CN105597099A - 一种用于肿瘤细胞靶向sers成像的多功能纳米探针及其制备方法 - Google Patents

一种用于肿瘤细胞靶向sers成像的多功能纳米探针及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种用于肿瘤细胞靶向SERS成像的多功能纳米探针及其制备方法,所述探针由内至外依次为金纳米颗粒、巯基苯甲酸、多肽和牛血清白蛋白,金纳米颗粒外包裹一层巯基苯甲酸分子,然后通过酰胺键与多肽连接在一起,最后在表面包裹一层牛血清白蛋白对探针表面裸露区域进行封闭得到;所述金纳米颗粒为星状金纳米颗粒。首先制备对近红外光有较强吸收性能的星状金纳米颗粒,随后在金纳米颗粒表面修饰拉曼分子,然后进一步绑定能够特异性结合肿瘤细胞的多肽。此探针集成多种功能,具有靶向性、SERS成像性能和光热疗功能,可以有效地定向识别肿瘤细胞,并对肿瘤成像,利用光热疗法杀死癌细胞。

Description

一种用于肿瘤细胞靶向SERS成像的多功能纳米探针及其制备方法
技术领域
本发明涉及纳米探针技术领域,具体涉及一种用于肿瘤细胞靶向SERS成像的多功能纳米探针及其制备方法。
背景技术
纳米技术在医学上的应用是当前一个快速发展的领域。很多有独特结构、光学、电学、磁学和催化等性质的纳米材料已经被探索用于肿瘤成像、诊断和治疗。癌细胞手术切除是癌症治疗的高效方法,但副作用明显,此外对于位于重要部位或很难接近的组织的原发肿瘤进行治疗仍是一个挑战。而光热治疗是将癌细胞组织的温度将升高到40-43℃或更高。温度高于43℃时,蛋白质变性,细胞膜损坏,这种情况下肿瘤组织会消融。光热治疗是一种最低限度侵入性治疗方法,利用金属纳米光热材料吸收近红外光(红外波段是透过人体血液和软组织的窗口,近红外光可以透过人体皮肤进入深的组织),通过等离子激元共振和非辐射能级跃迁的过程产生声子(即热能)、导致局部高温,从而使癌细胞凋亡的治疗手段。将金属纳米颗粒修饰生物分子,通过特异性相互作用靶向结合癌细胞,在激光束照射下,能够借助纳米材料优异的光热特性而产生局部高温,使肿瘤细胞死亡。此外,实现肿瘤细胞的特异性成像对于识别癌细胞并开展准确诊疗也是实际应用的迫切需要。表面增强拉曼光谱(SERS)成像技术具有高灵敏性和分辨率,是细胞成像较为理想的工具。已公开的集合SERS成像和光热疗的靶向纳米探针数量相对较少。
发明内容
为了克服目前集合SERS成像和光热疗的靶向纳米探针数量相对较少的缺陷,本发明提供一种用于肿瘤细胞靶向SERS成像的多功能纳米探针及其制备方法,该纳米探针采用星状金纳米颗粒作为探针构建的主体,随后在金纳米颗粒表面修饰拉曼分子(巯基苯甲酸),然后进一步绑定能够特异性结合肿瘤细胞的多肽(RGD),制备得到一种能够用于肿瘤细胞靶向识别、成像及光热治疗的多功能纳米探针。
为了实现上述目的,本发明采用的技术手段为:
一种用于肿瘤细胞靶向SERS成像的多功能纳米探针,所述探针由内至外依次为金纳米颗粒、巯基苯甲酸、多肽和牛血清白蛋白。
在星状金纳米颗粒外包裹一层巯基苯甲酸分子;然后通过对巯基苯甲酸分子的羧基端进行活化,将多肽上的氨基与活化后的羧基反应形成酰胺键而连接在一起,最后在材料表面再包裹一层BSA对探针表面裸露区域进行封闭。所述金纳米颗粒为星状金纳米颗粒。这种多肽为精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(RGD),对A549具有靶向作用。
所述多功能纳米探针的制备方法,包括如下步骤:
1)制备Au种子:将十六烷基三甲基氯化铵加入到氯金酸中搅拌5min,然后滴加NaBH4,快速搅拌2min,得到Au种子;
2)将十六烷基三甲基氯化铵加入到氯金酸中搅拌,加入步骤1)的Au种子,搅拌2min,加入AA搅拌2min,随后放在温控箱中静置生长和熟化3h,最后离心清洗,得到星状金纳米颗粒;
3)将步骤2)制备得到星状金纳米颗粒加入到巯基苯甲酸乙醇溶液中,以200r/min的转速反应20h;然后离心、水洗得到连接巯基苯甲酸的星状金纳米颗粒;
4)将步骤3)的连接巯基苯甲酸的星状金纳米颗粒加入EDC(N-(3-Dimethylaaminopropyl)-N’-ethylcarbodiimidehydrochloride)和NHS(N-Hydroxysuccinimide)中,反应半小时,然后离心、水洗,得到胶体溶液;
5)在胶体溶液中滴加多肽,以150~250转/分的转速反应15~25h,离心、清洗;
6)在步骤5)的胶体溶液中滴加3%(wt)BSA,在20~30℃条件下以150~250转/分的转速反应3~6小时,离心清洗,得到多功能纳米探针。优选在25℃的摇床中以200转/分的转速反应4小时。
步骤1)中十六烷基三甲基氯化铵、氯金酸与NaBH4的用量摩尔比为5:2000:12。
步骤2)中十六烷基三甲基氯化铵、氯金酸、Au种子、AA的用量摩尔比100:8000:1:600。
步骤3)中巯基苯甲酸与步骤2)中氯金酸的用量摩尔比1:25~:1:200。
所述多功能纳米探针在肿瘤细胞靶向识别、成像中的应用。
一种星状金纳米颗粒,所述金纳米星状结构是用金球作为种子,十六烷基三甲基氯化铵(CTAC)作为表面活性剂,用抗坏血酸(AA)还原氯金酸得到金纳米颗粒。
所述星状金纳米颗粒的制备方法,包括如下步骤:
1)制备Au种子:将十六烷基三甲基氯化铵加入到氯金酸中搅拌5min,然后滴加NaBH4,快速搅拌2min,得到Au种子;
2)将十六烷基三甲基氯化铵加入到氯金酸中搅拌,加入步骤1)的Au种子,搅拌2min,加入AA搅拌2min,随后放在温控箱中静置生长和熟化3h,最后离心清洗,得到星状金纳米颗粒。
步骤2)中静置生长温度为15度,生长及熟化时间为3小时。
本发明采用表面活性剂十六烷基三甲基氯化铵作为稳定剂和定向生长剂,制备得到的星状金纳米颗粒具有10个以上的尖端,且突起结构细节特征为从金核表面突起一片状结构顶部逐渐成为尖端,对近红外光有较强吸收性能和光热转换性能。上述尖端结构与已有报道的金纳米星不同,已有报道的金纳米星或采用聚乙烯吡咯烷酮包裹的小金颗粒作为种子,并以聚乙烯吡咯烷酮作为表面活性剂条件下通过还原氯金酸制备得到(High-yieldsynthesisandopticalresponseofgoldnanostars,Nanotechnology,2008,19,015606;GoldNanostarsForSurface-EnhancedRamanScattering:Synthesis,CharacterizationandOptimization,J.Phys.Chem.C,2008,112,18849–18859);另一类则是以柠檬酸盐包覆的小金颗粒为种子,在反应体系中加入硝酸银作为定向生长试剂,在无表面活性情况下利用抗坏血酸还原氯金酸制备得到金纳米颗粒(Goldnanostars:surfactant-freesynthesis,3Dmodelling,andtwo-photonphotoluminescenceimaging,Nanotechnology,2012,23,075102.)。上述金纳米星实质上是多枝杈结构金纳米颗粒,是在金纳米颗粒表面突起棒状枝杈结构。已报道的金纳米星形状及生长过程与本发明制备的金纳米星有明显区别。
所述星状金纳米颗粒在制备用于肿瘤细胞靶向识别、成像及光热治疗的多功能纳米探针中的应用。
在星状金纳米颗粒外包裹一层巯基苯甲酸分子;然后通过对巯基苯甲酸分子的羧基端进行活化,随将多肽上的氨基与活化后的羧基反应形成酰胺键而连接在一起,最后在材料表面再包裹一层BSA对探针表面裸露区域进行封闭。
一种纳米探针,包括所述的星状金纳米颗粒。
有益效果
本发明提供的多功能纳米探针能够对肿瘤细胞A549靶向识别、成像及高效的光热治疗,本发明通过控制反应中静置生长时的温度控制来调节星状金纳米颗粒的光吸收,使得制备的金纳米颗粒在近红外区域具有较强的吸收。这种探针结合了金纳米、巯基苯甲酸(4MBA)及RGD,Au纳米使得探针具有高的光热性能和较好的表面增强特性。4MBA作为拉曼标记物同时作为偶联金纳米粒子和靶向多肽RGD的偶联剂,使得探针具有简单结构,RGD的连接既可以使探针靶向A549,还可以降低探针的细胞毒性,提高探针的生物相容性。克服了以往纳米材料在生物体系中应用的难题。本发明中的SERS探针结构简单,功能多样。
附图说明
图1为用本发明制得的星状金纳米颗粒的表面等离子共振特性谱;
图2为用本发明制得的星状金纳米颗粒的SEM图;
图3为用本发明制得的星状金纳米颗粒光热性能的表征;
图4为用本发明制得的多功能探针构建过程的紫外吸收光谱;
图5为用本发明制得的多功能探针的SERS谱;
图6为用本发明制得的多功能探针的细胞SERS成像;
图7为用本发明制得的不同浓度的多功能探针对肺癌细胞A549的光热治疗荧光成像;
图8为用本发明制得的不同浓度的多功能探针对肺癌细胞A549的光热治疗LDH定量细胞活性检测。
具体实施方式
实施例1
1.制备Au种子:先在瓶中加入0.5mL5mMHAuCl4,然后加入10mL10mMCTAC搅拌5min,后逐滴(1/20mL)加入0.6mL冰水浴配置10mMNaBH4,快速(500~1000r/min)搅拌2min,颜色为浅棕色。
2.1mL10mMHAuCl4加入10ml200mMCTAC搅拌2min,将前一步制备的Au种子稀释100倍后加入0.05mL并搅拌2min,加入0.5mL0.3mMAA搅拌2min,随后放在15℃温控箱中静置生长和熟化3h,最后离心清洗并将纳米颗粒重新分散并定容至2mL。
3.星状Au链接4MBA,分别加入50μL、200μL、400μL浓度为1mM的4-MBA乙醇溶液,放入25℃的摇床中以200r/min的转速反应20h。3000r/min、6min离心水洗2次。
4.活化4MBA的羧基端,加入24μL100mM的EDC和59.4μL100mMNHS放在摇床反应半小时,之后3000r/min、6min离心水洗2次。在胶体溶液中滴加40μLRGD(精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸三肽结构)并在25℃的摇床中以200r/min的转速反应20h,最后离心清洗并重新分散到2mL水中。
实施例2
测试水及Au的光热性能,将785nm激光器设定0.4w,激光至96孔板的距离17mm,Au定容至2mL,每次测试需加200μlAu颗粒溶液。785nm激光照射下,每隔1min用手持测温仪记录温度,测试星状金纳米颗粒光热性能。根据图3,在激光照射10min时,星状金纳米颗粒溶液温度升高了16.4°C。
实施例3
测试SERS探针对A549肺癌细胞光热治疗的效果,A549肺癌细胞(RGD靶向)接种在6孔细胞培养板中,缓冲溶液中分别含有0.5mg/mL、0.2mg/mL、0.1mg/mLAu-4MBA-RGD和Au-4MBA孵育4h后,吸去培养基及胶体颗粒,用PBS清洗三次,以785nm激光器近红外激光照射6分钟。应用Calcein-AM(只对活细胞染色)和PI(对死细胞染色)染色PBS清洗,在倒置荧光显微镜下观察细胞存活情况。结果如图7,在相同的激光照射条件下,SERS探针投入浓度越高,PI对死细胞的染色越密集,说明光热治疗效果越好。
实施例4
SERS探针对A549肺癌细胞SERS成像,分别将0.5mg/mL、0.2mg/mL、0.1mg/mLSERS纳米探针Au-4MBA-RGD、Au-4MBA分别加入A549肺癌细胞共培养4h,吸去培养基及胶体颗粒,用PBS清洗三次,分别785nm1s10%激光下SERS成像。对比Au-4MBA-RGD、Au-4MBA两种探针的SERS成像结果可以看出不同浓度的靶向SERS纳米探针Au-4MBA-RGD可以对A549肺癌细胞高效成像。

Claims (8)

1.一种用于肿瘤细胞靶向SERS成像的多功能纳米探针,其特征在于,所述探针由内至外依次为金纳米颗粒、巯基苯甲酸、多肽和牛血清白蛋白,金纳米颗粒外包裹一层巯基苯甲酸分子,然后通过酰胺键与多肽连接在一起,最后在表面包裹一层牛血清白蛋白对探针表面裸露区域进行封闭得到,所述金纳米颗粒为星状金纳米颗粒。
2.根据权利要求1所述的用于肿瘤细胞靶向SERS成像的多功能纳米探针,其特征在于,所述多肽为精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸。
3.根据权利要求1所述的用于肿瘤细胞靶向SERS成像的多功能纳米探针,其特征在于,所述星状金纳米颗粒是采用如下方法制备得到的:
1)制备Au种子:将十六烷基三甲基氯化铵加入到氯金酸中搅拌5min,然后滴加NaBH4,搅拌2min,得到Au种子;
2)将十六烷基三甲基氯化铵加入到氯金酸中搅拌,加入步骤1)的Au种子,搅拌2min,加入AA搅拌2min,随后放在温控箱中静置生长和熟化3h,最后离心清洗,得到星状金纳米颗粒。
4.权利要求1所述多功能纳米探针的制备方法,其特征在于,包括如下步骤:
1)制备Au种子:将十六烷基三甲基氯化铵加入到氯金酸中搅拌5min,然后滴加NaBH4,快速搅拌5min,静置过夜熟化,得到Au种子;
2)将十六烷基三甲基氯化铵加入到氯金酸中搅拌,加入步骤1)的Au种子,搅拌2min,加入AA搅拌2min,随后放在温控箱中静置生长和熟化3h,最后离心清洗,得到星状金纳米颗粒;
3)将步骤2)制备得到星状金纳米颗粒加入到巯基苯甲酸乙醇溶液中,以120-200r/min的转速反应3-20h;然后离心、水洗得到连接巯基苯甲酸的星状金纳米颗粒;
4)将步骤3)的连接巯基苯甲酸的星状金纳米颗粒加入EDC和NHS中,反应半小时,然后离心、水洗,得到胶体溶液;
5)在胶体溶液中滴加多肽,以150~250转/分的转速反应15~25h,离心、清洗;
6)在步骤5)的胶体溶液中滴加BSA,在20~30℃条件下以150~250转/分的转速反应3~6小时,离心清洗,得到多功能纳米探针。
5.根据权利要求4所述的多功能纳米探针的制备方法,其特征在于,步骤1)中十六烷基三甲基氯化铵、氯金酸与NaBH4的用量摩尔比为5:2000:12。
6.根据权利要求4所述的多功能纳米探针的制备方法,其特征在于,步骤2)中十六烷基三甲基氯化铵、氯金酸、Au种子、AA的用量摩尔比100:8000:1:600。
7.根据权利要求4所述的多功能纳米探针的制备方法,其特征在于,步骤3)中巯基苯甲酸与步骤2)中氯金酸的用量摩尔比1:25~:1:200。
8.权利要求1所述多功能纳米探针在肿瘤细胞靶向识别、成像中的应用。
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