CN107703290A - 一种血管内皮因子检测试剂盒的制备方法 - Google Patents

一种血管内皮因子检测试剂盒的制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种血管内皮因子检测试剂盒的制备方法，包括如下步骤：(1)按试剂R1组分含量，将Tris溶于纯化水，调pH，得R1缓冲液；将NaN3、海藻糖、曲拉通、PEG‑2000溶于R1缓冲液，得试剂R1；(2)按试剂R2组分含量，将Tris溶于纯化水，调pH，得R2缓冲液；将NaCl、NaN3、BSA、甘油溶于R2缓冲液，得R2分散液；制备胶乳包被的血管内皮因子多克隆抗体；用R2分散液溶解胶乳包被的血管内皮因子多克隆抗体，得试剂R2。本发明的优点为：(1)操作简单、快速；(2)采取不同粒径的胶乳微球，提高了试剂盒的灵敏度和线性范围；(3)试剂盒稳定性佳，特异性强；(4)适合全自动测试。

Description

一种血管内皮因子检测试剂盒的制备方法
技术领域
本发明涉及医学检验技术领域，尤其涉及一种血管内皮因子检测试剂盒的制备方法。
背景技术
血管内皮生长因子(英文：vascular endothelial growth factor，简称：VEGF)，早期亦称作血管通透因子(英文：vascular permeability factor，简称：VPF)，是血管内皮细胞特异性的肝素结合生长因子(heparin-binding growth factor)，可在体内诱导血管新生(induce angiogenesis in vivo)。该因子能有效的促进血管再生，对医疗研究由重要作用。
目前，检测血管内皮因子的方法主要还是放射免疫分析法，但众所周知，放射免疫分析法具有一定的放射性污染，且应用仪器比较昂贵。
因此，目前急需一种无污染、操作成本低的血管内皮因子检测试剂盒。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供了一种无污染、操作成本低的血管内皮因子检测试剂盒的制备方法。
本发明是通过以下技术方案实现的：一种血管内皮因子检测试剂盒的制备方法，包括如下步骤：
(1)按照下列组分含量配制试剂R1：
试剂R1：
其溶剂为纯化水；
①按照上述试剂R1的组分含量，将Tris溶于纯化水中，搅拌均匀，调节pH，配制成R1缓冲液；
②按照上述试剂R1的组分含量，将NaN3、海藻糖、曲拉通、PEG-2000溶于R1缓冲液中，搅拌均匀，待所有原料充分溶解，即制得试剂R1；
(2)按照下列组分含量配制试剂R2：
试剂R2：
其溶剂为纯化水；
①按照上述试剂R2的组分含量，将Tris溶于纯化水中，搅拌均匀，调节pH，配制成R2缓冲液；
②按照上述试剂R2的组分含量，将NaCl、NaN3、BSA、甘油溶于R2缓冲液中，搅拌均匀，即得R2分散液；
③制备胶乳包被的血管内皮因子多克隆抗体：
a.取粒径为80nm和120nm的胶乳微球于MES缓冲液中，加入EDAC溶液混匀后于37℃环境中孵育混匀1h，离心去上清；再加入NHS溶液恢复至原体积后，混匀于37℃环境中孵育混匀1h，离心去上清，得混合微球乳液；
b.在混合微球乳液中加入聚乙烯对氯甲基苯乙烯共聚物，共聚80nm和120nm粒径的胶乳；离心沉淀，将剩余物质分散于MES缓冲液中，反复2-4次，最后于MES缓冲液中恢复至原体积，再加入血管内皮因子多克隆抗体，于37℃下反应3-4h，离心，将沉淀物分散于原体积的PBS缓冲液中，反复2-4次，最后将沉淀物分散于原体积的NHS缓冲液中，加入BSA；
c.2-8℃封存45-50h，得最终所需的胶乳包被的血管内皮因子多克隆抗体；
④用R2分散液来溶解得到的胶乳包被的血管内皮因子多克隆抗体，超声分散，最终制得试剂R2；其中，聚乙烯对氯甲基苯乙烯共聚物在试剂R2中的最终浓度为9％-11％。
作为本发明的优选方式之一，所述步骤(1)中，试剂R1的Tris缓冲液的pH为7.5。
作为本发明的优选方式之一，所述步骤(2)中，试剂R2的Tris缓冲液的pH为7.5。
作为本发明的优选方式之一，所述制备胶乳包被的血管内皮因子多克隆抗体的步骤a中，采用的MES缓冲液为100mM MES缓冲液。
作为本发明的优选方式之一，所述制备胶乳包被的血管内皮因子多克隆抗体的步骤a中，采用的EDAC溶液为50g/L的EDAC溶液。
作为本发明的优选方式之一，所述制备胶乳包被的血管内皮因子多克隆抗体的步骤a中，采用的NHS溶液为50g/L的NHS溶液。
作为本发明的优选方式之一，所述制备胶乳包被的血管内皮因子多克隆抗体的步骤b中，加入的BSA为30g/L的BSA。
本发明相比现有技术的优点在于：
(1)采用本方法制备的试剂盒具有较高的检测灵敏度，操作简单、快速，从检测到出结果只需10分钟；
(2)胶乳包被的血管内皮因子多克隆抗体的制备过程中，采取了不同粒径的胶乳微球混合使用，大大提高了试剂盒的灵敏度和线性范围；
(3)采用本方法制备的试剂盒与样品所形成的抗原抗体复合物，稳定性佳，在特定波长下有一定的吸光度，特异性强；
(4)采用本方法制备的试剂盒可用于全自动生化分析仪上，适合全自动测试，可大规模的开展和推广。
具体实施方式
下面对本发明的实施例作详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
实施例1
本实施例的一种血管内皮因子检测试剂盒的制备方法，包括如下步骤：
(1)按照下列组分含量配制试剂R1：
试剂R1：
其溶剂为纯化水；
①按照上述试剂R1的组分含量，将Tris溶于纯化水中，搅拌均匀，调节pH，配制成R1缓冲液；
②按照上述试剂R1的组分含量，将NaN3、海藻糖、曲拉通、PEG-2000溶于R1缓冲液中，搅拌均匀，待所有原料充分溶解，即制得试剂R1；
(2)按照下列组分含量配制试剂R2：
试剂R2：
其溶剂为纯化水；
①按照上述试剂R2的组分含量，将Tris溶于纯化水中，搅拌均匀，调节pH，配制成R2缓冲液；
②按照上述试剂R2的组分含量，将NaCl、NaN3、BSA、甘油溶于R2缓冲液中，搅拌均匀，即得R2分散液；
③制备胶乳包被的血管内皮因子多克隆抗体：
a.取粒径为80nm和120nm的胶乳微球于100mM MES缓冲液中，加入50g/L的EDAC溶液混匀后于37℃环境中孵育混匀1h，离心去上清；再加入50g/L的NHS溶液恢复至原体积后，混匀于37℃环境中孵育混匀1h，离心去上清，得混合微球乳液；
b.在混合微球乳液中加入聚乙烯对氯甲基苯乙烯共聚物，共聚80nm和120nm粒径的胶乳；离心沉淀，将剩余物质分散于MES缓冲液中，反复2次，最后于MES缓冲液中恢复至原体积，再加入血管内皮因子多克隆抗体，于37℃下反应3h，离心，将沉淀物分散于原体积的PBS缓冲液中，反复2次，最后将沉淀物分散于原体积的NHS缓冲液中，加入BSA30g/L；
c.2℃封存45h，得最终所需的胶乳包被的血管内皮因子多克隆抗体；
④用R2分散液来溶解得到的胶乳包被的血管内皮因子多克隆抗体，超声分散，最终制得试剂R2；其中，聚乙烯对氯甲基苯乙烯共聚物在试剂R2中的最终浓度为9％。
实施例2
本实施例的一种血管内皮因子检测试剂盒的制备方法，包括如下步骤：
(1)按照下列组分含量配制试剂R1：
试剂R1：
其溶剂为纯化水；
①按照上述试剂R1的组分含量，将Tris溶于纯化水中，搅拌均匀，调节pH，配制成R1缓冲液；
②按照上述试剂R1的组分含量，将NaN3、海藻糖、曲拉通、PEG-2000溶于R1缓冲液中，搅拌均匀，待所有原料充分溶解，即制得试剂R1；
(2)按照下列组分含量配制试剂R2：
试剂R2：
胶乳包被的血管内皮因子多克隆抗体3％
其溶剂为纯化水；
①按照上述试剂R2的组分含量，将Tris溶于纯化水中，搅拌均匀，调节pH，配制成R2缓冲液；
②按照上述试剂R2的组分含量，将NaCl、NaN3、BSA、甘油溶于R2缓冲液中，搅拌均匀，即得R2分散液；
③制备胶乳包被的血管内皮因子多克隆抗体：
a.取粒径为80nm和120nm的胶乳微球于100mM MES缓冲液中，加入50g/L的EDAC溶液混匀后于37℃环境中孵育混匀1h，离心去上清；再加入50g/L的NHS溶液恢复至原体积后，混匀于37℃环境中孵育混匀1h，离心去上清，得混合微球乳液；
b.在混合微球乳液中加入聚乙烯对氯甲基苯乙烯共聚物，共聚80nm和120nm粒径的胶乳；离心沉淀，将剩余物质分散于MES缓冲液中，反复4次，最后于MES缓冲液中恢复至原体积，再加入血管内皮因子多克隆抗体，于37℃下反应4h，离心，将沉淀物分散于原体积的PBS缓冲液中，反复4次，最后将沉淀物分散于原体积的NHS缓冲液中，加入BSA 30g/L；
c.8℃封存50h，得最终所需的胶乳包被的血管内皮因子多克隆抗体；
④用R2分散液来溶解得到的胶乳包被的血管内皮因子多克隆抗体，超声分散，最终制得试剂R2；其中，聚乙烯对氯甲基苯乙烯共聚物在试剂R2中的最终浓度为11％。
实施例3
本实施例的一种血管内皮因子检测试剂盒的制备方法，包括如下步骤：
(1)按照下列组分含量配制试剂R1：
试剂R1：
其溶剂为纯化水；
①按照上述试剂R1的组分含量，将Tris溶于纯化水中，搅拌均匀，调节pH，配制成R1缓冲液；
②按照上述试剂R1的组分含量，将NaN3、海藻糖、曲拉通、PEG-2000溶于R1缓冲液中，搅拌均匀，待所有原料充分溶解，即制得试剂R1；
(2)按照下列组分含量配制试剂R2：
试剂R2：
其溶剂为纯化水；
①按照上述试剂R2的组分含量，将Tris溶于纯化水中，搅拌均匀，调节pH，配制成R2缓冲液；
②按照上述试剂R2的组分含量，将NaCl、NaN3、BSA、甘油溶于R2缓冲液中，搅拌均匀，即得R2分散液；
③制备胶乳包被的血管内皮因子多克隆抗体：
a.取粒径为80nm和120nm的胶乳微球于100mM MES缓冲液中，加入50g/L的EDAC溶液混匀后于37℃环境中孵育混匀1h，离心去上清；再加入50g/L的NHS溶液恢复至原体积后，混匀于37℃环境中孵育混匀1h，离心去上清，得混合微球乳液；
b.在混合微球乳液中加入聚乙烯对氯甲基苯乙烯共聚物，共聚80nm和120nm粒径的胶乳；离心沉淀，将剩余物质分散于MES缓冲液中，反复3次，最后于MES缓冲液中恢复至原体积，再加入血管内皮因子多克隆抗体，于37℃下反应3.5h，离心，将沉淀物分散于原体积的PBS缓冲液中，反复3次，最后将沉淀物分散于原体积的NHS缓冲液中，加入BSA 30g/L；
c.4℃封存48h，得最终所需的胶乳包被的血管内皮因子多克隆抗体；
④用R2分散液来溶解得到的胶乳包被的血管内皮因子多克隆抗体，超声分散，最终制得试剂R2；其中，聚乙烯对氯甲基苯乙烯共聚物在试剂R2中的最终浓度为10％。
实施例4
本实施例的采用上述实施例方法制备得到的血管内皮因子检测试剂盒的使用方法，包括如下步骤：
(1)将4uL待测样品与150uL试剂R1混合，37℃孵育5min；
(2)用全自动生化分析仪在波长600nm处测定反应后的吸光度A1；
(3)再与50uL试剂R2混合，37℃反应5min；
(4)用全自动生化分析仪在波长600nm处测定反应后的吸光度A2；
(5)根据吸光度变化值ΔA＝A2-A1，计算出样本中血管内皮因子的浓度。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (7)

1.一种血管内皮因子检测试剂盒的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)按照下列组分含量配制试剂R1：
试剂R1：
①按照上述试剂R1的组分含量，将Tris溶于纯化水中，搅拌均匀，调节pH，配制成R1缓冲液；
②按照上述试剂R1的组分含量，将NaN3、海藻糖、曲拉通、PEG-2000溶于R1缓冲液中，搅拌均匀，待所有原料充分溶解，即制得试剂R1；
(2)按照下列组分含量配制试剂R2：
试剂R2：
①按照上述试剂R2的组分含量，将Tris溶于纯化水中，搅拌均匀，调节pH，配制成R2缓冲液；
②按照上述试剂R2的组分含量，将NaCl、NaN3、BSA、甘油溶于R2缓冲液中，搅拌均匀，即得R2分散液；
③制备胶乳包被的血管内皮因子多克隆抗体：
a.取粒径为80nm和120nm的胶乳微球于MES缓冲液中，加入EDAC溶液混匀后于37℃环境中孵育混匀1h，离心去上清；再加入NHS溶液恢复至原体积后，混匀于37℃环境中孵育混匀1h，离心去上清，得混合微球乳液；
b.在混合微球乳液中加入聚乙烯对氯甲基苯乙烯共聚物，共聚80nm和120nm粒径的胶乳；离心沉淀，将剩余物质分散于MES缓冲液中，反复2-4次，最后于MES缓冲液中恢复至原体积，再加入血管内皮因子多克隆抗体，于37℃下反应3-4h，离心，将沉淀物分散于原体积的PBS缓冲液中，反复2-4次，最后将沉淀物分散于原体积的NHS缓冲液中，加入BSA；
c.2-8℃封存45-50h，得最终所需的胶乳包被的血管内皮因子多克隆抗体；
④用R2分散液来溶解得到的胶乳包被的血管内皮因子多克隆抗体，超声分散，最终制得试剂R2；其中，聚乙烯对氯甲基苯乙烯共聚物在试剂R2中的最终浓度为9％-11％。
2.根据权利要求1所述的血管内皮因子检测试剂盒的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中，试剂R1的Tris缓冲液的pH为7.5。
3.根据权利要求1所述的血管内皮因子检测试剂盒的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中，试剂R2的Tris缓冲液的pH为7.5。
4.根据权利要求1所述的血管内皮因子检测试剂盒的制备方法，其特征在于，所述制备胶乳包被的血管内皮因子多克隆抗体的步骤a中，采用的MES缓冲液为100mM MES缓冲液。
5.根据权利要求1所述的血管内皮因子检测试剂盒的制备方法，其特征在于，所述制备胶乳包被的血管内皮因子多克隆抗体的步骤a中，采用的EDAC溶液为50g/L的EDAC溶液。
6.根据权利要求1所述的血管内皮因子检测试剂盒的制备方法，其特征在于，所述制备胶乳包被的血管内皮因子多克隆抗体的步骤a中，采用的NHS溶液为50g/L的NHS溶液。
7.根据权利要求1所述的血管内皮因子检测试剂盒的制备方法，其特征在于，所述制备胶乳包被的血管内皮因子多克隆抗体的步骤b中，加入的BSA为30g/L的BSA。
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CN112098647A (zh) * 2020-02-28 2020-12-18 安徽大千生物工程有限公司 一种基于胶乳增强免疫比浊法测定ck-mb的试剂盒及其制备使用方法

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