CN113995848A - 一种金纳米棒复合材料及其制备方法与应用 - Google Patents

一种金纳米棒复合材料及其制备方法与应用 Download PDF

Info

Publication number
CN113995848A
CN113995848A CN202111154875.3A CN202111154875A CN113995848A CN 113995848 A CN113995848 A CN 113995848A CN 202111154875 A CN202111154875 A CN 202111154875A CN 113995848 A CN113995848 A CN 113995848A
Authority
CN
China
Prior art keywords
solution
cells
gnra
csp12
composite material
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN202111154875.3A
Other languages
English (en)
Other versions
CN113995848B (zh
Inventor
闫飞
杜阳阳
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Jilin University
Original Assignee
Jilin University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Jilin University filed Critical Jilin University
Priority to CN202111154875.3A priority Critical patent/CN113995848B/zh
Publication of CN113995848A publication Critical patent/CN113995848A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN113995848B publication Critical patent/CN113995848B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
    • A61K47/61—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule the organic macromolecular compound being a polysaccharide or a derivative thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K33/00—Medicinal preparations containing inorganic active ingredients
    • A61K33/24—Heavy metals; Compounds thereof
    • A61K33/242—Gold; Compounds thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K41/00—Medicinal preparations obtained by treating materials with wave energy or particle radiation ; Therapies using these preparations
    • A61K41/0052—Thermotherapy; Hyperthermia; Magnetic induction; Induction heating therapy
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K41/00—Medicinal preparations obtained by treating materials with wave energy or particle radiation ; Therapies using these preparations
    • A61K41/0057—Photodynamic therapy with a photosensitizer, i.e. agent able to produce reactive oxygen species upon exposure to light or radiation, e.g. UV or visible light; photocleavage of nucleic acids with an agent
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A61K47/64—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B82—NANOTECHNOLOGY
    • B82Y—SPECIFIC USES OR APPLICATIONS OF NANOSTRUCTURES; MEASUREMENT OR ANALYSIS OF NANOSTRUCTURES; MANUFACTURE OR TREATMENT OF NANOSTRUCTURES
    • B82Y40/00—Manufacture or treatment of nanostructures
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B82—NANOTECHNOLOGY
    • B82Y—SPECIFIC USES OR APPLICATIONS OF NANOSTRUCTURES; MEASUREMENT OR ANALYSIS OF NANOSTRUCTURES; MANUFACTURE OR TREATMENT OF NANOSTRUCTURES
    • B82Y5/00—Nanobiotechnology or nanomedicine, e.g. protein engineering or drug delivery

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Nanotechnology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Medical Informatics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Inorganic Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Condensed Matter Physics & Semiconductors (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Manufacturing & Machinery (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)

Abstract

本申请公开了一种金纳米棒复合材料及其制备方法与应用。所述金纳米棒复合材料包括：金纳米棒GNR；修饰在所述金纳米棒GNR表面的第一修饰物；与所述第一修饰物通过酰胺键连接的第二修饰物；所述第一修饰物来源于硫代羧甲基壳聚糖；所述第二修饰物来源于12肽THRPPMWSPVWP。所述金纳米棒复合材料在金纳米棒进行硫代羧甲基壳聚糖和12肽修饰，具有良好的稳定性、靶向性、更容易被白血病细胞摄取，具有良好的白血病治疗效果。

Description

一种金纳米棒复合材料及其制备方法与应用
技术领域
本申请涉及一种金纳米棒复合材料及其制备方法与应用，属于药物技术领域。
背景技术
白血病是造血干细胞异常引发的预后较差、病死率极高的恶性血液系统癌症。大多数白血病患者可以用骨髓移植、化疗或靶向治疗使症状深度缓解并延长生存期。然而，这些患者体内仍存在“休眠”状态的白血病干细胞，这些细胞群静息在骨髓龛缺氧微环境中，一旦“觉醒”，新生的白血病细胞将对机体产生毁灭性的攻击，这也是白血病发病及药物复发的主要原因。分子层面，白血病的演进是由于白血病干细胞内环境表观转录组异常尤其是m6A甲基化导致细胞程序性死亡失调，癌细胞无限增殖。基于白血病演进是多层次、跨尺度、互相关联的复杂过程，设计开发一种既能靶向骨髓龛微环境中的白血病干细胞、同时能干预细胞内环境分子事件的药物将有望能根除白血病。金纳米棒GNR具有很强的等离子共振效应、极佳的比表面积、渗透性、吸收性、低毒性、生物相容性等功能，将纳米棒与壳聚糖和12聚肽功能化，分别增强其生物分布和活性靶向性，能实现从组织到细胞到分子的跨尺度干预作用，有望能解决从根源上杀灭白血病细胞这一问题。目前绝大多数研究都围绕实体瘤，是由于金纳米棒对实体瘤有高通透性和滞留效应，如光声成像、光热治疗、光动力治疗、声动力治疗、化疗、免疫治疗等，而对于白血病这类全身性血液疾病还未见报导。因为纳米药物对实体组织具有被动靶向的优势，而对于白血病这类全身性血液系统疾病的靶向治疗将极具挑战。更重要的是，癌症的本质是分子变异的结果，这在白血病演变进程中尤其重要。目前纳米药物的研究多数是在组织或细胞层面，对其在癌症中重要分子事件的调控过程和动态规律变化的作用并未有深入研究，尤其是对表观转录的调控尚未有报道。
发明内容
根据本申请的一个方面，提供一种金纳米棒复合材料，所述金纳米棒复合材料在金纳米棒进行硫代羧甲基壳聚糖和12肽修饰，具有良好的稳定性、靶向性、更容易被白血病细胞摄取，具有良好的白血病治疗效果。
本申请的技术方案拟以恶性血液系统疾病白血病治疗为目标，以表观转录分子调控事件为靶标，选择具有独特形貌的、更容易被没有组织结构的白血病细胞摄取的金纳米棒进行设计和优化，概念性提出“纳米表观药物”治疗策略，为基于表观转录调控机制的白血病治疗这一前沿科学问题提供独特的解决方案。
本申请的技术方案技术将对纳米医学的应用进行全新的诠释，同时也为再认识以m6ARNA甲基化为代表的癌症表观转录组学提供全新的视角。
本申请的技术方案有望开启纳米药物开发新模式并为癌症治疗提供新策略，符合“聚焦前沿、独辟蹊径”这一科学问题属性。
一种金纳米棒复合材料，所述金纳米棒复合材料包括：
金纳米棒GNR；
修饰在所述金纳米棒GNR表面的第一修饰物；
与所述第一修饰物通过酰胺键连接的第二修饰物；
所述第一修饰物来源于硫代羧甲基壳聚糖；
所述第二修饰物来源于12肽THRPPMWSPVWP(SEQ ID NO：1)。
可选地，所述金纳米棒的长度为8～135nm，直径为2～80nm。
可选地，所述金纳米棒的长度为8、10、20、50、80、100、135nm中的任意一个值或任意两个值之间的范围值。
直径为2、8、10、20、40、60、80nm中的任意一个值或任意两个值之间的范围值。
造血干细胞演变异常是引发白血病及其耐药的根源所在，由于白血病干细胞静息在骨髓缺氧微环境(骨髓龛) 中，大部分治疗方案无法有效将其杀灭。如何利用无机纳米材料的优势，从根源上清除白血病细胞，并克服潜在的白血病耐药隐患，是本申请技术拟解决的首要关键科学问题。
不同于实体瘤中组织或细胞之间的相互作用(如血管生成、肿瘤微环境、免疫细胞、炎症因子等)，白血病演变异常的本质是干细胞内环境中表观转录调控异常驱动的结果。深入阐明具有临床前景的纳米药物调控癌症中重要分子事件的过程和动态规律的作用将对白血病治疗更具意义，这是本申请技术拟解决的重要科学问题。
建立合成简便、结构清晰、稳定性好、毒副作用小、疗效好、机理明确的基于表观转录调控的“纳米表观药物”新策略，有望填补传统小分子化疗药物、分子靶向药物、表观药物、免疫治疗药物等弊端，发现并扩展新的联合用药方案，为治愈白血病乃至癌症提供重要临床转化依据。这是本申请技术最终要解决的关键科学问题。
根据本申请地另一个方面，提供上述任一项所述的金纳米棒复合材料的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：
(S1)将含有GNR-M的溶液I和含有硫代壳聚糖的溶液II混合，反应I，得到中间体；
所述M为稳定剂，选自CTAR、NaOL中的至少一种；
(S2)将含有所述中间体的溶液III和含有所述12肽的溶液VI混合，在耦合剂的作用下反应II，得到所述金纳米棒复合材料。
可选地，所述溶液I的溶剂包括水；
可选地，所述溶液I中，所述GNR-M的浓度为0.0300～0.090nM。
可选地，所述溶液I中，所述GNR-M的浓度为0.0300、0.0500、0.0600、0.0700、0.0800、0.0900nM中的任意一个值或任意两个值之间的范围值。
可选地，所述溶液II的溶剂包括水；
可选地，所述溶液II中，所述硫代壳聚糖的浓度为0.15～0.25mM。
可选地，所述溶液II中，所述硫代壳聚糖的浓度为0.15、0.18、0.20、0.22、0.23、0.25mM中的任意一个值或任意两个值之间的范围值。
可选地，所述溶液I和所述溶液II的体积比为0.5～1.5:0.5～1.5。
可选地，所述溶液I和所述溶液II的体积比为0.8～1.5：0.8:1.5。
可选地，所述溶液I和所述溶液II的体积比为0.8～1.2：0.8:1.2。
可选地，所述溶液III的溶剂包括水、硼酸钠缓冲液中的至少一种；
可选地，所述溶液III光密度OD值为2～4。
可选地，所述溶液III光密度OD值为2、2.5、3、3.5、4中的任意一个值或任意两个值之间的范围值。
可选地，所述溶液IV的溶剂包括硼酸钠缓冲液；
可选地，所述溶液IV中，所述12肽的浓度为0.03～2mg/ml。
可选地，所述溶液IV中，所述12肽的浓度为0.03、0.05、0.08、1、1.2、1.5、1.8mg/ml中的任意一个值或任意两个值之间的范围值。
可选地，所述溶液III和所述溶液IV的体积比为3～8：1。
可选地，所述溶液III和所述溶液IV的体积比为3:1、5:1、6:1、7:1、8:1中的任意一个值或任意两个值之间的范围值。
可选地，所述耦合剂包括1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐溶液和N-羟基硫代琥珀酰亚胺溶液；
可选地，所述1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐溶液的浓度为0.1～1M；
所述N-羟基硫代琥珀酰亚胺溶液的浓度为0.1～1M；
可选地，所述溶液III、所述1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐溶液和所述N-羟基硫代琥珀酰亚胺溶液体积比为3～8ml：200～1000μl：0.2～1.5ml。
可选地，所述溶液III、所述1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐溶液和所述N-羟基硫代琥珀酰亚胺溶液体积比为3～8ml：500～1000μl：0.2～1ml。
可选地，所述反应I的条件包括：超声5～10min，静置2h以上。
可选地，所述反应I的条件包括：超声5～10min，静置2h～4h。
可选地，所述反应II条件包括：温度为26～30℃，时间为12h以上。
可选地，所述反应II条件包括：温度为26～30℃，时间为12h～30h
可选地，所述反应II条件包括：在搅拌下进行，所述搅拌的转数为400～700rpm。
根据本申请地另一个方面，提供上述任一项所述的金纳米棒复合材料或根据上述任一项所述的制备方法制备得到的金纳米棒复合材料在制备白血病药物中的应用。
本申请中，相关英文或缩写说明如下：
GNR：金纳米棒；
GNR-CS：金纳米棒-硫代羧甲基壳聚糖；
CTAB：十六烷基三甲基溴化铵；
NaOL：油酸钠；
CMC：羧甲基壳聚糖；
EDC：1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐；
Sulfo-NHS：N-羟基硫代琥珀酰亚胺；
AML细胞系：急性髓细胞白血病细胞系。
TKI：酪氨酸激酶抑制剂。
Nilotinib：尼洛替尼。
BCR/ABL：BCR/ABL融合基因
12肽THRPPMWSPVWP中，T为苏氨酸，H为组氨酸，R为精氨酸，P为脯氨酸，M为甲硫氨酸，W为色氨酸，S为丝氨酸，V为缬氨酸。
本申请能产生的有益效果包括：
(1)本申请所提供的金纳米棒复合材料，所述金纳米棒复合材料在金纳米棒进行硫代羧甲基壳聚糖和12肽修饰，具有良好的稳定性、靶向性具有良好的白血病治疗效果。
(2)本申请所提供的金纳米棒复合材料，金纳米棒的尺寸更合理，更容易被白血病细胞摄取，对白血病细胞具有良好的选择性，生物安全性好。
(3)本申请所提供的组合物，金纳米棒复合材料和酪氨酸激酶可以协同抑制剂抑制白血病发生，克服m6A介导的TKI耐药性。
附图说明
图1为实施1制备得到的金纳米棒的TEM图，其中a为GNRa，b为GNRb，c为GNRc，d为GNRd，e为 GNRe，f为GNRf。
图2为实施1制备得到的金纳米棒紫外光谱分析图。
图3为细胞对GNR的摄取能力检测结果，其中A为MV4-11细胞系，B为Kasumi-1细胞系。
图4为GNRa-CSP12的稳定性测试结果，其中第一列为GNRa-CSP12原液，第二列为在不同环境下12h后，第三列为在不同环境下24h后。
图5为GNR-CSP12纳米复合材料对白血病细胞的选择性结果，其中，A为GNR-CSP12纳米复合材料在L02 正常细胞以及Kas-1,MV4-11白血病中的细胞摄取情况，B为GNR-CSP12纳米复合材料处理的LO2正常细胞中金的含量，C为GNR-CSP12纳米复合材料处理的MV4-11白血病细胞中金的含量，D为GNR-CSP12纳米复合材料处理的Kas-1白血病细胞中金的含量，表明GNR-CSP12纳米复合材料对白血病细胞有靶向性。
图6为GNR-CSP12的体内生物靶向性检测，其中A为给小鼠注射及取组织的示意图，B为不同尺寸的金纳米颗粒在小鼠外周血细胞及骨髓细胞中金的含量。表明GNRa-CSP12在骨髓中含量最多，靶向性最好。
图7为GNRa-CSP12对白血病细胞的毒性测定结果。
图8为GSH(谷胱甘肽)配体交换效率的评价结果，其中图8A示出了GSH和RhB的合成机理图，图8B示出GNRa-CSP12浓度影响GSH配体交换效率。
图9为GNRa-CSP12对AML细胞的影响，其中a为GSH/GSSG商业试剂盒检测中GNRa-CSP12对NB4细胞的影响，b为GSH/GSSG商业试剂盒检测中GNRa-CSP12对MV4-11细胞的影响，c为GSH/GSSG商业试剂盒检测中GNRa-CSP12对kas-1细胞的影响，d为谷胱甘肽过氧化物酶检测试剂盒中GNRa-CSP12对NB4细胞的影响，e为谷胱甘肽过氧化物酶检测试剂盒中GNRa-CSP12对MV4-11细胞的影响，f为谷胱甘肽过氧化物酶检测试剂盒中GNRa-CSP12对kas-1细胞的影响。
图10为GNRa-CSP12体内抗白血病作用检测结果，其中A为静脉注射0.5×106C1498细胞的C57BL/6N小鼠中白血球细胞的数量，B为静脉注射0.5×106FLT3+转染的C1498细胞的C57BL/6N小鼠中白血球细胞的数量，C 为两个细胞模型下的各个组小鼠的脾，D为两个模型下各个组小鼠的脾的重量。
图11为GNRa-CSP12的体内生物相容性检测结果。生化指标包括谷丙转氨酶(ALT)，结果如图11a、天门冬氨酸转氨酶(AST)，结果如图11b、总蛋白(TP)，结果如图11d、血尿素氮(BUN)，结果如图11e、白蛋白(ALB)，结果如图11c、碱性磷酸酶(ALP)，结果如图11f、直接胆红素(DBIL)，结果如图11g和葡萄糖(GLU)，结果如图11h。
图12为RNA-seq和m6A测序。
图13为铁死亡信号通路和表观转录组相关性分析，其中a为糖酵解，b为血红素代谢，c为E2F靶点，d为 P53通路。
图14为m6A methylomes AML细胞m6A测序结果分析，其中a为增通路，b为降通路。
图15为m6A斑点杂交法分析m6A RNA甲基化。
图16为LC-MS/MS定量分析，其中a为NB4、b为MV4-11，c为Kas-1。
图17为基因特异性m6A-qPCR测试，其中a为CD276在细胞中的相对m6A水平，b为SLC2A3在细胞中的mRNA水平,c为PKM在细胞中的相对m6A水平,d为CD276在细胞中的mRNA,e为SLC2A3在细胞中的相对m6A 水平,f为为PKM在细胞中的mRNA水平。
图18为细胞转染后Western blotting结果，其中图18A为在Kasumi-1细胞中FTO和ALKBH5的表达水平与 GNRa-CSP12的敏感性，B为在U937细胞中FTO和ALKBH5的表达水平与GNRa-CSP12的敏感性。
图19为GNRa-CSP12与抑制剂对各自突变的细胞系的协同作用,其中A为各处理的克隆数量，B为各处理的克隆大小，C为各处理的细胞菌落图像实拍。
图20为耐药细胞联合治疗。
图21为细胞的分子特征显示，GNRa-CSP12挽救了TKIs介导的m6A低甲基化，A为两种细胞中m6A斑点杂交实验结果照片，B为MV4PR细胞m6A斑点杂交实验结果数据统计，C为Kas-1NR细胞m6A斑点杂交实验结果数据统计。
图22为GNRa-CSP12显著抑制了MV4PR移植小鼠的白血病进展，其中A为白细胞个数，B为脾重量，C为生存期百分比，D为m6A水平。
具体实施方式
下面结合实施例详述本申请，但本申请并不局限于这些实施例。
如无特别说明，本申请的实施例中的原料均通过商业途径购买。
本申请的部分细胞系和培养条件如下：
细胞系：白血病细胞系(Kasumi-1、Skno-1、K562、MV4-11、MOLM13,MOLM14,U937、THP1,HL60,NB4, C1498、TF1)来源于American Type Culture Collection(ATCC，美国模式培养物保藏所)。
培养条件：
Kasumi-1、Skno-1：在37℃且5％CO2的条件下培养在补充20％胎牛血清(FBS,Gibco by Life Technologies，赛默飞世尔科技)和抗生素/抗真菌(Gibco by LifeTechnologies)的细胞培养基RPMI-1640(Gibco by Life Technologies)中。
K562、MV4-11、MOLM13、MOLM14、U937、THP1、HL60、NB4、C1498：在37℃且5％CO2的条件下培养在补充10％胎牛血清(FBS,Gibco by Life Technologies)和抗生素/抗真菌(Gibco by Life Technologies)的 RPMI-1640(Gibco by Life Technologies)中。
TF1：在37℃且5％CO2的条件下培养在10％胎牛血清和2ng/ml GM-CSF(PeproTech)的RPMI-1640中。
所有细胞系均使用PCR支原体检测试剂盒(PromoKine)检测支原体污染。
实施例1金纳米棒复合材料的合成与表征
1)金纳米棒(GNR)合成
①以十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)和油酸钠(NaOL)为二元表面活性剂，合成了金纳米棒。具体步骤如下：
将5ml HAuCl4(0.5mM)水溶液和5ml CTAB(0.2M)水溶液混合制成混合物，将0.6ml新鲜NaBH4(0.01M)的硼氢化钠溶液用冷水稀释至1ml。将稀释后的NaBH4注入上述混合物中，以1200rpm的转速剧烈搅拌2分钟，使溶液由黄色变为棕黄色，得到GNR种子溶液。种子溶液常温陈化30min。
制备生长溶液时，将不同质量的CTAB和NaOL(用量见表1)在50℃下溶于50ml水中，冷却至30℃后，加入不同体积的4mM AgNO3(用量见表1)，30℃静置15分钟。加入50ml 1mMHAuCl4，搅拌1h(700rpm)至无色。加入一定体积的HCl(37wt.％，12.1M)的水溶液来调节pH(用量见表1)，400rpm缓慢搅拌15分钟后，加入0.064M 抗坏血酸(AA)水溶液250uL，大力搅拌30s。
最后将种子液注入生长液中(用量见表1)，将所得混合物搅拌30s,在30℃下不受干扰12h，使NR(纳米棒) 生长。8000g离心30min分离GNRs。
表1不同金纳米棒合成过程中原料的添加量
Figure RE-GDA0003432445950000061
②用无种子一锅法合成了Small GNRs(小金纳米棒)。
在30℃剧烈搅拌下，将5ml HAuCl4·3H2O(1mM)水溶液加入到5ml CTAB(0.2M)水溶液中，再加入300uL AgNO3 (4mM)水溶液。加入12uL盐酸(37％)的水溶液调整pH值，加入75uL抗坏血酸(85.8mM)水溶液。溶液澄清后，注入7.5uL NaBH4(0.01M)水溶液，静置24h。9000g离心30min纯化，共纯化3次。得到的金纳米棒编号为GNRf，图片编号图1f。
2)硫代羧甲基壳聚糖的合成
羧甲基壳聚糖(CMC)的制备：将2g壳聚糖加入20ml去离子水和异丙醇混合物(去离子水和异丙醇体积比例为 50:50)得到混合溶液，混合溶液中加入8g NaOH碱化12h。然后加热到60℃，将8g一氯醋酸溶解在2ml异丙醇在30分钟内慢慢添加到碱化后的混合溶液中。反应6h后加50ml乙醇淬火,由此产生的CMC在乙醇中反复清洗, 真空干燥,直到过滤溶液的pH值中性。将产物溶于水，离心分离未反应的壳聚糖。除去水相，在乙醇中沉淀，真空干燥，并在50℃烘箱脱水。
硫代羧甲基壳聚糖的制备：500mg CMC溶解于50ml 1wt％的乙酸水溶液中，与1mlEDC碳二亚胺水溶液 (125mM)混合。加入500mg TGA(硫代乙醇酸)后，将溶液pH调至5，以防止偶联反应过程中聚合物链被氧化，形成二硫键。室温下，不断搅拌，在黑暗中孵育4h。分离硫醇盐CMC，分离方法为：在5mM HCl的水溶液中通过纤维素膜透析(12kDa)72h,然后在含有1wt％氯化钠的5mM HCl纤维素膜透析(12kDa)溶液中重复两次透析操作，为了减少阳离子聚合物和阴离子巯基之间的离子相互作用，最后pH值在5mM HCl中48h恢复到4。为了避免巯基的氧化，在4℃下进行黑暗透析。提纯后的硫代CMC被冻干以备后续实验。
3)合成GNRa-CS
将步骤1)合成的GNRa-CTAB&NaOL溶解于水中，浓度为0.0578nM(此处-CTAB&NaOL指的是GNRa是在含有CTAB和NaOL的体系中合成，GNRa表面带有CTAB和NaOL稳定剂)与等体积0.2mM硫代CMC(CS)水溶液搅拌混合，通过配体交换的方式取代其在GNR表面的CTAB。将混合物超声处理5分钟，静置2h。3000g超离心(Amicon ultra-15,Millipore)去除过量的硫代CMC，10分钟。GNRa-CS在水中重新悬浮，CTAB的含量通过电喷雾电离质谱(ESI-MS)(ThermoScientific,San Jose,CA)和Xcalibur 2.0软件测定。
4)合成GNRa-CSP12
通过EDC/Sulfo-NHS反应，将12肽THRPPMWSPVWP偶联到GNR表面的硫代CMC上。将浓缩的GNRa-CS 溶液分散于硼酸钠缓冲液(pH＝9)中，轻轻搅拌至光密度(OD)为3，将1ml肽溶液(1mg/ml在0.01M硼酸钠缓冲液中，pH＝9)与5ml GNRa-CS混合。偶合试剂EDC(500μl,0.2M)和Sulfo-NHS(1ml,0.2M)同时加入混合溶液，在 26～30℃下700rpm缓慢搅拌24h。使用含有Sephadex G-25树脂(GE)和PruBS(pH＝7.2)的PD-10脱盐柱纯化纳米颗粒。动物实验中，GNRa-CSP12溶液经10000g超离心(Amicon ultra-15,Millipore)离心30min浓缩至OD＝30，得到GNRa-CSP12原液。
其他GNR-CS、GNR-CSP12的合成方法与步骤3)和4)基本相同，区别仅在于将GNRa替换成相应的GNR。
5)表征
采用FEI公司的Tecnai G2 20S-TWIN透射电镜(TEM)观察纳米颗粒的形貌，并配备了加速电压为200千伏的场发射枪。
将GNRs(GNRa～GNRf)分别进行超声处理10分钟，滴入铜网，晾干进行TEM扫描结果如图1所示，纳米粒子为棒状结构，粒径梯度分布，其中，(a)的平均长度为130nm、平均直径为21nm，(b)的平均长度为89nm、平均直径为23nm，(c)的平均长度为68nm、平均直径为18nm，(d)的平均长度为132nm、平均直径为69nm， (e)的平均长度为129nm、平均直径为44nm，(f)的平均长度为8nm、平均直径为2nm。由紫外光谱分析金纳米棒，如图2所示。表明得到了梯度尺寸的金纳米棒。
6)细胞对GNR的摄取能力检测
测定方法：电感耦合等离子体原子发射光谱(Inductively coupled plasmaatomic emission spectroscopy,ICP-AES) 对不同类型细胞摄取能力检测。首先将MV4-11、Kasumi-1细胞在37℃、5％CO2的培养箱中培养24h，以得到较好的细胞状态，在细胞中加入不同尺寸不同浓度的GNR(最终细胞液中GNR摩尔浓度为0,0.1,0.2,0.3,0.4, 0.5nM)，共同孵育于37℃、5％CO2的培养箱中,0.5h后取出细胞，用硝酸-盐酸(王水)混合酸消解，用滤网过滤后取适量检测。
测定结果：如图3所示，其中A为MV4-11细胞系，B为Kasumi-1细胞系，从图中可以看出长度为130，直径为21的GNRa孵育的MV4-11或Kasumi-1细胞内Au含量最高。
7)GNRa-CSP12的稳定性测试
测定方法：将实施例1步骤4)得到的GNRa-CSP12取10ul原液分别溶于1ml PBS和血清，静止观察，对 GNRa-CSP12在不同pH环境(PBS、血清)不同时间(12h、24h)稳定性进行检测，利用TEM对GNRa-CSP12 的形貌进行表征，结果如图4所示，第一列为GNRa-CSP12原液，作为对照组，第二列在不同环境下12h后，第三列为在不同环境下24h后，表明GNRa-CSP12在不同环境下形态分布稳定。
8)GNR-CSP12纳米复合材料对白血病细胞的选择性
利用荧光成像和ICP-AES检测GNR-CSP12纳米复合材料对白血病细胞的选择性，将AML细胞系(MV4-11和 Kas-1)、正常细胞系(LO2和L929)和原代单核细胞与GNRs或GNR-CSP12混合在37℃和5％的CO2细胞培养箱中孵育，结果如图5所示，其中，A为GNRa-CSP12纳米复合材料在LO2正常细胞以及Kas-1、MV4-11白血病中的细胞摄取情况(GNRa-CSP12和AML细胞系混合液中GNRa-CSP12浓度为0.5nM)，第一列为细胞中检测到的DAPI 信号(蓝色荧光)，第二列为细胞中检测到的尼罗红信号(红色荧光)，第三列为第一列和第二列合并得到的图片。 B为不同浓度GNRa-CSP12～GNRf-CSP12纳米复合材料处理的LO2正常细胞中金的含量。C为不同浓度 GNRa-CSP12～GNRf-CSP12纳米复合材料处理的MV4-11白血病细胞中金的含量。D为不同浓度 GNRa-CSP12～GNRf-CSP12纳米复合材料处理的Kas-1白血病细胞中金的含量。结果可以表明GNR-CSP12纳米复合材料对白血病细胞有靶向性。
9)GNR-CSP12体内生物靶向性检测
GNR-CSP12的体内生物安全性检测：给正常小鼠注射高治疗剂量(剂量为2mg/kg)的GNR或GNR-CSP12，在给药后等待60天取血，进行生化指标及血常规评估，记录体重，并对骨髓细胞、心、肺、肝、肾、脾进行病理检测，结果如图6所示，其中A为给小鼠注射及取组织的示意图，B为不同尺寸的GNR和GNR-CSP12在小鼠外周血细胞及骨髓细胞中金的含量，图6中，每个样品的左边柱形为外周血细胞，右边为骨髓细胞，结果表明GNR-CSP12与对应的GNR相比，在小鼠外周血细胞及骨髓细胞中金的含量更高，并且，GNRa-CSP12在骨髓中含量最多，靶向性最好。
实施例2GNRa-CSP12通过诱导铁下垂抑制白血病细胞增殖研究
1)GNRa-CSP12对白血病细胞的毒性
测定方法：CCK-8法试验。体外细胞毒性实验是根据制造商说明使用CCK-8试剂盒(Dojindo Molecular Technologies)来测定实施例1步骤4)得到的GNRa-CSP12对U937细胞、THP-1细胞、Kas-1细胞、NB4细胞、 MV4-11细胞、HL60细胞、TF-1细胞、SKNO-1细胞、MOLM13细胞、MOLM14细胞、C1498细胞、BM细胞的毒性。取对数生长周期的上述白血病细胞，细胞计数调整细胞密度为5×104个/ml，96孔细胞培养板中每孔接种100ul 的细胞悬液，100％的湿度，然后GNRa-CSP12被添加到每个孔中(GNRa-CSP12终浓度为0.01、0.05、0.1、0.2、 0.5、1、2nM)。细胞随后在37℃和5％的CO2的条件下，培养48小时。然后，CCK-8液(10uL)被添加到每个孔中，再在37℃和5％的CO2下培养1个小时。用酶标仪(BioTek Epoch)测定450nm处的吸光度，以浓度为横坐标，绘制细胞生长曲线。实验进行了三次，每种条件重复测试三次，取平均值。
测定结果：结果如图7所示，GNRa-CSP12在体外以剂量依赖的方式抑制AML细胞的增殖。半最大抑制浓度(IC50)为0.1nM，说明AML细胞对即使是低剂量的GNRa-CSP12也很敏感。
2)GSH(谷胱甘肽)配体交换效率的评价(荧光淬灭实验)
GSH的巯基可以通过配体交换与GNR-GSP12反应形成Au-S键。为了测定GSH配体交换效率，实施例1 步骤4)得到的GNRa-GSP12与不同数量的还原GSH孵育(分别为RhB-GSH100uM+GNRa-CSP12 0nM、RhB-GSH 100uM+GNRa-CSP120.02nM、RhB-GSH100uM+GNRa-CSP120.05nM、RhB-GSH 100uM+GNRa-CSP12 0.1nM、 RhB-GSH 100uM+GNRa-CSP12 0.2nM)。然后通过超滤收集纳米颗粒，再悬浮于水中。用950紫外/可见/近红外分光光度计(PerkinElmer)检测GNRa-conjugated GSH分子。
测定结果：图8A示出了GSH和RhB的合成机理图，结果如图8B所示，GNRa-CSP12具有较高的GSH配体交换效率，并且浓度影响GSH配体交换效率。
3)GNRa-CSP12对AML细胞的影响
试验方法：利用GSH/GSSG商业试剂盒和谷胱甘肽过氧化物酶检测试剂盒检测不同浓度GNRa-CSP12(0、0.1nM、0.25nM)对AML细胞的影响，空白是商业试剂盒测试的标准品
结果如图9所示，其中a为GSH/GSSG商业试剂盒检测中GNRa-CSP12对NB4细胞的影响，b为GSH/GSSG 商业试剂盒检测中GNRa-CSP12对MV4-11细胞的影响，c为GSH/GSSG商业试剂盒检测中GNRa-CSP12对kas-1 细胞的影响，d为谷胱甘肽过氧化物酶检测试剂盒中GNRa-CSP12对NB4细胞的影响，e为谷胱甘肽过氧化物酶检测试剂盒中GNRa-CSP12对MV4-11细胞的影响，f为谷胱甘肽过氧化物酶检测试剂盒中GNRa-CSP12对kas-1细胞的影响，表明GNRa-CSP12在AML细胞中严重消耗谷胱甘肽，可使GPX4失活，从而导致铁上介导的细胞死亡。
4)在C1498和FLT3+AML模型中，体内测试了GNRa-CSP12的抗白血病作用
测定方法：雄性C57BL/6N和免疫缺陷NOD SCID小鼠(4-6周龄)购自北京查尔斯河公司。所有动物实验均按照长春中医药大学动物护理与使用委员会批准的《实验动物护理与使用指南》进行。各种白血病模型的建立如下： C57BL/6N小鼠静脉注射0.5×106C1498细胞或FLT3转染的C1498细胞。根据白细胞(WBC)计数确定白血病发病，并腹腔注射GNRa-CSP12，以PBS为对照，GNRa-CSP12每次剂量为0.1mg/kg或0.25mg/kg，每周3次，连续3 周，将第一次注射记为第0天，在第0、5、10、15、20、25、30天，尾静脉定期抽血，用38μl Turk血液稀释液(Ricca Chemical)稀释2μl血。光镜下计数白细胞。实验结束后，对小鼠实施安乐死，测定脾脏重量。结果如图10，其中 A为静脉注射0.5×106C1498细胞的C57BL/6N小鼠中白血球细胞的数量，B为静脉注射0.5×106FLT3+转染的 C1498细胞的C57BL/6N小鼠中白血球细胞的数量，C为两个细胞模型下的各个组小鼠的脾，D为两个模型下各个组小鼠的脾的重量，表明，PBS处理的对照组小鼠骨髓中白血球细胞个数较高，低剂量GNRa-CSP12显著降低了白血球细胞个数。此外，PBS处理的对照组小鼠脾脏肿瘤细胞浸润增加，导致脾肿大，并对红髓和白髓造成严重损害。
5)GNRa-CSP12的体内生物相容性
雄性Balb/c小鼠(4-6周大,n＝5)静脉注射一次GNRa-CSP12(10毫克/公斤,100μl)或PBS，等待30天后安乐死后。每只老鼠取大约500μl血液用于生化测试。生化指标包括谷丙转氨酶(ALT)，结果如图11a、天门冬氨酸转氨酶 (AST)，结果如图11b、总蛋白(TP)，结果如图11d、血尿素氮(BUN)，结果如图11e、白蛋白(ALB)，结果如图11c、碱性磷酸酶(ALP)，结果如图11f、直接胆红素(DBIL)，结果如图11g和葡萄糖(GLU)，结果如图11h。图11中，左边的柱形为PBS对照组，右边为GNRa-CSP12处理组，从图11可以看出，GNRa-CSP12处理组与PBS对照组在第30天血清中丙氨酸转氨酶等肾功能指标水平相似，表明GNRa-CSP12纳米颗粒对肝脏和肾脏的毒性很小，具有很好的生物安全性。
实施例3GNRa-CSP12通过灭活FTO和ALKBH5来调控m6a介导的组学研究
1)细胞处理。
根据实施例2中1)的测定结果，NB4细胞为最敏感细胞，因此将其用于本实验。
处理NB4细胞并提RNA。取两组10ml NB4细胞分别用100ul PBS和100ul GNRa-CSP12原液处理，12小时后离心去掉上清液，分别将细胞沉淀重悬于1ml RNAiso Plus,轻微晃动，确保使裂解液均匀分布于细胞表面。
1)RNA-seq和m6A测序。对PBS对照组和GNRa-CSP12处理的NB4细胞进行了转录组RNA测序(RNA-seq) 和m6A测序(m6A-seq)。用TRIzol从上述处理的细胞中分离总RNA，使用Dynabeads mRNA纯化试剂盒(Thermo Fisher)按照说明书纯化mRNA。用RNA片段化试剂(Invitrogen)对纯化后的mRNA进行片段化，并用抗m6a抗体 (Synaptic Systems)免疫沉淀。结合的mRNA用m6A钠盐(Sigma-Aldrich,M2780)洗脱，构建文库并在Illumina HiSeq2500平台上测序。GSEA(基因富集分析)被用来识别富集的信号通路。RNA-seq显示，在GNRa-CSP12组中，260 个基因和183个基因分别显著上调和下调至少2倍(图12)。
2)铁死亡信号通路和表观转录组相关性分析。利用基因集富集分析(GSEA)的分子特征数据库(MSigDB)，筛选出与差异表达基因相关的10条通路，发现GNRa-CSP12激活p53通路和血红素代谢，抑制E2F靶点和糖酵解(图 13，a为糖酵解，b为血红素代谢，c为E2F靶点，d为P53通路，GNR表示GNRa-CSP12处理，Con表示空白对照)。这些结果表明，GNRa-CSP12通过调节FTO或ALKBH5介导的通路发挥其抗白血病作用。
3)为了进一步验证是否是FTO或ALKBH5-medidated m6A脱甲基改变基因表达的结果,绘制了m6A甲基化的 m6A测序数据,发现m6A高峰主要分布在蛋白质编码区域(CDS)(3和3'端非翻译区'UTR)的mRNA转录(图14，a 为增通路，b为降通路，FTO抑制剂&shFTO表示FTO抑制剂&shFTO处理的NB4细胞的m6A测序数据，GNR表示GNRa-CSP12处理的NB4细胞的m6A测序数据)，结果表明在增通路中FTO抑制剂&shFTO相关的基因与 GNRa-CSP12相关的基因有极大的重合。
实施例4GNRa-CSP12诱导整体m6A超甲基化并转录后调节其下游靶标验证
1)细胞处理。分别用GNRa-CSP12(浓度0、0.1、0.25nM)处理10mlNB4、Kas、MV4-11、MOLM13、MOLM14、HL60,并在含5％CO2的37℃细胞培养箱中培养24h后,混匀细胞悬液，离心并去掉上清，取细胞沉淀进行后续实验。对照组为与GNRa-CSP12等量的PBS或DMSO。
2)M6A点印迹试验。进行m6A斑点杂交试验，使用miRNeasy Mini Kit(217004,Qiagen)(试剂盒)从上述处理的细胞中分离mRNA，并根据制造商的说明使用PolyATractmRNAisolation System IV(Z5310,Promega)(试剂盒)进一步富集poly(A)+RNA。RNA样品用RNA结合缓冲液稀释(稀释至1:5)，65℃变性5分钟，用1体积 20xSSC(Cat#S1030,PH＝7)缓冲液稀释。使用Bio-Dot仪器(#170-6545,Bio-Rad)将样本点置于AmershamHybond-N+膜(RPN119B,GE医疗)上，并在紫外线照射下交联。膜用0.02％亚甲基蓝(MB)染色，用PBST(磷酸盐吐温缓冲液)洗涤。在室温下用5％脱脂乳封闭1h后，用anti-m6A抗体(202003,Synaptic Systems,1:2000)在4℃下孵育过夜，然后用酶标山羊抗兔IgG(sc-2030,SantaCruz Biotechnology)二抗孵育过夜(1:5000)。使用Amersham ECL Prime WesternBlotting检测试剂(RPN2232,GE Healthcare)对点进行可视化，通过m6A斑点杂交法分析m6A RNA甲基化在 GNRa-CSP12抗白血病作用中的作用。如图15所示，GNRa-CSP12显著增加了m6A在转录组中的丰度。
3)LC-MS/MS quantitation(液质联用定量)。根据说明书，使用GenEluteTMmRNAMiniprep Kit(Sigma #MRN70)(试剂盒)从DMSO或GNRa-GSP12处理的细胞中纯化mRNA。1微克mRNA用2u核酸酶P1(Sigma)消化，置于40μl缓冲液(10mM Tris-HCl pH 7.0,100mM NaCl,2.5mM ZnCl2)中，37℃孵育12h，然后与1u碱性磷酸酶在 37℃孵育2h。
将消化后的RNA稀释10倍，将10μl的样品注射到Ultimate 3000高效液相色谱系统的SyncronisaQ C18柱(100 mm×2.1mm,1.7μm,Thermo Scientific，美国)，并与TSQQuantiva质谱联用(Thermo，美国)。样品经梯度甲醇洗脱， A和m6A的母质-产物离子分别为m/z 268.1/136.1(A)和282.1/150.1(m6A)。LC-MS/MS定量也证实了GNRa-CSP12 处理NB4、Kas-1和MV4-11细胞后m6A-mRNA水平升高(图16，a为NB4、b为MV4-11、c为Kas-1，横坐标为GNRa-CSP12的浓度，纵坐标为m6A-mRNA水平百分含量)。
4)Gene-specific m6A qPCR。如前所述，进行基因特异性m6A qPCR，简单地说，根据制造商说明，使用Magna MeRIP m6A试剂盒(17-10499,Millipore)免疫沉淀m6A RNA。然后按照下述方法进行RT和qPCR。引物序列如上述表2所示。
定量RT-PCR(反转录聚合酶链式反应)。根据制造商的说明，使用AppliedBiosystems公司的RT试剂盒(反转录试剂盒，)将200ng RNA反转录成cDNA。然后使用SYBRgreen PCR master mix(Applied Biosystems)在AB 7500 real-time cycle(AppliedBiosystems,Foster City,CA)上进行RT-PCR。内源对照为GAPDH(甘油醛-3-磷酸脱氢酶)。周期阈值(Ct)值用于确定mRNA的相对富集。引物序列如表2所示。
表2 RT-PCR引物序列
Figure RE-GDA0003432445950000101
Figure RE-GDA0003432445950000111
基因特异性m6A-qPCR进一步显示，GNRa-CSP12显著上调了NB4、Kas-1和MV4-11细胞中m6a修饰的 SLC2A3、CD276和PKM mRNA(图17，a为CD276在细胞中的相对m6A水平，b为SLC2A3在细胞中的mRNA 水平,c为PKM在细胞中的相对m6A水平,d为CD276在细胞中的mRNA,e为SLC2A3在细胞中的相对m6A水平,f 为为PKM在细胞中的mRNA水平)，并加速了这些转录本的衰变。
5)质粒和shRNA转染。将人FTO(基因ID:79068)和ALKBH5(基因ID:54890)基因序列克隆到pCDNA3载体上，将各自的shRNA(短发夹RNA)构建体克隆到pSUPER载体上(每个基因3个shRNA)。所有序列如表3所示。2ml Kasumi-1细胞或U937以1×106cells/well(细胞/孔)的密度被种到6-well板(6孔板)中，然后使用 LipofectamineTM3000按照说明书进行实验，得到的细胞用于Western blotting。
表3 shRNA序列
shRNA control sequence TTCTCCGAACGTGTCACGTTT(SEQ ID NO：30)
shRNA targeting sequence 1:ALKBH5 GATGAAATCACTCACTGCATA(SEQ ID NO：31)
shRNA targeting sequence 2:ALKBH5 CCTCAGGAAGACAAGATTAGA(SEQ ID NO：32)
shRNA targeting sequence 3:ALKBH5 GCTATGCTTCAGATCGCCTGT(SEQ ID NO：33)
shRNA targeting sequence 1:FTO CAACGTAACTTTGCTGAATTT(SEQ ID NO：34)
shRNA targeting sequence 2:FTO CGGTTCACAACCTCGGTTTAG(SEQ ID NO：35)
shRNA targeting sequence 3:FTO GGTTTCAAGGCAATCGATACA(SEQ ID NO：36)
6)Western blotting(蛋白质印迹法)按照PR标准操作进行。简单地说，细胞用冷冻PBS(磷酸缓冲液)洗涤两次，并与补充蛋白酶和磷酸酶抑制剂的RIPA裂解缓冲液(Sigma-Aldrich)在冰上匀浆(Thermo Fisher Scientific)。用BCA蛋白分析试剂盒(ThermoFisher Scientific)测定裂解液中的蛋白浓度。每孔将大约30-60ug的蛋白质装入10％的SDS-PA凝胶中进行电泳，然后转移到甲醇活化的PVDF膜上(Thermo Fisher Scientific)。用5％脱脂乳封闭后，用抗FTO、ALKBH5、β-actin和GPX4的一抗孵育膜，用TBST洗涤。分别用驴抗兔IgG-HRP和山羊抗小鼠IgG-HRP 对印迹进行检测，用化学发光试剂检测阳性条带。相对蛋白表达量归一化为β-actin(1:1000,Santa Cruz#sc47778)。图18A为在Kasumi-1细胞中FTO和ALKBH5的表达水平与GNRa-CSP12的敏感性，B为在U937细胞中FTO和 ALKBH5的表达水平与GNRa-CSP12的敏感性，表明这些细胞中FTO和ALKBH5的表达水平与GNRa-CSP12的敏感性一致。
7)在AML过表达这些酶(尼洛替尼Nilotinib、PKC412)时，GNRa-CSP12抑制FTO和ALKBH5活性，但不抑制这些酶的表达，导致全局m6A RNA甲基化增加。
实施例5GNRa-CSP12协同TKIs抑制白血病发生，克服m6A介导的TKI耐药性
假设GNRa-CSP12可以克服m6a介导的TKIs抗性。
1)分析了GNRa-CSP12与伊马替尼、nilotinib(BCR/ABL和KIT抑制剂)和PKC412(FLT3抑制剂)对各自突变的K562(BCR/ABL)、Kasumi-1(KIT)和MV4-11(FLT3)细胞系的协同作用。结果如图19所示，其中A为各处理的克隆数量，B为各处理的克隆大小，C为各处理的细胞菌落图像实拍，图A、B中的“nilotinib or PKC412”表示 K562和Kasumi-1中为nilotinib，MV4-11中为PKC412，表明GNRa-CSP12和TKIs协同抑制了不同细胞系的生长。
2)耐Nilotinib的Kas-1细胞(Kas-1NR)和耐PKC412的MV4-11细胞(MV4PR)分别暴露于0.1nM的 GNRa-CSP12中6h以抑制FTO活性，然后分别用1mM TKIs处理48h。结果如图20所示，其中A为MV4PR细胞，B为Kas-1NR细胞，联合治疗有效降低了各细胞系的活力，表明GNRa-CSP12使细胞对特异性TKI敏感。
3)GNRa-CSP12对耐Nilotinib的Kas-1细胞(Kas-1NR)和耐PKC412的MV4-11细胞(MV4PR)进行的点印迹实验以及m6A甲基化测序分析也显示，GNRa-CSP12挽救了TKIs介导的m6A低甲基化(图21为m6A斑点杂交实验， A为两种细胞中m6A斑点杂交实验结果照片，B为MV4PR细胞m6A斑点杂交实验结果数据统计，C为Kas-1NR 细胞m6A斑点杂交实验结果数据统计)。
4)这些发现在体内通过MV4PR细胞移植NOG小鼠得到验证(分别给MV4PR细胞移植NOG小鼠注射 PKC412、GNRa-CSP12或Combo，2mg/kg，PPS为空白对照)。GNRa-CSP12显著抑制了MV4PR移植小鼠的白血病进展，表现为骨髓中白细胞计数和白血病母细胞减少，脾脏肿大减少，肺转移减少，生存期延长。未观察到差异处理动物的体重和主要器官的变化。从机制上讲，GNRa-CSP12增加了白血病小鼠骨髓细胞中全局mRNA m6A 甲基化，并下调了MERTK和STAT3(如图22，A为白细胞个数，B为脾重量，C为生存期百分比，D为m6A水平)。
综上所述，GNRa-CSP12可协同TKIs抑制AML，克服m6a介导的TKI耐药。
以上所述，仅是本申请的几个实施例，并非对本申请做任何形式的限制，虽然本申请以较佳实施例揭示如上，然而并非用以限制本申请，任何熟悉本专业的技术人员，在不脱离本申请技术方案的范围内，利用上述揭示的技术内容做出些许的变动或修饰均等同于等效实施案例，均属于技术方案范围内。
序列表
<110> 吉林大学
<120> 一种金纳米棒复合材料及其制备方法与应用
<140> 2021111548753
<141> 2021-09-29
<160> 36
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Thr His Arg Pro Pro Met Trp Ser Pro Val Trp Pro
1 5 10
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ttattgttgt tgttgttctt ag 22
<210> 3
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
aatgccagga gtatgtag 18
<210> 4
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
agagattgac cagcagta 18
<210> 5
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
cttgattctt cgtagattgt g 21
<210> 6
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
caagattgac ctagagac 18
<210> 7
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
gttataccac aggattga 18
<210> 8
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
tgaacacagt aaggtagat 19
<210> 9
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
aggatgatga acatagagt 19
<210> 10
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
tataccagga caccacaa 18
<210> 11
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
ttattgctgt aacttcatca tc 22
<210> 12
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
cattcacaga ggaggatt 18
<210> 13
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
gctatgtaag gtaagttcaa t 21
<210> 14
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
gcaaagtgga gattgttg 18
<210> 15
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
agtggagtca tactggaa 18
<210> 16
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
gagtcaacgg atttggtcgt 20
<210> 17
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
gacaagcttc ccgttctcag 20
<210> 18
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
ctagtcggat tgctcttc 18
<210> 19
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
ccaagaaggt aatgaggaa 19
<210> 20
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
agttaatgat ggttgatgg 19
<210> 21
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
gagactacta caagaagga 19
<210> 22
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
cacattcctg gagcacat 18
<210> 23
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
gccaatggta cagatgatg 19
<210> 24
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
ggatgttgat atggtgtt 18
<210> 25
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 25
ttgctgataa tcttgatgt 19
<210> 26
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 26
tgtctgtctg tctcattgc 19
<210> 27
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 27
gcattctcct cctcacag 18
<210> 28
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 28
tctgccttct cacctctt 18
<210> 29
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 29
agtgctgaca tctgtagttg 20
<210> 30
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 30
ttctccgaac gtgtcacgtt t 21
<210> 31
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 31
gatgaaatca ctcactgcat a 21
<210> 32
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 32
cctcaggaag acaagattag a 21
<210> 33
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 33
gctatgcttc agatcgcctg t 21
<210> 34
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 34
caacgtaact ttgctgaatt t 21
<210> 35
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 35
cggttcacaa cctcggttta g 21
<210> 36
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 36
ggtttcaagg caatcgatac a 21

Claims (10)

1.一种金纳米棒复合材料，其特征在于，所述金纳米棒复合材料包括：
金纳米棒GNR；
修饰在所述金纳米棒GNR表面的第一修饰物；
与所述第一修饰物通过酰胺键连接的第二修饰物；
所述第一修饰物来源于硫代羧甲基壳聚糖；
所述第二修饰物来源于12肽THRPPMWSPVWP。
2.根据权利要求1所述的金纳米棒复合材料，其特征在于，所述金纳米棒的长度为8～135nm，直径为2～80nm。
3.权利要求1～2任一项所述的金纳米棒复合材料的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：
(S1)将含有GNR-M溶液I和含有硫代壳聚糖的溶液II混合，反应I，得到中间体；
所述M为稳定剂，选自CTAR、NaOL中的至少一种；
(S2)将含有所述中间体的溶液III和含有所述12肽的溶液VI混合，在耦合剂的作用下反应II，得到所述金纳米棒复合材料。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述溶液I的溶剂包括水；
优选地，所述溶液I中，所述GNR-M的浓度为0.0300～0.090nM；
优选地，所述溶液II的溶剂包括水；
优选地，所述溶液II中，所述硫代壳聚糖的浓度为0.15～0.25mM；
优选地，所述溶液I和所述溶液II的体积比为0.5～1.5:0.5～1.5。
5.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述溶液III的溶剂包括水、硼酸钠缓冲液中的至少一种；
优选地，所述溶液III光密度OD值为2～4。
6.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述溶液IV的溶剂包括硼酸钠缓冲液；
所述溶液IV中，所述12肽的浓度为0.03～2mg/ml。
7.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述溶液III和所述溶液IV的体积比为3～8：1。
8.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述耦合剂包括1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐溶液和N-羟基硫代琥珀酰亚胺溶液；
优选地，所述1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐溶液的浓度为0.1～1M；
所述N-羟基硫代琥珀酰亚胺溶液的浓度为0.1～1M；
优选地，所述溶液III、所述1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐溶液和所述N-羟基硫代琥珀酰亚胺溶液体积比为3～8ml：200～1000μl：0.2～1.5ml。
9.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述反应I的条件包括：超声5～10min，静置2h以上；
优选地，所述反应II条件包括：温度为26～30℃，时间为12h以上；
优选地，所述反应II条件包括：在搅拌下进行，所述搅拌的转数为400～700rpm。
10.权利要求1～2任一项所述的金纳米棒复合材料、根据权利要求3～9任一项所述的制备方法制备得到的金纳米棒复合材料在制备白血病药物中的应用。
CN202111154875.3A 2021-09-29 2021-09-29 一种金纳米棒复合材料及其制备方法与应用 Active CN113995848B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202111154875.3A CN113995848B (zh) 2021-09-29 2021-09-29 一种金纳米棒复合材料及其制备方法与应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202111154875.3A CN113995848B (zh) 2021-09-29 2021-09-29 一种金纳米棒复合材料及其制备方法与应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN113995848A true CN113995848A (zh) 2022-02-01
CN113995848B CN113995848B (zh) 2023-07-18

Family

ID=79922123

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202111154875.3A Active CN113995848B (zh) 2021-09-29 2021-09-29 一种金纳米棒复合材料及其制备方法与应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN113995848B (zh)

Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20120052513A1 (en) * 2010-08-24 2012-03-01 Pradeep Thalappil Gold sub-nanoclusters and uses thereof
WO2013059617A1 (en) * 2011-10-21 2013-04-25 Ndsu Research Foundation Liposome compositions and methods of use
CN103071156A (zh) * 2012-12-12 2013-05-01 中国人民解放军第四军医大学 一种壳聚糖包裹负电荷金纳米粒及其制备方法和应用
CN104258424A (zh) * 2014-09-17 2015-01-07 中山大学 一种复合纳米诊疗制剂及其制备方法
US20160243049A1 (en) * 2015-02-19 2016-08-25 Washington University Nanoraspberries for photothermal cancer therapy
CN107469081A (zh) * 2017-08-15 2017-12-15 西安交通大学 靶向PEG修饰的金纳米棒与AlpcS4偶联的结合体及其制备、应用和抗肿瘤组合物
WO2019079841A1 (en) * 2017-10-26 2019-05-02 University Of South Australia ANICANCER THERAPY BASED ON NANOPARTICLES
CN112823025A (zh) * 2016-12-19 2021-05-18 莫尔豪斯医学院 用于通过抑制胞外体释放以治疗疾病的组成物及方法

Patent Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20120052513A1 (en) * 2010-08-24 2012-03-01 Pradeep Thalappil Gold sub-nanoclusters and uses thereof
WO2013059617A1 (en) * 2011-10-21 2013-04-25 Ndsu Research Foundation Liposome compositions and methods of use
CN103071156A (zh) * 2012-12-12 2013-05-01 中国人民解放军第四军医大学 一种壳聚糖包裹负电荷金纳米粒及其制备方法和应用
CN104258424A (zh) * 2014-09-17 2015-01-07 中山大学 一种复合纳米诊疗制剂及其制备方法
US20160243049A1 (en) * 2015-02-19 2016-08-25 Washington University Nanoraspberries for photothermal cancer therapy
CN112823025A (zh) * 2016-12-19 2021-05-18 莫尔豪斯医学院 用于通过抑制胞外体释放以治疗疾病的组成物及方法
CN107469081A (zh) * 2017-08-15 2017-12-15 西安交通大学 靶向PEG修饰的金纳米棒与AlpcS4偶联的结合体及其制备、应用和抗肿瘤组合物
WO2019079841A1 (en) * 2017-10-26 2019-05-02 University Of South Australia ANICANCER THERAPY BASED ON NANOPARTICLES

Non-Patent Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ANA CAROLINA MARTÍNEZ-TORRES 等: "Chitosan gold nanoparticles induce different ROS-dependent cell death modalities in leukemic cells" *
LIAO SHENGNAN等: "Improvement of Gold Nanorods in Photothermal Therapy: Recent Progress and Perspective" *
ROGER PRADES等: "Delivery of gold nanoparticles to the brain by conjugation with a peptide that recognizes the transferrin receptor" *
WANG CHUNG-HAO等: "Gold nanorod stabilized by thiolated chitosan as photothermal absorber for cancer cell treatment" *
崔腾等: "聚合物修饰的金纳米粒在癌症治疗中的研究进展" *
杨玉东等: "金纳米棒:性能、制备、修饰、生物成像技术及应用" *
王冉等: "金纳米棒在肿瘤诊疗领域的表面修饰策略概述" *
赵鹏飞等: "基于营养转运体或信号受体介导的仿生递药策略在脑部肿瘤治疗中的应用进展" *

Also Published As

Publication number Publication date
CN113995848B (zh) 2023-07-18

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Du et al. Designer exosomes for targeted and efficient ferroptosis induction in cancer via chemo-photodynamic therapy
Cao et al. Glutathione‐bioimprinted nanoparticles targeting of N6‐methyladenosine FTO demethylase as a strategy against leukemic stem cells
Li et al. Mitochondria-based aircraft carrier enhances in vivo imaging of carbon quantum dots and delivery of anticancer drug
Lin et al. Radiotherapy-mediated redox homeostasis-controllable nanomedicine for enhanced ferroptosis sensitivity in tumor therapy
Xu et al. Inhibiting autophagy flux and DNA repair of tumor cells to boost radiotherapy of orthotopic glioblastoma
Ma et al. Nanoparticle delivery of Wnt-1 siRNA enhances photodynamic therapy by inhibiting epithelial–mesenchymal transition for oral cancer
Jin et al. Nanoscale dual-enzyme cascade metal–organic frameworks through biomimetic mineralization as ROS generators for synergistic cancer therapy
US10548842B2 (en) Nanoliposomal c-MYC-siRNA inhibits in vivo tumor growth of cisplatin-resistant ovarian cancer
Sun et al. Engineering mitochondrial uncoupler synergistic photodynamic nanoplatform to harness immunostimulatory pro-death autophagy/mitophagy
Jin et al. Orchestrated copper-based nanoreactor for remodeling tumor microenvironment to amplify cuproptosis-mediated anti-tumor immunity in colorectal cancer
Wang et al. Controllable hypoxia-activated chemotherapy as a dual enhancer for synergistic cancer photodynamic immunotherapy
Wang et al. In situ biosynthesized gold nanoclusters inhibiting cancer development via the PI3K–AKT signaling pathway
Li et al. A dihydroartemisinin‐loaded nanoreactor motivates anti‐cancer immunotherapy by synergy‐induced ferroptosis to activate Cgas/STING for reprogramming of macrophage
Jian et al. Zeolitic imidazolate framework-based nanoparticles for the cascade enhancement of cancer chemodynamic therapy by targeting glutamine metabolism
Huang et al. Bortezomib prodrug catalytic nanoreactor for chemo/chemodynamic therapy and macrophage re-education
Du et al. Targeting N6-methyladenosine reader YTHDF1 promotes second near-infrared Nano-Photothermal immunotherapy
Yu et al. Coordination-driven FBXW7 DNAzyme-Fe nanoassembly enables a binary switch of breast cancer cell cycle checkpoint responses for enhanced ferroptosis-radiotherapy
Zheng et al. Cascade amplification of tumor chemodynamic therapy and starvation with re-educated TAMs via Fe-MOF based functional nanosystem
Zhang et al. Moderating hypoxia and promoting immunogenic photodynamic therapy by HER-2 nanobody conjugate nanoparticles for ovarian cancer treatment
Gamal-Eldeen et al. Gum Arabic-encapsulated gold nanoparticles modulate hypoxamiRs expression in tongue squamous cell carcinoma
CN113995848A (zh) 一种金纳米棒复合材料及其制备方法与应用
CN112274634A (zh) 一种磷脂聚乙二醇修饰的超小型氧化铈纳米酶在制备治疗急性肾损伤药物中的应用
CN116474114A (zh) 一种载分子靶向药物聚合物囊泡及其制备方法与应用
CN114887061B (zh) 靶向肿瘤的光热基因联合治疗纳米系统的制备方法及应用
US11618901B2 (en) Anti-miRNA carrier conjugated with a peptide binding to a cancer cell surface protein and use thereof

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant