CN104530234A - 检测人vegf的组合试剂、试剂盒及其使用方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种抗人血管内皮生长因子(VEGF)的鼠单克隆抗体，以及包含所述鼠单克隆抗体的检测生物样品中人VEGF水平的组合试剂及包含该组合试剂的试剂盒及其使用方法。本发明所提供的鼠单克隆抗体与人VEGF结合的K_D值达到0.01 nM，由其组成的组合试剂和试剂盒具有检测灵敏度高、特异性高的优点。

Description

检测人VEGF的组合试剂、试剂盒及其使用方法

技术领域

本发明涉及免疫学领域，特别是一种抗人VEGF的鼠单克隆抗体及由其组成的检测生物样品中人VEGF水平的组合试剂、试剂盒及其使用方法。

背景技术

在迄今发现的20多种多肽类血管生长因子中，血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF, 也可写作VEGF-A) 是针对内皮细胞特异性最高，促血管生长作用最强的关键调节因子，在多种原发性恶性肿瘤组织中均呈高表达。此外，眼睛水状液和玻璃状液中VEGF的增加证实与各种视网膜病紧密关联（Aiello LP等, N Engl J Med, 1994, 331:1480-1487)。

VEGF是高度保守的同源二聚体糖蛋白，由两条分子量为24 kDa的单链以二硫键组成二聚体。人VEGF基因由8个外显子、7个内含子组成，由于mRNA剪切方式的不同，分别生成VEGF₁₂₁、VEGF₁₄₅、VEGF₁₆₅、VEGF₁₈₉、VEGF₂₀₆等至少5种蛋白异构体，其中VEGF₁₆₅是体内表达最多且生物活性最强的亚型。上述VEGF异构体NH₂末端115个氨基酸相同但COOH末端长度不同。VEGF₁₆₅分子量45 kDa，分泌型蛋白，可分泌进入血液循环，但也有相当一部分通过肝素结合部位结合于细胞表面和细胞外基质。VEGF₁₆₅ 和VEGF₁₈₉ 在纤溶酶作用下，裂解并释放出N-末端110氨基酸，这是其与受体结合的部位。VEGF通过与其3个高亲合力酪氨酸激酶受体(RTKs)，分别为VEGFR1(又称FLT1)、VEGFR2(又称KDR或Flk-l)和VEGFR3 (又称FLT4)结合而发挥作用。

1994年，Kondo等人首次报道了癌症病人血清中VEGF水平高于健康人群。后续的大量研究进一步表明VEGF可能是肿瘤广谱标志物(Tumor Marker)。因为在几乎所有实体肿瘤和部分非实体肿瘤病人中，其血液中VEGF浓度都有一定程度的增加(Kessler T等, Curr Drug Targets, 2007, 8:257-268)。这种趋势常见于肺癌、肝癌、胃癌、食管癌、结直肠癌、乳腺癌、宫颈癌、尿道上皮癌症、鼻咽癌、头颈部癌、膀胱癌、胰腺癌、骨肉瘤、Ewing氏瘤、软骨肉瘤、巨细胞瘤、黑色素瘤、白血病包括T-细胞白血病和B-细胞白血病、肾细胞癌、多发性骨髓瘤、非何杰金氏瘤、Wilm氏瘤、血管肉瘤、前列腺癌、软组织肉瘤、卵巢癌、阴唇癌、宫颈癌、子宫内膜癌、艾滋病并发的卡波氏肉瘤等(Berkman RA等,1993, J Clin Invest, 91:153-159)。

VEGF分泌进入血液循环，因此其血液浓度检测可以作为肿瘤的广谱筛查、辅助诊断、预后、治疗疗效是否复发等情况的监测指标。VEGF在几乎所有实体肿瘤的血液中增加，符合广谱筛查的“广谱”。虽然临床应用C-12、C-5等作为肿瘤筛查，目前我国尚没有筛查谱比较广的单一血液肿瘤标志物。而在体检临床实践中，C-12和C-5包括瘤种还是有限的。VEGF今后可作为我国癌症预防的初筛， 从普通人群发现可疑肿瘤患者。为精查和进一步确诊提供较为可靠的依据、这样可以节省成本、增加筛查效率。另一方面，在我国癌症预防实践中，用于筛查常用方法有子宫颈癌巴士涂片、结直肠癌隐血试验、前列腺癌肛门指诊、食管癌拉网等。组织特异性肿瘤标志物有AFP（肝癌）、PSA（前列腺癌）、CA125（卵巢癌）等。VEGF不仅可作为这些肿瘤普查、而且还可作为上述方法不能普查到其它大部分肿瘤的普查方法， 如脑部肿瘤、骨科肿瘤、间皮瘤等。

另一方面，VEGF还符合作为癌症早期标志物的一般标准。Findeisen等用ELISA方法检测了314份乳腺癌血清和58份正常女性血清的VEGF、TPA、CA15-3和CEA含量，结果发现：VEGF血液浓度不仅在乳腺癌各期均增加，而且在其早期0-1期即增加。而CA15-3和CEA只有4期癌症和正常对照才有显著性差异，由此推断VEGF在乳腺癌的早期检测优于CEA和CA15-3。另外，有人在研究VEGF和CEA的血液浓度与肺癌病人临床病例特征的关系时发现，VEGF在I期（早期）腺癌的早期诊断价值优于CEA。VEGF与CEA联合检测其灵敏度可达75%、特异度可达60% (el-Houseini ME等, Cancer Control, 2005, 12(4):248-253)。

VEGF血液浓度研究的另一项主要应用可能是肿瘤疾病预后。一是血液VEGF浓度与疾病生存时间长短、生存质量有关；二是血液VEGF浓度与疾病分期和严重程度有关。据报道，除极少数外，绝大多数研究均表明血液VEGF浓度与肿瘤的大小、进展程度或/和预后不良密切相关，即VEGF浓度越高，肿瘤瘤体越大或预后越差 (Brattström D等, Lung Cancer, 2002, 37(1):57-63)。综上可知，血液VEGF是一个可靠血管生成异常和癌症病程的标志物，检测和评价血液VEGF是一种癌症病人预后等极具前景的新方法。

目前，VEGF在肿瘤诊断中的应用主要有两方面，一是酶联免疫吸附试验（ELISA）方法检测血液VEGF浓度作为肿瘤筛查和辅助诊断；二是免疫组织化学方法检测肿瘤组织VEGF表达量的多寡，作为回顾性诊断。ELISA方法在目前VEGF血液检测试验中应用较多，主要有以下几种原因：一是方法灵敏度好；二是快速、方便、易于操作；三是与免疫荧光标记比，操作可控性更好；与同位素标记比，没有污染，费用低。有文献报道正常人群和肿瘤患者中血液VEGF浓度差别极大。测量血液VEGF 浓度能力依赖于建立灵敏且特异性高的检测方法。目前基于比色法、化学发光及荧光测定的酶联免疫吸附测定法检测血液VEGF已有报道。例如，Houck等(Lancet,1992,340:1120-1124) 描述了具有ng/ml灵敏度的比色ELISA，但其灵敏度不足以检测血液VEGF水平。Keyt等(J Biol Chem,1996,271:7788-7795) 及Shifren(J Clin Endocrinol,1996,Metab,81:3112) 开发了基于双单克隆抗体夹心的比色ELISA。虽然该ELISA 能够在癌症患者中检出升高的VEGF 浓度，但其缺乏在正常个体中测定内源水平的VEGF 所需的灵敏度。

VEGF检测试剂来源比较多，但都未能标准化，也没有经CFDA注册核准上市的VEGF诊断试剂，各个实验室得到的数据差异很大，如正常值范围相差近10倍左右，且抗体特异性不高，灵敏度较低，稳定性和重复性差等，尽管其中一些ELISA试剂盒能检测癌症患者升高的VEGF浓度，但是它缺乏测定正常个体中VEGF血液水平所需的敏感性，因而无法达到临床检验或诊断的需求。因而，本领域急需研制一种高特异性、高灵敏度的VEGF临床检验或诊断试剂，用于肿瘤的广谱筛查、辅助诊断、预后等情况的监测，其在癌症患者的生物样品中比试剂盒能检测到更高的VEGF可测定水平，并且能够测定循环中的VEGF多数亚型。

发明内容

本发明提供了一种检测生物样本中VEGF所有同工型的组合试剂、试剂盒及其使用方法，具体地，本发明提供检测生物样品中的VEGF的方法，优选来自癌症、糖尿病或其它与血管生成异常相关疾病病人的样品。

本发明人鉴定了一株高亲和力鼠单克隆抗体，命名为：TM12-15-1，与抗原VEGF的结合平衡解离常数K_D值达到0.01 nM，具有极高的特异性和灵敏度。一方面，所述鼠单克隆抗体TM12-15-1或其抗体片段高特异性地结合于VEGF生物活性区，当其作为捕获或包被抗体时，可以结合含N-末端前110个氨基酸的所有VEGF同工型。另一方面，当鼠单克隆抗体TM12-15-1作为检测抗体时，可结合VEGF生物活性区，即VEGF KDR或FLT1受体结合结构域，这确保检测到的VEGF分子是不被例如循环中可溶性VEGF受体封闭的。本发明还提供了一种组合试剂，包含所述鼠单克隆抗体TM12-15-1。再一方面，本发明提供了一种试剂盒，包含上述组合试剂。因而，本发明提供了一种检测循环型VEGF分子更准确、更简易的测定方法。

更详细地，本发明提供下列技术方案：

1、本发明提供一种鼠抗人VEGF单克隆抗体，其特征在于，所述鼠单克隆抗体可结合VEGF生物活性区，即VEGF KDR或FLT1受体结合结构域。

较佳地，所述鼠单克隆抗体的重链可变区的CDR-Hl、CDR-H2和CDR-H3氨基酸序列分别如SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5所示；所述鼠单克隆抗体的轻链可变区的CDR-Ll、CDR-L2和CDR-L3氨基酸序列分别如SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：10所示。

进一步地，在本发明的一优选实施例中，所述鼠单克隆抗体为TM12-15-1，其重链可变区含有如SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列，轻链可变区含有如SEQ ID NO：7所示的氨基酸序列。

2、一种检测生物样品中人VEGF水平的组合试剂，其包含如1所述抗人VEGF的鼠单克隆抗体。

进一步地，在本发明的一优选实施例中，所述组合试剂包含鼠单克隆抗体TM12-15-1。

3、一种检测生物样品中人VEGF浓度的组合试剂，其包含经标记的如1所述的抗人VEGF的鼠单克隆抗体；其中，标记选自放射性同位素、荧光素或酶底物。

4、一种检测生物样品中人VEGF浓度的试剂盒，包含捕获抗体和检测抗体，所述捕获抗体为抗人VEGF的多克隆抗体或单克隆抗体，其特征在于，所述检测抗体为经标记的如1所述的抗人VEGF的鼠单克隆抗体；其中，标记选自放射性同位素、荧光素或酶底物。

优选地，所述检测抗体为经辣根过氧化物酶（HRP）标记的鼠单克隆抗体TM12-15-1。

优选地，所述试剂盒还包含捕获抗体的固相载体。例如，所述捕获抗体可以固定化在所述固相载体（例如微量滴定板）上。

优选地，所述试剂盒还包含检测抗体的显色试剂。例如，若标记物是酶，则试剂盒通常会包括酶所需辅因子和底物。

优选地，所述试剂盒还包含实施测定法的说明书，和/或作为抗原标准品的VEGF（例如纯化的VEGF，优选重组VEGF），以及其它添加物，诸如包被缓冲液、样本稀释液、洗涤缓冲液和温育缓冲液等。

进一步地，所述试剂盒的成分以预定比例提供，各试剂的相对量适当地变化以使测定法灵敏度最大化。具体地，试剂可以干粉（通常是冻干的，包括赋形剂）提供，在溶解后其会提供浓度适于与待测试样品组合的试剂溶液。

本发明的一优选实施例中，所述捕获抗体为鼠单克隆抗体TM12-15-1。

本发明的另一优选实施例中，所述捕获抗体选自市售的鼠抗人VEGF单克隆抗体，如抗人VEGF的人源化单克隆抗体——Avastin（贝伐单抗bevacizumab，罗氏）。

本发明的另一优选实施例中，所述捕获抗体为抗人VEGF的多克隆抗体，该多克隆抗体可以选自市售的，如兔抗人VEGF₁₆₅（Abcam，货号：ab106580）。另一方面，抗人VEGF的多克隆抗体也可通过常规方法制备，如用VEGF和佐剂以皮下(sc)或腹腔(ip)注射的方式多次免疫动物来制备。

5、一种检测生物样品中人VEGF浓度的方法，包括如下步骤：(a) 使生物学样品与固定化至固相载体的捕获抗体接触并一起温育，其中，所述捕获抗体为抗人VEGF的单克隆抗体或多克隆抗体；(b) 将所述生物学样品与所述固定化捕获抗体分开；(c) 使所述固定化捕获抗体-靶标分子人VEGF复合物与检测抗体接触，所述检测抗体能结合人VEGF 的KDR或FLT1受体结合结构域；并(d) 使用针对所述检测抗体的检测手段来测量所述捕获抗体所结合的人VEGF的水平。

在某些实施方案中，所述生物学样品（例如肿瘤样品或肿瘤溶胞产物、血浆、血清、或尿等）是从人受试者中分离的；

其中，检测抗体为经标记的如1所述的抗人VEGF的鼠单克隆抗体；更具体地，所述检测抗体为经HRP标记的鼠单克隆抗体TM12-15-1；

其中，步骤（a）中，将经包被缓冲液稀释的特异性抗体加在固相载体上，连接形成固相抗体，用洗脱缓冲液洗涤除去未结合的抗体及杂质；

步骤（b）中，加入经样品稀释液稀释后的受检样品和不同浓度的标准品，使之与固相抗体接触反应一段时间，让样品中的抗原与固相载体上的抗体结合，形成固相免疫复合物，用洗脱缓冲液洗涤除去其他未结合的物质；

步骤（c）中，加入检测抗体（酶标记），使固相免疫复合物上的抗原与酶标记抗体结合，用洗脱缓冲液彻底洗涤未结合的酶标记抗体；

步骤（d）中，加底物显色液，使免疫复合物中的酶催化底物成为有色产物，反应一段时间，加入终止液，然后根据颜色反应的程度进行该抗原的定性或定量。一般地，采用酶标仪检测，读取其在450nm处的OD值，VEGF浓度与OD₄₅₀值之间呈正比，通过标准品绘制标准曲线，对照未知样本中的OD值，即可算出标本中VEGF浓度。

综上，本发明具有的技术效果概况如下：

本发明人制备、鉴定了一株鼠单克隆抗体TM12-15-1，具有极高特异性和灵敏度，与抗原VEGF的结合K_D值低至0.01 nM。当鼠单克隆抗体TM12-15-1作为检测抗体时，可结合VEGF生物活性区，即VEGF的KDR或FLT1受体结合结构域，这确保检测到的VEGF分子是不被例如循环中可溶性VEGF受体封闭的。另一方面，由于VEGF受体结合部位位于N-末端，因而当鼠单克隆抗体TM12-15-1作为捕获抗体时，可以捕获到含有N-末端前110个氨基酸的所有VEGF同工型，包括VEGF₁₂₁、VEGF₁₄₅、VEGF₁₈₉ 和VEGF₂₀₆。

附图说明

图1竞争法ELISA筛选各孔内抗人VEGF鼠单克隆抗体对经HRP标记的抗人VEGF人源化抗体Avastin与VEGF的竞争结合能力。

图2 间接法ELISA测定抗人VEGF鼠单克隆抗体结合VEGF的效价。其中，鼠单克隆抗体TM12-15-1的效价最高。

图3抗人VEGF鼠单克隆抗体对经HRP标记的Avastin与VEGF的竞争结合测定。其中，抗人VEGF鼠单克隆抗体TM 12-15-1竞争Avastin结合抗原的能力最强。

图4抗人VEGF鼠单克隆抗体TM12-15-1的重链可变区的核苷酸序列(示于SEQ ID NO:1)及其演绎的氨基酸序列(示于SEQ ID NO:2)。以下划线标出互补决定区的氨基酸残基 CDR-Hl (SEQ ID NO：3)，CDR-H2 (SEQ ID NO: 4)和 CDR-H3 (SEQ ID NO: 5)。

图5抗人VEGF鼠单克隆抗体TM12-15-1的轻链可变区的核苷酸序列(示于SEQ TD NO：6)及其演绎的氨基酸序列(SEQ ID NO:7)。以下划线标出互补决定区的氨基酸残基 CDR-Ll (SEQ ID NO: 8)，CDR-L2 (SEQ ID NO: 9)和 CDR-L3 (SEQ ID NO: 10)。

图6抗人VEGF鼠单克隆抗体TM12-15-1的Western-Blot分析。

图7 BLI分析鼠单克隆抗体TM12-15-1亲和力的动力学拟合曲线。

图8鼠单克隆抗体TM12-15-1与人VEGF结合平衡解离常数K_D值测定图。

图9 双抗体夹心ELISA检测rhVEGF样品（HRP标记 TM12-15-1为检测抗体）。

图10 双抗体夹心ELISA检测rhVEGF样品（HRP标记 Avastin为检测抗体）。

具体实施方式

各种形式的抗体被包括在本发明之中。例如，抗人VEGF抗体可以是全长的抗体 (例如具有完整的人Fc区)，或是抗体片段(如Fab、Fab或F(ab^')²)。

术语“抗体”被最广义地使用，并且具体地包括：单克隆抗体(包括全长的单克隆抗体)、多克隆抗体、多特异性抗体(包括双特异性抗体)、以及抗体片段，只要它们表现出所需的生物活性即可。

术语“抗体片段”包括完整抗体的一部分，通常是完整抗体的抗原结合区或可变区。抗体片段的例子包括Fab、Fab'、F(ab') ²和Fv片段；二体(diabody)；线性抗体；单链抗体分子；和由抗体片段形成的多特异性抗体。

术语“可变”表示抗体中可变区的某些部分在序列上有所不同，它形成了各种特定抗体对其特定抗原的结合和特异性。然而，可变性并不均匀地分布在整个抗体可变区中。它集中于轻链和重链可变区中被称为高变区中的三个片段中。可变区中较保守的部分称为构架区(FR)。天然重链和轻链的可变区中各自包含四个FR区(分别是FR1、FR2、FR3和FR4)，它们大致上呈β-折叠构型，由三个高变区相连。这些高变区形成连接β折叠结构的环并且在某些情况下是β折叠结构的一部分。每条链中的高变区通过FR区紧密地靠在一起并与另一链的高变区一起形成了抗体的抗原结合部位(Kabat等, Sequences of Proteins of Immunological of Immunological Interest, (5th), Public HealthService, NIH, Bethesda, MD (1991)), pp:647-669)。恒定区不直接参与抗体与抗原的结合，但是它们表现出不同的效应子功能，例如参与抗体的依赖于抗体的细胞毒性。

术语“高变区”指抗体中负责抗原结合的氨基酸残基。高变区包括来自“互补决定区“即“CDR”的氨基酸残基和/或来自“高变环”的残基(即以及重链可变区的残基)。

木瓜蛋白酶消化抗体产生了两个相同的抗体片段(称为“Fab”片段，每个片段有单个抗原结合位点)以及一个残余的“Fc”片段(该名称反映了其容易结晶的能力)。用胃蛋白酶处理产生了一个F(ab' )2片段，该片段有两个抗原结合位点，并仍能与抗原交联。

Fab片段还含有轻链的恒定区和重链的第一个恒定区(CH1)。Fab'片段与Fab片段的不同之处在于，在重链CH1区的羧基端多几个残基(包括来自铰链区的一个或多个半胱氨酸)。F(ab' )2抗体片段最初是以Fab'片段对的形式产生的，在其间有铰链半胱氨酸。抗体片段的其它化学偶联方式也是已知的。

术语“单克隆抗体”指从一类基本均一抗体获得的抗体，即该群体中包含的各抗体是相同的，除少数可能存在的天然发生的突变之外。单克隆抗体是高特异性的，针对单个抗原位点。而且，与常规的(多克隆)抗体制剂(它通常是包括针对不同的决定簇(表位)的不同抗体)不同，各单克隆抗体是针对抗原上的单个决定簇。修饰语“单克隆”表示了抗体的特性——即从基本均一的抗体群中获得的，而不应被解释成需要用任何特殊方法来生产抗体。例如，用于本发明的单克隆抗体可用杂交瘤方法(Köhler G等, Nature, 1975, 256:495)制得，或可用重组DNA方法(例如参见美国专利No.4,816,567) 制得。“单克隆抗体”还可利用例如Clackson T等, Nature, 1991, 352:624-628; Marks JD等, J Mol Biol, 1991,222:581-597)所述的技术从噬菌体抗体文库中分离得到的。

术语“抗原表位”，又称“抗原决定簇”(antigenic determinant，AD)，是抗原分子中决定抗原特异性的特殊化学基团，因而表位代表了抗原分子上的一个免疫活性区，负责与抗体分子或免疫细胞表面的抗原受体结合。严格来说，抗体的特异性是针对表位而不是针对完整的抗原分子的。

术语“标记的”在此表示抗VEGF抗体被融合于“标记”。“标记”在此指直接或间接与抗体偶联的可检测化合物或组合物。标记自身可以被检测到(例如放射性同位素标记或荧光标记)，或者，如果是酶标记，它们可催化化合物或组合物底物发生可检测的化学转变。

抗人VEGF抗体还可以用于VEGF的诊断性分析中，例如检测其在特定细胞、组织或血清中的表达。用于诊断时，抗体通常用可检测分子进行标记。有许多标记可以使用，它们可以大致如下分类：

(a) 放射性同位素，例如³⁵S、¹⁴C、¹²⁵I、³H和¹³¹I。可以利用例如《现代免疫学方法》(Current Protocols in Immunology)第1和第2卷, Coligen等编, ffiley-Interscience, New York, New York, Pubs. (1991))中所述的方法以放射性同位素来标记抗体，放射性可以利用闪烁计数法来测定。

(b) 荧光素标记，例如稀土螯合剂(铕螯合剂)或萤光素及其衍生物，罗丹明及其衍生物，丹酰，丽丝胺，藻红素和德克萨斯红(Texas red)。荧光标记可以利用例如上文《现代免疫学方法》中所述的方法与抗体偶联。荧光可以利用荧光计来定量。

(c) 有各种酶标记可供使用，而美国专利No.4,275,149公开了其中部分。所述的酶通常催化可以用各种技术测定的生色底物的化学改变。例如，酶催化底物的颜色变化，这种变化可以用分光光度计来测定。或者，酶改变底物的荧光性或化学发光性。前文已经说明了定量测定荧光变化的技术。化学发光底物因化学反应而被电激发，并由此发光，发出的光可以被测定(例如利用化学光度计)或向荧光受体供能。酶标记包括例如萤光素酶(例如萤火虫萤光素酶和细菌萤光素酶；美国专利No.4,37,456)、萤光素、2,3-二氢二氮杂萘二酮(2,3-dihydrophthalazinediones)、苹果酸脱氢酶、脲酶、过氧化物酶如辣根过氧化物酶(HRP)、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、溶菌酶、糖氧化酶(例如葡萄糖氧化酶、半乳糖氧化酶和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶)、杂环氧化酶(例如尿酸酶和黄嘌呤氧化酶)、乳过氧化物酶、微过氧化物酶等。

酶-底物的组合包括，例如：

(i) 辣根过氧化物酶(HRP)和作为底物的氢过氧化物酶，其中的氢过氧化物酶使染料前体(例如邻苯二胺(OPD)或盐酸3,3’,5,5’-四甲基联苯胺(TMB))氧化；

(ii) 碱性磷酸酶(AP)和作为生色底物的对硝基苯磷酸；

(iii) β-D-半乳糖苷酶(β-D-Gal)和生色底物(例如对硝基苯-β-D-半乳糖苷酶)或荧光底物4-methylumbelliferyl-β-D-半乳糖苷酶。

对本领域技术人员来说还有许多其它酶-底物组合。对这些组合的综述可参见美国专利No.4,275,149和4,318,980。有时，标记物与抗体间接偶联。技术人员也知道各种获得所述组合的方法。例如，抗体可以与生物素偶联，上述三大类标记中的任何一种都可以与亲和素偶联，或者正相反。生物素选择性地结合亲和素，标记可以间接方式与抗体偶联。或者，为了将标记与抗体间接偶联，抗体可以与小的半抗原(例如地高辛)偶联，而上述不同类型的标记之一与抗半抗原抗体(例如抗地高辛抗体)偶联。这样就获得的标记与抗体的间接偶联。

术语“检测抗体”指能够直接经由通过检测手段放大的标记物进行检测的抗体，典型地将抗体偶联可通过一些手段检测的模块。在一个实施方案中，检测抗体是生物素化的抗体。

术语“检测手段”指在本发明的ELISA 中用于检测检测抗体的存在的方法或技术，并包括放大固定化的标记物（诸如捕获到微量滴定板上的标记物）的检测试剂。在一个实施方案中，所述检测手段是比色检测剂，诸如亲合素或链霉亲合素-HRP。

术语“VEGF”在用于本文时指165个氨基酸的血管内皮细胞生长因子（VEGF₁₆₅）及相关的121个、145个、189个和206个氨基酸的同属于VEGF-A型不同剪切形式的的同工型(Leung等,Science 246:1306(1989); Houck 等,Mol.Endocrin.5:1806(1991))，还包括这些生长因子的天然存在等位基因形式和加工形式。

术语“生物学样品”指来自任何动物的身体样品，但优选来自哺乳动物，更优选来自人。在某些实施方案中，此类生物学样品来自血管生成异常、糖尿病、或癌症患者。此类样品包括生物学流体，诸如血清、血浆、玻璃体液、淋巴液、滑液、滤泡液、精液、羊水、乳汁、全血、尿液、脑脊液、唾液、痰、泪液、汗液、粘液、肿瘤溶胞产物、及组织培养液、以及组织提取物（诸如匀浆组织、肿瘤组织、和细胞提取物）。

对于免疫组织化学来说，肿瘤样品可以是新鲜的或者冷冻的或者包在石蜡和以福尔马林之类防腐剂固定的。

抗体还可以用于体内诊断分析。通常，以放射性核素(例如¹¹¹In、⁹⁹Tc、¹⁴C、¹³¹I、¹²⁵I、³H、³²P或³⁵S)标记抗体，使得可以利用免疫闪烁照相术来定位患病部位。

酶联免疫吸附测定法(ELISA) 包括基于比色法、化学发光、及荧光测定法的ELISA。在本发明提供了一种双抗体夹心法ELISA，利用连接于固相载体上的捕获抗体和检测抗体（酶标记）分别与样品中被检测抗原分子VEGF上两个抗原决定簇结合，形成捕获抗体-VEGF-酶标记抗体免疫复合物。在本发明所采用测定法的第一步中，使怀疑含有VEGF的生物学样品与捕获（或包被）抗体接触并一起温育，使得捕获抗体捕获或结合至VEGF，使其可在检测步骤中被检出。

例如，夹心分析法测定法利用如下步骤：

第1步：使生物学样品与固定化的捕获（或包被）抗体接触并一起温育，所述捕获抗体是抗VEGF 单克隆抗体。该抗体可以来自任何物种，但优选的单克隆抗体是大鼠或小鼠单克隆抗体，更优选小鼠的，最优选自本发明所鉴定的杂交瘤衍生的单抗TM12-15-1。因此，在具体的优选实施方案中，固定化的单克隆抗体是鼠单克隆抗体，最优选鼠单克隆抗体TM12-15-1。用上文所限定的捕获抗体包被于固相，所述捕获抗体可以根据需要通过非共价或共价的相互作用或物理连接方式而结合于固相。用于固定化的固相可以是基本上不溶于水的且可用于免疫测定法的任何惰性支持物或载体，包括例如表面、颗粒、多孔基质等形式的支持物。常用的固相载体的例子包括小薄片、Sephadex、聚氯乙烯、塑料珠及由聚乙烯、聚丙烯、聚苯乙烯等制造的测定板或试管（包括96 孔微量滴定板）、以及微粒材料，诸如滤纸、琼脂糖、交联的右旋糖苷、及其它多糖。优选地，捕获抗体包被在微量滴定板上。在一个实施方案中，固定化的捕获抗体包被在微量滴定板上，更具体地，使用的优选固相是可以用于一次分析数个样品的多孔微量滴定板，例如微量测试96孔ELISA板。用于抗体包被的技术参考美国专利No.4,376,110及其引用的参考文献所述。若共价的，则将96孔板或其它固相与交联剂连同捕获抗体在本领域公知的条件下一起温育，例如诸如在室温达1小时。

如利用96 孔板，将其用捕获抗体包被（典型地在缓冲液诸如0.05M Na₂CO₃中稀释，然后温育至少约10小时，更优选至少过夜，在约4-20℃、或约4-8℃的温度，及在约8-12的pH、或约pH9-10、或约pH9.6 条件下实现）。如果期望较短的包被时间，可以例如在室温包被96 孔板达2小时。再用封闭液处理经包被的96孔板，所述封闭液非特异性结合至固相载体上的结合位点并使其饱和以阻止游离配体对96孔板的多余位点的非特异性结合。适用于此目的的封闭液的例子包括例如明胶、牛血清清蛋白、卵清蛋白、酪蛋白及脱脂牛奶。封闭处理条件如下：在环境温度下，处理约1-4小时，优选约1-3小时，或在0-4℃过夜。包被和封闭后，将VEGF 标准品（纯化的VEGF）或待分析的生物样品（适当稀释的）添加至固相载体。优选的稀释比例按体积比计，约1-15%，优选约10%。

选择温育样品和捕获（包被）的抗体的条件以实现测定法的灵敏度最大化并使解离最小化。优选地，温育在相当恒定的温度下完成，其范围从约0℃至约40℃，优选约20-25℃。温育时间主要取决于温度，一般不大于10小时以避免灵敏度下降。优选地，温育时间从约0.5-3小时，更优选1-2小时，室温，以使游离VEGF对捕获抗体的结合最大化。若添加蛋白酶抑制剂以阻止生物样本的蛋白酶降解VEGF，则温育的持续时间可以延长。

在本阶段，温育混合物的pH通常选自约4-9.5的范围内，优选在约6-9的范围内，更优选约7-8，且最优选的稀释剂的pH为7.4。温育缓冲液pH的选择以维持捕获抗体对被捕获的VEGF高特异性结合。可以采用各种缓冲液以在本步骤过程中达到并维持期望的pH，包括硼酸盐、磷酸盐、碳酸盐、Tris-HCl 或Tris-磷酸盐、醋酸盐、巴比妥等。

第2步：将生物学样品与固定化的捕获抗体分开（优选通过洗涤来实现）以除去未捕获的分子。用于洗涤的溶液一般是洗涤缓冲液，优选的pH范围是约6-9。可以进行三次或更多次洗涤。洗涤温度典型地为约0-40℃，更优选约4-30℃。

第3步：加入检测抗体，温育，优选在约20-40℃的温度，更优选约20-25℃，温育时间约0.5-2小时，更优选约1小时。此时，连接于固相载体上的捕获抗体和检测抗体（酶标记）分别与样品中被检测抗原分子VEGF上两个抗原决定簇结合，形成捕获抗体-VEGF-酶标记抗体免疫夹心复合物。其中，检测抗体可以是单克隆抗体或多克隆抗体。

第4步：使用针对检测抗体的检测手段来测量已被结合至捕获抗体的游离VEGF 的水平。利用复合物上标记的酶催化底物显色，其颜色深浅与待测样品中抗原的量相关。该方法灵敏度可达到ng~pg/ml水平。检测抗体的标记物选自不干扰游离VEGF与抗体结合的任何可检测官能团。常用的标记物有辣根过氧化物酶HRP和碱性磷酸酶AP等。

在双抗体夹心法测定抗原时，如应用针对抗原分子上两个不同抗原决定簇的单克隆抗体分别作为固相抗体和酶标抗体，则在测定时可使标本的加入和酶标抗体的加入两步并作一步。这种双位点一步法不但简化了操作，缩短了反应时间，如应用高亲和力的单克隆抗体，测定的敏感性和特异性也显著提高。

为方便起见，本发明的测定方法可以试剂盒形式提供。该试剂盒包括如下基本元件：

(a)由抗人VEGF 分子的单克隆抗体构成的捕获抗体，其中所述单克隆抗体识别VEGF；和 (b) 由能结合VEGF 的KDR或FLT1受体结合结构域的经标记的检测抗体构成的检测试剂。这些基本元件在上文限定。

优选地，试剂盒还包含捕获抗体的固相载体，其可以作为分开的组件提供或者其上已经固定化捕获抗体。因此，试剂盒中的捕获抗体可以固定化在固相载体上，或者它们可以固定化在试剂盒所包括的或与试剂盒分开提供的这种支持物上。优选地，捕捉试剂包被在微量滴定板上。

在本方法中，若标记物是酶，则试剂盒通常会包括酶所需辅因子和底物，且若标记物是荧光团，则包括提供可检测生色团的染料前体。若标记物是生物素，则包括亲合素，诸如亲合素、链霉亲合素、或与HRP 或β-半乳糖苷酶偶联的链霉亲合素及MUG。

在一个具体的实施方案中，捕获抗体是单克隆抗体，优选啮齿类动物的，更优选鼠的，更优选小鼠的，且最优选单抗TM12-15-1。同样，在某些实施方案中，检测抗体是生物素化的单克隆抗体，该单克隆抗体是啮齿类动物的，更优选鼠的，还更优选小鼠的，还更优选单抗TM12-15-1。

试剂盒还包含实施测定法的说明书，和/或作为抗原标准品的VEGF（例如纯化的VEGF，优选重组生成的VEGF），以及其它添加物，诸如样本稀释液、洗涤缓冲液和温育缓冲液等。

VEGF标准品可从Genentech, Inc. ( South San Francisco, California)或其他本领域技术人员公开的方法获得的在哺乳动物细胞中生成的重组人VEGF。

试剂盒的成分以预定比例提供，各试剂的相对量适当地变化以使测定法灵敏度最大化。具体地，试剂可以以干粉（通常是冻干的，包括赋形剂）提供，在溶解后其会提供浓度适于与待测试样品组合的试剂溶液。

在本发明另一实施方案中，抗人VEGF抗体不必被标记，其存在可以利用标记过的结合该人VEGF抗体的抗体来检测。本发明抗体可以用在任一种已知的分析方法中，例如竞争性结合分析，直接或间接夹心分析和免疫沉淀分析(参见Zola等编, MonocloneAntibodiesi Manual of Techniques, CRC Press, Inc.,1987, pp.147-158)。竞争性结合分析依赖于标记过的标准物与被测样品中分析物竞争结合有限量抗体的能力。被测样品中VEGF的量与与抗体结合的标准物的量成反比。为了方便测定被结合标准物的量，通常令抗体在竞争前或竞争后不溶解，这样就可以方便地将与抗体结合的标准物和分析物与未结合的标准物和分析物分离。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York：Co Id Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1、抗人VEGF鼠单克隆抗体的制备

以重组人VEGF (hVEGF，PEPROTECH) 20μg在完全辅佐剂中给四周龄的BALB/c小鼠皮下注射。每三至四星期注射一次，一共五次。最后，并在腹膜内单次注射50μg hVEGF。经血清测试后，鉴定出含有高水平抗人VEGF抗体血清的小鼠。取出该小鼠脾脏与小鼠骨髓瘤Sp2/0细胞株相融合。混合5×10⁸ Sp2/0细胞与5×10⁸脾细胞在50%聚乙二醇 (PEG，分子量为1450)和5%二甲基亚砜(DMSO)溶液中融合。用Iscove培养基(含有10%胎牛血清，100单位/mL青霉素，100μg/mL链霉素，0.1mM次黄嘌呤，0.4μM氨基蝶呤和16μg胸苷)来调整脾脏细胞数至7.5×10⁵/mL，以0.2mL加入96孔培养板的孔内。置于37°C，5% CO₂的培养箱内。10天后，取出各孔内的培养基测试其中鼠源抗体对Avastin hVEGF结合的竞争作用，筛选出与Avastin竞争的阳性孔，其中第8，13和15阳性孔内鼠源抗体对Avastin的竞争作用最为显著（图1）。再将上述含有能够抑制HRP 标记Avastin与rhVEGF结合的单克隆抗体的孔内融合细胞进行亚克隆，同样以竞争ELISA方法筛选得到三个高亲和力的鼠单克隆抗体TM12-8-21、TM12-13-31和TM12-15-1，方法同实施例2。再用间接ELISA法测定纯化抗体与VEGF结合的效价，其中，以rhVEGF（PEPRO TECH）包被酶标板，以HRP标记的羊抗鼠IgG的多克隆抗体（Jackson Laboratory）作为检测抗体，其结果示于图2。

实施例2、抗人VEGF鼠源抗体与Avastin抗体的竞争结合测定

以辣根过氧化物酶(HRP) 标记抗人VEGF的全人源化抗体Avastin (Roche)作为试剂。将 rhVEGF (50 μL, 0.1μg/mL)包被酶标板(Corning)，室温过夜。弃去包被溶液，用溶解在磷酸盐缓冲盐水的脱脂奶封闭各孔0.5小时，用含有0.05% 吐温20的PBS洗孔。然后每孔加入50 μL生长培养基(DMEM+5% FBS，Invitrogen)与50μL HRP标记的Avastin抗体(250ng/mL)的混合液。以未标记的Avastin和含抗另一种抗原的非相关抗体(Irrelevant mAb)作为阳性与阴性对照。其中，鼠抗体TM12-8-21和TM12-13-31的竞争结合EC₅₀值分别为0.4μg/mL，即在高达0.4μg/mL浓度时，只能竞争掉约50% Avastin与hVEGF的结合。另一个鼠单克隆抗体TM12-15-1的 EC₅₀值为0.1μg/mL (相当于0.67nM)，即在大约0.1μg/mL浓度时，即可竞争掉约50% Avastin与hVEGF的结合，显著优于未标记的Avastin对HRP 标记Avastin的竞争结合能力（EC₅₀值为1μg/mL），即10倍于Avastin与hVEGF的结合能力，结果见图3。

实施例3、克隆TM12-15-1鼠源抗体的重链与轻链

为表达C12-15-1抗体，首先须获得编码抗VEGF鼠源抗体TM12-15-1重链和轻链可变区的DNA片段。用mRNA纯化试剂盒(NEB Corp.) 从TM12-15-1小鼠杂交瘤细胞分离出mRNA，以此制备cDNA(SMARTer RACE试剂盒，Clontech Corp.)。通过聚合酶链反应(PCR)使用5’-引物混合液 (Long (0.4 μM):

5'-ctaatacgactcactatagggc AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-3'(SEQ ID NO：11，引物1)和

Short (2μM): 5'-ctaatacgactcactatagggc-3'(SEQ ID NO：12，引物2)同3’-引物 5’-catcccagggtcaccatggagtta-3’ (SEQ ID NO：13，引物3) 从cDNA中分离重链可变区 DNA片段。 3’-引物与小鼠IgG1重链恒定区同源反义。将这些得到的DNA片段克隆进TOPO TA载体(Invitrogen)（pTOPO-VH）并测序。所有的重链可变区克隆显示同一核苷酸序列(SEQ ID NO:1)。该核苷酸序列与其编码的氨基酸序列(SEQ ID NO:2)列于图4，并以下划线标出互补决定区的氨基酸残基CDR-Hl (SEQ ID NO：3)，CDR-H2 (SEQ ID NO: 4)和 CDR-H3 (SEQ ID NO: 5) (互补决定区的定义参见Kabat E.等人的Sequences of Proteins of Immunological Interest 第5版U. S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242)。

以相似的PCR方法，使用SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：12的5’-引物混合液和另一个与小鼠免疫球蛋白κ 轻链恒定区同源反义的3’-引物5’-gactgaggcacctccagatgttaa-3’ (SEQ ID NO:14，引物4)，从 cDNA中分离轻链可变区DNA片段。将这些得到的DNA片段克隆进TOPOTA载体（pTOPO-Vκ）并测序，得到编码TM12-15-1小鼠杂交瘤轻链的可变区序列。其核苷酸序列（SEQ ID NO:6）与其编码的氨基酸序列(SEQ ID NO:7)列于图5，并以下划线标出互补决定区的氨基酸残基CDR-Hl (SEQ ID NO：8)，CDR-H2 (SEQ ID NO: 9)和 CDR-H3 (SEQ ID NO:10)。

实施例4、Western-Blot免疫印迹法检测鼠单克隆抗体TM12-15-1

采用免疫印迹法（Western-Blot）对纯化的鼠单克隆抗体TM12-15-1进行定性、定量分析。各泳道按表1中上样量加入抗原VEGF₁₆₅ (PEPRO TECH)，电泳、转膜、再分别与过量的HRP标记的Avastin（0.2mg/mL，1：1000稀释）和HRP标记的TM12-15-1（1mg/mL，1：5000稀释）抗体孵育，后进行显色、定量和定性分析，结果见图6。由结果可知，鼠单克隆抗体TM12-15-1同阳性抗体Avastin一样，可特异性的结合至抗原人VEGF₁₆₅，均呈现清晰、均一的条带，且随抗原上样量的增加，条带加粗。

表1、 Western-Blot分析鼠单克隆抗体TM12-15-1的抗原上样量

。

实施例5、TM12-15-1抗体亲和力分析试验

采用生物薄膜干涉技术(BLI)对纯化的鼠单克隆抗体TM12-15-1与抗原的结合亲和力常数进行测定（ForteBio Octet 系统，PALL公司）。多通道平行定量分析浓度梯度设定为：3.125、6.25、12.5、25、50和100nM，分别亲和偶联AMC传感器(Anti-mIgG Fc Capture)。亲和力分析动力学拟合曲线见图7，各通道动力学参数测定结果见表2。分析以上数据计算得出亲和力常数（见图8），其结合常数kon值=4.688×10⁵/Ms，解离常数kdis值=1.331×10^-5/s，平衡解离常数K_D值=kdis/kon=2.850×10^-11M（0.0285nM），说明鼠单克隆抗体TM12-15-1针对人VEGF具有极高的结合亲和力，可达到10^-11M数量级。

表2. 鼠单克隆抗体TM12-15-1亲和力测定动力学参数

。

实施例6、双抗体夹心酶联免疫吸附法（ELISA）检测hVEGF样品

以0.5μg/mL的抗人VEGF的全人源化抗体Avastin和TM12-15-1，作为捕获抗体包被酶标板(Corning)，每孔100μL，室温过夜。同时，平行包被一不相关抗体为阴性对照组。弃去包被溶液，用溶解在磷酸盐缓冲盐水的脱脂奶封闭各孔0.5小时，用含有0.05%吐温20的PBS洗孔。再分别将不同浓度的hVEGF样品（同源二聚体形式）加入相应孔中（100μL/孔），室温孵育120分钟。洗板3次，且最后一次置吸水纸上拍干。然后每孔加入100μL以HRP标记的抗人VEGF的鼠单克隆抗体TM12-15-1（1mg/mL，1：5000稀释）作为检测试剂，室温孵育60分钟，然后洗板3次，且最后一次置吸水纸上拍干。加入显色剂TMB 100μL/孔，避光室温孵育20分钟，最后加入终止液50μL/孔，混匀后即刻在双波长下测定OD₄₅₀/₆₂₀值，如图9所示，以HRP标记的鼠单克隆抗体TM12-15-1作为检测抗体时，当包被抗体TM12-15-1时，其检出下限低至约0.1ng/mL，而以Avastin作为捕获抗体时，其检出下限约1ng/mL。

实施例7、双抗体夹心酶联免疫吸附法（ELISA）检测hVEGF样品

以0.5μg/mL的抗人VEGF的全人源化抗体Avastin和TM12-15-1，作为捕获抗体包被酶标板(Corning)，每孔100μL，室温过夜。同时，平行包被一不相关抗体为阴性对照组。弃去包被溶液，用溶解在磷酸盐缓冲盐水的脱脂奶封闭各孔0.5小时，用含有0.05%吐温20的PBS洗孔。再分别将不同浓度的hVEGF样品（同源二聚体形式）加入相应孔中（100μL/孔），室温孵育120分钟。洗板3次，且最后一次置吸水纸上拍干。然后每孔加入100μL 以HRP标记的抗人VEGF的全人源化抗体Avastin（0.2mg/mL，1：1000稀释）作为检测试剂，室温孵育60分钟，然后洗板3次，且最后一次置吸水纸上拍干。加入显色剂TMB，100μL/孔，避光室温孵育20分钟，最后加入终止液50μL/孔，混匀后即刻在双波长下测定OD₄₅₀/₆₂₀值。如图10所示，以HRP标记的全人源化抗体Avastin作为检测抗体时，当包被抗体TM12-15-1时，其检出下限低至约1ng/mL，而以Avastin作为捕获抗体时，其检出下限约10ng/mL。

虽然说明并描述了本发明的优选例，应理解本领域的技术人员可根据本发明的教导，作出各种改变，这些改变不违背本发明的范围。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

序列表

注意序列序号位置

<110> 安源生物科技（上海）有限公司

<120> 检测人VEGF的组合试剂、试剂盒及其使用方法

<130> 2014.12.15

<160> 14

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 360

<212> DNA

<213> 抗体重链可变区核苷酸序列

<400> 1

gaggtccagc tccagcaatc cggccccgag ctggtcaagc ctggagcttc cgtgaagatg 60

agctgcaagg cctccggcta caccttcacc aacttcgtga tccactgggt gatccagaag 120

cccggccagg gactggagtg gttcggctat atcaacccct acaacgacga caccaaatac 180

aacgagaaat tcaagggcaa agctcggctg acctccgaca agagcagccg gacagcctac 240

atggaactgt cctccctgac ctccgaggac agcgctgtgt tttactgcgc tatcagcagc 300

gacggctacc acggctggtt tgcttactgg ggacagggca ccctcgtgac agtgagcgcc 360

<210> 2

<211> 120

<212> PRT

<213> 抗体重链可变区氨基酸序列

<400> 2

Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Phe

20 25 30

Val Ile His Trp Val Ile Gln Lys Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Phe

35 40 45

Gly Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Asp Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe

50 55 60

Lys Gly Lys Ala Arg Leu Thr Ser Asp Lys Ser Ser Arg Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Phe Tyr Cys

85 90 95

Ala Ile Ser Ser Asp Gly Tyr His Gly Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala

115 120

<210> 3

<211> 5

<212> PRT

<213> 抗体重链CDR-H1氨基酸序列

<400> 3

Asn Phe Val Ile His

1 5

<210> 4

<211> 17

<212> PRT

<213> 抗体重链CDR-H2氨基酸序列

<400> 4

Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Asp Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 5

<211> 11

<212> PRT

<213> 抗体重链CDR-H3氨基酸序列

<400> 5

Ser Ser Asp Gly Tyr His Gly Trp Phe Ala Tyr

1 5 10

<210> 6

<211> 336

<212> DNA

<213> 抗体轻链可变区核苷酸序列

<400> 6

gacgtgctga tgacacagcc tcctctcagc ctccctgtct ccctgggaga ccaagcctcc 60

atctcctgcc ggagcgacca atccatcgtc cacagcaacg gccacaccta cctcgagtgg 120

tacctccaaa agcccggcca aagccccaag ctgctcatct acaaggtgag caaccggttc 180

agcggagtcc ccgacaggtt ttccggatcc ggctccggaa ccgacttcac cctgaaaatc 240

agcagggtgg aggccgagga tctgggcctc tactactgct tccaaggatc ccacgtgccc 300

ttcaccttcg gctccggcac caagctggag attaag 336

<210> 7

<211> 112

<212> PRT

<213> 抗体轻链可变区氨基酸序列

<400> 7

Asp Val Leu Met Thr Gln Pro Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly

1 5 10 15

Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Asp Gln Ser Ile Val His Ser

20 25 30

Asn Gly His Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser

35 40 45

Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile

65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Leu Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly

85 90 95

Ser His Val Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 8

<211> 16

<212> PRT

<213> 抗体轻链CDR-L1氨基酸序列

<400> 8

Arg Ser Asp Gln Ser Ile Val His Ser Asn Gly His Thr Tyr Leu Glu

1 5 10 15

<210> 9

<211> 7

<212> PRT

<213> 抗体轻链CDR-L2氨基酸序列

<400> 9

Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser

1 5

<210> 10

<211> 9

<212> PRT

<213> 抗体轻链CDR-L3氨基酸序列

<400> 10

Phe Gln Gly Ser His Val Pro Phe Thr

1 5

<210> 11

<211> 45

<212> DNA

<213> 引物1

<400> 11

ctaatacgac tcactatagg gcaagcagtg gtatcaacgc agagt 45

<210> 12

<211> 22

<212> DNA

<213> 引物2

<400> 12

ctaatacgac tcactatagg gc 22

<210> 13

<211> 24

<212> DNA

<213> 引物3

<400> 13

catcccaggg tcaccatgga gtta 24

<210> 14

<211> 24

<212> DNA

<213> 引物4

<400> 14

gactgaggca cctccagatg ttaa 24

Claims (7)

1.一种抗人VEGF的鼠单克隆抗体，其特征在于，所述鼠单克隆抗体可结合人VEGF的生物活性区，即人VEGF的KDR或FLT1受体结合结构域；其中，所述鼠单克隆抗体的重链可变区的CDR-Hl、CDR-H2和CDR-H3氨基酸序列分别如SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5所示；所述鼠单克隆抗体的轻链可变区的CDR-Ll、CDR-L2和CDR-L3氨基酸序列分别如SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：10所示。

2.如权利要求1所述的抗人VEGF的鼠单克隆抗体，其特征在于，所述鼠单克隆抗体的重链可变区含有如SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列，所述鼠单克隆抗体的轻链可变区含有如SEQ ID NO：7所示的氨基酸序列。

3.一种检测生物样品中人VEGF水平的组合试剂，其特征在于，所述组合试剂包含如权利要求1或2所述的抗人VEGF的鼠单克隆抗体。

4. 一种检测生物样品中人VEGF水平的组合试剂，其特征在于，所述组合试剂包含经标记的如权利要求1或2所述的抗人VEGF的鼠单克隆抗体；其中，标记选自放射性同位素、荧光素或酶底物。

5.一种检测生物样品中人VEGF水平的试剂盒，包含捕获抗体和检测抗体，所述捕获抗体为抗人VEGF的多克隆抗体或单克隆抗体，其特征在于，所述检测抗体为经标记的如权利要求1或2所述的抗人VEGF的鼠单克隆抗体；其中，标记选自放射性同位素、荧光素或酶底物。

6.如权利要求5所述的检测生物样品中人VEGF水平的试剂盒，其特征在于，所述捕获抗体为如权利要求1或2所述的抗人VEGF的鼠单克隆抗体。

7.一种检测生物样品中人VEGF水平的方法，包括如下步骤：

(a) 使生物学样品与固定化至固相载体的捕获抗体接触并一起温育，其中，所述捕获抗体为抗人VEGF的单克隆抗体或多克隆抗体；

(b) 将所述生物学样品与所述固定化捕获抗体分开；

(c) 使所述固定化捕获抗体—靶标分子人VEGF复合物与检测抗体接触，所述检测抗体能结合人VEGF 的KDR或FLT1受体结合结构域；

(d) 使用针对所述检测抗体的检测手段来测定所述捕获抗体所结合的人VEGF的水平；其中，检测抗体为经标记的如权利要求1或2所述的抗人VEGF的鼠单克隆抗体。