CN104258424A - 一种复合纳米诊疗制剂及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
一种复合纳米诊疗制剂及其制备方法，包括集核磁共振成像及光热治疗功能于一体的复合纳米粒子，所述复合纳米粒子为通过非溶剂-络合法将金纳米棒包裹在二乙基三胺五乙酸-钆（DTPA-Gd）修饰的壳聚糖分子中并进一步通过化学交联法得到的性质稳定且呈单分散状态的复合纳米粒子。本发明利用金纳米棒作为光热转换剂，可有效地吸收近红外光并将其转化为局部高能热量，进而杀死肿瘤细胞，同时结合CS-DTPA-Gd良好的T1造影性能，可实现MRI造影导向光热治疗的目的，且本发明作为一种联合制剂，具有提高诊断效率、提高治疗选择性、降低毒副作用等优点，同时本发明的制备方法工艺简单、条件温和、重复性好，具有良好的临床应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及生物医学材料领域，具体是涉及一种复合纳米诊疗制剂及其制备方法。
背景技术
近十年来，癌症已严重威胁人类健康，对癌症的早期诊断和高效治疗是科研工作者长期以来研究工作的热点和难点。在目前的临床实践中，肿瘤的诊断与治疗仍为两个相对独立的过程。诊断试剂与治疗用药分开使用，延长了疾病诊断-治疗的周期，增加贻误病情风险的同时，也增加了患者的经济负担。
为了解决以上问题，近年来科研工作者利用纳米诊疗一体化试剂，为肿瘤早期诊断与治疗提供了强大的技术支持。这种诊疗一体化试剂依托于纳米材料较好的生物膜穿透力、被动靶向实体瘤的高通透性和滞留效应（EPR效应）及易于多功能化等优势。使用诊疗一体化试剂可针对肿瘤部位进行术前、术后的监测评价，并为光热治疗提供可定位的图像参考，提高诊疗效率的同时，可有效避免光热治疗过程中对正常组织的破坏和损伤。
光热治疗技术是一种新型、高效的肿瘤治疗方法。该技术利用光热材料吸收近红外光，并将其转化为局部热能的特性使肿瘤区域温度升高，从而达到杀死肿瘤细胞的目的。目前，光热材料主要包括有机小分子（如吲哚菁绿）、高分子纳米材料（如聚吡咯纳米材料）、碳材料及贵金属材料。其中贵金属材料类的金纳米棒以其精确的粒径可控性，高效的光热转换能力，已广泛应用于光热治疗研究中。这种光热转换能力主要归功于金纳米棒表面等离子共振吸收特性。金纳米棒可将吸收光有效地转化为热，而且吸收波长具有显著的尺寸形貌依赖性，随着纳米棒尺寸及长径比的增加，等离子共振吸收光的波长会向红外方向移动。一般来说，金纳米棒的表面等离子共振吸收光的波长可以达到近红外区域。人体对800 nm左右的近红外光吸收量最少，因此，将金纳米棒送达肿瘤部位后，近红外光可穿透人体组织，被金纳米棒有效吸收并转化为热，起到光热消融肿瘤的效果。然而，单一光热转换剂无法确定治疗部位，使其在临床应用中受到极大限制。为了有效确定治疗部位，实时监测治疗进程与治疗效果，将光热治疗与MRI造影技术结合。利用MRI造影技术高分辨率，并借助具有MRI造影增强效果的MRI造影剂，可大大提高诊断的灵敏度及治疗效率。
核磁共振成像（MRI）技术作为一种非侵入性的诊断技术，具有高的空间分辨率、高对比度以及灵活的断层扫描等优点，已成为现代临床诊断中最有力的检测手段之一。临床上为进一步提高MRI 成像分辨率和对比度，引入了一种诊断辅助试剂-钆喷酸葡胺（DTPA-Gd），该造影剂所含的过渡金属离子Gd3+ 中有多个未成对电子，这些未成对电子自旋产生磁场，能缩短邻近水分子中质子的纵向弛豫时间（T1），进而增大造影剂邻近区域的核磁共振信号，从而提高造影剂的对比度。但钆喷酸葡胺（DTPA-Gd）作为小分子物质，在各组织间呈非选择性分布，故无组织特异性，且在血液中易被清除。在成像时间内要通过大量注射该试剂才能保持足够浓度，增加了产生毒副作用的风险。
发明内容
本发明的目的在于针对上述诊段及治疗制剂存在的问题和不足，提供一种稳定性强、生物相容性好、毒副作用小，且集核磁共振成像与光热治疗功能于一体的复合纳米诊疗制剂及其制备方法。
本发明的技术方案是通过以下方式实现的：
本发明所述的复合纳米诊疗制剂，其特点是包括集核磁共振成像及光热治疗功能于一体的复合纳米粒子，所述复合纳米粒子为通过非溶剂-络合法将金纳米棒包裹在二乙基三胺五乙酸-钆（DTPA-Gd）修饰的壳聚糖分子中并进一步通过化学交联法得到的性质稳定且呈单分散状态的复合纳米粒子，且所述复合纳米粒子的粒径为100 nm左右。
本发明所述的复合纳米诊疗制剂的制备方法，其特点包括如下步骤：
1）以水溶性及生物相溶性较好的壳聚糖（CS）分子为载体，采用1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺盐酸盐 （EDC）与N-羟基琥珀酰亚胺 （NHS）作为交联剂，将不同百分含量的二乙基三胺五乙酸（DTPA）分子接枝到壳聚糖大分子上，得到一系列接枝率的CS-DTPA分子；
2）将得到的CS-DTPA分子溶于水中，加入一定量的氯化钆（GdCl3 · 6H2O）溶液室温搅拌，透析后冻干，得到CS-DTPA-Gd 材料；
3）以氯金酸为原料，通过种子生长法制备金纳米棒；
4）将CS-DTPA-Gd、金纳米棒以及一定量的氨基羧酸类样品共混搅拌；
5）向步骤4）混合液中逐滴加入无水乙醇，直至溶液由澄清变浑浊，加入交联剂持续搅拌，反应结束后透析；
6）将步骤5）获得的产物在真空冷冻干燥机中冻干48 h后取出，4 ℃冰箱保存。
其中，上述壳聚糖（CS）分子的分子量范围为1000～20000 Dalton。
上述DTPA 在壳聚糖（CS）分子上的接枝率范围为1%～50%。
上述氨基羧酸为二乙基三胺五乙酸（DTPA）、乙二胺四乙酸（EDTA）中的一种或两种的混合。
上述金纳米棒的长径比范围为3.5～5.0。
上述步骤5）中的交联剂为戊二醛、香草醛、茴香醛、香茅醛、胡椒醛中的一种或多种的混合。
上述步骤5）中的交联时间为4～12 h。
本发明与现有技术相比，具有如下优点：
（1）本发明制备的集核磁共振成像与光热治疗功能于一体的复合纳米粒子，将MRI造影与光热治疗结合在一起，其中MRI造影为光热治疗提供了可靠的影像依据，便于选择合适的治疗时间与治疗方案。在有效提高光热治疗准确性的同时，又提高了治疗效率，而且该复合纳米粒子因纳米尺寸所特有的EPR效应，易于富集在肿瘤部位。这样，既提高了诊断效率，又降低了患者承担毒副作用的风险，从而加快了MRI造影与光热治疗诊疗一体化的进程；
（2）本发明制备的复合纳米粒子的粒径分布均匀、性质稳定且呈单分散状态、水溶性和生物相容性良好，且天然分子壳聚糖包覆在金纳米棒表面，可有效解决金纳米棒胶体稳定性的问题（金纳米棒胶体溶液不稳定易聚集，常规制备方法是依靠生物毒性较大的十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）来维持其胶体稳定性）；
（3）本发明的制备方法条件温和、可控性强、简便易行。另外，本发明制备的复合纳米粒子最终形态可为冻干粉剂，稳定性好且易于储存运输。因此，本发明在临床肿瘤诊断与治疗方面具有广阔的应用前景。
下面结合附图对本发明作进一步的说明。
附图说明
图1 为本发明实施例1中制备的复合纳米粒子的流程示意图。
图2 为本发明实施例1中制得的复合纳米粒子的透射电镜图。
图3 为本发明实施例2中制得的复合纳米粒子的核磁共振成像图。
图4 为本发明实施例3中制得的复合纳米粒子的紫外-可见光吸收光谱图。
图5 为本发明实施例4中制得的复合纳米粒子的近红外热效应图。
图6为本发明实施例5中制得的复合纳米粒子对细胞活度的影响以及在近红外光照射下对肿瘤细胞的抑制率对比图。
图7为本发明实施例6中制得的复合纳米粒子的粒径分布图。
图8为本发明实施例7中制备的复合纳米粒子的粒径分布图。
图9为本发明实施例8中制备的复合纳米粒子的粒径分布图。
具体实施方式
本发明所述的复合纳米诊疗制剂，包括集核磁共振成像及光热治疗功能于一体的复合纳米粒子，所述复合纳米粒子为通过非溶剂-络合法将金纳米棒包裹在二乙基三胺五乙酸-钆（DTPA-Gd）修饰的壳聚糖分子中并进一步通过化学交联法得到的性质稳定且呈单分散状态的复合纳米粒子，且所述复合纳米粒子的粒径为100 nm左右。
实施例1：
（1）CS-DTPA-Gd 的制备过程：
称取DTPA（80 mg）溶于5 mL PBS溶液（pH=5.8）中，待完全溶解后加入EDC (49.6 mg)与NHS（30 mg）室温活化30 min；称取壳聚糖（5000 Dalton）161.2 mg溶于PBS溶液中，待完全溶解后，逐滴滴入上述DTPA混合溶液中完全反应6 h；蒸馏水中透析24 h去除未反应的DTPA、EDC及NHS，得到CS-DTPA溶液；
称取0.2 mmol（74.36 mg）氯化钆（GdCl3 · 6H2O）溶于水，加入CS-DTPA溶液中，为使Gd3+ 螯合在CS-DTPA上室温搅拌12 h，溶液透析24 h后，得到CS-DTPA-Gd（DTPA的接枝率为20%）；使用真空冷冻干燥机冻干48 h，取出样品后，4 ℃冰箱保存；
（2）CS-DTPA-GdGNR复合纳米粒子的制备过程：
以氯金酸为原料，通过种子生长法制备金纳米棒（GNR）溶液，将制备好的金纳米棒溶液于12000 rpm离心30 min，用蒸馏水洗涤两次除去游离的表面活性剂CTAB，再用蒸馏水分散，存储备用；
精密称取5 mg CS-DTPA-Gd和1 mg DTPA（质量比为5: 1），加入1 mL水中搅拌使之完全溶解，再加入1 mL（0.5 mg/mL）浓缩的金纳米棒溶液（CS-DTPA-Gd与金纳米棒的质量比为10:1），超声2 min使金棒均匀分散后，适度搅拌，并向混合液中缓慢滴加乙醇溶液，体系逐渐由澄清变浑浊，然后加入交联剂戊二醛（25%）10 μL，室温搅拌12 h后蒸馏水中透析24 h，去除乙醇、DTPA以及过量的交联剂戊二醛，最终得到CS-DTPA-GdGNR复合纳米粒子，本步制备过程如图1所示；
（3）透射电子显微镜（TEM）观察：将CS-DTPA-GdGNR复合纳米粒子分散液滴加到铜网上，0.02%磷钨酸染色30 s，空气中干燥后使用透射电子显微镜观察CS-DTPA-GdGNR复合纳米粒子的形态，透射电镜照片如图2所示。从图中可以看出，该实施例制备的CS-DTPA-GdGNR复合纳米粒子粒径约为100 nm，粒径分布较均匀。金纳米棒可包裹在CS-DTPA-Gd材料中，与示意图1所展示的结构相似，其中金纳米棒的包封率达到90%。
实施例2：
将实施例1中的CS-DTPA-GdGNR复合纳米粒子稀释成一系列的浓度梯度，即50μg/mL、100 μg /mL、200μg/mL、400μg/mL,并在核磁共振成像系统上实施核磁共振造影成像。结果如图3所示，随着CS-DTPA-GdGNR复合纳米粒子浓度的增加，T1造影成像的图像变得越来越亮。通过伪彩模式可以清楚得到该复合纳米粒子在浓度达到200 μg/mL时，核磁共振图像显示弛豫时间T1明显缩小。弛豫时间T1越短，弛豫系数r1越大，表明材料的造影能力越强。由此可知，本复合纳米粒子具有较高核磁共振成像灵敏度，可提供精确的诊断结果。
实施例3：
将实施例1中的CS-DTPA-GdGNR复合纳米粒子与游离的金纳米棒稀释成一定的浓度后（以蒸馏水作为空白对照），通过紫外-分光光度计检测，得到紫外-可见吸收光谱图。如图4a所示，单纯的金纳米棒与CS-DTPA-GdGNR复合纳米粒子在800 nm～850 nm这一段近红外范围内均有很强的吸收，当被CS-DTPA-Gd球包覆之后，其纵向吸收峰产生了略微红移的现象，这是由于周围CS-DTPA-Gd球腔改变了介质的折光指数，从而引起的共振吸收波长红移。以上分析说明，CS-DTPA-GdGNR复合纳米粒子很好地保留了金纳米棒的光学吸收性质。从样品的外观来看，如图4b所示，CS-DTPA-GdGNR复合纳米粒子在水相中具有良好的分散性，分散程度与单纯的金纳米棒（GNR）没有明显差异。
实施例4：
将实施例1中的CS-DTPA-GdGNR复合纳米粒子稀释成一定的浓度梯度（以含金量作为浓度标准）即：20μg/mL、40μg/mL、80μg/Ml,并以蒸馏水作为空白对照。将上述配制好的溶液（4 mL）加入比色皿中，使用波长为808 nm的二极管红外激光器在2 W/cm2的辐照功率下照射10 min，实验期间每隔10 s通过电子温度计记录实时温度。如图5所示，空白对照蒸馏水在10 min内升温约4 ℃，金含量为20μg/mL的CS-DTPA-GdGNR复合纳米粒子10 min内升温约14 ℃，随着复合纳米粒子浓度的升高其升温效率随之增强。10 min内温度可升高至42～47 ℃，可达到有效杀死肿瘤细胞的目的。由此可知，CS-DTPA-GdGNR复合纳米粒子具有较高的光热转换效率，且可在短时间内达到目标温度。
实施例5：
将实施例1中的CS-DTPA-GdGNR复合纳米粒子稀释成一定浓度梯度。将人宫颈癌细胞按照3×103个/孔接种到96孔板中，加入培养基培养12 h，然后吸弃孔内培养基，加入不同浓度的CS-DTPA-GdGNR复合纳米粒子200 μL，继续培养4 h，用波长为808 nm的二极管红外激光器在2 W/cm2的辐照强度下照射5 min，继续培养20 h。对照组与实验组的区别在于不加近红外光辐射继续培养20 h。用MTT体外细胞毒性法来验证细胞的活性。如图6所示，所有样品在没有近红外光（NIR）照射的情况下不显示明显毒性。然而，当细胞经NIR照射后，毒性呈浓度依赖关系。当复合纳米粒浓度为200 μg/mL时细胞毒性最大。以上结果说明，通过本实施例方法制得的CS-DTPA-GdGN复合纳米粒子是无毒的，只有经近红外光辐照作用时，才具有光热消融杀死肿瘤细胞的功能。
实施例6：
（1）同实施例1的步骤（1），区别在于DTPA 的接枝率为5%，加入的氯化钆为0.05 mmol；
（2）同实施例1的步骤（2），区别在于所用的氨基羧酸类物质为EDTA（1 mg），以香草醛（25%，20 μL）为交联剂。如图7所示，该方法得到的CS-DTPA-GdGNR复合纳米粒子粒径约为120 nm，粒径多分散系数(PDI)为0.046，说明复合纳米粒子粒径均一、分散性好。
实施例7：
（1）同实施例1的步骤（1），区别在于DTPA的接枝率为10%，加入的氯化钆为0.1 mmol；
（2）同实施例1的步骤（2），区别在于以香茅醛（25%，20 μL）为交联剂。如图8所示，该方法得到的CS-DTPA-GdGNR复合纳米粒子粒径约为100 nm，粒径多分散系数PDI为0.037。说明10%接枝率的复合纳米粒子粒径较均一，且具有良好的分散性。
实施例8：
（1）同实施例1的步骤（1），区别在于DTPA的接枝率为40%，加入的氯化钆为0.4 mmol；
（2）同实施例1的步骤（2），区别在于以胡椒醛（25%，20 μL）为交联剂。如图9所示，该方法得到的CS-DTPA-GdGNR复合纳米粒子粒径约为80 nm，粒径多分散系数PDI为0.161。以上数据说明，40%接枝率CS-DTPA-Gd制备的复合纳米粒子仍具有较好的分散性。通过计算，该实施例制备得到的复合纳米粒子中金纳米棒的包封率约为90%，说明以40%接枝率CS-DTPA-Gd制备的复合纳米粒子对金纳米棒仍具有较高的负载能力。
本发明是通过实施例来描述的，但并不对本发明构成限制，参照本发明的描述，所公开的实施例的其他变化，如对于本领域的专业人士是容易想到的，这样的变化应该属于本发明权利要求限定的范围之内。
Claims (9)
1.一种复合纳米诊疗制剂，其特征在于包括集核磁共振成像及光热治疗功能于一体的复合纳米粒子，所述复合纳米粒子为通过非溶剂-络合法将金纳米棒包裹在二乙基三胺五乙酸-钆（DTPA-Gd）修饰的壳聚糖分子中并进一步通过化学交联法得到的性质稳定且呈单分散状态的复合纳米粒子。
2.根据权利要求1所述的复合纳米诊疗制剂，其特征在于上述复合纳米粒子的粒径为100 nm。
3.一种复合纳米诊疗制剂的制备方法，该方法用于制备如前述任一权利要求所述复合纳米诊疗制剂，其特征包括如下步骤：
1）以水溶性及生物相容性较好的壳聚糖（CS）分子为载体，采用1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺盐酸盐 （EDC）与N-羟基琥珀酰亚胺 （NHS）作为交联剂，将不同百分含量的二乙基三胺五乙酸（DTPA）分子接枝到壳聚糖分子上，得到一系列接枝率的CS-DTPA分子；
2）将得到的CS-DTPA分子溶于水中，加入一定量的氯化钆（GdCl3 · 6H2O）溶液室温搅拌，透析后冻干，得到CS-DTPA-Gd 材料；
3）以氯金酸为原料，通过种子生长法制备金纳米棒；
4）将CS-DTPA-Gd、金纳米棒以及一定量的氨基羧酸类样品共混搅拌；
5）向步骤4）混合液中逐滴加入无水乙醇，直至溶液由澄清变浑浊，加入交联剂持续搅拌，反应结束后透析；
6）将步骤5）获得的产物在真空冷冻干燥机中冻干48 h后取出，4 ℃冰箱保存。
4.根据权利要求3所述复合纳米诊疗制剂的制备方法，其特征在于上述壳聚糖（CS）分子的分子量范围为1000～20000 Dalton。
5.根据权利要求3所述的复合纳米诊疗制剂的制备方法，其特征在于上述DTPA 在壳聚糖（CS）分子上的接枝率范围为1%～50%。
6.根据权利要求3所述的复合纳米诊疗制剂的制备方法，其特征在于上述氨基羧酸为二乙基三胺五乙酸（DTPA）、乙二胺四乙酸（EDTA）中的一种或两种的混合。
7.根据权利要求3所述的复合纳米诊疗制剂的制备方法，其特征在于上述金纳米棒的长径比范围为3.5～5.0。
8.根据权利要求3所述的复合纳米诊疗制剂的制备方法，其特征在于上述步骤5）中的交联剂为戊二醛、香草醛、茴香醛、香茅醛、胡椒醛中的一种或多种的混合。
9.根据权利要求3所述的复合纳米诊疗制剂的制备方法，其特征在于上述步骤5）中的交联时间为4～12 h。
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