CN109682972A - 一种检测乳腺癌肿瘤循环细胞的sers试剂 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种检测乳腺癌肿瘤循环细胞的SERS试剂,其采用三步法或者两步法在金属纳米颗粒表面MNSs依次修饰拉曼信号分子4‑巯基苯甲酸4‑MBA、薄薄的一层还原型牛血清白蛋白rBSA、以及在rBSA层接枝靶分子叶酸FA,从而获得复合金属纳米颗粒MNSs‑MBA‑rBSA‑FA,最后经离心洗涤两次,最后分散在水相中,4°C保存。本发明得到的一种检测乳腺癌肿瘤循环细胞的SERS试剂,其可确定外周血样中是否含有乳腺癌CTCs,且SERS检测试剂于保存条件下可以稳定6个月以上。
Description
技术领域
本发明涉及一种癌细胞检测,特别是一种检测乳腺癌肿瘤循环细胞的SERS试剂。
背景技术
癌症是全球死亡率仅次于心血管疾病的重大疾病,90%以上癌症患者的死亡都是由于肿瘤转移。因此,肿瘤的早期诊断对于挽救患者生命至关重要。然而,恶性肿瘤在早期无明显症状,发现时大多数已属中晚期,对患者来说已经错过最佳治疗时期。传统的临床诊断方法很难实现有效的肿瘤早期诊断,如:磁共振成像(MRI)、电子计算机断层扫描(CT)、正电子发射计算机断层显像(PET)。因此,发展一种肿瘤的早期诊断方法显得非常重要和迫切。
循环肿瘤细胞(CTCs)是从肿瘤组织脱落进入血管的肿瘤细胞,可在血液中循环侵入其他器官,从而形成肿瘤的转移扩散,这是导致大部分癌症病人死亡的主要原因。CTCs的检测可有效地应用于体外早期诊断、愈后及存活时间判断、快速判断治疗效果、体内耐药性检测、个体化治疗、肿瘤复发检测等,具有重要的科学意义和临床应用价值。
现有一种直接检测血液中乳腺癌CTCs的具有表面增强拉曼散射(SERS)功能的试剂,该SERS试剂检测乳腺癌CTCs的灵敏度达到了5个细胞/mL血液,且稳定性好,冷藏可稳定6个月以上。
虽然该SERS试剂检测乳腺癌CTCs的灵敏度达到了5个癌细胞/mL血液,可用于乳腺癌的疗效预测、个体化治疗指导、转移复发监测等,但不能用于乳腺癌的早期诊断,灵敏度有待进一步提高。
发明内容
本发明的目的是为了解决上述现有技术的不足而提供一种检测乳腺癌肿瘤循环细胞的SERS试剂,提高其灵敏度,同时应用于乳腺癌的早期诊断。
为了实现上述目的,本发明所设计的一种检测乳腺癌肿瘤循环细胞的SERS试剂,包括以下步骤:
1)制备金属纳米颗粒
按重量份将60-70份金、10-15份银、10-15份铂、1-5份石墨烯、0.5-2份铋、0.1-0.5份钼以及0.1-0.5份钯溶于稀盐酸溶液中,加热至沸,待冷却后,离心弃去上清液,再离心洗涤两次,贮存在4℃冰箱中待用,利用ICP-OES测其金元素的浓度,将其浓度稀释至0.02 mg/mL;上述金属纳米颗粒的形状为金属纳米星,且定义为MNSs;
2)制备还原型牛血清白蛋白-叶酸复合物
将叶酸(FA)、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)加入到PBS(pH7.4,10 mM)中溶解,并在避光条件下搅拌反应8.0 h,即可得到活化的FA(FA-NHS);接着将硼氢化钠(NaBH4)逐滴加入到牛血清白蛋白(BSA)中,在室温下搅拌反应持续1.0 h,即可获得还原型牛血清白蛋白(rBSA),然后把上述rBSA加入到FA-NHS的PBS溶液中,在室温下,反应4.0 h即可得到rBSA-FA复合物,最后使用超滤离心管将反应后的溶液浓缩,并分散在超纯水中,4 °C储存待用;
3)制备SERS试剂
采用三步法或者两步法在金属纳米颗粒表面依次修饰拉曼信号分子4-巯基苯甲酸(4-MBA)、薄薄的一层还原型牛血清白蛋白(rBSA)、以及在rBSA层接枝靶分子叶酸(FA),从而获得复合金属纳米颗粒MNSs-MBA-rBSA-FA,最后经离心洗涤两次,最后分散在水相中,4 °C保存,利用ICP-OES测纳米粒子的金元素浓度,将其浓度稀释至0.5 mg/mL。
为增加金属纳米颗粒的稳定性和表面亲水性,避免金属纳米颗粒与血细胞的非特异性相互作用,需要在金属纳米颗粒表面修饰一层亲水性高分子。文献报道的金属纳米颗粒表面高分子的修饰通常都是利用高分子末端的巯基(-SH)与金属纳米颗粒表面的Au反应形成Au-S键。然而,这种“站立式”高分子修饰导致金属纳米颗粒表面的高分子层较厚,会明显降低复合金属纳米颗粒的SERS信号强度,从而导致检测CTCs的灵敏度较低。因此本专利申请设计将硼氢化钠(NaBH4)逐滴加入到牛血清白蛋白(BSA)中,在室温下搅拌反应持续1.0 h,即可获得还原型牛血清白蛋白(rBSA)。由于大分子rBSA具有多个巯基(-SH),rBSA会“平躺式”修饰在金属纳米颗粒表面,故复合金属纳米颗粒表面的大分子层很薄,对SERS信号的影响很低,有利于CTCs检测灵敏度的提高。
本发明得到的一种检测乳腺癌肿瘤循环细胞的SERS试剂,其可确定外周血样中是否含有乳腺癌CTCs。上述SERS试剂具备以下优点:
1)金属纳米颗粒由金、银、铂、石墨烯、铋、钼以及钯组成,上述金属纳米颗粒对拉曼信号有显著的增强作用,一般可达到103-105倍;
2)在金属纳米颗粒表面修饰拉曼信号分子4-巯基苯甲酸(4-MBA),使金属纳米颗粒具有SERS信号;
3)在金属纳米颗粒表面修饰薄薄的一层还原型牛血清白蛋白(rBSA),增加金属纳米颗粒的稳定性和表面亲水性(含大量官能团-COOH和-NH2),避免金属纳米颗粒与血细胞的非特异性相互作用;
4)在金属纳米颗粒表面的rBSA层接枝靶分子叶酸(FA),用于特异性识别叶酸受体α(FRα)过量表达的乳腺癌细胞,从而增加复合金属纳米颗粒检测CTCs的特异性和灵敏度;
5)SERS检测试剂于保存条件下可以稳定6个月以上。
附图说明
图1是实施例1的一种检测乳腺癌肿瘤循环细胞的SERS试剂的结构设计图;
图2是实施例1的一种检测乳腺癌肿瘤循环细胞的SERS试剂的流程图。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明进一步说明。
实施例1:
如图1-2所示,本实施例提供的一种检测乳腺癌肿瘤循环细胞的SERS试剂,包括以下步骤:
1)制备金属纳米颗粒
按重量份将60-70份金、10-15份银、10-15份铂、1-5份石墨烯、0.5-2份铋、0.1-0.5份钼以及0.1-0.5份钯溶于稀盐酸溶液中,加热至沸,待冷却后,离心弃去上清液,再离心洗涤两次,贮存在4℃冰箱中待用,利用ICP-OES测其金元素的浓度,将其浓度稀释至0.02 mg/mL;上述金属纳米颗粒的形状为金属纳米星,且定义为MNSs;
2)还原型牛血清白蛋白-叶酸复合物的制备
将叶酸(FA)、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)加入到PBS(pH7.4,10 mM)中溶解,并在避光条件下搅拌反应8.0 h,即可得到活化的FA(FA-NHS);
将硼氢化钠(NaBH4)逐滴加入到牛血清白蛋白(BSA)中,在室温下搅拌反应持续1.0 h,即可获得还原型牛血清白蛋白(rBSA),然后把上述rBSA加入到FA-NHS的PBS溶液中,在室温下,反应4.0 h即可得到rBSA-FA复合物,最后使用超滤离心管(Millipore, MWCO 3.0 kDa)将反应后的溶液浓缩,并分散在超纯水中,4 °C储存待用。
3)复合金属纳米颗粒的三步法合成
MNSs上4-MBA、rBSA和FA的修饰可通过三步法合成:
(1)拉曼信号分子4-MBA的修饰
把不同浓度溶于THF的4-MBA分别加入到MNSs(金元素浓度为0.02 mg/mL),室温下搅拌反应2 min,即可获得修饰有4-MBA的纳米颗粒MNSs-MBA,使复合金属纳米颗粒具有SERS信号;
(2)亲水性大分子rBSA的修饰
将不同浓度的rBSA水溶液分别与MNSs-MBA混合,在室温下搅拌反应持续5.0 min,即可得到复合金属纳米颗粒MNSs-MBA-rBSA,增加金属纳米颗粒的稳定性和表面亲水性(含大量官能团-COOH和-NH2),避免金属纳米颗粒与血细胞的非特异性相互作用,由于大分子rBSA具有多个巯基(-SH),rBSA会“平躺式”修饰在金属纳米颗粒表面,故复合金属纳米颗粒表面的大分子层很薄,对SERS信号的影响很低;
(3)靶分子FA的偶联
将上述活化的FA(FA-NHS)加入到MNSs-MBA-rBSA分散液中,室温反应4.0 h,即可获得接枝有FA的复合纳米颗粒MNSs-MBA-rBSA-FA,FA的偶联有利于复合金属纳米颗粒特异性识别叶酸受体α(FRα)过量表达的乳腺癌细胞,增加了复合金属纳米颗粒检测乳腺癌细胞的特异性和灵敏度。
4)复合金属纳米颗粒的两步法合成
MNSs上4-MBA、rBSA和FA的修饰可通过两步法合成。
(1)拉曼信号分子4-MBA的修饰
把不同浓度溶于THF的4-MBA分别加入到MNSs(金元素浓度为0.02 mg/mL),室温下搅拌反应2 min,即可获得修饰有4-MBA的纳米颗粒MNSs-MBA,使复合金属纳米颗粒具有SERS信号。
(2)复合物rBSA-FA的修饰
将不同浓度的rBSA-FA水溶液分别与MNSs-MBA混合,在室温下搅拌反应持续5.0 min,即可得到表面功能化rBSA-FA的复合金属纳米颗粒MNSs-MBA-rBSA-FA。
将上述三步法或两步法制得的复合金属纳米颗粒MNSs-MBA-rBSA-FA离心洗涤两次,最后分散在水相中,4 °C保存。利用ICP-OES测纳米粒子的金元素浓度,将其浓度稀释至0.5 mg/mL。
通过实验条件优化,提高检测试剂(即复合金属纳米颗粒)的稳定性,使其在保存条件下(常温或4oC)可以稳定6个月以上。
5)兔血中乳腺癌细胞的检测
SERS试剂的灵敏度研究:把不同数目(4-400范围内)的HeLa细胞分散在4.0 mL 的PBS缓冲液中,与4.0 mL兔血混合均匀后加入含有2.0 mL外周血淋巴细胞分离液的离心管中,在400 × g条件下离心25 min。将分离后的单核细胞(包括白细胞和HeLa细胞)取出分散在PBS中,离心洗涤(400 × g,5 min)两次后分散在3.0 mL的PBS。然后向其中加入100 μL浓度为0.5 mg/mL的MNSs-MBA-rBSA-FA,在37 °C细胞培养箱中培养30 min。然后将样品在400× g条件下离心5 min,弃去上液,离心洗涤(400 × g,5 min)两次后分散在200 μL的PBS。最后使用拉曼光谱仪测其SERS信号。
SERS试剂的特异性研究:把上述方法中“不同数目(4-400范围内)的HeLa细胞”更换为“10个HeLa或HepG2细胞”,其他步骤完全一致。
通过灵敏度和特异性的检测结果, 优化MNSs-MBA-rBSA-FA的制备条件,并通过检测结果比较,得出一种最优SERS试剂,使从兔血中检测乳腺癌细胞的检测限≤1个癌细胞/mL血样。
6)乳腺癌患者外周血样中CTCs的检测
取7.5 mL乳腺癌患者外周血样,加入含有2.0 mL外周血淋巴细胞分离液的离心管中,在400 × g条件下离心25 min。将分离后的单核细胞(包括白细胞和乳腺癌CTCs)取出分散在PBS中,离心洗涤(400 × g,5 min)两次后分散在3.0 mL的PBS。然后向其中加入100-500μL的SERS试剂,在37 °C细胞培养箱中培养30 min。然后将样品在400 × g条件下离心5min,弃去上液,离心洗涤(400 × g,5 min)两次后分散在200 μL的PBS。最后使用拉曼光谱仪测其SERS信号,通过标准曲线计算乳腺癌患者外周血样中CTCs的浓度。通过优化SERS试剂使用量等实验条件,使从乳腺癌患者外周血样中检测CTCs的检测限≤3个CTCs/mL血样,检测精密度的批内CV% ≤ 15%、批间 CV% ≤ 20%。
Claims (3)
1.一种检测乳腺癌肿瘤循环细胞的SERS试剂,其特征在于:包括以下步骤:
1)制备金属纳米颗粒MNSs
按重量份将60-70份金、10-15份银、10-15份铂、1-5份石墨烯、0.5-2份铋、0.1-0.5份钼以及0.1-0.5份钯溶于稀盐酸溶液中,加热至沸,待冷却后,离心弃去上清液,再离心洗涤两次,贮存在4℃冰箱中待用,利用ICP-OES测其金元素的浓度,将其浓度稀释至0.02 mg/mL;上述金属纳米颗粒的形状为金属纳米星,且定义为MNSs;
2)制备还原型牛血清白蛋白-叶酸复合物rBSA-FA
将叶酸FA、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐EDC和N-羟基琥珀酰亚胺NHS加入到PBS缓冲溶液中溶解,并在避光条件下搅拌反应8.0 h,即可得到活化的叶酸FA-NHS;接着将硼氢化钠逐滴加入到牛血清白蛋白中,在室温下搅拌反应持续1.0 h,即可获得还原型牛血清白蛋白,然后把上述还原型牛血清白蛋白加入到已经活化的叶酸FA-NHS的PBS缓冲溶液中,在室温下,反应4.0 h即可得到还原型牛血清白蛋白-叶酸复合物rBSA-FA,最后使用超滤离心管将反应后的溶液浓缩,并分散在超纯水中,4 °C储存待用;
3)制备SERS试剂
采用三步法或者两步法在金属纳米颗粒表面依次修饰拉曼信号分子4-巯基苯甲酸4-MBA、薄薄的一层还原型牛血清白蛋白rBSA、以及在还原型牛血清白蛋白层接枝靶分子叶酸FA,从而获得复合金属纳米颗粒MNSs-MBA-rBSA-FA,最后经离心洗涤两次,最后分散在水相中,4 °C保存,利用ICP-OES测纳米粒子的金元素浓度,将其浓度稀释至0.5 mg/mL。
2.根据权利要求1所述的一种检测乳腺癌肿瘤循环细胞的SERS试剂,其特征在于:所述复合金属纳米颗粒的三步法制备方法包括以下步骤:
(1)拉曼信号分子4-MBA的修饰
把不同浓度溶于THF的4-MBA分别加入到金属纳米颗粒MNSs中,室温下搅拌反应2 min,即可获得修饰有4-MBA的纳米颗粒MNSs-MBA;
(2)亲水性大分子rBSA的修饰
将不同浓度的rBSA水溶液分别与MNSs-MBA混合,在室温下搅拌反应持续5.0 min,即可得到复合金属纳米颗粒MNSs-MBA-rBSA;
(3)靶分子叶酸FA的偶联
将上述活化的叶酸FA加入到MNSs-MBA-rBSA分散液中,室温反应4.0 h,即可获得接枝有叶酸FA的复合纳米颗粒MNSs-MBA-rBSA-FA。
3.根据权利要求1所述的一种检测乳腺癌肿瘤循环细胞的SERS试剂,其特征在于:所述复合金属纳米颗粒的三步法制备方法包括以下步骤:
(1)拉曼信号分子4-MBA的修饰
把不同浓度溶于THF的4-MBA分别加入到金属纳米颗粒MNSs,室温下搅拌反应2 min,即可获得修饰有4-MBA的纳米颗粒MNSs-MBA;
(2)复合物rBSA-FA的修饰
将不同浓度的rBSA-FA水溶液分别与MNSs-MBA混合,在室温下搅拌反应持续5.0 min,即可得到表面功能化rBSA-FA的复合金属纳米颗粒MNSs-MBA-rBSA-FA。
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