CN106093405A - 一种测定癌胚抗原的试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及医学及生物化学技术领域，具体来说是一种测定癌胚抗原的试剂盒。本发明的目的在于解决现有技术中癌胚抗原检测过程操作复杂、以及测定准确度低的问题，本发明解决上述技术问题提供的技术方案是：一种测定癌胚抗原的试剂盒，该试剂盒由试剂R1和试剂R2双液体组分组成试剂盒，其中R1试剂包含MOPS缓冲液15~185 mmol/L、氯化钠150~400 mmol/L、聚乙二醇5~25 g/L、牛血清白蛋白18~42 g/L、叠氮钠0.3~0.9 g/L，其溶剂为纯化水。R2试剂包含MOPS缓冲液50~150mmol/L、氯化钠100~300 mmol/L、牛血清白蛋白4~18 g/L、海藻糖5~35 g/L、叠氮钠0.3~0.9 g/L、乳胶包被抗人癌胚抗原单克隆抗体0.1~2.0%，其溶剂为纯化水。本发明具有准确度高、操作方便等优点。
Description
技术领域
本发明涉及医学及生物化学技术领域，具体来说是一种测定癌胚抗原的试剂盒。
背景技术
癌胚抗原是大肠癌组织产生的一种糖蛋白，作为抗原可引起患者的免疫反应。此种抗原称为癌胚抗原，可广泛存在于内胚叶起源的消化系统癌，也存在于正常胚胎的消化管组织中，在正常人血清中也可有微量存在。 癌胚抗原是一个广谱性肿瘤标志物，它能向人们反映出多种肿瘤的存在，对大肠癌、乳腺癌和肺癌的疗效判断、病情发展、监测和预后估计是一个较好的肿瘤标志物。
CEA最初发现于结肠癌和胎儿肠组织中，故名癌胚抗原。CEA升高常见于大肠癌、胰腺癌、胃癌、乳腺癌、甲状腺髓样癌等。此外，血清CEA水平与大肠癌的分期有明确关系，越晚期的病变，CEA浓度越高。
原发性结肠癌患者CEA增高占45－80%。除原发性结肠癌以外，胰腺癌、胆管癌、胃癌、食管癌、腺癌、肺癌、乳腺癌和泌尿系统的肿瘤阳性率也很高，一般在50－70%。
良性肿瘤、炎症和退行性疾病，如结肠息肉、溃疡性结肠炎、胰腺炎和酒精性肝硬化变病人CEA也有部分升高，但远远低于恶性肿瘤，一般小于20μg/L，CEA超过20μg/L时往往提示有消化道肿瘤。所以测定CEA可以作为良性与恶性肿瘤的鉴别诊断依据。
目前检测癌胚抗原的方法多位酶联免疫吸附法、化学发光。但酶联免疫吸附法操作复杂、耗时长、且对操作人员有较高的专业要求。化学发光虽然灵敏度和准确度均较高，但试剂成本相对较高，且配套的大型仪器较昂贵。
发明内容
本发明的目的在于解决现有技术中癌胚抗原检测过程操作复杂、以及测定准确度低的问题，提供一种测定类风湿因子的试剂盒。
本发明解决上述技术问题提供的技术方案是：一种测定癌胚抗原的试剂盒，包括彼此独立的试剂R1和试剂R2双液体组分，它们包括的成分及相应含量为：
试剂R1：
MOPS缓冲液 15~185 mmol/L
氯化钠 150~400 mmol/L
聚乙二醇 5~25 g/L
牛血清白蛋白 18~42 g/L
叠氮钠 0.3~0.9 g/L
其溶剂为纯化水。
试剂R2：
MOPS缓冲液 50~150 mmol/L
氯化钠 100~300 mmol/L
牛血清白蛋白 4~18 g/L
海藻糖 5~35 g/L
叠氮钠 0.3~0.9 g/L
乳胶包被抗人癌胚抗原单克隆抗体 0.1~2.0 %
其溶剂为纯化水。
作为优选方案 ，所述的彼此独立的试剂R1和试剂R2包括的成分及相应含量为：
试剂R1：
MOPS缓冲液 100 mmol/L
氯化钠 225 mmol/L
聚乙二醇 15 g/L
牛血清白蛋白 30 g/L
叠氮钠 0.6 g/L
其溶剂为纯化水。
试剂R2：
MOPS缓冲液 100 mmol/L
氯化钠 200 mmol/L
牛血清白蛋白 11 g/L
海藻糖 20 g/L
叠氮钠 0.6 g/L
乳胶包被抗人癌胚抗原单克隆抗体 1.0 %
其溶剂为纯化水。
作为优选，所述的乳胶包被抗人癌胚抗原单克隆抗体为含有能与人癌胚抗原特异性结合的Fab功能部位的完整抗体或抗体片段。
作为优选，所述的乳胶包被抗人癌胚抗原单克隆抗体的粒径在30~200nm之间。
作为优选，本测定癌胚抗原的试剂盒的制备方法和使用方法包括以下步骤：
（a）按照下列组分含量配制好R1试剂：
MOPS缓冲液 15~185 mmol/L
氯化钠 150~400 mmol/L
聚乙二醇 5~25 g/L
牛血清白蛋白 18~42 g/L
叠氮钠 0.3~0.9 g/L
其溶剂为纯化水。
（b）按照下列组分含量配制好R2试剂：
MOPS缓冲液 50~150 mmol/L
氯化钠 100~300 mmol/L
牛血清白蛋白 4~18 g/L
海藻糖 5~35 g/L
叠氮钠 0.3~0.9 g/L
乳胶包被抗人癌胚抗原单克隆抗体 0.1~2.0 %
其溶剂为纯化水。
（c）将待测样本与试剂R1和试剂R2混合，使其充分反应，进一步优选的R1与试剂R2的体积比为4：1，待测样本与试剂R1和试剂R2的总体积的体积比在1：5到1：30之间；
（d）用全自动生化分析仪测定反应后的吸光度差值；
（e）根据吸光度变化值计算出样本中的癌胚抗原的值。
作为优选，所述的乳胶包被抗人癌胚抗原单克隆抗体制备步骤如下：
（a）将粒径为80nm的胶乳颗粒，用50 mmol/L的MES缓冲液稀释胶乳颗粒到3 g/L，每mL溶液中加入EDAC 1.0 mg，室温反应2小时，在离心机内15000 rpm转速下离心30分钟，去上清，将沉淀悬浮于50 mmol/L的MES缓冲液中，超声分散；
（b）将步骤（a）的产物在离心机内20000rpm转速下离心30分钟，弃上清，将沉淀悬浮于50 mmol/L的MES缓冲液中，使得胶乳颗粒最终浓度为6.0 g/L，超声分散，边搅拌边加入等体积的含8 mg/mL 抗人癌胚抗原抗体的MES稀释液，混合搅拌，室温反应2小时，胶乳颗粒最终浓度为3.0 g/L；
（c）将步骤（b）的产物在离心机内20000 rpm转速离心30分钟，弃上清，沉淀悬浮于50mmol/L的MES缓冲液中超声分散，加入BSA使得BSA最终浓度达到15 g/L，4℃封闭过夜；离心去上清，用步骤（b）制得的分散液溶解胶乳颗粒，使胶乳颗粒终浓度为1.0%，超声分散即可制得乳胶包被抗人癌胚抗原单克隆抗体。
本发明所采用的胶乳增强免疫比浊法的反应原理是：血清样本中的癌胚抗原与含有包被了高特异性的抗人癌胚抗原抗体的缓冲液发生特异性结合，在促凝剂作用下形成不溶性的聚苯乙烯微球-抗原-聚苯乙烯微球颗粒复合物乳浊液，产生一定的浊度，其浊度高低与样本中的癌胚抗原抗原浓度成正比关系，在一定波长下进行浊度测定，即可测得样本中被检测癌胚抗原的含量。
样本中癌胚抗原（CEA）的活性（ng/mL）= CS ×（ng/mL）
式中：ΔAT/min 以空白管吸光度作对照的样品管吸光度值
ΔAS/min 以空白管吸光度作对照的校准管吸光度值
CS 校准液中CEA的浓度
与现有技术相比，本发明具有以下有益优点：对癌胚抗原的检测灵敏度更高，检测准确性更好，另外检测也比较方便。
附图说明：
图1为本试剂盒与化学发光法的检测结果对比。
具体实施方式
以下结合具体实施例进一步说明，但本发明并不仅限于这些实施例。
实施例1
本发明的试剂盒包括彼此独立的试剂R1和试剂R2双液体组分，其中
试剂R1：
MOPS缓冲液 100 mmol/L
氯化钠 225 mmol/L
聚乙二醇 15 g/L
牛血清白蛋白 30 g/L
叠氮钠 0.6 g/L
其溶剂为纯化水。
试剂R2：
MOPS缓冲液 100 mmol/L
氯化钠 200 mmol/L
牛血清白蛋白 11 g/L
海藻糖 20 g/L
叠氮钠 0.6 g/L
乳胶包被抗人癌胚抗原单克隆抗体 1.0 %
其溶剂为纯化水。
实施例2
试剂盒的制备和使用方法
1、乳胶包被抗人癌胚抗原单克隆抗体的制作：
（a）将粒径为80nm的胶乳颗粒，用50 mmol/L的MES缓冲液稀释胶乳颗粒到3 g/L，每mL溶液中加入EDAC 1.0 mg，室温反应2小时，在离心机内15000 rpm转速下离心30分钟，去上清，将沉淀悬浮于50 mmol/L的MES缓冲液中，超声分散；
（b）将步骤（a）的产物在离心机内20000rpm转速下离心30分钟，弃上清，将沉淀悬浮于50 mmol/L的MES缓冲液中，使得胶乳颗粒最终浓度为6.0 g/L，超声分散，边搅拌边加入等体积的含8 mg/mL 抗人癌胚抗原抗体的MES稀释液，混合搅拌，室温反应2小时，胶乳颗粒最终浓度为3.0 g/L；
（c）将步骤（b）的产物在离心机内20000 rpm转速离心30分钟，弃上清，沉淀悬浮于50mmol/L的MES缓冲液中超声分散，加入BSA使得BSA最终浓度达到15 g/L，4℃封闭过夜；离心去上清，用步骤（b）制得的分散液溶解胶乳颗粒，使胶乳颗粒终浓度为1.0%，超声分散即可制得乳胶包被抗人癌胚抗原单克隆抗体。
2、按照下列组分含量配制好试剂：
（a）按照下列组分含量配制好R1试剂：
MOPS缓冲液 100 mmol/L
氯化钠 225 mmol/L
聚乙二醇 15 g/L
牛血清白蛋白 30 g/L
叠氮钠 0.6 g/L
其溶剂为纯化水。
（b）按照下列组分含量配制好R2试剂：
MOPS缓冲液 100 mmol/L
氯化钠 200 mmol/L
牛血清白蛋白 11 g/L
海藻糖 20 g/L
叠氮钠 0.6 g/L
乳胶包被抗人癌胚抗原单克隆抗体 1.0 %
其溶剂为纯化水。
3、全自动生化分析仪参数设置
（a）检测温度：37℃；
（b）检测波长：主波长570nm；
（c）反应时间 ：10min，其中，孵育时间 5min，加入试剂 R2 后立即测定读取吸光度A1，5min后读取吸光度 A2，计算吸光度变化 ΔA ＝ A2-A1 ；
(d) 反应方向：正反应；
4、检测步骤
（a）取160μl试剂R1与20μl待测样本混匀；
（b）将混匀后的溶液在37℃的条件下孵育5min；
（c）加入40μl试剂R2，立即测定读取吸光度A1，5min后读取吸光度A2，计算吸光度变化ΔA ＝ A2-A1；
(d) 样本中癌胚抗原（CEA）的活性（ng/mL）= CS × （ng/mL）计算出样本中的癌胚抗原的活度。
参照附图1，附图1为用实施例1所制得的一种测定癌胚抗原的试剂盒多次测定不同样本中癌胚抗原的测定结果，以及在同等条件下与化学发光法测定结果的对比分析。从相关性实验结果可见，本试剂盒与化学发光检测结果相关性很好，相关方程 y=1.0191x+0.2502，R2=0.9966，从结果可以看出本试剂盒结果准确性可靠，相关性良好，可以应用于癌胚抗原的检测。
Claims (8)
1.一种测定癌胚抗原的试剂盒，其特征在于：包括彼此独立的试剂R1和试剂R2双液体组分，包括的成分及相应含量为：
试剂R1：
MOPS缓冲液 15~185 mmol/L
氯化钠 150~400 mmol/L
聚乙二醇 5~25 g/L
牛血清白蛋白 18~42 g/L
叠氮钠 0.3~0.9 g/L
其溶剂为纯化水
试剂R2：
MOPS缓冲液 50~150 mmol/L
氯化钠 100~300 mmol/L
牛血清白蛋白 4~18 g/L
海藻糖 5~35 g/L
叠氮钠 0.3~0.9 g/L
乳胶包被抗人癌胚抗原单克隆抗体 0.1~2.0 %
其溶剂为纯化水。
2.如权利要求1所述的一种测定癌胚抗原的试剂盒，其特征在于：所述的彼此独立的试剂R1和试剂R2双液体组分，包括的成分及相应含量为：
试剂R1：
MOPS缓冲液 100 mmol/L
氯化钠 225 mmol/L
聚乙二醇 15 g/L
牛血清白蛋白 30 g/L
叠氮钠 0.6 g/L
其溶剂为纯化水
试剂R2：
MOPS缓冲液 100 mmol/L
氯化钠 200 mmol/L
牛血清白蛋白 11 g/L
海藻糖 20 g/L
叠氮钠 0.6 g/L
乳胶包被抗人癌胚抗原单克隆抗体 1.0 %
其溶剂为纯化水。
3.如权利要求1所述的一种测定癌胚抗原的试剂盒，其特征在于：所述的乳胶包被抗人类风湿因子抗体为含有能与人癌胚抗原特异性结合的Fab功能部位的完整抗体或抗体片段。
4.如权利要求1所述的一种测定癌胚抗原的试剂盒，其特征在于：所述的乳胶包被抗人类风湿因子抗体的粒径在30~200nm之间。
5.如权利要求1所述的一种测定癌胚抗原的试剂盒，其特征在于：试剂盒的制备方法和使用方法包括以下步骤：
（a）按照下列组分含量配制好R1试剂：
MOPS缓冲液 15~185 mmol/L
氯化钠 150~400 mmol/L
聚乙二醇 5~25 g/L
牛血清白蛋白 18~42 g/L
叠氮钠 0.3~0.9 g/L
其溶剂为纯化水
（b）按照下列组分含量配制好R2试剂：
MOPS缓冲液 50~150 mmol/L
氯化钠 100~300 mmol/L
牛血清白蛋白 4~18 g/L
海藻糖 5~35 g/L
叠氮钠 0.3~0.9 g/L
乳胶包被抗人癌胚抗原单克隆抗体 0.1~2.0 %
其溶剂为纯化水
（c）将待测样本与试剂R1和试剂R2混合，使其充分反应；
（d）用全自动生化分析仪测定反应后的吸光度差值；
（e）根据吸光度变化值计算出样本中的癌胚抗原的值。
6.如权利要求1所述的一种测定癌胚抗原的试剂盒，其特征在于：所述的乳胶包被抗人癌胚抗原单克隆抗体制备步骤如下：
（a）将粒径为80nm的胶乳颗粒，用50 mmol/L的MES缓冲液稀释胶乳颗粒到3 g/L，每mL溶液中加入EDAC 1.0 mg，室温反应2小时，在离心机内15000 rpm转速下离心30分钟，去上清，将沉淀悬浮于50 mmol/L的MES缓冲液中，超声分散；
（b）将步骤（a）的产物在离心机内20000rpm转速下离心30分钟，弃上清，将沉淀悬浮于50 mmol/L的MES缓冲液中，使得胶乳颗粒最终浓度为6.0 g/L，超声分散，边搅拌边加入等体积的含8 mg/mL 抗人癌胚抗原抗体的MES稀释液，混合搅拌，室温反应2小时，胶乳颗粒最终浓度为3.0 g/L；
（c）将步骤（b）的产物在离心机内20000 rpm转速离心30分钟，弃上清，沉淀悬浮于50mmol/L的MES缓冲液中超声分散，加入BSA使得BSA最终浓度达到15 g/L，4℃封闭过夜；离心去上清，用步骤（b）制得的分散液溶解胶乳颗粒，使胶乳颗粒终浓度为1.0%，超声分散即可制得乳胶包被抗人癌胚抗原单克隆抗体。
7.根据权利要求5所述的一种测定癌胚抗原的试剂盒的制备方法和使用方法，其特征在于：步骤（c）中,所述的试剂R1与试剂R2的体积比为4：1。
8.根据权利要求5所述的一种测定癌胚抗原的试剂盒的制备方法和使用方法，其特征在于：步骤（c）中，所述的待测样本与试剂R1和试剂R2的总体积的体积比在1：5到1：30之间。
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| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20161109 |