CN105001331A - 一种vegf单克隆抗体及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种VEGF单克隆抗体，所述抗体包括轻链和重链，其中轻链可变区氨基酸序列见SEQ？ID？NO.1，重链可变区氨基酸序列见SEQ？ID？NO.2，本发明通过酶联免疫实验证实了所述抗体能够与VEGF特异性的结合。本发明所述的抗体能够有效检测VEGF，对其检测的灵敏度达0.6ng/ml。本发明所述的抗体能够用于制备检测VEGF的试剂盒和治疗相关疾病的药物。

Description

一种VEGF单克隆抗体及其应用

技术领域

本发明涉及生物医药领域，具体而言涉及一种VEGF的单克隆抗体，本发明还涉及所述抗体的制备方法与其在制备检测VEGF试剂盒中的应用。

背景技术

单克隆抗体由单一B细胞克隆产生的高度均一、仅针对某一特定抗原表位的抗体。通常采用杂交瘤技术来制备，杂交瘤(hybridoma)抗体技术是在细胞融合技术的基础上，将具有分泌特异性抗体能力的致敏B细胞和具有无限繁殖能力的骨髓瘤细胞融合为B细胞杂交瘤。应用于医疗中时，在识别抗原中的显示微小变化有助于减小副作用。单克隆抗体具有三种独特的作用机制，分别为靶向效应、阻断效应和信号传导效应。

单克隆抗体药物发展经历了四个阶段，分别为：鼠源性单克隆抗体、嵌合性单克隆抗体、人源化单克隆抗体和全人源单克隆抗体。在第一个阶段中，鼠源单克隆抗体是用小鼠制备的普通单克隆抗体药物，一方面抗体不能有效的激活人体中补体和FC受体相关的效应系统，被人体免疫系统识别产生人抗鼠抗体(HAMA)，在人体循环系统中很快被清除掉，另一方面它毒副作用明显，常引起人体的不良反应，大大制约了其在临床实验及相关应用领域的发展；第二代人鼠嵌合性单抗药物对小鼠抗体表面氨基酸残基进行人源化改造，使其人源化程度达到70％左右，仍有很大的毒副作用；而后出现的第三代人源化单抗的人源化程度达到95％左右，更加接近于人体自身的抗体，大大降低了毒副作用。全人源抗体是从人体免疫B细胞中直接分离，作为治疗性抗体基本没有排异反应，具有不可替代的优势。

单克隆抗体除了用于制备治疗药物，由于其与物质结合时特异的，所以单克隆抗体还可用于制备检测试剂。

人血管内皮生长因子(VEGF)是正常和异常血管新生的重要调节因子，在生理和病理性血管新生中起重要作用。其主要作用机制是作为一种促内皮细胞分裂素，促进血管内皮细胞分裂、增殖以及血管生成。VEGF参与了肿瘤发生和发展整个过程，肿瘤组织快速生长，导致营养供应不足，在缺氧状态下，肿瘤细胞表达VEGF显著增加，VEGF局部浓度的升高可以促进新生血管的形成，促进肿瘤的发生发展。

VEGF家族成员共包括五个:VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D和PIGF，分别由各自的基因编码。VEGF家族成员均与细胞膜酪氨酸受体相互作用，导致受体二聚化和自身磷酸化，并启动信号级联反应，激活大量下游蛋白，如磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase,PI3K)、Ras、有丝分裂原活化蛋白激酶(Mitogen-activated proteinkinase,MAPK)等，介导相应的生物学效应

VEGF-A通常被称为VEGF，因为VEGF-A是血管发生和祖内皮细胞分化的关键调节剂，在人类多种肿瘤中，VEGF-A都是过表达的，这与肿瘤的增殖、侵袭和转移呈正相关。

研究表明，食管癌患者血浆中VEGF与TGF-β1的表达水平明显高于正常人的表达水平，提示血浆中VEGF与TGF-β1可能参与了食管癌的发生。VEGF与TGF-β1的表达水平可以作为食管癌早期检测的指标。还有研究表明VEGF蛋白在前列腺癌组织中有显著的高表达，且与临床分期、骨转移密切相关。

鉴于此，本领域需要一种准确检测VEGF表达水平的试剂，用于各类与VEGF高表达的疾病的早期诊断。为解决上述问题本发明人通过杂交瘤技术筛选到了特异性强、灵敏度高的抗体。

发明内容

由于VEGF在众多肿瘤疾病中高表达，为此开发一种能准确检测VEGF表达水平的试剂，对于用于各类与VEGF高表达的疾病的诊断具有重要的临床意义。为此本发明通过杂交瘤技术筛选出了多株与VEGF特异性结合的单克隆抗体，其中编号为YS03的抗体株结合效果最好。

本发明公开了一种抗人VEGF的单克隆抗体YS03，所述单克隆抗体包括轻链和重链，其氨基酸可变区序列分别如序列表中SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2所示。

本发明所述的单克隆抗体YS03的轻链蛋白质分子可变区的互补决定区CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列，分别如序列表中SEQ IDNO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5所示。所述单克隆抗体的重链蛋白质分子可变区的互补决定区CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别如序列表中SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8所示。

本发明还公开了上述单克隆抗体YS03的制备方法，主要包括如下：

1.抗人VEGF单克隆抗体杂交瘤细胞株的构建

首先，原核表达人VEGF蛋白，免疫Balb/c小鼠，用常规方法进行细胞融合。用间接ELISA法筛选阳性细胞克隆再反复亚克隆，直到所有杂交瘤细胞培养上清检测为100％阳性。

2.杂交瘤细胞抗体轻、重链基因的钓取

提取单克隆抗体YS03细胞的RNA，经RT-PCR，用特异性引物钓取抗体的轻重链基因。常规法连接入载体，转化感受态细菌，培养后挑取单个菌落，提取质粒PCR鉴定后进行DNA测序分析。

3.单克隆抗体YS03可变区氨基酸序列和互补决定区氨基酸序列的分析

用www.expasy.org在线软件将单克隆抗体YS03的轻、重链可变区核苷酸序列翻译为其编码的氨基酸序列，单克隆抗体YS03的轻、重链可变区氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示；

根据Kabat数据库确定单克隆抗体YS03轻链可变区序列中的互补决定区CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别如序列表中SEQ IDNO：3、SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5所示；重链可变区序列中的互补决定区CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别如序列表中SEQ IDNO：6、SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8所示；

本发明的单克隆抗体基于上述已克隆到的人VEGF结合性单克隆抗体YS03轻、重链可变区基因，可构建和表达多种小分子基因工程抗体，如单链抗体、单域抗体、嵌合抗体、Fab抗体、抗体融合蛋白等；基于上述基因所编码的多肽或蛋白质，可以交联上多种生物活性分子，制备用于VEGF表达水平检测、诊断和治疗VEGF高表达所导致疾病的诊断或治疗药物。

本发明基于YS03抗体构建了用于检测VEGF的ELISA试剂盒，所述的ELISA试剂盒包括：抗VEGF抗体YS03、HRP标记的羊抗小鼠IgG抗体、辣根过氧化物酶底物缓冲液、蛋白标准品人VEGF(100ug/ml，0.1ml)、阴性对照样品BSA。

本发明还对单克隆抗体YS03的灵敏性进行了检测，结果显示本发明的试剂盒能够灵敏的检测样品中VEGF的含量，其灵敏度能够达到0.6ng/ml。

本发明的所述的YS03抗体或其片段也可连接化学物部分。这些化学物部分可以是多聚物、荧光标记物、细胞毒性因子、放射性核素等。化学物部分优选可提供抗体在体内半衰期的多聚物。适合的多聚物包括(但不限于)聚乙二醇、右旋糖酐和单甲基聚乙二醇。

本发明抗体和抗体片段可以连接荧光或化学发光标记物，如荧光团如稀土螯合物、荧光素及其衍生物、罗丹明及其衍生物、异硫氰酸酯、藻红蛋白、水母发光蛋白标记物、生物素/亲和素、旋光标记物和稳定自由基。

本发明抗体和抗体片段分子也可交联细胞毒性因子，例如白喉毒素、蓖麻毒素A链、α-八叠球菌、Phytoiacca americana蛋白、PAP Ⅰ，PAP Ⅱ和PAPS、苦瓜抑制物、局限曲霉素、酚霉素和依诺霉素。

对本发明的抗体或抗体片段对应的氨基酸或核苷酸序列进行浅显的或微小的修改也在本发明的保护范围内，包括(但绝不限于)把一个氨基酸残基替换成另外一个具有类似特征的氨基酸。具有特征类似的氨基酸被本领域所熟知。例如可互相替换的极性/亲水氨基酸包括天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、半胱氨酸、苏氨酸、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、天冬氨酸和谷氨酸；可互相替换的非极性/疏水氨基酸，包括甘胺酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和甲硫氨酸；可互相替换的酸性氨基酸，包括天冬氨酸和谷氨酸；可以互相替换的碱性氨基酸，包括组胺酸、赖氨酸和精氨酸。

本发明所述的抗体、抗体片段或抗体突变体的表达，可通过标准的分子生物学技术，将获得编码部分或全长轻链和重链的DNA，克隆到不同的表达载体中，使该基因有效地连接于转录和翻译控制序列。选择和使用的表达宿主细胞相容的表达载体和表达调控序列。该抗体轻链基因和抗体重链基因可以插入到不同的载体，或者更通常地，这两种基因都被插入到同一个表达载体中。通过标准方法(例如，连接抗体基因片段和载体上的互补性限制位点，或者，如果不存在限制位点，进行平端连接)将该抗体基因插入到表达载体中。本文所述的该抗体的轻链和重链可变区可用于产生任何抗体同类型的全长抗体基因，其通过以这样的方式将它们插入到已经编码期望的同种型的重链恒定区和轻链恒定区的表达载体，使得VH片段有效连接到载体中的重链恒定(CH)片段，VL片段有效连接到载体中的轻链恒定(CL)片段。此外或可选地，该重组表达载体可以编码促进宿主细胞分泌抗体链的信号肽。该抗体链基因可以被克隆到载体中，使得信号肽符合读码框地连接抗体链基因的氨基端。该信号肽可以是免疫球蛋白信号肽或异源信号肽(即源自非免疫球蛋白的信号肽)。

本发明的抗VEGF抗体分子可通过重组技术生产在原核细胞中表达。如将编码本发明抗体分子的核酸插入到pET的质粒中，并在大肠杆菌/T7系统中表达。将重组后的表达载体可以通过任何已知的方法导入宿主细胞。将异源多核苷酸导入哺乳动物细胞的方法为本领域所熟知，包括右旋糖酐介导的转染、磷酸钙沉淀法、polybrene介导的转染、原生质体融合法、电穿孔法、多核苷酸的脂质体包封、生物枪注射以及把DNA直接显微注射进细胞核内。

本发明的抗VEGF抗体分子可通过重组技术生产在真核细胞中表达。作为表达宿主的哺乳动物细胞为本领域所熟知，包括许多可从美国菌种典藏中心(ATCC)获得的永生细胞系。这些细胞系主要包括中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、NSO、SP2细胞、HeLa细胞、幼仓鼠肾(BHK)细胞、猴肾细胞(COS)、人肝癌细胞、549A细胞、3T3细胞、以及许多其他细胞系。通过测定哪株细胞系具有高表达水平而选出特别优选的细胞系。其他可用的细胞系包括昆虫细胞系、两栖动物细胞、细菌细胞、植物细胞以及真菌细胞。当把编码重链或其抗原结合部位、轻链和/或其抗原结合部位的重组表达载体导入哺乳动物宿主细胞时，可通过培养此宿主细胞持续足以使抗体能够在宿主细胞中表达的一段时间而产生此抗体，或更优选地，使抗体分泌到宿主细胞生长的培养基中。

本发明抗人VEGF抗体YS03的表达，优选在293T细胞中表达具体步骤如下：

1.将人VEGF抗体YS03的重链与轻链可变区基因克隆到pcDNA3.3上，得到重组表达载体。

2.将重组表达载体用转染试剂共转染293T细胞，转染后6-8小时换新鲜培养基，并在37℃5％CO₂培养箱中培养48-72小时。

3.收集转染上清，离心弃去细胞碎片，使用蛋白(Protein)A亲和层析法进行抗体纯化。

本发明的人VEGF抗体YS03与可药用的载体一起组合制备成药剂组合物。尽管本发明的范围包括了可通过任何途径(例如通过口、盐、局部或肺)施用于受试者的药剂组合物，但优选通过静脉注射途径。

可药用载体为本领域所熟知，如包括生理相容的水性和非水性载体、稳定剂、抗氧化剂、溶剂、分散介质、外衣层、抗微生物剂、缓冲液、血清蛋白、等渗和吸收减缓剂等类似物。优选的载体要适于注射进入受试者体内。

可用于本发明药物组合物的合适的水性和非水性载体的例子包括水、乙醇、多羟基化合物(例如甘油、丙二醇、聚乙二醇等等)及他们的适当组合、植物油，例如橄榄油、以及可注射的有机酯，例如油酸乙酯。通过使用例如外衣材料(如卵磷脂)、通过在分散状态保持所需的颗粒大小，以及通过使用表面活性剂，可保持合适的流动性。

可药用的抗氧化剂的例子包括：水溶的抗氧化剂如抗坏血酸、盐酸半胱氨酸、硫酸氢钠等；油溶的抗氧化剂如抗坏血酸棕榈酸酯、丁基羟基茴香醚(BHA)、丁基羟基甲苯(BHT)等。

附图说明

图1人VEGF抗体YS03灵敏度检测；

图2单克隆抗体YS03亲和力常数测定图。

具体实施方式

通过参阅下述实施例可以更容易地了解本发明的内容，这些实施例只是为进一步说明本发明，并不意味着限定本发明的范围。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例一抗VEGF单克隆抗体杂交瘤细胞株的构建

1.材料

融合VEGF-GST蛋白，protein G亲和层析柱，胎牛血清：北京元亨圣马生物技术研究所产品；无血清RPMI 1640：Gibco公司产品；OPTI-MEM培养基，福氏完全佐剂及福氏不完全佐剂，显色试剂TMB：Sigma公司产品；SP2/0细胞：ATCC引进；Balb/c以及C57BL/6小鼠：军事医学科学院实验动物中心提供；其余试剂均为市购。

2.方法和结果

(1)融合VEGF-GST蛋白免疫5周龄雌性Balb/c小鼠，100μg/只，首次免疫，100μg抗原与等体积的福氏完全佐剂混合，腹腔注射；第3周后用等量抗原与不完全佐剂混合后腹腔免疫；第5周第3次免疫，不加佐剂。

(2)脾细胞与骨髓瘤细胞的融合：融合前一周，复苏小鼠骨髓瘤细胞Sp2/0至OPTI-MEM培养基(含10％的胎牛血清)，置于37℃，5％CO₂培养箱中培养，融合前3天，将细胞传代一次。融合当天，收获骨髓瘤细胞，并计数，把5.0×10⁷骨髓瘤细胞用无血清培养基洗涤2次备用。小鼠经第3次免疫后3-5天，摘除眼球放血、处死。无菌操作取出小鼠脾脏，置灭菌平皿中，分离脾细胞，计数，备用。

把等同于小鼠1/2脾脏的脾细胞与骨髓瘤细胞混合，1300rpm离心4min，尽可能去除上清液。在2分钟内加入1.5ml的50％的PEG，边加边摇匀；然后在10分钟内加入20ml的无血清培养基，边加边摇匀。

把经PEG融合的细胞1000rpm离心4分钟，除去上清液，加150ml的HAT选择培养基重悬，将融合细胞接种至无菌96孔板150μl/孔，置于37℃，5％CO₂培养箱中培养4天，每孔补加100μl选择培养基。

(3)杂交瘤细胞的筛选和克隆：融合后10天，从每孔中吸50μl上清，加到包被有融合VEGF-GST蛋白的96孔ELISA板(用1％的BSA封闭)，室温孵育1.5小时；洗2次。稀释辣根过氧化物酶(HorseradishPeroxidase,HRP)标记的山羊抗小鼠1：2000，每孔加50μl，室温孵育1.5小时；洗涤4次。每孔加入100μl HRP底物(H₂O₂+TMB)，室温孵育0.5小时，每孔加入100μl 2M H₂SO₄，测A450nm值。对于阳性克隆，按上述方法检测其对GST标签蛋白的反应性，只有与融合VEGF-GST融合蛋白结合而与GST不结合的抗体克隆才被保留，继续下面的实验。

收集阳性孔细胞，重悬于HT选择培养基中，采用有限稀释法稀释细胞，并种植于96孔细胞培养板中，5天后观察，对确定只有一个细胞克隆生长的孔，作ELISA进行鉴定。对阳性孔细胞进行有限稀释，经过3-4次单细胞分离培养，直至获得稳定的杂交瘤细胞克隆。大量培养杂交瘤细胞，收集含有抗体的培养上清，用protein G亲和层析柱进行纯化，并透析到PBS中，测浓度，-20℃冻存备用。

通过上述杂交瘤技术共获得4株针对人VEGF的单克隆抗体，分别为YS01、YS03、YS07和YS10。

实施例二单克隆抗体轻、重链可变区基因的克隆

取对数生长期的杂交瘤细胞，采用Invitrogen公司的Trizol抽提总RNA，用oligo(dT)₂₀为引物，逆转录生成cDNA。然后利用特异性引物PCR分别扩增其重、轻链可变区基因。PCR产物经电泳纯化后，通过TA克隆插入pMD-18T载体，测序、进行序列分析，有关操作步骤如下：

(1)总RNA抽提：参照Invitrogen公司的Trizol抽提总RNA说明书操作，结果显示本发明提取的总RNA没有降解可以用于下一步实验。

(2)cDNA合成：以抽提的总RNA为模板，oligo(dT)20为引物，逆转录合成cDNA.

oligo(dT)₂₀(500μg/ml)         1μl

RNA                           10μl

dNTPs mix(10mM each)          1μl

65℃孵育5分钟，然后快速置于冰上3分钟，加入以下成分：

42℃孵育50分钟，然后70℃孵育15分钟灭活逆转录酶。

PCR扩增单抗重、轻链可变区基因VH和VL

扩增条件：94℃预变性5min，然后94℃变性30sec；56℃退火30sec；72℃延伸1min，共30个循环。

其中，扩增VH的引物是：

MHV1：5’ATGAAATGCAGCTGGGGCATSTTCTTC3’

MHV2：5’ATGGGATGGAGCTRTATCATSYTCTT3’

MHV3：5’ATGAAGWTGTGGTTAAACTGGGTTTTT3’

MHV4：5’ATGRACTTTGGGYTCAGCTTGRTTT3’

MHV5：5’ATGGACTCCAGGCTCAATTTAGTTTTCCTT3’

MHV6：5’ATGGCTTGTCYTRGSGCTRCTCTTCTGC 3’

MHV7：5’ATGGRATGGAGCKGGRTCTTTMTCTT 3’

MHV8：5’ATGAGAGTGCTGATTCTTTTGTG 3’

MHV9：5’ATGGMTTGGGTGTGGAMCTTGCTATTCCTG 3’

MHV10：5’ATGGGCAGACTTACATTCTCATTCCTG 3’

MHV11：5’ATGGATTTTGGGCTGATTTTTTTTATTG 3’

MHV12：5’ATGATGGTGTTAAGTCTTCTGTACCTG 3’

MHCG1：5’CAGTGGATAGACAGATGGGGG 3’

扩增VL的引物是：

MKV1：5’ATGAAGTTGCCTGTTAGGCTGTTGGTGCTG 3’

MKV2：5’ATGGAGWCAGACACACTCCTGYTATGGGTG 3’

MKV3：5’ATGAGTGTGCTCACTCAGGTCCTGGSGTTG 3’

MKV4：5’ATGAGGRCCCCTGCTCAGWTTYTTGGMWTCTTG 3’

MKV5：5’ATGGATTTWCAGGTGCAGATTWTCAGCTTC 3’

MKV6：5’ATGAGGTKCYYTGYTSAGYTYCTGRGG 3’

MKV7：5’ATGGGCWTCAAGATGGAGTCACAKWYYCWGG 3’

MKV8：5’ATGTGGGGAYCTKTTTYCMMTTTTTCAATTG 3’

MKV9：5’ATGGTRTCCWCASCTCAGTTCCTTG 3’

MKV10：5’ATGTATATATGTTTGTTGTCTATTTCT 3’

MKV11：5’ATGGAAGCCCCAGCTCAGCTTCTCTTCC 3’

MKC：5’ACTGGATGGTGGGAAGATGG 3’

兼并密码子：R＝A or G Y＝C or C M＝A or C K＝G or T S＝C or GW＝A or T H＝A or C or T B＝C or G or T V＝A or C or G D＝A or G or TN＝A or C or G or T.

(3)用分离出欲回收的DNA片段，在长波紫外光下切下含目的DNA片段的胶块，放入离心管中，加入三倍胶体积的化胶液，55℃水浴完全溶解胶块。用DNA片段纯化试剂盒回收DNA片段并将纯化的DNA片段在水溶液里，将回收的PCR产物在T4DNA连接酶缓冲液中按2：1的比例(摩尔比)和载体pMD-18T混合后，加入0.5U的T4DNA连接酶于16℃连接过夜，连接反应的总体积为10μL。

(4)取连接液10μl，加于200μl感受态细菌JM109中并轻柔混匀，冰浴30min，42℃水浴热休克90秒，迅速转入冰浴2min，加800μlLB培养基，转入37℃恒温摇床，以150r/min的速度摇动45min，4000r/min离心1min，弃去800μl上清，取沉淀涂布于含Amp(终浓度为100μg/ml)的固体LB平板，将平板倒置于37℃孵箱12～18h。

(5)在上述平板中挑取单个克隆，接种于含氨卞青霉素(100μg/ml)的LB培养基中。37℃恒温摇床170rpm，震荡培养过夜。取3ml菌液加入1.5ml Eppendorf管中，10000r/min离心1min，弃上清。将沉淀菌体重悬于100μL溶液Ⅰ中，加新鲜配制的溶液Ⅱ200μL，轻缓地上下颠倒数次，至液体变清澈为止。随后，再加入150μL溶液Ⅲ，轻柔地上下颠倒数次使液体混匀，此时出现大量白色絮状沉淀。4℃，12000r/min离心5min，取上清加至另一Eppendorf管中，加入等体积的Tris-HCl饱和酚，剧烈震荡后，12000rpm离心5min，将上层水相移至一新管中。再加入500μL氯仿，重新抽提一次。其后，小心吸取上层水相，移至一新管中，加2倍体积的无水乙醇混匀，于-20℃放置3h。4℃，12000rpm离心10min，弃上清，用70％乙醇洗沉淀2次，室温干燥20min，以40μL无菌双蒸水溶解，进行PCR鉴定及DNA测序分析。

通过上述步骤构建了含有人VEGF抗体YS03轻、重链基因的载体，经测序分析、序列比对为小鼠免疫球蛋白轻、重链基因，其对应的氨基酸序列分别为SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2。

根据Kabat数据库确定单克隆抗体YS03轻链可变区序列中的互补决定区CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别如序列表中SEQ IDNO：3、SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5所示；重链可变区序列中的互补决定区CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别如序列表中SEQ IDNO：6、SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8所示。

实施例三YS03单克隆抗体表达纯化

1.材料

1moL/L TRIS-HCL、0.1moL/L磷酸缓冲液、293T细胞、Protein ASepharose CL 4B蛋白柱购自北京本元正阳生物技术有限公司。

2.方法和结果

将配对的重链与轻链基因克隆到表达载体pcDNA3.3上，然后将表达载体转染进293T细胞，转染后6-8小时换新鲜培养基，并在37℃5％CO₂培养箱中培养48-72小时。

收集表达上清，离心弃去细胞碎片，加入1mL pH 8.0，0.1moL/L磷酸缓冲液并用pH 9.0，1moL/L TRIS-HCL调整pH至9.0。把细胞上清加入已经用0.1moL/L磷酸缓冲液pH 8.0平衡好的Protein A Sepharose CL 4B蛋白柱中，用上述缓冲液洗柱子，直到流出液中检测不到杂蛋白为止。用pH 3.0的柠檬酸缓冲液洗脱，收集流出液，并立即用1moL/L pH 8.5TRIS-HCL缓冲液中和，用pH 7.2，0.01M PBS透析72h。取样在紫外分光光度计上测OD260、OD280，计算蛋白质含量，然后置于4℃保存。

实施例四检测VEGF的ELISA试剂盒的组装

检测VEGF的ELISA试剂盒包括：单克隆抗体YS03、HRP标记的羊抗小鼠IgG抗体、辣根过氧化物酶底物缓冲液、蛋白标准品VEGF(100ug/ml，0.1ml)、阴性对照样品BSA、洗液液(PBS+0.05％Tween20)。

检测VEGF的ELISA试剂盒的使用方法如下：

1)按合适的稀释度(1:2～1:10)稀释正常人或患者的血浆，包被到高亲和力ELISA板中，4℃过夜后用含0.2％吐温的PBS缓冲液洗涤5次；

2)加入抗人VEGF的抗体YS03，37℃孵育1小时，用含0.2％吐温的PBS缓冲液洗涤5次；

3)最后加入羊抗小鼠HRP标记的抗体，37度孵育0.5小时，用含0.2％吐温的PBS缓冲液洗涤5次；

4)最后加入TMB显色，2N硫酸终止后检测OD450的值。

5)结果判定：当待测样品的OD值大于空白孔OD值的2倍的视为阳性，待测样品中VEGF的具体浓度根据标准品制作的标准曲线确定。

实施例五检测VEGF的ELISA试剂盒的灵敏度测定

用含有1％BSA的PBS倍比稀释VEGF(10000,2000,400,80,16,3.2,0.64,0)ng/ml，ELISA检测方法如实施例五所述，设定样品的OD值大于空白孔OD值的2倍的视为阳性，检测结果如表1和图1所示：

表1不同浓度VEGF的吸光值

上述实验结果显示：当VEGF的浓度大于0.64ng/ml时，能够被本检测体系测出。

实施例六单克隆抗体亲和力常数测定

将不同浓度的融合VEGF-GST蛋白铺板，ELISA法测定单克隆抗体YS01、YS03、YS07和YS10与抗原VEGF的反应曲线，当曲线接近平台表示全部抗原被结合，在曲线上找出与抗原最大结合50％的抗体浓度(mol/L)，带入如下公式即可求出Ka：

Ka＝(n-1)/2(nAb′-Ab)其中n＝Ag/Ag′

具体实验步骤如下：

1.取不同浓度抗原(1，2，4mg/m1)包被的酶标板，4℃过夜。

2.测定提纯抗体浓度，将抗体作系列稀释，加入依次稀释的抗体100μl/孔，37℃，孵育45min，洗涤5遍。

3.加HRP标记的二抗羊抗小鼠IgG抗体工作液(1：10000稀释)，100μl/孔，37℃，孵育45min，洗涤5遍。

4.加底物显色液，100μl/孔，室温避光5-10min。

5.加终止液2mol/L H₂S0₄，50μl/孔，立即在酶标仪上以492nm波长测定吸光值。

6.以492吸光值为纵坐标，抗体浓度为横坐标作图，从图中找出结合率从最高点下降到50％时相对应的抗体浓度，代入公式计算抗体亲和常数。

通过间接ELISA法测定单克隆抗体YS01、YS03、YS07和YS10与抗原VEGF的反应曲线，结果显示YS01、YS03、YS07和YS10与抗原VEGF亲和力常数分别为2.21×10⁸，1.27×10⁹，5.21×10⁷，3.23×10⁸，其中抗体YS03与VEGF的结合活力最高，其与抗原VEGF的结合活性曲线见图2。

Claims (9)

1.一种VEGF单克隆抗体及其片段，包括轻链CDR1-3和重链CDR1-3，其特征在于，所述轻链CDR1-3的氨基酸序列为：

CDR1：如序列表中SEQ ID NO：3所示；

CDR2：如序列表中SEQ ID NO：4所示；

CDR3：如序列表中SEQ ID NO：5所示；

所述重链CDR1-3的氨基酸序列为：

CDR1：如序列表中SEQ ID NO：6所示；

CDR2：如序列表中SEQ ID NO：7所示；

CDR3：如序列表中SEQ ID NO：8所示。

2.如权利要求1所述的单克隆抗体及其片段，其特征在于，所述轻链可变区的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO：1所示，所述重链可变区的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO：2所示。

3.编码权利要求1-2任意一项所述的单克隆抗体或其片段的核苷酸。

4.权利要求1-2任意一项所述的单克隆抗体或其片段在制备检测VEGF的试剂、药剂或试剂盒中的应用。

5.一种载体，其特征在于，所述载体含有编码权利要求1-2任意一项所述的单克隆抗体或其片段的核苷酸。

6.一种宿主细胞，其特征在于，所述细胞含有权利要求5所述的载体。

7.一种药用组合物，特征在于，所述的药物组合物含有权利要求1-2中任意一项所述的单克隆抗体或其片段和药学上可接受的载体。

8.权利要求7所述的药物组合物，其特征在于，所述的药学上可接受的载体为稳定剂、抗氧化剂、溶剂、分散介质、外衣层、抗微生物剂、缓冲液、血清蛋白、等渗和吸收减缓剂中的一种或多种。

9.权利要求1-2任意一项所述的单克隆抗体或其片段在制备治疗因VEGF高表达导致的疾病的药物中的应用。