CN102861340A - 智能型纳米递送系统、制备方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种可以向细胞输送生物大分子和有机小分子的智能型纳米粒药物释放系统、其制备方法及其在生物大分子和有机小分子（包括药物 ) 细胞输送的应用。通过递送药物分子、细胞营养及细胞排毒的生物化学物质 , 达到干预生理和病理代谢的目的。应用本发明投递分子的实施例包括但范围不限于以下分子 :(1) 端粒酶 (Telomerase) 细胞投递； (2) 抗氧化酶 [ 如：超氧化物歧化酶 (SOD) 、过氧化氢酶 (HPX) ，等 ] 细胞投递； (3) 抑癌蛋白（如： p53 、 PTEN, 等）细胞投递； (4) 有机化学和生物化学小分子 [ 如：阿托伐他汀（ Atorvastatin － 立普妥）、辅酶 Q-10, 等 ] 细胞投递。本发明涉及的纳米粒药物输送系统的分子缓释和控制具有独特性和靶向性， 故称“智能型纳米粒”。

Description

智能型纳米递送系统、制备方法及其应用

技术领域

本发明涉及生物大分子和有机小分子（包括药物 ) 细胞输送的一个智能型纳米递送系统，其制备方法及在药物细胞输送中的应用。本发明进一步提供一个细胞输送的纳米技术平台。

背景技术

人类端粒酶逆转录酶 (hTert) 是一个催化亚基或催化分子实体。已经证明这个催化亚基能够同时组合成端粒酶全酶，即：在人类细胞内组合成的全酶和另一个 RNA 成份 (hTert) 的复合体。人类端粒酶逆转录酶的蛋白成份 (hTert) 是一个催化分子亚基。实验表明 , 这个亚基可以同时和 RNA 成份 (hTert) 组成一个全酶。在自然界，端粒酶可以通过延长染色体末端的端粒修复染色体 DNA 。不正常长度的端粒或端粒加速缩短在一系列与年龄有关的疾病中扮演着重要的病理角色，比如：原因不明的肺部纤维化、先天性角化不良、皮癣、动脉硬化、骨质疏松、眼睛视网膜黄斑退行性病变。正常的端粒变短在人类和动物衰老过程中扮演着重要的角色。科学家认为：端粒酶可以减缓某些疾病的病情，如上述疾病。可见 , 投递端粒酶作一个药物分子对减缓以上病理现象具有很大的潜力 , 开发端粒酶药物有望带来一个新的药物研发方向 , 可能会导致新药物的开发，第一次能够治疗一些以往认为的不治之症。

端粒酶被普遍认为是一个非常有用的治疗疾病的生物大分子，是治疗性药物蛋白质。同时，临时性 / 短暂性的细胞稳定态 ( 无细胞凋亡 ) 是在 hTert 端粒酶蛋白亚基在培养皿细胞中观察到的，细胞的永久性生存可以安全的转移到活体内 ( 美国专利 6,358,739) 。后来科学家还建议这个细胞不老化概念可以用于人体组织、器官、系统甚至整体。尽管投递端粒酶来治疗疾病的前景令人向往并具潜力，但由于目前基因投递的局限性限制了实际使用端粒酶治疗疾病的可能性。

从药物研发和创新的角度来看，一种安全有效投递端粒酶或端粒酶催化亚基 (hTert) 进入细胞的实用方法急需开发 , 这种创新的投递方法将有助于减缓与年龄有关的严重疾患。一种安全、有效投递这些特殊类别的酶可能通过使用具生物降解、生物兼容特点的纳米粒来实现。研究已经观察到：在投递大分子和酶到细胞内时由乳酸和羟基乙酸双聚合而成的生物降解性纳米粒 (PLGA) 能携带这些酶迅速 ( 少于 10 分钟 ) 逃离溶酶体，从而保护酶分子不被溶酶体消化和破坏。

生物降解性纳米粒实验表明：能用于以一种慢速率向细胞内投递一系列有疗效的生物大分子，如：蛋白质和小分子量的药物，如：地塞米松，可带来持续性的治疗效果。相反，投递的分子可以通过生物工程的手段来实现快速释放。尽管多肽能穿透细胞，如： VP22 已经在细胞水平证明可作为一个有效地投递端粒酶亚基 (hTert) 基因 ( 美国专利： 6,358,739) 的方法。在药物和基因投递方面，与其它聚合物载体相对比 , 聚乳酸 - 羟基乙酸共聚物（ PLGA ）纳米粒载体具有诸多优势，包括生物降解性、生物兼容性，并被美国食品和药物管理局批准用于人体药物投递。聚乳酸 - 羟基乙酸共聚物（ PLGA ）纳米粒在科学界、医疗和药物开发领域已经被广泛、深入地研究过，被认为是一种非常可靠的方法来持续性向细胞内投递生物大分子。

蛋白质被包封在纳米粒内的过程还没有变成一个非常简单和容易重复的科学过程，蛋白质的投递在成功之前需要大量的研发工作和优化工作，因为每一个蛋白质的分子量、疏水性和稳定性都不一样。本质上来讲，每一类蛋白质以纳米粒方式投递需要特定的研发手段，从小规模到大规模，最后到临床试验，以验证纳米粒的可行性，同时研究和开发出合适的配置方法。

一个蛋白质是否代表一种新的药物，主要是由其分子大小而决定。正确的纳米粒配置方法，主要是由蛋白质的稳定性、分子量和水溶性来决定。端粒酶 (hTert) 的蛋白成份有 1,132 个氨基酸，分子量是 126,997 道顿，从生物学的角度的说是一个异乎寻常大的分子，而完整的端粒酶总和的分子量将近翻倍。端粒酶通常认为非常不稳定，并且仍不知道端粒酶是否能够成功地包裹在 PLGA 纳米粒里，以活性功能状态下投递到细胞内。基于端粒酶的不稳定性，尤其是需要穿透细胞核的核膜，目前还没有足够科学研究能把有活性功能的端粒酶投递到细胞内的过程简单化。必须能够证实：一旦投递到细胞核内，一定能够延长人类染色体末端的端粒。

本发明展示了一种包封人类端粒酶的纳米粒方法及其组成成份，端粒酶蛋白质亚基 (hTert) 和它的 RNA 亚基 (hTR) ，以及一些其它的变种，能被包封在有生物降解性的聚乳酸 - 羟基乙酸共聚物 (PLGA) 纳米粒内，从而投入到细胞内部，包括培养皿内的细胞和活体动物细胞。由于纳米粒的降解性，投递之后纳米粒能释放出端粒酶出来，并以一种持续性疗效方式能成功地延长细胞核内的端粒区。

心肌梗塞或大脑中风是一种心脏或大脑功能的突然丧失，是由通向心脏或大脑的血流受阻而导致的心脏或大脑突然缺血而造成的。心脏或脑缺血后 , 心脏和大脑的破坏有多种因素参与。研究表明 , 在这些因素中 , “氧化压力”在心脏或大脑缺血过程中扮演着非常重要的角色。氧化压力通常是由于细胞内过量产生的超氧化物离子 , 过氧化氢或其它含氧自由基导致的，这些超氧化物离子或过氧化氢可转化成具有对细胞具有强破坏能力的氧化剂。例如：羟基自由基和过氧化氮自由基。通常情况下，体内自由基的生产非常有限，通过超氧化物歧化酶和过氧化氢酶这些自由基清道夫将自由基代谢或中和。但是，在一些病理情况下，氧自由基会累积，这种累积可以破坏细胞，比如：在脑部缺氧、缺血的状态下，自由基大量累积可以达到对脑细胞的损害。

另外，脑缺血之后的再灌注也产生自由基，即血栓去除后血液恢复供应会产生过多的自由基，从而导致对脑部的损害。大脑对氧化压力引起的破坏是非常敏感的，因为在大脑内含有大量的不饱和脂肪酸，相对低的神经组织中的抗氧化酶来抵抗或中和自由基造成的危害。科学研究表明 , 自由基和相关反应活性的氧气分子参与了大脑组织的破坏，这些破坏是在暂时性大脑缺血后产生的。同时，过氧化物歧化酶和谷胱甘肽的活性在脑中风的病人中相对于对照组显著下降，缺氧面积的大小、大脑受破坏程度、短期的预后都与这些酶的活性有直接关系。这些研究表明 , 过氧化物离子、过氧化氢和一些其它过氧离子是主要有反应性的氧化自由基 , 在缺氧造成的脑组织损伤中扮演重要角色。

天然的自由基清道夫如过氧化物歧化酶或过氧化氢酶，它们的特点是在对抗氧化剂方面有非常高的稳定性和效率。这两种酶以天然形式已经使用来预防氧化性破坏，但是研究发现：只有重复地给予这些酶或对局部细胞、组织投递这些酶才有治疗效果。一般的靶向投递或不太理想的药物动力学限制了这些酶的使用。向大脑投递过氧化物歧化酶，通过使用原 ( 前 ) 药或载体系统如：抗体、微脂囊和表面修饰 , 如 : 聚乙二醇与过氧化物歧化酶结合体 (SOD-PENG) 等方法均已经尝试过。但是，脑部缺血和血液再灌注造成的损伤治疗一直受到限制，因为这些物质对大脑细胞的穿透力太差。基因疗法是另外一种投递方法，但是基因投递到脑细胞组织后 , 基因的表达速度较慢，并不能立即发挥作用。

p53 是一种抑制肿瘤生长的基因。在人类可染的癌症中，出现该基因突变的临床比例已经过半。经过这种基因编码的蛋白质（ p53 蛋白）是一种转录因子，控制着细胞周期的启动。 p53 蛋白是接收许多有关细胞代谢信号的重要生物分子。例如：关于是否开始细胞分裂就由 p53 蛋白来决定。如果细胞内 DNA 受损，且不能得到修复， p53 蛋白将参与启动过程使该受损细胞进入凋亡和死亡。有 p53 蛋白分子缺陷的细胞则没有这种控制能力，甚至在细胞不应繁殖和生长的情况下继续进行细胞分裂。正如其它抑癌因子一样， p53 在正常情况下对细胞分裂起着监视的作用。细胞中抑制癌变的 p53 能判断 DNA 变异的大小，如果变异较小， p53 促使细胞自我修复 ; 若 DNA 变异较大， p53 诱导细胞凋亡。

蛋白主要分布于细胞核浆，能与 DNA 特异结合，其活性受磷酸化、乙酰化、甲基化、泛素化等翻译后修饰调控。 p53 基因是迄今发现与人类肿瘤相关性最高的基因。现已认识到，引起肿瘤形成或细胞转化的 p53 蛋白是 p53 基因突变的产物，是一种肿瘤促进因子，它可以消除正常 p53 的功能。而野生型 p53 基因是一种抑癌基因，它的失活对肿瘤形成起重要作用。“ p53 基因疗法”是中国和世界创新药物发展历史上的一个重要里程碑 , 但与其不同的是，本发明通过使用抑癌蛋白分子，如 p53 蛋白 , （而不是 p53 DNA) 作为药物，聚乳酸 - 羟基乙酸共聚物（ PLGA ）或其它聚合物纳米粒（而不是基因工程改造过的活病毒 ) 作为 p53 或其它蛋白分子药物输送载体，提供了一种全新的“抑癌蛋白纳米粒疗法”，用于治疗恶性肿瘤和其它与抑癌因子基因突变或功能低下有关的疾病。

以商品名立普妥由辉瑞公司营销的阿托伐他汀药品属众所周知的他汀类药物，用于降低血液胆固醇浓度。该药物通过抗炎症和其他机制具有稳定血栓和预防中风的作用。与所有他汀类药物相似，阿托伐他汀作用于抑制在肝组织内发现的 3- 羟基 -3- 甲基戊二酰辅酶 A(HMG-CoA) 还原酶，该酶在人体胆固醇的合成中起关键性作用。立普妥是治疗异常血脂市场中遥遥领先， 2007 年的销售量比 2006 年增加 4.7% ，达 135 亿美元。立普妥的成功主要源于三方面因素：倾向用于早期血脂异常，达到积极的治疗性干预；立普妥卓杰的治疗效果；由辉瑞公司以其品牌效应支持下的积极并精良酝酿的市场推广。尽管市面上有几种非专利他汀类药物，但立普妥对重度异常血脂且没有其他高危因素病人更有成本 - 效果，没有任何一种药物象立普妥那样针对中度到重度病人提供如此宽大的有效剂量范围，也没有象 ASCOT 试验表明如此快速有效地控制血脂。其结果，立普妥提供医生几乎是单一药物的解决方案，而且被证明相当的普及。

立普妥属合成降脂类因子。阿托伐他汀是 3- 羟基 -3- 甲基戊二酰辅酶 A (HMG-CoA) 还原酶的阻滞剂。该酶催化 3- 羟基 -3- 甲基戊二酰辅酶转化为甲羟戊酸根，是胆固醇生物合成一个早期和限制合成效率的步骤。阿托伐他汀钙一个复杂的庚酸钙盐，并与三个水分子结合，阿托伐他汀钙的分子式为： (C₃₃H₃₄FN₂O₅)2Ca • 3H₂O ，其分子量为 1209.42 ，分子结构如上图所示。

阿托伐他汀钙呈白色结晶粉末，在酸碱度 pH 为 4 及以下的水溶液不能溶解。阿托伐他汀钙在蒸馏水、酸碱度 pH7.4 磷酸缓冲液和乙腈溶液中溶解度都非常低，而在甲醇中则完全溶解。鉴于立普妥在以下药物动力学方面仍颇有缺欠，如：生物利用效价仅 12% 、体内半衰期 14 小时、需要肝聚合酶链反应；同时立普妥的分子量达 1209.42 ，避免纳米粒配制过程预载可能发生隙漏；本发明将阿托伐他汀药物包裹在生物降解、生物兼容的多聚体纳米粒之内，以改进阿托伐他汀上述药物动力学的指标。该设计的阿托伐他汀制作工艺，可以提供口服剂型和静脉注射剂型的广谱药物，在定量的无菌缓冲液中配制为纳米粒悬液。预期效果：

1 、提高阿托伐他汀钙的药物生物利用效价；

2 、延长药物体内半衰期，改善体内药物有效作用浓度持续状态；

3 、减少药物投递剂量，降低副作用风险；

4 、在减少药物剂量的前提下，仍然获得满意的临床治疗效果，即在配合饮食和运动下的降胆固醇作用达 30-50% ( 立普妥的原有效果 );

5 、提供稳定、方便、有效、安全的降胆固醇新产品。

另外，由于立普妥可造成一些常见的不良反应 ( 副作用 ), 如 : 胃肠道不适、头痛、皮疹、头晕、视觉模糊、味觉障碍及血氨基转移酶可逆性升高，所以，基于本技术发明开发出的新产品的目标是配制时间调控释放的药物分子，延长有效成份的体内半衰期、提高生物利用效价、改善药物的有效性和减少其对肝脏或其它器官的副作用，最终显著地减低药物和治疗的成本。

发明内容

本发明涉及“智能型纳米粒”药物输送系统的设计和制备，并涉及以该系统为运送载体向活细胞投递纳米化药物分子的方法和组成成份。应用本专利技术可以投递的分子包括但不限于以下药物分子： (1) 端粒酶， (2) 抗氧化酶 , (3) 抑癌蛋白 , (4) 有机化学和生物化学小分子 , 如：阿托伐他汀 ( 药物商品名：立普妥 ) 和辅酶 Q-10 。

本发明的技术方案可以表示如下：

一种具有定向专一递送（靶向性）并可持续、定量释放活性药物的纳米药物释放系统，其特征在于，该系统包括作为活性药物的治疗性活性肽或其它生物大分子或有机小分子（包括药物 ) ，及至少一种生物降解性多聚物，一种惰性塑化剂，及用于组织、细胞准确专一传递的靶向分子定位部分。

所述生物降解性多聚物可以是下述中的任何一种物质或几种不同物质之间的组合：聚乳酸 - 羟基乙酸共聚物，聚乳酸，聚亚烷基二醇，聚丙烯酸正丁酯，甲基丙烯酸甲酯与甲基丙烯酸共聚物，聚烷基胺，聚酸酐，聚羟基丁酸和聚原酸酯。

所述专一定向递送的靶向分子定位部分可以是氨基酸序列 HIV-1 TAT 穿透肽 YGRKKRRQRRR ， YARAAARQARA,GRKKRRQRRR,YARKARRQARR,YARAARRAARR,YARAARRAARA,YARRRRRRRRR,RQIKIWFQNRRMKWKK, 或 GWTLNSAGYLLGKINLKALAALAKKIL 。

所述一种实现持续释放活性物质有效剂量的方法包括给与受治疗者上述的纳米药物释放系统，从而在受治疗者体上实现持续释放有效剂量的活性物质。

所述一种实现定量释放活性物质有效剂量的方法包括给与受治疗者上述的纳米药物释放系统，从而在受治疗者体上接受一定有效剂量的活性物质。

所述的惰性增塑剂可以是 L- 酒石酸二甲酯、柠檬酸三乙酯或三醋酸甘油酯。

所述的作为活性药物的治疗性活性肽可以是转录后未化学修饰或已化学修饰的寡肽、多肽、蛋白质、酶分子（包括这些分子的亚基和／或辅基）。

所述的作为活性药物的治疗性活性其它生物大分子可以是核酸类、多糖类、脂肪类或纤维类。

所述的作为活性药物的治疗性有机小分子可以是化学合成小分子药物类、天然小分子药物类或天然生物有机小分子。

靶向分子定位部分的氨基酸序列如 HIV-1 TAT 穿透肽 YGRKKRRQRRR 化学共价偶联于纳米粒上，其特征在于，包含以下步骤：

a.40 毫克载药纳米粒子分散在 4 mL 的硼酸盐缓冲液中（ pH5.0 ）， 12 毫克 DENACOL^®524 （五环氧树脂）溶解在等体积的硼酸盐缓冲液 ​​ ，将两者混合，由四氟硼酸锌作为催化剂，于 37 ° C 条件下反应进行 30 分钟，并轻轻搅拌，未反应 DENACOL^®524 用超速离心分离，将之与纳米粒分开 , 再用硼酸盐缓冲液对纳米粒冲洗一次；

b. 环氧活化的载药纳米粒首先悬浮于硼酸缓冲液中，然后与 TAT 短肽混合在 4 毫升硼酸盐缓冲溶液内，在 37 ° C 的条件下，反应进行 30 分钟，未参与反应的 TAT 短肽经超速离心分离，分开清除，纳米粒反复用清水洗干净。

本发明提供了递送有效剂量端粒酶或其催化亚基或上述两种物质之变种复合物从而治疗人类衰老疾病的方法。该方法有以下步骤组成：人类重组端粒酶或 hTert 蛋白的 PLGA 纳米粒通过使用一种双乳化溶剂蒸发技术制备而成；端粒酶全酶和端粒酶 hTert 催化蛋白亚基分别被包封在具生物降解性的 PLGA 聚合物中，制备成纳米粒；转染人类成纤维细胞后端粒酶成份缓释，治疗性地延长细胞染色体端粒的长度。

一种治疗人类衰老疾病的方法，其特征在于，所述的方法是使用上述任一的纳米粒作为端粒酶分子载体，通过口腔服用，动脉或静脉注射，皮肤表面涂用或其它常见的普通药物投递方法向需要治疗的患者提供，达到逆转或减缓一种或多种与“端粒变短”相关的生命衰老疾病。

本发明提供了向活体递送有效剂量活性超氧化物歧化酶或其它抗氧化酶或若干种抗氧化酶物质的混合物的方法，从而治疗和预防与急性或慢性自由基过量产生有关的人类疾病，包括但不限于心血管疾病、中风、癌症、糖尿病、自身免疫性疾病、风湿性关节炎、老年痴呆症、帕尔金斯症、过敏、哮喘、红斑狼疮、皮肤癣和白癜风。所述的方法是使用上述任一的纳米粒作为抗氧化酶分子载体，通过口腔服用，动脉或静脉注射，皮肤表面涂用或其它常见的普通药物投递方法向需要治疗的患者提供，达到治疗或预防一种或多种与“自由基过量产生”相关的炎症疾病或人体衰老。

本发明提供向活体递送一种或几种有效剂量抑癌蛋白，如 p53,p16,pRb,PTEN,WT1 蛋白 , 等，从而治疗癌症或其它细胞繁殖失控疾病的方法。该方法中，纳米粒的制备步骤是：

a. 聚乳酸 - 羟基乙酸共聚物（ PLGA ）（ 30 毫克 ; 50:50 ，固有粘度 1.30 ）溶解于 1 毫升氯仿中， 3 毫克酒石酸二甲酯（ DMT 的或酒石酸二酯，密度 1.2 克 / 毫升）溶解在上述聚合物溶液， 10 毫克大鼠血清白蛋白（ RSA ）和 20 微克 p53 蛋白溶解于 300 微升水中；

b. 在下列实验条件下：涡旋 1 分钟，超声分散 2 分钟，能量输出 55 瓦，用探针超声仪将蛋白质溶液和 PLGA 溶液乳化在一起，由此产生的乳液，在与上述完全相同的实验条件下，进一步乳化在 12 毫升的 2 ％ PVA 溶液中（ PVA 平均分子重量 30,000-70,000 ）， PVA 溶液在使用之前，要通过 0.22 微米注射器的过滤和用氯仿饱和；往 PVA 溶液中加入几滴氯仿，摇动，上清液用于纳米粒的制备， p53 蛋白纳米粒的冷冻干燥过程、包封率、纳米直径大小测定、 Zeta 电位均与本发明权利要求 1 所述相同。

本发明的方法可以通过口腔服用，动脉或静脉注射，皮肤表面涂用或其它常见的普通药物投递方法向需要治疗的患者提供，已达到逆转或减缓一种或多种疾病与“细胞繁殖失控”相关的恶性肿瘤、冠心病等。

本发明还提供向活体递送辅酶 Q10 从而治疗或预防因辅酶 Q10 缺少造成的疾病的方法，辅酶 Q10 纳米粒是通过使用乳化扩散蒸发技术来制备完成的，其步骤是： 50 毫克 PLGA （ 50:50 ）和 5 毫克辅酶 Q10 溶于 2.5 毫升乙酸乙酯在室温搅拌 30 分钟，有机相逐滴（ 1.0 毫升 / 分钟）加入 5 毫升含有稳定剂的水相。乳液的液滴体积缩小由高速均质机（转速： 10000 rpm ，时间： 15 分钟）均质化完成，由此产生的乳液倒入 25 毫升的水中，并不断搅拌，从而产生纳米沉淀物和纳米粒的形成。纳米粒悬浮液在不同的离心速度和离心时间条件下（ 15000 g ， 5 分钟； 25000 g ， 40000 g ， 15 分钟）重新收集水洗涤过的纳米粒，然后再悬浮在水中，此过程重复 3 次以去除多余的表面活性剂，然后冷冻干燥最后收集辅酶 Q10 纳米粒。

本发明提供一种递送有效剂量向活体递送阿托伐他汀（ Atorvastatin － Lipitor ）用于降低血液胆固醇浓度 , 通过抗炎症和其他机制 , 稳定血栓和预防中风的方法，阿托伐他汀纳米粒是通过使用乳化扩散蒸发技术来制备完成的。该方法中，纳米粒的制备步骤是：

a. 其步骤是 : 牛血清白蛋白 -FITC （ BSA-FITC 标记）被选定为代理蛋白封装物质是因其具备优异的理化性质和荧光信号，用 FITC 荧光标记的蛋白质与 PLGA 包封在一起的纳米粒是通过一种新型的双重乳化溶剂蒸发技术来制备完成的；

b.FITC 荧光标记的蛋白质溶于 200uL PBS 缓冲溶液或 0.01 N 盐酸溶液中，然后，将其加到聚合物溶液（含 30 毫克 PLGA 50:50 ，固有黏度 1.32 dL / g （ Lactel ^{（ R ）} 产品） / 1 mL 二氯甲烷（ DCM ）或 27 毫克 PLGA 和 3 毫克酒石酸二甲酯（ DMT ） / DCM 的 1 毫升），涡旋混合，使用超声仪 3000 和微探针进行乳化，在冰上乳化 2 分钟，探针设置位置为 3 （ Misonix ）；

c. 乳液加入 6 毫升用 DCM 饱和过的聚乙烯醇（ PVA ）溶液（ 2 ％ w/v PBS 缓冲溶液），涡旋形成双乳液，在冰上用超声波能量（设置强度为 3 ）处理 5 分钟，由此产生的双重乳液在化学通风柜内室温下搅拌 18 小时，然后在真空状态下搅拌 1 小时，最终蒸发掉 DCM 残留物；

d. 由此形成的 PLGA 纳米粒通过超速离心分离获得样品（ 100,000 RCF ， 20 分钟， 4 ° C ， WX80 超速离心机 , 使用转子 T-865 ），相应的上清液保留，为后续蛋白质包封效率分析使用；

e. 纳米粒子通过吸管和超声波使之悬浮于 10ml PBS 缓冲溶液中，重复两次以上超速离心和悬浮步骤以便清除 PVA 残留物和未能包裹到纳米粒中的蛋白质；

f. 纳米颗粒溶解在 5 毫升无菌、无核酸酶的水中，分装到预先称重、无菌试管中进行冷冻（ - 80 ° C ）和冻干，获得干粉制备产物并称重。

通过口腔服用或静脉注射向需要治疗的患者提供，以达到逆转或减缓与人体血液胆固醇超标有关的一种或多种疾病的作用。

在前述的药物释放系统中，其所述活性药物为端粒酶。

在前述的药物释放系统中，其所述活性药物为抗氧化酶。

在前述的药物释放系统中，其所述活性药物为抑癌蛋白。

在前述的药物释放系统中，其所述活性药物为阿托伐他汀。

在前述的药物释放系统中，其所述活性药物为辅酶 Q10 。

投递的端粒酶涉及到端粒酶亚基 (hTert) 及其变种。这种酶或其变种是在使用聚乳酸－羟基乙酸共聚物对其进行包封，然后通过口腔、皮肤或静脉注射到人体内，在用于大脑时还可以通过开颅将其直接注射，或经颈动脉、颈内静脉注射以治疗疾病。该疾病或状态是与端粒变短有关系，包括但并不仅限于以下疾病：原因不明的肺部纤维化、先天性角化不良、再生障碍性贫血、动脉粥样硬化、视黄斑萎缩、肝硬化、关节炎、老年痴呆、糖尿病、皮肤皱纹、白发，以及能通过这种方法治疗的与年龄有关的任何疾病。在专利的某些实施部分，所投递的酶是整个端粒酶，包括蛋白质部分和 RNA 部分 (hTert 和 hTR) ，其它实施过程仅仅是蛋白质亚基 (hTert) 。在本专利实施方案里，纳米粒主要是由生物降解性的多聚物，如聚乳酸 - 羟基乙酸共聚物 (PLGA) 。这些纳米粒也可以由一下不同化合物组成：多聚乳酸、聚乙二醇、聚氰基丙烯酸丁酯、聚甲基丙烯酸甲酯、聚烷基胺、聚酸酐、聚 -3- 羟基丁酸、聚己內酯多元醇、丙交酯 - 己内酯聚合物、聚羟基丁酸酯、聚氰基丙烯酸烷酯、聚原酸酯，或是上述某两种或多种聚合物的混合物。在另一些实施方案中，纳米粒可能包含有一个“靶向投递分子”或“塑化剂” , 如：酒石酸二甲酯、柠檬酸三乙酯、三醋酸甘油酯，促进端粒酶从纳米粒中持续性释放。纳米粒含有主要结构组成成份以促进纳米粒有效地通过细胞膜。非主要结构组成成份的化合物加入纳米粒中以改变纳米粒的特点，如 : 纳米粒内药物分子的释放速度 , 纳米粒的靶向投递 , 及纳米粒的细胞内、外定位，等。一种塑化剂可以加入纳米粒内，改变蛋白质或其它类型药物分子释放的特征或可续性。除上述三种塑化剂 ( 酒石酸二甲酯、柠檬酸三乙酯、三醋酸甘油酯 ) 之外，还可以考虑使用市场上一系列其它塑化剂。一种靶向投递的化学分子可以加到纳米粒内，从而增加细胞对药物分子的吸收率，同时可以改进纳米粒投递到特定种类细胞的精确度，或令纳米粒到达细胞中的特定亚细胞结构内。

本发明同时还提供了一种独特有效的治疗脑中风缺血和血液再灌注后造成的脑组织损伤的方法，该方法核心是投递有效剂量的高活性生物酶大分子抗氧化剂。这些抗氧化酶被包封在纳米粒内作为重要药物成份 , 通过颈动脉或颈内静脉注射 , 纳米粒穿越血脑屏障，释放出抗氧化酶，通过特异和高效地清除由大脑血液再灌注产生的过量氧自由基，抑制细胞和组织炎症的发生，最终抑制脑细胞和组织的损伤 , 达到保护大脑的结构和功能的目的。在该特定的纳米粒制作方法中，抗氧化剂可以是一个抗氧化酶，如：超氧化物歧化酶、过氧化氢酶、谷胱甘肽过氧化物酶、谷胱甘肽还原酶、谷胱甘肽转移酶 , 等。同时，被包封的分子也可以是小分子抗氧化剂，如：维生素抗氧化剂、乙基水杨酸、醣类、精氨酸、丙酮酸，或者是这些抗氧化剂的不同组合。在纳米粒制备的配方中，纳米粒载体内含生物降解物质，如：乳酸 - 羟基乙酸共聚物 (PLGA) 、多聚乳酸、烯乙二醇、聚氰基丙烯酸丁酯、聚甲基丙烯酸甲酯、聚烷基胺、聚酸酐、聚 -3- 羟基丁酸、聚己內酯多元醇、丙交酯 - 己内酯聚合物、聚羟基丁酸酯、聚氰基丙烯酸烷酯、聚原酸酯，或者是上述两种或几种聚合物的混合物。为了让纳米粒药物输送体系成为“智能型纳米粒”，本发明提供了将纳米粒“智能化”的方法，即对纳米粒进行化学修饰 , 以使纳米粒细胞投递具有靶向性和定位能力。另外，一些塑化剂，如酒石酸二甲酯、柠檬酸三乙酯三、醋酸甘油酯等能够帮助抗氧化剂从纳米粒中持续地释放。

在特殊的纳米粒制备过程中，一个纳米粒可以由聚乳酸 (PLA) 和聚乳酸羟基乙酸 (PLGA) 共同组成。有相关技术经验的人员应该能够优化这些特殊聚合物比例配置。在目前的技术条件下，任何合适的比例配置均可以实现。一般来讲，一个纳米粒的大小可以是在 1-1000 纳米之间，更理想的是 1-100 纳米之间。如果的纳米粒大小超过 100 个纳米可能会导致炎症反应，所以将纳米粒的大小控制 100 纳米以下是比较理想的。本发明涉及的纳米粒可以进一步包含一个聚合物，以改变纳米粒的电子负荷，或影响其亲水性和疏水性。任何生物兼容性的疏水多聚体都可以用于此目的，包括聚乙烯醇 (PVA) 。肝脏内纳米粒的聚集是一个经常遇见的问题，因此改变影响纳米粒亲水性和疏水性的电荷 , 对有效投递纳米粒相当重要。

为进一步提高蛋白分子的投递效果和药物效果，本专利发明所涉及的纳米粒可以包括一个靶向投递的分子，如蛋白质传导多肽。在这个专利发明中所采用的靶向投递多肽分子可以使任何靶向投递分子结合到纳米表面，促进纳米粒转移到靶向组织 , 这种有靶向的聚合物可以是蛋白、多肽或小分子。一系列的蛋白质传导部位，如 HIV-1 的 Tat 转移因子、果蝇内的转录分子和单纯疱疹病毒 VP22 蛋白已被证明可以促进蛋白质分子进入细胞内。进一步讲，富含精氨酸的多肽类、多聚赖氨酸的多肽类包括 Tat PTD, Pep-1 、热休克蛋白 70(HSP70) 及其蛋白片段等，都适合于将纳米粒专一地投递到细胞内。通常认为帮助纳米粒通过细胞膜的这种转移部位往往具有强碱性，与细胞膜具有强的相互作用，从而进入细胞内。纳米粒可以通过靶向投递结合化学修饰，用于药物分子投递到特殊组织内或相关细胞内。这种特殊的“智能”将药物分子定位、定点地投递到细胞某一部位，以预防或治疗局部病理性过程，如眼睛黄斑退化性疾病、肝硬化、动脉粥样硬化和皮肤老化性疾病。从药物安全性角度考虑，尤为重要的是能够控制绝大部分药物分子有把握地进入特定的组织类型内，试验的风险将容易控制且毒性比较低 , 目前本专利发明达到了这个要求。

上面表述配体的名字： PTD-4a, HIV TATa, PTD-3a, PTD-5a, PTD-6a, PTD-7a, ANTpb, Transportin ，它们相对应的氨基酸序列分别是 : YARAAARQARA, YGRKKRRQRRR, YARKARRQARR, YARAARRAARR, YARAARRAARA, YARRRRRRRRR, RQIKIWFQNRRMKWKK, GWTLNSAGYLLGKINLKALAALA KKIL 。适合靶向投递的小分子也可以附加到本专利发明的纳米粒中，包括但不限制于非肽类，如：多胍基树状结构、多聚 N- 二甲基丙烯酸羟丙基酯。

基于上述发明内容的描述，应用本“智能型纳米粒”发明技术向人体细胞和组织投递抑癌蛋白，如 p53 、 PTEN 等，有机化学和其它生物化学小分子 , 如：阿托伐他汀、辅酶 Q-10 等 , 与端粒酶和抗氧化酶的纳米药物递送的发明背景雷同，在此不再赘述。

附图说明

图 1: 向活细胞投递端粒酶 24 小时后端粒被延长的结果。 24 小时内，活性端粒酶全酶可延长染色体端粒的长度，而牛血清蛋白（ BSA ）实验对照组则无变化，展示出活性端粒酶的确被成功投递到细胞核中，并有效地延长了染色体端粒。

图 2: 向活细胞投递端粒酶 48 小时后端粒延长的结果。 48 小时内，活性端粒酶全酶可延长染色体端粒的长度，而牛血清蛋白（ BSA ）实验对照组则无变化，展示出活性端粒酶的确被成功投递到细胞核中，并有效地延长了染色体端粒。

具体实施方式

以下结合实施例对本发明的具体实施方式作详细说明。

实施例 1 ：

纳米粒制备与表征参数的测定。

聚乳酸 - 羟基乙酸共聚物（ PLGA) （ 90 毫克 ; 50:50 ，粘度 1.3 ）溶解于 3 毫升氯仿，在上述聚合物溶液中溶解酒石酸二甲酯或酒石酸二酯（密度 1.2 克 / 毫升）。牛血清白蛋白（ BSA ） 30 毫克）溶解于 300 微升水中，涡旋混合 1 分钟，蛋白质溶液乳化于上述 PLGA 溶液中，然后在 55 瓦的能量输出设置上，使用探头超声波处理器超声分散 2 分钟。在同样能量输出设置上，涡旋混合，超声分散 2 分钟，这个乳液进一步乳化到 12 毫升 2 ％的聚乙烯醇（ PVA ）溶液中（ PVA 的平均分子重量： 30,000-70,000 ）。 PVA 溶液通过 0.22 微米注射器过滤器过滤，在使用前用氯仿饱和。将几滴氯仿加入 PVA 溶液，摇匀，上清液即用于制剂的制备。

乳液在室温下搅拌过夜，然后真空干燥 1 小时，由此形成的纳米粒于 4 ° C ， 30,000 rpm 离心 30 分钟得以分离。颗粒化的纳米粒子再悬浮在水中，如上所述并再次离心。收集上清，并额外重复一次上述过程，的清除未包封的蛋白质和乳化剂。最后收集上清液，进行蛋白进行分析，以确定没有包封在纳米粒中的蛋白量。蛋白水平的测量是通过采用 Bio-Rad^® 公司的检测试剂盒。通过超声分散，纳米粒比较容易地悬浊于水中，然后悬浊液于冻干机上冷冻干燥 48 小时。纳米粒的直径大小的测定是通过使用光子相关光谱（ PCS ）和准弹性光散射设备（ ZetaPlus 电位仪）。为了评估含二甲基酒石酸 (DMT) 的纳米粒的分子释放情况，在模型蛋白质 ( 牛血清白蛋白 : BSA) 或编码荧光素酶的模型 DNA 序列的乳化之前，二甲基酒石酸以不同的比例在聚合物溶液溶解。结果发现，随着二甲基酒石酸浓度的增加，纳米粒的蛋白质包封率降低 ; 然而，纳米粒的大小和分散度没有显著影响。实验结果表明， BSA 从含有 10 ％ DMT 的纳米粒中释放的量要远远高于不含 DMT 的纳米粒（ 30 天的释放量分别是 70 ％和 30 ％）。另外，蛋白质从含有 DMT 的纳米粒中释放出后的聚合程度要远远低于从不含 DMT 纳米粒中释放出的蛋白质。同样，用 DNA 取代上述的 BSA 蛋白质包封于纳米粒中，所观察到的结果是相同的；并且，含有 DMT 的纳米粒的基因转染率更高，加入 10 ％的 DMT 不改变纳米粒的 DNA 承载能力，也不改变纳米粒的直径大小。

实施例 2:

人类端粒酶纳米粒制备、细胞递送及染色体端粒 DNA 长度延长活性测定。

含有人类重组端粒酶或 hTert 蛋白的 PLGA 纳米粒是通过使用一种双乳化溶剂蒸发技术制备而成，制备过程与实施例 1 相同。在该实施例中，端粒酶全酶和端粒酶 hTert 催化蛋白亚基分别被包封在具生物降解性的 PLGA 聚合物中，制备成纳米粒。转染人类成纤维细胞后端粒酶成份缓释，治疗性地延长细胞染色体端粒的长度。

将要被转染的成纤维细胞（ ATCC ， SCRC-1041 ）接种于 4 个 6 孔板中（细胞密度 1.4 × 10⁵ 细胞 / 孔），空中含有完全生长培养基（含 15 ％ V / V 血清），每个纳米粒样品置放入 3 个孔中，用同一密度的细胞接种于没有纳米粒的板孔中作为“对照组”，使细胞附着在板块上生长 24 小时。在无菌条件下，准备活性端粒酶全酶、端粒酶蛋白亚基（ hTert) 和负载 BSA 的纳米粒（ 9 毫克纳米粒溶于 1.1 毫升的 DMEM 无血清培养基中），纳米粒悬浮液经水槽超声器超声处理 10 分钟 ​​ ，每个纳米粒悬浮液用完全培养基液体稀释至 24 毫升。将培养基液体从板孔中吸出，向每个孔中添加 4 毫升纳米粒悬浮液。

在两个 6 孔板中，下述四个样品（ 1 ）活性端粒酶纳米粒、（ 2 ） hTERT 纳米粒、（ 3 ） BSA 纳米粒、（ 4 ）仅细胞（对照组，无纳米粒）的每个样品分别占据 3 个板孔，在 37˚C 、 5 ％ CO₂ 的条件下培养 24 小时。使用其他两个完全相同的 6 板孔和样品，细胞在相同条件下培养 48 小时。 24 或 48 小时后，经上述四个样品转染过的细胞用 PBS 缓冲液（ pH 7.4 ）清洗两次，并使用“橡胶棒”将细胞轻轻刮掉并收获。使用 DNeasy 试剂盒，提取每个板孔中的细胞基因组 DNA ， DNA 浓度使用 Picogreen 检测法测定。基因组 DNA 样品稀释至 5ng/ml ， 25ng DNA 加入到 96 孔板的孔内，然后风干。

使用定量 PCR 技术测定端粒的平均长度。端粒反应混合物由以下成份组成： 1 × Qiagen 公司 Quantitect SYBR Green 预混合物， 2.5 mmol/L DTT ， 100 nmol / L 引物 1b （ CGGTTTGTTTGGGTTTGGGTTTGGGTTTGGGTTTGGGTT ），和 900 nmol / L 的引物 2b （ GGCTTGCCTTACCCTTACCCTTACCCTTACCCTTACCCT ）。反应于 95˚C 下进行 3 分钟（ 1 个周期），在 95˚C 下进行 15 秒，然后 54˚C 下进行 1 分钟（共 40 个周期）。β - 珠蛋白基因放大反应包括 1 × Qiagen 公司 Quantitect 的 SYBR Green 预混合物， 300 nmol / L 的 hbg1 引物（ GCTTCTGACACAACTGTGTTCACTAGC ）， 700 nmol / L 的引物 hbg2 (CACCAACTTCATCCACGTTCACC) 。β - 珠蛋白基因放大反应进行在 95˚C 进行 3 分钟（ 1 个周期），在 95˚C 进行 15 秒、 58˚C 进行 20 秒、 72˚C 进行 28 秒，端粒和单拷贝基因（人类β - 珠蛋白）反应的所有样品均为一式三份。在另外的样品中，每个 96 孔板上都有 6 点标准曲线样品（用 5 到 100ng 的人类基因组 DNA 作为基因放大模板）。

使用“双尾学生 t 检验”方法，在 24 小时时间点上与 BSA 纳米粒对照组转染的细胞相比，统计学上有意义的活性端粒酶纳米粒转染的细胞的端粒有明显的伸长，活性端粒酶的相对端粒长度的平均值（± SE ）为 0.53 ± 0.02 ，而 BSA 对照组的平均值（± SE ）为 0.43 ± 0.03 （参见图 1 ）。细胞培养 48 h 后，发现在活性端粒酶纳米粒转染的细胞的端粒延长更为明显，相对活性端粒酶的相对端粒长度平的均值（± SE ）为 1.04 ± 0.1 ，而 BSA 对照组的平均值（± SE ）仅是 0.69 ± 0.02 ，（参见图 2 ）。

实施例 3

SOD 纳米粒制备及缓释特征。

制备含有二甲基酒石酸 (DMT) 的超氧化物歧化酶（ SOD ）纳米粒与制备 BSA 蛋白纳米粒的方法相同（参见实施例 1 ）。一般情况下， 10 ％的 DMT 用在纳米粒制剂中；纳米粒中 SOD 的负载量是通过测定未被纳米粒包封的 SOD 的含量来计算的。为此，纳米粒制备过程中产生的清洗液要进行分别收集和分析，使用标准 SOD 酶活性检测试剂盒对样品中的 SOD 酶活性分别测定和计算。超氧化物歧化酶纳米粒的负载量为 4.5 ％，包封率是 75 ％（即 75 ％的补充蛋白被包封在纳米粒之内）。

为了证明纳米粒缓释性质，本技术发明人进行了活体外的 SOD 释放实验研究，即通过使用由亲水性、低蛋白结合能力的 Millipore® 分子膜（孔隙度： 0.1 微米）分隔的双扩散室。 SOD 活性提供扩散室加载有含 5 毫克纳米粒悬浮液［预先溶于 2.5 毫升的磷酸盐缓冲液（ 0.15 M ， pH 7.4 ， 1 ％的 BSA ， 0.05 ％ Tween ™ -20 和 0.05 ％的叠氮化钠， 37 ° C] ，而 SOD 活性扩散接收室装有不含纳米粒的缓冲液。接收室的溶液在固定的时间间隔内不断地彻底清除，然后对 SOD 催化活性水平分别进行固定时间间隔的分析，量化纳米粒缓释的性质。

实施例 4

纳米粒的“智能化”－定位或靶向递送。

蛋白转导肽是人类免疫缺陷病毒 1 型 (HIV-1) 编码的一段富含碱性氨基酸、带正电荷的多肽 , 属于蛋白转导域家族的一员。其碱性氨基酸富集区的核心肽段 (YGRKKRRQRRR) 不仅能够在包括蛋白质、多肽及核酸等多种外源生物大分子的跨膜转导过程中具有重要作用 , 而且能够携带这些外源生物大分子和其他颗粒性物质 ( 包括纳米粒 ) 通过活体细胞的各种生物膜性结构 ( 如细胞膜和血脑屏障等 ) 并发挥生理功能。 TAT 肽也称为“穿膜肽”或“穿透肽”，经环氧活化法，可以用 TAT 肽对载药纳米粒的表面进行化学修饰，达到向活细胞定位、靶向高效地递送纳米粒的目的。由于 TAT 肽已经有效地使用在蛋白质或脂质体的分子偶联反应上， TAT 肽被普遍认为是一个合适的定位基。

短肽偶联到纳米粒上是通过纳米粒表面羟基功能团与环氧化合物发生化学反应而实现的，该功能团来自纳米粒成份之一聚乙烯醇（ PVA ）分子。具体步骤： 40 毫克载药纳米粒子分散在 4 mL 的硼酸盐缓冲液中（ pH5.0 ）， 12 毫克 DENACOL^® 524 （五环氧树脂）溶解在等体积的硼酸盐缓冲液 ​​ ，将 两者混合，由四氟硼酸锌作为催化剂，于 37 ° C 条件下反应进行 30 分钟，并轻轻搅拌。未反应 DENACOL^® 524 用超速离心分离，将之与纳米粒分开 , 再用硼酸盐缓冲液对纳米粒冲洗一次。将纳米粒共价偶联到 TAT 短肽上的化学反应步骤：环氧活化的载药纳米粒首先悬浮于硼酸缓冲液中，然后与 TAT 短肽混合在 4 毫升硼酸盐缓冲溶液内。在 37 ° C 的条件下，反应进行 30 分钟。未参与反应的 TAT 短肽经超速离心分离，分开清除，纳米粒反复用清水洗干净。 TAT 短肽偶联的纳米粒的整体稳定性可以通过以下步骤来测定：纳米粒首先与荧光化合物 FITC 标记的 TAT 短肽进行偶联，将偶联过的纳米粒加入含有血清的培养基中。在不同时间点对上述样品进行离心分装，并测量离心后上清液的荧光值。这些数值即可表明纳米粒的实际降解情况。

实施例 5

辅酶 Q10 纳米粒制备方法。

辅酶 Q10 纳米粒是通过使用乳化扩散蒸发技术来制备完成的。 50 毫克 PLGA （ 50:50 ）和 5 毫克辅酶 Q10 溶于 2.5 毫升乙酸乙酯在室温搅拌 30 分钟。有机相逐滴（ 1.0 毫升 / 分钟）加入 5 毫升含有稳定剂的水相。乳液的液滴体积缩小由高速均质机（转速： 10000 rpm ，时间： 15 分钟）均质化完成。由此产生的乳液倒入 25 毫升的水中，并不断搅拌，从而产生纳米沉淀物和纳米粒的形成。纳米粒悬浮液在不同的离心速度和离心时间条件下（ 15000 g ， 5 分钟； 25000 g ， 40000 g ， 15 分钟）重新收集水洗涤过的纳米粒，然后再悬浮在水中，此过程重复 3 次以去除多余的表面活性剂，然后冷冻干燥最后收集的辅酶 Q10 纳米粒。

实施例 6

肿瘤抑制因子 p53 蛋白纳米的制备和释放特征。

聚乳酸 - 羟基乙酸共聚物（ PLGA ）（ 30 毫克 ; 50:50 ，固有粘度 1.30 ）溶解于 1 毫升氯仿中， 3 毫克酒石酸二甲酯（ DMT 的或酒石酸二酯，密度 1.2 克 / 毫升）溶解在上述聚合物溶液， 10 毫克大鼠血清白蛋白（ RSA ）和 20 微克 p53 蛋白溶解于 300 微升水中。在下列实验条件下：涡旋 1 分钟，超声分散 2 分钟，能量输出 55 瓦，用探针超声仪将蛋白质溶液和 PLGA 溶液乳化在一起。

由此产生的乳液，在与上述完全相同的实验条件下，进一步乳化在 12 毫升的 2 ％ PVA 溶液中（ PVA 平均分子重量 30,000-70,000 ）。 PVA 溶液在使用之前，要通过 0.22 微米注射器的过滤和用氯仿饱和。往 PVA 溶液中加入几滴氯仿，摇动，上清液用于纳米粒的制备。 p53 蛋白纳米粒的冷冻干燥过程、包封率、纳米直径大小测定、 Zeta 电位均与本发明实施例 1 相同。下面 p53 蛋白从纳米粒中缓释是该发明实施的一部分，该例并不以任何方式限制本发明其它所有抑癌蛋白（或基因）因子在纳米粒载药投递平台上的使用。

蛋白纳米粒的缓释状况：本发明使用免疫印迹法测定 p53 蛋白从纳米粒制剂中释放的情况。结果表明，从粒子中释放出的 p53 蛋白在免疫印迹分析中显示出的蛋白带与 p53 蛋白在包封之前完全相同。这证实了 p53 蛋白质在其包封成纳米粒前后或 p53 缓慢释放前后都保持着它的分子构型。

实施例 7

阿托伐他汀（立普妥）纳米粒药物制剂。

本技术发明可使用于开发基于纳米技术的新型纳米化仿制药，应用本发明平台技术可改善一些具重大市场意义的化学或生物药物的药物动力学特征，以达到降低药物毒性、降低药物生产成本、提高药性甚至靶向性的多种目的。

聚乳酸羟基乙酸（ PLGA) 是一种无毒可生物降解的聚合物，可用作医用手术缝合线和注射用微胶囊、微球（纳米粒）及埋植剂等制剂的材料 , 确定其最佳制备工艺条件 , 有利于聚乳酸羟基乙酸后续药物载体研究与工业化生产条件的确立。本制备的目的 : 以聚乳酸羟基乙酸为包裹材料 , 以立普妥为药物，探明纳米粒的制备条件对粒径、表面形态等的影响 , 确定最佳制备工艺条件。本制备的方法 : 采用乳化 - 溶剂挥发法制备聚乳酸羟基乙酸纳米粒 , 以粒径为观察指标 , 根据本专利纳米粒药物输送系统技术，进一步确定乳化剂种类、乳化剂含量、油相种类、超声时间、挥发时间、油相与水相体积比 (W ／ O) 以及聚合物质量浓度等制备条件对纳米粒粒径的影响 , 确定制备聚乳酸 - 羟基乙酸纳米粒的最佳工艺条件。

根据本专利技术，优化后的制备工艺条件是在室温下 , 以一定的搅拌速度和滴加速度 , 选择常用无毒的乳化剂 , 浓度为 1.0%, 丙酮为有机相 , 超声时间 10 min 、挥发时间为 10 小时、水油相比 (W ∶ O)> 25 ∶ 1, 聚合物质量浓度 <60g/L 。该制备工艺简单、稳定 , 优化制备条件 , 可制备出表面形态规整、粒径适宜的聚乳酸 - 羟基乙酸纳米粒。

本发明以立普妥为药物，将 PLGA 作为载体材料，制备聚乳酸羟基乙酸立普妥纳米微球（ PLGA-Lipitor-Nanoparticles: LipiPA ），并研究静脉注射和口服该两种制剂对人体高胆固醇的治疗效果、生存期及肝肾毒性等不良反应。

荧光蛋白封装

牛血清白蛋白 -FITC （ BSA-FITC 标记）被选定为代理蛋白封装物质是因其具备优异的理化性质和荧光信号，并且经济廉价。选择仿制药阿托伐他汀钙（立普妥）是因它要用在纳米化阿托伐他汀中（ LipiPA ）。阿托伐他汀可以较容易地通过约翰逊等人所描述的方法用异硫氰酸荧光素（ FITC ）

PLGA 纳米粒制备

用 FITC 荧光标记的蛋白质与 PLGA 包封在一起的纳米粒是通过一种新型的双重乳化溶剂蒸发技术来制备完成的。在制备过程中， FITC 荧光标记的蛋白质溶于 200uL PBS 缓冲溶液或 0.01 N 盐酸溶液中。然后，将其加到聚合物溶液（含 30 毫克 PLGA 50:50 ，固有黏度 1.32 dL / g （ Lactel ^{（ R ）} 产品） / 1 mL 二氯甲烷（ DCM ）或 27 毫克 PLGA 和 3 毫克酒石酸二甲酯（ DMT ） / DCM 的 1 毫升），涡旋混合，使用 Sonicator 3000 和微探针进行乳化，在冰上乳化 2 分钟，探针设置位置为 3 （ Misonix ）。然后，乳液加入 6 毫升用 DCM 饱和过的聚乙烯醇（ PVA ）溶液（ 2 ％ w/v PBS 缓冲溶液），涡旋形成双乳液，在冰上用超声波能量（设置强度为 3 ）处理 5 分钟。由此产生的双重乳液在化学通风柜内室温下搅拌 18 小时，然后在真空状态下搅拌 1 小时，最终蒸发掉 DCM 残留物。由此形成的 PLGA 纳米粒通过超速离心分离获得样品（ 100,000 RCF ， 20 分钟， 4 ° C ， WX80 超速离心机 , 使用转子 T-865 ）。相应的上清液保留，为后续蛋白质包封效率分析使用。然后，纳米粒子通过吸管和超声波使之悬浮于 10ml PBS 缓冲溶液中。重复两次以上超速离心和悬浮步骤以便清除 PVA 残留物和未能包裹到纳米粒中的蛋白质。最后，纳米颗粒溶解在 5 毫升无菌、无核酸酶的水中，分装到预先称重、无菌试管中进行冷冻（ - 80 ° C ）和冻干，获得干粉制备产物并称重。

的制剂学分析评价

使用 ZetaPALS 仪器对每批 LipiPA 制剂的流体力学直径（ HD ）， zeta 电位（ Z ）和聚分散计量进行分析评价。用 FITC 标记的阿托伐他汀总量减洗涤液中的阿托伐他汀测量出每批的包封率（使用仪器为 M5 多模酶标）。

标记的阿托伐他汀药物释放效率的测定：降低血液胆固醇水平的阿托伐他汀从纳米中释放是通过测定荧光标记的阿托伐他汀在不同的释放时间（ 0 ， 24 ， 48 ， 72 和 96 小时）药物在缓冲溶液中的释放量。 LipiPA 纳米粒溶解于一定体积的 PBS 溶液中 (pH ＝ 7.5), 于 37C 在摇床上摇动，在不同的时间点上取样测定，阿托伐他汀药物释放效率由液相和固体相的百分比计算。

包封效率分析

直接测量荧光立普妥 -FITC 在洗涤液中的含量便可估计为每个制备样本的 Lipitor 包封效率。荧光数据值由 M5 多模式仪器测定。每个制备样本的包封量和效率由减色质量平衡法计算。

纳米颗粒的稳定性

含 1.6 毫克和 1.4 毫克的立普妥－ FITC 制备样品分别在溶解 50 uL 蒸馏水中，并在室温下溶解一个小时。每个重新溶解的制备样品然后转移到单个离心管中，在一定时间间隔点分析之间，上述样品存放在黑暗和室温之中。研究期限为 180 天，每隔约 30 天分析一次样品的稳定性。

Claims (27)

1.一种具有定向专一递送（靶向性）并可持续、定量释放活性药物的纳米药物释放系统，其特征在于，该系统包括作为活性药物的治疗性活性肽或其它生物大分子或有机小分子（包括药物)，及至少一种生物降解性多聚物，一种惰性塑化剂，及用于组织、细胞准确专一传递的靶向分子定位部分。

2.如权利要求1所述的纳米药物释放系统，其特征在于，所述生物降解性多聚物可以是下述中的任何一种物质或几种不同物质之间的组合：聚乳酸-羟基乙酸共聚物，聚乳酸，聚亚烷基二醇，聚丙烯酸正丁酯，甲基丙烯酸甲酯与甲基丙烯酸共聚物，聚烷基胺，聚酸酐，聚羟基丁酸和聚原酸酯。

3.如权利要求1所述的纳米药物释放系统，其特征在于，所述专一定向递送的靶向分子定位部分可以是氨基酸序列HIV-1TAT穿透肽YGRKKRRQRRR，YARAAARQARA,YGRKKRRQRRR,YARKARRQARR,YARAARRAARR,YARAARRAARA,YARRRRRRRRR,RQIKIWFQNRRMKWKK,或GWTLNSAGYLLGKINLKALAALAKKIL。

4.如权利要求1所述的纳米药物释放系统，其特征在于，所述一种实现持续释放活性物质有效剂量的方法包括给与受治疗者由上述权利要求1定义的纳米药物释放系统，从而在受治疗者体上实现持续释放有效剂量的活性物质。

5.如权利要求1所述的纳米药物释放系统，其特征在于，所述一种实现定量释放活性物质有效剂量的方法包括给与受治疗者由上述权利要求1定义的纳米药物释放系统，从而在受治疗者体上接受一定有效剂量的活性物质。

6.如权利要求1所述的纳米药物释放系统，其特征在于，所述的惰性增塑剂可以是L-酒石酸二甲酯、柠檬酸三乙酯或三醋酸甘油酯。

7.如权利要求1所述的纳米药物释放系统，其特征在于，所述的作为活性药物的治疗性活性肽可以是转录后未化学修饰或已化学修饰的寡肽、多肽、蛋白质、酶分子（包括这些分子的亚基和／或辅基）。

8.如权利要求1所述的纳米药物释放系统，其特征在于，所述的作为活性药物的治疗性活性其它生物大分子可以是核酸类、多糖类、脂肪类或纤维类。

9.如权利要求1所述的纳米药物释放系统，其特征在于，所述的作为活性药物的治疗性有机小分子可以是化学合成小分子药物类、天然小分子药物类或天然生物有机小分子。

10.如权利要求3所述的纳米药物释放系统，靶向分子定位部分的氨基酸序列如HIV-1TAT穿透肽YGRKKRRQRRR化学共价偶联于纳米粒上，其特征在于，包含以下步骤：

a.40毫克载药纳米粒子分散在4mL的硼酸盐缓冲液中（pH5.0），12毫克

524（五环氧树脂）溶解在等体积的硼酸盐缓冲液，将两者混合，由四氟硼酸锌作为催化剂，于37°C条件下反应进行30分钟，并轻轻搅拌，未反应

524用超速离心分离，将之与纳米粒分开,再用硼酸盐缓冲液对纳米粒冲洗一次；

b.环氧活化的载药纳米粒首先悬浮于硼酸缓冲液中，然后与TAT短肽混合在4毫升硼酸盐缓冲溶液内，在37°C的条件下，反应进行30分钟，未参与反应的TAT短肽经超速离心分离，分开清除，纳米粒反复用清水洗干净。

11.如权利要求1所述的纳米药物释放系统，本发明提供了递送有效剂量端粒酶或其催化亚基或上述两种物质之变种复合物从而治疗人类衰老疾病的方法。

12.如权利要求11所述的端粒酶的纳米颗粒化和细胞递送方法，其特征在于，该方法有以下步骤组成：人类重组端粒酶或hTert蛋白的PLGA纳米粒通过使用一种双乳化溶剂蒸发技术制备而成；端粒酶全酶和端粒酶hTert催化蛋白亚基分别被包封在具生物降解性的PLGA聚合物中，制备成纳米粒；转染人类成纤维细胞后端粒酶成份缓释，治疗性地延长细胞染色体端粒的长度。

13.一种治疗人类衰老疾病的方法，其特征在于，所述的方法是使用权利要求1制备的纳米粒作为端粒酶分子载体，通过口腔服用，动脉或静脉注射，皮肤表面涂用或其它常见的普通药物投递方法向需要治疗的患者提供，达到逆转或减缓一种或多种与“端粒变短”相关的生命衰老疾病。

14.如权利要求1所述的纳米药物释放系统，本发明提供了向活体递送有效剂量活性超氧化物歧化酶或其它抗氧化酶或若干种抗氧化酶物质的混合物的方法，从而治疗和预防与急性或慢性自由基过量产生有关的人类疾病，包括但不限于心血管疾病、中风、癌症、糖尿病、自身免疫性疾病、风湿性关节炎、老年痴呆症、帕尔金斯症、过敏、哮喘、红斑狼疮、皮肤癣和白癜风。

15.如权利要求14所述的向活体递送抗氧化酶大分子的方法，其特征在于，所述的方法是使用权利要求1制备的纳米粒作为抗氧化酶分子载体，通过口腔服用，动脉或静脉注射，皮肤表面涂用或其它常见的普通药物投递方法向需要治疗的患者提供，达到治疗或预防一种或多种与“自由基过量产生”相关的炎症疾病或人体衰老。

16.向活体递送一种或几种有效剂量抑癌蛋白，如p53,p16,pRb,PTEN,WT1蛋白,等，从而治疗癌症或其它细胞繁殖失控疾病的方法。

17.如权利要求16所述的向活体递送抑癌蛋白的方法，其特征在于，纳米粒的制备步骤是：

a.聚乳酸-羟基乙酸共聚物（PLGA）（30毫克;50:50，固有粘度1.30）溶解于1毫升氯仿中，3毫克酒石酸二甲酯（DMT的或酒石酸二酯，密度1.2克/毫升）溶解在上述聚合物溶液，10毫克大鼠血清白蛋白（RSA）和20微克p53蛋白溶解于300微升水中；

b.在下列实验条件下：涡旋1分钟，超声分散2分钟，能量输出55瓦，用探针超声仪将蛋白质溶液和PLGA溶液乳化在一起，由此产生的乳液，在与上述完全相同的实验条件下，进一步乳化在12毫升的2％PVA溶液中（PVA平均分子重量30,000-70,000），PVA溶液在使用之前，要通过0.22微米注射器的过滤和用氯仿饱和；往PVA溶液中加入几滴氯仿，摇动，上清液用于纳米粒的制备，p53蛋白纳米粒的冷冻干燥过程、包封率、纳米直径大小测定、Zeta电位均与本发明权利要求1相同。

18.如权利要求16所述的方法，其特征在于，通过口腔服用，动脉或静脉注射，皮肤表面涂用或其它常见的普通药物投递方法向需要治疗的患者提供，已达到逆转或减缓一种或多种疾病与“细胞繁殖失控”相关的恶性肿瘤、冠心病等。

19.向活体递送辅酶Q10从而治疗或预防因辅酶Q10缺少造成的疾病的方法，辅酶Q10纳米粒是通过使用乳化扩散蒸发技术来制备完成的，其步骤是：50毫克PLGA（50:50）和5毫克辅酶Q10溶于2.5毫升乙酸乙酯在室温搅拌30分钟，有机相逐滴（1.0毫升/分钟）加入5毫升含有稳定剂的水相。乳液的液滴体积缩小由高速均质机（转速：10000rpm，时间：15分钟）均质化完成，由此产生的乳液倒入25毫升的水中，并不断搅拌，从而产生纳米沉淀物和纳米粒的形成。纳米粒悬浮液在不同的离心速度和离心时间条件下（15000g，5分钟；25000g，40000g，15分钟）重新收集水洗涤过的纳米粒，然后再悬浮在水中，此过程重复3次以去除多余的表面活性剂，然后冷冻干燥最后收集辅酶Q10纳米粒。

20.一种递送有效剂量向活体递送阿托伐他汀（Atorvastatin－Lipitor）用于降低血液胆固醇浓度,通过抗炎症和其他机制,稳定血栓和预防中风的方法，阿托伐他汀纳米粒是通过使用乳化扩散蒸发技术来制备完成的。

21.如权利要求20所述的的方法，其特征在于，纳米粒的制备步骤是：

a.其步骤是:牛血清白蛋白-FITC（BSA-FITC标记）被选定为代理蛋白封装物质是因其具备优异的理化性质和荧光信号，用FITC荧光标记的蛋白质与PLGA包封在一起的纳米粒是通过一种新型的双重乳化溶剂蒸发技术来制备完成的；

b.FITC荧光标记的蛋白质溶于200uL PBS缓冲溶液或0.01N盐酸溶液中，然后，将其加到聚合物溶液（含30毫克PLGA 50∶50，固有黏度1.32dL/g（Lactel^(R）产品）/1mL二氯甲烷（DCM）或27毫克PLGA和3毫克酒石酸二甲酯（DMT）/DCM的1毫升），涡旋混合，使用超声仪3000和微探针进行乳化，在冰上乳化2分钟，探针设置位置为3（Misonix）；

c.乳液加入6毫升用DCM饱和过的聚乙烯醇（PVA）溶液（2％w/v PBS缓冲溶液），涡旋形成双乳液，在冰上用超声波能量（设置强度为3）处理5分钟，由此产生的双重乳液在化学通风柜内室温下搅拌18小时，然后在真空状态下搅拌1小时，最终蒸发掉DCM残留物；

d.由此形成的PLGA纳米粒通过超速离心分离获得样品（100,000RCF，20分钟，4°C，WX80超速离心机,使用转子T-865），相应的上清液保留，为后续蛋白质包封效率分析使用；

e.纳米粒子通过吸管和超声波使之悬浮于10ml PBS缓冲溶液中，重复两次以上超速离心和悬浮步骤以便清除PVA残留物和未能包裹到纳米粒中的蛋白质；

f.纳米颗粒溶解在5毫升无菌、无核酸酶的水中，分装到预先称重、无菌试管中进行冷冻（-80°C）和冻干，获得干粉制备产物并称重。

22.如权利要求20所述的方法，其特征在于，通过口腔服用或静脉注射向需要治疗的患者提供，已达到逆转或减缓与人体血液胆固醇超标有关的一种或多种疾病。

23.如权利要求1-3、6任一项所述的药物释放系统，其所述活性药物为端粒酶。

24.如权利要求1-3、6任一项所述的药物释放系统，其所述活性药物为抗氧化酶。

25.如权利要求1-3、6任一项所述的药物释放系统，其所述活性药物为抑癌蛋白。

26.如权利要求1-3、6任一项所述的药物释放系统，其所述活性药物为阿托伐他汀。

27.如权利要求1-3、6任一项所述的药物释放系统，其所述活性药物为辅酶Q10。

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