CN103990138B - 逐层组装纳米金复合物递药载体系统及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种逐层组装纳米金复合物递药载体系统,该递药载体系统包含:半胱胺修饰的纳米金核心,其表面带有氨基正电荷;带负电性的模型药物,其通过吸附包覆于半胱胺修饰的纳米金核心表面,形成模型药物层;含有二硫键骨架结构的聚合物多肽,其通过吸附包覆于模型药物层表面,形成还原响应释放层,该还原响应释放层表面还修饰有透明质酸。本发明还公开了该递药载体系统的制备方法和应用。本发明的纳米金复合物递药载体系统,具有谷胱甘肽触发智能释放、高效低毒的功效,且该纳米金复合物载体还呈现CD44介导的特异性内吞,具有体内肝靶向递送效果,对今后基因治疗中的非病毒给药载体研究以及肝脏疾病方面的治疗具有重要意义,应用前景广阔。
Description
技术领域
本发明涉及医药技术领域,具体涉及一种新型的响应释放型逐层组装纳米金复合物递药载体系统及其制备方法和应用,该递药载体系统可获得理想的肝靶向递送效果。
背景技术
肝癌、肝炎等肝脏疾病均为当前需要重点研究的重大防治疾病。这个顽固堡垒目前没有被有效攻克的主要原因,除了治疗药物本身的药理作用尚不够理想外,就是没有将药物有效递送至肝脏或肝脏的病变部位,即药物的肝靶向性差。此外,药物不能高效智能释放,也是一个主要原因。
金是化学性质最稳定的元素之一,但纳米级别的金粒子却具有特殊的物理化学性能,由于其良好的稳定性、尺寸效应、表面效应、光学效应以及其独特的生物亲和性,使其在生物传感器、光化学与电化学催化、生物医药(药物、基因、蛋白)、生物分析化学、食品安全快速检测、光电子器件、生物体着色等领域有着极其广阔的应用。
金纳米粒子(Gold nanoparticles,AuNPs)作为一种无毒性的载体,可以运用于药物以及基因递送。目前基因治疗传递载体包括病毒载体和非病毒载体。病毒载体通常都能展现出较理想的转染效果,其针对许多细胞类型具有天然的感染趋向性,天然的作用效果使其可有效从内涵体逃逸,进入细胞核进行表达。但是,在基因递送中病毒载体却会引起一系列问题,包括不可预知的免疫反应及毒副作用。例如,染色体插入后激活原癌基因而具有强的致癌性,较强的免疫反应致使多次注射给药受到限制。在另一方面,其具有尺寸限制,因而只能携载一定尺寸的核酸物质。如此种种,限制了其在实际的科学研究以及临床中的使用。由此,非病毒给药载体受到了科学家的广泛关注。与病毒载体相比,非病毒给药载体其免疫反应相对较低,染色体插入无风险,易于合成及质量控制。载体基本可包载任意尺寸的核酸物质。但是它也面临着许多的挑战和困难,其中,最主要的就是负载的药物不能高效智能释放、转染效果不理想及靶向性差。
目前国内纳米金体系的研究主要局限于普通金纳米粒的制备、处方优化及表征等,但对纳米金粒子的表面进行不同官能团的功能化以及基于该功能化纳米金的逐层自组装响应释放型肝靶向递药系统的研究在国内均未见报道。
虽然国外近年已出现采用逐层组装的功能化纳米金作为非病毒给药载体系统的研究报道,但是以功能化纳米金为核心采用逐层组装技术构建的含有丰富二硫键骨架结构的聚合物多肽,可利用细胞内部天然的谷胱甘肽作为药物触发释放基质并获得理想的肝靶向递送效果 的研究未见报道。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种逐层组装纳米金复合物递药载体系统,该递药载体系统能由体内天然谷胱甘肽(GSH)触发智能释放,高效低毒,且该载体系统具有很好的靶向给药效果。
此外,还需要提供一种上述逐层组装纳米金复合物递药载体系统的制备方法及应用。
为了解决上述技术问题,本发明通过如下技术方案实现:
在本发明的一个方面,提供了一种逐层组装纳米金复合物递药载体系统,该递药载体系统包含:
半胱胺修饰的纳米金核心,其表面带有氨基正电荷;
带负电性的模型药物,其通过吸附包覆于半胱胺修饰的纳米金核心表面,形成模型药物层;
含有二硫键骨架结构的聚合物多肽,其通过吸附包覆于模型药物层表面,形成还原响应释放层。
本发明的载体系统采用金纳米粒为核心,是因为纳米粒(NPs)是一种毒性小且稳定性较好的制剂类型,经静脉注射入血后能够将包裹的药物浓集于肝、脾等部位,可降低药物在其他组织中的分布,达到被动靶向效果。纳米(nanometer,nm)是计量单位,1nm是1m的千分之一,是一个氢原子直径的10倍。当物质的特征尺寸进入到纳米尺度时,原有的很多物理和化学性质会发生巨大的改变,表现出特有的小尺寸效应、表面效应和量子效应。以纳米颗粒作为载体,可以将药物、DNA或RNA等基因治疗分子包裹在纳米颗粒之中或吸附在其表面,通过纳米粒表面修饰的靶向分子与细胞表面特异性受体结合,在细胞摄取作用下进入胞内,实现安全有效的靶向性药物治疗和基因治疗。其优点是在体内具有长循环、隐形和主体稳定等特点,能克服药物在体内输送过程中所遇到的各种生理屏障,将药物送到一定的靶位,并可以控制药物在靶向部位的释放,不良反应较小。而将NPs的表面进行修饰后,可在一定程度上避免被单核巨噬细胞细胞识别,并可通过与靶细胞表面的特异性受体结合,实现其主动靶向效果。
优选的,本发明载体系统的还原响应释放层表面修饰有透明质酸(HA),HA作为载体系统的靶头,可以将药物特异性靶向肝脏细胞。
本发明载体系统中的纳米金,作为一种传递系统载体,其易于合成及功能化,并具有良好的生物相容性。可以利用功能基团修饰的纳米金所带电荷以及疏水等表面性能作为载体系统稳定的核心。金纳米粒子具有其独特的属性,首先,可以在其表面构建复合单层膜,能被 肿瘤细胞特异的识别,具有高的细胞穿透能力;第二,表面的单层膜能够在大多数的生理学环境下稳定存在;三,具有低的细胞毒性;四,为纳米级载体,粒径可控,构造出单层膜表面具有好的生物相容性,具有高的有效负载量。纳米金对蛋白质、DNA等具有很强的吸附能力。伯胺和季胺表面修饰的纳米金粒子可通过离子相互作用结合pDNA,与其它传统转染介质相比展现出了更有效的胞内传递效果。本发明的纳米金核心,进行半胱胺修饰后,被修饰的纳米金粒子表面带氨基正电荷,可以与带相反电荷的pDNA(模型药物)形成稳定的复合物。该半胱胺修饰的纳米金是由氯金酸、盐酸半胱胺氢氯化物和硼氢化钠经反应制备而成。
优选的,本发明载体系统中还原响应释放层的聚合物多肽,是由SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的多肽单体经氧化聚合反应,在多肽单体两端形成Cys-Cys连接而制成的含多个二硫键的聚TAT多肽。由聚合物多肽中的二硫键骨架结构,可利用细胞内部天然的谷胱甘肽作为药物触发释放基质,实现药物的高效智能释放,毒副作用减小。
本发明还原响应型逐层组装纳米金复合物肝靶向递药载体系统的粒径为100~300nm。
在本发明的另一方面,提供了一种逐层组装纳米金复合物递药载体系统的制备方法,包括以下步骤:
将氯金酸溶液和盐酸半胱胺氢氯化物溶液混合后,加入硼氢化钠水溶液反应,得半胱胺修饰的纳米金;
合成阳离子穿膜多肽,将该多肽溶于磷酸盐缓冲溶液,再加入二甲基亚砜反应,制得含有二硫键骨架结构的聚合物多肽;
将半胱胺修饰的纳米金原液,滴加入带负电性的模型药物溶液中,混合,得半胱胺修饰的纳米金核心包覆负电性模型药物层的纳米金复合物,再加入含有二硫键骨架结构的聚合物多肽,混合,离心洗涤,得表面包覆有聚合物多肽的纳米金复合物递药载体系统。
优选的,还包括步骤:在表面包覆有聚合物多肽的纳米金复合物中,加入透明质酸溶液,共孵育,离心洗涤,得表面修饰有透明质酸的逐层组装纳米金复合物递药载体系统。
优选的,所述阳离子穿膜多肽的序列如SEQ ID NO.1所示。
在本发明的另一方面,还提供了上述逐层组装纳米金复合物递药载体系统在制备肝靶向药物中的应用。
在本发明的另一方面,还提供了上述逐层组装纳米金复合物递药载体系统在制备基因治疗药物中的应用。
本发明的纳米金复合物递药载体系统,是以逐层组装为主要技术手段,以功能化的纳米级金粒子为核心,构建出的多层自组装纳米级复合物载体,其具有谷胱甘肽(GSH)触发智能释放、高效低毒、易于穿透细胞膜、有效逃逸内涵体并定位细胞核周围的功效。并且,后期在纳米复合物粒子表面修饰的靶向分子透明质酸(HA),能使该纳米金复合物载体呈现CD44介导的特异性内吞,具有体内肝靶向递送效果,对今后基因治疗中的非病毒给药载体研究以及肝脏疾病方面的治疗具有重要意义。
附图说明
下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。
图1是本发明的还原响应型逐层组装纳米金复合物递药载体系统在包覆不同层时其水化粒径变化图;
图2是本发明的还原响应型逐层组装纳米金复合物递药载体系统构建时包覆不同层其电位反转图;
图3是本发明的核心材料半胱胺修饰纳米金的(A)溶液颜色、(B)紫外扫描光谱、(C)透射电镜观察粒子形貌、(D)纳米粒水化粒径分布、(E)纳米粒粒子表面电位分布图;
图4是本发明的核心材料半胱胺修饰纳米金的原子力显微镜图;
图5是本发明的半胱胺修饰纳米金核心与pDNA的最优结合比例的琼脂糖凝胶电泳图;
图6是本发明的半胱胺修饰纳米金与pDNA结合后溶液颜色变化(A)及质粒载体尺寸改变(B)示意图;
图7是本发明的含有二硫键骨架结构pTAT多肽与pDNA的结合以及释放琼脂糖凝胶电泳图;
图8是本发明的半胱胺修饰纳米金与pDNA结合后透射电镜图;
图9是本发明的还原响应型逐层组装金纳米复合物AuCMs/pDNA/pTAT/HA的透射电子显微镜图;
图10是本发明的还原响应型逐层组装金纳米复合物AuCMs/pDNA/pTAT/HA制备过程中包覆不同层后的原子力显微镜图;
图11是本发明的还原响应型逐层组装金纳米复合物AuCMs/pDNA/pTAT及AuCMs/pDNA/pTAT/HA对三种不同细胞的细胞毒性柱状图;
图12是本发明的还原响应型纳米金复合物载体在COS-7细胞中的细胞内吞、摄取和细胞内追踪定位(A)及在Hep G2细胞中细胞内摄(B)的激光共聚焦显微镜图;
图13是本发明的基于半胱胺修饰纳米金包覆不同层材料后其细胞摄取内部透射电镜图;
图14是本发明的还原响应型逐层组装纳米金复合物载体HA竞争性抑制内吞柱形图;
图15是本发明的还原响应型逐层组装纳米金复合物载体的细胞转染激光共聚焦显微镜图;
图16是本发明的还原响应型逐层组装纳米金复合物载体定量细胞转染效果柱形图;
图17是本发明的还原响应型逐层组装纳米金复合物载体体内分布柱形图。
具体实施方式
为了克服目前递药载体系统靶向性差、不能高效智能释放药物的技术问题,本发明研制出了一种还原响应型逐层组装纳米金复合物递药载体系统,其结构包括:
(1)金纳米粒核心,可对纳米金表面进行各种功能化的修饰,作为载体系统核心部件,进行半胱胺修饰后,被修饰的粒子表面带氨基正电荷可以与带相反电荷的pDNA(模型药物)形成稳定的复合物;
(2)带负电性的模型药物层,为下一还原响应触发释放层的吸附提供负电性表面条件;
(3)响应释放层聚TAT多肽,TAT肽(序列为RKKRRQRRR(SEQ ID NO.2))是一种细胞穿透肽,阳离子穿膜肽的共同特点是含较多荷正电的精氨酸和/或赖氨酸,由于生理环境下细胞膜带负电,静电作用介导穿膜是其重要的透膜机制。用固相法制备CTATC后,采用氧化聚合反应氧化,使CTATC单体两端的半胱氨酸形成Cys-Cys连接,形成富含多个二硫键的聚合物多肽pTAT。当载体系统经由血液循环后定位肝脏组织,进入细胞后,高浓度的谷胱甘肽可还原富含二硫键骨架结构的多肽成小单体,从而获得相应释放效果;
(4)载体系统外修饰透明质酸(HA),实验的后期为了使整个载体系统具有特异性,在治疗过程中,提高药效和减轻不良反应,获得药物定向输送和细胞特异性的治疗效果,引入了肝脏细胞特异性的HA,作为系统的靶头,其可以与肝细胞表面丰富的CD44(clusterdeterminant44)、HARE(hyaluronan receptor for endocytosis)、LYVE-1、RHAMM、IVd4等受体特异性的结合,使药物的定点定向转运系成为了可能。
本发明逐层组装纳米金复合物递药载体系统的制备方法,包括以下步骤:
1.表面修饰半胱胺金纳米粒的合成
用移液枪吸取一定体积的1%的氯金酸溶液,加入40mL去离子水稀释后,再精密称取一定量盐酸半胱胺氢氯化物溶解于400μL去离子水中,加入至上述氯金酸溶液中。搅拌20min后,再将1mL新鲜配制的1mM硼氢化钠水溶液逐滴加入至上述混合液中,剧烈搅拌10-15min后,继续温和搅拌12h,反应全程注意避光操作,再于去离子水中透析纯化24h,即得表面修饰半胱胺的金纳米粒。
反应各项参数为:
表面修饰半胱胺的金纳米粒,其粒子表面带氨基正电荷,可以与带相反电荷的pDNA(模型药物)形成稳定的复合物。
2.含有二硫键骨架结构TAT聚多肽的制备
GTATG(序列为:GGRKKRRQRRRGG)以及CTATC(序列为:CGRKKRRQRRRGC)肽的制备采用FMOC方法,反应条件温和,在一般的实验条件下就可以进行合成,因此,也得到了非常广泛的应用。固相多肽在合成完成后,选择合适的切割试剂将多肽从树脂上切割下来,然后经过冰乙醚沉淀,离心收集沉淀,经过HPLC分离纯化,冷冻干燥得到最后产品。产品用液相测定样品纯度,质谱(TOF-MS)检测产物的分子量。
CTATC肽通过进一步氧化聚合反应进行二硫键修饰,使CTATC单体两端的半胱氨酸形成Cys-Cys连接,形成富含多个二硫键的聚合物多肽pTAT,具体反应过程如下:一定量的CTATC溶解于一定体积的磷酸盐缓冲溶液中,加入一定量的分析纯二甲基亚砜,于15-50℃下反应96h,低分子量的杂质用超滤离心管离心除去(cut-off=10,000Da)。最终产品pTAT用2,4,6-三硝基苯磺酸(TNBs)显色反应测定,并以GTATG作为标准对照品。
反应的各项参数为:
3.还原响应型逐层组装纳米金靶向给药系统的构建
用凝胶阻滞电泳分析并选择半胱胺修饰纳米金(AuCMs)与pDNA的最优投料比例,模型药物pDNA(1mg/mL),使用前稀释至所需浓度,将吸取AuCMs原液(ICP-AES测定Au3+的浓度为0.16mg/mL)逐滴加入于先前配制好的0.5mL的pDNA溶液中,二者经过磁力搅拌器温和混合45min从而能够形成AuCMs/pDNA纳米复合物。再加入一定体积pTAT(2mg/mL)溶液,室温下继续混合搅拌30min。接着,进行离心洗涤操作,于13,000g条件下离心10min,然后在去离子水中重悬,离心洗涤操作一般需重复2~3次,以确保将游离的pTAT去除完全。再加入事先配制好的透明质酸(HA)溶液(4mg/mL),共孵育30min后,采用上述相同方法重复离心洗涤步骤,最后将AuCMs/pDNA/pTAT/HA逐层自组装复合物重悬于去离子水中,以备后续实验使用。
反应的各项参数为:
下面通过具体实施例阐述本发明。
仪器和材料:
2-氨基乙硫醇盐酸盐(分析纯),沃凯公司;
四水合氯金酸(分析纯),国药集团化学试剂有限公司;
硼氢化钠(分析纯),国药集团化学试剂有限公司;
二甲基亚砜(分析纯),国药集团化学试剂有限公司;
氢氧化钠(分析纯),国药集团化学试剂有限公司;
盐酸(分析纯),国药集团化学试剂有限公司;
主氨基氮定量试剂盒,爱尔兰诊断试剂公司;
TAE,中国医药集团上海化学试剂分公司;
Gold View I型核酸染色剂,北京Solarbio科技有限公司;
琼脂糖凝胶,日本Takara公司;
DNAmarker,日本Takara公司;
Loading buffer,日本Takara公司;
脱氧核糖核酸酶I,日本Takara公司;
pBR322Vector(4361bp),美国Promega公司;
pGL3荧光素霉报告基因(5256bp),美国Promega有限公司;
pEGFP-N1Vector(4733bp),上海吉玛制药技术有限公司;
NANO pure Diamond TM超纯水机,美国Barnstead公司;
Centrifuge5424高速离心机,德国Eppendorf公司;
光学显微镜,荷兰EUROMEX公司;
MK3酶标仪,美国Thermo公司;
Leica TCS SP2共聚焦电子显微镜,德国Leica公司;
Zetasizer nano ZS激光粒度分析仪,英国马尔文公司;
Z-5000型ICP-AES原子吸收光谱分析仪,日本HITACHI公司;
HITACHI-7000型透射电镜,日本HITACHI公司;
原子力显微镜,美国Bruker-veeco公司;
FR-250电泳仪,上海复日科技有限公司;
NANO DROP2000超微量紫外/可见光分光光度计,美国Thermo scientific有限公司。
实施例1制备逐层组装纳米金复合物递药载体系统(AuCMs/pDNA/pTAT)
1.表面修饰半胱胺金纳米粒(AuCMs)的合成
用移液枪吸取2.3mL事先配制好,并经过0.22μm滤膜过滤除菌的1%的氯金酸溶液于50mL干净的烧杯中,并加入40mL去离子水进行稀释。再精密称取9mg盐酸半胱胺氢氯化物溶解于400μL去离子水中,并加入至上述氯金酸溶液中,搅拌20min。再吸取1mL新鲜配制的1mM硼氢化钠(精密称取3.783mg定溶于100mL容量瓶)水溶液逐滴加入至上述混合液中,25-50℃剧烈搅拌10-15min后,转为温和搅拌。12h后,再于去离子水中透析纯化24h即得半胱胺修饰的纳米金溶胶溶液,反应全程注意避光操作。
2.含有二硫键骨架结构TAT聚多肽的制备
GTATG以及CTATC肽的制备采用固相合成法合成后,经制备液相纯化并冻干。用质谱
(TOF-MS)检测产物的分子量,液相色谱测定样品纯度。色谱参数:Pump A:0.1%TAF in100%water;Pump B:0.1%TAF in100%acetonrtrile;Total Flow:1mL/min;Wavelength:214nm。质谱参数:Interface:ESI;Nebulizing Gas Flow:1.50L/min;CDLTemp:250℃;CDL Volt:0V;Block Temp:200;Prerod Bias:+4.5kV;Detector:-0.2kV;T.Flow:0.2mL/min;B.conc:50%H2O/50%MeOI。
在一系列的合成处理后,CTATC肽通过氧化聚合反应进行二硫键修饰,使CTATC单体两端的半胱氨酸形成Cys-Cys连接,形成富含多个二硫键的聚合物多肽pTAT,具体反应过程如下:20.8mg的CTATC溶解于145μL的PBS溶液中,加入70μL二甲基亚砜(DMSO),于室温下反应96h,通过加入15mL5mM的HEPES缓冲溶液(pH7.0)终止反应,低分子量的杂质用超滤离心管离心除去(cut-off=10,000)。
采用体积排阻色谱法(Size Exclusion Chromatography,SEC)进行pTAT分子量的确定,所得pTAT样品经过一定稀释后,连续两次SEC测定,直至分子量分布范围经过两次SEC分析后不再发生改变。
色谱条件的选择:SEC色谱柱选用CATSEC-300和CATSEC-1000串联获得,并以0.2MNaCl和0.1%TFA制备成流动相。由数学处理方法得到的渐进示差法绘制校正曲线,并以GTATG肽以及两种不同相对分子质量(14kDa和240kDa)的多聚赖氨酸为宽分布标样。
3.还原响应型逐层组装纳米金靶向给药系统的构建
用凝胶阻滞电泳分析并选择半胱胺修饰纳米金(AuCMs)与pDNA的最优投料比例(672∶1)。模型药物pDNA(1mg/mL),使用前稀释至所需浓度,使其最终体积为0.5mL(含3μgpDNA)。再吸取8mLAuCMs原液(ICP-AES测定Au3+的浓度为0.16mg/mL)逐滴加入于先前配制好的0.5mL的pDNA溶液中,一边加入一边缓慢搅拌。二者经过磁力搅拌器温和混合45min从而能够形成AuCMs/pDNA纳米复合物。再加入6μLpTAT(2mg/mL)溶液,室温下继续混合搅拌30min。接着,进行离心洗涤操作,于13,000g条件下离心10min,然后在去离子水中重悬,离心洗涤操作一般需重复2~3次,以确保将游离的pTAT去除完全,得逐层自组装纳米金复合物AuCMs/pDNA/pTAT。
实施例2制备逐层组装纳米金复合物递药载体系统(AuCMs/pDNA/pTAT/HA)
1.表面修饰半胱胺金纳米粒(AuCMs)的合成
用移液枪吸取2.3mL事先配制好,并经过0.22μm滤膜过滤除菌的1%的氯金酸溶液于50mL干净的烧杯中,并加入40mL去离子水进行稀释。再精密称取9mg盐酸半胱胺氢氯化物溶解于400μL去离子水中,并加入至上述氯金酸溶液中,搅拌20min。再吸取1mL新鲜配制的1mM硼氢化钠(精密称取0.1mg定溶于2.64mL)水溶液逐滴加入至上述混合液中,25-50℃剧烈搅拌10-15min后,转为温和搅拌。12h后,再于去离子水中透析纯化24h即得半胱胺修饰的纳米金溶胶溶液,反应全程注意避光操作。
2.含有二硫键骨架结构TAT聚多肽的制备
GTATG以及CTATC肽的制备采用固相合成法,经制备液相纯化并冻干。用质谱(TOF-MS)检测产物的分子量,液相色谱测定样品纯度。色谱参数:Pump A:0.1%TAF in100%water;Pump B:0.1%TAF in100%acetonrtrile;Total Flow:1mL/min;Wavelength:214nm。质谱参数:Interface:ESI;Nebulizing Gas Flow:1.50L/min;CDL Temp:250℃;CDLVolt:0V;Block Temp:200;Prerod Bias:+4.5kV;Detector:-0.2kV;T.Flow:0.2mL/min;B.conc:50%H2O/50%MeOI。
在一系列的合成处理后,CTATC肽通过氧化聚合反应进行二硫键修饰,使CTATC单体两端的半胱氨酸形成Cys-Cys连接,形成富含多个二硫键的聚合物多肽pTAT,具体反应过程如下:20.8mg的CTATC溶解于145μL的PBS溶液中,加入70μL二甲基亚砜(DMSO),于室温下反应96h,通过加入15mL5mM的HEPES缓冲溶液(pH7.0)终止反应,低分子量的杂质用超滤离心管离心除去(cut-off=10,000)。
采用体积排阻色谱法(Size Exclusion Chromatography,SEC)进行pTAT分子量的确定,所得pTAT样品经过一定稀释后,连续两次SEC测定,直至分子量分布范围经过两次SEC分析后不再发生改变。
色谱条件的选择:SEC色谱柱选用CATSEC-300和CATSEC-1000串联获得,并以0.2MNaCl和0.1%TFA制备成流动相。由数学处理方法得到的渐进示差法绘制校正曲线,并以GTATG肽以及两种不同相对分子质量(14kDa和240kDa)的多聚赖氨酸为宽分布标样。
3.还原响应型逐层组装纳米金靶向给药系统的构建
用凝胶阻滞电泳分析并选择半胱胺修饰纳米金(AuCMs)与pDNA的最优投料比例(672∶1)。模型药物pDNA(1mg/mL),使用前稀释至所需浓度,使其最终体积为0.5mL(含3μgpDNA)。再吸取8mL AuCMs原液(ICP-AES测定Au3+的浓度为0.16mg/mL)逐滴加入于先前配制好的0.5mL的pDNA溶液中,一边加入一边缓慢搅拌。二者经过磁力搅拌器温和混合45min从而能够形成AuCMs/pDNA纳米复合物。再加入6μLpTAT(2mg/mL)溶液,室温下继续混合搅拌30min。接着,进行离心洗涤操作,于13,000g条件下离心10min,然后在去离子水中重悬,离心洗涤操作一般需重复2~3次,以确保将游离的pTAT去除完全。再加入10μL事先配制好的透明质酸(HA)溶液(4mg/mL),共孵育30min后,采用上述相同方法重复离心洗涤步骤,最后将AuCMs/pDNA/pTAT/HA逐层自组装复合物重悬于去离子水中,以备后续实验使用。
实施例3制备逐层组装纳米金复合物递药载体系统(AuCMs/pDNA/pTAT/HA)
1.表面修饰半胱胺金纳米粒(AuCMs)的合成
用移液枪吸取1.5mL事先配制好,并经过0.22μm滤膜过滤除菌的1%的氯金酸溶液于50mL干净的烧杯中,并加入40mL去离子水进行稀释。再精密称取8mg盐酸半胱胺氢氯化物溶解于400μL去离子水中,并加入至上述氯金酸溶液中,搅拌20min。再吸取1mL新鲜配制的1mM硼氢化钠(精密称取0.3mg溶解于7.93mL去离子水中)水溶液逐滴加入至上述混合液中,25-50℃剧烈搅拌10-15min后,转为温和搅拌。9h后,再于去离子水中透析纯化24h即得半胱胺修饰的纳米金溶胶溶液,反应全程注意避光操作。
2.含有二硫键骨架结构TAT聚多肽的制备
GTATG以及CTATC肽的制备采用固相合成法,经制备液相纯化并冻干。用质谱(TOF-MS)检测产物的分子量,液相色谱测定样品纯度。色谱参数:Pump A:0.1%TAF in100%water;Pump B:0.1%TAF in100%acetonrtrile;Total Flow:1mL/min;Wavelength:214nm。质谱参数:Interface:ESI;Nebulizing Gas Flow:1.50L/min;CDL Temp:250℃;CDLVolt:0V;Block Temp:200;Prerod Bias:+4.5kV;Detector:-0.2kV;T.Flow:0.2mL/min;B.conc:50%H2O/50%MeOI。
在一系列的合成处理后,CTATC肽通过氧化聚合反应进行二硫键修饰,使CTATC单体两端的半胱氨酸形成Cys-Cys连接,形成富含多个二硫键的聚合物多肽pTAT,具体反应过程如下:10mg的CTATC溶解于100μL的PBS溶液中,加入55μL二甲基亚砜(DMSO),于 室温下反应48h,通过加入15mL5mM的HEPES缓冲溶液(pH7.0)终止反应,低分子量的杂质用超滤离心管离心除去(cut-off=10,000)。
采用体积排阻色谱法(Size Exclusion Chromatography,SEC)进行pTAT分子量的确定,所得pTAT样品经过一定稀释后,连续两次SEC测定,直至分子量分布范围经过两次SEC分析后不再发生改变。
色谱条件的选择:SEC色谱柱选用CATSEC-300和CATSEC-1000串联获得,并以0.2MNaCl和0.1%TFA制备成流动相。由数学处理方法得到的渐进示差法绘制校正曲线,并以GTATG肽以及两种不同相对分子质量(14kDa和240kDa)的多聚赖氨酸为宽分布标样。
3.还原响应型逐层组装纳米金靶向给药系统的构建
用凝胶阻滞电泳分析并选择半胱胺修饰纳米金(AuCMs)与pDNA的最优投料比例(672∶1)。模型药物pDNA(1mg/mL),使用前稀释至所需浓度,使其最终体积为0.5mL(含2μgpDNA)。再吸取6mL AuCMs原液(ICP-AES测定Au3+的浓度为0.16mg/mL)逐滴加入于先前配制好的0.5mL的pDNA溶液中,一边加入一边缓慢搅拌。二者经过磁力搅拌器温和混合45min从而能够形成AuCMs/pDNA纳米复合物。再加入3μLpTAT(2mg/mL)溶液,室温下继续混合搅拌30min。接着,进行离心洗涤操作,于13,000g条件下离心10min,然后在去离子水中重悬,离心洗涤操作一般需重复2~3次,以确保将游离的pTAT去除完全。再加入5μL事先配制好的透明质酸(HA)溶液(4mg/mL),共孵育30min后,采用上述相同方法重复离心洗涤步骤,最后将AuCMs/pDNA/pTAT/HA逐层自组装复合物重悬于去离子水中,以备后续实验使用。
实施例4制备逐层组装纳米金复合物递药载体系统(AuCMs/pDNA/pTAT/HA)
1.表面修饰半胱胺金纳米粒(AuCMs)的合成
用移液枪吸取3.5mL事先配制好,并经过0.22μm滤膜过滤除菌的1%的氯金酸溶液于50mL干净的烧杯中,并加入40mL去离子水进行稀释。再精密称取10mg盐酸半胱胺氢氯化物溶解于400μL去离子水中,并加入至上述氯金酸溶液中,搅拌20min。再吸取1mL新鲜配制的1mM硼氢化钠(精密称取0.6mg溶解于15.86mL去离子水中)水溶液逐滴加入至上述混合液中,25-50℃剧烈搅拌10-15min后,转为温和搅拌。20h后,再于去离子水中透析纯化24h即得半胱胺修饰的纳米金溶胶溶液,反应全程注意避光操作。
2.含有二硫键骨架结构TAT聚多肽的制备
GTATG以及CTATC肽的制备采用肽的制备采用固相合成法,经制备液相纯化并冻干。,
用质谱(TOF-MS)检测产物的分子量,液相色谱测定样品纯度。色谱参数:Pump A:0.1%TAF in100%water;Pump B:0.1%TAF in100%acetonrtrile;Total Flow:1mL/min;Wavelength:214nm。质谱参数:Interface:ESI;Nebulizing Gas Flow:1.50L/min;CDLTemp:250℃;CDL Volt:0V;Block Temp:200;Prerod Bias:+4.5kV;Detector:-0.2kV;T.Flow:0.2mL/min;B.conc:50%H20/50%MeOI。
在一系列的合成处理后,CTATC肽通过氧化聚合反应进行二硫键修饰,使CTATC单体两端的半胱氨酸形成Cys-Cys连接,形成富含多个二硫键的聚合物多肽pTAT,具体反应过程如下:30mg的CTATC溶解于200μL的PBS溶液中,加入90μL二甲基亚砜(DMSO),于室温下反应120h,通过加入15mL5mM的HEPES缓冲溶液(pH7.0)终止反应,低分子量的杂质用超滤离心管离心除去(cut-off=10,000)。
采用体积排阻色谱法(Size Exclusion Chromatography,SEC)进行pTAT分子量的确定,所得pTAT样品经过一定稀释后,连续两次SEC测定,直至分子量分布范围经过两次SEC分析后不再发生改变。
色谱条件的选择:SEC色谱柱选用CATSEC-300和CATSEC-1000串联获得,并以0.2MNaCl和0.1%TFA制备成流动相。由数学处理方法得到的渐进示差法绘制校正曲线,并以GTATG肽以及两种不同相对分子质量(14kDa和240kDa)的多聚赖氨酸为宽分布标样。
3.还原响应型逐层组装纳米金靶向给药系统的构建
用凝胶阻滞电泳分析并选择半胱胺修饰纳米金(AuCMs)与pDNA的最优投料比例(672∶1)。模型药物pDNA(1mg/mL),使用前稀释至所需浓度,使其最终体积为0.5mL(含4μgpDNA)。再吸取10mL AuCMs原液(ICP-AES测定Au3+的浓度为0.16mg/mL)逐滴加入于先前配制好的0.5mL的pDNA溶液中,一边加入一边缓慢搅拌。二者经过磁力搅拌器温和混合45min从而能够形成AuCMs/pDNA纳米复合物。再加入10μLpTAT(2mg/mL)溶液,室温下继续混合搅拌30min。接着,进行离心洗涤操作,于13,000g条件下离心10min,然后在去离子水中重悬,离心洗涤操作一般需重复2~3次,以确保将游离的pTAT去除完全。再加入30μL事先配制好的透明质酸(HA)溶液(4mg/mL),共孵育30min后,采用上述相同方法重复离心洗涤步骤,最后将AuCMs/pDNA/pTAT/HA逐层自组装复合物重悬于去离子水中,以备后续实验使用。
将实施例1~4制备的半胱胺修饰纳米金颗粒、聚合物多肽pTAT、以及还原响应型逐层组装纳米金靶向给药系统,进行如下测定和形态观察:
一、还原响应型逐层组装纳米金复合物载体粒径及表面zeta电位测定
采用动态光散射法测定功能化纳米金及纳米金复合物的粒径和zeta电位,包覆每层材料 步骤后均用去离子水进行充分的混悬,在逐层吸附的过程中,每吸附一层材料,同步测量纳米复合物系统的粒径及zeta电位,分别取溶液样品1mL,加入样品池中,确定容器内无气泡产生,利用英国马尔文公司纳米粒径测定仪测定样品的粒径和zeta电位,每个样品重复测量三次,得到逐层自组装纳米金复合物载体系统在制备过程中的粒径及电位变化。
结果显示,半胱胺修饰纳米金(AuCMs)的水化粒径为18±17.6nm,随着逐渐包覆不同层,可以看到一个明显的粒径增加趋势(图1),包覆每层粒径分布为18±17.6、135.6±7.4、186.3±10.8及199.7±21.0nm。并能随着在AuCMs表面包覆不同电性材料,可以观察到电位反转的过程,分别为34.3±7.09、-22.7±6.02、26±4.6、-17±4mV,证明LbL(逐层组装)系统的成功构建(图2)。
二、本发明中核心材料半胱胺修饰纳米级金颗粒的表征
AuCMs的合成是在半胱胺氢氯化物的存在下,通过硼氢化钠化学还原母体金阴离子而制备。在反应过程中,溶液会经历一个由淡褐色到酒红色的一个变化过程,证明胶体金纳米粒的成功形成(图3A)。用化学法制得的溶胶通常含有较多的电解质,虽然适量电解质可以作为溶胶的稳定剂,但过多的电解质会降低溶胶的稳定性。因此欲制得稳定的溶胶,常常采用透析法。经过透析操作后,通过马尔文粒度测定仪可以得到所形成的AuCMs粒子粒径为18±4.6nm(图3D),zeta电势为+33.3±7.7mV(图3E)。根据PANOPA试剂盒,测出PAN的浓度约为168.9±67mg每N/L。通过透射电镜得到AuCMs的平均粒径为14±4.1nm(图3C),半胱胺基团修饰的纳米金粒子粒径均一,表面光滑圆整,无粘连现象的出现。ICP-AES测得Au3+浓度为0.16mg/mL。AuCMs溶液在520nm左右有最大吸收(图3B),同时也证明纳米金粒子大小为20nm左右。原子力显微镜观察纳米粒形态:将适量纳米粒溶液,小心滴加于云母片上,待样品干燥后即制得AFM样品,显微镜观察纳米粒的大小及表面形貌,结果见图4,由结果可知纳米粒粒径大小均一,形貌圆整,分布均匀,与TEM所得结果相符。
三、半胱胺修饰纳米金与模型药物pDNA的结合能力考察
取1.92mg AuCMs,加入40μL去离子水溶解,分别设置1~7号样品,每个样品管中分别加入1、3、5、7、9、11μL的AuCMs溶液。相应在每个样品管中加入H2O至终体积均为11μL,再于每个样品管中加入1μL的pBR322vector。充分混匀后,于37℃恒温摇床孵育45min后,每孔加入1.1μL的loading buffer。配制1%的琼脂糖凝胶,在160V下电泳20min,电泳缓冲液为TAE buffer。
琼脂糖凝胶电泳结果表明(见图5),可以得到在AuCMs与pDNA的质量比大于等于672:1时,pDNA能够被AuCMs完全阻滞于上样孔中。并且,可以看到出现了体系颜色发生改变的现象(图6A),AuCMs作为一种正电性核心,能够有效吸附pDNA,这种基因纳米粒的组 装体在保护DNA分子生物活性的同时,能够诱导较大的圆形的pDNA压缩至一定体积(图6B),有利于pDNA进入细胞核。
四、本发明中pTAT聚合物多肽与pDNA的结合及还原条件的触发释放能力考察
2μgpEGFP-N1分别与一系列不同浓度的pTAT溶液(pTAT原液为2mg/mL)混合共孵育45min后上1%的凝胶阻滞电泳进行分析。对于释放样品,选取pTAT能够与2μgpEGFP-N1完全结合的浓度点的样品制备方法制备样品,并分别施加5μL DTT和5%SDS进行释放实验,释放实验于37℃孵育30min。
琼脂糖凝胶阻滞电泳分析结果见图7,图7中的Marker为5kDa,“0”为单纯pDNA对照组。当pTAT的用量与pDNA的用量为3∶2时,pTAT可以与pDNA形成有效复合物,pDNA被完全阻滞于上样孔内(泳道2)。但施加一定浓度的DTT后,可以发现由于施与一定浓度的还原条件,原先多个TAT肽间的二硫键被还原成为-SH,直接致使大段的pTAT瓦解形成小的片段,使复合物包裹pDNA的能力下降,从而在使用pTAT能完全滞留pDNA的比例下,pDNA得以释放如泳道5所示。除此之外,实验还施加了5%SDS的电泳实验作为对照,即当共孵育释放时,加入较多的SDS,有可能使整个系统的负电性加强,导致出现的条带跑至低分子量处,而非pDNA被降解为小片段所致(跑道6)。
五、本发明响应型逐层组装纳米金载pDNA纳米复合物形态观察
通过透射电镜(图8)可以观察到当AuCMs与pDNA结合后,呈现AuCMs纳米粒多个聚集在一起,并在粒子团簇周围可以观察到一层薄膜,证明AuCMs能够压缩并吸附负电性的pDNA。当逐渐包覆不同层,AuCMs团簇周围会出现更厚的雾状薄膜(图9)。原子力显微镜下(图10),可以看到基于AuCMs构建的纳米复合物,当包覆不同层时其粒子平均粒径逐渐增大,分别为19.68±4.3、39.97±5.7、58.59±3.9和86.55±4.2nm,更进一步证明了纳米复合物载体AuCMs/pDNA/pTAT/HA多层自组装体系的成功构建。
实施例5响应型逐层组装纳米金载pDNA复合物递药载体系统的细胞毒性评价
纳米复合物的细胞毒性评价采用MTT法,Hep G2、COS-7、B16F10细胞分别以6×103种于96孔板中,每组设置6个复孔(n=6),在37℃的5%CO2的孵育箱中培养过夜,直至细胞贴壁。去除培养基,分别施加一系列浓度的AuCMs/pDNA/pTAT及AuCMs/pDNA/pTAT/HA纳米复合物,设置不施加处理的空白组以及只施加单纯pEGFP-N1组,LipofectamineTM2000,bPEI(25kDa)为对照组。继续培养24h后,从培养箱中取出96孔板,加入5mg/mL的MTT溶液(20μL)于每个样品孔中,继续避光孵育4h后,小心吸去含MTT的培养液,在每孔中加入150μL的DMSO,将培养板置于微孔板振荡器上震摇30min,使结晶物被充分溶 解。用酶标仪检测各孔的OD值(检测波长为490nm)。计算细胞生成率:细胞存活率(%)=(实验组OD值-空白孔OD值)/(空白对照孔OD值-空白孔OD值)×100。其中以未加任何药品处理的正常培养的细胞为空白对照,以PBS孔为空白组。
采用MTT法测定AuCMs/pDNA/pTAT及AuCMs/pDNA/pTAT/HA在一系列的浓度下对B16F10、Hep G2和COS-7三种不同细胞的细胞毒性,并设置空白组以及对照组。从实验结果(图11)可以得到,对于B16F10和Hep G2细胞,随着所加入的纳米复合物载体的浓度的增加,细胞活性降低。在Hep G2和COS-7细胞,当加入100nM浓度以上的纳米复合物时,其细胞活性反而呈现出略微升高的趋势,可能是由于基于AuCMs纳米复合物在490nm处会有一定的干扰吸收。但是一般进行细胞实验时,浓度不会超过100nM,因此在这个浓度范围不会对以后的细胞实验产生影响。对比是否包覆HA层的纳米复合物,可以发现当包覆HA后(图11中nano-HA代表包覆HA层的纳米复合物),三种细胞的细胞活性均高于未包覆HA层组,主要是由于HA为载体系统提供了一个负电性表面的原因。经实验证实,AuCMs/pDNA/pTAT及AuCMs/pDNA/pTAT/HA的安全使用浓度范围:0~200nM。
实施例6基于Cy3-pDNA模型药物的响应型逐层组装纳米金复合物递药载体系统细胞内追踪定位实验
为了有效评价AuCMs/pDNA/pTAT和AuCMs/pDNA/pTAT/HA纳米复合物在COS-7细胞中的细胞内吞和摄取能力,本实验采用Cy3-标记的pBR322环状质粒载体(Cy3-pBR322的合成方法参照细胞内核酸定位试剂盒的使用说明书)。COS-7细胞以1.0×105细胞/孔接种于confocal专用培养皿中,次日细胞贴壁后,吸取培养基,将1mL新鲜制备好的AuCMs/Cy3-pBR322/pTAT及AuCMs/Cy3-pBR322/pTAT/HA纳米复合物载体加入于培养皿中,以LipofectamineTM2000/Cy3-pBR322复合物作为阳性对照,放入细胞培养箱中15min、2h和4h后取出,去除包含纳米粒的培养基,用冷的PBS洗三次后,加入4%的多聚甲醛(paraformaldehyde,PFA)固定细胞后,用PBS洗涤三次,再以100μL/皿加入事先配制好的Dio溶液,保留15min后小心吸去,用PBS洗三次。再加入DAPI溶液,使DAPI终浓度为100ng/mL,保留10min左右后吸去。再用PBS洗涤,每次10min,用封片液封片后,置于激光共聚焦显微镜下观察,并注意避光操作。
除此之外,用Hep G2细胞,与COS-7细胞相同操作,但将Cy3-pBR322改为pEGFP-N1载体,细胞与AuCMs/pEGFP-N1/pTAT/HA纳米复合物载体共孵育24h后,去除包含纳米粒的培养基,用冷的PBS洗三次后,加入4%的多聚甲醛(0.12M PBS,pH=7.2)固定细胞后,用PBS洗涤三次,再加入DAPI溶液,使DAPI终浓度为100ng/mL,保留10min左右 后吸去。再用PBS洗涤,每次10min,用封片液封片后,置于激光共聚焦显微镜下观察。
通过激光共聚焦结果(图12A)可以看到,分别考察15min、2h、4h细胞摄取实验,可以看到Cy3-标记pBR322vector的红色荧光。单纯施加的Cy3-pBR322质粒DNA在镜下已基本观察不到,仅有少量红色亮点出现在视野内。对于AuCMs/Cy3-pBR322/pTAT/HA纳米复合物,当与细胞的共孵育时间到2h,即可看到有红色荧光分布在细胞膜周围及细胞内部。随着时间的增加,4h后即可观察到大量的红色荧光定位于细胞核。可以从结果中看到,所构建的纳米复合物载体具有好的细胞膜穿透能力以及有效定位于细胞核周围。本实验以Cy3-LipofectamineTM2000为阳性对照,可以看到纳米复合物载体具有非常理想的细胞摄取及细胞核定位效果。并且,在Hep G2细胞的转染实验中发现(图12B),经过24h,在共聚焦激光显微镜下可以看到黑色的AuCMs小黑点分布于细胞内部,从而证明所构建的纳米系统具有理想的细胞内摄效果。
实施例7包覆不同层的AuCMs纳米复合物细胞摄取的TEM实验
Hep G2细胞接种于6孔板中,在含5%CO2温箱中培养过夜,次日观察,当细胞生长达到70%融合后,即可开始实验。去除培养基,分别6孔板中施加AuCMs、AuCMs/pDNA、AuCMs/pDNA/pTAT和AuCMs/pDNA/pTAT/HA复合物,培养基为含有10%FBS的DMEM完全培养基。当继续于孵箱中培养24h后,取出培养板,吸去含药物的培养基,接着用PBS(4℃)洗涤三次,胰酶消化后800rpm离心5min,重复操作2~3次后,将漂洗好的细胞在1,500rpm下离心10min,用针管沿试管壁缓慢加入500μL(4℃)的2.5%戊二醛固定,避免震荡,于4℃冰箱中静置,切片后于TEM下观察。
通过实验结果(图13)所示,Hep G2细胞分别与(A)AuCMs、(B)AuCMs/pDNA、(C)AuCMs/pDNA/pTAT、(D)AuCMs/pDNA/pTAT/HA纳米复合物共孵育24h后,透射电镜下,(A)纳米粒在细胞内聚集成大的团块;(B)、(C)当包覆pDNA以及pDNA/pTAT层后,纳米粒聚集程度有一定的缓减;(D)当包覆最外层HA,纳米复合物负电性的表面能够降低纳米复合物与血清中蛋白的非特异性结合,通过受体介导的内吞进入细胞,在细胞内仍然能够在一定程度上维持较好的分散效果。
实施例8还原响应型逐层组装纳米金复合物递药载体系统HA竞争抑制性摄取试验
首先,为了证明Hep G2和COS-7两种不同的细胞膜表面CD44受体的表达情况,采用了FITC-CD44抗体(鼠抗人)考察其与两种细胞的结合情况。分别将Hep G2和COS-7两种细胞,分别用胰酶消化后,于300g离心10min后,弃去上清,加入PBS重悬后,调整细胞数目至107 个细胞每100μL,分别以相同体积转移至3个1.5mL的Ep管中(n=3),加入10μL的CD44抗体,混匀后避光置于4℃冰箱孵育,10min后取出用1~2mL的PBS于300g离心10min,进行洗涤操作,离心后立即吸出上层清液,最后将细胞重悬于一定体积的PBS(2~8℃)中,避光送流式测样。每种细胞的处理相同。
选取Hep G2和COS-7细胞分别接种于6孔板中,用完全培养基进行培养,次日待细胞贴壁,80~90%融合后,去除培养基,分别更换为含不同浓度游离HA(0、2、5mg/mL)的完全DMEM培养基,37℃下孵育1h后,加入AuCMs/pDNA/pTAT/HA纳米复合物。当培养24h后,去除培养基,用PBS洗3次,胰酶消化后,1000rpm离心3min,重复用PBS洗涤,进行细胞计数。最后,用王水消化法处理细胞,最终样品用去离子水定量稀释后,用ICP-AES检测样品中Au3+的量。
对Hep G2和COS-7细胞进行FITC-CD44摄取效果的流式实验,从结果中可以看到本实验所用细胞Hep G2为CD44高表达细胞,COS-7为CD44低表达。
从而利用两种表达情况不同的细胞,进行HA竞争抑制性摄取实验,从ICP-AES结果(图14)中可以看到对于高表达CD44的Hep G2细胞,随着所加入游离HA的量的增加,AuCMs/pDNA/pTAT/HA有一个明显的摄取抑制趋势,而COS-7细胞的摄取并未受到游离HA的加入而造成影响。低分子量的HA可促进细胞的吞噬功能,该作用是通过细胞受体的介导完成的。因而,可以证明Hep G2细胞摄取AuCMs/pDNA/pTAT/HA纳米复合物,在很大程度上依赖于受体介导的内吞过程。
实施例9响应型纳米金复合物递药载体系统体外细胞转染及响应型转染效果实验
分别选用两种质粒DNA(pEGFP-N1、pGL3)进行实验。
(1)GSH-OEt对AuCMs/pEGFP-N1/pTAT/HA纳米复合物载体转染效果的影响:为了取得较高的转染效率,使用在50代以内的细胞进行实验。一般在转染前24h对细胞再次传代。COS-7和Hep G2细胞接种于6孔板中(1×105细胞/孔),在37℃含有5%CO2的培养箱培养24h,所用培养基为含10%FBS的高糖DMEM培养基。转染时细胞密度一般为60%~80%。分别设置两个对照组A和B,去除培养基,A组:加入1mL含0mM GSH-OEt的培养基,B组加入含20mM GSH-OEt的培养基,于37℃细胞培养箱培养1h后吸去,然后用PBS洗三次。再加入含AuCMs/pEGFP-N1(2μg)/pTAT/HA的完全培养基,放入培养箱中培养6h后,吸去含药物的培养基,然后继续培养48h,期间更换1次新鲜完全培养基。细胞样品经过固定后,用DAPI染色后用激光共聚焦进行观察。
(2)pGL3转染实验:为了定量转染效果,采用pGL3荧光素霉报告基因代替pEGFP-N1质 粒DNA。Hep G2和COS-7细胞分别以5×104细胞/孔,接种于24孔板中,放于细胞培养箱中培养过夜,加入400μL新鲜培养基直至长到80%融合。吸去培养基,用PBS洗两次,分别加入AuCMs/pGL3、AuCMs/pGL3/pTAT、AuCMs/pGL3/pTAT/HA(0mM GSH-OEt预处理)、AuCMs/pGL3/pTAT/HA(20mM GSH-OEt预处理),并设置不施加任何处理的空白对照组和单纯pDNA组,实验中选用市面上可购买得到的LipofectamineTM2000以及25kDa的bPEI(1∶10)为阳性对照组。分别与Hep G2细胞和COS-7细胞共孵育6h后,继续培养48h,每24h更换一次新鲜的完全培养基。用Promega萤光检测系统进行检测,并结合BCA蛋白定量试剂盒,从而得到每毫克蛋白的相对萤光值(RLU/mg protein)。
利用本发明构建的AuCMs/pDNA/pTAT/HA载体系统转染pEGFP-N1进入COS-7细胞,在共聚焦激光显微镜下可以看到一个高的绿色荧光表达效果,并且实验中发现,当加入20mM的GSH-OEt处理细胞后,绿色荧光蛋白的表达更加明显。此实验证明了AuCM/pDNA/pTAT/HA系统的有效转染在一定程度上依赖于细胞中GSH的浓度,只有给予一定的GSH时,致使含有二硫键骨架结构的pTAT多肽断裂成小片段,才能释放出其内所包载的pDNA,达到高效表达(图15)。
采用荧光素霉报告基因载体系列PGL3,为定量具有调节哺乳动物基因表达潜在能力的各种因子的活性提供了一个分析基础。这些可以是顺式或反式作用因子。经重新设计,PGL2荧光素霉报告基因载体系列的骨架成为了PGL3系列载体骨架,提高了表达量。实验发现,当施加20mM的GSH-OEt时,所构建的AuCM/pDNA/pTAT/HA载体系统对Hep G2细胞的转染效果要高于两组阳性对照组,结果如图(图16)。
实施例10响应型纳米金复合物递药载体系统体内分布实验
雄性的Balb/c小鼠5~6周龄,实验前称重挑选重量为21g左右,称重后尾静脉注射0.2mL的AuCMs/pDNA、AuCMs/pDNA/pTAT、AuCMs/pDNA/pTAT/HA三种纳米复合物溶液为实验组,并以PBS作为空白对照(n=4)。继续正常饲养24h后60min乙醚麻醉,心室灌注生理盐水30min,处死。分别取出心、肝、脾、肺、肾于PBS溶液中浸泡,洗涤干净后用滤纸吸净多余水分,称量每份组织样品的质量。在用王水消化法前,先用手术剪将组织样品剪碎形成靡桨状,用10mL新鲜制备的王水(1体积的浓硝酸和3体积的浓盐酸混合而成)分别消化处理。在电炉上加热直至溶液变为澄清,消化过程中溶液样品一直处于微沸状态,消化液与样品能够充分混合,避免了温度过高,引起溶液的暴沸,造成样品损失。同时,较长的消化时间又能使沉淀物中的重金属元素充分溶解于消化液中,保证了样品消化的稳定性和可靠性。再分别加入10mL50%HCL和10mL50%的HNO3。过滤后,加入一定量的去离子水,使每个 样品最终体积为50mL,ICP-AES测定样品Au3+浓度。
纳米复合物体内分布实验通过ICP-AES检查样品中Au3+的含量进行计算。如结果(图17)所示,经过计算,大多数的纳米复合物有50%~80%均富集于肝脏中,而其他组织中仅见较少的分布。对于AuCMs纳米粒,也可以见到一个高的肝脏富集效果,其主要归功于纳米尺寸物质被单核巨噬细胞系统摄取的一个被动靶向效果。当对比AuCMs/pDNA(5μg)/pTAT/HA与AuCMs/pDNA(5μg)/pTAT,从结果中可以看到,HA最外层的加入,能够在一定程度上提高纳米复合物在肝脏中的分布,其效果可能要归功于HA所提供的负电性表面以及其与肝脏细胞膜表面特异以及非特异的受体结合所致。
以上所述实施例仅表达了本发明的实施方式,其描述较为具体和详细,但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是,对于本领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明构思的前提下,还可以做出若干变形和改进,这些都属于本发明的保护范围。因此,本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
Claims (10)
1.一种逐层组装纳米金复合物递药载体系统,其特征在于,该递药载体系统包含:
半胱胺修饰的纳米金核心,其表面带有氨基正电荷;
带负电性的模型药物,其通过吸附包覆于半胱胺修饰的纳米金核心表面,形成模型药物层;
含有二硫键骨架结构的聚阳离子穿膜多肽,其通过吸附包覆于模型药物层表面,形成还原响应释放层。
2.根据权利要求1所述的逐层组装纳米金复合物递药载体系统,其特征在于,所述还原响应释放层表面还修饰有透明质酸。
3.根据权利要求1或2所述的逐层组装纳米金复合物递药载体系统,其特征在于,所述半胱胺修饰的纳米金是由氯金酸、盐酸半胱胺氢氯化物和硼氢化钠经反应制备而成。
4.根据权利要求1或2所述的逐层组装纳米金复合物递药载体系统,其特征在于,所述还原响应释放层的聚阳离子穿膜多肽,是由SEQ ID0NO.1所示氨基酸序列的多肽单体经氧化聚合反应,在多肽单体两端形成Cys-Cys连接而制成的含多个二硫键的聚TAT多肽。
5.根据权利要求2所述的逐层组装纳米金复合物递药载体系统,其特征在于,所述递药载体系统的粒径为100~300nm。
6.一种逐层组装纳米金复合物递药载体系统的制备方法,其特征在于,包括以下步骤:
将氯金酸溶液和盐酸半胱胺氢氯化物溶液混合后,加入硼氢化钠水溶液反应,得半胱胺修饰的纳米金;
合成阳离子穿膜多肽,将该多肽溶于磷酸盐缓冲溶液,再加入二甲基亚砜反应,制得含有二硫键骨架结构的聚阳离子穿膜多肽;
将半胱胺修饰的纳米金原液,滴加入带负电性的模型药物溶液中,混合,得半胱胺修饰的纳米金核心包覆负电性模型药物层的纳米金复合物,再加入含有二硫键骨架结构的聚阳离子穿膜多肽,混合,离心洗涤,得表面包覆有聚阳离子穿膜多肽的纳米金复合物递药载体系统。
7.根据权利要求6所述的制备方法,其特征在于,还包括步骤:在表面包覆有聚阳离子穿膜多肽的纳米金复合物中,加入透明质酸溶液,共孵育,离心洗涤,得表面修饰有透明质酸的逐层组装纳米金复合物递药载体系统。
8.根据权利要求6或7所述的制备方法,其特征在于,所述阳离子穿膜多肽的序列如SEQID NO.1所示。
9.权利要求1或2所述的逐层组装纳米金复合物递药载体系统在制备肝靶向药物中的应用。
10.权利要求1或2所述逐层组装纳米金复合物递药载体系统在制备基因治疗药物中的应用。
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