CN103071156A - 一种壳聚糖包裹负电荷金纳米粒及其制备方法和应用 - Google Patents

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范黎
吴红
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Abstract

本发明提供一种壳聚糖包裹负电荷金纳米粒及其制备方法和应用，首先将壳聚糖或叶酸修饰的壳聚糖通过三聚磷酸钠交联后经超声分散制得凝胶纳米粒，其次，将负电荷金纳米粒加入凝胶纳米粒溶液中，搅拌混合15分钟-2小时。本发明采用壳聚糖包裹负电荷的金纳米粒解决了负电荷金纳米粒入胞效率不足的缺点，叶酸壳聚糖可通过叶酸的主动靶向作用进一步提高金纳米粒的入胞率，在进入细胞后，负电荷金纳米粒则能发挥其载药率高的优势，显著增高药物装载率，及其优于正电荷金纳米粒的优势，显著降低细胞毒性，本发明采用壳聚糖凝胶纳米粒包裹负电荷金纳米粒，与单纯使用壳聚糖及其衍生物作为药物载体相比，药物的载药率及入胞率得到显著提高。

Description

一种壳聚糖包裹负电荷金纳米粒及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于制药技术领域，具体涉及一种壳聚糖包裹负电荷金纳米粒及其制备方法和应用。
背景技术
胶体金纳米粒在生命科学研究领域应用广泛，如药物转运，基因转染，生物探针及组织分析等领域。尤其在化疗药物运载领域，纳米金由于其粒径小，比表面积大等优势，可极大的提升化疗药的载药量。
哺乳动物细胞膜表面绝大部分区域带有负电荷，仅有少部分区域为中性或带有正电荷。由于静电斥力，阴离子分子难于与细胞表面结合，一般通过胞吞机制入胞。最近的研究结果表明，正电荷的金纳米粒与细胞膜的结合能力为负电荷金纳米粒的3倍以上，入胞能力是负电荷金纳米粒的5倍以上。然而，Goodman小组的研究表明，正电荷的金纳米粒具有细胞毒性，而负电荷的金纳米粒生物相容性良好，无细胞毒性。Hauck小组的研究也表明，正电荷金纳米粒的细胞毒性为负电荷金纳米粒的27倍以上。上述缺点是金纳米粒作为药物载体的瓶颈。
发明内容
本发明的目的在于提供一种壳聚糖包裹负电荷金纳米粒及其制备方法和应用，可有效提高药物的入胞率和载体的载药率。
为达到上述目的，本发明采用了以下技术方案。
一种壳聚糖包裹负电荷金纳米粒，包括壳聚糖（CS）凝胶纳米粒以及包裹于壳聚糖凝胶纳米粒内的用于载药的负电荷金纳米粒。
所述壳聚糖凝胶纳米粒上连接有用于与细胞表面受体结合的配体。
所述配体为叶酸（FA）；通过在壳聚糖凝胶纳米粒上连接配体如叶酸分子，可以提高壳聚糖包裹负电荷金纳米粒的入胞效率。
所述负电荷金纳米粒为C5-Au-C11-COOH。
上述壳聚糖包裹负电荷金纳米粒的制备方法，包括以下步骤：首先，将壳聚糖通过三聚磷酸钠交联制得纳米凝胶，将纳米凝胶经超声分散制得凝胶纳米粒溶液，其次，将负电荷金纳米粒加入凝胶纳米粒溶液中，搅拌混合15分钟-2小时。
所述纳米凝胶的制备方法为：将壳聚糖溶解于体积分数为0.5-5%的醋酸水溶液中得质量浓度为1.5mg/mL的壳聚糖溶液A，将壳聚糖溶液A的pH调节为4.0-6.0后得壳聚糖溶液B，向壳聚糖溶液B中加入质量浓度为0.6mg/mL的三聚磷酸钠（TPP）水溶液，然后搅拌10-60分钟得壳聚糖纳米凝胶，壳聚糖溶液B与三聚磷酸钠水溶液的体积比为1：0.1-1.5。
所述壳聚糖在交联前用叶酸进行修饰。
所述纳米凝胶采用以下方法制备：将壳聚糖溶解于体积分数为0.5-5%的醋酸水溶液中得质量浓度为1.5mg/mL的壳聚糖溶液A，将1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC）、琥珀酰亚胺（NHS）与叶酸（FA）加入二甲基亚砜（DMSO）中，搅拌0.5-2小时得混合溶液，1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐：琥珀酰亚胺：叶酸的摩尔比为（1.2-2）：（1.0-1.5）：1，将壳聚糖溶液A的pH调节为4.0-6.0后得壳聚糖溶液B，按照壳聚糖与叶酸的摩尔比为1：1向壳聚糖溶液B中加入混合溶液，然后避光搅拌12-48小时，搅拌后用NaOH水溶液调节pH值至8.0-10.0得反应液，向反应液中加入质量浓度为0.6mg/mL的三聚磷酸钠水溶液，壳聚糖溶液B与三聚磷酸钠水溶液的体积比为1：0.1-1.5，然后搅拌10-60分钟，搅拌后在pH为7.4的磷酸缓冲液（PBS）中透析3天得叶酸修饰的壳聚糖（FA-CS）纳米凝胶。
本发明通过调节pH、壳聚糖与三聚磷酸钠的比例，可以降低壳聚糖凝胶的沉淀，获得更多的凝胶纳米粒。用0.6mg/ml的TPP溶液进行交联，使得到的纳米凝胶粒度更均匀，且分散性更好，粒径更小，更适合作为纳米药物载体。
所述负电荷金纳米粒（C5-Au-C11-COOH）的制备方法为：在氮气保护条件下将纳米金核（Au-C5）和11-巯基十一烷酸（MUA）在二氯甲烷（DCM）中搅拌反应24-36小时，纳米金核与11-巯基十一烷酸的摩尔比为1：3-6，搅拌反应后旋转蒸发除去二氯甲烷、收集沉淀（C5-Au-C11-COOH），分别用正己烷、二氯甲烷洗涤沉淀，洗涤后旋转蒸发去除正己烷以及二氯甲烷，然后用蒸馏水溶解，溶解后在去离子水中透析2-7天，透析后冷冻干燥得负电荷金纳米粒。
上述壳聚糖包裹负电荷金纳米粒在向细胞内转运药物中的应用。
所述壳聚糖包裹负电荷金纳米粒的入胞效率大于50%，而叶酸修饰的壳聚糖包裹负电荷金纳米粒的入胞效率大于95%。
本发明的有益效果体现在：
本发明采用正电荷的生物材料壳聚糖包裹负电荷的金纳米粒解决了负电荷金纳米粒入胞效率不足的缺点，在进入细胞后，负电荷金纳米粒则能发挥其优于正电荷金纳米粒的优势，在提高载药率的同时显著降低细胞毒性。
本发明选用壳聚糖作为金纳米粒的转运载体，能促进负电荷金纳米粒的入胞，通过将叶酸接合至壳聚糖凝胶纳米粒的表面，可以发挥叶酸的主动靶向作用，可将负电荷金纳米粒的入胞效率从50%提升至95%以上，FA-CS包裹负电荷金纳米粒载体有望成为抗肿瘤药物转运更为有效的新体系。
本发明采用壳聚糖凝胶纳米粒包裹负电荷金纳米粒，与单纯使用壳聚糖作为药物载体相比，药物的载药率得到显著提高。
附图说明
图1为负电荷金纳米粒（C5-Au-C11-COOH）的1H-NMR谱图；
图2为粒度分布图；图2a为CS凝胶纳米粒粒度分布图；图2b为FA-CS凝胶纳米粒粒度分布图；图2c为FA-CS凝胶纳米粒包裹负电荷金纳米粒（C5-Au-C11-COOH）粒度分布图；
图3为FA-CS凝胶纳米粒包裹负电荷金纳米粒在不同溶剂中的粒度分布图；图3a溶剂为含10%牛血清的DMEM培养液；图3b溶剂为PBS缓冲液；
图4为为FA-CS凝胶纳米粒包裹负电荷金纳米粒在不同溶剂中的Zeta电位分布图；图4a溶剂为PBS缓冲液；图4b溶剂为含10%牛血清的DMEM培养液；
图5为CS凝胶纳米粒包裹C5-Au-C11-COOH的TEM图；
图6为FA-CS凝胶纳米粒包裹C5-Au-C11-COOH的TEM图；
图7为Western blot检测三种细胞中FR-α受体表达凝胶电泳图；
图8为不同浓度负电荷金纳米粒（C5-Au-C11-COOH）的细胞成活率曲线；横坐标为金纳米粒浓度负对数，纵坐标为细胞成活率（%）；
图9为ICP-MS检测细胞内负电荷金纳米粒含量柱状图；图9a为Hela细胞ICP-MS的分析结果；图9b为Hela folate free细胞ICP-MS的分析结果；图9c为A549细胞ICP-MS的分析结果；AU表示C5-Au-C11-COOH金纳米粒，AUFACS表示FA-CS凝胶纳米粒包裹C5-Au-C11-COOH，AUCS表示CS凝胶纳米粒包裹C5-Au-C11-COOH。
具体实施方式
下面结合附图对发明作进一步说明。
1材料
负电荷金纳米粒（C5-Au-C11-COOH）为实验室自制，其余化学试剂均购于Sigma-Aldrich或Fischer Scientific试剂公司。其中二氯甲烷（DCM）干燥除水后使用。核磁共振仪为BRUKER Avance 400MHz，透射电镜为JEOL 7C，使用条件：80kev。粒度分析仪器为Malvern Zetasizer Nano ZS。
2方法
2.1制备负电荷金纳米粒（C5-Au-C11-COOH）
1）以甲苯-水为两相反应溶剂，合成2nm纳米金核（Au-C5）。1g四氯金酸溶解于250mL水中得四氯金酸水溶液，2.1g四辛基溴化铵溶解于500mL甲苯中得四辛基溴化铵甲苯溶液，四氯金酸水溶液与四辛基溴化铵甲苯溶液混合后剧烈搅拌直至所有的四氯金酸转移至有机相中，然后向有机相中加入0.337ml1-戊硫醇（C5SH），然后将新鲜配制的硼氢化钠水溶液（含2g硼氢化钠）迅速加入到反应体系中，继续激烈搅拌过夜。反应后旋转蒸发（25℃，0.01KPa）除去有机相，然后加入400mL乙醇以除去过量硫醇，并在-18℃静置后滤过析出的棕黑色沉淀，沉淀用乙醇洗涤数次即得纳米金核。
2）通过配体交换反应制备C5-Au-C11-COOH。称取20mmolAu-C5和80mmol11-巯基十一烷酸（MUA），分别置于两个圆底烧瓶中，分别向两个圆底烧瓶中加入5mL二氯甲烷，磁力搅拌均匀，氮气保护；用针头将MUA二氯甲烷溶液滴加至Au-C5二氯甲烷溶液中，保持氮气保护，磁力搅拌反应24h。反应结束后，形成于瓶壁上的沉淀即为C5-Au-C11-COOH，旋转蒸发（25℃，0.01KPa）除去二氯甲烷，然后用正己烷、DCM洗涤三次，去除游离的MUA，然后旋转蒸发（25℃，0.01KPa）去除正己烷以及二氯甲烷，然后用蒸馏水溶解沉淀，并在去离子水中透析2d，去除游离的MUA，透析后冷冻干燥得负电荷金纳米粒。重新溶解于水中，加一滴NaOH水溶液助溶，4℃冰箱保存。
如图1所示，负电荷金纳米粒（C5-Au-C11-COOH）的1H-NMR显示出MUA配体的宽峰，而HS旁的亚甲基峰消失。在图谱中未见游离MUA配体的尖峰，也未见C5配体的尖峰，证明负电荷金纳米粒（C5-Au-C11-COOH）的成功合成。2.2制备CS以及FA-CS凝胶纳米粒包裹C5-Au-C11-COOH
用离子凝胶法制备壳聚糖（CS）纳米粒。将CS溶解于醋酸水溶液（1%，v/v）中制成1.5mg/mL的CS溶液，用NaOH（1M）水溶液调节CS溶液的pH值至5.0，然后分别用0.45μm和0.22μm的滤膜滤过；称取三聚磷酸钠（TPP）6mg，溶解于10mL去离子水中，制成0.6mg/mL的TPP溶液，然后分别用0.45μm和0.22μm的滤膜滤过；向20mL滤膜滤过后的pH值为5.0的CS溶液中滴加20mL滤膜滤过后的TPP溶液，搅拌10min后，出现白色乳光得CS纳米凝胶。对CS纳米凝胶超声分散（超声功率为40watt，超声分散时间5-10min）形成CS凝胶纳米粒溶液，用DLS法（动态光散射法）测定纳米粒粒径及粒度分布，如图2a所示。
制备叶酸修饰的壳聚糖（FA-CS）凝胶纳米粒。将CS溶解于醋酸水溶液（1%，v/v）中制成1.5mg/mL的CS溶液，用NaOH（1M）水溶液调节CS溶液的pH值至4.7。将2.5mg1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC）、1mg琥珀酰亚胺（NHS）与4.4mg叶酸（FA）溶于3mL无水二甲基亚砜（DMSO）中，室温搅拌1h直至FA完全溶解，吸取1微升滴加至5mLpH值为4.7的CS溶液中，避光搅拌16h，然后用NaOH水溶液调整pH值至9.0，加入0.5mL质量浓度为0.6mg/mL的三聚磷酸钠（TPP）水溶液，搅拌10-60分钟，然后在pH7.4的PBS中透析3天，去除游离的FA以及TPP，透析后得FA-CS纳米凝胶，对FA-CS纳米凝胶超声分散（超声功率为40watt，超声分散时间5-10min）形成FA-CS凝胶纳米粒溶液，用DLS法测定纳米粒粒径及粒度分布，如图2b所示。
将负电荷金纳米粒（C5-Au-C11-COOH）水溶液分别加入制备的CS以及FA-CS凝胶纳米粒溶液中，搅拌1h即可得到凝胶纳米粒包裹C5-Au-C11-COOH，4℃冰箱保存。用DLS测定其粒径及粒度分布，如图2c所示。
DLS检测结果表明，CS和FA-CS凝胶纳米粒包裹C5-Au-C11-COOH在不同溶剂（水，PBS缓冲液和含血清培养液）中粒径均匀，分散性良好。图3、图4列举出FA-CS凝胶纳米粒包裹C5-Au-C11-COOH在不同溶剂的粒度以及Zeta电位分布情况，平均粒径为60-80nm，Zeta电位为+12mv。
从图5、图6中可看出，CS、FA-CS凝胶纳米粒包裹C5-Au-C11-COOH体系结构圆整，且金纳米粒包裹于纳米凝胶内部，而非附着于凝胶壁。这是由于正电荷的纳米凝胶将负电荷金纳米粒通过静电引力吸入至凝胶内部。
壳聚糖纳米凝胶的载药率仅为10%左右，而用纳米金载药时，一个金核上可连接101个药物分子，壳聚糖包裹负电荷金纳米粒的载药率为99.99%。
2.3细胞培养
所有的细胞培养试剂均购置于Sigma-Aldrich或Fischer Scientific试剂公司。Hela folate free细胞系由美国UMASS大学D.Joseph Jerry教授提供。将Hela folate free细胞系用低糖DMEM无FA添加的培养液培养于75cm2培养瓶中。Hela细胞系用低糖DMEM培养液培养，A549细胞系用RPMI 1640培养液培养。培养液中含小牛血清10%，37℃孵箱培养。
2.4Western blot法检测三种细胞的FR-α受体表达
Hela folate free、Hela和A549细胞系的FR-α受体表达程度用Western blot法检测。Hela细胞具有与KB细胞相类似的FR-α受体表达程度，而A549细胞的FR-α受体表达未见报道。因此，采用A549作为阴性对照，并用Westernblot法进行验证。Hela folate free、Hela和A549细胞系分别用PBS冲洗3次，用细胞裂解液（Tris-HCl:50mM，NaCl:150mM，EDTA：2mM，Triton X-100（pH7.2）：0.5%，蛋白抑酶混合剂：10%）冰浴裂解30min，4℃离心（7000g）10min。总蛋白用BCA试剂盒（Pierce，Socochim，Switzerland）定量。分别取三种细胞蛋白30μg，用8%变性聚丙烯酰胺凝胶分离，或用2-巯基乙醇预处理后，用电泳转移至硝化纤维膜（Schleicher and Schuell，Dassel，Germany）上。用含5%（w/v）脱脂奶粉，0.05%（v/v）Tween-20（PBST）的PBS溶液室温封闭1h。抗-FR单抗（F5753，US biological）孵育1h，用1:500稀释的1%（w/v）的PBST脱脂奶溶液润洗3次。再用二抗（NA931V，GE Healthcare）孵育，继而用1:2000稀释的1%（w/v）的PBST脱脂奶溶液润洗3次。ECL（Amersham,Bioscience,Orsay,France）喷雾显色，G-box检测。
从图7中可以看出，在A549细胞系中，未见FR-α的蛋白表达谱带，而在Hela和Hela folate free细胞系中均见FR-α的蛋白表达谱带。且Hela folatefree细胞的表达最强。这是由于Hela folate free细胞是培养于无FA的培养液中，Hela细胞表面FR-α受体增多，表达增强。因此，选用Hela folate free为阳性细胞株，A549为阴性细胞株，考察CS和FA-CS胶凝纳米粒对C5-Au-C11-COOH地转运入胞能力。
2.5细胞存活率检测
为检测负电荷金纳米粒（C5-Au-C11-COOH）对Hela的细胞毒性，将Hela细胞以15000每孔的密度接种于96孔板中，培育24h。配置系列浓度C5-Au-C11-COOH金纳米粒培养液，用其继续培育细胞24h。PBS冲洗三次，10%Alamar blue培养液继续培育4h。细胞成活率用荧光检测器于570nm下检测。绘制不同浓度C5-Au-C11-COOH金纳米粒细胞成活率曲线。
从图8中可见，负电荷金纳米粒（C5-Au-C11-COOH）的IC50高达5μM，因此，负电荷金纳米粒（C5-Au-C11-COOH）不具细胞毒性，生物相容性良好。
2.6ICP-MS检测细胞吞噬金纳米粒含量
为验证FA-CS及CS运载系统对负电荷金纳米粒的运载能力，用Perkin-Elmer Elan 6100质谱仪检测给药后金纳米粒的细胞内含量。Hela folatefree、Hela和A549细胞分别以30000cell/well的密度接种于24孔板中，培育24小时使之贴壁。给药前用PBS润洗三次，然后分别给以C5-Au-C11-COOH金纳米粒，FA-CS凝胶纳米粒包裹C5-Au-C11-COOH和CS凝胶纳米粒包裹C5-Au-C11-COOH溶液，其中每孔金纳米粒给药含量为150ng。给药2h后，PBS润洗三次，加入细胞裂解液（250ML/well）裂解30min。细胞溶解产物用0.5mL王水消化4h。消化之后，每孔加入10mL去离子水，进行ICP-MS检测。
参见图9，Hela细胞ICP-MS的分析结果表明，负电荷金纳米粒（C5-Au-C11-COOH）单纯给药时，仅有20.01ng金纳米粒进入细胞，而当CS运载负电荷金纳米粒给药时，细胞内金纳米粒含量增高至94.95ng，用FA-CS运载负电荷金纳米粒给药，细胞内金纳米粒含量高达150ng。同时，在阳性对照Hela folate free细胞的ICP-MS分析结果中可看出，FA-CS运载负电荷金纳米粒给药与CS运载负电荷金纳米粒给药的细胞内金纳米粒含量差距增大，表明，FA发挥了受体介导的主动靶向作用，使更多的金纳米粒进入细胞。而在A549细胞的分析结果中，两种纳米凝胶对于金纳米粒的转运无明显差异。这一结果表明，用CS运载负电荷金纳米粒能提高负电荷金纳米粒的细胞内摄量，且接合了FA的CS纳米凝胶由于FA的主动靶向作用，能进一步的促进负电荷金纳米粒的入胞效率。
本发明采用用CS和FA-CS包裹负电荷金纳米粒（C5-Au-C11-COOH），旨在提高负电荷金纳米粒的入胞效率，为进一步用负电荷金纳米粒接合抗癌药物，制备高载药量抗肿瘤纳米药物转运体系打下基础。DLS结果表明，CS和FA-CS包裹负电荷金纳米粒（C5-Au-C11-COOH）复合物粒径均在100nm以下，且表面带有正电荷。这两种体系均能在血清培养液中稳定存在，为进一步的体内应用提供可能。以Hela folate free细胞系为阳性对照，A549细胞系为阴性对照，对比CS和FA-CS对于负电荷金纳米粒（C5-Au-C11-COOH）转运的差别，证明FA的主动靶向特性。结果表明，未包裹C5-Au-C11-COOH的入胞率为仅10%左右，经CS纳米凝胶包裹后，C5-Au-C11-COOH的入胞率为为50%左右，而用FA-CS纳米凝胶包裹后，C5-Au-C11-COOH入胞率为95%以上，对于FR-α阳性表达的细胞，FA-CS纳米凝胶体系能发挥FA的主动靶向特性，使更多的负电荷金纳米粒进入细胞内。本发明为进一步用负电荷金纳米粒载疏水性抗肿瘤药物高效入胞提供了基础。

Claims (10)

1.一种壳聚糖包裹负电荷金纳米粒，其特征在于：包括壳聚糖凝胶纳米粒以及包裹于壳聚糖凝胶纳米粒内的用于载药的负电荷金纳米粒。
2.根据权利要求1所述一种壳聚糖包裹负电荷金纳米粒，其特征在于：所述壳聚糖凝胶纳米粒上连接有用于与细胞表面受体结合的配体。
3.根据权利要求2所述一种壳聚糖包裹负电荷金纳米粒，其特征在于：所述配体为叶酸。
4.根据权利要求1所述一种壳聚糖包裹负电荷金纳米粒，其特征在于：所述负电荷金纳米粒为C5-Au-C11-COOH。
5.一种制备如权利要求1所述壳聚糖包裹负电荷金纳米粒的方法，其特征在于：包括以下步骤：首先，将壳聚糖通过三聚磷酸钠交联制得纳米凝胶，将纳米凝胶经超声分散制得凝胶纳米粒溶液，其次，将负电荷金纳米粒加入凝胶纳米粒溶液中，然后搅拌混合15分钟-2小时。
6.根据权利要求5所述一种制备壳聚糖包裹负电荷金纳米粒的方法，其特征在于：所述纳米凝胶的制备方法为：将壳聚糖溶解于体积分数为0.5-5%的醋酸水溶液中得质量浓度为1.5mg/mL的壳聚糖溶液A，将壳聚糖溶液A的pH调节为4.0-6.0后得壳聚糖溶液B，向壳聚糖溶液B中加入质量浓度为0.6mg/mL的三聚磷酸钠水溶液，然后搅拌10-60分钟，壳聚糖溶液B与三聚磷酸钠水溶液的体积比为1：0.1-1.5。
7.根据权利要求5所述一种制备壳聚糖包裹负电荷金纳米粒的方法，其特征在于：所述壳聚糖在交联前用叶酸进行修饰。
8.根据权利要求7所述一种制备壳聚糖包裹负电荷金纳米粒的方法，其特征在于：所述纳米凝胶采用以下方法制备：将壳聚糖溶解于体积分数为0.5-5%的醋酸水溶液中得质量浓度为1.5mg/mL的壳聚糖溶液A，将1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、琥珀酰亚胺与叶酸加入二甲基亚砜中，搅拌0.5-2小时得混合溶液，1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐：琥珀酰亚胺：叶酸的摩尔比为（1.2-2）：（1.0-1.5）：1，将壳聚糖溶液A的pH调节为4.0-6.0后得壳聚糖溶液B，按照壳聚糖与叶酸的摩尔比为1：1向壳聚糖溶液B中加入混合溶液，然后避光搅拌12-48小时，搅拌后用NaOH水溶液调节pH值至8.0-10.0得反应液，向反应液中加入质量浓度为0.6mg/mL的三聚磷酸钠水溶液，壳聚糖溶液B与三聚磷酸钠水溶液的体积比为1：0.1-1.5，然后搅拌10-60分钟，搅拌后在pH为7.4的磷酸缓冲液中透析3天。
9.根据权利要求5所述一种制备壳聚糖包裹负电荷金纳米粒的方法，其特征在于：所述负电荷金纳米粒的制备方法为：在氮气保护条件下将纳米金核和11-巯基十一烷酸在二氯甲烷中搅拌反应24-36小时，纳米金核与11-巯基十一烷酸的摩尔比为1：3-6，搅拌反应后旋转蒸发除去二氯甲烷、收集沉淀，分别用正己烷、二氯甲烷洗涤沉淀，洗涤后旋转蒸发去除正己烷以及二氯甲烷，然后用蒸馏水溶解，溶解后在去离子水中透析2-7天，透析后冷冻干燥得负电荷金纳米粒。
10.一种如权利要求1所述壳聚糖包裹负电荷金纳米粒在向细胞内转运药物中的应用。
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