区域可选自GRP78的376号-415号氨基酸的区域(SEQ ID NO：3)。构成致敏抗原的肽的氨基酸数优选至少为3或更多(例如5或更多，或者6或更多)。更具体而言，可将8-50个残基、优选10-30个残基的肽用作致敏抗原。
对用所述致敏抗原进行免疫的哺乳动物无特定限制。为根据细胞融合法得到单克隆抗体，优选在选择免疫动物时考虑其与用于细胞融合的亲代细胞的适合性。一般优选将啮齿动物用作免疫动物。具体而言，可将小鼠、大鼠、仓鼠或兔用作免疫动物。另外，也可将猴用作免疫动物。
可根据公知方法使用致敏抗原对所述动物进行免疫。例如，可通过常规方法--腹腔内或皮下注射致敏抗原来对哺乳动物进行免疫。具体而言，可从第4天-第21天每日给哺乳动物施用数次所述致敏抗原。可将致敏抗原用PBS(磷酸缓冲盐水)或生理盐水等以适当的稀释倍数进行稀释后用于免疫。也可将致敏抗原与佐剂共施用。例如可与弗氏完全佐剂混和、乳化后用作致敏抗原。还可在用致敏抗原进行免疫时使用合适的支持物。尤其当将分子量小的部分肽用作致敏抗原时，优选将致敏抗原肽与白蛋白、匙孔血蓝蛋白等支持物蛋白结合后进行免疫。
如述免疫哺乳动物，并确认血清中期望抗体的量升高后，从哺乳动物收集免疫细胞，并用于细胞融合。尤其将脾细胞用作优选的免疫细胞。
可将哺乳动物的骨髓瘤细胞用作可与所述免疫细胞融合的细胞。骨髓瘤细胞优选具有用于筛选的合适的筛选标记。筛选标记指可在特定培养条件下存活(或不能存活)的性状。已知的筛选标记有次黄嘌呤-鸟嘌呤-磷酸核糖转移酶缺陷(以下简称HGPRT缺陷)、或胸苷激酶缺陷(以下简称TK缺陷)等。具有HGPRT或TK缺陷的细胞具有次黄嘌呤-氨基蝶呤-胸腺嘧啶感受性(以下简称HAT感受性)。HAT感受细胞由于不能在HAT选择培养基中进行DNA合成而死亡，但可在与正常细胞融合后利用正常细胞的补救途径继续DNA合成，从而可在HAT选择培养基中增殖。
可在含6-硫鸟嘌呤、8-氮鸟嘌呤(以下简称8AG)、或5’溴脱氧尿苷的培养基中筛选HGPRT缺陷型或TK缺陷型细胞。由于正常细胞会将这些嘧啶类似物掺入DNA中而死亡，但具有这些酶缺陷的细胞由于不掺入这些嘧啶类似物，从而可在选择培养基中存活。另外，被称为G418抗性的筛选标记被新霉素抗性基因赋予了对2-脱氧链霉胺系抗生素(庆大霉素类似物)的抗性。已知适于进行细胞融合的各种骨髓瘤细胞。例如可利用P3(P3x63Ag8.653)(J.Immunol.(1979)123，1548-1550)、P3x63Ag8U.1(Current Topicsin Microbiologyand Immunology(1978)81，1-7)、NS-1(Kohler.G.and Milstein，C.Eur.J.Immunol.(1976)6，511-519)、MPC-11(Margulies.D.H.et al.，Cell(1976)8，405-415)、SP2/0(Shulman，M.et al.，Nature(1978)276，269-270)、FO(de St.Groth，S.F.et al.，J.Immunol.Methods(1980)35，1-21)、S194(Trowbridge，I.S.J.Exp.Med.(1978)148，313-323)、R210(Galfre，G.et al.，Nature(1979)277，131-133)等骨髓瘤细胞。
可根据公知方法(例如Kohler&Milstein法等)(Kohler.G.andMilstein，C.，Methods Enzymol.(1981)73，3-46)进行所述免疫细胞和骨髓瘤细胞的细胞融合。
更具体而言，可在促细胞融合剂的存在下，在常规营养培养液中进行所述细胞的融合。可使用例如聚乙二醇(PEG)、仙台病毒(HVJ)等促融合剂。还可根据需要加入可进一步提高融合效率的二甲基亚砜等辅助剂。
可任意设定免疫细胞和骨髓瘤细胞的使用比例。例如使免疫细胞优选为骨髓瘤细胞的1-10倍。可将例如适于增殖所述骨髓瘤细胞株的RPMI1640培养液、MEM培养液及其它用于培养这种细胞的常规培养液用作用于进行所述细胞融合的培养液。还可向培养液中加入胎牛血清(FCS)等血清补充液。
可通过将预定量的所述免疫细胞和骨髓瘤细胞均匀混合于所述培养液中，再混和预热至约37℃的PEG溶液来进行细胞融合，从而形成目的融合细胞(杂交瘤)。细胞融合中，通常可加入30-60％(w/v)浓度的平均分子量为约1000-6000的PEG。随后逐次加入所述合适的培养液，并通过重复离心除去上清的操作来除去不利于杂交瘤生长的细胞融合剂等。
可通过利用相应于细胞融合中使用的骨髓瘤具有的筛选标记的选择培养液筛选如述得到的杂交瘤。例如，可通过在HAT培养液(含次黄嘌呤、氨基蝶呤和胸腺嘧啶的培养液)中进行培养来筛选HGPRT或TK缺陷型细胞。即，将HAT感受性骨髓瘤细胞用于细胞融合时，可使成功与正常细胞融合的细胞在HAT培养液中选择性增殖。尽管目的杂交瘤之外的细胞(非融合细胞)在死亡，但也有充分的时间利用所述HAT培养液继续培养。具体而言，一般可通过数日-数周的培养来筛选目的杂交瘤。随后，可通过进行常规的有限稀释来对产生目的抗体的杂交瘤进行筛选及单克隆。或可根据国际公开WO03/104453中记载的方法制备识别GRP78的抗体。
可使用公知的基于抗原抗体反应的筛选方法适宜筛选并单克隆目的抗体。例如，向由聚苯乙烯等构成的珠或市售的96孔微孔板等支持物结合抗原，并使与杂交瘤的培养上清进行反应。随即洗涤支持物后使与经酶标记的第二抗体进行反应。如果培养上清中含与致敏抗原反应的抗体，则第二抗体将通过所述抗体与支持物结合。最后可通过检测结合于支持物上的第二抗体来确定培养上清中是否存在目的抗体。通过有限稀释法克隆产生具有针对抗原的结合能力的期望抗体的杂交瘤成为可能。此时可使用诸如用于免疫的抗原，适用实施上相同的GRP78蛋白。
另外，除通过向人以外的动物免疫抗原的所述得到杂交瘤的方法之外，也可通过抗原致敏淋巴细胞来得到目的抗体。具体而言，首先用GRP78蛋白体外致敏人淋巴细胞。接下来，将免疫致敏的淋巴细胞与合适的融合偶体融合。可将例如源于人的具有永久分裂能力的骨髓瘤细胞作为融合偶体(参照特公平1-59878号公报)。通过所述方法得到的抗GRP78抗体是具有与GRP78蛋白的结合活性的人抗体。
再通过向具有全套人抗体基因的转基因动物施用作为抗原的GRP78蛋白而得到抗GRP78人抗体。可通过与合适的偶体的细胞融合或用Epstein-Bar病毒感染等处理使经免疫动物的抗体产生细胞永生化。可从如述得到的永生细胞中分离针对GRP78蛋白的人抗体(参照国际公开WO94/25585、WO93/12227、WO92/03918、WO94/02602)。可通过进一步克隆经永生化的细胞来克隆产生具有目的反应特异性的抗体的细胞。将转基因动物作为免疫动物时，所述动物的免疫系统将人GRP78识别为异物。所以容易得到针对人GRP78的人抗体。可将如述制得的产生单克隆抗体的杂交瘤在常规培养液中继代培养。另外，也可将所述杂交瘤长期保存于液氮中。
可根据常规方法培养所述杂交瘤，并从所述培养上清中得到目的单克隆抗体。或可通过将杂交瘤施用于与之合适的哺乳动物中并增殖，从而从其腹水中得到单克隆抗体。前者的方法适于得到高纯度的抗体。
本发明中也可利用从产生抗体的细胞中克隆的抗体基因编码的抗体。可通过将克隆的抗体基因整合入合适的载体上后导入宿主来表达抗体。用于分离抗体基因、导入载体及转化宿主的方法已被建立(参照例如Vandamme，A.M.et al.，Eur.J.Biochem.(1990)192，767-775)。
例如，可从产生抗GRP78抗体的杂交瘤细胞得到编码抗GRP78抗体的可变区(V区)的cDNA。为此，首先从杂交瘤提取总RNA。从细胞提取mRNA的方法可使用例如胍超速离心法(Chirgwin，J.M.et al.，Biochemistry(1979)18，5294-5299)、AGPC法(Chomczynski，P.et al.，Anal.Biochem.(1987)162.156-159)等。
可使用如mRNA纯化试剂盒(GE Healthcare Bioscience制)纯化提取的mRNA。也有市售的可从细胞直接提取总mRNA的试剂盒，如QuickPrep mRNA纯化试剂盒(GE Healthcare Bioscience制)。也可使用如述试剂盒从杂交瘤得到总mRNA。可使用反转录酶由所得mRNA合成编码抗体V区的cDNA。可使用AMV反转录酶第一链cDNA合成试剂盒(生物化学工业公司制)等合成cDNA。可通过使用5’-Ampli FINDERRACE试剂盒(Clontech制)和PCR的5’-RACE法合成cDNA并进行扩增(Frohman，M.A.et al.，Proc Natl.Acad.Sci.USA(1988)85，8998-9002，Belyavsky，A.et al.，Nucleic Acids Res.(1989)17，2919-2932)。还可在如述合成cDNA的过程中在cDNA的两端导入下述合适的限制性酶切位点。
从所得PCR产物纯化目的cDNA片段，随后连接到载体DNA上。如述制备重组载体，将其导入如大肠杆菌，并在筛选集落后，从形成集落的大肠杆菌制备出期望的重组载体。可使用公知方法(如双脱氧核苷酸链终止法等)确认所述重组载体是否含有目的cDNA碱基序列。
可通过使用用于扩增可变区基因的引物的PCR得到编码可变区的基因。首先将提取出的mRNA作为模板合成cDNA，得到cDNA文库。合成cDNA文库的话，使用市售的试剂盒较为方便。实际上从少数细胞得到的mRNA极少，将其直接纯化则产率低。所以通常在加入已知不含抗体基因的载体RNA后进行纯化。或当可提取一定量的RNA时，可有效提取出产生抗体的细胞的RNA。当从例如≥10、或≥30、优选≥50的产生抗体的细胞提取RNA时，可不必加入载体RNA。
可以所得cDNA文库作为模板，通过PCR法扩增抗体基因。已知用于通过PCR法扩增抗体基因的引物。可根据文献如J.Mol.Biol.(1991)222，581-597等的公开设计用于扩增人抗体基因的引物。这些引物由不同于免疫球蛋白亚类的碱基序列构成。所以在将不明亚类的cDNA文库作为模板时，要在考虑到所有可能性的情况下进行PCR。
具体而言，在要得到例如编码人IgG的基因时，可利用可扩增编码重链γ1-γ5、轻链κ链和λ链的基因的引物。为扩增I gG可变区基因，一般可将与相当于铰链区的部分复性的引物用作3’侧的引物。而可将对应于各亚类的引物用作5’侧的引物。
将由用于扩增重链和轻链的各亚类的基因的引物得到的PCR产物作为各自独立的文库。可利用如述合成的文库重构由重链和轻链组合而成的免疫球蛋白。可以重构而成的免疫球蛋白与GRP78的结合活性作为指标筛选目的抗体。
本发明的抗体与GRP78的结合优选具有特异性。可通过例如如下步骤筛选与GRP78结合的抗体。
(1)使含由获自杂交瘤的cDNA编码的V区的抗体与GRP78接触；
(2)检测GRP78与抗体的结合；及
(3)筛选与GRP78结合的抗体。
已知检测抗体与GRP78的结合的方法。具体而言，使被检抗体与固定于支持物上的GRP78反应，再使识别抗体的标记抗体与所述被检抗体反应。如果可从经洗涤后的支持物上检测到标记抗体，则证明所述被检抗体与GRP78结合。可将过氧化物酶或β-半乳糖苷酶等具有酶活性的蛋白或者FITC等荧光物质用作标记物。也可利用表达GRP78的细胞的固定标本评价抗体的结合活性。
也可将利用噬菌体载体的淘选法用作以结合活性为指标的抗体筛选法。当如上所述将抗体基因作为重链和轻链的亚类的文库得到时，利用噬菌体载体的筛选方法较有利。可将编码重链和轻链的可变区的基因通过合适的配体序列连接成单链Fv(scFv)。可通过将编码scFv的基因插入噬菌体载体得到在表面表达scFv的噬菌体。将此噬菌体与目的抗原接触，并回收与抗原结合的噬菌体，即可回收编码具有目的活性的scFv的DNA。可根据需要重复此操作来浓缩具有目的结合活性的scFv。
本发明所述编码抗体的多核苷酸可编码抗体全长，也可编码抗体的一部分。抗体的一部分指抗体分子的任意部分。以下也将抗体的一部分称为抗体片段。本发明的优选的抗体片段含抗体互补决定区(CDR)。本发明的抗体片段更优选含全部构成可变区的3个CDR。
得到编码目的抗GRP78抗体的V区的cDNA后，用识别插入到所述cDNA两端的限制性酶切位点的限制性内切酶消化所述cDNA。优选的限制性内切酶识别出现在构成抗体基因的碱基序列上的可能性低的碱基序列，并消化。又为将1个拷贝的消化片段以正确的方向插入载体内，优选提供附着末端的限制性内切酶。可通过将经如上所述消化的编码抗GRP78抗体的V区的cDNA插入到合适的表达载体上而得到抗体表达载体。此时，可通过将编码抗体恒定区(C区)的基因与所述编码V区的基因框内融合来得到嵌合抗体。本文所述嵌合抗体指恒定区与可变区源自不同的生物。所以，不仅是如小鼠-人异种嵌合抗体，人-人同种嵌合抗体也属本发明的嵌合抗体。也可通过预先向具有恒定区的表达载体内插入所述V区基因来构建表达嵌合抗体的载体。
具体而言，例如可将编码期望的抗体恒定区(C区)的DNA插入表达载体的5’侧，并设置消化所述V区基因的限制性内切酶的限制性内切酶识别序列。可通过将两者用相同组合的限制性内切酶消化，并进行框内融合来构建表达嵌合抗体的载体。
为制备本发明的抗GRP78抗体，可将抗体基因在受表达调控区的调控下表达的形式整合入表达载体。用于表达抗体的表达调控区包括例如增强子或启动子。然后可通过将所述表达载体转化到合适的宿主细胞来得到表达编码抗GRP78抗体的DNA的重组细胞。
对于抗体基因的表达，可将编码抗体重链(H链)和轻链(L链)的DNA整合入各自不同的表达载体上。可通过将整合了H链和L链的载体共转化到宿主细胞内来表达具有H链和L链的抗体分子。也可将编码H链和L链的DNA整合入单个表达载体内而转化宿主细胞(参照国际公开WO94/11523)。
已知用于将分离的抗体基因导入合适的宿主来制备抗体的宿主和表达载体的组合。可将这些表达系统中的任一种应用于本发明。如果使用真核细胞作为宿主，可使用动物细胞、植物细胞或真菌细胞。具体而言，可用于本发明的动物细胞为例如哺乳动物细胞(CHO、COS、骨髓瘤、BHK(幼仓鼠肾)、Hela、Vero等)、两栖动物细胞(非洲爪蟾卵母细胞等)、昆虫细胞(sf9、sf21、Tn5等)。
已知源于植物细胞，如烟草属(Nicotiana)(如烟草(Nicotianatabacum)等)的细胞的抗体基因表达系统。植物细胞的转化可利用经愈伤组织培养的细胞。
还可使用真菌细胞，如酵母菌属(Saccharomyces)(如酵母(Saccharomyces serevisiae))、毕赤酵母属(Pichia)(如巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris))、曲霉菌属(Aspergillus)(如黑曲霉(Aspergillus niger))等。
也已知利用原核生物的抗体基因表达系统。例如，当使用细菌细胞时，可将诸如大肠杆菌(E.coli)、枯草芽孢杆菌等细菌细胞用于本发明。
使用哺乳动物时，可构建将常用的有用的启动子、待表达的抗体基因、其3’侧下游的多聚A信号功能性连接的表达载体。例如启动子/增强子可例举人巨细胞病毒立即早期启动子/增强子。
另外其它用于本发明的抗体表达的启动子/增强子为例如病毒启动子/增强子、或人延伸因子1α(HEF1α)等源于哺乳动物细胞的启动子/增强子。可利用启动子/增强子的病毒具体有例如反转录病毒、多瘤病毒、腺病毒、猿猴病毒40(SV40)等。
使用SV40启动子/增强子时，可利用Mulligan等的方法(Nature(1979)277，108)。另外，可根据Mizushima等的方法(Nucleic AcidsRes.(1990)18，5322)容易将HEF1α启动子/增强子用于目的基因的表达。
使用大肠杆菌时，可通过将常用的有用的启动子、用于分泌抗体的信号序列及待表达的抗体基因功能性连接来表达所述基因。启动子有例如lacZ启动子、araB启动子。使用lacZ启动子时可利用Ward等的方法(Nature(1989)341，544-546；FASEBJ.(1992)6，2422-2427)。也可根据Better等的方法(Science(1988)240，1041-1043)将araB启动子用于表达目的基因。
当在大肠杆菌的胞质中产生时，可将pe1B信号序列(Lei，S.P.et al.，J.Bacteriol.(1987)169，4379)用作分泌抗体的信号序列。在分离出产生于胞质中的抗体后，使用蛋白质变性剂(如胍的盐酸盐)将抗体重折叠(refold)成具有期望的结合活性的形式。
插入到表达载体的复制原点可源自SV40、多瘤病毒、腺病毒、牛乳头瘤病毒(BPV)等。为增加宿主细胞中基因的拷贝数，还可向表达载体中插入筛选标记。具体而言，可使用如氨基糖苷转移酶(APH)基因、胸苷激酶(TK)基因、大肠杆菌黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(Ecogpt)基因、二氢叶酸还原酶(dhfr)基因等筛选标记。
可通过将这些表达载体导入宿主细胞，并体外或体内培养经转化的宿主细胞来产生目的抗体。可根据公知方法培养宿主细胞。例如，可使用DMEM、MEM、RPMI1640、IMDM作为培养液，还可联用胎牛血清(FCS)等血清补充液。
可通过单独使用或适宜组合使用公知的常规蛋白纯化方法纯化如上所述表达、产生的抗体。例如，可适宜选择、组合亲和柱(如蛋白A柱)、层析柱、过滤、超滤、盐析、透析等分离、纯化抗体(AntibodiesA Laboratory Manual.Ed Harlow，David Lane，Cold Spring HarborLaboratory，1988)。
另外，除上述宿主细胞外，也可将转基因动物用于产生重组抗体。即可从导入了编码目的抗体的基因的动物得到所述抗体。例如，可通过将抗体基因框内插入编码在乳液中固有产生的蛋白的基因内来构建融合基因。可利用例如山羊β酪蛋白等分泌到乳汁中的蛋白。可将含插入了抗体基因的融合基因的DNA片段注入山羊胚中，并将所述经注入的胚导入雌性山羊。可从由接受所述胚的山羊生出的转基因山羊(或其后代)产生的乳汁中得到期望抗体与乳汁蛋白的融合蛋白。为增加转基因山羊产生的含期望抗体的乳汁的量，可对所述转基因山羊适宜使用激素(Ebert，K.M.et al.，Bio/Technology(1994)12，699-702)。可将源于动物抗体的C区用作本发明的重组抗体的C区。例如，可使用小鼠抗体H链C区的Cγ1、Cγ2a、Cγ2b、Cγ3、Cμ、Cδ、Cα1、Cα2、Cε，L链C区的Cκ、Cλ。也可使用小鼠抗体之外的动物抗体，如大鼠、兔、山羊、羊、骆驼、猴等的动物抗体。已知这些抗体的序列。另外，为改善抗体或其产生的稳定性，可对C区进行修饰。根据本发明将抗体施用于人时，可通过人为改变基因重组型抗体来降低针对人的异种抗原性等。基因重组型抗体包括例如嵌合(Chimeric)抗体、人化(Humanized)抗体。
可根据公知方法制备这些经改变的抗体。嵌合抗体指将不同来源的可变区与恒定区连接而成的抗体。例如，由小鼠抗体的重链、轻链的可变区与人抗体的重链、轻链的恒定区构成的抗体是小鼠-人-异种嵌合抗体。可通过将编码小鼠抗体的可变区的DNA与编码人抗体的恒定区的DNA连接，并将其整合入表达载体来制备表达嵌合抗体的重组载体。培养经所述载体转化的重组细胞，并表达整合的DNA来得到培养过程中生产出的所述嵌合抗体。可在嵌合抗体和人化抗体的C区使用人抗体的C区。例如，可将Cγ1、Cγ2、Cγ3、Cγ4、Cμ、Cδ、Cα1、Cα2和Cε用作H链的C区。还可将Cκ和Cλ用作L链的C区。已知这些C区的氨基酸序列，及编码它们的碱基序列。另外，为改善抗体本身、或产生抗体的安全性，可对人抗体的C区进行修饰。
嵌合抗体一般由源于人以外的动物的抗体V区与源于人抗体的C区构成。与此相比，人化抗体则由源于人以外的动物的抗体互补决定区(CDR)与源于人抗体的构架区(FR)及源于人抗体的C区构成。人化抗体由于对人体内的抗原性低，因此可用作本发明的治疗剂的有效成分。
抗体可变区通常由4个构架区(FR)间隔的3个互补决定区(CDR)构成。CDR是实质上决定抗体特异性的区域。CDR的氨基酸序列具有多样性。而构成FR的氨基酸序列，则即便是在具有不同结合特异性的抗体之间，也呈高度相同性。因此，一般情况下，不会由于CDR的移植，而降一种抗体的结合特异性移植给其它抗体。
也将人化抗体称为重构(reshaped)抗体。具体而言，已知将人以外的动物(例如小鼠)的抗体CDR移植于人抗体的人化抗体等。已知用于得到人化抗体的一般的基因重组方法。
具体而言，作为将小鼠抗体的CDR移植到人FR上的方法，已知例如过表达PCR。在过表达PCR中，向用于合成人抗体的FR的引物附加编码待移植小鼠抗体CDR的碱基序列。针对4个FR中的每个使用引物。将小鼠CDR移植于人FR时，一般选择与小鼠FR具有高度相同性的人FR，使与保持CDR的功能无关。即，一般优选利用由与邻接于待移植小鼠CDR的FR的氨基酸序列具有高度相同性的氨基酸序列构成的人FR。
另外，以相互框内连接的形式设计待连接的碱基序列。由各引物各自合成人FR。结果得到在各FR附加了编码小鼠CDR的DNA的产物。可以相互重叠的形式设计编码各产物的小鼠CDR的碱基序列。接下来，将以人抗体基因为模型合成的产物的重叠的CDR部分相互复性而进行互补链合成反应。由所述反应使人FR通过小鼠CDR序列被连接起来。
最后，由复性于连接了3个CDR与4个FR的V区基因的5’端和3’端的附加有合适的限制性内切酶识别序列的引物扩增所述基因的全长。通过将如述得到的DNA与编码人抗体C区的DNA以框内融合的形式插入到表达载体中而制备出用于表达人型抗体的载体。通过建立导入了所述整合载体的重组细胞后，培养所述重组细胞，并表达编码所述人化抗体的DNA来从所述培养细胞的培养物中产生所述人化抗体(参照欧洲专利公开EP 239400、国际公开WO96/02576)。
可通过定性或定量测定、评价如上所述制成的人化抗体与抗原的结合活性来适宜筛选出通过CDR连接时使所述CDR形成良好的抗原结合位点的人抗体的FR。也可根据需要取代FR的氨基酸残基，以使重构人抗体的CDR形成抗原结合位点。例如，可通过用于将小鼠CDR移植于人FR的PCR法向FR导入氨基酸序列变异。具体而言，可向复性于FR的引物中导入部分碱基序列的变异。通过所述引物合成的FR中导入有碱基序列的变异。可通过使用上述方法测定、评价有氨基酸取代的变异型抗体与抗原的结合活性来筛选出具有期望性质的变异FR序列(Sato，K.et al.，Cancer Res，1993，53，851-856)。
也已知得到人抗体的方法。例如，用期望的抗原或表达期望的抗原的细胞体外致敏淋巴细胞。然后，通过将经致敏的淋巴细胞与人骨髓瘤细胞融合而得到具有抗原结合活性的期望的人抗体(参照特公平1-59878)。融合配偶或人骨髓瘤细胞可为例如U266。
另外，可通过用期望的抗原免疫具有全套人抗体基因的转基因动物来得到期望的人抗体(参照国际公开WO93/12227、国际公开92/03918、WO94/02602、WO94/25585、WO96/34096、WO96/33735)。也已知使用人抗体文库通过淘选得到人抗体的技术。例如，可通过噬菌体展示法将人抗体V区在噬菌体表面表达为单链抗体(scFv)，并筛选出与抗原结合的噬菌体。可通过分析筛选出的噬菌体基因来确定编码与抗原结合的人抗体V区的DNA序列。确定与抗原结合的scFv的DNA序列后，可通过将所述V区序列与期望的人抗体C区序列框内融合，然后插入到合适的表达载体内而制备出表达载体。可通过将所述表达载体导入如上所述的合适的表达细胞中，并表达编码所述人抗体的基因来得到所述人抗体。这些方法已公知(国际公开WO92/01047、WO92/20791、WO93/06213、WO93/11236、WO93/19172、WO95/01438、WO95/15388)。
本发明的抗体只要可结合GRP78蛋白，不仅包括以IgG为代表的二价抗体，还包括一家抗体或以IgM为代表的多价抗体。本发明的多价抗体包括具有全相同的抗原结合位点的多价抗体，或者具有部分或全不同的抗原结合位点的多价抗体。本发明的抗体不局限于抗体的全长分子，只要可结合GRP78蛋白，也可为抗体或其修饰物。
经缩减抗体包括缺失全长抗体(例如全长IgG)的一部分的抗体片段。只要能结合GRP78抗原，就允许抗体分子有部分缺失。本发明的抗体片段优选包括重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)中的任一个或两个。VH或VL的氨基酸序列可包含取代、缺失、附加和/或插入。只要能结合GRP78抗原，可缺失VH和VL中的任一个或两个中的一部分。还可将可变区嵌合体化或人化。抗体片段的具体例子可为例如Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv等。经缩减抗体的具体例子可为例如Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv、scFv(单链Fv)、双抗体(Diabody)、sc(Fv)2(单链(Fv)2)等。这些抗体的多体(例如二聚体、三聚体、四聚体、多聚体)也属本发明的经缩减抗体。
可通过用酶处理抗体而产生抗体片段来得到抗体的片段。可产生抗体片段的酶已知例如木瓜蛋白酶、胃蛋白酶或纤溶酶等。也可构建编码这些抗体的基因，将其导入表达载体中后，在合适的宿主细胞中表达(例如参照Co，M.S.et al.，J.Immunol.(1994)152，2968-2976；Better，M.& Horwitz，A.H.Methods in Enzymology(1989)178，476-496；Plueckthun，A.& Skerra，A.Methods in Enzymology(1989)178，476-496；Lamoyi，E.，Methods in Enzymology(1989)121，652-663；Rousseaux，J.et al.，Methods in Enzymology(1989)121，663-669；Bird，R.E.et al.，TIBTECH(1991)9，132-137)。
消化酶切割抗体片段的特定位点而产生下述具有特定结构的抗体片段。对于所述通过酶切得到的抗体片段，如果采用基因工程方法，则可缺失抗体的任意部分：
木瓜蛋白酶消化：F(ab)2或Fab；
胃蛋白酶消化：F(ab’)2或Fab’；
纤溶酶消化：Facb。
双抗体指通过基因融合构建的二价(bivalent)抗体片段(Holliger P et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：6444-6448(1993)、EP404,097号、WO93/11161号等)。双抗体是由2个多肽链构成的二聚体。构成二聚体的各多肽链在相同链中的VL和VH通常由接头连接。双抗体中的接头一般较短，以使VL与VH不相互结合。具体而言，构成接头的氨基酸残基为例如约5个残基。因此，编码在同一多肽链上的VL和VH不形成单链可变区片段，而形成相异的单链可变区片段和双体。结果，双抗体具有了2个抗原结合位点。
可通过连接抗体的H链V区和L链V区来得到scFv。scFv中的H链V区和L链V区由接头、优选肽接头连接(Huston，J.S.et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A，1988，85，5879-5883)。scFv中的H链V区和L链V区可源自本说明书中记载的任意抗体。对连接V区的肽接头无特定限制。可将例如约3-约25个残基的任意单链肽用作接头。可通过例如上述PCR法连接V区。为使用PCR法连接V区，首先将编码所述抗体H链或H链V区的DNA序列和编码所述抗体的L链或L链V区的DNA序列的全长或编码期望的部分的氨基酸序列的DNA用作模板。
可通过使用具有对应于待扩增DNA两端序列的序列的引物对的PCR法分别扩增编码H链和L链V区的DNA。然后使用编码肽接头部分的DNA。也可利用PCR法合成编码肽接头的DNA。此时，向所用引物的5’侧附加可连接独立合成的各V区的扩增产物的碱基序列。接下来利用[H链V区DNA]-[肽接头DNA]-[L链V区DNA]的各DNA和用于装配PCR的引物进行PCR反应。用于装配PCR的引物由复性于[H链V区DNA]的5’侧的引物和复性于[L链V区DNA]的3’侧的引物组合而成。即，用于装配PCR的引物是可扩增编码待合成scFv的全长序列的DNA的引物组。而“肽接头DNA”上附加有可连接各V区DNA的碱基序列。结果，由连接有这些DNA，且用于装配PCR的引物最终生成scFv全长的扩增产物。一旦制成编码scFv的DNA，则可根据常规方法得到含所述DNA的表达载体及经所述表达载体转化的重组细胞。而且，可通过培养所得重组细胞，并表达编码所述scFv的DNA来得到所述scFv。
sc(Fv)2是将2个VH和2个VL通过接头等结合成单链的经缩减抗体(Hudson et al.，J.Immunol.Methods 1999；231：177-189)。可通过将例如scFv通过接头连接来制备sc(Fv)2。
另外，优选以2个VH和2个VL以单链多肽的N端侧为基点以VH、VL、VH、VL([VH]接头[VL]接头[VH]接头[VL])的顺序并列为特征的抗体。
2个VH与2个VL的顺序不特别局限于上述设置，可为任意顺序的并列。例如可为下述设置。
[VL]接头[VH]接头[VH]接头[VL]
[VH]接头[VL]接头[VL]接头[VH]
[VH]接头[VH]接头[VL]接头[VL]
[VL]接头[VL]接头[VH]接头[VH]
[VL]接头[vH]接头[VL]接头[VH]
可将可通过基因工程导入的任意肽接头或合成化合物接头(参照例如Protein Engineering，9(3)，299-305，1996中公开的接头)用作结合抗体可变区的接头。本发明优选肽接头。对肽接头的长度无特定限制，可由本领域技术人员根据需要适宜选择。构成肽接头的氨基酸残基通常为1-100个氨基酸、优选为3-50个氨基酸、更优选为5-30个氨基酸、尤其优选为12-18个氨基酸(例如15个氨基酸)。
只要不阻碍scFv的结合作用，构成肽接头的氨基酸序列可为任意序列。
也可利用合成化学物(化学桥联剂)连接V区。可将桥联肽化合物等中常规使用的桥联剂用于本发明。可使用例如N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)、双琥珀酰亚胺酰辛二酸(DSS)、双(硫代琥珀酰亚胺酰)辛二酸(BS3)、二硫双(琥珀酰亚胺酰丙酸)(DSP)、二硫双(硫代琥珀酰亚胺酰丙酸)(DTSSP)、乙二醇双(琥珀酰亚胺酰琥珀酸)(EGS)、乙二醇双(硫代琥珀酰亚胺酰琥珀酸)(硫代-EGS)、二琥珀酰亚胺酰酒石酸(DST)、二硫代琥珀酰亚胺酰酒石酸(硫代-DST)、双[2-(琥珀酰亚胺基氧基羰基氧基)乙基]砜(BSOCOES)、双[2-(硫代琥珀酰亚胺基氧基羰基氧基)乙基]砜(硫代-BSOCOES)等。
在结合4个抗体可变区时一般需要3个接头。几个接头间可相同或不同。本发明优选的经缩减抗体优选为双抗体或sc(Fv)2。可通过使用酶(例如木瓜蛋白酶、胃蛋白酶等)处理抗体形成抗体片段，或者构建编码所述抗体片段的DNA，将其导入表达载体上后在合适的宿主细胞中表达来得到所述经缩减抗体(参照例如Co，M.S.et al.，J.Immunol(1994)152，2968-2976；Better，M.and Horwitz，A.H.，Methods Enzymol.(1989)178，476-496；Pluckthun，A.and Skerra，A.，Methods Enzymol.(1989)178，497-515；Lamoyi，E.，MethodsEnzymol.(1986)121，652-663；Rousseaux，J.et al.，MethodsEnzymol.(1986)121，663-669；Bird，R.E.and Walker，B.W.，Trends Biotechnol.(1991)9，132-137)。
本发明的抗体可为结合了如聚乙二醇(PEG)等各种分子的经修饰抗体。可通过对本发明的抗体进行化学修饰来得到所述经修饰抗体。本领域已建立了修饰抗体的方法。
本发明的抗体可为双特异性抗体。双特异性抗体指在同一抗体分子内具有识别不同表位的可变区的抗体，其中所述表位可存在于不同分子中，也可存在于同一分子中。即本发明的双特异性抗体可具有识别GRP78分子上的不同表位的抗原结合位点。还可为其中一个识别位点识别GRP78，而另一个识别位点识别伤细胞物质的双特异性抗体。本发明所述“抗体”也包括这些抗体。
本发明也可联合识别GRP78之外的抗原的双特异性抗体。可联合例如识别与GRP78同样特异性表达于靶癌细胞的细胞表面的不同于GRP78的抗原的双特异性抗体。
已知制备双特异性抗体的方法。例如，可通过结合所识别抗原不同的2种抗体来制备双特异性抗体。待结合抗体可为各是具有H链和L链的1/2分子，也可为仅由H链构成的1/4分子。或者可通过融合产生单克隆抗体的杂交瘤而制备产生双特异性抗体的融合细胞。也可通过基因工程方法制备双特异性抗体。
抗体的结合活性
可通过公知方法测定抗体的抗原结合活性(Antibodies ALaboratory Manual.Ed Harlow，David Lane，Cold Spring HarborLaboratory，1988)。例如，可利用ELISA(酶联免疫吸附测定法)、EIA(酶免疫测定法)、RIA(放射免疫测定法)或荧光免疫法等。测定针对在细胞中表达的抗原的抗体的结合活性的方法可例如上述Antibodies A Laboratory Manual的第359-420页中记载的方法。
另外，测定表达于悬浮在如缓冲液等的细胞表面的抗原与针对所述抗原的抗体的结合的方法尤其可利用使用流式细胞仪的方法。所使用的流式细胞仪可为例如FACSCantoTM II、FACSAriaTM、FACSArrayTM、FACSVantageTM SE、FACSCaliburTM(以上均制于BD Biosciences公司)或、EPICS ALTRA HyPerSort、Cytomics FC 500、EPICS XL-MCL ADCEPICS XL ADC、Cell Lab Quanta/Cell Lab Quanta SC(以上均制于Beckman Coulter公司)。
测定被检GRP78抗体针对抗原的结合活性的优选方法之一为例如，用识别待与表达GRP78的细胞反应的被检抗体的经FITC标记的第二抗体进行染色后，用FACSCalibur(BD公司)进行测定，并用CELLQUEST软件(BD公司)分析其荧光强度。
增殖抑制活性
评价或测定基于抗GRP78抗体的抑制细胞增殖的效果的方法可优选为以下方法。评价或测定试管内抑制细胞增值的活性的方法可为以活细胞对加入到培养基中的经[3H]标记的胸苷的摄取作为DNA复制能力的指标的测定方法。更简便的方法有在显微镜下计数将台盼蓝等染料排出细胞外的能力的染料排出法或MTT法。后者利用了活细胞具有可将四硼酸盐MTT(3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-2，5-二苯基四唑溴)转化为蓝色的甲月替产物的能力。更具体而言，向被检细胞的培养液中连同配体一起加入被检抗体，经过一段时间后，向培养液中加入MTT溶液，并静置一段时间以使细胞摄取MTT。结果，黄色化合物MTT被细胞线粒体内的琥珀酸脱水酶转化成蓝色化合物。溶解此蓝色化合物，显色后，测定其吸光度，并将其作为活细胞数的指标。除MTT之外，也可适宜选择已有市售的MTS、XTT、WST-1、WST-8等(nacalaitesque等)。测定活性时，也可使用对照抗体。
另外，评价或测定活体内抑制细胞增殖的活性的方法可利用携带肿瘤的小鼠模型。例如，将表达GRP78的癌细胞移植入非人被检动物的皮内或皮下，从当日或次日起，每日或者每数日静脉内或腹腔内施用被检抗体。期间测定肿瘤大小，从而评价已知细胞增殖的活性。以与在试管内进行的评价相同的方式施用对照抗体，通过施用了抗GRP78抗体的施用组的肿瘤大小相比施用了对照抗体的组的肿瘤大小显著小来判定抑制细胞增殖的活性。将小鼠用作非人被检动物时，可适宜使用经遗传方法使胸腺缺陷而使其T淋巴细胞丧失功能的裸鼠(nu/nu)。可通过使用所述小鼠来排除评价、测定所施用的抗体的抑制细胞增值的活性的过程中的被检动物中T淋巴细胞的干扰。
抑制细胞增殖的方法
本发明提供通过使表达GRP78的细胞与本发明的抗体接触来抑制所述细胞的增殖的方法。如上所述，本发明的抗体是与本发明的细胞增值抑制剂中所含GRP78蛋白结合的抗体。待与抗GRP78抗体接触的细胞只要是表达GRP78的细胞则无特定限制，但优选GRP78位于细胞膜上的细胞，或优选疾病相关细胞。疾病相关细胞的优选例可为癌细胞。存在于恶性肿瘤内的血管内皮细胞(肿瘤血管)也属此类。对目的癌症种类无特定限制，可为例如前列腺癌、乳癌、胰腺癌、肺癌、食道癌、黑素瘤、结肠癌、胃癌、卵巢癌、膀胱癌、脑肿瘤。
使用抗GRP78抗体的递送方法
本发明涉及使用抗GRP78抗体将伤细胞物质递送到细胞内的方法。本发明所用抗体为结合有所述伤细胞物质的抗GRP78抗体。此时优选具有被细胞摄入活性的抗体。可通过使结合有伤细胞物质的抗GRP78抗体与表达GRP78的细胞接触来实施伤细胞物质的递送。对本发明中待递送伤细胞物质的细胞无特定限制，但优选GRP78位于细胞膜上的细胞，或优选疾病相关细胞。疾病相关细胞可为例如癌细胞。存在于恶性肿瘤内的血管内皮细胞(肿瘤血管)也属此类。对目的癌症种类无特定限制，可为例如前列腺癌、乳癌、胰腺癌、肺癌、食道癌、黑素瘤、结肠癌、胃癌、卵巢癌、膀胱癌、脑肿瘤。
本发明所述“接触”可在体外进行，也可在体内进行。此时加入的抗体形态可适宜为溶液或通过冻干等方法得到的固体形态。可为含例如表面活性剂、赋形剂、染料、芳香剂、防腐剂、稳定剂、缓冲剂、悬浮剂、等渗剂、结合剂、崩解剂、润滑剂、助流剂、调味剂等的溶液。对加入的浓度无特定限制，但培养液中的终浓度优选为1pg/ml-1g/ml、更优选为1ng/ml-1mg/ml，更优选为1μg/ml-1mg/ml。
另外，本发明所述体内“接触”可通过向有表达GRP78的细胞移植入体内的非人动物或具有内源性表达GRP78的癌细胞的包括人在内的动物施用来进行。施用方法可为经口、非经口施用中的任一种。尤其优选非经口施用的方法，有关施用方法可具体为例如注射施用、经鼻施用、经肺施用、经皮施用等。可通过注射施用(例如静脉内注射、肌肉内注射、腹腔内注射、皮下注射等)全身或局部施用本发明的药物组合物细胞增值抑制剂及抗癌剂。可根据被检动物的年龄、症状适宜选择施用方法。以水溶液的形式施用时可为仅含抗体的水溶液，也可为含例如表面活性剂、赋形剂、染料、芳香剂、防腐剂、稳定剂、缓冲剂、悬浮剂、等渗剂、结合剂、崩解剂、润滑剂、助流剂、调味剂等的溶液。施用量可选例如每次施用0.0001mg-1000mg/kg的施用量。或者可选例如0.001-100000mg/患者的施用量。但本发明的抗体的施用量不限于这些施用量。
药物组合物
另一方面，本发明的特征在于含结合GRP78蛋白的抗体的药物组合物。本发明的特征还在于含结合GRP78蛋白的抗体的细胞增值抑制剂，尤其是抗癌剂。优选将本发明的细胞增值抑制剂和抗癌剂施用给患癌症的受试者或具有患癌症的可能性的受试者。
本发明的含结合GRP78蛋白的抗体的细胞增值抑制剂可表现为包括将结合GRP78蛋白的抗体施用给受试者的步骤的抑制细胞增值的方法，或结合GRP78蛋白的抗体用于制备细胞增值抑制剂的用途。
另外，本发明的含结合GRP78蛋白的抗体的抗癌剂可表现为包括将结合GRP78蛋白的抗体施用给受试者的步骤的预防或治疗癌症的方法，或结合GRP78蛋白的抗体用于制备抗癌剂的用途。
本发明的药物组合物(例如细胞增值抑制剂、抗癌剂)所含抗体只要可结合GRP78蛋白则无特定限制，可使用本说明书中例示的任意抗体。
本发明的药物组合物的施用方法可通过经口、非经口施用中的任一种进行实施。尤其优选非经口施用的施用方法，相关施用方法具体有例如注射施用、经鼻施用、经肺施用、经皮施用等。注射施用的例子为可通过例如静脉内注射、肌肉内注射、腹腔内注射、皮下注射等全身或局部施用本发明的药物组合物。可根据患者年龄、症状适宜选择施用方法。施用量可选例如每次施用0.0001mg-1000mg/kg的施用量。或者可选例如0.001-100000mg/患者的施用量。但本发明的药物组合物的施用量不限于这些施用量。
可根据常规方法将本发明的药物组合物制成制剂(例如Remington’s Pharmaceutical Science，latest edition，MarkPublishing Company，Easton，U.S.A)，也可为共含药物可接受媒质或添加剂的制剂。所述媒质可为例如表面活性剂、赋形剂、染料、芳香剂、防腐剂、稳定剂、缓冲剂、悬浮剂、等渗剂、结合剂、崩解剂、润滑剂、助流剂、调味剂等，但不限于此，也可适宜使用其它常用载体。具体而言，可为例如轻质无水硅酸、乳糖、结晶纤维素、甘露醇、淀粉、羧甲纤维素钙、羧甲纤维素钠、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、聚乙烯乙醛二乙胺乙酸酯、聚乙烯吡咯烷酮、明胶、中级脂肪酸甘油三酯、聚氧乙烯(60)硬化蓖麻油、白糖、羧甲基纤维素、玉米淀粉、无机盐类等。
药物制备方法
本发明还提供包括下列步骤的制备药物，尤其是抗癌剂的方法。
药物组合物的制备方法，包括下列步骤：
(a)提供抗GRP78抗体；
(b)确认(a)的抗体是否具有被细胞摄入活性；
(c)筛选具有被细胞摄入活性的抗体；
(d)将(c)中筛选出的抗体与伤细胞物质结合。
可通过上述方法确认是否具有被细胞摄入活性。另外，其中所述抗GRP78抗体、伤细胞物质可使用上述抗GRP78抗体、伤细胞物质。
癌症诊断
本发明提供使用抗GRP78抗体的疾病诊断方法，尤其是癌症诊断方法。
本发明的诊断方法可通过检测被摄入细胞内的抗GRP78抗体来进行。用于本发明的抗GRP78抗体优选具有被细胞摄入活性，且优选标记有标记物。
因此，本发明的诊断方法的优选实施方式可为例如使用标记有标记物、且具有被细胞摄入活性的抗GRP78抗体的诊断方法。结合有标记物的抗GRP78抗体可用上述抗GRP78抗体。
对结合抗GRP78抗体的标记物无特定限制，可使用例如荧光染料、酶、辅酶、化学发光物质、放射性物质等本领域技术人员公知的标记物，具体可为例如放射性同位素(32P、14C、125I、3H、131I等)、荧光素、罗丹明、丹酰氯、伞形酮、荧光素酶、过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、β-葡糖苷酶、辣根过氧化物酶、葡糖淀粉酶、溶菌酶、糖氧化酶、微过氧化物酶、生物素等。如果使用生物素作为标记物，则优选在加入经生物素标记的抗体后再加入结合了碱性磷酸酶等酶的抗生物素蛋白。可使用戊二醛法、马来酰亚胺法、吡啶二硫法、过碘酸法等公知方法结合标记物和抗GRP78抗体。
可通过本领域技术人员公知的方法向抗体结合标记物。
在根据本发明的方法诊断的疾病是癌症时对目的癌症种类无特定限制，可为例如前列腺癌、乳癌、胰腺癌、肺癌、食道癌、黑素瘤、结肠癌、胃癌、卵巢癌、膀胱癌、脑肿瘤。
本发明的诊断可在体内进行，也可在体外进行。
体外诊断可通过包括例如下列步骤的方法进行：
(a)提供采自受试者的样品；
(b)使(a)的样品与结合有标记物的抗GRP78抗体接触；
(c)检测被摄入细胞内的抗体。
对所采样品无特定限制，但优选例如采自受试者的细胞、组织等。另外，将采自活体组织或细胞固定的标本或细胞培养液等获自被检样品的二次样品也属本发明的样品。
体内诊断可通过包括例如下列步骤的方法进行：
(a)给受试者施用结合有标记物的抗GRP78抗体；
(b)检测被摄入癌细胞内的抗体。
抗GRP78抗体的施用量由本领域技术人员根据标记物种类、待诊断疾病种类等适宜决定。可根据上述方法将经标记的抗GRP78抗体制成制剂。
本发明还提供包括下列步骤的制备诊断试剂，尤其是癌症诊断试剂的方法：
(a)提供抗GRP78抗体；
(b)确认(a)的抗体是否具有被细胞摄入活性；
(c)筛选具有被细胞摄入活性的抗体；
(d)向(c)中筛选出的抗体结合标记物。
可通过上述方法确认是否具有被细胞摄入活性。另外，其中所述抗GRP78抗体、标记物可使用上述抗GRP78抗体、标记物。
GRP78部分肽
本发明提供由SEQ ID NO：3(GRP78的376号-415号氨基酸)的氨基酸序列构成的多肽或其片段。由SEQ ID NO：3(GRP78的376号-415号氨基酸)的氨基酸序列构成的多肽或其片段可用作制备本发明的抗体的免疫原，或可用于评价制备出的抗体的结合活性。本发明所述“片段”至少为5个氨基酸或更多、优选10个氨基酸或更多，更优选15个氨基酸或更多。对由SEQ ID NO：3的氨基酸序列构成的多肽片段的例子无特定限制，可为由GRP78的384号-391号氨基酸的氨基酸序列构成的片段(由SEQ ID NO：3的9-16氨基酸序列构成的片段)、由GRP78的392号-407号氨基酸的氨基酸序列构成的片段(由SEQ IDNO：3的17-32氨基酸序列构成的片段)、由GRP78的400号-415号氨基酸的氨基酸序列构成的片段(由SEQ ID NO：3的25-40氨基酸序列构成的片段)等。
实施例
实施例1：免疫
1-1.制备免疫原
1-1-1.构建GRP78大肠杆菌表达载体
为构建GRP78大肠杆菌表达载体，首先根据以下方法克隆GRP78基因。首先，以人结肠腺癌cDNA(MTC，多组织cDNA panel，CloneTech)为模板，使用Pyrobest Taq聚合酶(TAKARA)根据以下条件进行RT-PCR来克隆全长GRP78基因。
GRP-1：atgaagctct ccctggtggc(SEQ ID NO：26)
GRP-2：ctacaactca tctttttctg ctgta(SEQ ID NO：27)
(94℃30秒钟、58℃30秒钟、72℃120秒钟，27个循环)
随后，以所得PCR产物为模板，根据以下条件再次进行PCR，得到在SEQ ID NO：1的碱基序列的nt55-1965的GRP78基因片段的5’端、3’端分别附加BamHI、XhoI酶切序列的GRP78 cDNA片段。
GRP-GST-1：aaaggatccg aggaggagga caagaaggag gacgtggg(SEQID NO：28)
GRP-GST-2：tttctcgagc tacaactcat ctttttctgc tgtatcctc(SEQID NO：29)
(94℃30秒钟、64℃30秒钟、72℃120秒钟，25个循环)
将其用BamHI、XhoI酶切后插入到同样经BamHI、XhoI酶切的大肠杆菌GST融合表达载体(pGEX-6P-1，Amersham Pharmacia)的GST编码区下游，从而构建了GRP78-GST融合蛋白表达载体(pGEX-GRP78-全长)。
1-1-2.GST融合GRP78蛋白的表达诱导和纯化
接下来，制备GRP78蛋白用作为得到GRP78结合抗体的免疫原。
首先用pGEX-GRP78-全长转化大肠杆菌(BL21)。将其培养于LB培养基(300ml)中，待OD610达0.5以上时加入IPTG至0.5mM，从而进行蛋白的诱导表达。培养5小时后通过离心收集大肠杆菌。
将收集的大肠杆菌悬浮于30ml的B-BER(PIAS公司)中进行裂解。然后将此经裂解的大肠杆菌裂解物用PBS稀释10倍，并向其中加入经PBS平衡的谷胱甘肽琼脂糖4B(Amersham Pharmacia)，在4℃温育过夜。此后用PBS洗涤数次以除去未吸附蛋白，在蛋白酶反应液(50mMTris-HCl、150mM NaCl、1mM EDTA、1mM DTT、pH7.5)中使PreScissuion蛋白酶(Amersham Pharmacia)于4℃反应过夜。通过此操作将GRP78-GST融合蛋白的GST蛋白与GRP78蛋白(19号-654号氨基酸)切分开。随后，将经蛋白酶消化而洗脱出的GRP78蛋白用Superdex200HR 10 30柱(Amersham Pharmacia)进行凝胶过滤色谱分离，并回收目的GRP78蛋白(19号-654号氨基酸)。
1-2.免疫
通过初次免疫时用完全佐剂(DIFCO：DF263810)，二次免疫之后用不完全佐剂(DIFCO：DF263910)制成GRP78蛋白的乳剂，将其以50μg/小鼠皮下注射给各小鼠[(MRL/1pr、雄性、4周龄)(Balb/c、雌性、6周龄)：均购自日本Charles River]每3只而进行免疫(TERMO注射器1ml、针26G)。初次免疫的2周后实施二次免疫，以后以1周的间隔进行免疫4-5次。GRP78(50μg)悬浮于100μl的PBS中，并通过尾静脉注射进行免疫来进行最后一次免疫，并在3天后进行细胞融合。
1-3.制备杂交瘤
如下进行细胞融合。从小鼠无菌摘出脾脏，在培养液1(RPMI1640+PS)中研磨成单细胞悬液。使其通过70μm的尼龙网(Falcon)而除去脂肪组织等，并进行细胞计数。将所得B细胞与小鼠骨髓瘤细胞(P3U1细胞)以约2∶1的细胞数比例混合，并加入1mL50％PEG(Roche，cat#：783 641)，进行细胞融合。将融合的细胞悬浮于培养液2[RPMI1640+PS、10％FCS、HAT(Sigma，H0262)、5％BMcondimed H1(Roche：#1088947)]中，并以200μL/孔注入合适个(10个)96孔平板中，于37℃进行培养。1周后用培养上清进行杂交瘤的筛选。
实施例2：识别位于细胞膜上的GRP78的抗GRP78抗体的筛选
2-1.由GRP78结合抗体的ELISA的筛选(一次筛选)
为得到位于细胞表面的抗GRP78抗体，首先进行结合GRP78的抗体的筛选。结合抗体的筛选中使用了ELISA。
使包被有1μg/ml由大肠杆菌纯化的GRP78蛋白的ELISA用平板(NUNC)与杂交瘤的培养上清反应，温育1小时。之后与经碱性磷酸酶(AP)标记的抗小鼠IgG(ZYMED：#62-6622)反应1小时后，加入1mg/ml的底物(SIGMA：S0942-50TAB)使显色。用读板仪(BioRad公司)测定OD405，筛选ELISA阳性孔。
2-2.通过FACS对位于细胞表面的抗GRP78抗体的筛选(二次筛选)
通过FACS分析了经一次筛选呈阳性的孔的培养上清对前列腺癌细胞株(DU145)的反应性。
用含10％FCS、1mM丙酮酸钠、0.1mM NEAA的EMEM(invitrogen)对DU145(获自ATCC)进行培养、传代。用1mM EDTA/PBS剥离DU145，使其与杂交瘤的培养上清反应，于4℃温育1小时。然后加入经FITC标记的抗小鼠IgG抗体(BECKMAN COULTER：PN IM0819)，于4℃温育30分钟。然后通过FACS(BD)分析各杂交瘤培养上清对DU145细胞表面的结合活性。
2-3.有限稀释(Limiting dilution)
选择经FACS分析稍微呈现对DU145细胞的结合活性的孔，对其进行有限稀释(Limiting dilution；LD)，使孔中的杂交瘤成单克隆。即测定各孔的细胞数，仪3细胞/孔接种96孔平板。培养约10天后，对形成集落的孔的培养上清再次进行ELISA，以结合活性为指标筛选产生抗体的单克隆。通过此连续操作得到6个克隆的GRP78结合抗体(GA-19抗体、GA-20抗体、GA-21抗体、GA-23抗体、GA-28抗体、GA-31抗体)。
2-4.确定亚型
用IsoStrip(Roche#1 493 027)确定抗体的亚型。亚型确定中使用了经PBS(-)10倍稀释的杂交瘤的培养上清。
以下显示了经纯化的各抗体的亚型。
表1
  抗体   亚型
  GA-19   G1
  GA-20   M
  GA-21   G3
  GA-23   G2a
  GA-28   G1
  GA-31   G1
2-5.抗体的纯化
用Hi Trap蛋白G HP 1mL柱(Amersham Biosciences #17-0404-01)从所得50mL单克隆的杂交瘤的培养上清中纯化GA-19抗体、GA-23抗体、GA-28抗体、GA-31抗体；另外，通过将蛋白L-琼脂糖(SIGMA)1ml填充于开放柱来纯化作为IgM和IgG3的GA-20抗体、GA-21抗体。以1mL/分钟的流速吸附杂交瘤上清，并用20mL 20mM的磷酸缓冲液(pH7.0)洗涤后，用3.5mL 0.1M甘氨酸-HCl(pH2.7)洗脱。将洗脱级分用预先各加入50μL 1M Tris-HCl(pH9.0)的Eppendorf管以每管0.5ml进行回收。测定OD280nm，汇集含抗体的级分，并加入PBS(-)使全量达2.5mL后，使用PD-10柱(Amersham Bioscience#17-0851-01)将缓冲液换成PBS(-)。使经纯化的抗体通过0.22μm滤膜(MILLIPORE #SLGV033RS)，以下详细讨论各经纯化抗体的性质。
实施例3：分析GRP78抗体
3-1.蛋白印迹分析
为确认所得抗体与由大肠杆菌纯化的GRP78(GST-GRP78)及在DU145细胞内表达的GRP78特异性结合而进行的蛋白印迹分析。
向泳道1中加入将DU145细胞(1×106细胞)用300μl NP40裂解缓冲液(0.5％NP40、10mM Tris-HCl、150mM NaCl、5mM EDTA、pH 7.5)裂解的细胞裂解样品，向泳道2中加入由大肠杆菌纯化的GST-GRP78融合蛋白(0.1μg)，并根据定法印迹于PVDF膜上。
将其与各抗体(2μg/ml)反应，并与第二抗体(经HRP标记的抗小鼠IgG)反应后，用ECL蛋白印迹检测试剂(GE Healthcare)检测蛋白。
结果发现，所得各抗体均不仅可识别由大肠杆菌表达的GST-GRP78融合蛋白，还可特异性识别在细胞内内源性表达的GRP78蛋白(图1)。
3-2.FACS解析
3-2-1.与前列腺癌株(DU145)细胞表面的结合活性
通过FACS分析了经纯化的各抗GRP78抗体是否使癌细胞的细胞表面着色。
在FACS缓冲液中将用1mM EDTA剥离的DU145细胞与各抗体(10μg/ml)于4℃下温育1小时。然后加入经FITC标记的抗小鼠IgG抗体(BECKMAN COULTER：PN IM0819)，并于4℃温育30分钟。然后通过FACS(BD)分析了DU145细胞表面向GRP78的结合活性。
结果，在所得6个抗GRP78抗体克隆中2个克隆(GA-20抗体、GA-21抗体)有DU145细胞着色(图2)。
由此证实了GA-20抗体、GA-21抗体识别在癌细胞中表达的GRP78分子的细胞外表位。
GA-20抗体的重链可变区的碱基序列示于SEQ ID NO：4，重链可变区的氨基酸序列示于SEQ ID NO：5，轻链可变区的碱基序列示于SEQID NO：6，轻链可变区的氨基酸序列示于SEQ ID NO：7。且GA-20抗体的重链可变区的CDR1的氨基酸序列示于SEQ ID NO：8，CDR2的氨基酸序列示于SEQ ID NO：9，CDR3的氨基酸序列示于SEQ ID NO：10；轻链可变区的CDR1的氨基酸序列示于SEQ ID NO：11，CDR2的氨基酸序列示于SEQ ID NO：12，CDR3的氨基酸序列示于SEQ ID NO：13。
GA-21抗体的重链可变区的碱基序列示于SEQ ID NO：14，重链可变区的氨基酸序列示于SEQ ID NO：15，轻链可变区的碱基序列示于SEQ ID NO：16，轻链可变区的氨基酸序列示于SEQ ID NO：17。且GA-21抗体的重链可变区的CDR1的氨基酸序列示于SEQ ID NO：18，CDR2的氨基酸序列示于SEQ ID NO：19，CDR3的氨基酸序列示于SEQ ID NO：20；轻链可变区的CDR1的氨基酸序列示于SEQ ID NO：21，CDR2的氨基酸序列示于SEQ ID NO：22，CDR3的氨基酸序列示于SEQ ID NO：23。
3-2-2.评价对其它肿瘤的FACS结合活性
接下来研究了识别位于细胞表面的GRP78的抗体--GA-20抗体对其它肿瘤的FACS反应性。卵巢癌细胞株(ES-2，SKOV3)、乳腺癌细胞株(MCF7)、结肠癌细胞株(LoVo)、前列腺癌细胞株(DU145、LNcap、22Rv1、PC3)购自ATCC，并根据ATCC推荐的培养条件进行培养。使用GA-20抗体(10μg/ml)如上所述对这些细胞进行染色，并进行FACS分析。结果发现不仅是DU145，GA-20抗体海可使LoVo、LNcap、22Rv1等多种癌细胞着色(图3)。
3-2-3.评价对癌细胞之外的细胞的FACS结合活性
其次分析了对癌细胞之外的细胞的FACS结合活性。猴肾细胞(COS7)、人正常成纤维细胞(MRC5)、小鼠原始B细胞(Ba/F3)、小鼠成纤维细胞(NIH3T3)、仓鼠卵巢细胞(DG44)购自ATCC，并在ATCC制定的培养基中进行了培养。用GA-20抗体(10μg/ml)对这些细胞进行染色，并进行FACS分析。同时用NP40裂解缓冲液裂解细胞，并用GA-20抗体(2μg/ml)进行了蛋白印迹分析。结果发现，尽管这些细胞均表达GRP78(图4B)，但均未被FACS着色(图4A)。由此推知，即便细胞表达GRP78，但其只位于如癌细胞等特定细胞的细胞表面。
3-3.分析被细胞摄入活性
3-3-1.通过FACS分析
为确认使细胞表面着色的抗GRP78识别抗体(GA-20抗体、GA-21抗体)是否具有被细胞摄入活性而进行了以下实验。
用1mM EDTA剥离DU145细胞，一方面在FACS缓冲液(含2％FCS、0.05％NaN3的PBS)中与各抗体(10μg/ml)于0℃作用2小时，另一方面在培养液中(含10％FCS的RPMI1640)与各抗体(10μg/ml)于37℃温育2小时。此后通过进行FACS分析用经FITC标记的小鼠IgG检测了残留于细胞表面的抗体。
结果，与任意抗体于37℃反应2小时，均发现细胞表面的抗体消失(图5)。
3-3-2.通过细胞免疫染色分析
为确认所述现象表明抗体不被释放到细胞外而进行了以下实验。向培养于皿中的DU145细胞分别各加入20μg/ml GA-20抗体或作为阴性对照的不与细胞表面结合的GA-31抗体，并于37℃培养3小时。用PBS洗涤后，用甘氨酸缓冲液(0.1M甘氨酸，pH 2.7)洗涤细胞2次，从而除去结合于细胞表面的抗体。此后，用4％多聚甲醛于室温下作用10分钟来固定细胞，随后用0.1％Triton X100于室温下作用5分钟。将其用经FITC标记的小鼠IgG染色，并用荧光显微镜(KEYENCE)观察摄入细胞内的抗体。
结果，可在细胞内检测到具有与细胞表面结合的活性的GA-20抗体，而在细胞内检测不到不与细胞表面结合的GA-31抗体(图6)。结果，通过于37℃培养3小时证实结合于细胞表面的GA-20抗体被摄入细胞内。
实施例4：表位分析
4-1.用于表位作图的GST融合蛋白的制备
4-1-1.用于表位作图的GST融合蛋白的表达载体的制备
为鉴定各抗体的表位，首先构建了将GRP78蛋白分割成各种区域的GST融合蛋白的大肠杆菌表达载体。
4-1-1-1.GST-GRP78-N(19-350)表达载体的构建
pGEX-GRP78-全长为模板，用正向引物GRP-GST-1(SEQ ID NO：28)、反向引物GRP-GST-3(SEQ ID NO：30)以94℃30秒钟、64℃30秒钟、72℃120秒钟×25个循环进行PCR，从而得到在5’端、3’端分别附加有酶切序列BamHI、XhoI的编码GRP78(19号-350号氨基酸)的cDNA片段。
将其用BamHI、XhoI酶切后插入到同样经BamHI、XhoI酶切的大肠杆菌GST融合表达载体(pGEX-6P-1)的GST编码区下游，从而构建了GRP78-GST融合蛋白表达载体(pGEX-GRP78-N(19-350))。
4-1-1-2.GST-GRP78-C(289-654)表达载体的构建
以pGEX-GRP78-全长为模板，用正向引物GRP-GST-4(SEQ ID NO：31)、反向引物GRP-GST-2(SEQ ID NO：29)以94℃30秒钟、64℃30秒钟、72℃120秒钟×25个循环进行PCR，从而得到在5’端、3’端分别附加有酶切序列BamHI、XhoI的编码GRP78(289号-654号氨基酸)的cDNA片段。
将其用BamHI、XhoI酶切后插入到同样经BamHI、XhoI酶切的大肠杆菌GST融合表达载体(pGEX-6P-1)的GST编码区下游，从而构建了GRP78-GST融合蛋白表达载体(pGEX-GRP78-C(289-654))。
4-1-1-3.GST-GRP78-C(289-350)表达载体的构建
以pGEX-GRP78-全长为模板，用正向引物GRP-GST-4(SEQ ID NO：31)、反向引物GRP-GST-3(SEQ ID NO：30)以94℃30秒钟、72℃30秒钟×25个循环进行PCR，从而得到在5’端、3’端分别附加有酶切序列BamHI、XhoI的编码GRP78(289号-350号氨基酸)的cDNA片段。
将其用BamHI、XhoI酶切后插入到同样经BamHI、XhoI酶切的大肠杆菌GST融合表达载体(pGEX-6P-1)的GST编码区下游，从而构建了GRP78-GST融合蛋白表达载体(pGEX-GRP78-C(289-350))。
4-1-1-4.GST-GRP78-C(289-445)表达载体的构建
以pGEX-GRP78-全长为模板，用正向引物GRP-GST-4(SEQ ID NO：31)、反向引物GRP-GST-5(SEQ ID NO：32)以94℃30秒钟、72℃30秒钟×25个循环进行PCR，从而得到在5’端、3’端分别附加有酶切序列BamHI、XhoI的编码GRP78(289号-445号氨基酸)的cDNA片段。
将其用BamHI、XhoI酶切后插入到同样经BamHI、XhoI酶切的大肠杆菌GST融合表达载体(pGEX-6P-1)的GST编码区下游，从而构建了GRP78-GST融合蛋白表达载体(pGEX-GRP78-C(289-445))。
4-1-1-5.GST-GRP78-C(289-538)表达载体的构建
以pGEX-GRP78-全长为模板，用正向引物GRP-GST-4(SEQ ID NO：31)、反向引物GRP-GST-6(SEQ ID NO：33)以94℃30秒钟、72℃30秒钟×25个循环进行PCR，从而得到在5’端、3’端分别附加有酶切序列BamHI、XhoI的编码GRP78(289号-538号氨基酸)的cDNA片段。
将其用BamHI、XhoI酶切后插入到同样经BamHI、XhoI酶切的大肠杆菌GST融合表达载体(pGEX-6P-1)的GST编码区下游，从而构建了GRP78-GST融合蛋白表达载体(pGST-GRP78-C(289-538))。
4-1-1-6.GST-GRP78(345-385)表达载体的构建
以pGEX-GRP78-全长为模板，用正向引物GRP-GST-7(SEQ ID NO：34)、反向引物GRP-GST-8(SEQ ID NO：35)以94℃30秒钟、64℃30秒钟、72℃30秒钟×25个循环进行PCR，从而得到在5’端、3’端分别附加有酶切序列BamHI、XhoI的编码GRP78(345号-385号氨基酸)的cDNA片段。
将其用BamHI、XhoI酶切后插入到同样经BamHI、XhoI酶切的大肠杆菌GST融合表达载体(pGEX-6P-1)的GST编码区下游，从而构建了GRP78-GST融合蛋白表达载体(pGEX-GRP78(345-385))。
4-1-1-7.GST-GRP78(376-415)表达载体的构建
以pGEX-GRP78-全长为模板，用正向引物GRP-GST-9(SEQ ID NO：36)、反向引物GRP-GST-10(SEQ ID NO：37)以94℃30秒钟、64℃30秒钟、72℃30秒钟×25个循环进行PCR，从而得到在5’端、3’端分别附加有酶切序列BamHI、XhoI的编码GRP78(376号-415号氨基酸)的cDNA片段。
将其用BamHI、XhoI酶切后插入到同样经BamHI、XhoI酶切的大肠杆菌GST融合表达载体(pGEX-6P-1)的GST编码区下游，从而构建了GRP78-GST融合蛋白表达载体(pGEX-GRP78(376-415))。
4-1-1-8.GST-GRP78(406-445)表达载体的构建
pGEX-GRP78-全长为模板，用正向引物GRP-GST-11(SEQ ID NO：38)、反向引物GRP-GST-5(SEQ ID NO：32)以94℃30秒钟、64℃30秒钟、72℃30秒钟×25个循环进行PCR，从而得到在5’端、3’端分别附加有酶切序列BamHI、XhoI的编码GRP78(406号-445号氨基酸)的cDNA片段。
将其用BamHI、XhoI酶切后插入到同样经BamHI、XhoI酶切的大肠杆菌GST融合表达载体(pGEX-6P-1)的GST编码区下游，从而构建了GRP78-GST融合蛋白表达载体(pGEX-GRP78(406-445))。
4-1-1-9.GST-GRP78(345-445)表达载体的构建
以pGEX-GRP78-全长为模板，用正向引物GRP-GST-7(SEQ ID NO：34)、反向引物GRP-GST-5(SEQ ID NO：32)以94℃30秒钟、64℃30秒钟、72℃30秒钟×25个循环进行PCR，从而得到在5’端、3’端分别附加有酶切序列BamHI、XhoI的编码GRP78(345号-445号氨基酸)的cDNA片段。
将其用BamHI、XhoI酶切后插入到同样经BamHI、XhoI酶切的大肠杆菌GST融合表达载体(pGEX-6P-1)的GST编码区下游，从而构建了GRP78-GST融合蛋白表达载体(pGEX-GRP78(345-445))。
以下列出所使用的引物序列。
GRP-GST-1：aaaggatccg aggaggagga caagaaggag gacgtggg(SEQID NO：28)
GRP-GST-2：tttctcgagc tacaactcat ctttttctgc tgtatcctc(SEQID NO：29)
GRP-GST-3：tttctcgagc taatcagaat cttccaacac tttctggacg ggc(SEQ ID NO：30)
GRP-GST-4：aaaggatccc ggcgcgaggt agaaaaggcc aaac(SEQ IDNO：31)
GRP-GST-5：ttctcgagct aggtaggcac cactgtgttc cttgg(SEQ IDNO：32)
GRP-GST-6：ttctcgagct agatttcttc aggtgtcagg cgatt(SEQ IDNO：33)
GRP-GST-7：tttggatccg tgttggaaga ttctgatttg aaga(SEQ IDNO：34)
GRP-GST-8：ttctcgagct aggatggttc cttgccattg aagaa(SEQ IDNO：35)
GRP-GST-9：aaaggatcca aagagttctt caatggcaagga(SEQ ID NO：36)
GRP-GST-10：ttctcgagct ataccaggtc acctgtatct tgatc(SEQ IDNO：37)
GRP-GST-11：aaaggatcct ctggtgatca agatacaggt gac(SEQ IDNO：38)
4-1-2.各GST融合GRP78蛋白的表达诱导
用如述构建的大肠杆菌表达载体分别转化大肠杆菌BL21株。将这些大肠杆菌培养于LB培养基(各1ml)，并在对数生长期加入IPTG(最终1mM)来诱导蛋白表达。4-5小时后回收大肠杆菌，将其裂解于SDS样品缓冲液(0.5ml)中而形成裂解物，此后将5μl根据定法进行SDS-PAGE，并印迹于PVDF膜上，从而用于蛋白印迹。
4-2.各抗体的表位作图
使用如上所述制备的GRP78蛋白的各区域GST融合蛋白进行蛋白印迹，并研究所得各抗GRP78抗体识别GRP78蛋白的哪个区域。
根据最初的蛋白印迹结果(图7)，未使细胞FACS着色的GA-19抗体识别N端侧(19-350)，而GA-23抗体、GA-28抗体、GA-31抗体识别C端的538-654区域。
而蛋白印迹着色图案显示使细胞FACS着色的GA-20抗体、GA-21抗体识别350号-445号氨基酸的跨约100个氨基酸的区域。
制备将所述350号-445号氨基酸区域分割成3个区域的GST融合蛋白同上进行蛋白印迹分析而进行GA-20抗体、GA-21抗体的结合区域的鉴定。结果发现GA-20抗体、GA-21抗体的表位是GRP78蛋白内的376号-415号氨基酸的40个氨基酸(图8)。
实施例5：制备利用了识别细胞外区域的抗GRP78抗体(GA-20抗体)的细胞死亡诱导剂
5-1.GA-20抗体可变区的克隆及其氨基酸序列测序
用Trizol(#15596-018，Life technologies)从约5×106个杂交瘤纯化总RNA。使用SMART RACE cDNA扩增试剂盒(CLONTECH#PT3269-1)根据随附的手册从1μg所得总RNA合成全长cDNA。以所得cDNA为模板，使用Advantage 2PCR酶系统(CLONTECH #PT3281-1)，在以下条件下进行PCR而扩增了编码GA-20抗体的重链(VH)和轻链(VL)可变区的基因。
用于克隆轻链可变区的引物
通用引物混合物(UPM)～k(VL-k)
UPM：试剂盒随附
VL-k：gct cac tgg atg gtg gga aga tg(SEQ ID NO：39)
用于克隆重链可变区的引物
UPM～VH-M
UPM：试剂盒随附
VH-M：cca cca gat tct tat cag aca gg(SEQ ID NO：40)
94℃5秒钟、72℃2分钟，5个循环
94℃5秒钟、70℃10秒钟、72℃2分钟，5个循环
94℃5秒钟、68℃10秒钟、72℃2分钟，27个循环
将如上所述扩增的基因片段TA-克隆于pCRII-TOPO(InvitrogenTOPO TA-克隆试剂盒，#45-0640)，随后用ABI3730测序仪测定各插入子的碱基序列。
5-2.经毒素标记的GA-20_单链Fv抗体(GA20_PE40)的制备
5-2-1.GA20_PE40表达载体的制备
5-2-1-1.pET22b_His_PE40的制备
基于特异性识别位于细胞表面的GRP78的抗体--GA-20抗体尝试制备了标记了免疫毒素(PE40)的细胞死亡诱导抗体。
首先构建了编码在GA-20抗体的单链Fv(scFv)上附加了毒素(PE40)的经毒素标记的抗体(GA20_PE40)表达载体。以购自ATCC的质粒DNA(pJH8)为模板，在以下条件下进行PCR而扩增了作为免疫毒素的PE40的基因。
使用5’端有EcoRI识别序列，接下来附加了由18个氨基酸构成的接头序列的正向引物(PE-1)及5’端有NotI识别序列，接下来附加了终止密码子、ER移位信号序列(KDEL)、FLAG标签序列的反向引物(PE-2)，在10×KOD-Plus缓冲液、2mM dNTP、25mM MgSO4、KOD-Plus(TAKARA公司)中以
98℃10秒钟、72℃5秒钟、68℃4分钟，5个循环
98℃10秒钟、70℃5秒钟、68℃4分钟，5个循环
98℃10秒钟、68℃4分钟，25个循环
进行PCR扩增。引物序列如下所示。
PE-1：taagaattcg gtggcgcgcc ggagttcccg aaaccgtccaccccgccggg ttcttctggt ttagagggcg gcagcctggc cgcgctg(SEQ ID NO：41)
PE-2：acttagcggc cgctcactac agttcgtctt tcttatcgtcgtcatccttg tagtccggcg gtttgccggg ctggc(SEQ ID NO：42)
用pGEM-T Easy Vector System I(Promega公司制)将所述PCR反应的扩增产物插入pGEM-T easy中。由ABI3730测序仪进行序列测定。
之后，向大肠杆菌表达载体--pET22b载体(Novagen公司制)的Pe1B信号序列下插入His标签序列、HindIII识别序列、EcoRI识别序列、NotI识别序列而制备pET22b_His。
然后，用EcoRI、NotI消化通过PCR扩增克隆到pGEM-T easy中的PE40基因后由琼脂糖凝胶分离，将其基因片段插入pET22b_His的EcoRI-NotI间，从而制成pET22b_His_PE40。
5-2-1-2.pET22b_His_GA20scFv-PE40的构建
在以下条件下对编码GA20抗体的单链Fv，即由15个氨基酸构成的接头序列((GlyGlyGlyGlySer)3)(SEQ ID NO：43)连接的GA-20抗体的重链可变区和轻链可变区的基因片段进行PCR扩增。
首先，将TA-克隆于pCRII-TOPO的GA-20抗体的重链可变区为模板，对重链可变区使用正向引物(GA20-1，SEQ ID NO：44)、反向引物(GA20-2，SEQ ID NO：45)，而对轻链可变区使用正向引物(GA20-3，SEQ ID NO：46)、反向引物(GA20-4，SEQ ID NO：47)，用pyrobestDNA聚合酶(TAKARA#R005)，于94℃反应1分钟后，以94℃30分钟、72℃30分钟、25个循环进行了PCR扩增。
接下来用S-300HR柱(Amersham Biosciences #27-5130-01)纯化所得重链和轻链可变区的PCR产物，各取1μL混合于同一管中，并用pyrobest DNA聚合酶于94℃反应1分钟后，94℃30分钟、72℃30分钟、5个循环进行了PCR扩增。
用引物GA20-1(SEQ ID NO：44)、GA20-4(SEQ ID NO：47)对1μL复性后的反应液，在以下条件下用pyrobest DNA聚合酶于94℃反应1分钟后，以94℃30分钟、72℃1分钟、25个循环进行了PCR扩增。
用S-400HR柱(Amersham Biosciences #27-5140-01)纯化扩增出的片段，用EcoRI-HindIII酶切，并用琼脂糖凝胶分离。将其插入到5-2-1-1中制备的pET22b_His_PE40的HindIII、EcoR之间，确认碱基序列，从而制成pET22b_His_GA20scFv-PE40。
所用引物序列如下所示：
GA20-1：aaaagcttga ggtccagctg caacagtctg g(SEQ ID NO：44)
GA20-2：cccgaaccac caccacccga accaccacca cctgaggagacggtgactga ggttcc(SEQ ID NO：45)
GA20-3：tggttcgggt ggtggtggtt cgggtggtgg cggatcggacattgtgatgt cacagtctcc atcct(SEQ ID NO：46)
GA20-4：ttgaattctt tgatttccag cttggtgcct c(SEQ ID NO：47)
所得GA20_PE40的碱基序列示于SEQ ID NO：24，所述碱基序列对应的氨基酸序列示于SEQ ID NO：25。
5-2-2.经毒素标记的GA-20_单链Fv抗体(GA20_PE40)的纯化
将经pET22b_His_GA20scFv-PE40转化的大肠杆菌BL21株接种于含50μg/ml氨苄西林的LB琼脂平板上。挑选生成的单菌落，培养于含50μg/ml羧苄西林(CosmoBio)的LB培养基(3ml)。培养4小时后，将生成的菌扩大到含200ml羧苄西林(50μg/ml)的LB培养基中继续培养。达对数生长期时，将培养液换成新鲜的LB培养基(加入了200ml羧苄西林)，并加入IPTG(终浓度1mM)来进行蛋白的表达诱导。培养5小时后，通过离心回收菌。
在完全无EDTA的蛋白酶抑制剂(Roche)的存在下裂解悬浮于20mlB-BER(PIAS公司)的菌，通过离心除去不溶蛋白后制成细胞裂解物。将所述细胞裂解样品施于HisTrap柱(HiTrap鳌合HP 1ml，AmershamPharmacia)，根据产品说明书纯化GA20_PE40。即，用结合缓冲液(20mM磷酸钠、0.5M NaCl、10mM咪唑，pH7.4)洗涤吸附到柱上的蛋白，用洗脱缓冲液(20mM磷酸钠、0.5M NaCl、500mM咪唑，pH 7.4)以每个级分500μl分取7个级分来进行洗脱。
为确认目的经毒素标记的GA20抗体从哪个级分洗脱出，通过对洗脱出的各级分进行以GRP78结合活性为指标的ELISA测定来研究了洗脱级分的结合活性。如下进行ELISA。向包被有1μg/ml由大肠杆菌纯化的GST-GRP78或阴性对照HB-EGF蛋白(R&D公司)的平板(NUNC)加入经稀释缓冲液(1％BSA、50mM Tris、1mM MgCl2、150mM NaCl、0.05％Tween20)40倍稀释的各级分。于室温下反应1小时后，用TBS-T(TBS-0.05％Tween20)洗涤平板3次，加入1μg/ml抗Flag抗体(M2抗体、Sigma)，并于室温下温育1小时。再用TBS-T洗涤3次，与经碱性磷酸酶标记的抗小鼠IgG(ZYMED)反应1小时后，用1mg/ml底物(Sigma)进行显色。
结果，在洗脱级分2、3(Elute2、3)检测到GRP78特异性结合活性，从而证实在洗脱级分2、3中浓含GA20-PE40蛋白(图9下)。
之后将洗脱级分2、3、4用PD-10柱(GE Healthcare)，根据产品说明书将缓冲液换成PBS。使这些通过0.22μm滤膜(Millipore)进行过滤除菌后用于分析伤细胞活性。
5-3.分析经毒素标记的抗GRP78抗体(GA20-PE40)的抗肿瘤活性
对所得GA20-PE40的细胞死亡诱导活性进行了分析。
将仓鼠卵巢细胞DG44以1×103细胞/孔，将前列腺癌细胞株DU145、22Rv1以6×103细胞/孔，以90μl/孔接种96孔平板。次日，以10μl/孔加入GA20-PE40级分(洗脱级分2、3、4)和PBS，并在37℃下进行培养。5天后，用WST-8(同仁化学)试剂测定活细胞数，将与对照(加入了PBS的组)相比的活细胞比例数值化而制成坐标图。
结果，与全然检测不到GA20-PE40对DG44细胞生长的影响(图10C)相比，在2种前列腺癌细胞株(DU145、22Rv1)则由检测到GRP78结合活性的洗脱级分2、3呈现伤细胞活性(对于DU145见图10A，对于22Rv1见图10B)。
此结果表明针对GRP78的细胞外表位(350-445)的抗体可用作抗肿瘤剂。
实施例6：通过再次免疫得到抗GRP78抗体
6-1.制备免疫原GST-GRP78(376-415)蛋白
从实施例4记载的以上分析可推知，由GRP78蛋白的376号-415号氨基酸构成的区域是GRP78的细胞外区域。因此以下将所述区域再免疫，尝试制备了识别GRP78的细胞外区域的亲和性强的抗体。
首先，将经实施例4中记载的GST-GRP78(376-415)表达载体(pGEX-GRP78(376-415))转化的大肠杆菌(BL21)培养于LB培养基(250ml)中，待OD610达到0.5以上时用IPTG(1mM)诱导蛋白表达。收集培养5小时后的大肠杆菌，25ml的B-PER(PIAS)中进行裂解。接下来，对所述经裂解的大肠杆菌裂解物用PBS稀释10倍，并向其中加入经PBS平衡的谷胱甘肽琼脂糖4B(Amersham Pharmacia)，在4℃温育过夜。此后将谷胱甘肽琼脂糖4B用PBS洗涤数次以除去未吸附蛋白，用20mM谷胱甘肽洗脱出目的蛋白。
洗脱级分经SDS-PAGE后，用CBB进行染色，汇集含目的蛋白的级分。将所述样品再用凝胶过滤层析(Superdex 200 16/60，GEHealthcare)在PBS中分离不纯蛋白，仅将目的蛋白高纯度纯化。将所述经纯化的蛋白作为免疫原用于以下实验。
6-2.GST-GRP78(376-415)蛋白的免疫
将实施例6-1中纯化的GST-GRP78(376-415)根据与实施例1-2相同的方法免疫小鼠[(MRL/1pr，雄性，4周龄)(Balb/c，雌性，6周龄)：均购自日本Charles River]。如实施例1-3所记载制备杂交瘤。
6-3.抗GRP78抗体的筛选
6-3-1.MBP-GRP78(376-415)蛋白的纯化
如下制备GRP78(376号-415号氨基酸)与麦芽糖结合蛋白(MBP)的融合蛋白(MBP-GRP78(376-415))。
将实施例4中制成的pGEX-GRP78(376-415)用BamHI-SalI进行酶切，切下编码GRP78(376-415)的基因片段。将其插入pMAL-c2X(New England BioLabs)的BamHI-SalI之间，从而构建了MBP-GRP78(376-415)表达载体pMAL-c2X-GRP78(376-415)
接下来，将经所述载体转化的大肠杆菌BL21株培养于LB培养基(250ml)中，待OD610达到0.5以上时用IPTG(1mM)诱导蛋白表达。离心收集培养5小时后的大肠杆菌，25ml的B-PER(PIAS)中进行裂解。接下来，对所述经裂解的大肠杆菌裂解物用柱缓冲液(20mM Tris、pH 7.5、200mM NaCl、1mM EDTA)稀释5倍，并向其中加入经柱缓冲液平衡的直链淀粉树脂(New England BioLabs)，在4℃温育过夜。此后，用柱缓冲液洗涤直链淀粉树脂数次，以除去未吸附蛋白，并用洗脱缓冲液(含10mM麦芽糖的柱缓冲液)洗脱目的蛋白。洗脱级分经SDS-PAGE后，通过CBB染色鉴定含目的蛋白的级分，将这些级分汇合后，用PD10柱将缓冲液换成PBS。将此经纯化的MBP-GRP78(376-415)在下列实验中用于结合抗体的ELISA筛选。
6-3-2.通过GRP78结合抗体的ELISA进行筛选(一次筛选)
用包被有1μg/ml实施例6-3-1中纯化的MBP-GRP78(376-415)的ELISA平板筛选结合GRP78蛋白的376号-415号氨基酸的区域的抗体。
方法如实施例2-1所记载。将经以与MBP-GRP78(376-415)蛋白的结合活性为指标的一次筛选而缩小范围的GRP78结合抗体再如下所述进行二次筛选。
6-3-3.通过FACS筛选位于细胞表面的抗GRP78抗体(二次筛选)
将经一次筛选所得GRP78结合抗体再以与前列腺癌细胞株(DU145和22Rv1(ATCC CRL-2505))的结合活性为指标进行了二次筛选。方法如实施例2-2所记载。
结果又新发现使前列腺癌细胞株FACS着色的4种抗体：GC-18抗体、GC-20抗体、GD-4抗体、GD-17抗体。
根据实施例2-3记载的方法对这些抗体进行有限稀释，并使成单克隆。根据实施例2-4所记载的方法确定这些抗体的亚型。各抗体的亚型如下所示。
表2
  抗体   亚型
  GC-18   G1
  GC-20   G1
  GD-4   G1
  GD-17   G1
接下来根据实施例2-5所记载的方法纯化抗体，以下对抗体性质详细分析。
6-4.分析通过再免疫新得到的抗体
6-4-1.FACS分析
为确认经纯化的4种抗体可使癌细胞的细胞表面着色，用前列腺癌细胞株(22Rv1)进行了FACS分析。用各抗体(10μg/ml)染色细胞，并根据实施例3-2-1所记载的方法进行了FACS分析。
结果发现，这些抗体均与22Rv1细胞的细胞表面结合(图11)。
6-4-2.表位作图
由于所得4种抗体是通过用GST-GRP78(376-415)进行免疫而得到的抗体，所以是识别GRP78的376号-415号氨基酸的部分区域的抗体。所以接下来，将所述区域再分成图12A所示4个区域(376号-391号氨基酸(即SEQ ID NO：3的1号-16号氨基酸)、384号-399号氨基酸(即SEQ ID NO：3的9号-24号氨基酸)、392号-407号氨基酸(即SEQ ID NO：3的17号-32号氨基酸)、400号-415号氨基酸(即SEQ ID NO：3的25号-40号氨基酸))，分析了4种抗体分别识别GRP78的376号-415号氨基酸中的哪个序列。
6-4-2-1.用于表位作图的GST融合蛋白的制备
6-4-2-1-1.用于表位作图的GST融合蛋白表达载体的构建
首先，如下制备分别编码由GRP78蛋白的376号-391号氨基酸、384号-399号氨基酸、392号-407号氨基酸及400号-415号氨基酸构成的区域的DNA片段。
通过复性寡聚体(GEP1/GEP2，分别为SEQ ID NO：48和49)来制备编码GRP78(376-391)(即SEQ ID NO：3的1号-16号氨基酸)的DNA片段；通过复性寡聚体(GEP3/GEP4，分别为SEQ ID NO：50和51)来制备编码GRP78(384-399)(即SEQ ID NO：3的9号-24号氨基酸)的DNA片段；通过复性寡聚体(GEP5/GEP6，分别为SEQ IDNO：52和53)来制备编码GRP78(392-407)(即SEQ ID NO：3的17号-32号氨基酸)的DNA片段；通过复性寡聚体(GEP7/GEP8，分别为SEQ ID NO：54和55)来制备编码GRP78(400-415)(即SEQ ID NO：3的25号-40号氨基酸)的DNA片段。
以下列出所用寡聚体序列。
GEP1：gatccaaaga gttcttcaat ggcaaggaac catcccgtggcataaaccca gatc(SEQ ID NO：48)
GEP2：tcgagatctg ggtttatgcc acgggatggt tccttgccattgaagaactc tttg(SEQ ID NO：49)
GEP3：gatccccatc ccgtggcata aacccagatg aagctgtagcgtatggtgct gctc(SEQ ID NO：50)
GEP4：tcgagagcag caccatacgc tacagcttca tctgggtttatgccacggga tggg(SEQ ID NO：51)
GEP5：gatccgaagc tgtagcgtat ggtgctgctg tccaggctggtgtgctctct ggtc(SEQ ID NO：52)
GEP6：tcgagaccag agagcacacc agcctggaca gcagcaccatacgctacagc ttcg(SEQ ID NO：53)
GEP7：gatccgtcca ggctggtgtg ctctctggtg atcaagatacaggtgacctg gtac(SEQ ID NO：54)
GEP8：tcgagtacca ggtcacctgt atcttgatca ccagagagcacaccagcctg gacg(SEQ ID NO：55)
将所制DNA片段插入经BamHI、XhoI酶切的大肠杆菌GST融合表达载体(pGEX-6P-1)的GST编码区下游而构建了编码各区域的GRP78-GST融合蛋白表达载体(分别为pGEX-GRP78(376-391)、pGEX-GRP78(384-399)、pGEX-GRP78(392-407)、pGEX-GRP78(400-415))。
6-4-2-1-2.各GST融合GRP78蛋白的表达诱导
用如述构建的大肠杆菌表达载体转化大肠杆菌BL21株，并根据实施例4-1-2所记载的方法进行蛋白的表达诱导。结果如图12B所示，证实目的蛋白在大肠杆菌中表达。然后用所述蛋白用于下述表位作图。
6-4-2-2.各抗体的表位作图
用如上所述制备的GST融合蛋白进行蛋白印迹分析，以分析所得各抗GRP78抗体识别GRP78蛋白的哪个区域。
从蛋白印迹的染色图案(图13)得知，GD-17抗体识别跨GRP78的384号-391号氨基酸的区域，GC-18抗体和GC-20抗体识别跨GRP78的392号-407号氨基酸的区域，而GD-4抗体识别跨GRP78的400号-415号氨基酸的区域。且得知，初期得到的GA-20抗体也与GD-4抗体识别同一区域(图13)。
6-4-3.可变区克隆及氨基酸序列测定
根据实施例5-1所记载的方法进行新得到的抗体(GC-18抗体、GC-20抗体、GD-4抗体、GD-17抗体)的可变区克隆和氨基酸序列测定。但由于这些抗体均为IgG1，可用下列VH-G1引物(SEQ ID NO：56)：
VH-G1：cca cca gat tct tat cag aca gg(SEQ ID NO：56)
克隆重链可变区。
将扩增的轻链和重链基因片段TA-克隆于pCRII-TOPO(Invitrogen TOPO TA-克隆试剂盒，#45-0640)，随后确认各插入子的碱基序列。
与跨GRP78的392号-407号氨基酸的区域结合的GC-18抗体的重链可变区的碱基序列示于SEQ ID NO：57，重链可变区的氨基酸序列示于SEQ ID NO：58；轻链可变区的碱基序列示于SEQ ID NO：59，轻链可变区的氨基酸序列示于SEQ ID NO：60。另外，GC-18抗体的重链可变区的CDR1的氨基酸序列示于SEQ ID NO：61，CDR2的氨基酸序列示于SEQ ID NO：62，CDR3的氨基酸序列示于SEQ ID NO：63；轻链可变区的CDR1的氨基酸序列示于SEQ ID NO：64，CDR2的氨基酸序列示于SEQ ID NO：65，CDR3的氨基酸序列示于SEQ ID NO：66。
与跨GRP78的392号-407号氨基酸的区域结合的GC-20抗体的重链可变区的碱基序列示于SEQ ID NO：67，重链可变区的氨基酸序列示于SEQ ID NO：68；轻链可变区的碱基序列示于SEQ ID NO：69，轻链可变区的氨基酸序列示于SEQ ID NO：70。另外，GC-20抗体的重链可变区的CDR1的氨基酸序列示于SEQ ID NO：71，CDR2的氨基酸序列示于SEQ ID NO：72，CDR3的氨基酸序列示于SEQ ID NO：73；轻链可变区的CDR1的氨基酸序列示于SEQ ID NO：74，CDR2的氨基酸序列示于SEQ ID NO：75，CDR3的氨基酸序列示于SEQ ID NO：76。
与跨GRP78的400号-415号氨基酸的区域结合的GD-4抗体的重链可变区的碱基序列示于SEQ ID NO：77，重链可变区的氨基酸序列示于SEQ ID NO：78；轻链可变区的碱基序列示于SEQ ID NO：79，轻链可变区的氨基酸序列示于SEQ ID NO：80。另外，GD-4抗体的重链可变区的CDR1的氨基酸序列示于SEQ ID NO：81，CDR2的氨基酸序列示于SEQ ID NO：82，CDR3的氨基酸序列示于SEQ ID NO：83；轻链可变区的CDR1的氨基酸序列示于SEQ ID NO：84，CDR2的氨基酸序列示于SEQ ID NO：85，CDR3的氨基酸序列示于SEQ ID NO：86。
与跨GRP78的384号-391号氨基酸的区域结合的GD-17抗体的重链可变区的碱基序列示于SEQ ID NO：87，重链可变区的氨基酸序列示于SEQ ID NO：88；轻链可变区的碱基序列示于SEQ ID NO：89，轻链可变区的氨基酸序列示于SEQ ID NO：90。另外，GD-4抗体的重链可变区的CDR1的氨基酸序列示于SEQ ID NO：91，CDR2的氨基酸序列示于SEQ ID NO：92，CDR3的氨基酸序列示于SEQ ID NO：93；轻链可变区的CDR1的氨基酸序列示于SEQ ID NO：94，CDR2的氨基酸序列示于SEQ ID NO：95，CDR3的氨基酸序列示于SEQ ID NO：96。
实施例7：对经毒素标记的GD17单链抗体(GD17_scFv-PE40)的药效的分析
7-1.构建GD17_scFv-PE40表达载体
在以下条件下对编码GD-17抗体的单链Fv，即由15个氨基酸构成的接头序列((GlyGlyGlyGlySer)3)(SEQ ID NO：43)连接的GD-17抗体的重链可变区和轻链可变区的基因片段进行PCR扩增。
首先，将TA-克隆于pCRII-TOPO的GD-17抗体的重链可变区为模板，对重链可变区使用正向引物(GD17-1，SEQ ID NO：97)、反向引物(GD17-2，SEQ ID NO：98)，而对轻链可变区使用正向引物(GD17-3，SEQ ID NO：99)、反向引物(GD17-4，SEQ ID NO：100)，用pyrobestDNA聚合酶(TAKARA#R005)，于94℃反应1分钟后，以94℃30分钟、72℃30分钟、25个循环进行了PCR扩增。
接下来用S-300HR柱(Amersham Biosciences #27-5130-01)纯化所得重链和轻链可变区的PCR产物，各取1μL混合于同一管中，并用pyrobest DNA聚合酶于94℃反应1分钟后，以94℃30分钟、72℃30分钟、5个循环进行了PCR扩增。
用引物GD17-1(SEQ ID NO：97)、GD17-4(SEQ ID NO：100)对1μL复性后的反应液，在以下条件下用pyrobest DNA聚合酶于94℃反应1分钟后，以94℃30分钟、72℃1分钟、25个循环进行了PCR扩增。
用S-400HR柱(Amersham Biosciences #27-5140-01)纯化扩增出的片段，用EcoRI-HindIII酶切，并用琼脂糖凝胶分离。将其插入到5-2-1-1中制备的pET22b_His_PE40的HindIII、EcoRI之间，确认碱基序列，从而制成pET22b_His_GD17scFv-PE40。
所用引物序列如下所示：
GD17-1：aaaagcttca ggttcagctc cagcagtctg g(SEQ ID NO：97)
GD17-2：cccgaaccac caccacccga accaccacca cctgaggagactgtgagagt ggtgcct(SEQ ID NO：98)
GD17-3：tggttcgggt ggtggtggtt cgggtggtgg cggatcggatgttgtgatga cccaaactcc ac(SEQ ID NO：99)
GD17-4：ttgaattctt tcagctcca gcttggtccc(SEQ ID NO：100)
所得GD17scFv_PE40的碱基序列示于SEQ ID NO：101，所述碱基序列对应的氨基酸序列示于SEQ ID NO：102。
7-2.经毒素标记的单链抗体的大量纯化
将经pET22b_His_GD17scFv-PE40转化的大肠杆菌BL21株接种于含羧苄西林(50μg/ml)的LB琼脂平板上。达对数生长期时加入IPTG(最终用量1mM)于室温(24℃)下培养过夜而诱导蛋白表达。将通过离心回收的大肠杆菌悬浮于结合缓冲液(20mM磷酸钠、500mM NaCl、20mM咪唑、pH 7.4)中，超声破碎后将裂解部分施于HisTrap FF Crude柱(GE Healthcare)上。然后由洗脱缓冲液(20mM磷酸钠、500mMNaCl、500mM咪唑、pH 7.4)洗脱出所述目的蛋白，用TBS稀释约10倍后，将其施于填充M2琼脂糖(Sigma)而制成的亲和凝胶上。使用AKTA explorer(GE Healthcare)用M2洗脱缓冲液(0.1M甘氨酸-HCl，pH3.5)洗脱目的蛋白，并使用PD10(GE Healthcare)将其缓冲液快速换成PBS而作为最终样品。
经纯化的GD17scFv-PE40经SDS-PAGE后进行CBB染色，以确认是否被纯化为100％纯度(图14)。
7-3.分析对GRP78蛋白的结合活性
接下来分析了经纯化的GD17scFv-PE40蛋白的GRP78结合活性。在4℃保存，37℃过夜的样品及进行冻溶的样品中通过ELISA测定、比较了对固相化GRP78的结合活性。
用稀释缓冲液(1％BSA、50mM Tris、1mM MgCl2、150mM NaCl、0.05％Tween 20)稀释各样品，将其加入到包被有由大肠杆菌纯化的GST-GRP78(1μg/ml)的平板(NUNC)上。在室温下反应1小时后，用TBS-T(TBS-0.05％Tween 20)洗涤平板3次，加入1μg/ml抗Flag抗体(M2抗体，Sigma)后在室温下温育1小时。再用TBS-T洗涤3次，与经碱性磷酸酶标记的抗小鼠IgG(ZYMED)反应1小时后，用1mg/ml底物(Sigma)进行显色。
结果发现，在4℃保存，对于37℃过夜的样品或进行冻溶的样品中的任意种，其GD17scFv-PE40蛋白与GRP78蛋白的结合活性均为EC50＝1.3nM左右，表明本经纯化样品是比较稳定的蛋白(图15)。
7-4.对体外诱导细胞死亡的活性的分析
接下来用癌细胞株(22Rv1、LNcap、MCF7、BxPC3、PANC1、SKOV3)或源于人的正常细胞株(HUVEC、MRC5)、源于小鼠的正常细胞株(CHO、NIH3T3、BaF3)对经纯化的GD17scFv-PE40的细胞死亡诱导活性进行了分析。
用于实验的细胞株中HUVEC购自CAMBREX公司，其它细胞株均购自ATCC，并根据产品说明书分别进行培养。
将各细胞接种于96孔平板上，次日向细胞加入用含10％FCS的RPMI1640培养基(Invitrogen)稀释成各浓度的GD17scFv-PE40。培养5天后用WST-8(NACALAI)测量活细胞数。
结果发现，尽管癌细胞的敏感性随细胞的不同而不同，但表现出最大活性的50％活性的浓度(EC50值)为约2-20nM，表明具有强细胞死亡诱导活性(图16A)。尤其是MCF7或22Rv1细胞的EC50值为约2-4nM，表明具有强力的伤细胞活性。而源于人和小鼠的正常细胞或全无活性，或以高浓度加入后有轻微的伤细胞活性(图16B)。
为证实所述敏感性的差异并非由于实验所用细胞之间有无GRP78蛋白表达，使用GD-17抗体进行了蛋白印迹分析。根据定法由细胞制备细胞裂解物，经SDS-PAGE后，用GD-17抗体(2μg/ml)进行了蛋白印迹分析。如图17所示，在未由GD17scFv-PE40产生伤细胞活性的细胞株中也可检测到对GD-17抗体的特异性着色带，由此推断，由GD17scFv-PE40所致的癌细胞特异性伤细胞活性并非由于癌细胞和正常细胞是否表达GRP78蛋白，而是由于两种细胞间GRP78蛋白的存在位置不同所致。
7-5.对体内抗肿瘤活性的分析
用添加有0.05％胰蛋白酶的0.02％EDTA溶液回收人前列腺癌细胞株22Rv1细胞(ATCC CRL-2505)，以1×107细胞/0.2ml HBSS(SIGMACat.No.H9269)移植到裸鼠(雄性，7周龄(CAnN.Cg-Foxn1<nu>CrlCrlj(BALB-nu/nu))：日本Charles River株式会社)的腹部皮下。确认肿瘤定殖，在移植后第16天根据肿瘤体积和体重分为7个组(对照组1个组，药物施用组6个组)。
分组次日(第17天)、第21天、第23天、第26天、第29天的各日给对照组施用生理盐水，给药物施用组施用0.5mg/kg剂量的GD17scFv-PE40，以10ml/kg的施用量静脉内瞬时施用。经时测定肿瘤体积，在最后一次施用2天后(第31天)进行最后一次测定。
结果如图18所示。最后一次测定时的肿瘤增值抑制率是47％，通过非参数邓奈特多重比较分析肿瘤体积的数据，结果发现0.5mg/kg施用组具有显著的肿瘤增值抑制效果。根据此结果证实了以GRP78为靶标的GD17scFv-PE40的体内有效性，并证明可将以GRP78为靶标的抗体用作癌症治疗抗体。
工业应用的可能性
本发明示可通过提供具有GRP78结合活性，且可被细胞摄入的新抗体来提供用于治疗将GRP78暴露于细胞表面的各种肿瘤或癌症的新药物组合物。而且，通过使用具有所述特征的抗体来提供诊断各种肿瘤或癌症的方法。
序列表
<110>FORERUNNER PHARMA RESEARCH CO.，LTD.
 
<120>含抗GRP78抗体作为有效成分的药物组合物
 
<130>YCT-1342
 
<150>JP 2007-47534
<151>2007-02-27
 
<160>102
 
<170>PatentIn version 3.1
 
<210>1
<211>1965
<212>DNA
<213>智人(Homo sapiens)
 
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(1965)
<223>
 
<400>1
 
atg aag ctc tcc ctg gtg gcc gcg atg ctg ctg ctg ctc agc gcg gcg     48
Met Lys Leu Ser Leu Val Ala Ala Met Leu Leu Leu Leu Ser Ala Ala
1               5                   10                  15
cgg gcc gag gag gag gac aag aag gag gac gtg ggc acg gtg gtc ggc    96
Arg Ala Glu Glu Glu Asp Lys Lys Glu Asp Val Gly Thr Val Val Gly
            20                  25                  30
atc gac ctg ggg acc acc tac tcc tgc gtc ggc gtg ttc aag aac ggc    144
Ile Asp Leu Gly Thr Thr Tyr Ser Cys Val Gly Val Phe Lys Asn Gly
        35                  40                  45
cgc gtg gag atc atc gcc aac gat cag ggc aac cgc atc acg ccg tcc    192
Arg Val Glu Ile Ile Ala Asn Asp Gln Gly Asn Arg Ile Thr Pro Ser
    50                  55                  60
tat gtc gcc ttc act cct gaa ggg gaa cgt ctg att ggc gat gcc gcc    240
Tyr Val Ala Phe Thr Pro Glu Gly Glu Arg Leu Ile Gly Asp Ala Ala
65                  70                  75                  80
aag aac cag ctc acc tcc aac ccc gag aac acg gtc ttt gac gcc aag    288
Lys Asn Gln Leu Thr Ser Asn Pro Glu Asn Thr Val Phe Asp Ala Lys
                85                  90                  95
cgg ctc atc ggc cgc acg tgg aat gac ccg tct gtg cag cag gac atc    336
Arg Leu Ile Gly Arg Thr Trp Asn Asp Pro Ser Val Gln Gln Asp Ile
            100                 105                 110
aag ttc ttg ccg ttc aag gtg gtt gaa aag aaa act aaa cca tac att    384
Lys Phe Leu Pro Phe Lys Val Val Glu Lys Lys Thr Lys Pro Tyr Ile
        115                 120                 125
caa gtt gat att gga ggt ggg caa aca aag aca ttt gct cct gaa gaa    432
Gln Val Asp Ile Gly Gly Gly Gln Thr Lys Thr Phe Ala Pro Glu Glu
    130                 135                 140
att tct gcc atg gtt ctc act aaa atg aaa gaa acc gct gag gct tat    480
Ile Ser Ala Met Val Leu Thr Lys Met Lys Glu Thr Ala Glu Ala Tyr
145                 150                 155                 160
ttg gga aag aag gtt acc cat gca gtt gtt act gta cca gcc tat ttt    528
Leu Gly Lys Lys Val Thr His Ala Val Val Thr Val Pro Ala Tyr Phe
                165                 170                 175
aat gat gcc caa cgc caa gca acc aaa gac gct gga act att gct ggc    576
Asn Asp Ala Gln Arg Gln Ala Thr Lys Asp Ala Gly Thr Ile Ala Gly
            180                 185                 190
cta aat gtt atg agg atc atc aac gag cct acg gca gct gct att gct    624
Leu Asn Val Met Arg Ile Ile Asn Glu Pro Thr Ala Ala Ala Ile Ala
        195                 200                 205
tat ggc ctg gat aag agg gag ggg gag aag aac atc ctg gtg ttt gac    672
Tyr Gly Leu Asp Lys Arg Glu Gly Glu Lys Asn Ile Leu Val Phe Asp
    210                 215                 220
ctg ggt ggc gga acc ttc gat gtg tct ctt ctc acc att gac aat ggt    720
Leu Gly Gly Gly Thr Phe Asp Val Ser Leu Leu Thr Ile Asp Asn Gly
225                 230                 235                 240
gtc ttc gaa gtt gtg gcc act aat gga gat act cat ctg ggt gga gaa    768
Val Phe Glu Val Val Ala Thr Asn Gly Asp Thr His Leu Gly Gly Glu
                245                 250                 255
gac ttt gac cag cgt gtc atg gaa cac ttc atc aaa ctg tac aaa aag    816
Asp Phe Asp Gln Arg Val Met Glu His Phe Ile Lys Leu Tyr Lys Lys
            260                 265                 270
aag acg ggc aaa gat gtc agg aaa gac aat aga gct gtg cag aaa ctc    864
Lys Thr Gly Lys Asp Val Arg Lys Asp Asn Arg Ala Val Gln Lys Leu
        275                 280                 285
cgg cgc gag gta gaa aag gcc aaa cgg gcc ctg tct tct cag cat caa    912
Arg Arg Glu Val Glu Lys Ala Lys Arg Ala Leu Ser Ser Gln His Gln
    290                 295                 300
gca aga att gaa att gag tcc ttc tat gaa gga gaa gac ttt tct gag    960
Ala Arg Ile Glu Ile Glu Ser Phe Tyr Glu Gly Glu Asp Phe Ser Glu
305                 310                 315                 320
acc ctg act cgg gcc aaa ttt gaa gag ctc aac atg gat ctg ttc cgg    1008
Thr Leu Thr Arg Ala Lys Phe Glu Glu Leu Asn Met Asp Leu Phe Arg
                325                 330                 335
tct act atg aag ccc gtc cag aaa gtg ttg gaa gat tct gat ttg aag    1056
Ser Thr Met Lys Pro Val Gln Lys Val Leu Glu Asp Ser Asp Leu Lys
            340                 345                 350
aag tct gat att gat gaa att gtt ctt gtt ggt ggc tcg act cga att    1104
Lys Ser Asp Ile Asp Glu Ile Val Leu Val Gly Gly Ser Thr Arg Ile
        355                 360                 365
cca aag att cag caa ctg gtt aaa gag ttc ttc aat ggc aag gaa cca    1152
Pro Lys Ile Gln Gln Leu Val Lys Glu Phe Phe Asn Gly Lys Glu Pro
    370                 375                 380
tcc cgt ggc ata aac cca gat gaa gct gta gcg tat ggt gct gct gtc    1200
Ser Arg Gly Ile Asn Pro Asp Glu Ala Val Ala Tyr Gly Ala Ala Val
385                 390                 395                 400
cag gct ggt gtg ctc tct ggt gat caa gat aca ggt gac ctg gta ctg    1248
Gln Ala Gly Val Leu Ser Gly Asp Gln Asp Thr Gly Asp Leu Val Leu
                405                 410                 415
ctt gat gta tgt ccc ctt aca ctt ggt att gaa act gtg gga ggt gtc    1296
Leu Asp Val Cys Pro Leu Thr Leu Gly Ile Glu Thr Val Gly Gly Val
            420                 425                 430
atg acc aaa ctg att cca agg aac aca gtg gtg cct acc aag aag tct    1344
Met Thr Lys Leu Ile Pro Arg Asn Thr Val Val Pro Thr Lys Lys Ser
        435                 440                 445
cag atc ttt tct aca gct tct gat aat caa cca act gtt aca atc aag    1392
Gln Ile Phe Ser Thr Ala Ser Asp Asn Gln Pro Thr Val Thr Ile Lys
    450                 455                 460
gtc tat gaa ggt gaa aga ccc ctg aca aaa gac aat cat ctt ctg ggt    1440
Val Tyr Glu Gly Glu Arg Pro Leu Thr Lys Asp Asn His Leu Leu Gly
465                 470                 475                 480
aca ttt gat ctg act gga att cct cct gct cct cgt ggg gtc cca cag    1488
Thr Phe Asp Leu Thr Gly Ile Pro Pro Ala Pro Arg Gly Val Pro Gln
                485                 490                 495
att gaa gtc acc ttt gag ata gat gtg aat ggt att ctt cga gtg aca    1536
Ile Glu Val Thr Phe Glu Ile Asp Val Asn Gly Ile Leu Arg Val Thr
            500                 505                 510
gct gaa gac aag ggt aca ggg aac aaa aat aag atc aca atc acc aat    1584
Ala Glu Asp Lys Gly Thr Gly Asn Lys Asn Lys Ile Thr Ile Thr Asn
         515                 520                 525
gac cag aat cgc ctg aca cct gaa gaa atc gaa agg atg gtt aat gat    1632
Asp Gln Asn Arg Leu Thr Pro Glu Glu Ile Glu Arg Met Val Asn Asp
    530                 535                 540
gct gag aag ttt gct gag gaa gac aaa aag ctc aag gag cgc att gat    1680
Ala Glu Lys Phe Ala Glu Glu Asp Lys Lys Leu Lys Glu Arg Ile Asp
545                 550                 555                 560
act aga aat gag ttg gaa agc tat gcc tat tct cta aag aat cag att    1728
Thr Arg Asn Glu Leu Glu Ser Tyr Ala Tyr Ser Leu Lys Asn Gln Ile
                565                 570                 575
gga gat aaa gaa aag ctg gga ggt aaa ctt tcc tct gaa gat aag gag    1776
Gly Asp Lys Glu Lys Leu Gly Gly Lys Leu Ser Ser Glu Asp Lys Glu
            580                 585                 590
acc atg gaa aaa gct gta gaa gaa aag att gaa tgg ctg gaa agc cac    1824
Thr Met Glu Lys Ala Val Glu Glu Lys Ile Glu Trp Leu Glu Ser His
        595                 600                 605
caa gat gct gac att gaa gac ttc aaa gct aag aag aag gaa ctg gaa    1872
Gln Asp Ala Asp Ile Glu Asp Phe Lys Ala Lys Lys Lys Glu Leu Glu
    610                 615                 620
gaa att gtt caa cca att atc agc aaa ctc tat gga agt gca ggc cct    1920
Glu Ile Val Gln Pro Ile Ile Ser Lys Leu Tyr Gly Ser Ala Gly Pro
625                 630                 635                 640
ccc cca act ggt gaa gag gat aca gca gaa aaa gat gag ttg tag        1965
Pro Pro Thr Gly Glu Glu Asp Thr Ala Glu Lys Asp Glu Leu
                645                 650
 
<210>2
<211>654
<212>PRT
<213>智人
 
<400>2
 
Met Lys Leu Ser Leu Val Ala Ala Met Leu Leu Leu Leu Ser Ala Ala
1               5                   10                  15
Arg Ala Glu Glu Glu Asp Lys Lys Glu Asp Val Gly Thr Val Val Gly
            20                  25                  30
Ile Asp Leu Gly Thr Thr Tyr Ser Cys Val Gly Val Phe Lys Asn Gly
        35                  40                  45
Arg Val Glu Ile Ile Ala Asn Asp Gln Gly Asn Arg Ile Thr Pro Ser
    50                  55                  60
Tyr Val Ala Phe Thr Pro Glu Gly Glu Arg Leu Ile Gly Asp Ala Ala
65                  70                  75                  80
Lys Asn Gln Leu Thr Ser Asn Pro Glu Asn Thr Val Phe Asp Ala Lys
                85                  90                  95
Arg Leu Ile Gly Arg Thr Trp Asn Asp Pro Ser Val Gln Gln Asp Ile
            100                 105                 110
Lys Phe Leu Pro Phe Lys Val Val Glu Lys Lys Thr Lys Pro Tyr Ile
        115                 120                 125
Gln Val Asp Ile Gly Gly Gly Gln Thr Lys Thr Phe Ala Pro Glu Glu
    130                 135                 140
Ile Ser Ala Met Val Leu Thr Lys Met Lys Glu Thr Ala Glu Ala Tyr
145                 150                 155                 160
Leu Gly Lys Lys Val Thr His Ala Val Val Thr Val Pro Ala Tyr Phe
                165                 170                 175
Asn Asp Ala Gln Arg Gln Ala Thr Lys Asp Ala Gly Thr Ile Ala Gly
            180                 185                 190
Leu Asn Val Met Arg Ile Ile Asn Glu Pro Thr Ala Ala Ala Ile Ala
        195                 200                 205
Tyr Gly Leu Asp Lys Arg Glu Gly Glu Lys Asn Ile Leu Val Phe Asp
    210                 215                 220
Leu Gly Gly Gly Thr Phe Asp Val Ser Leu Leu Thr Ile Asp Asn Gly
225                 230                 235                 240
Val Phe Glu Val Val Ala Thr Asn Gly Asp Thr His Leu Gly Gly Glu
                245                 250                 255
Asp Phe Asp Gln Arg Val Met Glu His Phe Ile Lys Leu Tyr Lys Lys
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Lys Thr Gly Lys Asp Val Arg Lys Asp Asn Arg Ala Val Gln Lys Leu
        275                 280                 285
Arg Arg Glu Val Glu Lys Ala Lys Arg Ala Leu Ser Ser Gln His Gln
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Ala Arg Ile Glu Ile Glu Ser Phe Tyr Glu Gly Glu Asp Phe Ser Glu
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Thr Leu Thr Arg Ala Lys Phe Glu Glu Leu Asn Met Asp Leu Phe Arg
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Ser Thr Met Lys Pro Val Gln Lys Val Leu Glu Asp Ser Asp Leu Lys
            340                 345                 350
Lys Ser Asp Ile Asp Glu Ile Val Leu Val Gly Gly Ser Thr Arg Ile
        355                 360                 365
Pro Lys Ile Gln Gln Leu Val Lys Glu Phe Phe Asn Gly Lys Glu Pro
    370                 375                 380
Ser Arg Gly Ile Asn Pro Asp Glu Ala Val Ala Tyr Gly Ala Ala Val
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Gln Ala Gly Val Leu Ser Gly Asp Gln Asp Thr Gly Asp Leu Val Leu
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Leu Asp Val Cys Pro Leu Thr Leu Gly Ile Glu Thr Val Gly Gly Val
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        435                 440                 445
Gln Ile Phe Ser Thr Ala Ser Asp Asn Gln Pro Thr Val Thr Ile Lys
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Val Tyr Glu Gly Glu Arg Pro Leu Thr Lys Asp Asn His Leu Leu Gly
465                 470                 475                 480
Thr Phe Asp Leu Thr Gly Ile Pro Pro Ala Pro Arg Gly Val Pro Gln
                485                 490                 495
Ile Glu Val Thr Phe Glu Ile Asp Val Asn Gly Ile Leu Arg Val Thr
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Ala Glu Asp Lys Gly Thr Gly Asn Lys Asn LysIle Thr Ile Thr Asn
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Asp Gln Asn Arg Leu Thr Pro Glu Glu Ile Glu Arg Met Val Asn Asp
    530                 535                 540
Ala Glu Lys Phe Ala Glu Glu Asp Lys Lys Leu Lys Glu Arg Ile Asp
545                 550                 555                 560
Thr Arg Asn Glu Leu Glu Ser Tyr Ala Tyr Ser Leu Lys Asn Gln Ile
                565                 570                 575
Gly Asp Lys Glu Lys Leu Gly Gly Lys Leu Ser Ser Glu Asp Lys Glu
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Thr Met Glu Lys Ala Val Glu Glu Lys Ile Glu Trp Leu Glu Ser His
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625                 630                 635                 640
Pro Pro Thr Gly Glu Glu Asp Thr Ala Glu Lys Asp Glu Leu
                645                 650
 
<210>3
<211>40
<212>PRT
<213>智人
 
<400>3
 
Lys Glu Phe Phe Asn Gly Lys Glu Pro Ser Arg Gly Ile Asn Pro Asp
1               5                   10                  15
Glu Ala Val Ala Tyr Gly Ala Ala Val Gln Ala Gly Val Leu Ser Gly
            20                  25                  30
Asp Gln Asp Thr Gly Asp Leu Val
        35                  40
 
<210>4
<211>360
<212>DNA
<213>小鼠(Mus musculus)
 
<400>4
gaggtccagc tgcaacagtc tggacctgag ctggtgaagc ctggggcttc agtgaagata   60
tcctgcaaga cttctggata cacattcact gaatacacca tgcactgggt gaagcagagc  120
catggaaaga gccttgagtg gattggaggt attaatccta acaatggtgg tactagctac  180
aaccagaagt tcaagggcaa ggccacattg actgtagaca agtcctccag cacagcctac  240
atggagctcc gcagcctgac atctgaggat tctgcagtct attactgtgc aagagaaaag  300
tatggtaact actatgctat ggactactgg ggtcaaggaa cctcagtcac cgtctcctca    360
 
<210>5
<211>120
<212>PRT
<213>小鼠
 
<400>5
 
Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Thr Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Glu Tyr
            20                  25                  30
Thr Met His Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Ser Leu Glu Trp Ile
        35                  40                  45
Gly Gly Ile Asn Pro Asn Asn Gly Gly Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe
    50                  55                  60
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Met Glu Leu Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Arg Glu Lys Tyr Gly Asn Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln
            100                 105                 110
Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
        115                 120
 
<210>6
<211>336
<212>DNA
<213>小鼠
 
<400>6
gacattgtga tgtcacagtc tccatcctcc ctggctgtgt cagcaggaga gaaggtcact     60
atgagctgca aatccagtca gagtctgctc aacagtagaa cccgaaagaa ctacttggct    120
tggtaccagc agaaaccagg gcagtctcct aaactgctga tctactgggc atccactagg    180
gaatctgggg tccctgatcg cttcacaggc agtggatctg ggacagattt cactctcacc    240
atcagcagtg tgcaggctga agacctggca gtttattact gcaagcaatc ttataatctt    300
cggacgttcg gtggaggcac caagctggaa atcaaa                              336
 
<210>7
<211>112
<212>PRT
<213>小鼠
 
<400>7
 
Asp Ile Val Met Ser Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ala Val Ser Ala Gly
1               5                   10                  15
Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser
            20                  25                  30
Arg Thr Arg Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
        35                  40                  45
Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
    50                  55                  60
Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65                  70                  75                  80
Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Lys Gln
                85                  90                  95
Ser Tyr Asn Leu Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
           100                 105                 110
 
<210>8
<211>5
<212>PRT
<213>小鼠
 
<400>8
Glu Tyr Thr Met His
1               5
 
<210>9
<211>17
<212>PRT
<213>小鼠
 
<400>9
 
Gly Ile Asn Pro Asn Asn Gly Gly Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe Lys
1               5                   10                  15
Gly
 
<210>10
<211>11
<212>PRT
<213>小鼠
 
<400>10
 
Glu Lys Tyr Gly Asn Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr
1               5                   10
<210>11
<211>17
<212>PRT
<213>小鼠
 
<400>11
 
Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser Arg Thr Arg Lys Asn Tyr Leu
1               5                   10                  15
Ala
 
<210>12
<211>7
<212>PRT
<213>小鼠
 
<400>12
 
Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser
1               5
 
<210>13
<211>8
<212>PRT
<213>小鼠
 
<400>13
 
Lys Gln Ser Tyr Asn Leu Arg Thr
1               5
 
<210>14
<211>336
<212>DNA
<213>小鼠
<400>14
caggtgcagc tgaagcagtc aggacctggc ctagtgcagc cctcacagag cctgtccatc     60
acctgcacag tctctggttt ctcattaact agctatggtg tacactgggt tcgccagtct    120
ccaggaaagg gtctggagtg gctgggagtg atatggagtg gtggaagcac agactataat    180
gaagctttca tatccagatt gagcatcagc aaggacaatt ccaagagcca agttttcttt    240
aaaatgaaca gtctgcaagc taatgacaca gccatatatt actgtgccag aaattgggac    300
tactggggcc aaggcaccac tctcacagtc tcctca                              336
 
<210>15
<211>112
<212>PRT
<213>小鼠
 
<400>15
 
Gln Val Gln Leu Lys Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Gln Pro Ser Gln
1               5                   10                  15
Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Ser Tyr
            20                  25                  30
Gly Val His Trp Val Arg Gln Ser Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu
        35                  40                  45
Gly Val Ile Trp Ser Gly Gly Ser Thr Asp Tyr Asn Glu Ala Phe Ile
    50                  55                  60
Ser Arg Leu Ser Ile Ser Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Phe
65                  70                  75                  80
Lys Met Asn Ser Leu Gln Ala Asn Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala
                85                  90                  95
Arg Asn Trp Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser
            100                 105                 110
 
<210>16
<211>336
<212>DNA
<213>小鼠
 
<400>16
gacattgtga tgtcacagtc tccatcctcc ctggctgtgt cagcaggaga gaaggtcact     60
atgagctgca aatccagtca gagtctgctc aacagtagaa cccgaaagaa ctacttggct    120
tggtaccagc agaaaccagg gcagtctcct aaactgctga tctactgggc atccactagg    180
gaatctgggg tccctgatcg cttcacaggc agtggatctg ggacagattt cactctcacc    240
atcagcagtg tgcaggctga agacctggca gtttattact gcaagcaatc ttataatctt    300
cggacgttcg gtggaggcac caagctggaa atcaaa                              336
 
<210>17
<211>112
<212>PRT
<213>小鼠
 
<400>17
 
Asp Ile Val Met Ser Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ala Val Ser Ala Gly
1               5                   10                  15
Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser
            20                  25                  30
Arg Thr Arg Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
        35                  40                  45
Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
    50                  55                  60
Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65                  70                  75                  80
Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Lys Gln
                85                  90                  95
Ser Tyr Asn Leu Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
            100                 105                 110
 
<210>18
<211>5
<212>PRT
<213>小鼠
 
<400>18
 
Ser Tyr Gly Val His
1               5
 
<210>19
<211>16
<212>PRT
<213>小鼠
 
<400>19
 
Val Ile Trp Ser Gly Gly Ser Thr Asp Tyr Asn Glu Ala Phe Ile Ser
1               5                   10                  15
 
<210>20
<211>4
<212>PRT
<213>小鼠
 
<400>20
Asn Trp Asp Tyr
1
 
<210>21
<211>17
<212>PRT
<213>小鼠
 
<400>21
 
Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser Arg Thr Arg Lys Asn Tyr Leu
1               5                   10                  15
Ala
 
<210>22
<211>7
<212>PRT
<213>小鼠
 
<400>22
 
Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser
1               5
 
<210>23
<211>8
<212>PRT
<213>小鼠
 
<400>23
 
Lys Gln Ser Tyr Asn Leu Arg Thr
1               5
 
<210>24
<211>2022
<212>DNA
<213>小鼠
 
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(2022)
<223>
 
<400>24
atg aaa tac ctg ctg ccg acc gct gct gct ggt ctg ctg ctc ctc gct    48
Met Lys Tyr Leu Leu Pro Thr Ala Ala Ala Gly Leu Leu Leu Leu Ala
1               5                   10                  15
gcc cag ccg gcg atg gcc atg gat cac cat cac cat cac cat cac cat    96
Ala Gln Pro Ala Met Ala Met Asp His His His His His His His His
            20                  25                  30
cat cac aag ctt gag gtc cag ctg caa cag tct gga cct gag ctg gtg    144
His His Lys Leu Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val
        35                  40                  45
aag cct ggg gct tca gtg aag ata tcc tgc aag act tct gga tac aca    192
Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Thr Ser Gly Tyr Thr
    50                  55                  60
ttc act gaa tac acc atg cac tgg gtg aag cag agc cat gga aag agc    240
Phe Thr Glu Tyr Thr Met His Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Ser
65                  70                  75                  80
ctt gag tgg att gga ggt att aat cct aac aat ggt ggt act agc tac    288
Leu Glu Trp Ile Gly Gly Ile Asn Pro Asn Asn Gly Gly Thr Ser Tyr
                85                  90                  95
aac cag aag ttc aag ggc aag gcc aca ttg act gta gac aag tcc tcc    336
Asn Gln Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser
            100                 105                 110
agc aca gcc tac atg gag ctc cgc agc ctg aca tct gag gat tct gca    384
Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala
        115                 120                 125
gtc tat tac tgt gca aga gaa aag tat ggt aac tac tat gct atg gac    432
Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Glu Lys Tyr Gly Asn Tyr Tyr Ala Met Asp
    130                 135                 140
tac tgg ggt caa gga acc tca gtc acc gtc tcc tca ggt ggt ggt ggt    480
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly
145                 150                 155                 160
tcg ggt ggt ggt ggt tcg ggt ggt ggc gga tcg gac att gtg atg tca    528
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Val Met Ser
                165                 170                 175
cag tct cca tcc tcc ctg gct gtg tca gca gga gag aag gtc act atg    576
Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ala Val Ser Ala Gly Glu Lys Val Thr Met
            180                 185                 190
agc tgc aaa tcc agt cag agt ctg ctc aac agt aga acc cga aag aac    624
Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser Arg Thr Arg Lys Asn
        195                 200                 205
tac ttg gct tgg tac cag cag aaa cca ggg cag tct cct aaa ctg ctg    672
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu
    210                 215                 220
atc tac tgg gca tcc act agg gaa tct ggg gtc cct gat cgc ttc aca    720
Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr
225                 230                 235                 240
ggc agt gga tct ggg aca gat ttc act ctc acc atc agc agt gtg cag    768
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Val Gln
                245                 250                 255
gct gaa gac ctg gca gtt tat tac tgc aag caa tct tat aat ctt cgg    816
Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Lys Gln Ser Tyr Asn Leu Arg
            260                 265                 270
acg ttc ggt gga ggc acc aag ctg gaa atc aaa gaa ttc ggt ggc gcg    864
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Glu Phe Gly Gly Ala
        275                 280                 285
ccg gag ttc ccg aaa ccg tcc acc ccg ccg ggt tct tct ggt tta gag    912
Pro Glu Phe Pro Lys Pro Ser Thr Pro Pro Gly Ser Ser Gly Leu Glu
    290                 295                 300
ggc ggc agc ctg gcc gcg ctg acc gcg cac cag gct tgc cac ctg ccg    960
Gly Gly Ser Leu Ala Ala Leu Thr Ala His Gln Ala Cys His Leu Pro
305                 310                 315                 320
ctg gag act ttc acc cgt cat cgc cag ccg cgc ggc tgg gaa caa ctg    1008
Leu Glu Thr Phe Thr Arg His Arg Gln Pro Arg Gly Trp Glu Gln Leu
                325                 330                 335
gag cag tgc ggc tat ccg gtg cag cgg ctg gtc gcc ctc tac ctg gcg    1056
Glu Gln Cys Gly Tyr Pro Val Gln Arg Leu Val Ala Leu Tyr Leu Ala
            340                 345                 350
gcg cgg ctg tcg tgg aac cag gtc gac cag gtg atc cgc aac gcc ctg    1104
Ala Arg Leu Ser Trp Asn Gln Val Asp Gln Val Ile Arg Asn Ala Leu
        355                 360                 365
gcc agc ccc ggc agc ggc ggc gac ctg ggc gaa gcg atc cgc gag cag    1152
Ala Ser Pro Gly Ser Gly Gly Asp Leu Gly Glu Ala Ile Arg Glu Gln
   370                 375                 380
ccg gag cag gcc cgt ctg gcc ctg acc ctg gcc gcc gcc gag agc gag    1200
Pro Glu Gln Ala Arg Leu Ala Leu Thr Leu Ala Ala Ala Glu Ser Glu
385                 390                 395                 400
cgc ttc gtc cgg cag ggc acc ggc aac gac gag gcc ggc gcg gcc aac    1248
Arg Phe Val Arg Gln Gly Thr Gly Asn Asp Glu Ala Gly Ala Ala Asn
                405                 410                 415
gcc gac gtg gtg agc ctg acc tgc ccg gtc gcc gcc ggt gaa tgc gcg    1296
Ala Asp Val Val Ser Leu Thr Cys Pro Val Ala Ala Gly Glu Cys Ala
            420                 425                 430
ggc ccg gcg gac agc ggc gac gcc ctg ctg gag cgc aac tat ccc act    1344
Gly Pro Ala Asp Ser Gly Asp Ala Leu Leu Glu Arg Asn Tyr Pro Thr
        435                 440                 445
ggc gcg gag ttc ctc ggc gac ggc ggc gac gtc agc ttc agc acc cgc    1392
Gly Ala Glu Phe Leu Gly Asp Gly Gly Asp Val Ser Phe Ser Thr Arg
    450                 455                 460
ggc acg cag aac tgg acg gtg gag cgg ctg ctc cag gcg cac cgc caa    1440
Gly Thr Gln Asn Trp Thr Val Glu Arg Leu Leu Gln Ala His Arg Gln
465                 470                 475                 480
ctg gag gag cgc ggc tat gtg ttc gtc ggc tac cac ggc acc ttc ctc    1488
Leu Glu Glu Arg Gly Tyr Val Phe Val Gly Tyr His Gly Thr Phe Leu
                485                 490                 495
gaa gcg gcg caa agc atc gtc ttc ggc ggg gtg cgc gcg cgc agc cag    1536
Glu Ala Ala Gln Ser Ile Val Phe Gly Gly Val Arg Ala Arg Ser Gln
            500                 505                 510
gac ctc gac gcg atc tgg cgc ggt ttc tat atc gcc ggc gat ccg gcg    1584
Asp Leu Asp Ala Ile Trp Arg Gly Phe Tyr Ile Ala Gly Asp Pro Ala
        515                 520                 525
ctg gcc tac ggc tac gcc cag gac cag gaa ccc gac gca cgc ggc cgg    1632
Leu Ala Tyr Gly Tyr Ala Gln Asp Gln Glu Pro Asp Ala Arg Gly Arg
    530                 535                 540
atc cgc aac ggt gcc ctg ctg cgg gtc tat gtg ccg cgc tcg agc ctg    1680
Ile Arg Asn Gly Ala Leu Leu Arg Val Tyr Val Pro Arg Ser Ser Leu
545                 550                 555                 560
ccg ggc ttc tac cgc acc agc ctg acc ctg gcc gcg ccg gag gcg gcg    1728
Pro Gly Phe Tyr Arg Thr Ser Leu Thr Leu Ala Ala Pro Glu Ala Ala
                565                 570                 575
ggc gag gtc gaa cgg ctg atc ggc cat ccg ctg ccg ctg cgc ctg gac    1776
Gly Glu Val Glu Arg Leu Ile Gly His Pro Leu Pro Leu Arg Leu Asp
            580                 585                 590
gcc atc acc ggc ccc gag gag gaa ggc ggg cgc ctg gag acc att ctc    1824
Ala Ile Thr Gly Pro Glu Glu Glu Gly Gly Arg Leu Glu Thr Ile Leu
        595                 600                 605
ggc tgg ccg ctg gcc gag cgc acc gtg gtg att ccc tcg gcg atc ccc    1872
Gly Trp Pro Leu Ala Glu Arg Thr Val Val Ile Pro Ser Ala Ile Pro
    610                 615                 620
acc gac ccg cgc aac gtc ggc ggc gac ctc gac ccg tcc agc atc ccc    1920
Thr Asp Pro Arg Asn Val Gly Gly Asp Leu Asp Pro Ser Ser Ile Pro
625                 630                 635                 640
gac aag gaa cag gcg atc agc gcc ctg ccg gac tac gcc agc cag ccc    1968
Asp Lys Glu Gln Ala Ile Ser Ala Leu Pro Asp Tyr Ala Ser Gln Pro
                645                 650                 655
ggc aaa ccg ccg gac tac aag gat gac gac gat aag aaa gac gaa ctg    2016
Gly Lys Pro Pro Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys Lys Asp Glu Leu
            660                 665                 670
tag tga                                                        2022
 
<210>25
<211>672
<212>PRT
<213>小鼠
 
<400>25
 
Met Lys Tyr Leu Leu Pro Thr Ala Ala Ala Gly Leu Leu Leu Leu Ala
1               5                   10                  15
Ala Gln Pro Ala Met Ala Met Asp His His His His His His His His
            20                  25                  30
His His Lys Leu Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val
        35                  40                  45
Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Thr Ser Gly Tyr Thr
    50                  55                  60
Phe Thr Glu Tyr Thr Met His Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Ser
65                  70                  75                  80
Leu Glu Trp Ile Gly Gly Ile Asn Pro Asn Asn Gly Gly Thr Ser Tyr
                85                  90                  95
Asn Gln Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser
            100                 105                 110
Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala
        115                 120                 125
Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Glu Lys Tyr Gly Asn Tyr Tyr Ala Met Asp
    130                 135                 140
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly
145                 150                 155                 160
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Val Met Ser
                165                 170                 175
Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ala Val Ser Ala Gly Glu Lys Val Thr Met
            180                 185                 190
Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser Arg Thr Arg Lys Asn
        195                 200                 205
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu
    210                 215                 220
Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr
225                 230                 235                 240
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Val Gln
                245                 250                 255
Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Lys Gln Ser Tyr Asn Leu Arg
            260                 265                 270
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Glu Phe Gly Gly Ala
        275                 280                 285
Pro Glu Phe Pro Lys Pro Ser Thr Pro Pro Gly Ser Ser Gly Leu Glu
    290                 295                 300
Gly Gly Ser Leu Ala Ala Leu Thr Ala His Gln Ala Cys His Leu Pro
305                 310                 315                 320
Leu Glu Thr Phe Thr Arg His Arg Gln Pro Arg Gly Trp Glu Gln Leu
                325                 330                 335
Glu Gln Cys Gly Tyr Pro Val Gln Arg Leu Val Ala Leu Tyr Leu Ala
            340                 345                 350
Ala Arg Leu Ser Trp Asn Gln Val Asp Gln Val Ile Arg Asn Ala Leu
        355                 360                 365
Ala Ser Pro Gly Ser Gly Gly Asp Leu Gly Glu Ala Ile Arg Glu Gln
    370                 375                 380
Pro Glu Gln Ala Arg Leu Ala Leu Thr Leu Ala Ala Ala Glu Ser Glu
385                 390                 395                 400
Arg Phe Val Arg Gln Gly Thr Gly Asn Asp Glu Ala Gly Ala Ala Asn
                405                 410                 415
Ala Asp Val Val Ser Leu Thr Cys Pro Val Ala Ala Gly Glu Cys Ala
            420                 425                 430
Gly Pro Ala Asp Ser Gly Asp Ala Leu Leu Glu Arg Asn Tyr Pro Thr
        435                 440                 445
Gly Ala Glu Phe Leu Gly Asp Gly Gly Asp Val Ser Phe Ser Thr Arg
    450                 455                 460
Gly Thr Gln Asn Trp Thr Val Glu Arg Leu Leu Gln Ala His Arg Gln
465                 470                 475                 480
Leu Glu Glu Arg Gly Tyr Val Phe Val Gly Tyr His Gly Thr Phe Leu
                485                 490                 495
Glu Ala Ala Gln Ser Ile Val Phe Gly Gly Val Arg Ala Arg Ser Gln
            500                 505                 510
Asp Leu Asp Ala Ile Trp Arg Gly Phe Tyr Ile Ala Gly Asp Pro Ala
        515                 520                 525
Leu Ala Tyr Gly Tyr Ala Gln Asp Gln Glu Pro Asp Ala Arg Gly Arg
    530                 535                 540
Ile Arg Asn Gly Ala Leu Leu Arg Val Tyr Val Pro Arg Ser Ser Leu
545                 550                 555                 560
Pro Gly Phe Tyr Arg Thr Ser Leu Thr Leu Ala Ala Pro Glu Ala Ala
                565                 570                 575
Gly Glu Val Glu Arg Leu Ile Gly His Pro Leu Pro Leu Arg Leu Asp
            580                 585                 590
Ala Ile Thr Gly Pro Glu Glu Glu Gly Gly Arg Leu Glu Thr Ile Leu
        595                 600                 605
Gly Trp Pro Leu Ala Glu Arg Thr Val Val Ile Pro Ser Ala Ile Pro
    610                 615                 620
Thr Asp Pro Arg Asn Val Gly Gly Asp Leu Asp Pro Ser Ser Ile Pro
625                 630                 635                 640
Asp Lys Glu Gln Ala Ile Ser Ala Leu Pro Asp Tyr Ala Ser Gln Pro
                645                 650                 655
Gly Lys Pro Pro Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys Lys Asp Glu Leu
            660                 665                 670
<210>26
<211>20
<212>DNA
<213>人工的
 
<220>
<223>用于扩增全长Grp78基因的引物
 
<400>26
atgaagctct ccctggtggc    20
 
<210>27
<211>25
<212>DNA
<213>人工的
 
<220>
<223>用于扩增全长Grp78基因的引物
 
<400>27
ctacaactca tctttttctg ctgta    25
 
<210>28
<211>38
<212>DNA
<213>人工的
 
<220>
<223>用于扩增GST-Grp78融合基因序列的引物
 
<400>28
aaaggatccg aggaggagga caagaaggag gacgtggg    38
 
<210>29
<211>39
<212>DNA
<213>人工的
 
<220>
<223>用于扩增GST-Grp78融合基因序列的引物
 
<400>29
tttctcgagc tacaactcat ctttttctgc tgtatcctc    39
 
<210>30
<211>43
<212>DNA
<213>人工的
 
<220>
<223>用于扩增GST-Grp78融合基因序列的引物
 
<400>30
tttctcgagc taatcagaat cttccaacac tttctggacg ggc 43
 
<210>31
<211>34
<212>DNA
<213>人工的
 
<220>
<223>用于扩增GST-Grp78融合基因序列的引物
 
<400>31
aaaggatccc ggcgcgaggt agaaaaggcc aaac          34
 
<210>32
<211>35
<212>DNA
<213>人工的
 
<220>
<223>用于扩增GST-Grp78融合基因序列的引物
 
<400>32
ttctcgagct aggtaggcac cactgtgttc cttgg    35
 
<210>33
<211>35
<212>DNA
<213>人工的
 
<220>
<223>用于扩增GST-Grp78融合基因序列的引物
 
<400>33
ttctcgagct agatttcttc aggtgtcagg cgatt    35
 
<210>34
<211>34
<212>DNA
<213>人工的
 
<220>
<223>用于扩增GST-Grp78融合基因序列的引物
 
<400>34
tttggatccg tgttggaaga ttctgatttg aaga    34
 
<210>35
<211>35
<212>DNA
<213>人工的
 
<220>
<223>用于扩增GST-Grp78融合基因序列的引物
 
<400>35
ttctcgagct aggatggttc cttgccattg aagaa    35
 
<210>36
<211>32
<212>DNA
<213>人工的
 
<220>
<223>用于扩增GST-Grp78融合基因序列的引物
 
<400>36
aaaggatcca aagagttctt caatggcaag ga    32
<210>37
<211>35
<212>DNA
<213>人工的
 
<220>
<223>用于扩增GST-Grp78融合基因序列的引物
 
<400>37
ttctcgagct ataccaggtc acctgtatct tgatc    35
 
<210>38
<211>33
<212>DNA
<213>人工的
 
<220>
<223>用于扩增GST-Grp78融合基因序列的引物
 
<400>38
aaaggatcct ctggtgatca agatacaggt gac    33
 
<210>39
<211>23
<212>DNA
<213>人工的
 
<220>
<223>用于克隆编码GA-20抗体的轻链可变区的核苷酸序列的引物
 
<400>39
gctcactgga tggtgggaag atg                23
 
<210>40
<211>23
<212>DNA
<213>人工的
 
<220>
<223>用于克隆编码GA-20抗体的重链可变区的核苷酸序列的引物
 
<400>40
ccaccagatt cttatcagac agg                                            23
 
<210>41
<211>87
<212>DNA
<213>人工的
 
<220>
<223>用于产生编码源于GA-20抗体的单链Fv的核苷酸序列的引物
 
<400>41
taagaattcg gtggcgcgcc ggagttcccg aaaccgtcca ccccgccggg ttcttctggt  60
ttagagggcg gcagcctggc cgcgctg                                      87
 
<210>42
<211>75
<212>DNA
<213>人工的
 
<220>
<223>用于产生编码源于GA-20抗体的单链Fv的核苷酸序列的引物
 
<400>42
acttagcggc cgctcactac agttcgtctt tcttatcgtc gtcatccttg tagtccggcg  60
gtttgccggg ctggc                                                   75
 
<210>43
<211>15
<212>PRT
<213>人工的
 
<220>
<223>Linker polypeptide of scFv sntibody.
 
<400>43
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1               5                   10                  15
 
<210>44
<211>31
<212>DNA
<213>人工的
 
<220>
<223>用于扩增编码源于GA-20抗体的单链Fv的核苷酸序列的引物
 
<400>44
aaaagcttga ggtccagctg caacagtctg g                               31
 
<210>45
<211>56
<212>DNA
<213>人工的
 
<220>
<223>用于产生编码源于GA-20抗体的单链Fv的核苷酸序列的引物
 
<400>45
cccgaaccac caccacccga accaccacca cctgaggaga cggtgactga ggttcc    56
 
<210>46
<211>65
<212>DNA
<213>人工的
 
<220>
<223>用于产生编码源于GA-20抗体的单链Fv的核苷酸序列的引物
 
<400>46
tggttcgggt ggtggtggtt cgggtggtgg cggatcggac attgtgatgt cacagtctcc  60
atcct                                                              65 
 
<210>47
<211>31
<212>DNA
<213>人工的
 
<220>
<223>用于产生编码源于GA-20抗体的单链Fv的核苷酸序列的引物
 
<400>47
ttgaattctt tgatttccag cttggtgcct c                             31
 
<210>48
<211>54
<212>DNA
<213>人工的
 
<220>
<223>用于扩增对应于GRP78(376-391)区域的核苷酸序列的引物
 
<400>48
gatccaaaga gttcttcaat ggcaaggaac catcccgtgg cataaaccca gatc    54
 
<210>49
<211>54
<212>DNA
<213>人工的
 
<220>
<223>用于扩增对应于GRP78(376-391)区域的核苷酸序列的引物
 
<400>49
tcgagatctg ggtttatgcc acgggatggt tccttgccat tgaagaactc tttg    54
 
<210>50
<211>54
<212>DNA
<213>人工的
 
<220>
<223>用于扩增对应于GRP78(384-399)区域的核苷酸序列的引物
 
<400>50
gatccccatc ccgtggcata aacccagatg aagctgtagc gtatggtgct gctc    54
<210>51
<211>54
<212>DNA
<213>人工的
 
<220>
<223>用于扩增对应于GRP78(384-399)区域的核苷酸序列的引物
 
<400>51
tcgagagcag caccatacgc tacagcttca tctgggttta tgccacggga tggg    54
 
<210>52
<211>54
<212>DNA
<213>人工的
 
<220>
<223>用于扩增对应于GRP78(392-407)区域的核苷酸序列的引物
 
<400>52
gatccgaagc tgtagcgtat ggtgctgctg tccaggctgg tgtgctctct ggtc    54
 
<210>53
<211>54
<212>DNA
<213>人工的
 
<220>
<223>用于扩增对应于GRP78(392-407)区域的核苷酸序列的引物
 
<400>53
tcgagaccag agagcacacc agcctggaca gcagcaccat acgctacagc ttcg    54
 
<210>54
<211>54
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>用于扩增对应于GRP78(400-415)区域的核苷酸序列的引物
 
<400>54
gatccgtcca ggctggtgtg ctctctggtg atcaagatac aggtgacctg gtac    54
 
<210>55
<211>53
<212>DNA
<213>人工的
 
<220>
<223>用于扩增对应于GRP78(400-415)区域的核苷酸序列的引物
 
<400>55
tcgagtacca ggtcacctgt atcttgatca ccagagagca caccagcctg gac    53
 
<210>56
<211>23
<212>DNA
<213>人工的
 
<220>
<223>用于克隆编码GC-18、GC-20、GD-4和GD-17抗体的重链可变区的核苷酸序列的引物
 
<400>56
ccaccagatt cttatcagac agg                                     23
 
<210>57
<211>402
<212>DNA
<213>小鼠
 
<400>57
atgagagtgt tgattcttgt gtacctgttg acagcccttc ctggtatctt gtcagatgta   60
cggcttcagg agtcaggacc tggccaggtg aagccttctc agacagtgtc cctcacctgc  120
tctgtcactg gctactctat cactaatggt aatcactggt ggaactggat ccggcaggtt  180
tcaggatcca aactggagtg gatagggtac ataagttcca gtggtagcac tgacagcaat    240
ccatctctca aaagtcgaat ctccatcact agagacactt ccaagaacca gttattcctg    300
cagttgaact ctgtgactac tgaagatata gccacatatt actgtgcaag aggctactac    360
tttgactact ggggccaagg caccactctc acagtctcct ca                       402
 
<210>58
<211>116
<212>PRT
<213>小鼠
 
<400>58
 
Asp Val Arg Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Gln Val Lys Pro Ser Gln
1               5                   10                  15
Thr Val Ser Leu Thr Cys Ser Val Thr Gly Tyr Ser Ile Thr Asn Gly
            20                  25                  30
Asn His Trp Trp Asn Trp Ile Arg Gln Val Ser Gly Ser Lys Leu Glu
        35                  40                  45
Trp Ile Gly Tyr Ile Ser Ser Ser Gly Ser Thr Asp Ser Asn Pro Ser
    50                  55                  60
Leu Lys Ser Arg Ile Ser Ile Thr Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Leu
65                  70                  75                  80
Phe Leu Gln Leu Asn Ser Val Thr Thr Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr
                85                  90                  95
Cys Ala Arg Gly Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu
            100                 105                 110
Thr Val Ser Ser
        115
 
<210>59
<211>393
<212>DNA
<213>小鼠
 
<400>59
atggagacag acacactcct gctatgggtg ctgctgctct gggttccagg ctccactggt   60
gacattgtgc tcacccaatc tccagcttct ttggctgtgt ctctagggca gagtgtcacc  120
atctcctgca gagccagtga aagtgttgaa tattatggca ctagtttaat gcagtggtac  180
caacagaaac caggacagcc acccaaactc ctcatctatg ctacatccaa cgtggaatct  240
ggggtccctg ccaggtttag tggcagtggg tctgggacag acttcagcct caacatccat  300
cctgtggagg aggatgatat tgcaatgtat ttctgtcagc aaagtaggaa acttccttcg  360
acgttcggtg gaggcaccaa gctggaaatc aaa                               393
 
<210>60
<211>111
<212>PRT
<213>小鼠
 
<400>60
 
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1               5                   10                  15
Gln Ser Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Glu Tyr Tyr
            20                  25                  30
Gly Thr Ser Leu Met Gln Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro
        35                  40                  45
Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Thr Ser Asn Val Glu Ser Gly Val Pro Ala
    50                  55                  60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Ser Leu Asn Ile His
65                  70                  75                  80
Pro Val Glu Glu Asp Asp Ile Ala Met Tyr Phe Cys Gln Gln Ser Arg
                85                  90                  95
Lys Leu Pro Ser Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
            100                 105                 110
 
<210>61
<211>7
<212>PRT
<213>小鼠
 
<400>61
 
Asn Gly Asn His Trp Trp Asn
1               5
 
<210>62
<211>16
<212>PRT
<213>小鼠
 
<400>62
 
Tyr Ile Ser Ser Ser Gly Ser Thr Asp Ser Asn Pro Ser Leu Lys Ser
1               5                   10                  15
 
<210>63
<211>6
<212>PRT
<213>小鼠
 
<400>63
Gly Tyr Tyr Phe Asp Tyr
1               5
 
<210>64
<211>15
<212>PRT
<213>小鼠
 
<400>64
 
Arg Ala Ser Glu Ser Val Glu Tyr Tyr Gly Thr Ser Leu Met Gln
1               5                   10                  15
 
<210>65
<211>7
<212>PRT
<213>小鼠
 
<400>65
 
Ala Thr Ser Asn Val Glu Ser
1               5
 
<210>66
<211>9
<212>PRT
<213>小鼠
 
<400>66
 
Gln Gln Ser Arg Lys Leu Pro Ser Thr
1               5
 
<210>67
<211>402
<212>DNA
<213>小鼠
 
<400>67
atgagagtgt tgattcctgt gtacctgttg acagcccttc ctggtatctt gtctgatgta     60
cgacttcagg agtcaggacc tggcctggtg aagccttctc agacagtgtc cctcacctgc    120
actgtcactg gctactctat cactaatggt aatcactggt ggaactggat ccggcaggtt    180
tcaggaagca aactggagtg gatagggtac ataagctcca gtggtagcac tgacagcaat    240
ccatctctca aaagtcgaat ctccatcact agagacactt ccaagaacca gttattcctg    300
cagttgaact ctgtgactac tgaagatata gccacatatt actgtgcaag aggctactac    360
tttgactact ggggccaagg caccactctc acagtctcct ca                       402
 
<210>68
<211>116
<212>PRT
<213>小鼠
 
<400>68
 
Asp Val Arg Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
1               5                   10                  15
Thr Val Ser Leu Thr Cys Thr Val Thr Gly Tyr Ser Ile Thr Asn Gly
            20                  25                  30
Asn His Trp Trp Asn Trp Ile Arg Gln Val Ser Gly Ser Lys Leu Glu
        35                  40                  45
Trp Ile Gly Tyr Ile Ser Ser Ser Gly Ser Thr Asp Ser Asn Pro Ser
    50                  55                  60
Leu Lys Ser Arg Ile Ser Ile Thr Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Leu
65                  70                  75                  80
Phe Leu Gln Leu Asn Ser Val Thr Thr Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr
                85                  90                  95
Cys Ala Arg Gly Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu
            100                 105                 110
Thr Val Ser Ser
        115
 
<210>69
<211>408
<212>DNA
<213>小鼠
 
<400>69
atgcatcaga ccagcatggg catcaagatg gaatcacaga ctctggtcct catatccata    60
ctgctctggt tatatggagc tgatgggaac attgtaatga cccaatctcc caaatccatg    120
tccatgtcag taggagagag ggtcaccttg acctgcaagg ccagtgagaa tgtggttact    180
tatgtttcct ggtatcaaca gaaaccagag cagtctccta aactgctgat atacggggca    240
tccaaccggt acactggggt ccccgatcgc ttcacaggca gtggatctgc aacagatttc    300
actctgacca tcagcagtgt gcaggctgaa gaccttgcag attatcactg tggacagggt    360
tacagctatc cgtacacgtt cggagggggg accaagctgg aaataaaa                 408
 
<210>70
<211>107
<212>PRT
<213>小鼠
 
<400>70
 
Asn Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Lys Ser Met Ser Met Ser Val Gly
1                5                   10                  15
Glu Arg Val Thr Leu Thr Cys Lys Ala Ser Glu Asn Val Val Thr Tyr
            20                  25                  30
Val Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Glu Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile
        35                  40                  45
Tyr Gly Ala Ser Asn Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly
    50                  55                  60
Ser Gly Ser Ala Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Val Gln Ala
65                  70                  75                  80
Glu Asp Leu Ala Asp Tyr His Cys Gly Gln Gly Tyr Ser Tyr Pro Tyr
                85                  90                  95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
            100                 105
 
<210>71
<211>7
<212>PRT
<213>小鼠
 
<400>71
 
Asn Gly Asn His Trp Trp Asn
1               5
 
<210>72
<211>16
<212>PRT
<213>小鼠
 
<400>72
 
Tyr Ile Ser Ser Ser Gly Ser Thr Asp Ser Asn Pro Ser Leu Lys Ser
1               5                   10                  15
<210>73
<211>6
<212>PRT
<213>小鼠
 
<400>73
 
Gly Tyr Tyr Phe Asp Tyr
1               5
 
<210>74
<211>11
<212>PRT
<213>小鼠
 
<400>74
 
Lys Ala Ser Glu Asn Val Val Thr Tyr Val Ser
1               5                   10
 
<210>75
<211>7
<212>PRT
<213>小鼠
 
<400>75
 
Gly Ala Ser Asn Arg Tyr Thr
1               5
 
<210>76
<211>9
<212>PRT
<213>小鼠
 
<400>76
 
Gly Gln Gly Tyr Ser Tyr Pro Tyr Thr
1               5
<210>77
<211>423
<212>DNA
<213>小鼠
 
<400>77
atgctgttgg ggctgaagtg ggttttcttt gttgtttttt atcaaggtgt gcattgtgag     60
gtgcagcttg ttgagactgg tggaggattg gtgcagccta aagggtcatt gaaactctca    120
tgtgcagcct ctggattcac cttcaatacc aatgccatga actgggtccg ccaggctcca    180
ggaaagggtt tggaatgggt tgctcgcata agaagtaaaa gtaataatta tgcagcatat    240
tatgccgatt cagtgaaaga caggttcacc atctccagag atgattcaca aagcatgctc    300
tatctgcaaa tgaacaactt gaaaactgag gacacagcca tgtattactg tgtgagagaa    360
ggctacggtt atagcttata ttttgactac tggggccaag gcaccactct cacagtctcc    420
tca                                                                  423
 
<210>78
<211>122
<212>PRT
<213>小鼠
 
<400>78
 
Glu Val Gln Leu Val Glu Thr Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Lys Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Thr Asn
            20                  25                  30
Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
        35                  40                  45
Ala Arg Ile Arg Ser Lys Ser Asn Asn Tyr Ala Ala Tyr Tyr Ala Asp
    50                  55                  60
Ser Val Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Gln Ser Met
65                  70                  75                  80
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Asn Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Met Tyr
                85                  90                  95
Tyr Cys Val Arg Glu Gly Tyr Gly Tyr Ser Leu Tyr Phe Asp Tyr Trp
            100                 105                 110
Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser
        115                 120
 
<210>79
<211>399
<212>DNA
<213>小鼠
 
<400>79
atggagtttc agacccaggt actcatgtcc ctgctgctct gcatgtctgg tgcctgtgca     60
gacattgtga tgactcagtc tccaactttc cttgctgtga cagcaagtaa gaaggtcacc    120
attaattgca cggccagtga gagcctttat tcaagcaaac acaaggtgca ctacttggct    180
tggtaccaga agaaaccaga tcaatctcct aaactgctga tatacggggc atccaaccga    240
tacattgggg tccctgatcg cttcacaggc agtggatctg ggacagattt cactctgacc    300
atcagcagtg tacaggttga agacctcaca cattattact gtgcacagtt ttacagctat    360
cctctcacgt tcggtgctgg gaccaagctg gagctgaaa                           399
 
<210>80
<211>113
<212>PRT
<213>小鼠
<400>80
 
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Thr Phe Leu Ala Val Thr Ala Ser
1               5                   10                  15
Lys Lys Val Thr Ile Asn Cys Thr Ala Ser Glu Ser Leu Tyr Ser Ser
            20                  25                  30
Lys His Lys Val His Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Lys Lys Pro Asp Gln
        35                  40                  45
Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Asn Arg Tyr Ile Gly Val
    50                  55                  60
Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65                  70                  75                  80
Ile Ser Ser Val Gln Val Glu Asp Leu Thr His Tyr Tyr Cys Ala Gln
                85                  90                  95
Phe Tyr Ser Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu
            100                 105                 110
Lys
 
<210>81
<211>5
<212>PRT
<213>小鼠
 
<400>81
 
Thr Asn Ala Met Asn
1               5
<210>82
<211>19
<212>PRT
<213>小鼠
 
<400>82
 
Arg Ile Arg Ser Lys Ser Asn Asn Tyr Ala Ala Tyr Tyr Ala Asp Ser
1               5                   10                  15
Val Lys Asp
 
<210>83
<211>11
<212>PRT
<213>小鼠
 
<400>83
 
Glu Gly Tyr Gly Tyr Ser Leu Tyr Phe Asp Tyr
1               5                   10
 
<210>84
<211>17
<212>PRT
<213>小鼠
 
<400>84
 
Thr Ala Ser Glu Ser Leu Tyr Ser Ser Lys His Lys Val His Tyr Leu
1               5                   10                  15
Ala
 
<210>85
<211>7
<212>PRT
<213>小鼠
 
<400>85
 
Gly Ala Ser Asn Arg Tyr Ile
1               5
 
<210>86
<211>9
<212>PRT
<213>小鼠
 
<400>86
 
Ala Gln Phe Tyr Ser Tyr Pro Leu Thr
1               5
 
<210>87
<211>408
<212>DNA
<213>小鼠
 
<400>87
atggaatgta actggatact tccttttatt ctgtcagtaa cttcaggtgt ctactcacag     60
gttcagctcc agcagtctgg ggctgaactg gcaagacctg gggcttcagt gaagttgtcc    120
tgcaaggctt ctggctacac ctttactagc tactggatgc attgggtaaa acagaggcct    180
ggacagggtc tggaatggat tggggctatt tatcctggag atggtgatac taggtacact    240
cagaagttca agggcaaggc cacattgact gcagataaat cctccagcac agcctacatg    300
caactcagca gcttggcatc tgaggactct gcggtctatt actgtgcaag cggaattact    360
gcggtagccg actactgggg ccaaggcacc actctcacag tctcctca                 408
 
<210>88
<211>117
<212>PRT
<213>小鼠
 
<400>88
 
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Arg Pro Gly Ala
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
            20                  25                  30
Trp Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
        35                  40                  45
Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Thr Arg Tyr Thr Gln Lys Phe
    50                  55                  60
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Met Gln Leu Ser Ser Leu Ala Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Ser Gly Ile Thr Ala Val Ala Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr
            100                 105                 110
Leu Thr Val Ser Ser
        115
 
<210>89
<211>393
<212>DNA
<213>小鼠
 
<400>89
atgaagttgc ctgttaggct gttggtgctg atgttctgga ttcctgcttc cagcagtgat    60
gttgtgatga cccaaactcc actctccctg cctgtcagtc ttggagatca agcctccatc    120
tcttgcagat ctagtcagag ccttgtacac agtaatggaa acacctattt acattggtac    180
ctgcagaagc caggccagtc tccaaagctc ctgatctaca aagtttccaa ccgattttct    240
ggggtcccag acaggttcag tggcagtgga tcagggacag atttcacact caagatcagc    300
agagtggagg ctgaggatct gggagtttat ttctgctctc aaagtacaca tgttccgctc    360
acgttcggtg ctgggaccaa gctggagctg aaa                                 393
 
<210>90
<211>112
<212>PRT
<213>小鼠
 
<400>90
 
Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly
1               5                   10                  15
Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser
            20                  25                  30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
        35                  40                  45
Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
    50                  55                  60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65                  70                  75                  80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Phe Cys Ser Gln Ser
                85                  90                  95
Thr His Val Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys
            100                 105                 110
 
<210>91
<211>5
<212>PRT
<213>小鼠
 
<400>91
 
Ser Tyr Trp Met His
1               5
 
<210>92
<211>17
<212>PRT
<213>小鼠
 
<400>92
 
Ala Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Thr Arg Tyr Thr Gln Lys Phe Lys
1               5                   10                  15
Gly
 
<210>93
<211>8
<212>PRT
<213>小鼠
 
<400>93
 
Gly Ile Thr Ala Val Ala Asp Tyr
1               5
 
<210>94
<211>16
<212>PRT
<213>小鼠
 
<400>94
 
Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His
1               5                  10                  15
 
<210>95
<211>7
<212>PRT    
<213>小鼠
 
<400>95
 
Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser
1               5
 
<210>96
<211>9
<212>PRT
<213>小鼠
 
<400>96
 
Ser Gln Ser Thr His Val Pro Leu Thr
1               5
 
<210>97
<211>31
<212>DNA
<213>人工的
 
<220>
<223>用于扩增编码GD-17抗体的重链可变区的核苷酸序列的正向引物
 
<400>97
aaaagcttca ggttcagctc cagcagtctg g                        31
 
<210>98
<211>57
<212>DNA
<213>人工的
 
<220>
<223>用于扩增编码GD-17抗体的重链可变区的核苷酸序列的反向引物
 
<400>98
cccgaaccac caccacccga accaccacca cctgaggaga ctgtgagagt ggtgcct    57
 
<210>99
<211>62
<212>DNA
<213>人工的
 
<220>
<223>用于扩增编码GD-17抗体的轻链可变区的核苷酸序列的正向引物
 
<400>99
tggttcgggt ggtggtggtt cgggtggtgg cggatcggat gttgtgatga cccaaactcc  60
ac                                                                 62
 
<210>100
<211>29
<212>DNA
<213>人工的
 
<220>
<223>用于扩增编码GD-17抗体的轻链可变区的核苷酸序列的反向引物
 
<400>100
ttgaattctt tcagctccag cttggtccc                                   29
 
<210>101
<211>2013
<212>DNA
<213>小鼠
 
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(2013)
<223>
 
<400>101
 
atg aaa tac ctg ctg ccg acc gct gct gct ggt ctg ctg ctc ctc gct    48
Met Lys Tyr Leu Leu Pro Thr Ala Ala Ala Gly Leu Leu Leu Leu Ala
1               5                  10                  15
gcc cag ccg gcg atg gcc atg gat cac cat cac cat cac cat cac cat    96
Ala Gln Pro Ala Met Ala Met Asp His His His His His His His His
            20                  25                  30
cat cac aag ctt cag gtt cag ctc cag cag tct ggg gct gaa ctg gca    144
His His Lys Leu Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala
        35                  40                  45
aga cct ggg gct tca gtg aag ttg tcc tgc aag gct tct ggc tac acc    192
Arg Pro Gly Ala Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr
    50                  55                  60
ttt act agc tac tgg atg cat tgg gta aaa cag agg cct gga cag ggt    240
Phe Thr Ser Tyr Trp Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly
65                  70                  75                  80
ctg gaa tgg att ggg gct att tat cct gga gat ggt gat act agg tac    288
Leu Glu Trp Ile Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Thr Arg Tyr
               85                  90                  95
act cag aag ttc aag ggc aag gcc aca ttg act gca gat aaa tcc tcc    336
Thr Gln Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser
            100                 105                 110
agc aca gcc tac atg caa ctc agc agc ttg gca tct gag gac tct gcg    384
Ser Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu Ala Ser Glu Asp Ser Ala
        115                 120                 125
gtc tat tac tgt gca agc gga att act gcg gta gcc gac tac tgg ggc    432
Val Tyr Tyr Cys Ala Ser Gly Ile Thr Ala Val Ala Asp Tyr Trp Gly
    130                 135                 140
caa ggc acc act ctc aca gtc tcc tca ggt ggt ggt ggt tcg ggt ggt    480
Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
145                 150                 155                 160
ggt ggt tcg ggt ggt ggc gga tcg gat gtt gtg atg acc caa act cca    528
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro
                165                 170                 175
ctc tcc ctg cct gtc agt ctt gga gat caa gcc tcc atc tct tgc aga    576
Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg
            180                 185                 190
tct agt cag agc ctt gta cac agt aat gga aac acc tat tta cat tgg    624
Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp
        195                 200                 205
tac ctg cag aag cca ggc cag tct cca aag ctc ctg atc tac aaa gtt    672
Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val
    210                 215                 220
tcc aac cga ttt tct ggg gtc cca gac agg ttc agt ggc agt gga tca    720
Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser
225                 230                 235                 240
ggg aca gat ttc aca ctc aag atc agc aga gtg gag gct gag gat ctg    768
Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu
                245                 250                 255
gga gtt tat ttc tgc tct caa agt aca cat gtt ccg ctc acg ttc ggt    816
Gly Val Tyr Phe Cys Ser Gln Ser Thr His Val Pro Leu Thr Phe Gly
            260                 265                 270
gct ggg acc aag ctg gag ctg aaa gaa ttc ggt ggc gcg ccg gag ttc    864
Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Glu Phe Gly Gly Ala Pro Glu Phe
        275                 280                 285
ccg aaa ccg tcc acc ccg ccg ggt tct tct ggt tta gag ggc ggc agc    912
Pro Lys Pro Ser Thr Pro Pro Gly Ser Ser Gly Leu Glu Gly Gly Ser
    290                 295                 300
ctg gcc gcg ctg acc gcg cac cag gct tgc cac ctg ccg ctg gag act    960
Leu Ala Ala Leu Thr Ala His Gln Ala Cys His Leu Pro Leu Glu Thr
305                 310                 315                 320
ttc acc cgt cat cgc cag ccg cgc ggc tgg gaa caa ctg gag cag tgc    1008
Phe Thr Arg His Arg Gln Pro Arg Gly Trp Glu Gln Leu Glu Gln Cys
                325                 330                 335
ggc tat ccg gtg cag cgg ctg gtc gcc ctc tac ctg gcg gcg cgg ctg    1056
Gly Tyr Pro Val Gln Arg Leu Val Ala Leu Tyr Leu Ala Ala Arg Leu
            340                 345                 350
tcg tgg aac cag gtc gac cag gtg atc cgc aac gcc ctg gcc agc ccc    1104
Ser Trp Asn Gln Val Asp Gln Val Ile Arg Asn Ala Leu Ala Ser Pro
        355                 360                 365
ggc agc ggc ggc gac ctg ggc gaa gcg atc cgc gag cag ccg gag cag    1152
Gly Ser Gly Gly Asp Leu Gly Glu Ala Ile Arg Glu Gln Pro Glu Gln
    370                 375                 380
gcc cgt ctg gcc ctg acc ctg gcc gcc gcc gag agc gag cgc ttc gtc    1200
Ala Arg Leu Ala Leu Thr Leu Ala Ala Ala Glu Ser Glu Arg Phe Val
385                 390                 395                 400
cgg cag ggc acc ggc aac gac gag gcc ggc gcg gcc aac gcc gac gtg    1248
Arg Gln Gly Thr Gly Asn Asp Glu Ala Gly Ala Ala Asn Ala Asp Val
                405                 410                 415
gtg agc ctg acc tgc ccg gtc gcc gcc ggt gaa tgc gcg ggc ccg gcg    1296
Val Ser Leu Thr Cys Pro Val Ala Ala Gly Glu Cys Ala Gly Pro Ala
            420                 425                 430
gac agc ggc gac gcc ctg ctg gag cgc aac tat ccc act ggc gcg gag    1344
Asp Ser Gly Asp Ala Leu Leu Glu Arg Asn Tyr Pro Thr Gly Ala Glu
        435                 440                 445
ttc ctc ggc gac ggc ggc gac gtc agc ttc agc acc cgc ggc acg cag    1392
Phe Leu Gly Asp Gly Gly Asp Val Ser Phe Ser Thr Arg Gly Thr Gln
    450                 455                 460
aac tgg acg gtg gag cgg ctg ctc cag gcg cac cgc caa ctg gag gag    1440
Asn Trp Thr Val Glu Arg Leu Leu Gln Ala His Arg Gln Leu Glu Glu
465                 470                 475                 480
cgc ggc tat gtg ttc gtc ggc tac cac ggc acc ttc ctc gaa gcg gcg    1488
Arg Gly Tyr Val Phe Val Gly Tyr His Gly Thr Phe Leu Glu Ala Ala
                485                 490                 495
caa agc atc gtc ttc ggc ggg gtg cgc gcg cgc agc cag gac ctc gac    1536
Gln Ser Ile Val Phe Gly Gly Val Arg Ala Arg Ser Gln Asp Leu Asp
            500                 505                 510
gcg atc tgg cgc ggt ttc tat atc gcc ggc gat ccg gcg ctg gcc tac    1584
Ala Ile Trp Arg Gly Phe Tyr Ile Ala Gly Asp Pro Ala Leu Ala Tyr
        515                 520                 525
ggc tac gcc cag gac cag gaa ccc gac gca cgc ggc cgg atc cgc aac    1632
Gly Tyr Ala Gln Asp Gln Glu Pro Asp Ala Arg Gly Arg Ile Arg Asn
    530                 535                 540
ggt gcc ctg ctg cgg gtc tat gtg ccg cgc tcg agc ctg ccg ggc ttc    1680
Gly Ala Leu Leu Arg Val Tyr Val Pro Arg Ser Ser Leu Pro Gly Phe
545                 550                 555                 560
tac cgc acc agc ctg acc ctg gcc gcg ccg gag gcg gcg ggc gag gtc    1728
Tyr Arg Thr Ser Leu Thr Leu Ala Ala Pro Glu Ala Ala Gly Glu Val
                565                 570                 575
gaa cgg ctg atc ggc cat ccg ctg ccg ctg cgc ctg gac gcc atc acc    1776
Glu Arg Leu Ile Gly His Pro Leu Pro Leu Arg Leu Asp Ala Ile Thr
            580                 585                 590
ggc ccc gag gag gaa ggc ggg cgc ctg gag acc att ctc ggc tgg ccg    1824
Gly Pro Glu Glu Glu Gly Gly Arg Leu Glu Thr Ile Leu Gly Trp Pro
        595                 600                 605
ctg gcc gag cgc acc gtg gtg att ccc tcg gcg atc ccc acc gac ccg    1872
Leu Ala Glu Arg Thr Val Val Ile Pro Ser Ala Ile Pro Thr Asp Pro
    610                 615                 620
cgc aac gtc ggc ggc gac ctc gac ccg tcc agc atc ccc gac aag gaa    1920
Arg Asn Val Gly Gly Asp Leu Asp Pro Ser Ser Ile Pro Asp Lys Glu
625                 630                 635                 640
cag gcg atc agc gcc ctg ccg gac tac gcc agc cag ccc ggc aaa ccg    1968
Gln Ala Ile Ser Ala Leu Pro Asp Tyr Ala Ser Gln Pro Gly Lys Pro
                645                 650                 655
ccg gac tac aag gat gac gac gat aag aaa gac gaa ctg tag tga        2013
Pro Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys Lys Asp Glu Leu
            660                 665
 
<210>102
<211>669
<212>PRT
<213>小鼠
<400>102
 
Met Lys Tyr Leu Leu Pro Thr Ala Ala Ala Gly Leu Leu Leu Leu Ala
1               5                  10                  15
Ala Gln Pro Ala Met Ala Met Asp His His His His His His His His
            20                  25                  30
His His Lys Leu Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala
        35                  40                  45
Arg Pro Gly Ala Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr
    50                  55                  60
Phe Thr Ser Tyr Trp Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly
65                  70                  75                  80
Leu Glu Trp Ile Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Thr Arg Tyr
                85                  90                  95
Thr Gln Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser
            100                 105                 110
Ser Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu Ala Ser Glu Asp Ser Ala
        115                 120                 125
Val Tyr Tyr Cys Ala Ser Gly Ile Thr Ala Val Ala Asp Tyr Trp Gly
    130                 135                 140
Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
145                 150                 155                 160
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro
                165                 170                 175
Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg
            180                 185                 190
Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp
        195                 200                 205
Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val
    210                 215                 220
Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser
225                 230                 235                 240
Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu
                245                 250                 255
Gly Val Tyr Phe Cys Ser Gln Ser Thr His Val Pro Leu Thr Phe Gly
            260                 265                 270
Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Glu Phe Gly Gly Ala Pro Glu Phe
        275                 280                 285
Pro Lys Pro Ser Thr Pro Pro Gly Ser Ser Gly Leu Glu Gly Gly Ser
    290                 295                 300
Leu Ala Ala Leu Thr Ala His Gln Ala Cys His Leu Pro Leu Glu Thr
305                 310                 315                 320
Phe Thr Arg His Arg Gln Pro Arg Gly Trp Glu Gln Leu Glu Gln Cys
                325                 330                 335
Gly Tyr Pro Val Gln Arg Leu Val Ala Leu Tyr Leu Ala Ala Arg Leu
            340                 345                 350
Ser Trp Asn Gln Val Asp Gln Val Ile Arg Asn Ala Leu Ala Ser Pro
        355                 360                 365
Gly Ser Gly Gly Asp Leu Gly Glu Ala Ile Arg Glu Gln Pro Glu Gln
    370                 375                 380
Ala Arg Leu Ala Leu Thr Leu Ala Ala Ala Glu Ser Glu Arg Phe Val
385                 390                 395                 400
Arg Gln Gly Thr Gly Asn Asp Glu Ala Gly Ala Ala Asn Ala Asp Val
                405                 410                 415
Val Ser Leu Thr Cys Pro Val Ala Ala Gly Glu Cys Ala Gly Pro Ala
            420                 425                 430
Asp Ser Gly Asp Ala Leu Leu Glu Arg Asn Tyr Pro Thr Gly Ala Glu
        435                 440                 445
Phe Leu Gly Asp Gly Gly Asp Val Ser Phe Ser Thr Arg Gly Thr Gln
    450                 455                 460
Asn Trp Thr Val Glu Arg Leu Leu Gln Ala His Arg Gln Leu Glu Glu
465                 470                 475                 480
Arg Gly Tyr Val Phe Val Gly Tyr His Gly Thr Phe Leu Glu Ala Ala
                485                 490                 495
Gln Ser Ile Val Phe Gly Gly Val Arg Ala Arg Ser Gln Asp Leu Asp
            500                 505                 510
Ala Ile Trp Arg Gly Phe Tyr Ile Ala Gly Asp Pro Ala Leu Ala Tyr
        515                 520                 525
Gly Tyr Ala Gln Asp Gln Glu Pro Asp Ala Arg Gly Arg Ile Arg Asn
    530                 535                 540
Gly Ala Leu Leu Arg Val Tyr Val Pro Arg Ser Ser Leu Pro Gly Phe
545                 550                 555                 560
Tyr Arg Thr Ser Leu Thr Leu Ala Ala Pro Glu Ala Ala Gly Glu Val
                565                 570                 575
Glu Arg Leu Ile Gly His Pro Leu Pro Leu Arg Leu Asp Ala Ile Thr
            580                 585                 590
Gly Pro Glu Glu Glu Gly Gly Arg Leu Glu Thr Ile Leu Gly Trp Pro
        595                 600                 605
Leu Ala Glu Arg Thr Val Val Ile Pro Ser Ala Ile Pro Thr Asp Pro
    610                 615                 620
Arg Asn Val Gly Gly Asp Leu Asp Pro Ser Ser Ile Pro Asp Lys Glu
625                 630                 635                 640
Gln Ala Ile Ser Ala Leu Pro Asp Tyr Ala Ser Gln Pro Gly Lys Pro
                645                 650                 655
Pro Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys Lys Asp Glu Leu
            660                 665

Claims (28)

1.含与葡萄糖调节蛋白78(GRP78)结合的抗体的药物组合物。
2.权利要求1的组合物，其是抗癌剂。
3.权利要求1或2的组合物，其中所述抗体是单克隆抗体。
4.权利要求1-3中任一项的组合物，其中所述抗体是与位于细胞表面的GRP78结合的抗体。
5.权利要求1-4中任一项的组合物，其中所述抗体是被表达GRP78的细胞摄入的抗体。
6.权利要求1-5中任一项的组合物，其中所述抗体是与SEQ ID NO：3所示表位结合的抗体。
7.权利要求1-6中任一项的组合物，其中所述抗体是结合有伤细胞物质的抗体。
8.与GRP78结合的单克隆抗体。
9.权利要求8的抗体，其特征在于与在细胞表面表达的GRP78结合。
10.权利要求8或9的抗体，其特征在于被表达GRP78的细胞摄入。
11.权利要求8-10中任一项的抗体，其特征在于与SEQ ID NO：3所示表位结合。
12.权利要求8-11中任一项的抗体，其特征在于识别与下列(a)-(f)中任一项的抗体识别的表位相同的表位：
(a)具有下述重链可变区和轻链可变区的抗体：
其中所述重链可变区具有下述CDR1-CDR3，其中，
CDR1具有SEQ ID NO：8所示氨基酸序列、
CDR2具有SEQ ID NO：9所示氨基酸序列、
CDR3具有SEQ ID NO：10所示氨基酸序列，
且其中所述轻链可变区具有下述CDR1-CDR3，其中，
CDR1具有SEQ ID NO：11所示氨基酸序列、
CDR2具有SEQ ID NO：12所示氨基酸序列、
CDR3具有SEQ ID NO：13所示氨基酸序列；
(b)具有下述重链可变区和轻链可变区的抗体：
其中所述重链可变区具有下述CDR1-CDR3，其中，
CDR1具有SEQ ID NO：18所示氨基酸序列、
CDR2具有SEQ ID NO：19所示氨基酸序列、
CDR3具有SEQ ID NO：20所示氨基酸序列，
且其中所述轻链可变区具有下述CDR1-CDR3，其中，
CDR1具有SEQ ID NO：21所示氨基酸序列、
CDR2具有SEQ ID NO：22所示氨基酸序列、
CDR3具有SEQ ID NO：23所示氨基酸序列；
(c)具有下述重链可变区和轻链可变区的抗体：
其中所述重链可变区具有下述CDR1-CDR3，其中，
CDR1具有SEQ ID NO：61所示氨基酸序列、
CDR2具有SEQ ID NO：62所示氨基酸序列、
CDR3具有SEQ ID NO：63所示氨基酸序列，
且其中所述轻链可变区具有下述CDR1-CDR3，其中，
CDR1具有SEQ ID NO：64所示氨基酸序列、
CDR2具有SEQ ID NO：65所示氨基酸序列、
CDR3具有SEQ ID NO：66所示氨基酸序列；
(d)具有下述重链可变区和轻链可变区的抗体：
其中所述重链可变区具有下述CDR1-CDR3，其中，
CDR1具有SEQ ID NO：71所示氨基酸序列、
CDR2具有SEQ ID NO：72所示氨基酸序列、
CDR3具有SEQ ID NO：73所示氨基酸序列，
且其中所述轻链可变区具有下述CDR1-CDR3，其中，
CDR1具有SEQ ID NO：74所示氨基酸序列、
CDR2具有SEQ ID NO：75所示氨基酸序列、
CDR3具有SEQ ID NO：76所示氨基酸序列；
(e)具有下述重链可变区和轻链可变区的抗体：
其中所述重链可变区具有下述CDR1-CDR3，其中，
CDR1具有SEQ ID NO：81所示氨基酸序列、
CDR2具有SEQ ID NO：82所示氨基酸序列、
CDR3具有SEQ ID NO：83所示氨基酸序列，
且其中所述轻链可变区具有下述CDR1-CDR3，其中，
CDR1具有SEQ ID NO：84所示氨基酸序列、
CDR2具有SEQ ID NO：85所示氨基酸序列、
CDR3具有SEQ ID NO：86所示氨基酸序列；
(f)具有下述重链可变区和轻链可变区的抗体：
其中所述重链可变区具有下述CDR1-CDR3，其中，
CDR1具有SEQ ID NO：91所示氨基酸序列、
CDR2具有SEQ ID NO：92所示氨基酸序列、
CDR3具有SEQ ID NO：93所示氨基酸序列，
且其中所述轻链可变区具有下述CDR1-CDR3，其中，
CDR1具有SEQ ID NO：94所示氨基酸序列、
CDR2具有SEQ ID NO：95所示氨基酸序列、
CDR3具有SEQ ID NO：96所示氨基酸序列。
13.权利要求8-12中任一项的抗体，其特征在于对表达GRP78的细胞具有伤细胞活性。
14.权利要求13的抗体，其特征在于结合有伤细胞物质。
15.使用抗GRP 78抗体将伤细胞物质递送至细胞内的方法。
16.通过结合于抗GRP78抗体的伤细胞物质抑制细胞增殖的方法。
17.权利要求15或16的方法，其中所述细胞是癌细胞。
18.抗GRP78抗体用于将伤细胞物质递送至细胞内的用途。
19.具有被细胞摄入活性的抗GRP78抗体用于抑制细胞增殖的用途。
20.权利要求18或19的方法，其中所述细胞是癌细胞。
21.权利要求18-20中任一项的用途，其特征在于所述抗GRP78抗体结合有伤细胞物质。
22.制备药物组合物的方法，包括：
(a)提供抗GRP78抗体；
(b)确认(a)中的抗体是否具有被细胞摄入活性；
(c)筛选具有被细胞摄入活性的抗体；
(d)向(c)中筛选出的抗体结合伤细胞物质。
23.权利要求22的方法，其中所述药物组合物是抗癌剂。
24.使用抗GRP 78抗体诊断癌症的方法。
25.权利要求24的方法，其特征在于使用结合有标记物的抗GRP78抗体。
26.权利要求24或25的方法，其特征在于检测被摄入细胞内的抗GRP78抗体。
27.结合有标记物的抗GRP78抗体。
28.由SEQ ID NO：3的氨基酸序列或其片段构成的多肽。
CN2008800024441A 2007-02-27 2008-02-27 含抗grp78抗体作为有效成分的药物组合物 Pending CN101951953A (zh)

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